JPH0532032B2

JPH0532032B2 -

Info

Publication number: JPH0532032B2
Application number: JP58244598A
Authority: JP
Inventors: Masakazu Mihashi; Masashi Kurimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1983-12-27
Filing date: 1983-12-27
Publication date: 1993-05-14
Also published as: JPS60142926A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新リンホカインに対して免疫学的
中和活性を示すモノクローナル抗体とその製造方
法に関する。

モノクローナル抗体については、Cesar
Milsteinが「Scientfic American」Vol.243、No.
４、56〜64頁（1980年）で詳細に解説している。

リンホカイン、とりわけ悪性腫瘍に対して障害
活性を有するリンホカインについては、リンホト
キシンやツモアネクロシスフアクターなどが
知られている。

リンホトキシンは、青木隆一ほか共著「リンホ
カイン」新免疫学叢書６、87〜105頁（1979年）
医学書院、Bloom B.R.＆Glade P.R.共編「In
Vitro Methods in Cell−Mediated Immunity」
Academic Press（1971年）、およびCellular
Immunology Vol.38、388〜402頁（1978年）な
どに記載され、ツモアネクロシスフアクター
は、Carswell E.A.et.、Pr.Natl.Acad.Sci.、U.S.
A.、Vol.72、No.９、3666〜3670頁（1975年）お
よびE.Pick編Tumor Necrosis Factor in
Lymphokines Vol.、235〜272頁、Academic
Press（1981年）などに記載されている。

また、最近、大西治夫らが特開昭58−146293号
公報でリンホカインの一種である抗腫瘍性糖蛋白
質を明らかにしている。

本発明者らは、リンホカインについて多年研究
してきた。その結果、従来知られているこれらの
リンホカインとは、全く違つた理化学的性質を有
する新リンホカインの存在を認め、そのモノク
ローナル抗体とその製造方法を確立して、本発明
を完成した。

すなわち、本発明は、理化学的性質が、分子量 20000±2000 等電点 pI＝5.6±02 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収溶剤に対する溶解性水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶、エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶。

呈色反応ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH40乃
至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である
新リンホカイン（本明細書を通じて、本物質
を新リンホカインと言う。）に対して免疫学
的中和活性を示すモノクローナル抗体とその製
造方法に関する。

まず、新リンホカインの製造方法について述
べる。

新リンホカインの製造方法は、新リンホカイ
ン産生能を有するヒト由来の細胞、例えば白血
球、リンパ球、培養株化された細胞などに誘導剤
を作用させて生成せしめればよい。

ヒト由来の白血球、リンパ球は、ヒトから採取
した血液を分離して調製すればよい。

培養株化されたヒト由来の細胞、常法に従つ
て、生体外（in vitro）で増殖させた細胞が使用
できる。

しかしながら、本発明の場合には、培養株化さ
れた細胞の増殖に際し、ヒト以外の温血動物体内
に直接移植するか、または拡散チヤンバー内へ接
種して、その温血動物の液体の供給を受けながら
増殖させる方が望ましい。

即ち、生体外（in vitro）で増殖させる場合と
は違つて、高価な血清などを含む栄養培地が不
要、または大幅に節約できるばかりではなく、細
胞増殖中の維持管理も極めて容易であり、その
上、得られた細胞から誘導生成される新リンホカ
イン活性が高い特徴を有している。

ヒト以外の温血動物を利用する方法は、培養株
化されたヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物
体内に移植し、あるいは、その動物の体液の供給
を受けることのできる拡散チヤンバーを動物体内
に埋設して通常の飼育をすれば、温血動物体から
供給される栄養物を含有する体液を利用してその
細胞が容易に増殖しうるのである。

更に、生体外（in vitro）で増殖させる場合と
比較して、この細胞の増殖が安定であること、そ
の増殖速度が大きいこと、得られる細胞量が多い
こと、更には、細胞当りの新リンホカインの収
量が著しく増加することも大きな特徴である。

本発明で使用する培養株化されたヒト由来の細
胞は、ヒト以外の温血動物体内に移植して容易に
増殖し得て、しかも新リンホカイン産生能を有
する細胞であればよく、例えば、「蛋白質核酸酵
素、Vol.20、No.６」616〜643頁（1975年）に記載
されているヒト由来の各種株化細胞を用いること
ができる。とりわけ、「Journal of Clinical
Microbiology Vol.1」116〜117頁（1975年）に
記載されているNamalva細胞、I.Miyoshi著
「Nature Vol.267」843〜844頁（1977年）に記載
されているBALL−１細胞、TALL−１細胞、
NALL−１細胞、「Journal of Immunoigy
Vol.113」1134〜1345頁（1974年）記載のＭ−
7002細胞、Ｂ−7101細胞、「組織培養」第６巻、
第13号、527〜546頁（1980年）に記載されている
JBL細胞、EBV−Sa細胞、EBV−Wa細胞、
EBA−HO細胞、MOLT−３細胞や、その他
BALM−２細胞、CCRF−SB細胞（ATCC CCL
120）CCRF−CEM細胞、DND−41細胞などの
株化されたリンパ芽球様細胞や、また、正常な単
核細胞顆粒性白血球細胞などを各種ウイルス、薬
剤、放射線などで処理し培養株化させた細胞など
が好適である。

また、これらヒト由来の細胞の新リンホカイン
産生能を有する遺伝子を、例えば、ポリエチレ
ングリコールやセンダイウイルスなどを利用する
細胞融合の手段、DNAリガーゼ、制限酵素（ヌ
クレアーゼ）、DNAポリメラーゼなどの酵素を利
用する遺伝子組み換えの手段などによつて処理
し、その増殖速度を高めたり、細胞当りの新リン
ホカイン産生能を高めたりして使用してもよ
く、本明細書に記載する株化細胞のみに限定され
るものではない。これらの細胞は、後に述べる新
リンホカインを誘導精製させるまでの過程で、
単独、または２種以上を混合して自由に利用され
る。必要ならば、これに、例えばヒトから採取し
調製される白血球、リンパ球などを併用すること
もできる。

本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞
が増殖し得るものであればよく、例えばニワト
リ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサ
ギ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、モルモツト、ラツ
ト、ヌードラツト、ハムスター、普通マウス、ヌ
ードマウスなどの哺乳類が使用できる。

これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好
ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、そ
の反応をできるだけ抑えるため、使用する動物は
できるだけ幼若な状態、即ち卵、胚、胎児、また
は新生期、幼少期のものの方が好ましい。

また、これら動物に例えば200〜600レム程度の
エツクス線若しくはガンマ線を照射するか、また
は抗血清若しくは免疫抑制剤などを注射するなど
の前処理をほどこして、免疫反応を弱めて移植し
てもよい。

使用する動物がヌードマウスあるいはヌードラ
ツトの場合には、成長したものであつても免疫反
応が弱いので、これらの前処理を必要とすること
もなもなく、培養株化されたヒト由来の細胞が移
植でき、急速に増殖できるので特に好都合であ
る。

また、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば
先づハムスターに移植し増殖させた後、この細胞
を更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒ
ト以外の温血動物間で移植してヒト由来の細胞の
増殖をより安定化したり、更にそれらから誘導生
成される新リンホカイン量を増加させることも
自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同網
間、同門間移植であつてもよい。ヒト由来の細胞
を移植する動物体内の部位は、移植した細胞が増
殖しうる部位であればよく、例えば尿液腔、静
脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。

また、動物体内にヒト由来の細胞を移植するこ
となく、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾
過膜、例えば孔径約10^-7〜10^-5ｍを有するメンブ
ランフイルター、限外濾過膜またはフオローフア
イバーなどを設けた公知の各種形状、大きさの拡
散チヤンバーを動物体内、例えば腹腔内に埋設し
て、動物体からの栄養物を含む体液の供給を受け
つつ、そのチヤンバー内で前述の培養株化された
ヒト由来の細胞を何れも増殖させることができ
る。

また必要に応じて、このチヤンバー内の栄養物
を含む溶液を動物体内の体液と接続し、潅流させ
るようにしたチヤンバーを、例えば動物体表に取
付け、チヤンバー内のヒト由来の細胞の増殖状態
をその表面に設けた窓を通じて透視できるように
することも、また、このチヤンバー部分のみを着
脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命一
杯細胞を増殖させて、動物固体当りの細胞生産量
を更に高めることもできる。

これらの拡散チヤンバーを利用する方法は、ヒ
ト由来の細胞が動物細胞と直接接触しないので、
ヒト由来の細胞のみが容易に採取できるだけでな
く、好ましくない免疫反応を起す心配も少ないの
で、免疫反応を抑制する前処理の必要もなく、各
種温血動物を自由に利用できる特徴を有してい
る。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の
飼育管理を続ければよく、移植後といえども特別
の取扱いは何ら必要としないので好都合である。

ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は通常
１〜10週の期間で目的を達成することができる。
このようにして得られるヒト由来の細胞数は動物
固体当り約10⁷〜10¹²個、またはそれ以上に達す
ることも見出した。

換言すれば、動物生体内で増殖させたヒト由来
の細胞数は、動物固体当り移植した細胞数の約
10²〜10⁷倍、またはそれ以上にも達し、生体外の
栄養培地に接種して増殖させる場合の約10¹〜10⁶
倍、またはそれ以上にも達して、新リンホカイン
の製造のために極めて好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来の細胞から
新リンホカインを誘導生成させる方法は自由で
ある。それが、増殖した動物体内のままで新リン
ホカイン誘導剤を作用させることもできる。例
えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来
の細胞に、また皮下に生じた腫瘍細胞に、新リン
ホカイン誘導剤を直接作用させて新リンホカイ
ンを誘導生成させ、次いで、その血清、腹水ま
たは腫瘍から新リンホカインを精製採取すれば
よい。

また、ヒト由来の増殖細胞をヒト以外の動物体
内から取り出し、生体外で新リンホカイン誘導
剤を作用させて新リンホカインを誘導生成させ
ることもできる。例えば、腹水中で増殖したヒト
由来の細胞を採取し、または皮下に生じたヒト由
来の細胞を含む腫瘍を摘出、分散し、得られる細
胞を約20〜40℃に保つた栄養培地に細胞濃度が約
10⁵〜10⁸／mlになるように浮遊させ、これに新リ
ンホカイン誘導剤を作用させることによつて新
リンホカインを誘導生成させ、これを精製採取
すればよい。

更に、ヒト由来の細胞を拡散チヤンバー内で増
殖させた場合は、増殖させた細胞をチヤンバー内
のままで、またはチヤンバーから取り出して、新
リンホカイン誘導剤を作用させ、新リンホカイ
ンを誘導生成させることもできる。

また、前述のようにヒト以外の温血動物を利用
して得られるヒト由来の細胞を、必要ならば、更
にインビトロで１〜４日程度培養し細胞の増殖世
代を同調させるなどした後、新リンホカイン誘
導剤を作用させ新リンホカインを誘導生成させ
ることも自由である。

また、例えば、増殖させたヒト由来の細胞に先
づ動物体内のまま新リンホカインを誘導生成さ
せた後、次いで、同一動物固体の特定の部位また
は全体から採取したヒト由来の細胞に動物体外で
新リンホカインを誘導生成させる方法、また、
一度新リンホカインの誘導生成に使用した細胞
を、更に２度以上新リンホカインの誘導生成に
使用する方法、または動物体内に埋設、若しくは
接続するチヤンバーを交換して得られる細胞数を
増加させる方法などによつて、使用する動物固体
当りの新リンホカイン生成量を更に高めること
も自由である。

本発明の新リンホカイン誘導剤としては、α
−インターフエロン誘導剤として知られているウ
イルス、核酸、ヌクレオチドなどやγ−インター
フエロン誘導剤として知られているフイトヘマグ
レチニン、コンカナバリンＡ、ポークウイードミ
トーゲン、リポポリサツカリド、エンドトキシ
ン、多糖類、細菌などが適宜用いられる。また、
感作化された細胞にとつては、抗原も新リンホカ
インの誘導剤である。

更に、ヒト由来の細胞から新リンホカインを
誘導生成させるに際し、新リンホカイン誘導剤
として、α−インターフエロン誘導剤とγ−イン
ターフエロン誘導剤とを併用することにより新リ
ンホカインの生産量を高めることも自由であ
る。

また、これら誘導生成によつて新リンホカイン
が産生されるだけでなく、種特異性の高いヒト
インターフエロンも同時に産生されることが判明
した。

このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物
質の同時生産を可能にし、更に、ヒト由来の細胞
の高度利用を可能にし、新リンホカイン及びヒ
トインターフエロンを大量に安価に供給する点か
らきわめて好都合である。

このようにして誘導生成された新リンホカイン
は、公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、
濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行うこと
によつて容易に精製分離し、採取することができ
る。更に高度の精製を必要とする場合には、例え
ば、イオン交換体への吸着−溶出、ゲル濾過およ
び等電点分画、電気泳動、イオン交換クロマトグ
ラフイー、高速液体クロマトグラフイー、カラム
クロマトグラフイー、アフイニテイクロマトグラ
フイーなど公知の方法を組合せれば、最高純度の
新リンホカインを採取することも可能である。

本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、前
述のようにして得られた新リンホカインを抗原
として、ヒト以外の温血動物を免疫し、該動物か
ら抗体産生細胞を採取し、この細胞と骨髄腫細胞
とを融合せしめ、得られる融合細胞から新リンホ
カインに対して免疫学的中和活性を示す抗体産
性能を有する融合細胞を選択し、この選択細胞を
増殖させ、生成した新リンホカインに対して免
疫学的中和活性を示すモノクローナル抗体を採取
すればよい。

新リンホカインで、ヒト以外の温血動物を免
疫する方法は、例えば、ニワトリ、ハト、イヌ、
ネコ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、
モルモツト、ラツト、ハムスター、マウスなどの
ヒト以外の温血動物の例えば、静脈、腹腔、皮下
などに、抗原としても新リンホカインを水溶
液、乳化液、懸濁液などとして注入した後、３日
以上飼育して抗体産生を誘導すればよい。また、
新リンホカインを特公昭58−23847号公報に記
載している方法で、新リンホカインの糖質結合
物に変えた後、抗原として利用することも有利に
実施できる。

抗原の注入は、１回だけでもよいし、必要なら
ば、約３〜30日間隔で２回以上注入してもよい。

このようにして免疫し、抗体産生を誘導させた
動物のひ臓細胞と同種、または異種動物由来の骨
髄腫（myeloma）細胞とを、例えば、G.Kohler
などが「Nature」Vol.256、495〜497頁（1975
年）、および「Eur.J.Immunol.」Vol.6、511〜
519頁（1976年）で報告している方法により融合
せしめ、得られる融合（hybrid）細胞を選択して
クローン化し、次いで、生体外（in vitro）、ま
たは生体内で培養し、この培養物より免疫学的中
和活性の高いモノクローナル抗体を採取する。な
かでも、生体内での培養は、生体外の場合と比較
して、高価な血清を必要としないばかりでなく、
融合細胞の増殖速度が大であり、かつ多量のモノ
クローナル抗体を産生し得るので極めて有利であ
る。

生体内で培養する場合には、免疫して抗体産生
を誘導させた動物と同種または異種の温血動物に
融合細胞を移植し、または拡散チヤンバー内へ接
種してその温血動物の体液の供給を受けながら増
殖させ、得られる腹水、血清などの液体からモノ
クローナル抗体を採取するか、または、生体内で
増殖させた融合細胞を、さらに無血清培地中で約
１〜５日間の短期間培養を行ない、その培養物か
らモノクローナル抗体を採取すればよい。

本発明で使用する抗体産生細胞としては、抗原
により免疫したヒト以外の温血動物のひ臓細胞を
使用した場合を例示しているが、例えば、「単ク
ローン抗体−ハイブリドーマとELISA」株式会
社講談社（1983年）発行第11頁第２〜７行に記
載されているように、ひ臓細胞のほかリンパ節細
胞や末梢血中のリンパ細胞なども使用することが
できる。

以上述べたようにして生成したモノクローナル
抗体は、常法に従つて、例えば、塩析、透析、濾
過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行うことに
よつて容易に生成分離し、採取することができ
る。更に高度の精製を必要とする場合には、例え
ば、イオン交換体への吸着−溶出、ゲル濾過、等
電点分画、電気泳動、イオン交換クロマトグラフ
イー、高速液体クロマトグラフイー、カラムクロ
マトグラフイー、アフイニテイクロマトグラフイ
ーなど公知の方法を組合せれば、最高純度のモノ
クローナル抗体を採取することも可能である。

また、高純度の新リンホカインを、例えば、
プロムシアン活性化セフアロースなどの担体に固
定化し、この固定化した新リンホカインゲルを
用いて精製し、モノクローナル抗体を高収率で採
取することも有利に利用できる。

このようにして得られるモノクローナル抗体
は、悪性腫瘍に対して障害活性を有する新リンホ
カインに対して免疫学的中和活性を示すことに
より、ヒトの疾病の診断剤、例えば、患者の新リ
ンホカイン血中濃度と正常人のそれと比較検討
し、疾病の診断をする測定試薬として、また、新
リンホカインを製造するためのアフイニテイク
ロマトグラフイーのリガンド（ligand）などとし
て有利に利用できる。

新リンホカインの活性は、標的細胞として
KB細胞、またはL₉₂₉細胞を用いて測定した。即
ち、KB細胞を用いる場合には、Cancer
Chemotherapy Reports Parts3、Vol.3、No.２、
September1972の記載に準じて、KB細胞の増殖
抑制活性を測定し、L₉₂₉細胞を用いる場合には、
E.Pick編、Tumor Necrosis Factor in
Lymphokines Vol.、245〜249頁、Academic
Press（1981年）の記載に準じて、アクチノマイシ
ンＤ存在下でのL₉₂₉細胞に与える細胞障害活性を
測定した。本明細書では、特にことわらない限
り、L₉₂₉細胞を用いる活性測定方法を採用した。

以下、本発明の実施例を述べる。

実施例１−(a) 部分精製した新リンホカインの調製新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法
で調製した抗血清を注射して、ハムスターの免疫
反応を弱めた後、その皮下にBALL−１細胞を移
植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮下
に生じた腫瘤を摘出して細切し、生理食塩水中で
分散させほぐした。得られた細胞を血清添加の
RPMI1640培地（PH7.2）で洗浄し、同培地に約
２×10⁶／mlになるよう懸濁した。本細胞懸濁液
に対して、ml当り約400赤血球凝集価のセンダイ
ウイルスを添加し、37℃で24時間保つて新リンホ
カインを誘導生成させた。

これを約４℃、約1000ｇで遠心分離し、沈澱物
を除去し、得られた上清をPH7.2、0.01Mリン酸
塩緩衝液を含有する生理食塩水で20時間透析し、
更に、精密濾過して得た濾液を、抗インターフエ
ロン抗体を固定化している抗体カラムに流し、そ
の非吸着画分を採取し、更に、これをクロマトグ
ラフイーカツシング法により活性画分を採取し、
濃縮し、凍結乾燥して新リンホカイン活性を含
有する粉末を得た。

本粉末の比活性は、約10⁶単位／mg蛋白質であ
つた。また、新リンホカインの収量は、ハムス
ター１匹当り約3000万単位であつた。

実施例１−(b) 抗新リンホカイン抗体の調製実施例１−(a)の方法で得た新リンホカインを
生理食塩水に蛋白質濃度として約0.05w／ｖ％に
なるように溶解し、これとフロイント完全アジユ
バント乳化液とを等量混合して、この混合液0.2
mlをマウスの皮下に注射し、７日後再び同様に注
射してマウスを免疫した。その抗体産生能を有す
る細胞に抗新リンホカイン抗体を誘導生成せし
め、このマウスからひ臓を摘出し、細切分散して
得られるひ臓細胞とマウス骨髄腫細胞P₃−X63−
Ag8（Flow Laboratories社製）とを、血清無含
有Eagleの最少基本培地で調製した50w／ｖ％ポ
リエチレングリコール1000溶液（PH7.2、温度37
℃）に、それぞれ10⁴／mlになるように浮遊させ
て５分間保つた後、前記基本培地で20倍に希釈
し、次いで、DavisonなどがSomatic Cell
Genetics、Vol.2、175〜176頁（1976年）に報告
している方法に準じてヒポキサンチン−アミノプ
リテン−チミジン培養液で増殖しうる融合細胞を
採取し、この融合細胞から抗新リンホカイン抗
体産生能を有する融合細胞を選択した。得られた
融合細胞をマウス腹腔内に１匹当り約10⁶個移植
して２週間飼育した後、これを屠殺して腹水、血
液などの体液を集め、遠心分離し、この上清を硫
安塩析して飽和度30〜50％の沈澱画分を集め、次
いで透析し、更に、この液を、実施例１−(a)の方
法で得た新リンホカインをプロムシアン活性化
セフアロースと室温下で反応させて得られる固定
化新リンホカインＩゲルを用いてアフイニテイク
ロマトグラフイーを行ない、抗新リンホカイン
抗体画分を得、透析した後、濃縮し、凍結乾燥し
て、新リンホカインＩのモノクローナル抗体粉末
を採取した。

本品は、新リンホカインの細胞障害活性に対
して免疫学的に得意的な中和活性を示した。

このモノクローナル抗体の水溶液での安定性を
中和活性の測定により調べた結果、PH7.2で30分
間保持する条件では、60℃で80％以上の活性が残
存し、70℃で90％以上の活性が失なわれた。ま
た、４℃で16時間保持する条件で、PH4.0〜11.0
の範囲では安定であり、PH2.0では90％以上の活
性が失なわれた。

更に、このモノクローナル抗体の性質を調べた
結果、２−メルカプトエタノールに不安定であ
り、抗マウスイムノグロブリンＭ抗体と特異的抗
原抗体反応を示すことが判明した。

従つて、このモノクローナル抗体は、イムノグ
ロブリンＭクラスに分類される抗体である。

実施例１−(c) 高純度に精製した新リンホカインの調製とそ
の理化学的性質実施例１−(a)の方法で調製した新リンホカイン
の部品精製品を、実施例１−(b)の方法で調製し
たモノクローナル抗体を固定化したゲルを用いて
アフイニテイクロマトグラフイーを行ない、新リ
ンホカインの活性画分を採取し、透析し、濃縮
して凍結乾燥した。

本品は、高純度に精製された新リンホカイン
であつて、その比活性は、約10⁹単位／mg蛋白質
であつた。また、本品はKB細胞を用いる活性測
定方法においてもほぼ同じ比活性を示した。

本品を用いて、理化学的性質を調査した。

分子量 K.Weber and M.Osborm、J.Biol.Chem.、
Vol.244、4406頁（1969年）の記載に準じて、
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
調べた。即ち、0.1％SDS存在下、10％アクリ
ルアミドゲルカラムに試料約10μｇを負荷し、
カラム当り８ｍA4時間泳動後、抽出し、その
活性測定から分子量を求めたところ、20000±
2000であつた。

等電点スウエーデン、LKB社製、等電点電気泳動
用ゲル、商品名AMPHOLINE PAGPLATE
（PH3.5〜9.5）を用いて、25W、２時間泳動し
た結果、等電点pIは5.6±0.2であつた。

電気易動度 B.J.Davis、Ann.N.Y.Acad.Sci.、Vol.121、
404頁（1964年）の記載に準じて、7.5％アクリ
ルアミドゲルカラムに試料約10μｇを負荷し、
PH8.3、カラム当り３ｍＡで２時間泳動後、抽
出してその活性測定から電気易動度を求めたと
ころ、Rf0.29±0.02であつた。

紫外線吸収スペクトル株式会社島津製作所製の分光光度計、商品名
UV−250を用いて紫外部での吸収スペクトル
を調べた結果、280nｍ付近に最大吸収を示し
た。

溶剤に対する溶解性水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶。エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶であつた。

呈色反応ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示した。

作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示した。イン
ターフエロン活性は実質的に示さなかつた。

水溶液での活性安定性 (i) 熱安定性約１×10⁵単位／mlの試料を各温度により
PH7.2で30分間保持した後、残存する活性を
測定した結果、60℃まで安定であつた。

(ii) PH安定性約１×10⁶単位／mlの試料0.1mlを各PH緩衝
液（PH２〜７…Mcllvaine buffer.PH７〜８
…Phosphate buffer.PH８〜11…Glycine−
NaOH buffer）１mlをに加え、４℃で16時
間保持した後、この0.1mlPH7.2、0.05Mリン
酸塩緩衝液でPH7.2に調製して残存する活性
を測定した結果、PH4.0乃至11.0の範囲で安
定であつた。

(iii) デイスパーゼ（DISPASE）に対する安定
性約１×10⁵単位／mlの試料にデイスパーゼ
（合同酒精株式会社製造のバシラス属細菌由
来のプロテアーゼ）100単位／mlになるよう
に加え、PH7.2、温度37℃で０乃至２時間反
応させ、経時的にサンプリングし、牛血清ア
ルブミンを1w／ｖ％になるように加えて反
応を止めた。この液の新リンホカインの残
存活性が失われた結果、新リンホカインは
デイスパーゼ処理により不安定で、その反応
につれて新リンホカインの活性が失なわれ
た。

凍結貯蔵による安定性 PH7.2の水溶液を−10℃で凍結し１ケ月間貯
蔵した後、融解し、活性を測定した結果、活性
の低下は見られなかつた。

以上の結果から、新リンホカインＩは、従来知
られているリンホトキシン、ツモアネクロシス
フアクター（TNF）、インターフエロンなどの
リンホカインとは、明らかに違つた理化学的性質
を有する。

従つて、新リンホカインの細胞障害活性と免
疫学的に特異的中和活性を示す本発明のモノクロ
ーナル抗体は、新規なモノクローナル抗体であ
る。

実施例２実施例１−(c)の方法で得た高純度新リンホカイ
ンを抗原に用いた以外は、実施例１−(b)と同様
にマウスを免疫して得られたひ臓細胞とマウス骨
髄腫細胞P3−NS−１／１−Ag4−１（大日本製
薬株式会社社製）とを、140ｍＭ NaCl、54ｍＭ
KCl、１ｍＭ NaH₂PO₄、２ｍＭ CaCl₂を含
有する塩類溶液に、それぞれ10⁴／mlになるよう
に浮遊させ、これに予じめ紫外線を不活性したセ
ンダイウイルスを含有する前記塩類溶液を氷冷下
で混合し、この混合液を５分後に37℃のRPMI培
地で約20倍に希釈し、次いで、実施例１−(b)と同
様にして抗新リンホカイン産生能を有する融合
細胞を選択した。

得られた融合細胞を、公知の方法で免疫反応を
弱めた生後７日のハムスターの腹腔内に１匹当り
約10⁷個移植し、実施例１−(b)と同様にしてモノ
クローナル抗体を採取した。

本品は、実施例１−(b)で調製したモノクローナ
ル抗体と同様に新リンホカインの細胞障害活性
に対し免疫学的に特異的中和活性を示した。

このモノクローナル抗体の水溶液での安定性
を、その中和活性の測定により調べた結果、PH
7.2で30分間保持する条件では、60℃で80％以上
の活性が残存し、70℃で90％以上の活性が失なわ
れた。また、４℃で16時間保持する条件では、PH
2.0〜11.0の範囲で安定であつた。

更に、このモノクローナル抗体の性質を調べた
結果、２−メルカプトエタノールに安定であり、
抗マウスイムノグロブリンＧ抗体と特異的抗原抗
体反応を示すことが判明した。

従つて、このモノクローナル抗体は、イムノグ
ロブリンＧクラスに分類される抗体である。

実施例３実施例２の方法のうち、マウス骨髄腫細胞P3
−NS−１／１−Ag4−１の代りに、SP2／０−
Ag14（大日本製薬株式会社製）を用いた以外は、
実施例２と同様に行ない、新リンホカインのモ
ノクローナル抗体を製造した。

本品は、新リンホカインの細胞障害活性と免
疫学的に特異的中和活性を調べたところ、実施例
２の場合と同様の結果が得られた。

Claims

【特許請求の範囲】１理化学的性質が、分子量 20000＋2000 等電点 pI＝5.6＋0.2 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収溶剤に対する溶解性水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶。エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶。呈色反応ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0
乃至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である
新リンホカインに対して免疫学的中和活性を
示すモノクローナル抗体。２理化学的性質が、分子量 20000±2000 等電点 pI＝5.6±0.2 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収溶剤に対する溶解性水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶。エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶呈色反応ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0
乃至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である
新リンホカインを抗原としてヒト以外の温血
動物を免疫し、該動物から抗体産生細胞を採取
し、これと骨髄腫細胞とを融合せしめ、得られ
る融合細胞から抗新リンホカイン抗体産生能
を有する融合細胞を選択し、次いで、この選択
細胞を増殖させ新リンホカインに対して免疫
学的中和活性を示すモノクローナル抗体を産生
せしめることを特徴としたモノクローナル抗体
の製造方法。