KR860001589B1 - 인체 갑상선 자극호르몬의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

인체 갑상선 자극호르몬의 제조방법

본 발명은 인체 갑상선 자극호르몬(Human thyroid­stimulating hormone, 이하 hTSH로 약칭함)의 제조방법에 관한 것이다.

hTSH는 뇌하수체 전엽의 호염기성 세포가 생산하는 호르몬으로, 갑상선 중량의 증가작용, 무기요소의 유기화촉진작용 및 ATPase 의 활성화작용등을 갖고 있다. 그러나, hTSH를 대량으로 싼 값에 제조할 수 있는 방법은 아직 알려져 있지 않다.

본 발명자는, hTSH의 대량공급을 목적으로 예의 연구를 거듭하였던바, 이외에도 hTSH생산능을 갖고 있는 인체유래의 임파아구세포가 그 증식속도가 크고 세포당 hTSH생산량도 커서 hTSH 생산세포로서 바람직하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 hTSH 생산능이 있는 인체유래의 임파아구 세포를 인체이의의 온혈동물체내에 이식하거나 또는 그 온혈동물의 체액을 공급받으면서 증식시킨 세포로 부터 hTSH를 생산시키는 것을 특징으로 하는 hTSH의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명방법은 시험관 내에서 배양시킬 경우와는 달리, hTSH의 생산량이 클뿐 아니라, 비싼 혈청등을 함유하는 영양배지를 필요로하지 않거나 또는 크게 절약할 수 있고, 이밖에 세포증식중의 유지관리도 극히 용이하다.

즉, hTSH 생산능이 있는 인체유래의 임파아구세포를 인체 이외의 온혈동물체내에 이식되거나, 또는 그동물의 체액을 공급받을 수 있는 챔버내에 수용하고 통상적인 사육을 하면 온혈동물체로 부터 공급되는 영양물질을 함유하는 체액을 이용해서 그 세포를 용이하게 증식시킬 수 있다.

이밖에, 시험관 내에서 배양하는 경우와 비교해서 이 세포증식이 안정하다는 점, 그 세포 증식속도가 크다는 점, 수득한 세포량이 많다는 점, 또한 세포당 hTSH 생산량이 크다는 점등에 특징이 있다.

본 발명에서 사용하는 인체유래의 임파아구세포는 hTSH 생산능이 있고, 또 인체 이의의 온혈동물체내에 이식해서 용이하게 증식시킬 수 있는 것이면 무방하다.

예를들면, 뇌하수체 전엽의 호염기성 세포, 뇌하수체 종양세포, 뇌하수체 색소혐성 선종세포등과 같이 본래부터 hTSH 생산능을 가지고 있는 세포및 폐암세포등이 이소성 hTSH생산능이 있는 세포로부터의 hTSH 생산유전자를, 폴리에틸렌글리콜이나 센다이비루스등을 이용하는 세포융합의 수단이나 또는 DNA리가아제, 제한효소(뉴클레아제), DNA폴리미라제등의 효소를 이용하는 유전자제조합수단등에 의해 도입한 인체유래의 임파아구세포 또는 이소성 hTSH 생산능이 있는 인체유래의 임파아구세포 등이 바람직하다.

이들 임파아구세포의 이용은 인체 이외의 온혈동물에 이식할때 그 숙주동물의 세포와 섞이기 어려운 연질의 거대한 종양을 형성하기 쉬울 뿐 아니라, 적출후의 분산처리도 용이하므로 살아있는 인체 임파아구세포를 채취함에 있어 매우 유리하다.

본 발명에서 hTSH제조방법에 사용하는 온혈동물은 hTSH 생산능을 갖고 있는 인체유래의 임파아구세포가 증식될 수 있는 동물이면 무방하다.

예를들면, 닭, 비둘기 등의 조류, 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소, 말, 토끼, 몰모트, 쥐, 햄스터, 보통 마우스, 누우드마우스 등의 포유동물을 사용할 수 있다.

이들 동물에 인체유래의 임파아구세포를 이식하면 바람직하지 못한 면역반응을 일으킬 염려가 있기 때문에, 그 반응을 가능한한 줄여주기 위해서 사용하는 동물은 가급적 유약한 상태, 즉 란(卵), 배(胚), 태아, 신생기 및 유소기(幼少期)의 동물이 바람직하다. 또, 이들 동물에 예컨데 약 200 내의 600REM의 X선 혹은 γ선을 조사하거나 또는 항혈청, 혹은 면역억제제등을 주사하는 등의 사전처리를 행하여, 면역반응을 약화시켜서 이식하여도 좋다.

사용하는 동물이 누우드마우스일 경우에는, 성장한 것이라 하더라도 면역반응이 약하기 때문에 이와 같은 사전처리를 할 필요가 없으며, 배양주화 된 인체유래의 임파아구세포를 이식할 수 있으며 급속도로 증식하므로 특히 바람직하다. 또, 인체유래의 임파아구세포를 예컨데 우선 햄스터에 이식하여 증식시킨 다음 이세포를 다시 누우드마우스에 이식하는 등의 절차로 인체 이외의 온혈동물간에 이식해서 인체유래의 임파아구세포 증식을 보다 안정화하거나, 나아가서 그로부터 생산되는 hTSH량을 증가시키는 것도 임의대로 행할수 있다. 이같은 경우, 동종간(同種間), 동속간(同屬間)은 물론이고, 동강간(同綱間), 동문간(同門間)이식이라 하더라도 무방하다.

이밖에, 인체유래의 임파아구세포를 이식하는 동물체내의 부위는 이식한 세포가 증식할 수 있는 부위라면 어디라도 상관없다. 예를들면, 뇨액강, 정맥, 복강(腹腔), 피하 등을 임의로 선택할 수 있다.

또, 직접 동물체내에 인체유래의 임파아구세포를 이식하지 않고서도 동물세포의 통과를 저지할 수 있는 다공성 여과막, 예를들면 공극직경이 약 10^－7내지 10^－5m로 된 멤브레인필터, 한의여과막 또는 중공(中空)섬유 등을 구비한 공지된 각종 형상, 크기의 확산챔버를 동물체내, 예컨데 복강내에 매설하여 동물체로 부터 영양물을 함유하는 체액의 공급을 받으면서 챔버내에서 배양주화시킨 인체유래의 임파아구세포를 증식시킬 수 있다.

또, 필요한 경우 이 확산챔버내의 영양물 함유 체액을 동물체내의 체액과 접속하여 관류하도록 설계한 확산챔버를 예컨데 동물체 표면에 부착하고 확산챔버내의 인체 유래의 임파아구세포의 증식상태를 투시할 수 있도록 하거나, 또는 이 확산챔버 부분만을 착탈 교환할 수 있도록 해서 동물을 도살하지 않고 수명이 다할때까지 세포를 증식시켜서 동물개체당의 세포생식량을 더욱 재고할 수도 있다.

이들 확산챔버를 이용하는 방법은 인체유래의 임파아구 세포가 동물세포와 직접 접촉하지 않기 때문에 인체유래의 임파아구 세포만을 용이하게 채취할 수 있을뿐 아니라, 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 염려도 적기 때문에, 면역반응을 억제하는 사전처리를 필요로 하지 않으며, 각종 온혈동물을 임의대로 이용할 수 있는 특징을 가지고 있다.

이식한 동물의 유지관리는 그동물의 통상적인 사육을 지속하는 것으로 족하며, 이식후라 하더라도 특별한 취급은 전혀 필요로 하지 않는다.

인체유래의 임파아구세포를 증식시키기 위한 기간은 1 내지 20주, 통상 1 내지 5주면 목적을 달성할 수 있다.

이같이 해서 수득한 인체유래의 임파아구세포수는 동물개체당 약 17⁷내지 10¹², 또는 그 이상에 이른다는 사실도 발견하였다.

바꿔 말하면, 본 발명에 사용하는 hTSH의 제조방법에 따라 증식시킨 인체유래의 임파아구세포수는 동물개체당 이식한 세포수의 약 10²내지 10⁷배, 또는 그 이상까지도 이르게 되어, 생체 이외의 영양배지에 접종해서 증식시킨 경우의 약 10¹내지 10⁶배, 또는 그 이상까지 도달하므로, hTSH의 제조에 있어 매우 바람직하다.

이같이 해서 증식시킨 인체유래의 임파아구 세포로부터 hTSH를 생산시키는 방법은 임의로 사용될 수 있다. 예를들면, 복강내복수에 부유상으로 증식시킨 인체유래의 임파아구세포를 채취하고나 또는 피하에서 증식시킨 거대한 종양을 적출하여 분산시킨 다음 채취하고, 이 세포를 약 20 내지 40℃로 보관한 영양배지에 세포농도가 약 10⁴내지 10⁸/mι가 되도록 부유시키고, 약 1내지 100시간 보관해서, hTSH를 생산시키면 된다.

이때 생산량을 보다 높여주기 위해서, 예컨데 글리신, 류우신, 리신, 아르기닌, 시스테인 등의 아미노산, 염화나트륨, 염화갈륨, 염화칼슘, 황산마그네슘등의 염류 및 갑상선 자극호르몬 방출호르몬(Thyritripin releasing hormone)등의 호르몬중 1종 또는 2종 이상의 물질을 공존시키는 것도 바람직하다.

또, 발명에 의해 hTSH의 생산과 동시에 다른 호르몬, 예를들어 인체 융모성선 자극호르몬(Human Chronic Gonadotropin, 이하 HCG로 약칭함), 인체난포자극호르몬(Human Follicle­stimulating Hormone, 이하 hSFH로 약칭함)등을 생산시키는 것도 임의대로 행할 수 있다.

이같이 해서 생산시킨 hTSH는 공지의 정제분리법, 예를들면, 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축, 동결건조등을 실시함으로서 용이하게 정제 분리하여, 체취할 수 있다. 이밖에, 고도의 정제를 필요로 하는 경우에는 예컨데 이온교환체에 의 흡착 및 탈착, 겔여과, 친화성 크로마토그라피, 등전점분획, 전기영동 등의 공지방법을 재차 조합해서 최고순도의 hTSH를 채취할 수도 있다. 이같이 해서 수득한 hTSH는 단일물지로서, 또는 여기에 다른 1종 또는 2종 이상의 물질을 함유시켜서, 예를들어 주사약, 외용약, 내복약, 진단약등으로서 인체질환의 예방 및 치료에 유익하게 이용할 수 있다.

hTSH의 생산량은 S.W. Manley 등에 의해 J. Endocrinol. Vol. 61,419 내지 436(1974)에 보고되어 있는 방사수용기검정법(radio­receptorassay method)에 준하여 측정하고 영국 National Institute for Medical Research로 부터 입수한 표준 hTSH의 국제단위(IU)로 표시하하였다.

또, hCG의 생산량은 A.R. Midgley, Jr.에 의해 Endocrinology, Vol. 79,10 내지 18페이지(1966)에 보고되어 있는 방사면역법(Radio­immunoassay method)에 준하여 측정하고, 또 국제단위(IU)로 표시하였다.

또한, hFSH의 생산량은 C. Faiman 등에 의해, J. Clin. Endocrinol. Metab., Vol. 27,444 내지 447페이지(1967)에 보고되어 있는 방사면역법에 준하여 측정하고 국제단위(IU)로 표시하였다.

다음에 2-3의 실시예를 상술하였다.

[실시예 1]

뇌하수체 전엽의 호염기성 세포 선종환자로 부터 적출, 세절하고 분산처리해서 수득한 인체 종양성 호기염기성 세포와 임파아구 나말바세포(Namalwa cell)를 140mM NaCl, 54mM KCl, 1mM NaH₂PO₄, 2mM CaCl₂를 함유하는 염류용액에 각각 약 10⁴/mι가 되도록 부유시키고, 여기에 미리 자외선으로 불활성화시킨 센다이비루스를 함유하는 전술한 염류용액을 빙냉하에서 혼합하고 약 5분후 37℃ 항온수조로 옮긴 다음, 약 30분간 교반하면서 세포융합을 진행시켜, 임파아구 나말바 세포에 hTSH 생산능을 도입하였다.

이 임파아구 나말바세포를 성장한 누우드 마우스의 복강내에 이식한 다음 통상적인 방법으로 5주간 사육하였다. 생겨난 거대한 종양 약 15g을 적출, 세절한 다음 트립신을 함유하는 생리식염수에 현탁해서 세포를 분산시켰다. 이 세포를 소의 태아혈청 10 v/v%를 보충한 Earle배지 199(pH 7.2)로 세척한 다음 L-아르기닌을 30mM을 첨가한 동일배지에 세포농도 약 10⁵/mι가 되도록 부유시키고, 37℃에서 35시간 보관해서 hTSH를 생산시켰다. 그후, 세포를 초음파 처리하고, 수득된 상등액을 사용해서 hTSH량을 측정한 결과 부유액 mι당 약 180mIU이었다.

또 이 상등액에서는 hFSH의 활성도 확인되었으며, 그 량은 부유액 mι당 약 500mIU이었다. 대조용으로 종양성 호염기성세포를 소의 태아혈청 10v/v%를 보충한 Earle배지 199(pH 7.2)에서 37℃로 시험관내 배양을 한 다음, 수득된 세포를 동일한 방법으로 처리해서 hTSH를 생산시킨 결과, 부유액 mι당 겨우 0.3mIU에 불과하였다.

[실시예 2]

뇌하수체 색소혐성세포 선종환자로부터 적출, 세절하고 분산시켜서 수득한 인체 색소혐성 선종세포와 임파아구 JBL세포를 실시예 1의 방법에 준하여 세포융합시켜서 임파아구 JBL세포에 hTSH생산능을 도입하였다. 이 세포를 토끼로 부터 공지방법에 따라 조제한 항혈청을 미리 주사해서 면역반응을 약화시킨 신생아 햄스터 피하에 이식한 다음 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다. 피하에 생겨난 거대한 종양 약 10g을 적출, 세절한 다음 콜라겐아제를 함유하는 생리적 식염수에 현탁해서 세포를 분산시켰다. 이 세포를 인체 혈청 5v/v%를 보충한 Eagle의 최소기본배지(pH7.4)로서 세척한 다음 L-리신 20mM, 황산마그네슘 10mM 및 갑상선 자극호르몬 방출호르몬을 mι당 약 10ng을 첨가한 동일 배지에 세포농도 약 10⁶/mι가 되도록 부유시키고 37℃로 20시간 보관해서, hTSH를 생산시켰다.

그 생산량을 측정한 결과, 부유액 mι당 약 22mIU이었다. 또, 이 부유액에서는 HCG의 활성도 확인되었으며, 그 량은 부유액 mι당 약 430IU이었다.

대조용으로, hTSH생산능을 도입한 임파아구 JBL세포를 이용해서 실시예 1과 동일하게 시험관내에서 배양해서 hTSH를 생산시킨 결과, 부유액 mι당 약 8mIU이었다.

[실시예 3]

갓난 새끼쥐의 정맥내에 실시예 1의 방법에 준해서 인체종양성 호염기성세포로 부터의 hTSH생산능을 도입한 임파아구 BALL-1세포를 이식한 다음 통상적인 방법으로 4주간 사육하였다. 생겨난 거대한 종양 약 30g을 적출하여 실시예 1과 동일하게 세절, 분산시켜 처리해서 hTSH를 생산시켰다.

그 생산량은 부유액 mι당 약 160mIU이었다. 또, 이 부유액에서는 hFSH의 활성도 확인되었으며, 그 량은 부유액 mι당 약 900mIU이었다. 대조용으로, hTSH생산능을 도입한 임파아구 BALL-1세포를 시험관내에서 배양하고, hTSH를 실시예 1과 동일하게 생산시킨 결과 부유액 mι당 약 5mIU에 불과하였다.

[실시예 4]

성장한 보통 마우스에 약 400REM의 X선을 조사하여 마우스의 면역반응을 약화시킨 다음, 그 피하에 실시예 1의 방법에 따라서 인체색소혐성 선종세포로 부터의 hTSH생산능을 도입한 임파아구 NALL-1세포를 이식하고 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다.

피하에 생긴 거대한 종양 약 15g를 외출하여 실시예 2와 동일하게 처리해서 hTSH를 생산시켰다. 그 생산량은 부유액 mι단 약 210mIU이었다. 또 이 부유액에서는 HCG의 활성도 확인되었으며 그 생산량은 부유액mι당 약 480IU이었다. 대조용으로, hTSH생산능을 도입한 임파아구 NALL-1 세포를 시험관내에서 배양하고 hTSH를 실시예 2와 동일하게 생산시킨 결과 부유액 mι당 약 7mIU이었다.

[실시예 5]

공극직경 약 0.5μ의 멤브레인필터를 구비한 용적이 약 10mι인 프라스틱제 원통형 확산챔버내에 실시예 1의 방법에 준하여 인체종양성 호염기성세포로 부터의 hTSH생산능을 도입한 임파아구 TALL-1세포를 생리식염수로서 부유시키고 이것을 성장한 쥐의 복강내에 매설하였다. 이 쥐를 통상적인 방법으로 4주간 사육한 다음, 이 확산챔버를 분리하였다. 이같이 해서 수득한 TALL-1세포의 농도는 약 7×10⁸/mι로서, 시험관내에서의 탄산가스 배양기내에서 배양할 경우의 양 10²배 이상까지도 이른다는 사실을 알았다. 이 세포를 실시예 2와 동일해서 처리해서 hTSH를 생산시켰다.

이 생산량은 부유액 mι당 약 170IU이었다. 이 부유액에서는 HCG도 확인되었으며, 그 생산량은 부유액 mι당 약 720IU이었다.

대조용으로 인체종양성 호염기성세포를 동일하게 확산챔버 내에 수용하고 쥐복강내에 매설한 후 4주간 사육해서 세포농도 약 8×10⁶/mι를 얻었다.

이 세포를 사용해서 동일하게 hTSH를 생산시킨 결과 부유액 mι당 약 0.1mIU에 불과하였다.

[실시예 6]

37℃에서 5일간 보관한 닭의 수정난에 실시예 1의 방법에 준하여 인체 폐암세포로부터의 hTSH생산능을 도입한 임파아구 JBL세포를 이식한 다음 37℃에서 1주간 보관하였다.

이 수정난을 난할한 다음, 증식세포를 채취하고 실시예 1과 동일하게 처리해서 hTSH를 생산시켰다. 이 생산량은 부유액 mι당 약 140mIU이었다. 대조용으로, 인체 폐암세포를 동일하게 닭의 수정난에 이식하였으나 증식하는 것을 볼 수 없었다.

Claims (1)

1. 인체 갑상선 자극호르몬 생산능을 가지고 있는 인체유래의 임파아구세포를 인체 이외의 온혈동물에 이식하거나 또는 그 온혈동물의 체액을 공급받으면서 증식시킨 세포로부터 인체 갑상선 자극 호르몬을 생산시키는 것을 특징으로 하는 인체 갑상선 자극호르몬의 제조방법.