JPS63502795A - 顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子‐様ポリペプチド、ｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子並びに微生物細胞中でヒト顆粒球−マクロファ−ジコロニ−刺激因子−様ポリペプチドを高収量で生産する方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子一様ポリペプチド、ＤＮＡ配列、組換 えＤＮＡ分子並びに微生物細胞中でヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因 子一様ポリペプチドを高収量で生産する方法 日　の　技 本発明は、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子一様ポリペプチド（ｈ ＧＭ−ＣＳＦ）、ＤＮＡ配列、組換である。更に特に、本発明は、高い特別の活 性を有するＤＮＡ分子並びにｈＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドを微生物細胞中に て高収率で生産可能にする方法に関するものである。 Ｂ　の　青　息 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子一様ポリペプチド（ｈＧＭ−ＣＳＦ） はコロニー刺激因子（“ＣＳＦ’　ｓ”）として知られている造血性発育因子の ４つのクラスの１つである。ＧＭ−ＣＳＰは多ポテンシャル細胞の増殖と分化を 制御する生長因子である［Ｅ、Ｒ，スタンレイ及びＰ、Ｔ、ユビンスキイー、“ 培養液中の造血細胞の発育と分化に影響する因子°クリニカル　ヘマトロジー、 第１３巻、第３２９〜４８頁（１９８４）］。ＧＭ−ＣＳＦは試験管内で単一骨 髄細胞から好球性顆粒球と単核食細胞の生成を刺激することも示されている［Ａ 、Ｗ、プルゲス等、“マウス肺−条件付けした培地からのコロニー刺激因子の精 製明のＧＭ−ＣＳＦは放射線照射又は化学療法の後に白血球の回復に有用である べきである。これらは更に白血球を活性化して細菌、真菌及び寄生体による病気 と戦いかつ白血病細胞の成熟を促進しこれにより白血病細胞の再生を停止させる べきである。 マウスＧＭＣＳＦ（またマウスＣ５Ｆ−２として知られている）、サブユニット を含有しない２４−２６．０００分子量の糖蛋白で、これは内毒素注射したマウ ス肺−条件付は培地から精製された［Ａ、Ｗ、プルゲス、Ｌａ：Ｎ、Ａ。 ニコラ等、ジャーナル、ビオロジカル、ケミストリ、第２５４巻、第５２９０〜 ９９頁（１９７９）］。赤血球系の、好酸性の、及び巨核細胞のコロニー又は適 切な培養条件におけるＴ−及びＢ−リンパ球のコロニーの生成を刺激することは 出来ず、この生成は造血性細胞の増殖効果に高度の選択性を伴う［Ａ、Ｗ、プル ゲス及びり、メトカルフ、“顆粒球−マクロファージ　コロニー刺激因子の特質 と作用“２ｊ−１九ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は公知でかつ低収率で動物細胞 中に発現されている［Ｎ、Ｍ、ゴウフ等、“ネズミ造血性発育調節体、顆粒球− マクロファージコロニー刺激因子をコード化するｃＤＮＡの分子クローンニング 、“ネイチャ、第３０９巻、第７６３〜６７頁（１９８４）；Ｎ、Ｍ、ゴウフ等 、“ネズミ顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子に対するｍ　ＲＮ　Ａの構 造と発現”　、ＢＭＢＯジャーナル、２−■、第６４５〜５３頁（１９８５）） 。 ヒトＧＭ−ＣＳＦもまた糖蛋白（２４〜２６．０００ダルトン）である。これは クローン化されかつそのｃＤＮＡ配列は報告される［Ｇ、Ｇ、ウォング等、“ヒ トＧＭ−ＣＳＦ：相補ＤＮＡの分子クローンニングと自然かっ組換型蛋白の精製 ”サイエンス、ＬＬＬＬＬ、第８１０〜１５頁（１９８５））。動物細胞が合成 グリコジル晶化されたｃＤＮＡ配列で１　ｕ　ｇ　／　ｍ　１程度に組換えられ た

【ウイエスバルト等、“ヒト顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子ハ好 中球活性化因子である°ネイチャー、第３１４巻、第３６１〜６３頁（１９８５ ）：　ウオング、組】。従って、これら動物細胞は生物学的並びに臨床的使用に 対し充分な量でかつ必要な純度でヒトＧＭ−ＣＳＦを生産することが出来なかっ た。 日　の　約 本発明は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を付与す ることによりかっこの配列を高収率で適切な微生物宿半に発現して顆粒球とマク ロファージコロニー−刺激活性を発揮するポリペプチドを効率的かつ経済的に多 量に生産することにより上述に関する問題を解決するものである。本発明による と、ｈＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列のアミノ（５°）末端を修飾するこ とが出来、これにより微生物宿主中に高収率でｈＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチド を生産することが出来る。本発明により、臨床的使用に対し充分多量にＧＭ−Ｃ ＳＦ活性を発揮するポリペプチドを得ることを初めて可能にするものである。 更に、本発明は、予期に反して少なくともＩ　Ｘ　１０”単位／　ｍ　ｇの特定 な活性を有する非グリコジル晶化ｈＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドを供給するも のである。この特定の活性は、自然ｈＧＭ−Ｃ９Ｆの特定活性又は培養でイース ト又は動物細胞中に生産したｈ　ＧＭ−ＣＳ　Ｆの特定活性より実質的に高い。 本発明のポリペプチドは、細菌の、真菌性の又は寄生体病気に対し、また白血病 の治療に対する方法と組成物のみならず放射線照射又は化学療法の後の白血球の 再生において、生産したまま又は更に誘導体とし又は修飾体としてのいずれかで 使用してよい。これらの組成物は、エイズにかかった固体のような免疫弱化固体 における通性感染の可能性を削減するためにも使用してよい。この場合、ＧＭ− ＣＳＦ一様ポリペプチドは、エイズ患者の白血球数を増加させて、適性感染を防 止し、かくして生存期間を引き伸ばし、かつエイズ患者の治療費用を減らす。 −ＣＳＦに対する核酸と推定アミノ酸配列とを表す。シグナルペプチドに対する 開裂部位は矢印で示される。ｃＤＮＡから誘導したＭｏ−細胞と、核酸とアミノ 酸との違いは対応Ｕ９３７の上下に示される。ヌクレオチド３５６はｃ　Ｄ　Ｎ 　Ａから誘導したＭｏ−細胞におけるＴ又はＣのいずれがである。 第２図は、５６３７細胞系統から単離したようなｈＧＭ−ＣＳＦに対する核酸配 列を表す。シグナルペプチドに対する開裂部位は矢印により示される。 第３図は、マウスＧＭ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ地図を表し 、Ｕ９３７ｈＧＭ−ＣＳＦ収集をスクリーンするため使用したコード化領域とニ ック−翻訳プローブの両方とも示される。 第４図は、本発明により微生物細胞中に高レベルのｈＧＭ−ＣＳＦ生産用のイー 、コリ発現媒介体ｐ　Ｐ　Ｌ　ｍ　ｕ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳＦ　（ｐ　２１０＊）の 構成を表している。 第５ａと５ｂ図は、２つのプラスミドシステムを介する細菌細胞中に並びに中間 プラスミドを介するこれらの構造中にｈＧＭ−ＣＳＦを生産するため使用した゛ イー、コリ発現媒ｈＧＭ−ＣＳＦの５°コ一ド化配列を置換するため使用した合 成領域がハツチングした領域により示される。 第６図は、ヌクレオチド配列と、イー、コリ発現（Ｎｃ　ｏ　ｌ−ＨｇλＩ）に 使用した合成結合の推定アミノ酸配列を表す。 第７図は、イー、コリ単一ブラスミド発現媒介体ｐ２４１−４８の構造を表す。 第８図は、ｈＧＭ−ＣＳＦコード化領域へのイーストα交配因子融合を表す。 第９〜１０図は、ｈＧＭ−ＣＳＦ生産用のイースト発現媒介体ｐ　５２８　／　 １の構造の略図を表す。 記載中、次の用語が使用される： ヌクレオチド・・糖部分（ペントース）、リン酸塩、及び窒素複素環塩基から成 るＤＮＡ又はＲ’ＮＡの単量体単位。 塩基は、グルコシド炭素（ペントースのｌ°炭素）を介して糖部分に結合され、 塩基と糖の組み合わせはヌクレオシドと呼ばれる。塩基は、ヌクレオチドを特徴 ずける。４つの塩基はアデニン（°Ａ”）、グアニン（“Ｇ−）、シトシン（“ Ｃ”）、及びチミン（“Ｔ”）である。４つのＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃ，及びウ ラシル（“Ｕ”）である。 ＤＮＡ配列・・隣接ペントースの３°と５°炭素間のリン酸ジエステル結合によ り互いに結合されたヌクレオチドの線状配列。 コードン・・アミノ酸のｍ　ＲＮ　Ａを介して翻訳開始シグナル又は翻訳停止シ グナルをコード化する３つのヌクレオチド（トリプレット）。例えば、ヌクレオ チドトリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，、ＣＴＡ及びＣＴＧはアミ ノ酸ロイシン（’Ｌｅｕ”　）をコード化し、ＴＡＧ、ＴＡＡ及びＴＧＡは翻訳 停止シグナルであり、ＡＴＧは翻訳開始シグナルである。 リーディング　フレーム・・アミノ酸配列中にｍ　ＲＮ　Ａの翻訳する間のコー ドンのグループ分け。翻訳中、適切なリーディング　フレームは保持されねばな らない。例えば、ＤＮＡＮＡ配列ＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは３つのリーディングフ レーム又はフェース中に発現され、その夫々は異なるアミノ酸配列を与える： ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＴＧＡ　ＡＡＧ−−Ａｌ１−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＬｙｓＧ　ＣＴ Ｇ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＡＧ−−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＶａｌＧＣＴＧＧ　ＴＴＧ　Ｔ ＡＡ　Ｇ−−Ｔｒｐ　Ｌｅｕ−（停止）ポリペプチド・・隣接するアミノ酸のα −アミノ酸とカルボキシ基の間のペプチド結合により互いに結合されるアミノ酸 の線状配列。 ゲノム・・細胞又はウィルスの全体のＤＮＡ、これは、とりわけオペレーター、 プロモーター及びリポソーム結合並びにシネ−ダルガロン配列のような配列を含 む相互作用配列のみならず物質のポリペプチドをコードする構造遺伝子を包含す る。 遺伝子・・特定ポリペプチドのアミノ酸特性の配列である鋳型又は伝令ＲＮＡ　 （“ｍ　ＲＮ　Ａ”）を介してエンコードするＤＮＡ配列。 ５＝Ｓ−−遺伝子又はＤＮＡ配列からｒｎ　ＲＮ　Ａを生産する方法。 翻訳・・ｍ　ＲＮ　Ａからポリペプチドを生産する方法。 １１・・ポリペプチドを生産するため遺伝子又はＤＮＡ配列により受ける方法。 プラスミド・・プラスミドが宿主細胞中に複製されるような完全“リプリコン” から成る非染色体の二重鎖ＤＮＡ配列。 プラスミドが単細胞微生物中に置かれる時に微生物の特性はプラスミドのＤＮＡ の為に変化され又は転換される。例えば、テトラサイクリン耐性（ＴＥＴＲ）の 遺伝子を持つプラスミドリンに６を性の細胞に転換する。プラスミドで転換され た細胞は“トランスフォーマント１と呼ばれる。 ファージ　はバクテリオファージ・・細菌性ウィルスで、この多くは蛋白エンベ ロープ又はコート（“カプシド”）中に包膜されたＤＮＡ配列から成る。 クローニング伝　体・・宿主細胞中に複製出来るプラスミド、ファージＤＮＡ１ コスミド又は他のＤＮＡ配列であって、１つ又は少数のエンドヌクレアーゼ認識 部位を特徴とし、その部位にて、このようなりＮＡ配列は、ＤＮＡの本質的生物 学的機能、例えば複製、コート蛋白の生成の損失、又はプロモーター又は結合部 位の損失の付随無しに測定可能な状態で切断され、かつ転換細胞の同定、例えば テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性の同定の使用に適した標識を包含す る。クローニング伝播体はしばしば媒介体と呼ばれる。 クローニング・・無性生殖により微生物又は配列から誘導した微生物又はＤＮＡ 配列の集団を得る方法。 組換型ＤＮＡ　子　はハイブリッドＤＮＡ・・生きた細胞の外で末端−末端結合 されかつ生きた細胞中で保持可能である異なるゲノムからのＤＮＡセグメントか ら成る分子。 ＩＪＩＩＩＥＦＩ　−−遺伝子に作用的に結合した時に遺伝子を制御し調節する ヌクレオチドの配列。これらは、ｌａｃシステム、β−ラクタマーゼイステム、 ｍシステム、ｔａｃシステムとｔｒｃシステム、ファージλの主オペレータとプ ロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、５ｖ４０の初期と後期のプロモータ 、ポリマーウィルスとアデノウィルスから誘導したプロモータ、金属チオニンブ ロモータ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他のグルコース分解酵素、酸ホ スファターゼのプロモータ例えばＰｂｏ２、イーストα交配因子のプロモータ、 及び原核生物性又は真核生物性の細胞及びこれらのウィルス又はこれらの組み合 わせの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列を含む。 ＧＭ−ＣＳＦ一様のポリペプチド・・ＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性を発揮するポ リペプチド。こ、のポリペプチドは成熟ＧＭ−ＣＳＦのポリペプチドに加えてア ミノ酸を含んでよく、又は成熟ＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸の総てを含まなくてもよ い。最後に、これはＮ−末端メチオニンを含んでよい。 本発明は、少なくともＩ　Ｘ　１０”単位／　ｍ　ｇの特定活性を有するｈ　Ｇ Ｍ−ＣＳ　Ｆ一様ポリペプチドに関し、かつこれらのポリペプチドを生産する方 法に関するものである。更に、本発明は、微生物細胞内に多量のｈＧＭ−、Ｃ３ Ｆ一様ポリペプチドを生産することに関する。本発明のポリペプチドは、前記し たように臨床的に有用であり、これらは又、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆに多クローン性及 び単クローン性抗血清の両方の生木　日　の　シ　ス　テ　ム 多種の宿主／発現伝播体組み合わせが、本発明のＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチド の高収率生産に使用される。更に、多種の宿主／発現伝播体組み合わせが本発明 の高い特定活性のｈＧＭ−ＤＳＦ一様ポリペプチドの生産に使用される。生産さ れたｈＧＭ−ＣＳＦをグリコジル塞化するこれらの宿主に対し、脱グリコジル基 化工程は、勿論、本発明の高い特定活性ｈＧＭ−ＣＳＦを生産するのに必要であ る。 適切な宿主の選択は当業者により理解される多くの因子により制御される。例え ば、選択された媒介体との適合性、ハイブリッドプラスミドによりコード付けさ れる蛋白の毒性、所望蛋白の回収の容易性、発現特性、生物学的安全性及びコス トが含まれる。これらの因子のバランスは、樋での宿主媒介体組み合わせが、本 発明の特別な組換型ＤＮＡ分子の発現に等しく有効であるとは限らないことが分 かることで与えられるに違いない。 有用な発現媒介体は、例えば、染色体、非染色体及び各種のＳＶ４０の公知誘導 体、公知細菌プラスミド、例えば、ｃｏｌＥｌ、ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭ Ｂ９及びこれらの誘導体を含むイー、コリからのプラスミド、広範囲の宿主範囲 のプラスミド、例えば、　ＲＰ４、ファージＤ　Ｎ　Ａ　ｓ　ｓ例えば、ファー ジλの多くの誘導体、例えば、ＮＭ　９８９、及び他のＤＮＡファージ、例えば Ｍ１３及び虹単鎖ＤＮＡファージ、２μプラスミド又はこの誘導体のようなイー ストプラスミド、及びファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を使用して修飾した プラスミドのようなプラスミドとファージＤ　Ｎ　Ａ　ｓとの組み合わせから誘 導した媒介体のような合成りＮＡ配列から成る媒介体を包含する。 更に、多種の発現制御配列のいずれか−−それに作用的に結合した時にＤＮＡ配 列の発現を制御する配列−−は本発明のＤＮＡ配列を発現するためのこれら媒介 体に使用してよい。このような有用な発現制御配列は、例えば、初期及び後期の ＳＶ４０のプロモーター、ｌａｃシステム、ｍシステム、ＴＡＣ又はＴＲＣシス テム、ファージλの主オペレーターとプロモーター領域、ｆｄコート蛋白の制御 領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他のグルコース分解酵素、酸ホスフ ァターゼのプロモーター、例えば、Ｐｂｏ２、イーストα−交配因子のプロモー ター、及び原核生物性又は真核生物性細胞又はこれらのウィルスの遺伝子の発現 を制御することの公知な他の配列、並びにこれらの各種紐み合わせを包含する。 好適な発現媒介体及び制御配列はＰＬプロモーター、イーストα−交配因子のプ ロモーター、及びイーストアクチンプロモーターを含む。 多種の宿主細胞も本発明のｈ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ一様ポリペプチドの生産に有 用である。これらの宿主は、イー、コリ、シュードモナス、ｓｉｉ、ストレプト マイシス、イーストのような真菌の菌株のような公知真核生物性及び原核生物性 宿主、及びＣＨＯ細胞のような動物細胞、Ｃ０５ＩＳＣＯＳ７、Ｂ５Ｃｌ、Ｂ５ Ｃ４０、及びＢＭＴＩＯのようなアフリカミドリザル細胞、及びヒト細胞並びに 組織培養の植物細胞を包２２８２、イー、コリＭＲＣＩ、のようなイー、コリ菌 株、シュードモナス、ｓｍ、及びストレプトマイシス、イースト及び他の真菌、 培養液中の植物細胞又は他の宿主を包含して菌株５Ｇ９２７　［ＡＴＣＣ３９６ ２７］、５Ｇ９２８［ＡＴＣＣ３９６２８］、５Ｇ９３５　（ＡＴＣＣ３９６２ ３］及び５Ｇ９３６　［ＡＴＣＣ３９６２４］並びにその誘導体、Ａ８９　［Ｄ ＳＭ３８６９］、及びイースト菌株サッカロミケスセレビシよりＪ１９９１を包 含する。 本発明のｈＧＭ−ＣＳＦ一様のポリペプチドｈ　ＧＭ−ＣＳ　Ｆ一様ポリペプチ ド（これら宿主中で本発明によって調製した）は、融合蛋白（例えば、原核生物 性、真核生物性又は組み合わせＮ−末端セグメントに結合して排出に導き、安全 性を向上し、純度を向上し、又はＮ−末端セグメントの可能な開裂を向上する） 形式で、ＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ一様のポリペプ チドシグナル配列又は他の真核生物性又は原核生物性シグナル配列の総て又は一 部にて開始）の前駆体の形式で、成熟ＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドの形式で、 又はｍｅｔ−ＧＭ−〇ＳＦ−Ｓポ一様プチドの形式でポリペプチドを含有してよ いことが理解されるべきでせある。 本発明に係るポリペプチド、又は少なくともその前駆体の特に有用な形式の一つ は、容易に開裂するアミノ酸又はこのアミノ酸末端に結合する一連のアミノ酸を 有する成熟ＧＭ−ａｓｐ一様ポリペプチドである。このような構造は、適切な宿 主中で蛋白の合成を可能とし、この宿主においては所望のＧＭ−ＣＳＦに存在し ない翻訳開始シグナルが必要とされ、かくして特別のアミノ酸を生体内又は生体 外において開裂して所望ＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドを生産する。このような 方法は特殊技術である。 本発明のポリペプチドは、また本発明のＤＮＡ配列のコードンのいくらか又は総 てに対し異なるコードンにより特徴付けするＤＮＡ配列により配列を又配列にコ ードするｈＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドも含む。このような置換コードンは、 置換されたがしかしポリペプチドを高収率で生成するコードンを又コードンによ りコードされたアミノ酸と同じアミノ酸をコードする。別法として、アミノ酸置 換へ又はより長い又より短いＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドに導くコードンの一 つ又は組み合わせの置換は、有用な方法における性質（例えば、安定性の増加、 溶解度の増加又は治療活性の増加）に変える。これらのポリペプチドも本発明の 部分であることを理解すべきである。 最後に、本発明の最も好適なｈ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｐ　ｓは少なくともＩＸＩ　 Ｏ単位／　ｍ　ｇの特別な活性により特徴付けられるものである。これらのポリ ペプチドはこれらのポリペプチドをグリコジル塞化しない宿主、例えば、イ＝、 コリのような細菌性宿主中に直接に生産される。これらはまた、例えばイースト と動物細胞のようなこれらのポリペプチドをグリコジル塞化する宿主中で生産さ れるポリペプチドを脱グリコジル基化することにより生産される。このような脱 グリコジル基化は当技術分野で公知の普通の方法と組成物を使用して、生体外又 は生体内のいずれかにて達成される。これはまた、普通の薬剤と方法を使用して 蛋白生産の間にグリコジル塞化を阻止することによっても達成される。 本発明のＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドは、各種の普通の工程と方策により精製 される。 本発明のｈＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドを　する組成物と　法 本発明のＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドは、それが生産される形態において治療 組成物と治療方法でほどこされるが、これらは公知方法を使用して処方して薬学 的に有用な組成物を調製してよいことも理解すべきである。このような組成物は 、好適にはまた薬学的に許容される担体も含むであろうし、かつ他の薬剤、担体 、アジュバント、結合剤、例えば、ヒト血清アルブミン又は血漿製剤を含んでよ い。例えば、レミングトン晋の１笠圧笠（Ｅ、Ｗ、マルチン）を参照のこと。得 られた処方は、レシピエンドに効果的な量のｈＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドを 含有して、顆粒球とマクロファージのコロニー生成を刺激する。これらのポリペ プチド、又は薬学的に許容のこの誘導体の投与は、ＧＭ−ＣＳＦの普通の許容の 投与方法を介してなされる。これらは、非経口投与、皮下投与、又は静脈内投与 を含む。 本発明のＧＭ−Ｃ８Ｆ一様ポリペプチドは、免疫−弱化患者の白血球を増加して 患者の感染の危険を削減するため組成物と方法において特に有用である。例えば 、本発明の組成物と方法は、エイズ患者の生存期間をしばしば短くする通性感染 の発生を防止しかつ治療費用がかさむのを防止するため、エイズ患者の治療に有 用である。 用量と投与割合は各種因子により、例えば、放射線療法の後の癌患者に治療がな されるか、又は通性感染を防止するためエイズ患者に治療がなされるのいずれか の場合である。 しかし、若し患者が長期に亙って堅実に治療がなされるならば、用量は１日当た り１〜１０８ｇ又は１週間当たり１０〜１００μｇである。 本発明をより良く理解される為に、次ぎの実施例で説明する。これらの実施例は 、ただ説明の目的のもので、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきでない。 実施例１ ヒ１−ｃＤＮＡ保存物の作成およびスクリーニングλｇｔｌＯにおけるヒト大食 細胞ラインＵ９３７から単離したポリ　（Ａ）″ｍＲＮＡからのヒトｃＤＮＡ保 存物の作成、およびイー・コリｃｓｏｏｈｒｔ細胞における前記保存物の増殖に つき以下説明する。 Ａ、ヒトＵ９３７細胞からのＲＮＡの抽出ヒト大食細胞Ｕ９３７細胞を培養によ りデキサメタソン（１０−’　Ｍ）およびフォルボールエステル（１０−’Ｍ） で誘起させ、かつ１．２　Ｘ　１０”　（［１Ｈの菌体を含有するペレットを４ ８　ｎ＋１（７）溶菌緩衝液（０，２Ｍ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、０ ．１　Ｍ’　Ｌ　ｉ　Ｃｌ　、２５’ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％５ＤＳ）および５ｍ Ｍバナジル錯体〔ベセスダ・リサーチ・ラボラドリース社〕に回動によって再懸 濁させた＊２４ｍ、ｌのフェノールを添加して菌体を溶菌させ、かつ５分間回動 させた。溶菌混合物へ２４＋ｗｌのクロロホルムを添加し、次いでこれを１ｏ分 間振とうした。臨床用遠心分離器で室温にて１ｏ分間遠心分離することにより、 有機相と水相とを分離した。水相をフェノール；クロロホルム（１：　１）で２ 回再抽出し、次いでクロロホルムだけで２回抽出した０次いで、核酸を０．３　 Ｍ酢酸ナトリウム中で一２０℃にて１晩エタノール沈澱させ、かつ核酸をツルバ ールＲＣＺＢ型遠心分離器（ＳＳ３４０−ク）により１４Ｋｒｐｍで４℃にて２ ０分間ペレット化させた。これらペレットを５ａ＋１の０．３　Ｍ酢酸ナトリウ ムｂｔ　重液に再懸濁させ、かつ核酸を上記と同様に再びエタノール沈澱させた 。 ｉ終的ペレントを３００ｔｔｌのＨ２Ｏ中に再懸濁し、これを−２０℃で貯蔵し た０次いで、このＲＮＡｍ製物をオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム（ＰＬバイ オケム社）に通過させてポリ　（Ａ＞”　ＲＮＡにつき濃縮した。 らｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成した。ポリ　（Ａ）”　ｍＲＮＡＧ３２０中５００μｇ ／ｎ＋１に希釈し、これを６５℃で３分間加熱し、ドライアイス−プロパツール 浴中にて急速に冷却させ、次いで解凍させた。次いで、０．１　Ｍ　）す、ｚ、 −ＨＣｌ　（ｐＨ８，３，４２”Ｃ）　ト０．０１Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２と０． ＯＩＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔと１ｍＭｄＣＴＰと１ｍＭ　ｄＧＴＰと１ｍＭ　ｄＴＴＰと ０．５ｍＭｄＡＴＰと１００，１ｊｃｉα−Ｐ３２−ＡＴＰ　（３０００Ｃｉ／ ミリモル、アメルシャム社もしくはニューイングランドヌクレア社）と２０Ｍｇ オリゴ（６Ｔ”）ｔｔ　ｓｓ　（ＰＬバイオケム社）と０．０３Ｍβ−メルカプ トエタノールと５ｍＭバラジル・リボヌクレオシド錯体（ベセスダ・リサーチ・ ラボラドリース社）と１６９Ｕ　ＡＭＶ逆転写酵素（セイヵガク・アメリカ社） とで構成された反応混合物へ、ＲＮＡを添加した。この反応混合物の最終容積は ２００μ！であった。 この混合物を室温にて２分間および４４℃にて６時間培養した６反応をｌ／１０ 容積の０．５　Ｍ　Ｎａ２−ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）の添加によって１♀止さ せた。 反応混合物を０．１５Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＨに調整し、かっこの混合物を３７℃にて １２時間培養し、次いで１／１０容禎のＩＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）お よびＭＣＩによって中和した。これをフェノール：クロロホルム飽和ＴＥ緩衝液 （１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，０）および１ｍＭ　Ｎａ２−ＥＤＴＡ） で抽出した。水相を、０．０１ＭにおけるセファデックスＧ１５０（ｐｌ（７， ４）と０．４Ｍ　ＮａＣ１と０．０１Ｍ　Ｎａ２−ＥＤＴＡと０．０５％ＳＤＳ とを含有する７×２９Ωの床で５ｍｌ無菌プラスチック製ピペットによりクロマ トグラフにかけた。前部ピーク・マイナス・テールを集め、ｃＤＮＡを２．５　 ｖ　ｏ　ｌの９５％エタノールにより一２０℃で沈澱させた。この反応により、 １Ｍｇの一本鎖ｃＤＮＡを得た。 ２、二重鎖の合成 一本鎖ｃＤＮＡを２００μｊ２　（最終容積）の０．１　ＭＨｅ　ｐ　ｅ　ｓ　 （ｐ）１６．９　）と０．０１Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２と０．００２５ＭＤＴＴと０ ．０７Ｍ　Ｍ　ＣＩと１ｍＭ　ｄＸＴＰと７５０クレノ一断片ＤＮＡポリメラー ゼ１　（ベーリンガー・マンハイム社）に再懸濁させ、かっこの反応混合物を１ ４℃にて２１時間培養シタ、反応ヲＮａ２−ＥＤＴＡ　（ｐ）１８．０　）　（ Ｄ添加（０，０１２５Ｍまで）によって停止させ、混合物を最初のｃＤＮＡ工程 におけると同様にフェノール：クロロホルムで抽出し、がっ水相を０．ＯＩＭ） すｘ　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）と０．１Ｍ　ＮａＣ１と０、ＯＩＭ　Ｎａ２− ＥＤＴＡと０．０５％　Ｓ　Ｄ　ＳとにおいてＧ１５゜カラムでクロマトグラフ にかけた。末端を含まない放射性ピークを再び集め、ＤＮＡをエタノール沈澱さ せた。 次いで、得られたＤＮＡを４２Ｕの逆転写酵素と共に５゜μｌのＯ，１Ｍ）リス −ＨＣｌ　（ｐＨ１８，３）と０．０１’Ｍ　ＭｇＣｌ２と０．０１Ｍ　Ｄ　Ｔ 　Ｔと０．１Ｍ　ＭＣＩと１ｍＭ　ｄＸＴＰＳと０．０３Ｍβ−メルカプトメタ ノールとにおいて３７℃で１時間培養して二重鎖合成を完結させた０反応を停止 させ、かつ上記と同様に処理した。 二重鎖合成の間に形成されたヘアピンループを次のように開裂させた。ペレット を５０μｌの０．０３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）と０．３Ｍ　ＮａＣ１と ０．００３　Ｍ　Ｚ　ｎ　Ｃ１、とに再熔解させ、これを１００ＵのＳ、ヌクレ アーゼ（シグマ社）により室温で３０分間処理した。反応をＥＤＴＡの添加によ り停止させ、かつ上記と同様に処理した。Ｓ、処理後の収量は９００ｎｇのｄｓ ＤＮＡであった。 Ｓ、ヌクレアーゼ切断後の平滑末端を確保するため、このＤＮＡを６０μｌの０ ．ＯＩＭ　）リス−ＨＣ１（ｐ）１７．４　）と０．０１Ｍ　ＭｇＣｌ２と１ｍ Ｍ　ＤＴＴと０．０５Ｍ　ＮａＣ１と８０ＭＭ　ｄＸＴＰと１２．５ｔＪクレノ ーとにおいてこのクレノーにより１４℃で９０分間処理し、５０：５０フェノー ル：クロロホルムで抽出し、かつ０．０１Ｍ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４） と０．１Ｍ　ＮａＣ１と０．０１Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａと０．０５％ＳＤＳとでＤ ＮＡをＧ５０スピンカラム（１ｍｌシリンジ）によりクロマトグラフにかけた。 次いで、その後のＥｃｏＲＩ切断の下での醗酵を避けるため、ｄ　ｓ　ＤＮＡを メチル化した。ＤＮＡを最終３０μｌの０．１Ｍトリス−ＨＣ１（ｐｌ＋８．０ 　）　と０．０１Ｍ　Ｎａ２−ＥＤＴＡと２４ＭｇＢＳＡ、ｌ！：０．００５Ｍ 　ＤＴＴと３０ＭＭＳ−アデノシルメチオニンと５ＵＥＣＯＲＩメチラーゼとに おいてこのＥｃｏＲＩメチラーゼにより３７℃で２０分間処理した０反応混合物 を７０℃で１０分間加熱し、冷却し、５０：５０のフェノール：クロロホルムで 抽出し、かつ上記と同様に０５０スピンカラムでクロマトグラフにかけた。 このメチル化したｄｓｃＤＮＡをホスホリル化ＥＣ０ＲＩリンカ（二ニー・イン グランド・バイオラブ社）に対し次の条件下で結合させた：最終容積７．５μｌ の０．０５Ｍ　）リス−〇ＣＩ（ｐＨ７，８）と０．ＯＩＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　、 と０．０２Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔと１ｍＭＡＴＰと５０Ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡと０．５μ ｇリンカと３００Ｕ　Ｔ４ＤＮＡリガーゼとにおいて１４℃で３２時間、この反 応混合物を０．１　Ｍ　）’ＪスーＨＣ１（ｐＨ７，５）　、０．０５ＭＮａＣ １，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１００Ｍｇ／ａ＋Ｉ　ＢＳＡに調整して１２５ＵのＥ ｃｏＲＩ　（二ニー・イングランド・バイオラブ社）を添加し、この混合物を３ ７℃にて２時間培養し、５０：５０のフェノール：クロロホルムで抽出し、そし て上記と同様にＤＮＡを０５０スピンカラムにてクロマトグラフにかけた。 ｃＤＮＡを１００．ｕｊ！の０．ＯＩＭ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）と０． １Ｍ　ＮａＣ１と１ｍＭ　ＥＤＴＡとに再溶解させ、これを予め同じ緩衝液で徹 底的に洗浄された（結合阻止剤を除去するため）ＩＸ５０ｃｍのバイオゲルＡ３ ０（ビオラド社）カラムにてクロマトグラフにかけた。各フラクションの１部を １％アガロースゲル上にＴＢＥ緩ｆｆｉ液（０，０８９Ｍ　トリス−ＭＣＩ、０ ．０８９　Ｍ硼酸および２．５　ｍＭ　Ｎａ２−ＥＤＴＡ）とで流動させ、乾燥 しかつ一７０℃に一晩露呈させた。　、５ｏ。 塩基対より大きいフラクションを全て集め、これらのフラクシヨンにおけるＤＮ Ａをエタノール沈澱さ廿、上エユＲＩ−切断されたλｇｔｌＯクローン化ベクタ ーにクローン化させた６寸法分画カラムにより、平均寸法的１５００ｂｐのｃＤ ＮＡ１２６ｎｇを得た。 ３、保存物の作成 ５ＭｇのＥＣ０ＲＩ−切断されたλｇｔｌＯを２０ＭｇのｃＤＮＡおよびＴ４Ｄ ＮＡリガーゼ緩衝液と共に４２℃で１５分間培養してＣＯ３部位を融合させ、次 いでエッペンドルフ遠沈管で５分間遠心分離し、そして１ｍＭのＡＴＰと２４０ ０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（二ニー・イングランド・バイオラブ社）を添加して 最終容積５０μ！にした（ヒユー・ヤングおよびデービス、「λｇｔｌｏおよび λｇｔｌｌにおけるｃＤＮＡ保存物の作成およびスクリーニングＪ、ＤＮＡクロ ーニング：実際的方法（Ｄ、グローバーり、ＩＲＬプレス社（オックスフォード 、１９８４））、この結合混合物を１４°Ｃにて一晩培養した。λｇｔｌＯｃＤ ＮＡ結合混合物をアメルシャム・パンケージング・ミックス〔アメルシャム・パ ンケージング・プロトコール〕によりファージ粒子中へ包封し、かツ０．５ｍｌ の５Ｍ１ｉ衝ン皮（１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭＭｇ　Ｓｏ、　、５０ｍＭ 　）’ＪスーＨＣＩ　（ｐＨ７，５）および０．０１％ゼラチン〕で希釈した。 次いで、イー・コリＣ６００ｈｆｌ菌体にこれら粒子を感染させてｌＸｌ０’個 の独立した組換体のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ保存物を作成した（Ｔ、マニアチス等、モレ キュラ・クローニング、第２３５Ｘ（コールド・スプリング・ハーバ−１１９８ ２）参照〕。 この保存物を塗抹しかつ増殖させるため、１ｗ＋１の面体および２５０μｌのパ ンケージングミックスを室温にて１５分間培養し、Ｌ　Ｂ　＋　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ ＊　ト７プアガＩ’−ス１’５０ｍ１まテ５０℃にて希釈しかつＬＢ　Ｍｇ　Ｎ ｕｎｃプレートに塗抹した。 これは２Ｘ１０’プレートのプラーク密度を示した。これらのプレートを、プラ ークがほぼ接触しうるようになるまで３７℃にて約８時間培養した。 これらのプレートに５０ｍ１の冷ＳＭ緩衝液（０，０１Ｍ　）リス−ＨＣｌ　（ ｐＨ７，５）、０．ＯＩＭ　ＭｇＣｌ２．０．１ｍＭ　Ｎａ２−ＥＤＴＡ）を満 たし、ジーイロ・回転振とぅ器にて４℃で一晩溶出させた。溶出物を２５０　ｍ ｌ瓶に集め、ツルバールＧＳＡロータにて６にで１０分間遠心分離した°、上澄 液を同容量の冷２０％ＰＥＧ４０００−２Ｍ　ＮａＣ１で水中ニテ３時間処理し 、かつファージをＲＣ−３Ｂ型ツルバ一ル遠心分ｇＩ器においてＨ４０００ロー タにより４にで３０分間遠心分離す゛ることによりペレット化させた。これらの ファージバンドを充分に排液し、６０ｍ１のＳＭに再Ｅ潰させ、がっＳ　Ｓ　３ ４０−夕ニｒｌＯ，０ＯＯｒ　ｐ　ｍで遠心分離することにより残骸を除去した 。上澄液を、１０ｍ１の上澄液へ７ｇのＣｓＣ１を添加することにより３．５　 Ｍ　Ｃｓ　Ｃ１に調整した。　７０．１ペンクマンロータに、より５０．００Ｏ ｒ　ｐ　ｍにて１５℃で１８時間遠心分離することにより、ファージバンドを得 た。これらのファージバンドを集めて、保存物用に４℃で貯蔵した。得られたタ イターは２．２　Ｘ　１０’　”　ＰＦＵ／ａ＋１であった。 上記ヒトｃＤＮＡ保存物をネズミＧＭ−Ｃ５Ｆ　ｃＤＮＡ配列の断片によってス クリーニングした。この方法の基礎は、ネズミＧＭ−Ｃ３Ｆが成る程度ヒト−Ｃ Ｍ−Ｃ５Ｆに対しアミノ酸類似性を有することにある（Ｎ、Ｍ、ジーン（上記） 、第２頁、Ｒ，Ｈ，ワイスパート（上記）、第３頁〕、シたがって、ネズミＧＭ −Ｃ５Ｆ　ｃＤＮＡは、ヒトｃＤＮＡ保存物からヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ関連ｃＤＮＡ の選択を可能にするのに充分な程度でヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ　ｃＤＮＡに交差ハイブ リッド化すると推定した。 ５、ネズミＧＭ−Ｃ３Ｆプローブの作成ヒ）ｃＤＮＡ保存物をスクリーニングす るためのネズミＧＭ−Ｃ５Ｆ　ｃＤＮＡプローブを次のようにして得た。フォル ボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）で誘発させたＥＬ− ４ネズミ胸癌細胞（ＡＴｃｃＴＩＢ３９）から分離したｍＲＮＡよりｃＤＮＡ保 存物を・作成した６次いで、オカヤマーベルグのプロトコール（Ｈ。 オカヤマおよびＰ、ベルブ、「全長ｃＤＮＡＯ高効率クローン化」、モレキュラ ・セル・バイオロジー、第２巻、第１６１〜１７０頁（１９８２））を用いて、 ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写させた。ｃＤＮＡをプラスミドベクターｐＨ０３２ ７、すなわち改変ｐＫＣＲベクター（Ｋ、オハーレ等、［原核ジヒドロホレート レダクターゼを発現する組換えプラスミドによるメトトレキセート耐性に対する ネズミ繊維芽の形質転換」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイ エンス。 ＵＳＡ、第７８巻、第１５頁、第２７〜３１頁（１９８１））に挿入し、これは ｃＤＮＡクローン化用の独特な五ユ」ｊ部位と２個の整合Ｂ　ａ　ｍ　８１部位 とを有して、挿入ｃＤＮＡ配列の便利な切除を可能にする。得られた保存物（Ｗ 、ボールおよびＣ，ワイスマンの寄贈）は約２Ｘ１０’個の個々のｃＤＮＡ分子 で構成された。このネズミｃＤＮＡ保存物を、ネズミ肺細胞誘導ＧＭ−Ｃ３Ｆに 対する公知ｃＤＮＡ配列（Ｎ、Ｍ、ジーン等、［ネズミ造血生長制御顆粒球−大 食細胞コロニーの刺戟因子をコードするｃＤＮＡの分子クローン化」、ネイチャ ー、第３０９巻、第７６３〜７６７頁（１９８４））に基づいて合成された２種 のオリゴマーＤＮＡプローブでのハイブリッド化によってスクリーニングし、そ の際固相ホスホトリエステル法を用いた〔Ｈ，イト−等、「ポリヌクレオチドの 固相合成：ＶＩ、固体支持体用ポリスチレン共重合体の研究」、ヌクレイツク・ アシッド・リサーチ、第１０巻、第１７５５〜１７６９頁（１９８２））。 これらのプローブは次の配列を有した：Ｇ　Ｍ　ＣＳ　Ｆ　−２プローブ：　Ｃ ＣＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＣＧＡＣＴＧ ０ＭＣ３Ｆ−１プローブ：ＣＴＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＴＧ ２Ｘ１０’（ｌ［のｃＤＮＡ分子のうち０．０２％は陽性であった。 最長の陽性挿入物の配列を常法によって決定した。たとえば、連鎖（♀走法（Ｆ 、サンガー等、プロシーディング・ナシ５４６３〜５４６７頁（１９７？）；Ｊ 、メンシングおよびＪ、ビエイラ、「二重切断制限断片のＤＮＡ鎖を選択するＭ １３ベクターの新規な対」、ジーン、第１９巻、第２６９〜２７６頁（１９８２ ））またはＤＮＡ鎖の化学的分解（Ａ。 Ｍ、マキサムおよびＷ、ギルバート、メソ７ズ・イン・エンチモロジー、第６５ 巻、第４９９〜５６０頁（１，９８０））のいずれかを用いることができる。こ のＤＮＡ配列はネズミ肺細胞からのＧＭ−Ｃ５Ｆの配列に類似していることが判 明した。コード化領域にわたり、３個のみの塩基変化が存在した（位置１８６． ２１３および４８２）、Ｌかしながら、位置４８２における塩基変化のみがアミ ノ酸置換を与えて、グリシンの代りにバリンをもたらす、これらの変化は、ｍＧ Ｍ−Ｃ３Ｆの種々異なる分離物につき報告された２種の変種のうち一方を示す（ Ｎ、Ｍ、ジーン等、「ネズミ顆粒球−大食細胞コロニー刺戟因子に対するｍＲＮ Ａの構造および発現」、ＥＭＢＯジャーナル、第４巻、第６４５〜６５３頁（１ ９８５））。 ６、ヒトｃＤＮＡ保存物のスクリーニングヒトｃＤＮＡ保存物をヒトＣＭ−Ｃ５ Ｆ配列につきスクリーニングし、その際ネズミＧＭ−Ｃ５Ｆ　（第３図）の３６ ５塩基対Ｎｃｉｌ−）（ｉｎｆｌ断片よりなる標識プローブを使用した。Ｎｃｉ ｒ−Ｈｉｎｆｌ断片を５％ポリアクリルアミドゲルで精製し、かつニック翻訳に よって放射能標識した。 スクリーニングするため、ベントンおよびデービスのプラークハイブリッド化技 術（Ｗ、Ｄ、ベントンおよびＲ，Ｗ、デービス、「単一プラークに対するハイブ リッド化によるその場でのλｇｔ組換クローンのスクリーニング」、サイエンス 、第１９６巻、第１８０頁（１９７７））を用いた。 このＤＮＡプローブによりスクリーニングするための保存物を作成するため、Ｌ −プロスおよび０．２％マルトースにおけるＣ６００ｈｆｌ菌体の一晩培養物を 作成しかつペレット化させ、そして同容量のＳＭ緩衝液に菌体を再懸濁させた。 次いで、０．９　ｎｉｌの菌体に２Ｘ１０’個のファージ粒子を室温にて１５分 間にわたり再吸着させた。この懸濁物をＬＢ＋１０ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＋お よび０．７％アガロースにて５０＋ａｌまで５５℃で希釈し、かつこれをＬＢ　 Ｍｇ　Ｎｕｎｃプレートに塗抹した、これらの１０枚のプレートをスクリーニン グした。 プレートを、プラークがほぼ接触しうるようになるまで３７℃にて約８時間培養 した０次いで、プレートを４℃で１時間冷却してアガロースを硬化させた。λｇ ｔｌｏファージ粒子をプラーク保存プレートからニトロセルロースへ移した。 フィルタを組換プラークを含有するプレート上に、使用した異なるフィルタの個 数に応じて３０秒間乃至５分間の異なる時間にわたって載置し、次いでフィルタ を釣り上げてＬＢ＋　１０　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４プレートにファージ含有 側を接しながら３７℃にて５時間培養した。 次いで、これらのフィルタを０．５Ｎ　ＮａＯＨのプールに５分間ｌいて溶菌さ せた後、１Ｍトリス−ＨＣ’ｌ　（ｐＨ７，０）で中和し、１Ｍトリス−ＨＣｌ 　（ｐＨ７，０）に浸漬させ、次いで８０℃にて２時間加熱した。 これらフィルタを、６×ＳＳＣと０．２％ポリビニル−ピロリドン（Ｍ、　Ｗ、 　４０，０００）と０．２％フィコール（Ｍ、Ｗ。 ４０．０００）と０．２％牛血清アルブミンと０．０５Ｍトリス−ＭＣＩ（ｐＨ ７，５）と１Ｍ塩化ナトリウムと０．１％ピロ燐酸ナトリウムと０．１％ＳＤＳ と１０％硫酸デキストリン（Ｍ、Ｗ。 ５００．０００　）と変性鮭精子ＤＮＡ　（≧１００　ｐｇ　／ｍｌ）とにおい て６５゛Ｃで、放射能標識された３６５塩基対Ｎｃｉｌ−Ｈｉ　ｎ　ｆ　Ｉ断片 ｃＤＮＡプローブにハイブリッド化させた。 次いで、これらを同じ緩衝液（２ＸＳＳＣ，０，１％５ＤＳ）にて６５℃で洗浄 した。自動放射能写真技術により、ハイブリッド化ｃＤＮＡ配列を検出した。こ の技術によりｌＸｌ０’個のファージをスクリーニングして、２０個の陽性プラ ークを釣り上げた。 これらの陽性ｃＤＮＡをさらに精製しかつ特性化した。最長のクローン化ｃＤＮ Ａは長さ７６８ヌクレオチドであった。 このｃＤＮＡ挿入物を常法によって配列決定した。その配列を第１図に示す、こ のｃＤＮＡに見られる最長の開放解読枠（ヌクレオチド７〜４３８）は、単一の 塩基（２９７）以外にはＭｏ−細胞誘導ｈＣ，Ｍ−Ｃ３Ｆにつき報告されたもの と全コード化領域にわたり同一である１４４個のアミノ酸よりなる蛋白をコード する。最初の１７個の残基は、残余の蛋白に対する信号配列と役割が推定上一致 する一連の疎水性アミノ酸からなっている。第１図に示したようにセリン（推定 信号配列の末端アミノ酸）とアラニン（コード化配列の第一アミノ酸）との間の 開裂部位も、報告された成熟蛋白の第一アミノ酸（アラニン）に一致する０位置 ２９７におけるＡからＧへの置換は、報告されたメチオニンの代りに一イソロイ シンに対するコドンをもたらす。 さらに、前記とほぼ同様にして、ヒト膀胱癌細胞ライン５６３７　（ＡＴＣＣＲ ＴＢ９）のポリ（Ａ）”　ＲＮＡからλｇｔｌｏにて第２のｃＤＮＡ保存物を作 成した。１０８組換ファージのこの保存物を上記プラークハイブリッド化技術に 従ってｈＧＭ−Ｃ３Ｆ配列につきスクリーニングし、その際第１図のｈＧＭ−Ｃ ５Ｆ　ｃＤＮＡのコード化領域からの２４０ヌクレオチド断片（Ｐｓ　ｔ　Ｉ− Ａｐａ　Ｉ）をプローブとして使用した。陽性信号が５００個のプラークにつき １個の頻度（０，０２％）で見られた。これらｃＤＮＡの最長のものは長さ９１ １ヌクレオチドであった。このＤＮＡ挿入物を常法により配列決定した。その配 列を第２図に示す、５６３７−誘発ｃＤＮＡのコード化配列は、Ｍｏ−誘発ｃＤ ＮＡにつき報告されたものと同一である。５６３７−誘発ｃＤＮＡは、Ｕ９３７ にもＭ　ｏ　−１（１１胞誘発ｃＤＮＡにも見られない付加的な非コード化配列 を５″末端と３′末端との両者に有する。 第４．５８および５ｂ図を参照して、ここにはｈＧＭ−ＣＳＦを高収量で産生ず ることを特徴とする組換えＤＮＡ分子（ｐ　Ｐ　Ｌ　ｍ　ｕ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　 Ｆ　）の製造方法における一実施例につき図示されている。これはヒトＧＭ−Ｃ ３ＦをコードするＵ９３７−誘発ＤＮＡ配列を有し、この配列はそのコード化＠ 域の５″末端がすでに改変されて潜在的に不利なＲＮＡ−次構造が最小化されて おり、ｍｕから誘導されかつｍｕからのシャイン・ダルガルノ配列を有するＤＮ Ａ配列に融合し、この融合ＤＮＡ配列はバクテリオファージλから誘導されたＰ Ｌプロモータに作用結合している。 発現ベクターｐＰＬｍｕＧＭ−Ｃ３Ｆを作成するため、最初に合成オリゴヌクレ オチドＤＮＡ配列もしくはリンカを作成して第一アラニンコドンとｈＧＭ−Ｃ３ Ｆ　ｃＤＮＡのヌクレオチド１２０における独特なＨｇａ　Ｔ部位との間のコー ド化配列を置換した（８１図）、このＮＣ０Ｉ一旦工Δ■リンカ（第６図）を、 リポソーム結合部位を利用しえなくするようなｍＲＮＡ二次構造の能力を低下さ せるよう作成した。 このリンカにおいて、天然ヌクレオチドをアデノシン（Ａ）で置換したが、遺伝 子コードの縮退は同一アミノ酸配列を保をコードする合成遺伝子のイー・コリに おける発現の最適化」、ヌクレイツク・アシフド・リサーチ、第１３巻、第１９ ２３〜１９３８頁（１９８５））、これらの塩基置換はｍＲＮＡ二次構造による 潜在自由エネルギーにおける１５Ｋｃａｌの変化をもたらしくΔＧ＝　２８．３ Ｋ　ｃ　ａ　ｌからΔＧ　−−１３，３Ｋｃａ　ｌまで）、予想よりも自由エネ ルギーを増大させて安定なステム・アンド・ループ構造を形成した。さらに、上 記リンカを用いてＡＴＧ開始コドンをコード化配列のＮ−末端アラニンの前に直 接付加させた。 次に第５！図を参照して、ここには各種の中間体を介するベクターｐ　２１０＊ の作成が示されている。上記のＤＮＡ配列改変を行なうため、第１図のＵ９３７ −誘発ｈＧＭ−Ｃ３ＦｃＤＮＡをｐｕｃ−ｓ　（Ｊ、ビエラおよびＪ、Ｒ，メフ シング、ジーン、第１９巻、第２５９〜２６８頁（１９Ｂ２））中へサブクロー ン化させた。ｐＵＣ８ＣＭ７Ｃ３Ｆと命名する得られたベクターを旦Ｊ」−Ｉお よびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。 得られた小断片を合成Ｎｃｏｌ一旦エユＩリンカに結合させた０次いで、ｐＰＬ ｍｕベクター（Ｅ、レムート等、ジーン、第１５巻、第８１〜９３頁（１９８１ ）；ｃ、グレイ等、ジーン、第３２巻、印刷中〕をＮｃｏｌおよびＨｉｎｄＩ［ ［で切断し、ここに上記断片を挿入した０次いで、ＢａｌＩ部位とΣｍａ１部位 との間の３″非コ一ド化配列を除去した。この名した。同様に、第２図の５６３ ７−誘発ｈＧＭ−Ｃ３Ｆを含有する第２のベクターを作成した。このベクターを ｐ　２１０＋−５６３７と命名した。 インビトロの転写−翻訳系においてｈＧＭ−Ｃ３Ｆの合成を指令するプラスミド ｐ　２１０”の能力を試験した。比較のため、Ｂａ１３１切断によりアラニンコ ドンまで欠失した原ｃＤＮＡ配列を有する同じ発現ベクターについても分析した 。 ３１よりも顕著に多いｈＧＭ−Ｃ３Ｆを生成したが、たｔ４しこの合成リンカお よびそのｍ　ＲＮ　Ａ二次構造の阻止はｈＧＭ−Ｃ５Ｆ様ポリペプチドの産生を 著しく向上させた。 １、イー・コリ宿主の選択および醗酵 同様にλＰＬプロモータの熱感受性リプレッサ（ＣＩ、、）をコードする第２の プラスミドを有するイー・コリ菌株Ｃ６００（Ｅ、レムート等、ジーン、第２２ 巻、第１０３〜１１３頁（１９８３））に発現プラスミドｐ２１０＊を導入した （第５ｂ図）、さらに、リプレッサが染色体の１部である菌株（下記説明）をも 使用することができた。菌体をリプレッサ活性のための許容温度である２８°Ｃ １或いはリプレッサ活性に対する非許容温度である４２℃で増殖させることによ り、転写を制御した。このイー・コリＣ６００宿主菌株を用いた場合、５ＤＳ− ＰＡＧＥ分析で検出しろる程充分な量のｈＧＭ−ＣＳＦを産生することができな かった。 次いで１．！１ＬＬｐ！Ｒｌ　ｏユ変異種であるイー・コリ菌株５Ｇ９３６　（ ｌａｃ　（ａｍ）、ｔ　ｒｐ　（ａｍ）、ｐｈ。 （ａｍ）、５ｕｐＣ（ｔｓ）＊　ｒｐｓ　１．ｍａｌ　（ａｍ）。 （ＡＴＣＣ３９６２４）を試験した。この変異種はＩｏｎプロテアーゼの生産が 欠如している。その結果、この菌株並びに１ヱユ変異菌株ＳＧ９３５　（ＡＴＣ Ｃ３９６２３）　、５Ｇ９２７　（ＡＴＣＣ３９６２７）および５Ｇ９２８　（ ＡＴＣＣ３９６２Ｂ）は、外来蛋白を菌体内へ蓄積する際或いは高温度にて分解 する能力が低下していることを示す（Ｓ、Ａ、ゴッフ等、「大腸菌におけるｉｏ ｎ遺伝子の蛋白分解および発現の割合に影響する遺伝子ＬｔｐＲのヒートショッ ク制御」、プロシーディング・ナシヨナル・アカデミ−・サイエンス。 ｔＪｓＡ、第８１巻、第６６４７〜６６５１頁（１９８４））。 イー・コリ菌株ＳＧ９３６を、標準誘発技術によってプラスミド２１０１で形質 転換させた。この菌株が調節醗酵条件下でｈＧＭ−Ｃ３Ｆを産生する能力を検査 した。形質転換したイー・コリＳＧ９３６を２８℃にて５０■／Ｉ１１のアンピ シリンと２００■／＋ｓｌのカナマイシンとを含有するし一プロスで約３０の光 学密度（６５０）まで増殖させた。４２℃にてヒートショックしかつ余分の培地 を追加した後、菌体を３時間増殖させて収穫した。 醗酵混合物の全菌体部分を種々の時間間隔で：すなわち接種時点、接種してから ４時間後、高温度（４２℃）にて誘発してから１時間後および誘発してから３時 間後のそれぞれに５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってｈＧＭ−Ｃ ３Ｆ産生につき分析した０強力な蛋白バンドが、誘発してから１時間後に出現し た。誘発した蛋白（見掛は分子！１４．５００を有する）は、予想した組換えｈ ＧＭ−Ｃ３Ｆ蛋白の予想分子量１４，５７４に充分一致した。収穫した後に採取 した部分のｈ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ産生を示す染色したゲルの１部につき、密度 計走査を行なった。この走査は、全蛋白の８〜９％がｈＧＭ−Ｃ３Ｆであること を示した。 さらに、他の宿主菌株を、そのｈＧＭ−Ｃ３Ｆを産生しかつ蓄積する能力につき 検査した。野性型イー・コリ菌株ＣおよびＢを変異イー・コリ菌株ＳＣ９３６と 比較した。何故なら、変異菌株は増殖が貧弱であるからである。菌株Ｂのみがｈ ＧＭ−Ｃ５Ｆにつき陽性であることが判明した。イー・コリＢにおけるｈＧＭ− Ｃ３Ｆのこの蓄積は、そのイー・コリ菌株におけるＩｏｎプロテアーゼの既知の 低レベルと一致した。したがって、前記高収量は、産生された後の組換え蛋白を 破壊しないｔｏｎプロテアーゼ変異株において向上した。 ２、単一プラスミドベクター より好適な実施例において、ヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆの産生につき単一のプラスミドベ クターを作成した。この単一プラスミドは、上記の２−プラスミド系よりも、イ ー・コリにおけるｈＧＭ−Ｃ３Ｆの合成につき幾つかの理由で一層有利である。 第一に、２種の別々のプラスミドは、２種の異なる抗生物質選択をその宿主菌体 の維持に必要とする。一方のプラスミド（２１０“）は、アンピシリナーゼをそ の耐性標識として用いた。残念ながら、増殖培地に要求されるアンピシリンは、 ヒト医薬生成物に関し醗酵の際に望ましくない要素である。 さらに、２種のプラスミドの相関的な増殖は一定でなかった。 したがって、一方のプラスミド（ｐ　ｃ　Ｉ　８５７）によりコードされるリプ レッサの量は、第２プラスミド（２１０“）に存在するプロモータコピーの個数 に適合する程一定でなかった。 これらおよびその他の理由で、予め２種のプラスミドにつき見出された全ての要 素を含有する単一プラスミド系を作成した。これらの要素は、ラムダＪｉｉ（Ｐ Ｌ）の左側転写プロモータを含み、次いでＭｕ相のｎｅｔ−１遺伝子に対するリ ポソーム結合部位と、成熟ヒトＣＭ−Ｃ３Ｆ蛋白をコードする改変配列（その前 に翻訳を開始させるメチオニンコドンが存在する）と、ファージＴ４遺伝子３２ からの転写ターミネータと、プラスミドｐＢＲ３２２からのテトラサイクリン耐 性遺伝子と、複製のオリジンと、プラスミドｐＡＴ１５３からの欠失変異体、す なわちＰＬの熱不安定性リプレッサをコードするファージλｃｌ遺伝子変異体８ ５７とが存在した。第７図に示したように、上記プラスミドからのこれら要素を 組合せた。 この単一プラスミドベクターを作成するため、３断片結合を行なった。すなわち 、ｃＩ８５７熱不安定性リプレッサを含有する第１断片を、ＥｃｏＲＩおよびＳ ａ’ｌＩによる切断にかけた後にプラスミド１５３−ＰＬ−Ｔ４−ｈＴＮＦｃＡ ３ｃｔｓ　（ＤＳＭ３４６０）から分離した。第２断片はプラスミドＴ４　ＣＡ ５　Ｄｒａ６　ＨｉｎｄＩ［Ｉから分離した。 これを５ａｌＩおよび）ｉｉｎｄＩ［［による切断にかけかつ小さｐ　２１０’ ）”から分離した。単一のプラスミドベクターｐ２４１−８が得られた。 単一のプラスミド系を作成する際の他の重要な要素は、転写ターミネータの導入 であった。このデータが示したところでは、この断片は単一のプラスミドベクタ ーを安定化させるのに有用である。 上記の高発現系における細菌宿主菌株（ＳＧ’９３６）をさらに変化させて、新 規な単一のプラスミドベクターを使用しうるようにした。５Ｇ９３６に既に存在 するテトラサイクリン耐性を除去した。テトラサイクリンの感受性に関するフザ リン酸に対するＨｉ苗の選択は、新たな菌株、すなわちＡ８９を与えた。単一の プラスミドベクター２４１−８を菌株Ａ８９に導入しかつｈＧＭ−Ｃ３Ｆの産生 を熱誘発によって開始させた際、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆは全菌体蛋白の８〜１０％を構 成し産生させたｈＧＭ−Ｃ３Ｆを精製するため、組換体−蛋白−含有のイー・コ リ菌体をフランスプレスによって溶菌させた。遠心分離し、次いで組換体−ｈＧ Ｍ−Ｃ３Ｆを含有する濃密な物質を含んだペレットを０．７５Ｍグアニジウム塩 酸塩と１％ツイーン４０と５０ｍＭ　ＥＤＴＡと０．１　Ｍ　トリス−ＨＣｌ　 （ｐＨ７，５）との可溶化緩衝液で洗浄して、可溶性汚染物を除去した０組換体 −ｈＧＭ−Ｃ３Ｆをペレットから５ｍＭＫＨ２ＰＯ，および６Ｍ尿素の緩衝溶液 によって抽出した。 さらに、このｈＧＭ−ＣＳＦをゲル濾過によってイー・コリから精製し、かつＣ −１００セフアデツクスカラムの溶出液を光学密度によって追跡した。これを行 なうため、洗浄したベレットをカラムに施した。試料をクロマトグラフにかけ、 かつ溶出液をＯ，Ｄ、２８０にて監視した。３個のピークが観察された０次いで 、５ＤＳ−ＰＡＧＥによりイー・コリで産生された組換体ｈＧＭ−Ｃ５Ｆ含有の 試料を分析し、クーマシー青により染色して結果を可視化させ、そしてｆ＆後の ピークが予想分子量の単一バンドを生ずることを見出した。 さらに、この最後のピークを逆相ＨＰＬＣ分析によって分■斤したカラム：ブラ ウンリーＲＰ３０．２．１　Ｘ　２００寵Ｃ８゜これは、さらに第３のＧ−１０ ０セフアデンクスカラムのピークがほぼ単一の蛋白ピークを示すことを確認した 。ゲル濾過クロマトグラフィーにより生じた他の２つのピークは、それぞれ汚染 物と２量体分子とを示した。 ４、生物学的活性分析 上記ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ発現プラスミドを有する溶菌したイー・コリ菌体の試料を分 析し、かつ骨髄クローン分析およびＣＭＬ分析を用いて生物学的活性の組換体蛋 白産生につき誘発させた。 最初に、ヒト骨ＶＢ８１ＩＩ胞に対する生物学的活性を分析した。 正常なヒト骨髄を密度によってフィコール中で分画し、かつプラスチックに吸収 させて大食細胞を欠失させた（Ｂ、バイツおよびＷ、Ａ、ロビンソン、ジャーナ ル、セル・フィジオロジー、第７６巻、第７７〜８４頁（１９７０））、次いで 、骨髄細胞（５０，０００１１１ｉ１の細胞）を血清フリーのメチルセルロース 培地またはアガロース培地にて１０％牛血清の存在下で増殖させた（Ｊ、Ｆ、エ リアソンおよびＮ、オダルチェンコ、「原始的増血細胞による血清フリー培地で のコロニー形成」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス。 ＵＳＡ、第８２巻、第７７５〜７７９頁（１９８５））、次いで、比較ＧＭ−Ｃ ５Ｆと、中外製薬社により供給された部分精製したｈＧＭ−Ｃ５Ｆと、組換ｈＧ Ｍ−Ｃ３Ｆとの作用を比較し、その際骨ＶＢ細胞を種々異なる希釈率にて各Ｃ３ Ｆの存在下で増殖させた。それぞれにつき、２反復で面体懸濁物の１１部分を直 径３５寵のベトリ皿に塗抹し、かつ各Ｃ５Ｆと共に３７℃にて５％ＣＯ２，５％ ０２および９０％Ｎ２の湿潤雰囲気内で培養した。７日間後および１４日間後に 、コロニーを計数した。これらを菌体の寸法およびコロニーの形態に基づいて顆 粒球、大食細胞または混合物として分類した。 成る場合には、さらにゲイムサで染色してコロニーの分類を確認した。この分析 は、原材料と組換材料との両者によるヒト骨髄細胞に対するコロニー形成の濃度 依存性刺戟を示した。 したがって、組換ｈＣ，Ｍ−Ｃ５Ｆはグリコジル化することなく活性である。 さらに、ＣＭＬ分析を行ってｈＧＭ−Ｃ３Ｆ活性を定量した。この分析は、予め 慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）を有する患者の末梢血液から精製された顆粒球に対す るＨ３−チミジンの吸収を測定する。細胞調製物は、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆに呼応して 増殖した７％血球を含有した（Ｊ、Ｄ、グリフイン等、ブランド、第６３巻、第 ９０４〜９１１頁（１９８４））、これらの菌体（１０５／ｍｌ）を種々の濃度 のＧＭ−ＣＳＦと共に４８時間培養し、かつＨ３−チミジン（１０，ｕ　Ｃｉ／ ＋＋＋１．２００　Ｃｉ　／　ｎモル）を６時間組込んで測定した。１ｍｌ当り １単位は、ＣＭ　Ｌ　８ｍ胞の最高のＨ３−チミジン組込みの５０％を誘発する 。ＧＭ−Ｃ５Ｆの存在下におけるこの吸収は、培養時間および細胞の関数に正比 例する。 イー・コリ産生したｈＧＭ−Ｃ３Ｆの活性を分析した：（１）ｐ　２１０’およ びｐｃ１８５７を有するＳＣ２３６菌体の誘発培養物；（２）ｐ２１０”および ｐｃＩ８５７を有する５ｃ９３６菌体の非誘発培養物；および（３１ｐ　Ｐ　Ｌ 　ｍ　ｕおよびｐｃ１８５７を有するＳＣ２３６菌体の誘発培養物、試料（２） および（３）と共に培養したＣＭＬ細胞は、バンクグランドレベルのみのＨ”− チミジンを組込んだ、試料（１）と共に培養したＣＭＬ細胞はＨ３−チミジン組 込みの希釈率依存性刺戟を示し、活性ＧＭ−Ｃ３Ｆの存在を確認した。 ５、イー・コリ産生ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの好適精製方法宿主細胞を再編成するため、 イー・コリ菌体（１００ｇ）を５倍容量のｉｇ￥Ｉ液１（１００ｍＭ燐酸ナトリ ウムＨ５ｍＭベンズアミジン−ＨＣ１、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　；　０．５　ｍＭ弗 化フェニルメチルスルホニル（エタノール中に溶解、ＩＯＷ／Ｖ％）；２５％蔗 糖；０．１７重量％の菌体リゾチーム）　（ｐＨ＝７．０）に懸濁させた。菌体 を氷水浴中で２分間音波処理した後、これらを２２℃にて１時間培養した０次い で、この混合物を４℃まで冷却し、かつフランス圧力セルに１６０００ｐｓｉに て２回通過させた０次いで、粗製ホモゲナイズ物を１０．４００ｘ　ｇ　（Ｇ　 Ｓ　Ａロータ、４０分間）で遠心分離し、かつ上澄液を捨てた。ペレットを１３ ｔ　ｉｆ液ＩＩ　（０，７５Ｍグアニジウム−ＨＣｌ、１％（Ｗ／Ｖ）ツイーン ４０を含有しかつ蔗糖とりゾチームとを含有しない以外は緩衝液■と同じ〕にて ９０秒間音波処理した０次いで、上記と同様に３０分間遠心分離した、得られた ベレットを８５−１の緩衝液１（１００ｍＭ燐酸ナトリウム；　３Ｍ　ｇ　ｕ　 ＨＣＩ　Ｈ１０ｒｎＭ　２−メルカプト１り）−ル；１ｍＭ　ＥＤＴＡ；ｐｌ（ −７，０）に熔解させた。この溶液を上記と同様に３０分間遠心分離し、かつ上 澄液を超遠心分離に４０．００Ｏｒ　ｐ　ｍにて１時間かけた（べ７クマンＴｉ −４５型ロータ）、超遠心分離からの上澄液をセファクリルＳ−２００（５，Ｏ Ｘ８７ｃｍ）のカラムに施こし、このカラムは予め緩衝液■で平衡化させた。ゲ ル濾過クロマトグラフィーの流速を７０ａ＋１／ｈに維持し、かつ１７ｍ１のフ ラクションを集めた。蛋白の分画をＡ２８０ｎ　ｍおよびＳＤＳゲル電気泳動に よって監視した（１２．５％アクリルアミド、クーマシー青染色により可視化し た蛋白）。 少なくとも８０％純度のｈＧＭ−Ｃ３Ｆを含有するＳ−２００カラムからのフラ クションを集め、かつ０．２５■／ｍｌ（７０８ｍｌ）の蛋白濃度まで緩衝液Ｉ Ｖ（１５ｍＭ燐酸ナトリウム；３Ｍ尿素、　ｐＨ＝　７．５３で希釈した。この 物質を、希釈緩衝液に対し、２−メルカプトエタノールの濃度が蛋白濃度の２５ ％未満になるまで透析した。さらに、最初の透析に際し、弗化フェニルメチルス ルホニル（０，５ｍＭ）を含ませて蛋白分解を防止した。 ＤＴＮＢを用いてＭ離スルフヒドリル基に関する分析を介して蛋白の酸化を監視 し、その間同じ緩衝液に対する透析を続けた。これらの条件下で減少する物質の 半減期は約４時間であると判明した。したがって、酸化は１８時間後に約９５％ 完結した。次いで、この物質を５倍容量の３０ｍＭ燐酸ナトリウムを含有するｒ ｉ街重液ｐＨ−７，５）に対して２回透析した。得られた溶液を遠心分離しく３ ０　ｍ　ｉ　ｎ、　１０．４００ｘ　ｇ）、かつ上澄液を２３０ｍｔまで濃縮し た。 濃縮液を再び上記と同様に遠心分離し、かつ上澄液を予め３０ｍＭ燐酸塩緩衝液 （ｐＨ＝　７．５　）で平衡化させたファースト・フローＱ　（２，６Ｘ　１５ 　ｃｍ）のカラムに施こした。このカラムを、流出液の吸光度（２８０ｎｍ）が ０になるまで同じ緩衝液で洗浄した。次いで、カラムを燐酸ナトリウムの濃度勾 配（３０〜１３０ｍＭ、６００Ｘ６００ｎ＋１）で展開させた。 ｈ　Ｇ　Ｍ　ＣＳ　Ｆを含有する１５ｍ１のフラクションを、５ＤＳ−ゲル電気 泳動によって最も純粋な生成物につき分析した。 これらのフラクションを集めかつ１０＋ｎｌまで濃縮した。 濃縮した物質を、３０ｍＭ燐酸ナトリウムと１３０ｍＭＮａＣ１とで平衡化させ た（ｐＨ＝　７．５　）ウルトロゲルＡＣＡ−５４（ＬＫＢ、　２．６　ｘ９０ 口）のカラムに施こした。純粋なｈＧＭ−Ｃ３Ｆを含有する５ｍｌフラクション を集めて一８０℃で貯蔵した。この精製法を用いて３０〜６０胃の純蛋白を生成 させ、これは１２．５〜２５％の収率を示す。 Ｂ、酵母において ヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆを高収率で産生させるための発現ベクターを酵母において作成 した。第９および１０図は、適当な酵母菌体を形質転換させるために使用した際 ｈＧＭ−Ｃ３Ｆを高収率で発現した発現ベクターｐ　５２８　／　１の作成方法 の一実施例を図示している。 リーダーもしくは酵母アルファ（α）接合因子の単一ペプチドを用いて、酵母で ｈＧＭ−Ｃ３Ｆを発現させた。ＭＦα１およびＭ　Ｆα２として示される２種の 遺伝子が、酵母のα接合因子をコードすると報告されている（Ｊ、クリアンおよ び１．ヘルスコライフッ、「酵母フェロモン遺伝子（ＭＦα）の構造：推定因子 先駆体は成熟α−因子の４種のタンデムコピーを含有する」、セル、第３０巻、 第９３３〜９４３頁（１９８２）；Ａ、シン等、「サツカロミセス・セルビシー はα−因子フェロモンをコードする２種の別個の遺伝子を含有する」、ヌクレイ ンク・アシ７ド・リサーチ、第１１巻、第４０４９〜４０６３頁（１９８３）） 、ＭＦα１は１６５個のアミノ酸の先駆体をコードし、α因子の４種のコピーを 含む。これらα因子反復の前に、８３個のアミノ酸よりなる分泌リーダ配列が存 在する０分泌リーグと第１反復との間、および各反復間における接合部は次の構 造を有する：（リーグもしくは反復）−１７ｓ−ａｒｇ−（ｇｌｕ／ａｓｐ−ａ 　ｌａ）　２−３−　（反復） 融合先駆体の異質蛋白部分からの分泌リーグの最適な開裂は、異質蛋白の第１ア ミノ酸を一１ｙｓ−ａｒｇ処理部位（第８図参照）の後に挿入した場合に得るこ とができる。したがって、このα接合因子の信号配列ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ融合体をベ クター中に使用した。 １、発現ベクター 発現ベクターを作成するため、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆをコードする２種の異なる遺伝子 を用いた。プラスミドｐ　２１０”に存在した遺伝子１はｈＧＭ−Ｃ５Ｆをコー ドするＵ９３７−誘導ＤＮＡ配列を特徴とし、これはそのコード領域の５′末端 が合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ配列もしくはリンカにより改変されている（第 ６図）、プラスミドｐ２０８に存在した遺伝子２は、未改変のｈＧＭ−ＣＳＦコ ード化配列配列当する。 組換え分子における第１ｈＧＭ−Ｃ３Ｆコドンの前の位置にＮｃｏ１部位を挿入 するために、ｐ２０８をムエｔＩで切断し、次いでこれをＢａ１３１で処理した ０次いで、切断配列をＢａｍＨＩで制服し、かつ小さい方の異質断片を分離した （ＰｓｔｌはｈＧＭ−Ｃ３Ｆコ一ド配列の上流に位置し、■で切断し、かつｄＮ ＴＰを充填した（Ｎｃｏ１部位は合成リンカの開始部を標識する）０次いで、こ の配列をＢａｍＨＩで制激し、かつ大きい断片を分離した。ｐ２ｏｓから採取し た異質の小さい断片（ｈＧＭ−Ｃ３ＦをコードするＤＮＡ配列を含む）を、ｐ２ １０’から採取した大きい方の断片（発現ベクターの残部を含有する）に挿入す ることにより、１群の組換えプラスミドを作成した（第９図参照）、１種の選択 プラス゛ミドにおいて、この結合はｈＧＭ−Ｃ３Ｆコ一ド配列の開始部にＮｃｏ Ｉ部位を再構成した。 これら２種のＧＭ−Ｃ５Ｆプラスミド（ｐ２０８　Ｂａ１３１およびｐ２１０　 ）をＮＣ０Ｉで切断し、かつＳ１ヌクレアーゼで処理した（第１０図参照）０次 いで、プラスミドをＨｉ　ｎ　ｄ　ｍによって切断した。原ｈＧＭ−Ｃ３Ｆコー ド化配列を含有する小さい方の断片（２０８８ａ１３１の場合）もしくは合成リ ンカ、並びにｈ（、Ｍ−Ｃ５Ｆ　ＤＮＡ配列の残部（ｐ２１０”の場合）を分離 した。 次いで、各ｈ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆコード化配列とｐＭＡＴＡ２１１５１の大き い方の５ｊｕｌ−）ｉｉｎｄＩＩＩＷｒ片とを含有する断片を用いて、組換えプ ラスミドｐ２１６を作成した。この断片は、Ｍ　Ａ　Ｔα１遺伝子のプロモータ と分泌リーグとを含有する。この断片を作成するため、最初にＭＦα１をコード するＤＮＡ配列を酵母のゲノム保存物から分離し、その際ＭＦα１の公知配列に したがって合成したＭＦα１先駆体（（５’　）ＧＴＡ　ＣＡＴ　ＴＧＧ　ＴＴ Ｇ　Ｇ／ＧＣＣＧ／Ａ／ＴＧＣ，（３’　））のアミノ酸９７−１０２に対応す るオリゴヌクレオチドプローブを用いた（Ｋ、Ａ、ナスミスおよびＳ、１．リー ド、「酵母における相補化による遺伝子の分離：セル−サイクル遺伝子の分子ク ローン化」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ 。 第７７巻、第２１１９〜２１２３頁（１９８０））。 ってｐＵｃ１Ｂ中へサブクローン化させた。得られたプラスミド（ｐ　２２０／ ３）をプライマ突然変異（Ｂ、Ａ、ウーストラ等、「部位指向性突然変異により プローブされたポリオーマ・ウィルス中間−Ｔ抗原の形質転換活性」、ネイチャ ー、第３０４巻、第４５６〜４５９頁（１９８３））により突然変異させて、− １ｙｓ−ａｒｇ開裂に相当する位置に５ｊｕｌ部位を導入した。さらに、独特の Ｎｃｏ１部位から出発する合成ＳＭＣＪ伝子を持った５００ｂｐＨｉｎｄＩｆｆ 断片ＣＧ。 ブエル等、「ソマトメジン−Ｃ（ＩＣＦ−１）をコードする合成遺伝子のイー・ コリにおける発現の最適化」、ヌクレイツク・フレンド・リサーチ、第１３巻、 第１９２３〜１９３８頁（１９８５））をｐ２２０／３の）（ｉｎｄＯＩ部位に 挿入した。この作成の結果、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆコ一ド化配列の第１コドン（Ａｌａ ）に結合されたＭＦα１の分泌リーグを有するプラスミド（ｐ　２１６）を得た ０次いで、ＥＣ０ＲＩ−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ断片におけるＭＦαｌ／ｈＧＭ−Ｃ５ Ｆ遺伝子融合体を、イー・コリおよび酵母に対する複製のオリジン（ｏ　ｒ　ｉ 　：複製の２オリジン）並びに両微生物に対する選択性標識（イー・コリ：β− ラクタマーゼ；酵母：ＵＲＡ３）を有する発現ベクターｐ　１６０　／　１に移 した。 ＭＦα１→−ｈＧＭ−Ｃ５Ｆ （５’　）　、、、ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＣＣ，、、（３’　）　ＭＦα １／２０８担３１１ｙｓ　ａｒｇ　ａｌａ　ｐｒ。 （５″）　、、、ＡＡＡ　ｘｃＡｔｃｃＡＣＣＡ　、、、（３’　）　ＭＦα１ ／２１０“−恒■呈開裂 組換えプラスミドｐ２１６をＥｃｏＲＩおよびＨｉ　ｎｄＩＩＩによって切断し 、かつＭＦｏ：ｌ／ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ融合体を含有する小さい断片を分離した。こ の断片を、イー・コリに対する複製のオリジンと酵母ＵＲＡ３遺伝子と２μサー クルの複製のオリジンとＡＲ３Ｉの複製のオリジン（酵母染色体とは独立して酵 母菌体で複製を可能にする自己複製配列）とＰＹＫＩ　（ＰＵＲ）の上流領域と を有する発現ベクターｐ１６０／Ｉ　（Ｄ、Ｔ、スティンコム等、「酵母染色体 レプ第３９〜４３頁（１９７９））に移した。 ｐ２０８　Ｂａ１３１のＤＮＡ配列（すなわち、標準ｃＤＮＡ配列）を用いて得 られたプラスミドを、プラスミド５２　Ｂ／１と命名した。ｐ２１０”のＤＮＡ 配列（すなわち、５′改改変列）を用いて得られたプラスミドを、プラスミド５ ２５／２と命名した。さらに、第３の発現プラスミドータがｐＭＡＴＡ２１１５ １のＭＦα１プロモータを置換しかつ高コピー数ベクター（ＪＤＢ２０７）を基 礎ベクターとして使用した（Ｊ、Ｄ、ベッグス、「多重コピー酵母ベクター」、 モレキュラ・ジェネティソクス・イン・イースト、アルフレンド・ベンゾン・シ ンポジウム１６、Ｄ、パン・ウェットスタイン、Ｊ、フライス、Ｍ、キーランド −プラントおヨヒステンデラップ編、ムンクスガルト、コペンハーゲン（１９８ １））、このベクターにおけるＬＥＵ２遺伝子の低発現は、選択培地にて増殖を 可能にするには形質転換体における高コピー数を必要とする（Ｅ、エアハルトお よびＥ、Ｐ。 ホーレンベルク、ジャーナル・バタテリオロジー、第１５６巻、第６２５〜６３ ５頁（１９８３））。 ２、発現の結果 ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ発現プラスミドをサツカロミセス・セルビ二３）（Ｅ、ジョーン ス、カーネギ−メロン大学から入手〕に形質転換させた。この形質転換体をｒＳ ＤＪ培地（Ｆ、ジャーマン等、「メソフズ・イン・イースト・ジェネティクソス 」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ ハーバ−１Ｎ、Ｙ、（１９８１））で増殖させ、この培地はトリプトファンおよ びロイシン（プラスミドｐ５２５／２およびｐ　５２８／１）またはトリプトフ ァンおよびウラシル（ｐ５４５／１）を含有し、増殖は２の光学密度（６００＋ ｎ）まで行なった。これらの培養物を用いて、４％カザミノ酸とトリプトファン とを含有するＳＤ−培地よりなる「産生培地」に接種した（接種量は産生培地の 最終容積の１０％とした）、増殖の間の適当な時間間隔にて０．５ｍｌの培養物 を微小遠心分離器でペレット化させ、次いで菌体ペレットをＳＤＳ試料緩衝液中 で５分間煮沸することにより初期培養容積の１７１０に再溶解させた（Ｕ、に、 レムリ、「バクテリオファージＴ４のヘッドを結合させる際の構成蛋白の開裂」 、ネイチャー、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０））、次いで、産生 した蛋白をニトロセルロースにブロア）し、かつｈＧＭ−Ｃ５Ｆに対する抗体で プローブしくウェスタンプロット技術）またはコンカナバリンＡでプローブした （Ｊ、Ｃ，Ｓ、フレフグ、「コンカナバリンＡおよびペルオキシダーゼを用いる 電気泳動分離した蛋白混合物のニトロセルロース移動におけるグリコ蛋白の検出 ：アレナウイルスおよびフラボウィルス蛋白に対する使用」、アナリチカル・バ イオケミストリー、第１２７巻、第３８９〜３９４頁（１９８２））。 実現された絶対的発現レベルは次の通りであった（ｏＤ６０ｏ、ｒＬＷＬｌｏに おける測定）　（ｍｇ／ｊり　ニブラスミド　培地　菌体 ｐ５２５／２　１０　５ ｐ５４５／１　２０　８ ｐ５２Ｂ／１　＜　０．１　＜　０．１５′改変ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を使用し た２種の構造のみが高レベルのｈ　Ｃ，Ｍ　−ＣＳ　Ｆを発現したが、天然ｃＤ ＮＡ配列を用いた構造は発現しなかったという事実は、分泌先駆体をコードする ｍ　ＲＮ　Ａの構造が遺伝子発現に顕著に影響を及ぼすことを示している。恐ら く、ｐ５２８／１におけるｍＲＮＡの望ましくない構造は、その翻訳を著しく阻 害する。 この作用は、細菌発現におけるＡＴＧ開始コドンの近傍におけるｍＲＮＡ二次構 造の観察された作用〔ブエル等、上記〕とは相違している。何故なら、プラスミ ドｐ５２５／２およびｐ　５４５　／　１でコードされたｍＲＮＡにおける改変 ＤＮＡ範囲が、２４０塩基対によりＡＴＧ開始コドンから分離しているからであ る。 上記結果から示されるように、産生された全ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの７０〜８０％が培 地中に分泌される。この分泌されたｈＧＭ−ＣＳＦは３種の主たる形態で生じた ：（ａｌ　非グリコジル化型（１４，５ｋ　ｄ　）　、この形態は全分泌ｈＧＭ −ＣＳＦの約１０％を占める。この分子の寸法はグリコジル化されていない原ｈ ＧＭ−ＣＳＦに正確に一致し、これは分泌リーグが正確に処理されてＡｌａ　Ｐ ｒｏで開始するｈＧＭ−ＣＳＦを生成することを示している。 （ｂｌ　低分子量のグリコジル化型（１８ｋｄ）、この形態は全分泌ｈ（１，Ｍ −Ｃ３Ｆの５％までを占める。原ｈＧＭ−ＣＳＦはグリコジル化されている。ｈ ＧＭ−Ｃ５Ｆ蛋白配列は、Ｎ−結合のグリコジル化に関する２つの潜在的部位を 有する〔ウオング等、サイエンス、第２２８巻、第８１０〜８１５頁（１９８５ ））。１８ｋｄ型の寸法は両潜在的グリコジル化部位のそれぞれに結合した２個 のコアグリコジル側鎖の存在、或いは一方のみのグリコジル化部位に結合した延 長コアグリコジル連鎖の存在のいずれかに一致した。 （Ｃ１高分子量のグリコジル化型（約４３ｋｄ）、この形態は全分泌ｈＧＭ−Ｃ ＳＦの８０〜９０％を占める。 上記グリコジル化ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ型のエンドグリコシダーゼＨによる処理はその 分子量を約１４．５ｋ　ｄまで低下させ、このことは全グリコジル側鎖が蛋白骨 格にＮ−結合したことをびに高コピーベクター（発現プラスミドｐ５４５／１） の使用は、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現を約２倍向上させた。しかしながら、培地におけ るグリコジル化型の量は増大したが、培地における非グリコジル化型の増加は観 察されなかった。寧ろ、２〜３倍多い非グリコジル化型ｈＧＭ−Ｃ３Ｆは菌体結 合し°ζおり、このことは熔解性が培地におけるｈＧＭ−Ｃ３Ｆの量を制約しう ろことを示している。 ｈＧＭ　Ｃ３Ｆを産生する酵母菌体の培養物の上澄液を、生物学的活性につき試 験した。上記骨髄クローン分析において、酵母分泌したｈＧＭ−Ｃ３Ｆは投与量 に依存してコロニー形成を刺戟した。同様に、上記ＣＭＬ分析は酵母産生される ｈＧＭ−Ｃ３Ｆに対し投与量依存性の反応を示した。 天然ｈＧＭ−Ｃ３Ｆは分子量約２２ｋｄのグリコ蛋白であることが知られている ＣＧ、Ｇ、ウオング等、サイエンス、第２２８巻、上記〕。ポリペプチド鎖には 位置２７および３７に２個のアスパラギン残基が存在し、これらはＮ−結合グリ コシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／５ｅｒ）に対する潜在的部位である。したがっ て、組換え技術で産生したｈ　ＧＭ−ＣＳ　Ｆは動物細胞で産生されかつグリコ ジル化されて生物学的に活性となると思われた。ｈＧＭ−Ｃ３Ｆを細菌菌体で産 生させる場合には、第２のグリコジル化工程が活性を付与するのに必要であると 思われた。この推定に反し、非グリコジル化ｈＧＭ−Ｃ３Ｆはグリコジル化ｈＧ Ｍ−Ｃ５Ｆよりも予想外に高い比活性を有することを突き止めた。すなわち、こ の種の非グリコジル化ｈＧＭ−Ｃ３Ｆは本発明の重要な部分である０本明細書に 示したように、これらのｈＧＭ−Ｃ３Ｆは少なくともｌＸｌ０”単位／■の比活 性を有する。 この種の脱グリコジル化したｈｃＭ−ｃｓｍは、数種、の方法で産生ずることが できる。たとえば、これらは産生ずる蛋白をグリコジル化しないような細菌菌体 において産生させることができる。たとえば、ポリペプチド鎖がイー・コリによ って産生される場合、これは結合炭水化物を含有せず、かつ１４．５ｋ　ｄの分 子量を有する。 さらに、これらの非グリコジル化ポリペプチドは、酵母もしくは動物細胞で産生 された蛋白を脱グリコジル化しても産生させることができる。たとえば、上記の ように（ｏｎＡ−クロマトグラフィーおよびゲル濾過を用いて酵母菌体で産生さ せたｈＧＭ−Ｃ５Ｆの高分子量フラクション（ＭＷ５０〜７０ｋｄ）を分離した 。さらに、トランスフェクトした支那ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を１０％胎 児牛血清含有培地で３日間増殖させることによりｈＧＭ−Ｃ３Ｆを動物細胞で産 生させた。Ｕ９３７菌体から分離したｈＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を有するベクターに よりトランスフェクトして誘導したＣＨＯ−細胞クローンを用いた。転写は、Ｓ Ｖ４０の早期およびアデノウィルスの主後期プロモータで促進させた。遺伝子増 殖はメトトレキセート選択で行なった。免疫−およびレクチン−クロマトグラフ ィーに続くゲル濾過によって、高分子量フラクション（ＭＷ２６〜３０ｋｄ）を 分離した。 次いで、分離したフラクションをエンド−およびエキソ−グリコ゛シダーゼの混 合物で脱グリコジル化した。高分子量フラクションの脱グリコジル化は、免疫プ ロットによって確認された。切断フラクションは、イー・コリ産生したｈＧＭ− Ｃ３Ｆにつき観察された分子量（すなわち１４．５ｋ　ｄ　）に近い分子量の低 下を示した。 競合放射免疫分析（ＲＩＡ）を用いてｈＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子度を測定し、その際 トレーサとしてｌ　ＩＺ’５　標識したイー・コリ誘４ｈＧＭ−Ｃ５Ｆと、スタ フィロコッカス・アウレウス菌体に固定された抗ｈＧＭ−Ｃ３Ｆとを用いた。続 いて行なったＣＭＬおよびＢＭＣ＊髄分析は上記した通りである。 脱グリコジル化分析の結果を下記第１表に要約する：Ａ、＠乳動物ｈＧＭ−ＣＳ Ｆ 切断前　２３０ｎｇ　／＋ｎｌ　Ｏ，４ＸＩＯ’　Ｕ　／ｍｇ　Ｏ，２Ｘｌ０３ Ｕ　／＋ｎｇ切断後　６００ｎｇ　／ｍｌ　３．２　ＸＩＯ’　Ｕ　／ｍｇ　２ ．３　ＸＩＯ”　Ｕ　／ｍｇＢ、酵母ｈＧＭ−Ｃ５Ｆ 切断前　０．０５ｍｇ／　ｍｌ　１．２　Ｘ　１０’　Ｕ　／ｎｖ　０．２５Ｘ 　１０”　Ｕ　／ｎｖ切断後　０．２０ｒｇ１０＋１　９．５　ＸＩＯ’　Ｕ　 ／ｍｇ　３．８　ｘｌＯ”　Ｕ　／１ｇＣ，イー・コリｈＧＭ−ＣＳＦ −２Ｘ１０”Ｕ／■　１．８　ｘ　１０’　Ｕ　／■これらの結果は、炭水化物 を全く含まずに産生したイー・コリ誘導のｈＧＭ−Ｃ３Ｆまたは脱グリコジル化 した酵母もしくは動物細胞誘導のｈＧＭ−Ｃ３Ｆが、グリコジル化された天然ｈ ＧＭ−ＣＳＦよりも臨床用途に対し優れていることを示している。 本発明の方法で作成した微生物および組換えＤＮＡ分子は、西ドイツ・ゲッチン ゲンＤ−３４００・グリシエバッハシュトラッセ８在のドイツチェ・ザンムルン ク・ホン・ミクロオルガニスムに１９８５年９月２日付けで寄託しかつＢ８４゜ Ｂ８５．Ｂ１０２およびＹＥ４６４として同定された培養物、並びに１９８６年 １０月４日付けで寄託しかつＢ１１１（ｐ２４１−８）として同定された培養物 により例示される。 Ａ、イー・コリ　Ｋ１２　（ｐ２１０ネ）Ｂ、イー・コリ　５Ｇ９３６　（ｐ２ １０”）およびｐｃ１Ｃ，イー・コリ　Ｋ１２　（Ｐ２１０”−５６３７）Ｄ、 酵母菌株　Ｓ、セルビシーＢＪ１９９１　（ｐ５２５／２）Ｅ、イー・コリ　Ａ ８９　（ｐ２４１）ＤＳＭ３４７４．ＤＳＭ３４７５．ＤＳＭ３４６５およびＤ ＳＭ３８６９が付与されている。 以上、本発明の多数の実施例につき説明したが、この基本構成を改変して本発明 の方法および組成物を使用する他の実施例を提供することもできる。したがって 、本発明の範囲は上記に例示した特定実施例のみに限定されず、寧ろ請求の範囲 により規定すべきであることが了解されよう。 ａ、（Ｌ　ｏｌａ　ｐｒｏ　ａｌｏ　ａｒｇ　ｓｅｒ　ｐｒｏ　ｓａｒ　ｐｒｏ 　ｓｅｒ　ｆｈｒ　ｇｌｎＯ，口、　９ｒｏ　ｌｒｐ　９１ｕ　ｈｉｓ　ｖｏｌ 　ａｓｎ　ｏｌｏ　ｉｌｅＭＦｃｃｌ　ｈＧＭ−Ｃ５Ｆ 手続補正書彷力 昭和６３年　２月２日

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト顆粒球−マクロファージコロニーの刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）一様ポ リペプチドをコード化するＤＮＡ配列から成る組換型ＤＮＡ分子において、ポリ ペプチドをコード化する前記ＤＮＡ配列は５′末端変更を特徴としかつ分子中の 発現制御配列に作用的に結合され、前記変更はｈＧＭ−ＣＳＦをコードする自然 ＤＮＡ配列よりも高い収率で前記ポリペプチドを生産させる組換型ＤＮＡ分子。
2. ２．５′変更は、式：【配列があります】、及び【配列があります】からなる配 列から選択される請求の範囲第１項記載の組換型ＤＮＡ分子。
3. ３．前記発現制御配列は、ｌａｃシステム、β−ラクタマーゼシステム、ｔｒｐ システム、ｔａｃシステム、ｔｒｃシステム、ファージλの主オペレータ並びに プロモータ部位、ｆｄコート蛋白、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他のグ ルコース分解酵素、リン酸塩のプロモータ、イーストα−交配因子、及び原核生 物又は真核生物の微生物細胞並びにこれらのウイルス及びこれらの組合せからな る遺伝子の発現を制御する他の配列から成る群から選択される請求の範囲第１項 又は第２項記載の組換型ＤＮＡ分子。
4. ４．ｐ２１０＊、ｐ２１０＊−５６３７、ｐ２４１−８、ｐ５２５／２、及びｐ ５４５／１から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の組換型ＤＮＡ分子 。
5. ５．請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換型 ＤＮＡ分子で転換された微生物宿主。
6. ６．イー．コリＳＧ９３６、イー．コリＳＧ９３５、イー．コリＳＧ９２８、イ ー．コリＳＧ９２７、イー．コリＡ８９及びｌｏｎ変異株でありかつ低レベルの ｌｏｎプロテアーゼの生産で特徴ずけられる他のイー．コリ株から成る微生物宿 主の群から選択される請求の範囲第５項記載の微生物宿主。
7. ７．微生物がサッカロミケスセレビシエ（ＢＪ１９９１）である請求の範囲第５ 項記載の微生物宿主。
8. ８．請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の組換型ＤＮＡ分子で転換 された微生物宿主を培養する工程から成るヒト顆粒球−マクロファージコロニー の刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）一様ポリペプチドの製造方法。
9. ９．前記ｈＧＭ−ＣＳＦ一様ポリペプチドは式：【配列があります】、 【配列があります】 を有するポリペプチドから選択され、かつＤＮＡ配列により遺伝情報を指定され たポリペプチドはｈＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列の５′末端変更により 特徴ずけられ、前記変更はｈＧＭ−ＣＳＦをコードする自然ＤＮＡ配列よりも前 記ポリペプチドを高い収率で生産させる請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．微生物宿主はイー．コリＳＧ９３６、イー．コリＳＧ９３５、イー．コリ ＳＧ９２８、イー．コリＳＧ９２７、イー．コリＡ８９及びｌｏｎ変異株であり かつ低レベルのｌｏｎプロテアーゼの生産で特徴ずけられる他のイー．コリ株か ら成る群から選択される請求の範囲第８項記載の方法。
11. １１．微生物宿主がサッカロミケスセレビシエ（ＢＪ１９９１）である請求の範 囲第８項記載の方法。
12. １２．ポリペプチドが少なくとも１×１０８単位／ｍｇの比活性を有するグリコ シル基化されないｈＧＭ−ＣＳＦ一様のポリペプチド。
13. １３．前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で転換された細菌宿主を培養す る工程から成る方法により生産された請求の範囲第１２項記載のｈＧＭ−ＣＳＦ 一様のポリペプチド。
14. １４．前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で転換された真核生物宿主を培 養する工程から成る方法で生産された請求の範囲第１２項記載のｈＧＭ−ＣＳＦ 一様のポリペプチド。
15. １５．請求の範囲第８項〜第１１項のいずれか１項に記載の方法により生産され かつ顆粒球とマクロファージの生成を刺激するのに有効な量のポリペプチドと薬 学的に許容される担体とから成る薬剤組成物。
16. １６．請求の範囲第１２項〜第１４項のいずれか１項に規定されかつ顆粒球とマ クロファージの生成を刺激するのに有効な量のｈＧＭ−ＣＳＦ一様のポリペプチ ドと桑学的に許容される担体とから成る薬剤組成物。
17. １７．免疫弱化したヒトを請求の範囲第１５項又は第１６項に規定の薬剤組成物 で治療する過程から成る通性感染の可能性を削減する方法。