JPS61115026A - 新リンホカイン２の製造方法 - Google Patents
新リンホカイン２の製造方法Info
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- JPS61115026A JPS61115026A JP60028396A JP2839685A JPS61115026A JP S61115026 A JPS61115026 A JP S61115026A JP 60028396 A JP60028396 A JP 60028396A JP 2839685 A JP2839685 A JP 2839685A JP S61115026 A JPS61115026 A JP S61115026A
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- lymphokine
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、腫瘍：ａ胞に対して細胞障害活性を有する新
リンホカインＨの製造方法に関する。
リンホカインＨの製造方法に関する。
腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有するリンホカインと
しては、リンホトキシンやツモア ネクロンス ファク
ターなどが知られている。
しては、リンホトキシンやツモア ネクロンス ファク
ターなどが知られている。
リンホトキシンは、青木隆−ほか共著「リンホカイ／」
新気疫学叢書６．８７〜１０５頁（１９７９年）医学書
院、Ｂｌｏｏｍ Ｂ、Ｌ％、 ＆Ｇｌａｄｅ Ｐ、Ｒ０
共編［Ｉｎ Ｖｉｔｒ。
新気疫学叢書６．８７〜１０５頁（１９７９年）医学書
院、Ｂｌｏｏｍ Ｂ、Ｌ％、 ＆Ｇｌａｄｅ Ｐ、Ｒ０
共編［Ｉｎ Ｖｉｔｒ。
ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ −ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｉｒｒｍｕｎｉｔｙ ＪＡｃａｄｅｍｉｃＬ’ｒｅｓ
ｓ （１９７１年）およびＣｅ１ｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ。
ｉｒｒｍｕｎｉｔｙ ＪＡｃａｄｅｍｉｃＬ’ｒｅｓ
ｓ （１９７１年）およびＣｅ１ｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ。
３８．３８８〜４０２頁（１９７８年）などに記載され
、ツモア ネクロシス ファクターは、Ｃａ ｒ ｓｗ
ｅ Ｌ Ｌ Ｅ 、Ａ。
、ツモア ネクロシス ファクターは、Ｃａ ｒ ｓｗ
ｅ Ｌ Ｌ Ｅ 、Ａ。
ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 Ｖｏｌ。７２、ｔ１α９ ３６６
６〜３６７０頁（１９７５年）およびＥ、 ｐｉｃｋ編
Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ
Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ Ｖｏｌ。■。
、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 Ｖｏｌ。７２、ｔ１α９ ３６６
６〜３６７０頁（１９７５年）およびＥ、 ｐｉｃｋ編
Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ
Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ Ｖｏｌ。■。
２３５〜２７２頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （
１９８１年）などに記載されている。
１９８１年）などに記載されている。
また、最近、大西治夫らが特開昭５８−１４６２９３号
公報でリンホカインの一種である抗；１Φ瘍性糖蛋白質
を明らかにしている。
公報でリンホカインの一種である抗；１Φ瘍性糖蛋白質
を明らかにしている。
本発明者らは、す／ホカインについて多年研究してきた
。その結果、従来知られているこれらリンホカインとは
全く違った理化学的性質を有する新リンホカインＩの存
在を認め、その製法を確立し、さらに各種悪性腫瘍細胞
に対する細胞障害活性を認め、その用途を確立して本発
明を完成した。
。その結果、従来知られているこれらリンホカインとは
全く違った理化学的性質を有する新リンホカインＩの存
在を認め、その製法を確立し、さらに各種悪性腫瘍細胞
に対する細胞障害活性を認め、その用途を確立して本発
明を完成した。
すなわち、本発明は、理化学的性質が、■分子量
２０．０００±２．ＯＯＯ
■等電点
ｐｌ、＝６．２±０．３
■ 易 動 度
Ｄｉｓｃ−ＰＡＧＥで、凡ｆ＝０．２９±０．０２■
紫外線吸収スペクトル ２８０口ｍ付近に最大吸収 ■ 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶エチルエー
テル、酢酸エチルまたはクロロホルムに離溶乃至不溶 ■ 呈色反応 ローリ−法まだはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す０作 用 Ｌ９２９細胞に対して細胞障害活性を示し、ＫＢ細胞に
対する細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を
実質的に示さず ■ 水浴液での活性安定性 ｐＨ７，２で３０分間保持する条件により６０℃まで安
定、４℃で１６時間保持する条件によりｐＨ４，０乃至
１１．０の範囲で安定 ■ −１０℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である新リ
ンホカイン■（本明細書を通じて、本物質を新リンホカ
イン１と言う。） の製造方法に関する。
紫外線吸収スペクトル ２８０口ｍ付近に最大吸収 ■ 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶エチルエー
テル、酢酸エチルまたはクロロホルムに離溶乃至不溶 ■ 呈色反応 ローリ−法まだはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す０作 用 Ｌ９２９細胞に対して細胞障害活性を示し、ＫＢ細胞に
対する細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を
実質的に示さず ■ 水浴液での活性安定性 ｐＨ７，２で３０分間保持する条件により６０℃まで安
定、４℃で１６時間保持する条件によりｐＨ４，０乃至
１１．０の範囲で安定 ■ −１０℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である新リ
ンホカイン■（本明細書を通じて、本物質を新リンホカ
イン１と言う。） の製造方法に関する。
新リンホカインＨの製法は、新すンホカイン■産生能を
有するヒト由来の細胞、例えば白血球、リンパ球、培養
株化された細胞などに誘導剤を作用させて生成せしめれ
ばよい。
有するヒト由来の細胞、例えば白血球、リンパ球、培養
株化された細胞などに誘導剤を作用させて生成せしめれ
ばよい。
ヒト由来の白血球、リンパ球は、ヒトから採取した血液
を分離して調製すればよい。
を分離して調製すればよい。
培養株化されたヒト由来の細胞は、常法に従って、生体
外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増殖させた？ｆａ胞が使用で
きる。
外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増殖させた？ｆａ胞が使用で
きる。
しかしながら、本発明の場合には、培養株化された細胞
の増殖に際し、ヒト以外の温血動物体内に直接移植する
か、または拡散チャ／・（−内へ接種して、その温血動
物の体液の供給を受けながら増殖させる方が望ましい。
の増殖に際し、ヒト以外の温血動物体内に直接移植する
か、または拡散チャ／・（−内へ接種して、その温血動
物の体液の供給を受けながら増殖させる方が望ましい。
即ち、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増殖させる場合と
は違って、高価な血清などを含む栄養培地が不要、また
は大幅に節約できるばかりではなく、細胞増殖中の維持
管理も極めて容易であり、その上、得られた細胞から誘
導生成される新すンホカイン■活性が高い特徴を有して
いる。
は違って、高価な血清などを含む栄養培地が不要、また
は大幅に節約できるばかりではなく、細胞増殖中の維持
管理も極めて容易であり、その上、得られた細胞から誘
導生成される新すンホカイン■活性が高い特徴を有して
いる。
ヒト以外の温血動物を利用する方法（は、培養株化され
たヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物体内に移植し
、あるいは、その動物の体液の供給を受けることのでき
る拡散チャンバーを動物体内に埋設して通常の飼育をす
れば、温血動物体から供給される栄養物を含有する体液
を利用してその細胞が容易に増殖しうるのである。
たヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物体内に移植し
、あるいは、その動物の体液の供給を受けることのでき
る拡散チャンバーを動物体内に埋設して通常の飼育をす
れば、温血動物体から供給される栄養物を含有する体液
を利用してその細胞が容易に増殖しうるのである。
更に、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増殖させる場合と
比較して、この細胞の増殖が安定であること、その増殖
速度が大きいこと、得られる細胞量が多いこと、更には
、細胞当りの新リンホカイン■の収量が著しく増加する
ことも大きな特徴である。
比較して、この細胞の増殖が安定であること、その増殖
速度が大きいこと、得られる細胞量が多いこと、更には
、細胞当りの新リンホカイン■の収量が著しく増加する
ことも大きな特徴である。
本発明で使用する培養株化されたヒト由来の細胞は、ヒ
ト以外の温血動物体内に移植して容易に増殖し得て、し
かも新すンホカイン■産生能を有する細胞であればよく
、例えば［蛋白質核酸酵素Ｖｏｗ、 ２０． ｍ ６
」６１６〜６４３ ｊＦ （１９７５年） Ｋ記載すれ
ているヒト由来の各種株化細胞を用いることができる。
ト以外の温血動物体内に移植して容易に増殖し得て、し
かも新すンホカイン■産生能を有する細胞であればよく
、例えば［蛋白質核酸酵素Ｖｏｗ、 ２０． ｍ ６
」６１６〜６４３ ｊＦ （１９７５年） Ｋ記載すれ
ているヒト由来の各種株化細胞を用いることができる。
とシわけ、［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
ＭｉｃｒＣ１１ｎｉｃａ１ Ｖｏｌ、 Ｉ Ｊ １１６
〜１１７頁（１９７５年）に記載されているＮａｍａｌ
ｖａ細胞、Ｉ 、 Ｍｉｙｏａｈｉ著［Ｎａｔｕｒｅ
Ｖｏｌ。２６７ ｊ ８４３〜８４４頁（１９７７年）
に記載されているＢＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬ、Ｌ−１細
胞、ＮＡＬＬ−１細胞、［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ ＩｒｒｍｕｎｏｌｏｇｙＶｏｌ、 １１３ Ｊ １
３３４〜１３４５ 頁（１９７４年）記載（７） Ｍ
−７００２細胞、Ｂ −７１０１細胞、「組織培養」第
６巻、第１３号、５２７〜５４６頁（１９８０年）に記
載されているＪＢＬ細胞、ＥＢＶ−８ａ細胞、Ｆ、 Ｂ
Ｖ −ｗａ細胞、ＥＢＶ−ＨＯ細胞、ＩＶＩＯＬＴ−
３細胞や、その他ＢＡＬＭ−２細胞、ｃｃ凡Ｆ−８Ｂ細
胞（ＡＴＣＣＣＣＬ。
ＭｉｃｒＣ１１ｎｉｃａ１ Ｖｏｌ、 Ｉ Ｊ １１６
〜１１７頁（１９７５年）に記載されているＮａｍａｌ
ｖａ細胞、Ｉ 、 Ｍｉｙｏａｈｉ著［Ｎａｔｕｒｅ
Ｖｏｌ。２６７ ｊ ８４３〜８４４頁（１９７７年）
に記載されているＢＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬ、Ｌ−１細
胞、ＮＡＬＬ−１細胞、［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ ＩｒｒｍｕｎｏｌｏｇｙＶｏｌ、 １１３ Ｊ １
３３４〜１３４５ 頁（１９７４年）記載（７） Ｍ
−７００２細胞、Ｂ −７１０１細胞、「組織培養」第
６巻、第１３号、５２７〜５４６頁（１９８０年）に記
載されているＪＢＬ細胞、ＥＢＶ−８ａ細胞、Ｆ、 Ｂ
Ｖ −ｗａ細胞、ＥＢＶ−ＨＯ細胞、ＩＶＩＯＬＴ−
３細胞や、その他ＢＡＬＭ−２細胞、ｃｃ凡Ｆ−８Ｂ細
胞（ＡＴＣＣＣＣＬ。
１２０ ）ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、ＤＮＤ−４１細胞な
どの株化されたリンパ芽球様細胞や、また、正常な単核
細胞、顆粒性白血球細胞などを各種ウィルス、薬剤、放
射線などで処理し培養株化させた訓肥などが好適である
。
どの株化されたリンパ芽球様細胞や、また、正常な単核
細胞、顆粒性白血球細胞などを各種ウィルス、薬剤、放
射線などで処理し培養株化させた訓肥などが好適である
。
また、これらヒト由来の細胞の祈すンホカイン■産生能
を有する遺伝子を、例えば、ポリエチレンゲルコールや
センダイウィルスなどを利用する細胞融合の手段、ＤＮ
ＡＩＪガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリ
メラーゼなどの酵素を利用する遺伝子組み換えの手段な
どによって処理し、その増殖速度を高めたす、細胞当り
の祈すンホカイン■産生能を高めたりして使用してもよ
く、本明細書に記載する株化細胞のみて限定されるもの
ではない。これらの細胞は、後に述べる新すンホカイ／
ＩＩを誘導生成させるまでの過程で、単独、または２種
以上を混合して自由に利用される。必要ならば、これに
、例えばヒトから採取し調製される白血球、す７７球な
どを併用することもできる。
を有する遺伝子を、例えば、ポリエチレンゲルコールや
センダイウィルスなどを利用する細胞融合の手段、ＤＮ
ＡＩＪガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリ
メラーゼなどの酵素を利用する遺伝子組み換えの手段な
どによって処理し、その増殖速度を高めたす、細胞当り
の祈すンホカイン■産生能を高めたりして使用してもよ
く、本明細書に記載する株化細胞のみて限定されるもの
ではない。これらの細胞は、後に述べる新すンホカイ／
ＩＩを誘導生成させるまでの過程で、単独、または２種
以上を混合して自由に利用される。必要ならば、これに
、例えばヒトから採取し調製される白血球、す７７球な
どを併用することもできる。
本発明で１吏用する温血動物は、ヒト由来の細胞が増殖
し得るものであればよく、例えばニワｌ−リ、ハトなど
の鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマ
、ウシ、モルモット、ラット、ヌードラット、ハムスタ
ー、−ＦＭマウス、ヌードマウスなどの哺乳類が使用で
きる。
し得るものであればよく、例えばニワｌ−リ、ハトなど
の鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマ
、ウシ、モルモット、ラット、ヌードラット、ハムスタ
ー、−ＦＭマウス、ヌードマウスなどの哺乳類が使用で
きる。
これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好ましくな
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
だけ抑えるため、使用する動物はできるだけ幼若な状態
、即ち卵、胚、胎児、まだは新生期、幼少期のものの方
が好ましい。
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
だけ抑えるため、使用する動物はできるだけ幼若な状態
、即ち卵、胚、胎児、まだは新生期、幼少期のものの方
が好ましい。
また、これら動物に例えば２００〜６００レム程度のエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処理をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処理をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。
使用する動物がヌードマウスあるい’′ｉヌードラット
の場合には、成長したものであっても免疫反応が弱いの
で、これらの前処理を必要とすることもなく、培養株化
されたヒト由来の細胞が移植でき、急速に増殖できるの
で特に好都合である。
の場合には、成長したものであっても免疫反応が弱いの
で、これらの前処理を必要とすることもなく、培養株化
されたヒト由来の細胞が移植でき、急速に増殖できるの
で特に好都合である。
まだ、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば先づハム
スターに移植し増殖させた後、この細胞を更にヌードマ
ウスに移植するなどのように、ヒト以外の温血動物間で
移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化したり、更
にそれらから誘導生成される新すンホカイン■量を増加
させることも自由である。
スターに移植し増殖させた後、この細胞を更にヌードマ
ウスに移植するなどのように、ヒト以外の温血動物間で
移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化したり、更
にそれらから誘導生成される新すンホカイン■量を増加
させることも自由である。
この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同線間、同門
間移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物
体内の部位は、移植した細胞が増殖しうる部位であれば
よく、例えば呆液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に礪は
一比る。
間移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物
体内の部位は、移植した細胞が増殖しうる部位であれば
よく、例えば呆液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に礪は
一比る。
また、動物体内にヒト由来の細胞を移植することなく、
動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例えば孔
径約１０−７〜ｔｏ−５ｍを有するメンブランフィルタ
−１限外濾過嘆またはフォローファイバーなどを設けた
公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、
例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む体
液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培、１
に株化されたヒト由来の細胞を何れも増殖させることが
できる。
動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例えば孔
径約１０−７〜ｔｏ−５ｍを有するメンブランフィルタ
−１限外濾過嘆またはフォローファイバーなどを設けた
公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、
例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む体
液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培、１
に株化されたヒト由来の細胞を何れも増殖させることが
できる。
また必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む溶
液を動物体内の体液と接続し、潅流させるようにしたチ
ャンバーを、例えば動物体表に取付け、チャンバー内の
ヒト由来の、■胞の増殖状態をその表面に設けた窓を通
じて透視できるようにすることも、また、このチャンバ
一部分のみを着脱交換できるようにして動物を屠殺せず
に寿命一杯細胞を増殖させて、動物個°体当９の細胞生
産量を更に高めることもできる。
液を動物体内の体液と接続し、潅流させるようにしたチ
ャンバーを、例えば動物体表に取付け、チャンバー内の
ヒト由来の、■胞の増殖状態をその表面に設けた窓を通
じて透視できるようにすることも、また、このチャンバ
一部分のみを着脱交換できるようにして動物を屠殺せず
に寿命一杯細胞を増殖させて、動物個°体当９の細胞生
産量を更に高めることもできる。
これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特徴
を有している。
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特徴
を有している。
移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育管理
を続ければよく、移植後といえども特別の取扱いは何ら
必要としないので好都合である。
を続ければよく、移植後といえども特別の取扱いは何ら
必要としないので好都合である。
ヒト由来の細胞を増殖させるだめの期間は通常１〜１０
週の期間で目的を達成することができる。
週の期間で目的を達成することができる。
このようにして得られるヒト由来の訓胞数は・均物個体
当り約１０ 〜ＩＯ個、またはそれ以上に達することも
見出した。
当り約１０ 〜ＩＯ個、またはそれ以上に達することも
見出した。
換言すれば、動物生体内で増殖させたヒト由来の細胞数
は、動物個体当り移植した細胞数の約１０〜ＩＯ倍、ま
たはそれ以上にも達し、生体外の栄養培地に接種して増
殖させる場合の約１０ 〜１０６倍・またはそれ以上に
も達して、新リンホカイン■の製造のために、儀めて好
都合である。
は、動物個体当り移植した細胞数の約１０〜ＩＯ倍、ま
たはそれ以上にも達し、生体外の栄養培地に接種して増
殖させる場合の約１０ 〜１０６倍・またはそれ以上に
も達して、新リンホカイン■の製造のために、儀めて好
都合である。
このようにして増殖させたヒト由来の細胞から新リンホ
カインＩＩを誘導生成させる方法は自由である。それが
、増殖した動物体内のままで新すンホカイン■誘導剤を
作用させることもできる。
カインＩＩを誘導生成させる方法は自由である。それが
、増殖した動物体内のままで新すンホカイン■誘導剤を
作用させることもできる。
例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の細
胞に、また皮下に生じた腫瘍細胞に、新すンホカインＨ
誘導剤を直接作用させて新リンホカインＩＩを誘導生成
させ、次いで、その血清、腹水または腫瘍から新リンホ
カインＩＩを精製採取すればよい。
胞に、また皮下に生じた腫瘍細胞に、新すンホカインＨ
誘導剤を直接作用させて新リンホカインＩＩを誘導生成
させ、次いで、その血清、腹水または腫瘍から新リンホ
カインＩＩを精製採取すればよい。
また、ヒト由来の増殖細胞をヒト以外の動物体内から取
り出し、生体外で新すンホカイン■誘導剤を作用させて
新リンホカインＩＩを誘導生成させることもできる。例
えば、腹水中で増殖したヒト由来の細胞を採取し、ｉた
は皮下に生じたヒト由来の細胞を含む腫瘍を摘出、分散
し、得られる細胞を約２０〜４０℃に保った栄養培地に
訓胞纜度が約１０ 〜ＬＯ／ｍｅになるよう浮遊させ、
これに新リンホカインＩＩ誘導剤を作用させることによ
って新リンホカインＩＩを誘導生成させ、これを積善採
取すればよい。
り出し、生体外で新すンホカイン■誘導剤を作用させて
新リンホカインＩＩを誘導生成させることもできる。例
えば、腹水中で増殖したヒト由来の細胞を採取し、ｉた
は皮下に生じたヒト由来の細胞を含む腫瘍を摘出、分散
し、得られる細胞を約２０〜４０℃に保った栄養培地に
訓胞纜度が約１０ 〜ＬＯ／ｍｅになるよう浮遊させ、
これに新リンホカインＩＩ誘導剤を作用させることによ
って新リンホカインＩＩを誘導生成させ、これを積善採
取すればよい。
更に、ヒト由来のＪ胞を拡散チャンバー内で増殖させた
場合は、増殖させた細胞をチャンバー内のままで、また
はチャンバーから取り出して、新すンホカイン■誘導剤
を作用させ、新リンホカイン■を誘導生成させることも
できる。
場合は、増殖させた細胞をチャンバー内のままで、また
はチャンバーから取り出して、新すンホカイン■誘導剤
を作用させ、新リンホカイン■を誘導生成させることも
できる。
また、前述のようにヒト以外の温血動物を利用して得ら
れるヒト由来の細胞を、必要ならば、四にインビトロで
１〜４日間程度培養し細胞の増殖世代を同調させるなど
した後、新り／ホヵイン■誘導剤を作用させ新リンホカ
インＩＩを誘導生成させることも自由である。
れるヒト由来の細胞を、必要ならば、四にインビトロで
１〜４日間程度培養し細胞の増殖世代を同調させるなど
した後、新り／ホヵイン■誘導剤を作用させ新リンホカ
インＩＩを誘導生成させることも自由である。
また、例えば、増殖させたヒト由来の細胞に先づ動物体
内のままで新リンホカインＩＩを誘導生成させた後、次
いで、同一動物個体の特定の部位または全体から採取し
たヒト由来の細胞に動物体外で新リンホカインＩＩを誘
導生成させる方法、また、一度新リンホカイン■の誘導
生成に使用した細胞を、更に２度以上新すンホカインＨ
の誘導生成文使用する方法、ま・たは動物体内に埋設、
若しくは接続するチャンバーを交換して得られる細胞数
を増加させる方法などによって、使用する動物個体当り
の新すンホカイン■生成量を更に高めることも自由であ
る。
内のままで新リンホカインＩＩを誘導生成させた後、次
いで、同一動物個体の特定の部位または全体から採取し
たヒト由来の細胞に動物体外で新リンホカインＩＩを誘
導生成させる方法、また、一度新リンホカイン■の誘導
生成に使用した細胞を、更に２度以上新すンホカインＨ
の誘導生成文使用する方法、ま・たは動物体内に埋設、
若しくは接続するチャンバーを交換して得られる細胞数
を増加させる方法などによって、使用する動物個体当り
の新すンホカイン■生成量を更に高めることも自由であ
る。
本発明のｉ ＩＪンホカイン■誘導剤としては、α−イ
ンターフェロン誘導剤として知られているウィルス、核
酸、ヌクレオチドなどやγ−インターフェロン誘導剤と
して知られているフィトヘマグルチニン、コンカナバリ
ンＡ１ポークウイードミトーゲン、リポポリサツカリド
、エンドトキシン、多糖類、細菌などが適宜用いられる
。また、感作化された細胞にとっては、抗原も新リンホ
カイン■の誘導剤である。
ンターフェロン誘導剤として知られているウィルス、核
酸、ヌクレオチドなどやγ−インターフェロン誘導剤と
して知られているフィトヘマグルチニン、コンカナバリ
ンＡ１ポークウイードミトーゲン、リポポリサツカリド
、エンドトキシン、多糖類、細菌などが適宜用いられる
。また、感作化された細胞にとっては、抗原も新リンホ
カイン■の誘導剤である。
更に、ヒト由来の細胞から新リンホカインＩＩを誘導生
成させるに際し、新すンホカイン■誘導剤トシて、α−
インターフェロン誘導剤とｒ−インターフェロン誘導剤
とを併用することにより新リンホカイン■の生産量を高
めることも自由である。
成させるに際し、新すンホカイン■誘導剤トシて、α−
インターフェロン誘導剤とｒ−インターフェロン誘導剤
とを併用することにより新リンホカイン■の生産量を高
めることも自由である。
まだ、これら誘導生成によって新リンホカイン■が産生
されるだけでなく、種特異性の高いヒトインターフェロ
ンも同時に産生されることが判明した。
されるだけでなく、種特異性の高いヒトインターフェロ
ンも同時に産生されることが判明した。
このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物質の同時
生産を可能にし、更に、ヒト由来の細胞の高度利用を可
能にし、新リンホカイン■及びヒトインターフェロンを
大量に安価に供給する点からきわめて好都合である。
生産を可能にし、更に、ヒト由来の細胞の高度利用を可
能にし、新リンホカイン■及びヒトインターフェロンを
大量に安価に供給する点からきわめて好都合である。
このようにして誘導生成された新リンホカイン■は、公
知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離
、濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易に精製分
離し、採取することができる。更に高度の精製を必要と
する場合には、例えば、イオン交換体への吸着−溶出、
ゲル、を慣通および等電点分画、電気泳動、イオン交換
クロマトグラフィー、高速度液体クロマトグラフィー、
カラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラ
フィーなど公知の方法を組合せれば、最高純度の新リン
ホカインＩＩを採取することも可能である。
知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離
、濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易に精製分
離し、採取することができる。更に高度の精製を必要と
する場合には、例えば、イオン交換体への吸着−溶出、
ゲル、を慣通および等電点分画、電気泳動、イオン交換
クロマトグラフィー、高速度液体クロマトグラフィー、
カラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラ
フィーなど公知の方法を組合せれば、最高純度の新リン
ホカインＩＩを採取することも可能である。
まだ、このようにして得られた新リンホカインＩＩを、
抗原としてヒト以外の温血動物を免疫し、該動物から抗
体産生細胞を採取して、この細胞と骨髄腫細胞とを融合
せしめ、得られる融合細胞から抗折リンホカイン■抗体
産生能を有する融合細胞を選択し、この選択細胞を増殖
させ、生成したモノクローナル抗体を、例えば、ブロム
シアン活性化セファロースと反応させて得られる固定化
モノクローナル抗体を用いて精製し、高純度の新リンホ
カイン■を高収率で採取することも有利に用いることが
できる。
抗原としてヒト以外の温血動物を免疫し、該動物から抗
体産生細胞を採取して、この細胞と骨髄腫細胞とを融合
せしめ、得られる融合細胞から抗折リンホカイン■抗体
産生能を有する融合細胞を選択し、この選択細胞を増殖
させ、生成したモノクローナル抗体を、例えば、ブロム
シアン活性化セファロースと反応させて得られる固定化
モノクローナル抗体を用いて精製し、高純度の新リンホ
カイン■を高収率で採取することも有利に用いることが
できる。
このようにして精製し製造された新リンホカイン■は、
理化学的性質が ■分子量 ２０．０００±２． ＯＯ’０ ■等電点 ｐ Ｉ ＝ ６．２±０．３ ■易動度 Ｄｉｓｃ −ＰＡＧＥで、Ｒｆ＝０．２９±０．０２■
紫外線吸収スペクトル ２８０ ｎｍ付近に最大吸収 ■ 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水寸たはリン酸塩緩衝液に可Ｍエチルエー
テル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不溶 ■ 呈色反応 ローリ−法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す０作 用 Ｌ９２９細胞に対して細胞障害活性を示し、ＫＢ細胞に
対する細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を
実質的に示さず ■ 水浴液での活性安定性 ｐＨ７，２で３０分間保持する条件により６０℃まで安
定、４℃で１６時間保持する条件によりｐＨｔｌ、０乃
至１１．０の範囲で安定 ■ −１０℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定であること
が判明した。
理化学的性質が ■分子量 ２０．０００±２． ＯＯ’０ ■等電点 ｐ Ｉ ＝ ６．２±０．３ ■易動度 Ｄｉｓｃ −ＰＡＧＥで、Ｒｆ＝０．２９±０．０２■
紫外線吸収スペクトル ２８０ ｎｍ付近に最大吸収 ■ 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水寸たはリン酸塩緩衝液に可Ｍエチルエー
テル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不溶 ■ 呈色反応 ローリ−法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す０作 用 Ｌ９２９細胞に対して細胞障害活性を示し、ＫＢ細胞に
対する細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を
実質的に示さず ■ 水浴液での活性安定性 ｐＨ７，２で３０分間保持する条件により６０℃まで安
定、４℃で１６時間保持する条件によりｐＨｔｌ、０乃
至１１．０の範囲で安定 ■ −１０℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定であること
が判明した。
また、新リンホカイン■は、マウスＬ９２９細胞のみな
らず、多くのヒト原動細胞に障害を与え死滅させる能力
を有しているが、ヒト正常訓胞には実質的に障害を与え
ないことも判明した。
らず、多くのヒト原動細胞に障害を与え死滅させる能力
を有しているが、ヒト正常訓胞には実質的に障害を与え
ないことも判明した。
従って、新リンホカイン■は、これを含有する組成物な
どとして、新リンホカイン「感受性疾患、例えば、悪性
腫瘍の予防剤、治療剤なかでも、従来、治療がきわめて
困難とされていたヒトの各種悪性腫瘍治療剤として有利
に用いることができる。
どとして、新リンホカイン「感受性疾患、例えば、悪性
腫瘍の予防剤、治療剤なかでも、従来、治療がきわめて
困難とされていたヒトの各種悪性腫瘍治療剤として有利
に用いることができる。
新リンホカインＨの活性は、標的細胞としてＫＢ細胞、
またはＬ９２９細胞を用いて測定した。即ち、Ｋ Ｂ細
胞を用いる場合には、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒａｐｙＲｅｐｏｒｔｓ ＰａｒｔＳ ３、Ｖｏｌ、
３、ｍ２、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９７２の記載に準じ
て、ＫＢ細胞の増殖抑制活性を測定し、Ｌ９２９細胞を
用いる場合には、Ｅ、 Ｐｉｃｋ編、ＴｕｍｏｙＮｅｃ
ｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ”Ｌｙｍｐｈｏｋｉ
ｎｅｓ” Ｖｏｌ、［、ｐｐ。
またはＬ９２９細胞を用いて測定した。即ち、Ｋ Ｂ細
胞を用いる場合には、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒａｐｙＲｅｐｏｒｔｓ ＰａｒｔＳ ３、Ｖｏｌ、
３、ｍ２、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９７２の記載に準じ
て、ＫＢ細胞の増殖抑制活性を測定し、Ｌ９２９細胞を
用いる場合には、Ｅ、 Ｐｉｃｋ編、ＴｕｍｏｙＮｅｃ
ｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ”Ｌｙｍｐｈｏｋｉ
ｎｅｓ” Ｖｏｌ、［、ｐｐ。
２４５〜２４９、Ａｃｂｄｅｍｉｃ ）’ｒｅｓｓ （
１９８１年）の記載に準じて、アクチノマイシンＤ存在
下でのＬ９２９細胞に与える細胞障害活性を測定した。
１９８１年）の記載に準じて、アクチノマイシンＤ存在
下でのＬ９２９細胞に与える細胞障害活性を測定した。
本明細書では、特にことわらない限り、Ｌ９２９細胞・
を用いる活性測定方法を採用した、 ヒトに種特異性の高いインターフェロンの活性ハ［蛋白
質核酸酵素Ｊ Ｖｏｌ、２０． Ｎａ ６．６１６〜６
４３頁（１９７５年）に報告されているヒト羊膜由来の
ＦＬ細胞を１吏用して公知のプラーク半減法で」１１定
した。
を用いる活性測定方法を採用した、 ヒトに種特異性の高いインターフェロンの活性ハ［蛋白
質核酸酵素Ｊ Ｖｏｌ、２０． Ｎａ ６．６１６〜６
４３頁（１９７５年）に報告されているヒト羊膜由来の
ＦＬ細胞を１吏用して公知のプラーク半減法で」１１定
した。
赤血球凝集価はＪ、Ｅ、 ５ａｌｋ著［’Ｉ’ｈｅ Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆ Ｉｒｒｍｕｎｃｌｏｇｙ ｊ Ｖｏ
ｌ、−１９，８７頁、（１９４４年）の方法に準じて測
定した。
ｏｕｒｎａｌｏｆ Ｉｒｒｍｕｎｃｌｏｇｙ ｊ Ｖｏ
ｌ、−１９，８７頁、（１９４４年）の方法に準じて測
定した。
次に、本発明を実験で説明する。
実験Ａ−１部分精製した新リンホカインＨの調製新生児
のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製した抗血
清を注射して、ハムスターの免疫反応を弱めた後、その
皮下にｊ：ｉＡＬＬ−ＩＭ胞を移植し、その後通常の方
法で３週間飼育した。皮下に生じだ腫瘤を摘出して細切
し、生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細胞を
血清添加の凡ＰＭＩ １６４０培地（ｐＨ７，２）で
洗浄し、同培地に約２Ｘ１０／、、ｖｌになるよう４濁
した。本細胞懸濁液に対して、ｒａｔ当り約４００赤血
球凝集価のセンダイウィルスを添加し、３７℃で２４時
間保って新リンホカインＩＩを誘導生成させた。
のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製した抗血
清を注射して、ハムスターの免疫反応を弱めた後、その
皮下にｊ：ｉＡＬＬ−ＩＭ胞を移植し、その後通常の方
法で３週間飼育した。皮下に生じだ腫瘤を摘出して細切
し、生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細胞を
血清添加の凡ＰＭＩ １６４０培地（ｐＨ７，２）で
洗浄し、同培地に約２Ｘ１０／、、ｖｌになるよう４濁
した。本細胞懸濁液に対して、ｒａｔ当り約４００赤血
球凝集価のセンダイウィルスを添加し、３７℃で２４時
間保って新リンホカインＩＩを誘導生成させた。
これを約４℃、約１，０００，９で遠心分離し、沈澱物
を除去し、得られた上清をｐＨ７，２，０，０１Ｍリン
酸塩緩衝液を含有する生理的食塩水で加時間透析し、更
に、精密濾過して得た濾液を、抗インターフェロン抗体
を固定比している抗体カラムに流し、その非吸着画分を
採取し、更に、これをクロマトフォーカノシング法によ
シ活性画分を採取し、濃縮し、凍結乾燥して新すンホカ
イン■活性を含有する粉末を得だ。
を除去し、得られた上清をｐＨ７，２，０，０１Ｍリン
酸塩緩衝液を含有する生理的食塩水で加時間透析し、更
に、精密濾過して得た濾液を、抗インターフェロン抗体
を固定比している抗体カラムに流し、その非吸着画分を
採取し、更に、これをクロマトフォーカノシング法によ
シ活性画分を採取し、濃縮し、凍結乾燥して新すンホカ
イン■活性を含有する粉末を得だ。
本粉末の比活性は、約ＩＯ単位／ｍ９蛋白質であった。
まだ、新リンホカイン■の収量は、ハムスター１匹当り
約２．０００万年位であった。
約２．０００万年位であった。
実験Ａ−２抗折リンホカイン［抗体の調製実９ Ａ −
Ｌの方法で得た新リンホカインＩＩを生理食塩水に蛋白
質・４度として約０．０５ ｗ ／ ｖ％になるように
磐解し、これとフロでント完全アジーパント乳化液とを
等量混合して、この混合液０．２ｒｎｅをマウスの皮下
に注射し、７日後再び同様に注射してマウスを免疫した
。その抗体産生能を有する細胞に抗折すンホカイン■抗
体を誘導生成せしめ、このマウスからひ臓を摘出し１１
則切分散して得られるひ臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｌ’
３− Ｘ ６３− Ａｇ ８（Ｐｌｏｗ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ社製）とを、血清無含有Ｅａｇｌｅの最少
基本培地で調製した５０Ｗ／ｖ％ポリエチレングリコー
ル−１０００溶液（ｐＨ７，２、温度３７℃）に、それ
ぞれ１０ ／ａｔになるように浮遊させて５分間保っ
た後、前記基本培地で加倍に希釈し、次いで、［）ａｖ
ｉｓｏｎなどがＳｏｍａｔｉｃ Ｃｅ目Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ 。
Ｌの方法で得た新リンホカインＩＩを生理食塩水に蛋白
質・４度として約０．０５ ｗ ／ ｖ％になるように
磐解し、これとフロでント完全アジーパント乳化液とを
等量混合して、この混合液０．２ｒｎｅをマウスの皮下
に注射し、７日後再び同様に注射してマウスを免疫した
。その抗体産生能を有する細胞に抗折すンホカイン■抗
体を誘導生成せしめ、このマウスからひ臓を摘出し１１
則切分散して得られるひ臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｌ’
３− Ｘ ６３− Ａｇ ８（Ｐｌｏｗ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ社製）とを、血清無含有Ｅａｇｌｅの最少
基本培地で調製した５０Ｗ／ｖ％ポリエチレングリコー
ル−１０００溶液（ｐＨ７，２、温度３７℃）に、それ
ぞれ１０ ／ａｔになるように浮遊させて５分間保っ
た後、前記基本培地で加倍に希釈し、次いで、［）ａｖ
ｉｓｏｎなどがＳｏｍａｔｉｃ Ｃｅ目Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ 。
Ｖｏｌ、２．１７５〜１７６頁（１９７６年）ニ報告シ
テイル方法に準じてヒポキサンチン−アミノプテリン−
チミジン培養液で増殖しうる融合細胞を採取し、この融
合細胞から抗折リンホカイン■抗体産生能を有する融合
細胞を選択した。得られた融合細胞をマウス腹腔内に１
匹当り約１０ 個移植して２週間飼育した後、これを
屠殺して腹水、血液などの体液を集め、遠心分離１．、
この上清を硫安塩析して飽和度３０〜５０％の沈澱画分
を集め、次いで透析し、更に、この液を、実験Ａ−１の
方法で得だ新リンホカインＩＩをプロムンアン活性化七
ファロースと室温下で反応させて得られる固定化新すン
ホカイン■ゲルを用いてアフィニティクロマトグラフィ
ーを行ない、抗折リンホカイン■抗体画分を得、透析し
た後濃縮し、凍結乾燥して新リンホカインＨのモノクロ
ーナル抗体粉末を採取した。
テイル方法に準じてヒポキサンチン−アミノプテリン−
チミジン培養液で増殖しうる融合細胞を採取し、この融
合細胞から抗折リンホカイン■抗体産生能を有する融合
細胞を選択した。得られた融合細胞をマウス腹腔内に１
匹当り約１０ 個移植して２週間飼育した後、これを
屠殺して腹水、血液などの体液を集め、遠心分離１．、
この上清を硫安塩析して飽和度３０〜５０％の沈澱画分
を集め、次いで透析し、更に、この液を、実験Ａ−１の
方法で得だ新リンホカインＩＩをプロムンアン活性化七
ファロースと室温下で反応させて得られる固定化新すン
ホカイン■ゲルを用いてアフィニティクロマトグラフィ
ーを行ない、抗折リンホカイン■抗体画分を得、透析し
た後濃縮し、凍結乾燥して新リンホカインＨのモノクロ
ーナル抗体粉末を採取した。
本品は、祈リンホカイン■の細胞障害活性に対して免疫
学的に特異的な中和活性を示しだ。
学的に特異的な中和活性を示しだ。
実験Ａ−３高純度に精製した新リンホカイン■の調製と
その理化学的性質 実験Ａ−１の方法で調製した新リンホカインＨの部分精
製品を、実験Ａ−２の方法で調製したモノクローナル抗
体を固定化したゲルを用いてアフィニティクロマトグラ
フィーを行ない新リンホカイン■の活性画分を採取し、
透析し、濃縮して凍結乾燥した。
その理化学的性質 実験Ａ−１の方法で調製した新リンホカインＨの部分精
製品を、実験Ａ−２の方法で調製したモノクローナル抗
体を固定化したゲルを用いてアフィニティクロマトグラ
フィーを行ない新リンホカイン■の活性画分を採取し、
透析し、濃縮して凍結乾燥した。
本品は、高純度に精製された新リンホカイン■であって
、その比活性は、約ＩＯ単位／Ｉｎ９蛋白質であった。
、その比活性は、約ＩＯ単位／Ｉｎ９蛋白質であった。
本品を用いて、理化学的性質を調査した。
■分子゛量
に、 Ｗｅｂｅｒ ａｎｄ Ｍ、 ０ｓｂｏｒｎ １Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。
、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。
ＶＯｌ、 ２４４．４４０６ 頁（１９６９年）ノ記載
Ｋｍ Ｌ、 テ、８ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により調べた。即ち、０．１％ＳＤＳ存在下、１０
％アクリルアミドゲルカラムに試料約１０μ２を負荷し
、カラム当り８ｍＡで４時間泳動後、抽出し、その活性
測定から分子量を求めたところ、２０．０００士２，０
００であった。
Ｋｍ Ｌ、 テ、８ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により調べた。即ち、０．１％ＳＤＳ存在下、１０
％アクリルアミドゲルカラムに試料約１０μ２を負荷し
、カラム当り８ｍＡで４時間泳動後、抽出し、その活性
測定から分子量を求めたところ、２０．０００士２，０
００であった。
■等電点
スウェーデン、ＬＫＢ社製、等電点′電気泳動用ゲル、
商品名ＡＭＰＨＯＩ！、ＩＮＥ ＰＡ（）ＰＬＡＴＥ
（ｐＨ３，５〜９．５）を用いて、２５Ｗ、２時間泳動
した結果、等電点ｐＩは６．２±０．３であった。
商品名ＡＭＰＨＯＩ！、ＩＮＥ ＰＡ（）ＰＬＡＴＥ
（ｐＨ３，５〜９．５）を用いて、２５Ｗ、２時間泳動
した結果、等電点ｐＩは６．２±０．３であった。
■ 電気易動度
Ｂ、Ｊ、 Ｄａｖｉｓ 、 Ａｎｎ、 Ｎ、Ｙ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、、 Ｖｏｌ。
ａｄ、 Ｓｃｉ、、 Ｖｏｌ。
１２１．４０４頁（１９６４年）の記載に準じて、７．
５％アクリルアミドゲルカラムに試料約１０μ２負荷し
、ｐＨ８，３、カラム当９３ ｍＡで２時間泳動後、抽
出してその活性測定から電気易動度を述めだところ、Ｒ
，ｆＯ，２９±０．０２であった。
５％アクリルアミドゲルカラムに試料約１０μ２負荷し
、ｐＨ８，３、カラム当９３ ｍＡで２時間泳動後、抽
出してその活性測定から電気易動度を述めだところ、Ｒ
，ｆＯ，２９±０．０２であった。
■ 紫外線吸収スペクトル
株式会社島津製作所製の分光光電計、商品名Ｕ Ｖ −
２５０を用いて紫外部での吸収スペクトルを調べた結果
、２８０ ｎｍ付近に最大吸収を示した。
２５０を用いて紫外部での吸収スペクトルを調べた結果
、２８０ ｎｍ付近に最大吸収を示した。
■ 溶剤に対する溶解性
水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶エチルエー
テル、酢酸エチルまたはクロロポルムに難溶乃至不溶で
あった。
テル、酢酸エチルまたはクロロポルムに難溶乃至不溶で
あった。
■ 呈色反応
ローリ−法まだはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質！趨性反応を示した。
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質！趨性反応を示した。
■作 用
Ｌ９２９細胞に対して細胞障害活性を示しだ。ＫＢ細胞
に対する細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性
は実質的に示さなかっだっ■ 水溶液での活性安定性 １）熱安定性 約１×１０５単位／ｍｌの試料を各温トｙによりｐＨ７
，２で３０分間保持した後、残存する活性を測定した結
果、６０ ℃まで安定であった。
に対する細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性
は実質的に示さなかっだっ■ 水溶液での活性安定性 １）熱安定性 約１×１０５単位／ｍｌの試料を各温トｙによりｐＨ７
，２で３０分間保持した後、残存する活性を測定した結
果、６０ ℃まで安定であった。
２） ｐＨ安定性
約１×１０６単位／ｍｌの試料０．１ｍＡを各ｐＨ緩８
Ｄ、（ｐＨ２＋ｖ７−＝ Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ ｂｕＨ
ｅｒ、 ｐＨ７ゝ８ ＝−）’ｈｏｓｐｈａｔ ｂｕ
ｆｆｅｒ、 ｐＨ８〜１１− Ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｎａ
ＯＨｂｕｆｆｅｒ ） １ ｍｌに加え、４℃で１６時
間保持した後、この０．１ｍＡをｐＨ７，２，０，０５
Ｍリン酸塩緩衝液でｐＨ７，２に調整して残存する活性
を測定した結果、ｐＨ４，０乃至１１．０の絶間で安定
であった。
Ｄ、（ｐＨ２＋ｖ７−＝ Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ ｂｕＨ
ｅｒ、 ｐＨ７ゝ８ ＝−）’ｈｏｓｐｈａｔ ｂｕ
ｆｆｅｒ、 ｐＨ８〜１１− Ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｎａ
ＯＨｂｕｆｆｅｒ ） １ ｍｌに加え、４℃で１６時
間保持した後、この０．１ｍＡをｐＨ７，２，０，０５
Ｍリン酸塩緩衝液でｐＨ７，２に調整して残存する活性
を測定した結果、ｐＨ４，０乃至１１．０の絶間で安定
であった。
３）ディスパーゼ（Ｉ）ＩＳＰＡＳＥ）に対する安定性
約ｌＸＩＯ３単位／ ｍｌの試料にディスパーゼ（合同
酒精株式会社製造のバシラス属細菌由来のプロテアーゼ
）１００単位／ｍｌになるように加え、ｐＨ７，２、温
度３７℃でＯ乃至２時間反応させ、経済的にサンプリン
グし、牛血清アルブミンを１ｗ／ｖ％になるように加え
て反応を止めた。この液の新リンホカイン［の残存活性
を測定した結果、析す／ホカイン■はディスバーゼ処理
により不安定−で、その反応につれて新リンホカイン■
の活性が失なわれた。
約ｌＸＩＯ３単位／ ｍｌの試料にディスパーゼ（合同
酒精株式会社製造のバシラス属細菌由来のプロテアーゼ
）１００単位／ｍｌになるように加え、ｐＨ７，２、温
度３７℃でＯ乃至２時間反応させ、経済的にサンプリン
グし、牛血清アルブミンを１ｗ／ｖ％になるように加え
て反応を止めた。この液の新リンホカイン［の残存活性
を測定した結果、析す／ホカイン■はディスバーゼ処理
により不安定−で、その反応につれて新リンホカイン■
の活性が失なわれた。
■ 凍結貯蔵による安定性
ｐＨ７，２の水溶液を一１０℃で凍結し１ケ月間貯蔵し
た後、融解し、活性を測定した結果、活性の低下は見ら
れなかった。
た後、融解し、活性を測定した結果、活性の低下は見ら
れなかった。
以上のｐｌから、新リンホカイン■は、従来知られてい
るリンホトキシン、ＴＮＦ１インターフェロンなどのリ
ンホカインとは、明らかに違った理化学的性質を有する
１、 実験Ｂ−１悪性腫瘍細胞に対する増殖抑制作用実験Ａ−
１、または実験Ａ−３の方法で得た新リンホカインＩＩ
を用いて、ヒト由来の各種細胞に対する増殖抑制作用を
調べた。
るリンホトキシン、ＴＮＦ１インターフェロンなどのリ
ンホカインとは、明らかに違った理化学的性質を有する
１、 実験Ｂ−１悪性腫瘍細胞に対する増殖抑制作用実験Ａ−
１、または実験Ａ−３の方法で得た新リンホカインＩＩ
を用いて、ヒト由来の各種細胞に対する増殖抑制作用を
調べた。
牛胎児血清を補足した公知の栄養培地１ ｒｎｌにヒト
由来の各種細胞を１０６個ずつとり、１日培養した後、
これに実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方法で調製した
新リンホカインＩＩを関単位または５００単位含有する
生理食塩水０．１ｒｎｌを加え、３７℃で２日間培養し
た。培養終了後、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙＶｏｌ、２２、ｍ４．６７１〜６７７頁（１９７
１年）に記載されている方法に準じて、染色剤ニュート
ラルレッドで生細胞を染色し、続いて、この染色剤をア
ンドエタノールで溶出し、溶出液の５４０ｎｍにおける
吸光度から生細胞量を測定した。
由来の各種細胞を１０６個ずつとり、１日培養した後、
これに実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方法で調製した
新リンホカインＩＩを関単位または５００単位含有する
生理食塩水０．１ｒｎｌを加え、３７℃で２日間培養し
た。培養終了後、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙＶｏｌ、２２、ｍ４．６７１〜６７７頁（１９７
１年）に記載されている方法に準じて、染色剤ニュート
ラルレッドで生細胞を染色し、続いて、この染色剤をア
ンドエタノールで溶出し、溶出液の５４０ｎｍにおける
吸光度から生細胞量を測定した。
なお、対照実験には、新リンホカイン■を含まない生理
食塩水０．１ｒｎｌを用いた。
食塩水０．１ｒｎｌを用いた。
細胞の増殖抑制率（％）は、次の式から算出した。
細胞増殖押割率（％）＝
その結果を、第１表に示しだ。
第 １ 表
第１表の結果から明らかなように、新リンホカイン■は
、正常細胞に対してほとんど影響を与えず、各種の悪性
腫瘍細胞に対してはその増殖を著るしく抑制することが
判明した。また、その効果は、高度に精製したもののみ
ならず、部分精製したものであってもよいことが判明し
た。
、正常細胞に対してほとんど影響を与えず、各種の悪性
腫瘍細胞に対してはその増殖を著るしく抑制することが
判明した。また、その効果は、高度に精製したもののみ
ならず、部分精製したものであってもよいことが判明し
た。
実験Ｂ−２
ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、マウス肉腫Ｍｅｔｈ−Ａ細胞を
移植し、その移植後１０日１から、実験Ａ−３の方法で
得られた新リンホカインＩＩを生理食塩水に爵解した状
態で、毎日１回、１００または１．．０００単位１ＩＧ
ｆｌずつ１５日間静脈注射を行った。その後、マウスを
屠殺して腫瘍の重量を測定した。
移植し、その移植後１０日１から、実験Ａ−３の方法で
得られた新リンホカインＩＩを生理食塩水に爵解した状
態で、毎日１回、１００または１．．０００単位１ＩＧ
ｆｌずつ１５日間静脈注射を行った。その後、マウスを
屠殺して腫瘍の重量を測定した。
その結果を、第２表に示した。
第 ２ 表
来 危険率５％以乍で、対照の値に比較し、推計学的に
有意差あり。
有意差あり。
実験Ｂ−３
ＢＡＬＢ／Ｃ由来ヌードマウスにヒト乳癌組織片を背部
皮下に移植し、その；重傷体積が約２００朋３になった
時期から、実験Ａ−１、または実験へ−３の方法で得ら
れた新リンホカインＩＩを生理食塩水に溶解した状態で
、毎日１回、１００まだは１，０００単位／にｇずつ四
日間静脈注射を行った。その後、ヌードマウスを屠殺し
て腫瘍の重量を測定した。
皮下に移植し、その；重傷体積が約２００朋３になった
時期から、実験Ａ−１、または実験へ−３の方法で得ら
れた新リンホカインＩＩを生理食塩水に溶解した状態で
、毎日１回、１００まだは１，０００単位／にｇずつ四
日間静脈注射を行った。その後、ヌードマウスを屠殺し
て腫瘍の重量を測定した。
その結果を、第３表に示した。
米 危険率５％以下で、対照の値に比較し、推計学的に
有意差あり。
有意差あり。
実験Ｂ−４
生後加重のマウスを使用して、実験Ａ−３の方法で得ら
れた新リンホカインＨの急性毒性試験をしたところ、新
リンホカイン■の毒性は極めて低く、腹腔内に注射した
時のＬＤｓｏは、１０９単位以上であることが判明した
。
れた新リンホカインＨの急性毒性試験をしたところ、新
リンホカイン■の毒性は極めて低く、腹腔内に注射した
時のＬＤｓｏは、１０９単位以上であることが判明した
。
以上の実験からも明らかなように、本発明の新リンホカ
イン■は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず、生
体内においても悪性腫瘍の増殖抑制に有効で６９、その
有効用量から見て安定性は極めて高い０ 本発明の新リンホカイン■の成人１日当シの用量は５〜
５００，０００，０００単位であり、好ましくは局所−
注射および点眼などの局所適用用量は５〜１０，０００
，０００単位、軟膏または坐剤などの経皮または経粘皮
適用の場合１０〜５０，０００，０００単位、静注およ
び筋注など全身注射の場合５０〜１００，０００，００
０単位、経口投与の場合５００〜５００，０００，００
０単位であるが、用法あるいは症状に応じて適宜増減す
ることができる。必要に応じて任意、慣用の製薬用担体
、基剤あるいは賦形剤とともに慣用の方法で医薬用製剤
に調製することができる。その１吏用竜は、新リンホカ
イン■の毒性、有効量および安全性を考慮すると医薬用
製剤ダラム当９５単位以上の新リンホカインＩＩを含有
せしめるのが望ましい。
イン■は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず、生
体内においても悪性腫瘍の増殖抑制に有効で６９、その
有効用量から見て安定性は極めて高い０ 本発明の新リンホカイン■の成人１日当シの用量は５〜
５００，０００，０００単位であり、好ましくは局所−
注射および点眼などの局所適用用量は５〜１０，０００
，０００単位、軟膏または坐剤などの経皮または経粘皮
適用の場合１０〜５０，０００，０００単位、静注およ
び筋注など全身注射の場合５０〜１００，０００，００
０単位、経口投与の場合５００〜５００，０００，００
０単位であるが、用法あるいは症状に応じて適宜増減す
ることができる。必要に応じて任意、慣用の製薬用担体
、基剤あるいは賦形剤とともに慣用の方法で医薬用製剤
に調製することができる。その１吏用竜は、新リンホカ
イン■の毒性、有効量および安全性を考慮すると医薬用
製剤ダラム当９５単位以上の新リンホカインＩＩを含有
せしめるのが望ましい。
新リンホカインＨを含有する新すンホカイン■感受性疾
患予防剤、若しくは治療剤は、その目的に応じてその形
状を自由に選択できる。
患予防剤、若しくは治療剤は、その目的に応じてその形
状を自由に選択できる。
経口投与剤としては、カプセル剤、錠剤、散剤などのｌ
ｉ！ｌＪ溶製剤、直腸内投与剤としては直腸坐剤、注射
剤としては、例えば、用量に注射用蒸溜水に溶解して使
用する凍結乾燥注射剤、その他点鼻もしくは点眼、軟膏
剤として用いることもできる。
ｉ！ｌＪ溶製剤、直腸内投与剤としては直腸坐剤、注射
剤としては、例えば、用量に注射用蒸溜水に溶解して使
用する凍結乾燥注射剤、その他点鼻もしくは点眼、軟膏
剤として用いることもできる。
また、新リンホカイン■を用いて悪性腫瘍を治療するに
際し、例えば、患者の腫瘍の一部を取り、これを新リン
ホカイン■で処理することによって、その腫瘍の免疫原
性を高めだ後、腫瘍患者の体内に戻すことにより、この
悪性腫瘍の治療をより効果的に行うこともできる。また
、新リンホカイン■と共に各種抗腫瘍剤、例えばインタ
ーフェロン、ＴＮＦ、 リンホトキシン、ＴＣＧＦなど
の他のリンホカイン、β−１，３グルカン、リポポリサ
ツカリドなどの抗腫瘍性多糖類、５−ＦＵなどの代謝拮
抗剤、マイトマイシンなどの抗生物質などと併用して新
リンホカイン■の抗腫瘍効果を更に高めることも有利に
実施できる。
際し、例えば、患者の腫瘍の一部を取り、これを新リン
ホカイン■で処理することによって、その腫瘍の免疫原
性を高めだ後、腫瘍患者の体内に戻すことにより、この
悪性腫瘍の治療をより効果的に行うこともできる。また
、新リンホカイン■と共に各種抗腫瘍剤、例えばインタ
ーフェロン、ＴＮＦ、 リンホトキシン、ＴＣＧＦなど
の他のリンホカイン、β−１，３グルカン、リポポリサ
ツカリドなどの抗腫瘍性多糖類、５−ＦＵなどの代謝拮
抗剤、マイトマイシンなどの抗生物質などと併用して新
リンホカイン■の抗腫瘍効果を更に高めることも有利に
実施できる。
以下、本発明の２〜３の実施例を述べる。
実施例 ｌ
ヒト由来のリンパ芽球様細胞ＢＡＬＬ−１細胞を牛胎児
血清を加％補足したＥａｇｌｅの最少基本培地（ｐＨ７
，４）に接種し、３７℃で常法に従い生体外（ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ）に浮遊培養した。得られた細胞を血清無添加
のＥａｇｌｅの最少基本培地（ｐＩ−１７，４）で洗浄
し、同培地に約１×１０７／ｍｌになるように懸濁した
。この懸濁液にセンダイウィルスをｒｎｌ当り約ｉ、ｏ
ｏｏ赤血球凝集価添加し、３８℃で１日保って新リンホ
カインＩＩを誘導生成させた。これを４℃、約１，００
０ ｊｉで遠心分離し、得られた上清をｐＨ’７．２．
０．０１ Ｍ ＩＪン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水
で１５時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を実験Ａ
−１と同様に抗インターフェロン抗体のカラムに流し、
その非吸着画分を、実験Ａ −３で述べた方法でモノク
ローナル抗体のゲルカラムを用いてアフィニティクロマ
トグラフィーにより精製し、儂縮して比活性約１０９単
位／ｍり蛋白質を有する新リンホカインＨの濃縮液を得
た。
血清を加％補足したＥａｇｌｅの最少基本培地（ｐＨ７
，４）に接種し、３７℃で常法に従い生体外（ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ）に浮遊培養した。得られた細胞を血清無添加
のＥａｇｌｅの最少基本培地（ｐＩ−１７，４）で洗浄
し、同培地に約１×１０７／ｍｌになるように懸濁した
。この懸濁液にセンダイウィルスをｒｎｌ当り約ｉ、ｏ
ｏｏ赤血球凝集価添加し、３８℃で１日保って新リンホ
カインＩＩを誘導生成させた。これを４℃、約１，００
０ ｊｉで遠心分離し、得られた上清をｐＨ’７．２．
０．０１ Ｍ ＩＪン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水
で１５時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を実験Ａ
−１と同様に抗インターフェロン抗体のカラムに流し、
その非吸着画分を、実験Ａ −３で述べた方法でモノク
ローナル抗体のゲルカラムを用いてアフィニティクロマ
トグラフィーにより精製し、儂縮して比活性約１０９単
位／ｍり蛋白質を有する新リンホカインＨの濃縮液を得
た。
活性収率は、誘導生成時の懸濁ｇｔｚ当り約１５０万単
位であった。
位であった。
実施例 ２
新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下に培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞
ＢＡＬＬ−１細胞を移植し、その後通常の方法で３週間
飼育した。皮下に生じた約１５．９の腫瘤を摘出し細切
し、生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細胞を
血清無添加のＲＰＭＩ １６４０培地（ｐ）１７．２
）で洗浄し、同培地に約５ Ｘ １０６／ ｍｌに懸濁
した。この懸濁液にセンダイウィルスをｒＩＬｌ当り約
１，０００赤血球凝集価及びＥ、ｃｏｌｉ由来のエンド
トキシンをｍｌ轟り約１０゛μｍを添加し、３７℃で１
日間保って新リンホカインＩＩを誘導生成させた。これ
を約４℃、約ｉ、ｏｏｏ ｇで遠心分離し、沈澱物を除
去し、得られた上清をｐＨ７，２，０，０１Ｍリン酸塩
緩衝液を含有する生理食塩水で２１時間透析し、更に精
密濾過して得た濾液を、実施例１と同様に抗体カラムを
用いて精製し、得られる浴液を濃縮し、凍結乾燥して比
活性約１０９単位７ｍ９蛋白質を有する新リンホカイン
■の粉末を得た。
た抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下に培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞
ＢＡＬＬ−１細胞を移植し、その後通常の方法で３週間
飼育した。皮下に生じた約１５．９の腫瘤を摘出し細切
し、生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細胞を
血清無添加のＲＰＭＩ １６４０培地（ｐ）１７．２
）で洗浄し、同培地に約５ Ｘ １０６／ ｍｌに懸濁
した。この懸濁液にセンダイウィルスをｒＩＬｌ当り約
１，０００赤血球凝集価及びＥ、ｃｏｌｉ由来のエンド
トキシンをｍｌ轟り約１０゛μｍを添加し、３７℃で１
日間保って新リンホカインＩＩを誘導生成させた。これ
を約４℃、約ｉ、ｏｏｏ ｇで遠心分離し、沈澱物を除
去し、得られた上清をｐＨ７，２，０，０１Ｍリン酸塩
緩衝液を含有する生理食塩水で２１時間透析し、更に精
密濾過して得た濾液を、実施例１と同様に抗体カラムを
用いて精製し、得られる浴液を濃縮し、凍結乾燥して比
活性約１０９単位７ｍ９蛋白質を有する新リンホカイン
■の粉末を得た。
活性収率は、約３，２００万単位であった。
実施例 ３
成長したヌードマウスの腹腔内に、培養株化されたヒト
由来のリンパ芽球様細胞ＴＡＬＬ−１細胞の移植後、通
常の方法で５週間飼育した。この腹腔内へ、約３，００
０赤血球凝集価のニューカッスル病ウィルスを紫外線に
よって予めほとんど失活させて注入し、２４時間後に屠
殺して腹水を採取した。
由来のリンパ芽球様細胞ＴＡＬＬ−１細胞の移植後、通
常の方法で５週間飼育した。この腹腔内へ、約３，００
０赤血球凝集価のニューカッスル病ウィルスを紫外線に
よって予めほとんど失活させて注入し、２４時間後に屠
殺して腹水を採取した。
以後、実権例２と同様に精製し濃縮乾燥して新リンホカ
イン■の粉末を得た。
イン■の粉末を得た。
活性収率は、ヌードマウス１匹当り約３５０万単位であ
った。
った。
実施例 ４
成長した普通マウスに約４００レムのエックス・９を予
め照射してマウスの免疫能を弱めた後、そのマウスの皮
下に培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞Ｍｏｎ
ｏ −１細胞を移植し、その後通常の方法で３週間飼育
した。皮下に生じた約ｌＯｇの腫瘤を摘出した後、実施
例２と同様にして細胞を分散させた。この細胞を実施例
２と同様に懸濁した後、この懸濁液に、センダイウィル
スをｒｎｌ当り約５００赤血球凝集価及びコンカナバリ
ンＡをＲ１当９０８μ９を添加し、３７℃で１日間保っ
て新リンホカインＩＩを誘導生成させた。以後、実施例
２と同様に精製、濃縮、乾燥して新リンホカイン■の粉
末を得た。
め照射してマウスの免疫能を弱めた後、そのマウスの皮
下に培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞Ｍｏｎ
ｏ −１細胞を移植し、その後通常の方法で３週間飼育
した。皮下に生じた約ｌＯｇの腫瘤を摘出した後、実施
例２と同様にして細胞を分散させた。この細胞を実施例
２と同様に懸濁した後、この懸濁液に、センダイウィル
スをｒｎｌ当り約５００赤血球凝集価及びコンカナバリ
ンＡをＲ１当９０８μ９を添加し、３７℃で１日間保っ
て新リンホカインＩＩを誘導生成させた。以後、実施例
２と同様に精製、濃縮、乾燥して新リンホカイン■の粉
末を得た。
活性収率は、ツウスミ匹当ｐ ２，０００万単位であっ
た０ 実施例 ５ 新生児のハムスターに実施例２と同様にして培養株化さ
れたヒト由来のリンパ芽球様細胞Ｎａｍａｌｖａ細胞を
移植し、その後通常の方法で４週間飼育した。皮下に生
じた約２０ｇの腫瘤を実施例２と同様にほぐして約３Ｘ
ｌＯ／ｍｌの細胞懸濁液を得た。本懸濁液にセンダイウ
ィルスをｍｌ当り約１，０００赤血球凝集価を添加し３
６℃で２日間保って新すンホカイ／ＩＩを誘導生成させ
次いで実施例１と同様に精製濃縮して新リンホカインＨ
の濃縮液を得た。
た０ 実施例 ５ 新生児のハムスターに実施例２と同様にして培養株化さ
れたヒト由来のリンパ芽球様細胞Ｎａｍａｌｖａ細胞を
移植し、その後通常の方法で４週間飼育した。皮下に生
じた約２０ｇの腫瘤を実施例２と同様にほぐして約３Ｘ
ｌＯ／ｍｌの細胞懸濁液を得た。本懸濁液にセンダイウ
ィルスをｍｌ当り約１，０００赤血球凝集価を添加し３
６℃で２日間保って新すンホカイ／ＩＩを誘導生成させ
次いで実施例１と同様に精製濃縮して新リンホカインＨ
の濃縮液を得た。
活性収率は、・・ムスク−１匹当り約２，２００万単位
であった。
であった。
実施例 ６
孔径０．５ミクロンのメンブランフィルタ−を設けた内
容量的１０ ｍｌのプラスチック製円筒型拡散チャンバ
ー内に、培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞Ｎ
ＡＬＬ−１細胞を生理食塩水で浮遊させ、これを成長し
たラットの腹腔内に埋設した。
容量的１０ ｍｌのプラスチック製円筒型拡散チャンバ
ー内に、培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞Ｎ
ＡＬＬ−１細胞を生理食塩水で浮遊させ、これを成長し
たラットの腹腔内に埋設した。
このラットを通常の方法で４週間飼育した後、この拡散
チャンバーを取り出しだ。これにより得られたヒト由来
の細胞の濃度は約５ＸＩＯ／ｍ／であって、生体外の栄
養培地に炭酸ガスインキュベーター中で増殖させる場合
の約１０２倍以上にも達することがわかった。この細胞
を実施例２と同様に懸濁し、この懸濁液に、ｍｌ当り約
５００赤血球凝集価のニューカッスル病ウィルスを紫外
線で予めはとんど失活させて加え、さらにフィトヘマグ
ルチニンをｍｌ当り約５０μ？加え３７℃で１日間保っ
て新リンホカインＩＩを誘導生成させた。以後、実施例
２と同様に精製し、濃縮、乾燥して新リンホカイン■の
粉末を得たつ 活性収率は、ラット１匹当り約８００万単位であった０ 実施例 ７ ３７℃で５日間保ったニワトリの受精卵に、ヒト由来の
株化細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を移植した後、３７℃で
１週間保った。この卵を割卵した後、増殖細胞を採取し
た。この細胞を実施例１と同様に５Ｘ １０６／ ｍｅ
に懸濁した。この懸濁液にｒｎｌ当り約５００赤血球凝
集価のセンダイウィルスを添加し、３７℃で１日間保っ
て祈リンホカインＨを誘導生成させ、次いで実施例２と
同様に精製し、濃縮乾燥して新リンホカイン■の粉末を
得た。
チャンバーを取り出しだ。これにより得られたヒト由来
の細胞の濃度は約５ＸＩＯ／ｍ／であって、生体外の栄
養培地に炭酸ガスインキュベーター中で増殖させる場合
の約１０２倍以上にも達することがわかった。この細胞
を実施例２と同様に懸濁し、この懸濁液に、ｍｌ当り約
５００赤血球凝集価のニューカッスル病ウィルスを紫外
線で予めはとんど失活させて加え、さらにフィトヘマグ
ルチニンをｍｌ当り約５０μ？加え３７℃で１日間保っ
て新リンホカインＩＩを誘導生成させた。以後、実施例
２と同様に精製し、濃縮、乾燥して新リンホカイン■の
粉末を得たつ 活性収率は、ラット１匹当り約８００万単位であった０ 実施例 ７ ３７℃で５日間保ったニワトリの受精卵に、ヒト由来の
株化細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を移植した後、３７℃で
１週間保った。この卵を割卵した後、増殖細胞を採取し
た。この細胞を実施例１と同様に５Ｘ １０６／ ｍｅ
に懸濁した。この懸濁液にｒｎｌ当り約５００赤血球凝
集価のセンダイウィルスを添加し、３７℃で１日間保っ
て祈リンホカインＨを誘導生成させ、次いで実施例２と
同様に精製し、濃縮乾燥して新リンホカイン■の粉末を
得た。
活性収率は、受精卵１０個当り約７０万単位であったっ
Claims (2)
- （１）理化学的性質が、 ［１］分子量 ２０，０００±２，０００ ［２］等電点 ｐＩ＝６．２±０．３ ［３］易動度 Ｄｉｓｃ−ＰＡＧＥで、Ｒｆ＝０．２９±０．０２［４
］紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍ付近に最大吸収 ［５］溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可 溶 エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ ホルムに難溶乃至不溶 ［６］呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で 蛋白質陽性反応を示し、フェノール硫酸法またはアント
ロン硫酸法で糖質陽性反応を示す［７］作用 Ｌ９２９細胞に対して細胞障害活性を示し、ＫＢ細胞に
対する細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を
実質的に示さず ［８］水溶液での活性安定性 ｐＨ７．２で３０分間保持する条件により６０℃まで安
定、４℃で１６時間保持する条件によりｐＨ４．０乃至
１１．０の範囲で安定 ［９］−１０℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である新
リンホカインII産生能を有するヒト由来の細胞を、ヒト
以外の温血動物体内に移植し、またはその温血動物の体
液の供給を受けながら増殖させた細胞から新リンホカイ
ンIIを産生せしめることを特徴とする新リンホカインI
Iの製造方法。 - （２）増殖させたヒト由来の細胞に新リンホカインII誘
導剤を作用させて新リンホカインIIを産生せしめること
を特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法
。
Priority Applications (16)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60028396A JPS61115026A (ja) | 1985-02-18 | 1985-02-18 | 新リンホカイン２の製造方法 |
| US06/792,158 US5019385A (en) | 1984-11-09 | 1985-10-28 | Novel lymphopine LK 2 and pharmaceutic compositions containing same |
| KR1019850008229A KR930004596B1 (ko) | 1984-11-09 | 1985-11-05 | 신규 림포킨(lymphokine) 및 이에 대해 특이성을 갖는 모노클로날(monoclonal) 항체의 제조 방법 |
| GB8527466A GB2168355B (en) | 1984-11-09 | 1985-11-07 | Novel lymphokine, monoclonal antibody specific to the lymphokine, and their production and uses |
| IT48762/85A IT1184668B (it) | 1984-11-09 | 1985-11-08 | Linfochina,suo anticorpo specifico monoclonale e relativo procedimento di produzione |
| AU49708/85A AU603053B2 (en) | 1984-11-09 | 1985-11-08 | Novel lymphokine, monoclonal antibody specific to the lymphokine, and their production and uses |
| CH4800/85A CH664574A5 (fr) | 1984-11-09 | 1985-11-08 | Lymphokine et anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine, leurs production et utilisations. |
| ES548727A ES8703161A1 (es) | 1984-11-09 | 1985-11-08 | Un procedimiento para producir una linfocina (lk 2) |
| SE8505286A SE468853B (sv) | 1984-11-09 | 1985-11-08 | Nytt lymfokin, monoklonala antikroppar specifika foer lymfokinet och deras framstaellning samt anvaendningar |
| FR858516536A FR2572936B1 (fr) | 1984-11-09 | 1985-11-08 | Nouveau lymphokine et anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine, leurs production et utilisations |
| DE3539775A DE3539775C2 (de) | 1984-11-09 | 1985-11-09 | Neues Lymphokin, gegen dieses Lymphokin spezifische Antikörper, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
| AT0327685A AT395017B (de) | 1984-11-09 | 1985-11-11 | Verfahren zur herstellung eines neuen lymphokins (lk 2) sowie verwendung von lk 2 zur herstellung eines pharmazeutischen praeparates |
| ES556785A ES8801582A1 (es) | 1984-11-09 | 1986-06-25 | Un procedimiento para preparar una composicion farmaceutica de una linfocina (lk2). |
| US07/223,717 US5003048A (en) | 1984-11-09 | 1988-07-21 | Method for the purification of lymphokine LK 2 |
| US07/223,719 US5030564A (en) | 1984-11-09 | 1988-07-21 | Monoclonal antibody specific to the lymphokine LK 2 and its method of production |
| US07/223,718 US5002878A (en) | 1984-11-09 | 1988-07-21 | Novel lymphokine, monoclonal antibody specific to the lymphokine, and their production and uses |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60028396A JPS61115026A (ja) | 1985-02-18 | 1985-02-18 | 新リンホカイン２の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59236356A Division JPH0811759B2 (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | 新リンホカイン▲ｉｉ▼とその製法および用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61115026A true JPS61115026A (ja) | 1986-06-02 |
| JPH0523755B2 JPH0523755B2 (ja) | 1993-04-05 |
Family
ID=12247497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60028396A Granted JPS61115026A (ja) | 1984-11-09 | 1985-02-18 | 新リンホカイン２の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61115026A (ja) |
-
1985
- 1985-02-18 JP JP60028396A patent/JPS61115026A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0523755B2 (ja) | 1993-04-05 |
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