JPS5823793A - ヒトｔ細胞増殖因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒ）Ｔ細胞増殖因子の製造方法に関する。

ヒトＴ細胞増殖因子（以下、ｈＴＣＧＦという）は、ヒ
ト血清から調整されるヒ）Ｔ細胞の増殖促進作用を示す
ホルモン様の蛋白性物質で、ヒト細胞増殖促進因子の一
種である。

Ｔ細胞は、生体内で、例えば遅延型アレルギー、腫瘍免
疫などの細胞性免疫をつかさどっている重要なリンパ球
である。

ｈＴＣＧＦは、このような働らきを有するヒトＴ細胞の
増殖を促進し、“活性化することから、インビトロでの
Ｔ細胞増殖促進剤として利用されるだけでなく、例えば
、喘息、悪性腫瘍などにおける疾患の治療研究のための
医薬、さらにはそれら疾患の免疫療法剤などとしての利
用が期待されており、その大量製造方法の確立が望１れ
ている。

Ｔ細胞増殖因子は、成松久「Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ
）とその応用」、代謝、ＶＯｌ、　１７．第２０６３〜
２０７７頁（１９８０年）の記載から明らかなように、
別名　インターロイキンともいわれ、その作用には種依
存性が見られない。

ヒト疾患の治療に際し、ヒト以外の動物細胞由来のＴＣ
ＧＦを使用することも考えられるが、アナフィラキシ−
ショックなどの好ましからざる抗原抗体反応が懸念され
る。

従って、ヒトの治療に供するには、ヒトの生細胞由来の
ｈＴＣＧＦを使用するのが安全であり、優れている。

ｈＴＣＧＦの調製材料としては、従来からヒト血清が知
られている。しかしながら、ヒト血清はヒトの新鮮面か
ら分離して調整されるものであり、その保存も困難であ
ることから、大量に安価に供給することは極めて困難で
ある。

このような理由から、ヒト疾患の予防や治療に使用し得
るｈＴＣＧＦの製造は、末だ工業的規模で実施されるま
でに至っていない。

本発明者は、工業的規模で容易に実施し得るｈＴＣＧＦ
の製造方法を鋭意検討した。

その結果、ｈＴＣＧＦ産生能を有する璧ト由来の・細胞
をヒト以外の温血動物を利用して増殖させて得た細胞は
、インビトロでの組織培養で得られる細胞よシもｈＴＣ
ＧＦの産生が著しく高く、細胞当り約２〜１０倍、また
はそれ以上にも達することを見いだし、本発明を完成し
た。

すなわち、本発明は、ｈＴＣＧＦ産生能を有するヒト由
来の細胞をヒト以外の温血動物体内に移植。

またはその温血動物の体液の供給を受けながら増殖させ
、得られる細胞からｈＴＣＧＦを産生させることを特徴
とするｈＴＣＧＦの製造方法に関するものである。　　
一 本発明の方法は、従来のインビトロで組織培養する場合
と比較して、大量のｈＴＣＧＦを生成できるだけでなく
、高価な血清などを含む栄養培地が不要、または大幅に
節約でき、更に側輪゛増殖中の維持管理も極めて容易で
ある。すなわち、　ｈＴＣＧＦ産生能を有するヒト由来
細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、またはその動
物の体液の供給を受けることのできるチャンバーに収容
し、通常の飼育をすれば、温血動物体から供給される栄
養物を含有する体液を利用してその細胞が容易に増殖し
うるのである。更に、インビトロで組織培養する場合と
比較して、細胞の増殖が安定していること、その増殖速
度が大きいこと、大量の細胞が得られること、更には細
胞当りのｈＴＣＧＦ産生量が大きいことが特徴である。

本発明で使用するヒト由来の細胞は、ｈＴＣＧＦ産生能
を有し、かつヒト以外の温血動物の体内に移植して容易
に増殖するものであればよい。例えば、ヒト末梢血細胞
、ヒト牌臓細胞、ヒト扁桃細胞、或いはヒト扁桃腫瘍細
胞、ヒト肝臓癌細胞、ヒト肺癌細胞など、更にはこれら
細胞を培養株化させたものなどが好適である。

また、培養株化された公知力ヒト由来の細胞とり、テは
、例えば、組織培養Ｖｏ１．６．第５２７〜５４６頁（
１９８０年）に記載されているＫＳ−５，ＭＯＬＴ−８
、ＭＴ−１，Ｍｏｎｏ−１，ＯＵＭＳ−１９などが適宜
選択される。

また、これら細胞のｈＴＣＧＦ産生能を持つ遺伝子を例
えば、ポリエチレングリコールやセンダイウィルスなど
を利用する細胞融合の手段や、ＤＮＡリガーゼ、制限酵
素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を
利用する遺伝子組み換えの手段などによって、より容易
に継代培養しうる培養株化されたヒトリンパ芽球様細胞
に導入して使用することは、その増殖速度が大きいだけ
でなく、細胞当りのｈＴＣＧＦ産生能が約２〜１０倍、
またはそれ以上にも高まるので特に好都合である。

また、培養株化されたヒ）　ＩＪンノく芽球様細胞を利
用すれば、ヒト以外の温血動物に移植する際、その宿主
動物の細胞と混りにくい軟腫瘤を形成し易く、摘出後の
分散も容易なので、ヒ）　ＩＪンノく芽球様生細胞だけ
を採取するのにきわめて有利である。

このようなヒトリンパ芽球様細胞には、ヒト白血病もし
くはヒト悪性リンパ腫由来の細胞株が適しており、例え
ばナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ　）細胞、ＢＡＬＬ−１細
胞、ＮＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＪＢＬ細胞
などの公知ヒト由来細胞株が、特に有利に使用しうる。

本発明のｈＴＣＧＦの製造方法に使用する温血動物は、
ｈＴＣＧＦ産生能を有するヒト由来の細胞が増殖しうる
ものであればよく、例えば、ニワ）　ｌ　。

ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ブタ。

ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、ノームスタ
ー、普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類などが使用
できる。

これら動物にヒト合法の細胞を移植すると、好ましくな
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
だけおさえるために、使用する動物は、できるだけ拗若
な状態５すなわち卵、胚。

胎児、または新生期、幼少期のものの方が好ましい。

また、これら動物に例えば、約２００〜６００レムのエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処置をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。使用する動
物がヌードマウスの場合には、成長したものであっても
免疫反応が弱いので、これらの前処置を必要とすること
なく、培養株化されたヒト由来の細胞が移植でき、急速
に増殖できるので特に好都合である。

また、ヒト由来の細胞を、例えば先ずハムスターに移植
し増殖させた後、この細胞を更にヌードマウスに移植す
るなどのように、ヒト以外の温血動物間で移植して、ヒ
ト由来の細胞の増殖をよシ安定化したり、更にそれらか
ら生成されるｈＴＣＧＦ量を増加させることも自由であ
る。この場合、同種間、同属間は勿論のこと囲網間、同
門間移植であってもよい。

ヒト由来の細胞を移植する動物体内の部位は、移植した
細胞が増殖し得る部位であればよく、例えば尿液腔、静
脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。

また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例え
ば孔径約１０−７〜１０−５ｍ’＆有するメンブランフ
ィルタ−１限外濾過膜またはホローファイバーなどを設
けた公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体
内、例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含
む体液の、供給を受けつつ、そのチャンバー内で公知の
培養株化された’ｅ　ト由来の細胞を何れも増殖させる
ことができる。

また、必要に応じて、この拡散チャンバー内の栄養物を
含む体液を動物体内のそれと接続し潅流させるようにし
た拡散チャンバーを、例えば動物体表に取付け、拡散チ
ャンバー内のヒト由来、Ω細胞の増殖状態を透視できる
ようにすることも、また、この拡散チャンバ一部分のみ
を着脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命−胚
細胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量を更に高
めることもで、きる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特徴
を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育を続
ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは何ら必要
としないので好都合である。ヒト由来の細胞を増殖させ
るための期間は通常１〜２０週である。移植する培養株
化された細胞が腫瘍細胞であるかりンバ芽球様細胞であ
る場合゛には、その増殖速度が特に犬であり、通常１〜
５週の期間で目的を達成することができる。このように
し、て得られるヒト由来の細胞数は、動物側体当シ約１
０７〜１ｏ１２．またはそれ以上に達することも見い出
した。

換言すれば、本発明で使用するｈＴＣＧＦの製造方法に
より増殖させたヒト由来の細胞数は、動物個体当り移植
した細胞数の約１０２〜１０７倍、またはそれ以上にも
達し、インビトロで栄養培地に接種して増殖させる場合
の約１０１〜１０’倍、または、それ以上にも達して、
ｈＴＣＧＦの製造にはきわめて好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来の生細胞からｈＴＣ
ＧＦを産生させる方法は自由である。

例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の細
胞を採取し、または皮下で増殖した腫瘤を摘出し、分散
させた後採取し、この細胞を約２０〜４０℃に保った栄
養培地に細胞濃度が約１０４〜１０８／−になるように
浮遊させてｈＴＣＧＦを産生させればよい。この際、必
要ならばｈＴＣＧＦ誘導剤を作用させてもよい。ｈＴＣ
ＧＦ誘導剤は、温血動物を利用して増殖させて得られる
ヒト由来細胞からｈＴＣＧＦを誘導生成できる物質であ
れば何でもよ＜、例、ｔｌｄ’、フィトヘマグルチニン
、コンカナノぐリンＡ、ポークウィードミトーゲン、リ
ポポリサツカリド、エンドトキシン、多糖類、細菌など
のミトーゲンやウィルス、核酸、ポリヌクレオチドなど
が適宜選択される。

また、ｈＴＣＧＦ産生に際し、ｈＴＣＧＦ安定剤を添加
し、生成し１ｈＴｃＧＦの安定化を計ってｈＴ　ＣＧ　
Ｆの収量を高めることも自由である。

このようにして誘導生成されたｈＴＣＧＦは、公知の精
製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離、濃縮
、凍結乾燥などを行なうことによって容易に精製分離し
、採取することができる。更に、高度の精製を必要とす
る場合には、例えば。

イオン交換体への吸着・脱着、ゲル濾過、アフィニティ
クロマトグラフィー、等電点分画、電気泳動などの公知
の方法を更に組み合わせればよく、最高純度のｈＴＣＧ
Ｆを採取することも可能である。

本発明により製造したｈＴＣＧＦは、従来公知のヒト血
清より調製したｈＴ　ＣＧ　Ｆと免疫学的に差異がない
ことはもとより、発熱性物質や肝炎ウィルスの混入もな
い。従って、ｈＴＣＧＦ単独で、またはこれに例えば、
ビタミン、ホルモン、抗癌剤などその他の一種もしくは
二種以上の物質を含有せしめ、内服薬、注射薬などとし
てヒト疾病の予防や治療に有利に利用できる。

なお明細書を通じてｈＴ　ＣＧ　Ｆの活性は、Ｑｉｌｌ
ｉｓＳ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏＬ　
、　Ｖｏｌ　１２０．第２０２７〜２０３２頁（１９７
８年）に記載されている方法に準じて゛３Ｈ−チミジン
の取シ込みを促進する活性量を測定した。

すなわち、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスからの胸腺細
胞をｗｅｌｌ当り１００μｔ　（１０５個）ずつになる
ようにマイクロプレートにとり、これに段階的に希釈し
たｈＴＣＧＦ含有液１００μｔを加え、３７℃で２日間
インキュベートした後　Ｈ−チミジンをｗｅ１１当り０
５μＣ１ずつ加え、４時間後に細胞内に取り込まれたＨ
−チミジン量を液体シンチレーションカウンターで測定
した。ｈＴＣＧＦの活性単位は、測定値がａｏｏ。

ｅｐｍになる希釈倍数とした。

以下、２〜８の実施例を挙げて更に詳細に本発明を説明
するが、この実施例は、本発明の好ましい実施態様の単
なる例示にすぎず１本発明を何ら限定するものでないこ
とは言うまでも々い。

実施例　Ｌ 成長したヌードマウスの皮下に、ヒト末梢血細胞を培養
株化させたＭＴ−１細胞を移植した後１通常の方法で３
週間飼育した。皮下に生じた腫瘤約１０２を摘出して細
切した後、トリプシン含有生理食塩水に浮遊させ細胞を
分散させた。

この細胞を血清無含有ＲＰＭＩ　１６４０培地（ｐＨ７
２）で洗浄した後、細胞濃度約１×１０５／ｍ７！にな
るように同培地に浮遊させ、３７℃で３日間保ってｈＴ
ＣＧＦを産生させた。培養終了後、細胞浮遊液を約ａ０
００　ｒｐｍで３０分間遠心分離し得られる上清に含ま
れるｈＴＣＧＦＯ量を測定したところ浮遊液１００μを
当り約１，６００単位であった。

対照として、ＭＴ−１細胞を仔牛血清１ｖ／ｖ％及び肉
エキス２０Ｖ／Ｖ％を含有するＥａｇｌｅ培地（ｐＨ７
２）１用い３７℃、インビトロで組織培養して得た対照
の細胞を用いて、前記同様にｈＴＣＧＦを産生せしめた
ところ浮遊液１００μを当り約４０単位の産生量にすぎ
なかった。

実施例　２ 扁桃腫瘍患者から摘出、細切、分散させた腫瘍細胞とリ
ンパ芽球様ナマルバ細胞（ＮａｍａｌｖａＣｅｌｌ　）
とを１４０　ｍＭ　Ｎａｃｌ、　５４ｍＭ　ＫＣＩ、　
１　ｍＭＮａＨ２ＰＯ，、２ｍＭ　ＣａＣ１□　を含有
する塩類溶液にそれぞれ約１０／−になるように浮遊さ
せ、これに予め紫外線で不活化したセンダイウィルスを
含有する前記塩類溶液を、水冷下で混合し、約５分後に
３７℃恒温水槽に移して、約３０分間攪拌しつつ細胞融
合させ、リンパ芽球様ナマルバ細胞にｈＴＣＧＦ産生能
を導入した。このリンパ芽球様ナマルバ細胞を成長した
ヌードマウスの腹腔内に移植した後、通常の方法で５週
間飼育した。

生じた腫瘤約１５９を摘出し、−当り１μ２のフィトヘ
マグルチニンを加えた培地を使用した以外は実施例１と
同様に処理してｈＴＣＧＦを産生せしめた。浮遊液１０
０μを当シのｈＴＣＧＦ産生量は約へ８００単位であっ
た。

対照として細胞融合させたリンパ芽球様ナマルバ細胞を
実施例１と同様にインビトロで組織培養して得た細胞を
用いて、ｈＴＣＧＦを産生せしめたところ、浮遊液１０
０μを当り約９０単位の産生量にすぎなかった。

実施例　ａ ハムスター新生児にウサギから公知の方法で調製した抗
血清を予め注射し、ハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下に、実施例２の方法に準じてｈＴＣＧＦ産生能
を導入したリンパ芽球様ＪＢＬ細胞を移植し、その後通
常の方法で３週間飼育した。

生じた腫瘤約１８ｆ’ｉ摘出し、ｒｎｌ、肖り５０μ２
のコンカナバリンＡを加えた培地を用いた以外は実施例
１と同様に処理した後、　ＲＰＭＩ　１６４０培地に代
えて、肉エキス２０ｖ／ｖ％を含有するＥａｇｌｅ培地
（ｐＨ７２）を用いたこと以外は実施例１と同様にして
ｈＴＣＧＦを産生させた。浮遊液１００μを当りのｈＴ
　ＣＧ　Ｆ産生量は約１，２００単位で細胞を実施例１
と同様にインビトロで培養増殖させ、次いでｈＴｃＧＦ
ｔ産生せしめたところ、浮遊液１００μを当り約１５０
単位の産生量にすぎなかった。

実施例　屯 ラット新生児の静脈内へ、リンパ芽球様ナマルバ細胞の
代りにリンパ芽球様ＢＡＬＬ−１細胞を用いた以外実施
例２と同様にしてｈＴＣＧＦ産生能を導入したリンパ芽
球様ＢＡＬＬ−１細胞を移植し、通常の方法で４週間飼
育した。

生じた腫瘤約８５Ｆを摘出し、実施例２と同様に処理し
てｈＴｃＧＦｔ産生せしめた。浮遊液１００μを当りの
ｈＴＣＧＦ産生量は約へ３００単位であった。

これに対して、対照としてインビトロで培養増殖させ、
ｈＴＣＧＦを産生せしめたものは、浮遊液１００μを当
り約１１０単位の産生量にすぎなかった。

実施例　五 成長した普通マウスに、約４００レムのガンマ線を照射
してマウスの免疫反応を弱めた後、その皮下にヒト末梢
血細胞を培養株化させたＭｏｎｏ−１細胞を移植し１、
その後通常の方法で４週間飼育した。

皮下に生じた腫瘤約２０ｙ’ｉ摘出し、実施例３と同様
に処理してｈＴｃＧＦｋ産生せしめた。浮遊Ｑ　１００
　ａｔ当りのｈＴＣＧＦ産生量は約４００レムであった
。

これに対して、対照としてインビトロで培養増殖せしめ
次いでｈＴｃＧＦ’に産生させたものでは、浮遊液１０
０μｔ”６り約３０単位の産生量にすぎなかった。

実施例　６ 孔径約（１５ミクロンのメンブランフィルタ−を設ケタ
内容量約１０−のプラスチック製円筒型拡散チャンバー
内に、実施例１で用いたＭＴ−１細胞を生理食塩水に浮
遊させ、これを成長したラットの腹腔内に埋設した。

このラットヲ通常の方法で４週間飼育した後、この拡散
チャンバーを取り出した。これにより得られたヒト由来
の細胞濃度は、約１０９７ｍ／にも達し、インビトロの
炭酸ガスインキュベーター中で培養する場合の約１０２
倍以上にも達することが判明した。

こうして得た細胞を実施例３と同様に処理してｈＴＣＧ
Ｆを産生せしめた。浮遊液１００μを当りのｈＴＣＧＦ
産生量は約４００レムであった。

実施例　７ 予め３７℃で５日間保温しておいたニワトリの受精卵に
実施例４の方法でｈＴＣＧＦ産生能を導入したリンパ芽
球様ＢＡＬＬ−１細胞を移植し、次いで３７℃に１週間
保った。

この卵を割卵して増殖細胞を採取し、実施例１と同様に
処理してｈＴＣＧＦを産生せしめた。

浮遊液１００μを当りのｈＴＣＧＦ産生量は約２，４０
０単位であった。

特許出願人 株式会社林原生物化学研究所 手続補正書 昭和５７年３月３１日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第９５６８号 ２、発明の名称 ヒトＴ細胞増殖因子の製造方法 ３８　　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ４、補正の対象 ５、　補正の内容 （１）　　明細書第１５頁第１２行〜第１７行記載の「
生じた腫瘤的１８ｇを摘出し、・・・・・山・産生させ
た。」を次文のように補正します。

［生じた腫瘤的１８ｇを摘出し、ＲＰＭＩ　　１６４０
培地に代えて、肉エキス２０　ｖ／ｖ％を含有するＥａ
ｇｌｅ培地（ＰＨ７，２）を用いたこと及びｍｌ当り犯
μｇのフンカナバリンＡを加えた培地を用いたこと以外
は実施例１．と同様にしてｈＴＣ（３Ｆを産生させた。

」 手続補正書 昭和５７年９月１４日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 Ｌ　事件の表示 昭和５７年特許願第９５６ｄ号 ２　発明の名称 ヒ）Ｔ細胞増殖因子の製造方法 ａ　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 昭和５７年８月１３日 ＆　補正の対象 明細書における「発明の名称」の項 Ｇ　補正の内容 明細書における「発明の名称」の項を、次のように補正
し１す。

「Ｌ　発明の名称 ヒトＴ細胞増殖因子の製造方法」

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ヒトＴ細胞増殖因子産生能を有するヒト由来
   の細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、またはその
   温血動物の体液の供給を受けながら増殖させ、得られる
   細胞からヒトＴ細胞増殖因子を産生せしめることを特徴
   とするヒトＴ細胞増殖因子の製造方法。
2. （２）　　ヒト細胞増殖因子を産生せしめるに際し、得
   られる細胞にヒトＴ細胞増殖因子誘導剤を作用せしめる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のヒトＴ細
   胞増殖因子の製造方法。