PT84849B - Processo para a producao de interleuquina-2 humana mediante expressao reforcada em celulas de mamiferos - Google Patents

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PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE INTERLEUQUINA-2 HUMANA LTEDIAN TE EXPRESSÃO REFORÇADA EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS

O desenvolvimento dos orocessos de DNA recombinante, que são muitas vezes referidos como engenharia genética ou união genéticol, tornaram possível a produção de uma larga variedade de produtos biológicos. Nos processos de DNA recombinante, sequências de DNA específicas são inseridas num veículo de DNA apropriado, ou vector, para formarem moléculas de DNA recombinante que se podem replicar em células hospedeiras. Moléculas de DNA de dupla cadeia circular chamadas plasmídeos são frequentemente utilizadas como vectores e na preparação de tais formas de DNA recombinante impõem a utilização de enzimas endonucleases de restrição que podem cortar o DNA em sítios específicos da sequência de bases. Métodos gerais para a preparação de tais moléculas de DNA recombinante foram descritos por Cohen et al. /U.S. ostente NS 4.237.2247, Collins et al. /ft.S. patente N2 4.304.863/ e Maniatis et al /Molecular Cloning : A Lãboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Lãboratory/.

As moléculas de DNA recombinante podem ser utilizadas para produzir o produto codificado pela sequência genética inserida, apenas se um número de condiçoes forem

- 2 observadas. 0 primeiro requesito consiste em que a molécula recombinante seja compatível com, e portanto capaz de uma replicação autónoma na célula hospedeira. Trabalhos muito recentes têm utilizado a bactéria Escherichia coli (E. coli) como organismo hospedeiro porque é compatível com uma larga variedade de plasmídeos recombinantes dependendo do vector/ /sistema de célula hospedeira utilizado, a molécula de DNA recombinante é introduzida no hospedeiro por meio de transformação, transducçao ou transfecção.

A simples inserção de um vector recombinante numa célula hospedeira não pode por si só assegurar que quantidades significativas do produto genético desejado sejam produzidas. Para que isto ocorra, a sequência genética estranha tem de ser fundida numa relação apropriada a uma região sinal de um vector chamado promotor. Alternativamente, o DNA estranho pode transportar o seu próprio promotor tanto quanto ele seja reconhecido pelo hospedeiro. Qualquer que seja a origem, um promotor é uma sequência de DK que está situado a montante de ou por outras palavras na região 5* do gene estranho que deve ser expresso. Esta sequência dirige a ligação de RNA polimerase e, portanto, promove a transcrição de DNA oara o RNA mensageiro (mRNA).

Dada a forte promoção que pode fornecer grandes quantidades de .mRNA, a máxima produção do produto genético desejado depende da eficácia da tradução do mRNA nara a. proteína, Isto, por sua vez, está dependente da eficácia da ligação ribossomal ao mRNA e da. estabilidade do mRNA dentro da célula hospedeira-Em células eucarióticas, os factores que dirigem a eficácia da tradução são pouco compreendidos

- 3 mas parecem incluir uma sequência de ácidos nucleicos favoráveis rodeando um codão AUG que inicia a tradução /Kozak Cell 44 : 283 (1986)/. Factores que afectam a estabilidade do mRNA, que são ainda pouco compreendidos quer em células procarióticas quer eucarióticas, também são críticos para a quantidade de produção de proteína que iode ser obtida.

A maior parte dos trabalhos no campo da recombinação genética até ao presente têm sido focados na utilização de sistemas de expressão bacterianos tais como o E. coli.. Contudo, a utilização de células bacterianas tem aspectos numerosos indesejáveis. Por exemplo, muitas proteínas e polipeptidos produzidos no E. coli acumulam-se no espaço periplásmico. A recolha destes produtos genéticos, portanto, requere a destruição das células, um processo que é ineficaz e que conduz a problemas sérios de purificação, para que o produto desejado deva ser purificado dos numerosos outros constituintes celulares do E. coli. Também as bactérias não podem conduzir a glicosilação que é necessária para completar a síntese de muitos produtos genéticos de interesse, Além disso, as bactérias podem não ser capazes de formarem ligações de sulfuretos específicas que sao essênciais para a conformação e actividade biológica adequada de muitas proteínas eucarióticas.

Para objectar a estas deficiências dos sistemas de expressão bacterianas, a atenção dos técnicos de genética dirigiu-se insistentemente para a utilização de células hospedeiras eucarióticas para a expressão de moléculas de DNA recombinantes. Células como as células de levedura e células de mamífero podem segregar produtos genéticos desejados em meios de cultura e podem realizar os processos de glicosilaçáo essenciais. Além disso, ainda que a utilização de células de mamíferos para colonagem e expressão de moléculas de DNA recombinantes também ponham numerosos obstáculos técnicos, têm que ser superados, por exemplo, os plasmidos endógenos que têm demonstrado serem tão úteis nas bactérias não sao replicados por células eucarióticas mais evoluídas. Como resultado, têm que ser tomadas outras vias.

Uma via tem sido a utilização de células eucarióticas de levedura inferior, por exemplo, Saccharomices cerevisiae, que se podem desenvolver e manipular com a mesma facilidade do E. coli. Comercializam-se sistemas de clonagem de leveduras.Através da utilização de tais sistemas consegiu-se a expressão eficaz em levedura de um gene de interferao humano /litzeman et al., Nature (London) 293 í 717 (1981)/. Contado genes de interferão não contêm intrões. Desde que se verificou que células de levedura não transcrevem correctamente pelo menos um gene de mamífero heterólogo que não contenha introes, nomeadamente gene de /3 -globulina de coelho /3eggs et al., Nature (London) 233 : 835 (1980)/, a presença ou a ausência de introes foi levada em consideração quando se utilizaram células de leveduras como hospedeiras para a expressão de genes de mamíferos.

Numa outra via, têm sido inseridos genes estranhos em células de mamíferos por meios directos. O que foi realizado, por exemplo, por meio de co-precipitação com fosfato de cálcio de genes clonados, 0 que permite que cerca de 1 a 2% de células nossam ser geralmente induzidas para apreenderem 0 DNA. Um nível tao baixo de rendimento, contudo,

ί ” produz apenas uma taxa verdadeiramente reduzida da expressão do produto genético desejado. Quando se encontram células de mamífero que na o possuem o gene da timidina quinase (células tk), podem-se obter melhore? resultados utilizando-se a co-transformaçâo com o gene t k seguido por desenvolvimento sob condições selectivas. As células tk não podem desenvolver-se em meio de hipoxantina-aminonterina-timidina (HAT). Elas podem recuperar esta actividade enzimática perdida pcc apreensão de DNA exogeno que contenha um gene tk (tal como o DNA do vírus do herpes simplex) através da co-precipitaçao com fosfato de cálcio. Outras moléculas de DNA ligadas de um modo covalente ao DNA tk ou apenas misturadas com ele também podem ser incorporadas pelas células e co-expressas freauentemente /ver Scangos et al., Gene 14 : 1 (1931/7.

Numa terceira via os genomas virais foram utilizados como vectores para a introdução de genes estranhos em células de mamífero. Têm sido descritos os vectores baseados no vírus Simian 40, vírus de napilloma e genomas de adenovirus /ver P.W.J. Rigby, Expression of Cloned Genes in Eukaryotic Cells Using Vector Systems Derived J?rom Virai Replicons” em Genetic Engineering, vol. 3, R. Williamson, ed., Academic Press, New York, po. 83 - 141 (1982) para uma revisão/. Estes sistemas de vectores, contudo, sofrem do inconveniente de uma escala de células hospedeiras limitada. Além disso, a roplicação virai nestes sistemas conduzem à, morte da célulr hospedeira. A utilização de elementos de controlo de DNA retroviral apenas impede alguns dos inconvenientes destes sistemas de vectores virais. Gorman et al., /Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 79 - 6777 (1982)/, demonstra/

ram, por exemplo, oue o Long Terminal Repeat” (LTR) dos vírus do sarcoma de rous é um forte promotor e pode ser introduzido em diversas espécies de células, incluindo as células de rim de macaco CV-1, fibroblastos de embrião de frango, células de ovário de hamster Chinês, células Hela e células de murganho NIH/3T3 por meio de transfecção medida por ΡΝΛ,

A evidência para a regulação da expressão genética por sequências não codificadoras 3’ e 5’ que representam as sequências directamente antes e respectivamente depois da sequência codificadora de um gene foi posta em evidência por meio de um estudo de onccgenes e cfe mRNAs de células eucarióticas elevadas. Os efeitos da eliminação ou modificação destas sequências na exoressao genética nestas células foi, por isso, observada. Por exemplo, Treisman /Cell 42:889 (19851/ estudou a acumulação de RNA c-fos após estimulação por soro de fibroblastos de murganho em que um gene c-fos humano clonado (homólogo celular do gene transportado pelo

T.T vírus do osteossarcoma de murino FBJ. designado c-fos-) fora transfectado. Vulgarmente a estimulação por soro por tais células provoca um forte mas transitório aumento do mRNA c-fos que atinge o máximo entre 10 a 15 minutos e em seguida decresce rapidamente, atingindo níveis de pré-estimulação entre um período de 1 a 2 horas devido à rápida degradação do mRNA.

Quando as sequências fIanqueadoras 5’ c-fos- sao fundidas com genes heterologos na ausência de sequências flanqueadoras 3’ c-fos— normais, contudo, os genes resultantes ainda são induzíveis por factores do soro mas o mRNA assim produzido persiste até 4 horas a seguir à estima- 7 -

laçao do soro. Experiências com unidades de transcrição hibridas mostraram que apenas os genes c-fos~ que contêm a extremidade 3’ e as regiões 3’ não codificadoras, mostram uma degradação típica do mRKA a seguir à estimulação_t Pode portan to ser que as sequências c-fos 3* actuem para desestabilizar o RNA que as contêm. A eliminação ou modificação destas sequências podem ter um efeito positivo sobre a expressão genética.

‘.'aior evidência para um papel regulador das sequências não codificadoras 3’ obteve-se a partir do estudo de Simcox et al., /ílol. Cell. Biol. 5 ? 3397 (1935/7 no sistema proteico de choque térmico”. Quando deslocada do seu

Λ ambiente de desenvolvimento para uma temperatura, de 37 C» a Drosophila melsnogaster rapidamente produz um certo número de proteínas de choque térmico, entre as quais existe uma proteína principal designada por hsp 70, A mudança de temperatura induz ao aumento na produção de RNAs. A seguir ao retorno para temperaturas de desenvolvimento normais, a transcrição do gene hsp 70 é rapidamente renrimida e os níveis do mRiíA correspondente decrescem rapidamente, portanto termina;, rapidamente a produção de mais proteína hsp 70. Simcox et al., en controu, contudo, que a rápida repressão da síntese da proteína hsp 70 após libertação proveniente do choque térmico é retardada quando foram anuladas sequências 3’ o que sugere que as sequências 3’ normalmente actuam para, desestabilizar o mRNA 70 hsp após a descida da temperatura.

Torna-se evidente que também se obteve uma função reguladora de mRNA para as sequências não codificadoras 5'. Butnick et al. /mol.Cell. Biol. 5 i 3009 (1985)7, mostraram que uma sequência nao codificadoTea 5’ que contenha /

cerca de 550 nucleótidos (designada exão 1) de um gene c-myc humano (o homólogo celular do vírus oncogénito da mielocitomatose das aves) afecta a expressão de plasmídeos que transportam aquele gene nas células de rim de macaco cvl transformadas com um vírus Simian 40 de origem imperfeita (designados células COS). Transcrições de plasmídeos em que as sequências não codificadoras 5’ do gene c-myc que fora anulado foram encontradas num nível elevado de estado estacionário como se fossem transcritos a partir de plasmídeos que transportam o gene intacto, sugerindo que as sequências não codificadoras 5’ de uma certa maneira actuam para estabilizar o mRNA correspondente.

Noutro estudo, Rabbits et al. /ÉNBO J.

: 3727 (1985)7, demonstraram que a truncagem de exão 1 de um gene c-myc provoca um aumento na estabilidade do mRNA c-myc nas células ÇOLú 320. De um modo semelhante, Eick et al. /SlffiO J. 4 : 3717 (1985)7 demonstraram que mRNAs c-myc produzidos em células de linfoma de Burkitt são muito mais estáveis do que o gene c-myc correspondente que contém uma translocação no exão 1.

As referências citadas antes sugerem todas as regiões não codificadoras 5’ e 3' de uma variedade de genes, podem de certa forma, produzir uma instabilidade nos correspondentes mRNAs transcritos destes genes. Uma anulação ou alteração destas regiões nao codificadoras nestes casos produz um aumento da estabilidade do mRNA e, portanto, um aumento em todo o nível da expressão genética. Além disso, o efeito da modificação ou anulação de tais sequências, nao codificadoras, na expressão genética nao pode ser previsível !

k__ com segurança.

Por exemplo, Johansen et al. /Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A. 81 : 7698 (1984)7 variaram o comprimento da região líder não codificadora 5’ .num sistema de vector recombinante que continha elementos de controlo genético fundidos com o gene de galactoquinase da Escierichia coli (galk). A variação no comprimento da região não codificadora não teve efeito na expressão do galK. Similarmente, Katz et al. /Mol. Cell. Biol. 6 : 372 (1986)7, introduziram anulações e substituições no líder não traduzido 5’ de mRNAs retrovirais de aves. Geralmente estas anulações ou substituições causam um decréscimo substancial na expressão do gene env. Estes decréscimos na expressão, contudo, não são devidos às reduções no número de moléculas de mRNA. Pensa-se que em vez disso que as alterações nas regiões não codificadoras provocam ura tradução deficiente que conduz à total redução da expressão.

A interleuquina-2 (IL-2) consiste numa proteína solúvel capaz de modelar a reactivida.de dos linfócitos e promover a cultura in vitro a longo prazo de antigéneos específicos de linfócitos-T. Anteriormente, isolou-se II-2 principalmente a partir de fracções sobrenadantes de culturas mitogeãiicas de células de mamíferos estimuladas. Por exemplo, Morgan et al. /Science 193 í 1007 (1976)7 e Ruscetti et al. /J. Immunol. 119 · 131 (1977)7 recuperaram IL-2 de fracções sobrenadantes reunidas de fito-hemaglutinina normal (PHA) de linfócitos humanos estimulados, enquanto Gillis et al. /Nature 268 : 154 (1977)7 utilizou células de baço de murganho DBA/2 normais estimuladas com concanavalina

A como uma fonte de proteínas. Mais recentemente, Stern (patente de invenção norte americana, N2 4 490 2897, descreveu e utilização de células malignas humanas induzidas como fonte de IL-2.

Também foram feitos esforços para produzir II-2 através da utilização de uma metodologia de DNA recombimnte. Por exemolo, Taniguchi et al. /Nature 302 · 305 (198317 descreveram a análise de sequências, clonagem e expressão de um DNA complementar (cDNA) que codifica para IL-2 humana preparada a partir de 3 NA mensageiro de linhas de células de leucemia Jurkat. A expressão de IL-2 foi realizada por Taniguchi etal., em culturas de cSl.ú^e· ÇQS cie macaco, ainda que os autores estabeleçam que o trabalho sobre a expressão de IL-2 utilizando-se o vector de DNA recombinante em E. Coli esteja em orogresso e que, a partir do sistema, de E. Coli será possível em breve produzir IL-2 em grandes quantidades. Após secreção pelas células corta-se uma sequência oeptídica sinal de comprimento 20 aminoácidos. A IL-2 madura é segregada nelas células sob a forma de um polipéptido com 133 aminoácidos. Para a expressão de IL-2 madura em E. Coli. tem que ser eliminada a sub-sequência que codifica a sequência peptidica sinal do gene que codifica para IL-2 por meio de metodologia de DNA recombinante, uma vez que o E. Coli não é caoaz de expelir as sequências oeptídicas sinal das eucarióticas.

Rosenberg et al. /Science 223 í 1412 (1984)7⁷ também exprimiram IL-2 em E. Coli, utilizando um gene isolado a partir de uma linha de células Jurkat. mais recentemente, Souza et al., /pedido de patente de invenção euÍ - 11 ropeia Νδ Al 136 48^7 a clonagem e expressão em microorganismos de sequências de DNA sintetizado quimicamente que compreende genes estruturais que codificam para um polipéptido que possui a sequência de aminoãcidos e as propriedades de IL-2 madura, Souza et al., também descreveram a utilização de genes sintéticos para produzir análogos de IL-2 que diferem na sequência de amino ácidos da IL-2 natural. Nos exemplos fornecidos no pedido de patente de invenção de Souza et al., 0 organismo hospedeiro é 0 E, Coli.

Barr et al., /pedido de patente de invenção internacional N9 85/O22OQ/⁷ descreveram recentemente a clonagem e expressão de um gene de 11-2 humano sintetizado quimicamente em levedura.

A presente invenção relata uma sequência de DNA que codifica interleuquina-2 humana (HI1-2) e uma sequência peptídica sinal que compreende um gene que codifica HI1-2 e uma sequência oeptídica sinal na qual as sequências não codificadoras 5’ do gene foram substituídas por sequências não codificadoras 5’ heterólogas, por exemplo, por as sequências de um gene de insulina murina, de preferência pelas sequências de um gene de pré-pro-insulina II murina. É abrangido por esta invenção a substituição adicional de nucleótidos adjacentes da sub-sequência que codifica a sequência peptídica sinal, por sequências heterólogas correspondentes, 0 que quer dizer, pelos nucleótidos da. sub-sequência que codifica a sequência peptídica sinal adjacente às sequências não codificadoras 5’ heterólogas referidas antes. No caso de nucleótidos da sub-sequência que codifica a sequência peptídica sinal serem substituídos, deve ter-se em ί

I

atenção que a cadeia de leitura do gene da HIL-2 se mantém. Além disso, a presente invenção refere-se a vectores recombinantes que compreendem uma sequência de 3NA como definida antes e uma célula de mamífero que contém a sequência de DNA ou a um vector recombinante que a incorpora. A presente invenção também se refere a um processo para a produça de interleuquina-2 humana, a interleuquina-2 humana propriamente dita obtida por meio deste processo e à utilização de interleuquina-2 humana para o tratamento e prevenção de doenças. Além disso, a oresente invenção refere-se a composições farmacêuticas que contêm a interleuquina-2 humana.

Surpreendentemente, níveis elevados de expressão do gene de HIL-2 foram obtidos através da utilização de novos vectores de clonagem e expressão em que sequências nao codificadoras 5’ naturais e os primeiros quatro nucleótidos ATG T da sub-sequência que codifica a sequência peptídica sinal do gene de HIL-2 foram substituídos pelas correspondentes sequências heterólogas do gene de insulina murino, designados pelos nucleótidos ATG GGG GTG TGG ATG G da sub-sequência que codifica a sequência peptídica sinal da pre-pro-insulina II de rato. As modificações que resultam no N-terminal do péptido sinal da HIL-2 não têm efeito no polipe^zptido de HIL-2 madura secretado a partir das células produtoras uma vez que o réptido sinal é cortado durante o processo de maturação.

A presente invenção pode ficar facilmente compreendida jor meio cia referência às figuras seguintes (não à escala) aqui incluídas.

Figura 1 consiste numa representação es-

quemática do plasmídeo PBÇ12MI, o vector de iniciação para a construção do vector de expressão de HIL-2;

Figura 2 mostra a estrutura do novo oéptido sinal N-terminal em plasmídeo ηΒ012/33ν/ΐΒ-2 e a insulina e as sequências de HIL-2 utilizadas para a, construção do plasmídeo. Sítios de ligação e restrição específicos estão sublinhados;

Figura 3 é uma representação esquemática do vector de expressão de IL-2 final; pBCl2/RSV/IL-2/dhfr; e

Figura 4 mostra a sequência nucleotídica removida do plasmídeo oBÇ4O p r mutagenese de sítio específico para a construção do nBÇ4CAj?. Os segmentos sublinhados delineam o iniciador de 24-mer utilizado para realizar a anulação que cria um novo sítio Hind III.

processo de invenção presente abrange as fases seguintes numa sequência lógicat (1) oreparaçao de uma sequência de DNA que codifica HIL-2 e de uma sequência peptídica sinal, (2) substituição de sequências não codificadoras 5’ e possivelmente nucleótidos adjacentes da sub-sequência que codifica a sequência peptídica sinal, por meio das sequências correspondentes, de preferência as sequências do gene de pré-pro-insulina II de rato, de tal forma que a cadeia de leitura da região que codifica HIL-2 é mantida, (3) transferência do vector recombinante que compreende a nova sequência de ΏΝΑ para uma célula hospedeira de mamífero apropriada, (4) amplificação do novo gene de HIL-2 e selecçao de células hospedeiras de mamíferos modificadas, e (5) identificação e purificação da HIL-2 produzida.

Tal como aqui se utiliza a designação

Γ

C ·* ”interleuquina-2 humana” ou HIL-2¹¹ significa uma proteína glicosilada que é produzida por uma célula de mamífero que foi transformada ou transfectada com uma sequência de DNA definida antes ou por uma sua modificação. A sequência de DNA codifica uma proteína que possui» (a) uma sequência de aminoãcido que é pelo menos substancialmente idêntica à sequência de aminoãcidos da interleuquina-2 humana natural e (b) uma actividade biológica que é comum à interleuquina-2 humana natural Sequências de aminoãcidos substancialmente idênticas ou diferem de um ou mais amino ácidos por alterações (anulações, adições ou substituições) que não originam uma desigualdade funcional adversa entre a proteína sintética e interleuquina-2 humana natural.

Exemplos de tais proteínas são as moléculas de interleuquina-2 descritas na patente de invenção europeia N2 82307036.2 e 85IOIO35.C, e as patentes de invenção norte-americanas N? 4.511.584 e 4.569.790. Estes polioéptidos de interleuquina-2 sa<- produzidos em sistemas bacterianos sob uma forma madura.

Uma sequência de UNA que codifica a interleuquina-2 humana e uma. sequência neptídica sinal pode ser preparada por qualquer uma das vias vulgarmente utilizadas na técnica. Ror exemplo, uma linha de células humana capaz de sintetizar HI1-2 pode ser estimulada para produzir mRNA de HI1-2 que pode servir como uma matriz para produzir cI)NA de HIL-2. Rosenberg et al., /Science 223 : 1412 (190417 uti” lizaram uma linha de células T de leucemia humana e linfócitos de sangue periférico humano normal para preparar 0 tal cDNA. Tanigushi et al., /Nature 302 t 305 (1983/7 utilizaram

células T de levedura humana para esse fim.

Alternativamente, uma vez que Tanigushi et al., descreveu a sequência nucleotídica, a sequência âe DNA que codifica para HIL-2 e uma sequência oeptídica sinal podem ser sintetizadas quimicamente utilizando-se um método de fosfo-tri-éster ou outro, de preferência em um sistema de fase sólida. Uma síntese química desta natureza, foi descrita por Souza et al /pedido de patente de invenção europeu N2 Al 136 489/, oor meio da sintetização de oligonucleótidos relativamente pequenos e em seguida de ligação destes, Barr et al., /pedido de patente de invenção internacional NS Uú 85/ 02200/ também preparam um gene de HIL-2. 'incha por meio de um outro método, pode isolar-se UNA genomico a partir de uma célula humana capaz de produzir HIL-2.0 gene de HIL-2 pode ser identificado por métodos de hibridizaçao padrão utilizando-se uma sonda de DNA marcada baseada na sequência publicada do gene de HIL-2.

Gomo ilustração os presente invenção, 0 plasmídeo pIL-2-2b, que contém uma cópia de cDNA da região codificadora completa de 459 pares de bases da HIL-2 flanqueada pela sequência nao traduzida 5’ de 31 pares de bases e pela sequência não traduzida 3’ de 309 pares de bases, utilizou-se como fonte de sequência de DNA que codifica a interleuquina-2 humana e uma sequência peptídica sinal. A clonagem desta cópia de cDNA de HIL-2 num plasmídeo nIL-2-2b foi descrita por Smith et al /Troe. Natl. Acad, Sei. U.S.A. 82 · 8404 (19851/. Proveniente deste método par· clonar 0 gene de HIL-2. 0 cDNA é flanqueado por sequências homopoliméricas G—G seguidas por sítios BamHI.

A substituição de sequências nao codifica

- 16 doras 5* e possivelmente de nucleótidos adjacentes da subsequência que codifica a sequência peptídica sinal de HIIi-2 e inserção da sequência de DNA resultante num vector de expressão apropriado são facilmente realizados quando as sequências de DNA necessárias e o vector de clonagem foram cortados com o mesmo enzima ou enzimas de restrição desde que os fragmentos com os terminais de DNA complementar sejam produzidos deste modo e que se possam ligar facilmente um ao outro. Se isto não puder ser realizado é necessário modificar as extremidades cortadas, por exemplo, por meio de digestão de DNA de cadeia simples cara se obter extremidades coincidentes. Também se pode obter o mesmo resultado por enchimento no terminal de cadeia simples com DNA polimerase apropriado tal como o fragmento de Klenow de DNA polimera.se I. As extremidades tornadas coincidentes podem em seguida ser ligadas por meio de enzimas, por exemplo, utilizando-se o enzima T4 DNA ligase.

Para inserção do gene de HIL-2 num vector qualquer sítio de combinação desejado pode ser também produzido por meio de ligação de sequências nucleobídicas (adaptadoras) no DNA terminal. Tais adaptadores pod-m incorporar sequências oligonucleotídicas específicas que codificam sequências de reconhecimento de sítio de restrição. 0 vector cortado e a sequência de DNA modificada que codifica HI1-2 pode também ser modificada por ligação homo-polimérica, como descrito por Morrow/fethods in Enzymology 68 * 3 (1979)/.

Na prática da presente invenção, todas as sequências não codificadoras 5' do gene HJL-2 devem ser substituídas pelas sequências correspondentes do gene de pre

-pro-insulina-II murina. Também deve ser possível anular uns tantos nucleótidos das sequências codificadoras adjacentes do gene de HIL-2. desde que estas sequências codifiquem o oolinéotido sinal que é finalmente cortado durante a maturação na células hospedeira no gene HIL-2 que será inserido e expresso. É evidente que a .anulação de uma região demasiado extensa das sequências codificadoras pode eliminar a. função do polipéptido sinal, portanto interferindo com a própria secreção da HIL-2 oor parte das células.

Nos exemplos da presente invenção, um vector de expressão eucariota designado OBÇ12NI foi utilizado como veículo de expressão e como fonte do gene de pre-pro-insulina II de rato. A substituição das regiões não codificadoras 5’ ocorridas deste modo após um gene de HIL-2, em que a região nao codificadora 5’ natural e os quatro primeiros nucleótidos da sequência eodifiosâora foram anulados, foi inserida no vector pBÇ12MI em justaposição com as sequências correspondentes do gene de pre-pro-insulina II murina.

vector pBC12MI é semelhante ao vector de expressão eucariótico pBC12BI çue foi descrito detalhadamente por Butnick et al., /tlol. Cell. Biol 5 : 3009 (1985),/. Este vector é baseado no vector plasmídico derivado de nBR322 pXf3 /Hanahan, J. Mol. Biol. 166 : 557 (1983)7 e também contém uma região ori do SV4O e promotor de repetição terminal longa (LTR) eficaz do Vírus do Sarcoma de Roas /Õullen et al., Nature 307 : 241 (1984)7 ^e nma, cópia genómica do gene de insulina II de rato /Lomedico et al., Cell 13 · 545 (1979)7· θ vector pBC12MI utilizado na construção descrita posteriormente é idêntico ao pBC12BI excepto no facto de que o fragmento

LTR ali contido se estende por 70 pares de bases adicionais na direcção 3’ (ver figura 1). Esta diferença nao tem efeito no nível da expressão dos genes codificados pelo vector.

Evidentemente que um gene de IL-2 em que regiões nao codificadoras 5’ e o codão de iniciação já foram substituídos com os correspondentes de um gene de insulina de rato podem ser produzidos nrimeiro quer por uma recombinaçao de DNA, quer por síntese química directa e numa segunda fase ser inseridos em um vector apropriado.

Vectores de expressão apropriados para se utilizar em células de mamíferos e que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem mas não se limitam a pBÇ12MI, pBÇ12BI, pSV2dhfr, 091023 (B), pcDVl e pRSVcat. estes vectores podem ser introduzidos em células hospedeiras de mamífero apropriadas, por meio de transformação, transducção ou transfecçao.

Muitos dos vectores de clonagem que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção contêm genes (genes selecionáveis) que codificam um ou mais actividad.es marcadoras que podem ser utilizadas para selecionar os transformantes desejados tais como a resistência à ampicilina no pBÇ12BI e no 0BC12MI e à actividade de di-hidrofolato redutase no pSV2dhfr. A seleção de células hospedeiras em que tais vectores foram inseridos é grandemente simplificada quando as células hospedeiras não oossuem a actividade conferida pelo vector. Nestes casos as células podem desenvolver-se sob condições de restrição em que apenas os transformantes que abrigam o plasmídeo e portanto a actividade se podem multiplicar.

/ í *

No aspecto preferido da presente invenção o olasmídeo que produz HI1-2 fornece actividade de di-hidrofolato redutase a células de ovário de hamster chinês que de outro modo não possuem tal actividade (células GHO-dhfr). Os transformantes são facilmente selecionados a partir de células não transformadas por desenvolvimento destas em meio isen to de hipoxantina e timidina.

A presença de uma actividade num plasmídeo que não está presente nas células hospedeiras pode propor cionar ainda outra vantagem para -a seleção de transformantes. Sob condições de restrição de desenvolvimento de células trans formadas que contêm e exorimem cópias múltinlas do gene dhfr desenvolver-se-ão mais rapidamente do que células com uma ou poucas cópias que exprimem baixos níveis de dhfr. Tais condições serão portanto selecionadas para células que aumentaram ou ampliaram o número de cópias do gene dhfr que exprimem. Quando um gene que deve ser expresso está, presente num plasmídeo nerto do gene selecionável, o gene desejado pode ser co-ampliado o que nor sua vez pode conduzir a um aumento da expressão do referido gene. Na. presente invenção os transformantes de cultura na presença de níveis melhorados de a ’etoot£ rina, um inihidor do síntese da purina, originam a produção de níveis melhorados de di-hidrofolato redutase e de HI1-2. Este processo é designado por”co-amnlificação”.

Qualquer sistema de gene selecionável idêntico pode ser utilizado, de acordo com a presente invenção, ainda que nem todos os sistemas produzam a amplificação do gene. Um outro sistema que pode ser utilizado, mas que não produzirá a amplificação, por exemplo, é baseado no gene got

da E. Coli que codifica a xantina-guanina-f osf oribosil-transferase. Mulligan et al., /Proc. Natl. Acad. Sei. U.S,A. 78 : 2072 (1981)/ selecionaram células de macaco e de murganho transfectadas com plasmídeos que transportam o gene gpt por meio de desenvolvimento das células na presença de ácido mecofenólico (um inibidor da síntese do ácido guanílico), adenina e xantina. A seleção neste sistema é ainda reforçada pela adição de aminopterina (um análogo da ametopterina) para o meio de seleção.

Existe ainda um outro sistema que envolve o gene para uma aminoglicosido 3’-fosfotransferase bacteriana, o produto que torna as bactérias resistentes à neomicina e canamicina. Colbere e Garapin et al., /J. mol. Biol. 150 t 1 (1981)7 selecionaram células de mamífero transfectadas com plasmídeos que transportam o gene da fosfotransfera.se sob controlo do promotor do gene da timidina quinase do vírus simplex do herpes (HSV tk) por meio de desenvolvimento celular na presença de G-418, um antibiótico 2-desoxi-estreptamina, que inibe a síntese das proteínas eucarióticas. Berg /ãcience 213 t 296 (1981)/ obtiveram o mesmo resultado com uma série de vectores pSV em que o gene da fosfotransferase estava sob o controlo de um promotor sy40.

A Hll-2 secretada pelas células que a produzem pode ser identificada no meio de cultura por qualquer método convencional. Por exemplo, um bioensaio baseado na utilização de células que são dependentes de HI1-2 para a proliferação. Além disso um radiomunoensaio ou um ensaio de imunoabsorçao ligado ao enzima pode ser realizado utilizando-se anti-corpos contra H1L-2. A electroforese em gel de poliacrilamida seguida de marcação rfestern /Towbin et al., Proc.

« ,ζ ( .**

Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76 « Λ35Ο (1979/7 também pode ser utilizada ou um método de análise idêntico. Alternativamente, pode-se realizar uma cromatografia líquida de alta resolução (HP1C) como descrito por Stern (patente de invenção norte-americana 4.490.289).

A HIL-2 da presente invenção pode ser concentrada por meio de precipitação com sais, tais como o sulfato de sódio ou o sulfato de amónio, por ultra-filtração ou por meio de outros métodos conhecidos. A nurifioação posterior pode ser realizada nor meio de técnicas convencionais de purificação de proteínas incluindo mas não exclusivamente a filtração do gel, a cromatografiu de troca iónica, a electroforese de gel preparativa, focagem isoeléctrica, destilação fraccionada de dissolventes orgânicos a baixa temneratura, HPLC ou distribuição contra-corrente. Os métodos descritos por Stern, supra, são os utilizados de preferência.

De acordo com a. presente invenção a HI1-2 purificada referida antes, pode ser utilizada para fins semelhantes como outros comoostos imunonoduladores conhecidos para o tratamento e prevenção de doenças, por exemnlo, co.no um meio para tratar condições imuno-sunressivas. Pode ser administrada sob a forma de condições f--rmaoêuticas aceitáveis para via oral, injectáveis ou tópicas. E a tax® de dose pode ser paralela às que correntemeate são utilizadas nas aplicações clínicas de compostos imunoaoduladores conhecidos,

Z tipicamente cerca de 1 - 200 x 10° unidades diárias. listas composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção contêm a referida HI1-2 em associação com veículos compatíveis aceitáveis em farmácia. Pode-se utilizar- qualquer veículo convencional. Os veículos podem ser constituídos oor

material inerte orgânico ou inorgânico apropriado para administração entérica, percutânea ou parentérica. São veículos apropriados a água, gelatina, goma-arábica, lactose, amido, estearato de magnésio, talco, -óleos vegetais, polialquileno-glicois, vaselina e outros. Além disso as preparações farmacêuticas podem conter outros agentes f?<rmacêuticamente activos. Aditivos tais como agentes aromatizantes, agentes conservantes, agentes estabilizadores, agentes emulsificantes, agentes tampão e outros, podem ser adicionados de acordo com a prática aceite na preparação de composições farmacêuticas.

As preparações farmacêuticas podem ser preparadas sob a forma de qualquer dose farmacêutica anropriada, que inclua· a) uma forma sólida para administração oral tal como, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos e outros; b) uma forma líquida para administração oral tal como soluções, xaropes, suspensões, elixires e outros; c) prenaraçoes para a administração parentérica tais como, soluções estéreis, suspensões ou emulsões; e d) preparações para administração tópica tal como, soluçoes, suspensões, pomadas, cremes, gel, pós micronizados, aerossois e outros. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou oodem conter agentes adjuvantes tais como, conservantes, estabilizadores, agentes humidificantes, emulsionantes, sais para variar a pressão osmótica e/ou agentes tampão.

As formas de dose parentérica podem ser infusões ou soluções injectáveis que podem ser administradas por via intra-venosa ou intra-muscular. As oreoarações podem também conter outras substâncias activas, isto é, medicainentos. Aditivos como agentes conservantes, agentes estabilizsn-

tes, agentes emulsionantes, agentes tampão e outros, podem ser adicionados de acordo com a tecnologia de formulações farmacêuticas.

Exemplo

Os exemplos que se seguem ilustram mas nao limitam os métodos através dos quais se realiza clonagem e exnressão de HIL-2 em células de mamífero. Eles proporcionam a evidência do reforço substancial da expressão do gene que é atribuível à substituição das regiões não codificadoras 5' normais do gene da IL-2 pelas regiões não-codificadoras 5’ do gene de insulina de murganho.

PREPARAÇÃO DE DNA

Realizou-se o isolamento em pequena escala de DNA plasmíd.íoo a partir de culturas de uma noite saturadas de acordo com o processo de Birnboim et al. /Nucleic Acids Research 7 í 1513 (1979)7. Este processo permite o isolamento de uma pequena quantidade de DNA a partir de uma cultura de bactérias para fins analíticos. Exceoto se indicado de um outro modo, quantidades maiores de DNA olasmídico foram preparadas de acordo com ·„ descrição de Ole.well et al., /J. Bacteriol. 110 : 1135 (1972)/. Fragmentos de enzimas de restrição específicos derivados de ;)NA plasmídico por meio de clivagem foram isolados por meio de electroforese preparativa em agarose a 1/ de baixo ponto de fusão (Seaui^que, FMC Inc., Rockland, ME). O DNA foi pi-evismente separado num gel de 9 x 5 e 1/2 cm. (50 mA, 1 hora) em tampão tris-acetato /Maniatis et al., molecular Cloning · A Laboratory i anual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 4-54.Z ® seguidamente visualizado por meio de coloração com brometo de etídio na oroporçâo de 1 jug/ml. Secções do gel que continham um fragmento de DNA desejado foram cortadas e fundidas à temperatura de 65°C durante 10 minutos e seguidamente diluídas com 5 ml de 20 míí tris/HCl (pH 7,4), NaCl 0,2 td e ΕΎ2Λ 1 rnií. O SM foi em seguida concentrado utilizando-se uma coluna Elutio-D (Schleicher e Schuell inc., Keen, NH) de acordo com as instruções do preparador e precipitada à temperatura de -20°C com etanol na presença ae 10 jug de tRNA de levedura (Bethesda Research laboratories, Bethesda, ND).

REACÇÕES ENZIIMTIQAS

As enzimas de restrição, DM polimerase I (fragmento de Klenow) e T4 DNA ligase foram fornecidas oela New. England Biolabs, NA. Os métodos e condições para a utilização destas enzimas foram essencialmente os indicidos pelo oreparador.

Para as endonucleases de restrição, definiu-se uma unidade de actividade com uma quantidade de enzima necessária para produzir uma digestão completa de 1,0 jug de PNA durante 60 minutos num volume reaccional total de 0,05 ml, tendo-se realizado essa mesma, digestão à temperatura de 37°C. 0 tampão utilizado para todas estas enzimas (aqui referidas como tampão de enzimas, de restrição) consiste em 100 mií de NaCl, 10 m;.' Tris/HCL (pH 7,5), 5 mi-f e 1 míJ

2-mercapto-etanol.

A ligação T4 de BNA foi realizada durante 16 horas à temperatura de 4°C num tampão (aqui designado pelo tampão de ligação) que continha 60 mM Tris/HCl (cH 7,5), 1G mM

Mgclg» 10 mM de. Di-trio.-treitol e 0,1 mA de ATP. Uma unidade de actividade de T4 D NA ligase é definida como a. quantidade requerida para proporcionar uma ligação de 50% de fragmentos Hind III de lambda D NA num oeríodo de 30 minutos à iemperat tira de 16°C em 20 ul de mistura de incubação e com utaa concentração terminal de DNA 5’ de 0,12 jum (300 jug/ml).

As extremidades de ΏΝΑ de cadeia simples foram tornadas coincidentes utilizando-se o fragmento de Klenow de DNA polimerase I por meio ãe um tampão de enzima de restrição que foi -ajustado para conter 1 míí tlUTP. ãATP, dCTP e dTTP. Uma unidade de actividade é definida como a quantidade de enzima que converte 10 amoles de desoxi-ribonucleótidos sob a forma de um ácido insolúvel num período de 30 minutos à temperatura de 37°C.

MEIO DE CULTURA meio de Eagle Modificado por Iscove (IMEK) /íscove et al., J. Exn. Ped. 147 : 923 (1973)./ foi fornecido por Grand Island Biological CO., Grand Island, N.Y.

Luria Proth (IP) que continha 5 g de extracto de levedura Pacto, 10 g de Bacto-triotona e 10 g de cloreto de sódio por litro, com um nH de 7,5. 0 antibiótico ampicilina foi adicionado numa concentração final de 50 up/ml. TRANSFORMAÇÃO E TRANSFECÇÃO

Estirpes de Pscherichia Poli foram trans formadas pelo método de peacock et al., /úiochim. Biophys. Acta 655 í 243 (19Ô1)/, essencialmente como se oegue. As células foram colhidas do meio LB e preparadas para transformação pelo método de Nogart et al., /j. Biol. Chem. 255 : 7665 (19801/ excepto que o tampão de cloreto de cálcio foi .modificado e substituído por ura tampão contendo 70 má de cloreto de magnésio, 40 de acetato de sódio, e 30 mM de cloreto de cálcio, pH 5,6.

Uma amostra de 100 ul de suspensão células em tampão de cloreto de sódio foi combinado com uma amostra de 50 pl de alasmídeo que continha entre 50 a 1000 ng de DNA. A mistura foi conservada sobre gelo durante uma hora

Λ e em seguida aquecida à temperatura de 37 C durante 2 minutos. As células foram colocadas em olacas de agar LB à temperatura de 4°0 com amnicilina e incubadas durante 16 horas h temperatura de 37°C para selecionar os transformantes.

Células de ovário de hamster chinês foram transfectadas pelo método de Graha.ii et al., /Virology 52 : 456 (197317 como se segue. 0,5 ml de uma mistura que continha 8 g/1 de cloreto de sódio, 0,37 g/1 de cloreto de potássio, 0,125 g/1 de hidrogenofosfato de sódio, 1 g/1 de dextrose, 3 g/1 de tris e 125 má de cloreto de cálcio com uma quantidade total de 10 mg de DNA foi adicionada a 5 X 10' de células numa placa de cultura de 6 cm que continha 4 ml de

-A -5

IáEá suplementado com 10 á de hipoxantina e 10 á de timidina (Ht). 0 DNA na mistura consistia era 5 mg de veículo de DNA de elevado peso molecular de timo de vitela 5 mg de pBÇ12/RSV/lL-2dnfr DNA que tini, a sido linearizado com Bvul.

A cultura foi incubada durante a noite à temperatura de 37°C com uma humidade de 5% num incubador com C0._;, após o que o meio foi eliminado e substituído com 5 ml de ΙΚΕΜ.suplementado com 10~⁴ M de hipoxantina e 10*“^ 11 de timidina (ΉΤ).

Após mais um dia de incubação as células foram destacadas da

£ ξ nlaca utilizando-se uma solução de tripsin-EDTA (GIBCO) e colocadas em placas de 10 cm com 20 ml de ILJEi¹' com soro fetal de vitela dializado a 10$ (PQS) mas isento de HT. Colónias transfectantes foram isoladas utilizando-se uma técnica de cilindros de clonagem padrão de incubação à temperatura de 37°C.

Células de rim de macaco verde africano (COS) foram transfectadas utilizando-se o método descrito por Butnick et al., /’ol. Cell. Biol. 5 · 3009 (1935/7. Blar cas de cultura de tecidos de 10 cm foram semeadas com 3 x 10 células COS com 10 ml de I1EN suplementado com ECS 10$ e 50 mg/ml de geitamicina e incubadas durante a noite à temperatura de 37°G num incubador humidificado com 5% de dióxido de carbono. As células foram lavadas em seguida uma vez com tampão de fosfato à temperatura de 37°C (1BS) e 2 ml de !BS à temperatura de 37°C que continha 500 jug/ml de DEAE-dextrano (Pharmacia). 0 DNA para transfeoção foi em seguida adicionado às células. As células COS foram, em seguida, incubadas para o que as placas de cultura foram agitadas cuidadosamente em intervalos de 5 minutos durante um período de 30 minutos. Após esta incubação, adicionaram-se 20 ml de IkEM que continha 10$ de FCS, 50 ;ug/ml de gentamicina e 3o jum de cloroquina a cada placa. A_:.ós 2 1/2 horas de incubação, o meio foi substituído com o meio IMEN fresco com 10$ de PCS e 50 ug/ml de gentamicina. Continuou-se a incubação à temperatura de 37°C durante 72 horas, e as células e meios foram. em seguida analisados como se descreve posteriormente.

CULTURAS DE CJ&ULAS

Duas estirões de Escherichia Coli foram utilizadas no trabalho descrito antes. A estirpe E, Coli &Γ.Π.19 que foi descrita por Marinus et al., /J. Bacteriol. 114 : 1143 (1973)7. Esta estirpe foi depositada em 26 de Novembro de 1985 sem restrição na American Type Culture Collection com o número de depósito ATCC 53339. A estiroe de E. Coli ídC1061 foi descrita por Casadaban et al., /J, Mol. Biol. 13θ : 179 (1980//. Esta estirpe também foi depositada em 26 de Novembro de 1985 sem restrições na American Type Culture Collection (ATCC) com o número de depósito ATCC 53338.

Utilizaram-se três linhas de células de mamífero. Uma linha de células de ovário de hamster chinês (CHO / dnfr~) isenta de di-hidrofolato redutase. A linha de célula* foi originalmente isolada por Urlaub et al., /Proc, Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77 í 4216 (1980)/. As culturas desta linha de células foram depositadas em 7 de Maio de 1986 na American Type Culture Collection sob o número de deoósito CRI 9036, Uma linha de células de rim de macaco verde africano (COS) que tinha sido transformada por uma origem de um genoraa virai minus SV 40 /&luzman, Cell 23 í 175 (1981/7 foi obtida a oartir da ATCC sob o número de depósito C3L 1651. Uma linha de células dependente de IL-2 murina (CTBl·) foi descrita por Robb /Methods in Enzymology 116 : 493 (1985/7 foi obtida da ATCC sob o número de depósito TIB 214.

iniciador-kutagenese dirigida

A mutagenese específica de sítio de iniciador dirigido foi realizada de acordo com o método descrito por Morinaga et al., /Bio/Technology 2 : 636 (1984/7. Os oligonucleótidos sintéticos utilizados para realizar a mutagenese foram preparados por um método de suporte sólido de fosforamídite de ãlatteucci et al., /j. Am. Chem. Soc. 103 :

3185 (1981)7.

HIBRID4ÇÃ0 DE COlONlAS

A hibridaçao de colónias foi realizada utilizando-se o método descrito por Haniatis et al., /líolecular Cloning : A laboratory Hanual, 1982, Cold Spring Harbor laboratory, pp. 312 - 3157· θ mesmo oligonucleótido utilizado para a mutagenese de iniciador dirigido foi utilizado como uma sonda as hibridações após mareagem da extremidade 5’ com Y-³²P-ATP utilizando-se polinucleótido quinase de acordo com o processo de Kaniatis et al., /supra, p. 396/. Sondas de DNA maiores utilizadas para localizar a 11-2 e os genes de dnfr foram marcadas utilizando-se um conjunto de tra.duçao exacta (Amersham) de acordo com as instruções do fabricante,

CONSTRUÇÃO DO VECTOR DE EXPRESSÃO DE INTER1EUQUINA-2pBC12/ RSV/ll-2/dnfr

A preparação do vector de expressão final da presente invenção foi realizada por fases sequenciais ; (1) de um vector em que um gene de HI1-2 humana modificada pode ser inserido, (2) modificação do gene de HI1-2 para se retirar a maior parte da região não codificadora 3’, todas as sequências não codificadoras 5’ e os primeiros quatro nucleótidos da sequência codificadora para a sequência peptídica sinal, e (3) inserção do gene de HIL-2 modificado no vector preoarado.

- 30 fí

PREPARAÇÃO DO VECTOR DE GLONAGEM

Tratou-se 1 aig de DNA plasmídico pBÇ12wI ;ver figura 1) com 20 unidades de BamHI em 100 ml de um tampão de enzima de restrição durante 1 hora, à temperatura de 37°C. Uma amostro de E. Poli 1101061 que continha o plasmídeo PBÇ12MI foi depositada em 7 de Maio de 1986 na American Type Culture Collection com o número de depósito ATOO 67109. 0 pias mídeo digerido com BaaíKI foi em seguida, tratado com 4- unidades de fragmento de Klenow de DNA polimerase I durante 2 horas à temperatura de 15 0, após o que a reacção foi detida por meio de aquecimento até à temperatura de 65°C durante 5 minutos. Dois ml da mistura foram em seguida, diluídos a l?10 com tampão de ligação. A mistura foi arrefecida com gelo. Adicionou-se uma unidade de T4 UNA ligase e a mistura reaccional foi em seguida incubada durante 16 horas à temperatura de 4°C.

A mistura reaccional de ligação foi em seguida utilizada directamente para transformar a estirpe de E. Coli 0119. Os transformantes foram selecionados em agar BB com ampicilina. 0 DNA das colónias resistentes à aaipicilina obtidas deste modo foi sondado por meio de clivagem de endonuclease de restrição. 0 DNA plasmídico isolado foi primeiramente digerido com BamHI ou Çlal e os fragmentos de DNA resultantes foram separados por meio de electroforese sob gel de agarose a 1$ e visualizados com brometo de etídio a 10 mg/ml. Um plasmídeo que tinha perdido o sítio BamHI mas adquirido um sítio Çlal em sua substituição foi portanto identificado e designado piasmídeo pBC12CI.

plasmídeo nBC12CI foi em seguida orepa-

rado em maior quantidade por meio do processo de lise detergente descrito por Clewell et al., /J. Bacteriol. 110 : 1135 (1972//. A preparação final do vector de clonagem foi realizada por meio de clivagem de 1 mg de oBC12CI com 20 unidades de Çlal e as extremidades tornadas coincidentes por meio de digestão do produto com fragmento de Klenow DHA oolimerase I.

PREPARAÇÃO DO FRAGMENTO DO M DE INTER1EUQUINA-2 plasmídeo PIl-2-2b, que continha a cópia de cDNA de região codificadora de 459 pb de 11-2 humana flanqueada por 31 pb da sequência não traduzida 5’ e 309 pb da sequência não traduzida 3’ /Taniguchi et al., Nature 302: 305 (19831/, foi utilizada como uma fonte do gene de 11-2. Uma vez que a sequência nucleotídica do gene de HI1-2 é conhe· cida segundo Taniguchi et al., o fragmento do gene que continha o gene de HI1-2 pode também ser sintetizado utilizando-se o método descrito por Souza et al., /pedido de patente de invenção europeia N^s AI 134 4897. Dez microgramas de PI1-2-2b foram cortados com 20 unidades de cada Rsal e BamHI em 100 ml de tampão de enzima de restrição durante 1 hora à temperatura de 37°C. 0 Rsal corta o cDNA de HI1-2 inserido num sítio simples de 1 pb 3' para o codão de iniciação de HI1-2. A mistura reacionai foi em seguida tratada com o fragmento de Klenow DNA oolimerase I e submetida a electroforese preparativa em gel de agarose de baixo ponto de fusão a 1%. 0 fragmento de cDIU Rsal/BamHI HI1-2 de 760 pares de bases procurado foi identificado e extraído do gel como se descreveu antes.

Cem mg do vector pBC12CI preparativo fo-

£ * ram misturadas com 100 ng do fragmento de HI1-2 de Rsal/BamHI, em 30 jal de tampão de ligação contendo 2 unidades de DITA ligase T4 e incubados durante & noite, à temperatura de 4°0. 0 ΏΝΑ ligado foi em seguida utilizado para transformar a estirpe MC1061 de E. Coli, e os transformantes foram selecionados em placas de agarose LB com ampicilina.

Duzentas ng do fragmento de HID-2 isolado foram utilizadas para produzir uma sonda de tradução exacta marcada P^J utilizando-se 0 conjunto de traduçao exacta Amersham, de acordo com as instruções do fabricante. Fez-se a suspensão das colónias das placas em filtros de nitrocelulose (Scleicher and Schuell INC.) e em seguida, sondadas para a presença do HI1-2 introduzido utilizando-se a sonda marcada e seguindo 0 procedimento de líaniatis et al., /flolecular Cloning : A Laboratory ííanual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory/. As colónias positivas hibridizadas foram selecionadas e as mini-preparações de DNA foram executadas por meio de procedimento de Birnboim et al. As preparações de DNA resultantes foram cortadas com Hind III e Stu I e sondadas por meio de electroforese de gel para a presença de um fragmento característico de 690 oares de bases, 0 qual é indicador da construção correcta do vector. Esta construção foi designada por pBÇlO.

Uma grande quantidade de pBOlO ΏΝΑ foi preparado e cortaram-se 10 jag com 20 unidades de Hind III e 16 unidades d.e Stu I num tampão de enzima de restrição durante 1 hora à temperatura de 37°C. 0 fragmento de DNA HIL-2 de 690 pares de base resultante foi isolado por meio de electroforese em gel de agarose oreparativo como se referiu antes.

- 33 Um jug de UNA pBC12MI plasmídico foi cortado com BamHI e a seguir foi tratado com DNA polimerase de Klenow como se referiu antes. Após incubação à temperatura de 65°C o PUA foi cortado com Hind III, extraído com solução aquosa de fenol-clorofórmio e precipitado por adição de metade do volume de acetato de amónio de 7,5 1*1 θ dois volumes de etanol, seguido de incubação A temperatura de -70°C. 0 DM DBC12BI precipitado foi recolhido por meio de centrifugação e lavado com etanol e fez-se de novo a sua suspensão em água.

Cem ng do vector de PBC12MI foi ligado a 200 ng de um fragmento IL-2 Hind Ill/Stu I em 30 p.1 de tampão de ligação como se referiu antes. A mistura, de ligação foi > utilizada para transformar a estirpe EIC1061 de E, Coli, e os transformantes foram selecionados em placas de agarose LB com ampicilina. As colónias individuais foram sondadas como referido antes, para a nresença de um fragmento de 650 pb Hind III/ BamHI, e uma construção incidindo neste critério foi designada por pBC12/RSV/lL-2.

Construído deste modo, o nBÇl2/RSV/lL-2 plasmídico continha um gene quimérico HIL-2 em que a região 5’ não codificadora e o primeiro dos quatro nucleótidos ATG- T da sequência codificadora para a sequência, peptídicasinal de HIL-2 assim como a região não-codificeidora 3' completa próxima tinha sido substituída pelas sequências que correspondem ao gene de pre-pro-insulina II de rato presente no vector pBC12fíI, Em parte, esta construção foi realizada para produzir uma região não-codificadora 3’ definida. Mas, é a substituição da região não-codificadora 5' que como será em seguida demonstrado, que produz um aumento acentuado no nível da expressão do gene /

HIL-2. A estrutura resultante do N-terminal do peptídico sinal

HIIi-2 mostra-se na figura 2.

Como se mostra na figura 2, esta construção resulta na formação de peptido sinal quimérico em que os primeiros dois amino ácidos da IL-2 (L^ret-Tyr) são substituídos pelos primeiros cinco amino ácidos do peptido sinal de insulina de rato (Met-Ala-Leu-Trn-Ile), e o sexto amino ácido (Asp) que é codificado pela nova sequência nucleótica criada na junção de ligaçao. Esta alteração não tem efeito na função do peptido sinal, que é cortado do gene da 11-2 durante a maturação, como é usual.

INSERÇÃO DE qEQUENCIAS DO GENE DE DI-HIDROEOLATQ REDUTASE

Um mg de dBC12/RSV/IL-2 foi cortado com Stu I. 0 ΏΝΑ foi extraído com fenol/clorofórmio, precipitado com etanol e fez-se de novo a sua suspensão em água. Dez mg de DNA p§V2 dnfr /Subramani et al., flol. Cell, Biol. 1 : 854 (1981)7 foram cortados com Pvu II e BamHI. 0 plasmídeo psv2 dnfr foi depositado em 7 de Maio de 1986, sob a forma de uma camostra de Ξ. Coli ZIC1O61 (pSV2 dnfr) na American Type Culture Collection, sob o número de depósito ATCC 67110. 0 fragmento do gene SV 40/dnfr do plasmídeo psv2 dnfr foi isolado em gel de -agarose preparativo, após o que 100 ng do vector pBC12/RSV/ll-2 foi ligado com 400 ng do fragmento SV 40/dnfr isolado eui 40 jul de tampão de ligação à temperatura de 4°C durante a noite. A mistura de ligação foi utilizada para transformar directamente E. Coli da estirpe UC1061. Os transformantes foram escolhidos em placas de agarose LB com ampicilina.

As colónias transformadas foram colocadas em filtros de nitrocelulose e 'sondadas utilizando-se uma

~ 32 sonda marcada de traduçao exacta ^p-J preparada contra o frsg· mento do gene SV 40/dnfr isolado, a sonda foi preparada por marcação de 200 ng do fragmento Pvuli/BamHI SV 40/clnfr utilizando-se um conjunto de tradução exacta Amersham, como se referiu antes. Utilizando-se o processo de Birhboim et al. (supra)isolou-se UNA plasmídico de colónias positivas de hibridação e pesquisou~se a presença de dois fragmentos BamHI por análise electroforética sobre gel.

A presença dos fragmentos BamHI confirmou a presença do fragmento SV 40/ dnfr e estabeleceu a orientação dos fragmentos. 0 fragmento do gene SV 40/dnfr clonado no pBC12/RSV/lL-2 continha um gene dnfr murino completo sob o controle do promotor da região próxima do vírus SV 40. Escolheu-se um clone em que os genes de dnfr e HIL-2 no plasmídeo estavam posicionados na mesma orientação, e designou-se o plasmídeo deste clone por OBC12/RSV/IL-2/dnfr ^ver figura 3).

A EXPRESSÃO ELEVADA DO GENE HIL-2

Para exprimir o gene HIL-2. foram colo5 cadas em placas 5 x 10* células CHO/dnfr, um dia antes da transfecção numa placa para cultura de tecidos de 6 cm em ml de IW suplementado com 10”^ moles de hipoxantina e

IO*⁷ moles de timidina (HT). Αχ^όε incubação durante a noite a uma temperatura de 37°C num incubador humidificado com COg a 5%, as células foram transfectadas com pBC12/RSV/lL-2/dnfr.

As colónias transfectadas foram isoladas como se descreveu antes.

Colónias clonadas designadas por d51-d56 foram obtidas deste modo, c^da. uma das quais Se desenvolveu /

- 36 em IMEM e foi sondada para outras e para uma cultura dnfr⁺ misturada com nao-clonados (designada por dó) para a produção de HI1-2. A produção de HIL-2 foi avaliada utilizando-se um bioensaio quantitativo que utilizava uma linha de células CT11 dependente de 11-2 murina. Este ensaio, que foi descrito por Robb /Methods in Enzymology 116 í 493 (1985)7, implica a mistura de diluições de duas vezes do meio sobrenadante dos diferentes clones celulares clnfr* com a linha de células CT11 dependente de 11-2 murina. Forque a linha CT11 não se desenvolve apenas na presença de 11-2, o grau de oroliferação destas células tal como determinado pela sua incorporação em ^I-dt, é uma medida rigorosa do nível de 11-2 secretado pelos clones dnfr*. Alternativamente células embrionárias PHA humanas podem ser utilizadas para se avaliar a produção de HI1-2 (Robb et al., supra). As células embrionárias PHA humanas podem ser obtidas por estimulação de linfócitos de sangue periférico humano durante 48 horas com fito-hemo-aglutinina (PHA). Os resultados desta análise das colónias clonadas estão representados no quadro 1, onde os dados são expressos sob a forma de actividade de 11-2 em unidades por ml do meio e em unidades/10^ células» Uma unidade da actividade de 11-2 é definida como a diluição recíproca que corresponde a uma resposta de metade da -proliferação máxima, ajustada pela resposta de 11-2 padrão que se pode obter do Biological Resoonse Modifiers, Programa do Instituto Nacional do Cancro, Frederik, 'TD /Thurman, lymohokina Res. 3 J 276 (1984)7 como descreveu Robb, suora.

- 37 quadro 1

Çomnaração de Produção de 11-2 por Glones Isolados

Concentração de 4metopterina	Actividade de Interle uquina-2 (unids/10-^ células)
Π one	(Molar)	(unids/ml)
d5	0	640	456
d51	0	1.920	1.370
d52	0	1. :J20	N.D.
d53	0	1.920	1.530
d54	0	320	L.D.
d55	0	550	N.D.
d51	5 x 106	51.200	60,160
d51	2 x IO*5	51,200	80.210
d51	8 x 10“5	76.800	150.400
d51	2 x IO”4	76.800	156.900
d51	5 x IO”4	153.600	401. )00

N.D. = não determinado

No quadro 1, como se pode ver, os clones d51 e d53 foram os produtores mais fortes de actividade de IL-2. Para se demonstrar o efeito da amplificação do gene selecionável referido, desenvolveram-se células de d51 de clone durante um período compreendido entre 7 e 14 dias em níveis de ametonterina melhoradas em ordem crescente até se obter

- 38 /

D uma linha resistente a uma concentração de 5 x 10~^ do inibidor, Como se mostra no quadro 1 esta linha de células secretava níveis elevados de HIL-2» Tal como se esperava, a análise das células por análise de Southern /llaniatis et al., Molecular Cloning : A Láboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, on. 382 : 38'^7 mostrou que cada uma continha cerca de 100 cópias do plasmídeo pBC12/RSV/lL-2/dnfr. As ligações homo-poliméricas G-C originalmente adicionados à cópia de cDNA de HIL-2 para facilitar a sua inserção no plasmídeo PIL-2-2b têm uma acção inibidora sobre a expressão do gene IL-2. Para se comparar adequadamente as razoes de expressão de IL-2 das sequências genéticas tendo regiões não-codificadoras 5’ humanas normais com as sequências em que estas regiões foram substituídas pelas regiões do gene de insulina de rato, preparou-se deste modo um plasmídeo em que as ligações homopoliméricas inibidoras foram anuladas. Este plasmídeo foi designado por pBV40 Δ7.

CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO pBC40 ΔΤ

Preparou-se um vector cortado em que o gene de HIL-2 podia ser preparado por clivagem de 1 ^ug de pBC12MI com 20 unidades de BamHI e 20 unidades de Hind III num tampão de enzima de restrição durante 1 hora à temperatura de 37°C. 0 fragmento resultante foi em seguida, tratado com um fragmento de Klenow de DNA polimerase I, extraído com fenol/ clorofórmio e precipitado como se referiu antes.

Um fragmento de DNA de HIL-2 foi preparado por corte de 10 /ig de PIL-2-2L· de DNA com 20 unidades de BamHI e 8 unidades de Stu I e as extremidades tornadas coincidentes

- 39 / com DNA polimerase de Elenow. Isolou-se depois um fragmento de aproximadamente de 550 pares de bases de HIL-2 por meio de gel de agarose preparativa como se referiu antes.

Cem ng do vector pBC12!'I preparado foi depois ligado com 150 ng de um fragmento HIL-2 BamHl/Stu I em 25 ul de tampão de ligação como se descreveu antes. A mistura de ligação foi utilizada directamente para transformar a estirpe MC1061 de E. Coli e os transformantes foram selecionados em placas de agarose LB com ampicilina. As colónias resistentes à ampicilina foram retiradas das placas para filtros de nitrocelulose e sondadas para a presença da inserção da IL-2 por hibridação de colónias com uma sonda de tradução exacta marcada. P prenarada com 200 ng de fragmento purificado BamHl/Stu I com um conjunto de Amersham.

Colónias positivas de hibridação foram retiradas e sondadas para a presença de um fragmento com aproximadamente 560 pares de bases BstEIl/BamHI pelo método de Birriboim et al., (Análise de Enzima de Restrição do DNA Plasmídico). Uma construção que continha o referido fragmento foi identificada e designada por pBC 40. 0 plasmídeo oBC 40 era idêntico ao oBC12/RSV/lL-2 excepto no facto de não possuir a região não-codificadora de insulina 5’ e possuir em sua substituição a região não-traduzida 5' de HIL-2 com 31 pares de bases natural. 0 plasmídeo também retinha o codão de iniciação HIL-2 natural e uma ligação homopolimérica com 17 pares de bases localizada na região não codificadora 5'. Preoarou-se uma grande quantidade de DNA de pBC40 pelo método de Clewell et al., /J. Bacteriol. 110 : 1135 (1972)/.

segmento da ligação homopolimérico do gene

HIL-2 foi anulado por um método de mutagenese de iniciador directo de Morinaga et al., /Bio/Technology 2 : 636 (1934)/⁷. Para se realizar este processo, 0 iniciador desoxi-oligonucleotídico com 24-mer fosforilado, foi preparado pelo método do suporte sólido de fosforamidite como se referiu antes que continha 12 desoxi-nucleótidos que tinham uma sequência complementar às bases em cada lado da região homo-polimérica, removida numa das cadeias de DNA. Apresentam-se na fig; 4 a sequência nucleótidica deste iniciador de 24-mer e a do DNA que continha a região homo-polimérica a ser retirada. As regiões que conduziram a hibridação durante 0 processo de mutagenese estão sublinhadas. A anulação da região homopolimérica cria um novo sítio Hind III no DNA resultante.

Para se realizar o processo de mutagenese linearizou-se 1 jug de DNA do plasmídeo pBC4O com Pvul, extraíu-se com fenol/clorofórmio, precipitou-se com etanol e fez-se de novo a suspensão com 2o jul de água. Dez jug de pBC40 adicionais foram cortados com EcoRI, e 0 fragmento do vector maior produzido, designado por vector intercalar foi isolado por meio de gel de agarose preparativo a 1/.

Quantidades iguais de 200 ng dos plasmídeos linearizados foram em seguida misturados com um excesso de 20 vezes molar de oligonucleótido fosforilado em 10 jul de água e 2 ul de 10 x tampão de Zlenow /1 II NaCl, 65 mM Tris/ HC1 (pH 7,4), 45 mM MgClg e 10 mM 2-mercapto-etanol/ foram adicionados. A mistura foi em seguida tratada por períodos sucessivos de 5,30, 30, e 5 minutos, à temperatura de 100°C, depois à temperatura ambiente, 4°C e sobre gelo, respectivamen te, depois do que a amostra foi completada para um volume até

- 41 20 jul por meio de adição de 2 jil de 10 mU ATP, 4 pl de uma mistura de 2,5 mM dCTP, dATP, dG-TP e dTTP, 0,5 de polímeras e I de Klenow (2,5 unidades de actividade) e 1 jul de T4

DNA ligase (0,8 unidades de actividade).

A mistura foi incubada durante 16 horas à temperatura de 15°C e a seguir directamente utilizada para transformar a estirpe ‘101061 de E. Coli. Os transformantes foram selecionados em placas de gel de agarose com ampicilina e as colónias das placas foram retiradas com filtros de nitrooelulose e sondadas para a presença de uma sequência homologa ao iniciador 24-mer utilizado no processo de mutagénese e que se utilizou como uma sonda <X- P-ATP marcada . para os oligonucleótidos sintéticos.

Colónias positivas foram seguidamente sondadas pelo método de Birhboim et al., na presença de um fragmento esperado Hind IIl/BamHI com 530 parese d® bases. Devido ao facto de as colónias obtidas por este processo serem mistas (Morinaga et al. supra), uma amostra de DNA positivo foi utilizada para transformar E. Coli LIC1061, e as colónias resultantes foram novamente sondadas para o fragmento HindIIl/ /BamHI com 530 pares de bases. Uma colónia positiva identificada deste modo, foi designada por uBC40AT, era idêntica ao pBC40 mas com uma anulação de um segmento de 22 pares de bases na sequência líder não-traduzida que consistia principalmente numa sequência homopolimérica G-C com 17 pares de bases

- 42 Κ^·>·

COimtP.çÃO FUNCIONAL DOS VECTORES PBC12/RSV/IL-2, PBC40 e PBC4O AT.

Poram comparadas as três construções descritas antes relativamente à sua capacidade para dirigirem a síntese de HIL-2 humana utilizando-se o ensaio de expressão transitória quantitativa de células COS transfectadas de Butnick et al., /Í7ol. Cell. Biol. 5 ? 3009 (1985/7. Neste processo quantidades equimolares de preparações de DM para serem comparadas foram introduzidas por meio de transfecção em linhas de células COS de rim de macaco verde africano como foi descrito oor Gluzman /Cell. 23 t 175 (1981/7, que é transformada por um genoma virai SV40 menos a origem. Ácidos desoxi-ribonucleicos que continham a origem do SV40 de replicação (tais como os plasmídeos de ensaio) que foram introduzidos nestas células, foram replicados para um elevado número de cópias eficientemente expressos deste modo oelo SV40 dependente do equipamento de reolicação de DNA presente nas células.

As taxas de HIL-2 oroduzidns pelas células COS transformadas foram determinadas utilizando-se o bioensaio da linha de células CTLL quantitativo de Robb (supra), com os resultados que se mostram no quadro 2 para quatro experiências diferentes.

QUADRO 2

Efeito de Sequências não-codificadoras 5' na exoressao de

Interleuquina-2

Produção relativa IL-2 (unids/ml)

Clone	1	2	3	4	Hédia
OBC12/RSV/IL-2	1.024	512	1.536	6,144	100
pBC40	24	8	32	192	2,8
nBC40 AT	128	96	128	768	12,1

Como se reoresenta no quadro 2, o plasmídeo oBC12/RSV/li-2 dirige a síntese de níveis considcr-avelmente mais elevados de 11-2 que os plasmídeos pBC4O e pBC4OAT. Ainda que a presença da região homopolimérica na região nao codificadora 5' do pBC4O o tornam menos efectivo que o pBC40AT, a diferença principal entre os três plasmídeos reside no facto de que o conjunto de sequências não traduzidas 5’ de pBC4O e pBC4OAT são sequências humanas naturais, enquanto que no plasmídeo dBC12/RSV/Hj-2 estão presentes as sequências correspondentes do gene de pre-pro-insulina II de rato.

A substituição das sequências nao-codificadoras 5’ humanas normais pelas sequências do gene de insulina de rato reforça de um modo acentuado a exuressão de HIIi-2 por razões que não são claras. Uma explicação do meca-

- 44 nismo do reforço de expressão não é essencial para a pz^sente invenção. Pode ser que a estabilidade do mRNA aumentada seja responsável por esta acção. Pelo contrário, pode ser possível que a substituição do codão AUG iniciador de insulina pelo codão AUG 11-2 natural (figura 2), confira uma eficiência de tradução mais elevada devida à sequência mais ideal adjacente do codão de iniciação de insulina /Kozak, Gell 44 : 283 (1986)7»

Muitas modificações e variantes da presente invenção podem ser realizadas sem afastamento do seu espírito e âmbito, assim como se tornará evidente para os entendidos nesta matéria. Os aspectos específicos aqui descritos são oferecidos apenas como exemplo e a presente invenção apenas é limitada pelos termos das reivindicações juntas.

Claims (20)

1, - Processo para a produção de interleuquina-2 humana, caracterizado pelo facto:

(a) de se cultivar uma célula de mamífero que contém um vector recombinante que incorpora um vector e uma sequência e DNA um vector e uma sequência de DNA que codifica para interleuquina-2 humana e uma sequência peptídica de sinal que compreende um gene que codifica para interleuquina-2 humana e uma sequência peptidica de sinal em que as sequências 5' não codificadoras do gene foram substituídas por sequências 5' não codificadoras heterólogas, sendo o vector recombinante capaz de dirigir a expressão da sequência de DNA; e (b) de se isolar interleuquina-2 humana a partir da cultura.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma célula de mamífero que contém um vector recombinante em que as referidas sequências heterólogas correspondentes são de um gene de insulina de rato.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma célula de mamífero que incorpora um vector recombinante que contém uma sequência de DNA, tal como definida na reivindicação 1, em que, de uma forma adicional, osnucleotidos adjacentes da sub-sequência que codifica para a sequência peptídica de sinal foram substituídos por sequências heterólogas correspondentes.

4, - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se utilizar uma célula de mamífero que contém um vector recombinante, compreendendo uma sequência de DNA, •46/ .

tal como definida na reivindicação 1, na qual os primeiros quatro nucleótidos ATG T da sub-sequência que codifica para sequência peptídica de sinal foram substituídos pelos nucleótidos ATG

GCC CTG TGG ATC G da sub-sequência que codifica para o pêptido de sinal de preproinsulina II de rato.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma célula de mamífero que contêm um vector recombinante que incorpora uma região ori de SV4O e um promotor de repetição terminal longo de vírus Rous de sarcoma.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma célula de mamífero que contém um vector recombinante escolhido entre pBC12/RSV/IL-2 e pBC12/RSV/IL-2/dhfr.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma célula de mamífero na qual o referido vector recombinante foi introduzido mediante transfecção.

8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se cultivar uma célula de mamífero que contêm um vector recombinante que incorpora um gene seleccionãvel em um meio de selecção e de se produzirem, mediante co-amplificação, cópias múltiplas do gene seleccionãvel/ e de sequência de DNA que codifica para a interleuquina-2 humana.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma célula de mamífero que contêm um vector recombinante que incorpora um gene seleccionãvel que codifica para dihidrofolato-reductase, encontrando-se a referida cê- / .* lula de mamífero, de outro modo, isenta de actividade de dihidrofolato-reductase, e de se cultivar a célula de mamífero em um meio isento de hipoxantina e timidina e contendo ametopterina.

10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a célula de mamífero ser uma célula CHO/dhfr .

11. - Processo para a preparação de uma célula de mamífero, caracterizado pelo facto de se introduzir um vector recombinante, tal como se definiu na reivindicação 1, em uma célula de mamífero, de modo que esta se torna capaz de imprimir interleuquina-2 humana.

12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se introduzir o referido vector recombinan te em uma célula de mamífero por meio de transfecção.

13. - Processo para a preparação de interleuquina-2 humana, caracterizado pelo facto de se utilizar uma cultura de células de mamífero transfectadas com um plasmídeo escolhido entre pBC12/RSV/lL-2 e pBC12/RSV/lL-2/dhfr.

14. - Processo para a preparação de interleuquina-2 humana, caracterizado pelo facto de utilizar uma cultura de células de mamífero tranfectadas com um plasmídeo escolhido entre pBC40 e pBC40Zi.T.

15. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 1 a 10 para a preparação de interleuquina-2 humana, caracteri zado pelo facto de se obter a interleuquina-2 humana sob uma forma glicosilada.

16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracte rizado pelo facto de se obter a interleuquina-2 humana sob uma forma essencialmente pura.

17. - Célula de mamífero de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo facto de ser capaz de exprimir interleuquina-2 humana.

18. - Célula de mamífero capaz de exprimir interleuquina-2 humana, caracterizada pelo facto de incorporar um vector recombinante de acordo com a reivindicação 1.

19. - Vector recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser capaz de exprimir interleuquina-2 humana.

20. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas utilizáveis no tratamento ou na prevenção de doenças, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade terapêutica eficaz de interleuquina-2 humana, obtida pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, com um veículo aceitável em farmácia.