JP2530632B2 - ヒトインタ―フェロンの生産方法 - Google Patents
ヒトインタ―フェロンの生産方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト細胞を用いて遺伝子組換え技術により
ヒトインターフェロンを量産することを目的とした形質
転換体およびそれによるヒトインターフェロンの生産方
法に関する。
ヒトインターフェロンを量産することを目的とした形質
転換体およびそれによるヒトインターフェロンの生産方
法に関する。
［従来の技術］ インターフェロンは抗ウイルス作用を示す糖蛋白質で
あり，抗癌剤として利用が最も期待されている生理活性
物質である。
あり，抗癌剤として利用が最も期待されている生理活性
物質である。
インターフェロンは種特異性が高く、すなわち、ヒト
に対してはヒトのインターフェロンしか効かないという
制約がある上に、天然のインターフェロンは微量にしか
得られないという問題があったが、近年急速な発展をと
げている遺伝子操作技術はこれら生体内微量生理活性物
質を大量に供給できる新しい方法を提供しつつある。
に対してはヒトのインターフェロンしか効かないという
制約がある上に、天然のインターフェロンは微量にしか
得られないという問題があったが、近年急速な発展をと
げている遺伝子操作技術はこれら生体内微量生理活性物
質を大量に供給できる新しい方法を提供しつつある。
本発明にかかわるヒトインターフェロンβやヒトイン
ターフェロンγについてもすでにチャイニーズハムスタ
ー細胞を用いた糖鎖がついたヒトインターフェロンの量
産化が報告されている（S.W.Stanfield et al,Mol.Cel
l.Biol.,4,173,1984;Michel et al,Serono Symp.,23,6
7,1985）。
ターフェロンγについてもすでにチャイニーズハムスタ
ー細胞を用いた糖鎖がついたヒトインターフェロンの量
産化が報告されている（S.W.Stanfield et al,Mol.Cel
l.Biol.,4,173,1984;Michel et al,Serono Symp.,23,6
7,1985）。
しかし、ヒト以外の細胞を用いてヒトインターフェロ
ンを合成した場合、糖鎖の構造が異なる可能性がある。
ンを合成した場合、糖鎖の構造が異なる可能性がある。
このため、ヒト以外の細胞で生産したヒトインターフ
ェロンは天然型ヒトインターフェロンとは生理活性や抗
原性が異なる可能性が考えられる。
ェロンは天然型ヒトインターフェロンとは生理活性や抗
原性が異なる可能性が考えられる。
したがって、抗癌剤などとしては天然型ヒトインター
フェロンの利用が望ましい。
フェロンの利用が望ましい。
天然型ヒトインターフェロンβの生産方法としては、
正常ヒト二倍体線維芽細胞を薬剤で処理する方法がある
が（〔E.A.Havell et al,Antimicrob.Aqents.Chemothe
r.,2,476 1972）、これには次のような欠点がある。
正常ヒト二倍体線維芽細胞を薬剤で処理する方法がある
が（〔E.A.Havell et al,Antimicrob.Aqents.Chemothe
r.,2,476 1972）、これには次のような欠点がある。
1.正常細胞では継代数に限りがあるため、常に新しい細
胞を供給しなければならない。
胞を供給しなければならない。
2.生産に使用した細胞はヒトインターフェロンβ産生後
死滅するため、細胞の再使用ができない。
死滅するため、細胞の再使用ができない。
3.一般的に細胞の増殖速度は遅いため、大量培養に移る
までに時間がかかる。
までに時間がかかる。
4.ヒト細胞の培養には高価な血清が必要なため生産コス
トが高い。
トが高い。
天然型ヒトインターフェロンγの生産方法としては、
末梢血リンパ球を薬剤で処理する方法があるが（H.M.Jo
nson et al,Methods Enzymol.,78（PtA）,158,1981）、
これには次のような欠点がある。
末梢血リンパ球を薬剤で処理する方法があるが（H.M.Jo
nson et al,Methods Enzymol.,78（PtA）,158,1981）、
これには次のような欠点がある。
1.生産に使用した細胞はヒトインターフェロン産生後死
滅するため細胞の再使用ができない。
滅するため細胞の再使用ができない。
2.細胞のヒトインターフェロン産生量は低い。
3.血液由来細胞を用いるため、供給量に限りがあるの
で、量産化ができない。
で、量産化ができない。
このように、従来ではヒト細胞で効率良くヒトインタ
ーフェロンを産生できる系は存在しなかった。
ーフェロンを産生できる系は存在しなかった。
一方、遺伝子操作技術を用いたヒト細胞発現系として
は、BKウイルスを利用した系（G.Milanesi et al,Mol.C
ell.Biol.,4,1551,1984）、EBウイルスを利用した系
（J.L.Yeates et al,Nature,313,812,1985）、アデノウ
イルスを利用した系（M.Yamada et al,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,82,3567,1985）が知られているが、これらには
次のような欠点がある。
は、BKウイルスを利用した系（G.Milanesi et al,Mol.C
ell.Biol.,4,1551,1984）、EBウイルスを利用した系
（J.L.Yeates et al,Nature,313,812,1985）、アデノウ
イルスを利用した系（M.Yamada et al,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,82,3567,1985）が知られているが、これらには
次のような欠点がある。
BKウイルス系の宿主細胞143BやHelaはヒトインターフ
ェロンに感受性なため、ヒトインターフェロンの産生に
は向かないし、BKウイルスはウイスコット アルドリッ
チ症候群などの免疫疾患を引き起こすと考えられている
ので（J.Virol.16,959,1975）、ウイルス由来の蛋白の
混入が心配である。
ェロンに感受性なため、ヒトインターフェロンの産生に
は向かないし、BKウイルスはウイスコット アルドリッ
チ症候群などの免疫疾患を引き起こすと考えられている
ので（J.Virol.16,959,1975）、ウイルス由来の蛋白の
混入が心配である。
EBウイルス系の宿主となるRajiなどの細胞は形質転換
が困難であるし、EBウイルスはバーキットリンパ腫を引
き起こすと考えらているので（Zur Hausent.H.DNA Tumo
r Virus,ed.Tooze.t,Cold Spring Harbar Laboratory,p
747−795,1982）、安全性に問題がある。
が困難であるし、EBウイルスはバーキットリンパ腫を引
き起こすと考えらているので（Zur Hausent.H.DNA Tumo
r Virus,ed.Tooze.t,Cold Spring Harbar Laboratory,p
747−795,1982）、安全性に問題がある。
アデノウイス系の宿主細胞はHelaであるためヒトイン
ターフェロンの産生には向かないし、この系はウイルス
の感染系を用いるため一過性である。
ターフェロンの産生には向かないし、この系はウイルス
の感染系を用いるため一過性である。
さらに、ヒト細胞発現系によるヒトインターフェロン
γの生産例としは、ＷI・26VA4およびFLを用いた系があ
るが（特開昭61−88875）、その生産性はそれぞれ524U/
24h/106cellsおよび3U/24h/106cellsと低い。
γの生産例としは、ＷI・26VA4およびFLを用いた系があ
るが（特開昭61−88875）、その生産性はそれぞれ524U/
24h/106cellsおよび3U/24h/106cellsと低い。
したがって、これまではヒトインターフェロンの産生
に適したヒト細胞発現系は存在しなかった。
に適したヒト細胞発現系は存在しなかった。
［発明が解決しようとうする問題点］ 本発明の目的は、天然性ヒトインターフェロンを高い
産生効率で産生し、安全でかつ継代数にかぎりがない株
化ヒト細胞を遺伝子操作技術を利用して樹立することに
ある。
産生効率で産生し、安全でかつ継代数にかぎりがない株
化ヒト細胞を遺伝子操作技術を利用して樹立することに
ある。
［問題点を解決するための手段］ 本発明は真核細胞型プロモータの支配下に置かれたヒ
トインターフェロンβ遺伝子あるいはヒトインターフェ
ロンγ遺伝子を持つベクターにより形質転換されたヒト
肺癌由来細胞PC8あるいはヒト肺癌由来細胞PC12を、培
養することを特徴とするヒトインターフェロンの生産方
法に関する。
トインターフェロンβ遺伝子あるいはヒトインターフェ
ロンγ遺伝子を持つベクターにより形質転換されたヒト
肺癌由来細胞PC8あるいはヒト肺癌由来細胞PC12を、培
養することを特徴とするヒトインターフェロンの生産方
法に関する。
以下に本発明で好ましい生産系である恒常的あるいは
薬剤誘導的にヒトインターフェロンを産生できる系を例
に説明する。
薬剤誘導的にヒトインターフェロンを産生できる系を例
に説明する。
ヒト細胞でのヒトインターフェロン発現ベクターの作
製は、動物細胞内で機能するプロモータの制御下にヒト
インターフェロン遺伝子が置かれた遺伝子配列と、大腸
菌での複製開始点と薬剤耐性遺伝子とからなる遺伝子配
列とを結合することにより達成せられる。ここに言うヒ
トインターフェロン遺伝子とは、ヒトインターフェロン
α、βまたはγが呈する生物学的活性を有するタンパク
のアミノ酸配列をコードする遺伝子を意味する。
製は、動物細胞内で機能するプロモータの制御下にヒト
インターフェロン遺伝子が置かれた遺伝子配列と、大腸
菌での複製開始点と薬剤耐性遺伝子とからなる遺伝子配
列とを結合することにより達成せられる。ここに言うヒ
トインターフェロン遺伝子とは、ヒトインターフェロン
α、βまたはγが呈する生物学的活性を有するタンパク
のアミノ酸配列をコードする遺伝子を意味する。
本発明の真核細胞型プロモータとは、動物ウイルスの
プロモータもしくは動物細胞遺伝子のプロモータであっ
て、ヒト細胞の中で下流のヒトインターフェロン遺伝子
をmRNAへ転写する機能のあるものであれば何でもよい。
プロモータもしくは動物細胞遺伝子のプロモータであっ
て、ヒト細胞の中で下流のヒトインターフェロン遺伝子
をmRNAへ転写する機能のあるものであれば何でもよい。
一例として、SV40初期プロモータ,SV40後期プロモー
タ,HBウイルス遺伝子のプロモータ,MMTVプロモータ，ヒ
トＴ細胞白血病ウイルスのプロモータ等が動物ウイルス
のプロモータとして挙げられる。また、チミジンキナー
ゼ遺伝子のプロモータ，メタロチオネイン遺伝子のプロ
モータ，熱ショック蛋白のプロモータ，インターフェロ
ン遺伝子のプロモータ等が動物細胞遺伝子のプロモータ
として挙げられる。これらは一種でも二種以上併用して
も良い。
タ,HBウイルス遺伝子のプロモータ,MMTVプロモータ，ヒ
トＴ細胞白血病ウイルスのプロモータ等が動物ウイルス
のプロモータとして挙げられる。また、チミジンキナー
ゼ遺伝子のプロモータ，メタロチオネイン遺伝子のプロ
モータ，熱ショック蛋白のプロモータ，インターフェロ
ン遺伝子のプロモータ等が動物細胞遺伝子のプロモータ
として挙げられる。これらは一種でも二種以上併用して
も良い。
これらのうち恒常的に発現させるプロモータは、SV40
初期プロモータ,SV40後期プロモータ，アデノウイルス
遺伝子のプロモータ,HBウイルス遺伝子のプロモータ，
ヒトＴ細胞白血病ウイルスのプロモータ，チミジンキナ
ーゼ遺伝子のプロモータ等である。また、誘導的に発現
させるプロモータは、MMTVプロモータ、メタロチオネイ
ン遺伝子のプロモータ，熱ショック蛋白のプロモータ．
インターフェロン遺伝子のプロモータ等である。
初期プロモータ,SV40後期プロモータ，アデノウイルス
遺伝子のプロモータ,HBウイルス遺伝子のプロモータ，
ヒトＴ細胞白血病ウイルスのプロモータ，チミジンキナ
ーゼ遺伝子のプロモータ等である。また、誘導的に発現
させるプロモータは、MMTVプロモータ、メタロチオネイ
ン遺伝子のプロモータ，熱ショック蛋白のプロモータ．
インターフェロン遺伝子のプロモータ等である。
なお、真核細胞型プロモータの上流には、転写効率を
高めると言われているHarbeyマウス肉腫ウイルスの５′
LTRエンハンサー配列あるいはSV40のエンハンサー配列
を挿入することが好ましい。
高めると言われているHarbeyマウス肉腫ウイルスの５′
LTRエンハンサー配列あるいはSV40のエンハンサー配列
を挿入することが好ましい。
大腸菌における複製開始点と薬剤耐性遺伝子を結合す
ることは該ベクターDNAを簡便，大量かつ純粋に調製す
るために有用である。複製開始点としては、大腸菌染色
体DNAの合成阻害剤で複製の増幅が起こることが知られ
ているコリシンE1プラスミド由来のもの例えばpBR322お
よびこれに類縁のプラスミドは望ましいが、これに限定
されるものではない。
ることは該ベクターDNAを簡便，大量かつ純粋に調製す
るために有用である。複製開始点としては、大腸菌染色
体DNAの合成阻害剤で複製の増幅が起こることが知られ
ているコリシンE1プラスミド由来のもの例えばpBR322お
よびこれに類縁のプラスミドは望ましいが、これに限定
されるものではない。
薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子，
テトラサイクリン耐性遺伝子，カナマイシン耐性遺伝
子，ストレプトマイシン耐性遺伝子，ネオマイシン耐性
遺伝子等が挙げられる。
テトラサイクリン耐性遺伝子，カナマイシン耐性遺伝
子，ストレプトマイシン耐性遺伝子，ネオマイシン耐性
遺伝子等が挙げられる。
以上の様な性質を持つ２つのDNA断片を結合すること
によりヒト細胞でのヒトインターフェロン発現ベクター
を作ることができる。
によりヒト細胞でのヒトインターフェロン発現ベクター
を作ることができる。
ベクターDNAを導入するヒト細胞としてはヒト肺癌由
来細胞が用いられ、好ましくはヒトインターフェロンで
増殖阻害のかからないヒト細胞が用いられる。具体例と
しては、ヒト肺癌由来細胞PC8及びPC12（M.Kinjo et a
l,Br.J.Cancer,39,15,1979）が挙げられる。
来細胞が用いられ、好ましくはヒトインターフェロンで
増殖阻害のかからないヒト細胞が用いられる。具体例と
しては、ヒト肺癌由来細胞PC8及びPC12（M.Kinjo et a
l,Br.J.Cancer,39,15,1979）が挙げられる。
ベクターDNAの調製は一般的な方法で行うことができ
る。（T.Maniatis et al,Molecular Cloning ,p86〜96,
1982）。
る。（T.Maniatis et al,Molecular Cloning ,p86〜96,
1982）。
ベクターDNAの動物細胞への導入は既存のリン酸カル
シウム法により可能である（F.L.Grahamet al,Virolog
y,54,536,1973）。
シウム法により可能である（F.L.Grahamet al,Virolog
y,54,536,1973）。
ヒトインターフェロン発現ベクターが導入されたヒト
細胞は、該ベクターをG418耐性遺伝子発現ベクターpSV2
neo（P.J.Southern et al,J.Mol.Appl.Genet.,1,327,19
82）、あるいはpNEO5′（M.Lusky et al,Cell,36,391,1
984）とともに導入すれば、形質転換されなかった細胞
が生き残れないG418を含む選択培地で生育できるため容
易に識別できる。
細胞は、該ベクターをG418耐性遺伝子発現ベクターpSV2
neo（P.J.Southern et al,J.Mol.Appl.Genet.,1,327,19
82）、あるいはpNEO5′（M.Lusky et al,Cell,36,391,1
984）とともに導入すれば、形質転換されなかった細胞
が生き残れないG418を含む選択培地で生育できるため容
易に識別できる。
恒常的プロモータ例えばSV40初期プロモータの支配下
にヒトインターフェロン遺伝子が置かれたベクターによ
り形質転換された細胞は恒常的にヒトインターフェロン
を培養液中に分泌し、誘導的プロモータ例えばMMTVプロ
モータの支配下にヒトインターフェロン遺伝子が置かれ
たベクターにより形質転換された細胞は培養液中に薬剤
を添加することにより誘導的にヒトインターフェロンを
培養液中に分泌する。
にヒトインターフェロン遺伝子が置かれたベクターによ
り形質転換された細胞は恒常的にヒトインターフェロン
を培養液中に分泌し、誘導的プロモータ例えばMMTVプロ
モータの支配下にヒトインターフェロン遺伝子が置かれ
たベクターにより形質転換された細胞は培養液中に薬剤
を添加することにより誘導的にヒトインターフェロンを
培養液中に分泌する。
形質転換された細胞により合成されたヒトインターフ
ェロンは、培養液から一般的な精製法により精製でき
る。例えば、抗ヒトインターフェロン抗体を結合した抗
体カラムを用いれば一段でほぼ純品に近いヒトインター
フェロンが得られる。ヒトインターフェロンの精製に使
用されている数々の方法もそのまま適用することができ
る。
ェロンは、培養液から一般的な精製法により精製でき
る。例えば、抗ヒトインターフェロン抗体を結合した抗
体カラムを用いれば一段でほぼ純品に近いヒトインター
フェロンが得られる。ヒトインターフェロンの精製に使
用されている数々の方法もそのまま適用することができ
る。
［実施例］ 以下に、SV40初期プロモータ、MMTVプロモータ、もし
くはショウジョウバエ熱ショック蛋白のプロモータの支
配下に置かれたヒトインターフェロン遺伝子を導入した
ト細胞で、ヒトインターフェロンを産生させた例を示す
が、本発明は無論これに限定されるものではない。
くはショウジョウバエ熱ショック蛋白のプロモータの支
配下に置かれたヒトインターフェロン遺伝子を導入した
ト細胞で、ヒトインターフェロンを産生させた例を示す
が、本発明は無論これに限定されるものではない。
実施例１ ヒトインターフェロンβ発現ベクターpSVβの作製： pSVβは、ヒトインターフェロンβ発現ベクターpSV2I
FNβ（特開昭61−52283）から真核細胞での複製を阻害
する配列（M.Lusky et al,Nature,293,79,1981）を除去
したベクターである。作製方法は以下の通りである。
（第１図参照） まず、pSV2IFNβのSV40初期プロモータの上流にあるP
vuIIサイトをSalIリンカーを用いてSalIサイトに置き換
えたあと、SalIとBamHIで切断してヒトインターフェロ
ンβの発現に必要な1.7KbのDNA断片を分離した。
FNβ（特開昭61−52283）から真核細胞での複製を阻害
する配列（M.Lusky et al,Nature,293,79,1981）を除去
したベクターである。作製方法は以下の通りである。
（第１図参照） まず、pSV2IFNβのSV40初期プロモータの上流にあるP
vuIIサイトをSalIリンカーを用いてSalIサイトに置き換
えたあと、SalIとBamHIで切断してヒトインターフェロ
ンβの発現に必要な1.7KbのDNA断片を分離した。
次に、pBR322から真核細胞での複製を阻害する配列を
除いたベクターpML2d（M.Lusky et al,Nature,293,79,1
981）をSalIをBamHIで切断し長鎖断片を分離した。
除いたベクターpML2d（M.Lusky et al,Nature,293,79,1
981）をSalIをBamHIで切断し長鎖断片を分離した。
これら２つのDNA断片をT4DNAリガーゼを用いて結合し
pSVβを得た。
pSVβを得た。
実施例２ ヒトインターフェロンβ発現ベクターpSV（ｒ）βの作
製： pSV（ｒ）βは、実施例１のpSVβのヒトインターフェ
ロンβシグナルペプチド遺伝子の上流に翻訳効率を高め
ると言われているCAAAG配列（M.Kozak,Nature,308,241,
1984）を挿入したベクターである。作製方法は以下の通
りである。（第２図参照） まず、pSVβをヒトインターフェロンβシグナルペプ
チド遺伝子の上流にある制限酵素XbaIサイトで切断後S1
ヌクレアーゼを用いて平滑末端化したあと、SV40初期プ
ロモータの下流にある制限酵素HindIIIサイトで切断す
ることにより、ヒトインターフェロンβ遺伝子の翻訳開
始コドンATGの上流に任意の配列を挿入できるようにし
た。
製： pSV（ｒ）βは、実施例１のpSVβのヒトインターフェ
ロンβシグナルペプチド遺伝子の上流に翻訳効率を高め
ると言われているCAAAG配列（M.Kozak,Nature,308,241,
1984）を挿入したベクターである。作製方法は以下の通
りである。（第２図参照） まず、pSVβをヒトインターフェロンβシグナルペプ
チド遺伝子の上流にある制限酵素XbaIサイトで切断後S1
ヌクレアーゼを用いて平滑末端化したあと、SV40初期プ
ロモータの下流にある制限酵素HindIIIサイトで切断す
ることにより、ヒトインターフェロンβ遺伝子の翻訳開
始コドンATGの上流に任意の配列を挿入できるようにし
た。
次に化学合成した２本のオリゴヌクレオチドをアニー
リングすることにより、５′末端にHindIII断末端を
３′末端に平滑末端を持つ挿入配列を作製した。
リングすることにより、５′末端にHindIII断末端を
３′末端に平滑末端を持つ挿入配列を作製した。
上記２つのDNA切断片をT4DNAリガーゼを用いて結合す
ることによりpSV（γ）βを得た。
ることによりpSV（γ）βを得た。
大腸菌に導入したベクターDNAについて挿入部分の塩
基配列をMaxam Gilbert法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
4、560,1977）により決定し目的通りの配列であること
を確認した。
基配列をMaxam Gilbert法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
4、560,1977）により決定し目的通りの配列であること
を確認した。
実施例３ ヒトインターフェロンβ発現ベクターpSV（Ha,r）βの
作製： pSV（Ha,r）βは、実施例２のpSV（ｒ）βのSV40初期
プロモータの上流に転写効率を高めると言われているHa
rbeyマウス肉腫ウイルスの５′LTRのエンハンサー配列
（以下Haエンハンサーと略す）を挿入したベクターであ
る。作製方法は以下の通りである。（第３図参照） まず、pSV（ｒ）βをSV40初期プロモータの上流にあ
る制限酵素SalIサイトで切断してからDNAポリメラーゼI
Klenow断片処理により平滑末端化し、さらにBAP（大腸
菌アルカリフォスファターゼ）処理により末端のリンを
除去した。
作製： pSV（Ha,r）βは、実施例２のpSV（ｒ）βのSV40初期
プロモータの上流に転写効率を高めると言われているHa
rbeyマウス肉腫ウイルスの５′LTRのエンハンサー配列
（以下Haエンハンサーと略す）を挿入したベクターであ
る。作製方法は以下の通りである。（第３図参照） まず、pSV（ｒ）βをSV40初期プロモータの上流にあ
る制限酵素SalIサイトで切断してからDNAポリメラーゼI
Klenow断片処理により平滑末端化し、さらにBAP（大腸
菌アルカリフォスファターゼ）処理により末端のリンを
除去した。
次に、Haエンハンサーを含むベクターpNEO5′（前
述）から制限酵素ClaIおよびSacI消化によりHaエンハン
サーを含む0.5Kbの断片を分離したあとDNAポリメラーゼ
IKlenow断片処理により平滑末端化した。
述）から制限酵素ClaIおよびSacI消化によりHaエンハン
サーを含む0.5Kbの断片を分離したあとDNAポリメラーゼ
IKlenow断片処理により平滑末端化した。
上記２つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合することに
よりベクターpSV（Ha,r）βを得た。
よりベクターpSV（Ha,r）βを得た。
実施例４ ヒトインターフェロンβ発現ベクターpMTVβの作製： pMTVβは実施例１のpSVβのSV40初期プロモータの代
わりにMMTVプロモータを導入したベクターである。作製
方法は以下の通りである。（第４図参照） まず、pSVβを制限酵素SalIで切断後、HindIIIリンカ
ーを用いてSalIサイトをHindIIIサイトに置き換えたあ
と、HindIIIで切断してSV40初期プロモータを含まない
3.8KbのDNA断片を分離した。さらに、BAP（前述）処理
により末端のリンを除いた。
わりにMMTVプロモータを導入したベクターである。作製
方法は以下の通りである。（第４図参照） まず、pSVβを制限酵素SalIで切断後、HindIIIリンカ
ーを用いてSalIサイトをHindIIIサイトに置き換えたあ
と、HindIIIで切断してSV40初期プロモータを含まない
3.8KbのDNA断片を分離した。さらに、BAP（前述）処理
により末端のリンを除いた。
次に、MMTVプロモータを含むベクターpMTVdhfr（F.Le
e et al,Nature,294,228,1982）を制限酵素HindIIIで切
断することによりMMTVプロモータを含む1.4KbのDNA断片
を分離した。
e et al,Nature,294,228,1982）を制限酵素HindIIIで切
断することによりMMTVプロモータを含む1.4KbのDNA断片
を分離した。
これら２つのDNA断片をT4DNAリガーゼを用いて結合す
ることによりpMTVβを得た。
ることによりpMTVβを得た。
実施例５ ヒトインターフェロンβ発現ベクターpMTV（ｒ）βの作
製： pMTV（ｒ）βは実施例２のpSV（ｒ）βのSV40初期プ
ロモータの代わりにMMTVプロモータを導入したベクター
である。作製方法は以下の通りである。（第５図参照） まず、pSV（ｒ）βのSV40初期プロモータの上流にあ
るSalIサイトをHindIIIサイトに置き換えたあと、HindI
IIで切断しSV40初期プロモータを含まない3.8KbのDNA断
片を分離した。さらに、BAP（前述）処理により末端の
リンを除いた。
製： pMTV（ｒ）βは実施例２のpSV（ｒ）βのSV40初期プ
ロモータの代わりにMMTVプロモータを導入したベクター
である。作製方法は以下の通りである。（第５図参照） まず、pSV（ｒ）βのSV40初期プロモータの上流にあ
るSalIサイトをHindIIIサイトに置き換えたあと、HindI
IIで切断しSV40初期プロモータを含まない3.8KbのDNA断
片を分離した。さらに、BAP（前述）処理により末端の
リンを除いた。
次に、pMTVdhfr（前述）を制限酵素HindIIIで切断しM
MTVプロモータを含む1.4KbのDNA断片を分離した。
MTVプロモータを含む1.4KbのDNA断片を分離した。
上記２つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合することに
よりベクターpMTV（ｒ）βを得た。
よりベクターpMTV（ｒ）βを得た。
実施例６ ヒトインターフェロンβ発現ベクターpMTV（Ha）βの作
製： pMTV（Ha）βは、実施例４のpMTVβのMMTVプロモータ
の上流にHaエンハンサーを導入したベクターである。作
製方法は以下の通りである。（第６図参照） まず、pMTVβのMMTVプロモータの上流にあるHindIII
サイトをSalIリンカーを用いてSalIサイトに変えた。こ
のあとSalIで切断後DNAポリメラーゼIKlenow断片で処理
し平滑末端化してからBAP（前述）の処理により末端の
リンを除いた。
製： pMTV（Ha）βは、実施例４のpMTVβのMMTVプロモータ
の上流にHaエンハンサーを導入したベクターである。作
製方法は以下の通りである。（第６図参照） まず、pMTVβのMMTVプロモータの上流にあるHindIII
サイトをSalIリンカーを用いてSalIサイトに変えた。こ
のあとSalIで切断後DNAポリメラーゼIKlenow断片で処理
し平滑末端化してからBAP（前述）の処理により末端の
リンを除いた。
次に、pNEO5′（前述）をClaIとSacIで切断して0.5Kb
のHaエンハンサー断片を分離し、DNAポリメラーゼIKlen
ow断片処理で平滑末端化した。
のHaエンハンサー断片を分離し、DNAポリメラーゼIKlen
ow断片処理で平滑末端化した。
これら２つのDNA断片をT4DNAリガーゼを用いて結合す
ることによりpMTV（Ha）βを得た。
ることによりpMTV（Ha）βを得た。
実施例７ ヒトインターフェロンβ発現ベクターpMTV（SV）βの作
製： pMTV（SV）βは実施例１のpSVβのBV40初期プロモー
タとヒトインターフェロンβ遺伝子の間にMMTVプロモー
タ（前述）を導入したベクターである。このベクターで
は、ヒトインターフェロンβ遺伝子はSV40初期プロモー
タとMMTVプロモータの支配下に置かれる。作製方法は以
下の通りである。
製： pMTV（SV）βは実施例１のpSVβのBV40初期プロモー
タとヒトインターフェロンβ遺伝子の間にMMTVプロモー
タ（前述）を導入したベクターである。このベクターで
は、ヒトインターフェロンβ遺伝子はSV40初期プロモー
タとMMTVプロモータの支配下に置かれる。作製方法は以
下の通りである。
（第７図参照） まず、pSVβを制限酵素HindIIIで切断後BAP（前述）
処理により末端のリンを除いた。
処理により末端のリンを除いた。
次に、MMTVプロモータを含むベクターpMTVdhfr（前
述）を制限酵素HindIIIで切断することによりMMTVプロ
モータを含む1.4KbのDNA断片を分離した。
述）を制限酵素HindIIIで切断することによりMMTVプロ
モータを含む1.4KbのDNA断片を分離した。
上記２つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合することに
よりベクターpMTV（SV）βを得た。
よりベクターpMTV（SV）βを得た。
実施例８ ヒトインターフェロンβ発現ベクターpMTV（SV,r）βの
作製： pMTV（SV,r）βは実施例２のpSV（ｒ）βのSV40初期
プロモータとヒトインターフェロンβ遺伝子の間にMMTV
プロモータ（前述）を導入したベクターである。このベ
クターでは、ヒトインターフェロンβ遺伝子はSV40初期
プロモータとMMTVプロモータの支配下に置かれる。作製
方法は以下の通りである。（第８図参照） まず、pSV（ｒ）βを制限酵素HindIIIて切断後BAP
（前述）処理により末端のリンを除いた。
作製： pMTV（SV,r）βは実施例２のpSV（ｒ）βのSV40初期
プロモータとヒトインターフェロンβ遺伝子の間にMMTV
プロモータ（前述）を導入したベクターである。このベ
クターでは、ヒトインターフェロンβ遺伝子はSV40初期
プロモータとMMTVプロモータの支配下に置かれる。作製
方法は以下の通りである。（第８図参照） まず、pSV（ｒ）βを制限酵素HindIIIて切断後BAP
（前述）処理により末端のリンを除いた。
次に、MMTVプロモータを含むベクターpMTVdhfr（前
述）を制限酵素HindIIIで切断することによりMMTVプロ
モータを含む1.4KbのDNA断片を分離した。
述）を制限酵素HindIIIで切断することによりMMTVプロ
モータを含む1.4KbのDNA断片を分離した。
上記２つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合することに
よりベクターpMTV（SV,r）βを得た。
よりベクターpMTV（SV,r）βを得た。
実施例９ ヒトインターフェロンβ発現ベクターpMTV（Ha,r）βの
作製： pMTV（Ha,r）βは、実施例５のpMTV（ｒ）βのMMTVプ
ロモータの上流にHaエンハンサーを導入したベクターで
ある。作製方法は以下の通りである。（第９図参照） まず、実施例６のpMTV（Ha）βを制限酵素BamHIとHin
dIIIで切断して、長鎖断片を分離してからBAP（前述）
処理により末端のリンを除いた。
作製： pMTV（Ha,r）βは、実施例５のpMTV（ｒ）βのMMTVプ
ロモータの上流にHaエンハンサーを導入したベクターで
ある。作製方法は以下の通りである。（第９図参照） まず、実施例６のpMTV（Ha）βを制限酵素BamHIとHin
dIIIで切断して、長鎖断片を分離してからBAP（前述）
処理により末端のリンを除いた。
次に、pMTV（ｒ）βをBamHIとHindIIIで切断して、短
鎖断片を分離した。
鎖断片を分離した。
上記２つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合することに
よりpMTV（Ha,r）βを得た。
よりpMTV（Ha,r）βを得た。
実施例10 ヒトインターフェロンβ発現ベクターpMTV（Ha,SV,r）
βの作製： pMTV（Ha,SV,r）βは、実施例３のpSV（Ha,r）βのSV
40初期プロモータとヒトインターフェロンβ遺伝子の間
にMMTVプロモータを導入したベクターである。作製方法
は以下の通りである。（第10図参照） まず、pSV（Ha,r）βを制限酵素HindIIIで切断してか
らBAP（前述）処理により末端のリンを除いた。
βの作製： pMTV（Ha,SV,r）βは、実施例３のpSV（Ha,r）βのSV
40初期プロモータとヒトインターフェロンβ遺伝子の間
にMMTVプロモータを導入したベクターである。作製方法
は以下の通りである。（第10図参照） まず、pSV（Ha,r）βを制限酵素HindIIIで切断してか
らBAP（前述）処理により末端のリンを除いた。
次にMMTVプロモータを持つベクターpMTVdhfr（前述）
をHindIIIで切断し、MMTVプロモータを含む1.4KbのDNA
断片を分離した。
をHindIIIで切断し、MMTVプロモータを含む1.4KbのDNA
断片を分離した。
上記２つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合することに
よりpMTV（Ha,SV,r）βを得た。
よりpMTV（Ha,SV,r）βを得た。
実施例11 ヒトインターフェロンβ発現ベクターpBPV97SV（ｒ）β
の作製： pBPV97SV（ｒ）βは、実施例２のpSV（ｒ）βよりヒ
トインターフェロンβ遺伝子の動物細胞での発現に必要
な制限酵素AccII切断断片（2Kb）をBPV1（牛パピローマ
ウイルス１型）全ゲノムを含むベクターpdBPV1（142−
６）（P.M.Howly,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,7147,198
2）のPvuIIサイトに挿入したベクターである。作製方法
は以下の通りである。（第11図参照） まず、pSV（ｒ）βをAccIIで切断しヒトインターフェ
ロンβ遺伝子を含む2KbのDNA断片を分離した。
の作製： pBPV97SV（ｒ）βは、実施例２のpSV（ｒ）βよりヒ
トインターフェロンβ遺伝子の動物細胞での発現に必要
な制限酵素AccII切断断片（2Kb）をBPV1（牛パピローマ
ウイルス１型）全ゲノムを含むベクターpdBPV1（142−
６）（P.M.Howly,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,7147,198
2）のPvuIIサイトに挿入したベクターである。作製方法
は以下の通りである。（第11図参照） まず、pSV（ｒ）βをAccIIで切断しヒトインターフェ
ロンβ遺伝子を含む2KbのDNA断片を分離した。
次に、pdBPV1（142−６）をPvuIIで切断し10KbのDNA
断片を分離してからBAP処理により末端のリンを除い
た。
断片を分離してからBAP処理により末端のリンを除い
た。
これら２つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合すること
によりpBPV97SV（ｒ）βを作製した。
によりpBPV97SV（ｒ）βを作製した。
実施例12 ヒトインターフェロンβ発現ベクターpDH（ｒ）βの作
製： pDH（ｒ）βは、実施例５のpMTV（ｒ）βのMMTVプロ
モータをショウジョウバエ熱ショック蛋白プロモータに
置き換えたベクターである。作製方法は以下の通りであ
る。（第12図参照） まず、pMTV（ｒ）βをHindIIIで切断してMMTVプロモ
ータをのぞいてからDNAポリメラーゼIKlenow断片処理に
より平滑末端化した。このあとBAP処理により末端のリ
ンを除いた。
製： pDH（ｒ）βは、実施例５のpMTV（ｒ）βのMMTVプロ
モータをショウジョウバエ熱ショック蛋白プロモータに
置き換えたベクターである。作製方法は以下の通りであ
る。（第12図参照） まず、pMTV（ｒ）βをHindIIIで切断してMMTVプロモ
ータをのぞいてからDNAポリメラーゼIKlenow断片処理に
より平滑末端化した。このあとBAP処理により末端のリ
ンを除いた。
次に、ショウジョウバエ熱ショック蛋白プロモータを
含むベクターpSP6HS9のPstIサイトをHindIIIリンカーを
用いてHindIIIサイトに置き換えたあと、HindIIIで切断
してプロモータを含む0.9KbのDNA断片を分離した（pSP6
HS9はp232.3（R.Holmgren et al Cell,18,1359,1979）
のショウジョウバエ熱ショック蛋白プロモータ断片Hind
III/PstI0.9KbをpSP65（Promega Biotech社）に組み込
んだベクターである）。
含むベクターpSP6HS9のPstIサイトをHindIIIリンカーを
用いてHindIIIサイトに置き換えたあと、HindIIIで切断
してプロモータを含む0.9KbのDNA断片を分離した（pSP6
HS9はp232.3（R.Holmgren et al Cell,18,1359,1979）
のショウジョウバエ熱ショック蛋白プロモータ断片Hind
III/PstI0.9KbをpSP65（Promega Biotech社）に組み込
んだベクターである）。
上記２つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合することに
よりベクターpDH（ｒ）βを得た。
よりベクターpDH（ｒ）βを得た。
実施例13 ヒトインターフェロンβ発現ベクターpBPVMTV（Ha）β
の作製： pBPVMTV（Ha）βは実施例６のpMTV（Ha）βとBPV1全
ゲノム（100％）を結合したベクターである。作製方法
は以下の通りである。（第13図参照） まず、pMTV（Ha）βをSV40ポリＡシグナルの後ろにあ
るBamHIサイトで切断後BAP処理により末端のリンを除い
た。
の作製： pBPVMTV（Ha）βは実施例６のpMTV（Ha）βとBPV1全
ゲノム（100％）を結合したベクターである。作製方法
は以下の通りである。（第13図参照） まず、pMTV（Ha）βをSV40ポリＡシグナルの後ろにあ
るBamHIサイトで切断後BAP処理により末端のリンを除い
た。
次に、pdBPV1（前述）をBamHIで切断してBPV1全ゲノ
ムからなる8.0KbのDNA断片を分離した。
ムからなる8.0KbのDNA断片を分離した。
これら２つのDNA断片をT4DNAリガーゼを用いて結合す
ることによりpBPV100MTV（Ha）βを得た。
ることによりpBPV100MTV（Ha）βを得た。
実施例14 ヒトインターフェロンβ発現ベクターpBPV97MTV（Ha）
βの作製： pBPV97MTV（Ha）βは実施例６のpMTV（Ha）βよりヒ
トインターフェロンβ遺伝子の動物細胞での発現に必要
な制限酵素AccII切断断片（3.1Kb）をpdBPV1（142−
６）（前述）のPvuIIサイトに挿入したベクターであ
る。作製方法は以下の通りである。（第14図参照） まず、pMTV（Ha）βをAccIIで切断しヒトインターフ
ェロンβ遺伝子を含む3.1KbのDNA断片を分離した。
βの作製： pBPV97MTV（Ha）βは実施例６のpMTV（Ha）βよりヒ
トインターフェロンβ遺伝子の動物細胞での発現に必要
な制限酵素AccII切断断片（3.1Kb）をpdBPV1（142−
６）（前述）のPvuIIサイトに挿入したベクターであ
る。作製方法は以下の通りである。（第14図参照） まず、pMTV（Ha）βをAccIIで切断しヒトインターフ
ェロンβ遺伝子を含む3.1KbのDNA断片を分離した。
次に、pdBPV1（142−６）をPvuIIで切断し10KbのDNA
断片を分離したあとBAP処理により末端のリンを除い
た。
断片を分離したあとBAP処理により末端のリンを除い
た。
これら２つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合すること
によりpBPV97MTV（Ha）βを作製した。
によりpBPV97MTV（Ha）βを作製した。
実施例15 ヒトインターフェロンγ発現ベクターpMTVγの作製： pMTVγは、ヒトインターフェロンγ遺伝子をMMTVプロ
モータの支配下に置いたベクターである。作製方法は以
下の通りである。（第15図参照） まず、実施例６のpMTVβをMMTVプロモータ下流にある
HindIIIサイトとヒトインターフェロン遺伝子の下流に
あるBglIIサイトで切断後、DNAポリメラーゼIKlenow断
片処理で平滑末端化してから、MMTVプロモータを含む3.
9KbのDNA断片を分離した。
モータの支配下に置いたベクターである。作製方法は以
下の通りである。（第15図参照） まず、実施例６のpMTVβをMMTVプロモータ下流にある
HindIIIサイトとヒトインターフェロン遺伝子の下流に
あるBglIIサイトで切断後、DNAポリメラーゼIKlenow断
片処理で平滑末端化してから、MMTVプロモータを含む3.
9KbのDNA断片を分離した。
このDNA断片とpSVIFNγ（特開昭61−52286）をDpnI切
断して得られるヒトインターフェロンγ遺伝子を含む0.
8KbのDNA断片をT4DNAリガーゼを用いて結合することに
よりpMTVγを得た。
断して得られるヒトインターフェロンγ遺伝子を含む0.
8KbのDNA断片をT4DNAリガーゼを用いて結合することに
よりpMTVγを得た。
実施例16 ヒトインターフェロンγ発現ベクターpMTV（SV）γの作
製： pMTV（SV）γは、実施例15のpMTVγのMMTVプロモータ
の上流にSV40初期プロモータを導入したベクターであ
る。作製方法は以下の通りである。（第16図参照） まず、pMTVγをSalIで切断後DNAポリミラーゼIKlenow
断片処理により平滑末端化してからBAP処理により末端
のリンを除いた。
製： pMTV（SV）γは、実施例15のpMTVγのMMTVプロモータ
の上流にSV40初期プロモータを導入したベクターであ
る。作製方法は以下の通りである。（第16図参照） まず、pMTVγをSalIで切断後DNAポリミラーゼIKlenow
断片処理により平滑末端化してからBAP処理により末端
のリンを除いた。
次に、pSV2IFNβ（特願昭59−169388）をPvuIIとHind
IIIで切断しSV40初期プロモータを含む0.3KbのDNA断片
を分離してから、DNAポリメラーゼIKlenow断片処理によ
り平滑末端化した。
IIIで切断しSV40初期プロモータを含む0.3KbのDNA断片
を分離してから、DNAポリメラーゼIKlenow断片処理によ
り平滑末端化した。
これら２つのDNA断片をT4DNAリガーゼを用いて結合す
ることによりpMTV（SV）γを得た。
ることによりpMTV（SV）γを得た。
実施例17 pSVβによるPC12の形質転換： 実施例１のpSVβ２μｇとpSV2neo（前述）0.2μｇと
をリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC12細胞
に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を400μg/
mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナマイシ
ン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））にて培
養したところ、20個の形質転換株を得た。
をリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC12細胞
に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を400μg/
mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナマイシ
ン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））にて培
養したところ、20個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（J.Virology,37,75
5,1981）に基ずき、ヒトFL細胞とVSVを用いたCPF阻止法
で測定したところ12個に100〜900単位/mlの活性が認め
られた。（第17図参照） 実施例18 pSV（ｒ）βによるPC12の形質転換： 実施例２のpSV（ｒ）β２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC1
2細胞に導入した。蛋白合成合成阻害剤G418（GIBCO社）
を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％と
カナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製
薬））にて培養したところ、12個の形質転換株を得た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（J.Virology,37,75
5,1981）に基ずき、ヒトFL細胞とVSVを用いたCPF阻止法
で測定したところ12個に100〜900単位/mlの活性が認め
られた。（第17図参照） 実施例18 pSV（ｒ）βによるPC12の形質転換： 実施例２のpSV（ｒ）β２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC1
2細胞に導入した。蛋白合成合成阻害剤G418（GIBCO社）
を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％と
カナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製
薬））にて培養したところ、12個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したところ５
個に150〜1800単位/mlの活性が認められた。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したところ５
個に150〜1800単位/mlの活性が認められた。
（第17図参照） 実施例19 pSV（Ha,r）βによるPC12の形質転換： 実施例３のpSV（Ha,r）β２μｇとpSV2neo（前述）0.
2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC
12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を4
00μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナ
マイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））
にて培養したところ、19個の形質転換株を得た。培地上
清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロンβ活
性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、ヒトFL
細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したところ８個に10
0〜4900単位/mlの活性が認められた。（第17図参照） 実施例20 pMTVβによるPC12の形質転換 実施例４のpMTVβ２μｇとpSV2neo（前述）0.2μｇと
をリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC12細胞
に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を400μg/
mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナマイシ
ン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））にて培
養したところ、18個の形質転換株を得た。
2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC
12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を4
00μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナ
マイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））
にて培養したところ、19個の形質転換株を得た。培地上
清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロンβ活
性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、ヒトFL
細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したところ８個に10
0〜4900単位/mlの活性が認められた。（第17図参照） 実施例20 pMTVβによるPC12の形質転換 実施例４のpMTVβ２μｇとpSV2neo（前述）0.2μｇと
をリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC12細胞
に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を400μg/
mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナマイシ
ン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））にて培
養したところ、18個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したところ７
個に100〜4300単位/mlの活性が認められた。（第17図参
照） 実施例21 pMTV（ｒ）βによるPC12の形質転換： 実施例５のpMTV（ｒ）β２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約107個のPC8
細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を400
μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナマ
イシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））に
て培養したところ、24個の形質転換株を得た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したところ７
個に100〜4300単位/mlの活性が認められた。（第17図参
照） 実施例21 pMTV（ｒ）βによるPC12の形質転換： 実施例５のpMTV（ｒ）β２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約107個のPC8
細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を400
μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナマ
イシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））に
て培養したところ、24個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法て測定したことろ、
19個に100〜5500単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例22 pMTV（Ha）βによるPC12の形質転換： 実施例６のpMTV（Ha）β２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC1
2細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を40
0μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナ
マイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））
にて培養したところ、20個の形質転換株を得た。
ンβ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法て測定したことろ、
19個に100〜5500単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例22 pMTV（Ha）βによるPC12の形質転換： 実施例６のpMTV（Ha）β２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC1
2細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を40
0μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナ
マイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））
にて培養したところ、20個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ12
個に100〜2800単位/mlの活性が認められた。（第17図参
照） 実施例23 pMTV（SV）βによるPC12の形質転換： 実施例７のpMTV（SV）β２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC1
2細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を40
0μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナ
マイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））
にて培養したところ、21個の形質転換株を得た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ12
個に100〜2800単位/mlの活性が認められた。（第17図参
照） 実施例23 pMTV（SV）βによるPC12の形質転換： 実施例７のpMTV（SV）β２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC1
2細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を40
0μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナ
マイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））
にて培養したところ、21個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）を、S.Rubinstein40方法（前述）に基ずきヒ
トFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法て測定したところ、10
個に100〜5600単位/mlの活性が認められた。（第17図参
照） 実施例24 pMTV（SV,r）βによるPC12の形質転換： 実施例８のpMTV（SV,r）β２μｇとpSV2neo（前述）
0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個の
PC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）
を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％と
カナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製
薬））にて培養したところ、22個の形質転換株を得た。
ンβ活性）を、S.Rubinstein40方法（前述）に基ずきヒ
トFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法て測定したところ、10
個に100〜5600単位/mlの活性が認められた。（第17図参
照） 実施例24 pMTV（SV,r）βによるPC12の形質転換： 実施例８のpMTV（SV,r）β２μｇとpSV2neo（前述）
0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個の
PC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）
を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％と
カナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製
薬））にて培養したところ、22個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ20
個に800〜48000単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例25 pMTV（Ha,r）βによるPC12の形質転換： 実施例９のpMTV（Ha,r）β２μｇとpSV2neo（前述）
0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個の
PC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）
を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％と
カナマイシン100μg/mlを含むRPMI培地（日水製薬））
にて培養したところ、24個の形質転換株を得た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ20
個に800〜48000単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例25 pMTV（Ha,r）βによるPC12の形質転換： 実施例９のpMTV（Ha,r）β２μｇとpSV2neo（前述）
0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個の
PC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）
を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％と
カナマイシン100μg/mlを含むRPMI培地（日水製薬））
にて培養したところ、24個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ。
20個に100〜30300単位/mlの活性が認められた。（第17
図参照） 実施例26 pMTV（Ha,SV,r）βによるPC12の形質転換： 実施例10のpMTV（Ha,SV,r）β２μｇとpSV2neo（前
述）0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106
個のPC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO
社）を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10
％とカナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水
製薬））にて培養したところ、22個の形質転換株を得
た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ。
20個に100〜30300単位/mlの活性が認められた。（第17
図参照） 実施例26 pMTV（Ha,SV,r）βによるPC12の形質転換： 実施例10のpMTV（Ha,SV,r）β２μｇとpSV2neo（前
述）0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106
個のPC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO
社）を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10
％とカナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水
製薬））にて培養したところ、22個の形質転換株を得
た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ10
個に300〜10300単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例27 pMTV（Ha,SV,r）βによるPC8の形質転換： 実施例10のpMTV（Ha,SV,r）β２μｇとpSV2neo（前
述）0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約107
個のPC8細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO
社）を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10
％とカナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水
製薬））にて培養したところ、27個の形質転換株を得
た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ10
個に300〜10300単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例27 pMTV（Ha,SV,r）βによるPC8の形質転換： 実施例10のpMTV（Ha,SV,r）β２μｇとpSV2neo（前
述）0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約107
個のPC8細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO
社）を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10
％とカナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水
製薬））にて培養したところ、27個の形質転換株を得
た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ18
個に150〜25500単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例28 pDH（ｒ）βによるPC12の形質転換： 実施例11のpDH（ｒ）β２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC1
2細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を40
0μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナ
マイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））
にて培養したところ、24個の形質転換株を得た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ18
個に150〜25500単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例28 pDH（ｒ）βによるPC12の形質転換： 実施例11のpDH（ｒ）β２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC1
2細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を40
0μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナ
マイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））
にて培養したところ、24個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法て測定したところ、
12個に63〜402単位/mlの活性が認められた。
ンβ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法て測定したところ、
12個に63〜402単位/mlの活性が認められた。
実施例29 pBPV97SV（ｒ）βによるPC12の形質転換： 実施例10のpBPV97SV（ｒ）β２μｇとpSV2neo（前
述）0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106
個のPC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO
社）を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10
％とカナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水
製薬））にて培養したところ、22個の形質転換株を得
た。
述）0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106
個のPC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO
社）を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10
％とカナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水
製薬））にて培養したところ、22個の形質転換株を得
た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ10
個に300〜10300単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例30 pBPVMTV（Ha）βによるPC12の形質転換： 実施例13のpBPVMTV（Ha）β２μｇとpSV2neo（前述）
0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個の
PC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）
を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％と
カナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製
薬））にて培養したところ、20個の形質転換株を得た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ10
個に300〜10300単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例30 pBPVMTV（Ha）βによるPC12の形質転換： 実施例13のpBPVMTV（Ha）β２μｇとpSV2neo（前述）
0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個の
PC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）
を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％と
カナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製
薬））にて培養したところ、20個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ11
個に100〜22300単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例31 pBPVMTV（Ha）βによるPC8の形質転換： 実施例13のpBPVMTV（Ha）β２μｇとpSV2neo（前述）
0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約107個の
PC8細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を
400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカ
ナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製
薬））にて培養したところ、25個の形質転換株を得た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ11
個に100〜22300単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例31 pBPVMTV（Ha）βによるPC8の形質転換： 実施例13のpBPVMTV（Ha）β２μｇとpSV2neo（前述）
0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約107個の
PC8細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を
400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカ
ナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製
薬））にて培養したところ、25個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ15
個に100〜20200単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例32 pBPV97MTV（Ha）βによるPC12の形質転換： 実施例13のpBPV97MTV（Ha）β２μｇとpSV2neo（前
述）0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106
個のPC8細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO
社）を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10
％とカナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水
製薬））にて培養したところ、24個の形質転換株を得
た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ15
個に100〜20200単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例32 pBPV97MTV（Ha）βによるPC12の形質転換： 実施例13のpBPV97MTV（Ha）β２μｇとpSV2neo（前
述）0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106
個のPC8細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO
社）を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10
％とカナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水
製薬））にて培養したところ、24個の形質転換株を得
た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ12
個に100〜20000単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例33 pSVIFNγによるPC12の形質転換： pSVIFNγ（特開昭61−52286）２μｇとpSV2neo（前
述）0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106
個のPC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO
社）を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10
％とカナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水
製薬））にて培養したところ、９個の形質転換株を得
た。
ンβ活性）をS.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき、
ヒトFL細胞とVSVを用いたCPE阻止法で測定したことろ12
個に100〜20000単位/mlの活性が認められた。（第17図
参照） 実施例33 pSVIFNγによるPC12の形質転換： pSVIFNγ（特開昭61−52286）２μｇとpSV2neo（前
述）0.2μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106
個のPC12細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO
社）を400μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10
％とカナマイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水
製薬））にて培養したところ、９個の形質転換株を得
た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンγ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とsindbis virusを用いたCPE阻止法て測定し
たところ、５個に100〜936単位/mlの活性が認められ
た。（第18図参照） 実施例34 pSVIFNγ／BPV97(P)によるPC12の形質転換： pSVIFNγ／BPV97(P)（特開昭61−52286）は、SV40初
期プロモータの支配下に置かれたヒトインターフェロン
γ遺伝子をからなる2.0Kbの遺伝子配列をpdBPV1（前
述）PvuIIサイトに導入したベクターである。
ンγ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とsindbis virusを用いたCPE阻止法て測定し
たところ、５個に100〜936単位/mlの活性が認められ
た。（第18図参照） 実施例34 pSVIFNγ／BPV97(P)によるPC12の形質転換： pSVIFNγ／BPV97(P)（特開昭61−52286）は、SV40初
期プロモータの支配下に置かれたヒトインターフェロン
γ遺伝子をからなる2.0Kbの遺伝子配列をpdBPV1（前
述）PvuIIサイトに導入したベクターである。
pSVIFNγ／BPV97(P)２μｇとpSV2neo（前述）0.2μｇ
とをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC12細
胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を400μ
g/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナマイ
シン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））にて
培養したところ、23個の形質転換株を得た。
とをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC12細
胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を400μ
g/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナマイ
シン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））にて
培養したところ、23個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンγ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とsindbis virusを用いたCPE阻止法て測定し
たところ、19個に100〜21600単位/mlの活性が認められ
た。（第18図参照） 実施例35 pMTVγによるPC12の形質転換： 実施例15のpMTVγ２μｇとpSV2neo（前述）0.2μｇと
をリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC12細胞
に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を400μg/
mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナマイシ
ン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））にて培
養したところ、27個の形質転換株を得た。
ンγ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とsindbis virusを用いたCPE阻止法て測定し
たところ、19個に100〜21600単位/mlの活性が認められ
た。（第18図参照） 実施例35 pMTVγによるPC12の形質転換： 実施例15のpMTVγ２μｇとpSV2neo（前述）0.2μｇと
をリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC12細胞
に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を400μg/
mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナマイシ
ン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））にて培
養したところ、27個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンγ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とsindbis virusを用いたCPE阻止法て測定し
たところ、17個に100〜4110単位/mlの活性が認められ
た。（第18図参照） 実施例36 pMTV（SV）γによるPC12の形質転換： 実施例16のpMTV（SV）γ２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC1
2細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を40
0μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナ
マイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））
にて培養したところ、32個の形質転換株を得た。
ンγ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とsindbis virusを用いたCPE阻止法て測定し
たところ、17個に100〜4110単位/mlの活性が認められ
た。（第18図参照） 実施例36 pMTV（SV）γによるPC12の形質転換： 実施例16のpMTV（SV）γ２μｇとpSV2neo（前述）0.2
μｇとをリン酸カルシウム法（前述）にて約106個のPC1
2細胞に導入した。蛋白合成阻害剤G418（GIBCO社）を40
0μg/mlの濃度で含む選択培地（牛胎児血清10％とカナ
マイシン100μg/mlを含むRPMI1640培地（日水製薬））
にて培養したところ、32個の形質転換株を得た。
培養上清の抗ウイルス活性（即ちヒトインターフェロ
ンγ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とsindbis virusを用したCPE阻止法て測定し
たところ、29個に100〜46500単位/mlの活性が認められ
た。（第18図参照） 実施例37 pMTV（SV,r）β/PC12クローン産生インターフェロンの
抗体中和： 飽和細胞密度まで増殖したpMTV（SV,r）β/PC12クロ
ーンを誘導培地（デキサメサゾン10-6Ｍと牛胎児血清10
％を含むRPMI1640培地（日水製薬））にて37℃で48時間
培養し得られた培養液について、抗ヒトインターフェロ
ンβ抗体あるいは抗ヒトインターフェロンγ抗体で処理
してから既述の方法で抗ウイルス活性を測定したとこ
ろ、抗ヒトインターフェロンβ抗体で特異的に中和され
た。結果を第１表に示す。
ンγ活性）を、S.Rubinsteinらの方法（前述）に基ずき
ヒトFL細胞とsindbis virusを用したCPE阻止法て測定し
たところ、29個に100〜46500単位/mlの活性が認められ
た。（第18図参照） 実施例37 pMTV（SV,r）β/PC12クローン産生インターフェロンの
抗体中和： 飽和細胞密度まで増殖したpMTV（SV,r）β/PC12クロ
ーンを誘導培地（デキサメサゾン10-6Ｍと牛胎児血清10
％を含むRPMI1640培地（日水製薬））にて37℃で48時間
培養し得られた培養液について、抗ヒトインターフェロ
ンβ抗体あるいは抗ヒトインターフェロンγ抗体で処理
してから既述の方法で抗ウイルス活性を測定したとこ
ろ、抗ヒトインターフェロンβ抗体で特異的に中和され
た。結果を第１表に示す。
この結果より、pMTV（SV,r）β/PC12クローンはヒト
インターフェロンβを産生していることが確認された。
インターフェロンβを産生していることが確認された。
実施例38 pSVIFNγ/BPV97（Ｐ）/PC12クローン産生インターフェ
ロンの抗体中和： 飽和細胞密度まで増殖したpSVIFNγ／BPV97(P)/PC12
クローンを牛胎児血清10％を含むRPMI1640培地（日水製
薬）にて37℃で48時間培養し得られた培養液について、
抗ヒトインターフェロンβ抗体あるいは抗ヒトインター
フェロンγ抗体で処理してから既述の方法で抗ウイルス
活性を測定したところ、抗ヒトインターフェロンγ抗体
で特異的に中和された。結果を第２表に示す。
ロンの抗体中和： 飽和細胞密度まで増殖したpSVIFNγ／BPV97(P)/PC12
クローンを牛胎児血清10％を含むRPMI1640培地（日水製
薬）にて37℃で48時間培養し得られた培養液について、
抗ヒトインターフェロンβ抗体あるいは抗ヒトインター
フェロンγ抗体で処理してから既述の方法で抗ウイルス
活性を測定したところ、抗ヒトインターフェロンγ抗体
で特異的に中和された。結果を第２表に示す。
この結果より、pSVIFNγ／BPV97(P)/PC12クローンは
ヒトインターフェロンγを産生していることが確認され
た。
ヒトインターフェロンγを産生していることが確認され
た。
実施例39 pMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローンのヒトインターフェロ
ンβ産生能： 実施例27で得られたpMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローンN
o19を、24穴マイクロプレート（Corning社）で飽和細胞
密度まで増殖させた後、次の４種の培地を用いて、１日
当りのヒトインターフェロンβ産生量を25日間にわたり
測定した。（第19図参照） 第19図中、10％FCS＋DEXは、牛胎児血清10％とデキサ
メサゾン10-6Ｍを含むRPI1640培地を、 ５％FCS＋DEXは、牛胎児血清５％とデキサメサゾン10-6
Ｍを含むRPMI1640培地を、 １％FCS＋DEXは、牛胎児血清１％とデキサメサゾン10-6
Ｍを含むRPMI1640培地を、 10％FCS−DEXは、牛胎児血清10％を含むRPMI1640培地を
を各々示す。
ンβ産生能： 実施例27で得られたpMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローンN
o19を、24穴マイクロプレート（Corning社）で飽和細胞
密度まで増殖させた後、次の４種の培地を用いて、１日
当りのヒトインターフェロンβ産生量を25日間にわたり
測定した。（第19図参照） 第19図中、10％FCS＋DEXは、牛胎児血清10％とデキサ
メサゾン10-6Ｍを含むRPI1640培地を、 ５％FCS＋DEXは、牛胎児血清５％とデキサメサゾン10-6
Ｍを含むRPMI1640培地を、 １％FCS＋DEXは、牛胎児血清１％とデキサメサゾン10-6
Ｍを含むRPMI1640培地を、 10％FCS−DEXは、牛胎児血清10％を含むRPMI1640培地を
を各々示す。
この結果より、pMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローンは、
いずれの培地においても25日間にわたり継続的にヒトイ
ンターフェロンを生産すること、また、このクローンの
高い生産性を維持するためには、５％以上の牛胎児血清
と10-6Ｍのデキサメサゾンを加えた培地が好ましいこと
がわかった。
いずれの培地においても25日間にわたり継続的にヒトイ
ンターフェロンを生産すること、また、このクローンの
高い生産性を維持するためには、５％以上の牛胎児血清
と10-6Ｍのデキサメサゾンを加えた培地が好ましいこと
がわかった。
実施例40 pMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローン産生ヒトインターフェ
ロンβの物性： 実施例27で得られたpMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローンN
o19を、牛胎児血清2.5％とデキサメサゾン10-6Ｍを含む
RPMI1640（日水製薬）培地にて培養し、23800単位/mlの
ヒトインターフェロンβ活性を示す培養液32.5lを得
た。培養液中のヒトインターフェロンβをブルーセファ
ロースカラム、抗ヒトインターフェロンβモノクローナ
ル抗体カラムおよび逆相HPLCで精製したところ、ヒト線
維芽細胞由来天然型ヒトインターフェロンβとSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の挙動が同じであった。
（第20図参照） 第20図中の天然型HuIFNβとは、ヒト正常二倍体線維
芽細胞を薬剤で処理し生産したヒトインターフェロンβ
である。PC8由来HuIFNβとは、pMTV（Ha,SV,r）β/PC8
クローンの生産したヒトインターフェロンβである。大
腸菌由来ヒトインターフェロンβとは、ヒトインターフ
ェロンβ大腸菌発現ベクターにより形質転換された大腸
菌により生産された、糖鎖を持たないヒトインターフェ
ロンβである。
ロンβの物性： 実施例27で得られたpMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローンN
o19を、牛胎児血清2.5％とデキサメサゾン10-6Ｍを含む
RPMI1640（日水製薬）培地にて培養し、23800単位/mlの
ヒトインターフェロンβ活性を示す培養液32.5lを得
た。培養液中のヒトインターフェロンβをブルーセファ
ロースカラム、抗ヒトインターフェロンβモノクローナ
ル抗体カラムおよび逆相HPLCで精製したところ、ヒト線
維芽細胞由来天然型ヒトインターフェロンβとSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の挙動が同じであった。
（第20図参照） 第20図中の天然型HuIFNβとは、ヒト正常二倍体線維
芽細胞を薬剤で処理し生産したヒトインターフェロンβ
である。PC8由来HuIFNβとは、pMTV（Ha,SV,r）β/PC8
クローンの生産したヒトインターフェロンβである。大
腸菌由来ヒトインターフェロンβとは、ヒトインターフ
ェロンβ大腸菌発現ベクターにより形質転換された大腸
菌により生産された、糖鎖を持たないヒトインターフェ
ロンβである。
この結果より、pMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローン生産
するヒトインターフェロンβは、天然型と同様に糖鎖が
付加されたポリペプチドであることが確認された。
するヒトインターフェロンβは、天然型と同様に糖鎖が
付加されたポリペプチドであることが確認された。
［発明の効果］ 本発明により天然型ヒトインターフェロンを高い効率
で産生し、かつ継代数にかぎりが無い株化ヒト細胞を樹
立することができた。
で産生し、かつ継代数にかぎりが無い株化ヒト細胞を樹
立することができた。
第１図は本発明のベクターの一例であるpSVβの作製方
法を示すものである。 第２図は本発明のベクターの一例であるpSV（ｒ）βの
作製方法を示すものである。 第３図は本発明のベクターの一例であるpSV（Ha,r）β
の作製方法を示すものである。 第４図は本発明のベクターの一例であるpMTVβの作製方
法を示すものである。 第５図は本発明のベクターの一例であるpMTV（ｒ）βの
作製方法を示すものである。 第６図は本発明のベクターの一例であるpMTV（Ha）βの
作製方法を示すものである。 第７図は本発明のベクターの一例であるpMTV（SV）βの
作製方法を示すものである。 第８図は本発明のベクターの一例であるpMTV（SV,r）β
の作製方法を示すものである。 第９図は本発明のベクターの一例であるpMTV（Ha,r）β
の作製方法を示すものである。 第10図は本発明のベクターの一例であるpMTV（Ha,SV,
r）βの作製方法を示すものである。 第11図は本発明のベクターの一例であるpBPV97SV（ｒ）
βの作製方法を示すものある。 第12図は本発明のベクターの一例であるpDH（ｒ）βの
作製方法を示すものである。 第13図は本発明のベクターの一例であるpBPVMTV（Ha）
βの作製方法を示すものである。 第14図は本発明のベクターの一例であるpBPV97MTV（H
a）βの作製方法を示すものである。 第15図は本発明のベクターの一例であるpMTVγの作製方
法を示すものである。 第16図は本発明のベクターの一例であるpMTV（SV）γの
作製方法を示すものである。 第17図は本発明の宿主・ベクター系により生産されたヒ
トインターフェロンβの活性を示すものである。 第18図は本発明の宿主・ベクター系により生産されたヒ
トインターフェロンγの活性を示すものである。 第19図は本発明のpMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローンの継
続したヒトインターフェロンβの生産と、生産性に及ぼ
す血清濃度とデキサメサゾンの影響を示すものである。 第20図は本発明のpMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローンの生
産したヒトインターフェロンのSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動のパターンを示すものである。
法を示すものである。 第２図は本発明のベクターの一例であるpSV（ｒ）βの
作製方法を示すものである。 第３図は本発明のベクターの一例であるpSV（Ha,r）β
の作製方法を示すものである。 第４図は本発明のベクターの一例であるpMTVβの作製方
法を示すものである。 第５図は本発明のベクターの一例であるpMTV（ｒ）βの
作製方法を示すものである。 第６図は本発明のベクターの一例であるpMTV（Ha）βの
作製方法を示すものである。 第７図は本発明のベクターの一例であるpMTV（SV）βの
作製方法を示すものである。 第８図は本発明のベクターの一例であるpMTV（SV,r）β
の作製方法を示すものである。 第９図は本発明のベクターの一例であるpMTV（Ha,r）β
の作製方法を示すものである。 第10図は本発明のベクターの一例であるpMTV（Ha,SV,
r）βの作製方法を示すものである。 第11図は本発明のベクターの一例であるpBPV97SV（ｒ）
βの作製方法を示すものある。 第12図は本発明のベクターの一例であるpDH（ｒ）βの
作製方法を示すものである。 第13図は本発明のベクターの一例であるpBPVMTV（Ha）
βの作製方法を示すものである。 第14図は本発明のベクターの一例であるpBPV97MTV（H
a）βの作製方法を示すものである。 第15図は本発明のベクターの一例であるpMTVγの作製方
法を示すものである。 第16図は本発明のベクターの一例であるpMTV（SV）γの
作製方法を示すものである。 第17図は本発明の宿主・ベクター系により生産されたヒ
トインターフェロンβの活性を示すものである。 第18図は本発明の宿主・ベクター系により生産されたヒ
トインターフェロンγの活性を示すものである。 第19図は本発明のpMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローンの継
続したヒトインターフェロンβの生産と、生産性に及ぼ
す血清濃度とデキサメサゾンの影響を示すものである。 第20図は本発明のpMTV（Ha,SV,r）β/PC8クローンの生
産したヒトインターフェロンのSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動のパターンを示すものである。
Claims (2)
- 【請求項１】真核細胞型プロモータの支配下に置かれた
ヒトインターフェロンβ遺伝子あるいはヒトインターフ
ェロンγ遺伝子を持つベクターにより形質転換されたヒ
ト肺癌由来細胞PC8あるいはヒト肺癌由来細胞PC12を、
培養することを特徴とするヒトインターフェロンの生産
方法。 - 【請求項２】真核細胞型プロモータが、SV40初期プロモ
ータ、マウス乳癌ウイルスのプロモータおよびショウジ
ョウバエ熱ショック蛋白のプロモータからなる群から選
ばれる一種以上である特許請求の範囲第（１）項記載の
ヒトインターフェロンの生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61288879A JP2530632B2 (ja) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | ヒトインタ―フェロンの生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61288879A JP2530632B2 (ja) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | ヒトインタ―フェロンの生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63141583A JPS63141583A (ja) | 1988-06-14 |
| JP2530632B2 true JP2530632B2 (ja) | 1996-09-04 |
Family
ID=17735948
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61288879A Expired - Lifetime JP2530632B2 (ja) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | ヒトインタ―フェロンの生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2530632B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2530631B2 (ja) * | 1986-12-05 | 1996-09-04 | 東レ株式会社 | 形質転換体 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6152283A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-14 | Toray Ind Inc | 発現ベクタ− |
| JPS6188875A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−γ |
| JPS63141582A (ja) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | 形質転換体 |
-
1986
- 1986-12-05 JP JP61288879A patent/JP2530632B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6152283A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-14 | Toray Ind Inc | 発現ベクタ− |
| JPS6188875A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−γ |
| JPS63141582A (ja) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | 形質転換体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63141583A (ja) | 1988-06-14 |
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