JP5255841B2 - 競合示差スクリーニング - Google Patents
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Description
本発明は所望の化合物をスクリーニングするための方法を提供する。特に、本発明は競合示差スクリーニングのための方法を提供する。幾つかの好ましい態様において、本発明は、タイトバインダーの同定を促進する競合示差スクリーニングのための方法を提供する。幾つかの態様において、本発明の方法において用いられる作用物質はタイト及びウィークバインダーを含む。他の態様において、本発明は、標的を認識及び結合するが所望のバインダーよりも結合の弱い、競合的バインダーを用いる方法を提供する。
第一コレクションの作用物質の少なくとも一部が第一標的に結合するような条件下において、第一標的を作用物質の第一コレクションに接触させて、第一結合標的を生成する工程と、第一結合標的を洗浄する工程と、第一結合標的中の標的に結合している作用物質を溶出して、抗−標的ペプチドのコレクションを生成する工程と、抗−標的ペプチドのコレクションを増幅して増幅された抗−標的ペプチドのコレクションを生成する工程と、作用物質の少なくとも一部が第一及び/又は第二標的に結合するような条件下において、増幅された抗−標的ペプチドのコレクションを第一標的及び/又は第二標的に対する作用物質の第一コレクション及び/又は作用物質の第二コレクションに曝して、更なる第一結合標的及び第二結合標的を生成する工程と、更なる第一結合標的及び/又は第二結合標的を洗浄する工程と、少なくとも1つの所望のバインダーを区別し、分離し、同定する工程を含む。
野生型細胞の少なくとも一部がファージ提示されたペプチドの第一プールのなかで幾つかのメンバーと結合するような条件下において、少なくとも1つの野生型細胞のコレクションをファージ提示された細胞の第一プールとインキュベートして結合細胞及び未結合ファージを生成する工程と、前記未結合ファージが除去するような条件下で、前記結合細胞及び未結合ファージを洗浄する工程と、前記結合細胞に結合しているファージを溶出して抗−標的ペプチドのコレクションを生成する工程と、前記抗−標的ペプチドのコレクションを増幅する工程と、異常細胞の少なくとも一部が前記抗−標的ペプチド又はファージ提示されたペプチドの第一及び/又は第二プールに結合するような条件下で、抗標的ペプチド及び、工程(i)のファージ提示されたペプチドの第一及び/又は第二プールを、異常細胞に適用して、結合抗−標的ペプチド及び少なくとも1つの所望のペプチドを有する結合異常細胞を生成する工程と、前記結合した異常細胞を洗浄し、前記異常細胞の表面に結合していないファージを除去して、結合抗−標的ペプチド及び少なくとも1つの所望のペプチドで覆われた細胞表面を残す工程と、前記抗−標的ペプチドを有する(bearing)前記異常細胞から、前記所望のペプチドを有する(bearing)ファージを区別し及び/又は分離する工程と、前記少なくとも1つの所望のペプチドを同定する工程とを含む。幾つかの態様において、前記ファージの第一及び第二コレクションが異なるゲノムを含む。更なる態様において、前記所望のペプチドを同定する工程が前記ファージの第二集団の核酸配列の少なくとも1部に特異的であるオリゴヌクレオチドを用いた増幅を用いて行われる。幾つかの代替的な態様において、前記方法は抗菌耐性パターンを用いて、ファージの第一及び第二コレクションの間の区別を行う工程を更に含む。幾つかの工程において、第二標的集団は腫瘍細胞を含む。更なる態様において、少なくとも1つの前記工程が繰り返される。更なる態様において、少なくとも2つの前記工程が繰り返される。幾つかの追加的な態様において、前記抗−標的ファージの増幅されたコレクションの濃度がファージの第二コレクションの濃度よりも少なくとも約1000倍高い。更なる態様において、前記方法は前記増幅されたコレクションを第二標的集団及び作用物質の第一コレクションとともにインキュベーションする前に、抗−標的物質を含むファージを失活させる工程を更に含む。幾つかの好ましい態様において、前記失活させる工程は前記ファージを生育不可能な温度に曝すことにより行われる。
標的集団の少なくとも一部が作用物質の少なくとも一部に結合するような条件下で、標的集団を作用物質のコレクションと接触させて、少なくとも1つのバインダーを有する結合標的集団を生成する工程であって、前記作用物質のコレクションが規定の濃度を有することを特徴とする工程と、前記結合した標的集団を洗浄し、前記標的集団に結合していない作用物質を除去する工程と、前記少なくとも1つのバインダーを区別し、分離し、及び同定する工程とを含む方法も提供する。幾つかの態様において、前記作用物質はペプチドであり、他の態様において前記作用物質は核酸である。幾つかの好ましい態様において、前記核酸はDNA及び/又はRNAである。追加的な態様において、標的は癌細胞、細胞株、細胞培養、腫瘍抽出物、癌組織、臓器、癌細胞に関係する分子、癌細胞株に関係する分子、癌細胞培地に関係する分子、腫瘍抽出物に関係する分子、癌組織に関係する分子、及び癌臓器に関係する分子からなる群より選択される。更なる態様において、前記標的は抗原である。幾つかの好ましい態様において、前記抗原は癌性抗原、muc−1、Tag72、CEA、CD22、ED−B及びFAPから成る群より選択される。幾つかの好ましい態様において、前記規定の濃度は前記標的集団の濃度の1×10−3倍乃至約1×103倍の間である。幾つかの態様において、前記規定の濃度が、個々の作用物質の濃度が前記作用物質の好適な解離定数の約1×10−4乃至約1×102倍の間まで高まるように作用物質の多様性を減少させることを含む。幾つかの追加的な態様において、規定の濃度は所望の標的に対する予め決められた解離定数を有するバインダーを含む少なくとも1つの競合的バインダーを含む。更なる態様において、前記標的集団が低い濃度を有し、前記低い濃度が約1マイクロモル乃至約1ピコモルの間である。幾つかの好ましい態様において、前記方法は更にファージ提示法を用いる。前記作用物質がファージの表面又はファージ感染細胞に存在するペプチドであり、前記抗標的作用物質がファージ表面に又はファージ感染細胞存在する別のペプチドである。幾つかの代替的な好ましい態様において、前記方法は前記増幅されたコレクションを前記第二標的集団及び前記作用物質の第一コレクションとインキュベートする前に、前記抗−標的物質を含むファージを失活させる工程を更に含む。
標的集団の少なくとも一部が前記作用物質のコレクションのメンバーの少なくとも一部に結合するような条件下で、前記標的集団を作用物質のコレクションと接触させて、少なくとも1つの所望のバインダーと未結合作用物質を有する結合標的集団を生成する工程であって、前記標的集団が低い濃度を有することを特徴とする工程と、前記結合標的を洗浄し、未結合作用物質を除去する工程と、前記少なくとも1つの所望のバインダーを区別し、分離し、及び同定する工程とを含むことを特徴とする方法。
第一標的を第一作用物質のコレクションと接触させる工程と、標的に存在する、標的分子に結合していない作用物質を洗浄除去する工程と、洗浄除去された作用物質を廃棄する工程と、標的分子に結合している作用物質を溶出して、抗―標的ペプチドのコレクションを生成する工程と、抗−標的ペプチドのコレクションを増幅する工程と、抗−標的ペプチドの増幅されたコレクション並びに作用物質の第一及び第二コレクションを第一又は第二標的に適用する工程と、第一及び第二標的中の、標的分子に結合していない作用物質を洗浄して除去する工程と、少なくとも1つの所望のバインダーを区別し、分離し、同定する工程とを含む方法も提供する。
少なくとも1つの野生型細胞のコレクションをファージ提示されたペプチドの第一プールとインキュベーションする工程と、野生型細胞の表面上の標的分子に結合していないファージを洗浄する工程と、標的分子に結合しているファージを溶出して抗−標的ペプチドのコレクションを生成する工程と、抗−標的ペプチドのコレクションを増幅する工程と、抗−標的ペプチドの増幅されたコレクション並びにファージ提示されたペプチドの第一及び/又は第二プールを異常細胞に適用する工程と、異常細胞の表面上の標的分子に結合していないファージを洗浄して除去し、少なくとも1つの所望のペプチドだけでなく結合抗−標的ペプチドで覆われている細胞表面を残す工程と、抗−標的ペプチドを有する(bearing)ファージから少なくとも1つの所望のペプチドを有する(bearing)ファージを区別及び/又は分離し、少なくとも、1つの所望のペプチドを同定する工程とを含む。
標的集団を規定の濃度を有する作用物質のコレクションに接触させる工程と、標的集団に結合していない作用物質を洗浄して除去する工程と、少なくとも1つのバインダーを区別し、同定し、分離する工程を含む方法も提供する。
低い濃度を有する標的集団を作用物質のコレクションと接触させる工程と、前記標的集団に結合していない作用物質を洗浄して除去する工程と、少なくとも1つの所望のバインダーを区別し、分離し、同定する工程とを含む方法も提供する。
図面の説明
図1は、ライブラリーメンバーP1及びP2の間の競合を示す。両者は1−10Mの濃度で存在する。標的濃度(T0)の関数として分析された標的に結合したP1及びP2(それぞれ、TP1及びTP2という)の解離定数はそれぞれKd1=1−10M、Kd2=1−7Mである。X軸は標的濃度(モル)を示し、Y軸は標的メンバーの濃度(モル)を示す。この図により示されるように、ライブラリーのメンバー結合の量は、解離定数と標的濃度との関数である。
本発明は所望の化合物をスクリーニングする方法を提供する。特に、本発明は競合示差スクリーニングのための方法を提供する。幾つかの好ましい態様において、本発明はタイトバインダーの同定を促進する競合示差スクリーニングのための方法を提供する。幾つかの好ましい態様において、本発明の方法に用いる作用物質はタイト及びウィークバインダーを含む。他の態様において本発明は、標的を認識し結合するが、所望のバインダーよりも弱い結合を有する、競合バインダーを用いた方法を提供する。
定義
本明細書において特に別途定義しない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。Singleton and Sainsbury、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY、第2版、John Wiley and Sons、ニューヨーク(1994年)、及びHale and Marham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY、Harper Perennial、ニューヨーク(1991年)は、当業者にとって、本発明において用いられている多くの用語を収録する一般的な辞書である。
本明細書で用いるように、「所望のタンパク質」の語は解析、同定、及び/又は修飾されるタンパク質を意味する。組換えタンパク質のほか自然発生タンパク質も本発明に用いることができる。
他の態様において、標的は分子である。いくつかの態様において、前記分子は有機分子である。更なる態様において、前記分子は生物分子である。追加的な態様において、前記生物学的分子は細胞関連分子である。更なる態様において、前記細胞関連分子は細胞の外表面に関係する。幾つかの態様において、前記細胞関連分子はタンパク質である。幾つかの態様において、前記タンパク質はレセプターである。追加的な態様において、前記細胞関連分子は特定の細胞タイプに特定される。更なる態様において、前記細胞は疾病及び/又は異常細胞である。幾つかの好ましい態様において、前記疾病細胞は、癌細胞である。他の態様において、前記疾病細胞は感染細胞である。本発明において、標的として用いることができる。他の分子はタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、多糖、糖タンパク、ホルモン、レセプター、抗原、抗体、毒物質、代謝物、抑制物質、薬物、含量、栄養素、及び成長因子を含むがこれらに限定されない。
発明の詳細な説明
本発明は、所望の化合物をスクリーニングするための方法を提供する。特に、本発明は競合示差スクリーニングのための方法を提供する。特に、幾つかの態様において、本発明は、標的結合の同定を促進する競合示差スクリーニングのための方法を提供する。幾つかの好ましい態様において、前記作用物質は、タイト及びウィークバインダーを含む本発明の方法において用いられる。他の態様において、本発明は標的を認識及び結合するが、所望のバインダーよりも弱い結合を有する競合バインダーを用いる方法を提供する。
他の態様において、標的は分子である。いくつかの態様において、前記分子は有機分子である。更なる態様において、前記分子は生物分子である。追加的な態様において、前記生物学的分子は細胞関連分子である。更なる態様において、前記細胞関連分子は細胞の外表面に関係する。幾つかの態様において、前記細胞外表面は細胞外基質の一部である。幾つかの態様において、前記細胞関連分子はタンパク質である。幾つかの態様において、前記タンパク質はレセプターである。追加的な態様において、前記細胞関連分子は特定の細胞タイプに特定される。更なる態様において、前記細胞は疾病及び/又は異常細胞である。幾つかの好ましい態様において、前記疾病細胞は、癌細胞である。他の態様において、前記疾病細胞は感染細胞である。本発明において、標的として用いることができる。他の分子はタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、多糖。糖タンパク、ホルモン、レセプター、抗原、抗体、毒物質、代謝物、抑制物質、薬物、含量、栄養素、及び成長因子を含むがこれらに限定されない。
実施例
以下の実施例は本発明の特定の好ましい態様及び側面を図示するものであり、本発明を限定するものではない。
PI(プロテアイナーゼインヒビター)、sd及びSD(標準偏差)、M(モルの)、mM(ミリモルの)、μM(マイクロモルの)、nM(ナノモルの)、mol(モル)、mmol(ミリモル)、μmol(マイクロモル)、nmol(ナノモル)、gm(グラム)、mg(ミリグラム)、μg(マイクログラム)、pg(ピコグラム)、L(リットル)、ml及び mL(ミリリットル)、μl及びμL(マイクロリットル)、cm(センチメートル)、mm(ミリメートル)、μm(マイクロメートル)、nm(ナノメートル)、LF(致死因子)、℃(摂氏)、cDNA(転写又は相補DNA)、DNA(デオキシリボ核酸)、ssDNA(一本鎖DNA)、dsDNA(二本鎖DNA)、dNTP(デオキシリボヌクレオチド三リン酸)、RNA(リボ核酸)、PBS(リン酸緩衝生理食塩水、g(比重)OD(光学密度)、CPM(1分間当たりのカウント)、rpm(1分間あたりの回転数)、ダルベッコリン酸緩衝溶液(DPBS)、HEPES(N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N-[2-エタンスルホン酸])、HBS(HEPES緩衝生理食塩水)、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、Tris−HCl(トリス [ヒドロキシメチル]アミノメタン-クロライド)、2−ME(2-メルカプトエタノール)、EGTA(エチレングリコール-ビス(β-アミノメチル エーテル)N,N,N',N'−四酢酸)、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、Abbott(アボットラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州)、Bio−Synthesis(バイオ-シンセシス、ルイスビル、テキサス)、ATCC(アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックイビル、メリーランド)、Gibco/BRL(ギブコ/BRL、グランドアイランド、ニューヨーク)、Sigma(シグマケミカル社、セントルイス、ミズリー)、Pharmacia(ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー)、Pierce(ピアスバイオテクノロジー、ロックフォード、イリノイ)、Roche(ロシュダイアグノースティックコーポレーション、インディアナポリス、インディアナ)、SynPep(シンペップ、ダブリン、カリフォルニア)、Bachem(ベイケムバイオサイエンス社、キングオブプルシア、ペンシルバニア)、及びStratagene(ストラタジェンクローニングシステムズ、ラホーヤ、カリフォルニア)。
以下の実施例において、各種計算が提供される。本発明を任意の計算式に限定することは意図しない。以下の記号がここで用いられる;
メンバーnのライブラリーLについて、letT0=標的の総量、T=未結合標的、Pi=未結合ライブラリーメンバーI、Pi 0=ライブラリーメンバーIの総量、Ki D=PiとTの解離定数,TPi=PiとTとの複合体、Ki on=第二オーダー関連速度定数、Ki off=第一オーダー関連速度定数、図1乃至8は上に例示された、関係を示すグラフである。
本実施例において以下のことが仮定される。1)安定状態の結合が達成される。2)各標的は1つのメンバーにもの結合することができる。及び3)各メンバーは同じ第二オーダー関係速度定数を有し、その後以下の式はライブラリーメンバー間の競合を示す。
−on速度は以下のように計算する:
d(TPi)/dt=Ki on(T)(Pi)
−off速度は以下のように計算する:
−d(TPi)/dt=Ki off(TPi)
−安定状態において、以下の式が適用される:
d(TPi)/dt=−dt(TPi)/dt
Ki on(T)(Pi)=Ki off(TPi)
Kioff/Kion=(T)(Pi)/(TPi)=KiD
−標的に結合するメンバーnを有するライブラリーにおいて、遊離標的の濃度は、:
T=T0−TP1−TP2−TP3...−TPn
−各メンバーPiについて:
Ki D=(T)(Ri)/(TPi)
T=(TPi/Pi)Ki D
−ライブラリーLにおいて、標的(P1)に結合する1つの結合メンバーがある。Tの関数として現される遊離P1に対する結合P1の割合は、:
T=(TP1/P1)K1 D
−Tは遊離標的の濃度であるので、ライブラリーの他のいずれかのメンバーP1は、:
T=(TPi/Pi)KiD
−ライブラリーの各メンバーPiについて、最もタイトなバインダーの比率(TP1/P1)に対する遊離比率(TPi/Pi)を超える結合は、:
(TPi/Pi)Ki D=(TP1/P1)K1 D
(TPi/Pi)=(TP1/P1)K1 D/Ki D
−ライブラリーのメンバーiについて、P1の遊離比率に対する遊離比率(TPi/Pi)の結合は直接的に2つの解離定数の直接比である:
Let X=(TP1/P1);r1 i=K1 D/Ki D
TP1/P1 0=(TP1/P1)/(1+(TP1/P1)=x/(1+x)
TPi/P0i=(TPi/Pi)/(1+(TPi/Pi)
Eqn1:TPi/Pi0=r1 i*x/(1+r1 i*x)
−結合メンバー1(TP1)に対する結合メンバーi(TPi)の割合は、
TPi/TP1=(1+x)*r1 i*x*Pi 0/x*(1+r1 i*x)*P1 0
=(1+x)*r1 i*Pi0/(1+r1 i*x)*P1 0
=(1+x)*Pi 0/((1/r1 i)+x)*P1 0
Epn2:TPi/TP1=(1+x)*Pi 0/((1/r1 i)+x)*P1 0
T=(TP1/P1)K1 D=(x)K1 D
T0が0に近づくと;Tが0に近づき、xは0に近づく
T0が∞に近づくと;Tが∞に近づき、xは∞に近づく
TPi/TP1=(1+x)*Pi 0/((1/r1 i)*P1 0
T0が0に近づくと、TPi/TP1は(1)*Pi 0/((1/r1i))*P1 0に近づき、
(r1 i)*Pi 0/P1 0に近づく
T0が∞に近づくと;TPi/TP1は(X)*Pi 0/(x)P1 0に近づき、
Pi 0/P1 0に近づく。
従って、標的が限定されている場合、最もタイトなバインダーに関係する各バインダーの量は、解離定数の比に比例する。標的の濃度が高い場合、各メンバーの結合は同程度である。この関係を図4に示す。ライブラリー中の最もタイトなバインダーのみを観察する場合、標的濃度は限定されるべきである。ライブラリー中のすべてのバインダーを観察する場合、標的は過剰に存在すればよい。この関係を図5に示す。観察されるタイトバインダーの割合を増やすためには幾つかの選択肢がある、1)ライブラリー濃度の増加、2)ライブラリーの多様性を減らす(メンバーの濃度を増やす)、3)標的濃度を減らす、又は4)他のバインダーから区別することができる(検出システムでは確認されることができない)1つの弱いバインダーを過剰に添加する。この関係を図6に示す。
この実施例では、標的に対する結合のための結合エネルギー及び標準偏差を説明する。検出は、平衡透析、蛍光活性化細胞ソーティング、ライブラリーから10のランダムに選択されたメンバーのための結合エネルギーの直接測定、を含むがこれらに限定されない、当分野で既知の方法を用いて行われる。低分子標的及びタンパク質又はペプチドリガンドを含む幾つかの態様において、当分野で知られているデータ(Lancet et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:3715−3719 [1993])は、平均値及び標準偏差の初期の評価に用いることができる。この文献において、バニリンに結合している抗体のライブラリーに対して1.8kacl/モルの標準偏差と−1.5kcal/モルの平均結合エネルギーが提供されている。タンパク質標的に対するタンパク質ライブラリーの結合のための代替的なデータ(Laskowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 98:1410−1415 [2001])を用いることができる。この文献において、1.8kcal/モルの標準偏差を有する−5.5kcal/モルの結合エネルギーの平均値が結合エネルギーの平均値は、ストレプトマイセス グリセスプロテアーゼAに対するオボムコイドプロテアーゼインヒビターのライブラリーの結合のために提供された。両文献は、これらのデータは2項(正規)分布になることを示している。
上の式1はその後、TP1/P1の各値におけるTPi/Pi0を計算するために用いられる:
TPi/Pi 0=r1 i*x/(1+r1 i*x)
式中、x=(TP1/P1);r1 i=K1 D/Ki D
TP1/P1の値は1×10−4乃至1×107の間で変化する。上の式には、TP1の各値に対するTP1に比例する各グループ(i)における結合メンバーの濃度を計算するためにその後用いられる:
TPi/TP1=(1+x)*Pi 0/((1/r1 i)+x)*P1 0 。
各TP1/P1におけるTPi/TP1のための値が計算される。TPiはRow26におけるTP1/P01の計算された比をTP1で掛けることにより計算される。各結合種(i)の総濃度はTPi/TP1をTP1に掛けて計算される。遊離(未結合)標的濃度は、T=(TP1/P1)K1Dの式を利用して、TP1/P1をK1Dで掛けて計算される。この式を満足する総標的濃度は遊離標的に対する総結合標的加えることにより計算される。ここの結合種の濃度は、KiD(Pi0/P10)におけるバインダーの数を結合種の総濃度を掛けることにより計算される。競合濃度及び解離定数が含まれる場合にも同様の計算が行われる。
この実施例では、マススペクトロメトリックスクリーニンの実験を説明する。図10乃至13はこれらの実験から得られたデータ及び計算を示す。ヒト角質層キモトリプシン(hCC)はBBI−loop−BLAから作られたライブラリーからスクリーニングされた(U.S.Pat.Appln.Ser. Nos.10/984,270及び10/984,410;及びPCT公報Nos.US04/36976,US04/36979及び US04/36980参照のこと、これらの文献を参照により本明細書に援用する)。これらのタンパク質ライブラリーは、タンパク質のN−末端において無作為抽出された(システイン拘束)3の不連続位置におけるタンパク質骨格からなる。HSCC(スクリーニング標的)(Swissprot、登録番号P49862)はビオチン標識し、ストレプトアビジンビーズ上に固定化(MagnaBind Beads;Pierce)された。
Claims (22)
- 少なくとも1つの所望の結合している作用物質を単離する方法であって、
(i)標的集団を作用物質のコレクションと接触させて、少なくとも1つの結合している作用物質を有する結合標的集団を生成する工程であって、前記標的集団の少なくとも一部が作用物質のコレクションの少なくとも一部に結合するような条件下で、作用物質のコレクションが規定の濃度を有し、前記規定の濃度が、前記標的集団の濃度の約1×10 −3 乃至約1×10 3 倍の間であるか、あるいは、個々の作用物質の濃度が前記結合している作用物質の好適な解離定数の約1×10 −4 乃至約1×10 2 倍の間まで高まるようなコレクションのメンバーの濃度であるか、あるいは前記作用物質のコレクションが所望の標的に対して予め決められた解離定数を有するバインダーを含む少なくとも1つの競合的作用物質の濃度であることを特徴とする工程と、
(ii)前記結合標的集団を洗浄し、前記標的集団に結合していない作用物質を除去する工程と、
(iii)前記少なくとも1つの結合している作用物質を区別し、分離し、及び同定する工程とを含み、
前記作用物質のコレクションが少なくとも1つのペプチドまたは少なくとも1つの核酸を含み、前記標的が生物分子であることを特徴とする方法。 - 前記作用物質のコレクションが少なくとも1つのペプチドを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記作用物質のコレクションが少なくとも1つの核酸を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記核酸がDNA又はRNAであることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記生物分子がタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的が抗原であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記抗原が癌性抗原、muc−1、Tag72、CEA、CD22、ED−B及びFAPから成る群より選択されることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記標的集団が低い濃度を有し、前記低い濃度が約1マイクロモル乃至約1ピコモルの間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法が更にファージ提示法を用いることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記ペプチドが少なくとも1つの抗体を含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記ファージのコレクション中の少なくとも1つの核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅を更に含むことを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 少なくとも1つの所望の結合している作用物質を単離する方法であって、
(i)標的集団を作用物質のコレクションと接触させて、少なくとも1つの所望の結合している作用物質と未結合作用物質を有する結合標的を生成する工程であって、前記標的集団の少なくとも一部が前記作用物質のコレクションのメンバーの少なくとも一部に結合するような条件下で、前記標的集団が低い濃度を有することを特徴とする工程と、
(ii)前記結合標的を洗浄し、未結合作用物質を除去し、前記少なくとも1つの結合している作用物質を区別し、分離し、及び同定する工程とを含み、
前記低い濃度が約1マイクロモル乃至約1ピコモルであり、前記作用物質のコレクションが少なくとも1つのペプチドまたは少なくとも1つの核酸であって、前記標的が生物分子である、ことを特徴とする方法。 - 前記作用物質のコレクションが少なくとも1つのペプチドを含むことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記作用物質のコレクションが少なくとも1つの核酸を含むことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記核酸がDNA又はRNAであることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記作用物質のコレクションが規定の濃度であって、前記規定の濃度が、前記標的集団の濃度の約1×10 −3 乃至約1×10 3 倍の間であるか、あるいは、個々の作用物質の濃度が前記結合している作用物質の好適な解離定数の約1×10 −4 乃至約1×10 2 倍の間まで高まるようなコレクションのメンバーの濃度であるか、あるいは前記作用物質のコレクションが所望の標的に対して予め決められた解離定数を有するバインダーを含む少なくとも1つの競合的作用物質の濃度であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記生物分子がタンパク質である、請求項12に記載の方法。
- 前記標的が抗原であることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記抗原が癌性抗原、muc−1、Tag72、CEA、CD22、ED−B及びFAPから成る群より選択されることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記方法が更にファージ提示法を含むことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記ペプチドが少なくとも1つの抗体を含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記ファージのコレクション中の少なくとも1つの核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅を更に含むことを特徴とする請求項20に記載の方法。
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