CN101044405A - 竞争性示差筛选 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于筛选的新方法。具体而言，本方明提供竞争性示差筛选的方法。在一些优选的实施方式中，本方明提供了帮助紧密结合物的鉴定的竞争性示差筛选方法。在一些优选的实施方式中，本发明的方法中所使用的试剂包括紧密结合物和弱结合物。在其它实施方式中，本发明提供了采用识别和结合靶标的竞争性结合物的方法，但所述竞争性结合物具有弱于目标结合物的结合。

Description

竞争性示差筛选

发明领域

[0001]本方明提供用于筛选目标化合物的方法。具体而言，本方明提供竞争性示差筛选的方法。在一些优选的实施方式中，本方明提供了有助于紧密结合物(binder)的鉴定的竞争性示差筛选方法。在一些优选的实施方式中，本发明的方法中所使用的试剂包括紧密结合物和弱结合物。在其它实施方式中，本发明提供了采用识别和结合靶标的竞争性结合物的方法，但所述竞争性结合物具有弱于目标结合物的结合。

发明背景

[0002]目前使用的筛选和/或鉴定目标化合物(例如结合物)的程序典型包括步骤：温育多种化合物的库与固定于表面的抗靶标(anti-targets)(即，预选择的不期望靶标)；洗去不结合于所述抗-靶标的化合物；以及将经洗去的化合物重施用于第二或新的靶标源。与抗靶标的温育使结合于不期望靶标的化合物的库减少。因此，该步骤筛选出结合抗靶标的化合物，从而提供这样的库，其在用于鉴定目标化合物的试验中显示出较低的污染和降低的背景。在一些试验系统中，对靶标和抗靶标进行若干轮的选择和去选择(de-selection)。

[0003]污染经常是一个显著的问题。因为所述库并未耗尽常见靶标，所以产生背景噪声(background noise)。降低污染和背景噪声的方法，尤其是降低针对常见靶标的污染和背景噪声的方法，已经被开发并被并入一些方法中。在一些方法中，并入了设计用于有效地筛选出常见靶标的结合物的封闭或预清除步骤。封闭或预清除步骤可以包括，例如，与蛋白如脱脂乳蛋白或其它常见蛋白温育，因为这些蛋白包含许多常见靶标。封闭或预清除温育有时也使用温和去垢剂(例如，TWEEN-20或Triton X-100)进行。

[0004]除了各种免疫试验体系之外，已经发现这些方法在噬菌体展示方法中有用。例如，针对污染表位的封闭或预清除步骤已经被用于减少噬菌体的富集。在该方法中，噬菌体与固相预温育，但不具有特异目标靶标。然后，选择噬菌体，并随后相对于目标靶标温育。

[0005]尽管这些方法随着时间已经被改进，它们尚未证明完全成功并且常常不能最小化污染和背景噪声。在存在污染的情况下，经常难以甚至不可能区别并随后分离结合目标靶标的具体化合物。因此，在现有技术中存在克服这些污染和背景噪声问题的方法的需求。

发明概述

[0006]本发明提供筛选目标化合物的方法。具体而言，本发明提供竞争性示差筛选的方法。在一些优选的实施方式中，本方明提供了帮助紧密结合物的鉴定的竞争性示差筛选方法。在一些优选的实施方式中，本发明的方法中所使用的试剂包括紧密结合物和弱结合物。在其它实施方式中，本发明提供了采用识别和结合靶标的竞争性结合物的方法，但所述竞争性结合物具有弱于目标结合物的结合。

[0007]本发明提供了分离至少一种目标结合物的方法，包括步骤：使第一靶标与试剂的第一收集物温育，在使得所述第一收集物中的所述试剂的至少一部分结合于所述第一靶标的条件下进行，以产生第一结合的靶标；洗涤所述第一结合的靶标；洗脱所述第一结合的靶标中结合于所述靶标的所述试剂，以产生抗靶标肽的收集物；扩增所述抗靶标肽收集物，以产生扩增的抗靶标肽收集物；使所述扩增的抗靶标肽收集物和试剂的第一收集物和/或试剂的第二收集物暴露于所述第一靶标和/或暴露于第二靶标，在使得至少一部分所述试剂结合于所述第一和/或第二靶标的条件下，以产生进一步的第一结合的靶标和/或第二结合的靶标；洗涤所述进一步的第一结合的靶标和/或所述第二结合的靶标；以及区别、分离和鉴定至少一种目标结合物。在一些实施方式中，所述试剂是肽，而在其它实施方式中，所述试剂是核酸。在一些优选的实施方式中，核酸是DNA和/或RNA。在另外的实施方式中，靶标选自癌细胞、癌细胞系、癌细胞培养物、肿瘤提取物、癌组织、癌器官、癌细胞相关分子、癌细胞系相关分子、癌细胞培养物相关分子、肿瘤提取物相关分子、癌组织相关分子、以及癌器官相关分子。在进一步的实施方式中，靶标是抗原。在一些优选的实施方式中，所述抗原选自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。在一些特别优选的实施方式中，第一靶标群和第二靶标群不同。在一些实施方式中，靶标群和第二靶标群是细胞。在一些优选的实施方式中，所述第一靶标群包含正常细胞并且所述第二靶标群包含异常细胞。在一些可选的实施方式中，第二靶标群包括肿瘤细胞。在另外的实施方式中，至少其中一个步骤被重复。在进一步的实施方式中，至少其中两个步骤被重复。仍在进一步的实施方式中，所述扩增的抗靶标试剂收集物的浓度比试剂的第一收集物的浓度至少大1000倍。在一些优选的实施方式中，抗靶标试剂收集物的每一成员以这样的水平存在，该水平选自比扩增之前的水平的大大约100倍、约500倍、约1000倍、约5000倍、约10,000倍、约100,000倍和约1,000,000倍。仍在另外的优选实施方式中，所述方法进一步采用噬菌体展示。在一些噬菌体展示实施方式中，所述试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上的肽，以及所述抗靶标试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上不同的肽。在另外的噬菌体展示实施方式中，所述方法进一步包括在使扩增的收集物与所述第二靶标群以及所述试剂的第一收集物温育之前，使包含抗靶标试剂的噬菌体失活的步骤。在一些优选的实施方式中，通过将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度来进行失活。

[0008]本发明还提供了分离至少一种目标肽的方法，包括：温育野生型细胞的至少一种收集物与噬菌体展示肽的第一库，在使得所述野生型细胞的至少一部分将结合噬菌体展示肽的第一库中的至少一些成员以产生结合的细胞或未结合的噬菌体的条件下进行；在使得未结合噬菌体被除去的条件下洗涤所述结合的细胞和未结合的噬菌体；洗脱结合于结合的细胞的噬菌体，产生抗靶标肽收集物；扩增所述抗靶标肽收集物；将扩增的抗靶标肽收集物和步骤(i)的噬菌体展示肽的第一和/或第二库施用于异常细胞，在使得至少一部分异常细胞结合于抗靶标肽或噬菌体展示肽的第一和/或第二库的条件下进行，以产生具有结合的抗靶标肽和至少一种目标肽的结合的异常细胞；洗涤所述结合的异常细胞并除去未结合在所述异常细胞表面上的任何噬菌体，以留下由结合的抗靶标肽和至少一种目标肽覆盖的细胞表面；从携带抗靶标肽的异常细胞区分和/或分离携带至少一种目标肽的噬菌体；以及鉴定至少一种目标肽。在一些实施方式中，噬菌体的第一和第二收集物包含不同的基因组。仍在进一步的实施方式中，使用对噬菌体的第二收集物中的至少一部分核酸序列特异的寡核苷酸进行的扩增，进行鉴定所述肽的步骤。在一些可选的实施方式中，所述方法进一步包括使用抗微生物耐受模式区分噬菌体的第一和第二收集物的步骤。在一些可选的实施方案中，第二靶标群包括肿瘤细胞。在另外的实施方式中，至少一个步骤被重复。在进一步的实施方式中，至少两个步骤被重复。在一些另外的实施方式中，所述扩增的抗靶标噬菌体收集物的浓度比噬菌体的第二收集物的浓度大至少约1000倍。仍在进一步的实施方式中，所述方法进一步包括在使扩增的收集物与所述第二靶标群以及所述试剂的第一收集物温育之前，使包含抗靶标试剂的噬菌体失活的步骤。在一些优选的实施方式中，通过将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度来进行失活。

[0009]本发明还提供分离至少一种目标结合物的方法，所述方法包括步骤：使靶标群与试剂收集物接触，其中所述试剂收集物具有操纵浓度，在使得至少一部分所述靶标群结合于至少一部分试剂以产生具有至少一种结合物的结合的靶标群的条件下进行；洗涤所述结合的靶标群，以除去未结合于靶标群的试剂；以及区分、分离并鉴定所述至少一种结合物。在一些实施方式中，试剂是肽，而在其它的实施方式中，所述试剂是核酸。在一些优选的实施方案中，核酸是DNA和/或RNA。在另外的实施方式中，靶标选自癌细胞、癌细胞系、癌细胞培养物、肿瘤提取物、癌组织、癌器官、癌细胞相关分子、癌细胞系相关分子、癌细胞培养物相关分子、肿瘤提取物相关分子、癌组织相关分子、以及癌器官相关分子。在进一步的实施方式中，靶标是抗原。在一些优选的实施方式中，所述抗原选自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。在一些优选的实施方式中，操纵浓度为所述靶标群浓度的约1×10^-3至约1×10³倍。在一些可选的优选实施方式中，操纵浓度包含试剂多样性的下降，使得每一单独试剂的浓度增加至所述试剂期望解离常数的约1×10^-4至约1×10²倍。在一些另外的实施方式中，操纵浓度包括至少一种竞争结合物，所述竞争性结合物包括对期望的靶标具有预先确定的解离常数的结合物。在进一步的实施方式中，所述靶标群具有低浓度，其中所述低浓度在约1微摩尔浓度至约1皮摩尔浓度之间。在一些优选的实施方式中，所述方法进一步采用噬菌体展示。在一些另外的优选实施方式中，所述试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上的肽，以及所述抗靶标试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上的不同的肽。在一些可选的优选实施方式中，所述方法进一步包括在使扩增的收集物与所述第二靶标群以及所述试剂的第一收集物温育之前，使包含抗靶标试剂的噬菌体失活的步骤。在一些特别优选的实施方式中，通过将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度来进行噬菌体失活。在一些实施方式中，所述肽包括至少一种抗体，而在另外的实施方式中，所述肽包括抗体的至少一部分。仍在进一步的实施方式中，所述方法进一步包括使用对噬菌体收集物中的至少一种核酸序列特异的寡核苷酸进行PCR扩增。

[0010]本发明还提供分离至少一种目标结合物的方法，所述方法包括步骤：使靶标群与试剂收集物接触，其中所述靶标群具有低浓度，在使得至少一部分所述靶标群结合于试剂收集物的至少一部分成员的条件下进行，以产生具有至少一种目标结合物的结合的靶标，和未结合的试剂；和洗涤所述结合的靶标，以除去未结合的试剂；区分、分离并鉴定所述至少一种目标结合物。在一些实施方式中，试剂收集物包括至少一种肽，而在一些可选的实施方式中，所述试剂收集物包括至少一种核酸。在一些优选的实施方式中，所述核酸是DNA和/或RNA。在进一步的实施方式中，所述试剂收集物具有操纵浓度。在一些优选的实施方式中，所述试剂收集物的操纵浓度为所述靶标群浓度的约1×10^-3至约1×10³倍。仍然在进一步的实施方式中，操纵浓度包含试剂多样性的下降，这样，每一单独试剂的浓度增加至所述试剂期望解离常数的约1×10^-4至约1×10²倍。在一些可选的优选实施方式中，操纵浓度包括至少一种竞争结合物，所述竞争性结合物包括对期望靶标具有预先确定的解离常数的结合物。在一些另外的实施方式中，靶标选自癌细胞、癌细胞系、癌细胞培养物、肿瘤提取物、癌组织、癌器官、癌细胞相关分子、癌细胞系相关分子、癌细胞培养物相关分子、肿瘤提取物相关分子、癌组织相关分子、以及癌器官相关分子。在进一步的实施方式中，靶标是抗原。在一些优选的实施方式中，所述抗原选自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。在进一步的实施方式中，所述靶标群具有低浓度，其中所述低浓度在约1微摩尔浓度至约1皮摩尔浓度之间。在一些优选的实施方式中，所述方法进一步采用噬菌体展示。在一些实施方式中，所述试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上的肽，以及抗靶标试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上的不同的肽。在一些优的选实施方式中，在使扩增的收集物与所述第二靶标群以及所述试剂的第一收集物温育之前，所述方法进一步包括使包含抗靶标试剂的噬菌体失活的步骤。在一些特别优选的实施方式中，通过将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度和条件来进行噬菌体失活。在一些优选的实施方式中，所述肽包括至少一种抗体，而在可选的优选实施方式中，所述肽包括抗体的至少一部分。仍在另外的实施方式中，所述方法进一步包括使用对噬菌体收集物中的至少一种核酸序列特异的寡核苷酸的扩增步骤。

[0011]本发明还提供了分离至少一种目标结合物的方法，包括：使第一靶标与试剂的第一收集物接触；洗涤掉未结合于所述靶标中存在的靶分子的试剂并丢弃被洗出的试剂；洗脱结合于靶分子的试剂，以产生抗靶标肽的收集物；扩增所述抗靶标肽收集物；将所述扩增的抗靶标肽收集物和试剂的所述第一收集物和/或第二收集物施用于所述第一靶标或施用于第二靶标；洗涤掉未结合于所述第一或第二靶标中的靶分子的试剂；以及区别、分离和鉴定至少一种目标结合物。

[0012]在一些优选的实施方式中，所述试剂是肽，而在其它可选的实施方式中，所述试剂是核酸。在一些实施方式中，核酸是DNA和/或RNA。在进一步的实施方式中，靶标选自癌细胞、癌细胞系或癌细胞培养物、肿瘤提取物或癌组织或癌器官；或与癌细胞、癌细胞系或癌细胞培养物、肿瘤提取物或癌组织或癌器官相关的分子；或与癌细胞、癌细胞系、癌细胞培养物、肿瘤提取物或癌组织或癌器官相关的细胞、细胞系或细胞培养物、组织或器官。

[0013]在一些特别优选的实施方式中，靶标是抗原。在一些优选的实施方式中，所述抗原选自癌抗原，如muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。

[0014]在一些可选的优选实施方式中，第一靶标群和第二靶标群不同。在一些优选的实施方式中，第一靶标群和第二靶标群是细胞。在一些进一步优选的实施方式中，所述第一靶标群包含正常细胞并且所述第二靶标群包含异常细胞。仍在一些进一步优选的实施方式中，异常的第二靶标群包括肿瘤细胞。

[0015]在一些优选的实施方式中，所述方法进一步包括重复步骤：在温育混合物中温育所述第一靶标群和所述试剂第一收集物，随后洗涤所述温育混合物，以从所述温育混合物除去未结合的试剂。

[0016]在一些另外的优选实施方式中，所述扩增的抗靶标试剂收集物的浓度比试剂的第一收集物的浓度大至少约1000倍。在一些特别优选的实施方式中，抗靶标试剂收集物的每一成员以这样的水平存在，该水平比扩增之前它们的水平的大大约100倍、约500倍、约1000倍、约5000倍、约10,000倍、约100,000倍或约1,000,000倍。

[0017]在一些可选的优选实施方式中，本发明的方法采用噬菌体展示。在一些优选的实施方式中，所述试剂是存在于噬菌体表面上的肽，以及所述抗靶标试剂是存在于噬菌体表面上的不同的肽。在一些优选的实施方式中，所述方法进一步包括在使扩增的收集物与所述第二靶标群以及所述试剂的第一收集物温育之前，使包含抗靶标试剂的噬菌体失活的步骤。在一些优选的实施方式中，失活步骤包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。

[0018]本发明还提供分离至少一种目标肽的方法，包括：温育野生型细胞的至少一种收集物与噬菌体展示肽的第一库；洗涤掉未结合于所述野生型细胞表面上的靶分子的噬菌体；洗脱结合于靶分子的噬菌体，产生抗靶标肽收集物；扩增所述抗靶标肽收集物；将扩增的抗靶标肽收集物和噬菌体展示肽的第一和/或第二库施用于异常细胞；洗涤掉未结合于异常细胞表面上的靶分子的噬菌体，以留下由结合的抗靶标肽以及至少一种目标肽覆盖的细胞表面；从携带抗靶标肽的噬菌体区分和/或分离携带至少一种目标肽的噬菌体；以及鉴定所述至少一种目标肽。

[0019]在一些优选的实施方式中，噬菌体的第一收集物和噬菌体的第二收集物包含不同的基因组。在一些优选的实施方式中，确定来自噬菌体第二收集物的肽的身份的步骤包括使用对噬菌体的第二收集物中的核酸序列特异的寡核苷酸的PCR扩增，其中所述肽结合于在所述第二细胞群的细胞表面上表达的靶。在一些可选的优选实施方式中，使用抗微生物剂耐受性。在一些特别优选的实施方式中，通过噬菌体第一收集物给予细胞的抗微生物剂耐受模式不同于通过噬菌体第二收集物给予细胞的抗微生物剂耐受模式。

[0020]在一些另外的优选实施方式中，所述方法进一步包括重复步骤：在温育混合物中温育所述第一靶标群和所述试剂第一收集物，并洗涤所述温育混合物，以从所述温育混合物除去未结合的试剂。

[0021]在一些进一步优选的实施方式中，所述扩增的抗靶标噬菌体收集物的浓度比噬菌体的第二收集物的浓度大至少约1000倍。

[0022]仍在一些进一步的实施方式中，所述方法进一步包括在使扩增的收集物与所述第二靶标群温育以及与所述试剂的第一收集物温育之前，使包含抗靶标试剂的噬菌体失活的步骤。在一些优选的实施方式中，失活步骤包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。

[0023]本发明还提供分离至少一种目标结合物的方法，包括步骤：使靶标群与试剂收集物接触，所述试剂收集物具有操纵浓度；洗涤掉未结合于所述靶标群的试剂；以及区分、分离并鉴定所述至少一种结合物。

[0024]在一些优选的实施方式中，试剂收集物包括至少一种类型的肽。在一些可选的优选实施方式中，试剂收集物包括至少一种类型的核酸。在一些优选的实施方式中，核酸的类型是DNA和/或RNA分子。

[0025]在一些优选的实施方式中，操纵浓度为所述靶标群浓度的约1×10^-3至约1×10³倍。在一些其它优选的实施方式中，操纵浓度包含试剂多样性的下降，使得每一单独试剂的浓度增加至所述试剂期望解离常数的约1×10^-4至约1×10²倍。在一些进一步优选的实施方式中，操纵浓度包括至少一种竞争结合物。在一些特别优选的实施方式中，所述至少一种竞争性结合物包括对期望的靶标具有预先确定的解离常数的结合物。

[0026]在一些进一步优选的实施方式中，靶标群选自癌细胞、癌细胞系或癌细胞培养物、肿瘤提取物或癌组织或癌器官。在一些可选的优选实施方式中，靶标群是一组抗原。在一些特别优选的实施方式中，存在至少一种抗原，选自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。

[0027]在一些另外的优选实施方式中，靶标群具有低浓度。在一些特别优选的实施方式中，所述低浓度在约1微摩尔浓度(1e-6M)至约1皮摩尔浓度(1e-12M)之间。在一些更特别优选的实施方式中，所述浓度在约1e-7M至约1e-11M。

[0028]在一些优选的实施方式中，采用噬菌体展示进行所述方法。在一些优选的实施方式中，所述试剂的收集物包括存在于噬菌体表面上的至少一种类型的肽。在一些可选的优选实施方式中，所述肽包括至少一种抗体。仍在一些另外的优选实施方式中，所述方法进一步包括使噬菌体失活，其中失活发生在使噬菌体与靶标收集物和包含试剂收集物的噬菌体温育之前。在一些优选的实施方式中，所述失活步骤包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。在一些特别优选的实施方式中，使用对噬菌体收集物中的核酸序列特异的寡核苷酸进行PCR扩增。

[0029]本发明还提供分离至少一种目标结合物的方法，所述方法包括步骤：使靶标群与试剂收集物接触，所述试剂收集物具有低浓度；洗涤掉未结合于所述靶标群的试剂；以及区分、分离并鉴定所述至少一种目标结合物。

[0030]在一些优选的实施方式中，试剂收集物包括至少一种类型的肽，而在一些可选的优选实施方式中，所述试剂收集物包括至少一种类型的核酸。在一些优选的实施方式中，所述核酸是DNA和/或RNA分子。

[0031]在一些优选的实施方式中，试剂收集物具有操纵浓度。在一些可选的优选实施方式中，所述操纵浓度为所述靶标群浓度的约1×10^-3至约1×10³倍。在一些另外的优选实施方式中，操纵浓度包含试剂多样性的下降，使得每一单独试剂的浓度增加至所述试剂期望解离常数的约1×10^-4至约1×10²倍。在一些进一步优选的实施方式中，操纵浓度包括至少一种竞争结合物，其中所述至少一种竞争性结合物包括对期望靶标具有预先确定的解离常数的结合物。

[0032]在一些优选的实施方式中，靶标群选自癌细胞、癌细胞系或癌细胞培养物，肿瘤提取物或癌组织或癌器官。在一些可选的优选实施方式中，靶标群是一组抗原。在一些特别优选的实施方式中，至少一种抗原选自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。

[0033]在一些优选的实施方式中，所述靶标群具有低浓度，所述低浓度在约1微摩尔浓度(1e-6M)至约1皮摩尔浓度(1e-12M)之间。在一些特别优选的实施方式中，该范围包括在约1e-7至约1e-11之间的任何浓度。

[0034]在一些优选的实施方式中，试剂收集物包括至少一种类型的肽，而在一些可选的优选实施方式中，所述试剂收集物包括至少一种类型的核酸。在一些优选的实施方式中，所述核酸是DNA和/或RNA。

[0035]在一些进一步优选的实施方式中，采用噬菌体展示进行所述方法。在一些优选的实施方式中，所述试剂收集物是存在于噬菌体表面上的至少一种类型的肽。在一些可选的优选实施方式中，所述肽包括抗体的至少一个部分。在一些进一步优选的实施方式中，所述方法进一步包括使噬菌体失活，其中失活发生在使噬菌体与靶标收集物和包含试剂收集物的噬菌体温育之前。在一些优选的实施方式中，所述失活步骤包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。一些可选的优选实施方式进一步包括使用对噬菌体收集物中的核酸序列特异的寡核苷酸的PCR扩增。

附图说明

[0036]图1提供了显示文库成员P1和P2之间竞争的图，两者都以1^-10M的浓度存在，其中结合靶标(target-bound)的P1和P2(分别为TP1和TP2)的浓度被绘制为靶标浓度(T₀)的函数。P1和P2的解离常数分别为Kd1＝1^-10M、Kd2＝1^-7M。x轴表示靶标浓度(摩尔浓度)，而y轴表示结合靶标的成员的浓度(摩尔浓度)。如该图所示，结合的文库成员的量是解离常数和靶标浓度的函数。

[0037]图2提供了文库(每一成员都以1^-10M的浓度存在)的每一结合的成员(TPi)的作为靶标浓度函数的浓度，其中，1种结合物(P1)，Kd＝1^-12M(with 1 binder(P1)at Kd＝1^-12M)；10种结合物(P2)，Kd＝1^-11M；100种结合物(P3)，Kd＝1^-10M；1000种结合物(P4)，Kd＝1^-9M；10,000种结合物(P5)，Kd＝1^-8M。x轴表示靶标浓度(摩尔浓度)，而y轴表示结合靶标的成员的浓度(摩尔浓度)。如该图所示，对于具有成员P1至P5的文库，结合的文库成员的量是解离常数和靶标浓度的函数。

[0038]图3提供了文库(每一成员都以1^-10M的浓度存在)的每一结合的成员TPi的作为靶标浓度函数的浓度，其中，1种结合物(P1)，Kd＝1^-12M；10种结合物(P2)，Kd＝1^-11M；100种结合物(P3)，Kd＝1^-10M；1000种结合物(P4)，Kd＝1^-9M；10,000种结合物(P5)，Kd＝1^-8M。所有的条件与图2相同，除了以1^-4M的浓度加入Kd＝1^-8M的1种另外的竞争结合物(P6)。x轴表示靶标浓度(摩尔浓度)，而y轴表示结合靶标的成员的浓度(摩尔浓度)。如该图所示，对于具有成员P1至P5的文库，结合的文库成员的量是解离常数和靶标浓度的函数。

[0039]图4提供了结合的噬菌体对靶标浓度的图。该图显示了噬菌体文库(每一成员都以1^-13M的浓度存在)的每一结合的成员(TPi)的浓度，其中，1种结合物(P1)，Kd＝1^-10M；5种结合物(P2)，Kd＝5^-10M；25种结合物(P3)，Kd＝2.5^-9M；50种结合物(P4)，Kd＝5^-9M；100种结合物(P5)，Kd＝1^-8M(并且无其它结合物)。x轴表示靶标浓度(摩尔浓度)，而y轴表示结合靶标的成员的浓度(摩尔浓度)。如该图所示，对于具有成员P1至P5的典型噬菌体文库，结合的文库成员的量是解离常数和靶标浓度的函数。

[0040]图5提供了结合的噬菌体对靶标浓度的图。该图显示了噬菌体文库(每一成员都以1^-13M的浓度存在)的每一结合的成员(TPi)的浓度，其中，1种结合物(P1)，Kd＝1^-10M；5种结合物(P2)，Kd＝5^-10M；25种结合物(P3)，Kd＝2.5^-9M；50种结合物(P4)，Kd＝5^-9M；100种结合物(P5)，Kd＝1^-8M(并且无其它结合物)。条件与图4所示相同，除了以1^-4M的浓度存在1个另外的竞争性非噬菌体结合物(P6)(1^-8MKd)。x轴表示靶标浓度(摩尔浓度)，而y轴表示结合靶标的成员的浓度(摩尔浓度)。该图显示，结合的文库成员的量是解离常数和具有成员P1至P5和一个添加的竞争性结合物的典型噬菌体文库的靶标浓度的函数。

[0041]图6提供了显示洗脱对滞留的竞争性结合图。图6A显示悬浮在溶液中的结合物，而图6B显示了结合于靶标的结合物，以及图6C显示了结合于靶标的一些结合物。表示了三种不同类型的结合物，并且所有三种类型要求相同量的时间，以结合于靶标(大约10秒)，但三种结合物的每一种具有不同的解离速率(off-rate)。具有1分钟解离速率的结合物由八边形表示；有30个这样的结合物被描绘。

[0042]具有10分钟解离速率的结合物由三角形表示；有10个这样的结合物被描绘。具有100分钟解离速率的结合物由倾斜45度的正方形表示；存在5个这样的结合物被描绘。靶标在图的底部被显示为“X”。因此，总而言之，图6显示了三类结合物结合至固定的靶标上。

[0043]图7显示了降低靶标浓度的影响。图7A显示悬浮在溶液中的结合物，而图7B显示了结合于靶标的结合物。具有最慢的解离速率的分子(具有最低浓度的两类分子)是结合的。图7C显示了一些结合物，仅仅具有最慢解离速率(处于最低浓度)的结合物与靶标结合。表示出三种不同类型的结合物，并且所有三种类型要求相同量的时间，以结合于靶标(大约10秒)，但三种结合物的每一种具有不同的解离速率。具有1分钟解离速率的结合物由八边形表示；存在30个这样的结合物被描绘。具有10分钟解离速率的结合物由三角形表示；存在10个这样的结合物被描绘。具有100分钟解离速率的结合物由倾斜45度的正方形表示；存在5个这样的结合物被描绘。靶标在图的底部被显示为“X”。因此，图7显示提供了例子，即当靶标的量有限或被降低时，三类结合物结合至固定的靶标。

[0044]图8显示了向文库加入竞争性结合物的影响。图8A显示悬浮在溶液中的结合物，而图8B显示了竞争性结合，涉及以高浓度和慢解离速率结合于靶标的结合物。在文库中存在四种不同类型的结合物。尽管所有四种类型要求相同量的时间以结合于靶标(大约10秒)，但三种结合物的每一种具有不同的解离速率。具有1分钟解离速率的结合物由八边形表示；存在30个这样的结合物被描绘。具有10分钟解离速率的结合物由等腰三角形和长三角形表示；其中10个结合物由等腰三角形表示，以及50个结合物由长三角形表示。具有100分钟解离速率的结合物由倾斜45度的正方形表示；存在5个这样的结合物被描绘。靶标在图的底部被显示为“X”。因此，该图显示，当竞争结合物有限时，三类结合物结合至固定的靶标。

[0045]图9提供了操纵浓度的计算结果或提供操纵浓度的计算结果。给定文库浓度(摩尔浓度)(以及该文库结合靶标的平均结合能(ΔG：千卡/摩尔))，在平均值的每一标准偏差内的文库成员P1-P8的期望数从二项(正态)分布计算。计算出每一成员的平均结合能，并且计算每一成员的解离常数K_D＝e^ΔG/RT。具有弱于或等于所述平均值的结合能的所有文库成员被集中成一组。

[0046]图10提供了多肽文库的样品计算的例子以及从这些计算得到的图表，所述多肽文库具有7个完全改变的氨基酸位置。图10A提供了具有7个氨基酸的多肽的样品计算的例子，而图10B提供了基于上述计算预测标准偏差的曲线，图10C提供根据上面的计算绘制的不含竞争物下结合的文库成员对靶标的图，图10D提供根据上面的计算绘制的含竞争物下结合的文库成员对靶标的图，以及图10E组合图10C和10D的图。

[0047]图11提供来自蛋白质文库的hSC胰凝乳蛋白酶抑制剂的质谱筛选的层析图，如实施例3所描述。

[0048]图12提供hSC胰凝乳蛋白酶结合物的MS/MS测序，如实施例3所描述。图12A显示结合物pj01，而图12B显示结合物pj02。

[0049]图13提供二级功能性筛选(secondary functional screening)并从抑制剂区分出结合物，通过质谱筛选hSC胰凝乳蛋白酶抑制剂，如实施例3所描述。

发明描述

[0050]本发明提供筛选目标化合物的方法。具体而言，本发明提供竞争性示差筛选的方法。在一些优选的实施方式中，本方明提供了帮助紧密结合物的鉴定的竞争性示差筛选方法。在一些优选的实施方式中，本发明的方法中所使用的试剂包括紧密结合物和弱结合物。在其它实施方式中，本发明提供了采用识别和结合靶标的竞争性结合物的方法，但所述竞争性结合物具有弱于目标结合物的结合。

定义

[0051]除非在本文中另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关的技术领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，2d Ed.，John Wiley和Sons，NY(1994)；以及Hale和Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)为本领域技术人员提供本发明中使用的许多术语的通用诠释。广为本领域技术人员所知的另外的参考资料包括Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork[1989]，以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene-Publishing & Wiley Interscience NY(1987；1999年增补)。

[0052]尽管与本文中描述的那些相似或等同的各种方法和材料在本发明的实践中发现有用，但优选的方法和材料在本文中被描述。因此，通过从整体上参考说明书，下面即将定义的术语被更充分描述。同样，如本文所使用，单数“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数涵义，除非上下文另外清楚地指出。

[0053]一般地，所使用的命名法，以及标准实验室步骤例如细胞培养、分子遗传学、以及核酸化学和杂交，在本领域中是熟知的并被广泛使用的。标准技术被用于重组核酸方法、多核苷酸合成、微生物培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、转导、分析化学、有机合成化学、化学合成和化学分析。通常，根据制造商的说明书，进行酶反应和纯化和/或分离步骤。

[0054]术语“试剂(agent)”指任何结合物(binder)(例如，肽、多肽、蛋白质或核酸)，其结合靶标上或靶标内的靶分子。核酸可以是DNA和/或RNA。在任一情况下，核酸可以是单链或双链的。该术语包括识别特定靶分子的配体，以及肽衍生物、肽模拟物、拟肽、有机小分子、碳水化合物，和从候选混合物中分离的其它分子，所述候选混合物以期望的方式作用于靶分子。如本文所使用，术语“试剂”不限于特定的分子大小或组成特征。在一些实施方式中，试剂作为酶催化反应的底物，而在其它实施方式中，试剂是激动剂、拮抗剂和/或信号信使。在一些实施方式中，试剂刺激或抑制代谢通路。在另选的实施方式中，试剂是表达在噬菌体表面上的肽或多肽，作为噬菌体被壳蛋白的一部分，如噬菌体展示筛选法所常规进行的。

[0055]在有些实施方式中，试剂结合靶分子。在有些实施方式中，试剂催化性地改变靶分子。类似地，在可选的实施方式中，试剂与靶分子反应，导致靶分子的修饰或变化。在又一个实施方式中，试剂被修饰，以促进试剂或试剂-靶标分子复合物的分离。在另外的实施方式中，“标记(tag)”(例如生物素)被连接在试剂或靶标上的至少一个位置中，以帮助使用链霉抗生物素分离新的、结合的试剂-靶标复合物。在可选的实施方式中，试剂被连接于螯合化合物或金属，使得促进通过螯合或磁场进行的分离。在还有一个实施方式中，试剂被直接或间接链接于报告分子或另一个标记物。在另外的实施方式中，试剂被修饰或被操纵，从而改变它们的形状或构象。仍在进一步的实施方式中，试剂对于靶分子具有这样的结合亲和力，该亲和力在抗体对于选择的配体的结合亲和力的典型范围的某处。

[0056]试剂(或抗试剂(反试剂，anti-agent))对其靶标(或抗靶标(反靶标，anti-target))的结合亲和力经常用解离常数(Kd)，50％有效结合所需的浓度(EC50)，或对结合至所述靶标的另一化合物的结合50％抑制所需的浓度(IC50)描述。Ko由k_off/k_on定义。k_off值定义靶标/配体复合物断裂开或分离的速率；k_on值描述试剂和靶标分子结合以形成试剂-靶标分子复合物的速率。结合亲和力术语在本领域中有时指试剂-靶标分子复合物的动力学稳定性或反映亲和力比率的任何其它可测量的量的比率。选择性或者通过结合亲和力的比率或者通过试剂-复合物的解离速率的比率(例如，靶分子Kd/抗靶分子Kd)来定义。在一些实施方式中，期望增加k_on，而在其它实施方式中，期望降低k_off，以及在进一步的实施方式中，期望增加k_on并降低k_off。

[0057]如本文所使用，“抗靶标(anti-target)”是指之前已被鉴定为结合靶标并通常被扩增，产生结合物收集物的试剂。在一些实施方式中，抗靶标是核酸(单链或双链DNA和/或RNA)。在本文中，为了方便起见，术语“试剂(agent)”被用在下面的实施例中，既指“试剂”(即，结合靶分子的分子)，又指“抗靶标剂”(抗靶标试剂)。因此，“试剂”包括识别特定靶标的配体或抗靶标分子。

[0058]如本文所使用，“收集物(collection)”指一组将被观察、研究、使用和/或保持在一起的对象。因此，该术语包括试剂收集物，其中靶标群被暴露于此试剂收集物。

[0059]如本文所使用，“类型(type)”是指可以与其它试剂区分开的试剂。在一些优选的实施方式中，类型通过结合亲和力或Kd与另一类型的试剂通过其结合亲和力区分开。作为非限制性例子，在本发明的一些实施方式中，三种不同类型的结合物包括三类大概具有三种不同结合亲和力的试剂。类型的一个图示例子提供在图中(例如，图7显示三种类型的结合物，具有1分钟解离速率的结合物，具有10分钟解离速率的结合物，和具有100分钟解离速率的结合物)。

[0060]如本文所使用，“目标蛋白质(protein of interest)”指被分析、鉴定和/或修饰的蛋白质。发现天然发生的蛋白以及重组蛋白在本发明中有用。

[0061]如本文所使用，“蛋白质(protein)”是指由氨基酸组成并被本领域技术人员承认为蛋白质的任何成分。术语“蛋白质”、“肽(peptide)”和多肽(polypeptide)在本文中可互换使用。其中肽是蛋白质的一部分，本领域的普通技术人员理解该术语在上下文中的用途。术语“蛋白质”包括成熟形式的蛋白，以及相关蛋白的原-(pro-)形式和前原-(prepro-)形式。蛋白质的前原形式包括具有可操纵性连接到蛋白质的氨基端的原序列(prosequence)的蛋白质的成熟形式，以及可操纵性连接到所述原序列的氨基端的“前”或“信号”序列。该术语意欲于还包括这样的序列如抗体的序列。

[0062]具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。如本领域所知，标准三字母或单字母氨基酸缩写在本文中被使用。等价的取代可以被包括在权利要求的范围内(例如，氨基酸取代相同组的另一氨基酸)。

[0063]在一些实施方式中，本发明的肽、多肽和/或蛋白质包括一个或多个非典型氨基酸。总体上说，“非典型氨基酸(non-classical amino acid)”通常包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸(4-Abu)、2-氨基丁酸(2-Abu)、6-氨基己酸(Ahx)、2-氨基异丁酸(2-Aib)、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、“设计师(designer)”氨基酸例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。

[0064]如本文所使用的“抗体(anibody)”(Ab)和“免疫球蛋白(Immunoglobulin)”(IgG)，指被定义为人和其它动物的B细胞和浆细胞产生的糖蛋白，其高特异性地结合抗原(通常但并不总是肽)或结构上相似的抗原，所述抗原导致抗体的产生。抗体可以通过任何已知的方法产生并且可以是多克隆或单克隆抗体。该术语还包括结合抗原的嵌合抗体、人源化抗体、免疫球蛋白或抗体或抗体的功能性片段。此类功能性部分的例子包括完整的抗体分子、抗体片段，例如Fv、单链Fv、互补决定区(CDRs)、V_L(轻链可变区)、V_H(重链可变区)、以及这些物质或能够结合靶抗原的免疫球蛋白肽的任何其它功能部分的任意结合。

[0065]本发明所使用的抗体可以使用各种免疫原制备。本领域已知的各种方法可以被用于多克隆抗体的生产。在一些制备抗体的实施方式中，通过注射相应于本发明的感兴趣靶标的肽，对不同的宿主动物(包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等)进行免疫。在一些优选的实施方式中，所述肽被偶联于免疫原载体(例如，白喉毒素、牛血清白蛋白(BSA)、或匙孔血蓝蛋白[MLH])。取决于宿主物种，各种佐剂可以被用于增加免疫应答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、以及潜在有用的人佐剂例如BCG(卡介苗(Bacille Calmette-Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。

[0066]为制备单克隆抗体，可以使用通过培养中的连续细胞系产生抗体分子的任何技术(参见，例如Harlow和Lane， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。这些技术包括但不限于最初由Khler和Milstein开发的杂交瘤技术(Khler和Milstein，Nature 256：495-497[1975])，以及三体瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(参见，例如Kozbor等人，Immunol.Today4：72[1983])，和用于产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见，例如Cole等人，在 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96[1985])。在本发明的一些特别优选的实施方式中，本发明提供IgG类的单克隆抗体。

[0067]在本发明的另外的实施方式中，在无菌动物中生产单克隆抗体(参见，例如PCT/US90/02545)。根据本发明，发现人抗体有用，并可以使用人杂交瘤(参见，例如Cote et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030[1983])或通过用EBV病毒体外转化人B细胞(参见，例如Cote et al.，见上)而获得。

[0068]发现描述单链抗体的产生的技术(美国专利4,946,778，并入本文作为参考)在产生特异识别目标分子的单链抗体中有用。在一些实施方式中，描述用于构建Fab表达文库的技术(例如，参见Huse et al，Science 246：1275-1281[1989])被用于允许迅速而容易地鉴定具有期望特异性的单克隆Fab片段。

[0069]含有抗体分子的独特型(抗原结合区)的抗体片段可以通过已知的技术产生。例如，此类片段包括但不限于：可以通过胃蛋白酶消化抗体分子而制备的F(ab′)2片段；可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生的Fab′片段，以及可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而得到的Fab片段。

[0070]在抗体的产生中，可以通过本领域已知的技术实现对期望抗体的筛选(例如，放射免疫测定、ELISA[酶联免疫试验]、“夹心”免疫试验、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散试验、原位免疫分析[例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记])、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集试验(例如凝胶凝集试验、血凝集试验等)、补体固定试验、免疫荧光测定、蛋白质A测定和免疫电泳试验等。

[0071]在一个实施方式中，通过检测一抗上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方式中，通过检测二抗或反应物与一抗的结合来检测一抗。在进一步的实施方式中，二抗被标记。许多手段在本领域中已知用于检测免疫试验中的结合，并在本发明的范围内。

[0072]如本文所使用，“染色(staining)”指本领域的普通技术人员已知的任何数量的过程，其被用于更好显现细胞或多个细胞的具体成分(多个成分)和/或特征(多个特征)。

[0073]如本文所使用，术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”被定义为由两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子。确切的大小取决于许多因素，其反过来取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何合适的方法制备，包括，例如，适宜的序列的克隆和限制以及通过本领域已知的任何合适的方法进行直接化学合成，例如磷酸三酯法(参见Narang et al.，Meth.Enzymol.，68：90-99[1979])；磷酸二酯法(例如参见Brown et al，Meth.EnzymoL，68：109-151[1979])；二乙基亚磷酰胺酯法(diethylphosphoramidite method)(参见Beaucage et al.，Tetrahedron Lett.22：1859-1862[1981])，以及固相支持体法(solid support methods)(例如参见美国专利第4,458,066号)。有关合成方法的多个有用的综述对于本领域技术人员是已知的(例如参见Goodchild，1990，Bioconjugate Chemistry1(3)：165-187[1990])。上述参考文献被并入本文作为参考。

[0074]

[0075]如本文所使用，术语“拟肽(peptoid)”是指抗酶促肽类似物(enzymaticallyresistant peptide analog)。

[0076]如本文所使用，术语“接触(contact)”和“暴露(expose)”意指使试剂的收集物和靶标分子处于极为接近或紧密联系中并包括体内和体外接触。该术语包括接触(touching)、偶联(associating)、结合(joining)或组合(combining)。该术语也被用于与抗靶标有关。

[0077]术语“分离(separating)”意指选择、分开(segregate)、分割(partition)、分离(isolation)、收集(collect)、保持分开(keep apart)和使分离(disunite)。

[0078]术语“扩增(amplifying)”和“扩增(amplify)”是指任何方法或方法步骤的组合，其增加分子或一类分子的拷贝量或拷贝数。作为例子，在一些实施方式中，试剂或抗靶标试剂的收集物的每一成员以这样的水平存在，该水平比扩增之前的水平高约100倍、约500倍、约1000倍、约5000倍、约10,000倍、约100,000倍或约1,000,000倍。

[0079]术语“低浓度(low concentration)”指靶标的浓度，其比通过计算文库成员与靶标的期望解离常数而获得的浓度高约1,000倍至底约10倍。低浓度可以是例如在文库成员与靶标结合的期望解离常数的约10倍或以下时的浓度。在一些实施方式中，优选的浓度在约1微摩尔浓度(1e-6M)和约1皮摩尔浓度(1e-12M)之间，优选约1e-7和1e-11之间的任何浓度。

[0080]如本文所使用，“操纵浓度(manipulated concentration)”是指已经被操纵以达到本发明的期望效应的浓度，尤其是靶标群的浓度。在一些实施方式中，操纵包括增加或降低靶标群的浓度，例如，使得靶标群具有与其它浓度成比例相关的浓度。在一些实施方式中，操纵浓度包括增加的文库浓度、文库多样性的降低——其增加文库的每一成员的浓度、和/或降低的靶标浓度。

[0081]术语“正常的(normal)”指实体处于没有可观察和/或可检测的异常或缺陷的状态。因此，正常细胞是这样的细胞，其符合或遵循典型的、标准的表达模式、表达水平，与其自身类型的未改变细胞的表型和基因型一致。相反地，“异常的(abnormal)”意指非典型的、不常见的或非正规的、不正常的。因此，病态的细胞是“异常的”细胞类型。

[0082]术语“靶标(target)”指目标物质，而该目标物质被暴露于根据本发明的试剂或试剂群。在一些实施方式中，靶标被温育一段期望的时期。

[0083]在另外的实施方式中，生物表面是器官的表面，而在可选的实施方式中，生物表面是细胞或组织的表面。在一些进一步的实施方式中，生物表面是患病器官、组织或细胞的表面，而在一些可选的实施方式中，生物表面是正常或健康器官、组织或细胞的表面。

[0084]仍在进一步的实施方式中，所述表面是组织胞间隙中的大分子。在另外的实施方式中，生物表面是微生物的表面，微生物包括但不限于细菌、真菌、病毒、寄生物(蠕虫、原生动物等)。在一些实施方式中，微生物是动物病原体，而在其它实施方式中，微生物对人和/或其它动物是非致病性的。细胞和/或组织的来源包括人、非人类动物、细菌、真菌和植物。

[0085]因此，预期任何生物表面(例如，细胞、组织、皮肤、指甲、内部器官、外部器官和/或毛发)将发现在本发明中可用作靶标。在一些实施方式中，细胞是人细胞，而在可选的实施方式中，所述细胞是非人类动物细胞、细菌细胞、或真菌细胞。该术语也包括含有病毒和/或病毒颗粒的细胞。在一些实施方式中，细胞是造血细胞、癌细胞、或逆转录病毒介导的转导细胞。

[0086]在可选的实施方式中，所述靶标是血细胞，包括造血细胞(例如，造血干细胞)，以及在红细胞系、血小板系和白细胞系中的各种未成熟细胞。“血细胞(bloodcells)”包括但不限于造血细胞、红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞、浆细胞、肥大细胞、巨噬细胞和天然杀伤细胞。在一些实施方式中，所述靶标是异常的血细胞。在一些实施方式中，HSC靶标具有CD34⁺Thy-1⁺或CD34⁺Thy-1⁺Lin^-的表面抗原表达模式(“Lin^-”指基于缺乏至少一种谱系特异性标记的表达而选择的细胞群)。分离和选择HSCs的方法在本领域中是熟知的(参见例如美国专利第5,061,620、5,677,136和5,750,397号，每一个专利被完整引入本文)。

[0087]在其它实施方式中，所述靶标是分子。在一些实施方式中，所述分子是有机分子。在进一步的实施方式中，所述分子是生物分子。在另外的实施方式中，所述生物分子是细胞相关分子。仍在进一步的实施方式中，所述细胞相关分子与细胞的外表面偶联。在一些实施方式中，所述细胞相关分子是胞外基质的一部分。在一些另外的实施方式中，所述细胞相关分子是蛋白质。在一些实施方式中，所述蛋白质是受体。在另外的实施方式中，所述细胞相关分子对特定细胞类型具有特异性。在进一步的实施方式中，所述细胞是病态和/或异常细胞。在一些优选的实施方式中，所述病态细胞是癌细胞。在另一个实施方式中，所述病态细胞是受感染的细胞。在本发明中发现作为靶标有用的另外的分子包括但不限于蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂类、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、毒性物质、代谢物、抑试剂、药物、染料、营养物和生长因子。

[0088]本发明所包含的蛋白质和化学靶标的非限定性例子包括趋化因子和细胞因子以及它们的受体。如本文所使用，术语“细胞因子(cytokine)”是指众多对细胞施加各种效应(例如，诱导生长、分化和/或增殖)的因子中的任何一种。非限制性例子包括白介素(IL)，例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14和IL-16；可溶性IL-2受体；可溶性IL-6受体；红细胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干细胞因子(SCF)；白血病抑制因子(LIF)；干扰素(例如，IFN-α、-β、-γ)；制瘤素M(OM)；免疫球蛋白超家族；肿瘤坏死因子(TNF)家族，尤其是TNF-α；转化生长因子，(例如，TGF-α和TGF-β)；和IL-α；和血管内皮生长因子(VEGF)家族，尤其是VEGF(在本领域中也称为VEGF-A)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PLGF)。从多个销售商可以商业获得细胞因子，包括Amgen(Thousand Oaks，CA)、Immunex(Seattle，WA)和Genentech(South San Francisco，CA)。

[0089]如本文所使用，术语“组织(tissue)”指一组或一层相似特化的细胞，其一起执行某些特化的功能。在一些组织中，仅存在一种类型的细胞，而在其它组织中，存在不同类型的细胞。该术语包括但不限于淋巴组织、淋巴结样组织、脂肪组织、骨(bony)组织、蜂窝(aerolar)组织、软骨组织、结缔组织、弹性组织、内皮组织、上皮组织、纤维组织、腺组织、肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid，GALT)、未分化(indifferent)组织、间质组织、网状组织、间充质组织、骨髓组织、肌肉组织、神经组织、骨(osseous)组织、骨骼组织、皮下组织和其它组织类型。如本文所使用，该术语还可以包括修饰的组织。

[0090]术语“靶标群(target population)”指感兴趣的靶标的收集物，试剂或试剂群被暴露于该感兴趣的靶标的收集物。靶标群可以包括单靶标或靶标的集合，如本文所述。生物表面的任何收集物，包括但不限于细胞、组织、皮肤、指甲和/或毛发，发现在本发明中作为靶标群有用。

[0091]在一些实施方式中，靶标群包括一组癌细胞、癌细胞系或癌细胞培养物，肿瘤提取物或癌组织或癌器官；与癌细胞、癌细胞系或癌细胞培养物，肿瘤提取物或癌组织或癌器官相关的分子；或与癌细胞、癌细胞系或癌细胞培养物，肿瘤提取物或癌组织或癌器官相关的细胞、细胞系或细胞培养物、组织或器官。在一些实施方式中，靶标群包括抗原或抗原收集物本身。靶标群的非限制例子可以在以下找到。

[0092]在一些优选的实施方式中，所述靶标是“癌症相关靶标”。该术语包括任何靶标，其中，作为有机体中癌症或癌症相关症状的诊断或检测的一部分，本发明的组合物与所述靶标结合。例如，该术语包括癌细胞、癌组织和/或癌器官；与癌细胞、癌组织和/或癌器官相关的分子；和/或与癌细胞、癌组织和/或癌器官相关的分子、细胞、组织或器官(例如，施用于对象的结合肿瘤的诊断分子)以及从对象取出的活组织检查样品，或健康组织(例如，与癌性组织相关的脉管系统)。癌症相关靶标的例子被提供在美国专利第6,261,535，号中，该专利被全部并入本文作为参考。然而，本发明不意欲限制于任何具体的癌症相关靶标。所述癌症相关靶标可以与任何癌症或癌症相关状态有关。癌症类型的例子包括但不限于癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、和混合类型的癌症。

[0093]术语“分子(molecule)”指靶分子(例如，抗原或配体)、试剂和/或抗靶标分子。合适的试剂、靶标分子和抗靶标分子包括但不限于蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂类、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、致病原、毒性物质、代谢物、抑试剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞或组织。

[0094]本发明提供竞争性示差筛选试验。本发明增加在最后一轮的筛选和洗脱之后获得的特异性结合至特定靶标的试剂的比例。这增加靶表面上或悬浮液中期望靶分子与非期望分子(例如抗靶标分子)的信噪比(signal-to-noise)，使得至少一种试剂(例如结合物)通过使用筛选试验而被分离。结果，所述试验促进更高质量和更紧密结合物的分离。

发明详述

[0095]本发明提供筛选目标化合物的方法。具体而言，本发明提供竞争性示差筛选的方法。在一些优选的实施方式中，本方明提供了促进紧密结合物的鉴定的竞争性示差筛选方法。在一些优选的实施方式中，本发明的方法中所使用的试剂包括紧密结合物和弱结合物。在其它实施方式中，本发明提供了采用识别和结合靶标的竞争性结合物的方法，但所述竞争性结合物具有不强于目标结合物的结合。

[0096]特别优选的实施方式，本发明提供手段，该手段增加在最后一轮的筛选和洗脱之后获得的特异性结合至特定靶标的试剂的比例。这增加靶表面上或悬浮液中期望靶分子与非期望抗靶标分子的信噪比，从而帮助至少一种结合物的分离。

[0097]在一些实施方式中，本发明提供分离至少一种目标结合物的方法，所述方法包括步骤：使靶标群与试剂收集物接触，所述试剂收集物具有操纵浓度；洗涤掉未结合于所述靶标群的试剂；以及区分、分离并鉴定所述至少一种目标结合物。

[0098]在一些实施方式中，本发明提供了分离至少一种目标结合物的方法，包括：使第一靶标与试剂的第一收集物接触；洗涤掉未结合于在所述靶标中存在的靶分子的试剂，并丢弃被洗出的试剂；洗脱结合于靶分子的试剂，以产生抗靶标肽的收集物；扩增所述抗靶标肽收集物；将所述扩增的抗靶标肽收集物和试剂的第一收集物或第二收集物施用于所述第一靶标或施用于第二靶标；洗涤掉未结合于所述第一或第二靶标中的靶分子的试剂；以及区别、分离和鉴定所述至少一种目标结合物。

[0099]在可选的实施方式中，本发明提供分离至少一种目标结合物的方法，所述方法包括步骤：使靶标群与试剂收集物接触，所述试剂收集物具有操纵浓度；洗涤掉未结合于所述靶标群的试剂；以及区分、分离并鉴定所述至少一种目标结合物。在一些优选的实施方式中，所述试剂收集物包括至少一种类型的肽。在进一步优选的实施方式中，所述试剂收集物包括至少一种类型的核酸。在另一个优选的实施方式中，所述核酸类型是DNA或RNA分子。

[0100]在一些优选的实施方式中，操纵浓度为所述靶标群浓度的约1×10^-3至约1×10³倍。在一些可选的优选实施方式中，操纵浓度包含试剂多样性的下降，使得每一单独试剂的浓度增加至所述试剂期望解离常数的约1×10^-4至约1×10²倍。在优选的实施方式中，操纵浓度包括至少一种竞争结合物，所述至少一种竞争性结合物包括对期望靶标具有预先确定的解离常数的结合物。预期本领域已知的用于操纵所述浓度的任何合适的方法将发现在本发明中有用。

[0101]在一些优选的实施方式中，所述试剂收集物包括至少一种类型的肽。在其它优选的实施方式中，所述试剂收集物包括至少一种类型的核酸。仍在另一个优选的实施方式中，所述核酸类型是DNA或RNA分子。

[0102]在一些优选的实施方式中，靶标群是一组靶标(例如，一组细胞或核酸)，其每一成员包含至少一种靶标或靶分子。在一些优选的实施方式中，所述靶标群包括癌细胞、癌细胞系、癌细胞培养物，肿瘤提取物或癌组织或癌器官；与癌细胞、癌细胞系或癌细胞培养物，肿瘤提取物或癌组织或癌器官相关的分子；或与癌细胞、癌细胞系或癌细胞培养物，肿瘤提取物或癌组织或癌器官相关的细胞、细胞系或细胞培养物、组织或器官。

[0103]在一些实施方式中，所述靶标群包括至少一种表面或一组表面。在一些优选的实施方式中，所述表面是生物表面。在其它实施方式中，所述生物表面是器官的表面。在进一步的实施方式中，所述生物表面是组织的表面。在另外的实施方式中，所述生物表面是细胞的表面。在还有进一步的实施方式中，所述生物表面是病态器官、组织或细胞的表面。在其它实施方式中，所述生物表面是正常或健康器官、组织或细胞的表面。在另外的实施方式中，所述表面是组织胞间隙中的大分子。在其它实施方式中，所述生物表面是非致病原或致病原的表面。在进一步的实施方式中，所述表面是非生物表面。在一些实施方式中，所述非生物表面是医疗设备的表面。在另外的实施方式中，所述医疗设备是治疗性设备。还在另外的实施方式中，所述治疗性设备是植入的治疗性设备。在仍进一步的实施方式中，所述医疗设备是诊断性设备。在其它实施方式中，所述诊断性设备是孔或盘。

[0104]在另外的实施方式中，所述靶标群是癌症相关的。在一些实施方式中，所述癌症相关靶标群包括任何靶标群，作为癌症或癌症相关症状的诊断或检测的一部分，试剂收集物与所述靶标群结合(例如，癌细胞、组织或器官；与癌细胞、组织或器官相关的分子；或与癌细胞、组织或器官相关的分子、细胞、组织或器官；也参见美国专利第6,261,535，号，该专利被全部并入本文作为参考)。在一些实施方式中，所述癌症相关靶标群与任何癌症或癌症相关状态有关。癌症类型的例子包括癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合类型的癌症。

[0105]在一些实施方式中，所述癌症是骨癌。例子包括，但不限于，尤文肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤和其它软组织肉瘤。在其它实施方式中，所述癌症是神经系统癌，包括但不限于脑肿瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜细胞瘤、脑膜瘤、淋巴瘤、施旺细胞瘤和成神经管细胞瘤。在另外的实施方式中，所述癌症是乳腺癌(例如，乳腺中的原位导管癌)。在进一步的实施方式中，所述癌症是前列腺癌。在仍进一步的实施方式中，所述癌症是内分泌系统癌症(例如，肾上腺、胰腺、甲状旁腺、垂体和甲状腺)。在另外的实施方式中，所述癌症是消化系统癌(例如，肛门癌、结肠直肠癌、直肠癌、口腔癌、舌癌、食道癌、胃癌、胆囊癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、大肠癌和小肠癌)。在进一步的实施方式中，所述癌症是妇科癌(例如，子宫颈癌、子宫内膜癌、子宫癌、输卵管癌、妊娠期滋养层疾病、绒毛膜癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌)。在仍进一步的实施方式中，所述癌症是头部和颈部癌症(例如，喉癌、口咽癌、甲状旁腺癌和甲状腺癌)。在另外的实施方式中，所述癌症是白血病(例如，急性成淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性成淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病和/或骨髓增生障碍)。在仍进一步的实施方式中，所述癌症是肺癌(例如，间皮瘤、非小细胞性肺癌以及小细胞性肺癌)。在另外的实施方式中，所述癌症是淋巴瘤(例如，AIDS相关淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、霍奇金病和非霍奇金病)。在其它实施方式中，所述癌症是骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)。仍在其它实施方式中，所述癌症是儿科癌(例如脑瘤、尤文肉瘤、白血病(例如，急性成淋巴细胞白血病或急性髓性白血病)、肝癌、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肉瘤(例如，骨肉瘤或横纹肌肉瘤)以及维耳姆斯瘤。在仍进一步的实施方式中，所述癌症是雄性生殖癌症，包括但不限于前列腺癌、睾丸癌、附睾癌和阴茎癌。在另外的实施方式中，所述癌症是皮肤癌(例如，皮肤T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、卡波西肉瘤、皮下或黑素瘤)。在进一步的实施方式中，所述癌症是甲状腺癌(例如，乳头状癌、滤泡性癌、髓样癌或未分化(anaplastic)或未分化(undifferentiated)甲状腺癌)。在另外的实施方式中，所述癌症是泌尿系统癌(例如，膀胱、肾和尿道)。在进一步的实施方式中，所述癌症或癌症相关症状是运动失调性毛细血管扩张症、未知初始起源的癌、Li-Fraumeni综合症或胸腺瘤。在仍进一步的实施方式中，所述癌症是转移癌症。

[0106]在另外的实施方式中，所述癌症相关靶标是与癌细胞或组织相关的分子。在一些实施方式中，所述分子是肿瘤或肿瘤脉管系统/基质抗原，例如CD20、CD19、CD30、CD3、GD2、Lewis-Y、72kd糖蛋白(gp72、衰变加速因子、CD55、DAF、C3/C5转化酶)、CO17-1A(EpCAM、17-1A、EGP-40)、TAG-72、CSAg-P(CSAp)、45kd糖蛋白、HT-29ag、NG2、A33(43kd gp)、38kd gp、MUC-I、CEA、EGFR(HER1)、HER2、HER3、HER4、HN-1配体、CA125、黏结蛋白聚糖-1、Lewis X、FAP基质抗原(成纤维细胞活化蛋白)、EDG受体(内皮糖蛋白受体)、ED-B、层粘连蛋白-5(γ2)、cox-2(+LN-5)、PgP(P-糖蛋白)，αVβ3整联蛋白、αVβ5整联蛋白、uPAR(尿激酶型纤溶酶原激活物受体)、内皮糖蛋白(CD105)、GD2、氨基肽酶、生腱蛋白-C、NG-2、TEM1、TEM8、膜联蛋白、叶酸受体骨桥蛋白(EDG 1，3)、p97(黑素运铁蛋白)、法尼基转移酶或凋亡途径中的分子(例如，死亡受体、fas、胱天蛋白酶或bcl-2)或凝集素。

[0107]在可选的实施方式中，所述靶标是血细胞，包括造血细胞(例如，造血干细胞)，以及在红细胞系、血小板系和白细胞系中的各种未成熟细胞。“血细胞”包括但不限于造血细胞、红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞、浆细胞、肥大细胞、巨噬细胞和天然杀伤细胞。在一些实施方式中，所述靶标是异常血细胞。在一些实施方式中，HSC靶标具有CD34⁺Thy-1⁺或CD34⁺Thy-1⁺Lin^-的表面抗原表达模式(“Lin^-”指基于缺乏至少一种谱系特异性标记的表达而选择的细胞群)。分离和选择HSCs的方法在本领域中是熟知的(参见例如美国专利第5,061,620、5,677,136和5,750,397号，每一个专利被完整引入本文)。

[0108]在其它实施方式中，所述靶标是分子。在一些实施方式中，所述分子是有机分子。在进一步的实施方式中，所述分子是生物分子。在另外的实施方式中，所述生物分子是细胞偶联分子。仍在进一步的实施方式中，所述细胞偶联分子与细胞的外表面相连。在一些实施方式中，所述细胞偶联分子是胞外基质的一部分。在一些另外的实施方式中，所述细胞偶联分子是蛋白质。在一些实施方式中，所述蛋白质是受体。在另外的实施方式中，所述细胞偶联分子对特定细胞类型特异。在进一步的实施方式中，所述细胞是病态和/或异常细胞。在一些优选的实施方式中，所述病态细胞是癌细胞。在另一个实施方式中，所述病态细胞是被感染的细胞。在本发明中发现作为靶标有用的另外的分子包括但不限于蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、酯类、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、毒性物质、代谢物、抑试剂、药物、染料、营养物和生长因子。

[0109]本发明包括的蛋白质和化学靶标的非限定性例子包括趋化因子和细胞因子以及它们的受体。如本文所使用，术语“细胞因子(cytokine)”是指众多对细胞施加各种效应(例如，诱导生长、分化、和/或增殖)的因子中的任何一种。非限制性例子包括白介素(IL)，例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14和IL-16；可溶性IL-2受体；可溶性IL-6受体；红细胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干细胞因子(SCF)；白血病抑制因子(LIF)；干扰素(例如，IFN-α、-β、-γ)；制瘤素M(OM)；免疫球蛋白超家族；肿瘤坏死因子(TNF)家族，尤其是TNF-α；转化生长因子，(例如，TGF-α和TGF-β)；和IL-α；和血管内皮生长因子(VEGF)家族，尤其是VEGF(在本领域中也称为VEGF-A)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PLGF)。从多个销售商可以商业获得细胞因子，包括Amgen(Thousand Oaks，CA)、Immunex(Seattle，WA)和Genentech(South San Francisco，CA)。在一些实施方式中，特别优选的靶标是VEGF和TNF-α。

[0110]抗TNF-α的抗体显示，封闭TNF-α与它的受体的相互作用可用于在许多疾病状态例如败血症性休克、类风湿性关节炎和其它炎症过程中调节TNF-α的过量表达。VEGF是生血管诱导剂、血管通透的介质和内皮细胞特异性有丝分裂原。VEGF也已涉及肿瘤。预期VEGF家族的靶向性成员和/或它们的受体将具有重要的治疗应用。例如，预期阻断VEGF将在卵巢过渡刺激综合症(OHSS)中具有治疗价值(例如参见Ferrara et al，Nat.Med.，5：1359[1999])；和Gerber et al，Nat.Med.，5：623[1999])。其它优选的靶标包括细胞表面受体，例如T细胞受体。

[0111]“趋化因子”是在细胞运输和炎症中发挥重要作用的小蛋白质的家族。趋化因子家族的成员包括但不限于IL-8、基质衍生因子-1(SDF-1)、血小板因子4、噬中性粒细胞激活蛋白-2(NAP-2)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)。这些蛋白质也发现在本发明的方法中可用作靶标。

[0112]其它蛋白质和化学靶标包括但不限于免疫调节调节蛋白，例如可溶性人白细胞抗原(HLA、I类和/或II类、以及非经典I类HLA(E、F和G))；表面蛋白，例如可溶性T或B细胞表面蛋白；人血清白蛋白；花生四烯酸代谢物，例如前列腺素、白三烯、凝血烷和前列环素；自身免疫或同种异型免疫或异种免疫的IgE、自身抗体或同种抗体；Ig Fc受体或Fc受体结合因子；G蛋白偶联受体；细胞表面糖类；血管生成因子；黏附分子；离子，例如钙、钾、镁、铝和铁；原纤维蛋白，例如，朊病毒和微管蛋白；酶，例如蛋白酶、氨基肽酶、激酶、磷酸酯酶、DNA酶、RNA酶、脂肪酶、酯酶、脱氢酶、氧化酶、水解酶、硫酸酯酶、环化酶、转移酶、转氨酶、羧化酶、脱羧酶、超氧化物歧化酶和它们的天然底物和类似物；激素和它们相应的受体，例如促卵泡激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、甲状腺素(T4和T3)、脱脂载脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、氢化可的松、醛固酮、雌三醇、雌二醇、孕酮、睾酮、脱氢表雄酮(DHBA)和其硫酸盐(DHEA-S)；肽激素，例如肾素、胰岛素、降钙素、甲状旁腺素(PTH)；人生长激素(hGH)、血管生压素和抗利尿激素(AD)、促乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、LHRH、促甲状腺素释放激素(THRH)、血管活性肠肽(VIP)、缓激肽和相应的激素原；儿茶酚肽例如肾上腺素和代谢物；辅因子包括atrionatriutic因子(AdF)、维生素A、B、C、D、E和K以及5-羟色胺；凝血因子，例如凝血酶原、凝血酶、纤维蛋白、纤维蛋白原、因子VIII、因子IX、因子XI和冯维勒布兰德因子；纤溶酶原因子，例如纤溶酶、补体激活因子、LDL和它们的配体以及尿酸；调节凝血的化合物，例如蛭素、蛭素类似物(hirulog)、裂纤酶(hementin)、肝素和组织纤溶酶原激活剂(TPA)；用于基因治疗的核酸；酶拮抗剂；结合配体的化合物，例如炎症因子和受体以及其它结合至前述一种或更多种的分子的蛋白质。

[0113]另外的化学靶标无限制性地包括药物，尤其易遭滥用的药物，例如大麻、海洛因和其它麻醉剂、苯环利定(PCP)、巴比妥类、可卡因和其衍生物以及苯二氮类(benzadiazepine)；毒素，例如重金属如水银和铅、砷和放射性化合物；化疗剂，例如4-乙酰氨基酚、地高新和自由基；细菌毒素，例如脂多糖(LPS)和其它革兰氏阴性毒素、葡萄球菌(Staphylococcus)毒素、毒素A、破伤风毒素、白喉毒素以及百日咳毒素；植物和海洋毒素；蛇和其它毒液，毒力因子，例如aerobactins、毒素、蛋白质等；感染性病毒，例如肝炎病毒、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(例如，1、2和6型HSV)、EB病毒(EBV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、人免疫缺陷病毒(例如，HIV-1、HIV-2)和其它逆转录病毒、腺病毒、轮状病毒、流感病毒、鼻病毒、细小病毒、风疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、副黏病毒、乳多空病毒、痘病毒、虫媒病毒、黄热病毒、沙粒病毒、狂犬病毒、杯状病毒、星状病毒、轮状病毒和小RNA病毒；朊病毒；原质团组织因子(plasmodia tissuefactor)，原生动物，包括阿米巴(例如，溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica))、丝虫(例如，丝虫(Wuchereria))、原形体(Plasmodium)、贾第虫属(Giardia)、利什曼原虫属(Leishmania)、隐包子虫属(Cryptosporidium)、肉孢子虫属(Sarcocystis)、巴贝虫(Babesia)、锥虫属(Trypanosoma)、和弓形体属(Toxoplasma)；蠕虫(例如，吸虫(trematodes)、绦虫(cestodes)和线虫(nematodes)；细菌，包括造成脓毒症、医院内感染和其它感染的需氧、厌氧和兼性细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)、不动杆菌(Acinetobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、变形菌(Proteus)、克雷白菌属(Klebsiella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、分枝杆菌(mycobacteria)、军团杆菌属(Legionnella)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、支原体属(Mycoplasma)、密螺旋体属(Treponema)、衣原体(Chlamydia)、立克次体属(Rickettsia)、巴尔通体属(Bartonella)等)和真菌(例如，假丝酵母属(Candida)、肺孢子虫(Pneumocystis)、曲霉菌(Aspergillus)、毛孢子菌属(Trichosporum)、小孢子菌属(Microsporum)、毕赤酵母属(Pichnia)、球孢子菌属(Coccidioides)、芽生菌属(Blastomyces)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、隐球菌属(Cryptococcus)等)。事实上，本发明并不意欲于被限制于任何具体的靶标，因为可以被结合(即，形成结合的靶标)的任何靶标在本发明中发现有用。

[0114]在进一步的实施方式中，所述靶标是植物或植物来源材料。在一些实施方式中，所述靶标是木质，而在其它实施方式中，所述靶标是非木本植物。本发明意欲包括任何植物和/或植物来源材料。

[0115]在一些实施方式中，所述靶标是酶，例如蛋白酶、氨基肽酶、激酶、磷酸酯酶、DNA酶、RNA酶、脂肪酶、酯酶、脱氢酶、氧化酶、水解酶、硫酸酯酶、纤维素酶、环化酶、转移酶、转氨酶、羧化酶、脱羧酶、超氧化物歧化酶和它们的天然底物和类似物。特别优选的酶包括水解酶，尤其是α/β水解酶；丝氨酸蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶，和胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶；纤维素酶和脂肪酶。

[0116]仍在另外的实施方式中，所述表面是非生物表面。在一些实施方式中，所述非生物表面是医疗设备的表面。在进一步的实施方式中，所述医疗设备是治疗性设备。还在其它实施方式中，所述治疗性设备是植入的治疗性设备。在另外的实施方式中，所述医疗设备是诊断性设备。在一些实施方式中，所述诊断性设备是孔或盘。

[0117]在进一步的实施方式中，所述靶标是非生物材料。在一些实施方式中，所述非生物材料是织物。在一些优选的实施方式中，所述织物是天然织物。在另外的实施方式中，所述织物是棉花、丝织品和/或毛织品。在进一步的实施方式中，所述织物是非天然织物。在一些实施方式中，所述织物是尼龙、人造纤维织物和/或聚酯。在一些实施方式中，所述织物是天然和/或合成纤维的混合。在仍进一步的实施方式中，所述非生物材料是塑料、陶瓷、金属和/或橡胶。在另外的实施方式中，所述材料是上述任何材料的复合材料。

[0118]在另外的实施方式中，所述靶标是微电路。该电路可以以其完成的形式或处于电路制造的任何阶段。靶化的试剂(targeted agent)可以被用于在所述电路上移除或沉积化合物，例如，n型掺杂剂(例如，砷、磷、锑、钛或其它供体原子种类)或p型掺杂剂(例如，硼、铝、镓、铟或其它受体原子种类)(例如参见，van Zant，Microchip Fabrication，McGraw-Hill，New York，[2000])，全部引入于此作为参考。

[0119]事实上，本发明不意欲于被限制于任何具体的靶标，因为发现可以被结合(即，形成结合的靶标)的任何靶标在本发明中都有用。

[0120]在一些实施方式中，表面上的污迹(stain)被认为是靶标群。因此，在一些实施方式中，一片棉植物(cotton)上的污迹包含试剂可以紧密结合的潜在靶分子，但未染污的棉织物包括抗靶标试剂结合至其上的抗靶标分子。因此，在一些实施方式中，污迹是包含试剂特异结合至其上的靶分子的化合物。在一些实施方式中，所述化合物是添加颜色至纺织品、金属或其它织物或固体材料，或添加至产生污迹的可见外观的物质的着色化合物。可以作为污迹的靶化类着色物质包括但不限于下列：卟啉源结构(例如，血中的血红素和植物中的叶绿素)；丹宁酸和多酚(参见Ribéreau-Gayon，in Oliver and Boyd(eds.)， Plant Phenolics，Edinburgh[1972]，pp.169-198)，其出现在茶叶污迹(tea stains)、葡萄酒污迹(wine stains)、香蕉污迹(banana stains)和桃污迹(peach stains)中；类胡萝卜素和类胡萝卜素衍生物，在番茄(番茄红素，红色)、芒果(胡萝卜素，橙黄色)和红辣椒中出现的着色物质；氧化类胡萝卜素(oxygenated carotenoids)和叶黄素(例如参见Bartley et al， Plant Cell，The，7：1027-1038 [1995])；花青素(即，在许多果实和花中出现的高着色分子；参见Ribéreau-Gayon，见上，pp.135-169)；以及美拉反应产物(即，在蛋白/肽结构存在下在加热碳水化合物分子的混合物后产生的黄色/棕色着色物质，例如在蒸煮油中发现的那些)。在可选的实施方式中，着色化合物是通过化学反应、吸附或分散整合入纤维的染料(例如，直接蓝染料、酸性蓝染料、活性蓝染料和活性黑染料)。在一些优选的实施方式中，尤其优选的靶标包括类胡萝卜素和叶黄素污迹。

[0121]在一些实施方式中，污迹选自下面的非限制性污迹：卟啉源污迹、丹宁酸源污迹、类胡萝卜素色素源污迹、花青素色素源污迹、土壤基污迹、油基污迹和人身体源污迹。在一些优选的实施方式中，所述污迹是血液来源或叶绿素来源的污迹。更特别地，在一些实施方式中，所述污迹是草、红辣椒、茶来源的污迹或果实或蔬菜来源的污迹(例如，来自葡萄酒、西红柿或浆果)。在一些特别优选的实施方式中，优选的污迹是人身体污迹以及更特别地是称为“衣领污迹”的污迹。

[0122]在一些优选的实施方式中，存在至少两种靶标群，包括第一靶标群和第二靶标群。在一些特别优选的实施方式中，所述第一靶标群和所述第二靶标群不同。在一些更特别优选的实施方式中，所述第一靶标群和所述第二靶标群是细胞。仍在另外的优选实施方式中，所述第一靶标群含有正常细胞而所述第二靶标群含有异常细胞。在仍进一步优选的实施方式中，所述异常的第二靶标群包括肿瘤细胞。

[0123]在一些实施方式中，其中所述第一靶标群是受损细胞、组织或器官上的分子，所述第二靶标群包括健康正常(即，非受损的)细胞、组织或器官或它们的组合。在一些实施方式中，所述细胞、组织和/或器官选自健康正常的全血、皮肤、毛发、牙齿和指甲。在一些实施方式中，在野生型细胞的表面上正常表达的蛋白质是第二靶标群分子，而仅在癌细胞表面上表达的蛋白质是第一靶标群分子。然而，本发明不意欲受限于野生型细胞上表达的分子与在异常或病态细胞上表达的那些分子的比较。在可选的实施方式中，不同的健康细胞类型被相互比较，以鉴定细胞特异性蛋白(例如，肾细胞可以与肝细胞相比)。

[0124]在一些进一步的实施方式中，其中所述靶标是在受损的细胞、组织或器官上存在的分子，抗靶标分子存在于健康正常(即，非受损的)细胞、组织、器官或它们的组合上。在一些实施方式中，所述抗靶标分子存在于选自健康正常全血、皮肤、毛发、牙齿和指甲的细胞、组织和/或器官上或所述细胞、组织和/或器官内。在一些实施方式中，在野生型细胞的表面上正常表达的蛋白质是抗靶标分子，而仅在癌细胞表面上表达的蛋白至是靶标分子。然而，本发明不意欲受限于野生型细胞上表达的分子与在异常或病态细胞上表达的那些分子的比较。在可选的实施方式中，不同的健康细胞类型被相互比较，以鉴定细胞特异性蛋白(例如，肾细胞可以与肝细胞相比)。

[0125]在一些优选的实施方式中，本发明的方法进一步包括重复步骤：在温育混合物中温育所述第一靶标群和所述试剂第一收集物，并洗涤所述温育混合物，以从所述温育混合物除去未结合的试剂。

[0126]在一些可选的优选实施方式中，所述扩增的抗靶标试剂收集物的浓度比试剂的第一收集物的浓度至少高约1000倍。优选地，抗靶标试剂收集物的每一成员可以以这样的水平存在，该水平比扩增之前它们的水平高约100倍、约500倍、约1000倍、约5000倍、约10,000倍、约100,000倍或约1,000,000倍。

[0127]在一些优选的实施方式中，所述试剂是存在于噬菌体表面上的肽，以及所述抗靶标试剂是存在于噬菌体表面上的不同的肽。在一些特别优选的实施方式中，所述方法进一步包括在使扩增的收集物与所述第二靶标群以及所述试剂的第一收集物温育之前，使包含抗靶标试剂的噬菌体失活的步骤。在一些优选的实施方式中，失活步骤包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。

[0128]本发明不要求试剂、抗靶标试剂、靶标群以及试剂收集物被表征至这样的程度——即，它们结合的分子是已知的。因此，例如，在一些实施方式中，在筛选前了解哪一抗靶标试剂结合靶标上或靶标内的抗靶标分子并不重要。类似地，在允许对靶标分子或群的纯度、稳定性和浓度的进行一些控制的结构(例如，序列相关的结构)、化学或遗传水平上，没有必要对靶标分子或群和抗靶标分子进行有些详细的表征。同样，不必知道分子可能结合哪一试剂或抗靶标试剂。

[0129]在一些优选的实施方式中，所述靶标群具有低浓度。在一些优选的实施方式中，所述低浓度在约1微摩尔浓度(1e-6M)至约1皮摩尔浓度(1e-12M)之间，而在一些特别优选的实施方式中，所述浓度在约1e-7M至约1e-11M之间。

[0130]因此，如本文所述，本发明提供鉴定结合至靶标群中的靶分子的试剂的方法。如本文中更详细的描述，“靶标群”是一组靶标(例如，一组细胞或核酸)，其每一成员含有至少一个靶分子。在一些优选的实施方式中，所述方法包括使第一靶标群与试剂的第一收集物在温育混合物中接触，其中至少一些试剂接触所述第一靶标群中的分子。如本文所描述，“试剂的第一收集物”是一组分子(例如，一组肽)，其结合野生型或正常靶分子。

[0131]在一些特别优选的实施方式中，所述方法要求洗涤所述温育混合物，以从所述温育混合物中除去未结合的试剂，然后洗脱所述结合的试剂，以产生抗靶标试剂的收集物。在有些另外优选的实施方式中，这些抗靶标试剂被扩增，使得每一成员在溶液中以非常高的浓度存在。

[0132]在一些实施方式中，扩增产生核酸序列的额外拷贝，并使用本领域中熟知的聚合酶链式反应(PCR)技术进行。在一些可选的实施方式中，扩增通过宿主细胞由噬菌体的产生而发生。

[0133]因此，在一些实施方式中，在扩增后，抗靶标试剂的收集物的每一成员都以非常高的拷贝数存在。例如，在一些实施方式中，抗靶标试剂收集物的每一成员都以这样的水平存在，该水平比扩增之前抗靶标试剂浓度的水平高约100倍、约500倍、约1000倍、约5000倍、约10,000倍、约100,000倍或约1,000,000倍。

[0134]在一些实施方式中，因为所述扩增的抗靶标试剂的收集物对于试剂的第一收集物大量过量，所以所述抗靶标试剂结合至第二靶标群中的基本上全部抗靶标。在第一靶标群中不存在的第二靶标群中的任何靶标分子是可检测的(即，通过将试剂结合至该靶标而检测)。因此，在洗涤后，该试剂的身份就是否是目标结合物被鉴定和分析。在一些实施方式中，所述第二靶标群包含与所述第一靶标群相同的靶标，而在可选的实施方式中，所述第二靶标群包含不同于所述第一靶标群的靶标。例如，在一些实施方式中，所述第一靶标群包含健康的肝细胞，而所述第二靶标群包含病态肝细胞。可选地，在一些实施方式中，所述第一靶标群包含皮肤，而所述第二靶标群包含毛发。在又进一步的实施方式中，所述第一靶标群存在于干净的衣服上，而所述第二靶标群存在于含有污迹的衣服上。

[0135]在一些实施方式中，所述试剂是表达在噬菌体的表面上的肽，而所述第一和第二靶标群分别是野生型细胞和异常细胞。

[0136]在一些优选的实施方式中，所述方法使用噬菌体展示进行。噬菌体展示是体外选择技术，其中肽或蛋白质与噬菌体的被壳蛋白遗传性融合，导致融合蛋白在噬菌体表面上的展示，同时编码所述融合蛋白的DNA定居在噬菌体内(例如，参见Barbas等人， Phage Display，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，[2001])。该方法允许筛选蛋白质的大量突变体或不同蛋白质，它们每一个连接至其的相应的DNA序列。

[0137]在一些优选的实施方式中，所述试剂收集物是噬菌体表面上的至少一种类型的肽。在一些优选的实施方式中，所述肽包括至少一种抗体。在其它优选的实施方式中，所述方法进一步包括使噬菌体失活，其中所述失活作用在将噬菌体与靶标收集物和包含试剂收集物的噬菌体温育之前发生。在可选的优选实施方式中，失活步骤包括将所述噬菌体暴露于使噬菌体不能存活的温度。在一些实施方式中，扩增也被使用，以产生额外拷贝的核酸序列。在一些优选的实施方式中，使用PCR进行扩增，如本领域中所知。在其它实施方式中，扩增通过感染宿主细胞由噬菌体的繁殖而发生。在一些实施方式中，试剂收集物包括在噬菌体表面上表达的肽，并且第一和第二靶标群分别是野生型细胞和异常细胞。

[0138]使用本领域中已知的任何合适的方法，进行区分和/或分离噬菌体。例如，在一些实施方式中，在洗脱的噬菌体上存在的扩增的肽收集物通过在80℃温育所述噬菌体5分钟而被失活，使得仅仅噬菌体展示肽的第一库的噬菌体是存活的并且可以在培养中复制和生长。

[0139]在可选的实施方式中，使用不同的噬菌体的两种不同的株或培养物。例如，具有不同核苷酸序列和/或抗微生物剂耐受模式的株发现在本发明中有用。因此，在抗微生物剂耐受的情况下，在选择的抗微生物剂存在下扩增的试剂收集物确实不生长，但所述带有结合物的噬菌体确实生长。在一些实施方式中，设计用来仅与一株噬菌体的基因组中的序列杂交的PCR引物被用于鉴定哪一噬菌体存在。

[0140]在一些优选的实施方式中，本发明提供分离至少一种目标结合物的方法，所述方法包括步骤：使靶标群与试剂收集物接触，所述试剂收集物具有低浓度；洗涤掉未结合于所述靶标群的试剂；以及区分、分离并鉴定所述至少一种目标结合物。

[0141]在一些优选的实施方式中，试剂收集物包括至少一种类型的肽。在一个可选的优选实施方式中，所述试剂收集物包括至少一种类型的核酸。在进一步优选的实施方式中，所述核酸是DNA和/或RNA分子。

[0142]在一些优选的实施方式中，试剂收集物具有操作浓度。在一些特别优选的实施方式中，所述操纵浓度为所述靶标群浓度的约1×10^-3至约1×10³倍。在一些优选的实施方式中，操纵浓度包含试剂多样性的降低，使得每一单独试剂的浓度增加至所述试剂期望解离常数的约1×10^-4至约1×10²倍。在一些优选的实施方式中，操纵浓度包括至少一种竞争结合物，其中所述至少一种竞争性结合物包括对期望靶标具有预先确定的解离常数的结合物。

[0143]在一些优选的实施方式中，靶标群选自癌细胞、细胞系或细胞培养物，肿瘤提取物或癌组织或器官，或与癌细胞、细胞系或细胞培养物相关的分子(例如，特异性抗原)。因此，在一些特别优选的实施方式中，靶标群是一组抗原。在一些实施方式中，所述抗原包含至少一种选自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP的抗原。

[0144]在一些优选的实施方式中，所述靶标群具有低浓度，所述低浓度在约1微摩尔浓度(1e-6M)至约1皮摩尔浓度(1e-12M)之间；优选的范围是约1e-7至约1e-11之间的任何浓度。

[0145]在一些优选的实施方式中，试剂收集物包括至少一种类型的肽，而在一些可选的优选实施方式中，所述试剂收集物包括至少一种类型的核酸。在一些特别优选的实施方式中，所述核酸是DNA和/或RNA分子。

[0146]在一些可选的优选实施方式中，采用噬菌体展示进行所述方法。在一些优选的实施方式中，所述试剂收集物是存在于噬菌体表面上的至少一种类型的肽。在一些优选的实施方式中，所述肽包括至少一种抗体。在一些优选的实施方式中，所述方法进一步包括使噬菌体失活，其中所述失活作用在将噬菌体与靶标收集物和包含试剂收集物的噬菌体温育之前发生。在一些优选的实施方式中，所述失活步骤包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。在一些优选的优选实施方式中，所述方法进一步包括使用对噬菌体收集物中的核酸序列特异的寡核苷酸进行PCR扩增。

[0147]本发明还提供分离至少一种目标肽的方法，包括步骤：温育野生型细胞的至少一种收集物与噬菌体展示肽的第一库；洗涤掉未结合于所述野生型细胞表面上的靶分子的噬菌体；洗脱结合于靶分子的噬菌体，产生抗靶标肽收集物；扩增所述抗靶标肽收集物；将扩增的抗靶标肽收集物和噬菌体展示肽的第一库和/或在温育野生型细胞的至少一种收集物与噬菌体展示肽的第一库之后获得的第二库施用于异常细胞；洗涤掉未结合于异常细胞表面上的靶分子的噬菌体，以留下由结合的抗靶标肽以及至少一种目标肽覆盖的细胞表面；从携带抗靶标肽的噬菌体区分和/或分离携带至少一种目标肽的噬菌体；以及鉴定所述至少一种目标肽。

[0148]在一些优选的实施方式中，噬菌体的第一收集物和噬菌体的第二收集物包含不同的基因组。在一些其它优选的实施方式中，确定来自噬菌体第二收集物的肽的身份的步骤包括使用对噬菌体的第二收集物中的核酸序列特异的寡核苷酸的PCR扩增，所述肽结合于在所述第二细胞群的表面上表达的靶标。在另外的优选实施方式中，使用抗微生物剂耐受标记物，并且噬菌体第一收集物的抗微生物剂耐受模式不同于噬菌体第二收集物的抗微生物剂耐受模式。

[0149]在一些优选的实施方式中，所述方法进一步包括重复步骤：在温育混合物中温育所述第一靶标群和所述试剂第一收集物，并洗涤所述温育混合物，以从所述温育混合物除去未结合的试剂。

[0150]在一些优选的实施方式中，所述扩增的抗靶标噬菌体收集物的浓度比噬菌体的第二收集物的浓度大至少约1000倍。

[0151]在进一步优选的实施方式中，在使扩增的收集物与所述第二靶标群温育以及与所述试剂的第一收集物温育之前，所述方法进一步包括使包含抗靶标试剂的噬菌体失活的步骤。在一些优选的实施方式中，失活步骤包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。

[0152]在一些优选的实施方式中，携带抗靶标肽的噬菌体被扩增约100倍、约500倍、约1000倍、约5000倍、约10,000倍、约100,000倍或约1,000,000倍，然后被施用到上面描述的方法中的异常细胞。因此，扩增的抗靶标肽的收集物结合至对于野生型和异常细胞都是常见的细胞表面蛋白。通过还应用噬菌体展示肽的原始的或不同的文库，仅在异常细胞表面上表达的蛋白保持未结合，并且，因此，成为包含在该文库中的新肽的靶标。

[0153]如上所示，使用本领域中已知的任何合适的方法，区分和/或分离噬菌体。在一些实施方式中，在洗脱的噬菌体上的扩增的抗靶标肽收集物通过在80℃温育所述噬菌体5分钟而被失活，这样，仅噬菌体展示肽的第一文库的噬菌体是存活的并且可以在培养中复制和生长(例如参见Barbas等人，见上)。

[0154]在可选的实施方式中，使用不同的噬菌体的两种不同的培养物或株。例如，具有不同核苷酸序列和/或抗微生物剂耐受模式的株发现在本发明中有用。因此，在抗微生物剂耐受的情况下，在选择的抗微生物剂存在下扩增的试剂收集物确实不生长，但带有结合物的噬菌体生长。在一些实施方式中，设计用来仅与一株噬菌体的基因组中的序列杂交的PCR引物被用于鉴定哪一噬菌体存在。

[0155]在一些特别优选的实施方式中，所述方法包括将扩增和纯化的抗靶标肽施用至未连接(link)或未连接(join)至噬菌体的第二靶标群。在该情况下，收集被洗脱的噬菌体，并用于转染细菌细胞，其产生与所述噬菌体结合的肽或蛋白质(例如参见Barbas等人，见上)。然后，从细菌培养物中纯化表达的肽或蛋白质，并与携带潜在新试剂的噬菌体一起，用作扩增的抗靶标试剂收集物。以这种方式，基本上所有非特异性的、抗靶标分子被结合至表达的和纯化的肽，而靶标分子结合至噬菌体。因此，仅结合至靶标分子的存活噬菌体在培养中生长。

试验

[0156]下面的例子用于说明本发明的一些优选的实施方式和方面，并不被解释成限制本发明的范围。

[0157]在随后的试验公开中，使用下面的缩写：sd和SD(标准偏差)；M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；nM(纳摩尔浓度)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；LF(致死因子)；℃(摄氏度)；cDNA(拷贝或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)；RNA(核糖核酸)；PBS(磷酸缓冲盐水)；g(重力)；OD(光密度)；CPM和cpm(每分次数)；rpm(每分钟转数)；Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸酸])；HBS(HEPES缓冲盐水)；SDS(十二烷基磺酸钠)；Tris-HCl(三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸盐)；2-ME(2-巯基乙醇)；EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙醚)N，N，N′，N′-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；Abbott(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)；Bio-Synthesis(Bio-Synthesis，Lewisville，TX)；ATCC(American Type CultureCollection，Rockville，MD)；Gibco/BRL(Gibco/BRL，Grand Island，NY)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Pharmacia(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)；Pierce(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)；Roche(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)；Synpep(Synpep，Pleasanton，CA)；Bachem(BachemBiosciences，King of Prussia，PA)；以及Stratagene(Stratagene，La Jolla，CA)。

                               实施例1

                          文库和结合物间的竞争

[0158]在下面的实施例中，提供多种计算。本发明并不意欲于被限制为任何具体的计算方法。下面的名称在本文中被使用：对于具有n个成员的库L，使T^o＝靶标总量，T＝未结合靶标，P_i＝未结合文库成员I，P_i ^o＝文库成员I的总量，Kⁱ _D＝P_i与T的解离常数，TP_i＝P_i与T的复合物，Kⁱ _on＝二级缔合速率常数，kⁱ _off＝一级解离速率常数。图1-8提供了本文中示例的关系的图解说明。

[0159]在该实施例中，假设：1)达到稳态结合；2)每一靶标具有仅结合一个成员的一个结合位点；和3)每一成员具有相同的二级缔合速率常数，然后，下面的方程式描绘文库成员间的竞争：

-缔合速率(on rate)如下计算：

             d(TP_i)/dt＝kⁱ _on(T)(P_i)

-解离速率如下计算：

             -d(TP_i)/dt＝kⁱ _off(TP_i)

-在稳态下，下式适用：

             d(TP_i)/dt＝-d(TP_i)/dt

                    kⁱ _on(T)(P_i)＝kⁱ _off(TP_i)

             kⁱ _off/kⁱ _on＝(T))(P_i)/(TP_i)＝Kⁱ _D

-在具有n个结合靶标的成员的文库中，游离靶标的浓度为：

             T＝T^o-TP₁-TP₂-TP₃...-TP_n

-对于每一成员P_i：

             Kⁱ _D＝(T)(P_i)/(TP_i)

            T＝(TP_i/P_i)Kⁱ _D

-在文库L中，存在结合最紧密的一个结合成分(“P₁”)。  结合的P₁与游离的P₁的比率作为T的函数，是：

            T＝(TP₁/P₁)K¹ _D

-由于T是游离靶标的浓度，所以对于该文库的任何其它成员P_i：

            T＝(TP_i/P_i)Kⁱ _D

-对于该文库的每一成员P_i，相对于最紧密结合物的结合与游离的比率(the boundover free ratio)(TP₁/P₁)，结合与游离的比率(TP_i/P_i)如下给出：

            (TP_i/P_i)Kⁱ _D＝(TP₁/P₁)K¹ _D

            (TP_i/P_i)＝(TP₁/P₁)K¹ _D/Kⁱ _D

-对于该文库的任一成员i，相对于P₁的结合与游离的比率，结合与游离的比率(TP_i/P_i)与两个解离常数的比率成正比：

            使x＝(TP₁/P₁)；r¹ _i＝K¹ _D/Kⁱ _D

            TP₁/P₁ ^o＝(TP₁/P₁)/(1+(TP₁/P₁))＝x/(1+x)

            TP_i/P_i ^o＝(TP_i/P_i)/(1+(TP_i/P_i))

方程式1：   TP_i/P_i ^o＝r¹ _i*x/(1+r¹ _i*x)

-结合的成分i(TP_i)对结合的成分1(TP₁)的比率是：

            TP_i/TP₁＝(1+x)*r¹ _i*x*P_i ^o/x*(1+r¹ _i*x)*P₁ ^o

            ＝(1+x)*r¹ _i*P_i ^o/(1+r¹ _i*x)*P₁ ^o

            ＝(1+x)*P_i ^o/((1/r¹ _i)+x)*P₁ ^o

方程式2：   TP_i/TP₁＝(1+x)*P_i ^o/((1/r¹ _i)+x)*P₁ ^o

            T＝(TP₁/P₁)K¹ _D＝(x)K¹ _D

            当T^o接近0时；T接近0和x接近0

            当T^o接近∞时；T接近∞和x接近∞

            TP_i/TP₁＝(1+x)*P^{i o}/((1/r¹ _i)+x)*P₁ ^o

              当T^o接近0时；TP_i/TP₁接近(1)*P_i ^o/(1/r¹ _i)*P₁ ^o

                            接近(r¹ _i)*P_i ^o/P₁ ^o

              当T^o接近∞时；TP_i/TP₁接近(x)*P_i ^o/(x)*P₁ ^o

                             接近P_i ^o/P₁ ^o

[0160]因此，当靶标有限时，每一结合物相对于最紧密结合物的量与解离常数的比率成比例。当靶标在最高浓度时，每一成员以相同的程度结合。该关系在图4中被描述。为仅观察文库中的最紧密结合物，靶标浓度必须有限。为观察文库中的所有结合物，靶标应该过量存在。该关系在图5中被描述。为增加被检测的紧密结合物的比例，多个选择是可能的：1)增加文库浓度；2)降低文库多样性(增加成员浓度)；3)降低靶标浓度；或4)添加一种过量的可以与其它结合物区分开的弱结合物(可以制成该检测系统不能检测出)。该关系在图6中被描述。

                           实施例2

                用于分离结合物(多种结合物)的计算

[0161]在本实施例中，描述了估算或确定结合至靶标的平均结合能以及标准偏差的方法。通过本领域中任何合适的方法进行确定，包括但不限于平衡透析、荧光活化细胞分选，或直接测量10个随机选择的文库成员的结合能。在一些涉及小分子靶标和蛋白质或肽配体的文库的实施方式中，对于本领域技术人员已知的数据(参见例如Lancet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：3715-3719[1993])在平均值和标准偏差的初始估计值时有用。在该参考文献中，对于结合香兰素的抗体文库，得出-1.5千卡/摩尔的平均结合能，具有1.8千卡/摩尔的标准偏差。对于蛋白质文库结合蛋白质靶标，可选的数据发现有用(参见，例如Laskowski et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，98：1410-1415[2001])。在该参考文献中，对于卵类黏蛋白蛋白酶抑试剂与灰色链霉菌(Streptomyces griseus)蛋白水解酶A结合，得到-5.5千卡/摩尔的平均结合能，标准偏差为1.8千卡/摩尔。这些参考文献都显示，它们的数据遵照二项(正态)分布。

[0162]在一些实施方式中，进行多个计算。例如，在本文中描述了7个氨基酸被改变的文库(20⁷的多样性)的计算。首先，在平均值的每一标准偏差内的文库成员的期望数被确定，并且平均结合能被分配给每一成员，其中每一组成员的总数通过二项(正态)分布被确定。所有结合能弱于或等于平均值的文库成员被组成一组。确定文库的总浓度。该文库对靶标的平均结合能(或估计或确定)也被确定。确定添加的竞争物的浓度和解离常数。然后确定文库结合能的标准偏差和/或平均结合能的平方根(用于估计值)。确定偏离平均值的标准偏差的数，所述标准偏差通过计算1/文库大小由单个成员表示。由高斯分布确定在每一对标准偏差之间的文库的百分比。结合能优于平均结合能的文库成员被分入其中结合能以1标准偏差变化的组内(例如，P1是偏离平均值的6个标准偏差，P2是5-6个标准偏差，P3是4-5个标准偏差等)。通过使文库的％乘以总浓度，确定每一种类的浓度。通过偏离平均值的标准偏差的数乘以标准偏差并将其加到平均ΔG值，确定在每一标准偏差时的ΔG值。由ΔG值，计算每一种类的平均ΔG。注意到，由平均值(mean)的＜0个标准偏差计算得到的平均值(average value)，与平均值-1个标准偏差相差2/3，以包括总分布。使用方程式K_D＝e^ΔG/RT确定每一种类的平均结合能。

[0163]然后使用上述的方程式1：

          TP_i/P_i ^o＝r¹ _i*x/(1+r¹ _i*x)

          其中，x＝(TP₁/P₁)；r¹ _i＝K¹ _D/Kⁱ _D

以计算在每个TP₁/P₁值时的TP_i/P_i ^o。TP₁/P₁值从1×10^-4到1×10⁷变化。然后使用上述的方程式2：

          TP_i/TP₁＝(1+x)*P_i ^o/((1/r¹ _i)+x)*P₁ ^o

以便为每一TP₁计算每一组(i)中结合的成员相对于TP₁的浓度。计算每一TP₁/P₁比率的TP_i/TP₁的值。通过将26行中的计算出的比率TP₁/P₁ ^o乘以P₁ ^o，计算TP₁。用TP₁/P₁ ^o乘以TP₁，计算每一结合种类(i)的总浓度。使用方程式T＝(TP₁/P₁)K¹ _D，通过TP₁/P₁乘以K¹ _D，计算游离(未结合的)靶标浓度。通过将总的结合靶标加至游离靶标，计算满足该方程的总靶标浓度。通过将结合种类(i)的总浓度除以在该Kⁱ _D(P_i ^o/P₁ ^o)时结合物的数量，计算每一单独的结合种类的浓度。还进行相同的计算，其中竞争物浓度和解离常数被包括在内。

[0164]然后，这些结果被绘制成靶标浓度(To)的函数。发现这些图在确定期望靶标浓度、文库浓度、文库多样性以及竞争物浓度以帮助鉴定文库的紧密(比平均值高若干个标准偏差的更优的结合能)结合物成员中有用。

                              实施例3

            从蛋白质文库中质谱筛选hSC胰凝乳蛋白酶的抑制剂

[0165]在本实施例中，描述了质谱筛选试验。图10-13提供了在这些试验期间获得的数据和计算值。从由BBI-环-BLA(BBI-loop-BLA)制备的蛋白质文库中筛选人角质层胰凝乳蛋白酶(human stratum cornium chymotrypsin，hSCC)的抑制剂(参见，例如美国专利申请序列第10/984,270和10/984,410号；和PCT申请第US04/36976、US04/36979号；和US04/36980)，其都被引入于此作为参考。蛋白质文库由其中在蛋白质的N端3个非连续位置被随机化(半胱氨酸约束)的蛋白质骨架组成。HSCC(筛选靶标)(Swissprot，编号P49862)被生物素化并固定在链霉抗生物素珠(MagnaBind Beads；Pierce)上。

[0166]在存在以1nM、10nM和100nM浓度加入的竞争物(大肠杆菌素(Ecotin)；Sigma)下，温育HSCC与每文库成员10nM的蛋白质文库。温育(4小时)之后，用温育缓冲液洗涤该珠，以除去非特异性结合物，并用洗脱溶液洗脱特异性结合物。

[0167]回收的结合物被浓缩(真空浓缩)，重悬于消化缓冲液，还原，烷基化，并用蛋白水解酶(Lys-c；Roche)消化。所得到的蛋白质消化液用毛细管LC-ESI-MS/MS分析。

[0168]图11显示了结果。如该图所示，在所有条件下观察到PJ02结合物，而仅在具有100nM竞争物(参见图12C)的条件下观察到pj01结合物。在图12(分别是12A和12B)中，显示了这些结合物的串联质谱。

[0169]基于这些质谱，确定每一结合物的全序列。检测从本筛选试验得到的结合物(由Synpep制备的合成肽)对hSCC的抑制活性。图13提供了用两种测序的结合物和已知的抑制剂滴定hSCC。每一结合物的浓度在0.1至10μM间变化，而hSCC被维持在0.1μM的浓度。本抑制试验的生色底物是肽suc-AAPF-pNA(Bachem Biosciences)。这些数据显示，pj02结合物是hSCC的抑制剂(Ki约500nM)。

[0170]在上面的详述中提到的所有出版物和专利被并入本文作为参考。本发明描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域的技术人员将是明显的，并不背离本发明的范围和精神。尽管本发明连同具体的优选实施方式被描述，但应该理解，本发明不应该被不适当地限制于此类具体的实施方式。事实上，为实施本发明而对描述的方式进行的各种修改对于分子生物学、试验开发、免疫学、配方和/或相关领域的普通技术人员是显而易见的，都意欲在本发明的范围内。

[0171]本领域的普通技术人员将容易理解，本发明非常适于进行所述目标并获得所提及的目标和优势，以及其中内在的那些。本发明描述的分子复合物和方法、步骤、处理、分子、具体化合物是目前的优选实施方式的代表，是示例性的，并且不意欲为对本发明的范围的限制。事实上，可以对本文所公开的发明进行变化性取代和改变而不背离本发明的范围和精神，这对于本领域的技术人员将是非常明显的。在此被阐述性地描述的本发明可以在未具体公开于本文中的任何元素或多个元素、限定或多个限定不存在的情况下适宜地进行。已经被使用的术语和表达被用作描述性术语，而非限制性术语，并且在此类术语和表达的使用中，不意欲于排除所显示和描述的特征的任何等价物或它们的部分，但是应当认识到，各种改变在所要求保护的发明的范围内是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选的实施方式和任选的特征予以具体公开，但本领域技术人员可以采取本文所公开的概念的改变和变化，并且应当理解此类改变和变化被认为在如所附权利要求所限定的本发明的范围之内。

[0172]本发明已经被广泛和一般地描述。落入本一般性公开的每一个较窄种类和亚类分组也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，其带有限制性条件或从类中去除任何主题的否定限制(negative limitation)是，无论该去除的物质被否在本文中具体叙述。

Claims (61)

1.分离至少一种目标结合物的方法，包括步骤：

i)使第一靶标与试剂的第一收集物接触，在使得在所述第一收集物中的所述试剂的至少一部分结合于所述第一靶标的条件下进行，以产生第一结合的靶标；

ii)洗涤所述第一结合的靶标；

iii)洗脱在所述第一结合的靶标中结合于所述靶标的所述试剂，以产生抗靶标肽的收集物；

iv)扩增所述抗靶标肽收集物，以产生扩增的抗靶标肽收集物；

v)使所述扩增的抗靶标肽收集物和试剂的所述第一收集物和/或试剂的第二收集物暴露于所述第一靶标和/或暴露于第二靶标，在使得至少一部分所述试剂结合于所述第一和/或所述第二靶标的条件下进行，以产生进一步的第一结合的靶标和/或第二结合的靶标；

vi)洗涤所述进一步的第一结合的靶标和/或所述第二结合的靶标；和

vii)区别、分离和鉴定所述至少一种目标结合物。

2.权利要求1所述方法，其中所述试剂是肽。

3.权利要求1所述方法，其中所述试剂是核酸。

4.权利要求3所述方法，其中所述核酸包括DNA或RNA。

5.权利要求1所述方法，其中所述靶标选自癌细胞、癌细胞系、癌细胞培养物、肿瘤提取物、癌组织、癌器官、癌细胞相关分子、癌细胞系相关分子、癌细胞培养物相关分子、肿瘤提取物相关分子、癌组织相关分子以及癌器官相关分子。

6.权利要求1所述方法，其中所述靶标是抗原。

7.权利要求6所述方法，其中所述抗原选自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。

8.权利要求1所述方法，其中所述第一靶标群和所述第二靶标群不同。

9.权利要求8所述方法，其中所述第一靶标群和所述第二靶标群是细胞。

10.权利要求9所述方法，其中所述第一靶标群包含正常细胞，所述第二靶标群包含异常细胞。

11.权利要求10所述方法，其中所述第二靶标群包含肿瘤细胞。

12.权利要求1所述方法，其中所述步骤i)和ii)被重复。

13.权利要求1所述方法，其中所述扩增的抗靶标试剂的收集物的浓度比试剂的所述第一收集物的浓度至少大1000倍。

14.权利要求13所述方法，其中所述抗靶标试剂的收集物的每一成员以这样的水平存在，该水平选自比扩增之前的水平大大约100倍、约500倍、约1000倍、约5000倍、约10,000倍、约100,000倍和约1,000,000倍。

15.权利要求1所述方法，其中所述方法进一步采用噬菌体展示。

16.权利要求15所述方法，其中所述试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上的肽，以及所述抗靶标试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上不同的肽。

17.权利要求15所述方法，进一步包括在使所述扩增的收集物与所述第二靶标群以及试剂的所述第一收集物温育之前，使包含抗靶标试剂的所述噬菌体失活的步骤。

18.权利要求17所述方法，其中所述失活步骤包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。

19.分离至少一种目标肽的方法，包括：

i)温育野生型细胞的至少一种收集物与噬菌体展示肽的第一库，在使得所述野生型细胞的至少一部分将结合所述噬菌体展示肽的第一库中的至少一些成员以产生结合的细胞和未结合的噬菌体的条件下进行；

ii)在使得所述未结合噬菌体被除去的条件下，洗涤所述结合的细胞和未结合的噬菌体；

iii)洗脱结合于所述结合的细胞的噬菌体，产生抗靶标肽收集物；

iv)扩增所述抗靶标肽收集物；

v)将所述扩增的抗靶标肽收集物和步骤(i)的噬菌体展示肽的所述第一库和/或第二库施用于异常细胞，在使得至少一部分所述异常细胞结合于所述抗靶标肽或噬菌体展示肽的所述第一和/或所述第二库的条件下进行，以产生具有结合的抗靶标肽和至少一种目标肽的结合的异常细胞；

vi)洗涤所述结合的异常细胞并除去未结合在所述异常细胞表面上的任何噬菌体，以留下由结合的抗靶标肽和至少一种目标肽覆盖的细胞表面；

vii)从携带所述抗靶标肽的所述异常细胞区分和/或分离携带所述至少一种目标肽的所述噬菌体；和

viii)鉴定所述至少一种目标肽。

20.权利要求19所述方法，其中噬菌体的所述第一收集物和所述第二收集物包含不同的基因组。

21.权利要求19所述方法，其中使用对噬菌体的所述第二收集物中的至少一部分核酸序列特异的寡核苷酸进行扩增，进行步骤(viii)中所述的鉴定所述肽。

22.权利要求19所述方法，进一步包括使用抗微生物剂耐受模式来区分噬菌体的所述第一收集物和所述第二收集物的步骤。

23.权利要求19所述方法，进一步包括重复步骤(i)和(ii)的步骤。

24.权利要求19所述方法，其中所述扩增的抗靶标噬菌体收集物的浓度比噬菌体的所述第二收集物的浓度大至少约1000倍。

25.权利要求19所述方法，进一步包括在使所述扩增的收集物与所述第二靶标群以及试剂的所述第一收集物温育之前，使包含抗靶标试剂的所述噬菌体失活的步骤。

26.权利要求25所述方法，其中所述失活步骤包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。

27.分离至少一种目标结合物的方法，所述方法包括步骤：

i)使靶标群与试剂收集物接触，其中所述试剂收集物具有操纵浓度，在使得至少一部分所述靶标群结合于至少一部分所述试剂以产生具有至少一个结合物的结合的靶标群的条件下进行；

ii)洗涤所述结合的靶标群，以除去未结合于所述靶标群的试剂；和

iii)区分、分离并鉴定所述至少一种结合物。

28.权利要求27所述方法，其中所述试剂收集物包括至少一种肽。

29.权利要求27所述方法，其中所述试剂收集物包括至少一种核酸。

30.权利要求29所述方法，其中所述核酸是DNA或RNA。

31.权利要求27所述方法，其中所述操纵浓度为所述靶标群浓度的约1×10^-3至约1×10³倍。

32.权利要求27所述方法，其中所述操纵浓度包括试剂多样性的下降，这样使得每一单独所述试剂的浓度增加至所述试剂的期望解离常数的约1×10^-4至约1×10²倍。

33.权利要求27所述方法，其中所述操纵浓度包括至少一种竞争结合物，所述竞争性结合物包含对期望靶标具有预先确定的解离常数的结合物。

34.权利要求27所述方法，其中所述靶标选自癌细胞、癌细胞系、癌细胞培养物、肿瘤提取物、癌组织、癌器官，癌细胞相关分子、癌细胞系相关分子、癌细胞培养物相关分子、肿瘤提取物相关分子、癌组织相关分子以及癌器官相关分子。

35.权利要求27所述方法，其中所述靶标是抗原。

36.权利要求35所述方法，其中所述抗原选自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。

37.权利要求27所述方法，其中所述靶标群具有低浓度，其中所述低浓度在约1微摩尔浓度至约1皮摩尔浓度之间。

38.权利要求27所述方法，其中所述方法进一步采用噬菌体展示。

39.权利要求38所述方法，其中所述试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上的肽，以及所述抗靶标试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上的不同的肽。

40.权利要求38所述方法，进一步包括在使所述扩增的收集物与所述第二靶标群以及试剂的所述第一收集物温育之前，使包含抗靶标试剂的所述噬菌体失活的步骤。

41.权利要求40所述方法，其中所述失活包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。

42.权利要求38所述方法，其中所述肽包括至少一种抗体。

43.权利要求38所述方法，进一步包括使用对所述噬菌体收集物中的至少一种核酸序列特异的寡核苷酸进行PCR扩增。

44.分离至少一种目标结合物的方法，所述方法包括步骤：

i)使靶标群与试剂收集物接触，其中所述靶标群具有低浓度，在使得至少一部分所述靶标群结合于所述试剂收集物的至少一部分成员的条件下进行，以产生具有至少一种目标结合物的结合的靶标，和未结合的试剂；和

ii)洗涤所述结合的靶标，以除去未结合的试剂；区分、分离并鉴定所述至少一种目标结合物。

45.权利要求44所述方法，其中所述试剂收集物包括至少一种肽。

46.权利要求44所述方法，其中所述试剂收集物包括至少一种核酸。

47.权利要求46所述方法，其中所述核酸是DNA或RNA。

48.权利要求44所述方法，其中所述试剂收集物具有操纵浓度。

49.权利要求48所述方法，其中所述试剂收集物的所述操纵浓度为所述靶标群浓度的约1×10^-3至约1×10³倍。

50.权利要求48所述方法，其中所述操纵浓度包括试剂多样性的下降，这样，使得每一单独所述试剂的浓度增加至所述试剂的期望解离常数的约1×10^-4至约1×10²倍。

51.权利要求48所述方法，其中所述操纵浓度包括至少一种竞争结合物，所述竞争性结合物包含对期望靶标的具有预先确定的解离常数的结合物。

52.权利要求44所述方法，其中所述靶标选自癌细胞、癌细胞系、癌细胞培养物、肿瘤提取物、癌组织、癌器官，癌细胞相关分子、癌细胞系相关分子、癌细胞培养物相关分子、肿瘤提取物相关分子、癌组织相关分子以及癌器官相关分子。

53.权利要求44所述方法，其中所述靶标是抗原。

54.权利要求53所述方法，其中所述抗原选自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。

55.权利要求44所述方法，其中所述靶标群具有低浓度，其中所述低浓度在约1微摩尔浓度至约1皮摩尔浓度之间。

56.权利要求44所述方法，其中所述方法进一步采用噬菌体展示。

57.权利要求56所述方法，其中所述试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上的肽，以及所述抗靶标试剂是存在于噬菌体或噬菌体感染的细胞表面上的不同的肽。

58.权利要求56所述方法，进一步包括在使所述扩增的收集物与所述第二靶标群以及试剂的所述第一收集物温育之前，使包含抗靶标试剂的所述噬菌体失活的步骤。

59.权利要求58所述方法，其中所述失活包括将所述噬菌体暴露于导致所述噬菌体不能存活的温度。

60.权利要求44所述方法，其中所述肽包括至少一种抗体。

61.权利要求44所述方法，进一步包括使用对所述噬菌体收集物中的至少一种核酸序列特异的寡核苷酸进行PCR扩增。

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