JPS62236495A - ヒト ツモア・ネクロシス・フアクタ−の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト　ッモア・ネクロシス・ファクター（以
下、ｈＴＮＦと略称する。）の製造方法に関する。

ツモア・ネクロシスやファクター（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃ
ｒ。

ｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ、以下、ＴＮＦと略称する。）は
、イー・ニー・カーズウエル（Ｅ、Ａ、Ｃａｒｓｗｅｌ
ｌ）等、「ブロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・ニー・ニス・ニ
ー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、
　ＵＳＡ）Ｊ　、第７２巻、第９号、第３６９９−３６
７０頁（１９７５年）およびイー・ビック（Ｅ、Ｐｊｃ
ｋ）繻、「リンホカインズ（Ｌｙｖｐｈｏｋｉｎｅｓ）
」、第２巻、第２３５〜２７２頁、アカデミツク・プレ
ス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）社発行（１０８１
年）などにも記載されているように、例えば、ウサギに
ｂａｃｉｌｌｉ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ　（
ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・バルバム（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍｐａｒｖｕ醜）、エンドトキシ
ンなどのＴＮＦ誘導剤を非経口的に投与することによっ
て、その血清中に誘導産生ずる蛋白性物質であって、Ｍ
ｅｔｈ　へ肉腫出血壊死能を持つ物質に与えられた名称
であり、特に腫瘍細胞に対して細胞障害機能を持ってい
ることは公知である。

ＴＮＦの持つこのような機能から、ＴＮＦはその発見の
当初より悪性腫瘍治療剤として期待されて来た。

ＴＮＦは、ウサギ、ラットなどの動物血清から調製され
、種特異性はないとされているけれども、ヒトの治療に
供するには、本質的にヒトの生細胞由来のｈＴＮＦであ
ることが、治療上に生じる抗原性などの副作用面におい
て極めて安全であり、優れている。

しかしながら、従来、ｈＴＨＦの製造方法は知られてお
らず、その作用効果についても不明である。

まして、ｈＴＮＦがヒト悪性Ｉｌｌ瘍の治療に有効であ
るかどうかについては全く知られていない。

本発明者は、工業的規模で容易に実施し得るｈＴＮＦの
製造方法を検討し、そのｈＴＮＦが悪性ＩＩｌ瘍の治療
剤として有用であるか否かを鋭意検討して来た。

その結果、ヒト由来の細胞が高活性のｈＴＨＦを産生じ
得ることを見出し本発明を完成した。また、精製、採収
したｈＴＮＦがヒトの各種悪性腫瘍に対して比較的少量
で細胞障害性活性を示し、更に、ｈＴＨＦの安全性の高
いことなども見いだした。

本発明のｈＴＮＦの製造方法は、ｈＴＮＦ産生能を有す
る細胞を増殖させてｈＴＨＦ産生せしめ、これを精製し
採収するものである。例えば、ｈＴＮＦ産生能を有する
ヒト由来の細胞、または、ヒト由来の細胞のｈＴＮＦ産
生能を有する遺伝子を細胞融合または遺伝子組み換えな
どの手段により導入した細胞などを増殖させ、これら細
胞から産生されるｈＴＮＦを精製し、採収して製造する
。

ｈＴＮＦの望ましい製造例を述べれば、ヒト由来の細胞
を、ヒト以外の温血動物体内に移植し、または、拡散チ
ャンバー内に接種してその動物体から栄養物を含有する
体液の供給を受けつつ増殖させ、得られる細胞に生体内
（ｉｎ　ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
でＴＨＦ　＃ｓ導剤を作用させることによって、ｈＴＮ
Ｆが高活性で誘導産生きれ、これを精製し採収すること
によってｈＴＨＦが多量且つ容易に製造し得る。

このように、ヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物を
利用し、その体液の供給を受けつつ増殖きせる場合には
、生細胞を生体外で増殖させる場合とは違って、高価な
血清などを含む栄養培地が不要または大幅に節約できる
ばかりでなく、細胞増殖中の維持管理も極めて容易であ
り、その上産生されるｈＴＮＦ活性が高い特徴を有して
いる。即ち、ヒト由来の細胞をヒト以外の温血動物体内
に移植し、あるいは、その動物の体液の供給を受けるこ
とのできる拡散チャンバー内に収容し、このチャンバー
を動物体内に埋設し通常の飼育をすれば、温血動物体か
ら供給される栄養物を含有する体液を利用してその細胞
が容易に増殖し得るのである。更に生体外で増殖させる
場合と比較して、その細胞の増殖が安定していること、
その増殖速度が大きいこと、得られる細胞量が多いこと
、更には細胞当りのｈＴＨＦ量が著増することも大きな
特１故である。

ヒト由来の細胞としては、容易に増殖し得てしかもｈＴ
ＮＦ産生能を有するものであればよい。例えば、「ジャ
ーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ旧ｃｒｏｂ　ｉ
ｏ　ｌｏｇｙ）」、第１巻、第１１６〜１１７頁（１９
７５年）に記載されているナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ）
細胞、アイ・ミヨシ（１，旧ｙｏｓｈ　ｉ　）、「ネー
チャＣＨａｔｕｒｅ）　Ｊ　、第２６７巻、第８４３〜
８４４頁（１９７７年）に記載されているＢＡＬＬ−１
細胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＨＡＬＬ−１細胞、「ザ・ジ
ャーナル・オブ拳イムノロジー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第１１３巻、第
１３３４〜１３４５頁（１９７４年）記載のドア００２
細胞、Ｂ−７１０１細胞などの株化細胞や、また、正常
な単核細胞、顆粒性白血球細胞などを各種ウィルス、薬
剤、放射線などて処理し培養株化させた細胞などが自由
に使用され、また、これら細胞のｈＴＨＦ産生能を持つ
遺伝子を、例えばポリエチレングリコールやセンダイウ
ィルスなどを利用する細胞融合の手段や、ＤＨ＾リガー
ゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＨ＾ポリメラーゼな
どの酵素を利用する遺伝子組み換えの手段などによって
、より容易に継代培養し得る培養株化されたリンパ芽球
様細胞、微生物などに導入し、その増殖速度を高めたり
、細胞当りのｈＴＨＦ産生能を高めたりして使用しても
よく、本明細書に記載する細胞のみに限定されるもので
はない。これらの細胞は、後に述べるｈＴＨＦを産生き
せるまでの工程で、単独または二種以上を混合して自由
に使用される。必要ならば、これに、例えば、ヒトの新
鮮面から調製される白血球を併用することもでざる。

細胞増殖に使用されるヒト以外の温血動物としては、ヒ
ト由来の細胞が増殖し得るものであればよく、例えば、
ニワトリ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ
、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、モルモット、ラット、ハム
スター、普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類が使用
できる。

これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好よ・シ＜
ない免疫反応を起こすおそれがあるので、その反応をで
きるだけ抑えるため、使用する動物はできるだけ幼若な
状態、即ち、卵、胚、胎児、または新生期、幼少期のも
のの方が好ましい。

また、これら動物に例えば２００乃至６００レム程度の
エックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血
清若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処置をほ
どこして、免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウス、ヌードラットなどの免疫
不全動物の場合には、成長したものであっても免疫反応
が弱いので、これらの前処置を必要とすることなく、培
養株化されたヒト由来の細胞か移植でき、急速に増殖す
ることができるので特に好都合である。

また、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば先ずハム
スターに移植し増殖させた後、この細胞を更にヌードマ
ウスに移植するなどのように、ヒト以外の温血動物ａ打
で移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化したり、
更にそれらから産生きれるｈＴＮＦ量を増加させること
も自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、開路間、同門
間移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物
体内の部位は、移植した細胞が増殖し得る部位であれば
よく、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下などが自由に暑
ばれる。

また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物ＩＩＩ胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、
例えば孔径約１０−７乃至１０＝＋＊を有するメンプラ
ンフィルシー、限外濾過膜またはポローファイバーなど
を段けた公知の各種形状、大きざの拡散チャンバーを動
物体内、例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物
を含む体液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で前述
の培養株化されたヒト由来の細胞を何れも増殖させるこ
とができる。

また、必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む
溶液を動物体内の体液と接続し、潅流きせるようにした
チャンバーを、例えば動物体表に取り付け、チャンバー
内のヒト由来の細胞の増殖状態を透視できるようにする
ことも、また、このチャンバ一部分のみを着脱交換でき
るようにして動物を屠殺せずに寿命一杯細胞を増殖させ
て、動物個体当りの細胞生産量を更に高めることムでき
る。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採収できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起こす心配も少ないので、免疫反応を抑制する前
処置の心配もなく、各種温血動物を自由に利用できる特
徴を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育管理
を続ければよく、移＃ａ後といえども特別の取扱いは同
等必要としないので好都合である。

ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は通常１乃至１
０遅の期間で目的を達成することができる。このように
して得られるヒト由来の細胞数は動物個体当り約１０７
乃至１０１２個、またはそれ以上に達することを見出し
た。

換言すれば、このようにしてｉｆＩ殖させたヒト由来細
胞数は、動物個体当り移植した細胞数の約１０２乃至１
０７倍、またはそれ以上にム達し、生体外の栄養培地に
接種して増殖させる場合の約１０乃至１０６倍、または
それ以上にも達して、ｈＴＮＦの製造のために極めて好
都合である。

このようにしてハＶｊ殖させたヒト由来の生細胞からｈ
ＴＮＦを産生きせる方法は自由である。それが増殖した
動物体内の十までＴＮＦ：Ｊ４導削を作用させることも
できる。例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト
由来の細胞に、または皮下に生じたＩｌ！瘍細胞に、Ｔ
ＮＦ誘導剤を直接作用させてｈＴＮＦを誘導産生させ、
次いでその血清、腹水または腫瘍からｈＴＨＦを精製し
採収すればよい。

また、ヒト由来の増殖細胞を動物個体から取り出し、生
体外でＴＨＦ　Ｍ４剤を作用させてｈＴＨＦを誘導産生
きせることもできる。例えば、腹水中で増殖したヒト由
来の細胞を採収し、または皮下に生じたヒト由来の細胞
を含むＩｌｌ摘出、採収し、得られる細胞を約２０乃至
４０℃に保った栄養培地に細胞濃度が約１０５乃至１０
８／ｍｌになるように浮遊させ、これにＴＨＦ！ｌ導剤
を作用きせることによってｈＴＮＦを誘導産生させ、こ
れを精製し採収すればよい。

更に、ヒト由来の細胞を拡散チャンバー内で増殖させた
場合には、増殖きせた細胞をチャンバー内のままで、ま
たはチャンバーから取り出して、ＴＨＦｉ１１導剤を作
用させ、ｈＴＮＦを誘導産生させることもできる。

また、例えば増１４させたヒト由来の細胞に先ず動物体
内の−Ｊ：までｈＴＨＦを産生させた後、次いで同一動
物個体の特定の部位または全体から採収したヒト由来の
細胞に動物体外でｈＴＮＦを誘導産生させる方法、また
は一度ｈＴＮＦの産生に使用した細胞を更に二度以上ｈ
ＴＮＩ”の産生に使用する方法、または動物体内に埋設
若しくは接続するチャンバーを交換して得られる細胞数
を増加させる方法などによって、使用する動物個体当り
のｈＴＨＦ生成量を更に高めることも自由である。

ＴＨＦ誘導剤としては、通常、例えばＢＣＧ　、コリネ
バクテリウム・バルバム、リボポリサツカリド、エンド
トキシン、多糖類などの一種若しくは二種以上が用いら
れる。一般的には、先ず、ヒト由来の細胞を移植したヒ
ト以外の温血動物に、例えば、ＢＣＧ、コリネバクテリ
ウム・バルパムなどの一種または二種以上を非経口的に
投与し一定期間経過した後、ヒト由来の細胞を採収し、
例えばりボボリサッカリド、エンドトキシン、多１１類
などの一種または二種以上を生体外で作用させてｈＴＮ
Ｆを誘導産生させればよい。

このようにして産生きれたｈＴＨＦは、公知の蛋白性物
質の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離
、濃縮、速結乾燥などを行なうことによって容易に精製
分離し、採収することができる。更に高度の精製を必要
とする場合には例えばイオン交換体への吸着・溶出、ゲ
ル濾過および等電点分画、電気泳動、高速液体クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの
公知の方法を組み合わせれば、最高純度のｈＴｌ（Ｆを
採収することも可能である。

ｈＴＮＦの活性は、イー・ビック（Ｅ、Ｐｉｃｋ）！、
「リンホカインズ（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ）　Ｊ　、
第２巻、第２３５−２７２頁、アカデミツク・プレス（
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）社発行（１９８１年）
に報告されているＬ−９２０細胞を使用して、一定時間
培養後の生残細胞数を測定する公知の方法を用いた。

以下、本発明の実施例を述べる。

実施例 生後間もないハムスターの皮下に、５Ｖ−４０ウイルス
で処理し培養株化されたヒト由来の単核細胞を移植し、
通常の方法で１週間飼育した後、ＢＣＧの生細胞を腹腔
内に１０７個注入し、更に２週間飼育した。皮下に生じ
た約１５８のＭｅ１鳩を摘出し細切した後、トリプシン
含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散分取した。この
細胞をヒト血清５ｖ／ｖ％含有するＰＨ７，２のイーグ
ル（Ｅａｇｌｅ）の最少基本培地で洗浄し３７℃に保っ
た同じ組成の培地に細胞濃度が約５Ｘ１０６／ｍｌにな
るように希釈し、これにイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由
来のエンドトキシンを約１０μｇ／−１の割合で加えて
１６時間保ってｈＴＨＦを誘導産生せしめた。これを４
℃、約ｌ、０００Ｘｇで遠心分離し、沈殿物を除去し、
得られた上清をｐＨ７，２，０，０ＩＭリン酸塩緩衝液
を含有する生理食塩水で２１時間透析し、更に精密濾過
して得た濾液を濃縮し、凍結乾燥してｈＴＮＦ活性を有
する粉末を得た。得られた粉末を１９７７年６月８日、
９日にザクレブで開催きれたインターフェロンのｔＩ２
造、標準化および臨床用途に関する第１１回国際免疫生
物学シンポジウム（Ｓｙ＋ａｐｏｓｉｕｍ　。

ｎ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、　５ｔａｎｄａｒｄｉｚ
ａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＣＬｔｎｉｃａＩ　　Ｕｓｅ　　
ｏｒ　　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、　　１１七ｈ　　Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｉｓｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、８　　＆　９　　Ｊ
ｕｎｅ　　］９７７゜Ｚａｇｒｅｂ、　Ｙｕｇｏｓｌａ
ｖｉａ）でジー・ボド（Ｇ、Ｂｏｄｏ）が報告した方法
に準じてイオン交換体への吸脱着、ゲル濾過による分子
量分画、濃縮および精密濾過などの手段によりインター
フェロンを除去し、更に硫安塩析、Ｃｏｎ八−セファロ
ースによるアフィニティークロマトグラフィーにより精
製し、Ｈｅｔｈ　Ａ肉腫に出血性壊死能を有し且つ正常
細胞に何等の悪影響も及ぼざないことを特徴とする高純
度ｈＴＮＦを約１　、０００　、０００単位得た。

このようにして得られたｈＴＮＦは、用いた誘導剤の混
入もなく比活性約３５０　、０００単位／Ｂ蛋白質であ
った。

以下、本発明の製造方法により製造したｈＴＮＦの有効
性、毒性、用法および用足について説明する。

実験例　　Ｉ ＢＡＬＢ／ｃ由来ヌードマウスに人乳癌組織片を背部皮
下に移植する。腫瘍体積が約２００１の時期から前述の
製造例で得られたｈＴＮＦを１００または１．００単位
／ｋｇずつ毎日−回静注し、１５５日目マウスを殺し、
１１瘍重量を測定した。その結果を第１表に示した。な
お、対照は、ｈＴＮＦ無含有生理食塩水を静注しｔ：。

第　　　１　　　表 ＊危険率５ｘ以下で対照の値に比し、推計学的に有意差
あり。

実験例　　２ 体重２５ｇ前後のＢＤＦ　＋雄マウスを１詳１０匹とし
、２＋ｗＩ角に切断したルイス肺癌を背部皮下に移植し
た。移植後８日目から前述の製造例で得られたｈＴＨＦ
を１００または１．０００単位／ｋｇずつ毎日−回静注
し、２１１日目マウスを殺して１ＩｌｉＴＩＪ重量を測
定した。

その結果を第２表に示した。なお、対照はｈＴＮＦ無含
有生理食塩水を静注した。

第　　　１　　　表 ネ危険率５ｚ以下で対照の値に比し、推計学的に有意差
あり。

実験例　　３　　急性心性 生後２００日目マウスを使用して、前述の製造例で得ら
れたｈＴＮＦの急性毒性試験をしたところ、ｈＴＮＦの
毒性は極めて低く、腹腔内に注射した時のし０５ｏは２
００　、０００単位／ｋｇ以上であることが判明した。

以上の結果からも明らかなように、本発明のｈＴＩＦは
、その有効量からも極めて安全であり、各種悪性Ｍ瘍の
治療にａ利に用いることができる。

本発明でいう悪性［％とは、ｈＴＮＦによって予防若し
くは治療される疾患であり、例えば、乳癌、肺癌、肝癌
、膀胱癌、子宮癌、胃癌、大腸癌、白血病、リンパ腫、
皮膚癌、神経芽腫などの悪性腫瘍である。

更には、悪性１１１１％に適用するにあたっては、例え
ば患者の腫瘍の一部を取り、本発明のｈＴＮＦと生体外
で処理することによってＭＰＡの免疫原性を高めた後、
Ｉ＠ｍ患者の体内に戻すことにより、この悪性ｌ１ＩＴ
ｌ＆の治療を行なうこともできる。

本発明のｈＴＮＦの成人１日当りの用量は１乃至５０．
Ｏｏｏ、ｏｏｏ単位であり、好ましくは局所注射および
点眼などの局所適用用量は１乃至１　、０００　、００
０単位、軟膏などの場合１０乃至ｓ、ｏｏｏ、ｏｏｏ単
位、静注および筋注など全身注射の場合１００乃至ｔｏ
、ｏｏｏ、ｏｏｏ−＋ｔｔ位、経口投与の場合１００乃
至５０，０００，０００単位であるが用法あるいＬよ症
状に応じて適宜増ンシすることができる。必要に応じて
、任意、慣用の製薬用担体、基剤あるいは賦形剤ととも
に慣用の方法で医薬用製剤に調製することができる。

製剤当りの使用量は、その有効量、毒性、安全性などを
考慮すると、ダラム当り１１１位以上、望ましくは１０
乃至１．０００，０００，０００単位が好適である。

本発明のｈＴＮＦを有効成分として含有する悪性腫瘍治
療剤は、その目的に応じてその形状を自由に選択できる
。

経口投与剤としてはカプセル剤、錠剤、散剤などのＭｒ
ｈ溶性製剤、直腸内投与剤としては直楊坐剤、注射剤と
しては、例えば用時に注射用蒸留水に溶解して使用する
凍結乾燥注射剤、その他点鼻若しくは点眼、軟膏剤とし
て用いることもできる。

以下に製剤の参考例を示すが、製剤はこれのみニ限定さ
れるものではない。

参考例　　１　　注　射　剤 生理食塩水２００ｍ　ｌに前述のＮ道側で調製したｈＴ
ＮＦを５００，０００単位溶解し、メンブランフィルタ
−を用いて無菌的に濾過する。濾１１ｋを滅菌したガラ
ス８器に２ｍ１ｔ’っ充填して凍結乾燥し、これを密栓
して、凍結乾燥粉末製剤とする。

氷晶は、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療に好適で
ある。

参考例　　２　　軟　膏　剤 前述の製造例で調製したｈＴＮＦを常法に従い少量の流
動パラフィンに研和した復、ワセリンを加え２０　、０
００単位／ｇの軟膏剤とした。

氷晶は、皮膚癌、乳癌、リンパ腫などの治療に好適であ
る。

参考例　　３　　点　眼　剤 蒸留水８００１とβ−フェニルエチルアルコール５１と
先述の製造例で調製Ｌ　タｈＴＮＦ　ｅ　２０，０００
，０００単位とに等張化するよう食塩を加え蒸留水で１
．０００ｍ１とし点眼剤とした。

氷晶は、網膜芽細胞腫などの治療に好適である。

参考例　　４　　腸溶性錠剤 前述の製造で調製したｈＴＮＦを常法に従っての粉とマ
ルトースとを混合使用して打錠するに際し、ｈＴＮＦ　
ｅ製品１錠（１００ｍｇ）当す２００．０００単位にな
るように含有せしめて錠剤を製造し、これにメチルセル
ロースフタレートをコーティングして腸溶性錠剤とした
。

氷晶は、大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好適である
。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト　ツモア・ネクロシス・ファクター産生能を
   有する細胞を増殖させてヒト　ツモア・ネクロシス・フ
   ァクターを産生せしめ、これを精製し採収することを特
   徴とするヒト　ツモア・ネクロシス・ファクターの製造
   方法。
2. （２）細胞が、ヒト由来の細胞であることを特徴とする
   特許請求の範囲第（１）項記載のヒト　ツモア・ネクロ
   シス・ファクターの製造方法。