JP2005013223A - 造血幹細胞移植後の生着安定組成物、該組成物を得るためのキット、造血幹細胞移植後の生着安定方法、ヒトモノクローナル抗体あるいはヒトポリクローナル抗体およびそれらの製法、ヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子および該遺伝子が導入された形質転換体 - Google Patents

Abstract

【課題】ＨＬＡ一致活性化リンパ球を用いて造血幹細胞移植後の生着安定をはかる。
【解決手段】末梢血または臍帯血より分離した単核球細胞中のＨＬＡ一致リンパ球を増殖・活性化させた後、さらにこれを分離採取してＨＬＡ一致リンパ球を主成分とした造血幹細胞移植後の生着安定組成物として用いる。 これにより、造血幹細胞移植後の生着不全予防および生着促進治療等に幅広く使用することができる。なお、本発明組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、ヒト化抗体を0.2 〜20mg/kg/日投与する。 投与は、一日一回（単回投与または連日投与）または間歇的に１週間に１〜３回、２、３週間に１回静脈注射により行う。

Description

本発明は、特に造血幹細胞の移植で問題になる生着の不全あるいは、生着後の抗体産生の立ち上がりや免疫応答の不具合を改善し、また種々の感染症の発症や癌の再発を低下させるために使用する造血幹細胞移植後の生着安定組成物、該組成物を得るためのキット、造血幹細胞移植後の生着安定方法、ならびにヒトの各種疾患の治療に使用するヒトモノクローナル抗体もしくはヒトポリクローナル抗体の製法に関する。

細胞の移殖、とくに造血幹細胞移植患者においては、種々の感染症の発症や癌再発の危険があるために、これまでその対応のための種々の研究がおこなわれてきた。 本発明者の１人である関根は、リンパ球を固相化した抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２により増殖できること、及びこれによって増殖させた自己由来リンパ球が抗腫瘍効果を有することを既に報告している（特開平３−８００７６号公報）。

また抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２により増殖させた自己由来リンパ球が先天性免疫不全患者のウイルス感染症に有効であることも既に報告した〔伊藤仁也、関根暉彬；医学のあゆみ、１８１巻、６号、４２６−４２７頁（１９９７年）〕。 さらに造血幹細胞移植の分野において、患者とドナーの白血球血液型であるＨＬＡ（human leukocyte antigen）によりＡ，Ｂ，Ｃ，ＤＲ，の４つの座、さらにはＤＱ，ＤＰといったいくつかの主要なＨＬＡ分子の一致が認められれば骨髄移植や輸血がおこなわれている。

さらに１９７５年にケーラーとミルスタインが細胞融合技術を確立して以来、種々のモノクローナル抗体が作成され、分析，測定，診断あるいは治療に応用されている。 現在までに報告されているモノクローナル抗体はほとんどが動物、特にマウス由来であり、免疫動物の抗体産生細胞を細胞融合法を用いて不死化することによって取得されている。 モノクローナル抗体は、抗体サブクラスにおいて均一であり、抗原結合特異性が高く、非常に小さなクリアランスをもつという点から考えても魅力ある薬物キャリアーであり、これを利用した新たなDrug Delivery System（ＤＤＳ）が検討されている。
特開平３−８００７６号公報 伊藤仁也、関根暉彬；医学のあゆみ、１８１巻、６号、４２６−４２７頁（１９９７年）

しかし、抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２により増殖させた自己由来リンパ球が抗腫瘍効果あるいは先天性免疫不全患者のウイルス感染症に有効であるとしても、それだけでは必ずしも十分な効果を期待できる段階ではない。 またＨＬＡの主要な分子の一致した場合に骨髄移植や輸血をおこなう場合にも、ＨＬＡの不一致による骨髄移植やＤＬＴ治療は患者に対して致死的な副作用、すなわち輸血後移植片対宿主病｛ Post Transfusion-Graft versus HostDisease, （以下、単に「ＰＴ−ＧＶＨＤ」と略す）｝をもたらす危険がある。

さらにモノクローナル抗体についても、前記したように動物を抗原感作させて得られる動物由来の抗体は、ヒトへ投与した場合、抗体自体が免疫原性を示すことが懸念され、治療薬として常用することは困難である。 この免疫原性を避けるために、動物由来のモノクローナル抗体を例えばＦab2，Ｆ(ab)'2 などへフラグメント化あるいはヒト抗体とのキメラ化やヒト化するなどの手法により抗原性を低下させる、あるいは実際の患者からスクリーニングして得られた抗体産生細胞やイン ビトロ（ in vitro）感作させたヒトリンパ球を用いてヒト抗体産生細胞株を樹立する手法などが検討されている。

しかし、いずれの手法も抗原性の残留、あるいはヒト抗体産生株樹立の困難性、細胞培養時の抗体生産能の低下や等の点で問題があり、別のアプローチによる簡便かつ効率的なヒト抗体の樹立方法の確立が強く望まれている。 またポリクローナル抗体についても、モノクローナル抗体と同様な問題を抱えており、これをヒトに対して安全かつ効率的に投与するために種々の手法が検討されている。

本発明者らは、移植した細胞、特に造血肝細胞の生着性を改善するための薬剤や方法を開発することを目標にして鋭意研究をおこなった結果、移植した造血幹細胞とＨＬＡが一致した細胞をインターロイキン２と抗ＣＤ３抗体により刺激・増殖させた後、これを患者に投与することにより移殖患者への肝細胞の生着性を改善させることが可能なＨＬＡ一致活性化リンパ球を調製することに成功した。

さらに、ヒト造血幹細胞を移植した免疫不全マウスにＨＬＡ一致ヒト活性化リンパ球を投与しながら抗原感作することによって効率的にヒトモノクローナル抗体を産生させることに成功した。 すなわち主要な発明の具体的なものを掲げれば、請求項１の発明は、末梢血または臍帯血より分離した単核球細胞中のＨＬＡ一致リンパ球を増殖・活性化させた後、さらにこれを分離採取してＨＬＡ一致リンパ球を主成分とした造血幹細胞移植後の生着安定組成物に関する。

また請求項４の発明は、ＨＬＡ一致リンパ球を含んだ末梢血または臍帯血より単核球細胞を分離する工程と、分離した単核球細胞中のＨＬＡ一致リンパ球を増殖・活性化させる工程と、増殖・活性化させたＨＬＡ一致リンパ球を分離して、これを主成分とする製剤に調製する工程とからなる造血幹細胞移植後の生着安定組成物の製法に関する。

さらに請求項７の発明は、末梢血または臍帯血より採取した血液よりＨＬＡ一致リンパ球を分離する器具と、インターロイキン２を含む培養液および抗ＣＤ３抗体固相化フラスコの何れか一方又は双方とからなる増殖・活性化器具と、該増殖・活性化器具により培養されたＨＬＡ一致リンパ球を取り出す器具とからなる造血幹細胞移植後の生着安定組成物を得るためのキットに関する。 さらに請求項８の発明は、哺乳類に対する移殖の前又は後にＨＬＡ一致活性化リンパ球を投与し、生着安定後に抗原を感作し、該哺乳類から抗原感作リンパ球を株化あるいは分離あるいは、遺伝子分離・発現等の手法により採取したヒトモノクローナル抗体産生細胞株に関する。

さらに請求項９の発明は、ヒト造血幹細胞をＳＣＩＤマウスなど重篤複合免疫不全マウスのような哺乳類に移植し、更に該移植前あるいは移植後にＨＬＡ一致活性化リンパ球を投与することにより生着を促進後、抗原を感作し、該哺乳類から抗原感作リンパ球を株化あるいは分離あるいは、遺伝子分離・発現等の手法により採取するようにしたヒトモノクローナル抗体産生株の製造法に関する。

本発明はＨＬＡ一致増殖活性化リンパ球、もしくは増殖させたドナー血細胞を主成分とするＨＬＡ一致活性化リンパ球を含有させたことを特徴とする造血幹細胞移植後の生着不全予防および生着促進用製剤であるために、移植時に幹細胞の生着促進等に幅広く使用することができる。 また、幹細胞の生着促進に使用できるほか、各種臓器などの生着促進用としても使用でき、また哺乳類にヒト造血幹細胞移植を行い、ＨＬＡ一致増殖活性化リンパ球と免疫原を投与することにより、特異性、抗原との結合能が高い抗体を獲得できる。 またその抗体を産生する細胞を利用し、ヒト型モノクローナル抗体を効率的に産生することができる。 またヒト造血肝細胞移植をおこない、ＨＬＡ一致増殖活性化リンパ球を投与した哺乳類を利用し、抗ウイルス薬、抗がん薬、抗高血圧薬等の薬剤のスクリーニングとしても広く使用が可能である。

これらの発明の具体的な内容について以下において順次説明をする
〔ＨＬＡ一致〕
本発明においてＨＬＡ一致とは、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲの四つの座、さらにはＤＱ、ＤＰといったいくつかの主要なＨＬＡ分子のうち、少なくとも３座以上一致していればＨＬＡ一致とする。

〔リンパ球の採取〕
増殖・活性化するためのＨＬＡ一致リンパ球は、次の手法により採取することができる。 すなわち本発明におけるＨＬＡ一致活性化リンパ球は、造血幹細胞のドナーの末梢血、リンパ節、骨髄、各種体液などから採取したリンパ球を材料として調製できる。 また造血幹細胞を培養することによりＨＬＡ一致活性化リンパ球を調整することもできるが、ドナーの末梢血から調製したリンパ球を材料とするのが効率性の面で最も望ましい。 また造血肝細胞のドナーとＨＬＡが少なくとも３座以上一致している活性化リンパ球を調整し、これを用いることも可能である。

採血方法としては腕の静脈からの採血が簡便で好ましいが、リンパ球を含むものであればいずれのものも材料とすることができる。 また臍帯血を材料とすることもできる。 採血量としては０．００１ｍｌから５００ｍｌ程度の微量の血液でよく、１０ｍｌから１００ｍｌ程度の範囲内の血液採取が好ましい。 さらに採血した血液には凝固が起こらないようにヘパリンやクエン酸を加えることができる。

〔ＨＬＡ一致リンパ球の培養増殖・活性化〕
採取したＨＬＡ一致リンパ球は以下の手法により培養増殖・活性化がおこなわれる。 なお本発明において、採取したリンパ球について「培養」とは、細胞組織の小片を、細胞が生きていくのに必要な栄養源を含む培養液中に入れ、組織細胞を人工的に増殖（インキュベーション）させることを、また「増殖」とは、上記した培養により、インビトロで人工的に組織細胞を量的に増加させることを意味する。 さらに「活性化」とは、上記した培養液中に増殖因子や活性化因子を加えて細胞を刺激することにより、沈滞している機能を活発に働くよう制御すること、さらに具体的には生着不全予防、生着促進特性を持たせることを意味する。

ＨＬＡ一致活性化リンパ球の増殖については、周知のリンパ球細胞の培養法によって実施することができ、またその培養法は、特に限定されるものではないが、例えば、特開平３−８００７６号公報に記載のように、インターロイキン２や抗ＣＤ３抗体の何れかを単独にて、又はこれらを組合わせて存在させて培養することにより行うことができる。 この場合において、増殖効率向上の観点からは、インターロイキン２及び抗ＣＤ３抗体両方の存在下において培養することが好ましい。

またリンパ球の増殖・活性化には、上記インターロイキン２や抗ＣＤ３抗体だけでなく、各種のサイトカインや抗ＣＤ２８抗体や各種のマイトージェンを使用することができる。 この場合、リンパ球を増殖・活性化させる機能を有する物質であればいずれの物質も使用できる。 さらに、この場合に使用するインターロイキン２は、市販されているものを用いることができ、培養用培地液１〜２０００Ｕ／ｍｌの濃度となるように用いるのが好ましい。

またインターロイキン２は、水、生理食塩液、ダルベッコりん酸緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＡＩＭ−Ｖ等の一般に広く用いられる細胞培養用培地液等に溶解して使用することができる。 一度溶解したものは、活性の低下を防ぐため、冷蔵保存することが好ましい。 なおこの場合に使用される培養用培地液としては、リンパ球細胞の培養に適したものであれば特に制限されず、例えば血清等の生物由来の培養液、平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などを加えた合成培地などが使用でき、ＲＰＭＩ−１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が好ましいものとして挙げられ、とりわけてＲＰＭＩ−１６４０が特に好ましい。

この場合に使用する培養用培地は、正常ヒト血清を添加したものが増殖効果に優れるので好ましく、またこれらの培地は市販品を用いることもできる。 さらに上記のヒト血清以外にもウシ胎児血清を使用することもできる。 また、血清を含まないような無血清培地を使用することもできる。 培養は、一般的な細胞培養の方法、例えばＣＯ２インキュベータ内で行うことができる。 ＣＯ_２濃度は１〜１０％の範囲内、望ましくは３〜７％の範囲内であるのが好ましく、温度は、３０〜４０℃の範囲内であって、特に３５〜３８℃が好ましい。

この培養には、日数に特に制限はないが、抗ＣＤ３抗体の刺激情報が細胞に伝達されることが前提となるため、２〜３０日間程度行うことが好ましく、特に３〜２１日間おこなうことが、細胞に対する安定した刺激情報伝達を可能にするとともに培養効率向上の観点から理想的である。 この培養の期間内には、顕微鏡下で細胞の状態を観察し、適宜細胞数を計測しながら、培養液を適宜追添加するようにするのが培養効率向上のためには一層好ましい。 なおこの培養では、通常、培養開始１〜２日目には目立った細胞の増殖はないが、３日目頃から細胞増殖が観察され、順調に増殖しだすと培養液がオレンジ色から黄色に変化するようになる。

なお培養液の追添加量は、添加前の培養中の培地液量に対して０．１〜５倍程度の追添加が好ましい。 また追添加の割合は、培養液の劣化及びインターロイキン２活性の低下を防ぐために、１〜７日、望ましくは３〜５日に１回おこなうものとする。 さらに抗ＣＤ３抗体存在下での培養後、抗ＣＤ３抗体による刺激無しに培養を継続することもできる。 すなわち、抗ＣＤ３抗体を固相化していない器具、例えば培養用フラスコ、ローラーボトル、培養用ガスパーミアブルバッグ等で投与まで培養を継続することができる。

これら条件下でのリンパ球細胞の培養は、抗ＣＤ３抗体による刺激がないこと以外は、抗ＣＤ３抗体存在下での培養の条件と同じであることが好ましく、しかもヒト血清の濃度、無血清培地を適時使用することが、作業性、コスト性、安全性等において、より一層好ましい。

また培養に際しては、例えばインターロイキン２を含む培養用培地液に臍帯血あるいは単核球細胞を浮遊させ、抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器に入れ培養を開始することができる。 さらにこの場合、必要により培養液中に各種サイトカインや、マイトージェンを添加使用するとリンパ球の増殖・活性化の効率がより一層向上する。 なお、リンパ球細胞の刺激に用いる抗ＣＤ３抗体は、精製したＣＤ３分子を用いて動物又は細胞に産生させることもできるが、安定性、コスト等に優れた市販のＯＫＴ３抗体（製造元：オーソファーマスーティカル）が使用できる。

しかし、これ以外にもリンパ球の増殖・活性化を促進できる抗体であれば、特に限定されるものではなく、このほかにも例えば抗ＣＤ２８抗体なども使用できる。 また抗ＣＤ３抗体は、リンパ球の増殖効率、操作の容易性の観点から、固相化して用いるのが好ましい。 抗体を固相化する器具としては、ガラス、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレン等の材質の培養容器が挙げられる。この場合、入手が容易であることから市販のプラスチック製の滅菌済み細胞培養フラスコ等を使用することもでき、その大きさは適宜選択できる。

また固相化は、抗ＣＤ３抗体の希釈液を上記した固相化する器具に添加し、例えば、４〜３７℃で２〜２４時間静置することによって行うことができる。 なお本抗ＣＤ３抗体の固相化には、抗ＣＤ３抗体を、滅菌したダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液中に０．１〜３０μｇ／ｍｌの濃度に希釈して用いることが好ましい。 また固相化後、使用時までコールドルームや冷蔵庫（４℃）で保存することも可能で、この場合には使用時に液を除去して、必要あれば、常温のダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液で洗浄して使用することができる。

上記により増殖して得られたＨＬＡ一致末梢血由来活性化リンパ球は、これを加工し、あるいは後記するように製剤化し、これを例えば移植後の生着不全防止や生着促進の治療薬等、生体防御手段として広範囲に使用が可能である。

さらに移殖に際し、ＰＴ−ＧＶＨＤ（輸血後移植片対宿主病）その他、何らかの副作用が生じる恐れがある場合には、調製された末梢血由来活性化リンパ球に対し、抗ＣＤ４抗体等を使用して加工し、主にＣＤ４陽性細胞を含むような細胞集団となるように調製して用いるのが有効である。

またＧＶＨＤなどの副作用が生じる恐れが少ないか、あるいは、生着不全防止や生着促進に加えて抗腫瘍効果や抗ウイルス効果を期待する場合は、ＣＤ８陽性細胞を含んだものの使用が効果的である。 またこの場合、ＣＤ８陽性細胞の含有率を適当に調製した細胞集団として治療に用いることもできる。

〔ＨＬＡ一致活性化リンパ球を主成分とする製剤〕
さらに増殖させた細胞を主成分とするＨＬＡ一致活性化リンパ球に、例えばヒトアルブミンを含む輸液用生理食塩液中に懸濁した形態で製剤化することにより、生着不全防止や生着促進の治療用製剤として用いるなど、各種の医薬用コンポーネントを添加して製剤化することもできる。 なおここでいう「製剤」とは、活性化リンパ球を主成分として含有した生体防御機能を有するすべての材料を意味し、ＨＬＡ一致活性化リンパ球を含んでいればどのような形態でも良い。

例えば、適当な溶液にＨＬＡ一致活性化リンパ球を懸濁させた形態のものでもよく、この場合特に上記したヒトアルブミンを含む輸液用生理食塩液にＨＬＡ一致活性化リンパ球を懸濁した形態の製剤が好ましいが、これに限定されるものではない。

またこの場合、末梢血又は臍帯血を直接に試験管内で増殖させ、この中からＨＬＡ一致活性化リンパ球を主成分として含む製剤を調製するか、または、末梢血又は臍帯血より単核球細胞を分離し、これを試験管内で増殖させることによりＨＬＡ一致活性化リンパ球を主成分として含む製剤を調製し、製造することもできる。 また本発明の製剤に含まれるＨＬＡ一致活性化リンパ球は、種々の遺伝子を導入したり、本来持っているような遺伝子を欠落あるいは変異させたものであってもよい。

〔ＨＬＡ一致活性化リンパ球を主成分とする製剤の調製用キット〕
本発明のＨＬＡ一致活性化リンパ球は、製剤としてその構成成分を単独の試薬として使用できるほかに、例えばインターロイキン２を含む培養液と抗ＣＤ３抗体固相化フラスコを構成成分として組合わせたキットとして作成し、これを使用することにより、より手軽に本発明の製剤の調製を行うことができる。

なおこの場合に使用する培養液は、抗ＣＤ３抗体固相化フラスコに予め分注しておくことができ、さらにこれを凍結保存しておくこともできる。 このように、少なくとも２個以上の構成成分を複数の試薬として組合わせたキットとして作成し、活性化リンパ球必要時にこれを使用することにより、より容易に本発明の製剤の調製をおこなうことができる。

上記した本発明のすべてに用いることの可能なＨＬＡ一致活性化リンパ球あるいはそれを含む製剤は、これを冷凍保存し、必要に応じて生着不全予防あるいは生着促進などの生着安定に使用することができる。 なおＨＬＡ一致活性化リンパ球は、以下の方法により凍結保存することができる。

保存するＨＬＡ一致活性化リンパ球は、その大きさ等により細胞保存液に懸濁する密度が適宜選択できるが、１×１０^３個／ｍｌから１×１０^１０個／ｍｌ密度で保存液中に懸濁し、凍結保存することができるが、１×１０^５個／ｍｌから１×１０^８個／ｍｌ密度で保存液中に懸濁し、凍結保存するのが望ましい。 またこの場合に使用される細胞保存液の液量も特に規定されるものではないが、便宜性から考えて０．１ｍｌから１，０００ｍｌの範囲内において使用できるが、０・５ｍｌから１００ｍｌの範囲内がより望ましい。

凍結保存に際しては、市販の細胞保存液が使用できるだけでなく、自家調製した細胞保存液も使用できる。 細胞保存液の成分としては、適当な緩衝液あるいは基礎培地に血清あるいはタンパク質、多糖類等の高分子物質やジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯと略すことがある）を含むものが使用できるが、保存するＨＬＡ一致活性化リンパ球によって列挙される物質が必ずしも全て必要とされるわけではない。そのため、ＨＬＡ一致活性化リンパ球保存ができる細胞保存液であれば、その組成は限定されない。 ＨＬＡ一致活性化リンパ球は、適当な細胞保存液に懸濁され低温下で凍結保存される。

〔投与量〕
さらにＨＬＡ一致活性化リンパ球を主成分とする製剤の投与量については、移殖患者の状態や治療対象等により、適宜増減して使用するものとするが、通常の場合においては、体重１Ｋｇあたりのリンパ球投与量が、１×１０^２個から１×１０^９個が目安である。また効力をより一層増大させるためには、１×１０^３個以上であることが好ましく、また５×１０^８個を超えても、それ以上の効力増大が見込めないところから、体重１Ｋｇ当り１×１０^３個〜５×１０^８個の範囲が最良である。

〔投与形態・方法等〕
さらに上記した製剤の投与形態としては、注射剤、点滴剤等の液体が好ましく、前記した細胞をヒト血清アルブミンが０．０１〜５％となるように添加した生理食塩液に分散した注射剤又は点滴剤がより好ましい。 投与方法としては、静脈への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が好ましい。 投与する液量は、投与方法、投与する部位等によっても異なるが、通常は１〜５００ｍｌとするのが好ましく、この液量中に前記したリンパ球投与量の細胞が含まれるようにするのがより好ましい。 さらに投与頻度は１回／日〜１回／月が良く、また投与回数は少なくとも１回以上は必要である。

〔ヒト型モノクローナル抗体の製法〕
つぎに、細胞移植後における安全で、しかも生着性の良好なヒト型モノクローナル抗体の動物を用いた効率的な製造方法について説明する。 具体的には免疫不全状態の動物に対する移殖の前又は後にＨＬＡ一致活性化リンパ球を投与し、生着安定後に抗原を感作し、該動物から抗原感作リンパ球を株化あるいは分離あるいは、遺伝子分離・発現等の手法により採取するものである。

ここで用いられる免疫不全状態の動物について説明すると、具体例としてはウシ、馬、羊、やぎ、ウサギ、モルモット、ラット、ニワトリ、アヒル等であり、中でも管理性や簡単操作の面ではマウスが挙げられる。 さらにマウスのなかでもＳＣＩＤ（severe combined immunodeficiency：以下「ＳＣＩＤ」と称する）マウスは、ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖のアロタイプ共通遺伝子（ allotype congenic）系マウスであるＣ．Ｂ−１７マウスより、血中免疫グロブリン濃度の極端に低いマウスとして知られ、重篤複合免疫不全で重症の免疫不全症を呈している。

このようにＳＣＩＤマウスは免疫系の主要な担当細胞である成熟ＴおよびＢ細胞を欠損しているところから、これらの分子を発現するために不可欠な遺伝子の再構成に関わる酵素（ recombinase）群に異常があり、特に recombinaseの基質特異性に欠陥があることがわかっている。 そのために、ＳＣＩＤマウスでは自己の抗体はほとんど産生されず、したがって抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）も認められないにもかかわらず、抗原提示細胞やＮＫ細胞の機能については異常は認められていない。

ヌードマウスやＴＣマウス（ Transchromo Mouse）、あるいは放射線照射によって一次的に免疫機能を失わせたマウスとは異なるこのようなＳＣＩＤマウスの特質を応用して、異種動物の各種組織、や腫瘍を移植した抗癌剤の作用機能の解析、あるいは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）やエプスタイン バー ウイルス（ＥＢＶ）などのヒトに特異的な感染症のモデルの作製に利用され、またヒト胎児胸腺と胎児肝の小片を腎皮膜下に組織学的構造を保持したまま移植したＳＣＩＤ−huマウスと呼ばれるもの、あるいはヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を腹腔内に移植したhu−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスと呼ばれるものが知られる。

後者はマウスを免疫することにより破傷風毒素やＢ型肝炎ウイルスＣ抗原に対するヒト抗体を誘導できる。 また自己免疫疾患モデルへの応用も期待できるなど、ＳＣＩＤマウスは種々の異種異系の組織、特にヒト組織の移植により他の動物では得られないヒト型病態を示すモデル動物となり得る。

そこで本発明においては、ヒトモノクローナル抗体の増産手段として、これらのＳＣＩＤマウスを利用するものである。 本発明において利用されるＳＣＩＤマウスは通常５ないし１５週令、好ましくは８ないし１２週令のＳＣＩＤマウスを用いる。

具体的には、ヒトの幹細胞を含む末梢血、骨髄液、臍帯血または免疫系組織、例えば脾臓などから公知の方法で精製したヒトリンパ球画分を生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の細胞および生体に影響を与えない溶液に懸濁した１×１０^７個から５×１０^８個、好ましくは約１×１０^８個のヒトリンパ球をＳＣＩＤマウスの腹腔内あるいは静脈内に移植する。

この場合に、移植手段の１つとして、免疫隔離膜に封入した移植細胞を腹腔内に移植する方法を採用してもよい。 この方法では、免疫隔離膜により移植後に移植細胞と宿主の組織が接触しないため、ＧＶＨ（ graft-versus-host；移植片対宿主）反応が抑えられ、目的とする抗原に対する抗体産生の効率を高められる。

ヒト抗原特異抗体産生細胞の回収は通常移植後７日ないし６０日の間に行うが、なかでも７日ないし２８日、特に２５ないし２８日の間が好ましい。 特に回収効率の点から移植後７日目ごろから毎週、ＳＣＩＤマウスの眼窩より適量の血液を採血し、ヒト抗体量の上昇およびヒト抗原特異抗体価の上昇を検査することが好ましい。

ヒト抗体量およびヒト抗原特異抗体価の測定には、酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略記することがある）、受動的赤血球凝集反応法、蛍光抗体法、オクタロニー法、ドットイムノアッセイ法など様々なものがあるが、抗原が可溶性抗原の場合、公知の抗ヒトイムノグロブリン抗体と目的とする抗原を固相化したイムノプレート（例えば、ヌンク社、デンマーク製など）を使用する酵素免疫測定法が適当である。 これらの方法によれば高い抗体量、抗体価を示したＳＣＩＤマウスよりヒト抗体産生細胞を回収することが可能である。

さらにＳＣＩＤマウスの各臓器からも、適宜、抗体産生細胞の回収をすることができるが、なかでもリンパ節から回収すると、回収率、純度の点で非常に有利である。 本発明で得られるヒトモノクローナル抗体産生細胞は従来の試験管内におけるヒト抗体産生細胞の誘導に比べ、抗体価測定またはプラーク法や蛍光免疫測定法などでヒト抗体産生細胞を誘導し得る点において非常に優れており、ヒトモノクローナル抗体取得に非常に有利である。

また本発明のヒト抗体産生細胞の回収および精製の具体的な方法としては、例えば以下の方法が用いられる。 最初に各臓器を物理的に単細胞化し、ここで臓器から回収した細胞に占める抗体産生細胞の割合が大きければ、そのまま抗体産生細胞の株化に用いることができるが、抗体産生細胞の純度が低いとき、例えばＳＣＩＤマウスの細胞の混入が甚だしい場合は比重遠心法、あるいは抗原を用いたパンニング法、あるいはマウスの細胞を除去するために抗マウス細胞抗体と補体を用いた細胞溶解法、または公知の抗ヒトＢ細胞抗体を用いたアフイニティーカラム法などで精製することにより抗体産生細胞の純度を上昇させる。

次に、精製されたヒト抗体産生細胞は以下のような方法で株化することができる。 株化の方法としては主にエプスタインバーウイルスによる形質転換法、または適当な増殖性の細胞と融合することによる細胞融合法が挙げられる。 エプスタインバーウイルスによる形質転換には公知の方法で調製されたエプスタインバーウイルス、例えば細胞株Ｂ９５．８の培養上清などをヒト抗体産生細胞を増殖培地に０．５ないし５×１０^７ 個／ｍｌで懸濁したものに対して１：１０〜１０：１の割合で添加し、３７℃で１時間ないし１８時間反応させる。

反応後、室温で遠心し増殖培地で１×１０^６個／ｍｌないし１×１０^５個／ｍｌの細胞濃度で９６穴プレートに０．１ｍｌずつ分注する。 さらに３７℃のＣＯ_２インキュベータのようなフラン器で培養し、７日ないし３０日の間に形質転換細胞の増殖が認められた穴の培養上清を採取して、それを上記に示したようなＥＩＡなどの適切なスクリーニング系を用いて、目的とする抗体を産生している形質転換細胞を単離する。

細胞融合法は公知の方法によって実施され、融合剤としてポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略記することがある）、センダイウイルスなどが用いられる。 また、融合剤を用いない電気融合法を用いることもできるが好ましくはＰＥＧが用いられる。 またＰＥＧとしては、平均分子量１０００〜９０００のものが用いられ、特に好ましくはＰＥＧ４０００またはＰＥＧ６０００が用いられる。

この場合の濃度は１０ないし８０％、好ましくは４０ないし５０％の範囲で用いる。細胞融合に使用する親株としては、どのような親株でも使用できるが薬剤マーカーが導入されたものが好ましい。 また、好ましくはヒトミエローマおよびヒトリンフォーマ細胞株、特に好ましくはヒトリンフォーマＡＣ−３３株、ヒトリンパ芽球細胞株としてＬＩＣＲ−２もしくはＳＫＯ−００７があげられる。 細胞融合はＳＣＩＤマウスより得られた抗体産生細胞と適切な細胞株、好ましくはヒトミエローマおよびヒトリンフォーマ細胞株、特に好ましくはヒトリンフォーマＡＣ−３３株を適当な無血清培地で洗浄し、通常１：１ないし１０：１の比率で混合し、室温で７００回転、５分間遠心して細胞ペレットを得る。

さらに細胞ペレットを３７℃の恒温槽で温めながらほぐし、予め温めておいたＰＥＧ溶液を徐々に加えながら混ぜる。 通常ＰＥＧ量は１０^８個細胞当たり１ｍｌ加えられるが、必要に応じて増減してもよい。 ついで予め温めておいた培地を細胞溶液に徐々に滴下しＰＥＧ濃度を下げていく。 通常は１０分位の時間をかけて１ないし３０ｍｌの培地を加える。

さらに室温で遠心して細胞を集め、１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳと略記することがある）を含む培地で親細胞株として１ないし５×１０^５個／ｍｌの細胞濃度で１晩放置後、ＨＡＴおよび１０％ＦＣＳを含む培地（ＨＡＴ培地）を添加する。 またこの操作を省略するために細胞融合後、細胞を直接ＨＡＴ培地に懸濁してもよい。 その後２ないし３週間に数回の培地交換を行う。

培地の交換方法としては培地０．１から０．２ｍｌを除き、新鮮な等量のＨＡＴ培地を加える。 この間、ハイブリドーマの出現が認められれば、出来るだけ早急に上記に示したようなＥＩＡなどの適切なスクリーニング系を用いて、目的とする抗体を産生しているハイブリドーマ細胞を単離する。 得られたハイブリドーマは直ちに適当な方法でクローニングを行う。

細胞培養に使用する液体培地としては、一般的にダイゴＴ培地（日本製薬）ダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地などが挙げられる。 エプスタインバーウイルスによる形質転換法の場合は、これらの培地に約２０％ＦＣＳを添加し増殖培地とする 。細胞融合法では１０ないし１５％のＦＣＳを添加して増殖培地とする。 こうして得られたヒト特異抗体産生細胞株からは公知の方法でヒトモノクローナル抗体を得ることができる。

例えば、ＳＣＩＤマウスの腹腔にヒト抗体産生細胞株を移植することにより、マウスハイブリドーマなどと同様なモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水が得られる。 また、適当な無血清培地、例えばＧＩＴ培地（日本製薬）、ＨＢ１０４（ハナメディア社）、ハイブリティ１（日本薬品開発社）などを用いて、大量培養を行うことも可能である。 これら腹水もしくは培養上清から公知の分離、精製法を適切に組み合わせれば高純度のヒトモノクローナル抗体を大量に得ることができる。

この場合、例えば抗体を含む溶液を遠心分離後、上清液を塩析する。 この際に通常は硫酸アンモニウムを用いる。 得られた蛋白沈殿物を適当な緩衝液に溶解し透析後、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥイオン交換カラム、ヒドロキシルアパタイトカラム、ゲル濾過カラム、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムなど）、イムノアフィニティクロマトグラフィなどに供し、目的とするヒトモノクローナル抗体を分離、精製することができる。 これらの方法で精製したヒトモノクローナル抗体の純度は９９．９％以上であり、医薬用薬剤としてヒトに投与する場合に好都合である。

また抗体のクラスには、IgA 、IgM 、IgG 、IgD 、IgE があり、さらにIgG はマウスの場合IgG1、IgG2a 、IgG2b 、IgG3（ヒトではIgG1、IgG2、IgG3、IgG4) の４つのサブクラスに分かれる。 動物に抗原を投与した場合、作られる抗体はほとんどの場合IgM かIgG である。 IgG は分子量およそ１６万で２量体構造を持ち、比較的扱いやすい分子である。 これに対しIgM は分子量がおよそ９０万という大きな分子であり、Ｊ鎖でつながれた複雑な５量体構造で存在しているため、精製が困難であること、凝集を起こしやすく保存が難しいこと、蛋白分解酵素による部分分解で失活しやすくFab を作製することが難しいこと、抗癌剤や毒素などを化学結合させるなどの化学修飾すると結合活性を失う場合が多いことなどの欠点がある。

さらに、癌に対する治療効果においてIgG クラスのモノクローナル抗体とIgM クラスのモノクローナル抗体のどちらが優れているかについては、バーンスタイン(Bernstein) らがリンパ球のThy-1 抗原に対するIgG クラスとIgM クラスのモノクローナル抗体を用いて詳細に検討している〔モノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies),R.H.Kennet, T.J.McKearnand K.B.Bechtol編集，Plenum Press, 1980, p.275)〕。

それによると、Thy-1 抗原陽性リンパ球に対し同じ強さの反応性を有するIgG クラスとIgM クラスのモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を比べた結果、in vitroの補体依存性抗腫瘍効果はIgM モノクローナル抗体が優れていたにもかかわらず、担癌マウスを用いて調べたin vivo の抗腫瘍効果では、IgG クラスのモノクローナル抗体に有意な抗腫瘍効果が認められたのに対し、IgM クラスのモノクローナル抗体には抗腫瘍効果が認められなかった。

さらに、マウスにアイソトープで標識したモノクローナル抗体を投与して血中半減期を調べたところ、IgG クラスのモノクローナル抗体に比べIgM クラスのモノクローナル抗体の血中半減期が非常に短いことが明らかになった。 このような結果は、ヒトの臨床に使われるモノクローナル抗体はIgG クラスが好ましいことを示している。

また本発明のヒト化抗体は、単独でまたは少なくとも１種以上の製剤上許容される補助剤と共に用いることができる。 例えば、ヒト化抗体を、生理食塩水やグルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して適当な医薬組成物とすることができ、あるいはヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を作成することができ、さらに本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば、製剤上許容される塩等を含有することができる。

なお、本発明組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、ヒト化抗体を0.2 〜20mg/kg/日投与する。 投与は、一日一回（単回投与または連日投与）または間歇的に１週間に１〜３回、２、３週間に１回静脈注射により行う。

〔ヒトモノクローナル抗体産生株から遺伝子工学的にヒトモノクローナル抗体を製造する方法〕
本発明のヒトモノクローナル抗体産生株からヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子を遺伝子工学的に抽出し、それを発現可能なベクターに組み込み、宿主となる細胞に導入し、ヒトモノクローナル抗体を産生可能な形質転換体として得ることができる。

本発明に用いる遺伝子は、通常用いられる方法およびその他の様々な方法で取得し、クローニングすることができる［L. G. Davisら編：ベーシック・メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジー（Basic Methods in Molecular Biology），エルスビアー（Elsevier）発行、ニューヨーク（New York），１９８６、およびJ. Federら：アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネテイックス（Am. J. Hum. Genetics），３７，６３５（１９８５）］。

また本発明に用いられる mＲＮＡについても、通常用いられる公知の方法で調製し、それを材料にしてcＤＮＡを作製しクローニングすることができる［J. Sambrookら編：モレキュラー・クローニング−ラボラトリー・マニュアル−（Molecular Cloning−A Laboratory Manual−），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・ブレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）発行，ニューヨーク（New York），１９８９］。

例えば、公知の方法により、ゲノムライブラリーから得ることができる。すなわち、まず細胞の遺伝子を標準的な方法で調製する。例えば、細胞にドデシル硫酸ナトリウム〔Sodium Dodecyl Sulphate （ＳＤＳ）〕存在下でプロティナーゼＫを作用させた後、フェノール抽出を行ない、さらにDNase−free RNase A を作用させたのちフェノール抽出することにより、遺伝子が取得される［村松正實編：ラボマニュアル遺伝子工学；丸善株式会社，５９頁（１９８８）］。

次に目的とする遺伝子が抗体可変部領域を含む遺伝子であれば、標準的な方法、すなわち、制限エンドヌクレアーゼによりゲノムＤＮＡを断片化して制限断片とし、得られた断片を適当な組換えＤＮＡクローニングベクターにクローニングし、放射性標識または酵素標識プローブを用いて、本発明で開示したＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングすることにより、単離される。遺伝子から得られたＤＮＡは一般的にポリペプチドをコードしていない介在配列をも含んでいるので、公知の方法を用いてＤＮＡの欠失または置換を行い改変する［W. Kramerら：ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res. ），１２，９４４１（１９８４）、およびT. A. Kvnkel：プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ），８２，４８８（１９８５）］。

本発明のヒトモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変領域であるポリペプチドをコードしているＤＮＡは、公知の方法により cＤＮＡライブラリーから得ることもできる［H. Okayamaら：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.），２，１６１（１９８２）］。すなわち、ヒトモノクローナル抗体産生細胞株のmＲＮＡを標準的な方法、例えば、細胞をチオシアン酸グアニジンを含む溶液にホモゲナイズしたのち、セシウムトリフルオロアセテート−ＥＤＴＡ液の密度勾配での超遠心分離によりＲＮＡペレットを取得し、さらにOligo−dＴカラムを用いてpoly(A)+−ＲＮＡを調製する。

この poly(A)+−ＲＮＡを鋳型とし、オリゴ−dＴプライマーまたはランダムプライマーあるいは抗体遺伝子のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを用いた公知の方法によりファーストストランドcＤＮＡが合成され、さらにこのファーストストランドcＤＮＡを鋳型としてセカンドストランド cＤＮＡが合成される［村松正實編：ラボマニュアル遺伝子工学；丸善株式会社，７０頁，７７頁（１９８８）］。

このような公知の方法で取得された cＤＮＡを適当なクローニングベクターにクローニングし、得られたクローンを可変領域をコードしている cＤＮＡに関して適当なプローブでスクリーニングする。所望のクローンを単離したのち、基本的にはゲノムＤＮＡと同じ方法で cＤＮＡを処理することができる。また、ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、公知の方法によりポリメラーゼ チエイン リアクションで特異的に増幅することにより取得することもできる［R. Orlandiら：Proc. Natl. Acad.Sci. USA，８６，３８３３（１９８９）］。

また軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡを常法により化学合成することもできる［N. D. Shina ら：ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.），１２，４３５９（１９８４）］。これらの合成ＤＮＡは、縮重コドンで元のコドンが置換されていても、翻訳された時に同じアミノ酸をコードしている限り、クローニングにより得られたＤＮＡと同一である必要はない。

本発明のヒトモノクローナル抗体の抗体軽鎖および重鎖定常領域をコードしているＤＮＡは、ゲノムＤＮＡおよび cＤＮＡからクローニングすることができる。また化学的に合成することもできる。このようにして得られた、ヒトモノクローナル抗体定常領域をコードしているＤＮＡを使用することにより、免疫原性のきわめて小さい軽鎖および重鎖ポリペプチドが得られる。このような、ヒトモノクローナル抗体定常領域ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ヒトリンパ細胞、例えば末梢血リンパ細胞から採取することも可能である。

このようにして得られたＤＮＡ構築物は、公知の方法に従い適当な組換えＤＮＡクローニングベクターおよび組換えＤＮＡ発現ベクターに導入できる［Y. Gluzman編：ユーカリテイック・バイラル・ベクター（Eukaryotic Viral Vectors），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ（Cold Spring Harbor Laboratories）発行］。

本発明においては、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードしているＤＮＡ構築物を発現ベクターの一部として適当な宿主細胞に導入する。本発明のヒトモノクローナル抗体を発現させる宿主細胞として用いられる宿主細胞としては、ハイブリドーマ、ＣＨＯ（chinese hamster ovary ）細胞、骨髄腫、形質細胞腫、リンパ腫細胞等が好ましい。また植物由来の宿主細胞でもかまわない。

〔ヒト型ポリクローナル抗体の製法〕
つぎに、細胞移植後における安全で、しかも生着性の良好なヒト型ポリクローナル抗体の動物を用いた効率的な製造方法について説明する。 具体的には免疫不全状態の動物に対する移殖の前又は後にＨＬＡ一致活性化リンパ球を投与し、生着安定後に抗原を感作し、該動物から抗原感作リンパ球を株化あるいは分離あるいは、遺伝子分離・発現等の手法により採取するものである。

さらに、ここで用いられる免疫不全状態の動物について説明すると、具体例としてはウシ、馬、モルモット、ラット、ニワトリ、アヒル等であり、また哺乳類の中でもやぎやウサギは管理性や操作が簡単で、しかも採取されるポリクローナル抗体量が多い等の点で有利である。 また免疫原の量も動物の種類に応じて適宜選択することができ、さらに免疫間隔についても適宜選択することができる。

免疫方法は、通常動物を免疫する際に採用される方法ならばいずれの方法でもよい。例えば、動物の皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等いずれのルートを通しても免疫することができる。 また免疫原は、市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ＢＣＧ、水酸化アルミニウムゲル、百日咳ワクチン等の適当なアジュバントと共に投与するのが望ましい。

こうして得られる本発明のヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体は感染症、薬物中毒における抗血清の代替物、抗イディオタイプ抗体を用いたワクチン、炎症反応を鎮静化させるための接着分子に対する抗体、または触媒型抗体などモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体で計画されている種々の治療、診断の分野において使用する場合、抗原性が低いか、あるいは抗原性が無いという点できわめて有利である。

診断薬として本発明の抗体を具体的に用いる場合には、例えば酵素，色素，放射性同位原素等の適当な標識物質と化学的あるいは遺伝子工学的に結合した標識抗体として用いればよく、また例えば治療薬として用いる場合には、例えば抗原が毒素等の活性物質の場合、好ましくは抗原の活性に対する中和能を有する本発明抗体を単独あるいは適当な併用薬剤等との混合剤として、また例えば癌や血栓症等の治療においては、適当な薬剤と化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体ターゲッティング製剤として調製し、投与することができる。

また、本発明のヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体は、必要に応じて例えばメンブレインフィルター等による濾過、除菌操作の後に、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、常法に従い非経口剤好ましくは注射剤などとして製剤化し、これを哺乳動物（マウス、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなど）の皮下、静脈内あるいは筋肉内に投与するなどの手法により、各種の疾患の治療に用いることが可能である。

また本発明のヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体を、リン酸緩衝液、生理食塩水、リンゲル液などの適当な担体に溶解し、常法に従って、例えば無菌濾過により無菌化し、アンプルに密封することにより製造することができる。 さらに、これらの液状の医薬を常法に従って凍結乾燥等により固形状の医薬とすることも可能である。さらに本発明のヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の投与量については、投与対象の体重，年齢，性別や対象となる疾患、症状あるいは投与ルートなどによって異なるが、イムノグロブリン量として１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ 体重／１日の範囲から１日１ないし数回を連続的にあるいは間欠的に投与することができる。

以下、実施例１により本発明を説明する

（１）＜ＯＫＴ３固相化フラスコ（中）及び（大）の調製＞
ＰＢＳ（−）で５μｇ／ｍｌに調製しておいたＯＫＴ３溶液を、培養用フラスコ（中）内に５ｍｌ、培養用フラスコ（大）内に１０ｍｌ入れ、底面に溶液を均一に浸した。 使用直前までコールドルームで保存した。

（２）＜移植用臍帯血からのリンパ球回収＞
上記（１）と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（中）内のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取った。 ＰＢＳ（−）１０ｍｌをフラスコ内に注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。 再度、クリーンベンチ内でＰＢＳ（−）１０ｍｌをフラスコ内に注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後蓋を開け、液を捨てた。

フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取るとともに、そのフラスコ内に、臍帯血移植後のバッグに、培養用培地１０ｍｌ〔培地（ＲＰＭＩ１６４０＋７）４４ｍｌ、３５，０００Ｕ／ｍｌ、ＩＬ（インターロイキン）−２を１ｍｌ、ヒト血清５ｍｌを混合して培養用培地としたもの（以下、単に「培養用培地」と略す）〕を注入し、軽く攪拌し、均一にした細胞懸濁液を移し、細胞数測定用に１０μｌ、ＣＤ４、ＣＤ８陽性細胞含有率測定用に１０００μｌ（１．５ｍｌチューブ３本に５００μｌずつとる）サンプリングし、３７℃ ＣＯ_２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。

（３）＜チュルク液による細胞数の測定＞
前記（２）において、採血した臍帯血１０μｌを４０μｌのチュルク液と混合し、血球計算版に１０μｌアプライし、顕微鏡下で細胞数を測定した。 その結果、フラスコ内総細胞数はそれぞれ１．３×１０^６ 個であった。

（４）＜細胞の表面抗原の解析＞
上記（２）において調製した３本の細胞懸濁液を６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた。 上清をきれいに吸い取った後、チューブ１にはＰＢＳ（−）８μｌ、ＣＤ３／ＨＬＡ―ＤＲ抗体８μｌを、またチューブ２にはＰＢＳ（−）８μｌ、ＣＤ４／ＣＤ８抗体８μｌをそれぞれのチューブに入れ３０分間反応させた。

なお、チューブ３は非特異的反応用コントロールとして、ＰＢＳ（−）８μｌのみを加えた。 反応後、シース液（コールター株式会社製：アイソトンＩＩ）８００μｌをそれぞれのチューブにいれボルテックスで攪拌した後、６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた。 上清みをきれいに吸い取った後、シース液を８００μｌ加え、ピペッティングし、細胞をほぐした後、ＦＡＣＳ測定用チューブ内に入れた。

ＦＡＣＳはＦＡＣＳｃａｎを使用し、またＦＡＣＳによる測定についてはマニュアルに従っておこなった。 その結果、ＣＤ３、ＨＬＡ―ＤＲ、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の含有率は、それぞれ２８％、３％、４６％及び５％であった。

（５）＜磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体によるＣＤ４陽性細胞の調製と培養＞
上記（２）において培養した結果、培養５日目に総細胞数３．４×１０^７個、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞数がそれぞれ９．５×１０^６個となった。 この培養細胞を５０ｍｌチューブ内に移し、回転数１，０００ｒｐｍ、遠心分離温度２０℃で１０分間遠心した。遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスをかけて良くほぐした。

さらにＣＤ８陽性細胞数の４倍量のビーズ数を含む磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体３００μｌを１５ｍｌチューブ内に入れ、マグネットＭＰＣ−１に装着し、１分間反応させた。 ビーズを吸わないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。 チューブ内にＰＢＳ（−）溶液を１ｍｌ入れ、良く攪拌した後、マグネットに装着した。 １分間反応後、ビーズを吸いとらないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。 さらにもう一度、ＰＢＳ（−）溶液を１ｍｌ入れて良く攪拌した後、マグネットに装着した。 １分間反応後、ビーズを吸いとらないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。

遠心して回収した細胞懸濁液に、反応用培地（洗浄用培地４５ｍｌとヒト血清５ｍｌを混合して作製）５ｍｌを入れ、軽く懸濁した後、磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体の入っているチューブ内に細胞を移し、マイルドミキサーで軽く振とうしながら３０分間コールドルームで反応させた。 反応後、チューブをマグネットに装着し、１分間反応させた。 ビーズを吸いとらないように溶液をとり、新しい１５ｍｌチューブ内に移した。 再度、マグネットに装着し、１分間反応後、ビーズをとらないように溶液をとり、これを新しいチューブ内に回収し、回転数１，０００ｒｐｍ、遠心分離温度２０℃で１０分間遠心した。 遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスをかけて、良くほぐした。

回収したＣＤ４陽性細胞に培養用培地１０ｍｌを加えて軽く懸濁した。 上記（１）と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（中）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取った。 ＰＢＳ（−）１０ｍｌをフラスコ内に注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。 再度、クリーンベンチ内でＰＢＳ（−）１０ｍｌをフラスコ内に注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後蓋を開け、液を捨てた。 フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取るとともに、そのフラスコ内に細胞懸濁液を移し、細胞数測定用に１０μｌ、ＣＤ４、ＣＤ８陽性細胞含有率測定用に１０００μｌ（１．５ｍｌチューブ２本に５００μｌずつとる）サンプリングし、３７℃ ＣＯ_２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。

（６）＜ＣＤ４陽性細胞の拡大培養＞
上記（５）において培養していた細胞液に、培養３日目、４日目にそれぞれ培養用培地を２０mlずつ加えた。 培養５日目に培養量をさらに拡大するためＯＫＴ３固相化フラスコを大きいサイズにした。 すなわち、前記（１）と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（大）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、ＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込み、フラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。

再度、無菌的にＰＢＳ（−）５０mlをフラスコ内に注ぎ込み、フラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開けて液を捨てた。 フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。 そのフラスコ内に、今まで培養していたフラスコを軽く数回叩きながら底面に付着していた細胞をはがして細胞懸濁液を移した。 さらに新しい培養用培地５０mlを今まで培養していたフラスコ内に入れ、残った細胞を懸濁し、新しいフラスコ内に移すとともに、これを３７℃ ＣＯ_２インキュベーターに入れて培養を継続した。

（７）＜ＣＤ４陽性細胞の凍結保存＞
上記（６）において培養していた細胞液について、培養６日目に下記の方法により細胞を凍結保存した。 保存方法については、フラスコを軽く数回叩きながら底面に付着していた細胞をはがした後、フラスコ内の培養液５００μｌを取り出して、トリプトソイ（ＴＳＡ）寒天培地にまき、３７℃ ＣＯ_２インキュベーター内に入れて無菌試験をした。 さらにフラスコ内の培養液１０μｌを取り出して細胞数を数えた。

次に５０mlチューブ２本に、培養していた細胞を４０mlづつ移し、１，０００ rpm、２０℃で５分間遠心した。 上清を捨て細胞沈さをボルテックスにかけた後、細胞懸濁液と細胞保存液〔ヒト血清５ml、ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略す）５mlと培地（ＲＰＭＩ１６４０＋７）４０mlを混合して作製〕をそれぞれ５分間氷中で冷やした後、４．５mlの細胞保存液で細胞懸濁液を１本にまとめ軽くピペッティングし、細胞を均一にした後、細胞保存用チューブ（２．０ml）３本に等量づつ入れた。

さらにチューブをバイセル内に入れ、−８０℃で数日保存し、その後、液体窒素タンク中で保存した。 培養時の細胞濃度は１．９×１０^６個／ml、保存細胞数はチューブ１本あたり５．１×１０^７個だった。

（８）＜トリパンブルー溶液による細胞数の測定＞
上記（７）において、細胞数測定用にサンプリングした細胞懸濁液１０μｌを２０μｌのトリパンブルー溶液と混合し、血球計算版に１０μｌアプライし、顕微鏡下で細胞数を測定した。 その結果、総細胞数は５．１×１０^７個だった。

（９）＜臍帯血移植とリンパ球投与以前の経過＞
寛解導入不能の急性骨髄単球性白血病患者に対し、ＨＬＡ一致同胞からの骨髄移植を行ったが２ヵ月後に再発し、さらに同一ドナーから末梢血幹細胞移植を２度行ったが、芽球が残存したまま骨髄低形成になった。 ３回の移植においてＧＶＨＤは認められなかった。 同患者に対しＨＬＡ３座不一致の臍帯血移植を実施したが、１０日後より３度のＧＶＨＤが認められたので、ｍＰＳＬｐｕｌｓｅ療法を実施した結果、ＧＶＨＤは軽快した。 今までの３回の幹細胞移植が不成功に終わり、ＧＶＨＤもなく従ってＧＶＬ効果も誘導されなかったので、移植後の抗腫瘍効果を期待し、またドナー細胞の生着を促進するため、活性化ＣＤ４陽性細胞療法を行うことを決定した。

（10）＜保存ＣＤ４陽性細胞の取出しと復活化＞
上記（７）において凍結保存しておいたＣＤ４陽性細胞を１本取り出し、３７℃のヒートブロックで４分間温めた。 無菌的に、１５ml遠沈管に洗浄用培地（ＲＰＭＩ１６４０＋６）を１０ml注ぎ込み、そこにトランスファーピペットで保存リンパ球細胞を培地に入れ懸濁した。 さらにこれを１，０００ｒｐｍ、２０℃、５分間遠心後、上清を捨て軽くタッピングしたあと、培養用培地５０mlに懸濁し、クローニングプレートに細胞懸濁液を移した。

細胞を顕微鏡で観察後、培養用３７℃ ＣＯ_２インキュベーターに入れ培養を再び開始した（培養０日目）。 培養２日目に細胞がプレートいっぱいに増殖していることを顕微鏡で確認後、クローニングプレートの細胞をフラスコ（２２５cm2 CELL CULTUREFLASK ）内に移した。 さらに新しい培養用培地５０mlをクローニングプレートに入れ、共洗いした後、フラスコに移し、培養用３７℃ ＣＯ_２インキュベータ内に入れて培養を続けた。

培養４日目に、上記（５）と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（大）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、ＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。 再度、無菌的にＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液をデカントで捨てた。

フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取るとともに、そのフラスコ内に、今まで培養していたフラスコを軽く数回たたきながら底面に付着していた細胞をはがした後、細胞懸濁液を移した。 さらに新しい培養用培地１５０mlを今まで培養していたフラスコに入れ、残った細胞を懸濁し、新しいフラスコに移した。 新しいフラスコを３７℃ ＣＯ_２インキュベーターに入れ、培養を継続した。

（11）＜培養用バッグによるＣＤ４陽性細胞の培養＞
上記（10）において培養していたフラスコを、培養６日目に、軽く数回たたきながら底面に付着していた細胞をはがした後、フラスコ内の培養液１mlを取り出し、サブローデキストロース（クロラムフェニコール添加）寒天培地と羊血液寒天培地に等量づつまき、３７℃ インキュベーター内に入れて無菌試験をした。

フラスコ内の培養液１０μｌを取り出し、前記（７）と同様にして細胞数を数えた。 バッグ培養用調製済みＡＩＭ−Ｖ培地〔培地１０リットルにＩＬ−２、ヒト血清およびオキザロ酢酸を終濃度がそれぞれ２００U/ml、１％および１ｍＭとなるように加えたもの〕と、ＣＰ−２（ＬＬ−７．１）培地（１リットル）が等量入った７５０ml培地入りカルチャーバッグＡ−１０００（細胞培養用バッグ）を３７℃に温めた。

そのバッグと５０mlシリンジを無菌的に接続し、シリンジからフラスコの培養液をすべて注ぎ込んだ。 鉗子でチューブをはさみ、チューブの先をシールし、バッグを培養用３７℃ ＣＯ_２インキュベーター内に入れて培養を継続した。

（12）＜ＣＤ４細胞の無菌試験及びエンドトキシンアッセイ＞
上記（11）において培養していたバッグを、培養７日目（投与前日）に培養バッグのサンプリングポートから２４Ｇ注射針をつけた１mlシリンジで培養液を約１ml無菌的にサンプリングした。 最初のその液は捨て、同じシリンジでもう一度約１mlサンプリングし、羊血液寒天培地に約２００μｌまき、残りを乾熱滅菌スピッツ管内に入れた。

サンプリングの終わったバッグのサンプリングポートをアルコール綿をはさんだ鉗子でよく拭き蓋をした後、培養用３７℃ ＣＯ_２インキュベーター内に入れ培養を続けた。寒天プレートは、３７℃インキュベーター内に入れ無菌試験し、乾熱滅菌スピッツ管は１，５００rpm、２０℃で５分間遠心した。

調製済み主剤溶液（トキシカラーシステムＬＳ−２００セットおよびトキシカラーシステムＥＴ−１セットを使用したエンドトキシン用キット）を乾熱滅菌試験管３本に乾熱滅菌ディスポーザブルマイクロピペットを使って１００μｌづつ入れた。 ブランク用試験管に注射用蒸留水を１００μｌ、陽性コントロール用試験管にスタンダード液を１００μｌ、乾熱滅菌ディスポーザブルマイクロピペットを使って入れた。 さらに検体用試験管に注射用蒸留水を８０μｌ、遠心の済んだ培養上清を２０μｌ、乾熱滅菌ディスポーザブルマイクロピペットを使って入れた。 ３本の試験管を３７℃ウオーターバスで３０分間反応させた。

さらに３０分後、それぞれの試験管に４００μｌづつ０．８Ｍ酢酸溶液を入れ、試験管をボルテックスで攪拌後、９６ウエルプレートに４００μｌづつ反応溶液を移し、吸光度４０５nm（リファレンス６３０nm）の値をプレートリーダーで測定した。 検体の吸光度の値を５倍とした値が陽性コントロールの値を超えていないことを確認した。

（13）＜回収前の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析＞
ＣＤ４陽性細胞を回収する前に、バッグ培養した培養液の一部をサンプリングし、細胞数を前記（８）と同様の手法により測定するとともに、ＣＤ８陽性細胞含有率を前記（４）と同様の手法により測定した。 その結果、総細胞数３．０×１０^９個、その内ＣＤ８陽性細胞が０．５％含まれていた。 総細胞数とＦＡＣＳ解析ＣＤ８陽性細胞の占める比率からＣＤ８細胞は１．５×１０^６個あった。

（14）＜ＣＤ４陽性細胞の回収＞
上記（11）においてバッグ培養した培養液１０００mlを無菌的に２５０ml遠沈管に入れ、１，５００rpm、 ２０℃で８分間遠心した。 遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐし、細胞洗浄液を遠沈管に２００ml入れ、さらに１，８００rpm、 ２０℃で８分間遠心した。 遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐした。 細胞洗浄液を１００mlづつ遠沈管に入れ、２５０mlチューブ２本にそれぞれの細胞懸濁液を移し、さらに１，８００rpm、 ２０℃で８分間遠心した。 遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐし、さらにこの細胞洗浄液を１００mlづつ２５０mlチューブに入れた。

遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスにかけて良くほぐした。 細胞懸濁液をファイナル液（２５０ml遠心管に生理食塩液１００mlと、２０％ヒト血清アルブミン溶液５mlを入れリンパ球細胞投与用液、ファイナル液とした。）に十分懸濁した後１００マイクロのメッシュに通した後、細胞懸濁液の液量を測定した。 また、細胞数とＣＤ４含有率を測定するため、細胞懸濁液をサンプリングした。

５０mlシリンジを分離バッグ（３００ml）と接続し、細胞懸濁液をシリンジから分離バッグに注ぎ込んだ。 注ぎ終わったら内筒でシリンジに残った液を押し出し、最後に鉗子でチューブをはさんだ。 チューブをチューブシーラーでシールするとともにシリンジをはさみで切り離した。 測定の結果、液量は１００ml、総細胞数は２．５×１０^９個だった。

（15）＜回収後の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析＞
回収後の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析を前記した（４）と同様の手法によりおこなった。 その結果、ＣＤ４陽性細胞は９９．７５％であり、ＣＤ８陽性細胞は０．２５％であった。

（16）＜ＣＤ４陽性細胞の患者への投与＞
上記（14）で調製したＣＤ４陽性細胞を、患者体重あたり４．５×１０^７個／kgで患者静脈より１時間かけて投与した。 その後の投与を、１週間ごとに３回、約１〜２週ごとに行った。 １回当りの投与量は患者体重あたり２．５×１０^６〜５．９×１０^７個／kgで患者静脈より１時間かけて投与した。

（１）＜ドナーからの採血＞
臍帯血移植後、リンパ球投与を９回行った。 さらに生着を促進するため、移植後８７日目に、患者の静脈から末梢血３０ｍｌをヘパリン加採血した。

（２）＜末梢血単核球の分離＞
クリーンベンチ内で無菌的に（以下単に「無菌的に」と略す）採血した注射筒の注射針を、接合部近くを触らないようにはずし、１９Ｇ注射針につけ替えた。 ５０ml遠沈管２本に、洗浄用培地を１５mlずつ注ぎ込み、その遠沈管内に、採血した血液全てを２本等量になるようにゆっくりと注いだ。 遠沈管の蓋を完全に閉めた後、２〜３回転倒混和した。 １０mlピペットでリンホセパールＩを１５ml遠沈管６本に３mlづつ入れ、次に、培地で希釈した血液１０mlをそれぞれの遠沈管に、液面を乱さないようにゆっくり重層した後、回転数１，８００rpm、 遠心分離温度２０℃、ブレーキをＯＦＦの状態で１５分間遠心した。

遠心後、無菌的に、遠沈管のリンパ球層の約１cm上までリンパ球細胞を吸い取らないように吸引機でゆっくり吸い取った。 ５mlピペットマンで血餅の層を吸い取らないようにリンパ球細胞の層をとり、あらかじめ、洗浄用培地（ＲＰＭＩ１６４０＋６）を２５ml入れておいた５０ml遠沈管に回収した。 遠沈管の蓋を閉め２〜３回転倒混和した後、回転数１，８００rpm、 遠心分離温度２０℃の状態で１０分間遠心した。 遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスにかけて良くほぐした。 さらに洗浄用培地を５０ml入れ良く転倒混和した後、細胞数測定用に１０μｌ、ＣＤ４、ＣＤ８含有率測定用に１．５mlマイクロチューブ２本に５００μｌずつサンプリングした。

（３）＜チュルク液による細胞数の測定＞
上記（２）において、細胞数測定用にサンプリングした細胞懸濁液１０μｌを４０μｌのチュルク液と混合し、血球計算版に１０μｌアプライし、顕微鏡下で細胞数を測定した結果、総細胞数は８．５×１０^７個だった。

（４）＜ＣＤ４陽性細胞の解析＞
上記（２）において調製した２本の細胞懸濁液を６，０００rpm、 ４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた後、上清をきれいに吸い取った。 その後ダルベッコりん酸緩衝液（１０００ml、以下ＰＢＳ（−）と略す）８μｌとＣＤ４／ＣＤ８抗体８μｌをそれぞれのチューブに入れ良く攪拌した後、４℃で３０分間反応させた。 反応後、シース液８００μｌをそれぞれのチューブに入れてボルテックスで攪拌した後、６，０００rpm、 ４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた。

上清をきれいに吸い取った後、シース液を８００μｌ加え、ピペッティングし、細胞をほぐした後、ＦＡＣＳ測定用チューブに入れた。 なおＦＡＣＳはＦＡＣＳｃａｎを使用した。 ＦＡＣＳの測定はマニュアルに従って行った。 その結果、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の占める比率はいずれも２８％あった。 総細胞数とＦＡＣＳ解析でのＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の占める比率からＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞はいずれも２．４×１０^７個あった。

（５）＜ＯＫＴ３固相化フラスコ（中）及び（大）の調製＞
ＰＢＳ（−）で５μg/mlに調製しておいたＯＫＴ３溶液を、培養用フラスコ（中）に５ml、培養用フラスコ（大）に１０ml入れ、底面に溶液を均一に浸すとともに、これを使用直前までコールドルームで保存した。

（６）＜磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体によるＣＤ４陽性細胞の調製と培養＞
上記（２）で調製した細胞懸濁液５０ml中の２０ml（総細胞数３．４×１０^７個、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞数がそれぞれ９．５×１０^６個）を５０mlチューブに移し、これを回転数１，０００rpm、 遠心分離温度２０℃で１０分間遠心した。 遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスをかけて、良くほぐした。

ＣＤ８陽性細胞数の４倍量のビーズ数を含む磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体３００μｌを１５mlチューブに入れ、マグネットＭＰＣ−１に装着し、１分間反応させた。 さらにビーズを吸わないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした後、該チューブ内にＰＢＳ（−）溶液を１ml入れて良く攪拌した後、再度マグネットに装着した。 １分間反応後、ビーズを吸いとらないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。 もう一度、ＰＢＳ（−）溶液を１ml入れて良く攪拌した後、さらにマグネットに装着した。 １分間反応後、ビーズを吸いとらないように溶液をとり、マグネットからチューブをはずした。

遠心して回収した細胞懸濁液に、反応用培地（洗浄用培地４５mlとヒト血清５mlを混合して作製）５mlを入れ、軽く懸濁した後、磁気ビーズ標識抗ＣＤ８抗体の入っているチューブに、細胞を移し、マイルドミキサーで軽く振とうしながら３０分間コールドルームで反応させた。 反応後、チューブをマグネットに装着し、１分間反応させた。 ビーズを吸いとらないように溶液をとり、新しい１５mlチューブに移した。 再度これをマグネットに装着し、１分間反応後、ビーズをとらないように溶液をとり、新しいチューブに回収し、回転数１，０００rpm、遠心分離温度２０℃で１０分間遠心した。 遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスをかけて、良くほぐした。

培養用培地〔（ＲＰＭＩ１６４０＋７）４４ml、３５，０００U/ml ＩＬ−２ １ml ヒト血清５mlを混合し培養用培地としたもの（以下単に「培養用培地」と略す）〕２０mlを、回収したＣＤ４陽性細胞に加えて軽く懸濁した。 前記（５）と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（中）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取った。 ＰＢＳ（−）１０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開けて液を捨てた。 再度、クリーンベンチ内でＰＢＳ（−）１０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後蓋を開け、液を捨てた。

フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。 そのフラスコに細胞懸濁液を移し、細胞数測定用に１０μｌ、ＣＤ４、ＣＤ８陽性細胞含有率測定用に１０００μｌ（１．５ｍｌチューブ２本に５００μｌずつとる）サンプリングし、３７℃ ＣＯ_２インキュベーター（湿度９５％）で培養を開始した（培養０日目）。 また前記（４）と同様にしてＣＤ４陽性細胞の解析を行った結果、ＣＤ４陽性細胞は４６％、ＣＤ８陽性細胞は５％あった。

（７）＜トリパンブルー溶液による細胞数の測定＞
上記（６）において、細胞数測定用にサンプリングした細胞懸濁液１０μｌを２０μｌのトリパンブルー溶液と混合し、血球計算版に１０μｌアプライし、顕微鏡下で細胞数を測定した結果、総細胞数は２．６×１０^７個だった。

（８）＜ＣＤ４陽性細胞の拡大培養＞
前記（６）において培養していた細胞液に、培養３日目、４日目に培養用培地を２５mlずつ加えた。 培養５日目に培養量をさらに拡大するためＯＫＴ３固相化フラスコを大きいサイズにした。 すなわち、前記（５）と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（大）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、ＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。

再度、無菌的にＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。 フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。 そのフラスコ内に今まで培養していたフラスコを軽く数回叩きながら、底面に付着していた細胞をはがした後、細胞懸濁液を移した。 さらに新しい培養用培地５０mlを今まで培養していたフラスコに入れ、残った細胞を懸濁し、新しいフラスコに移した。 新しいフラスコを３７℃ ＣＯ_２インキュベーター内に入れ、培養を継続した。

（９）＜ＣＤ４陽性細胞の凍結保存＞
上記（８）において培養していた細胞液を、培養６日目に一度、細胞の一部を凍結保存した。 保存方法は、最初、フラスコを軽く数回たたき、底面に付着していた細胞をはがした後、フラスコ内の培養液５００μｌを取り出し、トリプトソイ（ＴＳＡ）寒天培地にまき、３７℃ ＣＯ_２インキュベーター内に入れ無菌試験をした。 フラスコ内の培養液１０μｌを取り出し、前記（３）と同様に細胞数を数えた。

次に５０mlチューブ２本に、培養していた細胞を４０mlづつ移し、１，０００rpm、 ２０℃で５分間遠心した。 上清を捨て細胞沈さをボルテックスにかけた後、細胞懸濁液と細胞保存液〔ヒト血清５ml、ジメチルスルホキシド（以下単に「ＤＭＳＯ」と略す）５mlと培地（ＲＰＭＩ１６４０＋７）４０mlを混合し作製した〕をそれぞれ５分間氷中で冷やした後、４．５mlの細胞保存液で細胞懸濁液を１本にまとめ軽くピペッティングし、細胞を均一にした後、細胞保存用チューブ（２．０ml）３本に等量づつ入れた。 さらにチューブをバイセルに入れ、−８０℃で数日間保存し、その後、液体窒素タンク中で保存した。 培養時の細胞濃度は１．９×１０^６個／ml、保存細胞数はチューブ１本あたり５．１×１０^７個だった。

（10）＜保存ＣＤ４陽性細胞の取出しと復活化＞
上記（９）において凍結保存しておいたＣＤ４陽性細胞を１本取り出し、３７℃のヒートブロックで４分間温めた。 さらに１５ml遠沈管内に無菌的に洗浄用培地（ＲＰＭＩ１６４０＋６）を１０ml注ぎ込み、そこにトランスファーピペットで保存リンパ球細胞を培地に入れ懸濁した。 １，０００rpm、 ２０℃、５分間遠心後、上清を捨て軽くタッピングしたあと、培養用培地５０mlに懸濁し、クローニングプレートに細胞懸濁液を移した。

細胞を顕微鏡で観察後、培養用３７℃ ＣＯ_２インキュベーターに入れ培養を再び開始した（培養０日目）。 培養２日目に細胞がプレートいっぱいに増殖していることを顕微鏡で確認後、クローニングプレートの細胞をフラスコ（２２５cm2 CELL CULTUREFLASK ）に移した。 さらに新しい培養用培地５０mlをクローニングプレートに入れ、共洗いした後、フラスコに移し、培養用３７℃ ＣＯ_２インキュベータに入れ培養を続けた。

培養４日目、前記（５）と同様にして作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（大）のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、ＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。 再度、無菌的にＰＢＳ（−）５０mlをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液をデカントで捨てた。 フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。

そのフラスコに今まで培養していたフラスコを軽く数回たたき、底面に付着していた細胞をはがした後、細胞懸濁液を移した。 さらに新しい培養用培地１５０mlを今まで培養していたフラスコに入れ、残った細胞を懸濁し、新しいフラスコに移した。 新しいフラスコを３７℃ ＣＯ_２インキュベーターに入れ、培養を継続した。

（11）＜培養用バッグによるＣＤ４陽性細胞の培養＞
上記（10）において培養していたフラスコを、培養６日目、軽く数回たたき、底面に付着していた細胞をはがした後、フラスコ内の培養液１mlを取り出し、サブローデキストロース（クロラムフェニコール添加）寒天培地と羊血液寒天培地に等量づつまき、３７℃ インキュベーター内に入れ無菌試験をした。

フラスコ内の培養液１０μｌを取り出し、前記（７）と同様にして細胞数を数えた。 バッグ培養用調製済みＡＩＭ−Ｖ培地〔培地（１０リットル）にＩＬ−２、ヒト血清およびオキザロ酢酸を終濃度がそれぞれ２００U/ml、１％および１ｍＭとなるように加えたもの〕と、ＣＰ−２（ＬＬ−７．１）培地（１リットル）が等量入った７５０ml培地入り細胞培養用バッグを３７℃に温めた。 そのバッグと５０mlシリンジを無菌的に接続し、シリンジからフラスコの培養液をすべて注ぎ込んだ。 鉗子でチューブをはさみ、チューブの先をシールし、バッグを培養用３７℃ ＣＯ_２インキュベーターに入れて培養を継続した。

（12）＜ＣＤ４細胞の無菌試験及びエンドトキシンアッセイ＞
上記（11）において培養していたバッグを、培養７日目（投与前日）に培養バッグのサンプリングポートから２４Ｇ注射針をつけた１mlシリンジで培養液を約１ml無菌的にサンプリングした。 最初のその液は捨て、同じシリンジでもう一度約１mlサンプリングし、羊血液寒天培地に約２００μｌまき、残りを乾熱滅菌スピッツ管に入れた。

サンプリングの終わったバッグのサンプリングポートをアルコール綿をはさんだ鉗子でよく拭き蓋をした後、培養用３７℃ ＣＯ_２インキュベーター内に入れて培養を続けた。 寒天プレートは、３７℃インキュベーター内に入れ無菌試験し、乾熱滅菌スピッツ管は１，５００rpm、 ２０℃で５分間遠心した。

調製済み主剤溶液を乾熱滅菌試験管３本に乾熱滅菌ディスポーザブルマイクロピペットを使って１００μｌづつ入れた。 ブランク用試験管に注射用蒸留水を１００μｌ、陽性コントロール用試験管にスタンダード液を１００μｌ、乾熱滅菌ディスポーザブルマイクロピペットを使って入れた。 検体用試験管に注射用蒸留水を８０μｌ、遠心の済んだ培養上清を２０μｌ、乾熱滅菌ディスポーザブルマイクロピペットを使って入れた。 ３本の試験管を３７℃ウオーターバスで３０分間反応させた。

さらに３０分後、それぞれの試験管に４００μｌづつ０．８Ｍ酢酸溶液を入れ、試験管をボルテックスで攪拌後、９６ウエルプレートに４００μｌづつ反応溶液を移し、吸光度４０５nm（リファレンス６３０nm）の値をプレートリーダーで測定したところ、検体の吸光度の値を５倍とした値が陽性コントロールの値を超えていないことを確認した。

（13）＜回収前の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析＞
ＣＤ４陽性細胞を回収する前に、バッグ培養した培養液の一部をサンプリングし、細胞数を前記（７）と同様の手法により、またＣＤ８陽性細胞含有率を前記（４）と同様の手法により、それぞれ測定した。 その結果、総細胞数４．０×１０^９個、ＣＤ８陽性細胞が０．５％含まれていた。 総細胞数とＦＡＣＳ解析ＣＤ８陽性細胞の占める比率からＣＤ８細胞は２．０×１０^６個あった。

（14）＜ＣＤ４陽性細胞の回収＞
上記（12）においてバッグ培養した培養液１０００mlを無菌的に２５０ml遠沈管に入れ、１，５００rpm、 ２０℃で８分間遠心した。 遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐし、細胞洗浄液を遠沈管に２５０ml入れ１，８００rpm、 ２０℃で８分間遠心した。 遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐした。 細胞洗浄液を１００mlづつ遠沈管に入れ、２５０mlチューブ２本にそれぞれの細胞懸濁液を移した。 １，８００rpm、 ２０℃で８分間遠心した。 遠心後、上清を捨て、ボルテックスで細胞沈さをほぐした。 細胞洗浄液を５０mlづつ２５０mlチューブに入れた。

遠心後、上清を捨て、細胞沈さをボルテックスにかけて、良くほぐした。 細胞懸濁液をファイナル液（２５０ml遠心管に生理食塩液１００mlと、２０％ヒト血清アルブミン溶液５mlを入れリンパ球細胞投与用液、ファイナル液としたもの）に十分懸濁した後１００マイクロのメッシュに通し、さらに細胞懸濁液の液量を測定した。

また、細胞数とＣＤ４含有率を測定するため、細胞懸濁液をサンプリングした。 ５０mlシリンジを分離バッグ（３００ml）と接続し、細胞懸濁液をシリンジから分離バッグに注ぎ込んだ。 注ぎ終わったら内筒でシリンジに残った液を押し出し、最後に鉗子でチューブをはさんだ。 チューブをシールしシリンジをはさみで切り離した。 測定の結果、液量は１００ml、総細胞数は３．７×１０^９個だった。

（15）＜回収後の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析＞
前記した実施例１の（４）と同様にして、回収後の投与用ＣＤ４陽性細胞のＦＡＣＳによる解析を行った。 その結果、ＣＤ４陽性細胞は９９．７５％であり、ＣＤ８陽性細胞は０．２５％であった。

（16）＜ＣＤ４陽性細胞の患者への投与＞
上記（14）で調製したＣＤ４陽性細胞は、患者体重あたり３×１０^７個／kgで患者静脈より１時間かけて投与した。 その後投与を、１週間ごとに３回おこなった。 １回当りの投与量は患者体重あたり３×１０^７〜９×１０^７個／kgで患者静脈より１時間かけて投与した。

（１）＜イムノグロブリン量の測定＞
患者末梢血中のイムノグロブリン量の検査を行った結果、患者の末梢血中イムノグロブリン値は早期より上昇した。 また患者では移植後約２ヶ月で再発を認め、芽球が大半を占めることにより次第にリンパ球数も減少したが、イムノグロブリン値は、正常範囲内にとどまり、免疫グロブリンの補充療法を必要としなかった。

また好中球やリンパ球数の顕著な減少にも関わらず重篤な感染症に罹患しなかった。 このことより、ＣＤ４陽性細胞投与により患者の免疫能が著しく上昇することが解った。このように臍帯血幹細胞移植患者においても速やかに抗体産生が開始されたことから、ドナー由来の活性化リンパ球は造血幹細胞生着促進作用、抗体産生促進作用を有することが明らかとなった。

Claims (37)

1. 末梢血または臍帯血より分離した単核球細胞中のＨＬＡ一致リンパ球を増殖・活性化させた後、さらにこれを分離採取してＨＬＡ一致リンパ球を主成分とした造血幹細胞移植後の生着安定組成物。
2. 主成分であるＨＬＡ一致リンパ球に医療用コンポーネントを含有させてなる請求項１に記載の造血幹細胞移植後の生着安定組成物。
3. ＨＬＡ一致活性化リンパ球が、ＣＤ４陽性細胞であるところの請求項１に記載の造血幹細胞移植後の生着安定組成物。
4. 末梢血または臍帯血より採取した血液よりＨＬＡ一致リンパ球を増殖・活性化させるための器具であって、該器具がインターロイキン２を含む培養液および抗ＣＤ３抗体固相化フラスコからなるものである造血幹細胞移植後の生着安定組成物を得るためのキット。
5. ＨＬＡ一致リンパ球を含んだ末梢血または臍帯血より単核球細胞を分離する工程と、分離した単核球細胞中のＨＬＡ一致リンパ球を増殖・活性化させる工程と、増殖・活性化させたＨＬＡ一致リンパ球を分離して、これを主成分とする製剤に調製する工程とからなる造血幹細胞移植後の生着安定組成物の製法。
6. ＨＬＡ一致リンパ球の増殖・活性化が、培養用培地にインターロイキン２あるいは抗ＣＤ３抗体の何れかを単独にて、又はこれらを組合わせ存在下において培養されるものであるところの請求項５に記載の造血幹細胞移植後の生着安定組成物の製法。
7. ＨＬＡ一致リンパ球の増殖・活性化のための培養に際し、培養液中に各種サイトカイン又はマイトージェンを添加するようにした請求項５又は請求項６に記載の造血幹細胞移植後の生着安定組成物の製法。
8. 免疫不全状態の動物に対する移殖の前又は後にＨＬＡ一致活性化リンパ球を投与し、生着安定後に抗原を感作し、該動物から抗原感作リンパ球を株化あるいは分離あるいは、遺伝子分離・発現等の手法により採取したヒトモノクローナル抗体産生細胞株。
9. ヒト造血幹細胞を免疫不全状態にある動物に移殖するとともに、該移殖の前又は後にＨＬＡ一致活性化リンパ球を投与し、生着安定後に抗原を感作し、該動物から採取したヒトポリクローナル抗体。
10. ヒト造血幹細胞を免疫不全状態の動物に移植し、更に該移植前あるいは移植後にＨＬＡ一致活性化リンパ球を投与することにより生着を促進し、抗原を感作し、該免疫不全状態の動物から抗原感作リンパ球を株化あるいは分離あるいは、遺伝子分離・発現等の手法により採取するようにしたヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
11. 免疫不全状態の動物が重篤複合免疫不全マウスである請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
12. 重篤複合免疫不全マウスがＳＣＩＤマウスである請求項１１に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
13. 投与するＨＬＡ一致ヒトリンパ球がＨＬＡ一致ヒト活性化リンパ球であるところの請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
14. 投与するＨＬＡ一致ヒト活性化リンパ球がＣＤ４陽性細胞を主成分とするものである請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
15. 投与するＨＬＡ一致ヒト活性化リンパ球が、活性化ＣＤ４陽性細胞を投与総細胞数に対して９０％以上含有するものである請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
16. 投与するＨＬＡ一致ヒト活性化リンパ球に対するＣＤ８陽性細胞の混入率が投与総細胞数に対して１０％以下である請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
17. 免疫不全状態の動物から抗原感作リンパ球を株化する手段がエプスタイン バー ウイルスにより株化するものであるところの請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
18. 免疫不全状態の動物から抗原感作リンパ球を株化する手段がヒトミエローマ細胞株との細胞融合により株化するものであるところの請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
19. 抗原がヒト由来物質であるところの請求項１０〜１８のいずれか１に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
20. 抗原がヒト由来ハプテンとキャリアタンパクの複合体である請求項１０〜１８のいずれか１に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
21. 抗原がヒト由来ペプチドで構成されるＭＡＰ（Multiple Antigen Peptideの略）である請求項１０〜１８のいずれか１に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
22. 抗体が免疫グロブリンである請求項１０〜１８のいずれか１に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
23. 抗体がＩｇＧ免疫グロブリンである請求項１０記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株の製造法。
24. 請求項８または１０〜２３のいずれか１に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株が製造するヒトモノクローナル抗体。
25. 請求項８または１０〜２３のいずれか１に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株が製造するヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子。
26. 請求項８または１０〜２３のいずれか１に記載のヒトモノクローナル抗体産生細胞株が製造するヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子が導入された形質転換体。
27. ヒト造血幹細胞を免疫不全状態の動物に移殖し、さらに該移殖の前あるいは後にＨＬＡ一致活性化リンパ球を投与することにより生着を促進させ、抗原を感作し、該免疫不全状態の動物から採取するようにしたヒトポリクローナル抗体の製法。
28. 投与するＨＬＡ一致ヒト活性化リンパ球がＨＬＡ一致ヒト活性化リンパ球であるところの請求項２７に記載のヒトポリクローナル抗体の製法。
29. 投与するＨＬＡ一致ヒト活性化リンパ球がＣＤ４陽性細胞を主成分とするものである請求項２７に記載のヒトポリクローナル抗体の製法。
30. 投与するＨＬＡ一致ヒト活性化リンパ球が、活性化ＣＤ４陽性細胞を投与総細胞数に対して９０％以上含有するものである請求項２７に記載のヒトポリクローナル抗体の製法。
31. 投与するＨＬＡ一致ヒト活性化リンパ球に対するＣＤ８陽性細胞の混入率が投与総細胞数に対して１０％以下である請求項２７に記載のヒトポリクローナル抗体の製法。
32. 抗原がヒト由来物質であるところの請求項２７〜３１のいずれか１に記載のヒトポリクローナル抗体の製法。
33. 抗原がヒト由来ハプテンとキャリアタンパクの複合体である請求項２７〜３１のいずれか１に記載のヒトポリクローナル抗体の製法。
34. 抗原がヒト由来ペプチドで構成されるＭＡＰ（Multiple Antigen Peptideの略）である請求項２７〜３１のいずれか１に記載のヒトポリクローナル抗体の製法。
35. 抗体が免疫グロブリンである請求項２７〜３１のいずれか１に記載のヒトポリクローナル抗体の製法。
36. 抗体がＩｇＧ免疫グロブリンである請求項２７〜３１のいずれか１に記載のヒトポリクローナル抗体の製法。
37. 請求項９または２７〜３６のいずれか１に記載のヒトポリクローナル抗体。