KR870001149B1 - 인체 콜로니 자극인자의 제조방법 - Google Patents

Abstract

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Description

인체 콜로니 자극인자의 제조방법

본 발명은 인체 콜로니 자극인자(human Colony-Stimulating Factor, 이하 hCSF라고 약기함)의 제조방법에 관한 것이다.

hCSF라 함은 인체 골수세포가 각 혈액성분으로 분화(分化)할때, 백혈구의 분화를 촉진하는 자극호르몬의 1종이라고 생각되고 있다. 한편 미국 특허 제4,135,975호 명세서에서는 인체 콜로니 자극인자가 분자량 약 10,000내지 100,000의 단백질 형태의 물질인 것으로 기재하고 있다. 그 아미노산의 서열은 아직 밝혀지지 않고 있다.

최근 악성종양이 년간 사망율 원인의 상위를 차지하기에 이르렀으며, 악성종 양환자에 대한 방사선 조사라던가 항암제의 투여가 성행하고 있으나, 이와 같의 치료는 필연적으로 환자의 백혈구를 급격하게 감소시켜 육체적인 저항력을 상실하여서 치료를 계속하는 것이 매우 곤란하였다.

전술한 바와 같은 hCSF가 지닌 작용으로 말미암아, 이것을 현행의 악성종양의 치료에 병행하므로써 보다 대담한 치료를 가능하게 하였을뿐 아니라, 종래에 치료할 수 없는 것으로 생각하였던 백혈병에도 유효하리라고 생각되는 것이다. 그렇지만 사람의 분비물이나 각 조직에서 hCSF를 번잡한 공정을 거쳐 채취하는 방법이라거나 hCSF 산생능이 있는 인체세포를 등세초의 생장에 필요한 영양소를 함유하는 영양배양기에 접종하여 시험관내에서 증식시키거나 혹은 마땅한 면역처리를 하여 인체 이외의 동물체내에 이식하고 생체내에서 증식시켜서 획득한 증식세포에 hCSF 유도제를 작용시킨 조건하에서 hCSF를 산생케 하여 채취하는 방법으로서는 획득하는 hCSF가 면역학적으로 불할성하다던가 활성인 경우라도 그 량이 현저하게 미소량이라는 등의 결점이 있었다.

따라서, hCSF는 약제로서 유용성이 지대하면서도 어디까지나 잠재적인 것에 불과하였다.

본 발명자은 임상 및 치료등 각종 의료용도로 제공함에 충분하고 또한 품질이 일정한 hCSF를 제조하는 방법에 관하여 여러가지로 검토하였던바, 의외에도 hCSF 산생능이 있는 인체의 세포와 인체의 림프아세포를 세포융합시켜서 얻은 세포는, 세포당 hCSF 산생능을 통상 2-10배, 또는 그 이상에 이르렀다. 첨가하건데, 이 융합세포를 인체 이외의 온혈동물을 이용하여 증식시킨 세포는 이것을 시험관내의 조직배양에 따라 증식시킨것 혹은 hCSF 산생능이 있는 인체의 정상세포 또는 인체의 암세초를 생체내 또는 시험관내에서 증식시킨것과 비교하여 hCSF 산생능에 있어서 각별히 우수하였으며 통상 세포당으로 환산하여 약 2-50배, 또는 그 이상에 이른다는 사실을 발견하고 본 발명의 과제를 해결하였던 것이다.

즉, 본 발명은 hCSF 산생능이 들어있는 인체의 세포와 인체의 림프아세포를 융합시켜서 획득한 세포를 인체 이외의 온혈동물체내에 이식하거나, 또는 그 온혈동물의 체액을 공급받으면서 증식시켜서 획득하는 세포에서 hCSF를 산생시키는 것을 특징으로 하는 hCSF의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따라, 인체의 융합세로를 증식시킬 경우, 시험관내의 조직배양과 비교하여 대량의 hCSF를 산생할뿐 아니라, 값비싼 혈청등을 함유하는 영양배양이기를 필요로 하지 않거나 대폭적으로 절약할 수 있으며 첨가하건데 세포증식 중의 유지관리도 극히 용이하다. 즉, hCSF 산생능이 있는 인체의 세포와 인체의 림프아세포를 융함시켜 hCSF 산생능을 모입한 인체 림프아세포를 인체 이외의 온혈동물체내에 이식하거나 또는 그 동물체액의 공급을 받을 수 있는 침버내에 수용하여 통상적인 사육을 하면, 온혈동물에서 공급되는 영양물질을 함유하는 체액을 이용하여 그 융합세포를 용이하게 증식시킬 수 있는 것이다. 나아가서 널리 알려진 시험관내의 조직배양에 따라 증식시킬 경우와 비교하여 증식속도가 크다는 사실, 대량의 세포를 용이하게 얻을 수 있다는 사실, 나아가서는 세포당의 hCSF 산생량이 크다는 등의 여러가지 특징를 열거할 수 있다.

최근, hCSF 산생능이 들어있는 인체의 정장세포 혹은 암세포를 누우드마우스등의 면역불량물에 이식하여 시험관내에서 hCSF 산생세포를 증식하고 채취하여 hCSF를 산생시키는 방법이 개발되었으나, 본 발명의 방법과 이들 종래법을 비교하여도 본 발명에 따라 세포를 융합한 다음 생체내에서 증식시킨 세포의 hCSF 산생량은 통상 2-10배, 또는 그 이상에 이를 만큼 산생량이 높다.

본 발명에서 사용하는 융합세포는 hCSF 산생능이 들어있는 인체세포와 인체 림프 아세포를 널리 알려진 방법에 따라 융합시켜서 얻을수 있으며, 이 융합세포에는 hCSF 산생능이 들어있으며 또한 인체 이외의 동물체내에 이식하여 용이하게 증식할 수 있는 것이다. 세포 융합을 시키는 hCSF 산생능이 들어있는 인체세포는 hCSF 산생능이 들어있는 것이면 어떤 것을 사용하여도 무방하여 그 세포의 부위에 의한 구별은 없다. 예를 들면, 인체의 폐세포, 인체의 비장세포. 인체의 말초부혈액, 인체의 백혈구, 인체의 태아신장세포, 인체의 턱밑암세포, The American Type Culture Collection 172면 1973년 인체의 골수세포 인체의 T-림프틀, 인체의 자궁세포, 또는 이것을 각종 비루스, 약제, 방사선 등으로 종양화시키던가, 폐암환자, 백혈병환자, 림프종환자, 자궁암환자, 신장암환자, 위암환자로 부터 획득하는 암세포 혹은 종양세포, 나아가서는 이것들을 배양주화 한 세포가 가장 적당하다.

hCSF 산생능을 세포융합에 따라 도입하는 인체 림프아세포(Nature Vol.267 843-844 1977년)는 상기한바 hCSF 산생능이 들어있는 인체세포와 융합시킬 수 있으며 또한 획득하는 hCSF 산생능을 보존하고 있는 한 어떤 림프아세포를 사용하여도 좋다.

특히, 보다 용이하게 세대를 이어 배양할 수 있는 배양주로 된 인체 림프아세포를 사용하면, 그 증식속도가 클뿐아니라 세포당 hCSF 산생등을 통상 수배-수 10배 까지도 제고할 수 있어 hCSF의 대량생산에는 특히 가장 적당하다.

그 이외에도 배양주로 된 인체 림프아세포를 인체 이외의 온혈동물에 이식하면 숙주가 되는 온혈동물의 세포와 섞이기 어려운 연종혹을 형성하기 쉽고 이것을 적출한 다음 분산하는 것도 용이한 것이므로 인체 림프아세포만을 채취하는 목적에는 극히 유리하다.

상기의 hCSF 산생능이 들어있는 인체세포와 인체 림프아세포를 융합시키는 방법은 어느 방법을 이용하여도 무방하다.

예컨데, 센다이비루스(HVJ)를 사용하는 적혈구 고우스트융합법, 리보솜-HVJ 스파아크법, HVJ 첨가법이라던가, 폴리에틸렌글리콜을 이용하는 방법등에서 적당히 선택할 수 있다.

또, 전기한 세포의 hCSF 산생을 관리하는 유전자를 DNA 리가아제, 제한효소, DNA 폴리메라아제 등의 효소를 이용하는 유전자 재배염 수단에 의하여 인체 림프아세포에 도입하여도 세포융합에 의한 경우와 마찬가지의 결과를 달성할 수 있다.

본 발명의 hCSF 산생능이 들어있는 인체 융합세포가 증식할 수 있는 것이면 어떤 것이라도 무방하여 예컨데, 닭, 비둘기 등의 조류, 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소, 말, 토끼, 몰모트, 쥐, 햄스터, 보통마우스, 누우드마우스 등의 포유류 등을 사용할 수 있다.

이들 동물에 인체 융합세포를 이식하면 좋지않은 면역반응을 이르킬 염려가 있으므로 그 반응을 가급적 억제하기 위하여 사용하는 동물은 가급적 유약한 상태 즉, 알, 유생물, 태아, 또는 신생기 및 유소기의 것일수록 좋다.

또 이들 동물에 예컨데, 약 200-600 REM의 X선 그렇지 않으면 γ선을 조사하거나 또는 항혈청 또는 면역억제제 등을 주사하는 등의 사전처치를 하여서 면역반응을 약화시켜서 이식하여도 좋다. 사용하는 동물이 누우드마우스일 경우에는 성장한 것이라도 면역반응이 약하므로 이들 사전처치를 하지않고서도 배양주가 된 인체 융합세포를 이식할 수 있으며 급속하게 증식할 수 있으므로 특히 그 절차가 간단하다.

또 인체 융합세포를 예컨대, 우선 햄스터에 이식하고 증식시킨 다음, 이 세포를 다시금 누우드마우스에 이식하는 등과 같이 인체 이외의 온혈동물 사이에서 이식하여 인체 융합세포의 증식을 가일층 안정화 한다거나 나아가서 그로부터 산생되는 hCSF량을 증가시키는 것도 자유대로 할 수 있다.

이런 경우 같은 종간, 같은 속간은 물론이고 같은 강간, 같은 문간의 이식이라도 무방하다.

인체 융합세포를 이식하는 동물체내의 부위는 이식한 세포를 증식할 수 있는 부위라면 좋으며, 예컨데 뇨액강, 정맥, 복강, 피하등 자유로 선택할 수 있다.

또 직접 동물체내에 인체 융합세포를 이식하지 않고도 동물세포의 통과를 저지할 수 있는 다공성의 여과막, 예컨데, 구멍의 지름이 약 10^-7-10^-5m로 된 박막거르개, 한의여과막 또는 유공섬유 등을 마련한 널리 알려진 각종 형상, 대형의 확산챔버를 동물체내 즉, 복강내에 대설하여 동물체에서의 영양물질을 함유하는 체액의 공급을 받으면서 그 챔버내에서 인체 융합세포를 어느 것이나 증식시킬 수 있다.

또 필요에 따라서 이 확산챔버내의 영양물질을 함유하는 체액을 동물체내의 체액과 접촉하여 유입되도록 한 확산챔버를 예컨데, 동물체 표면에 부착하고 확산챔버내의 인체 융합세포의 증식상태를 투시할 수 있도록 하는 것도 또 이 확산쳄버 부분만을 착탈 교환할 수 있도록 하여 동물을 도살하지 않고도 수명이 다할 때까지 세포를 증식시켜서 동물개체당의 세포생산량을 더욱 제고할수도 있다.

이들 확산쳄버를 이용하는 방법은 인체 융합세포가 동물세포와 직접 접촉하지 않으므로 인체 융합세포만을 용이하게 채취할 수 있을뿐 아니라 좋지않은 면역반응을 일으킬 염려도 적으므로 면역반응을 억제하는 사전처치의 필요도 없으며 각종 온혈동물을 자유로히 이용할 수 있는 특징을 가지고 있다.

이식한 동물의 유지관리는 그 동물의 통상적인 사육을 지속할 수 있으면 되는 것으로 이식후라 하여도 특별한 취급은 하등 필요하지 않으므로 그 절차가 매우 간단하다.

인체 융합세포를 증식시키기 위한 기간은 통상 1-20주이다.

이식하는 인체 융합세포를 배양주로 된 것일 경우에는 그 증식속도가 커서 통상 1-5주의 기간으로 목적을 달성할 수 있다.

이와같이 하여 획득하는 인체 융합세포는 동물개체당 약 10⁷-10², 또는 그 이상에 이른다는 사실도 발견하였다.

바꾸어 말하면 본 발명에서 사용하는 hCSF의 제조방법에 따라 증식시킨 인체 융합세포수는 동물개체당 이식한 세포수의 약 10²-10⁷배, 또는 그 이상에도 이르며 시험관내에서 영양배양기에 접종하여 증식시키는 경우의 약 10¹-10⁶배, 또는 그 이상까지도 이르므로 hCSF의 제조에는 매우 좋은 조건이다.

이와같이 하여 증식시킨 인체의 융합세포에 hCSF를 산생시키는 방법은 선택적으로 할 수 있다.

예를 들면, 복강내의 복수에 부유상으로 증식한 융합세포를 채취하고 또는 피하에서 증식한 종혹을 약 20-40℃에서보존한 영양배양기에 세포농도가 약 10⁴-10⁸/ml로 되도록 부유시켜 이것을 약 1-15일간 같은 온도에서 보존하여 hCSF를 산생시키면 된다. 이때 필요에 따라서 배양기속에 hCSF의 증수할 수 있는 약제를 첨가하고 hCSF의 산생량을 가일층 제고할수도 있다. 종래부터 널리 알려진 어떠한 증수제라도 사용할 수 있으나, 예를 들면, 천연 2중 고리 RNA, poly Ⅰ- poly C등의 합성 2중고리 RNA미생물을 산생하는 리포다당, 피로헤마글루티닌, 캔카네이벌린 A, 투베클린(PPD ), 포우크위드미토우겐 등의 미토우겐, 덱스트란황산 등의 반합성고분자, 각종 양이온성 저분자, 피란공중합체, 폴리아크릴산 등의 합성고분자, 각종 엔도톡신, Li₂CO₃, LiCl등의 리튬화합물 중에서 적당히 선택할 수 있다.

이와같이 하여 산생시킨 hCSF는 널리알려진 정제분리법, 예를 들면, 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축, 동결건조 등을 실시하므로 인하여 용이하게 정제분리하여 채취할 수 있다. 나아가서 고도의 정제를 필요로 할 경우에는 예컨데, 이온교환체에 흡착, 탈착, 분자량분별 및 아피니티크로마토그래피, 등전점분별, 전기영등 등의 널리 알려진 방법을 새로이 조합한다면 최고순도의 hCSF를 채취하는 것도 가능하다.

이와같이 하여 획득한 hCSF를 인체조직에서 추출 분리된것과 면역학적으로 물리화학적으로도 차이가 있다는 것은 물론이고 혈청이나 뇨액에서 채취한 것과 같이 간염비루스 라던가 발열성 물질등이 섞여 들어가는 일이 없기 때문에 단독으로 또는 다른 1종 혹은 2종 이상의 물질을 함유시켜 약제로서 인체질병의 예방 및 치료에 유리하게 이용할 수 있다.

더우기 명세서를 통한 hCSF의 산생량은 마우스 골수세포를 사용하여, S. Asano et al., Br. J. Cancer. Vol. 689-694(1980)에 기재한 방법에 준하여 실시하였다.

hCSF 1단위라 하은 hCSF 시료 0.1ml를 사용하여 5×10⁴개의 마우스 골수세포에서 콜로니 1개를 형성하는 활성량으로 정의한다.

다음에 2-3의 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하는 바이지만, 이 실시예는 본 발명의 바람직한 실시상태를 단순히 예시한 것으로서 하등 본 발명을 한정하는 것이 아님은 두말할 것 없다.

[실시예 1]

폐암환자에서 적출, 세절, 분산시켜서 획득한 폐암세포(조직배양 6권 13호 527-748면 1980년)와 림프아톨 나말바세포(Namalwa cell)와를 140mM NaCl, 54mM KCl, 1mM NaH₂PO₄, 2mM CaCl₂를 함유하는 염류용액에 각기 약 10³/ml가 되도록 부유시킨 것과 미리 자외선으로 활성하지 못하게 한 센타이비루스를 함유하는 전기한 염류용액과를 빙점이하 조건에서 혼합한 다음 약 5분 후에 37℃의 항온수조에 옮겨서 약 30분간 교반하면서 세포융합을 하여 림프아를 나말바세포에 hCSF 산생능을 도입하였다.

이 림프아를 나말바세포를 성장한 누우드마우스의 복강내에 이식한 다음 통상적인 방법으로 5분간 사육하였다.

생겨난 종혹 약 14g을 적출하여 트립신을 함유하는 생리적 식염수에 부유시켜 세포를 분산시켰다.

이 세포를 소의 태아혈청 10v/v%를 보충한 RPMI 1940 배양기(pH 7.2)로 세정한 다음 등 배양기에 세포농도 약 1×10⁵/ml가 되도록 부유시키고 정기적으로 배양기를 교환하면서 37℃에서 7일간 보존하여 hCSF를 산생시켰다. 그리하여 세포를 초음파처리하여 형청 상층속에 함유하게 되는 hCSF의 량을 측정하였던바 부유액 ml당 약 2.500 단위였다.

이와 대조하기 위하여 아직 세포융합을 시키지않은 폐암세포를 마찬가지로 처리하여 hCSF를 산생시켰던바 부유액 ml 당 약 120 단위의 산생량에 불과하였다.

다시금 전기한 융합세포와 폐암세포를 각기 소의 태아혈청 10v/v%를 보충한 RPMI 1640 배양기(pH 7.2)를 사용하고 37℃에서 시험관내 배양을 하여 증식시켜 전기와 마찬가지로 처리하여 hCSF를 산생시켰던바 부유액 ml당의 NCSF 산생량은 더욱 저하되어 각기 약 95 단위와 83 단위에 불과하였다.

[실시예 2]

햄스터 신생아에 널리 알려진 방법으로 토끼에서 조제한 항혈청을 미리 주사하고 햄스터의 면역반응을 약화시킨 다음, 그 피하에 실시예 1의 방법에 준하여 인체 B-림프토 Nature. vol 267. 843-844면 1977년의 hCSF 산생능을 도입한 림프아톤 NALL-1 세포 Nature vol 267. 843-844면 1977년을 이식한 다음 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다.

생겨난 종혹 약 9g을 적출하여 실시예 1과 마찬가지로 처리하고 hCSF를 산생시켰던바 부유액 mI 당의 hCSF 산생량은 약 3,500 단위이었다.

[실시예 3]

목밑암환자에서 채취한 암세포와 림프아톨 JBL 세포를 사용하고 실시예 1의 방법에 준하여 hCSF 산생능을 도입한 림프아톨 JBL 세포를 갓난새끼쥐의 정맥내에 이식한 다음 통상적인 방법으로 4주간 사육하였다.

생겨난 종혹 약 37g을 적출하고 실시예 1과 마찬가지로 처리하여 hCSF를 산생시켰다. 부유액 ml 당의 hCSF 산생량은 약 2,900 단위이었다.

[실시예 4]

hCSF 증수약제로서 피로헤마글루티닌을 배양기 ml 당 약 10㎍을 첨가하는 외에 실시예 3과 마찬가지로 하여 hCSF를 산생시켰던바 부유액 ml당의 hCSF 산생량은 약 4,500 단위로 되었다.

[실시예 5]

위암환자에서 획득한 위암세포 조직배양 6권 13호, 527-748면 1980년와 림프아톨 TALL-1세포 Nature vol. 267, 843-844면 1977년와를 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 널리 알려진 방법으로 융합시키 림프아를 TALL-1 세포에 hCSF 산생능을 도입하였다. 이 세포를 약 400 REM의 γ선을 조사하여 그 면역반응을 약화시켜 성장한 보통마우스의 피하에 이식하고 통상적인 방법으로 4주간 사육하였다.

피하에 생겨난 종혹 약 15g을 적출하고 실시예 1과 마찬가지로 hCSF를 산생시켰던바 부유액 ml 당의 hCSF 산생량은 약 3,500 단위이었다.

[실시예 6]

구명의 지름이 0.5μ의 박막거르개를 마련한 용적 약 10ml인 프라스틱계 원통형 확산챔버내에 실시예 5의 방법에 준하여 신장암세포 조직배양 6면 13권호 527-748면 1980년에서 채취한 신장암세포의 hCSF 산생능을 림프아를 TALL-1 세포에 도입하였다. 림프아를 TALL-1 세포를 생리적식염수에 부유시키고 이것을 성장한 쥐의 복강내에 매설하였다.

위 쥐를 통상적인 방법으로 4주간 사육한 다음, 이 확산챌버를 들어내었다. 이에 따라 획득한 세포농도는 약 2×10⁰/ml였으며 시험관내에서의 탄산가스 항은수조 속에서 배양할 경우에 약 10³배 이상에도 이른다는 사실을 발견하였다. 증식세포를 실시예 1과 마찬가지로 처리하여 hCSF를 산생시켰던바 부유액 ml 당의 hCSF 산생량은 약 4,200 단위이었다.

[실시예 7]

실시예 6의 방법으로 융합, 증식시킨 세포를 배양기속에 합성 2중고리 RNA I·poly C를 ml 당 약 5㎍를 첨가함과 동시에 실시에 1과 마찬가지로 하여 hCSF를 산생시켰던바, 부유액 ml 당의 hCSF 산생량은 약 7,300 단위로 되었다.

[실시예 8]

미리 37℃에서 5일간 보존된 닭의 수정난에 실시예 1의 방법으로 조제한 hCSF 산생능을 도입한 림프아톨 나말바세포를 이식한 다음 이 온도에서 1주간 보존하였다.

그런 다음 알을 난할한 증식세포를 채취하여 배양기속에 투베르클린 PPD를 ml 당 약 10㎍ 첨가하는 한편 실시예 1과 마찬가지로 처리하여 hCSF를 산생시켰던바 부유액 ml 당의 hCSF 산생량은 약 5,700단위이었다.

Claims (11)

1. 인체 콜로니 자극인자 산생능이 들어있는 인체의 세포와 인체 림프아세포와를 융합시키고, 이 융합 세포를 인체 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 그 온혈동물의 체액의 공급을 받으면서 증식시켜서 획득하는 세포에서 인체콜로니 자극인자를 산생시키는 것을 특징으로 하는 인체 콜로니 자극인자의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 인체 림프아세포가 인체 폐암세포와 융합하는 인체 콜로니 자극인자의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 인체 림프아세포가 인체 B-림프르와 융합하는 인체 콜로니 자극인자의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 인체 림프아세포가 인체 B-턱밑암세포와 융합하는 인체 콜로니 자극인자의 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 인체 림프아세포가 인체 위암세포와 융합하는 인체 콜로니 자극인자의 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 인체 림프아세포가 인체 신장암세포와 융합하는 인체 콜로니 자극인자의 제조방법.
7. 제1항에 있어서, 인체 림프아가 인체콜로니 자극인자 산생능을 가지는 인체 림프아세포와 융합을 하는 인체 콜로니 자극인자의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 인체 림프아가 인체 림프아구인 인체콜로니 자극인자의 제조방법.
9. 제1항에 있어서, 인체 림프아세포가 Namalwa 세포, NALL-1 세포, TALL-1 세포 또는 JBL 세포인 인체 콜로니 자극인자의 제조방법.
10. 제1항에 있어서, 융합세포의 증식이 천연 2중쇄 RNA, 합성이중쇄 RNA, 미생물을 산생하는 리포다당, 미토우겐, 화학적 모조자연중합체, 합성중합체, 양이온성 저분자화합물, 엔도톡신과 리튬 화합물 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 공존하에서 인체 콜로니 자극인자를 산생시키는 인체 콜로니 자극인자의 제조방법.
11. 제1항에 있어서, 인체 이외의 온혈동물이라 함은 닭, 비둘기, 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소, 말, 토끼, 기니아피그, 쥐, 햄스터, 보통마우스, 누우스인 인체 콜로니 자극인자의 제조방법.