JPS63152993A - γ―インターフェロンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、γ−インターフェロンの製造方法とその用途
に関するものであり、更に詳しくは、培養株化されたヒ
ト由来のγ−インターフェロン産生能を有する骨髄単球
系細胞　ＩＱｅｌ＝＝＝；；＝１１）−一を用いてγ−
インターフェロンを産生せしめ、これ全採取することを
特徴とするγ−°インターフェロンの製造方法、このγ
−インターフェロンを抗原とした抗γ−インターフェロ
ンモノクローナル抗体の製造方法、このモノクローナル
抗体によるγ−インターフェロンの精製方法並びにこの
ｒ−インターフェロンを有効成分としたγ−インターフ
ェロン感受性疾患の予防剤および治療剤に関する。

（従来の技術） インターフェロンは、小林茂保著「インターフェロンＪ
　１９７５年　株式会社講談社発行、Ｄ、Ａ、Ｊ。

Ｔｙｒｒｅｌｌ著「１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｎｄ　工
ｔｓ　（：１ｉｎｉｃａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｊ　１
９７６年Ｗｉ　１１　ｊａｍ　Ｈｅ　ｉｎｅｍａｎｎ　
ＭｅｄｉｃａｌＢＯＯｋｓｌｔｄ、　（Ｌｏｎｄｏｎ　
）発行、［蛋白質　核酸　酵素Ｖｏ１．２１　Ｎｏ、４
　Ｊ　１９７６年などにも記載されテイルように、例え
ば、ウィルス、細菌、原虫、リケッチャ、核酸、エンド
トキシン、多糖類などのインターフェロン誘導剤を生細
胞に作用させることによって、その細胞内外に誘導生成
される糖蛋白質であって、その細胞内での各種ウィルス
の増殖を非特異的に抑制する機能を持つ物質に与えられ
た名称である。

インターフェロンの持つこのような機能から、インター
フェロンは、゛その発見の当初よりウィルス性疾患の予
防剤、治療剤として期待されてきた。

また、近年インターフェロンは、ウィルス性腫瘍のみな
らず、非ウィルス性腫瘍に対しても抗腫瘍性が認められ
るようになって、医薬品としてのインターフェロンが鶴
首されるに至った。

インターフェロンには、α−インターフェロン（別名、
白血球インターフェロン）、β−インター７二ロン（別
名、繊ｍｖ細胞インターフェロン）およびγ−インター
フェロン（別名、免疫インターフェロン、タイプ■イン
ターフェロン）がアリ、この内α−インターフェロンに
ついては白血球などから、β−インターフェロンについ
ては繊維芽細胞などからの製造方法が確立され、最近、
これら全利用した医薬品が市販されるまでに至った。

一方、γ−インターフェロンについては、多数の製造方
法が提案されているもののいずれも未だ工業的に実施さ
れるに至っていない。

例えば、特開昭５７−５８８９１号公報、特表昭５７−
５００９６１号公報、特表昭５８−５（１２）０３２号
公報、特開昭５９−８２０９２号公報、特開昭６０−７
００９９号公報、特開昭６０−８７３００号公報、特開
昭６０−１３９７００号公報、特開昭６０−１４９６０
０号公報などで提案されているヒト末梢血からの白血球
またはＴ−リンパ球を用いる方法は、原料の細胞を安定
して大量に供給することが困難であり、また細胞当りの
産生量も不充分である。

また、特開昭５５−９８１１８号公報で提案されている
方法は、培養株化されたヒト由来の細胞をヒト以外の温
血動物の体内に移植するか、またはヒト以外の温血動物
の体内もしくは体外に取り付けた拡散チャンバー内で、
その温血動物の体液の供給を受けながら増殖させ、得ら
れるヒト由来の細胞を用いてγ−インターフェロンを製
造する方法であり、原料のヒト由来の細胞を大量に安定
して供給できる点できわめて優れている。

しかしながら、この方法については、培養株化されたヒ
ト由来の細胞の違いによって、ｒ−インターフェロン産
生能に変動のあることが判明し、安定して高活性のγ−
インターフェロンを製造するにはなお改良の必要がアリ
、未だ工業的に実施するに至っていない。

γ−インターフェロンは、細胞増殖抑制作用、抗腫瘍作
用がα−インターフェロン、β−インターフェロンより
も著しく強く、また、α−インターフェロン、β−イン
ターフェロンなトド併用スることにより、これらの抗ウ
ィルス作用、細胞増殖抑制作用、抗腫瘍作用などを増強
することが知られており、その工業的製造方法の確立が
強く望まれている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者等は、工業的規模で容易に実施しうるγ−イン
ターフェロンの製造方法を確立することを目的に、培養
株化された各種ヒト由来の細胞、とりわけ、培養株化さ
れた各種ヒト由来りンノ（芽球様細胞のγ−インターフ
ェロン産生能について比較研究を続け、更に、そのγ−
インターフェロンがｒ−インターフェロン感受性疾患の
予防剤および治療剤として有用であるか否かを鋭意研究
した。

その結果、意外にも、培養株化されたヒト由来の骨髄単
球系細胞が、他のリンパ芽球様細胞とは違っテ、高いγ
−インターフェロン産生能を有シ、γ−インターフェロ
ン製造用細胞として好適であることを見いだし、更に、
その骨髄単球系細胞から得られたγ−インターフェロン
がγ−インターフェロン感受性疾患の予防剤、治療剤と
して優れていることを確認して本発明を完成した。

本発明でいう培養株化されたヒト由来の骨髄単球系細胞
とは、岩波書店発行、岸本忠三、渡辺武編、「岩披講座
　免疫科学３、免疫担当細胞」第１８１〜２０４頁（昭
和６１年）およびＭｉｋｉｏ　５ｈｉｋｉｔａａｎｄ　
工ｓａｏ　Ｙａｍａｎｅ著「Ｍａｍｍａｌｉａｎ　（’
ｅｌｌ　（：：ｕｌｔｕｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇ）ｒ　
Ｊ第１４１〜１６２頁１９８５年５ｏｆｔ　５ｃｉｅｎ
ｃｅｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｔｏｋｙｏ、　Ｊａ
ｐａｎなどに記載されているように、Ｔ−細胞、Ｂ−細
胞に属さない細胞であって、抗原抗体反応により骨髄単
球系抗原（Ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅ
ｎ　）　　の存在を示すことで同定される細胞を云う。

例えば、本発明者等が新たに樹立したＨＢＬ−３８細胞
、前述の引用文献に記載されているＨＬ−６０、ＫＧ−
１、ＭＬ−１、ＭＬ−２、ＭＬ−３、ＴＨＰ−１、［Ｊ
−９３７、更には、Ｑａｎｎ　Ｖｏｌ、７５第６６０〜
６６４頁１９８４年で報告されているＣＴＶ−１などが
適宜利用できるが、と９わけ、ＨＢＬ−３８細胞のｒ−
インターフェロン産生能は高く、本発明の実施に有利に
利用できる。

また、これら細胞のγ−インターフェロン産生能を持つ
遺伝子を、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイ
ウィルスなどを利用する細胞融合の手段やＤＮＡＩＪカ
ーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ
などの酵素を利用する公知の遺伝子組換えの手段などに
よって、より容易に継代培養しうる培養株化された細胞
に導入してその増殖速度を更に高めることも、また、そ
のγ−インターフェロン産生能を更に高めることも有利
に実施できる。

本発明で使用する培養株化されたヒト由来の骨髄単球系
細胞を増殖させる方法は、適宜に選択することができる
。例えば、γ−インターフェロン産生能を有するヒト由
来の骨髄単球系細胞を栄養培地に接種して増殖させる生
体外で行なう組織培養法や、γ−インターフェロン産生
能を有するヒト由来の骨髄単球系細胞をヒト以外の温血
動物の体内に移植するか、または、ヒト以外の温血動物
の体内もしくは体外に取り付けた拡散チャンバー内に移
植して、その体液の供給を受けながら増殖させる生体内
で行なう方法などである。

まず、生体外で増殖させる場合について説明する。

この際使用する栄養培地は、ヒト由来の骨髄単球系細胞
を接種して増殖しうるものであればよく、例えば、ＲＰ
ＭＩ　１６４０培地、イーグル最少基本培地などがあり
、必要に応じて、更に、ビタミン、ミネラル、炭水化物
、アミノ酸および哨乳類の血清などを補足して改良する
こともできる。

培養方法は、単層培養法または浮遊培養法が適宜選択で
きる。

培養温度は、約２０〜４０℃、好ましくは約あ〜羽℃、
接種量は、接種後約１週間で最大細胞発育をみることが
できるような培地−当シの細胞数であって、好ましくは
培地−当り約１０’−１０７個である。

細胞を接種した培地全上記条件で約４〜１０日間培養し
、この間培地を定期的に新鮮なものと取り替えて栄養物
を充分補給するとともに、培地中に放出された代謝産物
を洗浄または希釈して増殖させるのが望ましい。

次に、生体内で細胞を増殖させる方法について説明する
。

この方法では、γ−インターフェロン産生能を有するヒ
ト由来の骨髄卓球系細胞をヒト以外の温血動物体内に移
植するか、または、その体液の供給を受けることのでき
るチャンバー内に収容し、通常の飼育をすれば、温血動
物の体内から供給される栄養物を含有する体液を利用し
てその細胞が容易に増殖しうろことから、インビトロに
おける組織培養のように高価な血清などを含む栄養培地
を使わずして、または大幅に節約しても大量のγ−イン
ターフェロンを生成させることができる。

すなわち、ヒト以外の温血動物を利用する方法は、細胞
増殖中の維持管理が容易なことはもとより、インビトロ
で培養する場合と比較して細胞の増殖が安定しているこ
と、加うるに細胞当りのγ−インターフェロン産生量が
増大すること、とりわけ２〜１０倍、またはそれ以上に
も高まるのできわめて有利である。

この方法に使用する温血動物は、ヒト由来の骨髄単球系
細胞が増殖し得るものであればよく、例えば、ニワトリ
、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ブタ、ウ
シ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスター、
普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類などが使用でき
る。

これら動物にヒト由来の骨髄単球系細胞を移植すると好
ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、その反応
をできるだけおさえるために使用する動物は、できるだ
け幼若な状態、即ち卵、胚、胎児、または新生期、幼少
期のものの方が好ましい。

また、これら動物に、例えば、約２００〜６００レム程
度のエックス線若しくはガンマ線を照射するか、または
、抗血清若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処
置をほどこして、免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスの場合には、成長したもの
であっても免疫反応が弱いので、これらの前処置を必要
とすることなく、培養株化されたヒト由来の骨髄単球系
細胞が移植でき、急速に増殖できるので特に好都合であ
る。

また、培養株化されたヒト由来の骨髄単球系細胞を、例
えば、先ずハムスターに移植して増殖させた後、この細
胞を更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒト以
外の温血動物間で移植して、ヒト由来の骨髄単球系細胞
の増殖をよシ安定化したり、更にそれらから誘導生成さ
れるｒ−インターフェロン量を増加させることも自由で
ある。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同綱間、同門
間移植であってもよい。ヒト由来の骨髄単球系細胞を移
植する動物体内の部位は、移植した細胞が増殖し得る部
位であればよく、例えば、尿液腔、静脈、腹腔、皮下な
どが自由に選ばれる。

また、直接動物体内にヒト由来の骨髄単球系細胞を移植
することなく、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾
過膜、例えば、孔径約１０−７〜１０−５ｍを有するメ
ンブランフィルタ−１限外濾過膜またはホローファイバ
ーなどを設けた公知の各種形状、大きさの拡散チャンバ
ーを動物体内、例えば、腹腔内に埋設して、動物体から
の栄養物を含む体液の供給を受けつつ、そのチャンバー
内で前述の培養株化されたヒト由来の骨髄単球系細胞を
何れも増殖させることができる。

また、必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む
溶液を動物体内の体液と接続し潅流させるようにしたチ
ャンバーを、例えば、動物体表に取付け、チャンバー内
のヒト由来の骨髄単球系細胞の増殖状態を透視できるよ
うにすることも、また、このチャンバ一部分のみを着脱
交換できるようにして、動物を屠殺せずに寿命一杯細胞
を増殖させ、動物個体当りの細胞生産ｉ：を更に高める
こともできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
骨髄単球系細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト
由来の骨髄単球系細胞のみが容易に採取できるだけでは
、カ＜−好ましくない免疫反応を起す心配も少ないので
、免疫反応を抑制する前処置の必要もなく、各種温血動
物を自由に利用できる特徴を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育を続
ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは何ら必要
としないので好都合である。

ヒト由来の骨髄単球系細胞を増殖させるための期間は通
常約１〜１０週の期間で目的を達成することができる。

このようにして得られるヒト由来−の骨髄単球系細胞数
は、動物側体当シ約１０７〜１０１２、またはそれ以上
に達する。。

換言すれば、ヒト以外の温血動物を利用する方法により
増殖させたヒト由来の骨髄単球系細胞数は、動物個体肖
り移植した細胞数の約ｌＯ２〜１０’倍、またはそれ以
上にも達し、生体外の栄養培地に接種して増殖させる場
合の約１０”〜１０６倍、またはそれ以上にも達して、
γ−インターフェロンの製造のため極めて好都合である
。

このようにして増殖させたヒト由来の骨髄単球系生細胞
を用いてｒ−インターフェロンを産生させる方法は自由
である。それが増殖した動物体内のままで、γ−インタ
ーフェロン誘導剤を作用させることもできる。例えば、
腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の骨髄単球系
細胞に、または皮下に生じた重傷細胞に、γ−インター
フェロン誘導剤を直接作用させてｒ−インターフェロン
を誘導生成させ、次いで、その腹水または腫瘍からγ−
インターフェロンを精製し採取すればよい。

また、ヒト由来の骨髄単球系細胞を動物体内から取り出
し、生体外でγ−インターフェロン誘導剤を作用させて
ｒ−インターフェロンを誘導生成させることもできる。

例えば、腹水中で増殖したヒト由来の骨髄単球系細胞を
分取し、または皮下に生じたヒト由来の骨髄単球系細胞
を含む腫瘍を摘出、分散し、得られる細胞を約２０〜４
０℃に保った栄養培地に細胞ａ度が約１０’〜１０８／
−になるように浮遊させ、これにγ−インメーフェロン
誘導剤を作用させることによってγ−インターフェロン
を誘導生成させ、これを精製し採取すればよい。

更に、ヒト由来の骨髄単球系細胞を拡散チャンバー内で
増殖させた場合には、増殖させた細胞をチャンバー内の
ままで、またはチャンバーから取り出して、γ−インタ
ーフェロンを誘導生成させることもできる。

また、ｒ−インターフェロンの誘導生成に際して、必要
ならば、例えば、ヒトに種特異性の高いインターフェロ
ンを用いてプライミング処理をしたり、代謝阻害剤を使
用するスーパーインダクショ７法などの公知の方法を採
用することによって、生成するγ−インターフェロン量
を更に高めることも自由である。

また、例えば、増殖させたヒト由来の骨髄単球系細胞に
、先ず動物体内のままでγ−インターフェロン全誘導生
成させた後、次いで同一動物個体の特定の部位または全
体から採取し、たヒト由来の骨髄単球系細胞に、動物体
外でｒ−インターフェロンを誘導生成させる方法、また
、一度γ−インターフェロンの誘導生成に使用した細胞
を、更に２度以上γ−インターフェロンの誘導生成に使
用する方法、または、動物体内に埋設、若しくは接続す
るチャンバーを交換して、得られる細胞数を増加させる
方法などの方法によって、使用する動物個体当りのγ−
インターフェロン生成量を更に高めることも自由である
。

ｒ−インターフェロン誘導剤としては、通常、例えばフ
ィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ１ボークウイー
ドミトーゲン、リポポリサツカリド、リビドＡ、エンド
トキシン、多糖類、細菌などのミトーゲンが好適である
。

また、感作化された細胞にとっては、抗原もγ−インタ
ーフェロン誘導剤である。これらγ−インターフェロン
誘導剤を用いる場合には、通常的０．００１μｆ〜ｘｏ
ｑ／−の濃度で使用される。必要ならば、例えば、ウィ
ルス、核酸、ポリヌクレオチドなどのα−インターフェ
ロン誘導剤を併用して、γ−インターフェロン量を更に
増加させることも、α−インターフェロンとγ−インタ
ーフェロントを同時に生成させることも自由である。

このようにして誘導生成させたγ−インターフェロンは
、公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心
分離、濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易に精
製分離し、採取することができる。更に、高度の精製を
必要とする場合には、例えば、イオン交換体への吸着・
溶出、ゲル濾過、アフイニテイクロマトグラフイー、等
電点分画、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動など
の公知の方法を更に組み合せればよく、とりわけ、モノ
クローナル抗体を利用したクロマトグラフィーなどによ
り、最高純度のγ−インターフェロンを採取することも
可能である。

このようにして得られたγ−インターフェロンは、γ−
インターフェロン感受性疾患の予防剤、治療剤などとし
て有利に利用できる。

γ−インターフェロン感受性疾患とは、ｒ−インターフ
ェロンによって予防され、若しくは治療される疾患であ
り、それがウィルス性疾患、例えば、流行性血膜炎、ヘ
ルペス牲角膜炎、インフルエンザ、風疹、血清肝炎、エ
イズなどであっても、また、非ウィルス性疾患、例えば
、大腸癌、肺癌、肝癌、骨肉腫などの悪性腫瘍、更には
、アトピー性アレルギー、重症筋無力症、膠原病、悪性
貧血、関節゛リウマチ、全身性エリテマトーデスなどの
免疫疾患などであってもよい。

また、γ−インターフェロン感受性疾患予防剤、若しく
は治療剤は、その目的に応じてその形状を自由に選択で
きる。その−例を上げれば、噴霧剤、点眼剤、うがい剤
、注射剤などの液剤、軟膏のようなペースト剤、粉剤、
顆粒剤、錠剤などの固剤などである。

これら予防剤、治療剤には、γ−インターフェロンを、
通常、ダラム当り１〜１０，０００，０００単位程度の
活性を含有せしめればよく、必要に応じてγ−インター
フェロンとともに他のリンホカイン、例えハ、α−イン
ターフェロン、β−インターフ二クロンツモアネクロシ
ス　ファクター、す／ホトキシン、インターロイキン２
、Ｂ細胞分化因子などのγ−インターフェロン以外のリ
ンホカイン、更には、他の天然または合成中学化学治療
剤など　、の１種または２種以上を有効成分として含有
せしめ、その予防、治療効果２更に高めることも有利に
実施できる。

更に必要ならば、補助剤、増量剤、安定剤などの１種ま
たは２種以上を併用することも随意である。このように
して製造される本発明のγ−インターフェロン感受性疾
患の予防剤、治療剤は、例えは、抗ウィルス剤、抗腫瘍
剤として、また、抗腫瘍性化学療法剤の抗腫瘍効果増強
剤、悪性腫瘍の転移抑制、再発防止剤、免疫調節剤、免
疫疾患治療剤などとして有利に利用できる。

ヒトに種特異性の高いインターフェロンの活性は、［蛋
白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ、２０　Ｎｏ、６　Ｊ第６１
６〜６４３頁１９７５年に報告されているヒト羊膜由来
のＦＬ細胞を使用して、公知のプラーク半減法で測定し
た。

なお、γ−インターフェロンの活性は、抗α−インター
フェロン抗体及び抗β−インターフェロン抗体を共存さ
せて、α−インターフェロン及ヒβ−インターフェロン
を中和後、測定した。

赤血球凝集価は、Ｊ、Ｅ、　５ａｌｋ著ｒ　Ｔｈｅ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆ　工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、４
９　Ｊ第８７頁　１９４４年の方法に準じて測定した。

以下、本発明で新たに樹立した骨髄単球系細胞ＨＢＬ−
３８について説明する。

急性前随性白血病患者（男性　５５才）からの白血球細
胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで栄養培地に培養した結果、２１
日後に細胞の増殖が認められた。それ全継代培養し、こ
のうちの１種類を安定して増殖させることに成功し、こ
れ’！ｋＨＢＬ−３８と命名した。

（１）増殖能 牛胎児活性１０ｖ／ｖ％を加えたＲＰＭＩ　　１６４０
培地での増殖能を測定したところ、倍加時間は約３０時
間であった。

（２）形　態 増殖時に、フラスコの底面に付着する性質を有していた
が、付着性は弱く、すぐ遊離した。また、増殖時に細胞
集塊の形成もみられたが、強固なものではなく、軽く触
れると容易に単一細胞に分散された。この細胞を、位相
差顕微鏡で観察した結果を第１図に示した。細胞の形態
は、約１５μｍの単一なほぼ円形をしていた。ギムザ染
色を行なった結果、核は円形のものの他に、不規則な切
込や分葉傾向を示すものも認められた。

（３）染色体数 染色体の分析には、対数増殖期の細胞を使用した。染色
体数の頻度分布を、第１表に示した。１５０個の細胞に
ついて観察した結果、染色体数は低２倍体域にあり、そ
の頻度分布は、４５本が最も多く５３個であった。また
、４４本の細胞も４２個認められた。

第１表　染色体数の頻度分布 （４）抜型分析 抜型分析の結果を、第２図に示した。細胞の性染色体は
ＸＹであシ、細胞由来源と一致した。

染色体の＆１７の片方及び屋１８の全部が欠落していた
。＆５の短腕（ｐ）と屋１２の長腕（ψに染色体の挿入
が観察された。また、同定不可能なマーカー染色体と染
色分体が、それぞれ１本誌められた。

（５）細胞表面形質 各種細胞表面抗体を用いてＨＢＬ−３８細胞の同定を行
なった結果を、第２表に示した。ヒツジ赤血球（Ｅ）、
抗体感作ウシ赤血球（ＥＡ）、　ヒト補体感作ウシ赤血
球（ＥＡＣ）ｔ−用いた分析では、ＥＡに１０％のロゼ
ツト形成がみられたが、他のものは認められなかった。

ヤギ抗ヒト抗体を使用して、細胞表面免疫グロブリンの
検出を行なった結果、６種全て陰性であった。また、モ
ノクローナル抗体を用いた表面マーカーの検索の結果、
３Ａ１　、ＭＣ８−２、Ｂ３／２５　、　ＭＹ−９は、
高い陽性率を示し、ＮＵ−Ｔ２．Ｌｅｕ−５、Ｌｅｕ　
−４、Ａ−５０゜ＢＡ−２，０ＫＴ−１、ＮＵ−Ｎｌ　
、Ｂ２．ＭＯ−１、ＭＯ−２は、全て陰性であった。

（６）　　ＥＢ　ウィルス特異核抗原（ＥＢＮＡ）の検
索ＥＢＮＡについては、細胞株樹立後、早期より数回に
わたって検索したが、常に陰性であっ念。

（７）軟寒天培地中でのコロニー形成 コロニー形成因子（Ｃ８Ｆ）全含む０．３％寒天培地中
でのコロニー形成を試験し、培養１４日ロア倒立顕微鏡
により観察した結果、ミニロイド様のコロニーを形成す
る細胞が認められた。それらの頻度は、１〜２チであっ
た。コロニー形成因子を加えない場合は、全く造られな
かった。

以上の結果より、ＨＢＬ−３８細胞は、前駆単球系細胞
に属することが判明した。

次に、γ−インターフェロンの産生に関する実験Ｉを述
べる。

実験ｌ　培養株化されたヒト由来の各種リンパ芽球様細
胞のγ−インターフェロン産生能の比較 実験１−１　生体外で増殖させた細胞によるインターフ
ェロンの産生 牛胎児血清２０　ｖ／　ｖ　％　ｆ補足したＲＰＭＩ　
１６４０培地（ｐＨ７，２）に、培養株化されたヒト由
来の各種細胞をそれぞれに接種し、３７℃で、常法に従
って培養し、次いで、血清無添加のＲＰＭＩ　１６４０
培地（ｐＨ７，２）で洗浄し、同培地に濃度１刈０６／
／＋７！になるように懸濁した。

このようにして得たヒト由来の各種細胞懸濁液それぞれ
に、リボボリサツカリドヲー当り約１０μノを添加し、
３７℃で、２日間保ってインターフェロンを誘導させ、
遠心分離し、上清を用いてその−当りのインターフェロ
ン活性及びγ−インターフェロン活性を測定した。

その結果を、第３表にまとめた。

第　　　３　　　表 （注）数値はインターフェロン活性を示し、（）内の数
値はγ−インターフェロン活性を示す。

第３表の結果から明らかなように、培養株化されたヒト
由来の各種リンパ芽球様細胞のγ−インターフェロン産
生能を比較したところ、従来、その産生が全く知られて
いない前駆単球系細胞からの産生を見いだし、しかも、
その産生量の多いことが判明した。とりわけ、ＨＢＬ−
３８細胞は、γ−インターフェロン産生能が著しく高く
、本発明に有利に利用できる。

実験１−２　　生体内で増殖させた細胞によるインター
フェロンの産生 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を予め注射し、ハムスターの免疫を弱めた後、
その皮下に培養株化されたヒト由来の前駆単球系細胞を
それぞれ移植して、その後、通常の方法で３週間飼育し
た。

皮下に生じた腫瘍を摘出して細切した後、トリプシン含
有の生理食塩水に懸濁して細胞？分散、分取した。

得られたそれぞれの細胞を、実験１−１と同様に懸濁液
とし、同様に活性ｔｌ−測定した。

その結果を、第４表にまとめた。

（注）数値は、インターフェロン活性を示し、０内の数
値は、γ−インターフェロン活性を示す。

第３表および第４表の結果から明らかなように、培養株
化されたヒト由来の前駆単球系細胞、とシわけ、ＨＢＬ
−３８細胞は、生体外で増殖させた細胞よりも、生体内
で増殖させた細胞の方が、顕著に高いγ−インターフェ
ロン産生量を示すことが判明した。

以下、ｒ−インターフェロンの製造例を、実施例Ａとし
て示す。

実施例Ａ−１ ）（Ｂ　Ｌ−３８細胞を仔牛血清ｔ　ｏ　ｖ／　ｖチを
補足したＲＰＭＩ　　１６４０培地（１）Ｈ７，２）　
Ｋ：細胞濃ｆ　５Ｘ１０’／ｄになるよう接種した。

その後、常法に従って、定期的に新鮮な培地と取り替え
ながら、３７℃で培養し、次いで、新鮮な同培地で洗浄
し、同培地に濃［２Ｘ１０’／−になるよう懸濁した。

これにリポポリサツカリドを−当り約１０μ？添加し、
３７℃で、２日間保ってインターフェロンを誘導させた
。これを遠心分離し、その上清−当り、約５，１００単
位のγ−インターフェロンヲ得り。

実施例Ａ−２ 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を予め注射し、）・ムスターの免疫反応を弱め
た後、その皮下にＨＢＬ−３８細胞を移植し、その後、
通常の方法で、４週間飼育した。皮下に生じた約２Ｏｆ
の腫瘍を摘出した後、コラゲナーゼ含有生理食塩水に懸
濁して、細胞を分散、分取した。

この細胞を、イーグルの最少基本培地で洗浄した後、３
７℃に保った同じ組成の培地に、細胞濃度が約２Ｘ１０
’／−になるように希釈し、これに−当りフィトへマグ
ルチェ７２００μ？およびリビドＡ５μｆを加え、３７
℃で、２日間保ってインターフェロンを誘導させた。こ
れを遠心分離し、上清−当り約９３，０００単位のｒ−
インターフェロンを得た。ハムスター１匹当り、約１８
３．０００．０００単位のγ−インターフェロンが得ら
れた。

実施例Ａ−３ 新生児のラットの静脈内へ、ＫＧ−１細胞を移植した後
、通常の方法で、４週間飼育した。

皮下に生じた約２（１２）の腫瘍を摘出した後、実施例
Ａ−２と同様にして分散し、細胞懸濁数ヲ得た。これに
、−当りセンダイウィルス約１００　赤血球凝集価およ
びリボポリサツカリド約５μ２を力Ωえ、３７℃で、２
日間保ってインターフェロンを誘導させた。これを遠心
分離し、上清−当り、約４９．０００単位のγ−インタ
ーフェロンを得た。

ラット１匹当り、約９７．０００　、０００単位のγ−
インターフェロンが得られた。

実施例Ａ−４ 孔径的０．５ミクロンのメンブランフィルタ−を設けた
内容量的１０−のプラスチック製円筒型チャンバー内に
、ＣＴＶ−１細胞を生理食塩水で浮遊させ、これを成長
したラットの腹腔内に埋設した。

このラッ）１、通常の方法で、４週間飼育した後、この
チャンバーを取り出した。

この細胞を、実施例Ａ−１と同様に処理してインターフ
ェロンを誘導させた。これを遠心分離し、上清−当り、
約４１，０００単位のγ−インターフェロンを得た。ラ
ット１匹当り、約７８．０００，０００単位のｒ−イン
ターフェロンが得られた。

実施例Ａ−５ ３７℃で、５日間保ったニワトリの受精卵に、ＨＢＬ−
３８細胞を移植した後、３７℃で、１週間保った。この
卵を割卵した後、増殖細胞を採取し、その細胞を実施例
Ａ−２と同様に処理してインターフェロンを誘導させた
。これを遠心分離し、上清−当り、約３６　、０００単
位のｒ−インターフェロンを得た。受精卵１０個当り、
約６０，０００，０００単位のγ−インターフェロンが
得られた。

次ニ、抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体の製
造方法と、それを利用した高純度γ−インターフェロン
の製造例を、実施例Ｂとして示す。

実施例Ｂ−１ （１）部分精製したγ−インターフェロンの調製実施例
Ａ−２の方法で調製したγ−インターフェロン含有溶液
を、ｐＨ８，５，０，０１Ｍ　）　リス塩酸塩緩衝液で
、２０時間透析し、更に精密ｒ過して得たＰ液を、抗α
−インターフェロン抗体および抗ｌ−インターフェロン
抗体を固定化している抗体カラムに流し、その非吸着画
分を採取し、更に、これをクロマトフォー力ッシング法
により抗ウイルス活性画分を採取し、濃縮、凍結乾燥し
て、ｒ−インターフェロンを含有する粉末を、活性収率
的３０％で得た。本品の比活性は、約１０６単位／岬蛋
白質であった。

（２）抗ｒ−インターフェロンモノクローナル抗体の調
製 （１）の方法で得た部分精製γ−インターフェロンを、
生理食塩水に蛋白質製置として約０．０５ｗ／ｖチにな
るように溶解し、これとフロイント完全アジュバント乳
化液とを、等量混合して、この混合液帆２−をマウスの
皮下に注射し、７日後、再び同様に注射してマウスを免
疫した。その抗体産生能を有する細胞に抗γ−インター
フェロン抗体を誘導生成せしめ、このマウスからひ臓を
摘出し、細切分散して得られるひ臓細胞とマウス前駆腫
細胞Ｐ３−　Ｘ６３−Ａｇ　８　（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ社製）とを、血清無含有イーグル最少
基本培地で調製した５Ｑｗ／ｖ％ポリエチレングリコー
ル−１０００溶液（ｐＨ７，２、温度３７℃）に、それ
ぞれ１０　’　／Ｌｔになるように浮遊させて５分間保
った後、前記基本培地で２０倍に希釈し、次いでダビン
ン（１）ａｖｉｓｏｎ　）などが、ツマティック　セル
ゼネティックス（Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ　）＋Ｖｏ１．２．１７５〜１７６頁（１９７
６年）に報告シテイル方法に準じて、ヒボキサンチン−
アミノプテリン−チミジン培養液で増殖しうる融合細胞
を採取し、この融合細胞から抗ｒ−インターフェロン抗
体産生能を有する融合細胞を選択した。得られた融合細
胞を、マウス腹腔内に１匹当り約１０６個移植して、２
週間飼育した後、これを屠殺して腹水、血液などの体液
を集め、遠心分離し、この上清を硫安塩析して、飽和度
３０〜５０％の沈澱画分を集め、次いで透析し、更に、
この液全、（１）の方法で得たｒ−インターフェロンを
ブロムシア／活性化セファロースと室温下で反応させて
得られる固定化γ−インターフェロンゲルを用いてアフ
ィニテイクロマトグラフイーを行ない、抗γ−インター
フェロン抗体画分を得、透析した後、濃縮し、凍結乾燥
してγ−インターフェロンのモノクローナル抗体の粉末
を採取した。

本品は、前駆単球系細胞由来のヒトγ−インターフェロ
ン活性に対して免疫学的に特異的な中和活性を示した。

このモノクローナル抗体の水溶液での安定性を、中和活
性の測定により調べた結果、ｐＨ７，２で３０分間保持
する条件では、６０℃で８０％以上の活性が残存し、７
０℃で９０チ以上の活性が失なわれた。

また、４℃で１６時間保持する条件で、ｐＨ４，０〜１
１．０の範囲で安定であシ、ｐＨ２，０では９０チ以上
の活性が失なわれた。

更に、このモノクローナル抗体の性質を調べた結果、２
−メルカプトエタノールに不安定であ従って、このモノ
クローナル抗体は、イムノグロブリン間クラスに分類さ
れる抗体である。

（３）高純度に精製したｒ−インターフェロンの調製 （１）の方法で調製した部分調製γ−インターフェロン
を、（２）の方法で調製したモノクローナル抗体を固定
化したゲルを用いてカラムクロマトグラフィーを行ない
γ−インターフェロンの活性画分を採取し、透析し、濃
縮して凍結乾燥し、活性収率的８０％でγ−インターフ
ェロン固体を得た。本品は、高純度に精製されたγ−イ
ンターフェロンであって、その比活性は約１．５　Ｘ　
１０’単位／岬蛋白質であった。

実施例Ｂ−２ （１）部分精製したγ−インターフェロンの調製実施例
Ａ−３の方法で調製したγ−インターフェロン含有溶液
金、実施例Ｂ　−１（１）の方法に準じて部分精製し、
比活性約１０６単位／岬蛋白質のγ−インターフェロン
を収率的２０％で得た。

（２）　　抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体
の調製 （１）の方法で得た部分精製γ−インターフェロン全抗
原に用いた以外は、実施例Ｂ　−１（２）と同様にマウ
スを免疫し、ひ臓細胞を得た。

こめひ臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−ＮＳ−１／１−
Ａｐ４−１（大日本製薬株式会社製）とを、１４０ｍＭ
　Ｎａｃｚ＋　５４ｍＭ　ＫＣｌ、　１ｍＭ　ＮａＨ２
ＰＯ４，２ｍＭＣａＣ６２’を含有する塩類溶液に、そ
れぞれ１０’／ｍｔになるように浮遊させ、これに、予
じめ紫外線で不活化したセンダイウィルスを含有する前
記塩類溶液を水冷下で混合し、この混合液を、５分後に
３７℃のＲＰＭＩ培地で約２０倍に希釈し、次いで、実
施例Ｂ　−１Ｆ２）と同様にして抗ｒ−インターフェロ
ン抗体産生能を有する融合細胞を選択した。

得られた融合細胞を、公知の方法で免疫反応を弱めた生
後７日のハムスターの腹腔内に、１匹当り約１０７個移
植し、実施例Ｂ　−１（２）と同様にしてモノクローナ
ル抗体を採取した。

本品は、実施例Ｂ　−１（２）で調製したモノクローナ
ル抗体と同様に、ｒ−インターフェロン活性に対し免疫
学的に特異的中和活性を示した。

このモノクローナル抗体の水溶液での安定性を、その中
和活性の測定によシ調べた結果、ｐＨ７，２で３０分間
保持する条件では、６０℃で８０チ以上の活性が残存し
、７０℃で９０％以上の活性が失なわれた。また、４℃
で１６時間保持する条件では、ｐＨ２，０〜１１．０の
範囲で安定であった。

更に、このモノクローナル抗体の性質を調べた結果、２
−メルカプトエタノールに安定であり、抗マウスイムノ
グロブリンＧ抗体と特異的抗原抗体反応を示すことが判
明した。従って、このラスに分類される抗体である。

（３）高純度に精製したγ−インターフェロンの調製 （１）の方法で調製した部分精製γ−インターフェロン
ｔ−１（２）の方法で調製したモノクローナル抗体を固
定化したゲルを用いてカラムクロマトグラフィーを行な
いγ−インターフェロンの活性画分を採取し、透析、濃
縮して活性収率約８５チでγ−インターフェロン溶液を
得た。本品は、高純度に精製されたγ−インターフェロ
ンであって、その比活性は、約１．５Ｘ１０７単位／■
蛋白質であった。

実施例Ｂ−３ 実施例Ａ−１の方法で得られたγ−インターフェロンを
含有する上清を、ｐＨ７，２，０，０１Ｍリン酸塩緩衝
液を含有する生理食塩水で１５時間透析し、更に精密濾
過して得られるＰ液を、実施例Ｂ　−１（３）の方法に
準じて抗体カラムを用いて精製し、濃縮、凍結乾燥して
活性収率的７５％でｒ−インターフェロン固体を得た。

本品は、高純度に精製されたγ−インターフェロンであ
って、その比活性は、約１．５Ｘ１０’単位／１１Ｉｇ
蛋白質であった。

実施例Ｂ−４ 実施例Ａ−４の方法で得られたγ−インターフェロンを
含有する上清を、実施例Ｂ−３の方法に準じて透析、精
密濾過し、得られるＰ液を実施例Ｂ　−２（３）の方法
に準じて抗体カラムを用いて精製し、濃縮して、活性収
率的７０％でγ−インターフェロン溶液を得た。本品は
、高純度に精製されたγ−インターフェロンであって、
その比活性は約１．５　Ｘ　１０’単位／η蛋白質であ
り念。

実施例Ｂ−５ 実施例Ａ−５の方法で得られたγ−インターフェロンを
含有する上清を、実施例Ｂ−３の方法に準じて透析、精
密濾過し、得られるＰ液全実施例Ｂ　−１（３１の方法
に準じて抗体カラムを用いて精製し、濃縮、凍結乾燥し
て、活性収率約７０チでｒ−インターフェロン固体を得
た。本品は、高純度に精製されたγ−インターフェロン
であって、その比活性は、約１．５　Ｘ　１０７単位／
η蛋白質であった。

次に、γ−インターフェロンによるγ−インターフェロ
ン感受性疾患の予防、治療に関する実験■を述べる。

実験■　γ−インターフェロンによるγ−インターフェ
ロン感受性疾患の予防、治療試験実験■−１ｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏでのウィルス増殖抑制作用直径６ａｎのシャーレ
で単層培養したヒト胎児肺の初代培養細胞に、実施例Ｂ
　−１（３）の方法で調製したγ−インターフェロンを
０．１．１．０または１０．０単位を添加し、３７℃で
、５％炭酸ガスインキュベーター中に２０時間保った後
、これに、ｒ−インターフェロン無添加の場合に約１０
０個のプラーク形成能を有する量のバリセラーシスター
ウィルス（水痘帯状庖疹ウィルス）、またはヒトサイト
メガロウィルス（死産、早産原因ウィルス）を添加する
ことにより生成するプラーク数を計数した。

ウィルス増殖抑制作用は、γ−インターフェロンによる
プラーク数減少率の大きさで判定した。

Ａ：γ−インターフェロン無添加でのプラーク数Ｂ：γ
−インターフェロン添加でのプラーク数その計数した結
果を、第５表に示す。

第　　　５　　　表 第５表の結果から明らかなように、本発明で使用スるγ
−インターフェロンは、ウィルス性疾患を引き起すウィ
ルスの増殖をよく抑制していることがわかる。

実験ｎ−２１−インターフェロンによる悪性腫瘍の治療 （１）　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのγ−インターフェロン
による悪性腫瘍細胞増殖抑制作用 牛胎児血清１５ｖ／ｖ％を含有するＲＰＭＩ　１６４０
培地に、実施例Ｂ　−１（３）の方法で調製したｒ　−
インターフェロンを最終濃度を５％５０，５００単位／
−になるように添加して、さらに、これにヒト由来の悪
性腫瘍細胞を５×１０５／ゴの濃度になるように接種し
、３７℃に保った５％炭酸ガスインキュベーター中で３
日間培養した。対照としては、１００℃に３０分間保っ
て熱失活させたｒ−インターフェロンを、それぞれ等量
になるように添加して、同様に培養した。培養終了後、
［アプライド　マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）　Ｊ第２２巻、第４号、
６７１〜６７頂（１９７１年）に記載されている方法に
準じて、染色剤ニュートラルレッドで生細胞全染色し、
続いて、この染色剤をアンドエタノールで溶出し、溶出
液の５４０　ｎｍにおける吸光度から生細胞量を測定し
た。

細胞増殖抑制率（％）は、次式から算出した。

細胞増殖抑制率（％）　＝　（１−−）Ｘ１００Ａ：試
験区の生細胞量 Ｂ：対照区の生細胞量 測定結果を、第６表に示す。

第　　　６　　　表 第６表の結果から明らかなように、本発明で使用するγ
−インターフェロンは、ＫＢａ胞、ＨＥｐ−２細胞、Ｋ
ＡＴＯ−■細胞、Ｐ　−４７８８細胞などの悪性腫瘍細
胞の増殖を著しく抑制しており、その活性濃度も５〜５
００単位／ｍｌで有効であることがわかる。

（２）　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのγ−インターフェロン
による他のリンホカインの悪性腫瘍増殖抑制作用の増強
効果 使用したリンホカインとしては、ｒ−インターフェロン
を５単位／−１α−インターフェロンヲ５０単位／−１
およびツモアネクロシス　ファクター全１０単位／−使
用した。これらのリンホカインは、いずれもリンパ芽球
様細胞由来の天然型のもの全使用した。

実験方法は、（１）の方法に準じて行ない、細胞増殖抑
制率（２）を求めた。結果は、第７表に示す。

第　　　７　　　表 （注）　　ｒ−ＩＦＮは天然型ｒ−インターフェロンを
、α−ＩＦＮＨ天然型α−インターフェロンを、ＴＮＦ
は天然型ツモアネクロシスファクターを示す。

第７表の結果から明らかなように、γ−インターフェロ
ンは、他のリンホカインの持つ悪性腫瘍増殖抑制作用を
著しく増強し、その作用は、γ−インターフェロンの持
つその抑制作用と相乗効果を示す。

（３）　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのγ−インターフェロン
によル化学療法剤の悪性腫瘍増殖抑制作用の増強効果（
１）の方法に準じて調製した栄養培地１ｊＫヒト由来の
悪性腫瘍細胞を１０６個ずつとり、１日培養した後、こ
れに実施例Ｂ　−１（３）の方法で調製したｒ−インタ
ーフェロンを最終濃度５０単位及び／または化学療法剤
を含有する生理食塩水０．１ｄｉ加え、３７℃で、２日
間培養した。対照としては、γ−インターフェロン及び
化学療法剤を含まない生理食塩水を用いた。培養終了後
、（１）の方法に従って、細胞増殖抑制率（イ）を求め
た。

なお、化学療法剤の濃度は、培養液−当シ、塩酸ニムス
チン（ＡＣＮＵ　）　１．ＯＸ　１Ｏ−６ｆ、フルオロ
ウラシル（５−ＦＵ）　１．５　Ｘ　１０　　ｆ　、ド
キソルビシン（ＡＤＭ　）　１．Ｏｘ　ｌＯ−”　ｔ　
、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）　２．５　Ｘ　１Ｏ−９
ｆおよび硫酸ビンクリスチン（ＶＣＲ）１．５Ｘ１０−
”ｆとＬ７’ｃ。

結果を、第８表に示す。

第　　　８　　　表 （注）−は無添加を、＋は添加を示します。

また、ｒ−ＩＦＮはγ−インターフェロンを、ＡＣＮＵ
は塩酸ニムスチンを、５−ＦＵはフルオロウラシル’Ｆ
　ＡＤＭはドキソルビシンを、ＭＭＣはマイトマイシン
Ｃ１Ｆｒ：、ＶＣＲは硫酸ビンクリスチンを示す。

第８表の結果から明らかなように、ｒ−インターフェロ
ンは、各種化学療法剤の持つ悪性腫瘍増殖抑制作用を著
しく増強し、その作用は、γ−インターフェロンの持つ
その抑制作用と相加効果乃至相乗効果を示す。

（４）　　ｉｎ　ｖｉｖｏでの悪性腫瘍増殖抑制作用Ｂ
ＡＬＢ／Ｃ由来のヌードマウスにヒト乳癌組織片を背部
皮下に移植し、その腫瘍体積が約２００喘３になった時
期から、実施例Ｂ　−１（３）の方法で調製したγ−イ
ンターフェロンを単独で、またはこのγ−インターフェ
ロンとリンハ芽球様細胞由来の他のリンホカインおよび
化学療法剤とを併用して、生理食塩水に溶解した状態で
、毎日１回、四日間静脈注射を行った。

その後、ヌードマウスを屠殺して腫瘍の重量を測定した
。

なお、対照としては、生理食塩水を使用した。

結果全、第９表に示す。

第　　　９　　　表 秦　危険率５％以下で、対照の値に比較し、推計学的に
有意差あり。

第９表の結果から明らかなように、生体内（ｉｎ　ｖｉ
ｖｏ　）の試験においても、γ−インターフェロンは、
悪性腫瘍の増殖を著しく抑制する。

また、その増殖抑制作用は、他のリンホカインや化学療
法剤との併用により著しく増強され、高い抗腫瘍効果を
発揮する。

（５）急性毒性試験 生後２０日のマウスを使用して、実施例Ｂ−１（３）の
方法で得られたγ−インターフェロンの急性毒性試験を
した。

その毒性は極めて低く、腹腔内に注射した時のしＤ５ｏ
は、１０９単位以上であることが判明した。

以下、本発明のγ−インターフェロン全有効成分として
含有せしめた薬剤の製造例を、実施例Ｃとして示す。

実施例Ｃ−１液　　剤 生理食塩水に、実施例Ｂ　−１（３）の方法で調製した
γ−インターフェロンを−当り５００単位の割合で含有
せしめて液剤を製造した。

本品は、流行性結膜炎やインフルエンザなどのウィルス
性疾患の予防剤、治療剤として、噴霧用、点眼用、点鼻
用、うがい用に好適である。

実施例Ｃ−２注射剤 止環食塩水に、実施例Ｂ　−２（３）の方法で調製した
γ−インターフェロンを−当り１００，０００単位の割
合で含有せしめ、これを無菌的にｒ過し、得られるｒ液
を滅菌したガラス容器に２−ずつ採り、凍結乾燥して密
栓し、乾燥注射剤を得た。

本品は、実施例Ｃ−１の場合と同様にウィルス性疾患の
予防剤、治療剤として有利に利用できる。

また、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの悪性腫瘍の予防
剤、治療剤として、また、アトピー性アレルギー、悪性
貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなどの免
疫疾患の予防剤、治療剤としても好適である。

更に、メルフアラン、メントレキサート、ドキソルビシ
ンなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増強剤として利用する
ことも好都合である。

実施例Ｃ−３注射剤 生理食塩水に、実施例Ｂ−３の方法で調製したγ−イン
ターフェロン、リンパ芽球様細胞由来の天然型α−イン
ターフェロンおよびリンパ芽球様細胞由来の天然型ツモ
アネクロシスファクターヲ、−当りそれぞれ、１０，０
００単位、１００，０００単位および１００，０００単
位の割合で含有せしめ、これを無菌的にｒ過し、実施例
Ｃ−２と同様に凍結乾燥して乾燥注射剤を得た。

本品は、各種ウィルス性疾患の予防剤、治療剤として好
適である。

また、乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、白血病などの各種悪性
腫瘍の予防剤、治療剤として、また、アトピー性アレル
ギー、膠原病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス
などの免疫疾患の予防剤、治療剤としても好適である。

更に、テガフール、マイトマイシンＣ１硫酸ビンクリス
チンなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増強剤として利用す
ることも好都合である。

実施例Ｃ−４軟膏剤 実施例Ｂ　−１（３）の方法で調製したγ−インターフ
ェロンおよびリンパ芽球様細胞由来の天然型α−インタ
ーフェロンを、常法に従い少量の流動パラフィンに研和
した後、製品ダラム当りγ−インターフェロンおよびα
−インターフェロンがそれぞれ５０．０００単位および
５００，０００単位になるようワセリンを加えて混合し
、軟膏剤に得た。

本品は、ヘルペス、皮膚癌、アトピー性皮膚炎などの各
種皮膚疾患の予防剤、治療剤として好適である。

実施例Ｃ−５腸溶性錠剤 常法に従って、澱粉とマルトースとを基材として錠剤全
製造するに際し、実施例Ｂ−５の方法で調製したγ−イ
ンターフェロンおよびリンパ芽球様細胞由来の天然型ツ
モアネクロシス　ファクター金、１錠（２００■）当＃
）１０，０００単位ずつ含有せしめて錠剤を製造し、こ
れにメチルセルロース　フタレート？コーティングして
腸溶性錠剤を得た。

本品は、小腸、大腸などのウィルス性疾患の予防剤、治
療剤として有利に利用できる。

また、大腸癌、結腸癌、肝癌などの予防剤、治療剤とし
て、また、アトピー性アレルギー、重症筋無力症、関節
リウマチ、全身性エリテマトーデスなどの免疫疾患の治
療剤、予防剤としても有利に利用できる。

更に、ドキソルビシン、フルオロウラフル、マイトマイ
シンＣなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増強剤として利用
することも好都合である。

（発明の効果） 本文で詳記したように、従来、γ−インターフェロンは
、その産生量が不充分で、工業的に製造。

することはきわめて困難であった。これに対し、本発明
は、培養株化されたヒト由来の骨髄単球系細胞力、ｒ−
インターフェロン産生能の著しく大きいことを見いだし
、該細胞を用いるγ−インターフェロンの大量製造方法
を確立するものである。

また、このγ−インターフェロン全抗原とじたモノクロ
ーナル抗体の製造方法と、その抗体による精製方法を確
立し、得られたγ−インターフェロンを有効成分として
含有せしめｒ−インターフェロン感受性疾患の予防剤、
治療剤を完成するものである。この予防剤、治療剤は、
従来治療が困難とされているウィルス病、悪性腫瘍、免
疫疾患などの予防剤、治療剤として著効を示す。

本発明の産業的意義はきわめて大きい。

【図面の簡単な説明】

図において、第１図は、ＨＢＬ−３８細胞の位相差顕微
鏡写真を示す。 第２図は、ＨＢＬ−３８細胞の抜型分析の結果金示す写
真である′。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）培養株化されたヒト由来のγ−インターフェロン
   産生能を有する骨髄単球系細胞を用いてγ−インターフ
   ェロンを産生せしめ、これを採取することを特徴とする
   γ−インターフェロンの製造方法。
2. （２）骨髄単球系細胞が、ヒト以外の温血動物体内に移
   植させるか、またはヒト以外の温血動物体内もしくは体
   外に取り付けた拡散チャンバー内に移植されて、その温
   血動物の体液を受けながら増殖して得られる細胞である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載のγ−
   インターフェロンの製造方法。
3. （３）γ−インターフェロンの産生に際し、培養株化さ
   れたヒト由来のγ−インターフェロン産生能を有する骨
   髄単球系細胞に誘導剤を接触させることを特徴とする特
   許請求の範囲第（１）項または第（２）項記載のγ−イ
   ンターフェロンの製造方法。
4. （４）骨髄単球系細胞が、ＨＢＬ−３８、ＨＬ−６０、
   ＫＧ−１、ＭＬ−１、ＭＬ−２、ＭＬ−３、ＴＨＰ−１
   、Ｕ−９３７およびＣＴＶ−１から選ばれる細胞である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第（１）項、第（２）
   項または第（３）項記載のγ−インターフェロンの製造
   方法。
5. （５）培養株化されたヒト由来のγ−インターフェロン
   産生能を有する骨髄単球系細胞を用いてγ−インターフ
   ェロンを産生せしめ、これを採取し、得られるγ−イン
   ターフェロンを抗原としてヒト以外の温血動物を免疫し
   、該動物から抗体産生細胞を採取し、これと骨髄腫細胞
   とを融合せしめ、得られる融合細胞から抗γ−インター
   フェロン抗体産生能を有する融合細胞を選択し、次いで
   、この選択細胞を増殖させてγ−インターフェロンに特
   異性を示すモノクローナル抗体を産生せしめることを特
   徴とする抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体の
   製造方法。
6. （６）骨髄単球系細胞が、ヒト以外の温血動物体内に移
   植されるか、またはヒト以外の温血動物体内もしくは体
   外に取付けた拡散チャンバー内に移植されて、その温血
   動物の体液を受けながら増殖して得られる細胞であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第（５）項記載の抗γ−
   インターフェロンモノクローナル抗体の製造方法。
7. （７）モノクローナル抗体が、イムノグロブリンＧクラ
   スまたはイムノグロブリンＭクラスであることを特徴と
   する特許請求の範囲第（５）項または第（６）項記載の
   抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体の製造方法
   。
8. （８）培養株化されたヒト由来のγ−インターフェロン
   産生能を有する骨髄単球系細胞を用いてγ−インターフ
   ェロンを産生せしめ、これを抗γ−インターフェロンモ
   ノクローナル抗体を用いたカラムクロマトグラフィーに
   より精製することを特徴とするγ−インターフェロンの
   精製方法。
9. （９）骨髄単球系細胞が、ヒト以外の温血動物体内に移
   植させるか、またはヒト以外の温血動物体内もしくは体
   外に取り付けた拡散チャンバー内に移植されて、その温
   血動物の体液を受けながら増殖して得られる細胞である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第（８）項記載のγ−
   インターフェロンの精製方法。
10. （１０）抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体が
    、培養株化されたヒト由来のγ−インターフェロン産生
    能を有する骨髄単球系細胞を用いてγ−インターフェロ
    ンを産生せしめ、これを採取し、得られるγ−インター
    フェロンを抗原としてヒト以外の温血動物を免疫し、該
    動物から抗体産生細胞を採取し、これと骨髄腫細胞とを
    融合せしめ、得られる融合細胞から抗γ−インターフェ
    ロン抗体産生能を有する融合細胞を選択し、次いで、こ
    の選択細胞を増殖させてγ−インターフェロンに特異性
    を示すモノクローナル抗体を産生せしめ、採取されたも
    のであることを特徴とする特許請求の範囲第（８）項ま
    たは第（９）項記載のγ−インターフェロンの精製方法
    。
11. （１１）培養株化されたヒト由来のγ−インターフェロ
    ン産生能を有する骨髄単球系細胞を用いてγ−インター
    フェロンを産生せしめ、これを精製し採取されたγ−イ
    ンターフェロンを有効成分として含有せしめることを特
    徴とするγ−インターフェロン感受性疾患の予防剤およ
    び治療剤。
12. （１２）骨髄単球系細胞が、ヒト以外の温血動物体内に
    移植されるか、またはヒト以外の温血動物体内もしくは
    体外に取り付けた拡散チャンバー内に移植されて、その
    温血動物の体液を受けながら増殖して得られる細胞であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第（１１）項記載の
    γ−インターフェロン感受性疾患の予防剤および治療剤
    。
13. （１３）γ−インターフェロンの産生に際し、培養株化
    されたヒト由来のγ−インターフェロン産生能を有する
    骨髄単球系細胞に誘導剤を接触させることを特徴とする
    特許請求の範囲第（１１）項または第（１２）項記載の
    γ−インターフェロン感受性疾患の予防剤および治療剤
    。
14. （１４）骨髄単球系細胞が、ＨＢＬ−３８、ＨＬ−６０
    、ＫＧ−１、ＭＬ−１、ＭＬ−２、ＭＬ−３、ＴＨＰ−
    １、Ｕ−９３７およびＣＴＶ−１から選ばれる細胞であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第（１１）項、第（
    １２）項または第（１３）項記載のγ−インターフェロ
    ン感受性疾患の予防剤および治療剤。
15. （１５）有効成分として含有せしめるγ−インターフェ
    ロンが、抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体を
    用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し採取され
    たものであることを特徴とする特許請求の範囲第（１１
    ）項、第（１２）項、第（１３）項または第（１４）項
    記載のγ−インターフェロン感受性疾患の予防剤および
    治療剤。
16. （１６）γ−インターフェロンとともに他のリンホカイ
    ンを有効成分として含有せしめることを特徴とする特許
    請求の範囲第（１１）項、第（１２）項、第（１３）項
    、第（１４）項または第（１５）項記載のγ−インター
    フェロン感受性疾患の予防剤および治療剤。
17. （１７）他のリンホカインが、α−インターフェロン、
    β−インターフェロン、ツモアネクロシスファクター、
    リンホトキシン、インターロイキン２、Ｂ細胞分化因子
    から選ばれる１種または２種以上のリンホカインである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第（１１）項、第（１
    ２）項、第（１３）項、第（１４）項、第（１５）項ま
    たは第（１６）項記載のγ−インターフェロン感受性疾
    患の予防剤および治療剤。
18. （１８）γ−インターフェロン感受性疾患の予防剤およ
    び治療剤が、抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、抗腫瘍効果増強
    剤または免疫疾患治療剤であることを特徴とする特許請
    求の範囲第（１１）項、第（１２）項、第（１３）項、
    第（１４）項、第（１５）項、第（１６）項または第（
    １７）項記載のγ−インターフェロン感受性疾患の予防
    剤および治療剤。