JPS58126786A - ヒトカリクレインの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトカリクレインの製造方法に関する。

カリクレイン（ＥＣａ４．２Ｌ８）は、血漿中のキニノ
ーゲンから活性ペグチドであるキニンを生成する酵素で
、血管拡張作用、血圧降下作用などの条理作用を示すこ
とから、脳血管障害、冠動脈性心臓疾患、高血圧症など
循環器系疾患の治療剤として広く利用されるようになり
、その需要は急増している。

カリクレインは、補乳動物の膵臓、肝臓、唾液腺などの
臓器、血液、尿などの体液から製造できることが知られ
ている。

しかしながら、例えば、特開昭５２−１０２４９５号公
報、特開昭５５−１６７２２８号公報などにも見られる
ように、従来は主として豚由来の臓器から製造されてい
るだけであり、その生産緻も不充分であった。

ｔｉ、ヒトの治療に供するには、ヒトの生細胞由来であ
ることが抗原抗体反応の懸念もなく、治療上安全であり
、優れている。

本発明者は、ヒトカリクレインを大量安価に供給しつる
製造方法を鋭意検討した５、 その結果、ヒトカリクレイン産生能を有するヒト由来の
細胞をヒト以外の温血動物を利用して増殖させて得た細
胞は、インビトロでの組織培養で得られる細胞よりもヒ
トカリクレイン産生が著しく高いことを見いだし１本発
明を児成した。

すなわち１本発明は、ヒトカリクレイン産生能を有する
ヒト由来の細胞をヒト以外の温血動物体内に移植、″ま
たはその温血動物の体液が、供、給を受けながら増殖さ
せ、得られる細胞からヒトカリクレインを産生させるこ
とを特徴とするヒトカリクレインの製造方法に関するも
のである。

本発明の方法は、従来のインビトロで組織培養する場合
と比較して、大量のヒトカリクレインを生成できるだけ
でなく、高価な血清などを含む栄養培地が不要、または
大幅に節約でき、更に細胞増殖中の維持管理も極めて容
易である。すなわち、ヒトカリクレイン産生能を有する
ヒト由来細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、また
はその動物の体液の供給を受けることのできるチャンバ
ーに収容し、通常の飼育をすれば、温血動物体から供給
される栄養物を含有する体ｇ−を利用してその細胞が容
易に増殖しつるのである。更に、インビトロで組織培養
する場合と比較して、細胞の増殖が安定していること、
その増殖速度が大きいこと、大量の細胞が得られること
、更には細胞当りのヒトカリクレイン産生量が大きいこ
とが特徴である３本発明で使用するヒト由来の細胞は、
ヒトカリクレイン産生能を有し、かつヒト以外の温血動
物の体内に移植して容易に増殖するものであればよい。

例えば、ヒト膵臓細胞、ヒト唾液腺細胞、ヒト肝臓細胞
、ヒト腎臓細胞、ヒト肺線維芽細胞またはこれを各種ウ
ィルスや放射線などで腫瘍化させた細胞、或いは、ヒト
膵癌細胞、ヒト唾液腺腫細胞、ヒト肝癌細胞、ヒト胃癌
細胞、ヒト膀胱癌細胞、更には、これら細胞を培養株化
させたもの々どが好適である。

また、これら細胞のヒトカリクレイン産生能を持つ遺伝
子を例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウィル
スなどを利用する細胞融合の手段や、ｐＮＡリガーゼ、
制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼなどの
酵素全利用する遺伝子組み換えの手段などによって、よ
り容易に継代培養しうる培養株化されたヒトリンパ芽球
様細胞に導入して使用することは、その増殖速度が大き
いだけでなく、ａ胞当りのヒトカリクレイン産生能が約
２〜ＩＯ倍、−！たはそれ以上にも高まるので特に好都
合である。

ま之、培養株化されたヒトリンパ芽球様細胞を利用すれ
ば、ヒト以外の温血動物に移植する際、その宿主動物の
細胞と混りにくい軟腫瘤を形成し易く、摘出後の分散も
容易なので、ヒトリンパ芽球様生細胞だけを採取するの
にきわめて有利である。

このようなヒトリンパ芽球様細胞には、ヒト白血病もし
くはヒト悪性リンパ腫由来の細胞株が適しており、例え
ばナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ　）細胞、ＢＡＬＬ−１細
胞、ＮＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＪＢＬ細胞
などの公知ヒト由来細胞株が、特に有利に使用しうる。

本発明のヒトカリクレインの製造方法に使用する温血動
物は、ヒトカリクレイン産生能を有するヒト由来の細胞
が増殖しうるものであればよく。

例えば、ニワトリ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル
、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラッ
ト、ハムスター、普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳
類などが使用できる。

これら動物にヒト由来の細胞を移植すると、好ましくな
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
だけおさえるために、使用する動物は、できるだけ幼若
な状態、すなわち卵、胚、胎児、または新生期、幼少期
のものの方が好ましい。

また、これら動物に例えば、約２００〜６００レムのエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処置をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。使用する動
物がヌードマウスの場合には、成長したものであっても
免疫反応が弱いので、これらの前処置を必要とすること
なく、培養株化されたヒト由来の細胞が移植でき、急速
に増殖できるので特に好都合である。

また、ヒト由来の細胞を、例えば先ずノ・ムスターに移
植し増殖させた後、この細胞を更にヌードマウスに移植
するなどのように、ヒト以外の温血動物間で移植して、
ヒト由来の細胞の増殖ヲより安定化したり、更にそれら
から生成されるヒトカリクレイン量を増加させることも
自由である、この場合、同種間、同属間は勿論のこと同
綱間、同間開移植であ−りてもよい。

ヒト由来の細胞を移植する動物体内の部位は、移植した
細胞が増殖し得る部位であればよく１例えば尿液腔、静
脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。

また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例え
ば孔径約ｌ０−７〜１０−”ｍを有するメン７’う７フ
イルター、限外濾過膜″またはホローファイバーなどを
設けた公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物
体内、例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を
含む体液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で公知の
培養株化されたヒト由来の細胞を何れも増殖させること
ができる。

また、必要に応じて、この拡散チャンバー内の栄養物を
含む体液を動物体内のそれと接続し潅流させるようにし
た拡散チャンバーを、例えば動物体表に取付け、拡散チ
ャンバー内のヒト由来の細胞の増殖状態を透視できるよ
うにすることも、また、この拡散チャンバ一部分のみを
着脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命一杯細
胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量を更に高め
ることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特徴
金有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育を続
ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは何ら必要
としないので好都合である。ヒト由来の細胞を増殖させ
るための期間は通常１〜２０週である。移植する培養株
化された細胞が腫瘍細胞でおるかりンバ芽球様細胞であ
る場合には、その増殖速度が特に大であり、通常１〜５
週の期間で目的を達成することができる。このようにし
て得られるヒト出来の細胞数は、動物個体当り約１０’
〜１０１２、またはそれ以上に達することも見い出した
。

換言すれば、本発明で使用するヒト２力、リフレインの
製造方法により増殖させたヒト由来の細胞数は、動物個
体当り移植した細胞数の約１０〜１０倍、またはそれ以
上にも達し、インビトロで栄養培地に接種して増殖させ
る場合の約１０〜１０倍、またはそれ以上にも達して、
ヒトカリクレインの製造にはきわめて好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来の生細胞からヒトカ
リクレインを産生させる方法は自由である。

例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の細
胞を採取し、または皮下で増殖した腫瘤を摘出し、分散
させた後採取し、この細胞を約２０〜４０℃に保った栄
養培地に細胞濃度が約１０〜１０／−になるように浮遊
させてヒトカリクレインを産生させればよい。この際、
必要ならばカリクレイン誘導剤を作用させてもよい。カ
リクレイン誘導剤は５温血動物を利用して増殖させて得
られるヒト由来細胞からヒトカリクレインを誘導生成で
きる物質であれば何でもよく１例えば、グリシン、フェ
ニルアラニンなどのアミノ酸類、カゼインなどの蛋白質
、グルコース、イノシトール、リボース、デオキシリボ
ースなどの糖類、アドレナリンなどのホルモン類などか
ら適宜利用することができる。また必要に応じて、ヒト
カリクレイン産生の際に、カリクレイン安定化剤を添加
し、生成したヒトカリクレインの安定化を計ることも、
トリプシン（ＥＣａ４２Ｌ４）や各種アルカロイドなど
のカリクレイン増収剤を添加して更にヒトカリクレイン
の収量を高めることも自由である。

このようにして産生されたヒトカリクレインは。

公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分
離、濃縮、凍結乾燥などを行なうことによって容易に精
製分離し、採取することができる。

更に、高度の精製を必要とする場合には、例えば、イオ
ン交換体への吸着−脱着、ゲル濾過およびアフィニティ
クロマトグラフィー、等電点分画、電気泳動などの公知
の方法を更に組み合わせればよく、最高純度のヒトカリ
クレインを採取することも可能である。

本発明により製造したヒトかりフレインは、従来公知の
人尿より採取したヒトカリクレインと免疫学的に差異が
ないことはもとより、発熱性物質や肝炎ウィルスの混入
もない。従って、ヒトカリクレイン単独で、またはこれ
にステロイドホルモン、抗凝固薬、抗癌剤などその他の
一種もしくは二種以上の物質を含有せしめ、内服薬、注
射薬などとしてヒ゛ト疾病の予防や治療に有利に利用で
きる。

なお明細書を通じてヒトカリクレインの力価は、９屋ら
の方法（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ、　
５８　、２０１　（１９６５年））に準じて、犬の血圧
低下を測定する生物的カリクレイン単位（ＫＵ）で示し
た。

以下２〜８の実施例で本発明を説明する。

実施例　Ｌ 成長したヌードマウスの皮下に、培養株化されたヒト膵
臓腫細胞Ｃ０ＬＯ８５７を移植した後、通常の方法で４
週間飼育した。皮下に生じた腫瘤約１Ｏｆを摘出して細
切した後、トリプシン含有生理食塩水に懸濁した細胞を
分散させた。

この細胞を、牛胎児血清１０Ｖ／Ｖ％を補足したＥａｒ
ｌｅ　１９９培地（ｐＨ’乙２）で洗浄した後、カゼイ
ンを濃度約１■／ｒｎｅ存在せしめた同培地に細胞濃度
約Ｉ　Ｘ　１０５／ｄになるように浮遊させ、３７℃で
１０日間保ってヒトカリクレインを生成させた。

その後、細胞を超音波処理して得られる上清中のカリク
レイン力価を測定したところ、浮遊液−当す約６００に
、Ｕのカリクレイン産生量であった。

これに対して、同じ腫瘍細胞を牛胎児血清１０ｖ／ｖ％
’に補足したｐａｒｋｅｒｓ　１９９培地（ｐＨ’Ｚ２
）、８７℃でインビトロにて組織培養して得た対照の細
胞を用いて前記同様にヒトカリクレインを生成させたと
ころ、そのカリクレイン産生量は。

浮遊液−当り僅か２０　ＫＵに過ぎなかった。

実施例　２ 実施例１で使用したものと同じ培養株化されたヒト腫瘍
細胞とリンパ芽球様ナマルバ細胞（Ｎａｍａｌｖａ　ｃ
ｅｌｌ　）とｔ”　１４０ｍＭ　Ｎａｃｌ　、　５４　
ｍＭ　ＫＣＩ。

１　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ　ＣａＣｌ２　ｆ含
有ｊる塩類溶液にそれぞれ約１０３／−になるように浮
遊させ、これに予め紫外線で不活化したセンダイウィル
スを含有する前記塩類溶液を、水冷下で混合し約５分径
１ｃ１７℃恒温水槽に移して、約８０分間攪拌しつつ細
胞融合を起させ、リンノ（芽球様ナマルバ細胞にヒトカ
リクレイン産生能を導入した。

このリンパ芽球様ナマルバ細胞を成長したヌードマウス
の腹腔内に移植した後、通常の方法で５週間飼育した。

生じた腫瘤約１５ｒ　’ｉ摘出し、次いで、カゼインの
代りにフェニルアラニンαＩＷ／Ｖ％およびグルコース
をα１　ｗ　／　ｖ　％添加したこと以外は実施例１と
同様にしてヒトカリクレインを生成させた。浮遊液−当
りのカリクレイン産生量は約１．８００ＫＵであった。

対照として細胞融合させたリンパ芽球様ナマルバ細胞を
実施例１と同様にインビトロで組織培養しヒトカリクレ
インを生成させたところ、そのカリクレイン産生量は、
浮遊液−当り僅かＺｏｏ　ＫＵにすぎなかった。

実施例　ａ 腎腫瘍患者から摘出、細切１分散させて得たヒト腎腫瘍
細胞とリンパ芽球様ＢＡＬＬ−１細胞とを１４０　ｍＭ
　ＮａＣ１，５４ｍＭ　ＫＣ１、１ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ
４，２ｍＭ　ＣａＣｌ２　ｔ−含有する塩類溶液にそれ
ぞれ約１０３／−になるようにフラスコ中で浮遊させ、
これに予め紫外線で不活化したセンダイウィルスを含有
する前記塩類溶液を水冷下で混合し、約５分後に８７℃
恒温水槽に移して、約８０分間攪拌しつつ細胞融合を起
させ、ヒトカリクレイン産生能を導入したリンパ芽球様
ＢＡＬＬ−１細胞を得た。このリンパ芽球様ＢＡＬＬ−
１細胞を、新生児の）・ムスターにウサギから公知の方
法で調製した抗血清を予め注射しノ・ムスターの免疫反
応を弱めたその皮下に移植し、その後通常の方法で８週
間飼育した。生じた腫瘤約１０２を摘出し、実施例１と
同様に処理してヒトカリクレインを生成させた。浮遊液
−当りのカリクレイン産生量は、約２，１００ＫＵであ
った。

対照として細胞融合させたリン・々芽球様ＢＡＬＬ−１
細胞を実施例１と同様にインビトロで組織培養してヒト
カリクレインを生°成させたところ、浮遊液−当り僅か
２００ＫＵのカリクレイン産生量であった。

実施例　生 新生児ランドの静脈内へ、実施例２の方法でヒトカリク
レイン産生能を導入したリンパ芽球様ナマルバ細胞を移
植した後、通常の方法で４週間飼育した。

生じた腫瘤的４０２を摘出し、実施例２と同様に処理し
てヒトカリクレインを生成させた。浮遊液−当りのカリ
クレイン産生量は約１，４００ＫＵであった。

実施例　ｈ 成長した普通マウスに、約４００レムのエックス線を照
射してマウスの免疫反応を弱めた後、その皮下に実施例
１と同じ培養株化されたヒト腫瘍細胞を移植した。その
後、通常の方法で４週間飼育し、皮下に生じた腫瘤的１
５２を摘出し、実施例１と同様に処理してヒトカリクレ
インを生成させた。浮遊液−当りのカリクレイン産生量
は約９００　ＫＵであった。

実施例　Ｇ 孔径約０５ミクロンのメンブランフィルタ−を設けた内
容量的１０−のプラスチック製円筒型拡散チャンバー内
に、実施例３の方法でヒトカリクレイン産生能を導入し
たリンパ芽球様ＢＡＬＬ−１細胞を生理食塩水で浮遊さ
せ、これを成長したラットの腹腔内に埋設した。

このラッｌ−に通常の方法で４週間飼育した後。

コ（７Ｊ２；散チャンバーを取り出した。これにより得
られたヒト由来の細胞濃度は、約２　Ｘ　１０９７ｍ１
であって、インビトロでの炭酸ガスインキュベーター中
で培養する場合の約１０倍以上にも達することがわかっ
た。本細胞を実施例２と同様に浮遊液として処理しヒト
カリクレインを生成させた。浮遊液−１のカリクレイン
産生量は約１．８００ＫＵであった。

実施例　７ ８７℃で５日間保ったニワトリの受精卵に実施例８の方
法でヒトカリクレイン産生能を導入したリンパ芽球様Ｂ
ＡＬＬ−１細胞を移植した後、３７℃で１週間保った。

この卵を割卵した後、増殖細胞を採取し、実施例２と同
様に処理してヒトカリクレインを生成させた。浮遊液−
当りのカリクレイン産生量は約１，２００ＫＵであった
。

手続袖正曹 昭和５７年１１月１５日 特許庁長官若杉和夫殿 Ｌ　事件の表示 昭和５７年特許願第８７８９号 ２　発明の名称 ヒトカリクレインの製造方法 ａ　補正をする者 事件との関係　　％計量願人 屯　補正の対象 明細書における「発明の詳細な説明」の項＆　補正の自
答 ＋１１　　明細書第４頁第３行記載の「ヒト肺線維芽細
胞」を「ヒト肺義維芽細胞」に補正します。

（２）　　明細書第５頁第１７行記載の「ラット、／・
ムスター、」を「ラット、ヌードラット、／・ムスター
、」に補正します。

（３）　　明細書第６頁第９行記載の「ヌードマウス」
を「ヌードマウスやヌードラットなどの免疫不全動物」
に補正します。

（４）　　明細書第９頁第６行記載の「好都合である。

」の後に、天文を挿入します。

「増殖ヒト由来細胞は、ヒトカリクレイン産生に供する
前に、インビトロの栄養培地で適当期間、通常１〜４日
培養し、細胞代紺を整えてもよい。」 （５）　　明細書第１２頁第１７行記載の「１４０ｍＭ
　ＮａｃｌｌＪをｒ　１４０ｍＭ　ＮａＣ１，Ｊに補正
します。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒトカリクレイン産生能を有するヒト由来の細胞をヒト
   以外の温血動物体内に移植し、またはその温血動物の体
   液の供給を受けながら増殖し、得られる細胞からヒトカ
   リクレインを産生せしめることを特徴とするヒトカリク
   レインの製造方法。