JPH05508769A - 細胞培養及び治療に有用なβ―アレチン - Google Patents
細胞培養及び治療に有用なβ―アレチンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
細胞培養及び治療に有用なβ−アレチン胞腹0権息
本発明は、ナショナル インスチツート イン ヘルスと共に許可#HL 16
.796、#AM 10.628及び#5O7RR05583−25の下の研究
の成果で為されたものであり、アメリカ合衆国政府がある権利を有する。
1、及服n炊璽至亘
本発明は、細胞分化誘導、細胞の培養への順応及び細胞形質発現の促進、生体性
、寿命及び生産性のための化合物を提供する。
特に、本発明は、先駆細胞を特別の細胞中に分化させるに有用で、また、悪機能
細胞の機能を正規化するために、また、扱い難い細胞(即ち、′回復、救助成い
は制御に耐性”のある細胞:DOrland’s l1lustrated M
edical Dictionary、26th Edition、1974゜
W、 B、 5aunders、 Phi 1adelphia)を除去するた
めに有用な細胞分化化合物を提供する。
細胞分化は、良く知られる現象で、先駆細胞(通常、′幹細胞”と広く称する)
が、特別の細胞中に発現する方法と広く称するものである。分化化合物、即ち、
細胞の分化を誘導する化合物は、成長因子、即ち、細胞増殖を行うこれらの因子
から明確に区別されており、(文献では例えば、′成長、分化及び悪性の逆転”
、 5cientific American pp、40−47.1986
.1月及び本明細書に示す文献;を参照)、そして、身体の病気、異常の処理の
治療学的使用に関する意味が、現在の関心事になっている。
本出願は、非−細胞一系統一依存の分化化合物として、β−アレチンの分化に関
し、β−アレチンの使用は、分化及び或いは、細胞、特に、治療学的利点のため
に、種々の細胞の機能の正規化を行なうものである。
”細胞形質発現”は、ここで、細胞染色体列の発現にのみ関している”遺伝子型
細胞発現”とは逆に、遺伝学的に及び環境的に決定された個々の細胞の物理学的
、生化学的及び生理学的特性の全領域にわたり、表示されているものとして定義
されるものである。(例えば、Dorland’s l1lustrated
Medical Dictionary、26th Edition、 197
4.胃、 B、 5aunders、 Phi Iadelphiaを参照)、
従って、本発明の化合物の生化学的活性は、条件により影響されるとして、培養
物中の細胞の遺伝的物質の発現の変調を含み、細胞の年齢、用いた培養成いは条
件、及び、適宜に添加した生物学的効果体の存在をも含むものである。
2、従来技 の簡単を説明
β−アレチンは、生体内で生理的経路の副産物として生産されると知られている
。それは、既知の栄養利点を有するビタミンであるパントテン酸への経路を経て
、関係しており(例えば、J、Reprod、 Fert、 57;505−5
10(1979参照)及び関連化合物は、ラジオプロテクターとしてのラヂオテ
ラビイと一緒の使用を示唆している( J 、Med、Chew、29 ; 2
217−2225.1986 ;!1035100517.1985.1.17
. )。この化合物の他の関連の確定的な生物学的機能は、先行技術に説明され
ていない。この化合物は、関係化合物の化学合成のための出発原料として一義的
に良く知られている(例えば、日本特許出願(83)198461号、 (83
)46063A2号;(81)+56256A2号;(81)104861A2
;(80)124755号;(75)62932号; (80)07222号;
及び米国特許第2.835.704号及び第4.552.765号;β−アレチ
ン、β−アレティン、バンテツエイン及びその誘導体或いは中間体の製造の例と
して、また、コエンザイムA及びコエンザイムA誘導体或いは中間体として)。
3、及五Ω轟堅
本発明は、従って、細胞分化及び細胞機能の正規化の方法及び細胞形質発現、生
体性、寿命を高める方法及びβ−アレチンを分化化合物として使用する製造方法
を提供する。本発明は、試験管内及び生体内の両方のヒト細胞を含む哺乳動物細
胞の分化に特別の適用性を有し、特に、細胞成熟化及び分化依存細胞成長の双方
に関する細胞展開の正規化(ノーマリザイシゴン)にためであるが、レプチリア
ン、アビアン(鳥類)、植物、昆虫、クモ形類動物、リケッチ乙バクテリ乙イー
スト、モールド、プロトンアン及びファンガスの細胞のような他の細胞に対して
の分化化合物としてβ−アレチンを使用することを意図している。例示的適用例
としては、次のようなものである。(特に、哺乳動物及び特別にヒトの、免疫不
足及び自己免疫の病気及び異常の処理において、β−アレチンの治療的使用を含
む)免疫不足及び自己免疫細胞機能を正常にすること;細胞形質発現、生産性及
び生体活性そして、それから誘導される治療学的利点を高めること、及び、培養
への耐性のある細胞の順応化及びそれから誘導される診察的及び治療的な使用で
ある。
本発明の範囲内には、β−アレティン、β−アレチンの還元形があり、本発明を
実施する目的のためのβ−アレチンと生物学的に等価なものと考えられるべきも
のとして、β−アレチンは、容易に生体内でβ−アレティンに還元される。例え
ば、過剰な細胞内チオール化合物及び噛礼動物内のグルタチオン及びチオールー
ヂサルフィド イソメラーゼのような酵素により容易に還元される。両方の化合
物は、固有の抗酸化特性を有する利点を有するが、β−アレチンは、β−アレテ
ィンよりも抗酸化性に化学的に耐性を有し、本発明でのβ−アレチンの使用は、
一般的に、この理由により好適である。
4、置皿0!星l戊悪
第1図は、IMR−90ヒト胎児肺繊維芽細胞(フィブロプラスト)のレベル最
大2倍数(PDL)でのβ−アレチン効果をテストする一連の実験からのデータ
を示す。
第2図は、試験管内のヒト外縁血液ロイコシテス(HPBL)による非抗原特定
免疫合成へのβ−アレチン効果のテストする一連の実験からのデータを示す。
第3図は、非特定の免疫グロブリンのネズミの膵臓(スプレノシト)生成物への
β−アレチン効果を研究する一連の実験からのデータを示す。
第4図は、生体内から試験管内へ取られた細胞を順応化する能力へのβ−アレチ
ン効果を研究する一連の実験からのデータを示す。
第5〜7図は、非−隠の骨髄腫細fk(MS−1)で接種され、種々の投与量の
β−アレチンで処理されたマウスでの早期及び遅い腫瘍を示す。
第8図は、第5〜7図のデータの3次元構成図である。
第9図は、第8図の85度時計回転した図である。
第10図は、β−アレチンの種々の投与量に対するマウスの腫瘍の調整を示す。
5、好 な具体的 施例の説明
前記に示すように、β−アレチンは、既知の化合物[(HINCH,CH,(C
=O)N)ICH,CH,S)、及び次の式■)であり、通常、相当するモノサ
ルフィドの酸化により製造され、β−アレティン(H−NCH*CHオ(C=O
)N)lcH,cH,sH及び次の式II)は、空気中及び水溶液で不安定であ
る[メルクインデックス、9版(番221)、メルク&カンバニイ、Rahwa
y、 NJI
双方の化合物は、その酸塩として安定化され、特に、塩化水素塩及び特に塩酸塩
とする。(N、N’ −ビス−カルボベンゾキシ)ブロック化β−アレチンをデ
ブロックすることに基づくβ−アレチンの合成の種々の技術は、文献に記載され
ている(カルボベンゾキシはよ<CBZとして示される);然し乍ら、ぼんどの
既知の方法では、収率或いは純度、或いはその両方で不十分である。
従って、本発明の方法に有用なβ−アレチンは、純度を確保し、好適には、最大
の収率をとる方法により製造することが好適である。例えば、N−CBZ−ブロ
ック化β−アラニンをN−ヒドロキシサクシンイミドとカップリングして、相当
する活性エステルを作り、次に、システアミンを過酸化水素で酸化して作ったシ
スタミンとカップリングし、ビスーCBZ−ブロック化 β−アレチンを生成し
、それを回収し、デブロックする方法により製造することが好適である。この方
法は、実施例に詳細に説明されるが、製薬使用に適する高い収率と高い純度の生
成物を得る。
本発明に従って、β−アレチンは、細胞一系統で特定しなく、表現型特定に関係
ない細胞に共通である遺伝子分化機構の組を調整するようである。この前提に一
致するように、本発明によりβ−アレチンを使用することは、下記のものを除い
て、細胞サイクルにおいて、細胞系統、表現型或いはインターペンションに関し
て、著しく投与量−依存でない。広く、約1100p/ml培養物からの投与量
が、細胞分化に有用である。生体内の適用のために、約10pg/身体重量1k
gからの投与量が推薦され、特に、約10pg/kg〜200μg/kgの量、
或いはそれ以上の量、約100μg/kgまでの量が推薦され、通常の担体(例
えば、静脈注射を含む非経口のための生理的食塩液或いは経口での適用なエンテ
ロ被覆と共に)の存在により、通常の経由で投与され、好適には、毎日或いは隔
日に詳細には下記のレジムで、所望の結果が達成されるまで投与される。だが、
他のレジム、例えば、層間隔で、三周間隔でも、特に結果が顕著な場合、充分で
ある。即ち、正常化が進むにつれて、投与量を減らすことが適当である。必要な
分化、細胞機構の正常化或いは他の所望の効果に必要な量より過剰のβ−アレチ
ン量を用いることは、勧められない。即ち、過剰投与量は、逆の生産性となり得
、また、少なくとも、効果的でない。試験管内適用のために、約10 pg/m
1培養物からの投与量が勧められ、下記のように、補充もある。
β−アレチンは、一般的に、生きている生物、一般的的に、特にヒト、@乳動物
、レプチリアン、アビアン(鳥類)、植物、昆虫、クモ形類動物、リケッチア、
バクテリア、イースト、モールド、プロトンアン及びファンガスの細胞の分化に
有用であると意図している。即ち、それは、ここに報告される実験及び報告され
ない実験の双方で観察される相当する投与量で得られた結果の普遍性による。生
きているシステムでのβ−アレチンに対する先駆物質が偏在するものである。更
に、β−アレチンは、肝細胞のような(培養物−耐性細胞と称する)順応性とし
て一般的に見做されない培養細胞に順応するために有用である。
本発明によると、β−アレチンは、細胞機能を正常化しく即ち、不十分な機能を
改良し、或いは過剰機能を低減せしめ);細胞寿命及び/或いはバイオ生産性を
促進し、及び/或いは細胞機能を強化する(即ち、表現型細胞発現を伸長せしめ
る)分化化合物をなす。β−アレチンの特別機能は、(1)培養物耐性細胞を順
化すること;(2)老化が広く、細胞自体の培養物中の再生産を不能力の増大と
定義され、典型的には、特定の数の倍化レベル(PDL)の細胞ジエネレイショ
ン時間(T1)を著しく増加せしめることにより特徴ずけられる老化において、
試験管内の細胞の老化を遅らせること;(3)免疫サーベイランス(処置困難な
細胞の認識と除去)のように機能を正常化或いは改良すること、及び/或いは細
胞、特に、免疫システム(免疫細胞)のものを生産することである。特に、細胞
培養での老化遅延のために、顕著な細胞悪性化(この場合、老化の開始)の前に
、処理される細胞をβ−アレチンに接触せしめることが好適である。これは、例
えば、一旦始まった細胞老化を逆転することは困難であると分かったためであり
、従って、本発明によるβ−アレチンでの処理は、下記のように、細胞分化の悪
性化を防止すること、及び、多種の病気或いは異常に伴うような、存在する分化
悪性化を治療的処理すること、を含むものである。初期の病気或いは異常に示さ
れる異常細胞分化機能のマーカーは、研究細胞老化のマーカーも含み、良く知ら
れており、先行技術で開発され、実施者は、そのようなマーカーを評価する方法
として文献に参照される。
培養物中の細胞の寿命サイクルを正常化するだに、即ち、老化及び死亡に関して
、細胞の生長及び熟成を適当にし、培養物に耐性の細胞を順応化するために、老
化開始の前に、細胞を、β−アレチンに接触せしめることは好適である。細胞の
エイジングは、徐々の過程であるために、老化は、ある程度、寿命のある檀家で
その化合物に接触せしめられても、停止され得る。それは、細胞タイプ、培養物
条件及び他の因子に依存している。然し乍ら、老化細胞は、定義によりライビル
及び生産性の少なく、従って、寿命期間の遅い段階でそれを保持することは、本
研究が老化細胞に関心のあるのでも、本発明の範囲で、逆の生産性となる。従っ
て、多くの場合、最適の結果を得るために、(例えば、細胞寿命及び機能の最適
化が望ましい場合)、細胞をその寿命サイクルの早期に、該化合物に接触せしめ
ることが好適である。
培養−耐性細胞(即ち、通常の培養条件下で短い寿命期間、例えば、2週間或い
はそれ以下、を有する細胞;培養物中で正常の生体機能を表現しない細胞、例え
ば、ホルモン、酵素或いは他の生体生産物が、試験管内で抑制される正常な生産
性を表現しない細胞)は、その化合物の順応量に早くに接触せしめることにより
、培養物に順応化せしめる。好適には、細胞に導入する前に培養媒体に該化合物
を結合することによる。例示の耐性細胞は、リンパ腺、肝、肺臓、神経、甲状腺
及び胸腺の哺乳動物細胞を含むものである。
β−アレチンは、既知の培養物媒体に添加でき、時により、血漿、例えば、死亡
或いは新生牛血清のようなプロティン成分を補給し、本発明の結果を得る。用い
た媒体は、本発明の部分を形成しない。例示の媒体には、イーグル基底媒体;イ
ーグルミニマルエッセンシャル媒体;デイルベツコの変成イーグル媒体、ノ)ム
の媒体、例えば、FIO媒体或いはF1212媒ノく・yりのN15媒体、パッ
クのN16媒体、ライモス(Wamoth)のMB5421媒体、 McCoy
の5A媒体、RPMI媒体1603.1534及び1640;Leibovi
tzのL1515媒ATCC(ア/I+カノタイプカルツアコレクシヲ7)CR
CM30;MCDB媒tIF101,102,103,104;CMRL媒体1
066、1415及びHank或いはEarlのバ5yX塩溶液である。用いた
基底媒体は、既知のように、培養中の細胞の成長を支持するたえ゛の栄養素、基
本的アミノ酸、脂肪酸及び炭水化物を含む。媒体は典型的には更にビタミン、助
因子、痕跡性元案及び同化し得る量の塩のような基本的成分を含む。細胞の成長
及び保持を促進する他のファクターは、細胞の生存、機能、生産及び/或いは増
殖に必要な化合物及び因子;例えば、ホルモン、特にペプチジル或いはステロイ
ド ホルモン、成長因子及び抗生物質が含まれる。また、媒体は、一般的に、緩
衝溶液、pH調整剤、pHイインケータ等を含む。
本発明のモジュレイターを含有する媒体は、多種の細胞、特に真核生物細胞に適
用できる。本発明の媒体は、動物、特にヒトを含む哺乳動物、植物細胞、昆虫細
胞、バクテリア、ファクタ、モールド(徽)、原虫類(プロト−シア)及びリツ
ケチ乙特に、抗生物質生産細胞の培養に適する。β−アレチンは、広く、多種の
生きている細胞を、そのような細胞の培養物に適応する言わば組織培lI物媒体
の広いスペクトルにおいて、促進するために広く有効である。例示の適用として
は、ハイブリドーマ細胞系統のようなりローン化細胞、特に、ヒト細胞での哺乳
動物細胞、細胞生産物の生産のために、特に、プロティン及びホルモン、酵素及
び免疫因子のようなペプチド;ワクチンの生産のためのビールス感染細胞;例え
ば、分裂組織或いはカルルス培養での植物細胞;傷をいやすための組織を供する
上皮細胞;医学的或いは治療的用途のための耐性細胞;及び生物学的な期間及び
埋め込み組織の生産おす保持の適する媒体中でのものがある。
本発明の方法において培養物に有用な特定の細胞タイプは、哺乳動物組織、期間
及び腺から誘導される細胞を含み、例えば、脳、心臓、肺、胃、腸、甲状腺、副
腎、胸腺、上皮小体、末丸、肝臓、腎臓、ぼうこう、肺臓、膵臓、胆嚢、卵巣、
子宮、前立腺、及び皮膚;再生細胞(精子、卵子);リンパ線、骨、軟骨及び間
質細胞;免疫細胞、マクロファージのようなシトファージ、リンパ球、白血球、
赤血球及び血漿板のような血液細胞を含む。
更に、細胞ティグには、植物の幹、葉、花粉及び子房細胞を含み、微生物、上記
のようなビールス;及び昆虫組織、器官及び腺から誘導される細胞を含む。
本発明のモジュレイターと一緒に有用な培養技術は、固体支持体(特に、例えば
、モルレイヤ或いは懸濁培養での接極子(アンレッジ;ancho rage
)依存細胞のため)、例えば、ガラス、炭素、セルロース、中空繊維膜、懸濁粉
体膜及び固体基板を用いることであり、例えば、化合物がビーズ内に取り込まれ
、マトリックス内にトラップされ、或いは混合ジサルフィドのような共有結合の
場合に、アガロースゲルを用いることである。β−アレチンは、第一の培養物に
有用であり、系統培養、サブ培養、培II物の保持、氷結成いは乾燥培養物;及
びカプセル化細胞に有用で、培養物は、通常の媒体から該化合物含有の媒体に、
既知のトランスファ技術により移動せしめる。
本発明のこの点を実施に従って、細胞を、試験管内のこれらの細胞の培養物を促
進するに効果的な量、β−アレチンに処理する。例えば、[胞生存性或いは寿命
期間の増加、細胞バイオマスの増加或いは細胞生体生産性の増加が著しいことに
より測定できる。試験管内適用のために、約10 p glIIBF&培養物m
+(培養物m−10?細胞/ m 1の密度に基づいて)が推奨される。培養物
は、必要により化合物が補充され、一般的に、日に基づいて補充され、再び、隔
日で或いは二週間間隔で処理すると、所望の結果に依存して、充分である。
免疫の適用において、免疫細胞に、β−アレチンに接触せしめ、白血球、リンパ
球、膵臓細胞、T−細胞、B−細胞、自然キラー(NK)細胞及びマクロファー
ジのようなシト7アージのようま免疫細胞の機能を促進し、或いは/或いは強化
する。特に、β−アレチンは、生体内或いは試験管内で、モノクロナールの抗体
システムに使用する抗体の膵臓細胞或いはリンパ球生産を改良するに有用であり
、免疫グロブリン生産を強化或いは改良するのにも、また、免疫細胞の通常の免
疫機能を一般的に促進するのにも、また、特に、免疫システムでの病気或いは異
常を処置するのにも、有効であり、生物、特に、ヒトを含む@乳動物を、効果量
のβ−アレチンで処置することにより、好適には、上記の細胞の成長及び維持を
促進する剤を含有するが、或いは悪化された細胞を除去し、それを、試験管内で
、処置し、それを再び、悪化された生物内に入れることにより、有効である。こ
れらの治療に反応するとされるヒトの病気は、自己免疫病、バイブガンマグロブ
リン症及びエイズ(AIDS;acquired immune defici
ency syndrome)を含む。
6、去履男
L 、6ニニど±ヱΩ見童:
β−アレチンは、次のように製造されたN、 N’ −ビス−カルボベンゾキシ
(CBZ)ブロックされたβ−アレチンを解離(デブロック)することにより製
造された。
A、N、N’ −ビス−CBZ)−β−アレチン或いは5.5−ビス N−カル
ボベンゾキシ−β−アラニル)−2−アミノエチルヂサルフィドの製造
ジシクロへキシルカルボジイミド(23,3g)溶液を、ジクロロメタン中の乾
燥10%アセトニトリル全容量約5O0m1のN−CBZ、+9−7ラニン(2
4,84g)とN−ヒドロキシサクシンイミド(12,92g)の溶液中に添加
した。ジシクロへキシルウレア(24,51g)が、活性エステル形成の副産物
として沈殿した。活性エステルは、オイルで乾燥させ、無水エチルエーテルで粉
末化する。沈殿物は、ジクロロメタン中で再懸濁し、更にジクロロへキシルウレ
アを沈殿させる。得られた活性エステルのジクロロメタン溶液を一過し、シスタ
ミン(8,5g)の予め得た溶液に添加した。所望の生成物:N、N’−ビス−
(CBZ)−β−アレチンがこの混合物から沈殿した。母液、無水エーテル、生
成物のジクロロメタン抽出物及び上記のように回収した活性エステルを乾燥し、
粉末化、再結合して、生成物の収率を出した。生成物は、はとんど水、熱(約7
0℃以上)エチルアセテート及び熱(約30℃以上)エーテル中に不溶であり、
従って、これらは、不純物を抽出するに使用できる。生成物は、アセトニトリル
或いは水と一緒のジメチルサルフオキシドから再結晶化することができ、再び、
エチルアセテート或いはエーテルで洗浄した。
後者方法では、生成物融点で1℃上昇、即ち180から181℃(補正せず)に
なった。N、N’−ビス−(CBZ)−β−アレチンの収率を理論値に上げる試
みが為される。理論値の85〜90%の収率は通常で得られた。真空中でP、0
.上で乾燥すると、生成物は一モル当量の水を保持してい、従って、−水和塩と
して分析した分析: C,、H,、N、O,S、H,Oとしての計算値;C,5
3,78i1(,6,25iN、9.65実験値:C,54,23;H,6,5
6;N、 9.66試料は、ニューメキシコ州アルバカーキイ、ユニバシテイイ
ン ニューメキシコ、化学科のRuby Juにより分析された。
B、上記のIAから得られるCBZ−ブロワクイβ−アレチンのデブロック −
アレチン・2HC1或いはN、N−ビス−β−アラニル)−シスタミン或いはN
、N’ −ビス−β−アラニル−2−アミノエチル ジサルフ ドの製造]カル
ボベンゾキシ基を完全に除去することは、%。
86;1202−1206(1964)に説明される方法により行なわれる。N
、N’−ビス−(CBZ)−1−アレチンの1モル当り、氷酢酸中の4当量の臭
化水素で15時間でデブロックした後、β−アレチンは、アセトニトリルで沈殿
させることにより精製し、無水エチルエーテルで洗浄し、水で再懸濁し、−過し
、アセトニトリルで生成物との混合塩として沈殿させる。当初の収率は、理論最
大値の80%以上であった。β−アレチンは、予めIMのKC2で溶離させたダ
ウツクス(Dowex AG lX8(塩化形)(Dot Chemical
Corp、Midland。
Michigan)の30mlX15cmの憂いカラム上を通過させ、DI(脱
イオン化)水で完全に洗浄することにより、塩化水素塩に変換した。
Ca(O)l)tで中和し、水からβ−アレチンH(Jを再結晶化すると、細か
い針状で、224〜225℃融点(補正せず)のものが得られた。
分析:C8゜H1!N401S1・2HC1としての計算値iC,32,69;
H,6,59;N、15゜25 実験値:C,32,52;)1,6.69iN
、15.32試料は、ニューメキシコ州アルバカーキイ、ユニバシテイ イン
ニューメキシコ、化学科のRuby Juにより分析された。
C,B −7し+ ン(7)n性’ [’ ”CI−NMR門[’HI−NMR
;及ヒβ−7しf[工ヨ黙
β−アレチン 37.59 39.04 172.79 32.9 36.71
−−−■吐さ黙
β−アレチン 2.524 3.094 −−− 2.694 3.367 −
−−−βゴレチン 2.74Q 3.309 8.085 2.254 3.1
92 7.24(DMSO) a b c d e f3250w 3270V
1555w 29705−w
1286II11462s
1620s 1620s
128s
β−アレチン 3345s 334551545m 1535s
1640g 1270m
682s
ab c de f
(この表でRはベンジル部である)
(この表でRはベンジル部である)
β−アレチンは、pHの変化ECa(OHハによる中和コで異常であり、IRバ
ンドの位置と強度の変化を大きくする。
ピーク(HCl塩) : 3270s、 3170s、 2970s、 270
0w、 2550v、 2022w、 1657s、 1595m、 1560
s、 1450s、 1409m、 1390w、 1354w、 1325m
、 1300w、ショルダー/1251m/ショルダー、 1188m、 11
29m、 1097m、 1079w、 1030w、 950v、 905w
、 829m。
ピーク(中和) :3250s、 3180s、 2940m/プローF、 2
875s、 2230s、 2157s、 1936w、 1620s、 15
55w、 1462s、 1432シヨルダー、 1400m、 1342m、
1286m、 1217rn、 1188m、 1128s、 1020肌8
10w、 719m、 660w。
ビス−(CBZ)−β−アレチンは、β−アレチンに存在する共鳴の2.3のみ
を表示する。
ピーク: 3345s、 3310s、 1682s、 1640s、 154
5mショルダー、 1535s、 1450w、1427w、1375w、13
32m、1270m、1231m、1178w、1120w、1030m/ブト
「。
Il、β−アレチンに る 維芽細胞の細胞老イの遅れ。
第1図は、IMR−90ヒト胎児肺線維芽細胞(フィブロブラスト)のレベル最
大2倍数(PDL)でのβ−アレチン効果をテストする一連の実験からのデータ
を示す。その細胞系は、アメリカン タイプ 力ルチュア コレクション(AT
CC、ベセスダ、メリーランド州、米国)から得られる。そして試験管内細胞老
化試験のための標準として使用される。細胞老化は、培養中に、細胞自身を補充
する細胞能力がなくなる結果となるこれらの細胞の過程として曖昧に定義される
。このモデルは、生体内でのエイジング過程を示し、異なる年齢のヒトから発現
した細胞系は、試験管内でPDLを有し、それは、ドナーの時間的な年齢とは逆
に関係している。IMR−90細胞系は、約45のPDLの理想的組織培養条件
下で、最大のPDLを有するものとして示されたものである。IMR−90細胞
は、第1図に示されるように、10mMのHEPES緩衝液、100単位ヘニシ
リ:/ G / ml及び標準濃度で100μgストレプトマイシン/mlで補
強されたマツコイ(McCoy)の5八合成媒体;20%(V/V)の新誕生カ
ーフ血漿(NBC5) i及び2mMのし一グルタミンでの理想的な条件下で成
長された。処理細胞培養は、燐酸緩衝生理的食塩液(PBS)に溶解した異なる
濃度のβ−アレチンで増加されたー何時も培養当り30マイクロリツトルの標準
的量である。β−アレチンを、PDL35の培養物に添加した、これは、細胞が
通過する時間の時間的な意味で中間寿命、7エイスIIと考えられる。培養方法
は、細胞を0.25%トリプシンシンDTA (エチレンジアミン テトラ酢酸
)溶液で2〜5分間処理することにより、その基体から固有細胞を除去すること
による。次に、完全な媒体で2回洗浄し、そして、2倍のノイエバウェル(Ne
ubauer)血球計算器で数えた;2百万の細胞を定量し、20 m lの新
鮮な完全培養を有する新鮮な組織培養フラスコ(T−75、ポリスチレンi L
UX、 Flow General、マクリーン、メリーランド州、米国)に入
れた。この方法を、細胞が約80%表面金面になる48〜72時間毎に繰り返し
た。このように、細胞を指数関数的に増える条件下に維持し、即ち、30〜80
%表面全面に成面金るようにした。このような条件下で、IMR−90細胞を約
PDL45−47 (グラフの第1の欅)で老化する。β−アレチンで処理した
細胞は、この点を越えて良く成長続け、最終的には、PDL67からPDLIO
I。
2まで投与量依存して、老化した。β−アレチン依存成長期間にわたり、フェイ
スIF線維芽細胞と同様の表現型を有すると観察された。終局の老化の点で、こ
れらの表現型は、処理されない基準のPDL47と同様である。細胞の寿命の伸
びは、2倍にした成長増大そして、2倍で、55或いは3.6X10”倍に上が
った細胞数(バイオマス)の増加を示す絶対的意味で、示された。これは分化現
象であり、通常の老化点を越えて、β−アレチンでの処理の前と後についての、
処理された細胞が同じジェネレイション数(分割の1つの完全な回数に必要な時
WJ)を有すると観察されたことに基づいて分かる。
II+、β−アレチンによる リンパ様器官の分イ第2図は、試験管内のヒト外
縁血液ロイコシテス(HPBL)による非抗原特定免疫合成へのβ−アレチン効
果のテストする一連の実験からのデータを示し、一般的に、末梢リンパ線器官と
して、中間サイズの成熟リンパ球により特徴ずけられる末梢血液リンパ球により
試験管内で評債される。これらの実験では、血液は、健康な男から採取され、血
液は、ガラスピーズで脱繊維素され、たリンパ球は、遠心力で分離された(バッ
フィ コート技術)。残置の赤い血液細胞は、0.85%塩化アンモニアで短い
間処理され、溶菌された。リンパ球を数え、24のウェル組織培養トレイ(LU
X、 Flow General、 McClean、 MD、 USA)に、
ペニシリン、ストレプトマイシン、10%牛血漿及びL−グルタミンで補給され
たRPMI基底媒基底媒体1介lさせた。β−アレチンをテスト培養物中に種々
の濃度で30マイクロリツトル投与量で分散させた。細胞を、第2図に示すよう
に72〜144時間の種々の培養時間で収穫し、通常のプロティン−A容易化プ
ラクアッセイ(A−PFC或いはI g−PFC)を用いて、抗体生産性をテス
トした。このアッセイで、プロティン−Aは、洗浄羊赤血液細胞(SRB’ s
)と、生理的食塩水中の塩化クロム(6gm/100 m l )を用いて、共
有接合された。そして、プラクアッセイ中でターゲットとして用いた。更に、こ
の細胞少量をとって、沈降チミジン(6〜9Ci1モル)で処理して、新しく合
成したDNA中にラジオアクティビティを入れることにより、テストした。
第2図は、β−アレチンが、HPBLを#激し、約60回投与量依存で免疫グロ
ブリンを生産し、処理しないコントロールレベルと比較する。最適の濃度は、約
5ナノグラム/ml培II物であった。増殖率は、増加したチミジン含有量5
n g / m 1の投与量で低いレベルであった。これを2〜3倍に増加する
と、LPS(リポポリサッカライド)或いはPHA (フィトヘマググルチニン
;植物性血球擬集X)のような本当の増殖刺激と比較して、少しの顕著性を有し
、同様な条件下で、ラジオアクティビティ約200.000cpm、コントロー
ル・レベルの約100−200−倍になっている。実験で観察された増殖のレベ
ルは、β−アレチンで刺激された独立の増殖過程よりも、分化−依存性の増殖に
よった、即ち、活性細胞にあるデオキシリポ核酸に対する細胞の生存と保持力の
両方での増加によっていると結論された。
Iv、β−アレチンに る 心リンパ用器 の分イ第3図は、非特定の免疫グロ
ブリンのネズミの肺臓(スプレノシト)生成物へのβ−アレチン効果を研究する
一連の実験からのデータを示す。アッセイと培養物の技術は、上記の(実施例I
II)のHPBLに対するものと同じである。実験動物は、4〜6週間の歳の雌
BALBC/J マウスであり、頚部が変位することにより、犠牲にされた。そ
の肺臓は、無菌的に除去され、90メツシユのステンレス鋼スクリーンを通して
押し付けて得た。完全な媒体で数回洗浄された後、細胞を数えた、そして、24
のウェルトレイに分散され、テスト培養物は、β−アレチンを投与された。これ
らの培養物は、72〜144時間の種々の培養時間で収穫され、第3図に示すよ
うに、抗体生産と増殖についてテストされた。第3図は、β−アレチンはネズミ
膵臓細胞を顕著に刺激し、投与量依存で免疫グロブリンを生産し、約10ng/
mlの投与量で最適に提示されていることを示している。この場合、実施例11
1で説明したチミジン アッセイに基づいて、増殖を顕著に刺激するものではな
い。
第4図は、生体内から試験管内へ取られた細胞を順応化する能力へのβ−アレチ
ン効果を研究する一連の実験からのデータを示す。用いた培養−耐性細胞(ヘパ
トシテス)は、生体内から試験管内成長で採取された。ネズミのへパトシテス(
肝細胞)は、その細胞を培養物に順化するのが困難されるが、選択細胞の分化の
比較程度に関連していると示唆された;即ち、細胞の分化がより高いと、その培
養がより困難である。従って、細胞タイプのへノ<トシテス混合の数は、この実
験のために、これら細胞の分化が高いなるように選択された。この実験において
、B A L c / Jマウスの1つからの単一肝葉を、実験し、90メツシ
ユステンレス鋼スクリーンを通して押し付けて、T−25組織培養物フラスコ(
10、LUX、 Flow、 General、 McClean、 MD、米
国)中に入れた。全ての培養物を10m1の実施例111(RPMI−1640
+胎児牛血清◆ベン/連鎖球菌+L−グルタミン)と同じ媒体中に維持し、テス
ト培養物を、種々のβ−アレチン濃度に、第4図に示すように、接触せしめた。
第4図は、ヘパトシテスのコロニーが、コントロール培養物中にはないが、約5
0のコロニーが10ng/mlのβ−アレチンと処理された培養物中で観察した
ことを示す。コントロール培養物からいくらかの活性コロニーを得ることは可能
であるが、10−から2〇−倍のより高い初期細胞濃度を用いたときのである。
従って、β−アレチンが500〜1000倍、ネズミのへパトシテスを、試験管
内培養物に順化することに、コントロール、即ち、生理的食塩水処理の媒体より
も、効率が高い。更に、長期間培養で不安定なコンピュータ培養物に比べて、β
−アレチン処理培養物は、培養中安定しておる。効果は、前記のように、投与量
−依存性である。
Vl、β−アレチンによる新形成の 埋木発明は、更に、新形成をβ−アレチン
で処置する方法を提供する。特に、本発明は、腫瘍を低減し、腫瘍成長を抑制し
、腫瘍の脈管内成長(インドラバスキュラリゼイション)、例えば、腫瘍の転移
を抑制するような、多種の新形成を処置する方法を提供する。β−アレチンは、
細胞に分化を誘導し、そして、細胞成長、表現型発現(ビオ生産及び機能を含む
)、生活力及び寿命(上記)をモジュレイトする化合物である。出願中の米国特
許出願第071549,104号、細胞分化及び悪性化の逆転を示唆している。
例えば、−Growth、Differentiation、and the
Reversalof Malignancy−5cinetific Ame
rican第40−47頁、1月、1986及びここで引用した文献を参照。
本発明は、更に、β−アレチンを非細胞系統依存の抗腫瘍化合物としること、及
び、β−アレチンを種々の新形成細胞の機能を正常化するように使用することに
関している。従って、本発明は、更に、特に、癌の処置にための新形成細胞を認
識し、正常化し、消失せしめる方法を提供する。
本発明によると、β−アレチンは、細胞系統特定でなく、表現型特定に関係なく
、細胞の共通の遺伝子分化機構の組を調節するようである。この前提に一致する
ように、本発明による抗腫瘍剤としてβ−アレチンを使用することは、細胞系統
、表現型或いは細胞サイクルのインターペンションに関して、下記のものを除い
て投与量依存でない。生体内適用では、β−アレチン約1 opg/kg体重か
らが推薦される。特に、約109g/kgから約200μg/kg、また、更に
、約100μg/kgまでが好適である。それは、非経口的に、(例えば、i、
p、 )、或いは、生理的食塩水ような通常の担体を用いて、非経口ルートで、
経肛門で投与でき、また、適当な腸コーティングで経口的に投与することができ
る。この化合物は、好適には、毎日、隔日で、下記に説明するように、投与され
、所望の結果が得られるまで、行なう。
また、他のレジメ、毎週、又は隔週でのレジメが、特に、結果が明らかな時は、
充分である。正常化が進むに従って、或いは腫瘍が低減するに従って、投与量を
低減することは、好適であり、そして、過剰の生理学的なストレスを生物に与え
ることによる急速過ぎる腫瘍の後退を避けることは好適である。分化、細胞機能
の正常化、腫瘍の低減或いはここに示す他の結果を得るに必要な量より過剰な量
でのβ−アレチンを用いることは、推奨されない。
即ち、過剰な投与量は、逆な生産性を与え、或いは少なくとも、不効果的である
。試験管内の適用では、新形成細胞の正常化のために、約10pg/m+培養物
から始まる投与量が、毎日或いは隔日の補給で示唆される。
β−アレチンは、一般的に生きている生物の細胞の新形成の処置のために有用で
あり、それは、哺乳動物、特にヒト、レプチリアン、アビアン及び植物細胞を含
み、実験でここに報告された、或いは報告されない実験で、相当する投与量で得
られた結果の共通性による。本発明によると、β−アレチンは、細胞機能を正常
化する(即ち、不充分な機能を増大し、過剰機能を低減する)抗−腫瘍の化合物
である。β−アレチンは、特に、(1)腫瘍成長、特に、悪性腫瘍の成長を抑制
すること、(2)腫瘍、特に、悪性腫瘍を後退せしめること、(3)腫瘍転移を
抑制すること、(4)新形成細胞の成長特性を正常化すること、或いは/或いは
(5)新形成細胞の認識及び/或いは消失を改良することの機能を有する。
癌適用においては、新形成細胞或いは免疫細胞或いはその両方は、β−アレチン
に接触せしめ、細胞の分化を促進し、細胞サイクルを正常化せしめる。腫瘍細胞
の処置は、感染されたヒトを含む哺乳動物から免疫細胞を除去することにより、
効果的に免疫細胞から分離した。次に、免疫細胞は、培養物中でβ−アレチンで
処理し、或いは、β−アレチンと感染噴孔動物から導入した腫瘍免疫の組合せと
共に処置する。これは、免疫細胞が達成されるか或いは腫瘍細胞が完全に、!康
のために、減衰されるかいずれかになるまで行なう。活性化免疫細胞は好適には
転移腫瘍細胞を欠けている、従って、特に、ヒトを含む噴孔動物中のソフトな(
ヘマトリンフオイド)腫瘍種を低減し、腫瘍細胞の脈管自伝送を抑制し、特に、
不安定腫瘍の細胞を抑制するために生体内で有用である。この化合物は、従って
、腫瘍成長を抑制することにより、また、腫瘍転移を抑制することにより、また
、その両方により、腫瘍低減で有用である。特に、β−アレチンは、多くのソフ
トでリンパ線の悪性腫瘍、例えば、リンパ線腫瘍、白血病、ヘパト細胞腫瘍;肝
腫瘍及びホドキンス病;特に、黒腫のような腫瘍を処埋することに有用である。
β−アレチンは、なかんずく、新形成の処置に有用であり、(1)予防的に、(
2)腫瘍成長、特に、遅い成長の腫瘍を抑制する一義的な治療;及び(3)腫瘍
を除去し、特にビールス製或いは一義的腫瘍を除去するための外科的なインター
ベンジ3ンに続く補給的治療法として、有用である。β−アレチンによる処置は
、腫瘍を後退し、腫瘍マスを低減し、腫瘍成長を抑制し、腫瘍転移を抑制し及び
腫瘍腹水生産を抑制すると見出された。
抗腫瘍治療は、初期の腫瘍段で開始し、特に、大きな腫瘍の不安定性により生じ
る末梢生理的な複雑化を避けるようにする。腫瘍治療のためのβ−アレチンは、
上記のような通常の方法で投与され、例えば、i、V、或いはi、1)、で、少
なくとも、治療的に閾値量で、生理的食塩水のような適当な担体で、約1ng/
kg体重から約toaug/kgが、腫瘍の段階に依存して、特に適する。ステ
ィンIIの腫瘍に対しては、治療範囲の高い範囲での投与が推奨され、一方、低
い範囲では、ステイジI或いは初期腫瘍に対して適する。癌予防に対しては、約
10pg/kg体重、好適には、約11ng/kgから約tooμg/kg体重
が意図される。癌装置のために、上との投与量に対して、交替日で治療レジタが
適し、β−アレチン治療に反応すると考えられる酵素のようなバイオ薬剤を生体
内に入れることも、約48時間での化学刺激となるようである観察に基づいて好
適である。予防レジ7は、毎日、行なうことができる。
少なくとも、示す投与量レベルにおいて、β−アレチンは、健廣なマウスにおい
て、はぼ非毒性化合物であり、悪の副作用は見N5−1骨髄腫細胞(ATCCT
IB 18、P3/NSI/1−Ag4−1)を接種として用いた;これらの細
胞を骨髄腫をマウス中に確立するに約90%効果的であり、そして、処理すない
骨髄腫は、約2週間内にほとんど死亡する。
細胞を、37℃で、Co1下での湿分チャンバー中で、10%胎児牛血清(Hy
clone Laboratories、Logan、UT、米国)、2mMの
し一グルタミン、5,000単位のペニシリン及び5mgストレプトマイシンを
、75cm″のポリスチレン組織培養フラスコ中で含有するRPMI (ライ
トカー、 M、A、Bioproducts、ウオカーヒル、メリーランF。
米国)よりなる滅菌環境中で、数回(好適には一週rr!J)成長せしめる。生
体内でN5−1の成長を確実にするために、DMSO(冷凍剤ジメチル サルフ
オキサイド)を、数媒体変更と希釈により、除去することが本質的である。これ
は、細胞を長期フェイズ成長に維持するのに役立つものである。雌BALBc/
Jマウスに、O,1mlの標準的燐酸塩緩衝液中の104細胞を、引き離し、伝
送及びインデックスイングの後、なるべく直ぐに、i。
p、注射した。用いたN5−1細胞系統は、成熟の、或いは、この環境と同等で
ある動物に、−綬的に、最適に達成できなかったことが見出された。マウスは、
Wayne Roden Blox(胃ayne Re5earch Anim
al Diets、ン6:r、4+1/イ州、米国)任意量と水道水で維持され
た。
1、上記の(実施例I)のような得られたβ−アレチン濃度;1ng/kg、1
1)g/kg、10μg/kg及び100μg/kg(接種マウスの体重に基づ
いて)を、0.1ml生理的食塩水中で、i、p、注射した。腫瘍接種(日2)
の第28目に始められ、毎水曜限木曜日及び金曜日、日47を通して続けられた
。
このレジタ(処方箋)は、この化合物の反応での酵素及び公告された結果が、化
学的刺激後、48時間で誘導されたとのことを見て、予見された。接種されたマ
ウスは、a)処理されないコントロール及びb)担体−注射(生理的食塩水)コ
ントロールと比較した。
2、I
β−アレチンは、10pgβ−アレチン/kgマウスから100μg/kgマウ
スの濃度範囲にわたり、BALBc/JマウスのN5−1黒腫の開始を予防する
に効果的である。処置なしでは、実験の75%のマウスは、腫瘍の発展の結果と
して、静死或いは死亡した。効果的閾値以下、[即ち、約xopg/kg以下或
いは約tug/kg、或いはlng/kg(データが示していない)のβ−アレ
チン投与量では、1/3から273の動物が究極的に腫瘍を起こした。最大投与
量(即ち、約10μg/kg以上或いは約10μg/kg或いはlng/kg)
の近い投与量では、1つだけのマウスは触診できる腫瘍があった、そしれ、20
日耐えて、徐々に復帰した。
第5〜7図は、非−隠、の骨髄腫細胞(MS−1)で接種され、種々の投与量(
正常体重ゲインに対する関連しないマウスの体重に基づいて)で、低減する濃度
(各々、100μg、1077g及び1opg/kg)でβ−アレチンで処理さ
れたマウスでの早期及び遅い腫瘍発現を示す。第7図において、中心のパイシャ
チック曲線は、早期及び後期の腫瘍発現を示し、このβ−アレチンの投与量(1
0pg/kg)では、2つの死亡に相当し、モデル(第10図)でのこの化合物
での治療的最小の閾値である。正常のマイス体重ゲインは、100μg/kg(
第5図)で少し抑制されるが、10μg/kg(第6図)では顕著でない。lO
μg/kg(第6図)では、1とのマウスが、触診腫瘍を発現し、20日間耐え
たが、最終的に復帰した。抗折形成化合物β−アレチンの効果的投与量(約10
pg/kg体重から約10μg/kg体重)では、マウスの重量について(腫瘍
程度を反射して)、処置なしのコントロール群(ビーヘクル注射コントロール群
)と、処置された群を比較すると、大きな差がある。
N5−1黒腫瘍の処置においてβ−アレチン効果性を、更に、IF5図に示す。
それは、研究を3次元的に示すものである。そして、第9図においては、第8図
の提示図を時計回りで85°回転させたものであり、フロントの薬剤の高い投与
量からバックでの薬剤投与なしまでのものである。腫瘍接種のコントロール(最
も左側、第8図)で、腫瘍を得て、従って1、研究日(Y軸)に関して大きい点
で、重量(Z軸)を示す。β−アレチンの高い投与量のマウス(最も左側)は、
はとんど正常なもので、慢性腫瘍の記を示さない。高さでの峰或いは増加は、低
い濃度で(X軸で右側)腫瘍発現を示し、それは、発現腫瘍の形態のためのコー
ドされ(Ta=腹水症とTs=固い腫瘍)、そして、腹水症或いは固い腫瘍(各
々Ta或いはTs)から得られた死亡のためである。
完全な復帰は、腫瘍が最早触診できない点でRにより示される。
コントロール群のマウスの最初の重量に対して正規化され、プロットされ(第5
〜7図に示すように分析される)、コントロールマウス(生理的食塩水のみ注射
される)は、正常な成長を示し、マウス受腫瘍の成長と発現になり、10μgβ
−アレチン/kgマウス(第6と8図)を示す。これは、tIilO図に更に示
され、腫瘍がβ−アレチンの異なる濃度でモジュレイトされる。正常な成長曲線
からの離れは、触診される腫瘍の出現と喪失と一致する。
腫瘍は、出現し、10μg/kgのβ−アレチン治療(第6図)を行なったマウ
スで、印或いは検査を示さないで、復帰した。促進されると期待されるが、処置
しないコントロールで出現する腫瘍は、腹水症となるが、β−アレチンで治療さ
れたマウスで出現する腫瘍は、固体マスがなく;β−アレチンは、腫瘍の凝集を
促進し、離れたマスにし、β−アレチンは、外科的切除を含む処置レジタにおい
て、価値があるものでできる。
実験の後期で腫瘍を出現する単一マウス(第8図でのX軸上の4で、10pgβ
−アレチン/kgマウスの処置の後、約40日で停止される)は、10077g
β−アレチン/kgマウスで処置され、後期の治療インターペンションの、骨髄
腫への効果を測定した(第10図)。腫瘍の多くのログフェイズ成長は、肩から
尻へ、マウスの右側に沿って持続し、そして、より高い投与量で処置を開始した
後、10〜14日間、腹で持続した。それは、腹腔外の組織中に腫瘍を進められ
、処置が効果的になる前に、相当のラグ7エイズとなる。次に、成長が停止し、
腫瘍マスとマウスの重量の急速な低減となる。そして、短い期間、倦怠があり、
マウスの粗いコートが改良された。これは、マウス重量の一時的な安定と一致し
く約1週間)、腫瘍はこの時の間、安定化したことを示唆している。これは、次
いで、マウス重量の他の沈降落下となり、腫瘍マスの低減が明らかである。触診
マスが腹に残っていたが、マウスは、重量が正常になったとき、静死した。マウ
スが静死した時、日当り約10%の体重に等価する膿瘍の過程からの静脈炎が、
手足に生じた。組織学的に明らかな壊死となった後、元の腫瘍の85〜90%が
、壊死したか、再吸収された。再吸収速度を考えると、治療が完全な月間に維持
されたならば、腫瘍の完全な喪失が生じた。
腫瘍の喪失と適するマウスでないことを、切除された死体の重量を測定すること
により、確認された。このマウスでは、処置されないコントロールと異なり、腫
瘍により器官への進出の証拠はなく、残りの腫瘍は、壊死しく黄色帯緑色で、粒
状で古いスポンジのような)だように見える。組織を解剖学的に検査すると、腹
壁に、皮下の組織及び礼房腺に隣接して、骨格筋肉中に腫瘍細胞かのこっている
ことを示す。肝、泌尿生殖器及び胃腸腫瘍及び他の多種の腫瘍は、処置されない
マウスで観察されたものと一致しており、N5−1細胞系統の浸透して半安定特
性を示しているが、処置されたマウスでは、残りの器官では腫瘍細胞を含んでい
ないことを示す。病理学的骨挫傷がこのマウスで観察されるが、この骨の骨髄中
では、腫瘍細胞は見られない。腫瘍が急速に成長するために脱変成された骨は、
カルシウムと燐酸を要する過程で、そして、次の燐酸カルシウムの急速な外骨格
析出は、腫瘍が再吸収されるにつれ、破損となることが試験的に決められた。
この研究及び他の研究に基づいて、集合的新形成(例えば、ステイジII或いは
」1記の腫瘍)の存在下で、少なくとも一義的な腫瘍をβ−アレチン治療と合わ
せて、外科的に切除すべきであり、β−アレチン治療の開始前或いは後まもなく
、切除すべきであると推奨される。更に、ある場合には、後期インターペンショ
ン治療に使用された約100μg/kgのβ−アレチンの初期投与量は、徐々に
低減され、再吸収過程を遅くし、生物が治療に調節されるようにすることが推奨
される。約100μg/kgから約1ng/kgへの投与量を、腫瘍が治療に反
応するにつれて、徐々に低減(48時間レジメで変えられる)することが示唆さ
れる。
第1図
数倍化レベル
第2図
H−3TdR保持CPM
Ig−PFC/百万細胞
第3図
H−3TdR保持CPM
Ig−PFC/百方細胞
第4図
コロニー/百方細胞
コロニー/百方細胞
第5図
第6図
FIG、6
第7図
研究日数
第8図
正規化重量
牙S9図
正規化重量
研究日数
要約書
β−アレチンを、生体内及び試験管内の双方で、細胞分化及び細胞に生活力を賦
与するに用いる。特別の適用には、免疫異常及び免疫病気の処理並びに新形成の
処置及び培養の促進におし)て、β−アレチンの使用を含むものである。
国際調査報告
Claims (15)
- 1.試験管内或いは生体内の細胞を、β−アレチン或いはその正理学的に適合す る塩に、細胞の機能或いは生体生産を正常化する或いは改良するに充分な量で、 接触させることを特徴とする細胞機能或いは生体生成性を正常化する方法。
- 2.前記細胞は、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞である請求項1に記載の方法。
- 3.前記細胞は、ビールスを含む病原体に感染されている請求項2に記載の方法 。
- 4.前記細胞は、免疫細胞或いは新形成細胞である請求項2に記載の方法。
- 5.前記細胞は、充分なβ−アレチンに接触させ、免疫学的な監査を正常化或い は改良することである請求項1に記載の方法。
- 6.前記細胞は、試験管内で少なくとも約10pgβ−アレチン/ml細胞培養 の量で、また、生体内で少なくとも約10pg、β−アレチン/生体kgの量で 、接触させる請求項1に記載の方法。
- 7.哺乳動物に対して、β−アレチン或いはその生理学的に適合する塩を、腫瘍 の重荷を減少し、種瘍の退行を誘導し、種瘍の成長或いは転移を抑制するに十分 な量、哺乳動物に接し、そして、選択的に、種瘍の削除と合わせて、行なうこと を特徴とするヒトを含む哺乳動物の新形成を処理する方法。
- 8.前記新形成は、血液リンパである請求項7に記載の方法。
- 9.哺乳動物に、β−アレチン或いはその生理的に適合性のある塩を、哺乳動物 中の免疫学的機能或いは生体生産性を改良或いは正常化するに十分な量、投与す ることを特徴とするヒトを含む哺乳動物の免疫病気或いは異常を処理する方法。
- 10.前記免疫病気或いは異常は、エイズ(AIDS)或いは不全ガンマグロブ リン血症である請求項9に記載の方法。
- 11.哺乳動物から免疫細胞を抽出し、試験管内の免疫細胞に、β−アレチンを 十分に接触せしめ、その疫機能或いは生体生産性を刺激し、更に、刺激された免 疫細胞を、複罹哺乳動物に再導入することを特徴とする請求項1に記載のヒトを 含む哺乳動物中の免疫細胞機能或いは生体生産性を改良或いは正常化する方法。
- 12.前記哺乳動物は、新形成にかかっており、免疫細胞を、更に免疫細胞を哺 乳動物に再導入する前に、新形成細胞に接触することにより、刺激する請求項1 1に記載の方法。
- 13.生体内或いは試験管内で老化細胞を、その老化の遅延に十分な量β−アレ チンに接触させることによる老化開始を遅らせる方法。
- 14.生体内或いは試験管内の生物の培養耐性細胞に、培養に順応化するに充分 な量のβ−アレチンに接触せしめることを特徴とする生物の培養耐性細胞を培養 に順応化させる方法。
- 15.生物細胞を更に少なくとも、その細胞の維持或いは成長或いはその両方を 促進する−因子に接触せしめることを特徴とする請求項1に記載の方法。
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