CH664969A5 - Lymphokine humain, sa production et son utilisation pour obtenir un anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine. - Google Patents
Lymphokine humain, sa production et son utilisation pour obtenir un anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine. Download PDFInfo
- Publication number
- CH664969A5 CH664969A5 CH5906/84A CH590684A CH664969A5 CH 664969 A5 CH664969 A5 CH 664969A5 CH 5906/84 A CH5906/84 A CH 5906/84A CH 590684 A CH590684 A CH 590684A CH 664969 A5 CH664969 A5 CH 664969A5
- Authority
- CH
- Switzerland
- Prior art keywords
- cells
- human
- animal
- cell
- producing
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 77
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 58
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 26
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 13
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 13
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 12
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 5
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 4
- MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 10h-anthracen-9-one;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000016605 B-Cell Activating Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 claims description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 3
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 claims 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 28
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 10
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 10
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 6
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 5
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 4
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 4
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IUVCFHHAEHNCFT-INIZCTEOSA-N 2-[(1s)-1-[4-amino-3-(3-fluoro-4-propan-2-yloxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl]ethyl]-6-fluoro-3-(3-fluorophenyl)chromen-4-one Chemical compound C1=C(F)C(OC(C)C)=CC=C1C(C1=C(N)N=CN=C11)=NN1[C@@H](C)C1=C(C=2C=C(F)C=CC=2)C(=O)C2=CC(F)=CC=C2O1 IUVCFHHAEHNCFT-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 206010023856 Laryngeal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 208000036844 Squamous cell carcinoma of the larynx Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 231100000215 acute (single dose) toxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000011047 acute toxicity test Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009613 breast lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002662 enteric coated tablet Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940025708 injectable product Drugs 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 239000002799 interferon inducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940113116 polyethylene glycol 1000 Drugs 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000008261 skin carcinoma Diseases 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000003871 white petrolatum Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
DESCRIPTION
La présente invention concerne une nouvelle lymphokine humaine, sa production et une composition la renfermant. Elle se rapporte également à son utilisation pour la production d'un anticorps monoclonal spécifique de cette lymphokine.
La lymphotoxine (LT) et le facteur de nécrose des tumeurs (TNF) sont connus comme étant des lymphokines qui endommagent les cellules tumorales. Par exemple, LT est décrit par Aoki, Ryuichi et coll., Shin-Menekigaku Sosho, vol. 6, «Lymphokine», pp. 87-105 (1979), publié par Igaku-Shoin, Tokyo, In Vitro Method in Cell-mediated Immunity, édité par B.R. Bloom & P.R. Giade, publié par Academic Press, Inc. (1971), et Cellular Immunology, vol. 38, pp. 388-402 (1978); et TNF est décrit par E.A. Carswell et coll., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 72, N° 9, pp. 3666-3670 (1975), et Lymphokines, vol. 2, pp. 235-272, «Tumor Necrosis Factor», édité par E. Pick, publié par Academic Press Inc. (1981). H. Ohnishi et coll. décrivent une lymphokine glycoprotéinique dans le brevet japonais Kokai N° 146 293/83. C. Milstein passe en revue les détails des anticorps monoclonaux dans Scientific American, vol. 243, N° 4, pp. 56-64 (1980).
La présente invention concerne une nouvelle lymphokine humaine, abrégée LK 1, ayant une activité cytotoxique sur les cellules de tumeurs malignes, caractérisée par les propriétés physicochimiques suivantes, différentes de celles des lymphokines connues:
a) Poids moléculaire = 20 000 + 2 000 u (20 000 ± 2 000 daltons).
b) Point isoélectrique : pi = 5,6+0,2.
c) Mobilité électrophorétique: (sur rondelle de PAGE) Rf= 0,29+0,02.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
664 969
d) Spectre d'absorption UV: une absorption maximale au voisinage de 280 nm.
e) Solubilité dans les solvants: le produit est soluble dans l'eau, le sérum physiologique et le tampon phosphate, il est peu soluble ou insoluble dans l'oxyde de diéthyle, l'acétate d'éthyle ou le chloroforme.
f) Réactions colorées: protéine-positive par le procédé de Lowry ou le procédé «microburette». Sucre-positive par le procédé phénol-acide sulfurique ou le procédé anthrone-acide sulfurique.
g) Activités biologiques: cytotoxique sur cellule L 929. Inhibiteur de croissance sur cellule KB. Pratiquement dénué d'activité in-terféron.
h) Stabilité en solution aqueuse: stable jusqu'à 60° C lorsque mis à incuber à pH 7,2 pendant 30 minutes. Stable dans l'intervalle de pH compris entre 4 et 11, lorsque mis à incuber à 4° C pendant
16 heures.
i) Stabilité lors de la cryoconservation: stable à —10° C sur une période de 1 mois ou plus.
Cette invention concerne également des procédés tels que définis dans les revendications 2 et 3 pour la production de cette nouvelle lymphokine, une composition pharmaceutique à action antitumorale telle que définie dans la revendication 11 et l'utilisation de cette nouvelle lymphokine telle que définie dans la revendication 13 pour obtenir un anticorps monoclonal spécifique de la nouvelle lymphokine.
Cette nouvelle lymphokine est ci-après désignée par la simple abréviation LK 1. Elle est produite par exposition d'une cellule humaine productrice de ce corps, par exemple les leucocytes humains, les lymphocytes humains et leurs lignées de cellules établies, à un inducteur de LK 1 dans des conditions permettant l'accumulation de quantités marquées de LK 1. Les lymphocytes et leucocytes humains peuvent être isolés à partir de sang frais humain. Les lignées de cellules établies, humaines, peuvent proliférer selon des modes opératoires in vitro classiques avant d'être utilisées.
En vue d'une pratique plus efficace selon l'invention, on réalise de préférence une prolifération cellulaire in vivo, au cours de laquelle la lignée cellulaire humaine est transplantée directement dans un animal à sang chaud, ou bien est ensemencée dans une chambre de diffusion de type classique, par l'intermédiaire de laquelle le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud est apporté à cette lignée. A l'opposé de la prolifération cellulaire in vitro, le mode opératoire in vivo, en plus du fait qu'il permet l'obtention d'un titre plus élevé en LK 1, ne nécessite que peu ou pas de milieu nutritif renfermant du sérum coûteux, et moins de soins au cours de la prolifération cellulaire. Plus particulièrement, dans le mode opératoire in vivo, utilisant comme hôte un animal à sang chaud, la lignée cellulaire humaine peut proliférer facilement tout en utilisant le fluide corporel nutritif fourni par l'animal, en étant transplantée dans l'animal même, ou bien en étant placée dans une chambre de diffusion de type classique, équipée pour recevoir le fluide corporel, cette chambre étant elle-même située dans ou sur l'animal. Dans chaque cas, les animaux sont nourris de manière habituelle. En outre, le mode opératoire in vivo est caractérisé par les faits suivants: une prolifération cellulaire bien plus stable et rapide, une production cellulaire supérieure et une production de LK 1 bien plus élevée par cellule, par rapport à ce que l'on obtient par le mode opératoire in vitro.
Les lignées cellulaires humaines, utilisables selon l'invention,
sont les lignées capables de produire LK 1, pouvant être transplantées dans un animal à sang chaud et y proliférant aisément. Conviennent par exemple des lignées cellulaires humaines énumérées dans Protein. Nucleic Acid et Enzyme., vol. 20, N° 6, pp. 616-643 (1975). Conviennent plus particulièrement les lignées de lymphoblas-toïdes humains, comme Namalwa (ATCC CRL 1432), comme décrit dans Journal of Clinical Microbiology, vol. 1, pp. 116-117 (1975); BALL-1, TALL-1 et Nall-1, comme décrit par Mioshi, Nature, vol. 267, pp. 843-844 (1977); M-7002 et B-7101, comme décrit dans The Journal of Immunology, vol. 113, pp. 1334-1345 (1974); JBL, EBV-
Sa, EBV-Wa, MOLT-3 (ATCC CRL 1552) et EBV-HO, comme décrit dans The Tissue Culture, vol. 6, N° 13, pp. 527-546 (1980); CCRF-SB (ATCC CCL 120); CCRF-CEM (ATCC CCL 119); BALM-2; DND-41 ; ainsi que d'autres lignées de cellules établies, obtenues par transformation de monocytes ou de granulocytes normaux, au moyen de radiations, agents ou virus cancérigènes.
La vitesse de prolifération et/ou la productivité de LK 1 par cellule de ces lignées cellulaires, peuvent être améliorées par un traitement de fusion cellulaire utilisant du polyéthylène glycol ou du virus de Sendai, ou par une technique de recombinant de gène utilisant l'enzyme de nucléase, l'enzyme de ligase, l'enzyme d'ADN poly-mérase, et similaires. L'énumération des lignées cellulaires humaines utilisables n'est pas limitative.
Selon le cas, on peut utiliser un ou plusieurs membres de ces lignées cellulaires en combinaison, jusqu'à l'induction de LK 1 qui est décrite ci-après. Des lymphocytes et leucocytes humains, préparés par exemple à partir de sang frais humain, peuvent être aussi utilisés en combinaison avec ces lignées cellulaires.
Les animaux à sang chaud utilisables selon l'invention comprennent ceux dans lesquels peuvent proliférer ces lignées cellulaires humaines. Conviennent par exemple les volailles comme poulet et pigeon, ou des mammifères comme chien, chat, singe, lapin, chèvre, porc, cheval, vache, cobaye, rat, rat nu, hamster, souris ou souris nue. Comme la transplantation de ces cellules humaines dans les animaux a pour résultat de faire naître une immunoréaction indésirable, il est souhaitable d'utiliser ces animaux au stade le plus jeune possible, par exemple sous forme d'œuf, d'embryon, de foetus, ou d'animal nouveau-né ou en bas âge, afin de réduire autant que possible cette immunoréaction. Avant la transplantation, l'animal peut être irradié avec des rayons X ou gamma, environ 200-600 rems, ou recevoir une injection convenable d'antisérum ou d'immunosuppres-seur, afin de réduire l'immunoréaction au niveau le plus bas possible. Les animaux immunodéficients, comme souris et rat nus, conviennent comme hôte animal: n'importe laquelle des lignées cellulaires humaines citées plus haut peut être transplantée dans ces animaux sans traitement préalable, et y proliférer avec moins de danger d'y provoquer une immunoréaction indésirable puisqu'ils présentent moins d'immunoréaction, même à l'état adulte.
On peut obtenir une stabilisation de la prolifération cellulaire et/ou une augmentation de la production de LK 1 par transplantations successives utilisant des animaux à sang chaud semblables ou différents: par exemple, on peut atteindre ces objectifs en transplantant d'abord une lignée cellulaire humaine à un hamster, où elle prolifère, puis en transplantant ces cellules ayant proliféré dans une souris nue. Dans ce cas, la seconde transplantation peut s'effectuer avec un animal à sang chaud de même classe ou ordre, aussi bien qu'avec ceux de même genre ou espèce.
On peut transplanter les cellules humaines en tout site de l'animal, pourvu que ces cellules puissent y proliférer, par exemple dans la cavité allantoïque, ou par voie intraveineuse, intrapérito-néale ou sous-cutanée.
Au lieu de les transplanter chez l'animal, on peut, afin de les faire proliférer facilement, placer les cellules humaines mentionnées plus haut dans une chambre de diffusion de type classique, de formes et de dimensions variées, munie de moyens convenables pour empêcher la contamination de la chambre par les cellules de l'animal, tout en fournissant aux cellules humaines le fluide corporel nutritif de l'animal, par exemple membrane filtrante, ultrafiltre ou fibre creuse d'une dimension nominale de pore de l'ordre de 10-7-10~5 m;
insérer, par exemple par voie intrapéritonéale, cette chambre dans l'animal; et laisser les cellules humaines s'y développer grâce à l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal. En outre, la chambre de diffusion peut être conçue et placée sur l'animal de façon que le fluide nutritif puisse circuler librement dans la chambre. La culture dans cette chambre peut être observée au cours de la prolifération cellulaire, par une ou des fenêtres latérales, transparentes, prévues sur la ou les parois de la chambre, et/ou la chambre elle-même peut être remplacée par intervalles par une chambre fraîche, à la fois pour
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
664 969
4
poursuivre la prolifération cellulaire sur la période d'espace de vie de l'animal sans le sacrifier, et pour augmenter beaucoup plus la production cellulaire par animal. Comme, en raison de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'animal, ces chambres de diffusion suscitent beaucoup moins d'immunoréactions indésirables, on peut aisément utiliser tout animal à sang chaud sans traitement préalable destiné à réduire l'immunoréaction, et les cellules humaines viables, ayant proliféré, peuvent y être facilement recueillies.
L'alimentation de l'animal peut s'effectuer de manière habituelle, et il n'y a pas de précautions spéciales à prendre, même après la transplantation. La période nécessaire pour l'obtention de la prolifération cellulaire maximale est généralement comprise entre 1 et 10 semaines. Le nombre de cellules humaines ainsi obtenues par animal est de l'ordre de 107 à 1012 ou plus. Plus particulièrement, conformément à l'invention, le nombre de cellules humaines transplantées est multiplié par 102 à 101 ou plus, ce qui représente 10 à 10® fois, ou plus, ce que l'on obtient par ensemencement et prolifération des cellules humaines sur un milieu de culture nutritif in vitro. Cela est très favorable en vue de la production de LK 1.
Tout procédé est possible selon la présente invention, dans la mesure où il permet d'induire la production de LK 1 dans les cellules humaines ayant proliféré. Celles-ci peuvent être exposées à l'action d'un inducteur de LK 1 dans l'animal utilisé comme hôte pour la prolifération cellulaire. Par exemple, une cellule humaine ayant proliféré dans un ascite en suspension, ou une cellule tumorale, formée par exemple par voie sous-cutanée, est directement exposée in vivo à l'action d'un inducteur de LK 1, et la LK 1 accumulée est recueillie à partir de l'ascite, du sérum et/ou de la tumeur, puis est purifiée. Ou bien, la cellule humaine ayant proliféré peut être recueillie à partir de l'animal avant d'être exposée in vitro à l'action d'un inducteur de LK 1. Par exemple, la cellule humaine ayant proliféré, obtenue par récolte à partir de la suspension d'ascite, ou par extraction et désagrégation de la masse tumorale formée par exemple par voie sous-cutanée, est mise en suspension dans un milieu de culture nutritif, préalablement chauffé à environ 20°-40° C, afin de donner une densité cellulaire de l'ordre de 105-108 cellules/ml, et est exposée in vitro à l'action d'un inducteur de LK 1, avant que la LK 1 accumulée ne soit recueillie à partir de la culture. Lorsqu'on utilise une chambre de diffusion de type classique, l'exposition à l'inducteur de LK 1 de la cellule humaine ayant proliféré s'effectue dans la chambre, ou après sa récolte.
La cellule humaine ainsi obtenue peut être cultivée in vitro pendant 1 à 4 jours supplémentaires, afin de régler sa durée de génération, avant l'induction de LK 1. La production de LK 1 par animal peut être encore augmentée grâce à l'utilisation d'un ou de plusieurs des procédés suivants.
1) Procédé au cours duquel la cellule humaine ayant proliféré est exposée à l'action d'un inducteur de LK 1 dans l'animal préalablement utilisé comme hôte pour la prolifération cellulaire, puis est recueillie à partir de certains sites de l'animal, ou de son corps entier, et est exposée in vitro à l'action d'un inducteur de LK 1.
2) Procédé au cours duquel la cellule humaine est exposée à maintes reprises à l'action d'un inducteur de LK 1.
3) Procédé selon lequel la chambre de diffusion, incrustée dans l'animal ou reliée à lui, est remplacée par intervalles par une chambre fraîche.
L'inducteur de LK 1, utilisable conformément à l'invention, peut être un inducteur classique d'a-interféron (inducteur IFN-a) tel que virus, acide nucléique et nucléotide; ou un inducteur classique de y-interféron (inducteur IFN-y), comme phytohémagglutinine, conca-navalin A, phytolaque mitogène, lipopolysaccharide, endotoxine, Polysaccharide et bactérie. Les antigènes agissent comme inducteurs de LK 1 sur des cellules sensibilisées par eux. La production de LK 1 peut être encore augmentée par l'utilisation combinée des inducteurs IFN-a et IFN-y. Il se confirme qu'une telle combinaison induit une production simultanée d'interféron humain spécifique (HuIFN).
Cela est très avantageux lors d'une production à l'échelle industrielle, simultanée et à faible coût, de deux des substances les plus biologiquement actives, c'est-à-dire HuIFN et LK 1, de valeur inestimable, ainsi qu'au point de vue d'une utilisation bien plus efficace des cellules humaines.
5 La LK 1, ainsi obtenue, peut être récupérée par un ou plusieurs modes de purification et/ou séparation, par exemple relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration, et/ou lyophilisation. Lorsqu'on souhaite obtenir une préparation de LK 1 beaucoup plus pure, un produit de la plus haute pureté peut être préparé par le io mode préparatoire décrit plus haut, en combinaison avec d'autres modes opératoires classiques, comme adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, fractionnement au point isoélectrique, électrophorèse, Chromatographie par échange d'ions, Chromatographie liquide à performance élevée, Chromatographie sur 15 colonne et/ou Chromatographie par affinité.
Les anticorps monoclonaux immobilisés, obtenus par liaison d'un anticorps anti-LK 1 monoclonal qui est décrit ci-après, sur un support approprié insoluble dans l'eau, par exemple Sepharose activé par BrCN, un produit de Pharmacia Fine Chemical AB 20 (Suède), sont avantageusement utilisables pour une purification plus rapide et plus facile de LK 1.
Il se confirme que la LK 1 obtenue présente les propriétés physico-chimiques a) à i) indiquées plus haut.
Il se confirme aussi que LK 1 n'exerce pas de cytolyse poussée 25 sur les cellules humaines normales, mais réalise une cytolyse remarquable sur certaines cellules tumorales humaines, ainsi que sur la lignée fibroblastoïde de la souris L 929, en tuant ces cellules. Ainsi, on peut utiliser avantageusement LK 1, par exemple sous forme de composition, comme agent prophylactique et/ou thérapeutique pour 30 les maladies sensibles à LK 1, comme tumeurs malignes, plus particulièrement certaines tumeurs malignes humaines dont le traitement est jugé très difficile.
Le procédé de production d'un anticorps monoclonal spécifique de LK 1, selon la présente invention, comprend les stades de: immu-35 nisation d'un animal à sang chaud avec la LK 1 comme antigène; collecte à partir du corps de l'animal des cellules productrices d'anticorps; fusion de ces cellules avec des cellules de myélome; sélection d'un clone capable de produire un anticorps spécifique de LK 1 à partir des cellules d'hybridome résultant; prolifération du clone; et 40 production par les cellules ayant proliféré de l'anticorps monoclonal spécifique de LK 1.
L'immunisation peut être obtenue par injection, par exemple par voie intraveineuse, intrapéritonéale, ou sous-cutanée, d'une solution, émulsion ou suspension aqueuse LK 1, en tant qu'antigène, à un 45 animal à sang chaud convenable, par exemple poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster ou souris, suivie de l'alimentation pendant 3 jours ou plus de l'animal, afin d'induire la production d'anticorps. On peut également utiliser comme antigène un produit conjugué de LK 1 et d'un 50 saccharide, comme décrit dans la publication de brevet japonais N° 23 847/83. L'antigène peut être injecté en une dose unique, ou éventuellement en deux ou plusieurs dosages à des intervalles de l'ordre de 3 à 30 jours.
Les cellules spléniques de l'animal immunisé, dans lequel la pro-55 duction d'anticorps a été induite, sont fusionnées avec des cellules de myélome d'espèce semblable ou différente au moyen d'un mode opératoire convenable, par exemple ceux qui sont reportés par G. Kohler et coll. dans Nature, vol. 256, pp. 495-497 (1975) et Eur. J. Immunol., vol. 6, pp. 511-519 (1976). Les cellules hybrides ainsi 60 obtenues sont alors choisies et clonées, après quoi les clones sont cultivés in vitro ou in vivo, puis on recueille à partir de la culture résultante les anticorps monoclonaux hautement spécifiques, accumulés. Plus particulièrement, le mode opératoire in vivo est de beaucoup préférable au mode in vitro, car le premier permet d'atteindre une 65 prolifération bien plus élevée du clone et une production plus forte de l'anticorps monoclonal, sans utilisation de sérum coûteux. Au cours du mode opératoire in vivo, le clone prolifère en utilisant le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud, d'espèce semblable
5
664 969
ou différente de celle qui a été utilisée lors de l'immunisation, soit en le transplantant directement dans l'animal, soit en l'ensemençant dans une chambre de diffusion de type classique conçue pour recevoir le fluide corporel nutritif de cet animal, et l'anticorps monoclonal accumulé est recueilli à partir de fluides corporels comme ascite et sang. Autre possibilité, le clone, après prolifération in vivo, peut être cultivé sur un milieu de culture dénué de sérum pendant 1 à 5 jours supplémentaires, avant que l'on recueille l'anticorps monoclonal accumulé à partir de la culture résultante.
Les anticorps monoclonaux ainsi obtenus peuvent être facilement récupérés, avec un ou plusieurs modes de séparation et/ou de purification tels relargage, dialyse, filtration, centrifugation et/ou lyophilisation. Lorsqu'on souhaite une purification plus poussée, on peut obtenir une préparation très pure en combinant les modes opératoires ci-dessus avec d'autres modes opératoires classiques comme adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, fractionnement au point isoélectrique, électrophorèse, Chromatographie avec échange d'ions, Chromatographie liquide à haute performance, Chromatographie sur colonne, et/ou Chromatographie par affinité. Le rendement de récupération de l'anticorps monoclonal peut être avantageusement amélioré grâce à l'utilisation d'un gel de LK 1 immobilisé, obtenu par liaison de LK 1 très pure sur un support insoluble dans l'eau, convenable, par exemple Sepharose activé par BrCN.
L'anticorps monoclonal obtenu conformément à l'invention est avantageusement utilisable comme coordinat pour la Chromatographie par affinité orientée vers la production de LK 1, aussi bien que pour le diagnostic de différentes maladies humaines, en raison de sa spécificité envers LK 1 qui a une activité cytotoxique vis-à-vis des tumeurs malignes.
Les titres de LK 1 sont déterminés grâce à l'utilisation de cellules KB, ou de cellules L 929, prises comme cellules cibles : lorsqu'on utilise les cellules KB, l'activité d'inhibition de la croissance sur ces cellules est déterminée selon le procédé décrit dans Cancer Chemo-therapy Reports, partie 3, vol. 3, N° 2 (septembre 1972), avec une légère modification; lorsqu'on utilise les cellules L 929, l'activité cytotoxique sur ces cellules en présence d'Actinomycine D est déterminée par le procédé décrit dans Lymphokines, vol. 2, pp. 245-249, «Tumor Necrosis Factor», édité par E. Pick, publié par Academic Press, Inc. (1981), avec une légère modification. Dans la présente description, sauf indication contraire, on utilise le dernier procédé avec cellules L 929.
Les titres de HuIFN sont déterminés par le procédé classique de réduction sur plaque, utilisant des cellules FL d'origine amniotique humaine, décrit dans Protein, Nucleic Acid and Enzyme, vol. 20, N° 6, pp. 616-643 (1975).
Les titres d'hémagglutination sont déterminés selon le procédé reporté par S.E. Salk, The Journal of Immunology, vol. 49, pp. 87-98 (1944) avec une légère modification.
Les expérimentations suivantes illustrent plus en détail la présente invention.
Expérimentation A-l
Préparation de LK 1 particulièrement purifiée
On injecte à des hamsters nouveau-nés un antisérum classique préparé à partir de lapin, afin d'affaiblir leur immunoréaction, on y transplante par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoïdes humains, BALL-1, et on les alimente de manière habituelle pendant 3 semaines. Les masses tumorales, formées sous la peau, sont extraites, hachées et désagrégées dans du sérum physiologique. La suspension de cellules ainsi obtenue est alors rincée avec du milieu RPMI 1640 (pH 7,2) additionné de sérum, et on remet en suspension dans une préparation fraîche du même milieu de culture, afin d'avoir une densité cellulaire de l'ordre de 2 x 106 cellules/ml. On ajoute à cette suspension du virus de Sendai (environ 400 titres d'hémagglutina-tion/ml), et l'on met à incuber à 37° C pendant 24 heures pour induire la production de LK 1. La culture est alors centrifugée vers
4° C et 1000 g, et le précipité résultant est enlevé. La partie surnageante ainsi obtenue est dialysée contre du sérum physiologique renfermant 0,01M de tampon phosphate (pH 7,2) pendant 20 heures, et est traitée avec une membrane filtrante. On fait alors passer le filtrat au travers d'une colonne d'un anticorps anti-HuIFN immobilisé, et l'on collecte la fraction non adsorbêe. A partir de cette fraction, on récupère une fraction active au moyen de chromatoconcentration, on la concentre et la lyophilise pour obtenir une poudre dotée d'activité LK1.
L'activité spécifique de cette poudre est de l'ordre de 10® uni-tés/mg de protéine. Le rendement en LK 1 est de l'ordre de 3 x 107 unités par hamster.
Expérimentation A-2 Préparation d'anticorps anti-LK 1
Une préparation de LK 1, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-l, est dissoute dans du sérum physiologique afin d'avoir une concentration de l'ordre de 0,05% de protéine en poids/volume, et on ajoute à cette solution le même volume d'adjuvant complet de Freund. Des souris sont immunisées par injection sous-cutanée de portions de 0,2 ml du mélange ainsi obtenu, avec rappel 7 jours après la première injection. Après induction de la production d'anticorps anti-LK 1 dans les cellules productrices d'anticorps des animaux, on extrait les rates de ces derniers, les hache, les désagrège et les met en suspension conjointement avec une lignée cellulaire de myélome de souris, P3-X63-Ag8, en provenance de Flow Laboratories Inc. USA, dans du milieu essentiel minimal de Eagle dépourvu de sérum (pH 7,2) renfermant 50% poids/volume de polyéthylène glycol 1000, préchauffé à 37° C, afin d'obtenir des densités cellulaires respectives de 104 cellules/ml, puis on laisse reposer 5 minutes le mélange résultant. Ce mélange est ensuite dilué 20 fois dans une préparation fraîche du même milieu de culture, et les cellules d'hybridome capables de se développer sur le milieu renfermant hypoxanthine, aminoptérine et thymidine sont recueillies selon le procédé reporté par R.L. Davidson et P.S. Gerald dans Somatic Cell Genetics, vol. 2, N° 2, pp. 175-176 (1976) pour cloner les cellules d'hybridome capables de produire l'anticorps anti-LK 1. On transplante dans des souris, par voie intrapéritonéale, les cellules d'hybridome clonées à la dose d'environ 10® cellules par souris; on les alimente pendant 2 semaines avant de les sacrifier. Les fluides corporels des animaux, tels fluide ascitique et sang, sont recueillis, centrifugés et relargués avec du sulfate d'ammonium, puis on collecte les fractions déposées pour des saturations de 30-50%. Ces fractions sont dialysées et soumises à une Chromatographie par affinité utilisant un gel d'anticorps anti-LK 1 immobilisé, obtenu par réaction d'un spécimen de LK 1, préparé par le procédé décrit dans l'expérimentation A-l, avec du Sepharose activé par BrCN, à température ambiante, pour obtenir une fraction d'anticorps anti-LK 1, qui est ensuite dialysée, concentrée et lyophilisée en une poudre. Cette poudre présente une neutralisation immunologiquement spécifique de l'activité cytotoxique de LK 1.
La stabilité de l'anticorps monoclonal en solution aqueuse est étudiée par détermination des activités neutralisantes résiduelles, après mise en incubation dans les conditions prescrites: lorsqu'on opère à pH 7,2 et à différentes températures pendant 30 minutes, à 60° C, il reste au moins 80% de l'activité, mais à 70° C il y a perte de plus de 90%. Après mise en incubation à 4° C et différents pH pendant 16 heures, l'activité reste stable dans l'intervalle de pH compris entre 4 et 11, mais à pH 2 la perte d'activité est d'au moins 90%.
Lorsqu'on étudie les propriétés de l'anticorps monoclonal selon l'invention, on constate qu'il ne résiste pas au mercapto-2 éthanol, et provoque une réaction spécifique antigène-anticorps avec l'anticorps Immunoglobuline M antisouris. Aussi le présent anticorps monoclonal se classe-t-il dans le groupe des anticorps immunoglobuline M.
s
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
664 969
6
Expérimentation A-3
Préparation et propriétés physico-chimiques de LK 1 très pure
Un spécimen de LK 1 partiellement purifiée, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-l, est soumis à une Chromatographie par affinité au moyen d'un gel d'anticorps monoclonal immobilisé, préparé par le procédé décrit dans l'expérimentation A-2, et l'on recueille des fractions de LK 1 qui sont ensuite dialysées, concentrées et lyophilisées.
Le résultat est une préparation très pure de LK 1 ayant une activité spécifique de l'ordre de 109 unités/mg de protéine. Le dosage de LK 1 de cette préparation, utilisant des cellules KB, donne approximativement la même activité spécifique.
Les propriétés physico-chimiques de LK 1 sont étudiées à partir de cette préparation.
1) Poids moléculaire
Le poids moléculaire de LK 1 est déterminé par les procédés électro-phorétiques utilisant du gel de SDS-polyacrylamide, décrits par K. Weber et M. Osborn, J. Biol. Chem., vol. 244, p. 4406 (1969),
avec une légère modification. Les colonnes de gel à 10% d'acrylamide sont chargées avec des portions d'environ 10 |xg de la préparation, en présence de 0,1 % de SDS, et l'on met sous charge de 8 mA par colonne pendant 4 heures, afin de réaliser Félectrophorèse. Après extraction et dosage ultérieur de LK 1 des fractions actives, le poids moléculaire de LK 1 est de 20000+2000 u (20000 + 2000 daltons).
2) Point isoélectrique
Une électroconcentration à 25 W de la préparation, de 2 heures, utilisant « Ampholine Pagplate», un gel fabriqué pour l'électroconcen-tration par LKB-Produkter AB, Suède, donne un point isoélectrique pi de 5,6 + 0,2.
3) Mobilité électrophorétique
Selon le procédé décrit par BJ. Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci., vol. 121, page 404 (1964), légèrement modifié, on charge sur des colonnes de gel d'acrylamide à 10% des fractions d'environ 10 jxg de la préparation, on soumet à une électrophorèse à pH 8,3 et 3 mA par colonne pendant 2 heures, on extrait et on dose l'activité de LK 1 pour obtenir une mobilité électrophorétique Rf de 0,29 + 0,02.
4) Spectre d'absorption UV
Après analyse du spectre UV de la préparation à l'aide d'un spectro-mètre UV-250, fabriqué par Shimadzu Seisakusho KK, Japon, on observe une absorption maximale au voisinage de 280 nm.
5) Solubilité dans le solvants
Le produit est soluble dans l'eau, le sérum physiologique et la solution tampon phosphate; faiblement ou pas soluble dans l'oxyde de diéthyle, l'acétate d'éthyle et le chloroforme.
6) Réaction colorée
Elle est protéine-positive par le procédé de Lowry et celui de microburette; sucre-positive par le procédé au phénol-acide sulfurique et celui à l'anthrone-acide sulfurique.
7) Activité biologique
On observe une activité cytotoxique sur les cellules L 929 et une activité d'inhibition de croissance sur les cellules KB. On ne remarque pas d'activité HuIFN marquée.
8) Stabilité en solution aqueuse a) Stabilité à la chaleur:
On met à incuber à pH 7,2, pendant 30 minutes, et à différentes températures, des fractions d'environ 1 x 105 unités/ml de la préparation, et l'on détermine les activités cytotoxiques résiduelles. On constate que LK 1 est stable jusqu'à 60° C.
b) Stabilité au pH:
Des fractions de 0,1 ml de la préparation (1 x 10® unités/ml) sont additionnées avec 1 ml de solution tampon de différentes valeurs de pH, c'est-à-dire de tampon de Mcllvaine à pH 2 à 7, tampon phosphate à pH 7 à 8, tampon glycine-NaOH à pH 8 à 11, et l'on met à incuber à 4° C pendant 16 heures. Puis on ajuste à pH 7,2, avec du tampon phosphate 0,05 M, 0,1 ml du mélange incubé, et l'on détermine l'activité résiduelle. On constate que LK 1 est stable dans l'in-5 tervalle de pH compris entre 4 et 11.
c) Stabilité à la Dispase:
A environ 1 x 105 unités/ml de la préparation, on ajoute de la Dispase, une protéase de micro-organisme Bacillus, commercialisée par Godo Shusei Co., Ltd, Japon, de manière à donner une activité 10 enzymatique de 100 unités/ml, et l'on fait incuber ce mélange à pH 7,2 et à 37° C pendant 2 heures. Au cours de l'incubation, on prélève périodiquement de petites portions du mélange et on les additionne d'albumine de sérum de veau de manière à avoir une concentration de 1 % en poids/volume, afin d'arrêter la réaction enzymatique. Lors 15 du dosage des activités LK 1 dans les échantillons, on constate que LK 1 est sensible au traitement par la Dispase et perd son activité à mesure que se déroule la réaction enzymatique.
9) Stabilité à la cryoconservation 2Q La préparation de LK 1 est entreposée en solution aqueuse à —10° C et pH 7,2 pendant 1 mois, est dégelée et dosée. On ne constate pas de diminution d'activité.
Il ressort de ce qui précède que LK 1 a des propriétés physicochimiques différentes de celles des lymphokines connues comme LT, 25 TNF ou IFN. De même, l'anticorps monoclonal selon l'invention est nouveau, car il présente une neutralisation immunologiquement spécifique de l'activité cytotoxique de la nouvelle lymphokine LK 1.
Expérimentation B-l 30 Inhibition de la croissance des tumeurs malignes
L'effet inhibiteur de croissance, exercé par LK 1 sur plusieurs cellules humaines, a été étudié en utilisant les préparations de ce produit obtenues par le procédé décrit dans les expérimentations A-l et A-3.
35 10® cellules de l'une des lignées humaines, ênumérées dans le tableau 1, sont mises en suspension dans 1 ml de milieu nutritif classique additionné de sérum fœtal de veau; on cultive pendant 1 jour, y ajoute 0,1 ml de sérum physiologique renfermant 50 ou 500 unités de préparation de LK 1, préparée par le procédé décrit dans l'expéri-40 mentation A-l ou A-3, et met à incuber à 37° C pendant 2 jours. Lorsque la culture est achevée, les cellules viables sont colorées avec du rouge neutre, un type d'agent colorant, selon le procédé décrit dans Applied Microbiology, vol. 22, N° 4, pp. 671-677 (1971), et l'agent colorant est êlué au moyen d'une solution d'éthanol acidifié. 45 Ensuite, le nombre de cellules viables est déterminé par mesure de la capacité d'absorption de l'éluat, pour une longueur d'onde de 540 nm. On utilise comme témoin 0,1 ml de sérum physiologique exempt de LK 1.
Le pourcentage d'inhibition de croissance est calculé grâce à 50 l'équation suivante:
Inhibition de croissance (%) =
,j _ Capacité d'absorption avec LK L x jqq Capacité d'absorption du témoin
55
Les résultats sont indiqués dans le tableau I.
( Tableau en tête de la page suivante)
Ainsi qu'on peut le constater dans ce tableau, il se confirme que 60 LK 1 n'affecte guère les cellules normales, mais qu'elle inhibe fortement la croissance de différentes cellules de tumeurs malignes. Il se confirme également que l'action d'une LK 1 partiellement purifiée (A-l) est bien comparable à celle du produit très purifié (A-3).
65 Expérimentation B-2
Un groupe de souris BALB/c reçoivent un transplant de cellules Meth A, provenant de sarcome de souris. A partir du dixième jour après la transplantation, on injecte aux souris, par voie sous-cuta-
7
Tableau I
664 969
Nom de la lignée cellulaire
Source de la lignée cellulaire
LK 1 provenant de l'expérimentation A-l
LK 1 provenant de l'expérimentation A-3
50 unités
500 unités
50 unités
500 unités
HEp#2*
Carcinome épidermoïde du larynx
32
41
48
70
PC-8*
Carcinome du poumon
28
39
57
81
MKN 7*
Carcinome gastrique
37
44
61
76
HLE*
Carcinome du foie
31
40
54
72
HeLa*
Carcinome épithéloïde du col de l'utérus
26
36
45
69
L-132**
Poumon embryonnaire
4
-2
1
-3
Foie de Chang**
Foie
2
-4
-5
1
Cœur de Giradi**
Cœur
-3
2
-1
-3
Nota: * Lignées de cellules humaines provenant de tumeurs malignes. ** Cellules provenant de tissus normaux.
née, du sérum physiologique renfermant une préparation de LK 1 obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-3, à raison 25 de 100 ou 1000 unités/kg et par jour, pendant 15 jours. Ces souris sont ensuite sacrifiées, et les masses tumorales formées chez les animaux sont mesurées.
Les résultats figurent dans le tableau II.
30
Tableau II
Traitement
Dosage par jour (unités/kg)
Masse tumorale (g)
Témoin
10
5,6 ± 0,7
LK 1
100
3,4 + 0,4*
1000
2,9 + 0,3*
Nota: * indique les résultats statistiquement significatifs par rapport 40 au témoin de valeur 5%.
Expérimentation B-3
Des groupes de souris nues BALB/c reçoivent des transplants sous-cutanés, dans la région dorsale, de petits fragments de tissu de 45 cancer du sein humain.
Lorsque la croissance des masses tumorales atteint environ 200 mm3 dans le corps des animaux, on injecte par voie intraveineuse du sérum physiologique renfermant une préparation de LK 1, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-l ou A-3, 50 une fois par jour à raison de 100 ou de 1000 unités/kg, pendant 20 jours. Puis on sacrifie les animaux et les tumeurs résultantes sont pesées.
Les résultats figurent dans le tableau III.
Tableau III
Traitement
Dosage par jour (unités/kg)
Masse tumorale (g)
Témoin
0
10,5 ± 1,1
LK 1 de l'expérimentation A-l
100
7,2 + 0,8*
1000
6,9 + 0,5*
LK 1 de l'expérimentation A-3
100
6,4 ± 0,6*
1000
5,8 + 0,7*
Nota: * indique les résultats statistiquement significatifs par rapport au témoin de valeur 5%.
Expérimentation B-4
Un essai de toxicité aiguë, au cours duquel on administre à un groupe de souris âgées de 20 jours une préparation de LK 1, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-3, confirme que la toxicité de la préparation est extrêmement faible, c'est-à-dire que DLS0 est égale ou supérieure à 109 unités, par injection intrapérito-néale.
Ainsi qu'il ressort des expérimentations ci-dessus, la LK 1 selon la présente invention se révèle très efficace pour inhiber la croissance des tumeurs malignes in vitro aussi bien qu'z'n vivo. En outre, l'administration de LK 1 est sans risque eu égard au fait qu'un dosage élevé n'affecte pratiquement pas les cellules normales, alors qu'un faible dosage agit remarquablement sur les cellules tumorales.
Le dosage efficace de la présente LK 1 se situe généralement dans l'intervalle de 5 à 500 000 000 unités/jour pour un adulte; plus particulièrement, pour l'administration locale, par exemple sous forme de collyre ou d'injection locale, le dosage se situe entre 5 et 10000000 unités/jour; pour l'administration percutanée ou permucosale, par exemple sous forme d'onguent ou de suppositoire, entre 10 et 50 000 000 unités/jour; pour l'administration systémique, par exemple par injection intraveineuse ou intramusculaire, entre 50 et 100000000 unités/jour; et pour l'administration orale, entre 500 et 500000000 unités/jour, mais ces dosages sont très variables selon les symptômes du patient et les indications.
Bien que LK 1 puisse être préparée sous forme de médicament de manière habituelle après mélange avec support, base et/ou véhicule convenable, la teneur en LK 1 doit être d'au moins 5 unités/g, eu égard à la toxicité, au dosage actif et à l'innocuité.
La forme et le conditionnement des agents prophylactiques et/ou thérapeutiques, pour les maladies sensibles à LK 1, peuvent être librement choisis: par exemple, pour l'administration orale, ils peuvent être façonnés en préparations pour usage entérique, par exemple capsule, comprimé ou poudre; pour l'administration rectale, suppositoire; pour injection, ils peuvent être par exemple préparés sous forme de produit lyophilisé qui est dissous, avant l'usage, avec de l'eau distillée pour donner une solution injectable; ils peuvent également se présenter sous forme d'onguent, de collyre ou de «collunarium».
Lors du traitement d'un patient à tumeur maligne, par exemple, on peut traiter in vitro un fragment de tissu tumoral provenant de ce patient avec LK 1 afin d'augmenter l'immunogénicité de ce fragment, que l'on administre au patient afin d'obtenir un traitement beaucoup plus efficace de la tumeur maligne.
Les exemples A, B et C illustrent respectivement la production de LK 1, des compositions pharmaceutiques renfermant LK 1 et l'anticorps monoclonal spécifique de LK 1.
664 969
Exemple A-l:
Une lignée humaine de lymphoblastoïdes, BALL-1, est ensemencée sur un milieu essentiel minimal de Eagle (pH 7,4) additionné de 20% de sérum fœtal de veau, et est cultivée in vitro, en suspension à 37° C, de manière habituelle. Les cellules humaines ayant proliféré sont alors rincées avec du milieu essentiel minimal de Eagle (pH 7,4) exempt de sérum et sont remises en suspension dans une préparation fraîche du même milieu de culture, de façon à avoir une densité cellulaire de 1 x 107 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est additionnée de virus de Sendai à la dose d'environ 1000 titres d'hémaggluti-nation/ml, et l'on met à incuber à 38° C pendant 1 jour afin d'induire la production de LK 1. Après centrifugation de la culture résultante à 4° C et 1000 x g, environ, la partie surnageante est dialysée contre du sérum physiologique renfermant 0,01 M de tampon phosphate (pH 7,2) pendant 15 heures, et l'on traite avec une membrane filtrante. On fait ensuite passer le filtrat au travers d'une colonne d'anticorps anti-LK 1, comme dans l'expérimentation A-l, et la fraction non adsorbée est purifiée comme dans l'expérimentation A-3 au moyen d'une Chromatographie par affinité utilisant une colonne de gel d'anticorps anti-LK 1, puis l'on concentre afin d'obtenir un concentré ayant une activité spécifique LK 1 d'environ 109 unités/mg de protéine.
Le rendement est de l'ordre de 2 x 106 unités/litre de suspension de cellules induites.
Exemple A-2:
On injecte à des hamsters nouveau-nés un antisérum classique, préparé à partir de lapin, afin d'affaiblir leur immunoréaction, on y transplante par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoïdes humains, BALL-1, et on les nourrit pendant 3 semaines de manière habituelle. Les masses tumorales, environ 15 g chacune, formées sous la peau des animaux sont extraites, hachées et désagrégées dans du sérum physiologique. Après rinçage avec du milieu RPMI1640 exempt de sérum (pH 7,2), les cellules ayant proliféré sont remises en suspension dans une préparation fraîche du même milieu de culture, afin d'obtenir une densité cellulaire de l'ordre de 5 x 106 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est additionnée du virus de Sendai et d'endotoxine d'E. coli, à raison respectivement de 1000 titres d'hé-magglutination/ml et 10 (ig/ml, environ, et l'on met à incuber à 37° C pendant 1 jour, pour induire la production de LK 1. Après centrifugation de la culture à 4° C et 1000 x g, environ, pour éliminer le sédiment, la partie surnageante est dialysée contre du sérum physiologique renfermant 0,01 M de tampon phosphate (pH 7,2) pendant 21 heures, et est traitée avec une membrane filtrante. Le filtrat est purifié avec une colonne d'anticorps, comme dans l'exemple A-l, et la solution d'éluat est concentrée et lyophilisée pour donner une poudre ayant une activité spécifique LK 1 de l'ordre de 109 unités/mg de protéine.
Le rendement est voisin de 4 x 107 unités.
Exemple A-3:
On transplante dans des souris nues adultes, par voie intrapérito-néale, une lignée de lymphoblastoïdes humains, TALL-1, on les alimente de manière habituelle pendant 5 semaines, leur injecte par voie intrapéritonéale du virus de la maladie de Newcastle (environ 3000 titres d'hémagglutination par souris nue) qui a été au préalable pratiquement inactivé par irradiation aux UV, et les sacrifie 24 heures après cette injection, puis on recueille leurs fluides ascitiques. Ces fluides sont purifiés, concentrés et lyophilisés comme dans l'exemple A-2 pour donner une poudre possédant l'activité LK 1.
Le rendement est de l'ordre de 4 x 106 unités/souris nue.
Exemple A-4:
Des souris adultes sont irradiées avec environ 400 rems de rayons X afin d'affaiblir leur immunoréaction, on y transplante par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoïdes humains, Mono-1, et on les alimente de manière habituelle pendant 3 semaines. Les masses tumorales, environ 10 g chacune, formées sous la peau des animaux sont extraites et désagrégées comme dans l'exemple A-2. Les cellules humaines ainsi obtenues sont mises en suspension comme dans l'exemple A-2, après quoi la suspension cellulaire résultante est additionnée de virus de Sendai et de concanavaline A, aux doses respectives de 500 titres d'hémagglutination/ml et de 0,8 (ig/ ml, et l'on met à incuber à 37° C pendant 1 jour pour induire la production de LK 1. Cette culture est ensuite purifiée, concentrée et lyophilisée comme dans l'exemple A-2 pour donner une poudre possédant une activité LK 1. Le rendement est de l'ordre de 2,4 x 107 unités/souris.
Exemple AS:
On transplante dans des hamsters nouveau-nés une lignée de lymphoblastoïdes humains, Namalwa (ATCC CRL 1432), comme dans l'exemple A-2, et on les alimente de manière habituelle pendant
4 semaines. Les masses tumorales, environ 20 g chacune, formées sous la peau des animaux sont extraites et désagrégées pour donner une suspension cellulaire ayant une densité de l'ordre de 3 x 10® cellules/ml. Cette suspension cellulaire est additionnée de virus de Sendai à raison de 1000 titres d'hémagglutination/ml, et l'on met à incuber à 36° C pendant 2 jours pour induire la production de LK 1. Cette culture est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-l pour donner un concentré possédant l'activité LK 1. Le rendement est de l'ordre de 2,6 x 107 unités/hamster.
Exemple A-6:
Une lignée de lymphoblastoïdes humains, NALL-1, est mise en suspension dans du sérum physiologique et est placée dans une chambre de diffusion cylindrique de 10 ml environ, en matière plastique, munie d'une membrane filtrante ayant une dimension de pore nominale d'environ 0,5 p.. Cette chambre est incluse par voie intrapéritonéale dans un rat adulte, et l'animal est nourri de manière habituelle pendant 4 semaines. Après enlèvement de la chambre, on constate que la densité cellulaire dans celle-ci est de l'ordre de
5 x 108 cellules/ml, ce qui est environ 102 fois, ou plus, supérieur à ce que l'on obtient dans le cas d'une prolifération in vitro dans un incubateur à C02 utilisant un milieu de culture nutritif. Ces cellules humaines sont mises en suspension dans un milieu de culture semblable à celui de l'exemple A-2; on y ajoute du virus de la maladie de Newcastle (environ 500 titres d'hémagglutination/ml), préalablement inactivé par irradiation aux UV, et de la phytohémagglutinine (environ 50 |xg/ml), et l'on met à incuber à 37° C pendant un jour pour induire la production de LK 1. Cette culture est ensuite purifiée, concentrée et lyophilisée comme dans l'exemple A-2 pour donner une poudre possédant l'activité LK 1.
Le rendement est de l'ordre de 1 x 107 unités/rat.
Exemple A-7:
Une lignée de lymphoblastoïdes humains, CCRF-CEM (ATCC CCL 119), est ensemencée dans les cavités allantoïques d'œufs em-bryonnés qui ont été mis à incuber à 37° C pendant 5 jours, et ces œufs sont remis à incuber à la même température pendant une semaine supplémentaire. Les cellules humaines ayant proliféré sont recueillies à partir des œufs et mises en suspension comme dans l'exemple A-l, de manière à donner une densité cellulaire de 5 x 106 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est alors additionnée de virus de Sendai (environ 500 titres d'hémagglutination/ml), et mise à incuber à 37° C pendant un jour pour induire la production de LK 1. La culture résultante est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2 pour donner une poudre possédant l'activité LK 1.
Le rendement est de l'ordre de 8 x 105 unités pour 10 œufs em-bryonnés.
Exemple B-l:
Injection
500000 unités de spécimen de LK 1, préparées dans l'exemple A-2, sont dissous dans 200 ml de sérum physiologique, et on filtre dans
8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
des conditions stériles à l'aide d'une membrane filtrante. Des portions de 2 ml de ce filtrat sont réparties dans des fioles de verre stérilisées, sont lyophilisées, et on scelle ces fioles pour obtenir un produit injectable en poudre.
Ce produit est avantageusement utilisable pour le traitement du cancer du sein, du carcinome du poumon, du carcinome du foie et de la leucémie.
Exemple B-2:
Onguent
Le spécimen de LK 1, préparé dans l'exemple A-3, est pétri avec une quantité minimale de paraffine liquide, jusqu'à homogénéité. Ce mélange est alors additionné de vaseline blanche de manière habituelle pour obtenir un onguent ayant une teneur en LK 1 de 20 000 unités/g.
Cet onguent est avantageusement utilisable pour le traitement du carcinome de la peau, du cancer du sein et du lymphome.
Exemple B-3:
Collyre
Un mélange de 800 ml d'eau distillée, 5 ml de P-phényléthanol et 20 000 000 unités de spécimen de LK 1, préparée dans l'exemple A-4, est mélangé avec du chlorure de sodium dans une quantité supplémentaire d'eau distillée afin d'obtenir 1000 ml de solution isotoni-.que.
Cette solution est avantageusement utilisable comme collyre pour le traitement du rétinoblastome.
Exemple B-4:
Comprimés entëriques enrobés
On prépare des comprimés entériques enrobés selon un procédé classique à partir d'un mélange d'amidon, de maltose et de spécimen de LK 1, préparée dans l'exemple A-7, de manière à avoir une teneur en LK 1 de 200 000 unités par comprimé (100 mg), puis on enrobe les comprimés avec de l'ester phtalique de méthyl cellulose. Ces comprimés sont avantageusement utilisables pour le traitement du carcinome du côlon et du carcinome du foie.
Exemple C-l:
Des souris sont immunisées comme dans l'expérimentation A-2, à ceci près que l'on utilise comme antigène une LK 1 très pure, obtenue par le procédé décrit dans l'expérimentation A-l. Ensuite des cellules de rate de ces animaux sont mises en suspension avec une lignée de myélome de souris, P3-NS-l/l-Ag4-l, un produit de Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Japon, dans une solution saline renfermant 140 mM de NaCl, 54 mM de KCl, 1 mM de
664969
NaH2P04, et 2 mM de CaCl2, de manière à avoir des densités cellulaires respectives de 104 cellules/ml. On ajoute à cette suspension cellulaire une solution saline fraîche de même composition, mais renfermant en plus du virus Sendai, préalablement inactivé par une irradiation aux UV, avec refroidissement à la glace, et on laisse reposer ce mélange pendant 5 minutes. Puis on le dilue environ 20 fois dans du milieu RPMI 1640 à 37° C, et les cellules d'hybridome capables de produire l'anticorps anti-LK 1 sont clonées comme dans l'expérimentation A-2. Les cellules d'hybridome clonées sont transplantées par voie intrapéritonéale dans des hamsters âgés de 7 jours (environ 107 cellules par hamster) dont l'immunoréaction a été affaiblie par des modes opératoires classiques, et l'on récupère l'anticorps monoclonal à partir des corps des animaux comme dans l'expérimentation A-2.
Tout comme l'anticorps monoclonal préparé dans l'expérimentation A-2, le produit présente une neutralisation immunologiquement spécifique de l'activité cytotoxique de LK 1. La stabilité de l'anticorps monoclonal en solution aqueuse est étudiée par dosage des activités neutralisantes résiduelles après mise à incuber dans les conditions prescrites. Lors d'une incubation à pH 7,2 et différentes températures pendant 30 minutes, 80% ou plus de l'activité est conservée à 60° C, mais 90% ou plus est perdue à 70° C. Après incubation à 4° C et différentes valeurs de pH pendant 16 heures, l'activité reste stable dans un intervalle de pH compris entre 2 et 11.
Lors de l'étude de plusieurs propriétés de l'anticorps monoclonal, on constate que l'anticorps monoclonal selon l'invention résiste au mercapto-2 éthanol et suscite une réaction spécifique antigène-anticorps avec un anticorps anti-immunoglobuline de souris. Aussi l'anticorps monoclonal selon l'invention se classe-t-il dans le groupe des anticorps de l'immunoglobuline.
Exemple C-2:
Un anticorps anti-LK 1 monoclonal est préparé comme dans l'exemple C-l, à ceci près que l'on remplace P3-NS-l/l-Ag4-l par une lignée de myélome de souris, SP2/0-Agl4, provenant de Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Japon.
Lors de l'étude de la neutralisation immunologiquement spécifique par l'anticorps monoclonal de l'activité cytotoxique de LK 1, on obtient des résultats semblables à ceux de l'exemple C-l. Aussi l'anticorps monoclonal se situe-t-il dans la classe des anticorps d'immu-noglobuline G.
Il est bien entendu que la description détaillée et les exemples particuliers indiquant des formes de réalisation préférées de l'invention ne sont donnés qu'à titre d'illustration; différents changements et modifications possibles apparaîtront à l'homme de l'art en partant de cette description détaillée, sans sortir du cadre de l'invention.
9
5
10
15
20
25
30
35
40
45
R
Claims (15)
- 664 9692REVENDICATIONS1. Lymphokine humaine, abrégée LK 1, ayant une activité cyto-toxique sur les cellules de tumeurs malignes, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes:a) Poids moléculaire = 20000 + 2000 u (20000 + 2000 daltons).b) Point isoélectrique: pI = 5,6+0,2.c) Mobilité électrophorétique: (sur rondelle de PAGE) Rf= 0,29 ±0,02.d) Spectre d'absorption UV: une absorption maximale au voisinage de 280 nm.e) Solubilité dans les solvants: le produit est soluble dans l'eau, le sérum physiologique et le tampon phosphate, il est peu soluble ou insoluble dans l'oxyde de diéthyle, l'acétate d'éthyle ou le chloroforme.0 Réactions colorées: protéine-positive par le procédé de Lowry ou le procédé «microburette». Sucre-positive par le procédé phénol-acide sulfurique ou le procédé anthrone-acide sulfurique.g) Activités biologiques: cytotoxique sur cellule L 929. Inhibiteur de croissance sur cellule KB. Pratiquement dénué d'activité in-terféron.h) Stabilité en solution aqueuse: stable jusqu'à 60° C lorsque mis à incuber à pH 7,2 pendant 30 minutes. Stable dans l'intervalle de pH compris entre 4 et 11, lorsque mis à incuber à 4" C pendant 16 heures.i) Stabilité lors de la cryoconservation: stable à —10° C sur une période de 1 mois ou plus.
- 2. Procédé pour la production de lymphokine humaine, abrégée LK 1, selon la revendication 1, caractérisé par les stades de :exposition d'une cellule humaine capable de produire LK 1 à l'action d'un inducteur de LK 1, dans des conditions permettant l'accumulation de quantités marquées de ce produit, et récupération de la LK 1 ainsi obtenue.
- 3. Procédé pour la production de lymphokine humaine, abrégée LK 1, selon la revendication 1, caractérisé par les stades de: prolifération in vitro ou in vivo d'une cellule humaine capable de produire LK 1, exposition de la cellule humaine proliférée à l'action d'un inducteur de LK 1, dans des conditions permettant l'accumulation de quantités marquées de ce produit, et récupération de la LK 1 ainsi obtenue.
- 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules humaines, capables de produire LK 1, sont obtenues in vivo par leur transplantation dans un animal à sang chaud, que l'on alimente afin de permettre à ces cellules d'utiliser le fluide corporel nutritif de l'animal pour leur prolifération, suivie d'une extraction et de la désagrégation de la tumeur qui s'est formée dans l'animal.
- 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire LK 1 sont obtenues in vivo par mise en suspension de cellules humaines dans une chambre de diffusion, dans laquelle leur est apporté le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud, la chambre de diffusion étant incrustée dans ou placée sur l'animal de façon à permettre l'apport de son fluide corporel nutritif dans la chambre, et l'animal étant alimenté pour permettre aux cellules humaines d'utiliser ce fluide pour leur prolifération, suivie de la récolte des cellules ayant proliféré à partir de cette chambre.
- 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'animal est immunodéficient et que ses réactions immunologiques sont supprimées.
- 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la chambre de diffusion est munie d'une ou de plusieurs membranes filtrantes, fibres creuses ou ultrafiltres, ayant une dimension de pore nominale de 10~7 à 10~5 m.
- 8. Procédé selon une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire LK 1 sont des lymphocytes ou des leucocytes humains, en particulier des lymphoblas-toïdes, notamment ceux des lignées suivantes: Namalwa (ATCC CRL 1432), BALL-1, TALL-1, NALL-1, M-7002, B-7101, JBL,EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-HO, MOLT-3, (ATCC CRL 1552), CCRF-SB (ATCC CCL 120), CCRF-CEM (ATCC CCL 119), BALM-2, DND-41, et Mono-1.
- 9. Procédé selon une des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que l'inducteur de LK 1 est choisi dans les groupes suivants: virus, acide nucléique, nucléotide, mitogène, endotoxine, lipopolysacchari-des, saccharides, ainsi que leurs mélanges.
- 10. Procédé suivant une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une solution renfermant LK 1 et une quantité marquée d'impuretés avec une colonne d'un anticorps anti-LK 1 immobilisé, afin de réaliser une Chromatographie par affinité, puis à recueillir la fraction active de LK 1 résultante.
- 11. Composition pharmaceutique à action antitumorale, caractérisée en ce qu'elle renferme, outre un support pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace de LK 1 selon la revendication 1.
- 12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle renferme au moins 5 unités de LK 1 par gramme.
- 13. Utilisation de LK 1 selon la revendication 1 pour obtenir un anticorps monoclonal spécifique de LK 1, caractérisée en ce qu'elle consiste à immuniser un animal à sang chaud avec LK 1 comme antigène, à recueillir les cellules productrices d'anticorps à partir de cet animal, à fusionner ces cellules avec des cellules de myélome, à choisir un clone capable de produire à partir des cellules d'hybri-dome résultant des anticorps anti-LK 1, à faire proliférer ce clone et à laisser les cellules ayant proliféré produire un anticorps monoclonal spécifique de LK 1.
- 14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que la cellule productrice est une cellule splénique, en particulier de souris.
- 15. Utilisation selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce que le stade de fusion comprend la mise en suspension des cellules productrices d'anticorps avec des cellules de myélome, dans une solution saline renfermant une quantité efficace d'un agent inducteur de la fusion, en particulier du virus de Sendai ou du polyéthylène glycol, suivie d'un repos de durée suffisante pour que la fusion se réalise.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58233570A JPS60126228A (ja) | 1983-12-13 | 1983-12-13 | 新リンホカイン１とその製造方法および用途 |
| JP58244598A JPS60142926A (ja) | 1983-12-27 | 1983-12-27 | モノクロ−ナル抗体とその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH664969A5 true CH664969A5 (fr) | 1988-04-15 |
Family
ID=26531084
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH5906/84A CH664969A5 (fr) | 1983-12-13 | 1984-12-12 | Lymphokine humain, sa production et son utilisation pour obtenir un anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4758549A (fr) |
| KR (1) | KR930000188B1 (fr) |
| CH (1) | CH664969A5 (fr) |
| FR (1) | FR2556220B1 (fr) |
| GB (1) | GB2153364B (fr) |
| IT (1) | IT1199239B (fr) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5683688A (en) * | 1984-05-31 | 1997-11-04 | Genentech, Inc. | Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions |
| US6686455B1 (en) | 1984-07-05 | 2004-02-03 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor |
| US5672347A (en) * | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
| US5019385A (en) * | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Novel lymphopine LK 2 and pharmaceutic compositions containing same |
| JPH0631318B2 (ja) * | 1985-09-18 | 1994-04-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | 新リンホカインｉｉｉとその製法 |
| US4996145A (en) * | 1987-10-27 | 1991-02-26 | Oncotech Incorporated | Method for detecting immune-mediated cytotoxicity |
| US5795964A (en) * | 1990-06-27 | 1998-08-18 | Biogen, Inc. | Lymphotoxin-beta and lymphotoxin-beta complexes |
| DK0536299T3 (da) * | 1990-06-27 | 2001-07-09 | Univ California | Overfladekompleksbundet lymfotolksin |
| US7030080B2 (en) * | 1990-06-27 | 2006-04-18 | Biogen, Inc. | Lymphotoxin-β, lymphotoxin-β complexes, pharmaceutical preparations and therapeutic uses thereof |
| WO1996007673A1 (fr) * | 1994-09-09 | 1996-03-14 | Nycomed Dak A/S | Proteines inductibles par la chimiotaxine des monocytes |
| US5925351A (en) * | 1995-07-21 | 1999-07-20 | Biogen, Inc. | Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease |
| MX2009004134A (es) * | 2006-10-20 | 2009-08-12 | Biogen Idec Inc | Tratamiento de trastornos de desmielinizacion con el receptor de linfotoxina beta soluble. |
| US8338376B2 (en) * | 2006-10-20 | 2012-12-25 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions comprising variant LT-B-R-IG fusion proteins |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4438032A (en) * | 1981-01-30 | 1984-03-20 | The Regents Of The University Of California | Unique T-lymphocyte line and products derived therefrom |
| SE8204382L (sv) * | 1981-07-21 | 1983-01-22 | Hayashibara Biochem Lab | Sett att framstella malcellysfaktor och anvendning derav |
| US4481137A (en) * | 1982-02-26 | 1984-11-06 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Glycoproteins and processes for their production |
| US5019385A (en) * | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Novel lymphopine LK 2 and pharmaceutic compositions containing same |
-
1984
- 1984-11-27 US US06/675,291 patent/US4758549A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-12-10 GB GB08431152A patent/GB2153364B/en not_active Expired
- 1984-12-11 FR FR8418868A patent/FR2556220B1/fr not_active Expired
- 1984-12-12 CH CH5906/84A patent/CH664969A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1984-12-12 IT IT49292/84A patent/IT1199239B/it active
- 1984-12-13 KR KR1019840007900A patent/KR930000188B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR930000188B1 (ko) | 1993-01-11 |
| IT8449292A0 (it) | 1984-12-12 |
| GB2153364A (en) | 1985-08-21 |
| FR2556220A1 (fr) | 1985-06-14 |
| IT1199239B (it) | 1988-12-30 |
| GB2153364B (en) | 1987-09-23 |
| US4758549A (en) | 1988-07-19 |
| GB8431152D0 (en) | 1985-01-16 |
| FR2556220B1 (fr) | 1988-05-20 |
| IT8449292A1 (it) | 1986-06-12 |
| KR850004271A (ko) | 1985-07-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CH664974A5 (fr) | Production du facteur de lyse des cellules-cibles. | |
| CH637831A5 (fr) | Procede de preparation d'interferon et preparation le contenant. | |
| CH650801A5 (fr) | Procede pour preparer de l'interferon de type ii et preparation contenant de l'interferon de type ii. | |
| SE462261B (sv) | Farmaceutisk komposition och konjugat av melfalan och normalt humanimmunoglobulin med antitumoerverkan samt foerfarande foer dess framstaellning | |
| CH649786A5 (fr) | Production de facteur leucopoietique humain. | |
| LU84662A1 (fr) | Nouvelles glycoproteines,procedes pour leur preparation et agents therapeutiques contenant ces glycoproteines en vue de combattre les tumeurs | |
| CH664969A5 (fr) | Lymphokine humain, sa production et son utilisation pour obtenir un anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine. | |
| KR930004596B1 (ko) | 신규 림포킨(lymphokine) 및 이에 대해 특이성을 갖는 모노클로날(monoclonal) 항체의 제조 방법 | |
| FR2615737A1 (fr) | Preparation et utilisation d'interferon-gamma | |
| KR950008569B1 (ko) | 신규 림포카인(lymphokine) 및 그 제조방법과 사용방법 | |
| BE873594A (fr) | Interferon et preparation le contenant | |
| JP2532025B2 (ja) | 新リンホカインｉｉｉを有効成分とする抗腫瘍作用を有するリンホカインの活性増強剤 | |
| JPS61115028A (ja) | 抗腫瘍効果増強剤 | |
| EP0421876A1 (fr) | Application d'agents actifs pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de lymphomes ou assimilés | |
| JPH0527640B2 (fr) | ||
| JPH0523755B2 (fr) | ||
| JPS5815921A (ja) | 抗リンホトキシン感受性疾患剤 | |
| JPS61115027A (ja) | 新リンホカイン２とその製法および用途 | |
| JPH0532033B2 (fr) | ||
| CH658668A5 (fr) | Procede pour la production de kallikreine humaine. | |
| JPH0532032B2 (fr) | ||
| JPH0526468B2 (fr) | ||
| JPS59186926A (ja) | アスペルギルス菌感染症治療用薬剤 | |
| JPS62223196A (ja) | 精製されたヒト ツモア・ネクロシス・フアクタ− |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased |