NL8701132A - Menselijk interleukine-2. - Google Patents

Description

. * /Ί * . Ν.0. 34474

Menselijk inter!eukine-2.

De ontwikkeling van recombinant-DNA-procedures, vaak aangeduid als genetische manipulatie of genetic engineering, heeft de bereiding van een breed scala aan biologische produkten mogelijk gemaakt. Bij gangbare recombinant-DNA-technieken worden specifieke DNA-sequenties in een 5 geschikte DNA-drager, of vector, ingelast onder vorming van recombi-nant-DNA-moleculen die zich in gastheercellen kunnen vermeerderen. Circulaire dubbel-strengige DNA-moleculen, zogenaamde piasmiden, worden vaak als vectoren gebruikt en de bereiding van dergelijke recombinant-DNA-vormen houdt de toepassing van restrictie-endonuclease-en?ymen in, 10 die DNA op bepaalde plaatsen van de basissequentie kunnen splitsen. Algemene methoden voor de bereiding van dergelijke recombinant-DNA-mole-culen zijn beschreven door Cohen e.a. [U.$. octrooischrift 4.237.224],

Collins e.a. [U.S. octrooischrift 4.304.863] en Maniatis e.a.

[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor 15 Laboratory].

Recombinant-DNA-moleculen kunnen alleen voor de bereiding van het produkt waarvoor de ingelaste gen-sequentie codeert, worden gebruikt, indien aan een aantal voorwaarden is voldaan. Voorop staat de eis dat het recombinantmolecuul verenigbaar is met, en dus in staat zijn tot 20 autonome vermeerdering in, de gastheercel. De laatste tijd wordt veel gebruik gemaakt van de bacterie Escherichia coli (E. coli) als gast-heerorganisme omdat deze bacterie met een groot aantal recombinante piasmiden verenigbaar is. Afhankelijk van het gebruikte vector/gast-heercel-systeem wordt het recombinant-DNA-molecuul in de gastheer inge-25 voerd door transformatie, transductie of transfectie.

Invoeging van een recombinantvector in een gastheercel maakt op zichzelf nog niet dat er zonder meer noemenswaardige hoeveelheden van het gewenste gen-produkt worden gevormd. Wil dit gebeuren dan moet de vreemde gen-sequentie in de juiste relatie met een signaalgebied van de 30 vector, aangeduid als promotor, worden gefuseerd. In plaats daarvan kan het vreemde DNA ook zijn eigen promotor bij zich hebben, als deze maar door de gastheer wordt herkend. Ongeacht zijn herkomst is de promotor een DNA-sequentie die zich "stroomopwaarts", d.w.z. aan de 5'-zijde bevindt van het vreemde gen dat tot expressie moet worden gebracht. Deze 35 sequentie richt de binding van RNA-polymerase en bevordert daardoor de transcriptie van DNA naar boodschapper-RNA (mRNA).

Gegeven een sterke promotie die grote hoeveelheden van mRNA kan verschaffen, hangt de uiteindelijke produktie van het gewenste gen-pro- 8701132 w i 2 dukt af van de doeltreffendheid van de vertaling van mRNA naar eiwit. Dit is weer afhankelijk van de doelmatigheid van de ribosomale binding aan het mRNA en van de stabiliteit van het mRNA in de gastheercel. De faktoren die bepalend zijn voor de trans!atiedoelmatigheid in eukaryo-5 tische cellen zijn nog tamelijk onbekend maar een daarvan lijkt te zijn een gunstige nucleïnezuurvolgorde rondom een AUG-codon dat de translatie op gang brengt [Kozak, Cel! 44: 283 (1986)]. Faktoren die van invloed zijn op de stabiliteit van het mRNA, waarvan men zowel in proka-ryotische als in eukaryotische cellen nog weinig weet, zijn ook essen-10 tieel voor de hoeveelheid geproduceerd eiwit die kan worden verkregen.

Het werk op het gebied van recombinant-DNA is tot nu toe merendeels gericht op het gebruik van bacteriële expressiesysternen zoals E. coli. Niettemin heeft het gebruik van bacteriële cellen een aantal onaantrekkelijke aspecten. De meeste in E. coli geproduceerde eiwitten 15 en polypeptiden hopen zich bijvoorbeeld in de periplasmische ruimte op. Winning van deze gen-produkten vereist derhalve verbreking van de cellen, een inefficiënt proces dat een ernstig zuiveringsprobleem meebrengt, aangezien het gewenste produkt uit de talrijke andere cel bestanddelen van E. coli moet worden geïsoleerd. Ook kunnen bacteriën .20 geen glycosylering uitvoeren die nodig is om de synthese van vele belangrijke gen-produkten af te ronden. Bovendien zijn bacteriën niet altijd in staat de specifieke disulfidebindingen te vormen die voor de juiste conformatie en biologische activiteit van vele eukaryotische eiwitten essentieel zijn.

25 Om deze nadelen van bacteriële expressiesystemen te overwinnen richt de aandacht van genetische onderzoekers zich steeds meer op het gebruik van eukaryotische gastheercellen voor de expressie van recombi-nant-DNA-moleculen. Cellen zoals gist- en zoogdiercellen kunnen de gewenste gen-produkten in het kweekmedium afscheiden en kunnen tevens es-30 sentiële glycosyleringsprocessen uitvoeren. Toch levert ook het gebruik van zoogdiercellen voor het klonen en tot expressie brengen van recombinant-DNA-moleculen een reeks technische hindernissen op die uit de weg dienen te worden geruimd. Zo worden de endogene plasmiden, die in bacteriën zo nuttig zijn gebleken, bijvoorbeeld door hogere euka-35 ryotische cellen niet vermenigvuldigd. Er moeten dan ook andere benaderingen worden gekozen.

Een mogelijkheid is het gebruik van de lagere eukaryotische gist, Saccharomyces cerevisiae, die met hetzelfde gemak kan worden gekweekt en gemanipuleerd als E. coli. Kloonsystemen voor gist zijn beschikbaar. 40 Door het gebruik van dergelijke systemen is de doelmatige expressie in 87Q1332 3 gist van een menselijk interferon-gen tot stand gebracht [Hitzeman e.a., Nature (Londen) 293; 717 (1981)]. Interferon-genen bevatten echter geen intronen. Aangezien gebleken is dat gisteel!en tenminste een hetero!oog zoogdier-gen dat geen intronen bevat, te weten het β-globi-5 ne-gen van konijnen, niet correct transcribeert [Beggs e.a., Nature (Londen) 283: 835 (1980)], moet de aanwezigheid of afwezigheid van intronen in beschouwing worden genomen wanneer gist wordt gebruikt als gastheer voor de expressie van een zoogdier-gen.

In een andere benadering worden vreemde genen door rechtstreekse 10 opname ingevoegd in zoogdiercellen. Dit is bijvoorbeeld gedaan door co-precipitatie met calciumfosfaat van gekloonde genen, waarbij ongeveer 1-2¾ van de cellen er in het algemeen toe kan worden aangezet DNA op te nemen. Een dergelijk laag opnameniveau leidt echter slechts tot een zeer geringe mate van expressie van het gewenste gen-produkt. Wanneer 15 zoogdiercellen kunnen worden gevonden die geen thymidine-kinase-gen hebben (tk~ cellen) kunnen betere resultaten worden verkregen door cotransformatie met het tk-gen gevolgd door kweek onder selectieve omstandigheden. Tk” cellen kunnen niet groeien in een HAT (hypoxanthi-ne-aminoptenne-thymidine) medium. De verloren enzymatische activiteit 20 kunnen zij terugwinnen door exogeen DNA dat het. tk-gen bevat (zoals viraal DNA van herpes simplex) op te nemen door middel van coprecipitatie met calciumfosfaat. Andere met het tk-DNA covalent verbonden of daarmee slechts gemengde DNA-moleculen worden dan ook door de cellen opgenomen en vaak mede tot expressie gebracht [zie Scangos e.a., Gene 1£: 1 25 (1981)].

In een derde benadering worden virale genomen gebruikt als vectoren voor de introductie van vreemde genen in. de zoogdiercellen. Vectoren op basis van Simian-virus 40, papilloom-virus en adeno-virus-geno-raen zijn beschreven [zie P.W.J. Rigby, "Expression of Cloned Genes in 30 Eukaryotic Cells Using Vector Systems Derived form Viral Replicons", in Genetic Engineering, Vol. 3, R. Williamson, ed., Academic Press, New York, biz. 83-141 (1982) voor een overzicht]. Deze vectorsystemen hebben echter als nadeel een beperkte keuze aan gastheercellen. Bovendien leidt virusreplicatie in deze systemen tot sterfte van gastheercellen.

35 Door het gebruik van alleen retrovirale DNA-controle-elementen worden veel van de nadelen van deze virale vectorsystemen omzeild. Gorman e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79: 6777 (1982)] hebben bijvoorbeeld aangetoond dat de lange terminale herhaling (long terminal repeat, LTR) van het Rous sarcoom-virus een sterke promotor is en door middel van 40 transfectie met DNA in een verscheidenheid aan cellen kan worden inge- 8701132 t t 4 voerd, waaronder CV-1 apeniercellen, fibroblasten van kippe-embryo's, eierstokcellen van de Chinese hamster, HeLa-cellen en NIH/3T3-cellen van muizen.

Aanwijzingen dat gen-expressie wordt gereguleerd door niet code-5 rende sequenties aan de 5‘- en 3'-zijden, d.w.z. de sequenties vlak voor resp. vlak na de coderende sequentie van een gen, kwamen uit de studie van oncogenen en mRNA's van hogere eukaryotische cellen. De effecten van eliminatie of modificatie van deze sequenties op de gen-expressie in deze cellen werden nagegaan. Treisman [Cel! 42: 889 (1985)] 10 heeft bijvoorbeeld de accumulatie van c-fos-RNA na serumstimulatie van muizefibroblasten waarin een gekloond menselijk c-fos-gen (de cellulaire homoloog van het door het FBJ-murine-osteosarcoomvirus gedragen oncogen, aangeduid als c-fosH) was getransfecteerd, bestudeerd. Gewoonlijk veroorzaakt serumstimulatie van dergelijke cellen een sterke maar 15 voorbijgaande toename van c-fos-mRNA, waarvan de concentratie een maximum bereikt na 10-15 minuten en snel daarna afneemt en binnen 1 tot 2 uur als gevolg van snelle degradatie van het mRNA weer op het niveau voor stimulering komt.

Wanneer de aan het 5'-einde grenzende sequenties van c-fosH wor-20 den gefuseerd met heterologe genen in afwezigheid van de normale aan 3' grenzende sequenties van c-fos^, zijn de resulterende genen nog steeds induceerbaar door serumfaktoren maar blijft het daarbij geproduceerde mRNA na serumstimulering nog tot 4 uren bestaan. Proeven met hybride transcriptie-eenheden tonen aan dat alleen genen die het 3'-einde 25 van het c-fos^ gen en de niet coderende gebieden aan de 3'-zijde bevatten na stimulering de kenmerkende snelle afbraak van mRNA vertonen. Het zou dus kunnen zijn dat de 3'-sequenties van c-fos destabiliserend werken op een RNA dat deze bevat. Eliminatie of modificatie van deze sequenties kan een positief effect hebben op de gen-expressie.

30 Verdere aanwijzingen voor een regulerende rol van 3'-niet-coderen-de sequenties kwamen uit studies van Simcox e.a. [Mol. Cell. Biol. 5: 3397 (1985)] op het warmteschok-eiwitsysteem van Drosophila melanogas-ter. Wanneer de kweektemperatuur van Drosophila melanogaster wordt verschoven van kamertemperatuur naar 37eC produceert dit organisme snel 35 een aantal "heat shock" eiwitten waarvan een belangrijke wordt aangeduid als hsp 70. De temperatuurverandering wekt een verhoogde produktie van RNA's op. Na terugkeer naar normale kweektemperaturen wordt de transcriptie van het hsp 70 gen snel onderdrukt en nemen de concentraties van het overeenkomstige mRNA snel af waarbij verdere produktie van 40 hsp 70 eiwit spoedig wordt stopgezet. Simcox e.a. vonden echter dat de 8701132 v * » 5 snelle onderdrukking van de synthese van hsp 70 eiwit na terugkeer uit een warmteschok wordt vertraagd wanneer 3'-sequenties zijn gedeleteerd, hetgeen erop wijst dat de 3'-sequenties normaal destabiliserend werken op het hsp 70 mRNA na de temperatuurverlaging.

5 Aanwijzingen in de richting van een regulerende rol van mRNA zijn ook verkregen voor de niet coderende sequenties aan de 5'-zijde.

Butnick e.a. [Mol. Cell. Biol. 5: 3009 (1985)] hebben aangetoond dat een 5'-niet-coderende sequentie met ongeveer 550 nucleotiden (aangeduid als exon 1) van het menselijke c-myc-gen (de cellulaire homoloog van 10 het virus-oncogen van vogel-nryelocytornatose) invloed heeft op de expressie van plasmiden die dat gen dragen in met een origine-defectief Simian virus 40 getransformeerde CVl-apeniercellen (aangeduid als COS-cellen). Transcripties van plasmiden waarin de 5'-niet-coderende sequenties van het c-myc-gen waren gedeleteerd bleken in een hogere even-15 wichtsconcentratie aanwezig te zijn dan transcripties van plasmiden die het intacte gen droegen, hetgeen doet vermoeden dat de 5‘-niet-coderen-de sequenties op een of andere manier destabiliserend werken op het overeenkomstige mRNA.

In een andere studie hebben Rabbitts e.a. [EMBO J. 4: 3727 (1985)] 20 aangetoond dat de afknotting van exon 1 van het c-myc-gen een verhoging van de stabiliteit van c-myc-mRNA in COLO 320 cellen teweegbrengt.

Evenzo is door Eick e.a. [EMBO J. £: 3717 (1985)] aangetoond dat c-myc-mRNA's, geproduceerd in Burkitt's lymfoomcellen veel stabieler zijn wanneer het overeenkomstige c-myc-gen een trans!okatie in exon 1 be-25 vat.

De bovengenoemde referenties suggereren allemaal dat de niet coderende gebieden aan 5‘- en 3'-zijde van een verscheidenheid aan genen op de een of andere wijze kunnen leiden tot instabiliteit van de overeenkomstige uit deze genen getranscribeerde mRNA's. Deletie of wijziging 30 van deze niet coderende gebieden in deze gevallen veroorzaakte een verhoogde stabiliteit van mRNA en een in totaal verhoogde mate van gen-ex-pressie. Niettemin kan het effect van modificatie of deletie van derge-lijke niet coderende sequenties op de gen-expressie niet met zekerheid worden voorspeld.

35 Johansen e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 7698 (1984)] hebben bijvoorbeeld de lengte van het 5'-niet-coderende leidergebied gevarieerd in een recombinant-vectorsysteem dat de aan het galactokinase (galK) gen van Escherichia coli gefuseerde gen-regel-elementen bevatte.

De variatie in lengte van het niet coderende gebied had geen effect op 40 de galK-expressie. Evenzo hebben Katz e.a. [Mol. Cell. Biol. 6: 372 8701132 4 ï 6 (1986)] zowel deleties als vervangingen in de 5'-niet-getranslateerde leider van retrovirale mRNA's van vogels aangebracht. In het algemeen brachten deze deleties en vervangingen een belangrijke verlaging van de expressie van het env-gen teweeg. Deze afname van expressie was echter 5 niet het gevolg van vermindering van het aantal mRNA-moleculen. Het blijkt juist dat de veranderingen in de niet coderende gebieden een trans!atiegebrek veroorzaakten dat leidde tot een algehele vermindering in expressie.

Interleukine-2 (IL-2) is een oplosbaar eiwit dat in staat is de 10 reactiviteit van lymfocyten te reguleren en de in vitro kweek op lange duur van antigen-specifieke T-lymfocyten te bevorderen. In het verleden werd IL-2 voornamelijk geïsoleerd uit de vloeistof verkregen uit gekweekte met mitogeen gestimuleerde zoogdiercellen. Morgan e.a. [Science 193: 1007 (1976)] en Ruscetti e.a. [J. Immunol. 119: 131 (1977)] hebben 15 IL-2 bijvoorbeeld gewonnen uit bijeengevoegde bovenstaande vloeistoffen van normale met fyto-haemagglutinine (PHA) gestimuleerde menselijke lymfocyten terwijl Gillis e.a. [Nature 268: 154 (1977)] normale DBA/2-muizemiltcellen, gestimuleerd met concanavaline A, als eiwitbron gebruikten. Korter geleden beschreef Stern [Amerikaans octrooi schrift 20 4.490.289] het gebruik van geïnduceerde kwaadaardige menselijke cellen als bron van IL-2.

Ook zijn pogingen in het werk gesteld om IL-2 te bereiden door toepassing van recombinant-DNA-technieken. Taniguchi e.a. [Nature 302: 305 (1983)] hebben bijvoorbeeld de sequent!e-analyse, het klonen en de 25 expressie van een complementair DNA (cDNA), dat codeert voor menselijk IL-2 en werd bereid uit boodschapper-RNA van de Jurkat-leukemie-cel-lijn, beschreven. De expressie van IL-2 werd door Taniguchi e.a. uitgevoerd in gekweekte COS-cellen van apen; de auteurs merkten echter op dat men· bezig was met de expressie van IL-2 met behulp van een recombi-30 nant-DNA-vector in E. coli en dat het met het E. coli-systeem spoedig mogelijk zou zijn IL-2 in grote hoeveelheden te bereiden. IL-2 wordt in de cel gesynthetiseerd in de vorm van een voorloper-polypeptide met 153 aminozuren. Bij afscheiding uit de cel wordt een signaalpeptidesequen-tie van 20 aminozuren lengte afgesplitst. Het rijpe IL-2 wordt uit de 35 cel afgescheiden in de vorm van een polypeptide met 133 aminozuren.

Voor de expressie van het rijpe IL-2 in E. coli moet de deelsequentie die de signaalpeptidesequentie van het voor IL-2 coderende gen codeert door recombinant-DNA-technieken worden verwijderd, omdat E. coli niet in staat is eukaryotische signaalpeptidesequenties af te splitsen.

40 Rosenberg e.a. [Science 223: 1412 (1984)] hebben ook IL-2 in E.

8701132 . ♦ fr 7 coli tot expressie gebracht met behulp van een uit de Jurkat-cellijn gefsoleerd gen. Later hebben Souza e.a. [Europese octrooiaanvrage Al-136.489] het klonen en tot expressie brengen in micro-organismen beschreven van chemisch bereide DNA-sequenties met daarin structurele ge-5 nen die coderen voor een polypeptide met de aminozuursequentie en de eigenschappen van rijp IL-2. Souza e.a. leren ook het gebruik van synthetische genen voor de bereiding van IL-2 anal ogen die in aminozuursequentie verschillen van natuurlijk IL-2. In de voorbeelden bij de octrooiaanvrage van Souza e.a. is E. coli het gastheerorganisme.

10 Barr e.a. [Internationale octrooiaanvrage nr. 85/02200] hebben onlangs het klonen en tot expressie brengen van een chemisch bereid menselijk IL-2-gen in gist beschreven.

De uitvinding heeft betrekking op een DNA-sequentie die codeert voor menselijk inter!eukine-2 en een signaalpeptidesequentie, die een 15 gen omvat dat codeert voor HIL-2 en een signaalpeptidesequentie, waarbij de niet coderende sequenties aan de 5‘-zijde van het gen zijn vervangen door heterologe 5'-niet-coderende sequenties, b.v. door die van een rat-insuline-gen en bij voorkeur door die van het prepro-insuline- II-gen van de rat. De uitvinding omvat ook het vervangen van de aan-20 grenzende nucleotiden van de voor de signaalpeptidesequentie coderende deel sequentie door overeenkomstige heterologe sequenties, dat wil zeggen door de nucleotiden van de voor de signaalpeptidesequentie coderende deel sequentie aangrenzend aan de bovenvermelde heterologe 5'-niet-coderende sequenties. Wanneer nucleotiden van de voor de signaalpepti-25 desequentie coderende deel sequentie worden vervangen, moet er voor worden gezorgd dat het afleeskader van het HIL-2-gen in stand blijft. De uitvinding heeft verder betrekking op recombinantvectoren die een DNA-sequentie als boven omschreven omvatten en op een zoogdiercel die een dergelijke DNA-sequentie of een recombinantvector met die sequentie om-30 vat. De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het bereiden van menselijk inter!eukine-2 verkrijgbaar of verkregen volgens deze werkwijze en op de toepassing van menselijk inter!eukine-2 voor de behandeling en/of voorkoming van ziekten. Tenslotte heeft de uitvinding betrekking op farmaceutische preparaten die een dergelijk menselijk in-35 terleukine-2 bevatten.

Verrassenderwijs wordt een hoge mate van expressie van het HIL-2-gen verkregen bij gebruikmaking van de nieuwe kloon- en expressievecto-ren waarin natuurlijke 5'-niet-coderende sequenties en de eerste vier nucleotiden ATG T van de voor de signaalpeptidesequentie coderende 40 deel sequentie van het HIL-2-gen zijn vervangen door overeenkomstige he- 870 1 132 1 * 8 terologe sequenties uit het insuline-gen van de rat, namelijk door de . nucleotiden ATG GCC CTG TGG ATC G van de deel sequentie die codeert voor de signaalpeptidesequentie van prepro-insuline II van de rat. De resulterende wijzigingen aan het N-uiteinde van het signaal peptide van HIL-2 5 hebben geen effect op het rijpe HIL-2-polypeptide dat uit de producerende cellen wordt afgescheiden aangezien het signaal peptide tijdens het rijpingsproces wordt afgesplitst.

De uitvinding kan worden toegelicht met behulp van de figuren, die niet op schaal zijn.

10 Fig. 1 is een schematische weergave van piasmi de pBC12MI, de startvector voor de opbouw van de HIL-2-expressievector.

Fig. 2 toont de structuur van het N-uiteinde van het nieuwe signaal peptide in plasmi de pBC12/R$V/IL-2 en de insuline- en HIL-2-sequen-ties die voor de opbouw van het piasmi de worden gebruikt. De specifieke 15 restrictie- en ligatieplaatsen zijn onderstreept.

Fig. 3 is een schematische weergave van de uiteindelijke IL-2-ex-pressievector pBC12/RSV/IL-2/dhfr.

Fig. 4 toont de nucleotide-sequentie die door plaats-specifieke mutagenese uit piasmide pBC40 is verwijderd voor de opbouw van pBC40AT. 20 De onderstreepte segmenten geven de 24-mer-primer weer die wordt gebruikt voor het uitvoeren van de deletie waardoor een nieuwe HindlII-plaats ontstaat.

De werkwijze volgens de uitvinding behelst de volgende stappen in logische volgorde: (1) bereiding van een DNA-sequentie die codeert voor 25 HIL-2 en een signaalpeptidesequentie, (2) vervanging van S'-niet-coderende sequenties en eventueel van aangrenzende nucleotiden van de voor de signaalpeptidesequentie coderende deel sequentie door overeenkomstige sequenties, bij voorkeur van het prepro-insuline-II-gen van de rat, zodanig dat het afleeskader van het voor HIL-2 coderende gebied wordt ge-30 handhaafd, (3) overbrenging van de recombinantvector met daarin de nieuwe DNA-sequentie in een geschikte zoogdiergastheercel, (4) amplificatie van het nieuwe HIL-2-gen en selectie van de gemodificeerde zoog-diergastheercellen, en (5) identificatie en zuivering van het geproduceerde HIL-2.

35 Onder de term "mensel ijk interleukine-2" of "HIL-2" wordt hier verstaan een geglycosyleerd eiwit geproduceerd door een cel die met een hierboven omschreven DNA-sequentie of door een modificatie daarvan is getransformeerd of getransfecteerd. De DNA-sequentie codeert een eiwit met (a) een aminozuursequentie die geheel of grotendeels identiek is 40 met de aminozuursequentie van oorspronkelijk menselijk interleukine-2 8701132 9 en (b) een biologische activiteit die overeenkomt met die van oorspronkelijk menselijk interleukine-2. Onder het geheel of grotendeels identiek zijn van aminozuursequenties wordt verstaan dat de sequenties identiek zijn of verschillen in een of meer aminozuurwijzigingen (ver-5 wijderingen, toevoegingen of vervangingen) die geen nadelige functionele ongelijkheid veroorzaken tussen het synthetische eiwit en het oorspronkelijke menselijke interleukine-2.

Voorbeelden van dergelijke eiwitten zijn de interleukine-2-molecu-len beschreven in de Europese octrooiaanvragen 82307036.2 en 83101035.0 10 en de Amerikaanse octrooischriften 4.518.584 en 4.569.790. Deze inter-leukine-2-polypeptiden worden in zuivere vorm in bacteriële systemen geproduceerd.

Een DNA-sequentie die codeert voor menselijk interleukine-2 en een signaalpeptidesequentie kan op elke gangbare wijze worden bereid. Een 15 tot de synthese van HIL-2 in staat zijnde menselijke cellijn kan bijvoorbeeld worden gestimuleerd tot het maken van mRNA van HIL-2 dat kan dienen als tenqplaat voor de bereiding van cDNA van HIL-2. Rosenberg e.a. [Science 223: 1412 (1984)3 gebruikten een menselijke leukemische T-cellijn en normale menselijke perifere bloedlymfocyten voor de berei-20 ding van dergelijk cDNA. Taniguchi e.a. [Nature 302: 305 (1983)3 gebruikten voor dat doel een menselijke leukemische T-cel.

Aangezien Taniguchi e.a. de nucleotidesequentie hebben onthuld, kan de DMA-sequentie die voor HIL-2 en een signaalpeptidesequentie codeert chemisch worden bereid met behulp van de fosfotriester of volgens 25 een andere methode, bij voorkeur aan een vaste fase. Een dergelijke chemische synthese is beschreven door Souza e.a. [Europese octrooiaanvrage A-l 136.4893- Door synthese van betrekkelijk kleine oligonucleo-tiden en koppeling daarvan hebben Barr e.a. [Internationale octrooiaanvrage nr. WO 85/022003 ook een HIL-2-gen bereid. Volgens weer een ande-30 re methode kon genomisch DNA worden geïsoleerd uit een tot het maken van HIL-2 in staat zijnde menselijke cel. Het HIL-2-gen kon worden geïdentificeerd met standaard hybridisatiemethoden met een gemerkte DNA-sonde op basis van de gepubliceerde sequentie van het HIL-2-gen.

Als illustratieve uitvoeringsvorm van de uitvinding werd plasmide 35 pIL-2-2b, dat een cDNA-copie van het gehele coderende gebied van 459 baseparen (bp) van HIL-2, geflankeerd door 31 bp van de 5'-niet-ge-translateerde sequentie en 309 bp van de 3'-niet-getranslateerde sequentie bevat, gebruikt als bron van de DNA-sequentie die codeert voor menselijk interleukine-2 en een signaalpeptidesequentie. Het klonen van 40 deze cDNA-copie van HIL-2 in plasmide pIL-2-2b is beschreven door Smith 8701132 10 e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., SZ: 8404 (1985)]. Als gevolg van de voor het klonen van het HIL-2-gen gebruikte methode wordt het cDNA geflankeerd door homopolymere G-C-sequenties gevolgd door BamHI-plaatsen.

5 Vervanging van 5'-niet-coderende sequenties en eventueel aangrenzende nucleotiden van de voor de signaalpeptldesequentie van HIL-2 coderende deel sequentie en inlassing van de daardoor verkregen DNA-se-quentie In een geschikte expressievector geschieden gemakkelijk wanneer de vereiste DNA-sequenties en kloonvector met hetzelfde restrict!e-en-10 zym zijn geknipt omdat daarbij fragmenten met complementaire DNA-uit-einden worden geproduceerd die gemakkelijk aan elkaar kunnen worden gekoppeld. Wanneer gebruik van dezelfde restrict}e-enzymen niet mogelijk is kan het nodig zijn de knipeinden te modificeren, b.v. door terugdigereren van enkelstrengs-DNA tot stompe uiteinden. Hetzelfde resultaat 15 kan worden verkregen door de enkelstrengs-uiteinden op te vullen met een geschikt DNA-polymerase zoals het KIenow-fragment van DNA-polymera-se I. De stompe uiteinden kunnen dan enzymatisch worden gekoppeld, b.v. met behulp van het enzym T4 DNA-ligase.

Voor het invoegen van het HIL-2-gen in een vector kan elke gewens-20 te combinatieplaats ook worden bereid door het koppelen van nucleotide-sequenties {linkers) aan de DNA-uiteinden. Dergelijke linkers kunnen specifieke oligonucleotidesequenties omvatten die de herkenningssequen-ties voor de restrictieplaats coderen. De gesplitste vector en de gemodificeerde DNA-sequentie die HIL-2 codeert kunnen ook worden gemodifi-25 ceerd door homopolymere "tailing" zoals beschreven door Morrow [Methods in.Enzymology 68: 3 (1979)].

In de praktijk van de uitvinding moeten alle 5'-niet-coderende sequenties van het HIL-2-gen worden vervangen door overeenkomstige sequenties van het prepro-insuline II gen van de rat. Ook kunnen enige 30 nucleotiden van de aangrenzende coderende sequenties van het HIL-2-gen worden verwijderd, omdat deze sequenties het signaal polypeptide coderen dat uiteindelijk tijdens rijping binnen de gastheercel waarin het HIL-2-gen wordt ingevoegd en tot expressie wordt gebracht, wordt afgesplitst. Uiteraard leidt deletie van een al te groot gebied van de co-35 derende sequenties tot vernietiging van de signaalpolypeptidefunctie en tot verstoring van de gewenste afscheiding van het produkt HIL-2 uit de cellen.

In de uitvoeringsvorm van de uitvinding volgens voorbeeld werd een eukaryotische expressievector, aangeduid als pBC12MI, zowel gebruikt 40 als expressiedrager als als bron van prepro-insuline II gen-sequenties 87 0 1 1 32 * ί 11 van de rat. Vervanging van de 5'-niet-coderende gebieden vond aldus plaats nadat een HIL-2-gen, waarin het natuurlijke 5’-niet-coderende gebied en de eerste vier nucleotiden van de coderende sequentie waren gedeleteerd, in vector pBC12MI werd ingelast naast de overeenkomstige 5 sequenties van het prepro-insuline II gen van de rat.

Vector pBC12MI lijkt op de eukaryotische expressievector pBC12BI die uitvoerig is beschreven door Butnick e.a. [Mol. Cell. Biol. j[: 3009 (1985)]. Deze vector is gebaseerd op de van pBR322 afgeleide piasmi de-vector pXf3 [Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557 (1983)] en bevat ook een 10 SY40 ori-gebied en de doelmatige lange terminale herhalings- (LTR) promotor van Rous Sarcoma Virus [Cullen e.a., Nature 307: 241 (1984)] en een genoraische copie van het insuline-II-gen van de rat [Lomedico e.a.,

Cell 18: 545 (1979)]. De in de hieronder beschreven constructies gebruikte vector pBC12MI is gelijk aan pBC12BI met als uitzondering dat 15 het hierin aanwezige LTR-fragment 70 baseparen in de 3'-richting langer is (zie fig. 1). Dit verschil heeft geen effect op de mate van expressie van door de vector gecodeerde genen.

Uiteraard kan een IL-2-gen waarin de 5'-niet-coderende gebieden en het startcodon al zijn vervangen door die van een ratte-insuline-gen 20 ook eerst worden geproduceerd, hetzij door DNA-recombinatie hetzij door rechtstreekse chemische synthese, en in een tweede stap in een geschikte vector worden ingebouwd.

Volgens de uitvinding bruikbare en in zoogdiercellen toepasbare expressievectoren zijn onder meer pBC12MI, pBC12BI, pSV2dhfr, 25 p91023(B), pcDVl en pRSYcat. Deze vectoren kunnen door transformatie, transductie of transfectie in geschikte zoogdiergastheercellen worden ingevoerd.

Veel van de volgens de uitvinding bruikbare kloonvectoren bevatten genen (selecteerbare genen) die een of meer merkactiviteiten coderen 30 die kunnen worden gebruikt voor het selecteren van gewenste transformanten zoals ampicilline-resistentie in pBC12BI en pBC12MI en dihydro-folaat-reductasewerking in p$Y2dhfr. Selectie van gastheercellen waarin dergelijke vectoren zijn ingevoegd wordt sterk vereenvoudigd wanneer de gastheercellen de door de vector aangedragen werking missen. In derge-35 lijke gevallen kunnen de cellen onder beperkende omstandigheden worden gekweekt waarbij slechts de transformanten die het piasmide herbergen en derhalve de activiteit vertonen, zich kunnen vermeerderen.

In de voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt door het HIL-2-producerende piasmide dihydrofolaatreductase-activiteit verleend 40 aan eierstokcellen van de Chinese hamster die van zichzelf een derge- 8701132 12 lijke activiteit missen (CHO-dhfr- cellen). Transformanten worden eenvoudig uit niet getransformeerde cellen geselecteerd door kweken in een medium zonder hypoxanthine en thymidine.

De aanwezigheid van een activiteit in een piasmide die in gast-5 heercellen ontbreekt kan nog een voordeel voor de selectie van transformanten opleveren. Onder beperkende groei-omstandigheden groeien getransformeerde cellen die meervoudige copieën van het dhfr-gen bevatten en tot expressie brengen, sneller dan cellen met een of enkele copieën die geringe hoeveelheden dhfr tot expressie brengen. Dergelijke 10 omstandigheden werken daarom schiftend op cellen die het aantal copieën van het dhfr-gen dat zij tot expressie brengen hebben verhoogd of "geamplificeerd”. Wanneer een tot expressie te brengen gen in het piasmide in de buurt van het selecteerbare gen aanwezig is, kan het gewenste gen worden gecoamplificeerd wat weer leidt tot een verhoogde ex-15 pressie van het gen. Volgens de uitvinding leiden kweektransformanten in aanwezigheid van toenemende hoeveelheden amethopterine, een remmer van de de-novo-synthese van purine, tot de produktie van verhoogde hoeveelheden van zowel dihydrofolaatreductase als HIL-2. Dit proces wordt aangeduid als "co-amplificatie".

20 Volgens de uitvinding zou elk soortgelijk selecteerbaar gen-sy-steem kunnen worden gebruikt, al zullen niet alle systemen gen-amplifi-catie opleveren. Een systeem dat zou kunnen worden gebruikt maar dat geen amplificatie geeft is bijvoorbeeld gebaseerd op het gpt-gen van E. coli, dat xanthine-guanine-fosforibosyl-transferase codeert. Mulligan 25 e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2§.* 2072 (1981)] hebben ape- en muizecellen die zijn getransfecteerd met het gpt-gen dragende piasmi de geselecteerd door de cellen te kweken in aanwezigheid van mycofenolzuur (een remmer van de de-novo guanylzuursynthese), adenine en xanthine. Selectie van dit systeem wordt verder versterkt door toevoeging van 30 aminopterine (een analoog van amethopterine) aan het selectiemedium.

Een ander systeem heeft betrekking op het gen voor een bacterieel aminoglycoside-3'-fosfotransferase, waarvan het produkt bacteriën resistent maakt tegen neomycine en kanamycine. Colbere-Garapin e.a. [J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)] hebben zoogdiercellen die onder invloed van 35 de gen-promotor van thymidine-kinase van het Herpes simplex virus (HSV tk) getransfecteerd zijn met fosfotransferase-gen dragende piasmi-den geselecteerd door de cellen te kweken in aanwezigheid van G-418, een 2-deoxystreptamine-antibioticum dat de eukaryotische eiwitsynthese remt. Berg [Science 213: 296 (1981)] bereikte hetzelfde resultaat met 40 een reeks pSV-vectoren waarin het fosfotransferase-gen werd gereguleerd 8701132 * r 13 door een SV40-promotor.

Het door de producerende cellen afgescheiden HIL-2 kan met elke bekende methode in het kweekmedium worden geïdentificeerd. Bijvoorbeeld kan een biologische bepaling op basis van het gebruik van cellen 5 die voor proliferatie afhankelijk zijn van HIL-2 worden toegepast. Ook kan een radio-immuunbepaling (ria) of een enzym-gebonden immunosorptie-bepaling (elisa) worden uitgevoerd met antilichamen tegen HIL-2. Verder kan gebruik worden gemaakt van gel-elektroforese op polyacrylamide gevolgd door Western blot [Towbin e.a., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 10 4350 {1979}] of van een soortgelijke analysemethode. Verder kan analyse door middel van hoge-druk-vloeistofchromatografie zoals beschreven door Stern [Amerikaans octrooischrift 4.490.289] worden uitgevoerd.

Het HIL-2 volgens de uitvinding kan worden geconcentreerd door neerslaan met zouten zoals natrium- of ammoniumsulfaat, door ultrafil-15 tratie of door toepassing van andere bekende methoden. Verdere zuivering kan worden verkregen door conventionele eiwitzuiveringstechnieken zoals gel-filtratie, ionenuitwisselingschromatografie, preparatieve gel-elektroforese, iso-elektrische concentratie, fractionering met organische oplosmiddelen bij lage temperatuur, HPLC of tegenstroomverde-20 ling. De methoden beschreven door Stern (zie boven) worden bij voorkeur toegepast.

Volgens de uitvinding kan het bovenvermelde gezuiverde HIL-2 worden gebruikt voor soortgelijke toepassingen als de bekende immunomodu-latorverbindingen voor de behandeling en voorkoming van ziekten, b.v.

25 als middel voor de behandeling van immunosuppressieve omstandigheden.

Het kan worden toegediend in farmaceutisch aanvaardbare orale, injec-teerbare of plaatselijke preparaten en toedieningswijzen. De grootte en frequentie van de doseringen kunnen overeenkomen met die welke thans bij klinische toepassingen van bekende immunomodulatorverbindingen wor-30 den gebruikt, gewoonlijk 1-200 x 10^ eenheden daags. Deze farmaceutische preparaten volgens de uitvinding bevatten het HIL-2 in combinatie met een daarmee verenigbaar, farmaceutisch aanvaardbaar dragermate-riaal. Daarvoor is elk conventioneel dragermateriaal bruikbaar. Het dragermateriaal kan een organisch of anorganisch inert materiaal zijn 35 dat geschikt is voor enterale, percutane of parenterale toediening. Geschikte dragers zijn water, gelatine, arabische gom, lactose, zetmeel, magnesiumstearaat, talk, plantaardige oliën, polyalkyleenglycolen, in het bijzonder polyethyleenglycolen, vaseline en dergelijke. De farmaceutische preparaten kunnen ook andere farmacologisch werkzame stoffen 40 bevatten. Toevoegsels zoals reuk- en smaakstoffen, conserveermiddelen, 870 1 1 32 14 stabilisatoren, emulgeermiddelen, buffers en dergelijke kunnen in overeenstemming met de aanvaarde praktijk van het recepteren worden toegevoegd.

De farmaceutische preparaten kunnen tot elke geschikte farmaceut!-5 sche doseervorm worden verwerkt zoals: a) een vaste vorm voor orale toediening zoals tabletten, capsules, pillen, poeders, korrels en dergelijke; b) een vloeibare vorm voor orale toediening zoals oplossingen, siropen, suspensies, dranken en dergelijke; c) preparaten voor parente-rale toediening zoals steriele oplossingen, suspensies of emulsies; en 10 d) preparaten voor plaatselijke toediening zoals oplossingen, suspensies, zalven, crèmes, gelen, gemicroniseerde poeders, aerosol en en dergelijke. De farmaceutische preparaten kunnen gesteriliseerd zijn en/of hulpstoffen zoals conserveermiddelen, stabilisatoren, bevochtig!ngsmiridel en, emulgeermiddelen, osmotische druk regelende zouten en/of buffers 15 bevatten.

Parenterale doseervormen kunnen infuusvloei stoffen of injecteerba-re oplossingen zijn die intraveneus of intramusculair kunnen worden ingespoten. De preparaten kunnen ook andere medicinale stoffen bevatten. Toevoegsels zoals conserveermiddelen, stabilisatoren, emulgeermiddelen, 20 buffers en dergelijke kunnen in overeenstemming met de aanvaarde praktijk van het recepteren worden toegevoegd.

VOORBEELD

Het volgende voorbeeld dient ter illustratie van de methoden volgens welke het klonen en tot expressie brengen van HIL-2 in zoog-25 diercellen wordt uitgevoerd, zonder dat dit een beperking inhoudt. Het bewijst de duidelijke versterking van de gen-expressie die is toe te schrijven aan de vervanging van de normale 5'-niet-coderende gebieden van het HIL-2-gen door die van het insuline-gen van de rat.

BEREIDING DMA

30 Isolatie op kleine schaal van plasmide-DNA uit verzadigde een-nachtskweken werd uitgevoerd volgens de werkwijze van Birnboim e.a. [Nucleic Acids Research V. 1513 (1979)]. Volgens deze werkwijze kan een geringe hoeveelheid DNA uit een bacteriekweek voor analytische doeleinden worden verkregen. Tenzij anders aangeduid werden grotere hoeveelhe-35 den plasmide-DNA bereid zoals beschreven door Clewell e.a. [J.

Bacteriol. 110: 1135 (1972)]. Specifieke restrictie-enzymfragroenten verkregen door splitsing van plasmide-DNA werden geïsoleerd door pre-paratieve elektroforese in 1% laagsmeltende agarose (Seaplaque, FMC Inc., Rockland, ME, U.S.A.). Het DNA werd eerst afgescheiden op een gel 40 van 9 x 5 1/2 cm (50 mA, 1 uur) in tris-acetaatbuffer [Maniatis e.a., 070 1 1 32 , * f 15

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, biz. 454] en vervolgens zichtbaar gemaakt door kleuren met 1 /ug/ml ethidiumbromide. Gelstukken die het gewenste DNA-fragment bevatten werden uitgesneden en 10 minuten bij 65eC gesmolten en vervol-5 gens met 5 ml 20 mM tris/HCl (pH 7,4), 0,2M NaCl, 1 mM EDTA verdund.

Het DNA werd geconcentreerd met een Elutip-D-kolom (Schleicher and Schuell Inc., Keen, NH, U.S.A.) volgens aanwijzingen van de fabrikant en bij -20eC neergeslagen met ethanol in aanwezigheid van 10 /ug tRNA uit gist (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD, U.S.A.).

10 ENZYMREACTIES

De restrictie-enzymen, DNA-polymerase I (Klenow-fragment) en T4 DNA-ligase waren produkten van New England Biolabs, MA. De methoden en gebruiksomstandigheden van deze enzymen waren in hoofdzaak die van de fabrikant.

15 Voor de restrictie-endonucleasen wordt een eenheid van activiteit gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om een complete afbraak van 1,0 /ug DNA in 60 minuten in een totaal reactievolurne van 0,05 ml bij 37*C te bewerkstelligen. De voor al deze enzymen gebruikte buffer (hierna aangeduid als restrictie-enzymbuffer) bevatte 100 mM

20 NaCl, 10 mM tris/HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl2 en 1 mM 2-mercapto-etha-nol.

Koppeling van T4 DNA werd uitgevoerd gedurende 16 uren bij 4°C in een buffer (hierna aangeduid als ligatiebuffer) die 60 mM tris/HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiotreftol en 0,1 mM ATP bevatte. Een 25 eenheid van T4 DNA-11gase-activiteit wordt gedefinieerd als de hoeveel-. heid die nodig is om 50¾ koppeling van HindlII-fragmenten van lambda-DNA in 30 minuten bij 16eC in 20 /ul incubatiemengsel en en een concentratie van 5'-DNA-eindpunten van 0,12 /uM (300 /ug/ml) te geven.

30 Afhechting van enkelstrengs-DNA-uiteinden met het Klenow-fragment van DNA-polymerase I werd uitgevoerd in restrictie-enzymbuffer die bovendien 1 mM dGTP, dATP, dCTP en dTTP bevatte. Een eenheid van activiteit wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die 10 nmol deoxyribo-nucleotiden omzet in een in zuur onoplosbare vorm in 30 minuten bij 35 37*C.

KWEEKMEDIA

Iscove's gemodificeerd Eagle's Medium (IMEM) [Iscove e.a., J. exp. Med. 147: 923 (1978)] werd betrokken van Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y., U.S.A.

40 Luria-bouillon (LB) bevatte 5 g bacto-gistextract, 10 g bacto- 870 1 1^32 , t 16 trypton en 10 g NaCI per liter, tngesteld op pH 7,5. Het antibioticum ampicniine werd, waar aangegeven, toegevoegd tot een eindconcentratie van 50 /ug/ml.

TRANSFORMATIE EN TRANSFECTIE

5 Stammen van Escherichia coli werden getransformeerd volgens de methode van Peacock e.a. [Biochim. Blophys. Acta 655: 243 (1981)3, en wel als volgt. De cellen werden geoogst uit een LB-medium en voor transformatie voorbereid volgens de methode van Norgard e.a. [J. Biol. Chem. 255: 7665 (1980)] met dien verstande dat de CaCl2-buffer werd 10 gewijzigd en 70 mM MnCl2, 40 mM NaOAc en 30 mM CaCl2 bevatte met pH

5,6.

Een monster van 100 /ul van in de CaCl2-buffer gesuspendeerde cellen werd gecombineerd met 50 /ul piasmi demonster dat tussen 50 en 1000 ng DNA bevatte. Het mengsel werd 1 uur op ijs gehouden en vervol-15 gens 2 minuten op 37eC verwarmd. De cellen werden verspreid op LB-agar-platen bij 4°C met ampicilline en 16 uren bij 37°C gefncubeerd voor het selecteren van transformanten.

Eierstokcellen van de Chinese hamster werden getransfecteerd volgens de methode van Graham e.a. [Virology _52: 456 (1973)] en wel als 20 volgt. 0,5 ml van een mengsel dat 8 g/1 NaCl, 0,37 g/1 KC1, 0,125 g/1 Na2HP04.2H2Ö, 1 g/1 dextrose, 3 g/1 Tris en 125 mM CaCl2 bevatte met een totale hoeveelheid van 10 /ug DNA werden aan 5 x 10^ cellen toegevoegd in een kweekschaal van 6 cm die 4 ml IMEM en daarbij 10”4 M hypoxanthine en 10“5 M thymidine (HT) bevatte. Het DNA 25 in het mengsel bestond uit 5 /ug drager-DNA van de kalverthymus met hoog molecuul gewicht en 5 /ug pBC12/RSV/IL-2/dhfr DNA dat was geli-neariseerd met Pvul. De kweek werd gedurende een nacht gefncubeerd bij 37eC in een bevochtigde 5% C02-incubator waarna het medium werd verwijderd en vervangen werd door 5 ml vers IMEM waaraan toegevoegd 30 10-4 M hypoxanthine en 10"5 m thymidine (HT). Na nog een dag incubatie werden de cellen uit de schaal losgemaakt met een trypsine-EDTA-oplossing (GIBC0) en uitgespreid op twee schalen van 10 cm in 20 ml IMEM met 10¾ gedialyseerd foetaal kalfsserum (FCS) maar zonder HT. Transfectante kolonies werden na 10 dagen verder incuberen bij 37°C ge-35 isoleerd met behulp van een standaard klooncilindertechniek.

Niercellen van de Afrikaanse groene aap (COS) werden getransfecteerd volgens door Butnick e.a. [Mol. Cell. Biol. 5: 3009 (1985)] beschreven methoden. Weefselkweekschalen van 10 cm werden geënt met 3 x 10^ COS-cellen in 10 ml IMEM waaraan toegevoegd 10¾ FCS en 50 40 /ug/ml gentamycine en gedurende een nacht gefncubeerd in een be- 87 01 13 2 17 vochtigde incubator met 5¾ CO2 bij 37*C. De cellen werden vervolgens eenmaal bij 37eC gewassen met een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en tweemaal bij 37*C met PBS dat 500 /ug/ml DEAE-dextran (Pharmacia) bevatte. Het te transfecteren DNA werd vervolgens aan de 5 cellen toegevoegd. De COS-cellen werden geïncubeerd waarbij de kweek-schalen gedurende 30 minuten om de 5 minuten kalm werden geschud. Na deze incubatie werd 20 ml IMEM, dat 1.0¾ FCS, 50 /ug/ml gentamycine en 80 /uM chlorochine bevatte aan elke schaal toegevoegd. Na 2 1/2 uur verder incuberen werd het medium vervangen door vers IMEM met 10¾ FCS 10 en 50 /ug/ml gentanycine. De incubatie werd 72 uur bij 37X voortgezet en de cellen en media werden geanalyseerd zoals hieronder beschreven.

CELKWEKEN

Twee stammen van Escherichia coli werden in het hierna volgende 15 gebruikt. E. coli stam GM119 werd beschreven door Marinus e.a. [J. Bacteriol. 114: 1143 (1973)]. Deze stam is op 26 november 1985 zonder beperking gedeponeerd bij de American Type Culture Collection onder toegangsnummer ATCC 53339. E. coli stam MC1061 is beschreven door Casadaban e.a. [J. Mol. Biol. 138: 179 (1980)] en is ook op 26 november 20 1985 zonder beperkingen gedeponeerd bij de American Type Culture Collection onder toegangsnummer ATCC 53338.

Er werden drie zoogdiercellijnen gebruikt. Een cellijn was een eierstoklijn van de Chinese hamster (CHO/dhfr") die geen dihydrofo-laatreductase heeft. De cellijn was oorspronkelijk gefsoleerd door 25 Urlaub e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Th 4216 (1980)]. Culturen van deze cellijn zijn op 7 mei 1986 gedeponeerd bij de American Type Culture Collection met toegangsnummer CRL 9096. Een cellijn van de Afrikaanse groene apenier (COS) die is getransformeerd door een oorspronkelijk minus SV40 viraal genoom [Gluzman, Cell 23: 175 (1981)] is 30 bij de ATCC onder toegangsnummer CRL 1651 verkrijgbaar. Een murine IL-2 afhankelijke cellijn (CTLL), beschreven door Robb [Methods .in Enzymology 116: 493 (1985)], is beschikbaar bij de ATCC onder toegangsnummer TIB 214.

PRIMER-GERICHTE MUTAGENESE

35 Primer-gerichte plaats-specifieke mutagenese werd uitgevoerd volgens de methoden beschreven door Morinaga e.a. [Bio/Technology 2: 636 (1984)]. Het voor de mutagenese gebruikte synthetische oligonucleotide werd bereid volgens de fosforamidiet-methode met vaste drager volgens Matteucci e.a. [J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981)].

8701132 18

KOLONIEHYBRIDISATIE

Hybridisatie van kolonies werd uitgevoerd volgens een door Maniatis e.a. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, biz. 312-315] beschreven methode. Hetzelfde 5 voor de primer-gerichte mutagenese gebruikte oligonucleotide werd gebruikt als sonde voor de hybridisaties na merking van het 5'-einde met jf-32p-ATP met behulp van polynucleotide-kinase volgens de werkwijze van Maniatis e.a. [zie boven, blz. 396]. Grotere DNA-sonden die werden gebruikt voor het lokaliseren van de IL-2 en dhfr-genen werden gemerkt 10 met een "nick"-translatiekit (Amersham) volgens de aanwijzingen van de fabrikant.

OPBOUW VAN DE EXPRESSIEVECTOR pBC12/RSV/IL-2/dhfr VAN INTERLEUKINE-2

De bereiding van de uiteindelijke expressievector volgens de uitvinding geschiedde in stappen en wel achtereenvolgens: (1) bereiding 15 van een vector waarin een gemodificeerd menselijk HIL-2-gen kan worden ingevoegd, (2) modificatie van het HIL-2-gen waarbij het grootste deel van het 3'-niet-coderende gebied, alle 5'-niet-coderende sequenties en de eerste vier nucleotiden van de voor de signaalpeptidesequentie coderende sequentie werden verwijderd, en (3) invoeging van het gemodifi-20 ceerde HIL-2-gen in de bereide vector.

BEREIDING VAN DE KL00NVECT0R

1 /ug van pBC12MI-plasmide DNA (zie fig. 1) werd behandeld met 20 eenheden BamHI in 100 /ul restrictie-enzymbuffer gedurende 1 uur bij 37eC. Een monster E. coli MC1061 dat het piasmide pBC12MI bevatte 25 werd op 7 mei 1986 bij de American Type Culture Collection gedeponeerd onder toegangsnummer ATCC 67109. Het met BamHI gedigereerde piasmi de werd vervolgens 2 uren bij 15eC behandeld met 4 eenheden Klenow-frag-ment van DNA-polymerase I, waarna de reactie werd beëindigd door 5 minuten verwarmen op 65eC. 2 /ul van het mengsel werden vervolgens 30 1:10 met ligatiebuffer verdund. Het mengsel werd op ijs gekoeld. Een eenheid T4 DNA-ligase werd toegevoegd en het reactiemengsel werd 16 uren bij 4°C geïncubeerd.

Het ligeringsreactiemengsel werd vervolgens rechtstreeks gebruikt voor het transformeren van E. coli stam GM119. Transformanten werden in 35 LB-agar geselecteerd met ampicilline. Het DNA van aldus verkregen tegen ampicilline resistente kolonies werd onderzocht door splitsing met re-strictie-endonuclease. Het geïsoleerde plasmide-DNA werd eerst gedigereerd met BamHI of Clal en de verkregen DNA-fragmenten werden gescheiden door elektroforese op een 1% agarosegel en zichtbaar gemaakt 40 met 10 /ug/ml ethidiumbromide. Een plasmide dat de BamHI-plaats had 8701132 19 verloren maar een Clal-plaats daarvoor had opgenomen werd aldus geïdentificeerd en aangeduid als piasmide pBC12CI.

Plasmide pBC12CI werd vervolgens in grotere hoeveelheid bereid volgens de detergent-lysis-werkwijze van Clewell e.a. [J. Bacteriol.

5 110: 1135 (1972)]. De uiteindelijke bereiding van de kloonvector geschiedde door het splitsen van 1 /ug pBC12CI met 20 eenheden Cl al en afhechting van het digestieprodukt met Klenow-fragment van DNA-polyme-rase I.

BEREIDING VAN HET INTERLEUKINE-2 GEN-FRAGMENT 10 Plasmide pIL-2-2b, dat een cDNA-copie bevatte van het gehele coderende gebied van 459 baseparen van menselijk IL-2 geflankeerd door 31 bp van de 5‘-niet-getranslateerde sequentie en 309 bp van de 3'-niet-getranslateerde sequentie [Taniguchi e.a., Nature 302: 305 (1983)], werd als bron gebruikt van het IL-2-gen. Aangezien de nucleotidesequen-15 tie van het HIL-2-gen bekend is van Taniguchi e.a., kan het gen-frag-ment dat het HIL-2-gen bevat ook worden bereid volgens de door Souza e.a. beschreven methode [Europese octrooiaanvrage Al-134.489]. 10 /ug pIL-2-2b werden met 20 eenheden elk van Rsal en BamHI in 100 /ul restrict! e-enzymbuff er gedurende 1 uur bij 37eC gesplitst. Rsal splitst 20 de HIL-2-cDNA-inlas op een enkele plaats op 1 basepaar 3* ten opzichte van het HIL-2-startcodon. Het reactiemengsel werd vervolgens behandeld met het Klenow-fragment van DNA-polymerase I en aan preparatieve elek-troforese onderworpen in een 1% laagsmeltend agarosegel. Het gewenste 760 bp Rsal/BamHI HIL-2 cDNA-fragment werd geïdentificeerd en uit het 25 gel geëxtraheerd zoals boven beschreven.

100 ng van de bereide vector pBC12CI werd gemengd met 100 ng van het Rsal/BamHI HIL-2-fragment in 30 /u1 ligatiebuffer dat 2 eenheden T4 DNA-ligase bevatte en gedurende een nacht bij 4"C geïncubeerd. Het gekoppelde DNA werd vervolgens gebruikt om E. coli stam MC1Q61 te 30 transformeren en de transformanten werden geselecteerd op LB-agarose-platen met ampicilline.

200 ng van het geïsoleerde HIL-2-fragment werden gebruikt om een met 32p gemerkte "nick" getranslateerde sonde te vormen met behulp van de Amersham nick translatiekit volgens de aanwijzingen van de fabri-35 kant. Kolonies van de platen werden gelicht op nitrocellulosefliters (Schleicher and Schuell Inc.) en vervolgens onderzocht op de aanwezigheid van HIL-2-inlas met behulp van de gemerkte sonde en volgens de werkwijzen van Maniatis e.a. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory]. Hybridisatie-positieve kolonies 4(1 werden uitgelezen en er werden mini-DNA preparaten bereid volgens de 8701132 20 werkwijze van Birnboim e.a. De verkregen DNA-preparaten werden gesplitst met HindllI en StuI en met gel-elektroforese onderzocht op de aanwezigheid van een karakteristiek fragment van 690 bp dat wijst op de juiste constructie van de vector. Deze structuur werd aangeduid als 5 pBClO.

Er werd een grotere hoeveelheid pBCIO DNA bereid en 10 /ug werd gesplitst met 20 eenheden HindlII en 16 eenheden StuI in restrictie-en-zymbuffer gedurende 1 uur bij 37°C. Het resulterende 690 bp HIL-2 DNA-fragment werd geïsoleerd met preparatieve gel-elektroforese op agaro-10 se zoals boven beschreven.

1 /ug van plasmide pBC12MI DNA werd gesplitst met BamHI en vervolgens met Klenow-DNA-polymerase behandeld zoals boven beschreven. Na incubatie bij 65°C werd het DNA gesplitst met HindlII, geëxtraheerd met water-fenol/chloroform en neergeslagen door toevoeging van een half 15 volume 7,5 M ammoniumacetaat en 2 volumes ethanol, gevolgd door incubatie bij -70°C. Het neergeslagen pBC12MI DNA werd gewonnen· door centrifugeren, gewassen met ethanol en opnieuw gesuspendeerd in water.

100 ng van de bereide pBC12MI-vector werd gekoppeld aan 200 ng van het geïsoleerde IL-2 HindlII/StuI-fragment in 30 /ul ligatiebuffer 20 zoals boven beschreven. Het koppelingsmengsel werd gebruikt om E. coli stam MC1061 te transformeren en de transformanten werden op LB-agarose-platen met ampicilline geselecteerd. Afzonderlijke kolonies werden als boven onderzocht op de aanwezigheid van een HindlII/BamHI-fragment van 690 bp en een structuur die aan dit criterium voldeed werd aangeduid 25 als pBC12/RSV/IL-2.

Piasmi de pBC12/RSV/IL-2 zoals op deze wijze geconstrueerd bevat een chimeer HIL-2-gen waarin het 5'-niet-coderende gebied en de eerste vier nucleotiden ATG T van de voor de signaalpeptidesequentie van HIL-2 coderende sequentie alsmede vrijwel het gehele 3'-niet-coderende gebied 30 zijn vervangen door overeenkomstige sequenties van het in de pBC12MI-vector aanwezige prepro-insuline-II-gen van de rat. Gedeeltelijk werd deze constructie tot stand gebracht om een bepaald 3'-niet-coderend gebied te vormen. Maar het is juist de vervanging van het 5'-niet-code-rende gebied dat, zoals hieronder blijkt, een duidelijke verhoging in 35 de mate van expressie van het HIL-2-gen teweegbrengt. De verkregen structuur van het N-uiteinde van het HIL-2-signaalpeptide is afgebeeld in fig. 2.

Zoals uit fig. 2 blijkt resulteert deze constructie in de vorming van een chimeer signaal peptide waarin de eerste twee aminozuren van 40 IL-2 (Met-Tyr) zijn vervangen door de eerste vijf aminozuren van het 87 0 1 1 3 2

oü34ii9LC

21 signaalpeptide van ratte-lnsullne (Met-Ala-Leu-Trp-Ile) en een zesde aminozuur (Asp) dat wordt gecodeerd door een op de koppelingsplaats gecreëerde nieuwe nucleotidesequentie. Deze wijziging heeft geen effect op de functie van het signaalpeptide, dat tijdens de rijping zoals ge-5 woonlijk uit het IL-2-gen wordt afgesplitst.

INVOEGING VAN DE GEN-SEQUENTIES VAN DIHVDROFOLAATREDUCTASE

1 /ug van pBC12/RSV/IL-2 werd gesplitst met Stul. Het DNA werd geëxtraheerd met fenol/chloroform, neergeslagen met ethanol en opnieuw gesuspendeerd in water. 10 /ug pSV2dhfr DNA [Subramani e.a., 10 Mol. Cell. Biol. 1: 854 (1981)] werd gesplitst met PvuII en BamHI.

PIasmide pSV2dhfr is op 7 mei 1986 in de vorm van een monster van E. coli MC1061 (pSV2dhfr) gedeponeerd bij de American Type Culture Collection met toegangsnummer ATCC 67110. Het $V40/dhfr-genfragment van het piasmi de pSY2dhfr werd geïsoleerd in een 1-procents preparatief 15 agarosegel, waarna 100 ng van de pBC12/RSV/IL-2-vector werd gekoppeld aan 400 ng van het geïsoleerde SV40/dhfr-fragment in 40 /ug liga-tiebuffer bij 4eC gedurende een nacht. Het ligeringsmengsel werd gebruikt om rechtstreeks E. coli stam MC1061 te transformeren. De trans-formanten werden op LB-agaroseplaten met ampicilline geselecteerd.

20 Getransformeerde kolonies werden op nitrocellulosefilters gelicht en onderzocht met behulp van een met 32p gemerkte nick-translatiesonde, bereid tegen het geïsoleerde SV40/dhfr-gen-fragment. Het monster werd bereid door het merken van 200 ng van het geïsoleerde PvuII/BamHI SV40/dhfr-fragraent met behulp van de boven beschreven Amersham nick-25 translatiekit. Volgens de werkwijze van Birnboim e.a. (zie boven) werd plasmide-DNA uit hybridisatie-positieve kolonies geïsoleerd en door gel-elektroforese onderzocht op de aanwezigheid van twee BamHI-fragmenten.

De aanwezigheid van de BamHI-fragmenten bevestigde de aanwezigheid 30 van het SY40/dhfr-fragment en daarmee werd de richting van het fragment vastgesteld. Het in pBC12/RSV/IL-2 gekloonde SV40/dhfr-gen-fragment bevat een geheel murine dhfr-gen dat wordt geregeld door de vroege-ge-biedpromotor van het SV40-virus. Er werd een kloon uitgekozen waarin de HIL-2- en dhfr-genen in het piasmi de in dezelfde richting waren ge-35 plaatst en het plasmide van deze kloon werd aangeduid als pBC12/RSY/IL-2/dhfr (zie fig. 3).

STERKE EXPRESSIE VAN HET HIL-2-GEN

Voor het tot expressie brengen van het HIL-2-gen werden 1 dag voor transfectie 5 x 10^ CHQ/dhfr" cellen verspreid op een weefsel-4d kweekschaal van 6 cm in 4 ml IMEM aangevuld met 10"4 M hypoxanthine 8701132 ί·;3*:9ι_ 22 en 10-5 m thymidine (HT). Na incubatie gedurende een nacht in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37eC werden de cellen getrans-fecteerd met pBC12/RSV/IL-2/dhfr. De getransfecteerde kolonies werden als boven geïsoleerd.

5 Aldus werden gekloonde kolonies, aangeduid als d51-d56, verkregen, die elk in IMEM waren gekweekt en tegen de andere en tegen een niet gekloonde gemengde dhfr+-kweek (aangeduid d5) op HIL-2-produktie waren onderzocht. De HIL-2-produktie werd gemeten met behulp van een kwantitatieve biologische bepaling op basis van de murine IL-2 afhankelijke 10 cellijn CTLL. Deze bepaling die is beschreven door Robb [Methods in Enzymology 116: 493 (1985)] behelst het mengen van een reeks tweevoudige verdunningen van de bovenliggende media van verschillende dhfr+-celklonen met de murine IL-2 afhankelijke cellijn CTLL. Omdat de CTLL-lijn alleen groeit in aanwezigheid van IL-2 is de mate van proliferatie 15 van deze cellen zoals bepaald aan de hand van de inbouw van ^H-dT, een nauwkeurige maat van de door de dhfr+-klonen afgescheiden hoeveelheid IL-2. In plaats daarvan kunnen menselijke PHA-blasten worden gebruikt om de HIL-2-produktie te meten (Robb e.a.,' zie boven). Menselijke PHA-blasten kunnen worden verkregen door het stimuleren van menselijke pe-20 rifere bloedlymfocyten gedurende 48 uren met fytohemoagglutinine (PHA). De resultaten van deze analyse van de gekloonde kolonies zijn weergegeven in tabel A, waarbij de gegevens zijn uitgedrukt als IL-2-activiteit in zowel eenheden/ml medium en eenheden/106 cellen. Een eenheid IL-2-activiteit wordt gedefinieerd als het omgekeerde van de verdunning die 25 overeenkomt met de helft van de maximale proliferatierespons aangepast aan de respons van de IL-2-standaard die te betrekken is bij Biological Response Modifiers Program van het National Cancer Institute,

Frederick, MD, U.S.A. [Thurman, Lymphokine Res. 3: 276 (1984)] zoals beschreven door Robb, zie boven.

8701132

^S4C9LC

< 23

Tabel A

Vergelijking van IL-2-produktie van geïsoleerde klonen Kloon Concentratie Interleukine-2-activiteit 5 amethopterine (eenheden/ml) (eenheden/106 cellen) _(mol air)_ d5 0 640 456 d51 0 1.920 1.370 d52 0 1.920 N.D.

10 d53 0 1.920 1.580 d54 0 820 N.D.

d55 0 550 N.D.

d51 5 x 10-6 51.200 60.160 15 d51 2 x ΙΟ"5 51.200 80.210 d51 8 x ΙΟ"5 76.800 150.400 d51 2 x 10“4 76.800 156.900 d51 5 x 10"4 153.600 401.000 20 N.D. = niet bepaald.

U1t tabel A blijkt dat de klonen d51 en d53 de sterkste producenten van IL-2-activiteit waren. Om het bovenvermelde selecteerbare gen-versterkingseffect aan te tonen werden de klooncellen d51 7-14 dagen 25 gekweekt met stijgende concentraties amethopterine totdat een lijn werd verkregen die resistent was tegen een concentratie van 5 x ΙΟ-4 M yan de remmer. Tabel A geeft aan dat deze cellijn hoge concentraties HIL-2 afscheidde. Zoals verwacht bleek bij analyse van de cellen met Southern-analyse [Maniatis e.a., Molecular Cloning: A Laboratory 30 Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, biz. 382-389] dat elk ongeveer 100 copieën bevatte van het pBC12/RSV/IL-2/dhfr-plasmide. De homopolymere G-C-staarten die oorspronkelijk aan de HIL-2 cDNA-copie waren toegevoegd ter vergemakkelijking van de invoeging in piasmide pIL-2-2b hebben een remmend effect op de expressie van het IL-2-gen. Om 35 de mate van IL-2-expressie tussen gen-sequenties met de normale menselijke 5'-niet-coderende gebieden en sequenties waarin deze gebieden waren vervangen door die van het ratte-insuline-gen goed te kunnen vergelijken, werd een piasmi de bereid waarin de remmende homopolymere staarten waren verwijderd. Dit plasmide werd aangeduid als pBC40AT.

870 1 ) 32 i 24

CONSTRUCTIE VAN PLASMIDE pBC40AT

Een uitgeknipte vector waarin het HIL-2-gen kon worden gekloond werd bereid door 1 /ug van pBC12MI te splitsen met 20 eenheden BamHI en 20 eenheden HindlII in restrictie-enzymbuffer gedurende 1 uur bij 5 37°C. Het verkregen fragment werd vervolgens behandeld met het Klenow-fragment van DNA-polymerase I, geëxtraheerd met fenol/chloroform en neergeslagen zoals boven beschreven.

Een HIL-2 DNA-fragment werd bereid door splitsen van 10 /ug pIL-2-2b DNA met 20 eenheden BamHI en 8 eenheden Stul en afgehecht met 10 Klenow-DNA-polymerase. Een HIL-2-fragment van ongeveer 550 bp werd vervolgens geïsoleerd uit een 1-procents preparatief agarosegel zoals boven beschreven.

100 ng van de bereide vector pBC12MI werd vervolgens geligeerd met 150 ng van het HIL-2 BamHI/StuI-fragment in 25 /ul ligatiebuffer zo-15 als eerder beschreven. Het koppelingsmengsel werd rechtstreeks gebruikt om E. coli stam MC1061 te transformeren en de transformanten werden geselecteerd op LB-agaroseplaten met ampicilline. Ampicilline-resistente kolonies werdén uit de platen gelicht op nitrocellulosefilters en onderzocht op de aanwezigheid van de HIL-2-inlas door koloniehybridisatie 20 met een met 32P gemerkte nick-getranslateerde sonde bereid tegen 200 ng van het gezuiverde BamHI/StuI-fragment met de Amersham-kit.

Hybridisatie-positieve kolonies werden geïsoleerd en onderzocht op de aanwezigheid van een BstEII/BamHI-fragment van ongeveer 560 bp volgens de methode van Birnboim e.a. (restrictie-enzymanalyse van plas-25 mide-DNA). Een structuur met daarin het genoemde fragment werd geïdentificeerd en aangeduid als pBC40. Plasmide pBC40 is identiek met pBC12/RSV/IL-2 behalve dat dit het insuline 5'-niet-coderende gebied mist en in plaats daarvan het natuurlijke 5'-niet-getranslateerde gebied van HIL-2 van 31 bp heeft. Het plasmide bevat ook het natuurlijke 30 HIL-2-startcodon en heeft de homopolymere staart van 17 bp die is gelegen in het 5'-niet-coderende gebied. Een grotere hoeveelheid pBC40 DNA werd bereid volgens de methode van Clewell e.a. [J. Bacteriol. 110: 1135 (1972)].

Het homopolymere staartsegment van het HIL-2-gen werd gedeleteerd 35 volgens de primer-gerichte mutagenesemethode van Morinaga e.a. [Bio/Technology 2: 636 (1984)]. Hiervoor werd een gefosforyleerde 24-mer deoxyoligonucleotide-primer bereid volgens de fosforamidietme-thode met vaste drager zoals boven beschreven welke 12 deoxynucleotiden bevatte die in volgorde complementair zijn aan de basen aan beide zij-40 den van het te verwijderen homopolymere gebied op een van de DNA-stren- 87 0ΤΊ3 2....... ......... ......................”........... ...................................

* *' ·* \ 25 gen. De nucleotide-sequentie van deze 24-mer primer en die van het DNA dat het te verwijderen homopolymere gebied bevat, zijn afgebeeld in fig. 4. Gebieden die tijdens de mutagenese hybridisatie ondergaan zijn daarbij onderstreept. Verwijdering van het homopolymere gebied cre-5 eert een nieuwe HindiII-plaats in het resulterende DNA.

Voor de mutageneseprocedure werd 1 /ug pBC40 DNA gelineariseerd met Pvul, geëxtraheerd met fenol/chloroform, neergeslagen in ethanol en opgenomen in 20 /ul water. Nog eens 10 /ug pBC40 werd gesplitst met EcoRI en het grootste geproduceerde vectorfragment, aangeduid als 10 de "gekloofde vector", werd geïsoleerd in een 1-procents preparatief agarosegel.

Gelijke hoeveelheden van 200 ng van de gelineariseerde en gekloofde plasmiden werden vervolgens met een 20-voudige mol ai re overmaat van het gefosforyleerde oligonucleotide in 10 /ul water gemengd en er 15 werd 2 /ul lOx Klenow-buffer [1M NaCl, 65 mM tris/HCl (pH 7,4), 45 mM MgCl2 en 10 mM 2-mercapto-ethanol] toegevoegd. Het mengsel werd achtereenvolgens 5 minuten bij 100eC, 30 minuten bij kamertemperatuur, 30 minuten bij 4eC en 5 minuten op ijs behandeld waarna het monster werd aangevuld tot een volume van 20 /ul door toevoeging van 2 /ul 10 mM 20 ATP, 4 /ul van een mengsel van 2,5 mM dCTP, dATP, dGTP en dTTP, 0,5 /ul Klenow-plymerase I (2,5 eenheden van activiteit) en 1 /ul T4 DNA-ligase (0,8 eenheden van activiteit).

Het mengsel werd 16 uren bij 15*C gefncubeerd en vervolgens rechtstreeks gebruikt om E. coli stam MC1061 te transformeren. De 25 transformanten werden geselecteerd op LB-agaroseplaten met ampicilline, en kolonies van de plaat werden op nitrocellulosefilters gelicht en onderzocht op de aanwezigheid van een sequentie die homoloog is aan de bij de mutagenese gebruikte 24-mer primer met behulp van het met a-32p_ATp als sonde gemerkte synthetische oligonucleotide.

30 Positieve kolonies werden verder volgens de methode van Birnboim e.a. onderzocht op de aanwezigheid van een verwacht HindlII/BamHI-fragment van 530 bp. Omdat de met deze procedure verkregen kolonies gemengd zijn (Morinaga e.a., zie boven) werd een positief DNA-monster gebruikt om E. coli MC1061 te retransformeren en werden daaruit verkregen kolo-35 nies opnieuw onderzocht op het 530 bp HindlII/BamHI-fragment. Een aldus geïdentificeerde positieve kolonie die aangeduid werd als pBC40AT was Identiek aan pBC40 op de deletie van een 22 bp segment in de niet ge-translateerde leider na, hoofdzakelijk bestaande uit de homopolymere G-C-sequentie van 17 bp.

8701132 4' f * * 26

FUNCTIONELE VERGELIJKING VAN VECTOREN pBC12/RSV/IL-2, pBC40 EN pBC40AT

De drie boven beschreven structuren werden vergeleken wat betreft vermogen om de synthese van menselijk HIL-2 te richten met behulp 5 van de kwantitatieve transiënte-expressiebepaling met getransfereerde COS-cel volgens Butnick e.a. [Mol. Cell. Biol. 5; 3009 (1985)]. Hierbij worden equimolaire hoeveelheden van de te vergelijken DNA-pre-paraten door transfectie ingevoerd in de niercellijn COS van de Afrikaanse groene aap, beschreven door Gluzman [Cel! 23; 175 (1981)], die 10 door een oorspronkelijk minus SV40 viraal genoom wordt getransformeerd. Deoxyribonucleinezuren die een SV40 replicatie-oorsprong bevatten (zoals de proefplasmi den) die in deze cellen worden ingevoerd, worden in een hoge oplage gerepliceerd en aldus doeltreffend tot expressie gebracht door de in de cellen aanwezige SV40 afhankelijke DNA-replicatie-15 machinerie.

De door de getransformeerde COS-cellen geproduceerde concentraties HIL-2 werden bepaald met behulp van de kwantitatieve biologische bepaling met CTLL-cellijn volgens Robb (zie boven) waarvan de resultaten voor vier verschillende proeven in tabel B zijn weergegeven.

20

Tabel B

Effect van S'-niet-coderende sequenties op expressie van inter!eukine-2 Relatieve IL-2-produktie 25 (eenheden/ml)

Kloon_1_2_3_4 gemiddeld (¾) pBC12/RSV/IL-2 1.024 512 1.536 6.144 100 pBC40 24 8 32 192 2,8 pBC40AT 128 96 128 768 12,1 30

Zoals blijkt uit tabel B, richt plasmide pBC12/RSV/IL-2 de synthese van aanzienlijk hogere concentraties IL-2 dan piasmiden pBC40 en pBC40AT doen. Ook al maakt de aanwezigheid van een homopolymeer gebied in het 5'-niet-coderende gebied van pBC40 dit minder effectief dan 35 pBC40AT, is het voornaamste verschil tussen de drie piasmi den toch gelegen in het feit dat de massa van de 5'-niet-getranslateerde sequenties van pBC40 en pBC40AT natuurlijke menselijke sequenties zijn, terwijl in plasmide pBC12/RSV/IL-2 de overeenkomstige sequenties van het prepro-insiiline-II-gen van de rat aanwezig zijn.

40 De vervanging van de normale menselijke 5'-niet-coderende sequen- 87 0 1132 y 27 ties door die van het ratte-insuline-gen verhoogt de HIL-2-expressie om onduidelijke redenen aanzienlijk. Inzicht in het mechanisme van deze verhoogde expressie is echter niet van belang voor de uitvinding. Het zou kunnen zijn dat de verhoogde stabiliteit van tnRNA voor dit effect 5 verantwoordelijk is. Ook is het mogelijk dat vervanging van het natuurlijke II»-2 AUG-codon door het startcodon AUG van insuline (fig. 2) een hoger translatlerendement geeft als gevolg van de gunstiger sequentie naast het insulinestartcodon [Kozak, Cel! 44: 283 (1986)].

Diverse wijzigingen en aanpassingen van deze uitvinding zijn moge-10 lijk zonder van de kern van de uitvinding af te wijken zoals de deskundigen duidelijk zal zijn. De hier beschreven specifieke uitvoeringsvormen dienen slechts als voorbeeld en beperken de uitvinding geenszins.

8701132

Claims (24)

1. DNA-sequentie coderend voor menselijk interleukine-2 en een signaalpeptidesequentie, omvattende een gen voor het coderen van menselijk interleukine-2 en een signaalpeptidesequentie, waarbij de 5'-niet- 5 coderende sequenties van het gen zijn vervangen door heterologe 5'-niet-coderende sequenties.

2. DNA-sequentie volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de heterologe 5'-niet-coderende sequenties afkomstig zijn van een insulinegen van de rat.

3. DNA-sequentie volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat boven dien de aangrenzende nucleotiden van de voor de signaalpeptidesequentie coderende deel sequentie zijn vervangen door overeenkomstige heterologe sequenties.

4. DNA-sequentie volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de aan- 15 grenzende nucleotiden ATG T van de voor de signaalpeptidesequentie coderende deel sequentie zijn vervangen door de nucleotiden ATG GCC CTG TGG ATC G van de deel sequentie coderend voor de signaalpeptidesequentie van prepro-insuline II van de rat.

5. Recombinantvector omvattende een vector en een DNA-sequentie 20 volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat de recombinantvector in staat is de expressie van de DNA-sequentie in een verenigbare zoogdiercel te richten.

6. Recombinantvector volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de vector een SV40 ori-gebied, een lange terminale herhalingspromotor van

25 Rous sarcoomvirus en een insuline-II-gen van de rat omvat.

7. Recombinantvector volgens conclusie 5, gekozen uit de groep pBC12/R5V/IL-2 en pBC12/RSV/IL-2/dhfr.

8. Zoogdiercel die een DNA-sequentie volgens een der conclusies 1-4 bevat, met het kenmerk, dat de zoogdiercel in staat is het door de

30 DNA-sequentie gecodeerde menselijke interleukine-2 tot expressie te brengen.

9. Zoogdiercel die een recombinantvector volgens een der conclusies 5-7 bevat die in staat is het door de in die vector aanwezige DNA-sequentie coderende menselijke interleukine-2 tot expressie te bren- 35 gen.

10. Zoogdiercel volgens conclusie 8 of 9, met het kenmerk, dat de recombinantvector of de daarin aanwezige DNA-sequentie wordt geamplifi-ceerd.

11. Werkwijze voor het bereiden van menselijk interleukine-2, met 40~ het kenmerk, dat men een zoogdiercel die een recombinantvector volgens ®7ö ï 132 ....................” ............. SCSACfllC V Μ een der conclusies 5-7 bevat, kweekt en menselijk 1nterleuk1ne-2 uit het kweekmediura isoleert.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de recom-binantvector door transfectie in de zoogdiercel wordt ingevoerd.

13. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de recom- binantvector een selecteerbaar gen bevat en men de zoogdiercel kweekt in een selectiemedium waarbij meervoudige copieën van het selecteer-bare gen en de voor menselijk inter!eukine-2 coderende DNA-sequentie worden bereid door co-amplificatie.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het se- lecteerbare gen codeert voor dihydrofolaatreductase, de zoogdiercel van zichzelf dihydrofolaatreductase-activiteit mist en het selectiemedium geen hypoxanthine en thymidine en wel amethopterine bevat.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de zoog-15 diercel een CHO/dhfr- cel is.

16. Werkwijze voor de bereiding van een zoogdiercel volgens een der conclusies 8-10, met het kenmerk, dat men een recombinantvector volgens een der conclusies 5-7 in een zoogdiercel invoert.

17. Menselijk inter!eukine-2 te verkrijgen volgens een werkwijze 20 volgens een der conclusies 11-15.

18. Menselijk inter!eukine-2 bereid volgens een werkwijze volgens een der conclusies 11-15.

19. Menselijk inter!eukine-2 volgens conclusie 17 of 18 in vrijwel zuivere vorm.

20. Menselijk inter!eukine-2 volgens een der conclusies 17-19 als geneesmiddel.

21. Farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat dit menselijk inter!eukine-2 volgens een der conclusies 17-19 bevat.

22. Werkwijze voor de behandeling en/of voorkoming van ziekten, 30 met het kenmerk, dat men een menselijk interleukine-2 volgens een der conclusies 17-19 toepast.

23. Werkwijze voor de toepassing van een menselijk inter!eukine-2 volgens een der conclusies 17-19 als immunomodulatorverbinding.

24. Werkwijze voor de behandeling van immunosuppressieve condi-35 ties, met het kenmerk, dat men een menselijk interleukine-2 volgens een der conclusies 17-19 toepast. 1 1- 1- « »1 « TTTTTTT 8701132