SA516380090B1 - نظم، وطرق وجهاز لتمديد مجموعة من الخلايا - Google Patents

نظم، وطرق وجهاز لتمديد مجموعة من الخلايا Download PDF

Info

Publication number
SA516380090B1
SA516380090B1 SA516380090A SA516380090A SA516380090B1 SA 516380090 B1 SA516380090 B1 SA 516380090B1 SA 516380090 A SA516380090 A SA 516380090A SA 516380090 A SA516380090 A SA 516380090A SA 516380090 B1 SA516380090 B1 SA 516380090B1
Authority
SA
Saudi Arabia
Prior art keywords
binding
streptavidin
cells
avidin
reagent
Prior art date
Application number
SA516380090A
Other languages
English (en)
Inventor
ستيمبيرجير كريستيان
جيرميروث لوثار
Original Assignee
جونو ثيرابيوتكس جي إم بي اتش
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by جونو ثيرابيوتكس جي إم بي اتش filed Critical جونو ثيرابيوتكس جي إم بي اتش
Publication of SA516380090B1 publication Critical patent/SA516380090B1/ar

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/12—Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/52—CD40, CD40-ligand (CD154)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment
    • C12N2537/10—Cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

يتعلق الاختراع الحالي بطرق في المعمل لتمديد مجموعة من الخلايا مثل الخلايا اللمفاوية lymphocytes ، تشتمل على تلامس عينة تشتمل على مجموعة من الخلايا بمادة كاشفة لتعدد الوحدات multimerization reagent. ثبتت المادة الكاشفة لتعدد الوحدات على نحو عكسي عليها (مرتبط بها) عامل أول يوفر إشارة تنشيط رئيسية primary activation signal إلى الخلايا واختيارياً، عامل ثاني يقدم إشارة تحفيزية مشتركة co-stimulatory signal . كما يقدم الاختراع مواد كاشفة، وأطقم، وترتيبات لتعدد الوحدات وجهاز لتمديد الخلايا apparatus for expanding cells. شكل 1ج.

Description

‎ala‏ وطرق وجهاز لتمديد مجموعة من الخلايا ‎Methods, Kits and Apparatus for Expanding a Population of Cells‏ الوصف الكامل خلفية الاختراع يتعلق الاختراع الحالي بتمدد ‎expansion‏ (تكاثر ‎(proliferation‏ مجموعة من ‎Jie WAN‏ مجموعة من الخلايا اللمفية ‎lymphocytes‏ . ودوفر الاختراع بشكل عام طرق وكواشف ‎reagents‏ جديدة لتمدد (تكاثر) مجموعات الخلايا تتطلب ريط جزيء رابط للمستقبل (مثل عامل أول على النحو المبين في الطلب الحالي) بجزيء مستقبل على سطح الخلايا 3 وبالتالى توفير إشارة تنشيط أولى للخلايا . يستخدم كاشف تعدد وحد ات مثبت عليه (مرتبط به) عامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا. وعلى هذا النحو قد تكون إشارة التنشيط الأولى كافية لتنشيط الخلايا للتمدد و/التكاثر. وقد يكون هذا العامل الأول مرتبطاً بشكل قابل للعكس أو بشكل غير قابل للعكس أيضاً بكاشف تعدد الوحدات. وقد يكون مثبتاً على كاشف 0 تعدد الوحدات (مرتبطاً به) أيضاً عامل ثان يحفز ‎Win‏ ثانوياً على سطح الخلايا ‎surface of‏ ‎the cells‏ . وبالتالى فقد يحفز العامل الثانى؛ عند الارتباط بالجزيء الثانوي على سطح الخلاياء الخلايا المنشطة على التمدد. كذلك يمكن ربط هذا العامل الثانى بشكل قابل للعكس أو بشكل غير قابل للعكس أيضاً بكاشف تعدد الوحدات. ويمكن أن يكون عامل تعدد الوحدات مثبتاً على ‎sale‏ ‏حاملة صلبة أو قابلاً للذويان. وفى أحد الجوانب؛ الطريقة التى يكشف عنها الطلب الحالى عبارة 5 عن تمدد تسلسلي لمجموعة من الخلايا يتم فيها حفز/ تمديد مجموعة كاملة من الخلايا اللمفية؛ وبعد ذلك تتم إزالة الكواشف اللازمة للتمدد بالكروماتوجراف على طور ثابت مناسب وتتم إصابة الخلايا الممددة /المحفزة اختيارياً بالعدوى باستخدام مستقبل خلايا تائية ‎cell‏ 1 أو مستقبل ‎Ase‏ ‏ضد خيمري ‎(CAR) chimeric antigen receptor‏ على سبيل المثال وتعريضها لتمدد تحفيزي ثان بجزيء تحفيزي مختلف يرتبط بمستقبل خلايا 1 أو مستقبل مولد الضد الخيمري 0 المدخلين. كذلك يتعلق الاختراع بجهاز لتمدد مجموعة الخلايا المختارة.
لقد كان تطوير آليات لنشر مجموعات خلايا ‎AT‏ المختبر حاسماً في كثير من التطورات لفهم تعرف خلايا 7 على ‎alge‏ الضد وتنشيط خلايا 1. وكان تطوير طرق مزارع لتوليد نسائل خلايا 1 نوعية لمولِّد الضد مفيداً في تعريف مولِّدات الضد التي يتم التعبير عنها بواسطة العوامل الممرضة والأورام ‎Ally‏ تتعرف عليها الخلايا 1 في إرساء طرق العلاج المناعي لمعالجة عدد متنوع من
الأمراض لدى البشر. يمكن تمديد الخلايا 1 النوعية ‎aad‏ الضد في المختبر للاستخدام في العلاج المناعي الخلوي المعمول به أو علاج السرطان ‎cancer‏ الذي اتضح فيه أن عمليات تسريب خلايا 1 هذه تؤدي إلى تفاعلية مضادة للأورام لدى عائل ‎ela‏ للورم ‎tumor-bearing host‏ . بالإضافة إلى ذلك؛ تم أيضاً استخدام العلاج المناعي المعمول به في علاج أنواع العدوى الفيروسية
.immunocompromised ‏لدى الأفراد الذين لديهم قصور مناعي‎ viral infections
0 يتم وصف طريقة لتمديد خلايا ‎T‏ البشرية في المختبر في عدم وجود عامل نمو خارجي ‎Land)‏ ‏وخلايا ثانوية تم ترسيخها في السنوات الأخيرة في براءة الاختراع الأمريكية (6» 352 694 1( ويراءة الاختراع الأوروبية 0700430 - 1ب (0 700 430 1). وتكشف براءات الاختراع هذه عن طريقة في المختبر لحث تكاثر مجموعة من خلايا آ. وتشتمل الطريقة على ملامسة مجموعة من الخلايا 1 مع سطح طور صلب مثبت عليه بشكل مباشر : (أ) عامل ‎Jol‏ يوفر إشارة تنشيط
5 أولى لخلايا ‎oT‏ وبالتالي تنشيط ‎WIA‏ 7؛ و(ب) عامل ثان يحفز جزيئاً ثانوياً على سطح خلايا 7 وبالتالي تحفيز خلايا ‎T‏ المنشطة. يحث ربط العامل الأول والعامل الثاني بخلايا 1 تكاثر / تمديد خلايا 1. العامل الأول المفضل المبين في براءة الاختراع الأمريكية رقم (6» 352 694 1( وبراءة الاختراع الأوروبية 0700430 - 1ب )0 700 430 1) عبارة عن جسم مضاد 8000007 ل ‎CD3‏ أحادي النسيلة ‎monoclonal‏ يرتبط بمعقد ‎TCR) TCR/CD3 complex‏
0 = مستقبل خلايا ‎(T Cell Receptor‏ وبالتالي يحفز إشارة مرتبطة بمعقد 10/0003 في ‎DA‏ 1. ويكون العامل الثاني المفضل ‎Wy‏ لهاتين البراءتين عبارة عن جسم مضاد ل ‎CD28‏ ‏أحادي النسيلة ‎monoclonal anti‏ يريط الجزيء الثانويي ‎CD28‏ الموجود على ‎TWA‏ يوفر ربط هذا العامل الثاني بالجزيء الثانوي 6028 محفزاً مشتركاً اللازم الضروري لتمدد/تكائر خلايا آ المنشطة. مع ذلك؛ يتاح ‎(Invitrogen)CD28 /Dynabeads® CD3‏ تجارياً لتمدد خلايا
‎Dynabeads® 003/0028 CTS™ .T 5‏ عبارة عن خرزات بولي استيرين ‎polystyrene‏
موحدة؛ 4.5 ميكرومتر فائقة المغنطة؛ معقمة؛ غير مسببة للحمى مغلفة بخليطالأجسام المضادة أحادية النسيلة المنقاة بالألفة ضد جزيئات أسطح ‎CD3 WA‏ و6028 على خلايا 1 البشرية. ومع ذلك ¢ ‎Lean‏ دمج هذه الخرزات المغناطيسية؛ على سبيل المتال في طريقة لتمديد الخلايا في الظروف المطلوية للتجارب السريرية أو الأغراض العلاجية لأنه يتعين التأكد من إزالة هذه الخرزات المغناطيسية بشكل تام قبل إعطاء ‎TDA‏ الممدة لمريض. على هذا ‎«pall‏ يهدف الاختراع الحالى إلى توفير طريقة بديلة لتمديد مجموعات الخلايا ‎Jie‏ خلايا ‎T‏ التنظيمية أو خلايا 17 الذاكرة المركزية للأغراض البحثية؛ التشخيصية وخصوصاً الأغراض العلاجية. بشكل مثالي؛ ينبغي أيضاً أن تكون هذه الطريقة الجديدة متوافقة مع الدمج في العمليات الآلية التي يمكن استخدامها في التمدد السريع والسهل لمجموعة الخلايا المرغوب فيها في التطبيقات العلاجية.
0 يتحقق هذا الهدف من خلال ‎sale‏ الموضوع الواردة في عناصر الحماية المستقلة؛ وبالطرق؛ مجموعات الأدوات؛ الترتيبات والأجهزة المبينة فى عناصر الحماية المستقلة بين أشياء أخرى. الوصف العام للاختراع يوفر الاختراع ‎(lila all‏ مجموعات أدوات؛ ترتيبات؛ وجهاز لتمدد مجموعة ‎WIA‏ مرغوب فيهاء على سطحها جزيء مستقبل يمكن أن يوفر عند ربطه عاملاً مناسباً إشارة تنشيط أولى إلى
5 مجموعة الخلايا وبالتالى تنشيط مجموعة الخلايا للتمدد (التكاثر) في المختبر. على هذا النحو؛ تستخدم الطرق الواردة في الاختراع ‎Lad‏ في حث مجموعة من الخلايا للتكاثر. وفقاً لجانب ‎Jel‏ يوفر الاختراع طريقة تتم في المختبر لتمديد مجموعة من ‎(DAY‏ حيث تشتمل حيث يكون ‎Bite‏ على كاشف تعدد الوحدات بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) عامل أول يوفر إشارة
0 تنشيط أولى للخلايا؛ وحيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات على موضع ربط واحد على الأقل 21 لربط العامل الأول بشكل قابل للعكس؛
وحيث يشتمل العامل الأول على شريك ارتباط واحد على الأقل ‎«C1‏ حيث يمكن لشريك الارتباط ‎IC1‏ لارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط 21 لكاشف تعدد الوحدات؛ وحيث يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال رابطة قابلة للعكس مكوّنة بين شريك الارتباط61 ‎binding partner‏ وموضع الريط ‎«Z1 binding site‏ و حيث يرتبط عامل أول بجزيء مستقبل على سطح ‎(WAN‏ وبالتالي توفير إشارة تنشيط أولى
للخلايا ‎dally‏ تنشيط الخلايا. وفقاً لجانب ثان يوفر الاختراع طريقة تتم في المختبر لتمديد مجموعة من ‎(LAN‏ حيث تشتمل على ملامسة عينة مشتملة على جموعة من الخلايا مع كاشف لتعدد الوحدات ‎multimerization‏ ‎reagent‏ «
وحيث يكون كاشف تعدد الوحدات في صورة قابلة للذويان ويكون مثبتاً عليه (مرتبطاً به) عامل أول ‎jig‏ إشارة تنشيط ‎primary activation signal to the cells Wall gf‏ ¢ وحيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات على موضع ربط واحد على الأقل 21 لريط العامل الأول؛ وحيث يشتمل العامل الأول على شريك ارتباط واحد على الأقل ‎«C1‏ حيث يمكن لشريك الارتباط
‎IC1‏ لارتباط بموضع ربط 21 من كاشف تعدد الوحدات؛ ‎Cus‏ يرتبط العامل الأول يكاشف تعدد
‏حيث يرتبط العامل الأول بجزيء مستقبل على سطح الخلايا؛ ويالتالي توفير إشارة تنشيط أولى للخلايا ‎dally‏ تنشيط الخلايا. ‎lag‏ لجانب ثالث يوفر الاختراع مجموعة أدوات كاشفة لتمديد مجموعة من ‎(DAN‏ حيث تشتمل مجموعة الأدوات ‎kit‏ على :
‏0 (1) كاشف تعدد وحدات ‎multimerization reagent‏ « وحيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات على موضع ربط واحد على الأقل ‎Z‏ للريط القابل للعكس لعامل أول؛
)2( عامل أول يرتبط بجزيء مستقبل على سطح الخلاياء وبالتالي توفير إشارة تنشيط أولى للخلايا وبالتالى تنشيط ‎(WAY‏ ‏حيث يشتمل العامل الأول على شربك ارتباط واحد على الأقل 01؛ وحيث يمكن لشريك الارتباط ا لارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط 21 من كاشف تعدد الوحدات؛ وحيث يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C1‏ ‏وموضع الريط 1 و (3) عامل ثان يحفز جزيثاً ثانوياً على سطح الخلاياء وحيث يشتمل العامل الثاني على شريك ارتباط ‎«C2‏ وحيث يمكن لشريك الارتباط 02 الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط 2 من كاشف تعدد الوحدات؛ وحيث يرتبط العامل ‎Sal‏ يكاشف 0 تعدد الوحدات من خلال الرابطة المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ وموضع الريط ‎Z2‏ ‏وحيث يرتبط العامل الثاني بالجزيء الثانوي على سطح الخلايا؛ وبالتالي تحفيز ‎DAY‏ المنشطة. وفقاً لجانب رابع يوفر الاختراع مجموعة أدوات كاشفة لتمديد مجموعة من ‎(LAN‏ حيث تشتمل على ‎f de gana‏ لأدوات : )1( كاشف تعدد وحدات؛ حيث يكون كاشف تعدد الوحدات في صورة ‎ALE‏ للذوبان ويشتمل على موضع ربط واحد على الأقل ‎Z‏ للريط القابل للعكس لعامل أول؛ )2( عامل أول يرتبط بجزيء مستقبل على سطح الخلايا 3 ‎alls‏ يتم توفير إشارة تنشيط أولى للخلايا وبالتالى تنشيط الخلاياء حيث يشتمل العامل الأول على شربك ارتباط واحد على الأقل 01؛ وحيث يمكن لشريك الارتباط ‎IC1 20‏ لارتباط بموضع ربط ‎Z1‏ من كاشف تعدد الوحدات حيث يرتبط العامل ‎١‏ لأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C1‏ وموضع الربط 21.
وفقاً لجانب خامس يوفر الاختراع طريقة تتم في المختبر لتمديد مجموعة من الخلايا اللمفية تتابعياً حيث تشتمل مجموعة الخلايا اللمفية على خلايا ‎T‏ ¢ وتشتمل الطريقة على ‎H‏ ‏ملامسة ‎die‏ تشتمل على خلية ‎T‏ مشتملة على مجموعة من الخلايا اللمفية مع كاشف لتعدد الوحد ‎cel‏ ‏5 وحيث يكون كاشف تعدد الوحدات في صورة قابلة للذويان ويكون مثبتاً عليه بشكل قابل للعكس
(1) عامل ‎Jf‏ يوفر إشارة تنشيط أولى لخلايا 7 و(2) عامل ثان يحفز ‎tga‏ ثانوياً على سطح خلايا ‎T‏ ‏وحيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات على موضع ربط واحد على الأقل 21 لربط العامل الأول بشكل قابل للعكس؛
0 وحيث يشتمل العامل الأول على شريك ارتباط واحد على الأقل ‎C1‏ حيث يمكن لشربك الارتباط
‎IC1‏ لارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ‎dal‏ 21 من كاشف تعدد الوحدات؛ وحيث يرتبط العامل
‏الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C1‏ ‏وموضع الريط 1 وحيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات على موضع ربط واحد على الأقل 22 للريط القابل للعكس
‏15 للعامل الثاني؛ وحيث يشتمل العامل الثانى على شريك ارتباط واحد على الأقل ‎«C2‏ حيث يمكن لشريك الارتباط 02 لارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط 2 من كاشف تعدد الوحدات؛ وحيث يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ ‏وموضع الريط 2
‏0 وحيث يرتبط العامل الأول بجزيء مستقبل على سطح ‎TIA‏ وبالتالي يتم توفير إشارة تنشيط أولى للخلايا ‎ally‏ تنشيط ‎TWA‏ ‏وحيث يرتبط العامل التانى بالجزيء الثانوي على سطح خلايا ‎JI‏ وبالتالى يتم تحفيز الخلايا المنشطّة؛ حيث يقوم العامل الأول والعامل الثاني ‎Tae‏ بحث خلايا 7 للتمدد.
وفقاً لجانب سادس يوفر الاختراع ترتيباً من مفاعل حيوي وطور ثابت للكروماتوجراف؛ حيث يكون المفاعل الحيوي ‎bioreactor‏ مناسباً لتمدد الخلايا؛ حيث يكون الطور الثابت مناسباً لفصل الخلايا ‎Ally‏ الكواشف؛ ويكون الطور الثابت عبارة عن مصفوفة ترشيح بالجل و/ أو مصفوفة كروماتوجراف الألفة ؛ حيث يشتمل الترشيح بالجل و/ أو مصفوفة كروماتوجراف الألفة على كاشف ‎dill‏ حيث يشتمل كاشف الألفة على موضع ربط 21 يرتبط نوعياً بشربك ارتباط 1© مكون من عامل أول و/ أو يشتمل كاشف الألفة على موضع ربط ‎lagi 72‏ نوعياً بشريك ارتباط ‎C2‏ مكون من عامل ثان؛ وبالتالي يكون مناسباً للتثبيت على الطور الثابت للعامل الأول و/ أو العامل الثانى» شريك الارتباط الأول 1© و/ أو شريك الارتباط الحر الثانى ‎C2‏ ‏0 وحيث يتصل المفاعل الحيوي والطور الثابت ‎stationary phase‏ بطريق المائع ‎fluidly‏ ‏ووفقاً لجانب سابع يوفر الاختراع جهازاً لتنقية وتمديد مجموعة من ‎(LIA‏ حيث يشتمل الجهاز على ترتيب واحد على الأقل من مفاعل حيوي وطور ثابت للكروماتوجراف وفقاً للجانب السادس. وفقاً لجانب ثامن؛ يوفر الاختراع كاشف تعدد وحدات يمكنه تمديد مجموعة من ‎CDAD‏ ‏حيث يكون كاشف تعدد الوحدات في صورة قابلة للذويان وبشتمل على موضع ربط واحد على 5 الأقل 21 للريط القابل للعكس لعامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى للخلاياء وحيث يكون مثبتاً على كاشف تعدد الوحدات بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) العامل الأول المذكور الذي يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا؛ وحيث يشتمل العامل الأول على شريك ارتباط واحد على الأقل ‎«C1‏ حيث يمكن لشريك الارتباط 1الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط واحد على الأقل 21 من كاشف تعدد الوحدات؛ 0 حيث يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك ‎f‏ لارتباط 1 ‎C‏ وموضع الريط 1 ‎Z‏
ووفقاً لجانب تاسع؛ يوفر الاختراع تركيبة يمكنها تمديد مجموعة من ‎(DAY‏ حيث تشتمل التركيبة على ) 1 ( كاشف تعدد وحدات ‎«Jl‏ ‏حيث يكون كاشف تعدد الوحدات الأول في صورة ‎ALE‏ للذويان ويشتمل على موضع ربط واحد على الأقل 21 للريط القابل للعكس لعامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى للخلاياء
حيث يكون مثبتاً على كاشف تعدد الوحدات الأول بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) العامل الأول المذكور الذي يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا؛ وحيث يشتمل العامل الأول على شريك ارتباط واحد على الأقل ‎«C1‏ حيث يمكن لشريك الارتباط ‎Las VIC]‏ بشكل قابل للعكس بموضع ربط واحد على الأقل 21 من كاشف تعدد الوحدات؛ حيث
0 يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك ‎f‏ لارتباط 1 ‎C‏ وموضع الريط 1 ‎Z‏ و )2( كاشف تعدد وحدات ‎(Ob‏ ‏حيث يكون كاشف تعدد الوحد ات الثاني في صورة قابلة للذويان وبشتمل على موضع ربط واحد على الأقل 22 للريط القابل للعكس لعامل ثان يحفز جزيثاً ثانوياً على سطح الخلاياء
5 وحيث يكون مثبتاً على كاشف تعدد الوحدات بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) العامل الثاني المذكور الذي يحفز جزيثاً ثانوياً على سطح الخلاياء حيث يشتمل العامل الثانى على شريك ارتباط 2)؛ حيث يمكن لشريك ‎J‏ لارتباط ‎١02‏ لارتباط بموضع ربط واحد على الأقل 22 من كاشف تعدد الوحدات؛ حيث يرتبط العامل الثاني بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ وموضع الريط ‎Z2‏
0 شرح مختصر للرسومات يتم فهم الاختراع بشكل أفضل بالإشارة إلى الوصف التفصيلي حين يوضع في الاعتبار مع الأمثلة غير الحصرية والأشكال المرفقة. توضح الأشكال نماذج لطرق الاختراع. ويدون رغبة في التقيد
بنظرية معينة؛ تضم الأشكال استنتاجات تتعلق بآلية التمدد الضمنية. يتم تقديم الاستنتاجات لأغراض توضيحية فقط وتعمل فحسب على إعطاء تصور لطريقة التمدد بشكل يمكن تنفيذه على المستوى الجزيئي. شكل 1 يمثل نموذجاً لطريقة تتم في المختبر لتمديد مجموعة من الخلايا لها مستقبل على سطح الخلية يمكن أن يؤدي ربطه بواسطة عامل أول إلى إشارة تنشيط للخلايا للتمدد. على النحو المبين في شكل 1 أ تتم ملامسة عينة تشتمل على مجموعة الخلايا (2) التي تحمل جزيء مستقبل سطحياً ‎surface receptor molecule‏ (30) مع كاشف لتعدد الوحدات ‎reagent‏ 4(071010016128100). وتكون مجموعة الخلايا (2) في خليط مع مجموعات خلايا أخرى )22( تفتقر إلى جزيء المستقبل السطحي (30). ويكون ‎Bie‏ على كاشف تعدد الوحدات 0 (4) بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) عامل أول (6) يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا. يشتمل كاشف تعدد الوحدات (4) على موضع ربط واحد على الأقل 21 (42) لربط العامل الأول بشكل قابل للعكس )6( ويشتمل العامل الأول (6) على شريك ارتباط واحد على الأقل 1© (66)؛ حيث يمكن لشريك الارتباط 1© (6 أ) الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع الربط 21 (44) من كاشف تعدد الوحدات. ‎leg‏ هذا ‎gail)‏ ¢ للتثبيت»؛ يرتبط العامل الأول (6) بكاشف تعدد الوحدات (4) من خلال 5 الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط 1© (6 أ) وموضع الربط 21 (42). في مثال مبين في شكل 1 يكون بكاشف تعدد الوحدات (4) موضع ربط ثان 22 (44) لا يستخدم في المثال الحالي. ويكون كاشف تعدد الوحدات (4) نفسه مثبتاً على حامل صلب ‎solid support‏ )10( مثل خرزة مغناطيسية» خرزة بوليمرية من سطح طبق مزرعة ‎WIS‏ أو مفاعل. يمكن أن تكون مجموعة الخلايا (2)؛ على سبيل المثال» عبارة عن مجموعة خلايا لمفية مثل مجموعة من الخلايا 8 التي يمكن تنشيطها من خلال المستقبل ‎CD40‏ (انظر؛ على سبيل المثال» ‎Carpenter et al, Journal of Translational Medicine 2009, 7:93 “Activation‏ ‎of human B cells by the agonist CD40 antibody CP-870,893 and‏ ‎.(augmentation with simultaneous toll-like receptor 9 stimulation‏ في هذه الحالة؛ يكون جزيء سطح الخلية )30( عبارة عن 6040 ويمكن أن يكون الكاشف الأول )6( 5 عبارة عن أي جزيء رابط ل 6040 يوفر إشارة التنشيط المرغوب ‎cle‏ على سبيل المثال؛ الجسم
المضاد أحادي النسيلة 893 ,00-870 أو شظية رابطة للجسم المضاد ‎Jie die‏ شظية 0 أحادية التكافؤ. وقد يكون شريك الارتباط 61 للعامل الأول (6)؛ على سبيل المثال؛ عبارة عن أي ببتيد ألفة مدمج أو مترافق؛ على سبيل ‎(JB)‏ مع الطرف © من سلسلتي عديد الببتيد ‎polypeptide‏ (السلسلة الثقيلة أو الخفيفة ‎(heavy or light chain‏ من جزيء الجسم المضاد. قد يكون شريك الارتباط 1© (6 أ)؛ على سبيل المثال» عبارة عن ببتيد رابط لاستريبتيفيدين ‎Jisstreptavidin—binding peptide‏ ببتيه ‎Trp—Ser—His—Pro-GIn-Phe-Glu-Lys‏ ‏(متوالية رقم: 01(« معروف ‎Lad‏ باسم ‎("'Strep-tag®”‏ تصف براءة الاختراع الأمريكية رقم (5؛ 506< 121( على سبيل المثال؛ أو ببتيدات رابطة لاستريبتيفيدين بها ترتيب تسلسلي من اثنين أو أكثر من الجزيئات الرابطة الفردية على النحو المبين في إصدار براءة الاختراع الدولي رقم 0 (077018/02) أو براءة الاختراع الأمريكية )7( 981 632). عند استخدام ببتيد رابط لاستريبتيفيدين كشربك ارتباط ‎(C1‏ قد يكون كاشف تعدد الوحدات (4) عبارة عن أي ميوتين استريبتيفيدين يرتبط به ببتيد استرببتيفيدين )= شربك الارتباط الأول 1© (6 أ)) بشكل قابل للعكس من خلال مواضع ربطه (بيوتين ‎(biotin‏ 21 )42( المبينة تخطيطياً في شكل 1. وقد يكون كاشف تعدد الوحدات هذا عبارة عن ميوتين استريبتيفيدين ‎streptavidin mutein‏ (نظير) 5 يشتمل على متوالية الأحماض الأمينية ‎Val44-Thr45-Alad6-Argd7‏ (متوالية رقم: 02( في مواضع المتواليات 44 إلى 47 من النوع غير المعالج من استريبتيفيدين أو ميوتين استريبتيفيدين (نظير) يشتمل على متوالية الأحماض الأمينية ‎lled4-Gly45-Alad6-Argd7‏ ‏(متوالية رقم: 03) في مواضع المتواليات 44 إلى 47 من النوع غير المعالج من استريبتيفيدين 00 م ويتم وصف كل منهما في براءة الاختراع الأمريكية رقم )6 103 493)؛ على 0 سيل المثال» ويتاحان تجارياً بالعلامة التجارية ©18000-م506. في المثال الوارد في شكل 1؛ قد يضم كاشف تعدد الوحدات (4) أيضاً كالموديولين ‎calmodulin‏ متعدد الوحدات أو إنزيم جلوتاثيون-5-ترانسفيراز ‎glutathione—S—transferase‏ ¢ حيث يكون كل منهما روابط قابلة للعكسمع الببتيدات الرابطة لكالموديولين أو جلوتاثيون. على هذا النحو؛ يمكن أن يتكون موضع ربط 22 (44) بكالموديولين أو إنزيم جلوتاثيون -9-ترنسفيراز . ويمكن تحضير هذا المترافق 5 البروتيني على سبيل ‎JB)‏ من كالموديولين مع ميوتين استريبتيفيدين بكيمياء البروتينات العيارية؛ على سبيل المثال؛ بالروابط ثنائية الوظيفة ‎bifunctional linkers‏
على النحو المبين في شكل 1 ب؛ بعد ملامسة مجموعة الخلايا (2) مع كاشف تعدد الوحدات (4) وفي المعتاد احتضان مجموعة الخلايا مع كاشف تعدد الوحدات (4)؛ تكوّن مجموعة الخلايا (2) معقدات/ترتبط بعامل تعدد الوحدات من خلال العامل الأول (6). يرتبط عامل أول نوعياً بجزيء مستقبل سطح الخلية ‎Jie‏ 6040 في المثال الحالي ويوفر إشارة تنشيط لتمدد ‎All‏ على سبيل المثال خلايا 8. لا ترتبط مجموعات الخلايا الأخرى (22) الموجودة في العينة المبدئية التي
تفتقر إلى جزيء سطح الخلية النوعي (30) بكاشف تعدد الوحدات. في هذا الجانب؛ من الملاحظ أن مجموعة الخلايا (2) عادة يكون بها نسخ متعددة من جزيء سطح الخلية (30) على سطحها ويكون ربط هذه النسخ المتعددة مطلوياً نمطياً للتنتشيط. على هذا النحوء يوفر عامل تعدد الوحدات (4) نمطياً أكثر من موضع ربط 21 حتى يمكن ربط العوامل الأولى المتعددة (6) بشكل قابل
0 لللعكس لتحقيق "تعدد ‎"clang‏ العامل الأول؛ أي توفير العامل الأول في كثافة كافية لمجموعة الخلايا )2( (غير ‎dull‏ في المخطط الوارد في شكل1). في هذا الجانب؛ من الملاحظ أن يكون لعامل تعدد الوحدات بحسب الاستخدام في الطلب الحالي مواضع ربط 21 متعددة؛ على سبيل المثال» يكون لميوتين استريبتيفيدين (لكونه عبارة عن تترامير متجانس) في حالته الأصلية أربع مواضع ربط 21. ومع ذلك يمكن أن يقوم كاشف تعدد الوحدات على أساس مركب به على هذا
5 النحو موضع ربط 21 واحد فقط للريط القابل للعكس لشريك الارتباط 1©. هذا المثال هو كالموديولين متعدد الوحدات. ويهذا يكون بكالموديولين موضع ربط واحد فقط للببتيدات الرابطة لكالموديولين. ومع ذلك؛ يمكن ‎dallas‏ كالموديولين ببيوتين ثم يتفاعل مع أوليجومرات استريبتيفيدين (انظر أدناه أيضاً)؛ وبالتالي توفير كاشف تعدد وحدات تكون فيه جزيئات كالموديولين متعددة بكثافة عالية على 'سلسلة متجاورة"؛ وبالتالي يتم توفير توفير كالموديولين متعدد الوحدات.
0 على النحو المبين في شكل 1 ج؛ بعد الاحتضان (الذي يتم في المعتاد على مدى فترة زمنية مناسبة لتحقيق تمدد مجموعة الخلايا المرغوب فيها) يتم قطع الارتباط بين شربك الارتباط ‎Cl‏ ‏)16( للعامل الأول (6) وموضع ربط 21 لكاشف تعدد الوحدات (4) بقطع الرابطة القابلة للعكس المقابلة. ‎(Sarg‏ القطع بإضافة منافس لخليط الاحتضان/ التفاعل المحتوي على مجموعة الخلايا (2) التي يتم ريطها بكاشف تعدد الوحدات. للقطع التنافسي (والذي ‎(Say‏ فهمه باعتباره تصفية
5 تتابعية تنافسية) للرابطة القابلة للعكس بين شريك الارتباط 1© (6 أ) للعامل الأول وموضع ربط
1 ) لكاشف تعدد الوحدات؛ يمكن ملامسة خليط/مجموعة ‎WIA‏ الاحتضان مع شريك ارتباط حر أول ‎CL‏ )20( أو نظير لشريك الارتباط الأول المذكور© يمكنه قطع الرابطة بين شربك الارتباط الأول 1© (6 أ) وموضع الربط 21 (22). وفي المثال الذي يكون فيه شريك الارتباط 01عبارة عن ببتيد رابط لاستريبتيفيدين يرتبط بموضع ربط البيوتين من استريبتيفيدين» يمكن أن يكون الشريك الحر الأول ‎CL‏ (20) هو الببتيد الحر المناظر الرابط لاستريبتيفيدين أو نظير يرتبط تنافسياً. ويمكن أن يكون هذا النظير؛ على سبيل المثال؛ عبارة عن بيوتين أو مشتق بيوتين مثل ديس ‎off‏ بيوتين 065116051011 . على النحو المبين في شكل 1 ‎a‏ تؤدي إضافة الشريك الحر الأول (20) أو نظيره إلى إزاحة شريك الارتباط ‎C1‏ )16( من كاشف تعدد الوحدات (4) ومن ثم؛ لوجود شريك الارتباط 1© في 0 العامل الأول (6)؛ إزاحة العامل الأول )6( من كاشف تعدد الوحدات (4). تؤدي إزاحة العامل الأول (6) هذه بدورها إلى تفكك العامل الأول )6( من مستقبل سطح الخلية )30( خصوصاً إذا كان لألفة ريط الرابطة بين العامل الأول ومستقبل سطح الخلية (30) ثابت تفكك ‎dissociation‏ ‎constant‏ (>ا) بين 2-10 مولار و13-10 مولار ويكون على هذا النحو قابلاً للعكس أيضاً. ونتيجة لهذا التفكك؛ يتم أيضاً إنهاء تحفيز مجموعة الخلايا (2). على هذا النحوء يوفر الاختراع 5 الحالي ميزة إمكانية التحكم في الفترة الزمنية لتحفيز أو تمدد مجموعة الخلايا بدقة ومن ثم يمكن التحكم في الحالة الوظيفية لمجموعة الخلايا عن كثب أيضاً. في هذا السياق» من الملاحظ أن ألفة ارتباط جزيئات الجسم المضاد بالنسبة لمولّد ضدهاء بما في ذلك على سبيل المثال» مستقبل جزيء سطح الخلية ‎Jie‏ 6040 في هذا ‎sale (Jl)‏ تكون في نطاق ألفة ‎Kd‏ عبارة عن 7-10 مولار إلى 1013-10 . على هذا النحو؛ يمكن استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة التقليدية كعامل 0 أول (وكذلك بطبيعة الحال العامل الثاني على النحو المبين أدناه) في الاختراع الحالي. ولتفادي أية آثار شره غير مرغوب فيها تؤدي إلى ارتباط أقوى؛ يمكن استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة في صورة شظايا أجسام مضادة أحادية النسيلة منها ‎(Jie‏ الشظايا ‎Fab‏ أو ‎Fv Las‏ أحادية السلسلة ‎single chain Fv fragments‏ . بالإضافة إلى ذلك» نظراً لتفكك العامل الأول من جزيء سطح الخلية )30( يتسم الاختراع الحالي 5 بميزة مضافة تتمثل في أن مجموعة ‎LIAN‏ المحفزة تكون خالية من العوامل المحفزة في نهاية فترة
التحفيز وأنه يمكن إزالة كافة الكواشف الأخرى المستخدمة في الطريقة؛ تحديداً العامل الأول (6) وكذلك الشربك الأول الحر ‎(20)free first partner‏ من شربك الارتباط ‎C1‏ أو نظيره بسهولة من مجموعة الخلايا المحفزة (2) من خلال "خرطوشة إزالة" يصفها طلب براءة الاختراع الدولي رقم (124474/2013) بينما يتم الاحتفاظ بكاشف تعدد الوحدات (4) المثبت على حامل صلب مثل سطح مفاعل حيوي أو خرزة مغناطيسية ‎.magnetic bead‏ على هذا النحو» بالعودة إلى إزالة
العامل الحر ‎free agent‏ )6( والشريك الأول الحر )20( وفقاً لوصف "خرطوشة الإزالة ‎removal cartridge‏ " في طلب براءة الاختراع الدولي رقم (124474/2013) (ارجع إلى شكل 4منه؛ على سبيل المثال)؛ يمكن تحميل العينة التي يتم الحصول عليها في شكل 1 د في الطلب الحالي على عمود الكروماتوجراف الثاني في طلب براءة الاختراع الدولي رقم
0 (124474/2013). لعمود الكروماتوجراف ‎chromatography column‏ هذا ‎cul sha‏ مناسب يمثل مصفوفة كروماتوجراف ألفة و» في نفس الوقت؛ يمكن أن يعمل كمصفوفة نفاذية للجل ‎gel permeation matrix‏ . تضم مصفوفة كروماتوجراف كاشفا ألفة مثبتاً عليها. ‎Sag‏ ‏أن يكون كاشف ‎Aa)‏ في حالة المثال الحاضر؛ على سبيل المثال؛ عبارة عن استريبتيفيدين ‎«streptavidin‏ ميوتين استريبتيفيدين ‎streptavidin mutein‏ ¢ أفيدين ‎avidin‏ ¢ ميوتين
5 أفيدين ‎avidin mutein‏ أو خليط منها. يرتبط العامل الأول (6)؛ الشربك الأول الحر (20) من شربك الارتباط 61 (والمعروف أيضاً باسم 'كاشف التنافس” في الطلب الحالي) بكاشف ‎AY)‏ ‏وبالتالي المثبت على مصفوفة الكروماتوجراف. ونتيجة لذلك يتم استنفاد عينة التصفيى التتابعية المحتوية على مجموعة الخلايا المعزولة الممدة (2) من العامل الأول (6) وكاشف التنافس (20). الآن تصبح مجموعة ‎WAY‏ الممددة (2)؛ التي تم إخلاؤها من أية متفاعلات؛ في حالة تتيح
0 المزيد من الاستخدام؛ على سبيل المثال؛ في التطبيقات التشخيصية (على سبيل المثال؛ المزيد من فرز ‎(FACSTM‏ أو في أي تطبيق علاجي قائم على أساس الخلايا. يظهر شكل 2 نموذجاً آخر لطريقة التمدد الواردة في الاختراع. على النحو المبين في شكل 2 أ عينة تشتمل على مجموعة من الخلايا (2) التي تحمل جزيئين نوعيين على سطح الخلية (30) و(32). يشترك جزيء سطح الخلية (30) في إشارة تنشيط أولى إلى مجموعة ‎(WAY‏ بينما يكون
5 جزيء سطح الخلية )32( عبارة عن جزيء ثانوي على سطح الخلية يشترك في توفير محفز
للخلايا. قد تكون مجموعة ‎(DIAN‏ على سبيل المثال؛ عبارة عن مجموعة خلايا آ ‎led‏ يكون جزيء سطح الخلية )30( عبارة عن معقد 1014/0003 ويكون جزيء سطح الخلية (32) هو الجزيء الثانوي ‎.CD28‏ يعتبر ربط معقد ‎TCR/CD3‏ كإشارة تنشيط أولى و 0028كمحفز مشترك ‎Lg pin‏ لتمدد/تكاثر خلايا 1. وتكون مجموعة خلايا ‎T‏ (2) في خليط مع مجموعات
خلايا أخرى (22) تفتقر إلى جزئيات المستقبلات السطحية (30) و(32). كذلك في النموذج الحالي؛ تتم ملامسة مجموعة ‎WAY‏ (2) مع كاشف لتعدد الوحدات (4). ويكون مثبتاً على كاشف تعدد الوحدات (4) بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) عامل أول (6) يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا. بالإضافة إلى ذلك؛ يكون مثبتاً على عامل تعدد الوحدات بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) عامل ثان (8) يحفز ‎CD28‏ كجزيء ثانوي على سطح الخلايا.
0 يشتمل كاشف تعدد الوحدات (4) على موضع ربط واحد على الأقل 21 (42) لربط العامل الأول بشكل قابل للعكس (6) وبشتمل العامل الأول (6) على شربك ارتباط واحد على الأقل ‎C1‏ (6 أ)؛ حيث يمكن لشريك الارتباط 1© (6 أ) الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع الربط 21 (44) من كاشف تعدد الوحدات. على هذا النحوء للتثبيت؛ يتم ربط العامل الأول (6) بكاشف تعدد الوحدات )4( من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شربك الارتباط1© (6 أ) وموضع ربط 271
5 (42). بالإضافة إلى ذلك؛ في المثال الموضح في شكل 2؛ يشتمل العامل الثاني (8) على شريك ارتباط ‎C2‏ (8 أ)» حيث يمكن لشربك الارتباط ‎C2‏ الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع الربط ‎Z2‏ ‏)44( من كاشف تعدد الوحدات (4). ويرتبط العامل الثاني (8) بكاشف تعدد الوحدات (4) من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ (8 أ) وموضع الربط 22 (44). في هذا المثال؛ قد يكون العامل الأول )6( جسماً مضاداً ل 603 أحادي النسيلة أو شظية رابطة لمولّد
0 الضد منه مثل شظية ‎Fab‏ قد يكون العامل الثاني )8( عبارة عن جسم ‎alias‏ ل ‎CD28‏ أحادي النسيلة أو شظية رابطة ‎algal‏ الضد ‎Jie aie‏ شظية 85.وقد يكون شربك الارتباط الأول (6 أ) عبارة عن ببتيد رابط لاستريبتيفيدين (6 أ) مدمج أو مترافق مع الجسم المضاد ل 603 أو شظية من الجسم المضاد ل ‎.CD3‏ وقد يكون شريك الارتباط الثاني (8 أ) عبارة عن ببتيد ريط كالموديولين مترافق أو مدمج أيضاً مع الجسم المضاد ل 6028 أو شظية رابطة للجسم المضاد ل
5 028. في هذا السياق؛ يلاحظ أن الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة؛ على سبيل المثال؛ ل
3 أو 6028 تعتبر معروفة جيداً ‎hail)‏ على سبيل المثال» براءة الاختراع الأمريكية رقم (6؛ 352 694( أو براءة الاختراع الأوروبية رقم )0 700 430 1)) المبينة أعلاه) وتتاحان تجارياً من موردين متعددين مثتل ‎Life «(Santa Cruz, CA, USA) Santa Cruz Biotechnology‏ ‎San Jose, CA, ) BD Biosciences «(Carlsbad, CA, USA) «Technologies‏ ذلا ‎(San Diego, CA, USA) Biolegend‏ أو ‎Bergisch Miltenyi Biotec‏ ‎(Gladbach, Germany‏ على سبيل المثال لا الحصر. وبالتالي؛ يمكن استخدام هذه الأجسام المضادة أحادية النسيلة كعامل أول وثان ويمكن إقرانه (إرفاقه)؛ على سبيل المثال» كيميائياً بشريك ارتباط 1© أو ‎.C2‏ بشكل بديل؛ يمكن أيضاً استنساخ جينات النطاقات المتغيرة من سلالة الخلايا الورمية الهجينة أو استخدام جسم مضاد متوالية الأحماض الأمينية به معروفة وتنتج شظية جسم 0 مضاد مقابلة ‎Jie‏ شظية ‎Fab‏ أو ‎FV‏ بمعاودة الارتباط الجيني. عند استخدام هذه الطريقة على ‎sal‏ المبين في الطلب الحالي في قسم أمثلة سلالة الخلايا الورمية الهجينة 013( ‎ATCC®‏ ‎<CRL-8001™‏ المبينة في براءة الاختراع الأمريكية (4؛ 361 549) والتي تنتج جسماً مضاداً 003 أحادي النسيلة) والجسم المضاد 28.3 المضاد ل ‎CD28‏ الذي يتم وصفه بواسطة ‎Vanhove et al, BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570‏ ‎«and GenBank accession number AF451974.1 5‏ يتم إظهار شريكي الارتباط ‎C1‏ و ‎(AIC2‏ يتم توفيرهما بشكل ملائم بناقل التعبير المقابل المستخدم في الإنتاج بمعاودة الارتباط الجيني حتى تحمل شظية الجسم المضاد شريك الارتباط 1© أو 62 كببتيد اندماج كطرف © من السلسلة الخفيفة أو الثقيلة (في هذا السياق؛ متوالية الأحماض الأمينية من النطاق المتغير بالسلسلة الثقيلة والتطاق المتغير من السلسلة الخفيفة من الجسم المضاد ‎OKT3‏ على النحو الذي يتم وصفه 0 في (1996) 657-662 ,120 ‎Biochem.‏ .ل ‎Arakawa et al‏ لأغراض التوضيح بالمتواليتين رقمي 17 و18 وفي قوائم المتواليات المرفقة؛ بينما يتم إظهار متوالية الأحماض الأمينية من النطاق المتغير في الجسم المضاد 28.3 المضاد ل 0028 الذي يتم وصفه بواسطة ‎Vanhove et al‏ أعلاه؛ كمتوالية رقم 19 ‎(VH)S‏ و 20 ‎(VL)‏ في قوائم المتواليات المرفقة). كذلك تعتبر هذه الطريقة لاستنساخ النطاقات المتغيرة من جزيء جسم مضاد وإنتاج شظبة جسم 5 مضاد ‎Allie‏ بمعاودة الارتباط الجيني معروفة جيداً لمن يتمتع بالمهارة في المجال؛ انظر على سبيل المثال» ‎Skerra, A. (1994) A general vector, pASK84, for cloning,‏
‎production, and single-step‏ (08016118التنقية ‎of antibody Fab fragments.‏ ‎Gene 141, 79-84, or Skerra, A. (1993) Bacterial expression of‏ ‎.immunoglobulin fragments.
Curr Opin Immunol. 5, 256-562)‏ أخيراً؛» يمكن أيضاً توليد جزيئات جسم مضاد من جزيئات ربط صناعية بخصائص شبيهة بالجسم المضاد ضد هدف معين مثل ‎CD3‏ أو 0028كما في المثال الوارد في شكل 2 بطرق التطوير المعروفة جيداً مثل عرض الملتهم (يمكن الاطلاع عليه على سبيل المثال» في )1996( ‎Kay, B.K. etal.‏ ‎Phage Display of Peptides and Proteins — A Laboratory Manual, 1st Ed.,‏ ‎Academic Press, New York NY; Lowman, H.B. (1997) Annu.
Rev.‏ ‎Biophys.
Biomol.
Struct. 26, 401-424, or Rodi, D.J., and Makowski, L.‏ ‎Curr.
Opin.
Biotechnol. 10, 87-93 0‏ )1999( عرض الريبوسوم (يمكن الاطلاع عليه في 400-405 ,12 ‎(Amstutz, P. et al. (2001) Curr.
Opin.
Biotechnol.‏ أو عرض ‎mRNA‏ على النحو المسجّل في ‎Wilson, D.S. et al. (2001) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.‏ ‎USA 98, 3750-3755‏ في حالة المثال المبين في شكل 2 يضم كاشف تعدد الوحدات (4)موضعي ربط ‎Z1‏ )42( و 5 44(22) مختلفين. حين يكون شربك الارتباط ‎CL‏ )16( عبارة عن ببتيد رابط لاستريبتيفيدين» يتم توفير موضع ‎Z1 Lal)‏ (42) من كاشف تعدد الوحدات )4( بميوتين استريبتيفيدين مناسب يرتبط به ببتيد استريبتيفيدين (6 أ) بشكل قابل للعكس. ولأن 02 الرابط عبارة عن ببتيد رابط لكالموديولين» يتم توفير موضع الريبط 22 (44) من كاشف تعدد الوحدات (4) بكالموديولين متعدد الوحدات. ‎(Sag‏ أن يكون كاشف تعدد الوحدات (4) جزيثاً أحادياً» على سبيل المثال مترافقاً من 0 كالموديولين متعدد الوحدات مع استريبتيفيدين (يتم استخدام هذا البديل في المعتاد في حالة تعدد الوحدات بشكل قابل للذويان) أو يمكن أن يتكون أيضاً من جزيئين مستقلين. يفضل الخيار الأخير حين يكون كاشف تعدد الوحدات (44) ‎Tie‏ على ‎dela‏ صلب على النحو المبين في شكل 2. في هذه الحالة؛ يمكن وضع خليط من ميوتين استريبتيفيدين وكالموديولين كغلاف (تثبيته) على الحامل الصلب؛ على سبيل المثال؛ بنسبة مولارية 1:1 فيما يتعلق بموضعي ‎ball‏ 21و22 . في هذا 5 السياق؛ يلاحظ أنه؛ نظراً لتثبيت كالموديولين على سطح الحامل الصلب؛ لا تكون هناك ‎dala‏
لتحضير كالموديولين متعدد الوحدات على النحو المبين أعلاه لكن يكون تثبيت كالموديولين على السطح كافياً لتوفير كالموديولين (به؛ على النحو المبين أعلاه. موضع ربط واحد فقط للببتيدات الرابطة لكالموديولين؛ بكثافة عالية بالقدر الكافي لضمان ريط مجموعة الخلايا (2). على سبيل ‎(Jal‏ في هذه الحالة؛ يمكن استخدام شظية جسم مضاد ثنائية التكافؤ بها موضعا ربط ضد 0028 أو جسم مضاد سليم به في حد ذاته موضعا ربط متطابقان ككاشف ثان (8).
على النحو المبين في شكل 2 ب؛ بعد ملامسة مجموعة خلايا ‎T‏ (2) مع كاشف تعدد الوحدات )4( وفي المعتاد احتضان مجموعة الخلايا مع كاشف تعدد الوحدات (4)؛ تكوّن مجموعة خلايا 1 (2) معقدات / ترتبط بعامل تعدد الوحدات من خلال العامل الأول (6) والعامل الثاني (8). يرتبط ‎Jalal‏ الأول (6) والعامل الثاني )8( نوعياً بالمعقد ‎TCR/CD3‏ والجزيء الثانوي ‎CD28‏ ؛
‎July 0‏ يتم حث خلايا آ على التكاثر / التمدد. على النحو المبين في شكل 2 ج؛ بعد الاحتضان (الذي يتم في المعتاد على مدى فترة زمنية مناسبة لتحقيق تمدد مجموعة الخلايا المرغوب فيها) يتم قطع الارتباط بين شربك الارتباط ‎C1‏ (6 أ) من العامل الأول (6) وموضع الربط 21 من كاشف تعدد الوحدات (4) بقطع الرابطة القابلة للعكس المقابلة. بالمثل» يتم قطع الارتباط بين شريك الارتباط ‎C2‏ (8 أ) من العامل الثاني (8)
‏5 وموضع الربط 22 من كاشف تعدد الوحدات )4( بقطع الرابطة القابلة للعكس المقابلة. ‎(Sang‏ قطع الرابطة القابلة للعكس بين شريك الارتباط 1© (6 أ) من العامل الأول )6( وموضع ‎Lal‏ 21 ببيوتين (يعمل كنظير (20) للشربك الأول الحر) بينما الرابطة القابلة للعكس بين يمكن ربط شريك الارتباط ‎C2‏ (8 أ) من العامل الأول (8) وموضع الربط ‎Z2‏ بإضافة عامل خلب فلزي ‎dele)‏ ‏خلب كالسيوم) مثل ‎EDTA‏ أو ‎(Sa) EGTA‏ كنظير (20) للشربك الثاني الحر) لأن ريط
‏0 كالموديولين بالببتيدات الرابطة لكالموديولين يعتمد على أيون الكالسيوم (+082)). يعني هذا بطبيعة الحال أن ملامسة مجموعة الخلايا (2) تتم في محلول منظّم يحتوي على +082. على النحو المبين في شكل 2 د؛ تؤدي إضافة نظير (20) الشريك الحر الأول والشريك الحر الثاني» على الترتيب إلى ‎dal)‏ شريكي الارتباط 1© (6 أ) ‎C25‏ )18( من كاشف تعدد الوحدات (4) ومن ثم إزاحة العامل الأول (6) والعامل الثاني (8) من كاشف تعدد الوحدات (4). تؤدي
‏5 إناحة العامل الأول )6( والعامل الثان (8) هذه بدورها إلى تفكك العامل الأول (6) والعامل الثاني
)8( من معقد ‎TCR/CD3‏ والجزيء الثانوي ‎«CD28‏ وبالتالي إنهاء تحفيز / تمدد مجموعة الخلايا (2). على هذا ‎sail)‏ كما هو مبين أعلاه» يوفر الاختراع الحاليميزة التحكم في الفترة الزمنية لتحفيز أو تمدد مجموعة خلايا آبدقة ومن ثم يمكن أيضاً التحكم في الحالة الوظيفية لمجموعة الخلايا ‎T‏ عن كثب. بعد التصفية التتابعية للخلايا على النحو المبين في شكل 1 د؛
يمكن إزالة العامل الأول (6)؛ الكاشف الثاني (8) وكذلك نظير (20) الشريك الأول الحر من شربك الارتباط ‎C1‏ والشريك الثاني ‎all‏ من شريك الارتباط ‎C2‏ بسهولة من مجموعة الخلايا المحفزة )2( من خلال "خرطوشة الإزالة" التي يتم وصفها في طلب براءة الاختراع الدولي رقم (2013/ 124474). بالإضافة إلى ذلك؛ وبشكل هام؛ في الحالة التي كانت فيها العينة المبدئية عبارة عن مجموعة من الخلايا ‎alll‏ على سبيل المثال» في صورة ‎PMBCS‏ تم الحصول
0 عليها من تدرج ‎(Ficoll‏ تتاح مجموعة الخلايا ‎T‏ (2) حالياً للتمدد التسلسلي على النحو المبين في الطلب الحالي. ولأنه يمكن إصابة مجموعة الخلايا الممدة (على سبيل المثال بتحفيز مبدئي من خلال ‎(CD28/CD3‏ بالعدوى أثناء التمدد على سبيل المثال بمستقبل خلية ‎(TCR) T‏ أو مستقبل ‎de‏ ضد خيمري (0/8؛ معروف أيضاً بمستقبل خلايا 7 صناعي)؛ يمكن بعد ذلك تحرير الخلايا المعذّلة وراثياً من المحفّز المبدئي وتحفيزها بعد ذلك بنوع ثان من المحفّزات؛ على سبيل
5 المثال من خلال المستقبل المدخل حديثاً. ‎(Say‏ أن تشتمل هذه المحفزات الثانية على محفز ‎Age‏ ‏للضد في صورة جزيء ‎(MHC aii‏ المركب الترابطي المتجانس (للريط التشابكي) من المستقبل المدخل وراثياً (على سبيل المثال مركب ترابطي طبيعي من ‎(CAR‏ أو أي مركب ترابطي ‎Jie)‏ ‏جسم مضاد) يرتبط بشكل مباشر في إطار المستقبل الجديد (على سبيل المثال بالتعرف على مناطق ثابتة في المستقبل). على هذا النحو؛ يمكن استخدام مجموعة خلايا آ التي تم الحصول
0 عليها من هذا التمدد التسلسلي لنقل الخلايا المعمول به. شكل 3 يظهر نموذجاً آخر لطريقة تمدد واردة في الاختراع. كذلك تشتمل العينة المستخدمة في المثال الحالي على مجموعة من خلايا آ(2) تحمل جزيئي أسطح خلايا معيئين (30) و (32)؛ بحيث يكون جزيء سطح الخلية )30( عبارة عن معقد 105/603 ويكون جزيء سطح الخلية )32( هو الجزيء الثانوي 0028. في شكل 3 أ يتم إظهار مجموعة من الخلايا ‎T‏ (2) بعد
5 الملامسة مع كاشف تعدد الوحدات (4). كذلك في المثال الحالي؛ يكون مثبتاً على كاشف تعدد
الوحدات (4) بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) كعامل أول )6( جسم مضاد ل 003 أو شظية رابطة ‎algal‏ الضد منه توفر إشارة تنشيط أولى لخلايا ‎T‏ وكعامل ثان )8( جسم مضاد ل ‎CD28‏ ‏أو شظية رابطة ‎Agel‏ الضد ‎die‏ تحفز 0028 كجزيء ثانوي. يشتمل كاشف تعدد الوحدات (4) المبين في المثال الوارد في شكل 3 على نوع واحد فقط من موضع الربط 21 (42) للريط القابل للعكس لكل من العامل الأول (6) والعامل الثاني (8). ويشتمل كل من العامل الأول (6) والعامل الثاني (8) على شريك ارتباط واحد على الأقل ‎Cl‏ ‏(© أ 8 أ)» حيث يمكن لكل من شريك الارتباط ‎C1‏ (6 أ) وشريك الارتباط (8 أ) الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع الربط 21 (44) من كاشف تعدد الوحدات. على هذا النحوء للتثبيت»؛ يرتبط العامل الأول (6) والعامل الثاني (8)؛ على الترتيب بكاشف تعدد الوحدات (4) من خلال الرابطة 0 القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط 1© )16( وشريك الارتباط ‎C2‏ وموضع الربط 21 (42). يمكن أن يكون شريكا الارتباط ‎C2 5 C1‏ مختلفين أو متطابقين. على سبيل المثال» يمكن أن يكون شربك الارتباط ‎C1‏ عبارة عن ببتيد رابط لاستريبتيفيدين المتواليات ‎Trp—Ser—His—‏ ‎4ilsic))Pro-GIn-Phe-Glu-Lys‏ رقم: 01)؛ ‎("Strep-tag®'‏ بينما يمكن أن يكون شريك الارتباط ‎C2‏ هو الببتيد الرابط لاستريبتيفيدين من المتوالية ‎Trp—Ser-His—Pro-GIn—-Phe—‏ ‎Glu-Lys—(GlyGlyGlySer)3-Trp—Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys 5‏ ((متوالية رقم: 04)؛ المعروف أيضاً باسم ‎(('di-tag3"‏ أو من المتوائية ‎Trp—Ser—-His—Pro-GIn—-‏ ‎Phe-Glu-Lys—(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His—Pro-GIn-Phe-Glu-Lys‏ ‏((متوالية رقم: 05(« والمعروف أيضاً باسم "01-1892 ‎¢('the‏ التي يتم وصفها بواسطة ‎Junttila‏ ‎et al., Proteomics 5 (2005), 1199-3‏ أو براءة الاختراع الأمريكية رقم (7 981؛ 0 632). ترتبط كافة هذه الببتيدات الرابطة لاستريبتيفيدين بنفس موضع الربط تحديداً موضع ربط البيوتين من استريبتيفيدين. في حالة استخدام واحد أو أكثر من هذه الببتيدات الرابطة لاستريبتيفيدين كشريكي الارتباط ‎«C25 C1‏ يكون كاشف تعدد الوحدات (4) عبارة عن ميوتين استريبتيفيدين. على النحو المبين في شكل 3؛ يتم استخدام كاشف لتعدد الوحدات قابل للذويان (4). في ‎dlls‏ ميوتين استريبتيفيدين» قد يكون كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان هذاء على سبيل 5 المثال» عبارة عن أوليجومر أو بوليمر من استريبتيفيدين أو أفيدين أو أي ميوتين (نظير)
لاستريبتيفيدين أو أفيدين. وقد يشتمل الأوليجومر على ثلاثة أو ‎ST‏ من المونومرات من استريبتيفيدين؛ أفيدين أو ميوتين منها. وقد يرتبط الأوليجومر أو البوليمر تشابكياً بعديد سكريد. ‎(Sag‏ تحضير هذه الأوليجومرات أو البوليمرات من استريبتيفيدين أو أفيدين أو ميوتينات من استريبتيفيدين أو أفيدين في خطوة أولى بإدخال وحدات الكريوكسيل البنائية في عديد سكريد؛ على ‎Jus 5‏ المثال ديكستران» بشكل أساسي كالذي يتم وصفه في " ‎Noguchi, A., Takahashi, 1.٠‏ ‎Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M. & Sezaki, H.‏ ‎Preparation and properties of the immunoconjugate composed of‏ .)1992( ‎anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran‏ ‎"conjugate.
Bioconjugate Chemistry 3,132-137‏ في خطوة ثانية؛ يتم إقران 0 استريبتيفيدين أو أفيدين أو ميوتيناتها من خلال مجموعات أمينية أولية من ‎Bang‏ لايسين بنائية داخلية و/ أو الطرف للا الحر لمجموعات الكربوكسيل في السلسلة الرئيسية للديكستران بكيمياء كربودايميد التقليدية. بشكل بديل؛ يمكن أيضاً الحصول على أوليجومرات أو بوليمرات مرتبطة تشابكياً من استريبتيفيدين أو أفيدين أو أي ميوتين من استريبتيفيدين أو أفيدين بالريط التشابكي من خلال روابط ثنائية الوظيفة ‎(ie‏ جلوتار داي ألديهايد أو بالطرق الأخرى التي يتم وصفها في المراجع. باستخدامها كشركاء ارتباط 1© ‎(C25‏ تتميز الشقوق التي ترتبط بنفس موضع الربط (42) من عامل تعدد الوحدات بأنه؛ على النحو المبين في شكل 3 ب؛ يمكن استخدام نفس الشريك الحر (من شريك الارتباط الأول 1© وكذلك شريك الارتباط الثاني 02) أو نظير لها في إنهاء تمدد مجموعة الخلايا ‎T‏ )2( وإطلاق مجموعة الخلايا ‎T‏ (2) تلك من عامل تعدد الوحدات. في المثال 0 الوارد في شكل 3؛ ويمكن استخدام نظير الشريكين الأول والثاني 1© و62 ‎Jie‏ البيوتين أو مشتق بيوتين (إيمينو بيوتين أو ديس ثيو بيوتين) في إنهاء تمدد مجموعة الخلايا ‎T‏ (2) وتصفيتها التتابعية. على النحو المبين في شكل 3 ج؛ بعد التصفية التتابعية للخلايا على النحو المبين في شكل 1 د؛ يمكن بسهولة إزالة العامل الأول (6)؛ الكاشف الثاني (8) وكذلك البيوتين كنظير (20) للشريك 5 الأول ‎all‏ من شريك الارتباط 1© والشريك الثاني ‎all‏ من شريك الارتباط 02 من مجموعة
الخلايا المحفزة (2) عبر "خرطوشة الإزالة" التي يتم وصفها في طلب براءة الاختراع الدولي رقم 3 . بالإضافة إلى ذلك؛ يتميز نموذج استخدام كاشف تعدد وحدات قابل للذويان (4) بميزة اخرى تتمثل في القدرة على تفادي أي حامل صلب مثل الخرزات المغناطيسية. يعني هذا أنه لا يوجد احتمال بتلوث خلايا 1 المنشطة بهذه الخرزات المغناطيسية. يعني هذا أيضاً أن عملية متوافقة مع معايير ‎GMP‏ يمكن إرساؤها بسهولة أكبر مقارنة بالطريقة المعروفة ‎io‏ ‏استخدام ‎Dynabeads®‏ وفيه ينبغي اتخاذ إجراءات إضافية لضمان أن تكون مجموعة ‎T WA‏ النهائية الممدة خالية من الخرزات المغناطيسية. علاوة على ذلك؛ يتيح استخدام عامل تعدد وحدات قابل للذويان بسهولة أكبر بكثير إزالته من مجموعة الخلايا المنشطة (خلايا خلايا 7 8 أو الخلايا القاتلة الطبيعية أيضاً) لأن الخلايا يمكن أن تترسب ببساطة بالطرد المركزي ويمكن التخلص من 0 المادة الطافية بما في ذلك عامل تعدد الوحدات القابل للذويان. بشكل بديل؛ يمكن إزالة عامل تعدد الوحدات القابل للذويان من مجموعة الخلايا الممدة في مصفوفة نفاذيات الجل من خرطوشة الإزالة الواردة في طلب براءة الاختراع الدولي رقم (2013/ 124474). لعدم وجود طور صلب (على سبيل المثال خرزات مغناطيسية)؛ كذلك يوفر الاختراع الحالي نظاماً مغلقاً آلياً لتمدد الخلايا يمكن دمجه في أنظمة تمدد الخلايا المعروفة مثل ‎Xuri Cell Expansion System W25‏ ‎(WAVE Bioreactor 2/10 System 5‏ المتاحين من 168110856 ‎Little ) GE‏ ‎Quantum® Cell Expansion i (Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdom‏ ‎«System‏ المتاح من ‎.(Lakewood, CO, USA)TerumoBCT Inc.‏ شكل 4 يظهر نتائج تجرية فيها تم تكبير الخلايا المستجيبة ‎T‏ +0103 بعد التحفيز في المختبر بشظايا 00003 و ‎Fab‏ 000028 التي تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على خرزات مغلفة بميوتين 0 استريبتيفيدين ‎Strep-tactin®‏ يمثل شكل 4 أ في مخطط نسيجي يبين التوزيع الحجمي (المشيّت الأمامي) للخلايا المحفزة؛ يمثل شكل 4 ب مخططات نسيجية تمثل درجة التكاثر وفقاً لعدد الخلايا بكل قطاع خلوي مشار إليه أعلى شكل 4 ب (صفر تمثل الخلايا غير المنقسمة؛ 5 تمثل الخلايا التي مرت خلال 5 انقسامات على ‎(dV)‏ ويظهر شكل 4 ج صورة طبق المزرعة بعد 4 أيام من التحفيز.
شكل 5 يظهر نتائج تحريك الكالسيوم داخل الخلايا في خلايا ‎Jurkat‏ معلمة بالجسم المضاد 3 المضاد ل 0003 أو بشظايا ‎Fab‏ من ‎OKT3‏ متعددة الوحدات باستخدام -م506 ©8000)(يشار إليها في الطلب الحالي أيضاً باسم وحدات ‎Fab‏ المتعددة). شكل 5 أ: تم تحميل خلايا ‎Jurkat‏ بصبغ حساس للكالسيوم ‎fag INAO-1-AM‏ إطلاق الكالسيوم بحقن 00003
‎clayal)mAb 5‏ السوداء) أو وحدات ‎OKT3 Fab‏ 03©» المتعددة (المشتقة من سلالة الخلايا الأبوية ‎(OKT3‏ مع أو بدون قطع 00-بيوتين المسبق (مثلثات رمادية داكنة ودوائر رمادية خفيفة على الترتيب) مقارنة بحقن ‎PBS‏ (المثلثات البيضاء المقلوبة). مثل وضع أيونومايسين مادة مقارنة موجبة. تمت مقارنة التغيرات المرتبطة بالزمن في تركيز +082 في الخلايا بالتدفق الخلوي على أساس التغير بنسبة ‎FLOFLT‏ شكل 5 ب: تم تنشيط خلايا ‎Jurkat‏ المعلّمة بواسطة -000-1!
‏0 اال بمحفزات 00003 مختلفة كالتي يتم وصفها في 4 أ؛ 01613 : الرسم البياني العلوي ومتعدد الوحدات ‎:aCD3 Fab‏ الرسم البياني الأوسط) ويليه قطع إرسال إشارات (140<1[ث) متعدد الوحدات ‎Fab‏ 0003 بواسطة 0-بيوتين . حقن ‎PBS‏ (الرسم البياني الأسفل) واستخدم أيونومايسين كمادة مقارنة سالبة أو موجبة. تمثل البيانات ثلاث تجارب مختلفة. يظهر شكل 6 نتيجة التبقيع القابل للعكس للخلايا بواسطة متعددات الوحدات ‎CD3 OKT3‏
‎.Fab 5‏ تم تبقيع ‎PBMCs‏ المعزولة حديثاً بجسم مضاد أحادي النسيلة (المنحنى النقطي الأيسر؛ النسيلة الأبوية لمتعددات الوحدات ‎(Fab‏ أو متعددات الوحدات ‎Fab‏ المعلّمة بواسطة ‎PE‏ ‏متجانس وتم تحليلها قبل (العمود الأيسر الثاني) أو بعد المعالجة باستخدام 0ا-بيوتين (العمود الأوسط). بعد ذلك تم اكتشاف مونومرات ‎Fab‏ الباقية بعد خطوات الغسيل التالية باستخدام -ع]م ‎labeled Strep-Tactin®‏ جديد (العمود الأيمن الثاني).كان تبقيع متعدد الوحدات ‎Fab‏
‏0 الثانوي للخلايا المبقّعة بشكل قابل للعكس يمثل مادة مقارنة (العمود الأيمن). يتم فقط إظهار الخلايا الحية (0106981178). تبين الأرقام في المنحنيات النقطية النسبة المئوية للخلايا في البوابات. شكل 7 يظهر عزل الخلايا بالريط القابل للعكس للشظايا المضادة ‎Fab J‏ 1028 متعددة الوحدات ب ‎Strep-Tactin®‏ معلّم بفيكو إيريثرين كعلامة متألقة فلورباً. تم اختيار/ عزل الخلايا
‏5 +6028 باختيار الخلايا المغناطيسي بمتعدد الوحدات ‎Fab‏ من 01/865 معزولة حديثاً كالتي
يتم وصفها في طلب براءة الاختراع الدولي رقم (011011/2013). قبل الاختيار تم تبقيع الخلايا بمادة مقارنة ‎Le)‏ بمتعددات وحدات 80028 متألقة فلورياً (المنحنى النقطي الأيسر) أو بجسم مضاد موجه ضد سلسلة الجلوبيولين المناعي الخفيفة كابا (المنحنى النقطي الأيسر الثاني ‎01g‏ ‎(MAD LIS‏ بعد الاختيار» تمت معالجة الخلايا باستخدام 00-بيوتين وتم غسيلها بعد ذلك ‎AY‏ ‏5 الخرزات المغناطيسية ومونومرات 80. بعد ذلك تم تبقيع خلايا ‎CD28+‏ المحررة (-26) بمتعددات وحدات ‎CD28 Fab‏ (المنحنى النقطي الأيمن الثاني) أو 9١-#كابا©00/80‏ (المنحنى النقطي الأيمن) لاكتشاف مونومرات ‎Fab‏ الباقية بشكل محتمل. يتم إظهار ‎(Plnegative) a‏ +003 الحية فقط. تبين الأعداد في المنحنيات النقطية النسبة المئوية للخلايا في البوابات. شكل 8 يظهر نتائج تجرية تم فيها تكبير خلايا 7 +603 المستجيبة بعد تحفيزها في المختبر 0 بشظايا ‎Fab/aCD3‏ 001028 قابلة للعكس تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على ‎Strep—tactin®‏ ‏أوليجومري ‎LE‏ للذويان يعمل ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان. بالنسبة للتجارب التي يتم عرض نتائجها في شكل 8؛ تم تعليم 300.000 خلية ‎T‏ مستجيبة ‎(Tresp) CD3+‏ باستخدام 2 ميكرومولار من إستر سكسينيميديل كربوكسي فلوريسين ‎(CFSE)‏ وتم تعليمها بكميات متباينة من مستحضر من أوليجومرات 506018010 تم عليها تثبيت توليفة من شظية ‎Fab‏ 0003 و ‎Fab 5‏ #0028تحمل كل منهما تذييل ‎Strep‏ كببتيد رابط لاستريبتيفيدين عند السلسلة الثقيلة. ‎x1")‏ يناظر 3 ميكرو ‎aha‏ م510©80-تاكتين متعدد الوحدات مفعل باستخدام 0.5ميكرو جم 3 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 00028؛ تبين الأرقام ضعف الكمية "1). ‎Tresp LA Sf‏ بلا تحفيز أو تم تحفيزها بمتعددات وحدات م50©60-تاكتين غفل (بلا ‎Jia (Fab‏ الماجة المقارنة السالبة. تم استنبات الخلايا ‎Tresp‏ في مزدوجات في أطباق مكونة من 48 ‎lie‏ مع 300.000 0 خلية تغذية ذاتية سالبة 003 (معرضة للإشعاع باستخدام ‎(30GY‏ في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا المكمل باستخدام 20وحدة/مل من إنترليوكين 2 (-اا2). تم احتضان الخلايا عند 37 م دون تبادل أوساط وتم ‎(las‏ التكاثر وفقاً لتخفيف ‎CFSE‏ بعد 5 أيام بتحليل ‎FACS‏ (شكل 8 ب). يظهر شكل 8 أ التوزيع الحجمي ‎WAL‏ بعد 5 أيام في المزرعة. تظهر المخططات النسيجية خلايا +0103 حية؛ بينما يظهر شكل 8 ج الخلايا بعد المزرعة والتي تم تحريرها بكواشف التحفيز بعد المعالجة باستخدام ‎al‏ مولار (0-بيوتين والغسيل. تم تحليل تفكك وإزالة ‎Fab Las‏
المونومرية بإعادة التبقيع باستخدام ‎alas Strep-Tactin®‏ بفايكو إيريثرين (57-08) كعلامة متألقة فلورياً ‎aig‏ إظهار مخطط نسيجي تمثيلي. شكل 8 د يظهر إحصاء العدد المطلق للخلايا ‎dal‏ (السلبة لأزرق تريبان) بعد 5 أيام باستخدام ‎spas‏ عد ‎Neubauer‏ وتم تمثيله ‎Lily‏ مقابل حالة التحفيز المقابلة. يتم إظهار متوسطات أعداد الخلايا في شكل 8 د؛ وتبين أعمدة الخطأ الانحراف المعياري (500). يظهر شكل 8 ه صورة طبق المزرعة بعد 5 ‎all‏ من التحفيز. شكل 9 ‎Jia‏ توضيحاً لطريقة التمدد التسلسلي الواردة في الاختراع ‎Mal‏ (شكل 9 أ) بينما شكل 9 ب يصف بإيجاز بعض سمات ومزايا التمدد التسلسلي. يظهر شكل 10 ترتيباً للاختراع يمكن استخدامه مع طرق التمدد الواردة في الاختراع. يضم هذا الترتيب )100( مفاعلاً حيوياً )50( "خرطوشة إزالة" أولى (70) و"خرطوشة إزالة" ثانية (90). 0 يتصل المفاعل الحيوي (50) عن طريق المائع بالخرطوشة القابلة للإزالة الأولى (70)؛ وتتصل خرطوشة الإزالة الأولى بطريق المائع بخرطوشة الإزالة الثانية (90). ‎(Sag‏ أن يكون هذا الترتيب (100) جزءاً من جهاز لتمدد الخلايا الآلي والتنقية على النحو المبين في الطلب الحالي. في المفاعل الحيوي (50) يتم إجراء طريقة تمدد على النحو المبين في الطلب الحالي؛ على سبيل المثال طريقة التمدد الموضحة في شكل 3 التي تستفيد من كاشف تعدد وحدات قابل للذويان. في 5 هذه الحالة؛ بعد إنهاء تنشيط/تمدد مجموعة الخلايا )2( بإضافة منافس (20) (شربك حر لشربك الارتباط ‎C1‏ أو نظير له) تحتوي خلائط التفاعل التي يتم إطلاقها من المفاعل الحيوي على مجموعة الخلايا الممددة (2)؛ العامل الأول (6)؛ العامل الثاني (8) وكذلك كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان (4). في المثال الحالي؛ يكون العامل الأول (6) عبارة عن شظية رابطة للجسم المضاد 603 تضم ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين كشريك الارتباط ‎«C1‏ ويكون العامل الثاني )8( عبارة عن شظية رابطة للجسم المضاد 6028 تضم ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين كشريك الارتباط 1وبكون المنافس (20) (نظير حر لشريك الارتباط ‎(C1‏ عبارة عن بيوتين. يوضع خليط التفاعل هذا على خرطوشة الإزالة الأولى (70). خرطوشة الإزالة الأولى (70) هذه عبارة عن خرطوشة إزالة كالتي يتم وصفها في طلب براءة الاختراع الدولي رقم (2013/ 124474) وتضم عمود كروماتوجراف بطور ثابت مناسب. يمكن أن يخدم الطور الثابت كمصفوفة كروماتوجراف 5 آلفة و» في نفس الوقت»؛ يمكن أن يعمل كمصوفة لنفاذية الجل. يكون مثبتاً على كروماتوجراف
الألفة هذا كاشف ألفة. ويمكن أن يكون كاشف الألفة؛ في حالة المثال الحالي؛ على سبيل ‎(Jaa)‏ ‏عبارة عن استريبتيفيدين؛ ميوتين استريبتيفيدين؛ أفيدين» ميوتين أفيدين أو خليط منها. على هذا النحو؛ يرتبط العامل الأول (6) والعامل الثاني (8) بكاشف الألفة من خلال ببتيدهما الرابط لاستريبتيفيدين. كذلك يرتبط البيوتين كمنافس (20) بكاشف الألفة. على هذا النحو؛ يتم تثبيت هذه الكواشف الثلاثة على مصفوفة الكروماتوجراف لخرطوشة الإزالة الأولى بينما تمر مجموعة الخلايا
الممدة (2) وكاشف تعدد الوحدات القابل للذويان (4) خلال الطور الثابت. بعد ذلك يتم تطبيق هذا "التدفق الخلالي" على خرطوشة الإزالة الثانية (90). كذلك تشتمل خرطوشة الإزالة الثانية (90) هذه على طور ثابت. يشتمل هذا الطور الثابت على كاشف ألفة ثان عليه يمكنه الارتباط بموضع ربط 21 (42) من كاشف تعدد الوحدات (4). ويمكن أن يكون كاشف الألفة هذا على سبيل
0 المثال عبارة عن بيوتين مرتبط تساهمياً بالطور الثابت. وقد يكون هذا الطور الثابت؛ على سبيل ‎JU‏ عبارة عن ©-بيوتين ‎SepharoseTM‏ يمكن الحصول عليه من 81718070 ‎(Ans-Liege, Belgium)S.A.‏ على هذا النحوء يتم ربط (حجز) كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان (4) على الطور الثابت لخرطوشة الإزالة الثانية )90( بينما تمر مجموعة الخلايا )2( الممدة خلال الطور الثابت ويتم تحريرها من ‎dl‏ متفاعلات. وتكون مجموعة الخلايا (2) الآن في
5 حالة تتيح لها المزيد من الاستخدام»؛ على سبيل المثال؛ في التطبيقات التشخيصية (على سبيل المثال؛ المزيد من فرز ‎(FACSTM‏ أو أي تطبيق علاجي أساسه الخلايا. ينبغي هنا إدراك أنه من الممكن بطبيعة الحال تغيير ترتيب "خرطوشة الإزالة" الأولى (70) و"خرطوشة الإزالة" الثانية (90) في ترتيب (100)؛ بحيث يتصل المفاعل الحيوي (50) (بشكل مباشر) عن طريق المائع بالخرطوشة القابلة للإزالة الثانية (90)؛ وبتم ترتيب خرطوشة الإزالة الأولى (70) بعد خرطوشة
0 الإزالة الثانية )90( وتتصل بها بطريق المائع. في هذا الترتيب تتم ‎A)‏ كاشف تعدد الوحدات (4) أولاً من مجموعة الخلايا (2) وبعد ذلك تتم إزالة العامل الأول (6)؛ الثاني (8) وعلى سبيل المثال المنافس (20). يضم الاختراع الحالي أيضاً هذا الترتيب ويمكن أن يكون جزءاً أيضاً من جهاز لتمدد الخلايا الآلي والتنقية كالذي يتم وصفه في الطلب الحالي. شكل 11 يظهر نموذجاً آخر لترتيب للاختراع يمكن استخدامه مع طرق التمددة الواردة في
5 الاختراع. يضم هذا الترتيب )110( مفاعلاً ‎Liss‏ (50)» "خرطوشة ‎"ah‏ أولى (70) و'خرطوشة
إزالة” ثانية (90). يتصل المفاعل الحيوي (50) عن طريق المائع بالخرطوشة القابلة ‎ADU‏ الأولى (70)» وتتصل خرطوشة الإزالة الأولى عن ‎Gob‏ المائع بخرطوشة الإزالة الثانية (90). بالإضافة إلى ‎cells‏ تتصل خرطوشة الإزالة الثانية )110( عن طريق المائع بالمفاعل الحيوي (50). يمكن أن يكون هذا الترتيب )110( أيضاً جزءاً من جهاز لتمدد الخلايا الآلي والتنقية على النحو الذي يصفه الطلب الحالي. عند استخدامه؛ على سبيل ‎(JU‏ مع طريقة تمدد تستخدم كاشف تعدد وحدات قابلاً للذويان (4)؛ يتم الحصول على مجموعة ‎WIA‏ ممدة منقاة (2) كناتج تصفية تتابعية لخرطوشة الإزالة الثانية (90). ولأن خرطوشة الإزالة (90) تتصل عن طريق المائع بالمفاعل الحيوي )50( يمكن نقل مجموعة ‎WIA‏ )2( مرة أخرى إلى المفاعل الحيوي (50)؛ على سبيل المثال؛ لتمدد النسائل التسلسلي على النحو الذي يصفه الطلب الحالي؛ بإصابة مجموعة الخلايا 0 بالعدوى؛ على سبيل المثال؛ بجين مستقبل خلايا 1 والمزيد من التمدد (الثاني) بعد ذلك بطريقة تمدد واردة في الاختراع. شكل 12 يظهر نموذجاً آخر لترتيب للاختراع يمكن استخدامه مع طرق التمدد الواردة في الاختراع. يضم هذا الترتيب (120) مفاعلاً حيوباً (50)» "خرطوشة ‎"al‏ أولى (70) و"خرطوشة إزالة" ثانية (90). يتصل المفاعل الحيوي (50) عن طريق المائع بالخرطوشة القابلة للإزالة الأولى (70)؛ 5 وتتصل خرطوشة الإزالة الأولى عن طريق المائع بخرطوشة الإزالة الثانية (90). بشكل مماثل للنموذج المبين في شكل 11( تتصل خرطوشة الإزالة الثانية (110) عن طريق المائع بالمفاعل الحيوي (50). ومع ذلك» يتم ترتيب "خرطوشة انتقاء" (92) كالتي يتم وصفها في طلب براءة الاختراع الدولي رقم (2013/ 124474) بين خرطوشة الإزالة الثانية (90) والمفاعل الحيوي (50). على هذا النحو؛ ‎(Sa‏ اختيار/ إثراء مجموعة ‎LDA‏ فرعية (2 أ) مضمنة في مجموعة 0 الخلايا (2) عبر "خرطوشة الانتقاء" هذه (92) التي يتم وصفها في طلب براءنة الاختراع الدولي رقم (2013/ 124474). ويمكن نقل مجموعة الخلايا الفرعية (2 أ) هذه إلى المفاعل الحيوي (50)؛ على سبيل المثال؛ للخضوع للتمدد التسلسلي على النحو الذي يصفه الطلب الحالي. بشكل بديل (غير مبين)؛ يمكن استخدام مجموعة الخلايا الفرعية (2 أ) هذه في علاج أساسه الخلايا. ‎Lads‏ مرة أخرى أن استخدام كاشف تعدد وحدات قابل للذوبان على النحو الذي يصفه الطلب 5 الحالي يتيح تصميم أجهزة تنقية وتمديد خلايا آلية تكون مغلقة وظيفياً وغير عرضة على هذا النحو
للتلوث. بالإضافة إلى ذلك؛ لأن كاشف تعدد الوحدات القابل للذوبان يلغي الحاجة لمواد الطور الصلب ‎Jie‏ الخرزات المغناطيسية؛ يمكن تصميم أجهزة تنقية الخلايا تلك كأجهزة تدفق متصل. شكل 13 يظهر حركيات التمدد في تكاثر الخلايا المستجيبة +004 و1 +008 المنقاة ‎Ally (Tresp)‏ تم تحفيزها في المختبر بشظايا 85/0003 00028 أو باستخدام 00028/00003/ 00008 تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على نوعين من ميوتين ‎Strep—‏ ‏©8000أوليجومري قابل للذويان يعمل ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان. كان النوع الأول من ‎Strep—tactin®‏ الأوليجومري هو ‎sia‏ ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري ‎STN)‏ من أو يساوي 3) تم الحصول عليها في المثال 5 (وبشار ‎Lad a]‏ في الطلب الحالي باسم "السلسلة الرئيسية ©506018000 التقليدية"؛ موضحة بعلامة مثلث طرفه لأسفل في شكل 13)؛ وكان 0 انوع الثاني من ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري مستخدماً ككاشف تعدد وحدات قابل للذوبان تم الحصول عليه بتفاعل ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري القابل للذوبان مع زلال مصل بشري معالج بالبيوتين ‎(HSA)‏ يشار إلى كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان ‎Load HSA‏ في الطلب الحالي باسم "سلسلة ‎Streptactin®‏ الرئيسية الضخمة). وفي التجارب الواردة في شكل 13 تم إجراء التمدد بدون تبادل أوساط. يتم إظهار نتائج نتائج ‎T‏ +604 المستجيبة في شكل13 أ؛ ويتم 5 إظهار نتائج ‎WDA‏ 1 +008 المستجيبة في شكل 13 ب. في هذا السياق؛ يلاحظ أنه يشار إلى كواشف تعدد الوحدات القابلة للذويان المستخدمة تجريبياً التي تم تفعيلها بواسطة عوامل أولى مرتبطة بشكل قابل للعكس» واختيارياً عوامل ثانية وثالثة في الأشكال باسم "'متعددات الوحدات ‎."Streptamer®‏ ‏شكل 14 يظهر حركيات التمدد في تكاثر خلايا ‎+CD4‏ و1 +0108 المستجيبة المنقاة ‎(Tresp)‏ ‏20 التي تم تحفيزها في المختبر بشظايا 00103 / 000028 عبارة عن شظايا مثبتة بشكل قابل للعكس تم تثبيتها بشكل قابل للعكس بنوعين من ‎Strep—tactin®‏ أوليجومري قابل للذويان يعمل ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان. كان النوع الأول من ‎Strep—tactin®‏ الأوليجومري هو جزءٍ ميوتين استريبتيفيدين أوليجومري ‎STN)‏ من أو يساوي 3) تم الحصول عليه في المثال 5 (يشار إليه في الطلب الحالي أيضاً باسم ‎Streptactin® Ally’‏ الرئيسية ‎lil]‏ موضح بعلامة 5 المثلث الذي طرفه إلى أعلى في شكل 14)؛ وكان النوع الثاني من ميوتين استريبتيفيدين
الأوليجومري هذا المستخدم ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان هو عامل تعدد الوحدات القابل للذويان الذي أساسه ‎(HSA‏ 'سلسلة ©5060180600 الرئيسية الضخمة" المذكورة أعلاه). وفي التجارب الواردة في شكل 14 تم إجراء التمدد بتبادل الأوساط. يتم إظهار نتائج خلايا ‎T‏ +004 المستجيبة في شكل14؛ وإظهار نتائج ‎T WDA‏ +008 المستجيبة في شكل 14 ب. شكل 15 يظهر البيانات المجمّعة للنتائج التي تم الحصول عليها في شكلي 13 و14 لحركيات التمدد في تكاثر ‎WDA‏ 604+ و1 +608 المستجيبة المنقاة؛ حيث يمثل شكل 15 نتائج خلايا ‎T‏ +604 ويمثل شكل 15 ب نتائج خلايا 008+1. تستخدم الخطوط المستقيمة للزراعة بتبادل الأوساط في اليوم 3؛ بينما تمثل الخطوط المتقطعة القيم التي تم الحصول عليها لدرجة التمدد بدون تبادل أوساط في اليوم 3. يتم تقريب البيانات الواردة في شكل 15 إلى عدد الخلايا المدخلة. يتم فقط إظهار بيانات م1765 المحفز بميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري ‎SIN)‏ من أو يساوي ‎Tresp «(3‏ المحفز ب ‎Dynabeads‏ المتاحة تجارياً (المقارنة الموجبة) وخلايا 1 غير المحفزة (المقارنة السالبة) لكن بلا أية بيانات حول كاشف تعدد وحدات به 'سلسلة ‎Streptactin®‏ ‏الرئيسية الضخمة". شكل 16 يظهر التكون المبكر لتكتلات ‎T WIA‏ بعد تنشيط ‎WIA‏ 604+ و1 +608 المستجيبة 5 المتقاة المحفزة في المختبر بشظايا 00003/ ‎CD28 Fab‏ المثبتة بشكل قابل للعكس على ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري القابل للذويان ‎STN)‏ من أو يساوي 3) التي يتم وصفها في المثال 5. يمثل شكل 16 أ نتائج خلايا 604+7 ويمثل شكل 16 ب نتائج خلايا ‎.CD8+T‏ يتم ‎lel)‏ بيانات م1765 المحفز بكاشف تعدد الوحدات القابل للذويان (ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري)؛ ‎Tresp‏ المحفز ب ‎Dynabeads‏ المتاحة تجارياً (المقارنة الموجبة) وخلايا ‎T‏ غير 0 المحفزة (مقارنة سالبة). يظهر شكل 17 حركيات التمدد والنمط الظاهري لخلايا ‎T‏ الذاكرة المركزية ‎(Tem)‏ +603 ‎(CD3+CD62L+CD45RA-Tem)‏ المحفزة بشكل أحادي النسيلة في المختبر بشظايا 3 00028 تم تثبيتها بشكل ‎LE‏ للعكس على ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري القابل للذوبان (حيث ‎STN‏ من أو يساوي 3) التي يتم وصفها في المثال 5. تمثل الرسوم البيانية 5 الواردة في شكل 17 درجة التكاثر وفقاً لعدد الخلايا المجموعة لكل نقطة زمنية؛ حيث تظهر في
شكل 17 أ التكاثر فقط في أوساط مكملة بواسطة ‎IL-2‏ وتظهر في شكل 17 ب التكاثر في الأوساط المكملة باستخدام 2-اا و15-اا. ويظهر شكل 17 ج تحليل قياس التدفق الخلوي للتعبير السطحي عن ‎CDO2L‏ و 00127 بعد 14 يوماً من المزرعة في أوساط السيتوكين المتغيرة هذه. يظهر شكل 18 حركيات التمدد النوعي لمولِّد الضد (النوعي ل ‎(AG‏ الانتقائي لمجموعة حجمية من
خلايا ‎CD3+CD62L+CD45RA- Tem‏ مستجيبة منقاة تم تحفيزها في المختبر باستخدام معقد ببتيد: جزيء ‎MHC‏ (يعمل كعامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا) وشظية ‎Fab‏ 00028 (تعمل كعامل ثان يريط الجزيء الثانوي على سطح الخلايا) ويتم إظهار ‎TWA‏ غير ‎Hine‏ ‏(مقارنة سالبة). كان كل من معقد الببتيد النوعي ‎Algal‏ الضد مع جزيء ‎MHC‏ والشظية 00028
‎Fab 0‏ مثبتاً بشكل قابل للعكس على نفس ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري القابل للذوبان (حيث ‎N‏ ‏أكبر من أو يساوي 3) الذي يتم وصفه في المثال 5. كان الببتيد المستخدم للتمدد النوعي ‎Aged‏ ‏الضد في شكل 18 أ هو الببتيد ‎CRVLCCYVL‏ (متوالية رقم: 06)؛ الأحماض الأمينية 309- 7من بروتين 1 فوري مبكر مقيّد بجزيء ‎HLA-CT02 MHC‏ (يتم وصفه في ‎Ameres‏ ‎(et al, PLOS Pathogens, May 2013, vol. 9, issue 5, 3‏ يمثل قمة
‏15 لاصقة ‎HLA-CT/IE-1‏ نوعية للفيروس المضجّم للخلايا ‎(CMV)‏ يحمل جزيء ‎MHC ١‏ الذي يمثل الببتيد في طرف © منه من السلسلة الثقيلة الببتيد الرابط لاستريبتيفيدين ‎(SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK‏ (متوالية رقم: 07( المتاح تجارياً ك ‎"Twin-Strep-tag®’‏ من ‎.(IBA GmbH, Gottingen, Germany‏ يظهر شكل 18 أ تحليلاً تمثيلياً لقياس التدفق الخلوي لجزء الخلايا النوعية ل ‎AG‏ التي تتكاثر باستخدام معقد
‏0 ببتيد:|-116/ نوعي لهذه ‎dail‏ اللاصقة ‎HLA-CT/IE-1‏ هذه كعامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا المثبتة بشكل قابل للعكس على ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري القابل للذويان. توضح الرسوم البيانية في شكل 18 ب إلى شكل 18 ه حركيات التمدد في طبائع نوعية ل ‎Ag‏ ‏أخرى وفقاً لعدد ‎WAY‏ متعدد الخلايا الموجبة للببتيد: ‎MHC‏ المحددة المجموعة في كل نقطة زمنية قياساً بشكل 18 أ باستخدام معقدات متمايزة لببتيد نوعي لمولِّد الضد مع جزيء ‎MHC ١‏
‏5 كعامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا بشكل قابل للعكس المثبتة على ميوتين استريبتيفيدين
الأوليجومري القابل للذويان. بتفاصيل أكثرء يظهر شكل 18 ب تمدد الخلايا النوعية ل ‎Ag‏ ‏الممددة باستخدام معقد ببتيد: ‎MHC‏ النوعي للقمة اللاصقة 0065 ل ‎CMV‏ (الأحماض الأمينية 350-341 ‎«QYDPVAALF)‏ (متوالية رقم: 08)) المقيدة بواسطة ‎((HLA-A2402‏ ‎jek‏ شكل 18 ج تمدد الخلايا النوعية ل ‎Ag‏ الممددة باستخدام معقد ببتيد: ‎SAT MHC‏ نوعي للقمة اللاصقة 0065 ل /1/ا0(الأحماض الأمينية 274-265 ‎(RPHERNGFTV‏ (متوالية رقم: 09)) المقيد بواسطة ‎((HLA-BT02‏ ويظهر شكل 18 ج تمدد الخلايا النوعية ل ‎Ag‏ ‏تم إكثارها باستخدام معقد الببتيد: ‎1/116-١‏ النوعي للقمة اللاصقة للهكسون 5 من الفيروس الغدي (الأحماض الأمينية 124-114 ‎(CPYSGTAYNSL)‏ (متوالية رقم: 10)) المقيدة بواسطة ‎((HLA-BT02‏ ويظهر شكل 18 ه تمدد الخلايا النوعية ل ‎AG‏ التي تم إكثارها باستخدام معقد 0 ببتيد:1/0110-1 النوعي للقمة اللاصقة ‎HLA-B7/IE-1309-317‏ من ‎CMV‏ (بيانات05م] التمثيلية المبينة أعلاه في شكل 18 أ). تتاح ‎cilia‏ الببتيد: ‎MHC‏ التي تحمل ‎Twin Strep®-—‏ ‎Tag‏ تجارياً من ‎.IbaGmbH‏ في هذا السياق؛ يتم إظهار متواليات الأحماض الأمينية للجزيئات ‎HLA-C*0702 5 HLA-B*(0702 (HLA-A*2402‏ التي تحمل ‎"Twin-Strep-tag®"‏ ‏كطرف © لها كمتوالية رقم: 21 22 و23 في قوائم المتواليات المرفقة؛ بينما يتم إظهار متوالية 5 الأحماض الأمينية للجلوبيولين الدقيق ‎B2‏ (وبتكون مع السلسلة 0؛ وهو ما يعني جزيئات ‎HLA‏ ‏المشفرة من جزيء ‎MHC ١‏ المقابل) كمتوالية رقم: 24 في قائمة المتواليات المرفقة. بالإضافة إلى ‎cll‏ يظهر شكل 18 و تحليلاً تمثيلياً لقياس التدفق الخلوي في التعبير السطحي عن 00621و 7 بعد 14 يوم من مزرعة الخلايا ‎Hexon5114-124 [HLA-B7‏ المحفزة/الممددة في شكل 16 د. 0 يظهر شكل 19 حركيات التمدد النوع ل ‎Ag‏ الانتقائي خارج خلايا ‎CD3+CD62L+CD45RA-‏ ‏0 المستجيبة المحفزة في المختبر ب (أ) معقدات الببتيد و ‎MHC ١‏ النوعية ‎sal‏ الضد و(ب) شظايا ‎Fab‏ 00028 المثبتة بشكل قابل للعكس كعامل ‎Jol‏ وثان على ميوتينات استريبتيفيدين الأوليجومرية القابلة للذويان. لهذا الغرض تم تحفيز 500.000 خلية ‎CD3+CD62L+CD45RA-‏ مستجيبة ‎(Tresp) Tem‏ بشكل نوعي ل ‎Ag‏ باستخدام 3 ميكرو 5 "لتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ مفعّلة باستخدام 0.5 ميكروجم من معقدات
ببتيد: ‎MHC‏ الفئة | المزودة بببتيد رابط لاستريبتيفيدين ‎Jia)‏ الببتيد النوعي الأحماض الأمينية ‎<CPYSGTAYNSL) 124-114‏ متوالية رقم: 10( من بروتين 5 ‎Hexon‏ من الفيروس الغدي المقيد بواسطة ‎(HLA-B0702‏ انظر أعلاه) و0.5 ميكروجم من ‎«aS .aCD28 Fab‏ 4.5 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد وحدات ‎Streptactin‏ محمّل باستخدام 0.5 ميكرولتر من معقد الببتيد: ‎MHC‏ الفئة | هذاء 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 00108 و0.5ميكروجم ‎.0CD28 Fab‏
للمقارنة؛ تم التحفيز متعدد النسائل؛ باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات 70 (1مجم/مل) محملة مع توليفة من 0.5 ميكروجم ‎Fab‏ 00103 و0.5ميكروجم ‎Fab‏ 00028. مرة أخرى كظرف التحفيز البديل الذي يتم وصفه أعلاه؛ تم استخدام 4.5 ميكرولتر من مستحضر متعددات وحدات 506018010 محملة مع 0.5 ميكروجم 00103
‎Fab aay 500.5 Fab 0‏ 00108 و0.5ميكروجم 86 ‎.qCD28‏ كانت خلايا ‎Tresp‏ غير المعالجة (غير المحفزة) تمثل مادة مقارنة سالبة وتم تحفيز خلايا ‎Tresp‏ بشكل متعدد النسائل باستخدام ‎Dynabeads‏ كمادة مقارنة موجبة. تم استنبات ‎Tresp WA‏ في أطباق مكونة من 48 ‎Lie‏ في ‎dol‏ من وسط مزرعة ‎WIA‏ مكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا و5 نانوجم/ مل ‎IL=‏ ‏5. تم احتضان الخلايا عند 37 م مع تبديل الأوساط كل 3 أيام وتم تحليل عد الخلايا بعد 7
‏5 و14 يوم. تمثل الصور الفوتوغرافية في شكل 19 درجة تكون التكتلات في اليوم 5 للتحفيز النوعي ل ‎Ag‏ على النحو المبين كمثال للقمة اللاصقة 5 ‎HLA-B7/Hexon‏ من الفيروس الغدي. يظهر شكل 20 الحصيلة والنمط الظاهري لتمدد خلايا 7 +008 المستجيبة المنقاة المحفزة في المختبر بشظايا 00103 / ‎Fab‏ 00028 المثبتة بشكل قابل للعكس على نوعين من ‎Strep—‏
‎tactin® | 0‏ قابل للذويان أوليجومري يعمل ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان. كان النوع الأول من ‎Strep-tactin®‏ الأوليجومري هو ‎sda‏ ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري (الذي يتم الحصول عليه في المثال 5 (السلسلة الرئيسية التقليدية)؛ وكان النوع الثاني من ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري هذا المستخدم ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان هو الأوليجومر القابل للذويان الذي يتم وصفه أعلاه ويشار إليه في الطلب الحالي باسم سلسلة ‎Streptactin®‏ الرئيسية الضخمة. في
‏5 هذه التجارب؛ تم ‎Lad‏ استخدام ‎sa‏ ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري التقليدي ‎STN)‏ من أو
تساوي 3) ككاشف تعدد وحدات تم تفعيله بشظايا ‎Fab‏ أحادية (العمود الثالث في شكل 20 أ وشكل 20 ب) أو بتوليفة من شظايا 0003 3 ‎Fab‏ 00028. علاوة على ذلك للتحفيز المجمّع بشظايا ‎«CD28 Fab/aCD3‏ تم تثبيت شظية ‎Fab‏ 0008 إضافية أيضاً (متاحة تجارياً من ‎(IBA GmbH, Gottingen, Germany‏ لاختبار ما إذا كان ممكناً تحفيز مجموعة خلايا 7
معينة بشكل تفضيلي. يظهر شكل 20 أ رسماً بيانياً بالأعمدة يمثل درجة التكاثر وفقاً لعدد الخلايا المجموعة في اليوم 6 مقارنة بالمواد المقارنة السالبة (الخلايا ‎T‏ +008 المستجيبة غير المحفزة المنقاة) ومقرية للمادة المقارنة الموجبة ( 1 +0106 المستجيبة المنقاة محفزة باستخدام
5 متاحة تجارباً (خرزات يتم تثبيت الأجسام المضادة أحادية النسيلة 0003 ‎aCD28‏ بشكل غير قابل للعكس). يظهر شكل 20 ب تحليل قياس التدفق الخلوي في التعبير
0 السطحي عن 008 والجزيء السطحي 0045850 من ‎WIA‏ 1 (والذي يدل على تكاثر وتنشيط خلايا ‎(T‏ بعد زراعة الخلايا. تمت مقارنة ظروف التحفيز السابقة باستخدام ‎ANOVA‏ أحادي المسار ‎Geng‏ اكتشاف فرق كبير. يظهر شكل 21 الحصيلة والنمط الظاهري لتمدد خلايا ‎T‏ +008 المستجيبة المنقاة المحفزة في المختبر بشظايا 00103/001028 مثبتة بشكل قابل للعكس على ‎Strep—tactin®‏
5 الأوليجومري القابل للذويان الذي يعمل ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان تم تفعيله ‎Fab Lad‏ أحادية أو تولفة من شظايا ‎Fab‏ (على النحو المبين أعلاه بالفعل). في هذه التجارب؛ تم تحفيز ‎T LDA‏ +608 المستجيبة بكاشف تعدد وحدات قابل للذويان ( ‎IStrep—tactin®‏ لأوليجومري القابل للذويان (1[مجم/مل) الوارد في المثال 5) تم تفعيله بكميات متباينة من شظايا 0003 ‎Fab‏ 00028؛ اختيارياً مع الشظية ‎Fab‏ 08©» التي يتم وصفها أعلاه. يناظر الحد "1"
0 1.5 ميكروجم من ‎Streptactin‏ متعدد الوحدات مفعل باستخدام 0.5ميكروجم من شظية 00003 ‎Fab‏ وحدها و1.5ميكروجم من ‎Streptactin‏ متعدد الوحدات ‎Jade‏ باستخدام 0.5)ميكروجم من ‎Fab‏ 00028 وحده)؛ أو 3 ميكرولتر من مستحضر ‎Streptactin‏ أوليجومري محمل مع 5ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 0003 و0.5ميكروجم من ‎Fab‏ 00028؛ أو 4.5ميكرولتر من مستحضر متعددات وحدات ‎Streptactin‏ محمّل باستخدام 0.5ميكروجم من 00103 مذيل
5 باستخدام ‎strep‏ 0.5ميكروجم من 00108 مذيل باستخدام ‎strep‏ و0.5ميكروجم من 00028
‎Fab‏ مذيل باستخدام 5060. وبالتالي؛ الاصطلاح"2*” يناظر 3.0 ‎Streptactines Su‏ متعدد الوحدات مفعّل باستخدام 1ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 0003 وحدها و3.0 ميكروجم 07 متعدد الوحدات ‎Jide‏ باستخدام ‎ang Sil‏ من ‎Fab‏ 000028 وحده؛ بمعنى أنه استخدام ضعف كمية شظية ‎Fab‏ 00103 المستخدمة. كانت ‎Tresp LIA‏ غير المعالجة تمثل مادة مقارنة سالبة و7 +608 المستجيبة المنقاة المحفزة باستخدام ‎Dynabeads‏ متاحة تجارياً
(خرزات يتم تثبيت الأجسام المضادة 00003 و0028» أحادية النسيلة بشكل غير قابل للعكس) تمثل مادة مقارنة موجبة. شكل 21 أ يظهر رسوماً بيانية تمثل فيها الأعمدة درجة التكاثر ووفقاً لعدد الخلايا المجموعة في اليوم 5 مقارنة بالمواد المقارنة السالبة ومقربة للمادجة المقارنة الموجبة. يظهر شكل 21 ب تحليل ‎FACS‏ للتعبير السطحي عن 0608 و 604580 بعد زراعة
0 الخلايا. شكل 22 يظهر تنشيط تسلسلات الإشارات داخل الخلايا لخلايا ‎Jurkat‏ محولة تم تعديلها للتعبير عن مستقبل ‎Ase‏ ضد خيمري 006019 ‎(CAR)‏ وبتم تحفيزها باستخدام ‎Strep—tactin®‏ ‏الأوليجومري الوارد في مثال 5 ككاشف تعدد وحدات قابل للذوبان.الطبيعة النوعية ل ‎CAR‏ مشتقة ‎Lael‏ من منطقة ‎SCFV‏ مجمّعة من منطقة رابطة لمولّد الضد من جسم مضاد أحادي النسيلة
‎(MAD) 5‏ يريط نوعياً ‎alge‏ ضد مرتبطاً بهدف / ورم مثل 6019 ‎alas‏ بإرسال الإشارات النوعي لخلايا ‎T‏ (التي يتم وصفها في ;15 ‎Hudecek et al, Clin Cancer Res. 2013 June‏ 3153-4 :(19)12. في التجارب تم أيضاً استخدام النطاق خارج الخلوي ‎(ECD)‏ من 59 والذي يحتوي على المركب الترابطي الطبيعي ل ‎CAR‏ 16019] وكذلك الشظية ‎algG‏ ‏2 ) أحادية النسيلة التي تتعرف على فاصل 1964 ‎F(ab)2)‏ المضاد للبشر من الحمار
‏0 والمتاح تجارياً من ‎Jackson Immuno Research‏ ) في ‎aCD19-CAR‏ في هذه التجرية كعامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى لخلايا ‎Jurkat‏ تم التثبيت بشكل قابل للعكس بميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري القابل للذويان بواسطة ببتيد استريبتيفيدين ‎SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK‏ (متوالية رقم: 07)مدمج في الطرف © من 500 في ‎CD19‏ أو شظية ‎dallas (Fab)2‏ بالبيوتين من 96ا» (لأن ميوتين استريبتيفيدين
‏5 12 يريط بيوتين بألفة منخفضة؛ يكون هذا الربط قابلاً للعكس ويمكن إزاحته على سبيل ‎JE‏
بإضافة كمية زائدة من بيوتين حر). في التجربة المقارنة في شكل 22 أ تم تحفيز 300.000 من خلايا ‎Jurkat‏ +0103 المستجيبة ‎(Jresp)‏ بكميات متفاوتة من خليط مستحضرات من 00 الأوليجومري (1مجم/ مل) الذي تم تفعيله باستخدام ‎Fab‏ 0003 و 00028 ‎Fab‏ (17' يناظر 3 ميكروجم ‎Streptactin‏ متعدد الوحدات ‎Jade‏ باستخدام 0.5)ميكروجم ‎0.52CD3- 5‏ ميكروجم من ‎Fab‏ 801028 - متعدد وحدات ‎Streptamer‏ متعدد النسائل).
في التجربة الواردة في شكل 22 ب تم تفعيل 3 ميكرولتر من مستحضر 5160180010 أوليجومري باستخدام 0.5ميكروجم ‎(1X)‏ أو 1 ميكروجم ‎(2X)‏ من النطاق خارج الخلية ‎(ECD)‏ من ‎CD19‏ ‏أو باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر 506018010 أوليجومري محمّل باستخدام 0.5ميكروجم ‎(1X)‏ أو 1 ميكروجم ‎algG (2X)‏ يتعرف على فاصل 0964| (كلاهما متعدد وحدات
‎Streptamer® 0‏ نوعي بالنسبة ل ‎(CAR‏ كانت ‎Jresp‏ محفزة باستخدام 0866805/ا0(خرزات يتم تثبيت الأجسام المضادة 00003 و000028 أحادية النسيلة بشكل قابل للعكس) أى ‎PMA‏ ‏ويونومايسين تمثل مواد مقارنة موجبة. تم استنبات خلايا ‎Jresp‏ في أنابيب ‎Eppendorf‏ 1.5 مل في 200 ميكرولتر من وسط مزرعة خلايا مكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا. تم احتضان الخلايا عند 37 م ووضعها على الثلج وحلها بعد صفر دقيقة إلى 20 دقيقة من التحفيز.
‏5 شكل 23 يظهر تمدد خلايا 1 +003 المستجيبة المنقاة محفزة في المختبر بشظايا 3 0028 مثبتة بشكل قابل للعكس على ‎Strep—tactin®‏ الأوليجومري القابل للذويان في المثال 5 الذي كان يمثل كاشف تعدد وحدات قابل للذوبان. في إحدى التجارب؛ بالإضافة إلى شظايا 85/0003 00028؛ تم أيضاً تثبيت شظية ‎Fab‏ 0008 متاحة تجارياً من ‎IBA‏ ‎Germany « 6500098060011‏ (رقم كتالوج 203-8000-6) على الأوليجومر القابل
‏0 ا لذويان من ميوتين استريبتيفيدين لاختبار ما إذا كان ممكناً التحفيز التفاضلي في المختبر لمجموعة فرعية من ‎CD8+ T WIA‏ ضمن مزرعة ‎CD3+‏ الحجمية بكاشف تعدد الوحدات الوارد في الاختراع المثبت عليه بشكل قابل للعكس شظية ‎Fab‏ 0008 أيضاً. ‎wha‏ من التفصيل؛ تم تحفيز 500.000 من ‎T WA‏ مستجيبة +0103 منقاة ‎(Tresp)‏ باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر أوليجومري استريبتيفيدين (1مجم/ ‎(Ue‏ محمّل باستخدام توليفة من 0.5 ميكروجم من
‏5 0003 و0.5ميكروجم من ‎Fab‏ 00028. كطريقة بديلة؛ تم تحميل 4.5 ميكرولتر من أوليجومر
707 باستخدام 0.5ميكروجم من ‎«aCD3‏ 0.5 ميكروجم ‎Fab‏ 00108 و0.5ميكروجم ‎Fab‏ 10028التي يتم وصفها أعلاه. كانت خلايا ‎Tresp‏ غير المحفزة تمثل مادة مقارنة سالبة وتمثل ‎Tresp‏ المحفزة باستخدام ‎Dynabeads‏ (خرزات يتم تثبيت الأجسام المضادة 0003 و ‎CD28‏ أحادية النسيلة بشكل غير قابل للعكس) مادة مقارنة موجبة.
يمثل شكل 24 استراتيجيات تمثيلية لتوليد ميوتينات استريبتيفيدين أوليجومرية يمكن استخدامها ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان وارد في الاختراع. يظهر شكل 24 أ أنه في خطوة أولى؛ يتم استخدام ميوتين استريبتيفيدين "112" ‎(SaM2)‏ يشتمل على متوالية الأحماض الأمينية- 1644 ‎Gly45-Alad6-Argd7‏ (متوالية رقم: 03) في مواضع المتواليات 44 إلى 47 من استريبتيفيدين من النوع غير المعالج في توليد ميوتينات استريبتيفيدين أوليجومرية لها 'سلسلة رئيسية 0 تقليدية". وفي خطوة ثانية؛ ‎(Ka‏ توليد ميوتينات استريبتيفيدين أوليجومرية قابلة للذويان لها 'سلسلة رئيسية ضخمة" بإقران ميوتين استريبتيفيدين مع بروتين ‎dala‏ معالج بالبيوتين ‎Jie‏ زلال المصل البشري ‎(HSA)‏ أو بإقران ميوتينات استريبتيفيدين مع مواد حاملة تخليقية مثل ‎PEG‏ شكل 24 ب: معالجة زلال المصل البشري بالبيوتين ‎(HSA)‏ ‏الوصف التفصيلي: 5 يوفر الاختراع الحالي طرقاً؛ مجموعات أدوات وجهازاً لتمديد مجموعة من الخلايا أو حث تكاثر مجموعة خلايا 1. يضم الاصطلاح ‎de saad‏ من ‎"WIAD‏ بحسب الاستخدام في الطلب الحالي كافة الخلايا التي يمكن تمديدها بربط عامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا بمستقبل سطح خلية. من الممكن ‎Lad‏ لتمدد مجموعة من الخلاياء أن يكون مطلوباً ربط عامل ثان بمستقبل سطح خلية ثان (جزيء 0 ثانوي) لإنتاج إشارة تحفيزية مشتركة مطلوية لتمدد الخلايا. في بعض النماذج يمكن أن تكون مجموعة الخلايا عبارة عن مجموعة خلايا لمفية تضم؛ لكن بشكل غير حصري مجموعة من خلايا 8» مجموعة من ‎T WIA‏ أو مجموعة من الخلايا القاتلة الطبيعية. الأمثلة التوضيحية على مجموعات الخلايا عبارة عن خلايا ‎B‏ تحمل ‎CD40‏ أو 060137 (يمكن أن تتكاثر مجموعة الخلايا عند ربط عامل أول فقط يوفر إشارة تنشيط» على سبيل المثال مركب ترابطي 4-188؛ أو
جزيء جسم مضاد 00040 أو جزيء جسم مضاد 000137 (انظر على سبيل المثال ‎Zhang‏ ‎(et al., 2010, J Immunol, 184:787-795(‏ الأمثلة التوضيحية الأخرى للعوامل (الأول أو الثاني) التي يمكن استخدامها في تمدد ‎LAY‏ 8 هي العوامل التي ترتبط ب 6وا ‎«CD19‏ ‏8 أو ‎«CD14‏ على سبيل المثال جزبئات الأجسام المضادة ‎«algG «aCD19‏ 106028؛ أو 00014. من المتوقع أيضاً أن يشتمل العامل الأول أو الثاني لتمدد خلية 8 على مركبات
ترابطية للمستقبلات الشبيهة بالتول أو الإنترلوكينات؛ مثل 1-21 (انظر على سبيل المثال ‎(Dienz ©, et al. 2009. J.
Exp.
Med. 206:69‏ ويلاحظ أن الاختراع الحالي يضم أيضاً تنشيط خلايا 8 المعتمد على عديد سكريد شحمي؛ حيث يمكن استخدما عديد سكريد شحمي ‎Lad‏ كعامل أول ويمكن تزويده بشريك ارتباط 1© بحسب الاستخدام في الطلب الحالي. تضم
0 الأمثلة التوضيحية الأخرى المناسبة على مجموعات الخلايا مجموعة خلايا ‎T‏ تتمدد بعد تنشيطها بريط عامل أول ب 105/603 ‎Jays‏ عامل ثان بجزيء ثانوي على خلية ‎T‏ مثل 0028. وفي هذه الحالة؛ يحفز العامل الأول إشارة مرتبطة بمعقد ‎TCR/CD3‏ في خلايا ‎T‏ ويوفر العامل الثاني حافزاً ثانوياً بريط ‎CD28‏ كجزيء ثانوي. ويمكن أن تضم العوامل التي يمكن استخدامها في تمدد خلايا آ الإنترلوكينات»؛ مثل ‎IL-2‏ 7-ااء 15-اا؛ أو 21-ا(انظر على سبيل المثال
‎Cornish et al. 2006, Blood. 108(2):600-8, Bazdar and Sieg, 2007, 15‏ ‎Journal of Virology, 2007, 81(22):12670-12674, Battalia et al, 2013,‏ ‎(Immunology, 139(1):109-120‏ الأمثلة التوضيحية الأخرى للعوامل التي يمكن استخدامها في تمدد ‎T LDA‏ هي العوامل التي ترتبط ب ‎«CD8‏ 6045 أو 0090؛ ‎Jie‏ الأجسام المضادة 0008» 00045 أو 00090. وتضم الأمثلة التوضيحية على مجموعة خلايا ‎WAT‏
‏0 آ١‏ النوعية لمولّد الضد؛ ‎TIA‏ المساعدة؛ خلايا آ السامة ‎(LAL‏ خلية ‎T‏ ذاكرة (مثال توضيحي على ‎WIA‏ آ الذاكرة هي خلايا ‎T‏ الذاكرة المركزية النوعية ‎J‏ +008+-00621) أو خلايا 1 تنظيمية (مثال توضيحي على ‎Treg‏ عبارة عن خلايا ‎.(CD4+CD25+CD45RA+ Treg‏ يضم الاصطلاح '(مجموعة) ‎WIA‏ آ” بحسب الاستخدام في الطلب الحالي ‎Wa‏ آ التي تشتمل على مستقبل مولّد ضد خيمري ‎(CAR)‏ معروف أيضاً كمستقبلات ‎T WDA‏ صناعية أو مستقبلات
‏5 خلايا آخيمرية. على هذا النحو؛ يمكن أيضاً تمديد مجموعة خلايا 1 مشتملة على مستقبل ‎Age‏ ‏ضد خيمري بالطرق؛ الكواشف والأجهزة الواردة في الاختراع الحالي. انظر في هذا الصدد أيضاً
المثال 15 الذي تم فيه تحفيز خلايا ‎Jurkat‏ تعبر عن مستقبل ‎alge‏ ضد نوعي ل ‎CD19‏ خيمري ‎(CAR)‏ باستخدام كاشف تعدد وحدات ‎WE‏ للذويان وارد في الاختراع الحالي. يضم ‎Jie‏ توضيحي آخر على مجموعة ‎WIA‏ مناسبة الخلايا القاتلة الطبيعية (خلايا ‎(NK‏ حيث يمكن تمديدها على سبيل المثال بالعوامل التي ترتبط ب 6016 أو 0056؛ ومنها على سبيل المثال الأجسام المضادة 00016 أو 00056. وبضم مثال توضيحي على جسم مضاد 00016 كهذا الجسم المضاد 8متوالية 1/1 المبينة في متوالية رقم: 25 ومتوالية ‎Lind) VL‏ في متوالية رقم: 26 (انظر على سبيل المثال.15:78)12(:3232-40 ‎Hoshino et al, Blood. 1991 Dec‏ ). وقد يكون عامل ‎AT‏ يمكن استخدامه في تمدد خلايا ‎NK‏ هو ‎I-15‏ (انظر على سبيل المثال ‎(Vitale et al. 2002. The Anatomical Record. 266:87-92‏ كذلك يضم مثال
0 توضيحي ‎AT‏ على مجموعة خلايا مناسبة الخلايا الأحادية؛. حيث يمكن تمديدها على سبيل المثال باستخدام عامل يرتبط ب 0014؛ مثل جزيء جسم مضاد ‎(Sarg .0CD14‏ أن تكون مجموعة الخلايا من أي أصل ثديي؛ ‎La‏ في ذلك لكن بشكل غير حصري الإنسان؛ الأرنب؛ خنزير غينيا؛ السنجاب؛ الهامسترء القطة؛ الكلب؛ الليمورء الماعز؛ الخنزير؛ الحصان؛ القرد الريصيء المكاك؛ أو الشمبائزي.
5 على هذا ‎sail‏ بشكل يتفق مع ما ‎lets can‏ الاختراع الحالي بطرق للحث الانتقائي لتمدد مجموعة من الخلايا ‎Jie‏ خلايا 8؛ خلايا 1 أو الخلايا القاتلة الطبيعية خارج جسم الكائن الحي في غياب عوامل النمو خارجية المنشاًء مثل الليمفوكينات؛ والخلايا الثانوية. بالإضافة إلى ‎eld‏ يمكن حث تكاثر هذه الخلايا مثل خلايا 8 أو خلايا 1 بدون ‎dod dala‏ الضد؛ ومن ثم توفير مجموعة خلايا ممددة ‎Jie‏ مجموعة خلايا ‎T‏ أحادية النسيلة بالنسبة لتفاعلية ‎alge‏ الضد. ويمكن أن تتيح
0 الطرق التي يكشف عنها الطلب الحالي استدامة تكاثر مجموعة منتقاة من ‎WDA‏ آمثل خلايا +004 أو ‎T‏ +608 على مدى فترة زمنية ممتدة للحصول على زيادة لأضعاف مضاعفة في عدد هذه الخلايا بالنسبة لمجموعة ‎T WDA‏ الأصلية. ‎dng‏ عام؛ في حالة التمدد (النسيلي) لمجموعة خلايا لمفية على النحو المبين في الطلب الحالي؛ يمكن أن يشترك النسل كله في نفس الطبيعة النوعية لمولِّد الضد التي لمجموعة الخلايا المنتقاة للتمدد.
كذلك بما يتفق مع ما سبق؛ يوفر الاختراع الحالي طرقاً لتمديد مجموعة من ‎TWAS‏ النوعية لمولد الضد. لإنتاج مجموعة من خلايا ‎T‏ النوعية ‎algal‏ الضد؛ تتم ملامسة خلايا 1 مع ‎dpe‏ ضد في صورة مناسبة لإطلاق إشارة تنشيط أولى في خلية ‎oT‏ أي؛ يتم توفير ‎alge‏ الضد للخلية ‎T‏ بحيث يتم إطلاق إشارة في الخلية ‎T‏ من خلال معقد 1085/003. على سبيل المثال» يمكن توفير ‎Vga‏ ‏5 الضد للخلية ‎T‏ بخلية موفرة لمولّد الضد مع جزيء ‎(Sarg MHC‏ احتضان الخلية الموفرة ‎gal‏ ‏الضدء مثل خلية 8؛ خلية ملتهمة كبيرة؛ خلية ‎dala]‏ خلية تغضنية؛ خلية لانجرهانز؛ أو خلية أخرى يمكن أن توفر ‎alse‏ الضد لخلية ‎oT‏ مع خلية ‎(AT‏ وجود مولِّد الضد (على سبيل المثال؛ ‎Age‏ ضد قابل للذويان) بحيث تعمل الخلية الموفرة لمولّد الضد على توفير ‎alge‏ الضد للخلية 1. بشكل بديل؛ يمكن احتضان خلية تعبر عن ‎ge‏ ضد معني مع خلية آ. على سبيل المثال؛ يمكن 0 احتضان خلية ورمية تعتبر عن مولِّدات ضد مرتبطة بالورم مع خلية ‎T‏ لتحثا ‎Tae‏ استجابة نوعية للورم. بشكل مماثل؛ يمكن احتضان خلية مصابة بعدوى مسبب للمرض؛ على سبيل المثال؛ فيروس» وتوفر مولِّدات ضد مسبب المرض مع خلية 7. بعد التنشيط النوعي ‎Algal‏ الضد لمجموعة من خلايا ‎oT‏ يمكن التعبير عن الخلايا وفقاً لطرق الاختراع. على سبيل المثال؛ بعد إرساء الطبيعة النوعية ‎alg‏ الضد؛ يمكن تمديد خلايا آ بالزراعة مع جسم مضاد ل 003 (مستخدم كعامل أول) وجسم مضاد ل 6028 (مستخدم كعامل ثان) ‎ly‏ الطرق التي يصفها الطلب الحالي. في نموذج آخرء يمكن أن يكون العامل الأول عبارة عن معقد ‎cain (MHC ١‏ حيث يرتبط بمجموعة خلايا 1 نوعية ‎Asal‏ الضد. في نموذج كهذا؛ يمكن استخدام أي ببتيد نوعي ‎gal‏ الضد معروف ويمكن تعقيده مع جزيء ‎MHC ١‏ انظر في هذا الصدد مثالي 11 و12 اللذين تم ‎Lag‏ التمثيل للتمدد الانتقائي النوعي لمولِّد الضد لخلايا ‎Tom‏ مستجيبة من خلايا 7 الذاكرة المركزية +003 الحجمية 0 الأربعة خلايا نوعية ‎dod‏ الضد مختلفة. بشكل بديل؛ يمكن أيضاً كعامل أول استخادم المركب الترابطي الطبيعي لمستقبل يطلق تمدد الخلايا. انظر في هذا الصدد مثال 15 الذي فيه أدى النطاق خارج الخلوي من 6019 إلى تنشيط تسلسلات إرسال الإشارات الخلوي في خلايا ‎Jurkat‏ ‏المحولة التي تم تعديلها للتعبير عن مستقبل ‎dpe‏ الضد الرابط لذ 6019 الخيمري ‎(CAR)‏ ‏يمكن أن تكون عينة مجموعة الخلايا من أي مصدر مناسب؛ نمطياً كل عينة نسيج جسماني أو ‎gle 5‏ جسماني مثل الدم. وفي هذه الحالة الأخيرة؛ يمكن أن تكون العينة على سبيل المثال؛ عبارة
عن مجموعة من خلايا الدم الطرفية أحادية النواة ‎(PBMC)‏ التي يمكن الحصول عليها بطرق العزل العيارية مثل تدرج فيكول لخلايا الدم. ومع ذلك يمكن أن تكون مجموعة الخلايا المراد تمديدها في صورة منقاة ويمكن أن يكون قد تم عزلها بتقنية تبقيع/ ‎ALE WIS Jie‏ للعكس كالتي يتم وصفها في براءة الاختراع الأمريكية رقم (7» 776 562)؛ براءة الاختراع الأمريكية رقم 8,298,782 )8( 298؛ 782( ‎lla‏ براءة الاختراع الدولي رقم (02/ 054065( أو طلب
براءة الاختراع الدولي رقم (2013/ 011011). بشكل بديل؛ يمكن الحصول على مجموعة الخلايا أيضاً بفرز الخلايا من خلال الالتصاق المناعي المغناطيسي السالب الذي يتم وصفه في براءة الاختراع الأمريكية رقم )6( 352 694 1( أو براءة الاختراع الأوروبية رقم )0 700 430 1). في حالة استخدام طريقة عزل يتم وصفها في الطلب الحالي في بحث أساسي؛ يمكن أن تكون
0 العينة عبارة عن خلايا من تجارب مزارع خلايا في المختبر. نمطياً يتم تحضير العينة في صورة مائع؛ ‎ie‏ محلول أو مشتت. ‎Lay‏ يتفق مع ما سبق؛ في أحد النماذج يوفر الاختراع طريقة تتم في في المختبر لتمديد مجموعة من الخلاياء حيث تشتمل على ملامسة عينة مشتملة على مجموعة من الخلايا مع كاشف لتعدد الوحدات. يكون مثبتاً على كاشف تعدد الوحدات بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) عامل أول يوفر
‎sls) 5‏ تنشيط أولى ‎(WDA‏ حيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات على موضع ربط واحد على الأقل
‏1تربط العامل الأول بشكل قابل للعكس. يشتمل العامل الأول على شربك ارتباط واحد على
‏الأقل 01؛ حيث يمكن لشريك الارتباط 61 الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط 21 من كاشف تعدد الوحدات؛ وحيث يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال رابطة ‎A‏ ‏للعكس مكوّنة بين شريك الارتباط1© وموضع ربط 21. يرتبط العامل الأول بجزيء مستقبل على
‏0 سطح ‎(DIAN‏ وبالتالي يتم توفير إشارة تنشيط أولى للخلايا ‎Salley‏ يتم تنشيط الخلايا. في نموذج ‎AT‏ يوفر الاختراع طريقة؛ ‎Cun‏ يكون مثبتاً على عامل تعدد الوحدات بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) عامل ثان يحفز جزيثاً ثانوياً على سطح الخلايا. يشتمل العامل الثاني على شريك ارتباط ‎«C2‏ حيث يمكن لشريك الارتباط02 الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط 22> من كاشف تعدد الوحدات؛ حيث يرتبط العامل الثاني بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة
‏5 القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ وموضع الربط 22. يرتبط العامل الثاني ‎salt‏
الثانوي على سطح ‎(WAY‏ وبالتالي يتم تحفيز الخلايا المنشطة. في هذا النموذج يمكن أن يحفز العامل الأول إشارة مرتبطة بمعقد 105/0003 في خلايا ‎T‏ وقد تكون عامل ربط يربط ‎CD3‏ ‏نوعياً. وفي هذا النموذج قد يكون الجزيء الثانوي على خلية ‎T‏ عبارة عن 6028 ويكون العامل الثاني الذي يريط الجزيء الثانوي عبارة عن كاشف ربط يربط ‎CD28‏ نوعياً. وفي هذه الحالة؛
يمكن اختيار العامل الأول الذي يربط 603 نوعياً من المجموعة المكونة من جسم مضاد ل 3 شظية جسم مضاد ثنائي التكافؤ من جسم مضاد ل 003؛ شظية جسم مضاد أحادي النسيلة من جسم مضاد ل 0003؛ وجزيء رابط ل 0003 بروتيني بخصائص ربط مماثلة للجسم المضاد. كذلك يمكن اختيار العامل الثاني الذي يريط 6028 نوعياً من المجموعة المكونة من جسم مضاد ل 0028؛ شظية جسم مضاد ثنائي التكافؤ جسم مضاد ل ‎(CD28‏ شظية جسم
0 مضاد أحادي النسيلة من جسم مضاد ل ‎«CD28‏ وجزيء رابط ل 0028 بروتيني بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد. وقد تكون شظية الجسم المضاد ثنائي ‎SSH‏ عبارة عن شظية ‎(Fab)2’‏ ‏أو شظية ‎Fy‏ ثنائية التكافؤ أحادية السلسلة بينما يمكن اختيار شظية الجسم المضاد أحادية التكافؤ من المجموعة المكونة من شظية ‎(Fab‏ شظية ‎(Fv‏ وشظية ‎Fv‏ أحادية السلسلة ‎+(SCFV)‏ جزيء رابط ل 603 بروتيني أو ‎CD28‏ بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد عبارة عن أبتامير»ميوتين
5 قائم على عديد ببتيد من ‎Alle‏ الليبوكالين» جسم سكري؛ بروتين قائم على سلسلة أنكيرين المتجاورة؛ بروتين قائم على السلسلة البلورية المتجاورة؛ أدنيكتين؛ وأفيمر. بوجه عام قد يكون العاملان الأول والثاني المستخدمان في الاختراع الحالي؛ على سبيل المثال؛ ‎Ble‏ عن جسم مضاد» شظية منه وجزيء رابط بروتيني بوظائف شبيهة بالجسم المضادة. أمثلة شظايا الأجسام المضادة (الناتجة عن معاودة الارتباط الجيني) عبارة عن ‎Fv Lad (Fab Lad‏
0 شظايا ‎Fv‏ أحادية السلسلة ‎(SCV)‏ شظية جسم مضاد ثنائي التكافؤؤ ‎Jie‏ شظية ‎((Fab)2'‏ أجسام ثنائية؛ أجسام ثلاثية )437-441 ,409 )1997( ‎aluali(lliades, P., et al., FEBS Lett‏ عشرية ) ,318 )2007( ‎Stone, E., et al., Journal of Immunological Methods‏ )88-94( وغير ذلك من الأجسام المضادة النطاقية ( ‎Holt, L.J., et al., Trends‏ ‎(Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490‏ وفي بعض النماذج قد يكون واحد أو أكثر من
5 مواضع ربط العامل الأول أو الثاني عبارة عن جزيء رابط بروتيني ثنائي التكافؤ صناعي مثل
ليبوكالين ميوتين دايمري يعرف ‎Lad‏ باسم 'ديوكالين". في بعض النماذج قد يكون للكاشف الرابط للمستقبل موضع ربط أحادي ثان؛ أي؛ قد يكون أحادي التكافؤ. تضم أمثلة العامل الأول أو الثاني أحادي ‎ES‏ لكن بشكل غير حصري؛ شظية جسم مضاد أحادية ‎HSH‏ جزيء رابط بروتيني بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد أو جزيء 110/ا. تضم أمثلة شظايا الأجسام المضادة أحادية التكافؤ, لكن بشكل غير حصري شظية ‎Fab‏ شظية ‎Fv‏ وشظية ‎Fv‏ أحادية السلسلة ‎¢(scFV)‏ بما في ذلك شظية ‎Fv‏ أحادية السلسلة ثنائية التكافؤ. على النحو المبين أعلاه؛ يكون مثال جزيء رابط بروتيني بوظائف شبيهة بالجسم المضادة عبارة عن ميوتين قائم على عديد ببتيد من عائلة اللببوكالين (انظر على سبيل المثال» طلب براءة الاختراع الدولي رقم (03/ 029462) ‎Beste et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A.‏ 0 )1898-1903 ,96 )1999( تضم مركبات ليبوكالين» ‎fie‏ بروتين الليبين الرابط» ليبوكالين المرتبط بإنزيم جيلاتيناز العدلاتي البشري؛ صميم البروتين الشحمي 0 البشري أو ليبوكالين الدمعي البشري مواضع رابطة للمركب الترابطي بشرية يمكن تعديلها حتى تريط هدفاً معيناً. تضم الأمثلة الأخرى على جزيء رابط بروتيني بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد يمكن استخدامه ككاشف رابط للمستقبل يرتبط نوعياً بجزيء المستقبل؛ لكن بشكل غير حصري؛ ما يعرف بالأجسام السكرية 5 (انظر على سبيل المثال طلب براءة الاختراع الدولي رقم (23879/96))؛ بروتينات قائمة على سلسلة أنكيرين متجاورة ( ,6 ,13 )2004( ‎Mosavi, L.K., et al., Protein Science‏ 1435-1448( أو سلسلة بلورية متجاورة ‎Ae)‏ سبيل المثال طلب براءة الاختراع الدولي رقم (01/ 04144))؛ البروتينات التي يتم وصفها في )2000( ‎Skerra, J.
Mol.
Recognit.‏ 167-187 ,13 80160005 مركبات تترانيكتين ومركبات أفيمر. تحتوي مركبات أفيمرء بما 0 في ذلك بروتينات أفيمر متعددة التكافؤ التي تم تطويرها بتبديل الإكسون في عائلة نطاقات المستقبلات البشرية؛ على ما يعرف بنطاقات ‎A‏ التي تكون على شكل سلاسل من النطاقات المتعددة في العديد من مستقبلات أسطح الخلايا ( ‎Silverman, J., et al., Nature‏ ‎(Biotechnology (2005) 23, 1556-1‏ تحتوي أدنيكتين» المشتقة من نطاق فيبرونيكتين بشري؛ على ثلاث عقد يمكن تصميمها بالهندسة الوراثية للارتباط بالأهداف على نحو يشبه الجلوييولين المناعي ) ‎Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in‏
‎«(Biotechnology (2006) 17, 653-658‏ وبالمثل تحتوي مركبات تترانيكتين» المشتقة من البروتين الترايمري البشري المقابل؛ على مناطق عقدية في نطاق ليمتين من النوع © يمكن تصميمه بالهندسة الوراثية للريط المرغوب فيه (نفس المرجع). وتكون شبيهات الببتيد؛ التي يمكن أن تعمل كمركبات ترابطية بروتينية؛ عبارة عن مركبات قليلة (ا١-ألكيل)‏ الجلايسين تختلف عن الببتيدات في أن السلسلة الجانبية موصلة بنتروجين أميد وليس ذرة كربون 0. وتعتبر شبيهات الببتيد نمطياً مقاومة لإنزيمات بروتياز وغير ذلك من الإنزيمات المعيّلة ويمكن أن تكون ذات نفاذية خلوية ‎Jel‏ بكثير من الببتيدات (انظر على سبيل المثال ‎Kwon, Y.-U., and‏ ‎(Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509‏ كذلك تكون الأمثلة الأخرى على الجزيئات البروتينية الرابطة المناسبة هي نطاق ‎and‏ ب ‎(EGF‏ نطاق ‎(Kringle 0‏ نطاق فيبرونيكتين من النوع ا؛ نطاق فيبرونيكتين من النوع ‎ell‏ نطاق فيبرونيكتين من النوع ااا نطاق ‎«PAN‏ نطاق ‎«Gla‏ نطاق ‎SROR‏ نطاق متبّط كونيتز/ تريبسين البنكرياسي البقري؛ تينداميستات» ‎Glad‏ مثبط إنزيم سيرين بروتياز من النوع ‎(Kazal‏ نطاق ‎Trefoil‏ (من النوع ‎(P‏ نطاق عامل ‎von Willebrand‏ من النوعية ؛ نطاق شبيه بذيفان التأقي؛ نطاق ‎«CUB‏ ‏تكرارية جلوبيولين درقي من النوع ا نطاق مستقبل ‎LDL‏ من الفئة ‎(A‏ نطاق ‎(Sushi‏ نطاق ‎clink 5‏ نطاق ثرمبوسبوندين من النوع ‎ol‏ نطاق جلوبيولين مناعي أو نطاق شبيه بالجلوبيولين المناعي (على سبيل المثال؛ الأجسام المضادة النطاقية أو الأجسام المضادة ثقيلة السلسلة الجملية)؛ نطاق ليكتين من النوع ©؛ نطاق ‎(MAM‏ نطاق عامل ‎von Willebrand‏ من ‎Agsill‏ ‏نطاق سوماتوميدين ‎eo‏ نطاق لبي به أربعة روابط ثنائية الكبربتيد من النوع ‎WAP‏ نطاق ‎F5‏ 8 من النوع ‎«C‏ نطاق هيموبيكسين»؛ نطاق 5112؛ نطاق ‎¢SH3‏ نطاق شبيه ب ‎EGF‏ من نوعية ‎ll. et al., Protein Eng (1997) 10, 949-57 ‏"أجسام كابا" (قارن‎ «C2 ‏اللامينين» نطاق‎ 0 «(Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309( ‏ما يعرف باسم "جسم مصغر"‎ ‏ما يعرف‎ «( Holliger et al., PNAS USA (1993)90, 6444-6448, ‏جسم ثنائي‎
Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659, or ‏"3055ل" (قارن‎ aul ‏جسم نانوي؛ جسم‎ ¢(Traunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52 ‏25 ميكرويء أفيلين» جسم أليف الارتباطء نوتين؛ يوبيكويتين» بروتين إصبع الزنك؛ بروتين ذاتي التألق الفلوري أو بروتين تكراري غني بالليوسين. ويكون مثال على جزيء حمض نووي بوظائف شبيهة
بالجسم المضادة عبارة عن أبتامير. يتم طي أبتامير في موتيفة ثلاثية الأبعاد محددة وبظهر ألفة ‎Ale‏ لبنية مستهدفة معينة. بالتحول الآن إلى كاشف تعدد الوحدات؛ يمكن أن يكون موضعا الريبط 21 و22 من عامل تعدد الوحدات متطابقين (انظر أيضاً المثال الوارد في شكل 3). في هذه الحالة؛ يمكن استخدام عامل تعدد وحدات أحادي. في النموذج الذي يتم فيه استخدام رابطة قابلة للعكس أولاً و؛ اختيارياً عامل ثان؛ يمكن تثبيت كاشف تعدد الوحدات على سطح صلب. ويمكن استخدام أي سطح صلب (حامل) في تثبيت كاشف تعدد الوحدات. تضم الأمثلة التوضيحية للأسطح الصلبة التي يمكن عليها تثبيت كاشف تعدد الوحدات خرزة مغناطيسية؛ خرزة بوليمرية؛ طبق مزرعة ‎(WDA‏ طبق عيار دقيق؛ غشاء؛ أو 0 ليفة مجوفة. وتستخدم الألياف المجوفة؛ على سبيل المثال» كمفاعل حيوي في ‎Quantum® Cell‏ ‎«Expansion System‏ المتاح من ‎.(Lakewood, CO, USA) TerumoBCT Inc.‏ ويكون الكاشف متعدد الوحدات مرتبطاً تساهمياً بالحامل الصلب في المعتاد؛ ومع ذلك؛ يمكن أيضاً استخدام تفاعلات غير تساهمية للتثبيت» على سبيل المثال على ركائز بلاستيكية؛ في حالة الرغبة في ذلك. وعلى النحو الذي يتم شرحه أيضاً بتفاصيل ‎ST‏ يمكن أن يكون كاشف تعدد الوحدات؛ 5 على سبيل ‎Jia)‏ عبارة عن استريبتيفيدين أو أفيدين ميوتين يربط بشكل قابل للعكس ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين. ويمكن أن ترتبط ميوتينات استريبتيفيدين هذه تساهمياً ‎(sb‏ سطح؛ على سبيل المثال» (خرزات من) الراتنج المستخدم في التنقية بالكروماتوجراف والمتاح تجارياً بهذه الصورة من ‎«GottingendBA GmbH‏ على سبيل المثالء ‎Sepharoses‏ 180109 -معا -م516 ‎Superflow®‏ ظمناعةك لألعف08ق ‎Strep-Tactin® Superflow® high‏ أر ‎Strep—‏ ‎Tactin® MacroPrep® 0‏ . الأمثلة التوضيحية الأخرى لكواشف تعدد الوحدات المتاحة تجارياً بسهولة هي راتتنجات كروماتوجراف الألفة الفلزية المثبتة ‎(IMAC)‏ مثل راتنجات ‎TALON®‏ ‎(Westburg, Leusden, The Netherlands)‏ التي يمكن استخدامها في التثبيت القابل للعكس للبروتينات المذيلة بقليل الهيستيدين (المذيلة بواسطة ‎(his‏ بوجه عام؛ بمعنى ‎cal‏ للريط القابل للعكس لعامل أول أو ثان يحمل كشربك ارتباط أول 1© أو شريك ارتباط ثان ‎C2‏ تذييل 5 قليل هستيدين مثل تذييل بنتا - أو هكسا-هستيدين. الأمثلة الأخرى على كواشف تعدد الوحدات
هي كالموديولين سيفاروز المتاح من ‎GE Life Sciences‏ الذي يمكن استخدامه مع عامل أول أو ثان يشتمل على ببتيد ربط كالموديولين كشربك الارتباط 1© أو ‎C2‏ أو سيفاروز؛ يقترن به جلوتاثيون. في هذه الحالة؛ يكون شريك الارتباط ‎C1‏ أو ‎C2‏ عبارة عن إنزيم جلوتاثيون -5- ترانسفيراز.
في نماذج أخرى لطريقة الاختراع يمكن أن يكون كاشف تعدد الوحدات في صورة قابلة للذويان. من حيث المبداً؛ يمكن استخدام نفس عوامل تعدد الوحدات كما في ‎Ala‏ كاشف تعدد وحدات ‎Cie‏ ‏على ‎als‏ صلب. ويكون كاشف تعدد الوحدات عبارة عن صورة قابلة ‎(Sarg (ols‏ على سبيل ‎(Jal‏ أن يكون عبارة عن أوليجومر ميوتين استريبتيفيدين» أوليجومر كالموديولين». مركب (أوليجومر) يوفر مجموعتين خالبتين ‎K‏ على الأقل؛ حيث يمكن للمجموعتين الخالبتين على الأقل
0 الارتباط بأيون فلز انتقالي» مما يجعل الشق ‎A‏ قادراً على الارتباط بتذيين ألفة قليل الهيستيدين؛ إنزيم جلوتاثيون -5-ترنسفيراز متعدد الوحدات؛ أو بروتين حامل معالج ببيوتين. على النحو الذي يتم تفسيره أعلاه؛ يضم العاملان الأول والثاني؛ بالإضافة إلى موضع الربط الذي يمكنه ربط جزيء مستقبل سطح الخلية المقابل» شريك ارتباط 1© أو 62 (يشار إليهما باسم 'شريك الارتباط ©" فيما يلي لسهولة الإشارة). ويمكن لشربك الارتباط © الارتباط بموضع ربط ‎Z‏
من كاشف تعدد الوحدات (2 تعني موضع الربط 21 أو موضع الربط 22 من كاشف تعدد الوحدات) ©. يمكن أن يكون للرابطة غير التساهمية المكوّنة بين شريك الارتباط © المضمنة في ‎Jalal‏ الأول أو الثاني وموضع (مواضع) الربط ‎Z‏ من كاشف تعدد الوحدات بأي طول ‎dilly‏ ‏مرغوب فيهماء ‎Lalla‏ أنها قابلة للقطع أو قابلة للعكس تحت الظروف التي يتم فيها تنفيذ طريقة الاختراع. ويمكن أن يكون لرابط التفكك ‎(KD)‏ للارتباط بين شريك الارتباط © المضمّن في
0 الكاشف الرابط للمستقبل وموضع الربط 2 من كاشف تعدد الوحدات قيمة بين ‎Mon‏ 2-10 مولار وحوالي 13-10 مولار. على هذا ‎sail)‏ يمكن أن يكون لهذه الرابطة القابلة للعكس؛ على سبيل ‎KD (Jal‏ من حوالي 2-10 مولار إلى حوالي 13-10 مولار؛ أو من حوالي 3-10 مولار إلى حوالي 12-10 مولار أو من حوالي 4-10 مولار إلى حوالي 1-10 1مولار؛ أو من حوالي 10- 5 مولار إلى حوالي 10-10مولار. ويمكن تحديد ‎KD‏ هذه الرابطة وكذلك معدل ‎koff (KD‏
5 و 00 للارابطة المكوّنة بين موضع الريط 8 للكاشف الرابط للمستقبل وجزيء المستقبل ‎Ll‏ وسيلة
مناسبة؛ على سبيل المثال؛ بالمعايرة بالتألق الفلوري؛ الفصل الغشائي الاتزاني أو رنين البلازمون السطحي. يمكن أن يضم الكاشف الرابط لجزيء المستقبل واحداً على الأقل؛ بما في ذلك اثنين؛ ثلاثة أو أكثر؛ شريكي ارتباط © ثانيين ويمكن أن يضم كاشف الألفة اثنين على الأقل؛ على سبيل المثال ‎AG‏ أريعة؛ خمسة؛ ستة؛ سبعة؛ ثمانية أو أكثر من مواضع الريط لشريك الارتباط المضمّن في الكاشف الرابط لجزيء المستقبل. على النحو الذي يتم وصفه في براءة الاختراع الأمريكية (7» 776» 562(« براءة الاختراع الأمريكية )8( 298» 782) أو طلب براءة الاختراع الدولي رقم 054065/2002يمكن اختيار أية توليفة من شربك الارتباط © وعامل ألفة بواحد أو أكثر من مواضع الربط ‎Z‏ المناظرة؛ طالما أن شربك الارتباط © وموضع الريط 2 من عامل الألفة يمكنهما الارتباط بشكل قابل للعكس أو تكوين وحدات متعددة ‏ في معقد (متعدد التكافؤ)؛ وهو ما 0 يتفق نمطيا مع أثر الشره. قد يكون شريك الارتباط المضمّن في العامل الأول أو الثاني عبارة عن قليل ببتيد؛ عديد ببتيد؛ بروتين حمض ‎cand Gog‏ سكريد؛ قليل سكريد؛ أو عديد سكريد. ويكون لشريك ارتباط ألفة أعلى لموضع ربط كاشف تعدد الوحدات من المادة الأخرى. تضم أمثلة شربك ارتباط مقابل؛ لكن بشكل غير ‎Gran‏ جزيء جلوبيولين مناعي؛ شظية منه وجزيء رابط بروتيني بوظائف شبيهة بالجسم 5 المضادة. في بعض النماذج يضم شربك الارتباط © المضمّن في العامل الأول أو الثاني بيوتين ويضم كاشف الألفة نظير استريبتيفيدين أو نظير أفيدين يرتبط بشكل قابل للعكس بالبيوتين. في بعض النماذج يضم شربك الارتباط © المضمّن في العامل الأول أو الثاني نظير بيوتين يرتبط بشكل قابل للعكس باستريبتيفيدين أو أفيدين» ويضم كاشف الألفة استريبتيفيدين» أفيدين» نظير 0 استريبتيفيدين أو يرتبط بشكل قابل للعكس نظير أفيدين بنظير بيوتين المقابل. في بعض النماذج الأخرى يضم شربك الارتباط © المضمّن في العامل الأول أو الثاني استرببتيفيدين أو أفيدين ربط ببتيد ويضم كاشف الألفة استريبتيفيدين؛ أفيدين» نظير استريبتيفيدين أو يرتبط نظير أفيدين بشكل قابل للعكس بالببتيد الرابط لاستريبتيفيدين أو أفيدين المقابل.
في بعض النماذج يكن أن يضم شربك الارتباط المضمّن في العامل الأول أو الثاني ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين ‎Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys‏ (متوالية رقم: 01) ويمكن أن يضم كاشف ‎daly)‏ (نظير) ميوتين استريبتيفيدين يشتمل متوالية الأحماض الأمينية ‎Vald4-Thr45—‏ ‏1846-7/(متوالية رقم: 02) في مواضع المتواليات 44 إلى 47 من استريبتيفيدين من النوع غير المعالج أو (نظير) ميوتين استريبتيفيدين يشتمل على متوالية الأحماض الأمينية ‎lledd—‏ ‎Gly45-Alad6-Argd7‏ (متوالية رقم: 03) في مواضع المتواليات 44 إلى 47 من استريبتيفيدين من النوع غير المعالج» ويتم وصف كل منهما في براءة الاختراع الأمريكية رقم (6؛ 103 493(« على سبيل المثال» وبتاحان تجارياً بالعلامة التجارية ©5060-78000. وقد تكون الببتيدات الرابطة لاستريبتيفيدين» على سبيل المثال؛ عبارة عن ببتيدات أحادية مثل '-م5060 ‎tag® 0‏ الذي يتم وصفه في براءة الاختراع الأمريكية رقم )¢5 506؛ 121)؛ على سبيل المثال؛ أو الببتيدات الرابطة لاستريبتيفيدين التي بها ترتيب تسلسلي من اثنين أو أكثر من الجزيئات الرابطة الفردية كتلك التي يتم وصفها في إصدار براءة الاختراع الدولي رقم (02/ 077018) أو براءة الاختراع الأمريكية رقم ‎(T)‏ 981 632). في نموذج ما يضم شريك الارتباط © للعامل الأول أو الثاني شقاً معروفاً لمن يتمتع بالمهارة في 5 المجال كتذييل ألفة. في نموذج كهذا يضم كاشف الألفة شريك ارتباط مناظراً» على سبيل المثال؛ جسم مضاد أو شظية جسم ‎cabins‏ معروف أنها ترتبط بتذييل الألفة. كبضعة أمثلة توضيحية لتذييلات ‎Ad)‏ يمكن أن يضم شريك الارتباط المضمّن في العامل الأول أو الثاني قليل هستيدين؛ نطاق جلوبيولين مناعي» بروتين رابط للمالتوز» إنزيم جلوتاثيون -8-ترنسفيراز ‎glutathione=S—‏ ‎«(GST)transferase‏ بروتين رابط للكيتين ‎(CBP) chitin binding protein‏ أو 0 ثيوريدوكسين؛ ببتيد رابط لكالموديولين ‎(CBP)‏ ببتيد ‎(FLAG‏ تذييل ‎HA‏ (المتوالية : ‎Tyr—‏ ‎Pro-Tyr-Asp-Val-Pro—Asp-Tyr-Ala‏ (متوالية رقم: 11))؛ ‎Juli‏ 6-/1١5/٠ا‏ (المتوائية:5لاا-لاا© -نا© ا-9+/-850/-]16/١-اا©-ع|١-مي8/-17-الا1»‏ (متوالية رقم: 12))؛ تذييل ‎«GIn-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp: dJisill) HSV‏ (متوالية رقم: 13((¢ القمة اللاصقة 17 ‎Ala—-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-GIn-GIn-Met-)‏ ‎Gly 5‏ (متوالية رقم:14))؛ البروتين الرابط للمالتوز ‎(MBP) maltose binding protein‏ القمة
اللاصقة ‎HSV‏ من المتوالية ‎GIn—-Pro—-Glu-Leu-Ala-Pro—-Glu-Asp—-Pro-Glu-Asp‏ ‏(متوالية رقم: 13) من جلايكويروتين نا في فيروس الهربس البسيط؛ القمة اللاصقة "7/6" من عامل النسخ الوراني ‎c-myc‏ بالمتوائية ‎Glu-GIn-Lys-Leu-lle-Ser-Glu-Glu-Asp—‏ ‏ا© ا(متوالية رقم: 15)؛ تذييل ‎V5‏ (المتوالية: ‎Gly-Lys—Pro-lle-Pro—Asn-Pro-Leu-‏ ‎(Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr 5‏ متوالية رقم: 16)؛ أو إنزيم جلوتاثيون -5- ترنسفيراز ‎.(GST)glutathione-S-transferase‏ في نموذج كهذا يمكن قطع المعقد المكوّن بين واحد أو أكثر من مواضع ربط كاشف تعدد الوحدات؛ في هذه الحالة جسم مضاد أو شظية جسم مضاد؛ ومولّد الضد تنافسياً بإضافة مولِّد الضد الحرء أي الببتيد الحر (تذييل القمة اللاصقة) أو البروتين الحر (مثل ‎MBP‏ أو ‎L(CBP‏ كذلك يمكن أن يكون تذييل الألفة ‎le‏ عن تذييل قليل نيوكليوتيد. 0 ويمكن استخدام تذييل قليل النيوكليوتيد هذاء على سبيل ‎(Jal)‏ للتهجين إلى قليل نيوكليوتيد مع متوالية تكميلية؛ وربطه أو تضمينه في كاشف ‎AY)‏ ‏في بعض النماذج يتم الارتباط بين شريك الارتباط © المضمّن في العامل الأول أو الثاني وواحد أو أكثر من مواضع ربط كاشف تعدد الوحدات في وجود كاتيون ثنائي ‎«gall‏ ثلاثي التكافؤ أو رباعي التكافؤ. في هذا الصدد في بعض النماذج يضم كاشف تعدد الوحدات كاتيون ثنائي التكافؤ ثلاثي التكافؤ أو ‎oly‏ التكافو. محمول؛ على سبيل المثال ‎dine‏ بعامل خلب مناسب. ويمكن أن يكون شريك الارتباط المضمّن في الكاشف الرابط للمستقبل في نموذج يضم ثقاً به؛ على سبيل المثال يكون معقداً مع؛ كاتيون ثنائي ‎«GES‏ ثلاثي التكافؤ أو رباعي التكافؤ. تضم أمثلة عامل خلب فازي ‎lle‏ لكن بشكل غير حصريء إيثيلين داي أمين» حمض إيثيلين داي أمين تترا أسيتيك ‎(EDTA) ethylenediaminetetraacetic acid‏ حمض إيثيلين جلايكول تترا أسيتيك ‎((EGTA)ethylene glycol tetraacetic acid .- 0‏ حمض داي إيثيلين تراي أمين بنتا أسيتيك ‎Gar NN (DTPA)‏ (كريوكسي ميثيل) جلايسين (يعرف أيضاً ‎pls‏ حمض نيتريلو تراي أسيتيك» ‎(NTA‏ أو حمض 1؛ 2-بيس (0-أمينوفينوكسي) إيثان-لا؛ لا 'لااء'ل١-تترا‏ أسيتيك ‎(BAPTA)‏ كمثال؛ يكون ‎EDTA‏ معقداً مع معظم الأيونات الفلزية أحادية التكافؤ» ثنائية التكافق ثلاثية التكافؤ ورباعية التكافؤء ومنها على سبيل المثال الكالسيوم (+682)؛ المنجنيز ‎(MN2+)‏ ‏5 النحاس ‎((Cul+)‏ الحديد ‎((Fe2+)‏ الكويلت ‎(Co3+)‏ والزركنيوم ‎«(Zrd+)‏ بينما ‎BAPTA‏
نوعي ل +0827. كمثال توضيحي؛ تتمثل طريقة عيارية مستخدمة في المجال في تكوين معقد بين تذييل قليل هستيدين وأيونات النحاس ‎((Cu2+)‏ النيكل ‎((Ni2+)‏ الكوبلت ‎((Co2+)‏ أو الزنك ‎((ZN2+)‏ وبتم توفيرها بواسطة عامل الخلب حمض تيتربلوتراي أسيتيك ‎(NTA)‏ ‏في بعض النماذج يضم شربك الارتباط © المضمّن في العامل الأول أو الثاني ببتيد رابط لكالموديولين ويضم كاشف الألفة متعدد الوحدات كالموديولين كالذي يتم وصفه في براءة الاختراع الأمريكية رقم (5؛ 985؛ 658) أو على ‎sail)‏ المبين في الطلب الحالي بالإشارة إلى شكل 2؛ على سبيل المثال. في بعض النماذج يضم شريك الارتباط © المضمّن في العامل الأول أو الثاني ببتيد ‎FLAG‏ ويضم كاشف الألفة جسماً ‎Tobias‏ يرتبط بالببتيد ‎(FLAG‏ على سبيل المثال الببتيد ‎(FLAG‏ حيث يرتبط بجسم مضاد 4511 أحادي النسيلة كالذي يتم وصفه في براءة الاختراع 0 الأمريكية رقم (4؛ 851 341). في أحد النماذج يضم شربك الارتباط © المضمّن في العامل الأول أو الثاني تذييل قليل هستيدين ويضم كاشف الألفة جسماً مضاداً أو أيون فلز انتقالي يريط تذييل قليل الهستيدين. يمكن أن يتم قطع كل هذه المعقدات الرابطة بالخلب بأيون فلزي؛ على سبيل المثال الخلب بالكالسيوم» على سبيل المثال بإضافة ‎EDTA‏ أو ‎EGTA‏ (أعلاه). يمكن تكوين وحدات متعددة من كالموديولين؛ الأجسام المضادة مثل 4511 أو الأيونات الفلزية المعالجة 5 بالخلب أو عوامل الخلب الحرة بالطرق التقليدية؛ على سبيل المثال بالمعالجة ببيوتين والتعقيد مع استريبتيفيدين أو أفيدين أو متعددات الوحدات ‎lie‏ أو بإدخال وحدات كريوكسيل بنائية في عديد سكريد؛ على سبيل المثال ديكستران» بشكل أساسي كذلك الذي يتم وصفه في ‎Noguchi, A, et‏ ‎al.
Bioconjugate Chemistry (1992) 3, 132-137‏ في خطوة أولى وربط كالموديولين أو الأجسام المضادة أو الأيونات الفلزية المعالجة بالخلب أو عوامل الخلب الحرة من خلال 0 مجموعات أمينو أولية بمجموعات كريوكسيل في عديد السكريد»؛ على سبيل المثال سلسلة ديكستران رئيسية بكيمياء كريودايميد التقليدية في خطوة ثانية. في هذه النماذج يمكن قطع الارتباط بين شريك الارتباط © المضمّن في العامل الأول أو الثاني وواحد أو أكثر من مواضع ربط ‎Z‏ بكاشف تعدد الوحدات من خلال الخلب بأيون فلزي. ويمكن ‎sha)‏ الخلب الفلزي؛ على سبيل ‎(JB‏ بإضافة ‎.EDTA J EGTA‏
في بعض ‎oz dal‏ تحديداً؛ إذا كان كاشف تعدد الوحدات في صورة ‎ALE‏ للذويان وكان قائماً على استريبتيفيدين أو أفيدين» يكون ‎Ble‏ عن أوليجومر أو بوليمر من استريبتيفيدين أو أفيدين أو أي ميوتين (نظير) من استريبتيفيدين أو أفيدين. موضع ربط 2 هو الربط الطبيعي لأفيدين أو استريبتيفيدين. ويمكن ربط الأوليجومر أو البوليمر المقابل تشابكياً بعديد سكريد. وفي أحد النماذج 5 .يتم تحضير الأوليجومرات أو البوليمرات من استريبتيفيدين أو أفيدين أو من ميوتينات (نظائر)
استريبتيفيدين أو أفيدين بإدخال وحدات كريوكسيل بنائية في عديد سكريد؛ على سبيل المثال ديكستران» بشكل أساسي كالذي يتم وصفه في ‎Noguchi, A, et al., Bioconjugate‏ ‎Chemistry (1992) 3,132-7‏ في خطوة أولى. بعد ذلك يمكن ربط استريبتيفيدين أو أفيدين أو نظائرهما من خلال مجموعات أمينو أولية من وحدة الليسين البنائية الداخلية و/ أو
0 طرف لح الحر بالنسبة لمجموعات كريوكسيل في سلسلة ديكستران الرئيسية بكيمياء كريودايميد التقليدية في خطوة ثانية. بالإضافة إلى ذلك يمكن الحصول على أوليجومرات أو بوليمرات مرتبطة تشابكياً من استريبتيفيدين أو أفيدين أو أي ميوتين (نظير) من استريبتيفيدين أو أفيدين بالريط التشابكي لجزيئات استريبتيفيدين أو أفيدين فردية (يشار إلى الدايمر المتجانس ‎ely‏ الوحدات من استريبتيفيدين أو أفيدين في الطلب الحالي باسم "جزيء فردي" أو أصغر وحدة بنائية لأوليجومر أو
بوليمر مقابل) من خلال الجزيئات ثنائية الوظيفة؛ التي تعمل كرابط مثل جلوتار داي ألديهايد أو بالطرق الأخرى التي يتم وصفها في المجال. من الممكن؛ على سبيل المثال؛ توليد أوليجومرات من ميوتينات استريبتيفيدين بإدخال» في خطوة ‎(Jol‏ مجموعات ثيول في ميوتين استريبتيفيدين ‎Sarg)‏ ‏أن يتم هذاء على سبيل المثال؛ بتفاعل ميوتين استريبتيفيدين2-إيمينو ثيولان (كاشف ‎(Trauts‏ ‏وبتنشيط» في مجموعاتى أمينية لتفاعل منفصل متاحة في ميوتين استريبتيفيدين. يمكن تحقيق هذا
0 اتتنشيط للمجموعات الأمينية بتفاعل ميوتين استريبتيفيدين مع روابط تشابكية ثنائية الوظيفة غير متجانسة متاحة تجارياً مثل سلفوسكسينيميديل 4-([١-ماليميدوميثيل)سيكلوهكسان‏ -1 -كريوكسيلات (سلفو ‎(SMCC‏ أو سكسينيميديل-6-[(]-ماليميدوبروبيوناميدو) هكسانوات ‎(SMPH)‏ في خطوة ثانية؛ يتم خلط منتجي التفاعل اللذين يتم الحصول عليهما على هذا النحو؛ مما يؤدي إلى تفاعل مجموعات الثيول الموجودة في دفعة من ميوتين استريبتيفيدين المعدّل مع الأحماض الأمينية
5 المنشطة (بمجموعات ماليميد وظيفية) منة الدفعة الأخرى لميوتين استريبتيفيدين المعدّل. بهذا التفاعل» تتكون متعددات وحدات /أوليجومرات ميوتين استريبتيفيدين. يمكن أن يكون لهذه
الأوليجومرات أي عدد مناسب من "الجزبئات الفردية" أو كتل استريبتيفيدين البنائية" بما يزيد على 3 ويمكن تنويع درجة تكون الأوليجومر وفقاً لحالة التفاعل (انظر شكل 24). بعد تفاعل هاتين الدفعتين من ميوتين استريبتيفيدين المعدّل؛ يتم نمطياً عزل كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان الأوليجومري من خلال كروماتوجراف استبعاد الحجم ويمكن استخدام أي جزءِ مرغوب فيه ‎CRISS‏ ‏5 تعدد وحدات. نمطياً؛ لا يكون للأوليجومرات (ولا تحتاج) وزناً جزيئياً واحداً لكنها تتسم في المعتاد بتوزيع وزني إحصائي ‎Jie‏ توزيع ‎(Gaussian‏ يمكن استخدام أي أوليجومر به أكثر من ثلاث وحدات رباعية متجانسة من استريبتيفيدين ‎JS)‏ بنائية؛ ‎NY‏ أكبر من أو يساوي 3))ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان. وقد يكون بالأوليجومرات؛ على سبيل المثال من 3 إلى 25 من الوحدات الرياعية المتجانسة من ستيبتافيدين ميوتين. بوزن جزيئي عبارة عن حوالي 50 كيلو دالتون 10 لميوتينات استريبتيفيدين مثل الميوتين "771 أو "012 الذي يتم وصفه بتفاصيل أكبر أدناه؛ تتسم هذه الأوليجومرات القابلة للذوبان بوزن جزيئي من حوالي 150 كيلو دالتون إلى حوالي 1250 كيلو دالتون. ولأن كل جزيء استريبتيفيدين/ميوتين به أربعة من مواضع ربط البيوتين يوفر كاشف تعدد الوحدات هذا 12 إلى 100 موضع ربط 21 (و2> ) على النحو المبين في الطلب الحالي. وفقاً للكشف المبين أعلاه؛ بالإضافة إلى كواشف تعدد الوحدات الأوليجومرية المحتوية فقط على رباعيات وحدات متجانسة مرتبطة تشابكياً من استريبتيفيدين» يمكن تفاعل ميوتينات استريبتيفيدين ‎del‏ الوحدات مع حامل للحصول على كواشف تعدد وحدات تستخدم في الاختراع الحالي. بالإضافة إلى التفاعل المبين أعلاه مع عديد سكريد؛ يمكن ‎Lad‏ استخدام بروتينات مقبولة فسيولوجياً أو صيدلانياً مثل ‎JY)‏ المصل (على سبيل المثال ‎JY)‏ المصل البشري ‎(HSA)‏ أو ‎JY‏ ‏المصل البقري ‎(BSA)‏ كبروتين حامل. في هذه الحالة؛ يمكن إقران ميوتين استريبتيفيدين (كرياعي 0 وحدات متجانس فردي أو كذلك في صورة أوليجومرات بحيث تكون ‎HSIN‏ من أو يساوي 3) مع البروتين الحامل من خلال التفاعل غير التساهمي. لهذا الغرض؛ يمكن أن يتفاعل ‎BSA‏ معالج بالبيوتين (متاح تجارياً من موزدين متنوعين ‎Sigma 10600011508: Scientific (fic‏ ‎Aldrich‏ أو ‎Vectorlabs‏ كبضعة أمثلة فحسب) مع ميوتين استريبتيفيدين. عند القيام بهذاء ترتبط بعض أوليجومرات استريبتيفيدين بشكل غير تساهمي من خلال واحد أو أكثر من مواضع 5 ربط البيوتين (21؛ £2( بالبروتين الحامل المعالج بالبيوتين» مما يجعل غالبية مواضع ربط ‎Z1)‏
2) الأوليجومر متاحة لربط العوامل مثل العامل الأول واختيارياً العامل الثاني ‎(gly‏ عامل آخر على النحو المبين في الطلب الحالي. على هذا النحو؛ بهذه الطريقة يمكن تحضير كاشف تعدد وحدات قابل للذويان به مجموعة من مواضع ربط 21 بشكل ملائم (انظر شكل 24). بشكل بديل؛ يمكن إقران ميوتين استريبتيفيدين (كرياعي وحدات متجانس فردي أو كذلك في صورة أوليجومرات ب «أكبر من أو تساوي 3) تساهمياً مع حامل تخليقي ‎die‏ جزيء بولي إيثيلين جلايكول (6ع0). يمكن استخدام أي جزيء ‎PEG‏ مناسب لهذا الغرض» طالما أن جزيء 6ع"اوكاشف تعدد الوحدات المقابل يقبلان الذويان. ‎baa‏ يكون جزيء ‎PEG‏ حتى وزن جزيئي عبارة عن 1000 دالتون قابلاً للذويان في الماء أو أوساط المزارع التي يمكن استخدامها في الاختراع الحالي. يمكن تحضير كاشف تعدد الوحدات الذي أساسه ‎PEG‏ هذا بسهولة باستخدام جزيئات ‎PEG‏ منشطة 0 متاحة تجارياً (على سبيل المثال» مشتقات ‎PEG-NHS‏ متاحة من ‎NOF North America‏ ‎«Corporation, Irvine, California, USA‏ أو مشتقات ‎PEG‏ المنشطة المتاحة من ‎(Creative PEGWorks, Chapel Hills, North Carolina, USA‏ مع المجموعات الأمينية من ميوتين استريبتيفيدين. في ظل استريبتيفيدين أو استريبتيفيدين من نوع غير معالج (1000-استريبتيفيدين)؛ يشار إلى متوالية 5 الأحماض الأمينية التي يتم الكشف عنها بواسطة ‎Argarana et al., Nucleic Acids Res.‏ 1871-2 (1986) 14. ميوتينات استريبتيفيدين عبارة عن عديدات ببتيد تتميز عن متوالية النوع غير المعالج من استريبتيفيدين بواحد أو أكثر من استبدالات؛ حذوفات أو إضافات الأحماض الأمينية والتي تحتفظ بخصائص ربط ]/1-استريبتيفيدين. عديدات الببتيد الشبيهة باستريبتيفيدين وميوتينات استريبتيفيدين عبارة عن عديدات ببتيد مكافئة مناعياً بشكل أساسي للنوع غير المعالج ‎Ge 0‏ استريبتيفيدين ويمكنها بشكل خاص ربط البيوتين» مشتق بيوتين أو نظائر البيوتين بنفس الألفة أو ألفة مختلفة عن ]0-استريبتيفيدين. وقد تحتوي عديدات الببتيد أو ميوتينات استريبتيفيدين الشبيهة باستريبتيفيدين على أحماض أمينية ليست جزءاً من النوع غير المعالج من استريبتيفيدين أو يمكن أن تضم جزءاً فقط من النوع غير المعالج من استريبتيفيدين. كذلك تكون عديدات الببتيد الشبيهة باستريبتيفيدين عبارة عن عديدات ببتيد غير مطابقة للنوع غير المعالج من استريبتيفيدين» لأن العائل لا تكون به الإنزيمات المطلوية لتحويل عديد الببتيد الذي ينتجه العائل إلى بنية من
النوع غير المعالج من استريبتيفيدين. كذلك يضم الاصطلاح ‎cle by putin ial‏ وحدات من ‎Gaudin il‏ ودايمرات استريبتيفيدين» خصوصاً رياعيات الوحدات المتجانسة من استريبتيفيدين» الدايمرات المتجانسة من استريبتيفيدين؛ ‎Gleb‏ الوحدات غير المتجانسة من استريبتيفيدين والدايمرات غير المتجانسة ستريبتافيدين. تضم كل وحدة فرعية في المعتاد موضع ربط للبيوتين أو نظائر البيوتين أو للببتيدات ‎blll‏ لاستريبتيفيدين. يتم تقديم أمثلة على مركبات استريبتيفيدين أو ميوتينات استريبتيفيدين» على سبيل المثال» في طلب براءة الاختراع الدولي )02077/68(¢ براءة الاختراع الألمانية رقم )19641876 1)؛ براءة الاختراع الأمريكية رقم )6( 022« 951)؛ طلب براءة الاختراع الدولي (98/ 40396) أو طلب براءة الاختراع الدولي (96/ 24606). في نموذج مفضل؛ تكون مركبات ميوتين استريبتيفيدين المستخدمة ككاشف تعدد وحدات هي 0 مركبات ميوتين استريبتيفيدين التي يتم وصفها في براءة الاختراع الأمريكية رقم (6» 103 493؛ 6( وكذلك في براءة الاختراع الألمانية (196 41 876 .3). تضم ميوتينات استريبتيفيدين طفرة واحدة على الأقل في منطقة مواضع الأحماض الأمينية 44 إلى 53 بناء على متوالية الأحماض الأمينية في النوع غير المعالج من استريبتيفيدين. يفضل ميوتينات استريبتيفيدين هامشي؛ حيث تبدأ عند الطرف ‎AN‏ منطقة الأحماض الأمينية 10 إلى 16 من النوع غير المعالج من استريبتيفيدين 5 وتنتهي عند الطرف © في منطقة الأحماض الأمينية 133 إلى 142 من النوع غير المعالج من استريبتيفيدين. وتضم أمثلة ميوتينات استريبتيفيدين المفضلة هذه حمضاً أمينياً أليفاتياً غير آلف للماء وحمضاً بدلاً من ‎GIU‏ في الموضع 44؛ أي حمض أميني في الموضع 45؛ حمض أميني أليفاتي غير آلف للماء في الموضع 46 أو/و حمض أميني قاعدي بدلاً من 1/81 في الموضع 7. وقد يكون ميوتين استريبتيفيدين عبارة عن ميوتين يشتمل على متوالية الأحماض الأمينية 0 | 8144-7345-81846-20947/ا(متوالية رقم: 02) في مواضع المتواليات 44 إلى 47 أو (نظير) ميوتين استريبتيفيدين يشتمل على متوالية الأحماض الأمينية-1846/-1644-645 7زمتوالية رقم: 03) في مواضع المتواليات 44 إلى 47 من استريبتيفيدين من النوع غير المعالج. يتم وصف هذه الميوتينات في براءة الاختراع الأمريكية رقم )6< 103 493)؛ على سبيل المثال» وتكون متاحة تجارياً من ‎IBA GMbH‏ في صورة ميوتين ‎"M1"‏ وميوتين ‎AIIM"‏ ‏5 التتجارية ‎Strep-Tactin®‏
يمكن استخدام طريقة وفقاً للاختراع الحالي في بعض النماذج في استنفاد عينة كواشف تم استخدامها في السابق في تمدد الخلايا. وقد يوجد العامل الأول أو الثاني والشريك الحر المقابل (عامل التنافس)؛ على سبيل المثال» مضمناً في ناتج التصفية التتابعية في طريقة تمدد كتلك التي يتم وصفها أعلاه. وبطريقة وفقاً للاختراع قد تكون هذه الكواشف مزالة بشكل أساسي على الأقل؛
بما في ذلك بشكل كامل؛ من عينة؛ على سبيل المثال من مجموعة خلايا. كمثال توضيحي؛ يمكن استنفاد عامل أول أو ثان على النحو المحدد أعلاه من عينة إلى مستويات أقل من حد امتشاف على سبيل المثال ‎FACS‏ أو بقعة ويسترن. ويمكن أن يكون قد تم استخدام كاشف تنافس (شريك ارتباط حر أول أو ثان أو نظير لهما) لإنهاء والتحكم في تمدد وإطلاق مجموعة الخلايا من عامل تعدد الوحدات. وقد يكون بكاشف التنافس هذا موضع ربط يمكنه الارتباط نوعياً بموضع ربط ‎Z‏
0 لكاشف الألفة في "خرطوشة الإزالة" من طلب براءة الاختراع الدولي رقم (2013/ 124474). في نموذج كهذا يمكن أن تعمل الطريقة المقابلة الواردة في الاختراع على استنفاد العاملين الأول والثاني وكاشف التنافس» بما في ذلك إزالتهما. يمكن إجراء طريقة وفقاً للاختراع الحالي عند أية درجة حرارة لا تقل عندها حيوية مجموعة الخلايا بشكل أساسي على الأقل. حين يشار في الطلب الحالي إلى ظروف غير ضارة بشكل أساسي على
5 الأقل؛ أو غير متلفة أو لا تضعف الحيوية بشكل أساسي على الأقل؛ يشار إلى فيها تكون النسبة المئوية لمجموعة الخلايا النمراد تمديدها بصلاحية كاملة؛ على الأقل 70 96؛ بما في ذلك على الأقل 75 96 على الأقل 80 96 على الأقل 85 96 على الأقل 90 96 على الأقل 92 % على الأقل 95 96 على الأقل 97 % على الأقل 98 96 على الأقل 99 96 أو على ‎JY)‏ 99.5 96. في بعض النماذج يتم إجراء طريقة وفقاً للاختراع عند درجة حرارة تبلغ حوالي
0 20م أو أكثر. اعتماداً على مجموعة الخلايا المراد تمديدها يمكن أن يكون نطاق درجات ‎Sha‏ ‏مناسب على سبيل المثال من حوالي 20 م إلى حوالي 45 م؛ بما في ذلك من حوالي 25 م إلى حوالي 40 ‎cp‏ أو من حوالي 32 م إلى 37 م. وفي بعض النماذج يتم إجراء طريقة وفقاً للاختراع عند قيمة ‎dad‏ حرارة ثابتة؛ أو عند قيمة درجة حرارة مختارة + حوالي 5 م» +حوالي 4 ‎co‏ + حوالي 3 م + حوالي 2 ‎Mata‏ 1 .م أو + حوالي 0.5 م. ويمكن لمن يتمتع
بالمهارة في المجال تجريبياً تحديد درجة حرارة مناسبة؛ مع الأخذ في الاعتبار طبيعة الخلايا وظروف التمدد. نمطياً يتم تمديد الخلايا البشرية عند درجة حرارة مثل 37 م. في نموذج آخرء يوفر الاختراع طريقة تتم في المختبر لتمديد مجموعة من ‎(DAD‏ حيث تشتمل على ملامسة عينة مشتملة على مجموعة من الخلايا مع كاشف لتعدد الوحدات؛ وحيث يكون كاشف تعدد الوحدات في صورة قابلة للذويان ويكون مثبتاً عليه (مرتبطاً به) عامل أول يوفر إشارة
تنشيط أولى للخلايا. يشتمل كاشف تعدد الوحدات على موضع ربط واحد على الأقل 21 ‎Ll‏ ‏العامل الأول حيث يشتمل العامل الأول على شربك ارتباط واحد على الأقل 01؛ وحيث يمكن لشريك الارتباط ‎C1‏ الارتباط بموضع ربط ‎Z1‏ من كاشف تعدد الوحدات. يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة المكوّنة بين ‎clips‏ الارتباط ‎C1‏ وموضع ربط ‎Z]‏
0 ويرتبط العامل الأول بجزيء مستقبل على سطح ‎(DIAN‏ وبالتالي يتم توفير إشارة تنشيط أولى للخلايا وبالتالي يتم تنشيط الخلايا. من الملاحظ صراحة في الطلب الحالي أنه عند استخدام عامل تعدد وحدات قابل للذويان» ليس ضرورياً أن تكون الرابطة بين شريك الربط ‎C1‏ وموضع الربط 21 قابلة للعكس. في نموذج ثان يكون مثبتاً على عامل تعدد الوحدات (مرتبطاً به) عامل ثان يحفز ‎Wis‏ ثانوياً
5 على سطح ‎(DAY‏ حيث يشتمل العامل الثاني على شريك ارتباط 02؛ وحيث ‎(Kay‏ لشريك الارتباط ‎C2‏ الارتباط بموضع ربط ‎Z2‏ من كاشف تعدد الوحدات. يرتبط العامل الثاني بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ وموضع الريط 22؛ وحيث يرتبط العامل الثاني بالجزيء الثانوي على سطح الخلاياء وبالتالي يحفز الخلايا المنشطة. في أحد نماذج هذه الطريقة الثانية. يمكن أن تكون الرابطة المكوّنة بين شربك الارتباط ‎CI‏
0 وموضع الربط21 غير قابلة للعكس و/ أو يمكن أيضاً أن تكون الرابطة المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ وموضع الربط 22 غير قابلة للعكس. في نموذج مختلف لهذه الطريقة الثانية؛ قد تكون الرابطة المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C1‏ وموضع ‎La)‏ 21 قابلة للعكس. كذلك قد تكون الرابطة المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ وموضع الربط ‎A472‏ للعكس. في هذه الحالة؛ قد يكون ثابت تفكك ‎(Kd)‏ الارتباط القابل للعكس بين موضع
— 6 5 — الربط 21 المذكور وشريك الارتباط ‎C1‏ المذكور و/ أو الربط القابل للعكس بين موضع الربط ‎Z2‏ ‏المذكور وشربك الارتباط ‎C2‏ المذكور بين 2-10 مولار و0 13-1 مولار . في هذه الطريقة الثانية القائمة على كاشف تعدد وحدات قابل ‎(lsd‏ يمكن استخدام الكاشف الأول والثانى وكذلك كاشف تعدد الوحدات وكافة الكواشف ومجموعات الخلايا الأخرى بخلاف ذلك بنفس الطريقة التي يتم الكشف عنها أعلاه للطريقة التى تستفيد من الرابطة القابلة للعكس بين العامل الأول أو الثانى وكاشف تعدد الوحدات. الأدوات على (1) كاشف تعدد وحدات؛ حيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات على موضع ربط واحد على الأقل ‎Z‏ ‏0 للربط القابل للعكس لعامل أول؛ )2( عامل أول يرتبط بجزيء مستقبل على سطح الخلايا ¢ وبالتالي يتم توفير إشارة تنشيط أولى للخلايا ويالتالى تنشيط الخلاياء وحيث يشتمل العامل الأول على شريك ارتباط واحد على الأقل ‎C1‏ ¢ وحيث يمكن لشريك ‎J‏ لارتباط 01 لارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط 1 لكاشف تعدد الوحدات» وحيث يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس 5 1 المكوّنة بين شريك ‎f‏ لارتباط 1 ‎C‏ وموضع ‎Z 1 dal‏ و (3) عامل ثان يحفز جزبثاً ثانوياً على سطح الخلاياء حيث يشتمل العامل الثاني على شربك ارتباط ‎C2‏ ¢ وحيث يمكن لشريك ‎J‏ لارتباط 02 لارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط 2 لكاشف تعدد ‎clan gl)‏ وحيث يرتبط العامل الثانى بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ وموضع الريط 2م وحيث يرتبط العامل الثاني بالجزيء الثانوي على 0 سطح الخلاياء؛ وبالتالي يتم تحفيز الخلايا المنشطة. الأدوات على
(1) كاشف تعدد وحدات؛ حيث يكون كاشف تعدد الوحدات في صورة قابلة للذويان ويشتمل على موضع ربط واحد على الأقل 2 للريط القابل للعكس لعامل أول؛ (2) عامل أول يرتبط بجزيء مستقبل على سطح ‎(LAN‏ وبالتالي يتم توفير إشارة تنشيط أولى للخلايا ‎Jilly‏ تنشيط الخلاياء وحيث يشتمل العامل الأول على شربك ارتباط واحد على الأقل ‎«C1 5‏ وحيث يمكن لشربك الارتباط 61 الارتباط بموضع ربط 21 لكاشف تعدد الوحدات؛ وحيث يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط1© وموضع الربط 21. وقد تشتمل هذه المجموعة الثانية من الأدوات الكاشفة على (3) عامل ثان يحفز ‎lia‏ ثانوياً على سطح ‎(LOAN‏ وحيث يشتمل العامل الثاني على شربك ارتباط ‎«C2‏ وحيث يمكن لشريك الارتباط 0 2الارتباط بموضع ربط ‎Z2‏ من كاشف تعدد الوحدات؛ وحيث يرتبط العامل الثاني بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ وموضع الريط ‎Z2‏ ‏تستخدم ‎de gana‏ الأدوات على النحو الذي يكشف عنه الطلب الحالي بشكل خاص حين تكون مجموعة الخلايا عبارة عن مجموعة خلايا لمفية. وفقاً للكشف المبين أعلاه؛ يوفر الاختراع أيضاً كواشف تعدد وحدات جديدة وتركيبة جديدة تشتمل على كواشف تعدد وحدات يمكنها تمديد مجموعة الخلايا. ويكون كاشف تعدد الوحدات هذا الذي يمكنه تمديد مجموعة من الخلايا عبارة عن كاشف تعدد وحدات في صورة قابلة للذويان ويشتمل على موضع ربط واحد على الأقل 21 للربط القابل للعكس لعامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى ‎(LDA‏ حيث يكون مثبتاً على كاشف تعدد الوحدات بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) العامل الأول المذكور الذي يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا؛ وحيث يشتمل العامل الأول على شربك ارتباط واحد 0 على الأقل 01؛ وحيث يمكن لشريك الارتباط 1© الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط واحد على الأقل 21 لكاشف تعدد الوحدات» وحيث يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C1‏ وموضع الربط 21. وينبغي ملاحظة أنه يمكن أن يكون ‎Tide‏ على عامل تعدد الوحدات هذا أي من العامل الأول الذي يصفه الطلب الحالي.
كذلك يشتمل كاشف تعدد الوحدات الوارد في الاختراع على موضع ربط واحد على الأقل ‎Z2‏ للريط القابل للعكس لعامل ثان يحفز جزيثاً ثانوياً على سطح ‎(DAY‏ وحيث يكون مثبتاً على كاشف تعدد الوحدات بشكل قابل للعكس ‎Unie)‏ به) ‎Jalal)‏ الثاني الذي يحفز جزيئاً ثانوياً على سطح الخلاياء وحيث يشتمل العامل الثاني على شربك ارتباط ‎«C2‏ وحيث ‎(Say‏ لشريك الارتباط2 الارتباط بموضع ربط واحد على الأقل 22 لكاشف تعدد الوحدات. وفي هذا النموذج يرتبط العامل الثاني
بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ وموضع الريط ‎Z2‏ ‏كذلك بشكل يتفق مع الكشف المبين أعلاه؛ يمكن لكاشف تعدد الوحدات هذا تمديد مجموعة خلايا لمفية أو مجموعة فرعية موجودة في مجموعة الخلايا اللمفية. ويمكن أن تكون مجموعة الخلايا اللمفية المراد تمديدها عبارة عن أية مجموعة مناسبة؛ على سبيل ‎(Jha)‏ مجموعة خلايا 8؛
0 مجموعة ‎WA‏ 1 أو مجموعة الخلايا القاتلة الطبيعية. قد تكون مجموعة الخلايا ‎Ble T‏ عن مجموعة ‎WIA‏ 1 نوعية ‎cain Alga‏ مجموعة ‎T WIA‏ مساعدة؛ خلية ‎T‏ سامة ‎(al‏ خلية 7 ذاكرة؛ خلية ‎T‏ تنظيمية؛ أو مجموعة خلايا آ قاتلة طبيعية. وبالتالي؛ في هذه النماذج لكاشف تعدد الوحدات يمكن للعامل الأول تحفيز إشارة مرتبطة بمعقد 105/003 في ‎T WIA‏ وقد يكون العامل الأول الموجود في كاشف تعدد الوحدات على هذا النحو عبارة عن كاشف ربط يريط نوعياً
‎«CD3 5‏ بينما قد يكون العامل الثاني الذي يريط الجزيء الثانوي عبارة عن عامل ربط يريط نوعياً 8 أو ‎.CD137‏ ‏في نماذج كاشف تعدد الوحدات قد يكون العامل الأول الذي يريط نوعياً 603 عبارة عن جسم مضاد ل 0103؛ شظية جسم مضاد ثنائي التكافؤؤ من جسم مضاد ل 0103؛ شظية جسم مضاد أحادي التكافؤ من جسم مضاد ل 003؛ و/ أو جزيء ربط 0003 بروتيني بخصائص ربط شبيهة
‏0 بالجسم المضاد. في هذه النماذج؛ قد يكون العامل الثاني الذي يربط نوعياً ‎CD28‏ أو 00137 عبارة عن جسم مضاد ل 0028؛ شظية جسم مضاد ثنائي التكافؤؤ من جسم مضاد ‎J‏ 0028؛ شظية جسم مضاد أحادي التكافؤ من جسم مضاد ل 00028؛ جزيء رابط ل ‎CD28‏ بروتيني بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد؛ جسم ‎alias‏ ل 010137؛ شظية جسم مضاد ثنائي التكافؤ من جسم مضاد ل 00137؛ شظية جسم مضاد أحادي التكافؤ من جسم مضاد ل 00137؛
‏5 جزيء رابط ل 60137 بروتيني بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد؛ المركب الترابطي -4
8. وأي خليط منها. على هذا ‎sail‏ يمكن أن يكون مثبتاً على كاشف تعدد الوحدات الوارد في الاختراع بوجه عام نوع واحد من عامل ‎Jol‏ وخليط من عوامل ثانية؛ على سبيل ‎«JB‏ جسم مضاد ل 003 كعامل أول وعلى سبيل المثال»؛ جسم مضاد ل ‎CD28‏ ومركب ترابطي 4-188 كعوامل ثانية (مشتركة).
إذا أريد استخدام كاشف تعدد الوحدات لتمدد خلايا 8؛ قد يكون العامل الأول المثبّت على كاشف تعدد الوحدات عبارة عن كاشف ربط يربط ‎Les‏ 040© أو ‎.CD137‏ ووفقاً للكشف الذي يبينه الطلب الحالي؛ في هذه النماذج يمكن اختيار كاشف الريط الأول الذي يريط ‎CD40 Legs‏ أو 7 من جسم مضاد ل ‎«CD40‏ شظية جسم مضاد ثنائي التكافؤ من جسم مضاد ل 0040؛ شظية جسم مضاد أحادي التكافؤ من جسم مضاد ل 00040؛ وجزيء ربط 0040 بروتيني
0 بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد أو جسم مضاد ل 00137؛ شظية جسم مضاد ثنائي التكافؤ من جسم مضاد ل 00137؛ شظية جسم مضاد أحادي التكافؤ من جسم مضاد ل 7 جزيء رابط ل 00137 بروتيني بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد؛ ومركب ترابطي ‎CD40‏ (00154). كذلك وفقاً للكشف العام للاختراع الحالي؛ في كاشف تعدد الوحدات على النحو المبين في الطلب 5 الحالي يمكن أن يكون موضعا الربط 21 و22 من كاشف تعدد الوحدات متطابقين. على النحو المبين ‎edad‏ يمكن أن يشتمل كاشف تعدد الوحدات هذا على أوليجومر أو بوليمر استريبتيفيدين» أوليجومر أو بوليمر أفيدين؛ أوليجومر أو بوليمر من نظير استريبتيفيدين يربط البيوتين بشكل ‎ME‏ ‏للعكس» أوليجومر أو بوليمر من نظير أفيدين يربط البيوتين بشكل قابل للعكس؛ كاشف يشتمل على الأقل على مجموعتين خالبتين كا حيث يمكن للمجموعتين الخالبتين على الأقل الارتباط 0 بأيون فاز انتقالي؛ وهو ما يتيح للكاشف الارتباط بتذييل ألفة قليل الهستيدين؛ إنزيم جلوتاثيون -5- ترنسفيراز متعدد الوحدات؛ كالموديولين متعدد الوحدات ‎dala (pig png‏ معالج بالبيوتين. تشتمل تركيبة جديدة يوفرها الطلب الحالي يمكنها تمديد مجموعة من الخلايا على )1( كاشف تعدد وحدات ‎(Jol‏ حيث يكون كاشف تعدد الوحدات الأول في صورة قابلة للذويان ويشتمل على موضع ربط واحد على الأقل 21 للريط القابل للعكس لعامل أول يوفر إشارة تنشيط
أولى للخلاياء حيث يون مثبتاً على كاشف تعدد الوحدات الأول بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) ‎Jalal‏ الأول المذكور الذي يوفر إشارة تنشيط أولى للخلاياء وحيث يشتمل العامل الأول على شربك ارتباط واحد على الأقل ‎«C1‏ وحيث ‎(Ka‏ لشريك الارتباط ‎C1‏ الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع الربط الواحد على الأقل 21 من كاشف تعدد الوحدات» وحيث يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C1‏ وموضع الربط ‎5Z1‏ ‏)2( كاشف تعدد وحدات ثان؛ حيث يكون كاشف تعدد الوحدات الثاني في صورة قابلة للذويان ويشتمل على موضع ربط واحد على الأقل 22 للريط القابل للعكس لعامل ثان يحفز جزيثاً ثانوياً على سطح الخلاياء حيث يكون مثبتاً على كاشف تعدد الوحدات بشكل قابل للعكس (مرتبطاً به) 0 العامل الثاني المذكور الذي يحفز جزيثاً ثانوياً على سطح الخلايا؛ء حيث يشتمل العامل الثاني على شريك ارتباط ‎«C2‏ وحيث يمكن لشربك الارتباط 62 الارتباط بموضع الربط الواحد على الأقل ‎Z2‏ ‏لكاشف تعدد الوحدات»؛ وحيث يرتبط العامل الثاني بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة المكوّنة بين شربيك الارتباط ‎C2‏ وموضع ‎Jal‏ 22. هذه التركيبة الجديدة؛ على سبيل المثال؛ هي خليط التفاعل المستخدم في المثال 13؛ وفيه تم 5 تفعيل كاشفي تعدد وحدات منفصلين إما بشظية ‎Fab‏ 0003 وحدها أو شظية ‎aCD28 Fab‏ وحدها. يلاحظ في هذا السياق؛ أنه اتضح في مثال 13 أن هذه التركيبة تتسم بنفس كفاءة تمدد كاشف تعدد وحدات أحادي ‎cli‏ عليه العامل الأول والعامل الثاني بشكل مشترك. على هذا ‎gal‏ حيث يكون الاستخدام المجمّع لاثنين أو أكثر من كواشف تعدد الوحدات المفعلة فردياً بنوع واحد فقط من الكواشف (على سبيل المثال؛ عامل أول واحد أو عامل ثان واحد) مكافثاً وظيفياً 0 الاستخدام كاشف تعدد وحدات واحد مشترك مثبت عليه عامل أول وعامل ثان للتمدد. في هذا ‎gland)‏ يلاحظ أيضاً أنه يتم تفعيل كاشف تعدد الوحدات الوارد في الاختراع الحالي بكثير من ‎algal‏ (على سبيل المثال؛ واحد؛ اثنين؛ ثلاثة؛ أربعة أو حتى أكثر من العوامل) المراد استخدامها في تمدد مجموعة ‎WIA‏ مختارة. وقد يوفر عامل ثالث أو رابع» على سبيل المثال؛ حافزاً لتمدد مجموعة فرعية مرغوب فيها من الخلايا. انظر في هذا السياق؛ على سبيل المثال؛ مثال 13 الذي 5 .تم فيه تفعيل كواشف تعدد الوحدات القابلة للذويان بشكل قابل للعكس بثلاثة كواشف؛ تحديداً شظية
— 1 6 — ‎qCD3 Fab‏ ككاشف أول» شظية ‎Fab‏ 00028 ككاشف ثان وشظية ‎Fab‏ 0008 ككاشف ثالث لإثراء المجموعة الفرعية من خلايا 1 +608 فى عينة من مجموعة من ‎WA‏ 1 +603 (الخلايا اللمفية). باستخدام هذه التوليفات من العوامل التي يمكن تثبيتها جميعاً بشكل قابل للعكس على نفس كاشف تعدد الوحدات؛ يتيح الاختراع الحالي إمكانية التمديد التفضيلي أو الإثراء الانتقائي لأية مجموعة خلايا (فرعية) من ‎die‏ على سبيل المثال؛ تشتمل على عدد متنوع من
المجموعات الفرعية المختلفة. في هذا السياق؛ يلاحظ أنه يمكن مع ذلك لهذا الغرض استخدام ثلاثة كواشف تعدد وحدات مختلفة؛ على سبيل المثال» كاشف تعدد وحدات أول مفعّل بشظية ‎Fab‏ 00103 فقط؛ كاشف تعدد وحدات ثان مفعّل بشظية ‎Fab‏ 1028» وكاشف تعدد وحدات ثالث مفعّل بشظية ‎Fab‏ 0008. بالمثل؛ يمكن استخدام كاشفي تعدد وحدات مختلفين فقط
كاشف تعدد وحدات أول ‎SETI‏ بشظية ‎Fab‏ 6103 فقط وكاشف تعدد وحدات ثان ‎BET‏ بشظية ‎Fab‏ 00028 وشظية ‎Fab‏ 0008. وبالتالي؛ يتيح الاختراع الحالي تصميم أي نوع من كواشف التمدد غير المرغوب فيها بطريقة نمطية. يوفر الاختراع أيضاً طريقة تتم في المختبر للتمديد التسلسلي لمجموعة من الخلايا اللمفية؛ حيث تشتمل مجموعة الخلايا اللمفية على خلايا 1. تشتمل هذه الطريقة على
5 ملامسة ‎die‏ تشتمل على خلية 1 حيث تشتمل على مجموعة من ‎WAY‏ اللمفية مع كاشف لتعدد الوحد ات ؛ حيث يكون كاشف تعدد الوحدات في صورة قابلة للذويان ويكون مثبتاً عليه بشكل قابل للعكس (1) عامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى لخلايا 1 و(2) عامل ثان يحفز جزيثاً ثانوياً على سطح خلايا ‎T‏
حيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات على موضع ربط واحد على الأقل 21 لريط العامل الأول بشكل قابل ‎(all‏ ‏وحيث يشتمل العامل الأول على شريك ارتباط واحد على الأقل ‎«C1‏ حيث يمكن لشريك الارتباط ‎IC1‏ لارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط 21 لكاشف تعدد الوحدات؛ وحيث يرتبط العامل
— 2 6 — الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C1‏ ‏وموضع الريط 1 وحيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات على موضع ربط واحد على الأقل 22 للريط القابل للعكس للعامل الثانى؛ وحيث يشتمل العامل الثاني على شريك ارتباط واحد على الأقل ‎«C2‏ وحيث يمكن لشريك الارتباط 002 لارتباط بشكل قابل للعكس بموضع الريط 2 لكاشف تعدد الوحدات؛ وحيث يرتبط العامل الأول بكاشف تعدد الوحدات من خلال الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين شريك الارتباط ‎C2‏ ‏وموضع الريط 2 وحيث يرتبط العامل الأول بجزيء مستقبل على سطح ‎WIA‏ آ؛ ‎Jilly‏ يتم توفير إشارة تنشيط 0 أولى ‎ally WAL‏ تنشيط ‎TWA‏ ‏وحيث يرتبط العامل التانى بالجزيء الثانوي على سطح خلايا ‎JI‏ وبالتالى يتم تحفيز الخلايا المنشطة؛ العامل الأول والعامل الثانى ويالتالى حث تمدد خلايا 1. في هذه الطريقة تؤدي ملامسة العينة ‎All‏ تحتوي على مجموعة الخلايا اللمفية المحتوية بدورها على مجموعة خلايا 1 مع كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان المثبت عليه العاملان الأول والثاني 5 إلى ربط نوعى لخلايا 1 بكاشف تعدد الوحدات. يمكن أن تتم ملامسة العينة المشتملة على مجموعة ‎WIA‏ لمفية تشتمل على خلية 1 مع كاشف تعدد الوحدات في مفاعل حيوي ‎Jie‏ مفاعل حيوي ليفي مجوف (على سبيل المثال مفاعل حيوي ليفى مجوف من نظام تمدد الخلايا ‎(QUaNtuM®‏ أو مفاعل حيوي من كيس بلاستيكي (على سبيل المثال ‎Cellbag®‏ المستخدم في ‎Xuri Cell Expansion System W25‏ من ‎GE‏ ‎.(Healthcare 0‏ تشتمل هذه الطريقة ‎Load‏ على ملامسة مجموعة الخلايا اللمفية (خليط التفاعل المحتوي على خلايا ‎T‏ مرتبطة بكاشف تعدد الوحدات من خلال العامل الأول والعامل الثاني) مع (1) شريك ارتباط أول حر ‎C1‏ أو نظير له يمكنه قطع الرابطة بين شريك الارتباط الأول ‎C1‏ وموضع الربط ‎Z1‏
و(2) شريك ارتباط ثان حر 62 أو نظير ‎ais cad‏ قطع الرابطة بين شريك الارتباط الثاني ‎C2‏ ‏وموضع الربط 22. بهذا يتم قطع الرابطة القابلة للعكس بين شريك الارتباط المذكور 61 للعامل الأول وموضع الربط المذكور 21 وكذلك الرابطة القابلة للعكس بين شريك الارتباط المذكور ‎C2‏ ‏للعامل الثاني وموضع الربط المذكور 22 لكاشف تعدد الوحدات المذكور؛ وبالتالي يتم في ناتج تصفية تتابعية إطلاق ‎TWA‏ مرتبطة بكاشف تعدد الوحدات من خلال العامل الأول والعامل الثاني وإيقاف تمدد خلايا 1. في هذه الطريقة يمكن إخضاع ناتج التصفية التتابعية (خليط التفاعل الذي تم فيه إنهاء تفاعل التمدد بإضافة الشربك (الشركاء) الأول الحر أو نظيره (نظائره)) الذي يحتوي على مجموعة خلايا ‎T‏ الممدة للكروماتوجراف على طور ‎(Jl)‏ ثابت مناسب. قد يكون الطور (الأول) الثابت المناسب 0 عبارة عن مصفوفة ترشيح بالجل و/ أو مصفوفة كروماتوجراف الألفة التي يتم وصفها في طلب براءة الاختراع الدولي رقم (2013/ 124474). تشتمل مصفوفة الترشيح بالجل و/ أو كروماتوجراف الألفة هذه على كاشف ألفة؛ حيث يشتمل كاشف الألفة على موضع ربط 21 و/ أو 2 لارتباط نوعياً بشريك الارتباط 1© و/ أو 62 الموجودين في العامل الأول أو العامل الثاني. بهذا يتم تثبيت العامل الأول العامل الثاني؛ شريك الارتباط1© الأول و/ أو شربك الارتباط الثاني 5 الحر ‎C2‏ على الطور الثابت. في هذه الطريقة؛ يتصل الطور الثابت الأول عن طريق المائع بالمفاعل الحيوي. في أحد نماذج هذا التمدد التسلسلي يكون موضعا الربط 21 و22 ‎Jalal‏ تعدد الوحدات متطابقين.بالإضافة إلى ذلك؛ يمكن استخدام عامل تعدد وحدات أحادي. وعند استخدام عامل تعدد وحدات قابل للذوبان» يتم فصل مجموعة خلايا 1 (أو مجموعة الخلايا الممدة بوجه ‎(ple‏ من 0 كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان. يمكن أن يتم الفصل /الإزالة باستخدام طور ثابت ثان. لهذا الغرض» يتم إخضاع خليط مشتمل على خلايا 1 وكاشف تعدد الوحدات القابل للذويان» قبل أو بعد الوضع على الطور الثابت الأول المبين أعلاه؛ للكروماتوجراف على طور ثابت ثان مناسب. قد يكون هذا الطور الثابت الثانوي عبارة عن مصفوفة ترشيح بالجل و/ أو مصفوفة كروماتوجراف ‎(Aa‏ حيث تشتمل مصفوفة الترشيح بالجل و/ أو كروماتوجراف الألفة على كاشف ألفة. يضم 5 كاشف الألفة الموجود في راتنج الكروماتوجراف شريك ارتباط ‎D‏ يرتبط (نوعياً) بموضع ‎da)‏ 21
و/ أو موضع الربط ‎Z2‏ إن وجد؛ لكاشف تعدد الوحدات؛ وبالتالي تثبيت كاشف تعدد الوحدات على الطور الثابت. إذا تم استخدام عامل تعدد وحدات أساسه استريبتيفيدين وكان بكل من العاملين الأول والثاني ببتيد رابط لاستريبتيفيدين كشريك ارتباط 1© أو 02؛ يمكن أن يكون شريك الارتباط ‎D‏ الموجود في كاشف الألفة لهذا الطور الثابت الثاني عبارة عن بيوتين. بعد ذلك يرتبط الأوليجومر القابل للذويان من استريبتيفيدين أو ميوتين استريبتيفيدين المستخدم ككاشف تعدد
وحدات بالبيوتين الذي يقترن تساهمياً في المعتاد بمصفوفة كروماتوجراف ‎biotin—(Jie‏ ‏04 المتاح تجارياً. في هذه الطريقة للتمدد التسلسلي؛ يمكن أن يحفز العامل الأول إشارة مرتبطة بمعقد ‎TCR/CD3‏ ‏في خلايا ‎T‏ ويمكن أن يكون العامل الأول على هذا النحو عبارة عن كاشف ربط يريط نوعياً
0 003. بالإضافة إلى ذلك؛ قد يكون الجزيء الثانوي على خلية ‎T‏ عبارة عن 0028. وفي هذه الحالة يكون العامل الثاني الذي يريط الجزيء الثانوي عبارة عن كاشف ربط يريط نوعباً 0028 . بهذه الطريقة للتمدد التسلسلي؛ يمكن إصابة خلايا ‎T‏ بالعدوى أثناء أو بعد التمدد على سبيل المثال بمستقبل خلية ‎(TCR) T‏ أو مستقبل ‎alse‏ ضد خيمري ‎(CAR)‏ يعرف أيضاً باسم مستقبل خلية 1 الصناعي). يمكن أن تتم هذه الإصابة بالعدوى لإدخال جين المستقبل المرغوب فيه بأي ناقل
5 فيروس قهقري مناسب؛ على سبيل المثال. بعد ذلك يمكن تحرير مجموعة الخلايا المعدّلة وراثياً من المحفز المبدئي (المحفز 0028/003؛ على سبيل المثال) وبالتالي يتم تحفيزها بنوع ثان من المحفزات على سبيل المثال من خلال المستقبل حديث الإدخال). ويمكن أن يشتمل هذا النوع الثاني من المحفزات على محفز ‎alge‏ ضد في صورة جزيء ‎MHC xis‏ المركب الترابطي ‎Ll)‏ ‏التشابكي) متجانس التكوين للمستقبل المدخل ‎Lily‏ (على سبيل المثال المركب الترابطي الطبيعي ل
‎(CAR 0‏ أو أي مركب ترابطي (مثل جسم مضاد) يرتبط بشكل مباشر في إطار المستقبل الجديد (على سبيل المثال بالتعرف على مناطق ثابتة في المستقبل). قارن في هذا الجانب؛ ‎Cheadle et‏ ‎al, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol‏ ‎Biol. 2012; 907:645-66 or Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor‏ ‎.Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)‏
في هذه الطريقة؛ يمكن أن تكون مجموعة الخلايا اللمفية التي تشتمل على خلايا آعبارة عن مجموعة من خلايا الدم الطرفي أحادية النواة ‎(PBMC)‏ أو مجموعة من ‎WIA‏ 1 الثرية أو المنقاة. يمكن الحصول على مجموعة الخلايا اللمفية؛ على سبيل المثال؛ من الدم الكامل؛ أو من منتج فصادة غير منقول أو مستحضر نسيجي مجمد.
في هذه الطريقة للتمدد التسلسلي القائمة على كاشف تعدد وحدات قابل للذوبان» يمكن استخدام الكاشف الأول والثاني وكذلك كاشف تعدد الوحدات والكواشف ومجموعات الخلايا الأخرى بخلاف ذلك بنفس الطريقة التي يتم الكشف عنها أعلاه للطريقة التي تستخدم رابطة قابلة للعكس بين العامل الأول أو الثاني وكاشف تعدد الوحدات. يتعلق الاختراع أيضاً بترتيب مفاعل حيوي وطور أول ثابت للكروماتوجراف. المفاعل الحيوي
مناسب لتمدد ‎(WAY‏ والطور الثابت مناسب لفصل ‎AY‏ وإزالة الكواشف. الطور الثابت الأول عبارة عن مصفوفة ترشيح بالجل و/ أو مصفوفة كروماتوجراف ‎AY)‏ حيث تشتمل مصفوفة الترشيح بالجل و/ أو كروماتوجراف الألفة على كاشف ‎dill‏ وحيث يشتمل كاشف الألفة على موضع ريط 21 يرتبط نوعياً بشريك الارتباط ‎C1‏ الموجود في عامل أول و/ أو يشتمل كاشف الألفة على موضع ربط 22 يرتبط نوعياً بشربك الارتباط ‎C2‏ الموجود في عامل ثان. وبالتالي
5 يعتبر الطور الثابت الأول مناسباً لتثبيت العامل الأول و/ أو العامل الثاني» شريك الارتباط الأول ‎Cl‏ و/ أو شريك الارتباط الثاني الحر 62 عليه. بالإضافة إلى ذلك يتصل المفاعل الحيوي والطور الثابت بطريق المائع. ويمكن استخدام هذا الترتيب في التمدد التسلسلي على النحو المبين أعلاه ويمكن دمجه في أنظمة تمدد خلايا معروفة ‎Jie‏ نظام تمدد الخلايا ‎(Quantum®‏ أو ‎Xuri‏ ‎.Cell Expansion System 5‏
في هذا الترتيب يوجد الطور الثابت الأول في عمود كروماتوجراف أو يكون طوراً ثابتاً مستوياً. وقد يشتمل الترتيب أيضاً على طور ثابت ثان يتصل عن طريق المائع بالطور الأول الثابت. وقد يكون الطور الثابت الثانوي ‎Ble‏ عن مصفوفة لترشيح بالجل و/ أو مصفوفة كروماتوجراف ألفة؛ ‎Cus‏ ‏تشتمل مصفوفة الترشيح بالجل و/ أو كروماتوجراف الألفة على كاشف ألفة. ويمكن أن يشتمل كاشف الألفة هذا على شريك ارتباط ‎D‏ يرتبط (نوعياً) بموضع الربط 21 من كاشف تعدد
5 الوحدات؛ وبالتالي يكون مناسباً لتثبيت كاشف تعدد الوحدات على الطور الثابت.
— 6 6 — يتعلق الاختراع الحالي أيضاً بجهاز لتنقية وتمدد مجموعة من ‎(LIA‏ حيث يشتمل الجهاز على ترتيب واحد على الأقل لمفاعل حيوي وطور ثابت أول أو طور ثابت ثان للكروماتوجراف على النحو المبين أعلاه. يمكن أن يشتمل الجهاز أيضاً على مجموعة ترتيبات لمفاعل حيوي وطور ثابت متصل بطريق المائع على التوالي.
ويمكن أن يشتمل الجهاز على مدخل عينات متصل عن طريق المائع بالمفاعل الحيوي من ترتيب مفاعل حيوي والطور الثابت للكروماتوجراف. كذلك قد يشتمل الجهاز على مخرج عينات للخلايا المستهدفة المنقاة والممدة» حيث يتصل مخرج العينات بطريق المائع بالطور الثابت للترتيب الواحد على الأقل لمفاعل حيوي والطور الثابت للكروماتوجراف.
0 أخيراً؛ يمكن تصميم الجهاز كنظام مغلق وظيفياً. كما يدرك من يتمتع بالمهارة العادية في المجال بسهولة من الكشف الوارد في الاختراع الحالي؛ يمكن بالمثل وفقاً للاختراع الحالي استخدام تركيبات المادة؛ الوسائل؛ الاستخدامات؛ الطرق؛ أو الخطوات؛ الموجودة حالياً أو التي سيتم تطويرها فيما بعد ‎(Aly‏ تؤدي بدرجة كبيرة نفس الوظيفة أو تحقق بدرجة كبيرة نفس نتيجة النماذج التمثيلية المناظرة التي يصفها الطلب الحالي.
5 الأمثلة التجريبية المتال 1: تحفيز/تمدد خلايا ‎T‏ +003 المستجيبة ‎0CD3/0 CD28 Fab Lady‏ تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على خرزات مغلفة بميوتين استريبتيفيدين ‎Strep—tactin®‏ ‏تم تعليم 300.000 من ‎T WA‏ المستجيبة ‎(Tresp) CD3+CD62L‏ المعزولة بالإثراء المغناطيسي التسلسلي من منتج ‎ld salad‏ غير متحرك) باستخدام 3 ميكرو مولار ‎CFSE‏ وتم
0 تحفيزها باستخدام 5 ميكرو لتر من مستحضر 15 ميكرولتر من خرزات ‎Streptactin®‏ )10 مجم جسيمات مغناطيسية /مل؛ محمّلة بخرزات 35 ميكروجم ‎Streptactin®‏ /مجم) محمّلة بشظية ‎Fab‏ 0003 0.5ميكروجم ‎lid‏ شظية ‎Fab‏ 00028 0.5ميكروجم فقط أو خليط من شظية ‎Fab‏ 0003 0.5ميكروجم ‎Faby‏ 00028 0.5ميكروجم.
تم اشتقاق شظية ‎Fab‏ 00003 المستخدمة من الجسم المضاد أحادي النسيلة الرابط لذ ‎CD3‏
المنتج بسلالة الخلايا الورمية الهجينة 73>ا0. يتم وصف سلالة الخلايا الورمية الهجينة 073
والجسم المضاد 01613 في براءة الاختراع الأمريكية رقم )4 361 549)؛ حيث تم إيداع سلالة
الخلايا رقم وصول ‎CRL-8001™‏ ©28100). تم اشتقاق ‎Fab‏ 0028 المستخدم من الجسم المضاد 6028 المضاد للبشر أحادي النسيلة 0028.3 ( 15 ‎Vanhove et al, BLOOD,‏
‎Vol. 102, No. 2, pages 564-570‏ ,2003 لاانال). تم إيداع المتوالية النيوكليوتيدية
‏للنطاقات المتغيرة من هذا الجسم المضاد ‎CD28.3‏ في ‎GenBank‏ في صورة جسم مضاد
‏8 مضاد للبشر من تركيبة أحادية السلسلة ‎Fv‏ تخليقي 0028.3 برقم وصول
‎.(GenBank ‏في‎ 1
‏0 "تم إنتاج كل من الشظيتين ‎Fab‏ بمعاودة الارتباط الجيني في إيشيرشيا كولاي ‎coli.‏ على النحو الذي يتم وصفه في طلبي براءة الاختراع الدوليين رقمي (2013/ 011011) و ‎WO‏ (2013/ 4 ) حيث تحملان كنطاقات ثابتة ( ‎(Ckappa ys CHI‏ متوالية ‎IgG]‏ إجماعية. تم دمج السلسلة الثقيلة من شظيتي 80 في طرف الكريوكسي مع ترتيب تتابعي من وحدتي ربط استريبتيفيدين نمطيتين ‎<SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK‏ (متوالية
‏5 رقم: 07))؛ متاحة تجارياً < ‎Twin-Strep-tag®'‏ من ,6561009080 ‎IBA GmbH,‏ ‎(Germany‏ تم استخدام الشظية ‎Fab‏ 00003 كعامل أول حيث يمثل الببتيد الرابط لاستريبتيفيدين شريك الارتباط ‎C1‏ وتم استخدام الشظية ‎Fab‏ 000028 كعامل ثان بحيث ‎Jia‏ ‏الببتيد الرابط لاستريبتيفيدين شريك ارتباط 02. يمثل ميوتين استريبتيفيدين (رباعي الوحدت) 'كاشف تعدد وحدات ‎Strep-tactin®‏ تم تثبيت شظيتي 80"ابشكل قابل للعكس عليه.
‏0 في تجربة التمدد؛ كانت خلايا ‎Tresp‏ المحفزة بخرزات غفل (بلا ‎(Fab‏ تمثل ‎sale‏ مقارنة سالبة. تم استنبات الخلايا ‎Tresp‏ في ثلاثيات بأطباق مكونة من 48 ‎lie‏ مع 300.00 خلية ‎CD3‏ ‏تغذوية ذاتية ‎dallas)‏ بالإشعاع باستخدام لا306) في وسط مزرعة خلايا 3 مل كامل ‎RPMI)‏ ‏(61000) مكمّل باستخدام 9610 (حجم/ حجم) من مصل أجنة البقرء !-جلوتامين» -ميركابتو إيثانول» ‎(HEPES‏ بنسيلين» استرببتومايسين وجنتامايسين)مكمّل باستخدام 10[وحدات / مل من
‏5 الإنترلوكين 2 (2-اا). تم احتضان الخلايا عند 37 م بدون تبديل الأوساط وتم التحليل لمدة 4
أيام بتحليل ‎.FACS‏ تم ‎ais‏ وتحليل ‎FACS‏ بعد 10 دقائق من الاحتضان مع 100 ميكرو مولار لا-البيوتين.يتم إظهار منحنى تمثيلي واحد لكل حالة في شكل 4. تظهر المنحنيات خلايا +003 الحية التي تم تبقيعها بيوديد البروبيديوم ‎(Pl)‏ لتمييز الخلايا الحية / الميتة. شكل 4 أ عبارة عن مخطط نسيجي يبين التوزيع الحجمي (التشتت الأمامي) للخلايا المحفزة. شكل 4 أ يظهر أن مجموعة خلايا معينة من خلايا 17650 تم تحفيزها وتمديدها (تزيد في الحجم / العدد مقارنة بالمادة المقارنة غير المحفزة من "الخرزات ‎(had‏ عند احتضانها في وجود خرزات يتم عليها تثبيت خليط من شظية ‎Fab‏ 0003 0.5ميكروجم 5 ‎Fab‏ 00028 0.5 ميكروجم؛ بعد تحفيزها في المختبرب شظايا ‎Fab‏ 0003/00028 تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على خرزات مغلفة بميوتين استريبتيفيدين ©5160-18000. ‎Jia‏ شكل 4 ب مخططات نسيجية لتخفيف صبغ ‎AS‏ 0 6556الذي يمثل درجة ‎SIS‏ وفقاً لعدد الخلايا لكل قطاع خلوي (مبين أعلى شكل 4 ب؛ تمثل صفر الخلايا غير المنقسمة؛ 5 تمثل الخلايا التي مرت خلال على الأقل 5 انقسامات). ويمكن أن نرى من شكل 4 ب أن مجموعة خلايا ‎T‏ المحفزة بخرزات مثبّت عليها خليط عبارة عن شظية ‎Fab‏ 0003 5.0 ميكروجم 5 ‎Fab‏ 00028 0.5ميكروجم مرت في معظمها خلال ثلاثة انقسامات خلوية وتمثل نمط تكاثر موحداً بدرجة أكبر منها في حالة وجود محفز أحادي فقط (عدد 5 صغير من الخلايا في القمة غير المنقسمة 'صفر"). كذلك يتم تمثيل زيادة القيمة المطلقة للتكاثر (تكاثرت خلايا أكثر بشكل موحد بعد 4 ‎all‏ من التحفيز باستخدام خرزات مفعّلة بواسطة 0003 و06028) بالاستهلاك الأكثر كثافة للأوساط على النحو المبين بتغير مؤشر لوني إل اللون الأصفر في شكل 4ج. مثال 2: تحليل حركة الكالسيوم التفاضلية داخل الخلايا في خلايا ‎Jurkat‏ 0 تتم هنا فحص تحليل القياس الخلوي المنخفض في الزمن الفعلي لحركة الكالسيوم التفاضلية داخل الخلايا المستحثة في خلايا ‎Jurkat‏ المعلمة بنسيلة ‎OKT3‏ الجسم المضاد 0003 أو بشظايا
Strep-tactin® ‏بعد التحويل إلى وحداتى متعددة باستخدام‎ of OKT3 ‏من‎ Fab ‏حساس للكالسيوم وتم بدء إطلاق‎ INdO—1-AM ‏بصبغ‎ Jurkat ‏لهذا الغرض؛ تم تحميل خلايا‎ ‏(منتج بسلالة الخلايا الورمية الهجينة‎ OKT3 ‏الكالسيوم بحقن جسم مضاد 00003 أحادي النسيلة‎ 5 1613ا0؛ انظر ما سبق؛ المريعات السوداء) أو شظايا ‎Fab‏ 00003 (مشتقة من سلالة الخلايا
الأبوية ‎(OKT3‏ تم إكسابها تعدد الوحدات بالربط القابل للعكس لببتيدها الرابط لاستريبتيفيدين ب 5060-0 قابل لذويان مرفق بشكل متألق فلورياً مع فيكوإيريثرين. ‎Alla Ag‏ معقدات ‎Fab-Strep-Tactin‏ 01613 متعددة الوحدات السليمة؛ تم بدء إطلاق الكالسيوم على مدى فترة زمنية مطابقة لنسيلة الجسم المضاد الأبوي (المثلثات التي باللون الرمادي الداكن). ويمكن تفادي تنشيط الخلايا بشكل تام بحقن معقدات ‎Fab-Strep-Tactin‏ معالجة بواسطة (آ-بيوتين» سابقة التفكيك (الدوائر التي بلون رمادي خفيف) بشكل مطابق لحقن المادقال مقارنة السالبة ‎PBS‏ ‏(المثلثات البيضاء المقلوية). كان وضع أيونومايسين يمثل مادة مقارنة موجبة لفيض الكالسيوم. تمت مراقبة التغيرات الحادثة بمرور الزمن في تركيز +682 داخل الخلايا بقياس التدفق الخلوي بناء على التغير في نسبة 16/717. ويمكن أن نرى من شكل 5 أ أن الجسم المضاد الأبوي 0 0/13 وكذلك الشظية أحادية التكافؤ متعددة الوحدات ‎Fab‏ من ‎OKT3‏ نتج عنهما إطلاق الكالسيوم»؛ بمعنى أن الشظية أحادية التكافؤؤ متعددة الوحدات ‎Fab‏ من ‎OKT3‏ لها بشكل أساسي نفس فعالية الجسم المضاد الأبوي. بشكل ملحوظ؛ لم يكن ممكنا للشظية ‎Fab‏ متعددة متعدد الوحدات 01613 بدء إطلاق الكالسيوم ‎(pa‏ تمت إضافة البيوتين إلى 51080-تاكتين المثبت عليه الشظية ‎Fab‏ 01613 قبل إضافة شظية ‎Fab‏ 506018000-01613. في هذه الحالة؛ قطع 5 البيوتين الرابطة القابلة للعكس المكوّنة بين م5160-تاكتين كعامل تعدد وحدات والشظية ‎OKT3‏ ‏0 . لذا تمت إزاحة ‎Fab dad‏ أحادية التكافؤ من عامل تعدد الوحدات وبعد التفكك لم يكن ممكناً لها بدء إطلاق الكالسيوم بالارتباط ب 603 من ‎Jurkat LA‏ في التجارب المبينة في شكل 5 ب تم تنشيط خلايا ‎Jurkat‏ المعلّمة بواسطة /000-1-8 بمعقدات ‎Fab-Strep-Tactin‏ 00103 مشتقة من ‎OKT3‏ على النحو الذي يتم وصفه في شكل 0 5 أ. وكان حقن المعقدات السليمة (المنحنى العلوي) أو سابقة التفكك (المنحنيات السفلية) تمثل مواد مقارنة موجبة أو سالبة على الترتيب. بالإضافة إلى ذلك أدى تحفيز الخلايا باستخدام معقدات 18000 ‎Fab-Strep‏ سليمة متبوعة بالحقن ب (ا-بيوتين (بالقرب من التنشيط القمي عند ‎140=t‏ ث) إلى القطع الفجائي لإرسال إشارات متعدد الوحدات ‎Fab‏ 0003 (الرسم البياني الأوسط). وكان حقن أيونومايسين في المجموعة المعقدة ‎Fab‏ سابقة التفكيك يمثل المقارنة 5 الموجبة. تمثل البيانات ثلاث تجارب مختلفة. بشكل ‎cals‏ يظهر شكل 5 ب أن إضافة 0ا-بيوتين
إلى العينة تؤدي سريعاً إلى إزاحة شظية ‎Fab‏ من عامل تعدد الوحدات ‎(Strep—tactin‏ وبالتالي إنهاء إطلاق الكالسيوم بشكل فعال حتى في ظل التحفيز المستمر للكالسيوم وإظهار أن الشظية ‎Fab‏ 01613 المفككة لم تعد فعالة حيوباً. بالمثل؛ لم يكن ممكناً للشظية ‎OKT3 Fab‏ متعددة الوحدات بدء إطلاق الكالسيوم حين تمت إضافة البيوتين إلى متعدد وحدات الشظية م5060- تاكتين- ‎OKT3 Fab‏ قبل إضافة عينة ‎Streptactin-OKT3 Fab‏ لخلايا ‎Jurkat‏
المثال 3: التبقيع القابل للعكس للخلايا بواسطة متعددات الوحدات ‎Fab‏ 603 يختبر هذا المثال التبقيع القابل للعكس للخلايا بمتعددات الوحدات ‎Fab‏ 003. تم تبقيع ‎PBMCs‏ ‏معزولة حديثاً بالنسيلة ‎OKT3‏ للجسم المضاد 0003 أحادي النسيلة (المنحنى النقطي الأيسر؛ النسيلة الأبوية لمتعددات الوحدات ‎(Fab‏ أو متعددات الوحدات -85] ‎OKT3‏ المعلّم بفيكو
0 إيريثرين ‎(PE)‏ متجانس التكوين وتم تحليلها قبل (العمود الأيسر الثاني) أو بعد المعالجة باستخدام 0-البيوتين (العمود الأوسط). بعد ذلك تم اكتشاف مونومرات ‎Fab‏ الباقية بعد خطوات الغسيل التالية باستخدام ‎Jas Strep-Tactin®‏ ب ‎PE‏ حديث (العمود الأيمن الثاني). وكان التبقيع بمتعدد الوحدات الثانوي ‎Fab‏ للخلايا المبقعة بشكل قابل للعكس يمثل المادة المقارنة (العمود الأيمن). يتم إظهار خلايا 603 الحية فقط السالبة في التبقيع بيوديد بروبيديوم ‎(Pl)‏ لتميبز
5 الخلايا الحية / الميتة في شكل 6. تبين الأرقام في المنحنيات النقطية النسبة المئوية للخلايا في البوابيات. تظهر التجرية أن تبقبع ‎CD3+ PBMCs‏ بشظية ‎Fab‏ مضادة ل 603 متعدد الوحدات مع استخدام ‎Streptactin‏ ككاشف تعدد وحدات قابل للعكس بشكل كامل بإضافة 0-البيوتين ‎Oly‏ ‏شظية ‎Fab‏ أحادية التكافؤؤ وحدها لا ترتبط بجزيء 603 الموجود على ‎PBMCs‏ ‏المثال 4: العزل القابل للعكس للخلايا بمتعددات الوحدات ‎CD28 Fab‏
0 يظهر هذا المثال أن عزل الخلايا بالربط القابل للعكس ‎Fab Ladd‏ مضادة ل 0028 متعددة الوحدات بجسيمات ‎Strep-Tactin®‏ مغناطيسية (الجسيمات المغناطيسية المتاحة من ‎IBA‏ ‎(GmbH Gottingen, Germany‏ تم استخدام شظايا ‎Fab‏ المشتقة من الجسم المضاد 3 والتي يتم وصفها في المثال 1 أعلاه لهذا الغرض. تم اختيار/ ‎Jie‏ خلايا +0028 بالانتقاء الخلوي المغناطيسي لمتعدد الوحدات ‎Fab‏ من ‎PMBCs‏ معزولة حديثاً على النحو الذي
يتم وصفه بشكل أساسي في طلب براءة الاختراع الدولي رقم (2013/ 011011). قبل تبقيع الخلايا المنتقاة بمادة مقارنة بمتعددات وحدات 00028 متألقة ‎bs‏ متجانسة التكوين (المنحنى النقطي الأيسر) أو بجسم مضاد موجه ضد السلسلة الخفيفة كابا من الجلوبيولين المناعي (المنحنى النقطي الأيس الثاني» ‎kappa MAb‏ وا-0) كتبقيع مقارن. بعد الانتقاء؛ تمت معالجة الخلايا
+0028 باستخدام 0-بيوتين وتم غسيلها بعد ذلك لإزالة الخرزات المغناطيسية ومونومرات ‎Fab‏ ‏بعد ذلك تم تبقيع خلايا +6028 المحررة ‎(fe)‏ بمتعددات وحدات ‎CD28 Fab‏ (المنحنى النقطي الأيمن الثاني) أو باستخدام ‎o-lgkappa mAb‏ ( المنحنى النقطي الأيمن) لاكتشاف مونومرات ‎Fab‏ الباقية بشكل محتمل. يتم إظهار ‎WIA‏ +0103 الحية ‎(Plnegative)‏ فقط. تبين الأعداد في المنحنيات النقطية النسبة المئوية للخلايا في البوابات. ويظهر شكل 7 أنه يمكن عزل
0 خلايا +6028 من ‎PMBC‏ باستخدام شظية ‎Fab‏ المضادة ل ‎CD28‏ متعددة الوحدات وأن كل كواشف العزل ‎La‏ في ذلك مونومرات ‎Fab‏ المضادة ل ‎CD28‏ بعد الانتقاء . ‎Jd)‏ 5: تحفيز/تمدد خلايا ‎T‏ +603 المستجيبة ‎Fab Lad‏ 00603/00028 تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على م5060 - تاكتين قابل للذويان في هذا المثال تم تمديد خلايا 7 +603 المستجيبة (المعزولة بالانتقاء المغناطيسي من عينة
5 81/08 حديثة تم الحصول عليها من تدرج ‎(Ficoll‏ بعد التحفيز المختبري لشظايا ‎Fab‏ 0003/00028 تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على ©5060-18000 أوليجومري قابل للذويان يعمل ككاشف تعدد الوحدات القابل للذويان. تم الحصول على ‎Strep-tactin®‏ ‏الأوليجومري ببلمرة ‎Strep—tactin®‏ بسلفو ‎SMCC‏ (سلفوسكسينيميديل 4-(ل]- ماليميدوميثيل)سيكلوهكسان-1 -كريوكسيلات. المنتج ‎Thermo Scientific‏ 22122 #(
0 وإيمينوثيولان (المنتج ‎Thermo Scientific‏ 26101 #( وفقاً لبروتوكول الجهة المصبّعة ‎(Thermo Scientific)‏ فصل استريبتيفيدين أوليجومري من ميوتين استريبتيفيدين مونومري (غير متفاعل) ودايمري بكروماتوجراف استبعاد الحجم وتم استخدام ‎gall‏ الذي تم الحصول عليه بهذه الطريقة من ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري ‎STN)‏ من أو يساوي 3) ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان.
للتمدد في المختبر»؛ تم تعليم 300.000 خلية ‎T‏ مستجيبة ‎(Tresp) CD3+‏ باستخدام 2 ميكرو مولار من إستر كريوكسي فلوريسين سكسينيميديل ‎(CFSE)‏ وتم تحفيزها بكميات متفاوتة من مستحضر أوليجومرات ‎Strep—tactin®‏ تم عليه تثبيت توليفة من شظية ‎OKT3 Fab‏ 0003 المبينة أعلاه والشظية ‎Fab‏ 00028 من الجسم المضاد 28.3 (ويحمل كل منهما ‎Twin—‏ ‎Strep-tag® 5‏ سابق الذكر كببتيد رابط لاستريبتيفيدين في السلسلة الثقيلة). ‎Ix)‏ يناظر 3 ميكروجم ‎Streptactin‏ متعدد الوحدات ‎Jade‏ باستخدام 0.5)ميكروجم من 00103 و0.5ميكروجم 08 من شظية ‎Fab‏ المونومرية؛ تبين الأعداد "0.5 "2" و ‎"x5"‏ مقدار مضاعفات ‎N‏ ‏المقابل من *«1'). ثركت خلايا ‎Tresp‏ بلا تحفيز أو تم تحفيزها بمتعدادت وحدات م5180- تاكتين ‎Jee‏ (بلا ‎(Fab‏ وكانت تمثل مواد مقارنة سالبة. تم استنبات خلايا ‎Tresp‏ في ثنائيات في 0 أطباق مكونة من 48 ‎lie‏ مع 300.00 من الخلايا التغذوية الذاتية السالبة 003(المعالجة بالإشعاع باستخدام 308( في 1 مل من وسط مزرعة خلايا مكمّل باستخدام 20 وحدة/ مل ‎IL-‏ ‏2. تم احتضان ‎WAN‏ عند 37 م بدون تبديل الأوساط وتم تحليل ‎[Sal‏ وفقاً لتخفيف ‎CFSE‏ ‏بعد 5 أيام بتحليل ‎(FACS‏ يظهر شكل 8 أ الزيادة في التوزيع الحجمي للخلايا المتكاثرة بعد 5 أيام في المزرعة مقارنة بالمواد المقارنة السالبة. يظهر شكل 8 ب أنه تم تحفيز خلايا +003 ‎Tresp 5‏ بشكل ملائم وتكاثرت بقوة عند الاحتضان مع ‎Strep—tactin®‏ الأوليجومري القابل للذويان (مقارنة بجسيمات ‎Streptactin‏ المغناطيسية الصلبة في شكل 4) المثبّت عليه خليط من شظايا ‎Faby 0003 Fab‏ 00028. تبين النتائج في شكل 8 أ و8 ب أنه في ظل هذه الظروف في المختبر انقسمت معظم خلايا 7 +003 المستجيبة (2 إلى 5 من انقسامات الخلايا) بعد ارتباط سطح ‎CD28‏ ومعقد 708/003 ‎Wad:‏ 0003 و ‎Fab‏ 00028 تم تثبيتها بشكل 0 قابل للعكس على أوليجومرات ©5060-18000 قابلة للذويان. بعد التمدد في المختبر تفككت كواشف التحفيز ‎Fab-Strep-Tactin‏ القابلة للذويان وأزبلت بعد المعالجة باستخدام (ا-بيوتين. تم تحليل تفكك وإزالة شظايا ‎Fab‏ المونومرية من حيث قياس التدفق الخلوي بإعادة تبقيع الخلايا بعلامة فيكو إيريثيرين ‎(Strep-Tactin®)‏ (ا51-0). يتم إظهار مخطط نسيجي تمثيلي (مخطط نسيجي رمادي داكن) مقارنة بالمادة المقارنة السالبة من ‎ST-PE‏ ملائمة فقط (مخطط نسيجي رمادي خفيف). ويمكن أن نرى من شكل 8 ج تفكك كل من الشظيتين ‎Fab‏ بشكل كامل وإزالتهما كلياً من الخلايا الممدة. ويظهر شكل 8 د العدد المطلق للخلايا الحية (السالبة بأزرق
‎(Glass‏ بعد 5 أيام. تم إحصاء العدد بحجيرة إحصاء ‎Neubauer‏ وتم تمثيله ‎Lily‏ مقابل ظرف
‏التحفيز المقابل. يتم إظهار متوسط أعداد الخلايا في شكل 8 د؛ وتبين أعمدة الخطأ الاتحراف
‏المعياري ‎(SD)‏ يظهر شكل 8 د أن كافة خلائط ‎Fab‏ 0003 وشظايا ‎afi 00028 Fab‏
‏على كاشف تعدد وحدات م5106- تاكتين قابل للذويان كانت بنفس القدر من الفعالية في تمديد خلايا +003 وأدت إلى زيادة عبارة عن 4 أضعاف تقريباً في أعداد ‎LAY‏ المطلقة.
‏المثال 6: حركيات تكاثر خلايا 004+ و7 +008 المستجيبة المنقاة المحفزة في المختبر
‏باستخدام متعددات وحدات ‎Fab-Streptamer/aCD3‏ 801028 قابلة للعكس بدون تبديل
‏أوساط
‏في المثال الحالي تم اختبار حركيات التمدد في تكاثر خلايا ‎T‏ المستجيبة +004 أو +008
‎(Tresp) 0‏ المنقاة التي تم تحفيزها في المختبر بشظايا ‎Fab‏ 00003/000028 تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على ميوتينات استريبتيفيدين أوليجومرية قابلة للذويان. لهذا الغرض؛ كان ميوتين ‎Strep-tactin®‏ الأوليجومري القابل للذويان بحجمين مختلفين يمثل كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان. وكان النوع الأول من ‎Strep—tactin®‏ الأوليجومري هو ‎sia‏ ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري ‎STN)‏ من أو يساوي 3) الذي تم الحصول عليها في المثال 5 (يشار إليه في
‏5 الطلب الحالي أيضاً باسم 'سلسلة ‎Streptactin®‏ الرئيسية التقليدية"؛ الموضح بعلامة المثلث طرفه لأعلى في شكل 13). وكان النوع الثاني من ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري هذا المستخدم ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان عبارة عن ميوتين استريبتيفيدين أوليجومري ‎NY)‏ أكبر من أو يساوي 3) تفاعل مع زلال المصل البشري المعالج ببيوتين (يشار إليه في الطلب الحالي أيضاً باسم 'سلسلة ‎Streptactin®‏ الرئيسية الضخمة).
‏0 في هذا المثال تم تحفيز 500.000 من خلايا ‎T‏ المستجيبة +0604 أو +0608 ‎(Tresp)‏ المنقاة بشكل منفصل بمتعددي الوحدات ‎Streptamer‏ هذين المختلفين على النحو المبين ‎ded‏ أي بسلسلة ‎Streptactin‏ الرئيسية الواردة في مثال 5 (بمحلول به تركيز عبارة عن 1 مجم من ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري/مل)) أو بسلال ‎Streptactin‏ الرئيسية الضخمة (0.1مجم/ مل). تم تحميل 3 ميكرولتر من السلسلتين الرئيسيتين المختلفتين بتوليفة من 0.5ميكروجم من 00103 و
‏5 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 00028 المستخدمين في الأمثلة السابقة ويحملان ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين
‎415i) SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK‏ رقم: 07) في الطرف ‎C=‏ من السلسلة الثقيلة بالشظية ‎(Fab‏ بالإضافة إلى ذلك؛ تم تحميل 4.5 ميكرولتر من سلسلة 70 الرئيسية التقليدية باستخدام 0.5ميكروجم من شظية ‎«aCD3 Fab‏ 0.5ميكروجم من شظية ‎«IBA GmbH 65100960(0008 Fab‏ وتحمل أيضاً في الطرف © من الشظية 96ح الببتيد الرابط لاستريبتيفيدين ‎SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK‏ ‏(متوالية رقم: 07) و0.5 ميكروجم من شظية ‎.qCD28 Fab‏ كانت ‎WA‏ م1165 غير المعالجة (غير المحفزة) تمثل مادة مقارنة سالبة وخلايا ‎Tresp‏ المحفزة بخرزات ‎Dyna‏ متاحة تجارياً (خرزات مثبّت عليها الأجسام المضادة أحادية النسيلة 0603 و 00028 بشكل غير قابل للعكس) كمادة مقارنة موجبة. تم استنبات خلايا ‎Tresp‏ في ثنائيات بأطباق مكونة من 48 عيناً 0 في 1 مل من وسط مزرعة ‎Jie (Gibco)RPMI 1640 ( Wal‏ باستخدام 9610 (حجم/ حجم من مصل أجنة ‎«all‏ 960.025 (وزن/حجم) ‎٠‏ -جلوتامين» 960.025 (وزن/حجم)ا - أرجينين؛ 1 (وزن/ حجم) ‎(HEPES‏ 960.001 (وزن/ حجم) جنتامايسين» 160.002 (وزن/ حجم) استريبتومايسين» 960.002 (وزن/ حجم) بنسلين) ‎Jae‏ باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا. تم احتضان الخلايا عند 37م بدون تبديل الأوساط وتم تحليل عدد الخلايا بعد 1؛ 3 و 6 أيام. وفي 5 التتجارب الواردة في شكل 13 تم التمدد دون تبديل أوساط. يتم إظهار نتائج خلايا ‎T‏ +004 المستجيبة في شكل 13 ‎ag of‏ إظهار نتائج ‎T WIA‏ +008 المستجيبة في شكل 13 ب؛ حيث تمثل الرسوم البيانية درجة التكاثر وفقاً لعدد الخلايا المجموعة في كل نقطة زمنية لذ +004 ‎Tresp‏ (شكل 13 أ) ‎Tresp‏ +008 في شكل 13 ب. كما 55 من شكل 13 أ أدى كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان "الأصغر” المثبت عليه شظايا ‎Fab; 06003 0‏ 0028» بشكل قابل للعكس إلى مقدار تمدد ‎WIA‏ 204+7ممائل لخرزات 8 وهي حتى الآن الكاشف العياري لتمدد خلايا ‎oT‏ بينما أتاح استريبتاكتين الأوليجومري القابل للذويان "الأكبر" تمدداً أفضل مقارنة ب ‎.Dynabead‏ قد يكون هذا التحسين ناتجاً عن أن ‎Cail‏ تعدد الوحدات الأوليجومري الأكبر” القابل للذويان يمكنه الارتباط بخلايا 1 أكثر في نفس الوقت مقارنة بالأوليجومر "الأصغر” القابل للذويان؛ وبالتالي يمكنه تحفيز خلايا 004+1 أكثر من الأوليجومر "الأصغر".
كما يتضح من شكل 13 ب؛ باستخدام كواشف تعدد الوحدات القابلة للذويان الواردة في الاختراع الحالي يمكن تمديد ‎T WA‏ +008 في الأيام الثلاثة الأولى على الأقل بنفس الكفاءة التي تكون مع خرزات ‎Dyna‏ بشكل ملحوظ» في هذه الفترة الزمنية؛ أظهرت تجرية التمدد التي استخدمت كاشف تعدد وحدات قابلاً للذويان يحمل بالإضافة إلى شظايا 0003 و ‎Fab‏ 00028 (كعامل أول وثان) مثبتة عليه بشكل قابل للعكس شظية ‎«CD Fab‏ أفضل درجة تمدد في ظل ظروف
الزراعة هذه. يبين هذا أنه يمكن بحافز نوعي لمجموعة فرعية محددة من الخلايا (هنا الشظية ‎(CDS Fab‏ زيادة أو تعديل انتقائية التمدد؛ ‎Jilly‏ الحصول على كميات أكبر من مجموعة الخلايا (الفرعية) المرغوب فيها. على هذا النحو؛ ملخص ما سبق هو أن مثال 6 يظهر أن فعالية كاشف تعدد الوحدات القابل
0 لذويان المستخدم في الاختراع الحالي ‎Lad‏ يتعلق بإطلاق تمدد خلايا 1 قريبة من الطريقة العيارية الحالية لاستخدام خرزات ‎Dyna‏ لهذا الغرض. ومع ذلك؛ ولأنه يمكن التحكم في التحفيز (وإنهاؤه؛ في حالة الرغبة في ذلك) بإضافة منافس مثل البيوتين في حالة التفاعل القابل للعكس على أساس استريبتيفيدين بين العامل الأول والثاني وكاشف تعدد الوحدات» يوفر الاختراع ‎Mall‏ ميزة كبيرة مقارنة بتقنية خرزات ‎Dyna‏ لأنه يمكن تحقيق الصورة المثالية لظروف التمدد (يمكن على سبيل
5 المثال إيقاف التحفيز في التجرية الواردة في شكل 13 ب بعد 3 أيام). بالإضافة إلى ذلك؛ لأنه ‎(Sa‏ بسهولة إزالة كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان من التفاعل (على سبيل المثال؛ بتثبيت الكاشف على عمود معالج ببيوتين بعد تفاعل التمدد)» يمكن إجراء طريقة التمدد الواردة في الاختراع وتنفيذها آلياً في أنظمة مغلقة مطلوية؛ على سبيل ‎(Jha)‏ لإنتاج ‎GMP‏ للخلايا من أجل أغراض ‎candle‏ دون ‎dala‏ للتعامل مع إزالة خرزات مثل خرزات ‎Dyna‏
0 المثال 7: حركيات تكاثر خلايا ‎T‏ المستجيبة +0004 و+008 المنقاة المحفزة في المختبر بمتعددات وحدات ‎Fab-Streptamer/aCD3‏ 80028 قابلة للعكس مع تبديل الأوساط كذلك في هذا المثال تم اختبار حركيات التمدد في تكاثرخلايا ‎T‏ المستجيبة +604 5 ‎CD8+‏ ‏المنقاة ‎(Tresp)‏ التي تم تحفيزها في المختبر ‎Fab Lad,‏ 00103/001028 تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على ميوتين استريبتيفيدين أوليجومري قابل للذويان. لهذا الغرض؛ كان ميوتين
‎Strep—tactin® | 5‏ الأوليجومري القابل للذويان بحجمين مختلفين يمثل كاشف تعدد وحدات قابلاً
للذويان. وكان النوع الأول من ‎Strep—tactin®‏ الأوليجومري هو ‎sia‏ ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري ‎STN)‏ من أو تساوي 3) الذي تم الحصول عليه في المثال 5 (يشار إليه في الطلب الحالي ‎La‏ باسم 'سلسلة ‎Streptactin®‏ الرئيسية التقليدية'؛ والموضح بعلامة مثلث طرفه لأسفل في شكل 13). تم الحصول على النوع الثاني من ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري هذا المستخدم ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان بتفاعل م5460- تاكتين الأوليجومري ‎STN)‏ ‏من أو تساوي 3) في المثال 5 بزلال المصل البشري المعالج ببيوتين. وبشار إلى كاشف تعدد الوحدات الأوليجومري القابل للذوبان هذا في الطلب الحالي ‎Load‏ باسم 'سلسلة ‎Streptactin®‏ ‏الرئيسية الضخمة. في هذا ‎Jl)‏ تم تحفيز 400.000 خلية ‎T‏ مستجيبة +004 أو +0608 ‎(Tresp)‏ منقاة بشكل 0 منفصل بمتعددي وحدات ‎Streptamer‏ مختلفين على النحو المبين أعلاه؛ أي بسلسلة 70 الرئيسية الواردة في مثال 5 )1.0 مجم/ ‎(de‏ أو سلاسل ‎Streptactin‏ الرئيسية الضخمة (0.1مجم/ مل). تم تحميل 3 ميكرولتر من السلسلتين الرئيسيتين المختلفتين بتوليفة من 5ميكروجم من 0003 و0.5ميكروجم من ‎Fab Lad‏ 00028 التي يتم وصفها أعلاه. بالإضافة إلى ذلك؛ تم تحميل 4.5 ميكرولتر من سلسلة ‎Streptactin‏ الرئيسية الواردة في المثال 5 5 باستخدام 0.5ميكروجم 0003؛ 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 0008 و 0.5ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 00028 على النحو الذي يتم وصفه أعلاه. كانت ‎Tresp Wa‏ غير المعالجة (غير المحفزة) تمثل ‎sale‏ مقارنة سالبة ‎Tresp Las‏ المحفزة بخرزات ‎Dyna‏ (المثبّت عليها الأجسام المضادة أحادية النسيلة 00003 و0028» بشكل غير قابل للعكس) تمثل مادة مقارنة موجبة. تم استنبات خلايا ‎Tresp‏ في ثنائيات في أطباق مكونة من 48 ‎lie‏ في 1 مل من وسط مزرعة 0 الخلايا المكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا. تم احتضان الخلايا عند 37 م مع تبديل الأوساط في اليوم 3 وتم تحليل عدد الخلايا بعد 1؛ 3 و6 أيام. يتم إظهار نتائج خلايا ‎T‏ +004 المستجيبة في شكل 14 ‎of‏ ويتم إظهار نتائج ‎T WIA‏ +008 المستجيبة في شكل 14 ب؛ حيث تمثل الرسوم البيانية درجة التكاثر وفقاً لعدد الخلايا المجموعة في كل نقطة زمنية ل +004 م0 (شكل 14 أ) ‎Tresp‏ +008 في شكل 14 ب.
كما نرى من شكل 14 أ أدت كواشف تعدد الوحدات القابلة للذويان الواردة في الاختراع الحالي المثبّت عليها شظايا 0003 3 ‎Fab‏ 00028 بشكل قابل للعكس إلى تمدد أفضل لخلايا ‎CD4+T‏ من خرزات ‎.Dyna‏ ‏كما يتضح من شكل 14 ب؛ باستخدام كواشف تعدد الوحدات القابلة للذويان الواردة في الاختراع الحالي أمكن تمديد ‎T WA‏ +008 خلال الأيام الستة الأولى على الأقل بنفس الكفاءة التي مع خرزات ‎Dyna‏ بشكل ملحوظ» في هذه الفترة الزمنية؛ أظهرت تجرية التمدد التي استخدمت كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان الأكبر الذي كان يحمل شظايا 0003 ‎Fabs‏ 00028 (كعامل ‎Jf‏ وثان) أفضل درجة من التمدد تحت ظروف الزراعة هذه. ويمكن أن يكون هذا راجعاً مرة أخرى إلى قدرة " كاشف تعدد الوحدات الأوليجومري الأكبر” القابل للذويان على الارتباط بخلايا ‎SST‏ ‏0 في نفس الوقت مقارنة بالأوليجومر "الأصغر" القابل للذويان؛ ويالتالي القدرة على تحفيز خلايا 04+17 أكثر من الأوليجومر "الأصغر". المثال 8: حركيات تمدد مزارع ‎LDA‏ +604 و1 +008 المنقاة مع تبديل الأوساط أو بدونه في هذا المثال تم تقريب البيانات المجمعة من مثالي 6 و7 عن عدد الخلايا المدخلة لكاشف تعدد الوحدات القابل للذويان "الأصغر” والمادة المقارنة الموجبة والسالبة. لم يتم الحصول على ‎af‏ ‏5 بيانات تقريب حول كاشف تعدد الوحدات "الأكبر". على النحو المبين في مثالي 6 ‎(Ty‏ تم تحفيز 0 إلى 500.000 خلية 1 مستجيبة +604 أو ‎(Tresp) CD8+‏ باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر متعددات وحدات 5160180101 )1 مجم/ مل؛ ‎is‏ عليه 0.5ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 00103 و0.5ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 001028. كانت خلايا م1165 غير المعالجة (غير المحفزة) تمثل مادة مقارنة سالبة وخلايا ‎Tresp‏ المحفزة باستخدام خرزات ‎Dyna‏ ‏0 تمثل مادة مقارنة موجبة. تم استنبات خلايا ‎Tresp‏ في ثنائيات في أطباق مكونة من 48 ‎Lie‏ في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا المكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا. وتم استنبات خلايا 0 في ثنائيات في أطباق مكونة من 48 ‎Tue‏ في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا المكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-ا. تم احتضان الخلايا عند 37 م مع تبديل الأوساط (الخطوط المستقيمة في شكل 15) أو بدون تبديل الأوساط (الخطوط المتقطعة في شكل 15) في اليوم 3 5 وتم تحليل عدد ‎WAN‏ بعد 1 3 و6 أيام. كما يتضح من البيانات المقرية الواردة في شكل 15 ‎J‏
أدى كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان "الأصغر” المثبّت عليه ‎Lad‏ 0003 و7850 00028 بشكل قابل للعكس إلى الحصول على حوالي 2.5 ضعف تمدد ‎WIA‏ 004+7. بينما أدى التمدد باستخدام خرزات ‎Dyna‏ إلى معدل تمدد يبلغ حوالي 1.8 ضعفاً. على هذا النحو؛ ويتيح كاشف تعدد وحدات قابل للذويان وارد في الاختراع إحداث تحسن في تمدد خلايا 0004+1 عن خرزات ‎Dyna 5‏ بشكل مماثل؛ يؤكد شكل 15 ب؛ أنه باستخدام كواشف تعدد الوحدات القابلة للذويان
الواردة في الاختراع الحالي أمكن تمديد خلايا ‎T‏ +608 خلال الأيام الثلاثة الأولى على الأقل بنفس الكفاءة التي تكون مع خرزات ‎Dyna‏ ‎Jal‏ 9: التكون المبكر للتكتلات بعد تنشيط ‎T WIA‏ المستجيبة ‎+CD8 5 +CD4‏ المنقاة المحفزة في المختبر بمتعددات وحدات ‎85-5160180086١ /aCD3‏ 80028 قابلة للعكس
0 في هذا ‎(Jill‏ تم تحفيز 400.000 خلية ‎T‏ مستجيبة ‎(Tresp)‏ +004 أو +008 باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر من كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ الأوليجومري )1 مجم/ مل) محمّل بتوليفة من 0.5ميكروجم -0003 و 0.5ميكروجم من ‎Fab‏ 006028. كانت خلايا 0 غير المعالجة (غير المحفزة) تمثتل مادة مقارنة سالبة وخلايا ‎Tresp‏ المحفزة باستخدام خرزات ‎Dyna‏ تمثل مادة مقارنة موجبة. تم استنبات ‎Tresp WA‏ في ثنائيات بأطباق مكونة من
‎Lue 48 5‏ في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا المكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا. تم احتضان الخلايا عند 37 م وتم تحليلها مجهرباً بعد يوم واحد ويومين. يتم إظهار تحفيز ‎CD4+ Tresp‏ (شكل 16 أ) ‎Tresp‏ +608 (شكل 16 ب) لخرزات ‎Dyna‏ (الصف الأوسط) ومتعددات وحدات ‎Streptamer‏ (الصف الأدنى) على الترتيب. تمثل الصور الفوتوغرافية درجة تكون التكتلات:لرؤية أفضل يشار إلى التكتلات التمثيلية بدوائر للتحفيز بأوليجومرات ميوتين
‏0 استريبتيفيدين قابلة لذويان في شكل 16 أ وشكل 16 ب. ‎(gf‏ التكتلات في تحفيز خرزة ‎Dyna‏ ‏بسهولة من خلال تراكم الجسيمات المحفُّزة الداكنة. وكما هو واضح: بالنسبة لخلايا +604 و1 +0058 تكوّنت تكتلات مبكرة عند استخدام طريقة التمدد الواردة في الاختراع والتي تستخدم كاشف تعدد وحدات أوليجومرياً قابلاً للذويان. المثال 10: حركيات التمدد 8 النمط الظاهري لخلايا 7 الذاكرة المركزية ‎(Tom)‏ الحجمية
‏5 المنشطة/ الممدة متعددة النسائل
في هذا المثال» تم تحفيز 500.000 خلية ‎Tem‏ مستجيبة ل ‎CD3+CD62L+CD45RA‏ ‎(Tresp)‏ باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر ‎Streptactin‏ الأوليجومري القابل للذويان الوارد في مثال 5 (1 مجم/ مل) المحمّل بتوليفة من 0.5ميكروجم 00003 و0.5ميكروجم 00028 0 . علاوة على ذلك؛ تم استخدام 4.5 ميكرولتر من مستحضر متعددات وحدات ‎Streptactin‏ ‏5 محمّل باستخدام 0.5ميكروجم 0003؛ 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 0008 و0.5ميكروجم 00028 0 "كظرف تحفيز إضافي. كانت خلايا ‎Tresp‏ غير المعالجة (غير المحفزة) تمثل مادة مقارنة سالبة والخلايا ‎Tresp‏ المحفزة باستخدام خرزات ‎Dyna‏ (المثبّت عليها الأجسام المضادة أحادية النسيلة 00103 و000028 بشكل غير قابل للعكس) تمثل مادة مقارنة موجبة. تم استنبات خلايا 0 بأطباق مكونة من 48 عيناً في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا المكمّل باستخدام 30 0 وحدة/ مل 2-اا فقط أو 30 وحدة/ مل 2-اا و5 نانوجم/ مل 15-اا. تم احتضان الخلايا عند 7م مع تبديل الأوساط كل 3 أيام وتم تحليل عدد الخلايا بعد 7 و14 يوماً. تمثل الرسوم البيانية درجة التكاثر وفقاً لعدد الخلايا المجموعة عند كل نقطة ‎edie)‏ في شكل 117 الأوساط المكملة ب ‎IL-2‏ فقط وفي شكل 17 ب الأوساط المكملة ب 2-اا و15-اا. وكما نرى من شكل17 أ وشكل 7 ب؛ يؤدي كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان المرتبط عليه بشكل قابل للعكس شظية ‎CD3‏ ‎Fab 5‏ وشظية ‎Fab‏ 00028 إلى الحصول على تمدد خلايا افضل من خرزات ‎.Dyna‏ وكما يتضح بشكل أكبر بتحليل قياس التدفق الخلوي في التعبير السطحي عن 00621 و60127 بعد 4 يوماً من المزرعة في أوساط سيتوكين متغيرة من شكل 17 ج؛ تحتفظ الطرق ‎dap all‏ باستخدام كواشف تعدد الوحدات القابلة للذويان الواردة في الاختراع الحالي؛ تحت الظرفين المختارين ‎clin‏ بمحتوى أعلى من ‎T WIA‏ الذاكرة طويلة الأمد التي تعبر عن 60127 مقارنة 0 بالتمدد بخرزات ‎Dyna‏ يوضح هذا ميزة أخرى للطرق الواردة في الاختراع الحالي. المثال 11: التمدد النوعي لمولّد الضد الانتقائي في الخلايا المستجيبة ‎Tom‏ خارج خلايا 7 الذاكرة المركزية +603 الحجمية (الحركيات 8 النمط الظاهري) في هذا المثال؛ تم اختبار الحركيات والنمط الظاهري في التمدد الانتقائي النوعي ‎gal‏ الضد ‎esl)‏ ل ‎(Ag‏ خارج خلايا ‎Tem‏ المنقاة المستجيبة 1 ‎.CD3+CD62L+CD45RA‏
بتفاصيل أكبر؛ تم تحفيز ‎Tom WIA‏ المستجيبة ل /0045+-603+00621 في المختبر بمعقد الببتيد: جزيء ‎MHC‏ (الذي يعمل كعامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى للخلايا) وشظية ‎Fab‏ 00028 (تعمل ككاشف ثان يحفز جزيثاً ثانوياً على سطح الخلايا). تم تثبيت معقد الببتيد النوعي لمولِّد الضد مع جزيء ‎MHC‏ وشظية ‎Fab‏ 00028 بشكل قابل للعكس على ميوتين
استريبتيفيدين الأوليجومري القابل للذوبان (بحيث تكون ‎٠‏ أكبر من أو تساوي 3) الذي يتم وصفه في المثال 5. كان الببتيد المستخدم في التمدد النوعي لمولِّد الضد هو الببتيد ‎CRVLCCYVL‏ ‏(متوالية رقم: 06)؛ الأحماض الأمينية 309 - 317 من بروتين 1 الفوري المبكر (الذي يتم وصفه في ,5 ‎Ameres et al, PLOS Pathogens, May 2013, vol. 9, issue‏ 3ه والذي يمثل قمة لاصقة ‎IE-1 [HLA-CT‏ نوعية للفيروس المضجّم للخلايا
‎.(CMV) 0‏ يحمل جزيء ‎MHC ١‏ الذي يوفر الببتيد في الطرف © من السلسلة » (السلسلة الثقيلة) الببتيد الرابط لاستريبتيفيدين ‎SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK)‏ (متوالية رقم: 07( المتاح تجارياً < ‎"Twin-Strep—tag®"‏ من ,65100080 ‎IBA GmbH,‏ ‎.(Germany‏ ‏لهذا الغرض؛ تم تحفيز 500.000 خلية ‎Tem‏ مستجيبة ‎(Tresp)‏ ل
‎CD3+CD62L+CD45SRA 5‏ بشكل نوعي ل ‎Ag‏ باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ الأوليجومري القابل للذويان المفعّل باستخدام 0.5ميكروجم من معقد البيتيد ‎MHC:‏ من الفئة | المزودة بببتيد رايط لاستريبتيفيدين و0.5ميكروجم من ‎aCD28 Fab‏ الذي يتم وصفه أعلاه. ‎(aS‏ تم تحميل 4.5 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات 707 باستخدام 0.5ميكروجم من معقدات الببتيد: ‎MHC‏ الفئة | ‎oda‏ 0.5ميكروجم
‎aFab | 0‏ 0008و 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 000028. للمقارنة؛ تم إجراء التحفيز متعدد النسائل؛ باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ (1مجم/ ‎(Ue‏ محمّل بتوليفة من 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 00003 و0.5 ميكروجم ‎Fab‏ 00028. مرة أخرى كظرف التحفيز البديل المبين أعلاه؛ تم استخدام 4.5 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات ‎Jase Streptactin‏ بشكل ‎LE‏ للعكس باستخدام 0.5ميكروجم ‎«aCD3 Fab‏ 0.5ميكروجم
‏25 86+ 00008 و0.5ميكروجم ‎Fab‏ 001028. كانت ‎Tresp WIA‏ غير المعالجة ‎ye)‏ المحفزة)
‎Jia‏ مادة مقارنة سالبة وخلايا ‎Tresp‏ المحفزة بشكل متعدد النسائل بخرزات ‎Dyna‏ (الخرزات المثبّت عليها الأجسام المضادة أحادية النسيلة 00003 5 ‎0CD28‏ بشكل غير قابل للعكس) تمثل مادة مقارنة موجبة. تم استنبات خلايا ‎Tresp‏ بأطباق مكونة من 48 عيناً في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا المكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-ا و53 نانوجم/ مل 15-ا. تم احتضان
‏5 الخلايا عند 37 م مع تبديل الأوساط كل 3 أيام وتم تحليل عدد ‎WAY‏ بعد 7 و14 يوماً. يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي التمثيلي لجزء الخلايا النوعية ل 89 التي تم تحفيزها/ تمديدها من خلال أوليجومر استريبت-تاكتين القابل للذوبان الذي تم عليه تثبيت معقد ببتيد: ‎MHC‏ لقمة لاصقة 7©-ها/ ‎(CMV J) IE-1‏ (شكل 18 أ) أنه تم تمديد خلايا 1 النوعية لمولِّد الضد هذه نوعياً. تظهر الرسوم البيانية الواردة في شكل 18 ب إلى شكل 18 ه (التي تمثل درجة تمدد طبائع نوعية
‏0 محددة ل ‎Ag‏ وفقاً لعدد الخلايا الموجبة لمتعدد الوحدات من الببتيد: ‎MHC‏ المجموعة عند كل نقطة زمنية بالقياس إلى تجربة التمدد المبينة في شكل 18 أ) أن كاشف تعدد الوحدات الذي يستخدم المعقد المقابل من الببتيد النوعي ل ‎Ag‏ وجزيء 1 ‎MHC‏ أدى إلى أعلى عدد من الخلايا الممدة (بزيادة تراوح بين عشرين ضعف عدد الخلايا بالنسبة للخلايا النوعية ل 89 التي تتعرف على القمة اللاصقة 0065 ل ‎CMV‏ (الأحماض الأمينية 341 - 350 ‎«QYDPVAALF)‏
‏5 (متوالية رقم: 08)) المقيدة بواسطة ‎(HLA-A2402‏ (انظر شكل 18 ب) إلى زبادة تبلغ 98 ضعف في عدد الخلايا النوعية ل ‎Ag‏ التي تتعرف على القمة اللاصقة ‎HLA-B7/IE-1309-‏ ‎CRVLCCYVL) 317‏ (متوالية رقم: 06)) ل ‎CMV‏ (انظر شكل 18 ه)؛ وهو ما يظهر بالتالي أن طريقة التمدد في الاختراع الحالي يمكن تطبيقها بشكل كامل على تمدد الخلايا النوعية ل ‎Ag‏ ‎pal‏ يؤكد تحليل قياس التدفق الخلوي التمثيلي في التعبير السطحي عن 00621 و
‏0 00127 بعد 14 يوماً من المزرعة للقمة اللاصقة ‎HLA-B7‏ / 16005 (للفيروس الغدي) المبينة في شكل 18 و أيضاً أن الطرق التجريبية باستخدام كواشف تعدد الوحدات القابلة للذويان الواردة في الاختراع الحالي تحتفظ بمحتوى أعلى خلايا 1 الذاكرة طويلة الامد التي تعبر عن 7 في ظروف تحفيزية متعددة النسائل ونوعية ل ‎Ag‏ ‏المثال 12: حركيات التمدد 8 النمط الظاهري الانتقائي التوعي ل 89 في خلايا ‎T‏ الذاكرة المركزية
‏5 الحجمية
-2ع8- يختبر المثال الحالي حركيات التمدد النوعي ل ‎AG‏ الانتقائي خارج الخلايا المستجيبة ل ‎CD3+CD62L+CD45RA-Tem‏ المنقاة التي تم تحفيزها في المختبر باستخدام (أ) معقدات ‎MHC |‏ ببتيدية نوعية ‎algal‏ الضد و(ب) شظايا ‎Fab‏ 006028 تم تثبيتها بشكل قابل للعكس كعامل أول وثان على ميوتينات استريبتيفيدين الأوليجومرية القابلة للذوبان. 5 .لهذا الغرض تم تحفيز 500.000 خلية ‎Tem‏ مستجيبة ‎(Tresp)‏ ل ‎CD3+CD62L+CD45RA‏ بشكل نوعي ل ‎Ag‏ باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ المفعّل باستخدام 0.5)ميكروجم من معقدات الببتيد: ‎MHC‏ من الفئة ‎١‏ ‏المزودة بواسطة ببتيد رابط لاستريبتيفيدين (يوفر الببتيد النوعي الأحماض الأمينية 114 - 124 ‎<CPYSGTAYNSL)‏ متوالية رقم: 10) من بروتين 5 ‎Hexon‏ من الفيروس الغدي) المقيدة 0 بواسطة ‎(HLA-BO7‏ و0.5 ميكروجم من ‎Fab‏ 000028. كبديل» 4.5 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ محمّل باستخدام 0.5ميكروجم من معقد الببتيد: ‎MHC‏ ‏الفئة | هذاء 0.5 ميكروجم ‎Fab‏ 00108 و0.5ميكروجم ‎Fab‏ 001028. للمقارنة؛ تم التحفيز متعدد النسائل؛ باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ (1[مجم/ مل) المحمّل بتوليفة من 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 0003 و 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 00028. مرة أخرى كظرف التحفيز البديل الذي يتم وصفه ‎lel‏ 4.5ميكرولتر من مستحضر متعددات وحدات 7 محملة باستخدام 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 0.5.00103ميكروجم ‎aCD8 Fab‏ و0.5ميكروجم ‎.qCD28 Fab‏ كانت خلايا م1165 غير المعالجة (غير المحفزة) تمثل ‎Bale‏ ‏مقارنة سالبة والخلايا م1165 المحفزة بشكل متعدد النسائل بخرزات ‎Dyna‏ تمثل مادة مقارنة موجبة. تم استنبات خلايا ‎Tresp‏ بأطباق مكونة من 48 ‎Lue‏ في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا 0 المكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا و5 نانوجم/ مل 15--ا. تم احتضان الخلايا عند 37 م مع تبديل الأوساط كل 3 أيام وتم تحليل عدد الخلايا بعد 7 و14 يوماً. تمثل الصور الموضحة في شكل 19 درجة تكون التكتلات في اليوم 5؛ وتم توضيح التحفيز النوعي ل ‎Ag‏ التمثيلي للقمة اللاصقة 5 ‎HLA-B7 /Hexon‏ من الفيروس الغدي. كما نرى من شكل 19؛ يمكن تمديد الخلايا النوعية لمولّد ضد الفيروس الغدي نوعياً من المجموعة 003+60621+60455/8-10100 5 المستجيبة الأصلية.
المثال 13: الحصيلة والنمط الظاهري للخلايا الممدة ‎T‏ +008- التفاوت الحجمي في كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان وإضافة 0008-5780 للتحفيز في هذا المثال؛ تم اختبار تمدد الخلايا 7 +008 المستجيبة المنقاة المحفزة في المختبر بشظايا ‎Fab‏ 00603/00028 تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على ميوتين استريبتيفيدين الأوليجومري
القابل للذويان. بالإضافة إلى ذلك؛ تم اختبار أثر إضافة 0008-7895 إلى كاشف تعدد الوحدات لزيادة الطبيعة النوعية للتمدد في خلايا 1 +008. لهذا الغرض» تم تحفيز 300.000 خلية 1 مستجيبة ‎(Tresp)‏ +0008 منقاة بشكل منفصل باستخدام كاشفي تعدد وحدات مختلفين أساسهما ‎(Streptactin‏ تحديداً كاشف تعدد الوحدات 207 الأوليجومري الصغير الوارد في مثال 5 (1مجم/ ‎(de‏ أو أوليجومرات ‎Streptactin‏
0 الأكبر التي يتم وصفها أعلاه (0.1مجم/ مل). تم تحميل 3 ميكرولتر من كاشفي تعدد الوحدات المختلفين (السلاسل الرئيسية) بتوليفة من 0.5 ميكروجم 00003 و0.5ميكروجم من شظايا ‎CD28 Fab‏ التي يتم وصفها أعلاه. بالإضافة إلى ذلك؛ تم تحميل 4.5 ميكرولتر من كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ الأصغر (السلسلة الرئيسية) باستخدام 0.5 ميكروجم0003 « 0.5 ميكروجم ‎Fab‏ 0008 و0.5ميكروجم من ‎Fab Lad‏ 00028 التي يتم وصفها أعلاه. علاوة
5 على ذلك تم استخدام 3 ميكرولتر من كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ "الأصغر” (السلسلة الرئيسية) مفعّل فقط باستخدام 0.5ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 0003 فقط أو 0.5ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 001028 فقط. كانت خلايا م1165 غير المحفزة تمثل ‎sale‏ مقارنة سالبة و
0 المحفزة باستخدام خرزات ‎Dyna‏ تمثل مادة مقارنة موجبة. تم استنبات خلايا ‎Tresp‏ في ثنائيات بأطباق مكونة من 48 ‎Lue‏ في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا المكمّل باستخدام 30
0 وحدة/ مل 2-اا. تم احتضان الخلايا عند 37 م مع تبديل الأوساط بعد 3 أيام وتم تحليلها بعد 6 أيام. يمثل شكل 20 أ درجة التكاثر وفقاً لعدد الخلايا المجموعة في اليوم 6 مقارنة بالمواد المقارنة السالبة ومقربة للمادة المقارنة الموجبة. يظهر شكل 20 أ أن تمدد ‎Wa‏ 1 +008 باستخدام كواشف تعدد الوحدات القابلة للذويان الواردة في الاختراع يؤدي إلى حصائل ‎ef‏ لخلايا +008 آ مقارنة بالتمدد باستخدام خرزات ‎Dyna‏ يظهر تحليل ‎FACS‏ للتعبير السطحي عن ‎CD8‏
5 (شكل 20 ب) والتعبير السطحي عن 0045850 (شكل 20 ج) بعد زراعة الخلايا أنه تم تمديد
نفس النمط الظاهري لخلايا 1 +008 بواسطة كواشف تعدد الوحدات الواردة في الاختراع أو خرزات ‎Dyna‏ (تمت مقارنة ظروف التحفيز المتنوعة باستخدام ‎ANOVA‏ أحادي المسار ‎aly‏ يتم اكتشاف اختلاف كبير). قد تكون الحصيلة المحسنة من خلايا +608 باستخدام طرق التمدد المبتكرة مقارنة بخرزات ‎Dyna‏ راجعة إلى أن كاشف تعدد الوحدات القابل للذويان يمكن أن يصل إلى مستقبلاته المستهدفة على سطح الخلية بشكل أفضل من الأجسام المضادة ‎A‏ على خرزات 8. وقد تكون هذه الحصيلة المحسنة مفيدة جداً عند تمديد مجموعة ‎WIA‏ نادرة من عينة مبدئية. بالإضافة إلى ذلك؛ بمقارنة حصيلة تمدد التي تحققت بعامل تعدد الوحدات المثبّت عليه 5ميكروجم 0003 و0.5ميكروجم من شظايا ‎Fab‏ 00028 بشكل مشترك (العمود الثاني من 0 اليسار في شكل 20 ب) بالحصيلة باستخدام كاشفي تعدد وحدات مفكّلين فقط بشظية 0003 ‎Fab‏ فقط أو الشظية ‎Fab‏ 00028 فقط (العمود الثالث من اليسار في شكل 20 ب)؛ يمكن أن نرى أن كلتا التجريتين شهدت نفس كفاءة التمدد. على هذا النحو؛ تظهر هاتان التجريتان أن استخدام كاشف تعدد وحدات واحد ‎iia‏ عليه العامل الأول والعامل الثاني بشكل مشترك مكافيء وظيفياً لاستخدام كاشفي تعدد وحدات منفصلين محمّلين بالعامل الأول والعامل الثاني فقطء على 5 التترتيب ‎call‏ ‏المتال 14: الحصيلة 8 النمط الظاهري لخلايا ‎١1‏ +0108 الممدة - معايرة كواشف تعدد وحدات قابلة للذويان منفصلة بنسب مختلفة من شظية 00103 و86 001028 مثبتة عليها في هذا المثال تم اختبار الحصيلة والنمط الظاهري لخلايا ‎T‏ +0005 المستجيبة ‎(Tresp)‏ الممدة ‎sisal‏ في المختبر بشظايا ‎Fab‏ 0003/00028 تم تثبيتها بشكل قابل للعكس بكميات مختلفة 0 على ميوتينات استريبتيفيدين الأوليجومرية القابلة للذويان. لهذا العرض تم تحفيز 300.000 خلية ‎T‏ مستجيبة ‎CD8+ (Tresp)‏ بكميات متفاوتة من خليط مستحضرات من كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ الأوليجومري "الصغير" (1 مجم/ ‎(do‏ ‏المفعّل ب ‎Fab‏ 0003 وحده و85 00028 وحده ‎1X7)‏ يناظر 1.5ميكروجم من كاشف تعدد الوحدات 506018010 المفعّل باستخدام 0.5 ميكروجم 00103 وحده و5. [ميكروجم من متعدد
الوحدات ‎Streptactin‏ مفكّل باستخدا م 0.5ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 00028 وحدها)؛ أو 3 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات 5106018010 المحمّل باستخدام 0.5ميكروجم
3 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 0028؛ أو 4.5 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات 07 المحمّل باستخدام 0.5ميكروجم ‎«aCD3‏ 0.5ميكروجم من 000008 ‎Ji‏ باستريب
و5.لميكروجم ‎.qCD28 Fab‏ كانت ‎WA‏ م1165 غير المعالجة تمثل ‎sale‏ مقارنة سالبة و
0 المحفزة باستخدام خرزات ‎Dyna‏ تمثل مادة مقارنة موجبة. تم استنبات خلايا ‎Tresp‏ ‏بأطباق مكونة من 48 ‎Tue‏ في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا المكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا. تم احتضان الخلايا عند 37م بدون تبديل الأوساط وتم تحليلها بعد 5 أيام. يمثل شكل 1 أ درجة التكاثر وفقاً لعدد الخلايا المجموعة في اليوم 5 مقارنة بالمواد المقارنة السالبة ومقرية
0 لللمادة المقارنة الموجبة. شكل 21 أ يظهر أن تمدد خلايا 7 +608 باستخدام كواشف تعدد الوحدات القابلة للذويان الواردة في الاختراع المتنوعة يؤدي إلى حصائل أعلى من ‎T Wa‏ +008 مقارنة بالتمدد باستخدام خرزات ‎Dyna‏ (خصوصاً أن الكمية الإجمالية التراكمية للكاشف في الظرف *5 أدت إلى تمدد مثالي للخلايا خصوصاً مقابل الزمن /الزيادة في إجمالي الخلايا ببداية انقسام الخلايا). يظهر تحليل ‎FACS‏ للتعبير السطحي عن 608 (شكل 21 ب) والتعبير
5 السطحي عن 6045850 (شكل©210 ) بعد زراعة الخلايا تمديد نفس النمط الظاهري لخلايا 7 +608 بكواشف تعدد الوحدات المتنوعة الواردة في الاختراع أو بخرزات ‎Dyna‏ المتاحة تجارياً. المتال 15: تنشيط تسلسلات إرسال الإشارات داخل الخلوية بعد تحفيز متعددات الوحدات ‎Streptamer‏ لخلايا ‎Jurkat‏ المستحثة ب ‎aCD19-CAR‏ ‏في هذا المثال تم اختبار تنشيط تسلسلات إرسال الإشارات داخل الخلوية لخلايا ‎Jurkat‏
0 المستحثة ‎Addl‏ للتعبير عن مستقبل ‎dpe‏ ضد خيمري ‎(CAR)‏ نوعي للورم؛ تحديداً هنا 0019 والتي تم تحفيزها باستخدام ‎Strep—tactin®‏ الأوليجومري الوارد في مثال 5 ككاشف تعدد وحدات قابل للذويان. لهذا الغرض؛ تم تحفيز 300.00 خلية ‎Jurkat‏ مستجيبة ‎(Jresp)‏ باستخدام (أ) كميات متفاوتة من خليط من مستحضرات كاشف تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ (1مجم/ ‎Jade (Ue‏ باستخدام
‎Faby 0003 Fab Las 5‏ 028©» التي يتم وصفها هنا ‎X17)‏ يناظر 3 ميكروجم من كاشف
تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ المفعّل باستخدام 0.5ميكروجم -00103 و0.5ميكروجم 001028 ‎Fab‏ — يوفر هذا 'كاشف تعدد وحدات متعدد النسائل أساسه 18000م508")؛ أو (ب) 3 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد وحدات ‎Streptactin‏ مفعّل باستخدام 0.5ميكروجم ‎(XL)‏ ‏1 ميكروجم ‎(X2)‏ من النطاق خارج الخلوي ‎(ECD)‏ من 00019 (المركب الترابطي الطبيعي ل ‎0CD19-CAR 5‏ — يوفر هذا 'كاشف تعدد وحدات أساسه 506018600 نوعي ل ‎(‘CAR‏ أو 3 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد وحدات ‎Streptactin‏ محمّل باستخدام 0.5ميكروجم ‎(X1)‏ ‏أو 1 ميكروجم ‎(X2)‏ من 0196 يتعرف على الفاصل 0964| في ‎aCD19-CAR‏ - يوفر هذا ‎Lad‏ 'كاشف تعدد وحدات أساسه ميوتين استريبتيفيدين نوعي ل ‎((CAR=‏ تم الحصول على ‎ECD of CD19‏ مزود بتذييل هكساهستيدين من ‎Sino Biological/Life technologies‏ (متوالية رقم: 27( وتم تفعيله للارتباط بكاشف تعدد وحدات أساسه استريبتيفيدين بخلط ‎ECD of‏ 09 انمع الجزيء المهايىء ‎IBA GmbH, Germany, Order ) His—STREPPER‏ ‎(number 2-0920-005‏ بنسبة جزيئية 1 : 1 والاحتضان ‎sad‏ 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. يحتوي الجزيء المهايىء ‎HisS=STREPPER‏ على جزءِ خلب يرتبط بتذييل هكساهستيدين ‎Ang‏ رابط لاستريبتيفيدين» وبالتالي تزويد الجزيء المستهدف بشكل مؤقت؛ وهو هنا ‎ECD 0706019 5‏ بببتيد رابط لاستريبتيفيدين يمكن أن يرتبط بشكل قابل للعكس بكاشف تعدد الوحدات القائم على أساس ميوتين استريبتيفيدين. كانت ‎Jresp‏ المحفزة باستخدام خرزات ‎Dyna‏ ‏(خرزات مثبت عليها الأجسام المضادة أحادية النسيلة 0003 5 ‎aCD28‏ بشكل غير قابل للعكس) أو ‎PMA‏ وكان أيونومايسين ‎Jia‏ المواد المقارنة الموجبة. تم استنبات خلايا 850١ل‏ في أنابيب ‎Eppendorf‏ 1.5 مل في 200 ميكرولتر من وسط مزرعة الخلايا المكمّل باستخدام 30 0 وحدة/ مل 2-اا. تم احتضان الخلايا عند 37 م وؤضعت على الثلج وتم حلها بعد صفر دقيقة إلى 20 دقيقة من التحفيز. يشير اكتشاف ‎ERK‏ المفسفر إلى إرسال نشط لإشارات ‎(MAPK‏ ‏وبشير تبقيع ]-أكتين الإشرافي إلى تحميل كميات متساوية من البروتين الإجمالي في كل حالة ونقطة زمنية. وكما نرى من مقارنة شكل 22 أ الذي يظهر تنشيط خلايا ‎Jurkat‏ من خلال 'كاشف تعدد وحدات 506018010 متعدد النسائل" وشكل 22 ب الذي يظهر تنشيط خلايا ‎Jurkat 25‏ من خلال ‎il‏ تعدد الوحدات القائمين على أساس ‎Streptactin‏ النوعيين ل ‎CAR‏ ‏¢ يمكن تنشيط/ تمديد خلايا ‎Jurkat‏ من خلال ربط النطاق ‎CD19‏ خارج الخلوي بمستقبل ‎Age‏
الضد الخيمري النوعي ل 0019. ولأن المعالجة الجينية البعدية لخلايا آ تتم بشكل يكاد يكون حصرياً على مجموعات ‎WIA‏ سابقة الانتقاء؛ يؤدي تنشيط عام من خلال الربط التشابكي ل ‎CARS‏ المدخلة عبر النطاق الفاصل 0964| (وبتم الحفاظ عليه في 0/1458 متنوعة بطبائع نوعية مختلفة) إلى زيادة إمكانية تطبيق تحفيز/تمدد الخلايا القابل للعكس في مواقف معالجة الخلايا في المختبر هذه.
على هذا النحوء تظهر هذه التجرية أن أية مجموعة خلايا منشطة بعامل ربط (مركب ترابطي) توفر من حيث ‎fas)‏ إشارة تنشيط أولى ‎to the‏ مجموعة الخلايام*© ‎can be‏ #0باستخدام ‎a‏ ‏عامل أول بشكل قابل للعكس ‎ON 8 cia‏ كاشف تعدد الوحدات على النحو الذي يصفه الطلب الحالي.
0 المثال 16 : الحصيلة وتركيبة المجموعة الفرعية من خلايا ‎T‏ +603 الممدة مع إضافة 0608-7 للتحفيز تظهر التجرية تمدد خلايا ‎T‏ +003 المستجيبة المنقاة المحفزة في المختبر بشظايا ‎Fab‏ 0003/00028 تم تثبيتها بشكل قابل للعكس على ‎Strep-tactin®‏ الأوليجومري القابل للذويان الوارد في مثال 5 الذي كان ‎Jie‏ كاشف تعدد وحدات قابلاً للذويان. وفي إحدى
5 التجارب؛ بالإضافة إلى شظايا ‎Fab‏ 0003/00028؛ تم أيضاً ‎cud‏ شظية ‎aCD8 Fab‏ متاحة تجارياً من ‎IBA GmbH, Géttingen, Germany‏ (برقم كتالوج 6-8000-203) على الأوليجومر القابل للذويان من ميوتين استريبتيفيدين لاختبار ما إذا كان ممكناً تحفيز مجموعة فرعية معينة من ‎T WDA‏ تفضيلياً في المختبر بمتعددات وحدات ‎Fab—/aCD3‏ 80028 ‎Streptamer‏ قابلة للعكس. بتفاصيل أكبر؛ تم تحفيز 500.000 خلية ‎T‏ مستجيبة ‎(Tresp)‏
‎sli CD3+ 0‏ باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر استريبتيفيدين أوليجومري (1 مجم/ ‎(de‏ محمّل بتوليفة عبارة عن 0.5ميكروجم من 0003 و 0.5ميكروجم من ‎Fab‏ 00028. كطريقة بديلة؛ تم تحميل 4.5 ميكرولتر من أوليجومر ‎Streptactin‏ باستخدام 0.5 ميكروجم من 0003؛ 5ميكروجم من ‎Fab‏ 00006 مذيّل بواسطة ‎strep‏ و0.5ميكروجم من ‎Fab‏ 001028 مذيّل بواسطة م506. كانت ‎WIA‏ م1165 غير المحفزة تمثل ‎sale‏ مقارنة سالبة وم1765 المحفزة
‏5 باستخدام خرزات ‎Dyna‏ (خرزات يتم عليها تثبيت الأجسام المضادة أحادية النسيلة 0003 و
8بشكل غير قابل للعكس) تمثل مادة مقارنة موجبة. وكما نرى من شكل 23 أ أدى كاشف تعدد الوحدات المحمّل بشكل قابل للعكس بالشظية ‎«qCD3 Fab‏ الشظية ‎Fab‏ 00028 وكذلك الشظية ‎aCD8 Fab‏ إلى توفير أعلى عدد من خلايا 1 +603 الممدة. ببلوغ عدد الخلايا الممدة 106 ‎X‏ 1*1 صارت الحصيلة أعلى بنسبة تبلغ حوالي 30 % منها في تمدد خلايا ‎T‏ هذه باستخدام خرزات ‎Dyna‏ المتاحة تجارياً. بالإضافة إلى ذلك وبشكل أكثر أهمية؛ على النحو المبين
في شكل 23 ب باستخدام كاشف تعدد الوحدات هذا الذي يحمل شظية ‎CD3 Fab‏ شظية ‎Fab‏ 00028 وشظية ‎Fab‏ 0008 كانت كمية ‎T WIA‏ +008 هي الأعلى؛ مقارنة بالتمدد بخرزات ‎Dyna‏ أو كاشف تعدد وحدات قابل للذويان وارد في الاختراع يحمل فقط الشظية 00003 ‎Fab‏ والشظية ‎Fab‏ 00028 كعامل أول وعامل ثان على النحو المبين في الطلب الحالي. على
0 هذا ‎call‏ تظهر هذه التجرية ‎se Load‏ الاختراع الحالي التي تتمثل في أنه بالإضافة إلى عامل أول يوفر إشارة تنشيط أولى لمجموعة الخلايا المرغوب فيها واختيارياً عامل ثان يوفر إشارة تحفيزية مشتركة؛ يمكن تثبيت عامل آخر نوعي لتنشيط مجموعة الخلايا المرغوب فيها على كاشف تعدد الوحدات. على هذا النحوء بتنفيذ هذاء يتيح الاختراع الحالي إمكانية التمدد بشكل تفضيلي أو إثراء أية مجموعة خلايا (فرعية) مرغوب فيها انتقائياً من عينة؛ على سبيل المثال؛ يشتمل على عدد
5 متنوع من المجموعات الفرعية المختلفة. المثال 17: التمدد المتوازي النوعي لمولِّد الضد في خلايا ‎TEM‏ مستجيبة من تجمع واحد في هذا المثال؛ يتم اختبار حركيات التمدد المتوازي النوعي ‎algal‏ الضد (النوعي ل ‎(AG‏ من تجمع واحد ‎T WAT‏ مستجيبة محفزة في المختبر بمتعددات وحدات قابلة للعكس متعددة من الببتيد : ‎Fab-Streptamer‏ 110/001126ا/ا.
يتم بشكل متزامن تحفيز 500.000 خلية مستجيبة ‎Tem‏ مستجيبة ‎(Tresp)‏ ‎D3+CD62L+CD45RA‏ للطبائع النوعية المتعددة ل ‎(SAG‏ طبيعة نوعية باستخدام 3 ميكرولتر من متعددات الوحدات ‎Streptactin‏ مفعلة باستخدام 0.5 ميكروجم من معقدات الببتيد: ‎MHC‏ الفئة 1 المقابلة التي تحمل ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين و0.5ميكروجم من ‎Fab‏ 00028 يحمل ‎fay Lad‏ رابطاً لاستريبتيفيدين. كطريقة بديلة؛ يتم استخدام 4.5
5 ميكرولتر من كاشف تعدد وحدات أساسه ‎Streptactin‏ مفكّل باستخدام 0.5 ميكروجم من
المعقدات ببتيد: ‎MHC‏ من الفئة ‎١‏ التي تحمل ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين» 0.5ميكروجم 0008 0 او0.5 ميكروجم ‎Fab‏ 001028 على النحو الذي يصفه الطلب الحالي لكل طبيعة نوعية. للمقارنة؛ يتم التحفيز متعدد النسائل؛ باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد وحدات أساسه ‎Streptactin‏ (1 مجم/ مل) ‎Jase‏ بشكل قابل للعكس بتوليفة من 0.5 ميكروجم من ‎Fab‏ 0003 و0.5ميكروجم من ‎Fab‏ 00028. مرة أخرى كظرف التحفيز البديل الذي يتم وصفه أعلاه؛ يمكن استخدام 4.5 ميكرولتر من مستحضر كاشف تعدد الوحدات أساسه 07 محمّل بشكل قابل للعكس باستخدام 0.5ميكروجم ‎«aCD3 Fab‏ 0.5 ميكروجم ‎Fab‏ 0008و0.5 ميكروجم ‎Fab‏ 00028 (يحمل كل منها ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين). كانت خلايا ‎Tresp‏ غير المعالجة (غير المحفزة) تمثل مادة مقارنة سالبة وخلايا ‎Tresp‏ المحفزة بشكل 0 متعدد النسائل بخرزات ‎Dyna‏ (خرزات مغلفة بواسطة 00103 3 ‎(@CD28-mMAb‏ تمثل ‎sale‏ ‏مقارنة موجبة. يتم استنبات خلايا ‎LLL Tresp‏ مكونة من 48 ‎Lue‏ في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا مكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا و5 نانوجم/ مل 15-ا. يتم احتضان ‎WAN‏ عند 7م مع تبديل الأوساط كل 3 ‎all‏ ويتم تحليل عدد الخلايا بعد 7 و14 يوماً. المثال 18: التكاثر التفضيلي لخلايا ‎١‏ +0008 بين خلايا ‎T‏ +0003 المستجيبة المحفزة في 5 المختبر بكواشف تعدد وحدات أساسها استريبتيفيدين مفعّلة بشكل قابل للعكس ‎Lady‏ ‎Fab‏ 0.013/0018/001026 يتم تحفيز 300.000 خلية 1 مستجيبة ‎(Tresp)‏ +0103 باستخدام 3 ميكرولتر من مستحضر تعدد الوحدات ‎Streptactin‏ (1 مجم/ مل) أو مستحضر كاشف تعدد الوحدات باستخدام سلسلة 07 الرئيسية الضخمة (0.1مجم/ ‎(de‏ المحمّل بتوليفة من 0.5ميكروجم 00103 و 0 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 00028 ؛ أو 4.5ميكرولتر من كاشف تعدد وحدات أساسه مستحضر 07 محمّل باستخدام 0.5ميكروجم 0.5»00103ميكروجم ‎Fab‏ 00108 و0.5ميكروجم ‎Fab‏ 06028؛ أو 3 ميكرولتر من خليط من كاشف تعدد وحدات أساسه مستحضرات 977 مع 0.5ميكروجم ‎Fab‏ 00103 وحده و0.5 ميكروجم ‎Fab‏ 001028 وحده ‎JS)‏ ‏شظية ‎Fab‏ تحمل مرة أخرى ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين). كان خلايا 132650 غير المعالجة تمثل 5 مادة مقارنة سالبة وم1765 المحفزة باستخدام خرزات ‎Dyna‏ (الخرزات المغلفة باستخدام 00103
‎mAb‏ -00028) تمثل مادة مقارنة موجبة. يتم استنبات خلايا ‎Tresp‏ في ثنائيات بأطباق مكونة من 48 ‎Tue‏ في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا المكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا. يتم احتضان الخلايا عند 37 م مع تبديل الأوساط بعد 3 أيام وتحليلها بعد 6 أيام. المثال 19: التكاثر التفاضلي لخلايا 7 +608 بين خلايا 7 +603 المستجيبة المحفزة في المختبر بكواشف تعدد وحدات أساسها استريبتيفيدين مفعلة بشكل قابل للعكس بتظايا 0003 ‎aCD28 Fab‏ يتم تحفيز 300.000 خلايا ‎T‏ مستجيبة ‎ (Tresp)‏ +0103 محفزة بكميات متباينة من خليط كاشف تعدد وحدات أساسه مستحضرات ‎(Je [ane 1) Streptactin‏ مفعّل بشظية ‎Fab‏ 0003 وحدها وشظية ‎Fab‏ 00028 وحدها (كاشف تعدد وحدات أساسه 1.5 ميكروجم ‎Streptactin‏ ‏0 مفعّل باستخدام 0.5ميكروجم من شظية ‎ang 0003 Fab‏ و1.5 ميكروجم من كاشف تعدد وحدات أساسه ‎Streptactin‏ مفعّل باستخدام 0.5ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 00028 وحدها)؛ أو كميات متباينة من خليط من كاشف تعدد وحدات أساسه مستحضرات ‎Streptactin‏ مفعّل باستخدام شظية ‎Fab‏ 0003 وشظية ‎Fab‏ 00028 مع أو بدون شظية ‎JS) 0008 Fab‏ شظية ‎Fab‏ مرة أخرى تحمل ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين) (3 ميكروجم من كاشف تعدد وحدات 5 أساسه ‎Streptactin‏ مفكّل باستخدام 0.5ميكروجم من 00003 و0.5ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 00028 — بدون شظية ‎Fab‏ 0008 أو 4.5 ميكرولتر من كاشف تعدد وحدات أساسه مستحضر ‎Streptactin‏ محمّل باستخدام 0.5)ميكروجم شظية ‎Fab‏ 00103؛ 0.5 ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 00108 و 0.5ميكروجم من شظية ‎Fab‏ 00028 حيث تحمل شظية ‎seFab‏ ‏أخرى ببتيداً رابطاً لاستريبتيفيدين). تمثل ‎Tresp WA‏ غير المعالجة ‎sale‏ مقارنة سالبة و ‎Tresp‏ ‏0 المحفزة باستخدام خرزات ‎Dyna‏ (الخرزات المغلفة بواسطة 00103 5 ‎mAb‏ -000028) تمثل مادة مقارنة موجبة. يتم استنبات خلايا ‎Tresp‏ بأطباق مكونة من 48 ‎Lue‏ في 1 مل من وسط مزرعة الخلايا المكمّل باستخدام 30 وحدة/ مل 2-اا. يتم احتضان الخلايا عند 37 م مع تبديل الأوساط بعد 3 أيام ويتم تحليلها بعد 6 أيام. لا ينبغي بالضرورة أن يكون إيراد أو مناقشة وثيقة منشوة في السابق في هذه المواصفة إقراراً ‎Ob‏ ‏5 الوثيقة ‎oda‏ من ‎Ala‏ الفن أو تمثل معرفة ‎elie dale‏
يمكن بشكل مناسب تنفيذ الاختراع الذي يتم وصفه بشكل توضيحي في الطلب الحالي في عدم وجود أي عنصر أو عناصرء قيد أو قيود؛ لا يتم الكشف عنها بشكل محدد في الطلب الحالي. على هذا النحو؛ على سبيل ‎(Jha)‏ ينبغي قراءة الاصطلاحات "مشتمل على" "يضم" 'يحتوي على" إلخ. بمفهوم رحب وبدون قيد. بالإضافة إلى ذلك؛ يتم استخدام الاصطلاحات والتعبيرات المستخدمة في الطلب الحالي كاصطلاحات للوصف وليس للحصرء ولا توجد نية في استخدام هذه
الاصطلاحات والتعبيرات لاستبعاد أية مكافئات للسمات المبينة والتي يتم وصفها أو أجزاء منهاء لكن من المعترف به أنه يمكن إدخال تعديلات متنوعة تعتبر ضمن مجال الاختراع المطلوب حمايته. على هذا ‎coal)‏ ينبغي إدراك أنه على الرغم من أن الاختراع الحالي تم الكشف ‎aie‏ بشكل محدد بنماذج تمثيلية وسمات اختيارية؛ يمكن اللجوء إلى تعديل وتبديل الاختراعات المجسدة به
0 والتي يكشف عنها الطلب الحالي بواسطة من يتمتعون بالمهارة في المجال؛ وأن هذه التعديلات والتغييرات تعتبر ضمن مجال الاختراع الحالي. تم وصف الاختراع بمفهوم واسع وعام في الطلب الحالي. وتعتبر كافة الأنواع الأضيق نطاقاً والمجموعات الأقل عمومية ضمن الكشف العام جزءاً أيضاً من الاختراع. يضم هذا الوصفٌ العام للاختراع بشرط أو بقيد سلبي يتمثل في عدم إزالة أية مادة موضوع من ذات الجنس؛ بغض النظر
5 عما إذا كانت المادة المبتورة واردة في الطلب الحالي نصاً أم لا. تعتبر النماذج الأخرى ضمن عناصر الحماية التالية. بالإضافة إلى ذلك؛ حين يتم وصف سمات أو جوانب الاختراع على أساس مجموعات ‎(Markush‏ يدرك من يتمتعون بالمهارة في المجال أن الاختراع يتم أيضاً وصفه على هذا النحو على أساس أي عضو فردي أو مجموعة أعضاء فرعية من مجموعة ‎.Markush‏

Claims (1)

  1. عناصر الحماية 1- طريقة تتم في المختبر لتحفيز مجموعة من الخلايا اللمفاوية ‎lymphocytes‏ « تشتمل الطريقة على تلامس عينة مشتملة على مجموعة من الخلايا اللمفاوية ‎lymphocytes‏ مع كاشف لتعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ يكون مرتبطًا بصورة قابلة للعكس مع عامل أول وعامل ثانٍ؛ ‎Cus‏ ‏5 يكون كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ في صورة قابلة للذويان وبشتمل على
    قليل وحدات أو بوليمر ‎polymer‏ من الاستريتافيديين ‎streptavidin‏ ؛ أفيدين ‎avidin‏ ؛ استريبتيفيدين ميوتين ‎streptavidin mutein‏ ؛ أو أفيدين ميوتين ‎avidin mutein‏ . العامل الأول (1) يشتمل على شريك ارتباط أول واحد على الأقل قادر على الربط بشكل قابل للعكس بموضع ربط أول لكاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ لتشكيل رابط قابل
    0 للعكس بين شربك ارتباط استريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ وموقع الارتباط الأول» و(2) يكون قادر على ربط جزيء مستقبل على سطح خلية لمفاوية في مجموعة لتحفيز إشارة أولية إلى الخلية اللمفاوية ‎lymphocyte‏ ؛ و يشتمل العامل الثاني (1) على شربك ربط ثانٍ ستبرتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ ثان ‎asl‏ على الأقل قادر على الارتباط بشكل قابل للعكس بموضع ربط ثانٍ لكاشف تعدد الوحدات
    ‎multimerization reagent 5‏ لتكوين رابطة بين شريك ربط الاستربتأفيدين ‎streptavidin‏ أو الأفيدين ‎avidin‏ الثاني وموقع الربط الثاني؛ و(2) يكون قادر على ربط جزيء ملحق على سطح خلية لمفاوية لتحفيز إشارة ملحقة للخلية اللمفاوية ¢ وبالتالي يتم تحفيز الخلايا اللمفاوية ‎lymphocytes‏ في المجموعة.
    ‏20 2- الطريقة ‎Gg‏ لعنصر الحماية رقم 1 حيث تكون مجموعة الخلايا اللمفية ‎lymphocyte‏ عبارة عن مجموعة خلايا 8؛ مجموعة خلايا تائية ‎T cells‏ مجموعة ‎WIA‏ قاتلة طبيعية ‎natural‏ ‎killer cell population‏ أو خليط منها. 3- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 2( حيث تكون مجموعة الخلايا التائية ‎cells‏ 1 عبارة عن
    ‏5 مجموعة ‎WDA‏ تائية ‎cells‏ 1 نوعية ‎Algal‏ الضدء مجموعة ‎WIA‏ تائية ‎cells‏ 1 مساعدة؛
    — 9 3 — مجموعة ‎WIA‏ تائية ‎T cells‏ سامة ‎cytotoxic‏ للخلايا ‏ مجموعة ‎LIA‏ تائية ‎T cells‏ ذاكرة regulatory ‏تنظيمية‎ 1 cells ‏تائية‎ WIA ‏أو مجموعة‎ Memory 4- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 1 حيث تشتمل مجموعة الخلايا اللمفاوية ‎lymphocytes‏ ‏5 على مجموعة ‎WIA‏ تائية ‎cells‏ 1 وعامل ‎Jol‏ يشتمل على ‎:MHC ١‏ معقد بيبتيد ‎peptide‏ ‎complex‏ أو يحفز إشارة مرتبطة بمعقد ‎complex-associated signal‏ 10/003 فى ‏خلايا تائية ‎T cells‏ و/أو تشتمل على كاشف رابط ‎binding reagent‏ يرتبط ب ‎.CD3‏ ‏5- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 4؛ حيث يشتمل العامل الأول على ‎MHC ١‏ معقد ببتيد أو ‏0 يحفز إشارة مرتبطة بمعقد ‎complex—associated signal‏ 104/0103 فى خلية تائية 1
    ‎.cell‏ ‏6— الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 4؛ حيث يربط العامل الأول ‎CD3‏ تحديدا. ‏5 7- الطريقة ‎Gig‏ لعنصر الحماية رقم 4 ‎Cun‏ يكون الجزيء الثانوي على الخلية التائية ‎cell‏ 1 عبارة عن ‎CD28‏ أو 00137 و/أو يشتمل العامل الثانى على كاشف رابط ‎binding reagent‏ يرتبط ب ‎CD28‏ أو 60137 أو يكون مزيجا من الكاشفين الرابطين المختلفين الذين يرتبط كلاهما ب ‎CD28‏ أو ‎.CD137‏ ‏0 8- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 7 حيث يشتمل العامل الثاني الذي يريط الجزيء الثانوي عبارة عن كاشف ريط ‎binding reagent‏ يريط ‎CD28 Lei‏ أو 00137. ‏9- الطريقة ‎Gig‏ لعنصر الحماية 1؛ حيث: يكون العامل الأول عبارة عن جسم مضاد ‎antibody‏ ل 003؛ شظية جسم مضاد ثنائي التكافؤ ‎divalent antibody fragment 5‏ من جسم مضاد ‎«CD31 antibody‏ شظية جسم مضاد
    — 4 9 — أحادي التكافوؤ ‎monovalent antibody fragment‏ من جسم مضاد ‎«CD3 antibody‏ أو جزيء رابط ل ‎dig» CD3‏ بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد ‎antibody‏ ‏0- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 9( حيث تكون شظية الجسم المضاد ثنائي ‎HS‏ ‎divalent antibody fragment 5‏ عبارة عن شظية ‎(F(ab')2 fragment‏ أو شظية ‎Fv‏ أحادية
    السلسلة ‎single—chain Fv fragment‏ ثنائية التكافؤ ‎divalent‏ ‏1- الطريقة ‎Gg‏ لعنصر الحماية رقم 9 حيث يتم اختيار شظية الجسم المضاد أحادي التكافؤ ‎monovalent antibody fragment‏ من المجموعة المكونة من شظية ‎«Fab fragment‏
    شظية ‎(Fv fragment‏ وشظية ‎Fv‏ أحادية السلسلة ‎(scFv) single—chain Fv fragment‏ . 2- الطريقة وفقا لعنصر الحماية 1 حيث يكون العامل الثاني ‎Hle‏ عن جسم مضاد ‎antibody‏ ‏ل 00-28؛ شظية جسم مضاد ثنائية التكافؤؤ ‎divalent antibody fragment‏ لجسم مضاد ‎antibody‏ ل ‎«CD-28‏ شظية جسم مضاد أحادي التكافؤؤ ‎monovalent antibody‏
    ‎fragment 5‏ من جسم مضاد ‎antibody‏ ل 0003؛ أو جزيء رابط ل 0003 بروتيني بخصائص ريط شبيهة بالجسم المضاد /ا801500. 3- الطريقة وفقا لعنصر الحماية 12( حيث يتم اختيار شظية الجسم المضاد أحادي التكافؤ ‎monovalent antibody fragment‏ من المجموعة المكونة من شظية ‎«Fab fragment‏
    ‏20 شظية ‎(Fv fragment‏ وشظية ‎Fv‏ أحادية السلسلة ‎(scFv) single—chain Fv fragment‏ . 4- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 1؛ حيث يكون العامل الأول عبارة عن ‎Fab‏ مضاد ل 3 ويكون العامل ‎SUI‏ عبارة عن ‎Fab‏ مضاد ل ‎.CD28‏
    ‏5 15- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 9( حيث يتم اختيار الجزيء الرابط ل ‎CD3‏ البروتيني بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد من المجموعة التي تتألف من أبتامير ‎aptamer‏ ميوتين
    ‎mutein‏ قائم على عديد ببتيد ‎polypeptide‏ من ‎ile‏ الليبوكالين ‎lipocalin family‏ ؛ جسم سكري ‎glubody‏ ؛ بروتين قائم على سلسلة أنكيرين 80167010 متجاورة؛ بروتين قائم على السلسلة البلورية ‎crystalline scaffold‏ المتجاورة؛ أدنيكتين ‎adnectin‏ ؛ وأفيمر ‎avimer‏ . 16- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 2 حيث تشتمل مجموعة الخلايا اللمفاوية ‎lymphocytes‏ على مجموعة خلايا 8 ويكون الجزئي المستقبل عبارة عن 0040 أو 00137 و/أو يشتمل العامل الأول على كاشف ربط ‎CD40 Lu), binding reagent‏ أو ‎.CD137‏ ‏7- الطريقة ‎Ug‏ لعنصر الحماية رقم 16( حيث يكون العامل الأول ‎Ble‏ عن جسم مضاد 0 801000 ل ‎«CD40‏ شظية جسم مضاد ثنائي التكافؤ ‎divalent antibody fragment‏ من جسم مضاد ‎antibody‏ ل ‎«CD40‏ شظية جسم مضاد أحادي التكافٌ ‎monovalent antibody‏ 71 من جسم مضاد ‎antibody‏ ل ‎«CD40‏ جزيء رابط ل ‎CD40‏ بروتيني بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد؛ أو جسم مضاد ‎antibody‏ ل ‎«CD137‏ شظية جسم مضاد ثنائي التكافوؤ ‎divalent antibody fragment‏ من جسم مضاد ‎antibody‏ ل ‎«CD137‏ شظية جسم 5 مضاد أحادي التكافؤؤ ‎monovalent antibody fragment‏ من جسم مضاد ‎antibody‏ ل ‎«CD137‏ جزيء رابط ل 010137 بروتيني بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد؛ أو ‎CD40‏ ‏المركب الترابطي (000154). 8- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 17( حيث تكون شظية الجسم المضاد ثنائي التكافؤ ‎divalent antibody fragment 0‏ عبارة عن شظية ‎(F(ab')2 fragment‏ أو شظية ‎Fv‏ أحادية السلسلة ‎single—chain Fv fragment‏ ثنائية التكاف ‎«divalent‏ و/أو حيث يتم انتقاء شظية الجسم المضاد ‎antibody fragment‏ أحادي التكافؤ ‎monovalent‏ من المجموعة التي تتألف من شظية ‎Fab fragment‏ وشظية ‎Fv fragment‏ وشظية ‎Fv‏ أحادية التسلسل ‎single-chain‏
    ‎.(scFv) Fv fragment‏ ‎25
    — 6 9 — 9- الطريقة ‎lady‏ لعنصر الحماية رقم 17( حيث يتم اختيار الجزيء الرابط ل ‎CD40‏ البروتيني أو الجزيء الرابط ل 00137 ‎sg dl‏ بخصائص ربط شبيهة بالجسم المضاد من المجموعة التي تتألف من أبتامير ‎aptamer‏ ميوتين ‎mutein‏ قائم على عديد ببتيد ‎polypeptide‏ من عائلة الليبوكالين ‎lipocalin family‏ ¢ جسم سكري ‎glubody‏ ؛ بروتين قائم على سلسلة أنكيرين ‎ankyrin 5‏ المتجاورة؛ بروتين 238 على السلسلة البلورية ‎crystalline scaffold‏ المتجاورة؛ أدنيكتين ‎adnectin‏ ؛ وأفيمر ‎avimer‏ . 0- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 16( حيث يكون الجزيء الثانوي على خلية 8 عبارة عن
    ‎.CD40‏ 10 1- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 20 حيث يكون العامل ‎AE‏ عبارة عن المركب الترابطي ‎CD40 (CD154)‏ أو ‎.CD137‏ ‏2- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 1؛ حيث يكون موضعا الربط الأول والثاني من كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ متطابقين. 3- الطريقة ‎Uh‏ لعنصر الحماية رقم 1 حيث ترتبط الوحدات الفرعية الفردية للأوليجومر ‎oligomerf‏ و البوليمر ‎polymer‏ تشابكيا بواسطة عديد سكريد ‎polysaccharide‏ . 0 24- الطريقة ‎Ug‏ لعنصر الحماية رقم 1 حيث ترتبط الوحدات الفرعية الفردية للأوليجومر 0100001 و البوليمر ‎polymer‏ تشابكيا من خلال رابط ثنائى الوظيفة ‎bifunctional linker‏ . 5- الطريقة ‎Gig‏ لعنصر الحماية 1 حيث: (أ) يشتمل شريكا الارتباط ستريبتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ المذكورين الأول و/ أو 5 الثاني بشكل مستقل عن بعضهما البعض على بيوتين ‎biotin‏ ويشتمل كاشف تعدد الوحدات
    ‎multimerization reagent‏ المذكور على ميوتين استريبتيفيدين ‎streptavidin mutein‏ أو ميوتين أفيدين ‎avidin mutein‏ يرتبط بشكل قابل للعكس بالبيوتين ‎biotin‏ ¢ (ب) يشتمل شريكا الارتباط ستريبتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ المذكوران الأول و/ أو الثاني بشكل مستقل عن بعضهما البعض على نظير بيوتين ‎biotin‏ يرتبط بشكل قابل للعكس باستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ ويشتمل كاشف تعدد الوحدات
    ¢ avidin ‏؛ أو أفيدين‎ streptavidin ‏المذكور على استريبتيفيدين‎ multimerization reagent ‏يرتبط بشكل قابل للعكس بنظير البيوتين‎ cstreptavidin mutein ‏أو ميوتين استريبتيفيدين‎ ‏رتبط بشكل قابل للعكس بنظير بيوتين‎ avidin mutein ‏المذكور» أو ميوتين أفيدين‎ biotin ‏المذكور» أو‎ 00
    0 (ج) ‎das‏ شريكا ستريبتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الارتباط المذكوران الأول و/ أو الثاني بشكل مستقل عن بعضهما البعض على ببتيد ‎peptide‏ رابط لاستريبتيفيدين ‎gf streptavidin‏ أفيدين ‎avidin‏ ويشتمل كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ المذكور على استريبتيفيدين ‎streptavidin‏ ¢ أو أفيدين ‎avidin‏ ؛ أو ميوتين استريبتيفيدين ‎streptavidin mutein‏ ؛ يرتبط بشكل قابل للعكس مع ببتيد ‎peptide‏ ريط استريبتيفيدين
    ‎streptavidin 5‏ أو أفيدين ‎avidin‏ ¢ أو ميوتين أفيدين ‎avidin mutein‏ بشكل قابل للعكس بالببتيد ‎peptide‏ الرابط لاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ المذكور. 6- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization‏ ‎reagent‏ على أوليجومر أو بوليمر ‎polymer‏ ستريبتيفيدين أفيدين ‎streptavidin avidin‏
    ‏20 ‏7- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1؛ حيث يكون شريك الارتباط ستبرتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكور و/أو شربك الارتباط ‎streptavidin coast yin‏ أو أفيدين 0 الثاني المذكور على بيبتيد رابط لاستريبتيفيدن ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ . 8- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل كل من شريك الارتباط ستريتأفيدين
    ‎streptavidin 25‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكور وشربك الارتباط استريتأفيدين ‎streptavidin‏ ‏أو أفيدين ‎avidin‏ الثاني المذكور على ببتيد رابط لاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ - أفيدين
    07 وشتمل كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ المذكور على أوليجومر ‎oligomer‏ أو بوليمر ‎polymer‏ مكون من ثلاثة أو أكثر من رياعيات الوحدات ذات الروابط المتشاعبة؛ استريبتيفيدين ميوتين ‎streptavidin mutein‏ التي ترتبط على التوالي مع ببتيد ‎da) peptide‏ الاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ المذكور.
    9- الطريقة ‎Gy‏ لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل شريك الارتباط ستربتأفيدين ‎sistreptavidin‏ ‏أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكور و/أو شربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الثاني المذكور بشكل مستقل على ببتيد رابط لاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ -110-501 ‎His—Pro-GIn-Phe-Glu-Lys‏ (المتوالية برقم الهوية: 1( أو ببتيد ربط استريبتيفيدين
    ‎GGSAWSHPQFEK2SAWSHPQFEK(GGGS) streptavidin 0‏ (المتوالية برقم الهوية: 7( 0- الطريقة ‎By‏ لعنصر الحماية رقم 27 حيث يندمج ببتيد ربط الاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ ‏لشريك ‎Jal‏ ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول مع المطرافية الكريونية في
    ‏5 السلسلة الثقيلة ‎C-terminus of the heavy chain‏ في العامل الأول؛ و/ أو ببتيد ‎peptide‏ ‏ربط الاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ لشربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين 0 الثاني مع المطرافية ‎dag Sl)‏ في السلسلة الثقيلة ‎C-terminus of the heavy‏
    ‎chain‏ في العامل الثاني.
    ‏0 311- الطريقة ‎Gy‏ لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization‏ ‎Je reagent‏ ميوتين استريبتيفيدين 100101810 ‎streptavidin‏ والذي يشتمل على المتوالية الحمضية الأمينية ‎Val44-Thrd5-Alad6-Arg47 amino acid‏ في مواضع التوالي من 4 إلى 47 لاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ من النوع البري؛ أو ميوتين استريبتيفيدين ‎streptavidin mutein‏ يشتمل على المتوالية الحمضية الأمينية ‎lled44-Gly45- amino acid‏
    ‎Alad6-Argd7 5‏ في مواضع التوالي من 44 إلى 47 من استريبتيفيدين ‎streptavidin‏ من النوع البري.
    2-الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 31( حيث تكون الوحدة البنائية المطرافية النيتروجينية في الحمض النووي ‎N-terminal amino acid‏ لميوتين استريبتيفيدين ‎streptavidin mutein‏ في منطقة الأحماض الأمينية ‎amino acids‏ من 10 إلى 16 للمتوالية الحمضية الأمينية ‎amino‏ ‎acid sequence 5‏ لاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ من النوع البري؛ وتكون الوحدة البنائية
    المطرافية الكريونية في الحمض النووي ‎(ised C-terminal amino acid‏ استريبتيفيدين ‎streptavidin mutein‏ في منطقة للأحماض الأمينية ‎region of amino acids‏ من 133 إلى 142 من المتوالية الحمضية الأمينية ‎amino acid sequence‏ لاستريبتيفيدين 07 من النوع البري.
    10 3- الطريقة ‎ay‏ لعنصر الحماية رقم 28؛ ‎Cua‏ يشتمل الاستريبتيفيدين ميوتين ‎streptavidin‏ ‎mutein‏ على المتوالية الحمضية الأمينية ‎Val44-Thr45- amino acid sequence‏ ‎Alad6-Arg47‏ في مواضع التوالي من 44 إلى 47 لاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ من النوع البري؛ أو ميوتين استريبتيفيدين ‎streptavidin mutein‏ الذي يشتمل على المتوالية الحمضية
    الأمينية ‎lled4-Gly45-Alad6-Arg47 amino acid sequence‏ في مواضع ‎sill‏ من 4 إلى 47 من استريبتيفيدين ‎streptavidin‏ من النوع البري. 4- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 33 حيث تكون الوحدة البنائية في المطرافية النيتروجينية في الحمض الأميني ‎N-terminal amino acid‏ للاستريبتيفيدين ميوتين ‎streptavidin‏
    ‎mutein 0‏ في منطقة الأحماض الأمينية ‎region of amino acids‏ 10- إلى 16 من النوع البري من متوالية الاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ » وتكون الوحدة البنائية في المطرافية الكربونية في الحمض الأميني للاستريبتيفيدين ميوتين ‎streptavidin mutein‏ في منطقة الأحماض الأمينية ‎amino acids‏ من 133- إلى 142 من النوع البري من متوالية الاستريبتيفيدين 0 في متوالية الحمض الأميني ‎.amino acid‏
    ‎25
    5- الطريقة ‎Gig‏ لعنصر الحماية 1؛ حيث يكون شريكا الارتباط استربتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول والثانى مختلفين. 6- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1؛ حيث يكون شربكا الارتباط ستربتأفيدين 51060187010 أو أفيدين ‎avidin‏ الأول والثانى متطابقين.
    7- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1؛ حيث تشتمل كذلك على قطع الارتباط بين ‎eld‏ الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكور وموقع الارتباط الأول المذكور الخاص بكاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ المذكورء و/أو قطع الارتباط بين
    0 شربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الثاني المذكور للعامل الثانى وموقع الارتباط الثاني المذكور من كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ المذكور. 38- الطريقة ‎FE‏ لعنصر الحماية رقم 37( حيث يسبب القطع المذكور إنهاء تحفيز الخلايا للإشارة الأولية و/أو الإشارة التكميلية للخلايا المفاوية ‎lymphocyte‏
    9- الطريقة وفقا لعنصر الحماية 28؛ ‎lly‏ تشتمل أيضا على قطع الارتباط بين شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكورء للكاشف الأول وموقع الارتباط الأول المذكور في كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ المذكور» و/ أو قطع الارتباط بين شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الثاني المذكور؛
    0 - للكاشف الثاني وموقع الارتباط الثاني المذكور في كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization‏ ‏71 المذكور. 0- الطريقة ‎Gg‏ لعنصر الحماية 1 حيث يكون ثابت التفكك ‎(Kd)‏ للربط القابل للعكس بين شربك الارتباط ستربتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكور وموقع الارتباط
    5 الأول المذكور و/أو ‎Kd‏ للريط القابل للعكس بين شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو
    أفيدين ‎avidin‏ الثاني المذكور وموقع الارتباط الثاني المذكور في نطاق من 2-10 إلى 13-10 مولار. 1- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1؛ حيث يكون ثابت التفكك ‎(Kd)‏ للريط القابل للعكس بين
    شريك الارتباط الأول ستربتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ المذكور وموقع الارتباط الأول المذكور و/أو ‎Kd‏ للريط القابل للعكس بين شربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الثاني المذكور وموقع الارتباط الثاني المذكور في نطاق من 5-10 إلى 10-10 مولار.
    0 42- الطريقة ‎Uy‏ لعنصر الحماية 1 حيث يتم قطع الارتباط القابل للعكس المذكور بين شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكور وموقع الارتباط الأول المذكور لكاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ المذكور بتلامس مجموعة الخلايا اللمفاوية ‎lymphocytes‏ المذكورة مع شريك ارتباط ‎Jol‏ حر أو نظير شريك الارتباط ستربتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكور على قطع الارتباط بين شربك الارتباط
    5 مستربتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول وموقع الارتباط الأول و/أو حيث يتم قطع الارتباط القابل للعكس المذكور بين شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ ‏الثاني المذكور وموقع الارتباط الثاني المذكور لكاشف تعدد الوحدات ‎multimerization‏ ‏71 بواسطة تماس المجموعة المذكورة من الخلايا اللمفاوية ‎lymphocytes‏ مع شريك ارتباط ثانٍ حر أو نظير لشريك الارتباط الثاني المذكور قادر على قطع الارتباط بين شريك
    0 الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الثاني وموقع الارتباط الثاني.
    3- الطريقة ‎Gig‏ لعنصر الحماية رقم 42؛ حيث يكون شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الحر الأول و/ أو شربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ ‏أو أفيدين ‎avidin‏ الحر الثاني عبارة عن مركب غير ضار ‎LIAL‏ اللمفاوية ‎lymphocytes‏
    4- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1 ‎Cus‏ يتم قطع الارتباط بين شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكور وموقع الارتباط الأول المذكور و/أو الارتباط القابل للعكس بين شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الثاني وموقع الارتباط الثاني بواسطة تماس مجموعة الخلايا اللمفاوية ‎lymphocytes‏ 3< البيوتين ‎biotin‏ أو نظير البيوتين ‎biotin‏ ؛ وحيث:
    (أ) يشتمل شريكا الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ المذكوران الأول و/ أو الثاني بشكل مستقل عن بعضهما البعض على بيوتين ‎biotin‏ ويشتمل كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ المذكور على ميوتين استريبتيفيدين ‎istreptavidin mutein‏ ميوتين أفيدين 07101650 ‎avidin‏ يرتبط بشكل قابل للعكس بالبيوتين ‎biotin‏ ¢
    0 (ب) يشتمل شريكا الارتباط ستربتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ المذكوران الأول و/ أو الثاني بشكل مستقل عن بعضهما البعض على نظير بيوتين ‎biotin‏ يرتبط بشكل قابل للعكس باستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ ويشتمل كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ المذكور على استريبتيفيدين ‎streptavidin‏ ؛ أو أفيدين ‎avidin‏ ¢ أو ميوتين استرببتيفيدين ‎streptavidin mutein‏ يرتبط على التوالي بنظير البيوتين ‎biotin‏
    5 المذكورء أو ميوتين أفيدين ‎avidin mutein‏ يرتبط بشكل قابل للعكس بنظير البيوتين ‎biotin‏ ‏المذكور؛ أو (ج) يشتمل شريكا الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ المذكوران الأول و/ أو الثاني بشكل مستقل عن بعضهما البعض على ببتيد رابط لاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ وشتمل كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ المذكور على
    0 استريبتيفيدين ‎streptavidin‏ ؛ أو أفيدين ‎avidin‏ ؛ أو ميوتين استريبتيفيدين ‎streptavidin‏ ‎mutein‏ « يرتبط بشكل قابل للعكس بالببتيد ‎peptide‏ الرابط لاستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ أو أو ميوتين أفيدين ‎avidin mutein‏ يرتبط بشكل قابل للعكس بالببتيد ‎peptide‏ الرابط المذكور للإستريبتيفيدين ‎streptavidin‏ أو الأفيدين ‎avidin‏ .
    5 45- الطريقة ‎Gh‏ لعنصر الحماية 1 حيث يتم قطع الارتباط القابل للعكس بين شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكور وموقع الارتباط الأول المذكور و/
    أو ‎dal)‏ القابل للعكس بين شربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الثاني المذكور وموقع الارتباط الثاني المذكور بتلامس مجموعة الخلايا اللمفاوية ‎lymphocytes‏ مع البيوتين ‎biotin‏ أو نظير البيوتين ‎biotin‏ 46- الطريقة وفقا لعنصر الحماية 45؛ حيث يكون نظير البيوتين ‎biotin‏ هو ديس ثيو بيوتين
    ‎.desthiobiotin‏ ‏7- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1؛ حيث ينتج عن تماس العينة مع كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ ارتباط نوعي للخلايا التاثية بكاشف تعدد الوحدات
    ‎.multimerization reagent 0‏ 8- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 47( تشتمل كذلك على فصل الخلايا المرتبطة بكاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ عن الخلايا غير المرتبطة من مجموعة الخلايا. 9- الطريقة وفقًا لأي من عناصر الحماية من 1 إلى 24؛ حيث يتم تنفيذ تماس العينة مع عامل ‏5 تعدد الوحدات في مفاعل ‎bioreactor (gpa‏ مثل طبق استزراع ‎culture plate‏ » أو مفاعل حيوي ليفي مجوف ‎chollow—fiber bioreactor‏ أو مفاعل حيوي ذي عبوة بلاستيكية ‎plastic‏
    ‎.bag bioreactor‏ 0- الطريقة ‎Bg‏ لعنصر الحماية رقم 48 تشتمل كذلك على تماس ‎Wal‏ التائية ‎T cells‏ ‏0 المرتبطة بكاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ عبر العامل الأول والعامل الثاني مع )1( شريك ارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ أول حر أو نظير له قادر على قطع الارتباط بين شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول وموقع الارتباط الأول» و/أو شريك ارتباط ستربتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ ثانٍ حر أو نظير له قادر على قطع الارتباط بين شربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎SEY avidin 5‏ وموقع الارتباط الثاني؛
    حيث يتم قطع الارتباط القابل للعكس المذكور بين شربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول المذكور وموقع الارتباط الأول المذكور والارتباط القابل للعكس بين شربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الثاني المذكور وموقع الارتباط الثاني المذكور» وبالتالي يتم تحرير الخلايا ‎cells Lal‏ آ المرتبطة من كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent 5‏ و/أو من العامل الأول والعامل الثاني. 1- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 50؛ ‎Aly‏ تتضمن جمع ناتج فصل يحتوي على الخلايا التائية ‎T cells‏ التي تم تحريرهاء وكاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ « والعامل الأول و/أو العامل الثاني وشريك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ ‏0 الأول الحر أو نظير ‎cad‏ و/أو شربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ ‏الثاني الحر أو نظير له. 2- الطريقة وفقًا لعنصر الحماية رقم 51؛ تشتمل كذلك على ما يلي: تعريض ناتج الفصل إلى الاستشراب ‎chromatography‏ على ‎sh‏ ثابت ‎stationary phase‏ أول يشتمل على كاشف ألفة أول» حيث يشتمل كاشف الألفة الأول على موضع ربط قادر على الارتباط النوعي بشربك الارتباط ستريتأفيدين ‎streptavidin‏ أو أفيدين ‎avidin‏ الأول و/أو الثاني؛ وبالتالي يتم تثبيت العامل الأول والعامل الثاني وشربك الارتباط الأول ستريتأفيدين ‎of streptavidin‏ أفيدين ‎avidin‏ الحر أو نظير ‎cad‏ و/أو شريك الارتباط ستريتأفيدين ‎of streptavidin‏ أفيدين ‎avidin‏ الثاني ‎al‏ أو نظير له على الطور الثابت ‎stationary‏ ‎phase 20‏ الأول؛ واختياريا: تعريض ناتج الفصل إلى الاستشراب ‎chromatography‏ على ‎sh‏ ثابت ‎stationary phase‏ ثانٍ يشتمل على كاشف ‎dll‏ حيث يشتمل كاشف الألفة الثاني على شربك ارتباط قادر على الارتباط التوعي بموقع الارتباط الأول و/أو الثاني لكاشف تعدد الوحدات ‎multimerization‏ ‎reagent‏ ؛ وبالتالي يتم تثبيت كاشف تعدد الوحدات ‎multimerization reagent‏ على الطور 5 الثابت الثاني.
    3- الطريقة ‎Bg‏ لعنصر الحماية رقم 52؛ حيث يشتمل الطور الثابت ‎stationary phase‏ الأول و/أو الثاني على مصفوفة ترشيح جيل ‎gel filtration matrix‏ و/أ مصفوفة استشراب ألفة ‎affinity chromatography matrix‏ . 54-الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 47( حيث يتم إدخال مستقبلة الخلايا التائية ‎cells‏ 1 أو
    مستقبلة مستضد خيمرية ‎chimeric antigen receptor‏ فى الخلايا ‎cells dal‏ 1 بعد التحفيز ‎stimulation‏ أو أثناء التحفيز ‎stimulation‏ . 5- الطريقة ‎Gg‏ لعنصر الحماية رقم 54؛ حيث يتم تحفيز الخلايا التائية ‎cells‏ 1 باستخدام
    0 كاشف ثالث يرتبط بمستقبلة الخلايا التائية ‎cells‏ 1 التي تم إدخالها أو مستقبلة المستضد الخيمرية ‎chimeric antigen receptor‏ . 6 -الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1( حيث تكون مجموعة ‎LAY‏ اللمفاوية ‎lymphocytes‏ ‏عبارة عن مجموعة من الخلايا أحادية النواة للدم المحيطيى ‎peripheral blood‏
    ‎(PBMCs) mononucleated cells 5‏ أو مجموعة من الخلايا التائية ‎cells‏ 1 التي تم تنقيتها أو إثراؤها. 7-الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 1 حيث تكون مجموعة الخلايا اللمفاوية ‎lymphocytes‏ ‏عبارة عن مجموعة من الخلايا التائية 1 ‎Toeells‏ التي تم إثراؤها أو تنقيتها.
    Ty ‏لم‎ : { > 2 ‏ار ألا‎ ١ : Lop, OO o> 5 ‏اله سب‎ t Fe ST ‏دس‎
    ‎0. ) 5d » ‏لحت ب‎ I on ‏صر مي‎ TE N= : — | m—_ oo ‏يا‎ = we ‏ع‎ ‎LSS ‏ال حم‎ ٍ in, an aan OE > 0 CD FR TT AL Ne ITS 8 et 2 ea ٠١ ‏شكل‎
    ‎Pp‏ ب : 4 \ تر ¥ ا | ل ض رج يجيي يجيي = } - ا 3 ‎AV‏ | | :. ‎rv‏ ‏امع ‎ine 2 Je‏ شكل ‎١‏ اب
    : كم :؟ بم ببسم ”+ ا امس ‎f 1 Ta : 1‏ ‎J ~,‏ ‎ng‏ 84 ر ‎١‏ ‎i:‏ ب ‎Ta { by‏ 1 صا ‎P “ “ oc <‏ ]|إصتبحع 1( بذ" ‎I |‏ ل . صضحة نيح اط ‎ay‏ ان 1 لحي ‎NG *‏ شكل اج
    VA i - ‏لمسسسسسا‎ 8 : 3 ‏م‎ Hd ‏اا‎ ~ & ‏رع ا‎ 5 nes : Ls > SV : ~ ~ (se € Vey 2 A as Sh ‏سما‎
    ‎Ne. SZ = = ‏ص اليك ب‎ A ‏عد‎ hi | SY NA — 2% : I ~ ead 4 ‏إْ ل‎ 1 0 NS (wes — Sora 8 : ‏لآ‎ "0 د١‎ sa
    AS ! 5 5 ‏جه‎ ‎0 ‎7 4 ‏با‎ ’ * © oo 5 — ‏م‎ 7 Cy [3 ey ny ‏ربك‎ md A ‏اليا‎ og ( RN ‏الم بك ار نأ ان‎ J ry = ‏يم‎ ‎J ‏سس‎ AU ~~ C 3 ‏ةساس‎ — 0 ‏وكام‎ ‎by ‏شكل‎ v LUA i 7 [re ‏كن"‎ 4X y 1 ‏مسي‎ I ‏ا‎ ‏زان دما" __سما‎ A - ‏صصح‎ ‎ov oY 1 ‏محا‎ ‎BE 7 NY ‏شكل ؟ ب‎
    SE ‏ذه د‎ ‏ل‎ ‎AY To] yg ¥ [1 - ‏ب‎ ‎i ‏شكل‎ av) ¥ NA > 4” ‏مجح ححا‎ i 1 > Tr Tn ¥ “1 | . 4 7 ‏وب‎ : 0 ‏ات 1 م‎ Dw, 3 ‏ال‎ ‏جد إ‎ CJ bE 4 ‏سمس " ب = لس‎ av | "١١! A | 5 ' | ‏ب"‎ ee : A LD (Je oc _ ‏عي‎ ) A = TTT Av mY ER ‏شكل‎
    ل 1 قاضا و_ ادل ‎“NL‏ ‏ا سام سل ,م ‎Y‏ ‎SE SE LAY‏ ما ‎os FE‏ : بببيييممجمة ‎a, oY‏ > — و ‎TY‏ —— سام الكل حي ‎oo n &‏ 3 4 الا ‎i‏ ب ‎Co O-_ Ss‏ ]— 4 = ‎Ly‏ ٍ ؟
    £ . شكل ‎by‏ ‎EEN‏ ‏سا ‎SA‏ ‏سس ] مسح لما — سم لا . & ‎Ly A‏ ‎A‏ ل ‎nT‏ ‏اله لخصضة ‏ الإ مي ‎i I‏ : احج لح حا ‎wy ini‏ * ‎es NJ Y‏ | ليا ~~ ‎“I - N Ly‏ ‎NOT CT‏ / ادح نا = = ‎Ne‏ ‏0 لم ‎RC‏ ‏طبه ‏الا ,الم ال ان ‎ix { LU i‏ ب 2 ‎t‏ شكل ل
    A 5 Yo 4 iA hi 3 A I ‏ل ص | وس‎ iq A I ‏اسح‎ ‎ry ‏مستت ص‎ 1 — ‏ا[ اال‎ a= 0 ow ‏نا لأسب‎ ‏باتك لل[‎ Lek ‏برحل‎ ‎1 Se (GR ‏تلا نيبت‎ HE ‏م‎ — : Ae CN ? —— — eS ‏با ال‎ SE ‏لم ال سا‎ Py : j Sad > Frans % 3 ‏ا‎ 8 ‏ا‎ | | TV 8 Ne I Y ‏شكل‎
    0 3 19,4 | ْ $5 i i if 3 ‏حب‎ 2 17 fi Bd 8 !' 43 ‏ل "م‎ 3 1 { yl ‏,أ‎ ‎i 2 ' FSC [7 4 IH R hy | ii 3 7 4 ‏ال و‎ ‏ناما‎ | he ES ¢ y LJ BSC fave 3 ere 1 01000 2 | ‏ل‎ ‎5 J aN EE EAN FSC for R 44 ١ i BB Fo w ER 3 | \ ‏الخ‎ i 1 ‏ب‎ | / 1 2 ‏ل‎ ١ 4 1 1 3 ‏ل‎ ‏ما‎ NE FSC od a ‏شكل أ‎
    ًّ i a 7 4 ‏مط‎ ‏الال‎ TTY ‏بت‎ J UE ‏إْ ا‎ bos 0 3 Pod B 1 ‏ا إٍْ‎ 1 101 0 1 ٍْ ‏ل اا‎ ‏ا إٍْ‎ I 1 ‏“ا إٍْ‎ 1 ‏ا‎ : 0: 05 0500 N 1 4 SE SE Pood N 1 ًٍ ‏ا‎ ‎ِْ ‏ا‎ ‎| IN : AES \ \ i HE N 1 4 : i H By 3 NA 1 : TE EE 1 i NE 010 010 41 N 3 i i TE OE TE 01 ‏اما‎ i : ERE EE : ‏لا‎ NE \ 0 EE | TIE : N 8 N AL Ct ANN Jrr—— LT] ! ‏ض‎ | | | | || | 0003 Rapes es 1 “| ‏أل‎ ‎3 fo THI i PEERED i 1 EEE. ! / ‏ل‎ INE \ GUD2E Fab sete co oy 1 IEE TENT | ! :ٍ / 8 CA ‏إْ‎ | ْ 8 \ + UTD R wend op Sige ‏إٍْ‎ ERR 002028 Fab suse 5 ‏شكل + ب‎ x 3 1 0 4, © iS fit | = 8 * 3 . . J 0 v 0 8 > PD 2 i 3 i 'y pe Ma, 5 A, 80 Tbe 0 - 3 ‏ملا‎ 0 © 2 3 on N oo A 3 0 8 ‏ا‎ ‎١ : 0) ws LJ 3 ~ ‏يع‎ ‎38 3 + ‏لل لل ل ل لل‎ S— ‏ااا ا‎ \ le ‏ا‎ | : 0 = = ‏ا ا ا ا‎ ‏ال‎ re - LL 3 ___ LN hh oo ge Lo Ss FF LL LL a AN a ‏ااا‎ | =. A Na a . : NN : 2D Nie he g \ 3 Le - ‏ل ل"( ِ اكد‎ 1 ‏عا‎ 0 \ = {i ‏ا‎ ‎a Lf NE a NE aN vo ek 28 aaa FF © AA 0 NMR LL LL Tm aaa a
    3 =. og gh = LL LA a A mee oo SP ‏ا‎ A a ‏ا ال لسر‎ a ‏ا ا ااا ا ا ا‎ a . i A (= £4 nn = Yh 3] R 3 . nae NN bh. ‏ا ا ا م ل‎ a Nd WEN ND ‏اا‎ ‎Er aE Ee ‏اا لإ ا لإ‎ ‏اا‎
    0 ‏بره‎ 3 0 0 BS 2000 3 ‏ا‎ ‎0 3 § i '/ 2 X & 1 ; N Hy 0 88 NI 5 Foam By 0 Ta Te § % HE } : PRE | ‏اه ا امت‎ 2 1 3 ‏جا‎ w 0 8 5 0 = 0 8 ‏ب‎ 1 8 #8 BE 3 im od 5 4 2 0 Rac ‏آل‎ 8 boy EN I % 508 Jo 4 N 3 ‏ا‎ 0 8 ‏د‎ 3 ET ¥ 3 3 “a Nocy RX 3 2 TH RNS RE ‏م‎ N § Rtn i i x 3 oe we 3 eed N Fa Ne Ree § : 3 i 3 >>> RRO: wn 8 ‏مانا‎ #8 * 0 8 ّ Ng ‏ا‎ 1 0 i IN ‏اس ا حش‎ Ww 3 . \ i ‏ب مسا ااا‎ 0 i 8 4 0 ‏ا‎ THEN Ea, RE N TURNER ae REE Res t > 8 NN 3 5 Read Pg ‏جح مدن ان‎ ‏ا ل ل ال حجار‎ rey SRNR A A Si SR Sa ph a a > oon 8 ‏و تير‎ Ta Teo go Bae es fo] pet me ~m— +mAb (OKT3) =, AY ‏ان‎ 7-5 1 + : ‏مسال‎ ROLLS FAD ‏الوحدات‎ das ‏الات‎ ككفلا‎ seb Rah ‏معدد وحدات‎ 0 ‏رحدات 10 بق الحفحك‎ 3 ‏تك‎ +PBS : ‏اب‎ 4 to ‏شكا‎ ‎Saf
    ا زبخ او 3 ‎3d‏ 2 8 * 1 3 * تسيا سس سوسس و 4 ‎Fo Yous : 1‏ ‎HI ER |‏ 1 امه ‎cd 3 Foe ee Mey‏ ‎ST ne i a EL SE‏ ا 3 ‎i‏ ع ا ا تم ‎EL RR 8 i SAE Eg‏ ‎SONNE EEE RES‏ 8 4 0 ‎i 3 8 RRR: 2 Snails 8‏ ا 1 ‎RR :‏ ا 8 ا ان ‎A 3 3 ws‏ ا لالش ل 0 = ‎i 3 § 3 i Ba 03 Fat‏ شط مسد عدت ‎Fab‏ 203 ا ا ا ل | ‎seed‏ © ‎Hig es Ade‏ 2 4*«ءة ل ‎he) x Kea ps‏ ‎Po 1 sin‏ = ‎Bia TI‏ 3 3 ‎ARE‏ ربتعت # 3 3 لس ‎I sw‏ ‎Te oa oo Se‏ الا لاك ا ‎EERE RRC in‏ ‎Yow Ten 0 0 H Li A ae Mn ae‏ مار ‎Noa xd‏ ‎New‏ و ‎TP vg 8 ’ N Fx‏ ‎I‏ 3 3 3 ‎ad‏ الت 3 3 3 1 لبمس [ت] & ‎HE‏ ‎“x‏ 3 ها ؟ ‎IE gy‏ 4+ 3 ‎Ra] Fok 3 at‏ 3 ‎bess Ry‏ اا ‎A 8 Fd‏ ‎i i $f & Ea SE |‏ 1 ‎EXE FE - Foe : 1 8 0‏ ا م ّ + ‎PARE‏ ‎i 3 i Tenure SE +‏ 3 ‎nd‏ اا ا : ‎STEN I‏ نا تا 0 1 3 4 ‎RRR : BRA ag Ny‏ [ 2 ال ‎BN 8 nn‏ ا ‎fe 3 2 TN FOR‏ ‎C3 F X b laden‏ . 0 ل ل ا أ ا ا ‎oF N i NE‏ جعيد الح 8 ‎SD Eh NR : 44 Rad‏ 4 ¥ 3 3 1 = ‎x & Bo) SUE Ry 5 8‏ اجا ‎pay‏ ‎ca‏ ¥ ل 0 ‎J‏ الل 0 : 3 3 : عند ‎٠‏ اعم 0 + مين بل : الام حك 10 ؟ ‎NE‏ 8 - 3 : ا ; : 8 3 ‎He‏ ‎pss iad y F 5 :‏ & 8 0 3 ‎HE #3 I‏ ‎IRATE {df‏ 9 ب" دحج د جحت دج حج دجت جد حو د جد حج لح دح جحو دج << جح ‎aa‏ جع ‎LH‏ ‏اليحود دح دج ح دا دود حك دود وحن ديدي ديت ججح ٍ + ‎Yas‏ لمر ‎Wey CALI A os Ses‏ ¥ : الاك : 0 رين ‎ie‏ 3 ‎a‏ 3 3 ‎kK Ey‏ ‎EY 8‏ ,3 ل ا لح ‎Fi‏ § : ا 7 لمي ‎SE I‏ ٍ 0 0 ال« ‎by H ¥ Fon Ll 8 : Ie‏ ‎TR‏ ا لق ا ا ا ا 4 0 ‎ne nl 3 8‏ 8 5 ; 2 ا - . ا 1 . ا ري ‎DA‏ ا ؟ ~ ‎N I 000% Fahey‏ ا ار اكت تا 2 0 معدم ونا ‎LLG an‏ 1 الل ‎Se i ¥ Rt aa‏ د #8 8 ‎Ea 3 et a‏ 7 ‎kan RRR RRR i 3 H Pa.‏ ¥ £ يم ‎yd RACER‏ :ال ‎By Ls‏ 0 4 < سابل ‎HR‏ ا ‎Sp‏ ! ‎EY i‏ © المتجه تت ¥ 0 ‎EE‏ 3 ‎RARER a ETERS ) +‏ —— مم ‎is - ِ x‏ جب ‎١ fa T‏ 8 عيبا ‎Tas Fos in EEE‏ وب لبر ‎Fx re‏ فج ب ‎uf‏ > الزمن ‎A‏ ‎wo Ka‏
    Faby Sty ‏سدم‎ Fall ding ime POR ‏رحدات‎ 20m ‏ريات تاك‎ avons vn iF ‏ب‎ Fs wT ie » 2 ade > ‏ار‎ 1 ‏لي‎ 3 ٍ TPE Fab airs nine Fr 3 ‏سس‎ : I ] ‏سو و ة‎ x ‏؟‎ 0 3 bd Co he 3 3 H A b3 as : ‏كم | ل قة | ل‎ 3 EonEe bg Vosieas { + i i ‏اللخ‎ 1 7 : Tass fF ‏ا : ب"‎ : oan adn ][ ‏لني‎ §ONIN H ‏لمحا 0 المح‎ |] : | : : 3 i : BONER 3 Ye HN LL RE HE: NE : tod : HE : : ‏الح‎ H SHER ‏ا ال ألم ا‎ 1 PA } PONY ; =) fan HO HC Rnd Po i : ‏الاق‎ H Fell ‏د‎ EC ‏لخ‎ RE od ’ ER rar EO Raged : fey 3 3 i £5. 8 $3 Se § J ee Hd gag 3 EE H 2 Na Poo UNE PoE POS H ‏لات‎ SO RG {OBR PONE EAE H 3 FRR EE Eigse SEL RR SER ; £3 0 ‏ل‎ a bag + ‏موف‎ SR 2S Rein i ‏و ةن‎ ERA: ASS FET ree Fine repped ‏1ه‎ 3 BETTY ‏ا‎ et ‏ادال‎ ‏لاط‎ BITC ‏تباط‎ BIEL ‏قوو ا‎ Fob ‏أحقاء علد رحدات‎ LE ‏اا ا الم ل ا ا هس‎ ‏الات اق‎ x ١ ET EE pas SL § bee 2 BE Boe EL rrr ‏ا‎ EER 3 da Ea 1028 o> EH Lo ol dal dag ‏مسقا سد رحيت طق‎ mak Fak 0 ‏ا تي‎ 473 A ‏ل‎ bd 30 ‏وحدات‎ FON Be! rid ‏جومموا-© اا المقارنة السانية‎ TAD It ae ‏بحو‎ ‎N ' 8 1 ‏ا 50 ا ا سس‎ 77 ry ‏دح‎ RRR RRR RRR ARRAS ARAN RRR, % 81 va 3 > 1 3 ‏ا« _ت سا سس‎ 4 ‏ل | #4 ا‎ tL ‏ا‎ NE UIE: SL SN E 3 H ‏ل‎ 3 0 Te i 2 2 i i \ 8 : : 3 {id 3 ‏؟:‎ 3 { N ‏م ب"‎ { ‏ال ص‎ 3 § 5 8 8 CER HB i 2 1 Fg 3 (3 N H BONY H 3 ENE ‏لا‎ RE BE ng RRR RR 3 0 i Reo ran Poa i i A Pda ‏إٍْ‎ ‏ل ااه‎ H SRR: N ER 0 ‏الا‎ i ‏قالخ‎ | © i ir 3 i 0 ‏ا‎ ‎8 #1 ORE ‏ماد‎ 1 PIs ! 82 i ! t ‏سد ؟‎ Same ‏ال ل اراح لجا ب الوا ايت وي حا‎ FLE —aF450 Fons ¥ Se
    Fy . a Co * 7 Lael} ‏عش“‎ ‎4 101 0 8 3 3 0:0: 0: |: FR i i BEER 1d $ H 3 SESE SE ‏م‎ ‏ب غ2‎ In y ¥ 8 ky ‏:د‎ on 8 ‏ير امقر‎ 8 H 0 1:11 8# ‏بي الجر‎ N 1 i 1 EEE Vo 1 8 ‏ا‎ ‎N by 8 1 0: 1: 8 BN by 3 ‏؟‎ : 0 0: 11 8 3 3 0 SHEE 8 N H ‏؟‎ 1000 H N H N pi NR § i 3 ‏؟‎ SEE #5 8 N EE i ‏مات‎ SEE Si N SERRE 3 Protoror 8 3 1 RE 3 RI + pay o ‏تيا‎ ‎N ‎N EE i 3 0101071 07 ‏سن0ن0 ْم‎ 0 SEE SE Re 1:01:01 8# i 1 i SERENE 1 1 1 11007 3 § H 0 0:0: 1 1: ‏م‎ ‏عت اح‎ i HN 8 : RE SEER ok ‏وات‎ PRE i i H 1 10100 i
    ; a. I. oR Said } i 1 1 110101 8 i 0 3 NE EEE i hy 31 1: 0 SEE SE 8 08 ‏يعيب َب يبب يبب‎ N EE k. xy 1 N Poin he 1 N ERNE 1 ‏ب ال شت اوس ؟‎ C8 1 1 ‏د‎ Vi IS : a 3 : : A i LI : | 3 : i 8 i N BNE HH 3 8 3 3 N 1 WE : : Vie 3 3 0 \ he ‏ا‎ Ll 4 $1 { 43 1: : gd i § 1 i 8 ii a. i 8 - ‏اد‎ i H N ANE 8 RADE: SI Fy 1 ‏ال‎ 1 I$ 3 N 3 1 ‘ a 7 FI
    0.5% mia. Fi 31 ‏ام‎ ‎: i yd N EYL 4 4 § i : 13 § 0 0 ‏مه لاحب ال‎ © : | 1 ‏ال لط إن ال‎ 1 ‏امسا مسا سني‎ N 1 RELY: 1 3 oF 58 : 0 ‏مح مستا سل اا :ا‎ i po 3 hE WAL AACE 10 J Reba. Tess) > Viel ‏ا الس‎ : : N ‏ل‎ : Tn i N HE 3 Ni : 5 ‏لدت سس‎ N i iN EE NNR A i 8 3 N i 13 Salt Edel dart LETS AY i B H N MY 1 [ ‏و‎ 5 : i HY H N LE SRE i 8 SRP, ‏ا‎ i 1 1 i | BE BE OSTRE aii bo H 3 8 SE 00: : : ET fx i ! 4 i 1 | VE ‏طرف محر‎ 8.58 1 i A SE ١ SE ‏أل‎ i \ HE a x Hy N A 3 N ‏غم : لكي : ل‎ + H 3 0 ‏ا‎ ; Poe we Opt 3 3 N ERR 2H } LN ‏لكا‎ i Fi 0 ‏ال‎ ‎H NE 110:1: 7 1 N REE —— ‏لهجو اا ا‎ i N ; 1 AA . : \ LEE Pe N 810] HR 3 3 ve i i 0 0 A HL HE] ER H N i i 7: 07: HR 8 3 N 53 HE 8 HI H ki 3 N ER 2x 8 1 | i EL i 1 1 1 rE ] a H N 21 : 3411 : ‏8م‎ ‎i § 1 " 1 0 N HEIRS i 0 N AER AE IN 1 W, 0 ¥ ~ 9 8 : 0: 4 0 3 : \ ‏الم‎ ‎i Ne LER. ‏ا بسي‎ H N EAE i N ‏سد د‎ i 8 801011 1 ‏ا‎ EE 1 i HE Pd 78 1 1 ERE 1 + HY H HN 8: 00 HE i H N 140101 0: ‏لأا أل‎ 1 0 Sy ‏لخ 010 ؟‎ i 1 BREEN ‏او ا 1ل ةك‎ | ١ ‏لاا‎ 1 0: i 3 NEE EE TER ‏لال‎ 1 ١ | ie ‏ال‎ ‎wed ‏ا ب ا ا‎ ARE EE ‏ا‎ ‎| & SERENE om PRCA: SESE NE ARON SA Ss. > FEC (SN i N A & *, ul
    Xo + _ IE IE SR ee Tor ‏اج‎ 2% 8 . ; 3 Vara ov vg ay A ot ‏عر‎ aN ‏د‎ fu * *# ‏ض اد ا‎ ] So 4 ‏,أ‎ ١ 3 ‏ض‎ ١ 1 i’ SEC + ‏»م يي‎ 13 ٍ ‏طرف التحثي‎ ‏شكا مد‎
    ا اا ا ا ا ا ‎LE A aa ee‏ 00 ا ‎Sai‏ ا ‎Aw “i sn‏ 0 ا ‎ou 5 8 oe‏ ‎Ga ced CE‏ ا ‎hee:‏ ‏وال ا ا ا ا ا ره ا 0 ددر ‎ae Ad‏ ا = بيب
    LE ‏شكل‎
    على سبيل المكال تار ‎Baa‏ الخلوي المي تام ف الحا تا ارال ‎Bla = 3 5‏ بايا ‎Sheed‏ ‎i : | ; eset‏ الح له د ل ا زالة #راقاي ‎EN Spied‏ ‎Tad oT TEL‏ ‎rods So ARETE # EE I‏ © ا احا اااي 2 ‎as d 7 ١‏ ‎Sad fan a DA em ol‏ ‎CERNE‏ ا 4 5 :8 3 § ‎ol RE Na‏ القسائة ‎RN 8 1 3 k HE NE‏ ل ا ل . ا ‎Lh RE‏ 0 ا بلا عاة اليو ‎PERC‏ ‎ed R= : J.‏ خثير ذلك اق 0 لس » السس تا ا 3 ‎SEE‏ > ‎Sr Sa 0 Sree‏ اا 7 ‎Se]‏ ‎NE‏ ا ل ل ‎LF re =‏ . ‎ENN - Bs Nh‏ ‎ps: RNR‏ 0 ب 0 ‎pos: Tr‏ : ال : 2 ‎a‏ 7 5 ا ا > 5 ‎BR a TR by‏ مه نز ب ‎CF Po‏ 2 ا امس ا 5 ‎ed‏ ال حت ‎AA‏ ‏8 ا لل 8 _. ‎Ex‏ ‏ساف ‎ei‏ مموعر جوع 5 ‎aa RELA Boe‏ حد ‎Ager‏ مام فى ‎AT mn R R‏ ا بنطام عي 19318028 ‎a‏ ا ا ‎i i or wade Kee‏ 0 ‎Cool = 2 :‏ لاد ‎al Shall od i pial REE‏ ] 1 ل 8 حت اج إهالة اليرين ليا يلي ؛ لكك ‎ERE 0 ee‏ ا الما الع العم ب اميد 0 8 د ‎RE‏ وي ا ا 1 0 : يناف ‎whol‏ ومس لي 0 = ‎Ast AN aa‏ ‎ER‏ وحم ‎ge‏ العلا بن د ‎Be MOEA‏ ‎nN 2 OR FRR % Salk‏ 3 5 شك ا ب قراه انهاه ‎CATCH‏ مع لديل ‎LMR‏ المتجائمة ببح النظام املق تيديل 80 جحة وها من ‎JAR‏ التسديد في ملية ‎Be baie‏ ‎spac‏ كراشا 032/0025 متا ‎Ny tions Hie‏ امراك للجرزاتم ‎te‏ بشكل ‎Je‏ ليذه نظام ‎phd‏ لعدم الساجة لأولة ‎Go‏ ‏ني ‎Die‏ مقاطنية ,يسن تسج ‎silly Salt‏ في الضلية ‎BM‏ ‏إطالة ‎lated‏ بلي : إرقاب تفلك ‎Bt (Soul onl wh‏ طيخ ‎dee‏ النتجائن العمديد المتطيع العام 00370728 ‎Snel ely‏ = ‎a‏ ‏شكل اب
    * < A Wi _ ‏ا‎ 5 WA Eh Ea | 2 Fe Ne 8 ‏ا‎ ey 3 ‏ما كت فح أ أ سس‎ ‏ب ا‎ oh ‏مم الت 14 الح‎ ‏م الح ,| وميم حي ال‎ ‏ص ص2‎ 5 5 La ‏ا‎ Ne iy toed ‏مرا يمسم لسن‎ ae —€ 5 ‏جح‎ ‎et yh Ne NRE I] ‏ب‎ ‏تبح‎ | ort LE #8 ‏الم‎ ve po 2 pres Se ‏يا‎ ‏احم‎ en? Food 55 Co Ng wo} Ye ‏الم‎ ‎ًٌ ‎tus 7+ 1 1 ‏رسيا‎ : [ \ ‏سم‎ ‎Ne oy Ty pa eo ey ‏ينب‎ ‎£m Ls TAN ‏جم ابا ل سا‎ ‏لمحي الي 1 كيبي‎ Ho 3 > 5 4 Loy 9 ‏ا‎ Ee prey 8 ‏ا عا‎ ‏ارا ات‎ ( ae MC 5 5 = ep HES ‏ما ا‎ ‏الع لمجم مه تك‎ ‏سب ال‎ ْ = a =, oP of ‏حمر‎ ‎WEE ‏الات‎ TM a] rt J x, Mona ‏أن‎ ‎(= od RS ma A LE A EE ‏شك‎ ‏ا‎ Gos
    ‎ds 5‏ < ‎ry‏ 1 ب" تت ‎EI at Loo‏ ‎TN 3‏ تم . د ا ; 5 ا ب ‎Sy ay‏ 5 البسسسة للدي ‎boy pr Sy‏ ب ابه - الت اله © لجع الماع ان الل تيتا سن أ الب داج مح "28 ‎ey Th ed‏ 3 1 ال حيبي ال كي ةرسا ‎Ze‏ 2 ‎EE ae . : = Fo ad‏ م تب جح 3 ‎jail‏ ‏يي الم قح احا ال سي + تح 1 مر ض ام : ‎i‏ ‎Ty Sho Ty‏ ‎Db Cid‏ 1 ا احاح ا ‎ln Ea [Cp I‏ اا ل ‎TE em CT UT‏ الم ‎a‏ انا جا 5 ‎Dp‏ ‎NE omy 55‏ مخ الس اع ‎LF‏ ال وح احج مق ص ويا ‎be i‏ الها ‎fer inl rad‏ كي ‎Tey 3 Te‏ ‎end‏ ا * % ‎pod :‏ ]1 ‎I & rd‏ ‎NE‏ 0 ا ‎RE ST‏ شكا ‎٠١‏ ‎Tee‏
    He
    1 & : HERA om Eo ‏.م‎ ‏لحي ني‎ - a 7 Fa Ea g i Toy Toy LO bens SVS ‏إْ الخد الع‎ jee oes al ‏لم‎ ry Co fot ‏لعب‎ ed Cen TRE Bite ‏ا‎ ‏مح يج مي رط‎ RES J ee ‏لحي‎ ‎FREE quis ea ‏ا جر الل نا‎ 1 ‏اد ب“ م ني لش اي‎ fe Sy Nagel : = ANG, Fg hs ye pi 2 na y £0 oo : ‏إْ فر ا م نج لما‎ ‏إْ جح ايشم ا ارا‎ ‏إْ وال سمب الي‎ ay He ‏إ‎ ‏ف‎ ‎ira ‏إ مسي‎ ‏الب‎ 1 % ; E j 1 i § J ‏»م لسع‎ : Eo pel { 4 3 NE = fo ‏با‎ SE ST PE eo : oo SE ‏ار ل‎ ‏يض ؟‎ eli ‏تل مم 5 ات مس اضيا‎ ‏ب © لم اراي حب تب‎ ‏بأ أت سر ليه ا ا ام‎ ‏عشم ما لش‎ SR Ny ‏إ جب‎ ‏سنا‎ 5 LAE ST NS ol : ‏تحير‎ x Ln room Nin, end 3 o TY, ‏الي‎ Fond : Rea my : Med fy ‏إُ‎ ‏من الصا‎ '| ooo gen I : Raia A ‏اا‎ Ty i ot Td I ‏ين‎ J 1 ‏ا‎ 1 § 1 ! x, Lax a Fs rd OC ge ed ‏كل ا‎ = ‏شكا ؟‎
    ‏م ارلا‎ HR N : 8 ‏ا‎ pS { ‏ب‎ 3 Sa ‏ا‎ 2 4 texted ‏ع وفوا غير مسار الخو‎ 3 : 0 ‏حا ا‎ 3 Ee ‏غير‎ QUEST Be : $ 6 So a : 3 ‏ا‎ NEEL ‏ا ب الماع‎ 3 ‏الا ا د‎ SET We Dying ‏عر‎ ‎ww ] ‏اجا الو لاا الس ب ا 8 0 ا‎ EE . : 8 *ِ oe C04 ¥ ‏عا‎ + UDR CINE- Fab ES N ‏مر ييتامير على السلسيلة الرئيسية الفتيضية‎ 3 KS Sd * ‏الجد ا لانن‎ fi LEENA ga ‏ا‎ ‎yx ‏يي ص ب‎ SEH Tell + al DICH Fab Yoo sete Galley bdo ERS TY BO -® ] - ewe wT a : 8 ‏صق‎ x >: 5 ‏بن‎ ‎* oy © Nhe wh ARN ‏و لوق‎ ONS 2 ٍِ ‏بر نر يي‎ ORGS ‏عد‎ ‏ا ل‎ or nl . ‏ب"‎ ‏ع‎ BR TERE SR A C08 T ‏عاد‎ + Dyn ane 8 ‏ال الاي ل‎ a ‏نا لمك‎ 1 ٌٍِ FO a CBT 0 + ‏سا لاست ان‎ Fan 3 8 a Fe 8 5 AE STEIN SU NEA TON FR ‏بج جام‎ ‏ا م 7 % حم يال وله ا‎ i ssf Sse ‏علي‎ peg ‏مك‎ ‎@& > ‏وي‎ = 2 a ge ton ‏لد ذا‎ TRY ee i ‏ايام ين لا‎ i 3 8 ‏اكار اي‎ oe a COT Ub + ‏مهت اي‎ Fab ox Ww 2 ‏مم يعر * أ ات ال‎ ey ‏عدوت‎ ‏اط مضع + عد تمن ب ا‎ ‏الت‎ Ey ae ‏وو‎ ‎* By LI % a ‏ب‎ & IER ‏ا‎ = Fab oN ‏اب‎ tds edb A ‏امغر‎ ¥ £ 3 & EER iow Ee 0 J LS ‏ابا‎
    Eo “5 ‏ل‎ ‏قر عدر‎ 8 ‏وه‎ Be SORE 7 ‏عير‎ ‎1 & ‏الا ال يو ع ا اا‎ 0 3 tes ST a COST ‏عن‎ + Digna age 3 Say wl COT ‏تمستا + عاب‎ Fab >, Oy x ‏ا ب 5 نحت‎ wy ‏الا يه الاك‎ - > ‏ب‎ I= NER ERE ‏حاير على‎ & ¥B 08 an BE 7 ‏له‎ Ly ‏لز‎ ‏م‎ 1 i ; co SDE Tall + ‏ته‎ 015 Fab & ee ‏ب>‎ 1 3 a al sige Ee ‏تمد‎ hdass SE of NT nh ‏رجي‎ ‎Nr ON ‏الي‎ oo GREET WV ‏ا را‎ Towa ix LN Rs EE 0 ole ‏.م‎ ‎3 Sa i: ERD ‏وات لبمار‎ Glee ‏8غ‎ & a ١ ‏اد د 5 ا‎ ‏اتا ان‎ ‏ل‎ ‎8 ‎Ne we ‏قلا ألا ور‎ & ‏ايقن‎ ‏اا‎ ¥ £3 3 A “4 Faw Yo 5 ot A [| N Bde CORT i ‏م‎ > CDE T ‏عا‎ + Dyna ‏غرزات‎ ‎i 5 TREY ‏علي‎ +03 CD Fab o ‏مد يمير على السلسلة الرئيسية الخضمة‎ 0 i 0 qn CDE TEE © oD3CDN- Fab 3 ‏ال‎ ¥ TU te ihe ‏معدجات‎ ‎3 ES i RN aa ‏الاج‎ ‎3 i N an REET ee + alDReCDRe CD = | R : Fal ‏مرضي‎ Sey ‏مستذات‎ ‏اج لاا‎ i 3 ‏ل‎ ‎FIR > 1 8 ‏الا‎
    ‎3 . RY ath
    FO. peg EE A So 0 i 5 * Sea ‏الومن‎ ‎+ re x ‏شخل ب‎
    ‎i‏ ‎Te‏ ‏ب إْ ‎fy‏ 5:3 = ‎UG Tus‏ غير ‎x 3 v4 ov = Tall‏ ‎F 9 1‏ ا 8 8 2 ‎os Sad po‏ :"0 ]% 3“ عرزات ‎S| A ne] B 0104+ 1 wis + Dyna‏ 2 ال ‎OEY‏ للج ا ‎PART‏ با ل اس ا إْ هر ال ‎Fab‏ 30728 تان + خغاية ‎CDT‏ - ارا ل لسر ا إْ 2 = سعددات وحدات ‎Pr‏ “ ير & 0 5 3 ‎Sp b.
    AN & 5‏ 4 اللا ما © تب ‎a‏ سا مخ ب لجيما ليما ب :ْ ‎J : \‏ اي ‎A‏ 34 £ ¥ مف الزمن ‎a)‏ ‏اص ‎“od‏ ‎i " FATT DRL‏ : ساق ا علايا ] ‎CUB‏ غير ‎malt‏ © 4 | ا ‎ER 3 we - 3 FEC 8 3‏ ا رات قلا + علايا ‎ODE T‏ £8 & 5" / 0 3 ‎a] a‏ 5 ب جود ا ‎Yor ee a pW END‏ ابيا الح ‎Fab‏ 300028 انا + ‎pe COS Tie‏ 1 ا امي 4 2 متعد ‎CHD‏ وحدات ‎Po iS ’ tla peel‏ لل ب 3 “بي له 4 + 0 اا اسه رايا ‎CE)‏ ‏في ‎A‏ 3 4 0 صقر ‎got‏ ميم ‎i‏ ‎Yo be‏
    اح 83 ل حي ‎Ch Ng‏ ‎cn Gy 4 SEN‏ م #1 ‎gi {ed‏
    ا اي ال ا ‎shhh hh Sm hs CR‏ ‎III Tay‏ ل ل ال ل الل اتات ا ال ا
    : الل ا ا ا ‎Aas‏ ا ل اي الت يا و
    عير اموه ل ‎ea‏ ال ل ‎a as Se a Rate Sean tol‏ ال ل انر يا الا ا ‎Ses Re‏ رات لمتشا و اا ا ا ال الل ا ا اللا ا و ا
    RS SE ‏ا م‎ see eR RE SR a
    AISNE : ‏ا‎ ROR - A ‏ا ا لح ياج تج مح هن‎ ee owed nas ERERERRRAN ‏ا‎ GES RSRESEaE
    LEAN i ‏اا‎ FARR RN ns
    SEER ET A ‏اا‎ Re NIN nn SR ‏جه‎
    I I a BSR ERR ‏ال‎ a ‏ال ل‎ RAR A eT Re
    CEE MI tT SER TREE aimee Sines
    CRITE An I ‏الل‎ Re EE na ne Ree SIE SIT ‏الها اا‎ Ee ns CRI eT, ONE a Mn Chea ‏ال ل اا ا ا‎ Sena ‏ل ا ل ا‎ SR ‏الت الال‎ SPEEA Bs 0 ‏ا‎ a se ‏حت الل ل وي ال ا الم و سن‎ Si Sp A rs -
    اي ل ا م هر ا ال ل جه ا ا ا ا اي يات ا اي ال ا ‎nt Ci ad BE TE Sl RRR] Selanne‏
    SII ON i Nn AN, In I I Re
    Th ‏ل ا لح ل ل ات ال ا‎ RR RE CR RN RE a Rn
    SR ‏م ل ل ل اس ا امي يخي‎ I Tn ‏حل‎ HA ‏ات ا ا اا ااا تت ا‎ ‏ال ال ال‎ a ‏ا الت ا ا ا الت ا ا ا الست ا ا ا‎ 0 Telaaaialanand Shab RSieoaiaan SEENON ‏ال‎ I, i I SEES RRR BREE ‏ل‎
    ‎i -‏ م ا ا ‎TN NT‏ ال هي ا ا يت الله ا ا ا عد ‎WH,‏ يذ لجح 1 !يت تلم اي 0 ‎a‏ الت ا ل ‎a ER‏ 3 انب 3 1 د ‎ER A EERIE ERASE SE‏ 0 اتا ل ‎I a‏ ال ال ات ا ال ا ‎RR Aes I CN‏ ل ا ل جح م ‎Bs‏ ‎I TN i‏ ا ا الا ا ‎ERT‏ ا ‎FONT I GI‏ ‎CORRE Sanaa Ee Ba‏ ‎FE‏ ال 1 ‎LIE‏
    ١ ‏عالقا‎ ‎5 ‎Yow fix a Fa ‏ون‎ ‎5 : ‏ص‎ ‎% 6 Ed ‏ا‎ 2 5 - 2# ٍ ‏اد سخ‎ & ao Won ed pa + ‏د ب‎ & 33 ‏ل‎ TE p el ‏ين‎ ‎5 +" oe = ‏الي ا‎ Ea 5 ‏ب ا‎ N oo AEE FE | ara 2 1 ‏الا طلا‎ : ‏تعر‎ : : ha? Ee) vs A & fay oP Poy Is t id +5 LIT ‏ار‎ 0 : N ٍ & + : 5 ‏ا‎ X Ya + 8 ْ: ‏غير محفرة هد ص‎ : + ‏ا‎ + Dyna es 84 ‏ب"‎ 0 # i. ‏باتو اناد‎ 23- Fab ‏در دي‎ OF ‏يماي‎ el ‏معددات وحنات‎ 1 OF JE ‏ا‎ Terres, ‏ا‎ : ‏لقع سن اتاد 8 اللو ا ل إْ‎ Fab 1 A & Wat ‏سعد ذاك وحدات‎ 4 1 ‏ل«‎ ١ : ‏يدو‎ AA ‏ا اين‎ oF ‏ال ل‎ Tota NEE Ey. 2 ‏اح‎ Eda ‏ل‎ ‏مقر‎ : 3 per 2 ts he Sash) ‏الرض‎ ‏شكل اب‎ i % £. F t a Wo ‏م‎ ” : Fon ‏احاح امس‎ = 25 PERE B AHL : 3 5 H TEL 3 bs 5 3 be Cn 5 . 1 Ti : ‏مقو‎ : xX N ‏ا‎ Sa FI H VRE es 4 8 ‏غير مخز 8 0 ا‎ ‏ا ا‎ : EE Nd ْ: ‏ا‎ ‎vr i [ON : ‏ا اجا‎ ood EERIE FEE Na 3 a ‏اش‎ : . 0 OR ‏ا‎ ‏الححن حا ا ا ا ل ا‎ 8 ‏ا‎ : NNN % i 0 ‏ا‎ NN ‏اد ا ؟‎ SE ‏م3‎ PER RRR FE ‏ا الملا‎ 0 ‏ا‎ ; WEEE I i SHEER ; REA Ea Ree le Xo oT ‏اح ته‎ Sa ‏ل‎ 3 wed $8 0 ry WX ERali Risk Vit GIR. A oy a R 0 ‏نم 0 3 1 ل‎ i a Ta 3 Ha ‏ب + 4 ا‎ * ks Ye AE Na Ya LR J A EC LX Far wn ETT ae ELA TEI ‏بك‎ eR : ‏فق‎ ‎8 ps : by 7: be - 3 ARIE : . I 3 mo . ‏اا‎ SRE hs Lp eC ‏ا‎ OR EO ot ae ke RARE ‏م‎ poe ‏ا‎ . Eo : SEE NE : FR: SNS ‏ا‎ : ARAN Ren SAE RR ‏جم‎ ‎EL LB =. Dyna ais ¥ 1 ST fi 7 RRR RR FEN 1 ‏ا‎ ‎RRR ER ‏ل‎ EE ANT, ‏ال‎ ‎EN NE i Ra NEE vo EEE ETE Na 3 oo JEN RENN Eo Th SENG TEESE ; ‏أ‎ Nh ‏ا‎ : SRR ‏و سجر لوت‎ Se 8 0 ‏ا ا : ال ا‎ BOS Ea ft ERE ‏ال ا‎ Ee otk Ry (18 L051 EA. RESETS ‏متت اال‎ ٍ 3 . Ad : 1 ES i Shut iS d 5; BS FEY Yeo ‏اع‎ ha ve, Ta ‏ب غك الح الا‎ 0 BL ‏يي ب لللبللللالت ل ة”ى >ج< «#ا#7]7ا©””©ا)ا57ر(زن١ؤإا٠اسخ “دوا<“©<او‎ A Lr ‏يد يدل الل د 2 ل د‎ AL (ET ERE : Vy
    + . LE i 3 2 8 : ‏المت ا ال ا ا ا لج : الما ا ا تي ات ا اام‎ Na ‏لت لوا‎ a FEN Ne : : Ni N = ‏وات‎ abla Be INE Do EE \ os git 4 ‏ا‎ 8 5 RR Si ANT ‏ينم‎ ‎ok RN TEER 0 ‏العا‎ ‎pas: Si EERE eid WEEE ‏مان لاإ _إ_‎ ‏ل‎ : RE ENN ‏ف د لال‎ 0 : nt EERE NE ERE NS 3 FREER 9 : ‏ا‎ ‏اتا‎ © Ea : ‏الا‎ ‎: ‏لدعا با‎ REERREG ‏ليرد‎ A ‏ا‎ Raa VEY ol EEE TT ‏د‎ Se EC TE ‏ل‎ <5 ds ¥ x ¢ { 1 - ‏ل‎ Yr LES ‏د‎ RES ‏ع“ . ص‎ Xs ¥ 0 8 | = 4 Ty ‏شكا‎ ‏ل بجا‎ i 1 4 . ‏ا بها اله ال‎ ‏ؤ ض ا‎ 0 ssnncanee, % sosscsscascan ‏اس نا‎ : i = : 3 1 III ) | - | Nn RRR EER EERIE ERR | 3 ‏ججح‎ ‎| 1 (| | ‏ض‎ | : ; FRY Bn Ean or : ¥ ‏ل‎ ‎j | a ٍ : ٍ * : : - = 1 Let ee A Rox ١ ‏ْم‎ ْ: | i EN ; al aE i 8 ‏عن‎ SE H 4 ET Hoon NEE od |e i . ; 5 ‏ال : ا‎ E CEN H = EOS anda SNe I iow : ‏ةل : : ل‎ : 4 _ TR 1 CRUE - 1 ‏ا‎ 8 : ‏ا ال‎ ERLE RE 0 ‏الل الا‎ : : BERR: 5 : 0 ‏ا‎ B 3 yi RIA Pant ١ LW RE SAE BY How : ‏ل ا‎ H ‏تا : ان ا ل ا‎ 0 3 i Ty i 0 ‏ا‎ ‎4 FREER RR bs § Fini RES SR 8 ‏ال‎ PERI: Ra : po My FURR g TER 8 ‏ال‎ Sa i 1 Sg a ‏د‎ ِ i ERR ‏ا ل )0 0 الل اشح‎ {oi Best Perel LI S SR SRR : ‏ا‎ 5 SEE ChE SPR SOIR p IAT, ARR SL L : BPR Res ‏ل‎ 0 Ves ge Tn Ra be 25 SE Na RES 2 + 4 * i 1 } Te do | 1: ‏ا ا ا‎ eo IR SANE Ne ‏ال ا صق‎ fos ER 8 ‏ا ال‎ ad Ng 0 Be ‏م8‎ 1! $0 REE ‏ا‎ Na ERE a EEN Le oi ae ‏تمعن 2ل‎ NG hasan Be fsa CE 1 ‏الت ات‎ ES ‏ل يت + 0 الج ا ل‎ 3 RR.
    DUES 3 LET x 3 : ‏اتات‎ i 8 0 LEA 8 : ‏ل ل‎ 8. > ‏ا تنا 0 كييك‎ EEE ‏ال‎ Sa Rea Sak 1 7 3 Ba ] RR a 4 Aw ENE fa ‏د"‎ NE ‏ىن‎ HS oe ‏تس‎ i SS EE LN 3 L = ‏ال‎ TL 6 ‏اك‎ © FOR on SE 9 ١ + Ys Xe 3 A : CEE Tan Xs Yow Fo) ER ¥ ¥ Ck 4 ‏و‎ 4 £ : ‏ا‎ Xe 3 \ a ‏ان‎ ‎YA BS
    4 1 Ed 3 Teed NEE TER 1 1 $e 1 § of ok i I ‏بالاو‎ 8: on LER 4 ‏ا‎ Sb I H or fees 3 = N SF 1 a x \ 5 5 og oo % i 5 SF LE ‏الحا‎ pr w ‏وبع 3 حن 0 1 ود‎ ‏بن‎ $y wad > i p ] SF EEE 58 4 ‏ام‎ ‎8 1 X22 & 5 5 § xed Se a. N ‏ا‎ i 87 * ‏نْ‎ A i & ‏ب ب‎ Rom Taw AF 8 0 ‏م‎ + 5 : pe Rs x 5 = ars VE i SF wo Fad & SE mi] stressing] + oD 1 ‏د اق اام‎ ; ne 1 Lae FET AA ‏ا لاوا‎ ae ‏ب ب‎ J Ue ei ‏م‎ mmr oe 737577 ‏ا + امي‎ 7 ‏الا ا ا ا ااا‎ i os = ‏ا‎ . or == ; 3 BE RS A ? 5 ‏اا 6-6 مار‎ pete ‏مت 58 # عبش‎ ِ Te iE fan pe ‏ارس ويد‎ ‏ام‎ IC AY, ‏مج‎ R Bo LF kA 9 W 4 + ‏وو لاط‎ i " x LE €, we SE F ‏ب‎ ‎> H pa 8 ‏الل‎ i 5 J dvd ‏م‎ £5 » BR . ‏ص‎ ‎EA 0 ‏ا‎ J oF H 3S EK pe i i iS 0 01 ‏ا‎ i i 0 +4 ٍ # ks + LENE SCY 4 3 ‏ب‎ pre 1 ‏ل‎ 4 5 5 bi 3 0 ‏ا‎ 3 0 : CH ‏غ مكار هد‎
    1 . ~ : a : - aim 3 1 ¥52 A a (IRE ER BOSE GE Ser sed ‏أ‎ Fan x ‏وت الي ا ا‎ La [hen den ECE Wt a SRR G ‏ال‎ ‎PB: k Cara Cae 3 ‏ب‎ PEI 3 ia = 3 EE ‏ل ا ا متت ج ا‎ dante H < FE Ry ‏حا الا‎ Cn : ‏ب‎ ‎Ho 0 : Ss Ea ‏بي‎ of sed + BTR ‏اليل ل‎ ee REARS ‏اد اا د ال‎ gy Tau ll 0 0 ee Ry 3 ‏الا اللي يل‎ F cp A ‏مو‎ << an i SF i ‏الت اا ل ا‎ a : 8 ‏ل وس 1 يب ل‎ wb vn EER ‏بد‎ . ; ‏صم بجتسي سس وار‎ Fina CERRY CREE Sp x - ‏مغر‎ + ve 5# ‏مر‎ 2 te ‏ب‎ ‏الزن رويب الرمن تي‎ ‏ا ام‎ : ‏ا‎ BS IN is
    ‏اا ست‎ 3 3 Jeb ‏عن‎ 0 CREE) : ‏ل من مغر‎ Ng hs tiie ‏وحذات‎ Silane SL Sass A 4 oe & 8 ‏الوق ل‎ co % i i ‏ب‎
    اتا ا اي ل الحا سا اللا ‎BR‏ الح لجح تح ا ا ص
    Ena FE fF HII Law HEE SVE TeET xe bed ; IE A EE I SE SR ‏ال‎ EE NS SOR :
    IR ‏ل ما و 1 تاي ا‎ EE Ea i
    ‎i Lg ;‏ حا إٍْ 0 ْ ا قدا إ
    ‎ER SE HERE = ar Vox fa \ 5 Pe DEER NS i
    ‎0 ‏اد‎ ay ٠| RE = + ‏ا‎
    ‎] ‏الل اا 5ن ل‎ Fad SR NN eed
    ‎Pi SNE i INGER i SANE Py BEARER :
    ‎NE i‏ الا * ‎SENN : : ¥ LES Ni NR 1 3 LI EDEN rR H‏ ا * [ يد
    ‏: ا ل الح : : ا ‎pa TENN p‏ 3
    ‎RC H A CRE 1 RRR ‏ل‎ i AN i
    ‎oo‏ ا ا ‎TY cde, Be Lh Re avis‏ عن ينا
    ‎STARA 2a TREE nd FET EE BARRE TT‏ يق
    ‏ا واد صق ‎JERR OE PO BE LACH SE NE LPN‏ تست بخ ‎Se Ha nn‏ يبا ابا ا تا روا ‎rh De‏ ميا ‎Too Be‏ ديا رتح تك ان
    ‏شا ا 2 بي يٍ
    ‏ومع وتو‎ ‏ا ا‎ ‏ا‎ ‏ا‎ ‏اا‎ ‏اا‎ ‏اا‎ ‏ا‎ so . ‏غير محفرة‎ ‏م“ ااا‎ ‏ااا‎ ‏اا‎ ‏لا‎ 8 ba IN - RR LL a VRE CL : a . a Sa WERE 4 ‏ل‎ ‏اله ا‎ ‏ا اا‎ ‏ا‎ A \ EE DRE 8 XN Le W 8 | | ‏د“‎ ‎a NE | 0 ‏ال ا ا‎ a SR ‏واوا الال لضي‎ 3 8 : ‏ل ا‎ N Ss TH 08 ‏اال ل اي‎ Ni ee ON a ‏بها 70 ا لها‎ TN ae La aN ‏د ا ا‎ ‏با‎ = ca ‏ا‎ ‎La a oa ‏د جدذدات أ تيتا غير لذ ل ا ل‎ ‏ااال اس ااا‎ «٠ Sg Poa Na SNe LT Na Sana RR Sa naa ERNE SEE ‏الل‎ : 2 0 ‏الا‎ a Lg ‏السائل‎ ame a ‏ا ا‎ ‏ا اا‎ ٠ 0 ‏مار‎ A ‏مي‎ ‎WN ‏ا‎ — «>
    =... ‏ا ا‎ ‏ا د اع اد‎ \ LY
    Lo . a mss LL \ ahh ‏هااا‎ Goa - A eet ‏متعدد وحذات‎ ; Na ; RZ _ NE 3 ‏ا‎ Ny . . Ag fa Ne N ‏تع أ كر ل ا‎
    ‏ا . د‎ NN . ‏نوعي ل‎ a Se ® ih LL NY BR Nh 3 0 0 AREY
    -. ١5١ ‏شكا‎ ‎tod
    ‏ااه ا‎ ‏للستت‎ ... 3 0 teed - | =
    3. INE I 3 5 ‏ليرا‎ D0 0 ‏:ا‎ IRIEL ‏ا‎ § ] 1 OF 11 pe 1 8 § 3 ‏ل‎ ‎’ TOE JUNE DUI PO I 10isls 1818s ‏دل ولك‎ #8 ‏ا‎ ‎1 ‏[ن 5ل‎ 58 8 i = ‏ب‎ 2 = = 4 pe mt PY 2G AE 8 GY Roan 31+ 0 ga Dyna ‏هرات‎ ‎5 ENR ‏على سلسلا ئيسية‎ 6102 11100287 Faby moe + 80003 0028 - Fab ‏سدس‎ wins ‏بعادت‎ ‏ل‎ TED3-Fab Bg Bey tide : UD Fab wits ‏سيراه رهدات‎ ‏لاوطو ل انا تلات ادغ لا‎ Blog tas Spor ‏غير‎
    ‎y . 1 FENN i oh ‏ل‎ ie Wl cA St ١ Pm a ١ ١ 0 0 | ‏م‎ ‎ERI ‏وجح‎
    ‎=. 3 FB 41 1 ‏امم‎ NN BO TRE 0 a 11 11 1B 1! = eens FE 5 0 0 mas i 5 0 ‏ل‎ B 1 cha COMER Yu ‏شكل‎ i iy ‏رزوع لووقا‎ Aa Sieg ‏تسد‎ ‎i 5 i SETHE Fah cid ihe ‏نسدد‎ ‎3 # ri | 8 3 ‏ا‎ ‎3 9 ow] 0 F g 3 8 NY ; erm \ \ \ \ 0 and » ‏ل‎ ١ 0 0 0 1 0 0 flit gre : ‏ا‎ re \\ \ \ ‏ب‎ 0 a ‏د‎ _ 5 SINE CR ‏كه‎ 301 3 3 F EE { H £3 5 3 % 3 5 : : 3 8 a EF 0 cos CO4SRO ¢ SCD Flared Sieg a CDE Fal aiid ‏وجنات‎ das 3 1 ‏نيمود‎ ER Cds ‏يداد‎ PTE Pal ated Seg tid ‏الى اد لكا الي ا ا اع ال لد ل الى‎ BL ١ ١ | ١ ١ ‏د‎ Fe i | | . ‏أي‎ 0 NN “HNN ١ | | ١0٠ 1 \ 0 i ‏ال‎ li \4 ‏ل‎ \§ |] ima. 8 + | ANN ‏ل‎ he ‏مم2‎ - Y ITE EE * * mE 4 A mE 1 ‏مج‎ { si 8 82 53 £18 FRE ‏ا‎ es 8 “au ps 0 3 5 FE 8 La ‏يح 3 و ا‎ 5 0 : ٠١ ‏شكل‎
    ‎olan Silly Shae NE EE NASR‏ ماق الس ‎E 8‏ : ارج ينين ال د حت ا د د ات ا ا ل
    3 وم ‎ha‏ ‎ees SERIE Ee‏ ‎SN NS Shap AEE‏ دخ ا ‎SR A SRR‏ ل ‎RS A‏ ال ‎RAL 5‏ ا يا ‎ea‏ دجت جرت متت تت ‎IRI TT‏ وه برجي اجون وجي قوفي يفي لحي ديدي قت جنوج م وجيت وتو تج ‎BRK‏ لد ‎ET RR RN aE RE‏ ا ال ل ل ‎JE 4‏ رك ال 3# ال ل الي ال ا 8 ‎USS SRN‏ ™ ا ا ‎a HER RRR‏ تتا الا الما اا ا الا ‎RR‏ اا ‎RR‏ و جسن ا حم الج ا الم = ا ‎CANN he wi Fad‏ د د و سس ‎EN Cm A‏ ل ~ ~ الم ا ل ا ا ا ل ا ا ل ا ا ا ا ا ا ‎Ba‏ ‎ey ry‏ | مستت ا ا ل ‎N Minin DA El i‏ ان ‎Noni Ee I SR A a EE HS RRR PLO 2 Ro‏ لني ‎ama‏ «ااساسبب سنن ب اه سا الجا اي بيد
    > > on a es Oo es ‏يه ال‎ EC A ER RAR SNA SO CS aa 1 ‏ل‎ NN INE TS ‏اد م أ‎ a Ba 3 4 Suis AE a ‏ا ا ا‎ NS Riis
    وخ م 0 6؟ «ج 0# ؟ ‎CH‏ اج ماع و مض اجا + د مق .ءا ‎SE AT‏ بحس
    ‎SEARS‏ مسرا ‎Sie‏ مه ‎ele‏ اال ‎CANE‏ ب ‎subse FRIAS‏ وخلاطة تند ‎CAR, galt poli‏ ‎ape dag‏ الاجحح أ ‎EEE EEL EEE EEE EEE LEE EEE‏ ‎alt‏ واه ل ‎RYTON FUMED‏
    ‎SE RR : 0‏ ا اج ات حت ا ‎EE‏
    ‎Dir day 4‏ ل تت ‎i‏ ال ل ‎ta‏ جين ا ا ل ا م ‎BR ANN‏ ال ال ‎a the‏ ا 1 ‎Vi‏ ‎hh i‏
    ‏الا المح ‎SE Re‏ ال لا للم ‎A‏ 8 1 لشت ‎RTA‏ ل ال ‎RR‏ ‎ed hg ap ~‏ خخ دن 3 مانت ا د 0 = 0 ل ‎Vinings‏ ‎Eos fs sss‏ ا ا ا حي ل و ا م امو حا ا ا ا ات ا ‎Rs SE SE hw gli phe ER‏ : ا ل 0 ‎Ne : : ONS NN SY Ne Ba gd Be wy‏ 3 ‎SRY 6‏ ل ا 88 8 0 ا 0 الى الج ا د ير بي ‎Thr‏ 0 ال ا ل ‎eS‏ ل ‎A NE‏ جيه لبهي ‎NE BE‏ ال ‎ET‏ ا : ل ‎Rs ERR‏ ابي ‎a 08# i hm NE‏ ادا ‎St‏ ‏كاي ‎ple‏ ا 0 ٍْ ا ا ا ‎BR a sss‏
    ‏نيج ي# اي اد او صقي و « ‎FEET J‏ عوج ده ؟ ه* ‎A‏ .1+ سمش
    ‏30 اتير لقنا 0 ب 3
    0" EATS 1 obey 0 I=] iN 0 10 = aan: ENE 5 lo 0 8“ NN "0 ‏ا‎ ‎3 nN "0 ‏ا‎ ‎iL 7 lo ol ete ‏اد‎ AR RE ‏د‎ ‎18315 + ‏ل‎ ‎35 3% * * ‏لل‎ 8 18 18 Fo 4.8 1# ONE LF ‏اج‎ ‏د‎ I tet hagas 4 ; % soosecorseanl Ll ‏مج‎ ‎5 ans ‏تسبح‎ Silda ‏تعد‎ EE ER III I i EE ; 3 : if 8 8 ‏سصوئسيسعرت ا‎ IL ‏س سن نا‎ A ‏قر‎ ¥ H 5 3 . As Jaa ‏تركيبة المصبوحة الفرعية‎ Yrs
    ‎ERED canoe‏ ‎HLL i‏ الانسة ‎a‏ 3 ل ‎Sad efeviisie ay‏ , ‎Traut ay A Te‏ : م 1 ا م 5 ادف 04 ب إْ اللسليلة الزجية الخية ب ‎Sy‏ ل و21 الست السلسلة الرئيسية القلينية جا وريج = جوري ممتي ‎WBA‏ تسد ‎mint‏ | ل إ ‎Sad aS i h ep a‏ روا 1 ‎ek‏ ‎HEA‏ : وت ‎PHS‏ | شحج شكل ‎ve‏
    لاله الهيلة السعودية الملضية الفكرية ا ‎Sued Authority for intallentual Property‏ ‎RE‏ .¥ + \ ا 0 § 8 ‎Ss o‏ + < م ‎SNE‏ اج > عي كي الج ‎TE I UN BE Ca‏ ‎a‏ ةا ‎ww‏ جيثة > ‎Ld Ed H Ed - 2 Ld‏ وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها ‎of‏ سقوطها لمخالفتها ع لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف ع النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية. ‎Ad‏ ‏صادرة عن + ب ب ‎٠.‏ ب الهيئة السعودية للملكية الفكرية > > > فهذا ص ب ‎101١‏ .| لريا ‎1*١ v=‏ ؛ المملكة | لعربية | لسعودية ‎SAIP@SAIP.GOV.SA‏
SA516380090A 2014-04-16 2016-10-16 نظم، وطرق وجهاز لتمديد مجموعة من الخلايا SA516380090B1 (ar)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461980506P 2014-04-16 2014-04-16
PCT/EP2015/058339 WO2015158868A2 (en) 2014-04-16 2015-04-16 Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SA516380090B1 true SA516380090B1 (ar) 2021-10-21

Family

ID=53052805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SA516380090A SA516380090B1 (ar) 2014-04-16 2016-10-16 نظم، وطرق وجهاز لتمديد مجموعة من الخلايا

Country Status (26)

Country Link
US (2) US11274278B2 (ar)
EP (2) EP3988920A1 (ar)
JP (3) JP6696969B2 (ar)
KR (2) KR102459384B1 (ar)
CN (3) CN116656605A (ar)
AU (2) AU2015248786B2 (ar)
BR (1) BR112016024072B1 (ar)
CA (2) CA2945889C (ar)
CY (1) CY1124717T1 (ar)
DK (1) DK3132247T3 (ar)
ES (1) ES2892927T3 (ar)
HR (1) HRP20211430T1 (ar)
HU (1) HUE056852T2 (ar)
IL (3) IL280738B (ar)
LT (1) LT3132247T (ar)
MX (2) MX2016013493A (ar)
MY (1) MY184699A (ar)
PH (2) PH12016502017A1 (ar)
PL (1) PL3132247T3 (ar)
PT (1) PT3132247T (ar)
RS (1) RS62471B1 (ar)
RU (2) RU2020133435A (ar)
SA (1) SA516380090B1 (ar)
SG (2) SG10201808491UA (ar)
SI (1) SI3132247T1 (ar)
WO (1) WO2015158868A2 (ar)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106940268B (zh) 2012-02-23 2021-09-21 朱诺治疗有限公司 细胞和其它复杂生物材料的色谱分离
CN116656605A (zh) 2014-04-16 2023-08-29 朱诺治疗有限公司 用于扩增细胞群的方法、试剂盒及装置
KR20220136455A (ko) 2014-04-23 2022-10-07 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 치료용 면역 세포 집단의 단리, 배양 및 유전자 조작 방법
MA45489A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés
RU2021134624A (ru) * 2015-10-22 2022-03-15 Джуно Терапьютикс Гмбх Способы, наборы, средства и устройства для трансдукции
MA45488A (fr) * 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
EP3192810A1 (en) 2016-01-14 2017-07-19 Deutsches Krebsforschungszentrum Psma binding antibody and uses thereof
CN107129988A (zh) * 2016-02-29 2017-09-05 广西医科大学 一种特异性结合cd3的核酸适配体及其筛选方法和应用
BR112018073909A2 (pt) * 2016-06-02 2019-02-26 Klotho Therapeutics, Inc. proteínas klotho recombinantes terapêuticas e composições e métodos envolvendo as mesmas
JP7062640B2 (ja) 2016-07-29 2022-05-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 抗ｃｄ１９抗体に対する抗イディオタイプ抗体
US10294454B2 (en) 2016-08-24 2019-05-21 General Electric Company Methods and kits for cell activation
CN110249046A (zh) * 2016-12-05 2019-09-17 朱诺治疗学股份有限公司 用于过继细胞疗法的工程化细胞的产生
US11624046B2 (en) * 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
CN117247899A (zh) * 2017-03-31 2023-12-19 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
CA3060526A1 (en) * 2017-04-27 2018-11-01 Juno Therapeutics Gmbh Oligomeric particle reagents and methods of use thereof
MA51154A (fr) * 2017-12-15 2020-10-21 Aleta Biotherapeutics Inc Variants de cd19
CN107904278B (zh) * 2017-12-25 2021-07-20 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 检测药物对细胞增殖影响的方法
US11149244B2 (en) * 2018-04-04 2021-10-19 Southwest Research Institute Three-dimensional bioreactor for T-cell activation and expansion for immunotherapy
EP3790958A1 (en) * 2018-05-08 2021-03-17 Life Technologies Corporation Compositions and methods for culturing and expanding cells
WO2019226529A1 (en) * 2018-05-21 2019-11-28 Bioprocessia Technologies Llc Multivalent protein complexes
BR112021002390A2 (pt) 2018-08-09 2021-05-11 Juno Therapeutics Inc processos para gerar células modificadas e suas composições
BR112021004686A2 (pt) 2018-09-11 2021-06-08 Eberhard Karls Universität Tübingen proteínas de ligação de antígeno anti-flt3 melhoradas
EP3623383A1 (en) 2018-09-11 2020-03-18 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Improved bispecific flt3xcd3 antigen binding proteins
EP3856888A4 (en) * 2018-09-24 2022-10-12 Southwest Research Institute THREE-DIMENSIONAL BIOREACTORS
BR112021008133A2 (pt) 2018-10-31 2021-10-05 Juno Therapeutics Gmbh Métodos para seleção e estimulação de células e aparelhos para os mesmos
KR20200132147A (ko) * 2019-05-15 2020-11-25 의료법인 성광의료재단 자연 살해 세포의 배양용 조성물 및 이를 이용한 방법
EP3978925A4 (en) * 2019-05-24 2023-06-28 Sol Bio Corporation Affinity separation system and method using switch-like adhesion reaction
AU2020287882A1 (en) * 2019-06-07 2022-01-20 Juno Therapeutics, Inc. Automated T cell culture
JP2023500318A (ja) 2019-10-30 2023-01-05 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 細胞選択および／または細胞刺激デバイスならびに使用方法
EP3822288A1 (en) 2019-11-18 2021-05-19 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Antibodies targeting, and other modulators of, the cd276 antigen, and uses thereof
EP4069742A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to gprc5d-targeted binding domains and related compositions and methods
CN115916817A (zh) 2019-12-06 2023-04-04 朱诺治疗学股份有限公司 针对bcma靶向结合结构域的抗独特型抗体及相关组合物和方法
JP2023509802A (ja) 2020-01-31 2023-03-09 セル．コペディア ゲーエムベーハー 生物学的実体を単離する方法
JP2023519098A (ja) 2020-02-12 2023-05-10 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｃｄ１９指向性キメラ抗原受容体ｔ細胞組成物ならびにその方法および使用
KR20220152227A (ko) 2020-02-12 2022-11-15 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ｂｃｍａ-지시된 키메라 항원 수용체 ｔ 세포 조성물 및 이의 방법 및 용도
EP4192868A1 (en) 2020-08-05 2023-06-14 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to ror1-targeted binding domains and related compositions and methods
CN116802203A (zh) 2020-11-04 2023-09-22 朱诺治疗学股份有限公司 从经修饰的恒定cd3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法
CN116635064A (zh) 2020-12-18 2023-08-22 世纪治疗股份有限公司 具有适应性受体特异性的嵌合抗原受体系统
KR20230159851A (ko) 2021-03-22 2023-11-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 치료 세포 조성물의 효력을 결정하는 방법
JP2024517863A (ja) 2021-05-06 2024-04-23 ジュノ・セラピューティクス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 細胞を刺激し、形質導入する方法
EP4373920A1 (en) 2021-07-19 2024-05-29 Repairon Immuno GmbH Method of producing a population of immune cells from pluripotent stem cells
WO2023213969A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4361549A (en) 1979-04-26 1982-11-30 Ortho Pharmaceutical Corporation Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells, and methods of preparing same
WO1986002077A1 (en) 1984-10-02 1986-04-10 Meade Harry M Production of streptavidin-like polypeptides
US4851341A (en) 1986-12-19 1989-07-25 Immunex Corporation Immunoaffinity purification system
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
DE4237113B4 (de) 1992-11-03 2006-10-12 "Iba Gmbh" Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins
DK0700430T3 (da) 1993-06-04 2005-08-15 Us Navy Fremgangsmåder til selektivt af stimulere proliferation af T-celler
AU5132096A (en) 1995-01-30 1996-08-21 Terrapin Technologies, Inc. Glubodies - multiplicities of proteins capable of binding a variety of small molecules
JPH11501008A (ja) 1995-02-09 1999-01-26 ユニバーシティ オブ ワシントン 改変−アフィニティーストレプトアビジン
WO1997011183A1 (en) 1995-04-11 1997-03-27 Trustees Of Boston University Streptavidin mutants
DE19641876B4 (de) 1996-10-10 2011-09-29 Iba Gmbh Streptavidinmuteine
CA2283716A1 (en) 1997-03-14 1998-09-17 Gabriel O. Reznik Multiflavor streptavidin
US5985658A (en) 1997-11-14 1999-11-16 Health Research Incorporated Calmodulin-based cell separation technique
US6664042B1 (en) 1999-01-26 2003-12-16 Cornell Research Foundation, Inc. Determining viral load in double negative T cells
NZ551331A (en) * 1999-02-03 2008-08-29 Amgen Inc Methods using polypeptides involved in immune response
AU759719B2 (en) 1999-02-04 2003-04-17 Pluristem Ltd. Method and apparatus for maintenance and expansion of hemopoietic stem cells and/or progenitor cells
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
US20030235908A1 (en) 2000-02-24 2003-12-25 Xcyte Therapies, Inc. Activation and expansion of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
EP1227321A1 (en) 2000-12-28 2002-07-31 Institut für Bioanalytik GmbH Reversible MHC multimer staining for functional purification of antigen-specific T cells
DE10113776B4 (de) 2001-03-21 2012-08-09 "Iba Gmbh" Isoliertes streptavidinbindendes, kompetitiv eluierbares Peptid, dieses umfassendes Fusionspeptid, dafür codierende Nukleinsäure, Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Gewinnung des Fusionsproteins
WO2003029462A1 (en) 2001-09-27 2003-04-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins
ATE370159T1 (de) 2002-03-01 2007-09-15 Volker A Erdmann Streptavidin-bindungspeptid
US7754155B2 (en) 2002-03-15 2010-07-13 Ross Amelia A Devices and methods for isolating target cells
US20050271653A1 (en) 2002-04-23 2005-12-08 Meir Strahilevitz Methods and devices for targeting a site in a mammal and for removing species from a mammal
FR2841905B1 (fr) 2002-07-05 2004-09-03 Centre Nat Rech Scient Fragments fab mutants de l'anticorps anti-cd4 chimere 13b8.2 et leurs applications
WO2004029221A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and uses thereof
WO2004096975A2 (en) 2003-05-02 2004-11-11 Insception Bioscience, Inc. Apparatus and methods for amplification of blood stem cell numbers
CA2525519A1 (en) * 2003-05-08 2004-12-02 Xcyte Therapies, Inc. Generation and isolation of antigen-specific t cells
EP1690090A1 (en) 2003-11-20 2006-08-16 Biosensor Applications Sweden AB (Publ) Mixture of at least two different antibodies specific for predetermined antigens and use of the mixture
SE0400181D0 (sv) 2004-01-29 2004-01-29 Gyros Ab Segmented porous and preloaded microscale devices
DE602005013957D1 (de) 2004-06-03 2009-05-28 Meso Scale Technologies Llc Verfahren zur durchführung von vollbluttests
JP5255841B2 (ja) 2004-10-15 2013-08-07 ジェネンコー・インターナショナル・インク 競合示差スクリーニング
WO2006058226A2 (en) * 2004-11-24 2006-06-01 The Trustees Of Boston University Modified dimeric streptavidins and uses thereof
US20060252087A1 (en) 2005-01-18 2006-11-09 Biocept, Inc. Recovery of rare cells using a microchannel apparatus with patterned posts
US7704708B2 (en) * 2006-02-13 2010-04-27 Uti Limited Partnership Monomeric streptavidin muteins
US7855057B2 (en) 2006-03-23 2010-12-21 Millipore Corporation Protein splice variant/isoform discrimination and quantitative measurements thereof
US20090208471A1 (en) 2006-04-07 2009-08-20 Yun Theodore J Isolation and Use of Human Regulatory T Cells
US20080085532A1 (en) 2006-09-18 2008-04-10 Jorn Gorlach Method for determining the immune status of a subject
EP2687540A1 (en) 2006-10-17 2014-01-22 Oncotherapy Science, Inc. Peptide vaccines for cancers expressing MPHOSPH1 or DEPDC1 polypeptides
WO2008053973A1 (en) 2006-11-02 2008-05-08 Kyowa Medex Co., Ltd. Method of immunoassay of component to be measured
AU2007353319A1 (en) 2006-11-15 2008-11-20 Invitrogen Dynal As Methods for reversibly binding a biotin compound to a support
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
CN101226118B (zh) 2007-01-19 2010-06-16 中国医学科学院肿瘤研究所 一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法及其用途
WO2008118476A2 (en) * 2007-03-26 2008-10-02 Codon Devices, Inc. Cell surface display, screening and production of proteins of interest
EP3023436A1 (en) 2007-07-03 2016-05-25 Dako Denmark A/S Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers
AU2008290537B2 (en) 2007-08-20 2014-04-03 Nextera As pVII phage display
ES2640216T3 (es) 2007-12-07 2017-11-02 Miltenyi Biotec Gmbh Sistemas y métodos para procesamiento de células
EP3358354B1 (en) 2008-01-18 2020-07-15 President and Fellows of Harvard College Methods of detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids
ES2890729T3 (es) 2008-01-29 2022-01-21 Hutchinson Fred Cancer Res Identificación de células T CD8+ que son CD161hi y/o IL-18Rahi y que tienen una capacidad de evacuación rápida de fármacos
CN101446576B (zh) 2008-12-29 2011-06-22 江苏省苏微微生物研究有限公司 一种微囊藻毒素-lr单抗免疫亲和柱的制备和使用方法
WO2010080032A2 (en) 2009-01-09 2010-07-15 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Bead-assisted viral transduction
US20110070581A1 (en) 2009-04-27 2011-03-24 Amit Gupta Separation of Leukocytes
WO2011053971A2 (en) * 2009-11-02 2011-05-05 Fina Biosolutions, Llc Method for enhancing the sensitivity of antibody based assays
US20120321665A1 (en) * 2009-12-14 2012-12-20 Benaroya Research Institute At Virginia Mason Compositions and methods for treating airway inflammatory diseases
EP2363501A1 (en) 2010-03-02 2011-09-07 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Method for isolating target cells
EP3376225A1 (en) 2010-08-06 2018-09-19 Ludwig-Maximilians-Universität München Identification of t cell target antigens
WO2012058627A2 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Miqin Zhang Pre-targeted nanoparticle system and method for labeling biological particles
ES2841983T3 (es) 2011-03-23 2021-07-12 Hutchinson Fred Cancer Res Método y composiciones para inmunoterapia celular
CN103797028B (zh) 2011-07-18 2017-08-25 Iba 股份有限公司 使靶细胞可逆染色的方法
US9353161B2 (en) 2011-09-13 2016-05-31 Uti Limited Partnership Streptavidin mutein exhibiting reversible binding for biotin and streptavidin binding peptide tagged proteins
CN106940268B (zh) 2012-02-23 2021-09-21 朱诺治疗有限公司 细胞和其它复杂生物材料的色谱分离
UA114108C2 (uk) * 2012-07-10 2017-04-25 Борд Оф Ріджентс, Дзе Юніверсіті Оф Техас Сістем Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання
CA2878862C (en) 2012-07-13 2023-01-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of assessing the suitability of transduced t cells for administration
WO2014031687A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Jensen, Michael Method and compositions for cellular immunotherapy
WO2014076277A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 Iba Gmbh Streptavidin muteins and methods of using them
CN103305464B (zh) 2013-06-05 2015-04-15 南昌大学 直接分离cd4+和cd8+淋巴细胞的方法
US9698876B2 (en) 2013-07-23 2017-07-04 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Transmission mode allocation in LTE networks
SG10201804439PA (en) 2013-12-20 2018-06-28 Hutchinson Fred Cancer Res Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof
KR20240042250A (ko) 2014-04-07 2024-04-01 노파르티스 아게 항-cd19 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
CN116656605A (zh) * 2014-04-16 2023-08-29 朱诺治疗有限公司 用于扩增细胞群的方法、试剂盒及装置
KR20220136455A (ko) 2014-04-23 2022-10-07 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 치료용 면역 세포 집단의 단리, 배양 및 유전자 조작 방법
US10131876B2 (en) 2014-04-24 2018-11-20 Miltenyi Biotec Gmbh Method for automated generation of genetically modified T cells
RU2741899C2 (ru) 2014-04-25 2021-01-29 Блубёрд Био, Инк. Улучшенные способы производства средств адоптивной клеточной терапии
CN106662584B (zh) * 2014-04-30 2020-05-05 Iba股份有限公司 分离靶细胞的方法
MX2017012939A (es) 2015-04-08 2018-05-22 Novartis Ag Terapias cd20, terapias cd22 y terapias de combinacion con una celula que expresa un receptor quimerico de antigeno (car) de cd19.
WO2016166568A1 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells
MA45488A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
MA45489A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés
RU2021134624A (ru) 2015-10-22 2022-03-15 Джуно Терапьютикс Гмбх Способы, наборы, средства и устройства для трансдукции
JP7184645B2 (ja) 2015-12-03 2022-12-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 修飾キメラ受容体ならびに関連する組成物および方法
CA3060526A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Juno Therapeutics Gmbh Oligomeric particle reagents and methods of use thereof
BR112021002390A2 (pt) 2018-08-09 2021-05-11 Juno Therapeutics Inc processos para gerar células modificadas e suas composições
BR112021008133A2 (pt) 2018-10-31 2021-10-05 Juno Therapeutics Gmbh Métodos para seleção e estimulação de células e aparelhos para os mesmos

Also Published As

Publication number Publication date
IL248360B (en) 2021-02-28
PH12016502017B1 (en) 2017-01-09
PH12020551028A1 (en) 2021-06-07
AU2022200527A1 (en) 2022-02-17
CA2945889A1 (en) 2015-10-22
PH12016502017A1 (en) 2017-01-09
LT3132247T (lt) 2021-12-10
JP2020124210A (ja) 2020-08-20
CN116656605A (zh) 2023-08-29
CN106414724A (zh) 2017-02-15
BR112016024072B1 (pt) 2021-02-09
AU2015248786A1 (en) 2016-11-03
ES2892927T3 (es) 2022-02-07
JP2023062124A (ja) 2023-05-02
PT3132247T (pt) 2021-11-03
SG10201808491UA (en) 2018-11-29
CN111961647A (zh) 2020-11-20
EP3132247A2 (en) 2017-02-22
IL280738B (en) 2022-07-01
IL293587A (en) 2022-08-01
HUE056852T2 (hu) 2022-03-28
AU2015248786B2 (en) 2021-11-04
IL280738A (en) 2021-03-25
US11274278B2 (en) 2022-03-15
EP3988920A1 (en) 2022-04-27
WO2015158868A3 (en) 2016-01-28
IL248360A0 (en) 2016-11-30
KR20220150988A (ko) 2022-11-11
BR112016024072A2 (pt) 2017-10-10
RU2016144724A (ru) 2018-05-18
RU2020133435A (ru) 2020-12-01
SI3132247T1 (sl) 2021-12-31
NZ763583A (en) 2021-10-29
RU2016144724A3 (ar) 2018-12-12
CA2945889C (en) 2024-01-09
JP2017513524A (ja) 2017-06-01
RS62471B1 (sr) 2021-11-30
WO2015158868A2 (en) 2015-10-22
US20220195388A1 (en) 2022-06-23
MY184699A (en) 2021-04-18
HRP20211430T1 (hr) 2021-12-10
MX2020014089A (es) 2021-07-21
RU2735640C2 (ru) 2020-11-05
DK3132247T3 (da) 2021-10-11
EP3132247B1 (en) 2021-08-18
PL3132247T3 (pl) 2022-01-03
RU2735640C9 (ru) 2021-02-08
NZ763587A (en) 2021-11-26
CY1124717T1 (el) 2022-07-22
MX2016013493A (es) 2017-05-10
SG11201608557UA (en) 2016-11-29
CA3176848A1 (en) 2015-10-22
KR102459384B1 (ko) 2022-10-26
US20170037368A1 (en) 2017-02-09
JP6696969B2 (ja) 2020-05-20
KR20170003932A (ko) 2017-01-10
NZ725213A (en) 2021-10-29
NZ763585A (en) 2021-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SA516380090B1 (ar) نظم، وطرق وجهاز لتمديد مجموعة من الخلايا
US11913024B2 (en) Methods for culturing cells and kits and apparatus for same
JP6895959B2 (ja) 細胞を培養するための方法ならびにそのためのキットおよび装置
JP6603209B2 (ja) ソルターゼ（Ｓｏｒｔａｓｅ）を用いた生存細胞のタンパク質修飾
US20210032297A1 (en) Oligomeric particle reagents and methods of use thereof
SA518391219B1 (ar) التركيبات والطرق اللازمة لمجاورة النوع الأول والنوع الثاني من المجالات خارج الخلية كبروتينات كيميرية متغايرة
JP2018531035A6 (ja) 細胞を培養するための方法ならびにそのためのキットおよび装置
CN108474002A (zh) 用于转导的方法、反应剂盒、反应剂和设备
US11513113B2 (en) Compositions and methods for identification of antigen specific T cells
JP2022512872A (ja) 細胞の選択および刺激のための方法ならびにそのための装置
JP2021505168A (ja) 操作されたｔ細胞の組成物を製造するための方法
CN113272018A (zh) 产生基因工程化t细胞的方法
WO2017083545A1 (en) Nkg2d decoys
KR20190129062A (ko) 항체 선택 방법
RU2777989C2 (ru) Олигомерные реагенты в виде частиц и способы их применения
RU2778411C2 (ru) Способы культивирования клеток и наборы и устройство для них
CN115835873A (zh) 用于产生表达重组受体的供体分批细胞的方法