CN1798834A - 使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物、用于获取该组合物的试剂盒、使造血干细胞移植后附着生长稳定的方法、人单克隆抗体和多克隆抗体及其制备方法、编码人单克隆抗体的基因以及导入了该基因的重组细胞 - Google Patents

使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物、用于获取该组合物的试剂盒、使造血干细胞移植后附着生长稳定的方法、人单克隆抗体和多克隆抗体及其制备方法、编码人单克隆抗体的基因以及导入了该基因的重组细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN1798834A
CN1798834A CNA2004800152691A CN200480015269A CN1798834A CN 1798834 A CN1798834 A CN 1798834A CN A2004800152691 A CNA2004800152691 A CN A2004800152691A CN 200480015269 A CN200480015269 A CN 200480015269A CN 1798834 A CN1798834 A CN 1798834A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
human
consistent
preparation
people
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2004800152691A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1798834B (zh
Inventor
马场宪三
黑岩保幸
森尾友宏
清水则夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LYMPH TECHNOLOGY KK
Original Assignee
LYMPH TECHNOLOGY KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LYMPH TECHNOLOGY KK filed Critical LYMPH TECHNOLOGY KK
Publication of CN1798834A publication Critical patent/CN1798834A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1798834B publication Critical patent/CN1798834B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明目的是利用人类白细胞抗原(HLA)一致的活性淋巴细胞使造血干细胞移植后附着生长稳定。从末梢血或脐带血分离获得的单核球细胞中的HLA一致淋巴细胞经增殖、活化后，进一步分离提纯，制备以HLA一致淋巴细胞为主要成分的造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物。该组合物可以广泛应用于预防造血干细胞移植后附着生长不全及促进造血干细胞移植后附着生长的治疗。本发明中组合物的给药量因患者的年龄、症状而异，对于包括人在内的哺乳动物，人源抗体的给药量为0.2－20毫克/千克体重·天。给药可经静脉注射，每日一次(单次给药或连续给药)或间隔性地每周1－3次，每2周或每3周1次。

Description

使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物、用于获取该组合物的试剂 盒、使造血干细胞移植后附着生长稳定的方法、人单克隆抗体和多克隆抗体 及其制备方法、编码人单克隆抗体的基因以及导入了该基因的重组细胞
技术领域
本发明涉及一种使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物，该组合物可以用于改善造血干细胞移植中出现的附着生长不全、附着生长后诱发抗体产生、免疫应答不适等问题，还可以用于防止各种感染并发症和癌症的复发。本发明还涉及为获取该组合物而使用的试剂盒(kit)、使造血干细胞移植后附着生长稳定的方法、以及用于治疗各种人类疾病的单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法。
背景技术
细胞移植特别是造血干细胞移植患者有并发各种感染症、癌症复发等危险。到目前为止，人们针对上述情况进行了种种研究，本发明申请人之一的关根曾经报道固定化的抗CD3抗体和白细胞介素2(IL-2)可以诱导淋巴细胞增殖，而且由此增殖产生的自源淋巴细胞具有抗肿瘤效果(特开平3-80076号公报)。
此外，我们还报道了由固定化的抗CD3抗体和IL-2诱导产生的自源淋巴细胞对先天性免疫缺陷患者的病毒感染症具有疗效(伊藤仁也、关根晖彬；医学のあゆみ，181卷，第6期，426-427，1997年)。在造血干细胞移植研究领域，标志着患者和捐献者白细胞血型的人类白细胞抗原(humanleukocyte antigen，HLA)与A、B、C、DR的四个基因位点以及被称为DQ、DP的数种主要HLA分子一致时，才可以进行骨髓移植和输血。
自1975年Kohler和Milstein创立细胞融合技术以来，人们制备了各种单克隆抗体，并将其应用于分析、测定、诊断和治疗。目前为止报道的单克隆抗体几乎都是动物特别是小鼠来源的，利用细胞融合技术使免疫动物的抗体常生细胞免于死亡，即可获得这些抗体。单克隆抗体在抗体子集(sub class)上是均一的，具有抗原结合特异性高、清除率极低等特点，被视为一种极富魅力的药物载体。我们正致力于基于上述特点开发一种新型的药物输送系统(Drug Delivery System，DDS)。
专利文献：特开平3-80076号公报
非专利文献：伊藤仁也、关根晖彬；医学のぁゆみ，181卷，第6期，426-427，1997年
发明内容
尽管已经证实由抗CD3抗体和IL-2诱导产生的自源淋巴细胞具有抗肿瘤效果和防止先天性免疫缺陷患者病毒感染症的功能，但仅就目前的水平，还远远达不到期望的良好疗效。而且，即使在HLA主要分子一致的情况下进行骨髓移植和输血，也可能由于HLA的不一致而给接受骨髓移植和剂量限制性毒性(dose limiting toxicity，DLT)治疗的患者带来致死的副作用，即有引发输血移植后抗宿主病(Post Transfusion-Graft versus HostDisease，PT-GVHD)的危险。
关于单克隆抗体，它们全部是如前述那样用抗原免疫动物所获得的动物源抗体，在施用于人体时，抗体自身可能存在一定的免疫原性，因此很难作为常规的治疗用药。为了避免产生免疫原性，我们将研究如何采用杂合化或与人源抗体嵌合化(chimera)、人源化等方法处理动物源的单克隆抗体如Fab2、F(ab)’2等，以降低其免疫原性；还将研究如何利用由患者体内筛选而得的抗体产生细胞或者体外(in vitro)免疫的人淋巴细胞创建人源抗体产生细胞株。
以上举例的方法存在着抗原性残留或者是人源抗体产生细胞株创建困难、培养细胞时抗体产生能力低等问题，因此人们非常渴望能够建立基于其它生产工艺的简便且高效的抗体制备方法。在多克隆抗体方面，面临着与单克隆抗体相同的问题，我们正在致力于研究能够将其安全且高效地应用于人类的各种方法。
本发明的发明人以开发可改善移植细胞特别是造血干细胞附着生长稳定性的药物、方法为目标，潜心研究的结果表明：通过IL-2和抗CD3抗体刺激、增殖与移植造血干细胞HLA一致的细胞，可以制得HLA一致活性淋巴细胞，该一致活性淋巴细胞施用于患者后，可以改善移植患者的干细胞附着生长机能。
我们对移植了人造血干细胞的免疫缺陷小鼠给予HLA一致活性淋巴细胞，通过抗原致敏，成功地使所述免疫缺陷小鼠高效地产生了人源单克隆抗体。总之，我们的主要发明具体地说包括：权利要求1中所述的发明涉及到一种使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物，以HLA一致淋巴细胞为主要成分的该组合物是由从末梢血或脐带血分离得到的单核球细胞中的HLA一致淋巴细胞经增殖、活化后，再分离提纯而制得的。
权利要求4中所述的发明涉及使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物的制备方法，该制备方法包括从含有HLA一致淋巴细胞的末梢血或脐带血中分离得到单核球细胞的步骤、增殖及活化分离所得的单核球细胞中的HLA一致淋巴细胞的步骤、分离经增殖及活化的HLA一致淋巴细胞，制备以此为主要成分的制剂的步骤。
权利要求7中所述的发明涉及制备使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物所需的试剂盒(kit)，该试剂盒包括由从末梢血或脐带血采集而来的血液中分离获得HLA一致淋巴细胞的器具、由含有IL-2的培养液以及固定有抗CD3抗体的培养瓶中的一种或两种构成的增殖、活化器具、以及从增殖、活化器具中取出培养的HLA一致淋巴细胞的器具。
权利要求8中所述的发明涉及一种用于产生人源单克隆抗体的细胞株，获取该细胞株的方法为对哺乳类动物在移植前后给予HLA一致活性淋巴细胞，待附着生长稳定后进行抗原致敏，再对该哺乳动物的抗原免疫细胞进行细胞株化或者是进行分离或者是进行基因的分离与表达。
权利要求9中所述的发明涉及用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，制备该细胞株的方法为：将人造血干细胞移植入SCID小鼠等重症复合免疫缺陷小鼠等哺乳动物体内，通过在移植前和移植后给予HLA一致活性淋巴细胞促进其附着生长，然后进行抗原致敏，采用细胞株化、分离、基因的分离与表达等手段从该哺乳动物体内获取抗原致敏淋巴细胞。
如上所述，本发明是一种HLA一致增殖活性淋巴细胞，即以含有以增殖的捐献者血细胞为主要成分的HLA一致活性淋巴细胞为明显特征的、用于预防造血干细胞移植后附着生长不全及促进生长附着的制剂。因此可以广泛应用于移植时干细胞附着生长的促进等情况。除了用于促进干细胞的附着生长之外，本品还可用于促进各种器官的附着生长。而且对哺乳动物进行人造血干细胞移植，通过给予HLA一致增殖活性淋巴细胞和免疫原，可以获得特异性的、高抗原结合力的抗体。进而，利用产所述抗体的细胞，可以高效地生产人源单克隆抗体。而且，移植了人造血干细胞并给予了HLA一致增殖活性淋巴细胞的哺乳动物，可以广泛地应用于抗病毒药、抗癌药、抗高血压药等药物的筛选。
具体实施方式
以下将依顺序就上述发明的具体内容加以说明。
HLA一致
本发明所述的“HLA一致”是指在A、B、C、DR四个基因位点以及被称为DQ、DP的数种主要HLA分子中，至少有三个位点以上是一致的。
淋巴细胞的采集
通过下述方法采集用于增殖和活化的HLA一致淋巴细胞。本发明中所述的HLA一致活性淋巴细胞，是以从造血干细胞捐献者的末梢血、淋巴节、骨髓、各种体液中采集的淋巴细胞为材料制备的。尽管通过造血干细胞培养的方法也可以获得HLA一致活性淋巴细胞，但从效率的层面来讲，以从捐献者末梢血中获得的淋巴细胞为材料是最令人期待的，而且采用这种方法可能获得与造血干细胞捐献者HLA至少三个位点一致的活性淋巴细胞。
关于采血方法，因腕静脉采血简便易行而较宜采用，实际上任何部位采集的含有淋巴细胞的血液均可作为材料，甚至可以以脐带血为材料。
关于采血量，其范围可以在0.001毫升至500毫升，优选10毫升至100毫升。为了防止采集到的血液发生凝固，可向其中加入肝素或柠檬酸。
HLA一致淋巴细胞的培养增殖与活化
采集的HLA一致淋巴细胞采用下述方法进行活化。在本发明的描述中对于采集的淋巴细胞来说，“培养”指将细胞组织切片置于含有细胞生长所必需的营养成分的培养液中，人工地使组织细胞增殖。所谓“增殖”是指通过上述的培养过程，在体外(in vitro)人工地使组织细胞的数量增加。所谓“活化”是指通过向上述的培养液中加入增殖因子、活性因子从而刺激细胞，调控其发挥沉滞已久的机能，具体地说就是使其具有预防附着生长不全、促进附着生长的特殊功能。
关于HLA一致活性淋巴细胞的增殖，可以采用公知的淋巴细胞培养方法，而且这种方法并非仅限于特定的情况。例如，据特开平3-80076号专利公报报道，在IL-2或抗CD3抗体单独存在及上述两者同时存在的情况下进行培养，均可进行细胞的增殖。在这种情况下，出于提高增殖效率的考虑，我们认为在IL-2和抗CD3抗体两者同时存在的条件下进行培养最为适合。
在淋巴细胞的增殖及活化方面，除了上述的IL-2和抗CD3抗体外，还可以使用各种细胞分裂素(Cytokinin)、抗CD28抗体和各种促细胞分裂剂(mitogen)。此时，可以使用任何具有淋巴细胞增殖及活化功能的物质。这种情况下所使用的IL-2可以为市售商品，其在培养液中的浓度以1-2000单位/毫升(U/ml)为宜。
IL-2可溶于水、生理盐水、Dulbecco’s缓冲盐溶液(Dulbecco’s bufferedSalt Solution，DPBS)以及RPMI-1640、DMED、IMDM、AIM-V等普遍使用的细胞培养液中。一个批次溶解的IL-2，为了防止其活力下降，最好冷藏保存。这种情况下使用的细胞培养液只要适于淋巴细胞培养即可，没有特别限制。例如，血清等生物来源的培养液，向平衡盐溶液中加入了氨基酸、维生素、核苷酸等物质的合成培养液均是合适的。优选培养液包括RPMI-1640、AIM-V、DMEM、IMDM等，最优选RPMI-1640。
这种情况下所使用的细胞培养液可为市售商品，如果向其中添加正常人血清则增殖效果更加。除人血清外，还可使用小牛血清，也可以使用无血清培养液。培养方法采用通常的细胞培养方法即可，如可以在CO2培养箱内进行培养。CO2浓度应控制在1-10％，优选3-7％为最佳；温度应控制在30℃-40℃，优选35-38℃。
关于培养天数，没有特别限定，但因需要保证抗CD3抗体的刺激信息传达至细胞，故以2-30天为宜。当培养天数为3-21天时，不但细胞可以获得稳定的刺激信息，而且从提高培养效率的角度来讲也较为理想。在培养期间可以根据在显微镜下观察的细胞状态及细胞计数的结果，适当地补充营养液以提高培养效率。通常情况下，上述培养在开始的1-2天内无明显可见的细胞增殖现象，接下来随细胞的继续增殖，培养液将由橙色变为黄色。
补加的培养液的量以初始培养液量的0.1-5倍为宜。补加培养液的频率应为每1-7天一次，优选每3-5天一次，这样可以有效防止培养液变质和IL-2失活。在抗CD3抗体存在的条件下培养一段时间后，可以在无抗CD3抗体刺激的条件下继续培养细胞，即可以转移至未固定化抗CD3抗体的器具(如培养瓶、培养板、培养皿)中进行培养。
在上述条件下的淋巴细胞培养，除无抗CD3抗体刺激外，其它条件均可与抗CD3抗体存在时的情况相同，而且，在人血清浓度、无血清培养液的适时使用等方面，更具有可操作性强、成本低廉、安全性高等优势。
在培养的过程中，可以使脐带血或单核球细胞悬浮于含有IL-2的培养液中，并将所述细胞置于固定化有抗CD3抗体的容器内而开始培养。这种情况下，可以根据需要向培养液中加入各种细胞分裂素和促细胞分裂剂，以提高增殖、活化细胞的效率。用于刺激淋巴细胞的抗CD3抗体，可由纯化的CD3分子免疫动物或细胞制备，也可使用性质稳定、价格低廉的市售OKT3抗体(生产商：ォ-ソフア-マス-テイカル)。
对于使用的抗体，只需该抗体具有促进淋巴细胞增殖、活化功能，其它没有特别限定，比如还可以使用抗CD28抗体等。从淋巴细胞的增殖效率、操作的简便程度等方面考虑，将抗CD3抗体固定化后再行利用较为妥当。固定化抗体的器具可以使用玻璃、聚氨酯、聚烯烃、聚苯乙烯等材料的细胞培养容器。从操作简便的角度出发，通常可以使用市售的已灭菌的细胞培养瓶，同时可根据需要选择合适的尺寸。
所谓固定化，是将抗CD3抗体的稀溶液加入上述的用于固定化抗体的容器中静置一段时间，比如在4-37℃下静置2-24小时，即可完成。在固定化抗CD3抗体的过程中，需先用灭菌的Dulbecco’s缓冲盐溶液(DPBS)等生理缓冲液对抗CD3抗体进行稀释，使其浓度在0.1-30微克/毫升。容器在固定化后至使用前通常是保存在冷藏室或冰箱(4℃)中的，这种情况，在使用时应先除尽液体，必要时可用常温的Dulbecco’s缓冲盐溶液等生理缓冲液洗净容器。
上述方法增殖而得到的末梢血来源的HLA一致活性淋巴细胞，在经加工或如后述进行制剂后，可以作为一种广泛应用的生物防御手段，比如用作移植后的防止附着生长不全、促进生长附着的治疗药物。
在移植时，为了避免发生输血移植后抗宿主病(PT-GVHD)及其它副作用，可使用抗CD4抗体等进一步处理已制备的末梢血来源的活性淋巴细胞，使其成为以CD4阳性细胞为主的细胞群，该产品对预防上述副作用的发生效果较佳。
含有CD8阳性细胞的产品，可以有效减少GVHD等副作用的发生，或者在防止附着生长不全、促进附着生长的基础上同时具有抗肿瘤和抗病毒的效果。这种情况下，可以制备适当CD8阳性细胞含量的细胞群用于疾病治疗。
以HLA一致活性淋巴细胞为主要成分的制剂
将以增殖细胞为主要成分的HLA一致活性淋巴细胞以一定形态制剂化，比如可以将其悬浮在含有人白蛋白的输液用生理盐水中，可以用作防止附着生长不全、促进附着生长的治疗制剂；也可以通过添加各种医药成分(component)实现制剂化。这里所述的“制剂”是指以活性淋巴细胞为主要成分的具有生物防御功能的一切材料，只要其中含有HLA一致活性淋巴细胞，无论何种具体形态，均在所述之列。
例如，制剂的形态可以是将HLA一致活性淋巴细胞悬浮于适当的溶液中，这种情况下，优选上述的将HLA一致活性淋巴细胞悬浮于含有人白蛋白的输液用生理盐水中的制剂形态，但并不仅限于此。
这种情况下，可以使末梢血或脐带血直接在试管内进行增殖，制备以HLA一致活性淋巴细胞为主要成分的制剂；也可以先从末梢血或脐带血中分离出单核细胞，再使分离出的单核细胞在试管内进行增殖，制备以HLA一致活性淋巴细胞为主要成分的制剂。此外，本发明所述的制剂中含有的HLA一致活性淋巴细胞，可以是导入了各种其它基因的细胞，也可以是缺失了某些原有基因或原有基因发生变异的细胞。
用于制备以HLA一致活性淋巴细胞为主要成分的制剂的试剂盒
在制备本发明所述的以HLA一致活性淋巴细胞为主要成分的制剂时，除了可以使用单独的试剂、器材之外，还可以将它们组合起来加以利用。例如，使用将含有IL-2的培养液和固定化有抗CD3抗体的培养瓶作为组成部分组合在一起而得到的试剂盒，可以比较容易地制备发明中所述的制剂。
这种情况下使用的培养液，可以预先分装在固定化有抗CD3抗体的培养瓶中，从而进行冷冻保存。像这样，将至少2个组成部分组合成试剂盒，必要时用于活性淋巴细胞的培养，可以较为容易地制备本发明中所述的制剂。
如上所述的所有可能用于本发明的HLA一致活性淋巴细胞或者含有该成分的制剂，均可冷冻保存，并可根据需要作为附着生长稳定剂，起到预防附着生长不全、促进附着生长等作用。HLA一致活性淋巴细胞可以按如下方法冷冻保存。
需保存的HLA一致活性淋巴细胞，应以其大小选择适当的浓度悬浮于细胞保存液中，冷冻保存时细胞悬浮在保存液中的浓度应为1×103个/毫升至1×1010个/毫升，其中以1×105个/毫1至1×108个/毫升为宜。此外，这种情况下使用的细胞保存液的量没有特别要求，从操作方便的角度考虑，应控制在0.1毫升至1000毫升，其中以0.5毫升至100毫升为宜。
在进行冷冻保存时，不仅可以使用市售的细胞保存液，还可以自行配制细胞保存液。作为细胞保存液的成分，是在合适的缓冲液或基本培养基中加入血清或者蛋白质、多糖等大分子，以及二甲基亚砜(DMSO)等化学物质，但根据需保存的HLA一致活性淋巴细胞的要求，保存液中未必含有上述列举的全部成分。实际使用的细胞保存液只要适于保存HLA一致活性淋巴细胞，不必仅限于上述组成成分。HLA一致活性淋巴细胞可悬浮于合适的细胞保存液中在低温下冷冻保存。
给药量
关于以HLA一致活性淋巴细胞为主要成分的制剂的给药量，应视移植患者的状态、治疗对象等适当增减。通常情况下应为每1千克体重给予淋巴细胞1×102个至1×109个。为提高疗效，每1千克体重给予给药量应在1×103个以上，但如超过5×108个，疗效未见有明显提高，因此，给药量以1×103至5×108个细胞/千克体重为最佳。
给药形态和方式
上述制剂的给药形态以注射剂和点滴剂等液体制剂为宜，将前面所说的细胞分散至添加有0.01％-5％人血清白蛋白的生理盐水中的注射剂和点滴剂较为理想。关于给药方式，以静脉点滴或静脉、动脉、局部注射为宜。液体制剂的给药量因给药方式和给药部位而异，优选为1-500毫升，更优选上述液体制剂中所含的细胞数与前述的淋巴细胞的给药量要求相符。给药频率应为每日1次至每月1次，给药次数应至少为1次。
人单克隆抗体的制备
下面将说明一种使用动物高效地制备可用于细胞移植后的安全性高且附着生长良好的人单克隆抗体的方法。具体地说，就是针对免疫缺陷的动物在移植前和移植后分别给予HLA一致活性淋巴细胞，附着生长稳定后，进行抗原致敏，通过细胞株化或者分离、基因的分离与表达等方法从该动物获得抗原免疫淋巴细胞。
关于这里使用免疫缺陷动物，具体地讲可以是牛、马、绵羊、山羊、家兔、豚鼠、大鼠、家鸡、家鸭等，从易于管理和操作简便的角度出发，以小鼠最为适合。其中，SCID(severe combined immunodeficiency，以下简称SCID)小鼠是目前已知的血液免疫球蛋白浓度较BALB/c小鼠的免疫球蛋白(Ig)重链异型共有基因(allotype congenic)系小鼠——C.B-17小鼠更低的小鼠物种，患有重症复合免疫不全症，呈现严重的免疫缺陷状态。
SCID小鼠缺少免疫系统的主要功能细胞——成熟T细胞及B细胞，这是因为表达某些特定分子必须具有特定的基因，而SCID小鼠的与合成这些特定基因相关的酶系(recombinase)异常，特别是酶系缺少基质特异性。因此，SCID小鼠几乎不产生自身抗体，因而不仅不受抗体依赖细胞的细胞毒作用(ADCC)影响，而且抗原呈递细胞、NK细胞等的机能也不认定其为异常。
与裸鼠、Tc小鼠(Transchromo Mouse)或者经放射线照射一次性丧失免疫功能的小鼠相比，SCID小鼠具有一定优势。利用SCID小鼠的优势，可以植入异种动物的各种组织和肿瘤以分析抗癌药物的作用机制，或者建立获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染等人类特有疾病的研究模型。此外，将人胎儿胸腺或胎肝的切片在保持其组织学结构的前提下植入SCID小鼠的肾皮膜下，这样的小鼠称为SCID-hu小鼠，将人末梢血淋巴细胞(PBL)植入腹腔内，则称为hu-PBL-SCID小鼠——这些已为本领域技术人员公知。
后者通过免疫小鼠可以诱导产生针对破伤风毒素、乙型肝炎病毒C等的人抗体。利用SCID小鼠，通过植入各种异种异系的组织，特别是人体组织，可以建立使用其它动物无法获得的人类疾病模型，如此构建的自身免疫疾病模型就相当值得人们期待。
在本发明中，还可以利用上述的SCID小鼠作为人单克隆抗体的制备方法。本发明中利用的SCID小鼠一般为5-15周龄，其中以8-12周龄为宜。
具体来讲，可将从含有人干细胞的末梢血、骨髓、脐带血或免疫组织比如脾脏中以经典的方法提取纯化的人淋巴细胞成分悬浮于生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等对细胞及生物体无影响的溶液中，然后植入SCID小鼠的腹腔内或静脉内。悬浮的人淋巴细胞浓度应为1×107个至5×108个，其中以1×108个左右为宜。
这种情况下，作为一种植入方法，可以先将移植细胞包被在免疫隔离膜中再将其植入动物腹腔。采用这种方法，由于免疫隔离膜的存在避免了移植细胞与宿主组织的接触，有效抑制了移植抗宿主(graft-versus-host，GVH)现象的发生，同时还可以提高产生针对目的抗原的抗体的效率。
人抗原特异性抗体产生细胞的收获通常选择在移植后7天至60天内进行，其中以7天至28天为宜，特别以25天至28天为最佳。此外，为保证收获效率，应自移植后的第7天开始，每周从SCID小鼠的眼窝适量取血液一次，以检查其中人抗体量及人抗原特异性抗体效价是否呈上升趋势。
人抗体含量及人抗原特异性抗体效价的测定可以采用酶免疫测定法(以下简称EIA)、被动红血球凝集反应法、荧光抗体法、放射性免疫法、点免疫分析法等方法，在抗原为可溶性抗原的情况下，通常采用使用固定化有抗人源免疫球蛋白抗体和目的抗原的免疫板(如丹麦ヌンク公司产品)的公认的酶免疫测定法。通过采用上述测定方法，我们可以从抗体含量和抗体效价高的SCID小鼠体内收获人抗体产生细胞。
从SCID小鼠的各脏器均可以收获抗体产生细胞，但从收获率、产品纯度的角度考虑，选择淋巴结是最为合适的。本发明中采用抗体效价测定以及血小板法、荧光免疫测定法等方法，这与传统的试管内培养细胞的方法相比，在诱导人抗体产生细胞方面是非常成功的，且对获取人单克隆抗体十分有利。
关于本发明中人抗体产生细胞的收获及精制的具体方法，可以按以下方式进行。首先采用物理方法将各脏器单细胞化，如果从脏器收获的细胞中抗体产生细胞所占比例较大，即可直接用于制备抗体产生细胞株；如果抗体产生细胞的纯度较低，比如混有较多的SCID小鼠细胞，为提纯抗体产生细胞可采用的方法有：密度梯度离心法、抗源淘筛(panning)法、使用抗小鼠细胞抗体与补体除去小鼠细胞的细胞溶解法以及经典的使用抗B细胞抗体的亲和层析(affinity column)法。
接下来，按以下步骤将纯化的人抗体产生细胞细胞株化。细胞株化的方法主要有借助爱泼斯坦—巴尔病毒(EBV)的基因组法以及融合于合适的增殖性细胞的细胞融合法等。采用借助EBV的基因组法，需先按典型方法制备EBV，比如细胞株B95.8的培养上清等按1∶10至10∶1的比例添加到悬浮有0.5-5×107个细胞/毫升人抗体产生细胞的增殖培养基中，在37℃下反应1小时-18小时。
反应结束后，在室温下以在经离心的培养基中1×106个/毫升至5×105个/毫升的细胞浓度加入96孔板内，每孔加入的体积为0.1毫升。然后置于二氧化碳培养箱中37℃培养7天至30天，取有细胞增殖现象的小孔中的培养基上清，应用上述的EIA等筛选方法，可以分离得到产生目的抗体的重组细胞。
细胞融合可以依公知的方法进行。可以使用的融合剂有聚乙二醇(以下简称PEG)、仙台病毒等。此外，也可以不使用融合剂而直接进行电转化，但最好使用PEG。适宜的PEG的平均分子量为1000-9000，其中以PEG4000和PEG6000为最佳。
这种情况下的PEG的浓度应为10％至80％，其中以40％至50％为佳。细胞融合所使用的亲本细胞可以是任何细胞株，但最好具有药物标记。较为理想的细胞有骨髓系细胞株和人淋巴系细胞株等，特别以人淋巴细胞株AC-33、人淋巴芽球细胞LICR-2或SKO-007为佳。所述细胞融合，首先需要将通过SCID小鼠获得的抗体产生细胞与适当的细胞株(应为人骨髓系细胞或人淋巴系细胞株，以人淋巴细胞株AC-33为佳)分别用无血清培养基洗净，然后将两者以1∶1至10∶1的比例混合，室温、700转/分钟离心5分钟，从而得到富集细胞(cell pellet)。
将富集细胞置于37℃下温浴并使其中的细胞分散开来，然后向其中缓缓加入预热的PEG溶液，混匀。一般PEG的用量为1毫升/108个细胞，可以根据需要进行增减。接下来，再向其中缓缓加入预热的培养基以稀释PEG溶液。培养基的添加速度一般控制在每10分钟1-30毫升。
在室温下离心收集细胞，作为亲本细胞株以1-5×105个/毫升的浓度在含有10％小牛血清(以下简称FCS)的培养基中静置一夜，然后加入含有次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、氨基喋呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶(thymidine，T)(HAT)和10％FCS的培养基(HAT培养基)。此步操作可以省略，而在细胞融合后将细胞直接悬浮在HAT培养基中。在其后的2至3周内，应该数次更换培养基。
更换培养基的方法是先移除0.1至0.2毫升陈旧培养基，然后补加等量的HAT培养基。这期间如果发现出现了可能的杂交系，应尽早采用前述的EIA等适合的方法进行筛选，并将产生目的抗体的杂交系分离出来。分离得到的杂交系应重新采用适当的方法进行检测加以确认。
用于细胞培养的液体培养基可以是美味T培养基(日本制药)、ダルべツコ改变イ-グル培养基、RPMI-1640培养基、イスコフ改变ダルべツコ培养基等。在利用EBV进行基因重组时，可向上述培养基中添加约20％的FCS作为增殖培养基；而采用细胞融合法时，需添加的FCS浓度为10-15％。从这样获得的人特异抗体产生细胞株中可以采用公知的方法提取人单克隆抗体。
例如，通过向SCID小鼠的腹腔内植入人抗体产生细胞，可以获得含有高浓度的与小鼠杂交系相同的单克隆抗体的腹水。此外，使用适当的无血清培养基比如生长抑制试验(Growth inhibition test，GIT)培养基(日本制药)、HB104(ハナメデイア公司)、ハイブリテイI(日本药品开发公司)等，可以进行大量培养。合理地组合使用各种经典的分离、精制方法，可以从上述的腹水及培养液上清中大量获取高纯度的人单克隆抗体。
这种情况下，可以先将含有抗体的溶液进行离心分离，然后对上清液进行盐析处理。盐析时通常使用硫酸铵，所得到的蛋白质沉淀再经适当的缓冲液溶解并透析后，可以采用柱层析(二乙胺基乙基纤维素(DEAE)离子交换柱、羟基磷灰石柱、凝胶过滤柱、蛋白A柱、蛋白G柱等)、免疫亲和层析等手段分离精制目的人单克隆抗体。这种方法精制而得的人单克隆抗体的纯度可达99.9％以上，完成符合人用药物制剂的要求。
抗体可分为IgA、IgM、IgG、IgD、IgE等类型，其中小鼠的IgG又分为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3(人类为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)4种亚型。对动物给予抗原刺激时，产生的抗体几乎全是IgM或IgG。IgG的分子量约为16万，具有二聚体结构，是一种比较易于处理的分子。而IgM是一种分子量约为90万的大分子，以J链彼此相连的五聚体形式存在，因此具有许多明显的不足，比如分离纯化困难、易发生凝集反应而难于保存，易因蛋白酶的部分水解失活而难于制备Fab片段，以抗癌药物、毒素等进行化学修饰时容易丧失结合活性等。
关于IgG型单克隆抗体和IgM型单克隆抗体哪一种在治疗癌症方面的表现更为出色，Bemstein等曾经利用针对淋巴细胞Thy-1抗原的IgG型单克隆抗体和IgM型单克隆抗体进行了十分详细的研究。(见《monoclonalAntibodies》，R.H.Kennet，T.J.Mc Keamand，K.B.Bechtol编著，Plenum Press，1980，P.275)
据此，比较对于Thy-1抗原阳性淋巴细胞具有相同反应性的IgG型单克隆抗体和IgM型单克隆抗体的抗肿瘤作用的研究结果表明：尽管IgM单克隆抗体在体外(in vitro)表现出较好的补体依赖抗肿瘤效果；但当使用癌症小鼠进行体内(in vivo)抗肿瘤效果研究时，IgG型单克隆抗体表现出了有效地抗肿瘤作用，而IgM型单克隆抗体则未见明显效果。
在通过给予小鼠放射性标记单克隆抗体来研究其在血液中的半衰期时发现，IgM型单克隆抗体的血液半衰期远比IgG型单克隆抗体要短得多。上述研究结果表明，IgG型单克隆抗体更适合应用于临床。
本发明所述的人源抗体，可以单独使用，也可以与一种或一种以上的制剂方面许可使用的辅剂联合使用。比如，将人源抗体溶于生理盐水、葡萄糖、乳糖、甘露醇等的水溶液中可以作为适宜的医药组合物；或者使用常规方法将人源抗体冻干，再向其中加入氯化钠可以制成粉末注射剂。根据需要，还可以向上述医药组合物中加入制剂领域中通用的添加剂，比如制剂方面许可使用的各种盐类。
本发明中所述组合物的给药量因患者的年龄、病情等情况而异。对于包括人在内的哺乳动物，人源抗体的给药量一般为0.2-20毫克/千克·日。给药可以采取一日一次(单次给药或连续给药)或间隔性地1周1-3次，也可2至3周一次进行静脉注射。
利用基因工程手段从人单克隆抗体产生细胞株制备人单克隆抗体的方法
利用基因工程手段，将从本发明所述的人单克隆抗体产生细胞中提取的编码人单克隆抗体的基因装载在合适的表达载体上，然后导入宿主细胞中，这样可以获得能够产生人单克隆抗体的重组细胞。
本发明中所利用的基因，可以通过常规方法或其他各种方法获得并进行克隆见(L.G.Davis等人编著，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier发行，New York 1986，及J.Feder等人Am.J.Hum.Genetics，37，635(1985))。
本发明中所利用的mRNA，也可以通过常规的经典方法制备，并可以此为材料制备cDNA，并进行克隆(见J.Sambrook等人编著Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press发行，NewYork，1989)。
例如，可以通过公知的方法从基因组文库中获取。即首先采用标准方法制备细胞的基因组。比如，在十二烷基硫酸钠(SDS)存在的条件下，用蛋白酶K处理细胞后，酚抽提，然后用不含DNA酶的RNA酶A(DNase-freeRNase A)处理，再酚抽提，这样即可获得基因组DNA(村松正实编著《ラボマニユアル遗传子工学》，丸善株式会社，59页(1988))。
接下来，采用标准方法分离获取含有抗体可变结构域编码区的目的基因。所述方法是通过用限制性核酸内切酶处理基因组DNA使其片段化，将得到的限制性片段克隆到适当的重组DNA克隆载体上，采用放射性探针或酶标探针筛选本发明所述的DNA序列，并将其分离出来。从基因组中取得的DNA序列一般含有不编码多肽的内含子，可以采用公知的方法进行DNA删除或置换(见W.Kramer等，Nucleic Acids Res.12，9441，1984年，及T.A.Kvnkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488，1985年)。
本发明所述的编码人单克隆抗体轻链和重链可变区多肽的DNA序列，也可以采用公知的方法从cDNA文库中获取(见H.Okayama等，Mol.cell.Biol.，2，161，1982年)。即采用标准方法提取人单克隆抗体产生细胞的mRNA，将细胞在含有硫氰酸胍的溶液匀浆后，在三氟乙酸铯的EDTA溶液中进行密度梯度离心分离得到富集RNA，然后用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(Oligo-dT)柱回收poly(A)+-RNA。
以poly(A)+-RNA为模板，以Oligo-dT引物或者随机引物或者目标抗体基因特异性DNA序列为引物，采用公知的方法合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板合成cDNA第二链(村松正实编著：《ラボマニュアル遗传子工学》，丸善株式会社，第70页，第77页，1988年)。
将采用公知的方法获得的上述cDNA克隆到合适的克隆载体上，然后采用适当的探针从中筛选出编码抗体可变区的cDNA。在分离获得所期望的克隆后，基本上可以采用以基因组DNA相同的方法处理cDNA。此外，还可以采用经典的方法通过聚合酶链式反应(PCR反应)(polymerase chainreaction)扩增编码人单克隆抗体轻链及重链可变区的基因(见R.Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3833，1989年)。
此外，编码轻链及重链可变区的基因还可通过常规的化学合成方法获得(N.D.Shina等人，Nucleic Acids Res.，12，4359，1984年)。这些化学合成的DNA中，即使以简并密码子代替原来的密码子，翻译时仍然会得到相同的氨基酸，因此它们没有必要与分子克隆方法获得的DNA序列完全一致。
本发明中所述的人单克隆抗体轻链及重链的恒定区基因，可以从基因组DNA或cDNA中筛选获得，也可通过化学合成方法获得。利用这样获得的编码人单克隆抗体恒定区的DNA序列，可以得到免疫原性极低的轻链及重链多肽。这种编码人单克隆抗体恒定区多肽的DNA序列，也可以从各种人淋巴细胞，比如末梢血淋巴细胞中提取获得。
采用公知的方法，可以将所获得的DNA序列导入合适的重组DNA克隆载体及重组DNA表达载体中(Y.Gluzman等人，Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratories发行)。
在本发明中，将编码轻链多肽及重链多肽的DNA序列作为表达载体的一部分导入适当的宿主细胞中。本发明中用于表达人单克隆抗体的宿主细胞以杂合系、中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(Chinese hamster ovary)、骨髓瘤细胞、形质细胞瘤细胞、淋巴瘤细胞等为宜，也可以使用植物来源的宿主细胞。
人源多克隆抗体的制备方法
下面将说明一种使用动物高效地制备细胞移植后安全可靠、且附着生长性能良好的人源多克隆抗体的方法。具体地说，就是针对免疫缺陷的动物在移植前和移植后分别给予HLA一致活性淋巴细胞，附着生长稳定后，进行抗原致敏，通过细胞株化或者分离、基因的分离与表达等方法从该动物获得抗原免疫淋巴细胞。
关于这里使用的免疫缺陷动物，具体地讲可以是牛、马、豚鼠、大鼠、家鸡、家鸭等，在哺乳动物中从易于管理和操作方便的角度出发，以山羊和家兔为宜，而且从上述动物体内收获的多克隆抗体的量也较多。此外，还应根据动物种类的不同选择合适的免疫原的量及免疫的时间间隔。
关于免疫方法，可以采用任何免疫动物的常规方法。比如可通过动物皮下、腹腔、静脉、肌肉、皮肤等途径进行免疫。此外，免疫原最好与市售的弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、卡介苗(BCG)、氢氧化铝凝胶、百日咳疫苗等适当的免疫佐剂共同使用。
本发明中所述的单克隆抗体及多克隆抗体具有无抗原性或抗原性低的显著特点，在用于治疗感染症、药物中毒的抗血清的替代品、使用抗基因型抗体的疫苗、针对消除炎症反应的接合分子的抗体、以及催化抗体等各个治疗、诊断领域时，均表明出相当明显的优势。
作为一种诊断试剂，本发明所述的抗体在具体应用中，可以通过化学的或基因工程的方法与酶、色素、放射性同位素等合适的标记物结合而成为标记抗体。在作为治疗药物时，如果抗原本身是毒素等活性物质，则可以单独使用具有抗原活性中和能力的本发明所述的抗体；本抗体也可以与其它药物联合使用而成为混合制剂，比如在针对癌症、血栓等疾病时，就可将其通过化学的或基因工程的方法与其它药物结合起来制成抗体靶向性药物，用于治疗。
本发明所述的单克隆抗体及多克隆抗体根据要求，例如经薄膜滤器过滤、除菌后，可以将其本身或与适宜的药理学上允许使用的载体、赋形剂、稀释剂等一起，采用常规的方法制成以注射剂为佳的非口服制剂。这种制剂经哺乳动物(大鼠、小鼠、家猫、家犬、家猪、牛、猴、人等)的皮下、静脉或肌肉给药，是治疗各种疾病的有效手段。
将本发明所述的人单克隆抗体及多克隆抗体溶解于磷酸缓冲液、生理盐水、林格氏液等适宜的溶剂中，可以采用常规方法进行无菌处理并封装至安瓶中。这些液体药剂在经常规方法冻干后可以成为固体药剂。关于本发明所述的人单克隆抗体和多克隆抗体的给药剂量，因给药对象的体重、年龄、性别及疾病种类、症状和给药途径而异。一般来说，给予的免疫球蛋白的量应为1日一至数次间隔或连续给药，每日1微克至1毫克/千克体重。
实施例1
以下通过实施例1对本发明加以阐述。
(1)固定化鼠抗CD3单克隆抗体(OKT3)的中号及大号培养瓶的制备
先用PBS(-)配制5微克/毫升的OKT3溶液，然后向中号培养瓶中加入5毫升、大号培养瓶中加入10毫升该溶液，使溶液均匀地覆盖培养瓶底部。使用之前需在冷藏室内保存。
(2)从移植用脐带血中回收淋巴细胞
将按上述(1)中所述方法制得的OKT3固定化培养瓶(中号)中的OKT3溶液用吸液器吸净。向培养瓶内加入10毫升PBS(-)，盖好瓶盖剧烈振荡，打开瓶盖，倒出其中的液体。然后在超净台内再向培养瓶内加入10毫升PBS(-)，盖好瓶盖、剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。
用吸液器小心地将培养瓶和瓶盖内的液体吸尽，向其中加入脐带血，再向培养瓶内加入10毫升培养用培养基(由44毫升RPMI1640+7培养基、1毫升35000单位/毫升(U/ml)的IL-2、5毫升人血清配制而成，简称培养用培养基)，轻轻搅拌，移取均匀的细胞悬浮液样品，细胞计数用10微升，CD4、CD8阳性细胞含量测定用1500微升(可用1.5毫升离心管3支，各装入500微升)，置于37℃二氧化碳培养箱内，开始培养(培养的第0天)。
(3)基于提尔克氏液的细胞计数
将前述(2)中采集的脐带血10微升与40微升提尔克氏液混合，取10微升加于血球计数板上，在显微镜下测定细胞的数目。由上述结果可知培养瓶内的总细胞数在1.3×106个左右。
(4)细胞表面抗原分析
将上述(2)中所配制的3管细胞悬浊液于4℃，6000转每分钟离心5分钟，以沉淀细胞。吸去上清液，向管1中加入PBS(-)8微升、CD3/HLA-DR抗体8微升，管2中加入PBS(-)8微升、CD4/CD8抗体8微升，分别反应30分钟。
管3只加入PBS(-)8微升，作为非特异性反应对照。反应后向每管中加入鞘液(コ-ルタ-株式会社制アイソトンII)800微升，旋涡混合后，4℃，6000转每分钟离心5分钟，以沉淀细胞。小心吸去上清液，加入800微升鞘液，反复吹吸，重悬细胞，然后转移至用于FACS测定的小管中。
荧光活性细胞分选(FACS)需使用细胞流式仪(FACScan)，基于FACS的测定应遵照操作指南进行操作。测定结果表明，CD3、HLA-DR、CD4及CD8阳性细胞的含量分别为28％、3％、46％和5％。
(5)基于磁性小球标记的抗CD8抗体的CD4阳性细胞的制备与培养
上述(2)中的培养结果，在培养第5天时，细胞总数可达3.4×107个，CD4及CD8阳性细胞分别达到9.5×106个左右。将这些细胞转移至50毫升离心管中，20℃，1000转每分钟离心10分钟。离心后弃上清，用旋涡振荡器充分重悬细胞。
接下来，向15毫升小管中加入含有相当于CD8阳性细胞4倍量的小球的磁性小球标记抗CD8抗体300微升，放置于磁铁装置MPC-1上，反应1分钟。小心移取溶液，不要吸入小球，然后将小管从磁铁上移开。向小管内加入1毫升PBS(-)溶液，充分搅拌，重复上述操作。再向小管内加入1毫升PBS(-)，充分搅拌。并重复上述操作一次。
向离心回收得到的细胞悬浊液中加入5毫升反应用培养基(由清洗用培养基45毫升加人血清5毫升混合配制而成)，轻轻地重悬细胞，然后将细胞转移至盛有磁性小球标记的抗CD8抗体的小管内，以振荡器轻轻振荡，于冷室内反应30分钟。反应后将小管置于磁铁上，反应1分钟。小心移取溶液，不要吸起小球，将溶液转移至一个新的15毫升小管内。再次置于磁铁上，反应1分钟后，小心移取溶液，不要吸起小球，将溶液回收到新的小管内，20℃、1000转每分钟离心10分钟。离心后弃上清，用旋涡振荡器充分重悬沉淀的细胞。
向回收得到的CD4阳性细胞中加入培养基10毫升，轻轻悬浮细胞。将上述(1)中所制作的OKT3固定化培养瓶(中号)中的OKT3溶液用吸液器吸尽。向培养瓶内加入10毫升PBS(-)，盖好瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。然后在超净台中再向培养瓶内加入10毫升PBS(-)，盖好瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。用吸液器小心地吸尽培养瓶和瓶盖内残留的液体，向其中加入细胞悬浮液。取细胞计数用样品10微升、CD4、CD8阳性细胞含量测定样品1000微升(可用1.5毫升离心管2支，各装入500微升)，置于37℃二氧化碳培养箱内，开始培养。(培养的第0天)。
(6)CD4阳性细胞的扩大培养
在培养的第3天、第4天，分别向上述(5)中所述的细胞培养液内各自加入培养用培养基20毫升。在培养的第5天，为进一步扩大培养，需更换体积较大的OKT3固定化培养瓶。即，将上述(1)中所制作的OKT3固定化培养瓶(大号)中的OKT3溶液用吸液器吸尽，向其中加入PBS(-)50毫升，盖好瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。
再次向培养瓶中加入50毫升灭菌的PBS(-)，盖好瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒出其中的液体。小心地用吸液器吸尽残留在培养瓶和瓶盖中的液体。反复轻轻敲打生长有细胞的中号培养瓶，使附着在其底部的细胞脱离下来，将细胞悬浮液转移至处理好的大号培养瓶中。然后向这个大号培养瓶中加入新的培养用培养基50毫升，重悬起其中的细胞，将其转移至一个新的培养瓶内，置于37℃二氧化碳培养箱内继续培养。
(7)CD4阳性细胞的冷冻保存
上述(6)中的培养细胞液，在培养第6天时，应按下述方法冷冻保存。保存方法是，首先反复轻轻敲打培养瓶底面，使附着在其底部的细胞脱离下来，从培养瓶中取出500微升培养液，涂布于胰蛋白胨大豆(TSA)琼脂培养基上，置于二氧化碳培养箱中于37℃培养，进行无菌试验。然后再从培养瓶中取出10微升培养液用于细胞计数。
接下来，向两支50毫升离心管中各加入培养细胞40毫升，1000转每分钟，20℃离心5分钟。弃上清，用旋涡混合器重悬起沉淀的细胞，分别将细胞悬浮液和细胞保存液(由人血清5毫升、DMSO 5毫升、RPMI1640+7培养基40毫升混合而成)置于冰水中冷却5分钟，然后将4.5毫升细胞保存液和细胞悬浮液混于一个管内，轻轻吹吸以混匀细胞，以等量加入3支细胞保存用小管(2.0毫升)中。
然后将小管置于低温冰箱中，于-80℃放置数日，其后可以置于液氮中保存。培养时细胞的浓度为1.9×106个/毫升，保存时每管中约含有5.1×107个细胞。
(8)基于台盼兰溶液的细胞计数
将上述(7)中采集的细胞悬浮液10微升与20微升台盼兰溶液混合，取10微升加于血球计数板上，在显微镜下测定细胞的数目。由测定结果可知细胞总数为5.1×107个。
(9)脐带血移植与给予淋巴细胞之前的过程
针对无法进行缓解导入的急性骨髓单核细胞白血病患者，在接受HLA一致的捐献者的移植骨髓两个月后病情复发，此时又接受了同一捐献者的两次末梢血干细胞移植，结果芽球依然存在而骨髓形成能力很低，这3次移植过程中均未出现GVHD。针对同一患者进行了HLA位点不一致的脐带血移植，从十天后开始出现了3次GVHD，在实施了甲基脱氢皮质醇脉冲(methylprednisolone-pulse，mPSLpulse)疗法后，GVHD现象表现减轻。在经历了上述3次不成功的干细胞移植后，为了不产生GVHD现象和不引发移植物抗白血病(GVL)作用，以及增强移植后的抗肿瘤效果和促进捐献者细胞的附着生长，决定采取活性CD4阳性细胞疗法。
(10)冻存的CD4阳性细胞的取出及活化
取出一管上述(7)中冷冻保存的CD4阳性细胞，37℃热冲击4分钟。在无菌条件下，向15毫升离心管中加入10毫升清洗用培养基(RPMI1640+6)，然后用移液器将保存的淋巴细胞加入培养基中并重悬细胞。20℃，1000转每分钟离心5分钟，弃上清，轻轻敲击，重悬于50毫升培养用培养基中，然后将细胞悬浮液转移至克隆板上。
细胞在经显微镜下观察后，置于37℃CO2培养箱中重新开始培养(培养的第0天)。在培养的第2天，用显微镜确认细胞是否已长满整个克隆板，然后将克隆板上的细胞转移至培养瓶(225平方厘米，CELLCULTUREFLASK)中。用新制培养用培养基50毫升洗涤克隆板一次，然后转移至培养瓶中，于37℃CO2培养箱中继续培养。
在培养的第4天，将按上述(5)中同样方法制作的OKT3固定化培养瓶中的OKT3溶液用吸液器吸尽，向培养瓶中加入50毫升PBS(-)，盖紧瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。然后，在无菌条件下向培养瓶中加入50毫升PBS(-)，盖紧瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。
用吸液器小心地将培养瓶内和瓶盖中残留的液体吸干，反复轻轻敲打生长有细胞的培养瓶，使附着在其底部的细胞脱离下来。将细胞悬浮液转移至已处理的培养瓶中，向原来的培养瓶内加入150毫升新制培养用培养基，重悬起残余的细胞，将其转移至新的培养瓶中，置于37℃CO2培养箱中继续培养。
(11)基于培养袋的CD4阳性细胞培养
在培养的第6天，反复轻轻敲打上述(10)中所述的培养瓶，使附着在其底部的细胞脱离下来，从培养瓶中取出1毫升培养液，分别以等量涂布在萨布罗琼脂培养基(添加氯霉素)和羊血琼脂培养基上，置于37℃CO2培养箱中进行无菌试验。
从培养瓶中取出10微升培养液，按前述(7)中所述的方法进行细胞计数。将装有含等量的细胞袋培养用AIM-V培养基(10升培养基中含200单位/毫升(U/ml)的IL-2、1％的人血清及1毫摩尔/升的过氧乙酸)和CD-2(LL-7.1)培养基共750毫升的培养袋A-1000(细胞培养专用)在37℃下保温。
无菌的条件下，将培养袋与一个50毫升注射器连接，通过注射器将培养瓶中的培养液全部注入培养袋中。用钳子剪断软管，并将软管的尖端密封起来，然后将培养袋置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养。
(12)CD4细胞的无菌试验及肉毒素试验
在培养的第7天(给药前一天)于无菌条件下，用装有24G针头的1毫升注射器从上述(11)的细胞培养袋的取样孔中取出约1毫升培养液。弃去最先取出的液体，用同一支注射器再次取出约1毫升样品，将其中约200微升涂布于羊血琼脂培养基上，剩余的培养液注入干热灭菌的spitz管内。
取样完毕的细胞培养袋，小心用经酒精棉球处理过的钳子将其取样孔盖好后，置于37℃二氧化碳培养箱内继续培养。琼脂板置于37℃培养箱内进行无菌试验；干热灭菌spitz管于20℃、1500转每分钟离心5分钟。
用经干热灭菌处理的微量移液器将配制好的主要试剂(使用toxicolour系统LS一200及toxicolour系统ET-1的肉毒素用试剂盒)加入3支干热灭菌的试管中，每支试管加样100微升。向空白管内加入蒸馏水100微升、阳性对照管内加入标准液100微升，然后向检验管内加入蒸馏水80微升、经离心处理的培养液上清20微升，将3支试管一起置于37℃水浴中反应30分钟。
30分钟后，向每支试管内加入400微升0.8摩尔/升醋酸溶液，旋涡振荡混合，然后各取400微升反应液移至96孔板内，用读板器测定405纳米(参考630纳米)处的吸光度值。可以确定所检测的样品的吸光度值未达到阳性对照样品的1/5。
(13)基于FACS的给药用CD4阳性细胞的回收前分析
在回收CD4阳性细胞前，从细胞培养袋中取出一部分培养液，在采用前述(8)中的方法细胞计数的同时，采用前述(4)中的方法测定CD8阳性细胞的含量。结果表明，细胞总数为3×109个，其中CD8阳性细胞的含量为0.5％。由细胞总数和FACS分析得到的CD8阳性细胞的含量可知，体系中CD8阳性细胞的数量为1.5×106个。
(14)CD4阳性细胞的回收
取上述(11)中的细胞袋中的培养液1000毫升，分装于无菌的250毫升离心管中，20℃，1500转每分钟离心8分钟。离心后，弃上清，振荡重悬细胞。向离心管内加入200毫升细胞清洗液，20℃，1800转每分钟离心8分钟。离心后，弃上清，振荡重悬细胞。每个离心管中加入细胞清洗液100毫升，然后将细胞悬浮液转移至2支250毫升管内，20℃，1800转每分钟离心8分钟。离心后，弃上清，振荡重悬细胞，向每个250毫升管内加入100毫升细胞清洗液。
离心后，弃上清，振荡重悬细胞。将细胞悬浮液充分重悬在菲那尔液(在250毫升离心管中由生理盐水100毫升和20％人血清白蛋白溶液5毫升混合配制而成的淋巴细胞给药用液即菲那尔液)，然后过100目微滤网，测定细胞悬浮液的量。同时取一定量的细胞悬浮液，用于细胞计数和CD4含量测定。
在分装袋(300毫升)上连接一个50毫升注射器，通过注射器将细胞悬浮液注入袋内。完毕后，用注射器内筒压出残留的液体，最后用钳子剪断软管，用封口机封上软管，用剪刀剪断注射器。测定结果，液体量为100毫升，细胞总数为2.5×109个。
(15)基于FACS的给药用CD4阳性细胞的回收后分析
采用与上述(4)中所述相同的方法，进行基于FACS的给药用CD4阳性细胞的回收后分析。结果表明，CD4阳性细胞含量为99.75％，CD8阳性细胞含量为0.25％。
(16)针对患者的CD4阳性细胞给药
根据患者的不同，以4.5×107细胞/kg体重，采用静脉注射1小时的方式，给予上述(14)中制备的CD4阳性细胞。其后，可给药1-2周，每周3次。每次的给药量为2.5×106-5.9×107个细胞/千克体重，给药方式为静脉注射1小时。
实施例2
从供血者体内采血
在脐带血移植后，给予淋巴细胞9次。为了促进生长附着，在移植后的第87天，从患者的静脉采血30毫升，加肝素保存。
(2)末梢血单核球细胞的分离
超净台内无菌(以下简称无菌)条件下，将采过血的注射器的针头更换为19G注射针，注意不要接触到针筒与针头的结合部位。向2支50毫升离心管内各加入15毫升清洗用培养基，将采集的所有血液分成两等份加入到这2支离心管中。盖紧离心管盖，上下颠倒2-3次，充分混合，用10毫升吸液管向6支15毫升离心管内各加入3毫升淋巴细胞提取液，然后向各管中加入培养基稀释后的血液10毫升，注意小心操作，不要激起液面。20℃，1800转每分钟，制动装置处于关闭(OFF)状态下离心15分钟。
离心后，在无菌条件下，用吸液器吸去离心管中距淋巴细胞层1厘米以上的液体，注意不要吸起淋巴细胞。再用5毫升吸液管取出淋巴细胞层，注意不要吸起血细胞层。将取出的淋巴细胞置于装有25毫升清洗培养基(RPMI1640+6)的50毫升离心管中，盖好离心管盖，上下颠倒离心管2-3次，20℃，1800转每分钟离心10分钟。离心后，弃上清，用振荡器充分重悬细胞。再次加入清洗培养基50毫升，充分颠倒混合，取10微升用于细胞计数，用1.5毫升小管2支各取500微升用于CD4、CD8细胞含量测定。
(3)基于提尔克液的细胞计数
将前述(2)中的用于细胞计数的细胞悬浮液10微升与40微升提尔克液混合，取10微升加于血球计数板上，在显微镜下测定细胞的数目。结果表明，细胞总数为8.5×107个。
CD4阳性细胞的分析
将上述(2)中制备的两管细胞悬浮液于4℃，6000转每分钟离心5分钟，吸尽上清。向每管内加入8微升PBS(-)和8微升CD4/CD8抗体，充分搅拌，4℃反应30分钟。反应后，向每管中加入鞘液800微升，旋涡搅拌，4℃，6000转每分钟离心5分钟，沉淀细胞。
吸尽上清，加入800微升鞘液，反复吹吸，重悬细胞，然后将其转移至FACS测定用的小管内。FACS需使用FACScan，基于FACS的测定应遵照操作指南进行操作。CD4、CD8阳性细胞含量均为28％，由总细胞数和CD4、CD8阳性细胞的含量可知，体系中CD4、CD8阳性细胞均为2.4×107个。
(5)OKT3固定化中号培养瓶和大号培养瓶的制备
先用PBS(-)配制5微克/毫升的OKT3溶液，然后向中号培养瓶中加入5毫升、大号培养瓶中加入10毫升该溶液，使溶液均匀地覆盖培养瓶底部。使用之前需在冷藏室内保存。
(6)基于磁性小球标记的抗CD8抗体的CD4阳性细胞的制备与培养
从上述(2)中制备的50毫升细胞悬浮液中取20毫升(细胞总数3.4×107个，CD4及CD8阳性细胞均为9.5×106个)转移至50毫升小管中，20℃，1000转/分钟离心10分钟。离心后，弃上清，旋涡振荡重悬细胞。
接下来，向15毫升小管中加入含有相当于CD8阳性细胞4倍量的小球的磁性小球标记抗CD8抗体300微升，放置于磁铁装置MPC-1上，反应1分钟。小心移取溶液，不要吸入小球，然后将小管从磁铁上移开。向小管内加入1毫升PBS(-)溶液，充分搅拌，重复上述操作。再向小管内加入1毫升PBS(-)，充分搅拌。并重复上述操作一次。
向离心回收得到的细胞悬浊液中加入5毫升反应用培养基(由清洗用培养基45毫升加人血清5毫升混合配制而成)，轻轻地重悬细胞，然后将细胞转移至盛有磁性小球标记的抗CD8抗体的小管内，以振荡器轻轻振荡，于冷室内反应30分钟。反应后将小管至于磁铁上，反应1分钟。小心移取溶液，不要吸起小球，将溶液转移至一个新的15毫升小管内。再次置于磁铁上，反应1分钟后，小心移取溶液，不要吸起小球，将溶液回收到新的小管内，20℃、1000转每分钟离心10分钟。离心后弃上清，用旋涡振荡器充分重悬沉淀的细胞。
向回收得到的CD4阳性细胞中加入培养用培养基20毫升(由培养基RPMI1640+7 44毫升、1毫升35000单位/毫升(U/ml)的IL-2、5毫升人血清配制而成，简称培养用培养基)，轻轻悬浮细胞。将上述(5)中所制作的OKT3固定化培养瓶(中号)中的OKT3溶液用吸液器吸尽。向培养瓶内加入10毫升PBS(-)，盖好瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。然后在超净台中再向培养瓶内加入10毫升PBS(-)，盖好瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。
用吸液器小心地吸尽培养瓶和瓶盖内残留的液体，向其中加入细胞悬浮液。取细胞计数用样品10微升、CD4、CD8阳性细胞含量测定样品1000微升(可用1.5毫升小管2支，各装入500微升)，置于37℃二氧化碳培养箱内(湿度95％)，开始培养(培养的第0天)。如前述(4)进行CD4阳性细胞分析，结果表明CD4阳性细胞含量为46％、CD8阳性细胞含量为5％。
(7)基于台盼兰溶液的细胞计数
将上述(6)中采集的细胞悬浮液10微升与20微升台盼兰溶液混合，取10微升加于血球计数板上，在显微镜下测定细胞的数目。由测定结果可知细胞总数为2.6×107个。
(8)CD4阳性细胞的扩大培养
在培养的第3天、第4天，分别向上述(6)中所述的细胞培养液内各自加入培养用培养基20毫升。在培养的第5天，为进一步扩大培养，需更换体积较大的OKT3固定化培养瓶。即，将上述(5)中所制作的OKT3固定化培养瓶(大号)中的OKT3溶液用吸液器吸尽，向其中加入PBS(-)50毫升，盖好瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。
再次向培养瓶中加入50毫升灭菌的PBS(-)，盖好瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒出其中的液体。小心地用吸液器吸尽残留在培养瓶和瓶盖中的液体。反复轻轻敲打生长有细胞的中号培养瓶，使附着在其底部的细胞脱离下来，将细胞悬浮液转移至处理好的大号培养瓶中。然后向这个大号培养瓶中加入新的培养用培养基50毫升，重悬起其中的细胞，将其转移至一个新的培养瓶内，置于37℃二氧化碳培养箱内继续培养。
(9)CD4阳性细胞的冷冻保存
上述(8)中的培养细胞液，在培养第6天时，应按下述方法冷冻保存。保存方法是，首先反复轻轻敲打培养瓶底面，使附着在其底部的细胞脱离下来，从培养瓶中取出500微升培养液，涂布于胰蛋白胨大豆(TSA)琼脂培养基上，置于二氧化碳培养箱中于37℃培养，进行无菌试验。然后再从培养瓶中取出10微升培养液，如前述(3)进行细胞计数。
接下来，向两支50毫升离心管中各加入培养细胞40毫升，1000转每分钟20℃离心5分钟。弃上清，用旋涡混合器重悬起沉淀的细胞，分别将细胞悬浮液和细胞保存液(由人血清5毫升、DMSO 5毫升、RPMI1640+7培养基40毫升混合而成)置于冰水中冷却5分钟，然后将4.5毫升细胞保存液和细胞悬浮液混于一个管内，轻轻吹吸以混匀细胞，以等量加入3支细胞保存用小管(2.0毫升)中。然后将小管置于低温冰箱中，于-80℃放置数日，其后可以置于液氮中保存。培养时细胞的浓度为1.9×106个/毫升，保存时每管中约含有5.1×107个细胞。
(10)冻存的CD4阳性细胞的取出及活性
取出1管上述(9)中冷冻保存的CD4阳性细胞，37℃热冲击4分钟。在无菌条件下，向15毫升离心管中加入10毫升清沈用培养基(RPMI1640+6)，然后用移液器将保存的淋巴细胞加入培养基中并重悬细胞。20℃，1000转每分钟离心5分钟，弃上清，轻轻敲击，重悬于50毫升培养用培养基中，然后将细胞悬浮液转移至克隆板上。
细胞在经显微镜下观察后，置于37℃，CO2培养箱中重新开始培养(培养的第0天)。在培养的第2天，应用显微镜确认细胞是否已长满整个克隆板，然后将克隆板上的细胞转移至培养瓶(225平方厘米，CELLCULTUREFLASK)中。用新制培养用培养基50毫升洗涤克隆板一次，然后转移至培养瓶中，于37℃，CO2培养箱中继续培养。
在培养的第4天，将按上述(5)中同样方法制作的OKT3固定化培养瓶中的OKT3溶液用吸液器吸尽，向培养瓶中加入50毫升PBS(-)，盖紧瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。然后，在无菌条件下向培养瓶中加入50毫升PBS(-)，盖紧瓶盖，剧烈振荡，打开瓶盖，倒去其中的液体。用吸液器小心地将培养瓶内和瓶盖中残留的液体吸干。
反复轻轻敲打生长有细胞的培养瓶，使附着在其底部的细胞脱离下来。将细胞悬浮液转移至已处理的培养瓶中，向原来的培养瓶内加入150毫升新制培养用培养基，重悬起残余的细胞，将其转移至新的培养瓶中，置于37℃CO2培养箱中继续培养。
(11)基于培养袋的CD4阳性细胞培养
在培养的第6天，反复轻轻敲打上述(10)中所述的培养瓶，使附着在其底部的细胞脱离下来，从培养瓶中取出1毫升培养液，分别以等量涂布在萨布罗琼脂培养基(添加氯霉素)和羊血琼脂培养基上，置于37℃CO2培养箱中进行无菌试验。
从培养瓶中取出10微升培养液，按前述(7)中所述的方法进行细胞计数。将装有含等量的细胞袋培养用AIM-V培养基(10升培养基中含200单位/毫升(U/ml)的IL-2、1％的人血清及1毫摩尔/升的过氧乙酸)和CD-2(LL-7.1)培养基(1升)的共750毫升的培养袋A-1000(细胞培养专用)在37℃下保温。无菌的条件下，将培养袋与一个50毫升注射器连接，通过注射器将培养瓶中的培养液全部注入培养袋中。用钳子剪断软管，并将软管的尖端密封起来，然后将培养袋置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养。
(12)CD4细胞的无菌试验及肉毒素试验
在培养的第7天(给药前一天)于无菌条件下，用装有24G针头的1毫升注射器从上述(11)的细胞培养袋的取样孔中取出约1毫升培养液。弃去最先取出的液体，用同一支注射器再次取出约1毫升样品，将其中约200微升涂布于羊血琼脂培养基上，剩余的培养液注入干热灭菌的spitz管内。
取样完毕的细胞培养袋，小心用经酒精棉球处理过的钳子将其取样孔盖好后，置于37℃、二氧化碳培养箱内继续培养。琼脂板置于37C培养箱内进行无菌试验；干热灭菌spitz管于20℃1500转每分钟离心5分钟。
用经干热灭菌处理的微量移液器将配制好的主要试剂加入3支干热灭菌的试管中，每支试管加样100微升。向空白管内加入注射用蒸馏水100微升、阳性对照管内加入标准液100微升，然后向检验管内加入注射用蒸馏水80微升、经离心处理的培养液上清20微升，将3支试管一起置于37℃水浴中反应30分钟。
30分钟后，向每支试管内加入400微升0.8摩尔/升醋酸溶液，旋涡振荡混合，然后各取400微升反应液移至96孔板内，用读板器测定405纳米(参考630纳米)处的吸光度值。可以确定所检测的样品的吸光度值未达到阳性对照样品的1/5。
(13)基于FACS的给药用CD4阳性细胞的回收前分析
在回收CD4阳性细胞前，从细胞培养袋中取出一部分培养液，在采用前述(7)中的方法细胞计数的同时，采用前述(4)中的方法测定CD8阳性细胞的含量。结果表明，细胞总数为4.0×109个，其中CD8阳性细胞的含量为0.5％。由细胞总数和FACS分析得到的CD8阳性细胞的含量可知，体系中CD8阳性细胞的数量为2.0×106个。
(14)CD4阳性细胞的回收
取上述(12)中的细胞袋中的培养液1000毫升，分装于250毫升离心管中，20℃，1500转每分钟离心8分钟。离心后，弃上清，振荡重悬细胞。向离心管内加入250毫升细胞清洗液，20℃，1800转每分钟离心8分钟。离心后，弃上清，振荡重悬细胞。每个离心管中加入细胞清洗液100毫升，然后将细胞悬浮液转移至2支250毫升管内，20℃，1800转每分钟离心8分钟。离心后，弃上清，振荡重悬细胞，向每个250毫升管内加入50毫升细胞清洗液。
离心后，弃上清，振荡重悬细胞。将细胞悬浮液充分重悬在菲那尔液(在250毫升离心管中，由生理盐水100毫升和20％人血清白蛋白溶液5毫升混合配制而成的淋巴细胞给药用液即菲那尔液)，然后过100目微滤网，测定细胞悬浮液的量。
同时取一定量的细胞悬浮液，用于细胞计数和CD4含量测定。在分装袋(300毫升)上连接一个50毫升注射器，通过注射器将细胞悬浮液注入袋内。完毕后，用注射器内筒压出残留的液体，最后用钳子剪断软管，用封口机封上软管，用剪刀剪断注射器。测定结果，液体量为100毫升，细胞总数为3.7×109个。
(15)基于FACS的给药用CD4阳性细胞的回收后分析
采用与上述实施例1的(4)中所述相同的方法，进行基于FACS的给药用CD4阳性细胞的回收后分析。结果表明，CD4阳性细胞含量为99.75％，CD8阳性细胞含量为0.25％。
(16)针对患者的CD4阳性细胞给药
根据患者的不同，以3×107细胞/kg体重，采用静脉注射1小时的方式，给予上述(14)中制备的CD4阳性细胞。其后，可每周3次给药。每次的给药量为3×107-9×107个细胞/千克体重，给药方式为静脉注射1小时。
实施例3
(1)免疫球蛋白量的测定
对患者末梢血中免疫球蛋白的量进行了测定，结果表明与早期相比，患者末梢血中免疫球蛋白值有所提高。患者在移植后两个月病情复发，芽球细胞数量过半且淋巴细胞数量减少，但免疫球蛋白值仍在正常水平，因此无需进行免疫球蛋白的增补疗法。
与嗜中型粒细胞和淋巴细胞数量显著减少无关，患者并未发生重症感染。这个事实说明，给予的CD4阳性细胞可以显著地提高患者的免疫力。这样，对于脐带血干细胞移植患者可以迅速地产生抗体，这表明捐献者来源的活性淋巴细胞具有促进造血干细胞附着生长和促进抗体产生的作用。

Claims (37)

1、一种使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物，该组合物以人类白细胞抗原一致淋巴细胞为主要成分，所述人类白细胞抗原一致淋巴细胞是通过将从末梢血或脐带血中分离的单核球细胞中的人类白细胞抗原一致淋巴细胞，经增殖、活化、分离提纯而得到的。
2、如权利要求1所述的使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物，其中，该组合物的主要成分人类白细胞抗原一致淋巴细胞含有用于医疗的成份。
3、如权利要求1所述的使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物，其中，人类白细胞抗原一致活性淋巴细胞是一种CD4阳性细胞。
4、一种用于获取造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物的试剂盒，该试剂盒是用于增殖、活化从末梢血或脐带血中采集的血液人类白细胞抗原一致淋巴细胞的器具，该器具包括含有白介素-2的培养液以及抗CD3抗体固相化的培养瓶。
5、一种使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物的制备方法，其中该方法包括从含有人类白细胞抗原一致淋巴细胞的末梢血或脐带血中分离单核球细胞的步骤；增殖、活化已分离的单核球细胞中的人类白细胞抗原一致淋巴细胞的步骤；分离已增殖、活化的人类白细胞抗原一致淋巴细胞并制备以此为主要成分的制剂的步骤。
6、如权利要求5所述的使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物的制备方法，其中人类白细胞抗原一致淋巴细胞的增殖与活化是在培养用培养基中进行培养的，所述培养用培养基中含有白介素-2和/或抗CD3抗体。
7、如权利要求5或6所述的使造血干细胞移植后附着生长稳定的组合物的制备方法，其中当培养是以增殖、活化人类白细胞抗原一致淋巴细胞为目的时，培养液中需添加各种细胞分裂素或促细胞分裂素。
8、一种用于产生人单克隆抗体的细胞株，该细胞株通过对免疫缺陷状态的动物，在移植前和移植后给予人类白细胞抗原一致活性淋巴细胞以促进附着生长稳定后，针对所述淋巴细胞进行抗原致敏，采用细胞株化、分离、基因的分离与表达等手段从该动物获得。
9、一种人多克隆抗体，该多克隆抗体通过将人造血干细胞移植到免疫缺陷状态的动物，在移植前和移植后给予人类白细胞抗原一致活性淋巴细胞，附着生长稳定后进行抗原致敏，从该动物提取。
10、一种用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，所述细胞株通过将人造血干细胞移植到免疫缺陷状态的动物，在移植前和移植后给予人类白细胞抗原一致活性淋巴细胞以促进附着生长，经抗原致敏，采用细胞株化、分离、基因的分离与表达等手段从该免疫缺陷动物获得。
11、如权利要求10所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中免疫缺陷状态的动物是重症复合免疫缺陷小鼠。
12、如权利要求11所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中重症复合免疫缺陷小鼠是SCID小鼠。
13、如权利要求10所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中给予的人类白细胞抗原一致人淋巴细胞是人类白细胞抗原一致人活性淋巴细胞。
14、如权利要求10所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中给予的人类白细胞抗原一致人活性淋巴细胞以CD4阳性细胞为主要成分。
15、如权利要求10所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中给予的人类白细胞抗原一致人活性淋巴细胞中，活性CD4阳性细胞占给予总细胞数的90％以上。
16、如权利要求10所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中对于给予的人类白细胞抗原一致人活性淋巴细胞，CD8阳性细胞的掺入率为给予的总细胞数的10％以下。
17、如权利要求10所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中，由免疫缺陷动物细胞株化抗原敏感淋巴细胞的方法是基于爱泼斯坦-巴尔病毒的细胞株化方法。
18、如权利要求10所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中，由免疫缺陷动物细胞株化抗原敏感淋巴细胞的方法是与人骨髓瘤细胞株进行细胞融合的细胞株方法。
19、如权利要求10-18中任何一项所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中使用的抗原是人类来源的。
20、如权利要求10-18中任何一项所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中使用的抗原可以是人源半抗原和载体蛋白的复合体。
21、如权利要求10-18中任何一项所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中使用的抗原可以是由人源小肽构成的多抗原肽。
22、如权利要求10-18中任何一项所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中使用的抗体是免疫球蛋白。
23、如权利要求10-18中任何一项所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株的制备方法，其中使用的抗体是IgG免疫球蛋白。
24、一种人单克隆抗体，由如权利要求8或10-23中任何一项所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株所产生。
25、一种编码人单克隆抗体的基因，其中所述人单克隆抗体由如权利要求8或10-23中任何一项所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株所产生。
26、一种导入了编码人单克隆抗体的基因的重组细胞，其中所述人单克隆抗体由如权利要求8或10-23中任何一项所述的用于产生人单克隆抗体的细胞株所产生。
27、一种人多克隆抗体的制备方法，该方法包括将人造血干细胞移植到免疫缺陷状态的动物，在移植前和移植后给予人类白细胞抗原一致活性淋巴细胞以促进附着生长，经抗原致敏，从该免疫缺陷动物提取所述多克隆抗体。
28、如权利要求27所述的人多克隆抗体的制备方法，其中给予的人类白细胞抗原一致人活性淋巴细胞是人类白细胞抗原一致人活性淋巴细胞。
29、如权利要求27所述的人多克隆抗体的制备方法，其中给予的人类白细胞抗原一致人活性淋巴细胞以CD4阳性细胞为主要成分。
30、如权利要求27所述的人多克隆抗体的制备方法，其中给予的人类白细胞抗原一致人活性淋巴细胞占给予的总细胞数的90％以上。
31、如权利要求27所述的人多克隆抗体的制备方法，其中对于给予的人类白细胞抗原一致人活性淋巴细胞，CD8阳性细胞的掺入率为给予的总细胞数的10％以下。
32、如权利要求27-31中任何一项所述的人多克隆抗体的制备方法，其中使用的抗原是人类来源的。
33、如权利要求27-31中任何一项所述的人多克隆抗体的制备方法，其中使用的抗原可以是人源半抗原和载体蛋白的复合体。
34、如权利要求27-31中任何一项所述的人多克隆抗体的制备方法，其中使用的抗原可以是由人源小肽构成的多抗原肽。
35、如权利要求27-31中任何一项所述的人多克隆抗体的制备方法，其中使用的抗体是免疫球蛋白。
36、如权利要求27-31中任何一项所述的人多克隆抗体的制备方法，其中使用的抗体是IgG免疫球蛋白。
37、如权利要求9或权利要求27-36中任何一项所述的人多克隆抗体。
CN2004800152691A 2003-06-03 2004-05-26 使造血干细胞移植后生长稳定的组合物及获取该组合物的试剂盒和多克隆抗体及其制备方法 Expired - Fee Related CN1798834B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003157996 2003-06-03
JP157996/2003 2003-06-03
JP2004138468A JP3876441B2 (ja) 2003-06-03 2004-05-07 造血幹細胞移植後の生着安定組成物、該組成物を得るためのキット、造血幹細胞移植後の生着安定方法、ヒトモノクローナル抗体あるいはヒトポリクローナル抗体およびそれらの製法、ヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子および該遺伝子が導入された形質転換体
JP138468/2004 2004-05-07
PCT/JP2004/007164 WO2004108909A1 (ja) 2003-06-03 2004-05-26 造血幹細胞移植後の生着安定組成物、該組成物を得るためのキット、造血幹細胞移植後の生着安定方法、ヒトモノクローナル抗体あるいはヒトポリクローナル抗体およびそれらの製法、ヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子および該遺伝子が導入された形質転換体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1798834A true CN1798834A (zh) 2006-07-05
CN1798834B CN1798834B (zh) 2013-06-19

Family

ID=33513370

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800152691A Expired - Fee Related CN1798834B (zh) 2003-06-03 2004-05-26 使造血干细胞移植后生长稳定的组合物及获取该组合物的试剂盒和多克隆抗体及其制备方法

Country Status (8)

Country Link
US (3) US20070025961A1 (zh)
EP (1) EP1637591A4 (zh)
JP (1) JP3876441B2 (zh)
KR (1) KR101193095B1 (zh)
CN (1) CN1798834B (zh)
AU (1) AU2004245792B2 (zh)
CA (1) CA2531569A1 (zh)
WO (1) WO2004108909A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102697583A (zh) * 2006-10-27 2012-10-03 世元世龙技术株式会社 医疗试剂盒和使用该试剂盒的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100068194A1 (en) * 2006-10-24 2010-03-18 Dong-Ku Kim Composition for in vivo transplantation for treatment of human cervical cancer comprising mononuclear cells derived from umbilical cord blood
KR20150127300A (ko) * 2008-05-30 2015-11-16 엑스바이오테크, 인크. 인터류킨-1 알파 항체 및 그의 사용 방법
CN108925548A (zh) * 2017-05-24 2018-12-04 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种冻存细胞制剂及细胞复苏方式
JP6977969B2 (ja) * 2019-03-22 2021-12-08 株式会社ガイアバイオメディシン 免疫細胞提供システム

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3607381A1 (de) * 1986-03-06 1987-09-10 Pascal Zimmer Verwendung von diphenylhydantoin und seinen derivaten zur behandlung von immunerkrankungen
US6352694B1 (en) * 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
GR1001034B (el) * 1989-07-21 1993-03-31 Ortho Pharma Corp Μεθοδος διεγερσης του πολλαπλασιασμου λεμφοκυτταρων περιφερειακου αιματος.
EP1978033A3 (en) * 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2227327A1 (en) * 1995-07-25 1997-02-13 Celltherapy, Inc. Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease
JP4186013B2 (ja) * 1996-07-15 2008-11-26 暉彬 関根 ウイルス感染症の治療・予防剤、その調製方法
JP4389039B2 (ja) * 1998-04-09 2009-12-24 株式会社リンフォテック アロジェニックな活性化ｃｄ４陽性細胞を主成分とする医薬組成物、およびその製造方法、ならびに該医薬組成物調製用キット
MXPA02008265A (es) * 2000-02-24 2004-09-10 Xcyte Therapies Inc Concentracion y estimulacion simultanea de calulas.
WO2001087058A1 (fr) * 2000-05-15 2001-11-22 Sonoko Habu Souris chimerique ayant une immunite creee par utilisation de cellules positives cd34 humaines et utilisation de cette souris
JP4917201B2 (ja) * 2000-12-04 2012-04-18 株式会社リンフォテック 臍帯血移植後の腫瘍および各種感染症の予防・治療用製剤、臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤、臍帯血移植後の腫瘍および各種感染症の予防・治療用製剤ならびに臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤の製造方法。
CA2439811A1 (en) * 2001-03-05 2002-09-12 Lymphotec Inc. Method of treating tumor and consignment system of proliferating and processing activated lymphocytes to be used in parallel to pdt
JP4562353B2 (ja) * 2002-04-08 2010-10-13 株式会社リンフォテック Ｈｌａ一致他人由来活性化リンパ球を含有してなる腫瘍・感染症および自己免疫疾患の予防・治療用製剤
US7435592B2 (en) * 2003-05-13 2008-10-14 Immunovative Therapies, Ltd. Compositions for allogeneic cell therapy

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102697583A (zh) * 2006-10-27 2012-10-03 世元世龙技术株式会社 医疗试剂盒和使用该试剂盒的方法
CN101528157B (zh) * 2006-10-27 2014-09-03 世元世龙技术株式会社 医疗试剂盒和使用该试剂盒的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1637591A4 (en) 2007-02-14
EP1637591A1 (en) 2006-03-22
AU2004245792B2 (en) 2009-07-02
KR101193095B1 (ko) 2012-10-19
WO2004108909A1 (ja) 2004-12-16
KR20060021874A (ko) 2006-03-08
CA2531569A1 (en) 2004-12-16
US20070025961A1 (en) 2007-02-01
AU2004245792A1 (en) 2004-12-16
JP3876441B2 (ja) 2007-01-31
US20100015593A1 (en) 2010-01-21
US20110097314A1 (en) 2011-04-28
US8394368B2 (en) 2013-03-12
CN1798834B (zh) 2013-06-19
JP2005013223A (ja) 2005-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1198642C (zh) 哺乳动物细胞激动素合成抑制因子的制药用途
CN1541113A (zh) 利用激活的t细胞使抗原提呈细胞成熟
CN1925843A (zh) 生产单克隆抗体的方法和组合物
CN101735982A (zh) 白介素15受体-白介素2复合物扩增淋巴细胞的方法
CN1084564A (zh) 反义多核苷酸
CN109593711A (zh) 扩增自然杀手细胞部份的扩增方法及用途
CN110317822A (zh) Trop2嵌合抗原受体、其t细胞及其制备方法和用途
US8394368B2 (en) Method for producing a composition for promoting survival of transplanted hematopoietic stem cell
CN1735428A (zh) 伴侣蛋白10的免疫抑制作用
CN1835679A (zh) 人源免疫活性细胞的制备方法
CN100497601C (zh) 人骨髓瘤细胞系
CN1528783A (zh) 一种法氏囊素的提取方法及其在疾病治疗和免疫中的应用
CN1545551A (zh) 针对丙型肝炎病毒e2糖蛋白的人单克隆抗体
CN86104913A (zh) 治疗癌和非恶性肿瘤的方法和组合物
CN1481901A (zh) 源于hla相匹配的供体的激活的淋巴细胞
CN1079400A (zh) 抗肿瘤方法和抗肿瘤剂
CN1557487A (zh) 预防和治疗疾病的免疫原性组合物及其制备方法
CN1737011A (zh) 抗hla－dr10的淋巴瘤特异性嵌合单抗
CN1847397A (zh) 抗ehec o157志贺样毒素ⅱa亚单位单克隆抗体5f3轻、重链可变区基因及应用
CN1823160A (zh) 单核细胞来源的自体的自身耐受性诱导细胞和它们在药物制剂中的用途
CN1506375A (zh) 具有广谱抗肿瘤作用的细菌蛋白天青蛋白及其用途和含有其的药物组合物
CN113416701B (zh) 一种nk细胞培养基及培养方法
CN1831121A (zh) 抗乙肝病毒人单克隆抗体的杂交瘤细胞系构建方法及应用
CN1189484C (zh) 重组抗人CD11a单克隆抗体及其制法和药物组合物
Sateesh Biotechnology-5: Animal Cells, Immunology & Plant Biotechnology

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130619

Termination date: 20190526