KR860001591B1 - 인체 부신피질 자극호르몬의 제법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

인체 부신피질 자극호르몬의 제법

본 발명은 인체부신피질 자극호르몬(human Adrenocorticotropic Hormone, 이하 hACTH로 약칭한다)의 제법에 관한 것이다.

hACTH는, 인체 뇌하수체 전엽세포가 생산하는 호르몬으로서 스테로이드 호르몬의 생산을 촉진하며 인슐린의 분비를 촉진하는 작용을 한다.

본 발명자는, hACTH의 대량공급을 목적으로 예의 연구를 계속하였던바 의외에도 hACT의 생산농이 있는 인체유래의 임파아구세포가 그 증식속도가 크고 세포당 hACTH 생산량도 크므로 hACTH 생산세포로서 가장 적당하다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성히였다.

즉, 본 발명은 hACTH생산능이 있는 인체유래의 임파아구세포를 인체 이외의 온혈동물체내에 이식하거나 또는 그 온혈동물의 체액을 공급받으면서 증식시킨 세포로 부터 hACTH를 생산시키는 것을 특징으로 하는 hACTH의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 시험관내에서 배양시킨 경우와는 달라서 hACTH 생산량이 많을뿐만 아니라 값비싼 혈청등을 함유하는 영양배지가 필요없거나 또는 크게 절약할 수 있으며, 이밖에 세포등식 중에 있어서의 유지관리도 극히 용이하다.

즉, hACTH생산능이 있는 인체유래의 임파아구세포를 인체 이외의 온혈동물체내에 이식하거나 또는 그 동물체액을 공급받을 수 있는 챔버에 수용하고 통상적인 사육을 행하면, 온혈동물체내로부터 공급되는 영양물질을 함유하는 체액을 이용하여 그 세포를 용이하게 증식시킬 수 있다. 또한 시험관내에서 배양시키는 경우와 비교하여 이 세포의 증식이 안정되어 있는점, 그 증식속도가 큰점, 수득한 세포량이 많은점, 이밖에도 세포당 hACTH 생산량이 큰 점등을 그 특징으로 들 수 있다.

본 발명에서 사용하는 인체유래의 임파아구세포는 hACTH 생산능이 있고 또 인체 이외의 온혈동물체내에 이식하여 용이하게 증식시킬 수 있는 것이면 좋다.

예를들면, 뇌하수체 전엽세포, 뇌하수체 종양세포, 뇌하수체 색소혐성(色素嫌性) 신종세포 등 본래부터 hACTH 생산능이 있는 세포와 췌장속의 란겔핸스섬 암세포, 폐암 세포등의 비정상적인 생식지에 hACTH생산능이 있는 세포로 부터의 hACTH 생산유전자를 폴리에티렌글리콜 또는 센다이 비루수등을 이용하는 세포융합수단이나 DNA리가아제, 제한효소(뉴클레아제), DNA폴리머라제등의 효소를 이용하는 유전자 재조합 수단등에 의해 도입시킨 인체유래의 임파아구세포 또는 비정상적인 생식지(生殖地)에서 hACTH 생산능이 있는 인체유래의 임파아구세포등이 바람직하다.

이들 임파아구세포의 이용은 인체 이외의 온혈동물에 이식할 경우 그 숙주동물의 세포와 섞이기 어려운 연질종양을 형성하기 쉽고 적출한 다음의 분산도 용이하므로 살아있는 인체 임파아구세포를 체취하는데 매우 유리하다.

본 발명에서 hACTH 제조방법에 사용하는 온혈동물은 hACTH 생산능이 있는 인체유래의 임파아구 세포를 증식할 수 있는 것이면 어느것이나 좋은바 예컨데, 닭, 비둘기, 등의 조류, 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소, 말, 토끼, 물모트, 쥐, 햄스터, 보통마우스, 누우드마우스등의 포유류등을 사용할 수 있다.

이들 동물에 인체유래의 임파아구세포를 이식하면 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 염려가 있기 때문에, 그 반응을 가능한 한 억제하기 위하여 사용하는 동물은 될수 있는대로 어린상태, 즉, 란(卵),배(胚), 태아, 신생기, 유소기(幼少期)의 동물을 사용하는 것이 바람직하다.

또 이들 동물에 예컨데 약 200 내지 600REM의 X선 혹은 γ선을 조사하던가 또는 항혈청 혹은 면역억제제등을 주사하는 등의 사전처리를 행해서 면역반응을 약화시킨후 이식하여도 좋다.

사용하는 동물이 누우드마우스일 경우에는 성장한 것이라 하더라도 면역반응이 약하므로 이같은 사전처리를 하지 않고도 배양주화된 인체유래의 임파아구세포를 이식할 수 있으며 신속하게 증식하므로 아주 바람직하다.

또 인체유래의 임파아구세포를 예컨대 우선 햄스터에 이식하고 증식시킨 다음 이 세포를 다시 누우드마우스에 이식하는 등과 같이, 인체 이외의 온혈동물간의 이식으로 인체유래의 임파아구세포의 증식을 보다 안정하게 하고, 나아가서 이로 부터 생산되는 hACTA량을 증가시키는 것도 임의대로 행할 수 있다. 이 경우 동종간(同種間), 동속간(同屬間)물론이고, 동강간(同綱間), 동문간(同門間) 이식을 행하더라도 상관없다.

인체유래의 임파아구세포를 이식하는 동물체내의 부위는 이식한 세포가 증식할 수 있는 부위라면 어디라도 상관없으며, 예컨데 뇨액강, 정맥, 복강(腹腔), 피하등 임의로 선택할 수 있다.

또 직접 동물체내에 인체유래의 임파아구세포를 이식하지 않고 동물세포의 통과를 저지할 수 있는 다공성여과막 예컨데, 공극직경이 약 10^－7내중 10^－5인 멤브레인필터, 한의여과막 또는 중공(中空) 섬유등을 구비한 공지된 각종 형상, 크기의 확산챔버를 동물체내 예를들어, 복강내에 매설하여 동물체로부터 영양물을 함유하는 체액의 공급을 받으면서, 그 챔버내에서 배양주화시킨 인체유래의 임파아구세포를 증식시킬 수 있다.

또 필요에 따라서는, 이 확산챔버내에서 영양물을 함유하는 체액을 동물체내의 체액과 접속시켜서 관류된도록 한 확산챔버를 예컨데 동물체 표면에 부착하고 확산챔버내의 인체유래의 임파아구세포의 증식상태를 투시할 수 있도록 한다거나 또 이 확산챔버 부분만을붙였다 떼었다 교환할 수 있도록 하여서 동물을 도살하지 않고도 수명이 미치는데까지 세포를 증식시켜서 동물개체당의 세포생산량을 보다 높여줄 수도 있다.

이같은 확산챔버를 이용하는 벙법은 인체유래의 임파아구 세포가 동물세포와 직접 접촉하지 않기 때문에 인체유래의 임파아구세포만을 용이하게 채취힐 수 있을 뿐 아니라, 바람직하지 않은 면역바능을 일으킬 염려도 적기 때문에 면역반응을 억제하는 사전처치를 할 필요도 없고 각종 온혈동물을 임의대로 이용할 수 있는 특징을 가지고 있다. 이식한 동물의 유지관리는 그 동물을 통상적인 방법으로 사육을 계속할 수 있으면 되는 것으로, 이식후라 하더라도 별도의 특별한 취급을 필요로 하는 것이 아니므로 바람직하다.

인체유래의 임파아구세포를 증식시키는 기간은 통상은 1내지 20주이다. 이같이 해서 수득되는 인체유래의 임파아구 세포수는 동물개체당 약 10⁷내지 10¹², 또는 그 이상에 이른다는 사실도 발견하였다.

바꾸어 말하면, 본 발명에서 사용하는 hACTH의 제조방법에 따라 증식시킨 인체유래의 임파아구세포수는 동물개체당 이식한 세포수의 약 10²내지 10⁷배 또는 그 이상에 이르게 되며 시험관에서 영양배지에 접종해서 증식시켰을 경우의 약 10¹내지 10⁶배, 또는 그 이상에 이르게 되어 hACTH제조를 위해서 매우 바람직하다.

이같이 하여 증식시킨 인체유래의 임파아구세포에 hACTH유도제를 작동시켜서 hACTH를 생산시키는 방법은 임의대로 행할 수 있다. 예컨대, 복강내의 복수(腹水)에 부유상으로 증식한 인체유래의 임파아구세포를 채취하고 또 피하에서 증식시킨 거대한 종양을 적출해서 분산시킨 다음 채취하여 이 세포를 약 20내지 40℃로 유지한 영양배지에 세포농도가 약 10⁴내지 10⁸/mι로 되도록 부유시키고 여기에 hACTH유도제를 약 1내지 50시간 작용시켜 줌으로서 hACTH을 유도 생성하게 하는 것이다. hACTH유도제로서는 hACTH의 생산을 촉진하는 물질이라면 어느것이든지 사용 가능하고, 예컨데, 베소프레신(항이뇨호르몬), 아트로핀, 인슐린, 글루카곤, 세균성내독소, 세로토닌, 프로프라노를 등을 사용하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명에 의하여 hACTH의 생산과 동시에 다량의 색소포자극호르몬(human Melanocyte­stimulating Hormon, 이하 hMSH라고 약칭함) 및, 또는 인체 리포트로핀(human Lapotropic Hormone, 이하 hLPH라고 약칭함)이 생산된다는 것을 발견하였다.

이같이 해서 유도 생성된 hACTH, hMSH 및 hLPH는 공지된 정제분리법 예컨대, 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축, 동결건조 등을 행하여 용이하게 정제분리하여 채취할 수 있다. 이밖에, 고도의 정제를 필요로할 경우에는 예를들면, 이온교환체에의 흡착 및 탈착, 겔여과, 친화성 크로마토그래피등, 등전점분획 또는 전기영동등의 공지 방법을 다시 조합하여 실시하므로서 최고순도의 hACTH채취가 가능하다.

이같이 해서 수득된 hACTH는 단일물질로서 또는 여기에 그밖의 1종 또는 2종 이상의 물질을 함유시켜 예컨대, 주사약, 외용약, 내복약, 진단약등으로 인체의 질환, 즉, 뇌하수체전엽기능저하증 등의 예방 및 치료에 효과적으로 이용할 수 있다. hACTH의 생산량은 S. Matsukura 등 J. Lab. Clin. Med., Vol. 77. 490내지 500(1971)에 기재되어 있는 방사면역 분석시험법에 준하여 측정하여, hACTH의 중량으로 표시하였다.

hMAS 및 hLPH의 생산량은 K. Abe 등, J. Clin. invest. Vol. 46. 1906내지 1916(1967)에 기재되어 있는 방사면역 분석시험법에 준하여 인체 β-MSH 및 인체 β-LPH를 이용하여 양 호르몬의 총량을 측정하고, 이어 겔여과분획법에 따라 수득된 인체 β-MSH 및 인체 β-LPH의 중량비로서 산출하였다. 2-3의 실시예를 기술하면 다음과 같다.

[실시예 1]

폐암환자로 부터 적출, 세절, 분산시켜서 얻은 인체폐암 세포와 임파아구 나말바세포(Namalva Call)를 140mM NaCl, 54mM KCl, 1mM NaH₂PO₄, 2mM CaCl₂를 함유하는 염류용액에 각각 약 10⁴/mι가 된도록 플라스크중에서 부유시키고 여기에 사전에 자외선으로 비활성화시킨 센다이 비루스를 함유하는 전술한 염류 용액을 얼음냉각하에서 혼합한 다음 약 5분후에 37℃의 항온수조로 옮기고 약30분간 교반하면서 세포융합을 일으켜 임파아구 나말바세포에 hACTH생산능을 도입하였다.

이 임파아구 나말바세포를 성장한 누우드마우스의 복강내에 이식한 다음 통상의 방법으로 5주간 사육하였다. 피하에 생겨난 거대한 종양 약 15g을 적출하여 세절한 다음 트립신을 함유하는 생리식염수에 혼탁하여서 세포를 분산시켰다.

이 세포를 소태아의 혈청 10v/v%를 보충한 Earle배지 199(pH 7.2)로 세척한 다음, mι당글루카곤 0.1㎍을 혼합시킨 동일배지에 세포농도 약 10⁶/mι가 되도록 부유시키고 35℃로 20시간 보관해서 hACTH를 생산시켰다. 그후, 세포를 초음파 처리해서 수득한 상등액을 이용해서 hACTH, hMSH 및 hLPH의 생산량을 측정한바 부유액 mι당 각각 250㎍, 580㎍, 40㎍이었다.

대조용으로 인체폐암세포를 누우드마우스에 직접 이식한 다음 통상적인 방법으로 5주간 사육하고 피하에 생겨난 거대한 종양 약 5g을 적출하고 세절, 분산시켜서 수득한 세포를 사용해서 동일방법에 따라 hACTH를 유도생성시킨 다음, hACTH, hMSH 및 hLPH의 생산량을 측정한 결과, 부유액 mι당 각각 600ng, 1.2㎍ 및 350ng이었다.

[실시예 2]

뇌하수체 색소혐성세포 선종환자로 부터 적출, 세절, 분산시켜서 획득한 인체색소혐성 선종세포와 임파아구 JBL세포를 실시예 1의 방법에 따라 세포융합을 시켜서 임파아구 JBL 세포에 hACTH 생산능을 도입하였다. 이 세포를 토끼로부터 공지 방법에 따라 조제한 항혈청을 미리 주사해서 면역반응을 약화시킨 갓 태어난 햄스터의 피하에 이식한 다음 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다.

피하에 생겨난 거대한 종양 약 10g을 적출하여 세절한 다음 콜라게나아제를 함유하는 생리식염수에 현탁시켜서 세포를 분산시켰다. 이 세포를 인체혈청 5v/v%를 보충한 Earle의 최소기본배지(pH 7.2)로 세척한다음 mι당 항이뇨호르몬 3μU를 첨가시킨 동일배지에 세포농도 약 10⁵/mι가 되도록 부유시키고, 37℃로 15시간 보관해서 hACTH를 생산시켰다.

이어 실시예 1과 동일하게 호르몬 생산량을 측정한 결과 hACTH, hMSH 및 hLPH는 부유액 mι당 각각 380㎍, 740㎍, 510㎍이었다.

대조용으로, 색소혐성 선종세포를 햄스터에 이식한 다음 3주간 사육하고 피하에 생겨난 거대한 종양 약 3g을 적출해서 세절, 분산시켜 수득된 세포를 사용해서 동일한 방법에 따라 hACTH를 생산시킨 다음 호르몬 생산량을 측정한 결과 hACTH, hMSH 및 hLPH는 부유액당 각각 750ng, 560ng, 및 430ng이었다.

[실시예 3]

새끼쥐의 정맥내에 실시예 1의 방법에 따라 hACTH 생산능을 도입한 임파아구 BALL-1세포를 이식한 다음 통상적인 방법으로 4주간 사육하였다. 생겨난 거대한 종양 약 30g을 적출하여 세절하고 분산시켰다.

이세포를 송아지 혈청 10v/v%를 보충한 RPMI 배지(pH 7.4)에서 세척한 다음 세로토닌 6mM을 첨가시킨 동일배지에 세포농도 약 10⁷/mι가 되도록 부유시키고 30℃로 40시간 보관해서 hACTH를 생산시켰다.

이어, 호르몬 생산량을 측정하였던바 hACTH 및 hMSH는 부유액 mι당 각각 730㎍ 및 940㎍이었다. 대조용으로 폐암세포를 쥐에 이식한 다음 4주간 사육하고 생겨난 거대한 종양 약 5g을 적출한후 세절 또는 분산시켜서 수득한 세포를 사용하여 동일한 방법을 따라 hACTH를 생산시켰다. 이어 동일한 방법으로 호르몬 생산량을 측정하였던바 hACTH 및 hMSH는 부유액 mι당 각각 650ng 및 1.8㎍이었다.

[실시예 4]

성장한 보통마우스에 약 400REM의 X선을 조사하여 마우스의 면역반응을 약화시킨 다음, 그 피하에 실시예 2의 방법에 따라 hACTH생산능을 도입한 임파아구 NALL-1세포를 이식하고 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다. 피하에 생겨난 거대한 종양 약 15g을 적출하고 분산시켜서 수득된 세포를 실시예 2와 동일한 방법으로 처리해서 hACTH를 생산시켰다. 이어, 호르몬 생산량을 측정한 결과, hACTH 및 hLPH는 부유액 mι당 각각 480㎍ 및 350㎍이었다.

대조용으로 인체색소혐성 선종세포를 마우스에 이식한 다음, 3주간 사육해서 생겨난 거대한 종양 약 5g을 적출하고 세절, 분산시켜서 얻은 세포를 사용해서 동일한 방법에 따라 hACTH를 생산시켰다. 이어, 호르몬 생산능을 측정한 결과, hACTH 및 hLPH는 부유액 mι당 각각 520ng 및 790ng이었다.

[실시예 5]

공극직경 약 0.5마이크론의 멤브레인 필터를 구비한 내용량 약 10mι의 프라스틱제 원통형 확산챔버 내에 실시예 1의 방법에 따라 hACTH 생산능을 도입한 임파아구 TALL-1 세포를 생리식염수에 부유시키고 이것을 성장한 쥐의 복강내에 매설하였다.

이 쥐를 통상작인 방법으로 4주간 사육한 다음 이 확산챔버를 들어내었다. 이같이 해서 수득된 TALL-1세포의 농도는 약 7×10⁸/mι로서 시험관내에서의 탄산가스배양기에서 배양하는 경우의 약 10²배 이상까지 이르게 된다는 사실을 알게 되었다. 이 세포를 실시예 3과 동일하게 처리해서 hACTH를 생산시켰다. 이어 호르몬 생산량을 측정한 결과, hACTH, hMSH 및 hLPH는 부유액 mι당 각각 280㎍, 770㎍ 및 160㎍이었다.

대조용으로 인체폐암세포를 동일한 방법에 따라 확산챔버내에 수용하고 쥐의 복강내에 매설해서 마찬가지 방법으로 4주간 사육한 다음 세포농도 약 10⁷/mι를 얻었다. 이 세포를 사용하여 동일한 방법에 따라 hACTH 생산시키고 호르몬 생산량을 측정한 결과 hACTH, hMSH 및 hLPH는 480ng, 2.3㎍ 및 250ng이었다.

[실시예 6]

37℃에서 5일간 보관한 닭의 수정난에 실시예 1의 방법에 따라 인체폐암세포로 부터 hACTH 생산능을 도입한 임파아구 JBL세포를 이식한 다음 37℃에서 1주간 보관하였다.

이 알을 난할한 다음 증식세포를 채취하고 실시예 2와 동일한 방법에 따라 처리해서 hACTH를 생산시켰다. 그 생산량은 부유액 mι당 520㎍이었다.

대조용으로 인체폐암세포를 동일한 방법으로 닭의 수정난이 이식하였으나 증식하는 것을 발견할 수 없었다.

Claims (2)

1. 인체 부신피질 자극호르몬의 생산능이 있는 인체유래의 임파아구세포를 인체 이외의 온혈동물에 이식하거나 또는 그 온혈동물의 영양체액의 공급을 받으면서 증식시킨 세포로부터 인체 부신피질 자극호르몬을 생산시키는 것을 특징으로 하는 인체 부신피질 자극호르몬의 제법.
2. 인체 부신피질 자극호르몬의 생산능이 있는 인체유래의 임파아구세포를 인체 이외의 온혈동물에 이식하거나 또는 그 온혈동물의 영양채액의 공급을 받으면서 증식시킨 세포로부터 인체부신피질 자극호르몬과 함께 색소포자극 호르몬 또는 인체 리포트로핀을 동시에 생산시키는 것을 특징으로 하는 인체 부신피질 자극호르몬 함유 복합호르몬의 제법.