KR860001590B1 - 인체 캘시토닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

인체 캘시토닌의 제조방법

본 발명은 인체 캘시토닌(Human Calditonin, 이하 HCT라고 약칭함)의 제조방법에 관한 것이다.

HCT는 갑상선의 방로(旁瀘) 세포(Parafollicular cell)가 생산하는 호르몬으로서, 뼈에서 칼슘의 방출억제작용 및 인슐린 분비억제작용을 한다.

HCT를 대량으로 싼값에 제조하는 방법은 아직 알려져 있지 않다.

본 발명자는 HCT의 대량공급을 목적으로 예의 연구를 거듭하였던바 이외에도 HCT생산능이 들어있는 인체의 임파아구세포가 그 증식속도가 크고, 세포당 HCT생산량도 크므로 HCT생산세포로서 가장 적합하다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명자는 HCT생산능이 있는 인체의 임파아구세포를 인체 이외의 온혈동물체내에 이식하고 그 온혈동물의 체액의 공급을 받으면서 증식시킨 세포에서 HCT를 생산시키는 것을 특징으로 하는 HCT의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 시험관내에서 배양시키는 경우와 틀려서 HCT의 생산량이 클뿐 아니라 값비싼 혈청등을 함유하는 영양배양기를 불필요 또는 대폭적으로 절약할 수 있으며 나아가서 세포증식중의 유지관리도 극히 용이하다. 즉, HCT생산능이 있는 인체의 임파아구세포를 인체이외의 온혈동물체내에 이식하여 그 동물체액의 공급을 받을 수 있는 쳄버에 수용하고 통상적인 사육을 하면 온혈동물체에서 공급되는 영양물질을 함유하는 체액을 이용하여 그 세포를 용이하게 증식할 수 있다.

나아가서, 시험관내에서 배양시키는 경우와 비교하여 이 세포의 증식이 안정하다는 사실, 그 증식속도가 크다는 사실, 획득한 세포량이 크다는 사실, 나아가서 세포당 HCT생산량이 크다는 것이 특징이다.

본 발명에 사용하는 인체의 임파아구세포는 HCT생산능이 있어야 하고, 또한 인체 이외의 온혈동물의 체내에 이식하여 용이하게 증식하는 것이라면 선택할 수 있다.

예를 들면, 갑상선 방로세포 및 갑상선 선종세포 등과 같이 본래부터 HCT생산능을 갖고 있는 세포 및 카시노우이드세포, 폐암세포 등의 이소성 HCT산생능을 갖는 세포에서 HCT생산유전자를 폴리에티렌글리콜이나 센다이 비루스등을 이용하는 세포융합의 수단으로던가, DNA리가아제, 제한효소(뉴클레아제), DNA 폴리메라아제 등의 효소를 이용하는 유전자 재배열수단 등으로 도입한 인체의 임파아구세포 또는 이소성 HCT생산능을 갖는 인체의 임파아구세포등이 가장 적합하다.

이들 임파아구 세포의 이용은 인체 이외의 온혈동물에 이식할때, 그 숙주동물의 세포와 섞이기 어려운 연종혹을 형성하기 쉬우며 적출한 다음의 분산도 용이하므로 생활활동의 인체의 임파아구세포를 채취함에 있어 극히 유리하다.

본 발명에 있어서 HCT의 제조방법에 사용하는 온혈동물은 HCT생산능이 있는 인체의 임피아구세포를 증식할 수 있는 것이라면 채택할 수 있는 바, 예컨데 닭, 비둘기등의 조류, 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소, 말, 토끼, 몰모트, 쥐, 햄스터, 보통마우스, 누우드마우스 등의 포유류등을 사용할 수 있다.

이들 동물에 인체의 임파아구세포를 이식하면 좋지 않은 면역반응을 일으킬 염려가 있으므로 그 반응를 가급적 억제하기 위하여 사용하는 동물은 될 수 있으면 유약한 상태의 것, 즉 알, 배, 태, 신생기 및 유소기의 것일수록 좋다.

또, 이들 동물에 예컨데 약 200 내지 600REM의 X선 또는 γ선을 조사하던가 또한 항혈청 그렇지 않으면 면 역억제약품 등을 주사하는 등의 사전처치를 하여서 면역반응을 약화시켜서 이식하여도 좋다.

사용하는 동물이 누우드마우스일 경우에는 성장한 것이라 하더라도 면역반응이 약하므로 이들 사전처리를 하지 않아도 배양주로 된 인체의 임파아구세포를 이식할 수 있으며 급속도로 증식하므로 특히 그 절차가 간단하다.

또, 인체의 임파아구 세포를 예컨데 우선 햄스터에 이식하고 증식시킨다음, 이 세포를 다시금 누우드 마우스에 이식하는 등과 같이 인체 이외의 온혈동물 사이에서 이식하여 인체의 임차아구세포의 증식을 보다 안정되게 하기도 하고 나아가서 그로부터 생산되는 HCT량을 증식시키는 것도 임의대로 할 수 있다.

이런 경우 같은 종간, 같은 속간은 물론이고 같은 강간, 같은 문간의 이식이라도 좋다. 인체의 임파아구세포를 이식하는 동물체내의 부위는 이식한 세포가 증식할 수 있는 부위라면 무방한 것으로, 예를들면 뇨액강, 정맥, 복강, 피하등 자유로히 선택할 수 있다.

또, 직접 동물체내에 인체의 임파아구세포를 이식함이 없이 동물세포의 통과를 저지할 수 있는 다공성의 여과막, 예컨데 구멍의 지름 약 10^－7내지 10^－5m인 박막거르게, 한의여과막 또는 유공섬유등을 마련한 널리 알려진 각종 형상, 대형의 확산챔버를 동물체내, 예컨데 복강내에 매설하여 동물체로부터의 영양물질을 함유하는 체액의 공급을 받으면서 그 챔버내에서 배양주화 된 인체의 임파아구세포를 증식시킬 수 있다.

또, 필요에 따라 이 확산 챔버내의 영양물질을 함유하는 체액을 동물체내의 체액과 접속하여서 유입하도록한 확산챔버를 예컨데 동물체 표면에 부착하여 확산챔버내의 인체의 임파아구세포의 증식상태를 투시할 수 있도록 하거나 또 이확산챔버부분만을 착탈 교환할 수 있도록 하여 동물을 도살하지 않고도 수명이 다할때까지 세포를 증식시켜서 동물개체당의 세포생산량을 더욱 재고할 수도 있다.

이들 확산챔버를 이용하는 방법은 인체의 임파아구세포는 동물의 세포와 직접 접촉하지 않으므로 인체의 임파아구세포만을 용이하게 채취할 수 있을 뿐 아니라 좋지 않은 면역반응을 일으킬 염려도 적으므로 면역반응을 억제하는 사전처리를 할 필요도 없으며 각종 온혈동물을 자유로히 이용할 수 있는 특징을 가지고 있다.

이식한 동물의 유지관리는 그 동물의 통상적인 사육을 지속하면 되는 것으로 이식한 다음이라 하더라도 특별한 취급은 하등 필요로 하지 않는다.

인체의 임파아구세포를 증식시키기 위한 기간은 1-20주이나 통상 1-5주이다.

이와같이 하여 획득하여 인체의 임파아구세포수는 동물개체당 약 10⁷-10¹²개, 또는 그 이상에 이른다는 사실도 발견하였다.

바꾸어 말하면, 본 발명에서 사용하는 HCT의 제조방법에 따라 증식시킨 인체의 임파아구세포수는 동물개체당 이식한 세포수의 약 10²내지 10⁷개, 또는 그 이상에도 이르며 생체 이외의 영양배지에 접종하여 증식시키는 경우의 약 10¹내지 10⁶배, 또는 그 이상에도 이르므로 HCT의 제조를 위하여는 극히 좋은 조건이다.

이와같이하여 증식시킨 인체의 임파아구세포에서 HCT를 산생시키는 방법은 선택적으로 할 수 있다.

예컨데, 복강내의 복수에 부유상으로 증식한 인체의 임파아구세포를 채취하고 또는 피하에서 증식한 종혹을 적출하여 분산시킨 다음 채취하여 이 세포를 약 20 내지 40℃로 보존한 영양배지에 세포농도를 약 10⁴내지 10⁸/㎖가 되도록 부유시켜 약 1내지 100시간 보존하여 생산시키면 좋다.

이때 생산량을 보다 재고하기 위하여 예를 들면 글리신, 류우신, 리신, 아르기닌 및 시스테인 등의 아미노산 ; 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 황산마그네슘 등의 무기염류 ; 와 디부틸사이클 AMP 및 프로스타글라딘 E와 같은 호르몬 등의 1종 또는 2종 이상의 물질을 공존시키는 것도 좋은 조건이다.

이와같이하여 생산한 HCT는 널리 알려진 정제분리법, 즉 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축, 동결건조등을 실시함으로써 용이하게 정제분리하여 채취할 수 있다. 나아가서, 고도의 정제를 필요로 할 경우에는 예컨데 이온교환체의 흡착, 탈착, 겔여과, 아피니티크로마토그라피, 등전점분별, 전기영동 등의 널리 알려진 방법을 새로히 조합하면 최고순도의 HCT를 채취하는 것도 가능하다.

이와같이 하여 획득한 HCT는 단일물질로서 또는 이에 그밖의 1종 또는 2종 이상의 물질을 함유시켜, 예컨데 주사약, 외용약, 내복약, 진단약 등으로 하여서 인체질환의 예방 및 치료에 유리하게 이용할 수 있다.

HCT의 생산량은 N.A. Samaan등 J. Lad. Clin. Med., Vol. 81, 671-681(1973)에 보고되어 있는 방사면역 분석시험법에 준하여 측정하고 WHO에서 입수한 국제표준품(International refereme Preparation of calcitonin)의 중량으로 표시한다. 2-3의 실시예를 상술하면 다음과 같다.

[실시예 1]

갑상선 선종의 환자로부터 적출, 세절, 분산시켜서 얻은 인체 갑상선 선종세포와 임파아구 나말바세포 (Namalwa cell)를 140mM NaCl,54mM KCl, 1mM NaH₂PO₄, 2mM CaCl₂를 함유하는 염류용액에 각각 약 10⁴/ml가 되도록 부유시켜 이에 미리 자외선으로 불활성화시킨 센다이비루스를 함유하는 전기한 염류용액을 빙점 이하에 조건으로 혼합하고 약 5분후에 37℃의 항온수조에 옮겨서 30분간 교반하면서 세포융합을 일으킨 다음 임파아구 나말바세포에 HPT생산능을 도입하였다.

이 임파아구 나말바세포를 성장한 누우드마우스의 복강내에 이식한 다음 통상적인 방법으로 5주간 사육하였다. 생겨난 종혹 약 15g을 적출하여 세절한 다음 트립신을 함유하는 생리적 식염수에 현탁하여 세포를 분산시켰다.

이 세포를 소의 태아혈청 10v/v%를 보충한 Earle 배지 199(pH7.2)로 세정한 다음 20mM CaCl₂, 30mM L-아르기닌을 작용시킨 같은 배지에 세포농도 약 10⁵/ml가 되도록 부유시켜 37℃에서 40시간 보존하여 HCT를 생산시켰다. 그후 세포를 초음파 처리하여 획득하는 혈청 상층부를 이용하여 HCT의 생산량을 측정하였던바 부유액 ml당 4.4㎍이었다.

이와 대조하기 위하여 인체 갑상선 선종세포를 소의 태아혈청 10v/v%를 보충한 Earle배지 199(pH7.2)에 37℃의 시험관내에서 배양하여 획득하는 세포를 이용하여 마찬가지 방법으로 처리하여 HCT를 생산시켰던바 부유액 ml당 10ng이었다.

[실시예 2]

기관지 카아시노이드 환자로 부터 적출, 세절, 분산시켜서 획득한 인체 기관지 카아시노이드 세포와 임파아구세포 HCT를 실시예 1의 방법에 준하여 세포융합을 시켜 임파아구 JBL세포에 HCT생산능력을 도입하였다.

이 세포를 토끼로 부터 널리 알려진 방법으로 조제한 항혈청을 미리 주사하여 면역반응을 약화시킨 갓난새끼 햄스터의 피하에 이삭하고 난 다음 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다.

피하에 생긴 종혹 약 10g을 적출하여 세절한 다음 콜라게나아제를 함유하는 생리적 식염수에 현탁하여 세포를 분산시켰다.

이 세포를 인체혈청 5v/v%를 보충한 Eagle의 최소기본배지(pH 7.4)로 세정한 다음, 10mM CaCl₂, 40mM MgSO₄, 0.1mM디부틸사이클리크 AMP를 작용시킨 같은 배지에 세포농도 약 10⁶/ml가 되도록 부유시키고 37℃에서 30시간 보존하여 HCT를 생산시켰다.

그 생산량을 측정하였던바 부유액 ml당 약 3.7μg이었다.

이와 대조하기 위하여 HCT생산능을 도입한 임파아구 JBL세포를 이용하여 실시예1과 마찬가지로 시험관 내에서 배양하고 HCT를 생산시켰던바 부유액 ml당 60ng이었다.

[실시예 3]

갓난 새끼쥐의 정맥내에 실시예 1의 방법에 준하여 인체 갑상선 선종세포에서 HCT생산능을 도입한 임파아구 BALL-1세포를 이식한 다음 통상적인 방법으로 4주간 사육하였다.

생겨난 종혹 약 30g을 적출하고 실시예 1과 마찬가지로 처리하여 HCT를 생산시켰다.

그 생산량은 부유액 ml당 약 4.1μg이었다. 이와 대조하기 위하여 HCT생산능을 도입한 임파아구 BALL-1세포를 시험관내에서 배양하고 HCT를 실시예 1과 마찬가지로 생산시켰던바 부유액 ml당 85ng이었다.

[실시예 4]

성장한 보통 마우스에 약 400REM의 X선을 조사하여 마우스의 면역반응을 약화시킨 다음, 그 피하에 실시예 2의 방법에 준하여 인체 폐암세포에서 HCT생산능을 도입한 임파아구 NALL-1세포를 이식하고 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다.

피하에 생긴 종혹 약 15g을 적출하여 실시예 2와 마찬가지로 처리하여 HCT를 생산시켰다. 그 생산량은 부유액 ml당 약 5.2μg이었다.

이와 대조하기 위하여 HCT생산능을 도입한 임파아구 NALL-1세포를 시험관내에서 배양하고 HCT를 실시예 2와 마찬가지로 생산시켰던 바 부유액 ml당 약 90ng에 불과하였다.

[실시예 5]

구멍의 지름이 약 0.5μ인 박막거르개를 마련한 용적 약 10ml의 플라스틱제 원통형 확산챔버내에 실시예 1의 방법에 준하여 인체 갑상선 선종세포에서 HCT생산능을 도입한 임파아구 TALL-1세포를 생리적 식염수로 부유시키고 이것을 성장한 쥐의 복강내에 매설하였다.

이 쥐를 통상적인 방법으로 4주간 사육한 다음, 이 확산챔버를 들어내었다. 이에 의하여 획득한 TALL-1세포의 농도는 약 7×10⁸/ml였으며, 시험관내에서의 탄산가스 항온수조 속에서 배양하였을 경우의 약 10²배 이상까지도 이른다는 사실을 알게되었다. 이 세포를 실시예2와 마찬가지로 처리하여 HCT를 생산시켰다.

그 생산량은 부유액 ml당 약 3.1μg이었다. 이와 대조하기 위하여 기관지 카아시노이드 세포를 마찬가지로 확산챔버내에 수용하고 쥐의 복강내에 매설하여 마찬가지로 4주간 사육하여 세포농도 약 6×10⁶/ml을 얻었다.

이 세포를 이용하여 실시예2와 마찬가지로 HCT를 생산시켰던바 부유액 ml당 약 15ng에 불과하였다.

[실시예 6]

37℃에서 5일간 보존한 닭의 수정난에 실시예 1의 방법에 준하여 인체 기관지 카아시노이드 세포에서 HCT생산능을 도입한 임파아구 JBL세포를 이식한 다음 37℃에서 1주간 보존하였다.

이 알을 난할한 다음 증식세포를 채취하여 실시예 1과 마찬가지로 처리하여 HCT를 생산시켰다. 그 생산량을 부유액 ml당 2.6μg이었다.

이와 대조하기 위하여 인체 기관지 카아시노이드 세포를 마찬가지로 닭의 수정난에 이식하였으나 증식하는 것을 발견할 수 없었다.

Claims (1)

1. 인체 캘시토닌 생산능이 있는 인체의 임파아구 세포를 인체이외의 온혈동물에 이식하거나 또는 그 온혈동물의 체액의 공급을 받으면서 증식시킨 세포에서 인체 캘시토닌을 생산시키는 것을 특징으로 하는 인체 캘시토닌의 제조방법.