FR2615737A1 - Preparation et utilisation d'interferon-gamma - Google Patents

Abstract

Préparation et utilisation pharmaceutique d'HuIFN-gamma. La préparation de l'HuIFN-gamma se fait à partir de myélomonocytes humains établis. L'HuIFN-gamma, ainsi obtenu, est purifié par chromatographie sur colonne d'anticorps anti-HuIFN-Gamma, monoclonal, également préparés à partir d'HuIFN-gamma obtenu. Ce procédé de préparation d'HuIFN-gamma, utilisable à l'échelle industrielle, permet d'obtenir de l'interféron utile pour le traitement de maladies sensibles à l'HuIFN-gamma, comme maladies virales, tumeurs malignes et immunopathies.

Description

La présente invention.se rapporte à la prépara-

tion et aux utilisations de l'interféron-gamma, et plus par-

ticulièrement à un procédé de préparation d'interféron-

gamma qui consiste à recueillir l'interféron-gamma produit et accumulé par un myèlomonocyte humain établi; elle con-

cerne également un procédé de préparation d'anticorps anti-

interféron-gamma monoclonal grâce à l'utilisation de cet

interféron, et un procédé de purification de l'interféron-

gamma au moyen de l'anticorps monoclonal, ainsi qu'un agent propnylactique ou thérapeutique renfermant comme constituant actif l'interféron-gamma, pour le traitement des maladies

justiciables de ce produit.

Ainsi qu'il est décrit dans Shigeyasu Kobayashi,

"Interferon", publié par Kodansha Co., Ltd, 1975, par D.A.J.

Tyrrell, "Interferon and its Clinical Potential", publié par: William Heinemann Medical Books Ltd., Londres 1976, et dans Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol. 21, N 4 pp 245-333

(1976), interféron est un nom qui désigne des glycoprotéi-

nes qui peuvent être induites extracellulairement dans une cellule vivante, par l'action d'un inducteur d'interféron, comme,par exemple, virus, bactérie, protozoaire, rickettsie,

acide nucléique, endotoxine, ou polysaccharide; l'interfé-

ron présente une activité d'inhibition de croissance virale

non spécifique.

- Cette activité fait des interférons des agents

prophylactiques et thérapeutiques puissants, pour le trai-

tement des maladies virales. De récentes études révèlent que les interférons exercent une activité anti-oncotique sur

les tumeurs virales, aussi bien que sur les tumeurs non vi-

rales. En raison de cette activité, on s'attend à un grand développement des produits pharmaceutiques utilisant les interférons. Les- interférons comprennent les formes alpha ou leucocytaire, bêta de'fibroblaste et gamma ou immunisant. La préparation de l'interféron-alpha et de l'interféron-bêta,

ebt bien établie, au moyen de leucocytes ou de fibroblastes.

On a récemment commercialisé des produits pharmaceutiques

renfermant ces interférons.

Dans ce qui suit, les différents interférons seront désignés par les abréviations "IFN-alpha", "IFN- bêta" et "IFN-gamma", avec éventuellement le préfixe "Hu"

représentant l'origine humaine.

Bien que l'on ait proposé différents procédés pour la préparation d'HuIFNgamma, aucun ne s'est avéré pouvoir

être pratiqué à l'échelle industrielle.

Les procédés utilisant des leucocytes ou des lymphocytes T provenant du sang humain périphérique, comme

proposé par exemple dans les brevets japonais mis à l'ins-

pection N 58 891/82, 82 092/84, 70 099/85, 87 300/85, 139 700/85 et 149 600/85,dans les Publications en japonais des brevets internationaux N 500 961/82 et 502 032/83,

sont en pratique désavantageux car il est très difficile d'a-

voir un apport abondant de substance cellulaire, et la pro-

ductibilité de ces cellules est insuffisante.

Le brevet japonais mis à l'inspection N 98 118/80

propose un procédé au cours duquel on utilise, pour prépa-

rer de l'HuIFN-gamma, une cellule humaine obtenue par im-

plantation d'une cellule humaine établie dans un animal à sang chaud, ou en plaçant cette cellule dans une chambre de diffusion disposée à l'intérieur ou à l'extérieur du corps

d'un animal à sang chaud, et en laissant cette cellule pro-

liférer grâce à l'apport du fluide nutritif provenant de l'animal. Ce procédé est caractérisé par un apport abondant

de substance cellulaire humaine.

La demanderesse a constaté que la productivité d'HuIFN-gamma,par ce procédé,varie avec le type de cellule humaine utilisé. Ainsi, ce procédé peut être amélioré pour préparer à l'échelle industrielle de l'HuIFNgamma à titre

très élevé.

Il est connu que l'HuIFN-gamma a des activités cytostatiques et antioncotiques bien supérieures à celles de l'HuIFN-alpha et de l'HuIFNbêta. On sait également que la combinaison avec HuIFN-alpha et/ou HuIFNbêta, augmente les activités antivirales, cytostatiques et antioncotiques de l'HuIFN-gamma. C'est pour ces raisons qu'il existe une nette demande de développement à l'échelle industrielle

de la préparation d'HuIFN-gamma.

L'invention est basée sur les constatations sui-

vantes: la demanderesse a fait des recherches sur diffé-

rentes cellules humaines établies, en particulier sur des

lymphoblastoides humains établis, concernant leurs producti-

bilités d'HuIFN-gamma susceptibles de faciliter la prépara-

tion à l'échelle industrielle de ce produit, ainsi que leur

potentialité en tant qu'agents prophylactiques et théra-

peutiques pour le traitement des maladies sensibles à HuIFN-gamma; elle a trouvé de manière inattendue que les myélomonocytes humains présentaient une productibilité

d'HuIFN-gamma supérieure à celles des autres lymphoblastoi-

des et que l'HuIFN-gamma obtenu, était supérieurement effi-

cace comme agent prophylactique et thérapeutique pour le

traitement des maladies sensibles à HuIFN-gamma.

Le nouveau procédé de préparation d'interféron-

gamma consiste à laisser se développer un myélomonocyte humain établi, capable de produire de l'HuIFN-gamma et à

recueillir celui-ci.

Dans les dessins annexés ci-après, la figure 1 représente une vue microscopique en opposition de phase de

cellule HBL-38, et la figure2 montre les résultats de l'a-

nalyse caryotypique sur la cellule HBL-38.

La dénomination "myélomonocyte humain établi" signifie qu'il s'agit de cellules qui ne sont pas groupées en T ou en B, et sont identifiables par vérification de la

présence d'antigène myélomonocytique par réaction antigène-

anticorps; par exemple, celles qui sont décrites dans Iwanami Koza Meneki Kagaku (The Iwanami Immunology Series), Vol. 3, "Immunity responsive cells", édité par Tadamitsu Kishimoto et Takeshi Watanabe, pp. 181-204, publié par Iwanamishoten Publisher, Tokyo (1986) et dans "Mammalian Cell Culture Technology" écrit par Mikio Shikita et Isao Yamane, pp. 141-162, publié par Soft Science Publications,

Tokyo, (1985).

Des exemples de tels myélomonocytes comprennent les cellules HBL-38 établies par la demanderesse; les cellules HL-60, KG-1, ML-1, ML-2, ML-3, THP-1 et U-937,

décrites dans les références ci-dessus; et les cellules CTV-

1 reportées dans Japanese Journal of Cancer Research (Gann), Vol. 75, pp. 660-664 (1984). Plus particulièrement, les cellules HBL-38 conviennent au mieux pour la réalisation

de la présente invention, car elles présentent une produc-

tivité supérieure en HuIFN-gamma. En vue d'augmenter le taux de prolifération et la productivité d'HuIFN-gamma, on

peut introduire le gène codant pour la production d'HuIFN-

gamma dans une cellule humaine établie, facilement repiqua-

ble, par fusion cellulaire utilisant, par exemple, du polyéthylène glycol ou le virus de Sendai, ou par technique de gène recombinant, utilisant l'ADN ligase, une enzyme

de restriction (nucléase) et l'ADN polymérase.

Le procédé de prolifération, pour le myélomonocyte humain, peut être choisi de manière adéquate. Des exemples de ce procédé comprennent le procédé de culture de tissus, au cours duquel le myélomonocyte humain est ensemencé sur un milieu de culture nutritif, et y est cultivé in vitro; et le procédé au cours duquel on implante un myélomonocyte

dans un animal à sang chaud, ou bien dans une chambre de dif-

fusion placée à l'intérieur ou à l'extérieur du-corps d'un

animal à sang chaud, et on le laisse proliférer sous l'ac-

tion de l'apport du fluide corporel nutritif provenant de l'animal.

On explique ci-après la prolifération in vitro.

Pour cela, on peut utiliser tout milieu de culture

nutritif, dans lequel un myélomonocyte humain peut proli-

férer, par exemple milieu RPMI 1640 ou milieu essentiel

minimal d'Eagle. Ces milieux de culture peuvent être modi-

fiés par addition de vitamines, sels minéraux, hydrates de carbone, acides aminés et/ou sérum de mammifère.

La culture peut être en mono-couche ou en sus-

pension. La température est de l'ordre de 20 à 40 C, de pré-

férence voisine de 35 à 38 C, et l'ensemencement doit com-

porter un nombre de cellules, par ml de milieu de culture,

qui donne une prolifération maximale sur une période d'en-

viron une semaine, de préférence 104 à 107 cellules/ml de

milieu de culture.

Le milieu,de culture renfermant le myélomonocyte humain est cultivé dans ces conditions pendant environ 4 à

10 jours, et au cours de cette culture, il peut être renou-

velé, pour apporter des quantités suffisantes de produits nutritifs, ainsi que pour laver et/ou diluer les métabolites

libérés dans ce milieu.

La prolifération in vivo est expliquée dans ce qui

suit.

Les myélomonocytes humains peuvent facilement pro-

liférer in vivo par implantation dans un animal à sang chaud, ou par placement dans une chambre de diffusion, dans laquelle ces cellules peuvent recevoir le fluide corporel

nutritif de l'animal, ce dernier étant nourri de manière ha-

bituelle. La prolifération in vivo donne une quantité d'HuIFN-gamma plus grande que la culture tissulaire in

vitro, sans ou avec beaucoup moins de milieu de culture nu-

tritif renfermant du sérum coûteux.

La prolifération in vivo présente l'avantage sup-

plémentaire de réduire les soins au cours de la proliféra-

tion cellulaire; elle stabilise la prolifération cellu-

laire; et elle augmente la productivité en HuIFN-gamma

par cellule, en particulier de 2 à 10 fois, ou même plus.

Les animaux à sang chaud, utilisables pour la prolifération in vivo, sont ceux dans lesquels prolifèrent les myélomonocytes humains; ce sont notamment les volailles comme poulet et pigeon, et les mammifères comme chien,chat, singe, chèvre, cochon, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris'et souris nue. Comme l'implantation de myé-

lomonocytes humains peut provoquer une immunoréaction indé-

sirable chez l'animal, l'utilisation d'un animal au stade le plus jeune possible, par exemple, oeuf, embryon ou foetus, ou animal nouveau-né ou en bas âge, est souhaitable afin de

réduire l'immunoréaction à son niveau le plus bas possible.

Dans le même but, l'animal peut être irradié avec des rayons-

X ou -gamma, environ 200 à 600 rem, ou il peut recevoir une

injection d'un antiserum ou d'un immunodépresseur préalable-

ment à l'implantation. Lorsqu'on utilise une souris nue, le myélomonocyte humain peut être implanté sans prétraitement, et il prolifère facilement avec moins de danger d'apparition d'une immunoréaction indésirable, du fait que la souris nue

provoque moins d'immunoréaction, même à l'âge adulte.

On peut stabiliser la prolifération cellulaire

20.et/ou augmenter la production d'HuIEN-gamma, par implanta-

tion successive, utilisant des animaux à sang chaud sembla-

bles ou différents. On peut le réaliser par exemple, par im-

plantation et prolifération du myélomonocyte humain d'abord chez le hamster, suivies de l'implantation des cellules ayant proliféré chez la souris nue. De telles implantations peuvent être effectuées avec des animaux à sang chaud de même classe

ou ordre, aussi bien qu'avec ceux de même espèce ou genre.

Le myélomonocyte humain peut être implanté en tout site de l'animal, si la cellule y prolifère; par exemple, il peut être implanté dans la cavité allantoique, par voie

intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée.

Ou bien, on peut faire proliférer le myélomonocyte humain en le plaçant dans une chambre de diffusion classique de taille et fonrme variées munie de moyens appropriés excluant les cellules de l'animal, mais fournissant à HBL-38 le fluide corporel nutritif de cet animal à sang chaud, par exemple

membrane filtrante, ultrafiltre ou fibre creuse d'une dimen-

sion de pore de 10-7 à 105 m; cette chambr-fest incorporée, par exemple par voie intrapéritonéale dans un animal à sang chaud, et la cellule prolifère dans la chambre grâce à l'ap-

port du fluide corporel nutritif provenant de l'animal. Cet-

te chambre de diffusion peut être arrangée et placée par

exemple sur l'animal, de telle manière que le fluide nutri-

tif puisse y circuler librement. Elle peut être arrangée de telle manière que l'on puisse observer la culture au coursde la prolifération cellulaire, au travers de la paroi de la chambre, et/ou que l'on puisse la remplacer par intervalles'

par une chambre fralche, afin de poursuivre la proliféra-

tion cellulaire sur l'espace de vie de.l'animal, sans sacri-

fier ce dernier, et d'augmenter encore beaucoup plus la pro-

duction cellulaire par animal.

Comme dans le procédé utilisant la chambre de dif-

fusion, le myélomonocyte humain n'est jamais en contact avec les cellules de l'animal, ce qui entraîne beaucoup moins d'immunoréaction indésirable, on peut utiliser aisément tout animal à sang chaud, sans lui faire subir de prétraitement

pour réduire 1' immunoréaction, et les cellules ayant proli-

féré peuvent être facilement recueillies. L'animal est nourri de manière habituelle, et aucun soin spécial n'est requis,

même après l'implantation. La période de prolifération cel-

lulaire maximale est habituellement de 1 à 10 semaines. Le nombre de myélomonocytes obtenus par animal est de l'ordre

de 107 à 1012 cellules, ou plus. En particulier, conformé-

ment à l'invention,le nombre des myélomonocytes implantés est de 102 à 10 fois supérieur, ou plus, ce qui multiplie par

à 10o6 le nombre obtenu par ensemencement et proliféra-

tion du myélomonocyte sur milieu de culture nutritif in vitro.

C'est très avantageux pour la préparation de l'HuIFN-gamma.

On peut utiliser tout moyen d'induction dans la présente invention, à condition qu'il induise la production d'HuIFN-gamma dans les myélomonocytes humains obtenus de cette manière. Le myélomonocyte humain peut être exposé à

l'action de l'inducteur d'IFN-gamma à l'intérieur de l'ani-

mal utilisé pour la prolifération. Par exemple, un myélomo-

nocyte humain, ayant proliféré dans une ascite en suspen- sion, ou une tumeur formée par exemple sous la peau, est

exposé directement à l'inducteur d'IFN-gamma, et l'HuIFN-

gamma est recueilli à partir de l'ascite, du sérum et/ou de la tumeur, puis est purifié. Le myélomonocyte humain, ayant proliféré, peut être recueilli à partir de l'animal, et être exposé ensuite in vitro à l'action de l'inducteur d'IFN-gamma. Par exemple, un myélomonocyte humain, obtenu par récupération à partir d'une ascite, ou par extraction et broyage de la masse tumorale formée, par exemple sous

la peau, est mis en suspension dans un milieu de.culture nu-

tritif à environ 20 à 40 C, pour donner une densité cellu-

laire de l'ordre de 105 à 108 cellules/ml, et on expose à l'action d'un inducteur d'IFN-gamma avant de recueillir et

de purifier l'HuIFN-gamma résultant.

Lorsqu'on utilise la chambre de diffusion, le

myélomonocyte humain peut être exposé à l'inducteur d'IFN-

gamma dans la chambre même, ou après sa récupération. Le procédé d'amorçage, utilisant HuIFN, et/ou le procédé de superinduction utilisant un antimétabolite, peuvent être

mis en oeuvre pour augmenter encore la production d'HuIFN-

gamma. La production d'HuIFN-gamma par animal peut être accrue par utilisation d'un ou de plusieurs des procédés suivants.

1) Procédé au cours duquel un myélomonocyte hu-

main est exposé à un inducteur d'IFN-gamma dans l'animal, est récupéré à partir d'un certain site de l'animal ou de la totalité de son corps, et est exposé in vitro à un inducteur d'IFN-gamma. 2) Procédé dans lequel le myélomonocyte humain est exposé à maintes reprises à l'inducteur d'IFNgamma, et

3) Procédé au cours duquel la chambre de diffu-

sion incorporée dans l'animal ou reliée à lui, est rempla-

cée par intervalles par une chambre fraîche..

Les inducteurs d'IFN-gamma utilisables conformé- ment à l'invention sont habituellement 'des mitogènes, par exemple, phytohémoagglutinine, concanavaline A, mitogène

-de phytolaque, lipopolysaccharide, endotoxine, polysacchari-

de ou bactérie.

Des antigènes agissent sur des cellules sensibili-

sées comme un inducteur d'IFN-gamma. Les inducteurs d'IFN-

gamma sont habituellement utilisés à une concentration de l'ordre de 0, 001 gg/ml à 10 mg/ml. La combinaison avec un inducteur d'IFN-alpha, par exemple virus, acide nucléique

et polynucléotide, peut accroître la production d'HuIFN-

gamma et/ou induire une production simultanée d'HuIFN-

alpha. L'HuIFN-gamma obtenu peut être récupéré par un ou plusieurs procédés classiques de purification et de séparation, par exemple relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyophilisation. Lorsqu'une

purification ultérieure est requise, on utilise en combinai-

son un ou plusieurs autres modes opératoires classiques,

comme adsorption et désorption avec échange d'ions, filtra-

tion sur gel, fractionnement au point isoélectrique, électro-

phorèse, chromatographie par échange d'ions, chromatographie liquide à haute performance, chromatographie sur colonne,

et chtomatographie par affinité. La chromatographie utili-

sant un anticorps monoclonal conduit à un HuIFN-gamma de la

plus grande pureté.

L'HuIFN-gamma, ainsi obtenu, peut être avantageu-

sement utilisé pour prévenir et traiter les maladies sensi-

bles à ce produit. L'expression "maladies sensibles à HuIFN-

gamma" comprend les maladies qui peuvent être empêchées ou traitées avec HuIFN-gamma, par exemple, des maladies virales 1 0 comme la conjonctivite contagieuse, aiguë, la kératite herpétique, l'influenza, la rubéole, l'hépatite infectieuse,

épidémique, du type serum-homologue U/le syndrome immuno-

déficitaire acquis (SIDA); et des maladies non virales, y compris des tumeurs malignes comme le carcinome du colon,

le carcinome du poumon, le carcinome du foie et l'ostéo-

sarcome; et des immunopathies y compris allergie déplacée, myoasthénie, collagénose, anémie pernicieuse, rhumatisme

articulaire et lupus érythémateux général.

L'agent selon la présente invention peut être préparé sous une forme convenant à son utilisation finale,

par exemple sous forme de collyre, de collutoire, de nébu-

lat, de médicament liquide pour injection, de médicament en forme de pâte tel qu'onguent, ou d'un solide en poudre,

granule ou comprimé.

La teneur en HuIFN-gamma est habituellement de l'ordre de 1 à 10 000 000 d'unités/g. L'efficacité peut être augmentée par combinaison avec une ou plusieurs lymphokines comme HuIFN-alpha, HuIFN-bêta, facteur de nécrose tumoral

(TNF), lymphotoxine, interleukine 2, et facteur de différen-

tiation cellulaire-B ou des produits chimiothérapeutiques

naturels ou synthétiques.

L'HuIFN-gamma peut être utilisé en combinaison

avec adjuvant, charge et/ou stabilisant. L'agent ainsi ob-

tenu convient, par exemple, comme antiviral, antioncotique, potentialisateur des antioncotiques chimiothérapeutiques,

dépresseur des métastases tumorales, suppresseur de palin-

dromie, et immunorégulateur.

L'activité d'HuIFN est déterminée par le procédé de réduction de plaque utilisant les cellules FL provenant de l'amnios humain, comme décrit dans Protein, Nucleic

Acid and Enzvme, Vol. 20. N 6, Dp. 616 à 643 (1975). L'ac-

tivité d'HuIFN-qamma est déterminée après neutralisation

d'HuIFN-alpha et d'HuIFN-bêta, respectivement avec des anti-

corps anti-HuIFN-alpha et anti-HuIFN-bêta.

Le titre d'hémoagglutination est déterminé con-

formément au procédé décrit par J.E. Salk dans The Journal

of Immunology, Vol. 49, pp. 87 à 98 (1944).

La cellule HBL-38, établie par la demanderesse, est décrite ci-après. Après culture in vitro sur un milieu de culture nutritif, un leucocyte provenant d'un patient souffrant de myéloleucémie aiguë (âgé de 55 ans), commence à proliférer au 2lème jour. On repique le. leucocyte à

maintes reprises et on réussit en fin de compte à faire pro-

liférer de façon stable l'un des repiquages. Ce repiquage

est dénommé "HBL-38".

1) Prolifération

Le temps de doublement sur milieu RPMI 1640 ad-

ditionné de 10% en volume/volume de serum foetal de veau,

est d'environ 30 heures.

2) Morphologie La cellule HBL-38 a tendance à se fixer sur le fond interne du flacon au cours de la prolifération, mais

cette fixation est lâche et la cellule est facilement déta-

chable. Bien que des amas de cellules se forment pendant la

prolifération, ceux-ci ne sont pas compacts et se désagrè-

gent aisément. Le résultat de l'observation microscopique en opposition de phase est représenté dans la figure 1. La

cellule est régulièrement arrondie avec une épaisseur voi-

sine de 15 micromètres. La coloration de Giemsa révèle que

le novau est arrondi, avec un lobe irrégulier et uncarvolobe.

3) Nombre de chromosomes L'analyse chromosomique est réalisée avec des

cellules en croissance exponentielle. La fréquence de distri-

bution des nombres de chromosomes est indiquée dans le

tableau I. L'observation sur 150 cellules révèle que les nom-

bres de chromosomes sont dans une région diplolde faible et

la distribution la plus fréquente est de 45 (53 cellules).

42 cellules ont un nombre de chromosone de 44.

TABLEAU I Fréquence de distribution du nombre de chromosomes. Nombre de chromosomes 31 32 36 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Nombre de cellules 1 1 1 1 7 6 11 42 53 14 7 5 1 0 4) Analyse caryotypique

Les résultats de l'analyse caryotypique sont in-

diqués dans la figure 1. Le chromosome sexuel est XY, et il est en harmonie avec celui de la source cellulaire. Une partie complémentaire du chromosome 17 et la totalité du chromosome 18 font défaut. On constate qu'un chromosome s'insère dans une branche courte (p) du chromosome 5 et

une branclelongue (q) du chromosome 12. On observe un chro-

mosome marqueur, non identifiable, et un chromatide.

* ) Caractère superficiel de la cellule. L'identification de la cellule HBL38 s'effectue avec différents anticorps de surface de cellule, et les résultats sont représentés dans le tableau II. L'analyse, utilisant de l'érythrocyte de chèvre (E), de l'érythrocyte

sensibilisateur (EA) et du complément d'érythrocyte sensi-

bilisateur (EAC), révèle que EA forme 10% de corps en rosace, mais pas les autres. La détection des immunoglobulines de surface (SmIg) au moyen de 6 anticorps de chèvre antihumains,

révèle que la cellule HBL-38 est négative à. tous les anti-

corps. L'étude des marqueurs de surface au moyen d'anticorps

monoclonaux, révèle que 3A1, MCS-2, B3/25, et MY-9, exer-

cent une positivité relativement élevée, mais que NU-T2, Leu-5, Leu-4, A50, BA-2, OKI-1, NU-N1, B2,-MO-1 et MO-2

sont négatifs.

6) Etude de l'antigène nucléaire déterminé du virus EB (EBNA) HBL-38 est étudié vis-à-vis de EBNA à plusieurs reprises à partir d'un stade précoce de l'établissement. Les

résultats montrent que la cellule HBL-38 est EBNA-négative.

7) Formation de colonie sur milieu d'agar mou.

La cellule HBL-38 est essayée pour la formation

de colonie dans un milieu d'agar à 0,3% renfermant un fac-

teur de stimulation de colonie (CSF).

L'observation microscopique inversée au 14ème jour, révèle la présence d'une cellule myéloIde en formation

de colonie. La fréquence est de 1 à 2%. Il n'y a pas de for-

mation de colonie en l'absence d'apport de CSF.

En se basant sur ces données, on classe la cellule

HBL-38 dans le groupe des myélomonocytes.

Les expérimentations 1 suivantes constituent une non

illustration/limitative de la préparation d'HuIFN-gamma.

EXPERIMENTATION 1

Comparaison avec des cellules lymphoblastoides humaines établies du point de vue de la productivité d'HuIFN gamma Expérimentation 1-1

Production d'HuIFN par prolifération cellulaire in vitro.

On ensemence un lymphoblastolde humain établi sur du-milieu RPMI 1640 (pH 7,2) additionné de 20% de serum foetal de veau, et l'on cultive à 37 C de manière habituelle. La culture résultante est rincée avec du milieu RPMI 1640 exempt de

serum (pH 7,2) puis est mise en suspension dans une prépa-

ration fraîche du même milieu de culture à raison de 1x106 cellules/ml. La suspension cellulaire obtenue est additionnée d'environ et gg/ml de lipopolysaccharide,/le mélange est maintenu à 37 C pendant deux jours afin d'induire la production d'HuIFN-gamma. La culture est séparée par centrifugation, et l'on dose, dansla partie surnageante, les activités d'HuIFN et d'HuIFN-gamma. Les résultats sont reportés

dans le tableau III.

Il ressort de ces données que les myélomonocytes humains sont producteurs d'HuIFN-gamma, et que leur production est

supérieure à celle que l'on obtient avec les lymphoblastoi-

des humains établis essayés. La cellule HBL-38 est très

supérieure quant à la productibilité d'HuIFN-gamma.

TABLEAU II

Marqueurs de surface (Etalon) E EA EAC SmIg

K X e S X -

0 10 0 0 0 0 0 0 0

(Anticorps monoclonal) NU-T2 Leu-5 Leu-4 Leu-3a A50 3AI Leu-2a BA2 NU-N2 Tac OKM-1 MCS-1

0 0 0 10 0 90 10 0 0 10 10 20

MCS-2 MY-1 MY-9 M0-1 CA-2-38 MO-2 B7/21 OKI-1 B3/25 A3/10 B2

10 70 0 40 0 10 60 100 60 0

Virus marqueur EBV

Nota: Les chiffres représentent le pourcentage de réponses positives.

TABLEAU III

Cellule T

CCRF-CEM TALL-1 MOLT-3 KE-37

inférieur inférieur inférieur inférieur

à 100 à 100 à 100 à 100

Cellule B NALM-1 KLM-2 Namalwa BALL-1 inférieur inférieur inférieur inférieur

à20 à 20 à 20 à 20

Cellule Non T.non B

KM-3 NALL-1 KOPN-K BV-173

inférieur inférieur inférieur inférieur

à20 à 20 à 20 à 20

Cellule Non L.non M

K-562 HEL SPI-801 L-428

inférieur inférieur inférieur inférieur

à20 à 20 à 20 à 20

Myélomonocyte

HBL-38 KG-1

3 800 (3 200) 1 600 (1 400)

Nota: Les valeurs représentent l'activité d'HuIFN, et celles

qui sont entre parenthèses l'activité d'HuIFN-gamma.

Expérimentation 1-2 Production d'HuIFN par prolifération cellulaire in vivo On injecte à des hamsters nouvellement nés un antiserum préparé à partir de lapin de manière habituelle, afin d'affaiblir une immunoréaction possible, et on y implante par voie sous-cutanée un myélomonocyte humain établi, puis_

on les nourrit de manière habituelle pendant trois semaines.

On extrait les masses tumorales formées dans les corps de ces hamsters, et on les désagrège en les mettant dans du

sérum physiologique renfermant de la trypsine. Une suspension cellulaire ainsi obtenue est traitée et dosée

quant aux activités d'HuIFN/ttglHuIFN-gammalcomme dans l'ex-

périmentation 1-1.

Les résultats sont présentés dans le tableau IV.

TABLEAU IV

Production d'HuIFN par des myélomonocytes

HBL-38 KG-1

66 000 (59 000) 31 000 (25 000)

Nota: Les chiffres représentent l'activité d'HuIFN; celles

qui sont entre parenthèses l'activité HuIFN-gamma.

Les données des tableaux III et IV confir-

ment que les myélomonocytes humains établis, en particulier

la cellule HBL-38, présentent une productibilité d'HuIFN-

gamma plus élevée in vivo qu'in vitro.

Les exemples suivants constituent une illustration

non limitative de la préparation d'HuIFN-gamma.

Exemple A-1

On implante de la cellule HBL-38 sur du milieu RPMI 1640 (pH 7,2) additionné de 10% volume/volume de serum

foetal de veau, à raison de 5x105 cellules/ml.

Le mélange résultant est cultivé à 37 C, avec renouvellement périodique du milieu de culture. Ensuite, avec utilisation

d'une préparation fraîche du même milieu de culture, les cel-

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lules sont rincées et remises en suspension à raison de

2x106 cellules/ml. Cette suspension cellulaire est addition-

née avec environ 10 gg/ml de lipopolysaccharide, et le mé--

lange est maintenu à 37 C pendant 2 jours pour induire la production d'HuIFN. La culture résultante est séparée par

centrifugation pour donner une partie surnageante renfer-

mant environ 5 100 unités d'HuIFN-gamma/ml.

Exemple A-2

On injecte à des hamsters nouvellement nés un antisérum préparé de manière habituelle à Partir de lapin,

afin d'affaiblir une possible immunoréaction, et on y im-

plante par voie sous-cutanée des cellules HBL-38, puis on les nourrit de manière habituelle pendant 4 semaines. Les masses tumorales, formées dans les animaux, environ 20g

chacune, sont extraites et désagrégées par mise en suspen-

sion dansdu sérum physiologique renfermant de la.collagé-

nase. Après rinçage avec du milieu essentiel minimal de Eagle, les cellules sont diluées avec une préparation fralche du même milieu de culture à raison d'environ 2x106

cellules/ml, et on y ajoute 200 gg/ml de phytohémoaggluti-

nine conjointement avec 5 g/ml de lipide A. Ce mélange est maintenu à 37 C pendant 2 jours afin d'induire la production d'HuIFN. La culture obtenue est séparée par centrifugation, ce qui donne une partie surnageante, renfermant environ 93 000 unités d'HuIFN-gamma. On obtient ainsi, par hamster,

183 000 000 unités d'HuIFN-gamma.

Exemple A-3

On injecte à des rats nouvellement nés, par voie intra-vei-

neuse, des cellules KG-1, et on les nourrit de manière ha-

bituelle pendant 4 semaines.

Les masses tumorales, environ 20g chacune, formées chez l'a-

nimal, sont extraites et désagrégées comme dans l'exemple

A-2 pour obtenir une suspension cellulaire. Cette suspen-

sion est additionnée de 100 titres d'hémoaglutination/ml

de virus de Sendai et d'environ 5 gg/ml de lipopolysaccha-

ride, et le mélange est mis à incuber à 37 C pendant deux

jours afin d'induire la production d'HuIFN. La culture ob-

tenue est séparée par centrifuqation et donne une partie surnageante renfermant environ 49 000 unités d'HuIFN-gamma/ ml. Le rendement en HuIFNgamma est de l'ordre de 97 000 000 unités/rat.

Exemple A-4

Des cellules CTV-1 sont mises en suspension dans du sérum physiologique, dans des chambres de diffusion cylindriques en matière plastique de 10 ml environ, munies d'une membrane filtrante dont la dimension de pore est de l'ordre de 0,5 microns, et l'on incorpore ces chambres de diffusion par

voie intrapéritonéale dans des rats adultes.

Ces rats sont nourris normalement pendant 4 semaines, et les

chambres sont enlevées.

Les cellules ayant proliféré sont traitées comme dans l'exem-

ple A-1 afin d'induire la production d'HuIFN. La culture résultante est séparée par centrifugation pour donner une

partie surnageante renfermant environ 41 000 unités d'HuIFN-

gamma/ml. Le rendement est de l'ordre de 78 000 000 unités/ rat.

Exemple A-5

On ensemence avec des cellules HBL-38, des oeufs embryonnés, préalablement chauffés à 37 C pendant 1 semaine, et on les

met à incuber à cette température pendant 1^ semaine supplé-

mentaire. Les cellules ayant proliféré sont récupérées par cassure des oeufs et sont traitées comme dans l'exemple A-2, afin d'induire la production d'HuIFN. La culture résultante

est séparée par centrifugation pour donner une partie sur-

nageante, renfermant une activité de l'ordre de 36 000 uni-

tés d'HuIFN-gamma par ml. Le rendement est de l'ordre de

000 000 unités pour 10 oeufs.

Les exemples B suivants constituent une illustra-

tion non limitative de la préparation d'anticorps anti-HuIFN-

gamma monoclonal et de la purification d'HuIFN-gamma au

moyen de ces anticorps.

Exemple B-1(1)

Préparation d'HuIFN-gamma partiellement purifié Un liquide renfermant de l'HuIFN-gamma, préparé par le procédé de l'exemple A-2, est dialysé contre du tampon Tris-phosphate 0,01 M (pH 8,5) pendant 20 heures, puis

est filtré sur membrane. Le filtrat est appliqué à une co-

lonne d'anticorps liant les anticorps anti-HuIFN-alpha et

anti-HuIFN-bêta, et la fraction non adsorbée est'recueillie.

Cette fraction est soumise à une chromatofocalisation, qui donne une fraction dotée d'une activité antivirale, qui

est ensuite concentrée et lyophilisée, pour donner une pou-

dre renfermant HuIFN-gamma avec un rendement d'activité de l'ordre de 30%. L'activité spécifique de cette poudre

est voisine de 10o6 unités/mg de protéine.

Exemple B-1 (2) Préparation d'un anticorps anti-HuIFN-gamma monoclonal Un HuIFN-gamma partiellement purifié, obtenu par le procédé

de l'exemple B-1(1), est dissous dans du sérum physiologi-

que à raison de 0,05% poids/poids, et la solution résultante est additionnée d'un volume équivalent d'adjuvant complet de Freund. On injecte par voie intraveineuse à des souris des portions de 0,2 ml de ce mélange et, au 7ème jour après cette première injection, on fait un rappel de manière identique afin de réaliser 1' immunisation. On extrait des

souris, les rates, dans lesquelles la production d'anti-

HuIFN-gamma a été induite dans les cellules productrices d'anticorps, et on les broye et les désagrège, après qoi

les cellules spléniques sont mises en suspension conjointe-

ment avec des cellules P3-X63-Ag8, des cellules de myélcme de souris fournies par Flow Laboratories Inc. (USA), dans du milieu essentiel minimal de Eagle exempt de serum à 37 C (pH 7,2) renfermant 50% en poids/volume de polyéthylène

glycol 1000 de manière à avoir une densité cellulaire res-

pective de 104 cellules/ml. Après 5 minutes de repos, la

suspension cellulaire est diluée 20 fois dans une prépara-

tion fraîche du même milieu de culture, et l'on recueille les cellules hybrides, capable de croître sur un milieu renfermant hypoxanthine, aminoptérine et thymidine, et on les clone conformément au procédé rapporté par R.L. Davidson et P.S. Gerald, Somatic Cell Genetics, Vol. 2, N 2, pp.175-176 (1976) afin d'obtenir des cellules hybrides,

capable de produire l'anticorps anti-HuIFN-gamma. Ces cel-

lules hybrides sont ensuite implantées par voie intrapéri-

tonéale chez des souris, à la dose de 106 cellules/souris,

que l'on nourrit pendant 2 semaines avant de les sacrifier.

Les fluides corporels recueillis à partir de ces souris, com-

me ascite et sang, sont séparés par centrifugation pour don-

ner une partie surnageante que l'on additionne ensuite de sulfate d'ammonium à 30 à 50% de saturation. Le sédiment résultant est dialysé et chromatographié par affinité avec un gel d'HuIFN-gamma immobilisé, obtenu par réaction à température ambiante d'un HuIFN-gamma qui a été préparé par le procédé de l'exemple B-1(1), avec du Sepharose activé par du BrCN. La fraction d'anticorps anti-HuIFN-gamma obtenue est dialysée, concentrée et lyophilisée en une poudre. Ce produit neutralise immunologiquement un HuIFN-gamma provenant

de myélomonocytes humains.

La stabilité de l'anticorps monoclonal en solution aqueuse

est dosée par la mesure de l'activité neutralisante rési-

duelle après une incubation de 30 minutes à pH 7,2. Il en résulte que, mis à incuber à 60 C,l'anticorps monoclonal garde plus de 80% de son activité, mais perd plus de 90% de cette activité quand on le met à incuber à 70 C. Lors d'une

incubation de 16 heures à 4 C, l'anticorps monoclonal de-

meure stable à un pH compris entre 4 et 11, mais il perd

plus de 90% de son activité à pH 2.

D'autres études révèlent que l'anticorps monoclonal est

instable en présence de mercapto-2 éthanol, et qu'il pro-

voque une réaction antigène-anticorps en particulier avec

l'tanticorps immunoglobuline M anti-souris.

Cela confirme que l'anticorps monoclonal appartient à la classe des anticorps immunoglobuline M.

Exemple B-1(3)

Préparation d'HuIFN-gamma hautement purifié

De l'HuIFN-gamma partiellement purifié, préparé par le pro-

cédé de l'exemple B-1(1), est chromatographié sur une co-

lonne d'un gel d'anticorps monoclonal immobilisé, préparé par

le procédé de l'exemple B-1(2), et l'on recueille la frac-

tion à activité d'HuIFN-gamma, on la dialyse, la concentre

et la lyophilise pour obtenir un solide renfermant HuIFN-

gamma avecun rendement de l'ordre de 80%. Le produit est

de l'HuIFN-gamma hautement purifié, dont l'activité spéci-

fique est d'environ 1,5x107 unités/mg-de protéine.

Exemple B-2(1) Préparation d'HuIFN-gamma partiellement purifié Une solution renfermant un HuIFN-gamma, préparé selon le procédé de l'exemple A-3, est partiellement purifiée selon le procédé de l'exemple B-1(1) pour donner une préparation d'HuIFN-gamma ayant une activité spécifique d'environ 106

unités/mg de protéine, avec un rendement de l'ordre de 20%.

Exemple B-2(2)

Préparation d'anticorps anti-HuIFN-gamma monoclonal On obtient des cellules spléniques par immunisation de souris comme dans l'exemple B-1(2) , à ceci près que l'on utilise

comme antigène l'HuIFN-gamma partiellement purifié obtenu -

dans l'exemple B-2(1).

Les cellules spléniques sont mises en suspension, conjointe-

ment avec des cellules P3-NS-1/1-Ag4-1 provenant de myélome de souris, fournies par Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd, (Japon), dans une solution saline renfermant 140 mM de NaCl, 54 mM de KCl, lmM de NaH2PO4 et 2 mM de CaCl2, avec des

densités cellulaires respectives de 104 cellules/ml. On a-

joute à cette suspension refroidie à la glace une prépara-

tion fraîche de la même solution saline renfermant en plus un virus de Sendai inactivé par irradiation aux UV, et on dilue ce mélange environ 20 fois au boutd'un intervalle de temps de 5 minutes dans du milieu RPMI 1640 à 37 C. Une

cellule hybride capable de produire l'anticorps anti-

HuIFN-gamma, est clonée par traitement de ce mélange dilué

comme dans l'exemple B-1(2).

Les cellules hybrides obtenues sont implantées par voie intrapéritonéale chez des hamsters âgés de 7 jours, dont l'immunoréaction a été affaibiie de manière habituelle, à la dose d'environ 107 cellules par hamster, et l'on traite ces animaux comme dans l'exemple B-1(2) pour obtenir un

anticorps monoclonal. Le produit neutralise immunologique-

ment un HuIFN-gamma obtenu comme celui qui a été préparé

dans l'exemple B-1(2).

La stabilité de cet anticorps monoclonal en solution aqueuse

est dosée par la mesure de l'activité neutralisante rési-

duelle après incubation de 30 minutes à pH 7,2. Il en résul-

te que,mis à incuber à 60 C, l'anticorps monoclonal garde plus de 80% de son activité, mais il en perd plus de 90% lors d'une incubation à 70 C. Lors d'une incubation de

16 heures à 4 C, cet anticorps demeure stable dans l'inter-

valle de pH de 2 à 11.

Une étude ultérieure révèle que cet anticorps monoclonal est stable en présence de mercapto-2 éthanol et qu'il provoque

une réaction antigène-anticorps en particulier avec l'anti-

corps immunoglobuline G anti-souris.

Cela confirme que cet anticorps monoclonal appartient. à la classe des anticorps immunoglobuline G.

Exemple B-2(3)

Préparation d'HuIFN-gamma hautement purifié

De l'HuIFN-gamma partiellement purifié, préparé par le pro-

cédé de l'exemple B-2(1), est chromatographié sur une colon-

ne d'un anticorps monoclonal immobilisé, préparé selon le procédé de l'exemple B-2(2), et l'on recueille la fraction renfermant HuIFN-gamma, on la dialyse et la concentre pour obtenir un liquide renfermant HuIFN- gamma avec un rendement d'activité voisin de 85%. Ce produit est un HuIFN- gamma très pur, dont l'activité spécifique est de l'ordre de 1,5

x 107 unités/mg de protéine.

Exemple B-3

Un filtrat obtenu par dialyse de la partie surnageante, ren-

fermant HuIFN-gamma préparé par le procédé de l'exemple A-1,

est dialysé contre une solution saline,renfermant du tam-

pon phosphate 0,01 M (pH 7,2) pendant 15 heures; le surna-

geant résultant, filtré sur membrane, est purifié sur une colonne d'anticorps, selon le procédé de l'exemple B-1(3),

il est concentré et lyophilisé pour donner un solide renfer-

mant de l'HuIFN-gamma avec un rendement d'activité de l'or-

dre de 75%. Le produit est de l'HuIFN-gamma très pur, dont l'activité spécifique est voisine de 1,5 x107 unités/mg de protéine.

Exemple B-4

Une partie surnageante renfermant HuIFN-gamma, obtenue par le procédé de l'exemple A-4, est dialysée et filtrée sur

membrane en conformité avec le procédé de l'exemple B-3.

Le filtrat résultant est purifié sur une colonne d'anti-

corps et est concentré comme dans l'exemple B-2(3) pour don-

ner une solution renfermant de l'HuIFN-gamma avec un rende-

ment d'activité de l'ordre de 70%. Ce produit est de l'HuIFN-

gamma très pur, dont l'activité spécifique est voisine de

1,5x107 unités/mg de protéine.

Exemple B-5

Une-partie surnageante renfermant de l'HuIFN-gamma, prépa-

rée selon le procédé de l'exemple A-5, est dialysée et filtrée sur membrane conformément au procédé de l'exemple

B-3, Le filtrat résultant est purifié sur une colonne-d'an-

ticorps, est concentré et lyophilisé comme dans l'exemple B-1(3) pour donner un solide renfermant HuIFN-gamma avec un rendement d'activité de l'ordre de 70%. Le produit est

un HuIFN-gamma très pur, dont l'activité spécifique est voi-

sine de 1,5x107 units/mq de protine.

sine de 1,5xlO unités/mq de protéine.

* Les expérimentations 2 suivantes sont une illus-

tration non limitative du traitement et de la prévention

par HuIFN-gamma de maladies justiciables de cet interféron.-

EXPERIMENTATION 2

Effets prophylactiques et thérapeutiques d'HuIFN-gamma sur les maladies sensibles à cet interferon Expérimentation 2-1 Inhibition du virus in vitro Une culture initiale en couche monomoléculaire de poumon

foetal humain, dans une boîte de Pétri de 6 cm, est addi-

tionnée d'HuIFN-gamma préparé conformément au procédé de l'exemple B-1(3) en un inoculum de 0,1, 1 ou 10 unités, et l'on fait incuber dans un incubateur à 5% de C02 à 37 C pendant 20 heures. La culture résultante est additionnée de virus de varicelle-zona ou de cytomégalovirus humain'à une

dose capable de former 100 plaques en l'absence de HuIFN-

gamma. L'activité d'inhibition du virus est déterminée par le taux, décroissant du nombre de plaques (vésicules éruptives): A - B Taux de réduction des plaques (%) = x 100 A A désignant le nombre de plaques sans addition d'HuIFN-gamma;

B, ce nombre lors de l'addition d'HuIFN-gamma.

Les résultats sont représentés dans le tableau V.

TABLEAU V

HuIFN-gamma Virus de varicelle- Cytomégalo-

zona virus 0,1 11il % 10 %

1,0 54 % 49 %

,0 93 % 88 %

Ces résultats confirment que HuIFN-gamma utilisé conformément à l'invention exerce une action fortement inhibitrice sur la

croissance de virus pathogènes.

Expérimentation 2-2 Traitement de tumeurs malignes avec HuIFN-gamma Expérimentation 2-2(1) Activité cytostatique in vitro d'HuIFN-gamma sur des tumeurs malignes

Un prélèvement de milieu RPMI 1640 additionné de 15% en volu-

me/volume de serum foetal de veau, est complété avec de l'HuIN-gamma préparé selon le procédé de l'exemple B-1(3), jusqu'à une concentration finale de 5,50 ou 500 unités/ml,

et l'on ensemence ce mélange avec des cellules tumorales hu-

maines, malignes, à raison de 5x105 cellules/ml. L'ensemble est mis à incuber dans un incubateur à 5% de CO2, à 37 C,

pendant 3 jours. A titre de témoin, on ajoute la même quan-

tité d'HuIFN-gamma préalablement inactivé par une incubation de 30 minutes à 100 C, à une préparation fraîche du même

milieu de culture, et on traite ce mélange comme précédem-

ment. A la fin de la culture, les cellules vivantes sont teintées avec du rouge neutre conformément au procédé décrit

dans Applied Microbiology, Vol. 22, N 4, pp. 671-677 (1971).

Ensuite, le rouge neutre est élué avec de l'éthanol acidi-

fié, et le nombre de cellules vivantes est déterminé par la

capacité d'absorption de l'éluat à 540 nm.

Le taux cytostatique (%) est déterminé par l'équation sui-

vante:

A

Taux cytostatique (%) = (1 -) x 100 B dans laquelle A désigne le nombre de cellules vivantes dans le système d'essai, et B le nombre de cellules vivantes dans

le témoin.

Les résultats sont représentés'dans le tableau VI.

___

26T5737

TABLEAU VI

Cellule tumorale HuIFN-gamma (Unités/ml) KB HEp-2 KATO-II P-4788

18% 14% 28% 9%

72% 31% 60% 22%

500 93% 53% 85% 43%

Nota: Les cellules KB proviennent d'un carcinome épider-

moide oral humain; Les cellules HEp-2 d'un carcinome épidermoide humain, du larynx; Les cellules KATO-II d'un carcinome de l'estomac humain; et

Les cellules P-4788 d'un carcinome du colon humain.

Ces résultats confirment que l'HuIFN-gamma, utilisé dans la resente / 'invention, inhibe fortement à une concentration de 5 à 500 unités/ml la croissance des cellules de tumeurs malignes

comme les cellules KB, HEp-2, KATO-II et P-4788.

Expérimentation 2-2(2) Potentialisation in vitro de l'activité cystostatique d'autres lymphokines par HuIFN-gamma Les lymphokines utilisées au cours de cette expérimentation sont HuIFN-gamma (5 unités/ml) , HuIFN-alpha (50 unités/ml) et TNF (10 unités/ml). Ces lymphokines sont des produits

naturels provenant de lymphoblastoides.

On teste ces lymphokines pour leur taux cytostatique (%) conformément au procédé de l'expérimentation 2-2(1). Les

résultats sont rapportés dans le tableau VII.

TABLEAU VII

Cellule tumorale Lymphokine KB HEp-2 KATO-II P-4788 HuIFN-gamma 16% 14% 26% 9% HuIFN-alpha 9% 6% 11% 5%

T N F 5% 6% 10% 6%

HuIFN-gamma plus HuIFN-alpha 45% 30% 43% 27% HuIFN-gamma plus T N F 70% 51% 54% 42% HuIFN-gamma HuIFN-alpha 92% 65% 78% 61% plus T N F Ces résultats confirment à l'évidence que la combinaison avec HuIFN-gamma réhausse fortement l'effet cytostatique des autres lymphokines sur les tumeurs malignes et que ce

réhaussement est synergique.

Expérimentation 2-2(3) Potentialisation in vitro de l'activité cytostatique de produits chimiothérapiques sur les tumeurs malignes, par HuIFN-gamma Des prélèvements de 1 ml d'un milieu de culture nutritif, préparé conformément au procédé de l'expérimentation 2-2(1), sont ensemencés avec-106 cellules d'une tumeur maligne humaine, et ces mélanges sont cultivés pendant un jour. La

culture résultante est additionnée de 50 unités d'un HuIFN-

gamma préparé par le procédé de l'exemple B-1(3), et/ou de 0,1 ml de serum physiologique (renfermant un produit chimiothérapique), et l'on cultive à 37 C pendant deux jours. On utilise comme témoin un sérum physiologique exempt d'HuIFN-gamma et de produit chimiothérapiuée Après la culture, le taux cytostatique (%) est déterminé

selon le procédé de l'expérimentation 2-2(1). Les concen-

trations en produits chimiothérapiques sont comme suit: -6

chlorhydrate de nimustine (ACNU), 1x10 g/ml; fluoroura-

-8 cile (5-FU), 1,5x108 g/ml; doxorubicine (ADM), 1x1010 -9 g/ml; mitomycine C (MMC), 2,5x10-9 g/ml; et sulfate de

vincristine (VCR), 1,5x1010 g/ml.

Les résultats sont reportés dans le tableau VIII.

TABLEAU VIII

Cellule tumorale Produit HuIFN- HEp-2 PC-9 HLE HeLa chimio- gamma thérapique - + 38% 53% i 44% 52%

ACNU- 4% 2% 5% 5%

A + 54% 65% 63% 72%

5-FU 8% 10% 8% 12%

+ 67% 68% 71% 70%

-AD 13% 6% 7% 17%

+ 59% 72% 62% 64%

M-C 10% 5% 12% 7%

MMC

+ 61% 64% 65% 62%

VCR 5% 8% 10% 10%

VCR + 58% 66% 58% 65%

Nota: (-) signifie "sans addition"; et (+) "avec addi-

tion". HEp-2 est une cellule provenant de carcinome

épidermoide de larynx humain; PC-9 provient de car-

cinome du poumon humain; HLE de carcinome du foie humain; et HeLa de carcinome épithéloide du col de

l'utérus humain.

Ces résultats confirment à l'évidence que HUIFN-

gamma rehausse l'activité cystostatique des produits chi-

miothérapiques sur les tumeurs malignes et que cette élé-

vation d'activité est arithmétique ou synergique.

Expérimentation 2-2(4) Activité cytostatique in vivo sur les tumeurs malignes On implante sur la surface dorsale de souris nues BALB/c un

segment de tissu de cancer du sein humain. A partir du mo-

ment o les tumeurs atteignent 200 mm3, on injecte aux sou-

ris nues, une fois par jour, un ou plusieurs HuIFN-gamma préparé conformément au procédé de l'exemple B-1(3), une lymphokine provenant de lymphoblastoides humains, et/ou un produit chimiothérapique en solution saline sur une

durée de 20 jours.

Les souris nues sont ensuite sacrifiées et les tumeurs

sont pesées.

A titre de témoins, des souris reçoivent des injections de serum physiologique comme plus haut. Les résultats sont

rapportés dans le tableau IX.

Les résultats confirment de façon évidente qu'HuIFN-gamma

inhibe fortement in vivo la croissance des tumeurs mali-

gnes. L'activité cytostatique est fortement accrue et exerce un effet anti-oncotique intense, lorsqu'on combine un ou

plusieurs lymphokines ou produits chimiothérapiques.

TABLEAU IX

Traitement Dose/kg/jour Tumeur (g) Témoin - 10,8-1,0 HuIFN-gamma 50 unités 6,5-0,9* HuIFN-alpha 500 unités 7,1-0,8* T N F 100 unités 6,4-0,5* + M M C 1 mg 5,1-0,4* HuIFN-qamma 500 unités * plus HuIFH-alpha 100 unités 4,60,5 HuIFN-qamma 50 unités plus T N F 100 unités 4,30,5 HuIFN- qamma 50 unités 3,9 0,4* plus M M C 1 mg3,90,4 HuIFN-gamma 50. unités HuIFN-alpha 500 unités 2,7-0,5* plus T N F 100 unités HuIFN-gamma 50 unités HuIFN-alpha 500 unités 2,6-0,6* plus M M C 1 mg Nota: Les valeurs sont stochastiquement significatives

vis-à-vis du témoin à 5% près.

Expérimentation 2-2(5) Toxicité aiguë La toxicité aiguë d'une préparation d'HuIFN-gamma, obtenue par le.procédé de l'exemple B-1(3), est essayée au moyen de souris âgées de 20 jours. Le résultat confirme que la toxicité de l'HuIFN-gamma est très faible, c'est-à-dire de 10 unités ou plus, en ce qui

concerne la DL50, lors d'une injection par voie intrapéri-

tonéale.

Les exemples C suivants constituent une illustra-

tion non limitative de la préparation de compositions phar-

maceutiques renfermant en tant que constituant actif l'HuIFN-

gamma préparé selon le procédé de l'invention.

Exemple C-1

Médicament liquide On prépare un médicament liquide par dissolution, dans du serum physiologique, d'un HuIFN-gamma obtenu par le procédé

de l'exemple B-1(3), à raison de 500 unités/ml.

Ce produit, sous forme de nébulat, de collyre, de collutoire

ou similaire convient comme agent prophylactique ou théra-

peutique pour des maladies virales comme la conjonctivite

épidémique et l'influenza.

Exemple C-2

Injection

On obtient une injection par dissolution dans du serum phy-

siologique de 100 000 unités/ml d'un HuIFN-gamma préparé conformément au procédé de l'exemple B-2(3), filtration dans des conditions stériles, répartition et lyophilisation

du filtrat en portions de 2 ml dans des fioles, et scel-

lement de ces fioles.

Ce produit est avantageusement utilisable comme agent pro-

phylactique et thérapeutique pour le traitement de maladies

virales, comme le produit de l'exemple C-1.

Il convient pour le traitement prophylactique et thérapeuti-

que de tumeurs malignes comme cancer du sein, carcinome du poumon, carcinome du foie et leucémie; et d'immunopathies comme allergie déplacée, anémie pernicieuse, rhumatisme

articulaire, et lupus érythémateux général. -

Le produit convient comme potentialisateur de produits chimiothérapiques comme melphalan, methotrexate et ADM.

Exemple C-3

Injection On ajoute à du sérum physiologique 10 000 unités/ml d'un HuIFNgamma préparé selon le procédé de l'exemple B-3, 100 000 unités/ml d'HuIFN-alpha de lymphoblastoide naturel et 100 000 unités/ml de TNF de lymphoblastoide naturel, et l'on filtre de manière stérile et lyophilise ce mélange comme dans l'exemple C-2 afin d'obtenir une injection solide.

Le produit convient comme agent prophylactique et thérapeu-

tique pour le traitement des maladies virales.

Il convient également pour le traitement de tumeurs malignes, comme /cancer dusein, carcinome du poumon, carcinome du foie, cancer de l'estomac, leucémie,et d'immunopathies comme allergie

déplacée, collagénase, rhumatisme articulaire et lupus -

érythémateux général.

Ce produit peut être avantageusement utilisé pour potentia-

liser l'activité cytostatique de produits chimiothérapiques

comme tegafur, MMC et VCR.

Exemple C-4

Onguent On pétrit ensemble, de manière habituelle, avec une petite quantité de paraffine liquide, un HuIFN-gamma préparé selon

le procédé de l'exemple B-1(3), et un HuIFN-alpha de lympho-

blastoide naturel; on ajoute à ce mélange de la vaseline blanche, de manière à avoir des concentrations respectives en HuIFN-gamma et en HuIFNalpha de 50 000 unités/g et de

500 000 unités/g.

Ce produit convient ppur le traitement prophylactique et

thérapeutique de maladies de la peau comme herpès, carci-

2-615737

nome de la peau et dermatite générale.

Exemple C-5

Comprimé à revêtement entérique Lors de la préparation de comprimés classiques, utilisant amidon et maltose comme véhicules, on incorpore dans ces comprimés, à raison de 10 000 unités de chaque par comprimé

de 200 mg, un HuIFN-gamma préparé selon le procédé de l'e-

xemple B-5 et un TNF de lymphoblastoide naturel. Les com- primés obtenus sont ensuite revêtus de phtalate de méthyl-

cellulose. Le produit est avantageusement utilisable pour le traitement prophylactique et thérapeutique de maladies virales comme celles qui sévissent dans le petit et le gros intestin,

aussi bien que pour celui de tumeurs malignes comme car-

cinome du colon ou du foie, et d'immunopathies comme aller-

gie générale, anémie pernicieuse, rhumatisme articulaire

et lupus érythémateux général.

Ce produit peut être avantageusement utilisé pour potentia-

liser l'activité anti-oncotique de produits chimiothérapi-

ques comme ADM, 5-FU et MMC.

Ainsi.que décrit en détails précédemment, les

procédés classiques aboutissent à une productivité insuffi-

sante d'HuIFN-gamma, ce qui rend très difficile la produc-

tion de cet interféron à l'échelle industrielle. La pré-

sente invention, basée sur la constatation que les myélomo-

nocytes humains établis possèdent une aptitude supérieure

à produire de l'HuIFN-gamma, fournit un procédé de prépara-

tion de ce produit avantageusement applicable à l'échelle industrielle.

La présente invention concerne également un procédé de pré-

paration d'un anticorps monoclonal utilisant l'HuIFN-gamma ainsi obtenu, ainsi qu'un mode de purification d'HuIFN-gamma

utilisant cet anticorps, et un agent prophylactique et thé-

rapeutique pour le traitement des maladies sensibles à HuIFN-

gamma. Cet agent est très efficace vis-à-vis de maladies vi-

raies, de tumeurs malignes et d'immunopathies, dont le

traitement s'avère très difficile.

La présente invention représente un progrès marqué dans son domaine.

Claims (12)

Revendications

1. Procédé de préparation d'interféron-gamma,

caractérisé en ce qu'on laisse un myélomonocyte humain éta-

bli, approprié, produire cet interféron que l'on recueille ensuite.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on obtient le myélomonocyte humain établi, par implantation directe dans un animal a sang chaud, ou bien par ensemencement dans une chambre de diffusion, située

à l'intérieur ou à l'extérieur de l'animal, d'un myélomono-

cyte humain établi, qu'on laisse y proliférer grâce à l'ap-

port de fluide corporel en provenance de l'animal à sang chaud.

3. Procédé selon une des revendications 1 ou'2,

caractérisé en ce que le stade de production d' interfé-

ron-gamma par le myélomonocyte humain établi comprend un

stade au cours duquel ce myélomonocyte.est exposé à l'ac-

tion d'un inducteur.

4. Procédé selon une des revendications 1 à 3,

caractérisé en ce que le myélomonocyte humain établi est l'une des cellules suivantes: HBL-38, HL-60, KG-1, ML-1,

ML-2, ML-3, THP-1, U-937 et CTV-1.

5. Procédé de préparation d'un anticorps anti-

interferon-gamma monoclonal, caractérisé par les stades de:

- production d'interféron-gamma par un myélomono-

cyte humain établi, approprié, - récupération de l'interféron accumulé,

- immunisation d'un animal à sang chaud par-uti-

lisation comme antigène de cet interféron-

gamma obtenu, - récupération à partir de l'animal des cellules productrices d'anticorps, - fusion de ces cellules productrices d'anticorps avec des cellules de myélome, - choix de cellules hybrides capablesde produire l'anticorps anti-interféron-gamma, et - culture de ces cellules hybrides, pour produire

un anticorps monoclonal spécifique de l'inter-

feron-gamma.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé-

en ce que le myélomonocyte humain établi est obtenu par lé

procédé selon une des revendications 2 à 4.

7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, caracté- risé en ce que l'anticorps monoclonal obtenu appartient à la classe des immunoglobulines G ou M.

8. Procédé de purification de l'interfêron-gamma,

caractérisé en ce qu'on laisse un myélomonocyte humain éta-

bli, approprié, produire cet interféron, que l'on soumet ensuite à une chromatographie sur colonne comportant un

anticorps anti-interferon-gamma.

9. Procédé de purification selon la revendication 8, caractérisé en ce que le myélomonocyte humain établi

est obtenu conformément au procédé d'une des revendications

2 à 4, et en ce que l'anticorps anti-interferon-gamma est

obtenu conformément au procédé d'une des revendications 5

à 7.

10. Agent prophylactique et thérapeutique pour le traitement des maladies sensibles à l'interferon-gamma, caractérisé en ce qu'il renferme comme constituant actif

un interferon-gamma préparé et purifié selon une des reven-

dications 8 ou 9.

11. Agent prophylactique et thérapeutique selon la

revendication 10, caractérisé en ce qu'il renferme une lym-

phokine additionnelle, en particulier, interferon-alpha,

interferon-bêta, facteur de nécrose tumoral (TNF), lympho-

toxine, interleukine 2, facteur de différentiation cellu-

laire B, ainsi que leurs mélanges.

12. Agent selon une des revendications 10 ou 11,

caractérisé par une activité antivirale, antioncotique, potentialisatrice de l'activité anti-oncotique de produits

chimiothérapiques, ou thérapeutique vis-à-vis des immuno-

pathies.