CH658668A5 - Procede pour la production de kallikreine humaine. - Google Patents

Procede pour la production de kallikreine humaine. Download PDF

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Hayashibara Biochem Lab
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Description

La présente invention concerne un procédé pour produire de la kallikréine humaine.
La kallikréine (EC 3.4.21.8) est constituée de plusieurs enzymes de sources différentes et de spécificités différentes ayant la propriété commune de libérer des peptides vasomoteurs (kinines) à partir de leurs précurseurs inactifs (kininogènes) dans le plasma.
Les actions pharmacologiques de la kallikréine, c'est-à-dire les actions vasodépressive et hypotonique, la rendent utile comme agent thérapeutique dans les maladies des organes circulatoires, par exemple l'artériosclérose cérébrale ou cardiaque ou l'hypertension; donc les besoins en kallikréine s'accroissent rapidement.
Il est bien connu qu'on obtient la kallikréine à partir d'organes de mammifères, tels que le foie ou le pancréas, ou de liquides de l'organisme de mammifères, tels que le sang, la salive ou l'urine.
Comme décrit dans des demandes de brevets, par exemples les demandes de brevets japonais publiées non examinées Nos 102 495/77 et 167 228/80, on a généralement produit à ce jour la kallikréine avec des organes de porc mais en quantité insuffisante pour satisfaire la demande.
Par suite de la réaction de type antigène-anticorps provoquée par la kallikréine lorsqu'on l'utilise en thérapeutique humaine, l'emploi de la kallikréine dérivant de cellules humaines vivantes est excellent et dépourvu de danger par suite de la moindre antigénicité.
Donc, on recherche un procédé peu coûteux pour produire à l'échelle industrielle de la kallikréine humaine. Comme le montre la description qui suit, l'invention satisfait à ce besoin.
L'invention a pour objets:
— un procédé efficace pour multiplier des cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine;
— un procédé pour produire de la kallikréine humaine de titre élevé avec les cellules humaines ainsi obtenues;
— un procédé pour obtenir des cellules hybrides capables de produire de la kallikréine humaine, présentant un taux de multiplication cellulaire et un taux de production de la kallikréine humaine extrêmement élevés, et
— un procédé pour accroître la production de kallikréine humaine par cellule.
De façon générale, on atteint ces objectifs ainsi que d'autres selon le procédé de l'invention qui comprend la multiplication de cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine, en transplantant lesdites cellules chez un animal à sang chaud autre que l'homme ou sinon en laissant lesdites cellules se multiplier dans une chambre de diffusion classique qui apporte auxdites cellules un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud autre que l'homme, et la production de la kallikréine humaine avec les cellules humaines multipliées par l'un ou l'autre des modes de multiplication in vivo ci-dessus.
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Plus particulièrement, les objectifs de l'invention ont été atteints selon le procédé qui comprend (1) la transplantation de cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine chez un animal à sang chaud autre que l'homme; l'alimentation de l'animal pour permettre aux cellules humaines d'utiliser un liquide nutritif de l'organisme fourni par l'animal pour leur multiplication; l'extraction et la désagrégation de la tumeur obtenue formée chez l'animal pour obtenir les cellules humaines multipliées; la culture in vitro des cellules humaines dans un milieu nutritif en présence ou non d'un inducteur de kallikréine pendant une période suffisante pour accumuler une quantité notable de kallikréine humaine; et la récolte de la kallikréine humaine accumulée à partir de la culture ou sinon: (2) la mise en place d'une suspension de cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine dans une chambre de diffusion de type classique qui fournit auxdites cellules humaines un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud autre que l'homme; l'inclusion ou la mise en place de la chambre dans ou sur l'animal à sang chaud autre que l'homme; l'alimentation de l'animal pour permettre aux cellules humaines d'utiliser un liquide nutritif de l'organisme fourni pour leur multiplication; la récolte des cellules humaines multipliées dans la chambre; la culture des cellules humaines in vitro dans un milieu nutritif en présence ou non d'un inducteur de kallikréine pendant une période suffisante pour accumuler une quantité notable de kallikréine humaine; et la récolte de la kallikréine humaine accumulée dans la culture.
Les modes de réalisation préférés de l'invention vont maintenant être décrits de façon détaillée.
L'invention repose sur la découverte que la production de kallikréine humaine avec des cellules humaines, obtenues par multiplication in vivo de cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine en utilisant un animal à sang chaud autre que l'homme, est extrêmement supérieure à celle que l'on obtient avec les cellules multipliées in vitro. L'invention fournit un procédé pour produire de la kallikréine humaine qui consiste à multiplier des cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine par transplantation desdites cellules chez un animal à sang chaud autre que l'homme ou sinon à laisser lesdites cellules se multiplier dans une chambre de diffusion de type classique qui fournit auxdites cellules un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud autre que l'homme et à produire la kallikréine humaine désirée avec les cellules humaines ainsi obtenues.
Contrairement aux procédés classiques utilisant une culture de tissu in vitro, le procédé réalisé in vivo ne nécessite pas ou bien moins de milieu nutritif contenant du sérum coûteux et rend bien plus facile l'entretien de la culture pendant la multiplication cellulaire et produit de plus une kallikréine humaine de titre bien supérieur.
Plus particulièrement, dans le procédé selon l'invention qui utilise comme hôte un animal à sang chaud autre que l'homme, on peut facilement multiplier certaines cellules humaines en utilisant un liquide nutritif de l'organisme fourni par l'animal en transplantant ces cellules chez l'animal ou sinon en les plaçant dans une chambre de diffusion de type classique conçue pour recevoir un liquide de l'organisme et en incluant ou plaçant la chambre dans ou sur l'animal et en alimentant l'animal de façon habituelle.
De plus, le procédé de l'invention se différencie des procédés classiques de multiplication cellulaire in vitro du fait qu'on peut obtenir des caractéristiques additionnelles, c'est-à-dire une multiplication cellulaire bien plus stabilisée et rapide, une production accrue des cellules et une production extrêmement plus élevée de kallikréine humaine par cellule.
Les cellules humaines utilisables dans l'invention sont celles qui produisent une quantité notable de kallikréine humaine et que l'on peut multiplier chez un animal à sang chaud autre que l'homme après les y avoir transplantées. On peut utiliser de façon favorable dans l'invention des cellules humaines normales de pancréas, de glandes salivaires, de foie, de rein, de vessie et des fibroblastes pulmonaires; des cellules obtenues par transformation des cellules humaines normales par emploi d'un virus carcinogène ou de radiations; des cellules tumorales humaines de cancer du pancréas, de tumeur des glandes salivaires, de cancer du foie, de cancer du rein et de cancer de la vessie; et des lignées cellulaires établies des cellules 5 humaines ci-dessus.
Au lieu de l'emploi des cellules humaines décrites ci-dessus, l'emploi d'une lignée lymphoblastoïde humaine, qu'il est bien plus facile de soumettre à des repiquages et dans laquelle on peut introduire un ou plusieurs gènes humains codant pour la production de la io kallikréine par fusion cellulaire en utilisant du polyéthylèneglycol ou le virus Sendaï ou par des techniques de recombinaison génétique par emploi de nucléase, de ligase et d'ADN-polymérase, conduit à un accroissement extrême de la vitesse de multiplication cellulaire et/ou de la production de kallikréine humaine par cellule qui sont 15 environ deux à dix fois supérieures à ce qu'on obtient lorsqu'on emploie les cellules normales ou tumorales décrites ci-dessus.
La transplantation d'une telle lignée lymphoblastoïde humaine à l'animal tend à former une ou plusieurs tumeurs massives qui sont très peu contaminées par les cellules de l'animal hôte. De plus, leur 20 désagrégation après l'extraction est très facile car la récolte des cellules humaines vivantes peut être facilement effectuée.
Des lignées lymphoblastoïdes humaines provenant de leucémies ou de lymphomes humains, telles que les lignées Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 et JBL sont particulièrement appropriées à ces 25 objectifs.
L'animal à sang chaud autre que l'homme que l'on peut utiliser dans l'invention peut être un de ceux chez qui les cellules humaines peuvent être multipliées: par exemple des oiseaux tels que le poulet et le pigeon; ou des mammifères tels que le chien, le chat, le singe, la 30 chèvre, le porc, le cheval, le lapin, la vache, le cobaye, le rat, le rat nu, le hamster, la souris ou la souris nue.
Comme la transplantation de ces cellules humaines à l'animal déclenche une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal à sang chaud autre que l'homme à l'âge le plus précoce possible, par 35 exemple à l'état d'oeuf, d'embryon, de fœtus, d'animal nouveau-né ou d'animal très jeune est souhaitable pour réduire autant que possible la réaction immunitaire.
Avant la transplantation, on peut de plus traiter un tel animal par irradiation avec des rayons X ou des rayons y à raison d'environ 40 200 à 600 rems ou injecter un antisérum ou un immunosuppresseur pour réduire la réaction immunitaire au niveau le plus bas possible.
L'emploi d'un animal de laboratoire présentant un déficit immunitaire, tel que la souris nue ou le rat nu, comme animal hôte, produit une réaction immunitaire moins indésirable même lorsque 45 l'animal est adulte et on peut facilement transplanter à l'animal l'un quelconque des types de cellules humaines décrites ci-dessus sans effectuer un tel prétraitement et les cellules s'y multiplient rapidement en risquant moins de provoquer la réaction immunitaire.
On peut obtenir à la fois une stabilisation de la multiplication 50 cellulaire et une augmentation de la production de kallikréine humaine et une augmentation delà production de kallikréine humaine par transplantation répétée en utilisant une combinaison d'animaux à sang chaud autres que l'homme différents. Par exemple, on peut atteindre les deux objectifs en transplantant tout d'abord les 55 cellules humaines chez le hamster et en les y multipliant puis en retransplantant les cellules humaines multipliées chez la souris nue. Dans ce cas, la transplantation répétée peut être effectuée avec des animaux à sang chaud autres que l'homme appartenant à la même classe ou au même ordre ou appartenant à la même espèce ou au 60 même genre.
Comme site de transplantation des cellules humaines chez l'animal, on peut choisir un site quelconque tant que les cellules s'y multiplient: on peut par exemple utiliser la cavité allantoïdienne ou effectuer la transplantation par voie intraveineuse, intrapéritonéale 65 ou sous-cutanée.
Au lieu de transplanter les cellules humaines chez l'animal, on peut multiplier facilement l'un quelconque des types de cellules humaines précédemment décrits en les plaçant dans une chambre de
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diffusion de type classique de formes et de tailles diverses munie par exemple d'une membrane filtrante, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant une taille nominale des pores d'environ 10~7 à 10-5 m, empêchant la contamination de la chambre par les cellules de l'animal mais alimentant les cellules humaines en liquide nutritif de l'organisme; en effectuant l'inclusion par exemple intrapéritonéale de la chambre chez l'animal et en laissant les cellules humaines s'y multiplier en utilisant le liquide nutritif de l'organisme fourni par l'animal.
De plus, la chambre de diffusion conçue à cet effet peut être placée sur l'animal pour que le liquide nutritif de l'organisme et la solution nutritive dans la chambre puissent circuler librement à travers la chambre. De la sorte, on peut observer la culture dans la chambre pendant la multiplication cellulaire à travers une ou plusieurs fenêtres latérales transparentes disposées sur une ou plusieurs parois de la chambre et/ou remplacer continuellement la chambre par une chambre neuve pour poursuivre la multiplication cellulaire pendant la durée de la vie de l'animal sans le sacrifier et augmenter considérablement la production de cellules par animal.
Comme l'emploi d'une telle chambre de diffusion réduit la réaction immunitaire indésirable par suite de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et les cellules de l'animal, on peut facilement utiliser comme hôte un animal à sang chaud autre que l'homme quelconque sans prétraitement et on peut en recueillir facilement les cellules humaines vivantes multipliées.
On peut facilement alimenter l'animal de façon habituelle et aucun soin particulier n'est nécessaire, même après la transplantation.
La période requise pour obtenir la multiplication cellularie maximale est généralement de 1 à 20 semaines. Lorsque les cellules humaines sont des cellules tumorales ou lymphoblastoïdes, on peut généralement obtenir la multiplication cellulaire maximale en environ 1 à 5 semaines. Le nombre des cellules humaines ainsi obtenues peut être d'environ 107 à 1012 ou plus par animal. Selon l'invention, la production des cellules humaines transplantées est accrue d'environ 102 à 107 fois ou plus, ce qui est supérieur d'environ 10 à 10e fois ce qu'on obtient selon un procédé de multiplication in vitro utilisant un milieu nutritif. Donc, les cellules humaines multipliées peuvent être utilisées de façon favorable pour la production de kallikréine humaine.
On peut réguler la reproduction des cellules humaines multipliées en les soumettant à une culture tissulaire in vitro de 1 à 4 jours avant le stade d'induction décrit ci-après.
On peut employer dans l'invention un procédé quelconque induisant les cellules humaines multipliées à produire la kallikréine humaine. Par exemple, les cellules humaines multipliées obtenues par récolte à partir d'une suspension dans l'ascite ou d'une extraction et d'une désagrégation d'une ou plusieurs tumeurs massives, formées par exemple sous la peau, sont mises en suspension dans un milieu nutritif préchauffé à une température comprise dans la gamme d'environ 20 à 40: C pour obtenir une densité cellulaire d'environ 104 à 108 cellules par millilitre et incubées pour obtenir la kallikréine humaine. Dans ce cas, on peut exposer les cellules humaines à l'action d'un inducteur de la kallikréine pour accroître encore la production de kallikréine. L'inducteur de kallikréine utilisable dans l'invention peut être constitué d'un ou plusieurs de ceux qui induisent la production de kallikréine humaine dans les cellules humaines obtenues par multiplication de cellules humaines par emploi d'un animal à sang chaud autre que l'homme. Par exemple on peut utiliser comme inducteur de la kallikréine des amino-acides tels que la glycine ou la phénylalanine, des protéines telles que la caséine, des saccharides tels que le glucose, l'inositol, le ribose ou de désoxyri-bose ou une hormone telle que l'adrénaline.
La stabilisation de la kallikréine humaine dans la culture et l'accroissement de la production de la kallikréine humaine peuvent être obtenus par addition à la culture d'un stabilisant de la kallikréine ou d'un stimulateur de la kallikréine tel que la trypsine (EC 3.4.21.4) ou d'un alcaloïde.
La kallikréine humaine peut être facilement récoltée dans la culture selon des procédés de purification et de séparation qui utilisent des techniques classiques, par exemple la concentration, le relargage, la dialyse, la filtration, la centrifugation et/ou la lyophilisation. 5 Si une préparation de kallikréine humaine plus purifiée est souhaitable, on peut obtenir une préparation ayant la pureté maximale possible par emploi des techniques décrites ci-dessus en combinaison avec d'autres techniques classiques, par exemple l'absorption et la dé-sorption avec un échangeur d'ions, la filtration sur gel, l'électropho-îo rése, la Chromatographie d'affinité et/ou le fractionnement au point isoélectrique.
La présente kallikréine humaine est identique sur le plan immu-nologique à celle provenant de l'urine humaine et elle ne contient ni pyrogène ni virus de l'hépatite: on peut donc l'utiliser de façon 15 avantageuse isolément ou en combinaison avec un ou plusieurs agents tels qu'une hormone stéroïdienne, un anticoagulant ou un agent carcinostatique pour l'administration interne ou pour l'injection pour la prévention ou le traitement de maladies humaines.
Dans toute la présente description, les titres de la kallikréine 20 humaine ont été déterminés selon la méthode de dosage biologique indiquée par Moriya et coll., Journal of Biochemistry, vol. 58,
page 201 (1965) avec une légère modification et ils sont exprimés en unités biologique (UK) déterminées par mesure de l'abaissement de pression sanguine chez un chien après administration de la kalli-25 kréine humaine.
Plusieurs modes de réalisation de l'invention vont être décrits sans que la portée de l'invention soit limitée de quelconque façon.
Exemple 1 :
30 On transplante par voie sous-cutanée à des souris nues adultes une lignée de cellules humaines de cancer du pancréas, COLO 357, et on les alimente de façon habituelle pendant 4 semaines.
Cette transplantation de cellules et l'alimentation ultérieure des animaux provoquent la formation sous-cutanée de tumeurs massives 35 pesant chacune environ 10 g que l'on extrait, fragmente et désagrège par mise en suspension dans une solution salée physiologique contenant de la trypsine.
Ensuite on lave les cellules humaines avec du milieu 199 de Earle (pH 7,2) additionné de 10% v/v de sérum fœtal de veau et on met en 40 suspension dans du milieu frais ayant la même composition et contenant de plus environ 1 mg/ml de caséine, pour obtenir une densité cellulaire d'environ 1 x 10s cellules par millilitre puis on incube la culture pendant 10 jours à 37 C pour provoquer la production de kallikréine humaine.
45 Ensuite, on soumet la culture obtenue à un traitement par les ultrasons et on détermine le titre en kallikréine humaine du surnageant.
La production de kallikréine humaine est d'environ 600 UK par ml de culture.
se On réalise le témoin de la façon suivante: On cultive des cellules humaines de cancer du pancréas de la lignée COLO 357 in vitro dans du milieu 199 de Parker (pH 7,2) additionné de 10% v/v de sérum fœtal de veau et on soumet les cellules humaines multipliées à une induction semblable à celle ci-dessus. La production de kalli-55 kréine humaine n'est que de 20 UK par ml de culture.
Exemple 2:
On met ensemble en suspension des cellules de la lignée humaine de cancer du pancréas COLO 357 et d'une lignée lymphoblastoïde se humaine Namalvva dans un récipient avec une solution salée de 140 mM en NaCl, 54 mM en KCl, 1 mM en NaH2P04 et 2 mM en CaCl2, pour obtenir des densités cellulaires respectives d'environ 103 cellules/ml. A la suspension cellulaire on ajoute, en refroidissant par la glace, une solution salée fraîche ayant la même composition et 65 contenant de plus du virus Sendaï préalablement inactivé par irradiation par les ultraviolets. Environ 5 minutes après l'addition, on transfère le mélange dans un incubateur à 37: C et on l'y agite pendant environ 30 minutes pour effectuer la fusion cellulaire et in
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troduire la capacité de production de la kallikréine humaine de la lignée humaine de cellules de cancer du pancréas dans la lignée humaine de cellules lymphoblastoïdes.
On transplante par voie intrapéritonéale les cellules hybrides obtenues à des souris nues adultes que l'on alimente de façon habituelle pendant 5 semaines.
Après extraction des tumeurs massives obtenues pesant chacune environ 15 g, on soumet la suspension de cellules à une induction de la production de kallikréine humaine comme dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on remplace la caséine par 0,1% p/v de phénylalanine et 0,1% p/v de glucose.
La production de kallikréine humaine est d'environ 1500 UK par ml de culture.
Le témoin, pour lequel on cultive les cellules humaines hybrides in vitro pour leur multiplication puis traitées comme dans l'exemple 1 pour produire de la kallikréine humaine, ne fournit qu'environ 100 UK de kallikréine humaine/ml de culture.
Exemple 3:
On met en suspension des cellules humaines de tumeur rénale que l'on a obtenues par extraction de tissu de tumeur rénale d'un patient, fragmentation et désagrégation, et des cellules de la lignée lymphoblastoïde humaine BALL-1 dans un récipient avec une solution salée 140 mM en NaCl, 54 mM en KCl, 1 mM en NaH2P04 et 2 mM en CaCl2, pour obtenir des densités cellulaires respectives d'environ 103 cellules par millilitre. On ajoute à la suspension cellulaire, en refroidissant par de la glace, une solution salée fraîche ayant la même composition et contenant de plus du virus Sendaï préalablement inactivé par irradiation par les ultraviolets. On transfère ensuite le mélange dans un incubateur à 37°C environ 5 minutes après l'addition, et on l'y agite pendant environ 30 minutes pour effectuer la fusion cellulaire et introduire la capacité de production de la kallikréine humaine des cellules humaines de tumeur rénale dans les cellules de la lignée lymphoblastoïde.
Après injection d'un antisérum préparé de façon habituelle chez le lapin à des hamsters nouveau-nés pour réduire leur réaction immunitaire, on transplante les cellules hybrides par voie sous-cutanée à ces animaux que l'on alimente de façon habituelle pendant 3 semaines.
On traite comme dans l'exemple 1, pour induire la production de kallikréine humaine, la suspension cellulaire obtenue à partir des tumeurs massives formées sous la peau et pesant chacune environ 10 g.
La production de kallikréine humaine est d'environ 2100 UK/ml de culture.
Le témoin, pour lequel on cultive les cellules BALL-1 hybridées in vitro comme dans l'exemple 1 pour les multiplier, puis qu'on traite comme dans l'exemple 1 pour produire la kallikréine humaine, ne fournit qu'environ 200 UK de kallikréine humaine/ml de culture.
Exemple 4:
On transplante par voie intraveineuse à des rats nouveau-nés des cellules d'une lignée lymphoblastoïde humaine Namalwa hybridées dans lesquelles on a introduit la capacité de production de la kallikréine humaine comme dans l'exemple 2 et on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines.
Après extraction des tumeurs massives obtenues, pesant chacune 5 environ 40 g, on traite la suspension cellulaire comme dans l'exemple 2 pour induire la production de kallikréine humaine.
La production de kallikréine humaine est d'environ 1400 UK/ml de culture.
io Exemple 5:
Après avoir irradié des souris adultes avec des rayons X à une dose d'environ 400 rems pour réduire leurs réactions immunitaires, on transplante par voie sous-cutanée aux animaux des cellules de la lignée humaine cancéreuse COLO 357 et on les alimente de façon 15 habituelle pendant 4 semaines.
On extrait les tumeurs massives obtenues formées sous la peau pesant chacune environ 15 g et on les traite comme dans l'exemple 1 pour induire la production de kallikréine humaine.
La production de kallikréine humaine est d'environ 900 UK/ml 20 de culture.
Exemple 6:
On met en suspension des cellules de la lignée lymphoblastoïde 25 humaine BALL-1 hybridées, dans lesquelles on a introduit la capacité de produire la kallikréine humaine de la même façon que dans l'exemple 3, dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique ayant un volume intérieur d'environ 10 ml munie d'une membrane filtrante ayant une taille nominale des pores d'environ 30 0,5 |im avec une solution salée physiologique et on place la chambre dans le péritoine d'un rat adulte. Ensuite on alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines et on retire la chambre.
La densité des cellules humaines dans la chambre est d'environ 2 x 10® cellules/ml ce qui est supérieur d'environ 103 fois ce qu'on 35 obtient selon une méthode de culture tissulaire in vitro avec un incubateur à C02.
On traite ensuite les cellules humaines comme dans l'exemple 2 pour induire la production de kallikréine humaine.
La production de kallikréine humaine est d'environ 1800 UK/ml 40 de culture.
Exemple 7:
On transplante dans les cavités allantoïdiennes d'œufs embryon-nés que l'on a préincubés pendant 5 jours à 37° C des cellules de la 45 lignée lymphoblastoïde humaine BALL-1 hybridées dans lesquelles on a introduit la capacité de produire la kallikréine humaine comme dans l'exemple 3 et on incube les œufs à cette température pendant environ 1 semaine.
On recueille les cellules humaines dans les œufs et on les traite 50 comme dans l'exemple 2 pour induire la production de kallikréine humaine.
La production de kallikréine humaine est d'environ 1200 UK/ml de culture.
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Claims (9)

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  1. (1) transplanter des cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine chez un animal à sang chaud autre que l'homme;
    alimenter l'animal pour permettre aux cellules humaines d'utiliser un liquide nutritif de l'organisme de l'animal pour leur multiplication;
    extraire et désagréger la tumeur obtenue formée chez l'animal pour obtenir les cellules humaines multipliées;
    cultiver les cellules humaines dans un milieu nutritif in vitro en présence ou non d'un inducteur de kallikréine pendant une période suffisante pour accumuler une quantité notable de kallikréine humaine, et recueillir la kallikréine humaine accumulée à partir de la culture, ou sinon,
    (1) transplanter des cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine chez un animal à sang chaud autre que l'homme;
    laisser les cellules humaines utiliser un liquide nutritif de l'organisme de l'animal pour leur multiplication, et laisser les cellules humaines multipliées libérer la kallikréine humaine, ou sinon,
    1. Procédé pour produire la kallikréine humaine, caractérisé en ce qu'il comprend les stades qui consistent à:
  2. (2) placer une suspension de cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine dans une chambre de diffusion de type classique pour alimenter lesdites cellules humaines en un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud autre que l'homme;
    inclure ou placer la chambre dans ou sur un animal à sang chaud autre que l'homme;
    alimenter l'animal pour permettre aux cellules humaines d'utiliser le liquide de l'organisme pour leur multiplication;
    recueillir les cellules humaines multipliées à partir de la chambre; cultiver les cellules humaines dans un milieu nutritif in vitro en présence ou non d'un inducteur de kallikréine pendant une période suffisante pour accumuler une quantité notable de kallikréine humaine, et recueillir la kallikréine humaine accumulée à partir de la culture.
    2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les stades consistant à:
    (2) placer des cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine dans un dispositif leur fournissant un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud autre que l'homme;
    inclure ou placer le dispositif dans ou sur l'animal;
    laisser les cellules humaines utiliser le liquide nutritif de l'organisme pour leur multiplication, et laisser les cellules humaines multipliées libérer la kallikréine humaine.
    2
    REVENDICATIONS
  3. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules humaines capables de produire la kallikréine humaine sont des cellules humaines normales choisies parmi le groupe constitué par les cellules humaines de pancréas, les cellules humaines de glandes salivaires, les cellules humaines de foie, les cellules humaines de rein, les cellules humaines de la vessie et les fibroblastes pulmonaires.
  4. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules humaines sont des cellules humaines tumorales choisies parmi le groupe constitué par les cellules humaines de cancer du pancréas, les cellules humaines de cancer des glandes salivaires, les cellules humaines de cancer du foie, les cellules humaines de cancer du rein, les cellules humaines de cancer de la vessie et celles obtenues par transformation des cellules humaines décrites dans la revendication 3.
  5. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules humaines sont des cellules humaines hybrides dans lesquelles on a introduit la capacité de produire la kallikréine humaine.
  6. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules humaines sont des cellules d'une lignée lymphoblastoïde humaine hybridées avec l'une quelconque des cellules humaines décrites dans les revendications 3 et 4 pour introduire la capacité de production de la kallikréine humaine des secondes dans les premières.
  7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite lignée lymphoblastoïde humaine fait partie du groupe constitué par les lignées Namalvva, BALL-1, NALL-1, TALL-1 et JBL.
  8. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit animal à sang chaud autre que l'homme est un mammifère ou un oiseau.
  9. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit inducteur de kallikréine est un ou plusieurs éléments du groupe constitué par les amino-acides, les protéines, les sucres et les hormones.
CH376/83A 1982-01-25 1983-01-24 Procede pour la production de kallikreine humaine. CH658668A5 (fr)

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