ES2328424T3 - Vectores de alfavirus recombinantes. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA CASSETTES DE EXPRESION PARA LA EXPRESION DE PROTEINAS ESTRUCTURALES DE ALFAVIRUS EN CELULAS HOSPEDADORAS, INCLUYENDO EL EMPAQUETAMIENTO DE CELULAS PARA EMPAQUETAR VECTORES DE RNA DE ALFAVIRUS QUE CONTIENEN DICHOS CASSETTES DE EXPRESION.
Description
Vectores de alfavirus recombinantes.
La presente invención se refiere, en general, al
uso de virus recombinantes como vectores y, más específicamente, a
alfavirus recombinantes, tales como el virus Sindbis, que son
capaces de expresar una secuencia heteróloga en las células
diana.
Los alfavirus comprenden un conjunto de virus
transmitidos a través de artrópodos serológicamente relacionados de
la familia de los Togavirus. De manera resumida, los alfavirus se
distribuyen por todo el mundo, y persisten en la naturaleza a
través de un mosquito en el ciclo de los vertebrados. Pájaros,
roedores, caballos, primates, y seres humanos están entre los
hospedadores/huéspedes vertebrados definidos de los alfavirus.
Se han clasificado veintiséis virus y subtipos
de virus dentro del género alfavirus utilizando el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HI). De manera resumida, el ensayo
HI secreta los 26 alfavirus en tres complejos principales: el
complejo de la encefalitis de Venezuela (VE), el complejo del bosque
Semliki (SF), y el complejo de la encefalitis occidental (WE).
Además, cuatro virus más, encefalitis oriental (EE), Bosque Barmah,
Middelburg, y Ndumu, reciben una clasificación individual en
función del ensayo serológico HI.
Los miembros del género alfavirus se clasifican
también en función de sus características clínicas con respecto a
los seres humanos; alfavirus asociados principalmente con
encefalitis, y alfavirus asociados principalmente con fiebre,
sarpullido, y poliartritis. Incluidos en el grupo más antiguo están
los complejos VE y WE, y EE. En general, la infección con este
grupo puede dar como resultado secuelas permanentes, que incluyen
cambios en el comportamiento y discapacidades en el aprendizaje, o
muerte. En el último grupo está el complejo SF, comprendido por los
alfavirus individuales Chikungunya, O'nyong-nyong,
Sindbis, Ross River, y Mayaro. Con respecto a este grupo, aunque se
ha informado de epidemias graves, la infección es, en general,
autolimitante, sin secuelas permanentes.
El virus Sindbis es el miembro prototipo del
género alfavirus de la familia Togavirus. Aunque no usualmente
aparentes, las manifestaciones clínicas de la infección por virus
Sindbis incluyen fiebre, artritis, y sarpullido. El virus Sindbis
se distribuye por Europa, África, Asia, y Australia, con los mejores
datos epidemiológicos provenientes de Sudáfrica en el que un 20% de
la población es seropositiva. (Para una revisión, véase Peters y
Dalrymple, Fields Virology (2d ed), Fields y col. (eds.), B.N. Raven
Press, New York, NY. capítulo 26. pp. 713-762). Se
ha aislado el virus Sindbis infeccioso del suero de seres humanos
únicamente durante un brote en Uganda y en un único caso en África
Central.
La morfología y la morfogénesis del género
alfavirus es generalmente muy uniforme. En concreto, la mayor parte
de células de vertebrados se infectan por partículas con envolturas
de 60-65 nm, en las que la infección productora es
citopática. Por otra parte, la infección de células de
invertebrados, por ejemplo, las derivadas de mosquitos, no da como
resultado ninguna citopatología manifiesta. Normalmente, los
alfavirus se propagan sobre células BHK-21 o vero,
en las que el crecimiento es rápido, alcanzando un rendimiento
máximo en las 24 horas de la infección. Las cepas de campo se
aíslan normalmente en embriones primarios de aves, por ejemplo,
cultivos de fibroblastos
de pollo.
de pollo.
El ARN genómico (ARN de 49S) de los alfavirus es
no segmentado, de polaridad positiva, de aproximadamente
11-12 kb de longitud, y contiene una caperuza en el
extremo 5' y una cola poliadenilada en un extremo 3'. El virus con
envoltura infecciosa se produce mediante el ensamblaje de las
proteínas de la nucleocápsida vírica sobre el ARN genómico en el
citoplasma, y brota a través de la membrana celular embebida con
glicoproteínas víricas codificadas. La entrada del virus en las
células se produce mediante endocitosis a través de los poros
recubiertos con claterina, fusión de la membrana vírica con el
endosoma, liberación de la nucleocápsida y liberación del genoma
vírico. Durante la replicación vírica, el ARN genómico de 49S sirve
como plantilla para la síntesis de la cadena negativa
complementaria. La cadena negativa sirve a la vez como plantilla
para el ARN genómico y para un ARN subgenómico iniciado
internamente. Las proteínas no estructurales se traducen a partir
del ARN genómico. Las proteínas estructurales alfavíricas se
traducen a partir del ARN subgenómico de 26S. Todos los genes
víricos se expresan en forma de poliproteínas y se procesan a
proteínas individuales mediante rotura proteolítica después de la
traducción.
El uso de vectores de alfavirus recombinantes
para tratar individuos requiere que sean capaces de transportarse y
almacenarse durante largos periodos de tiempo a una temperatura
deseada, de tal manera que se mantenga la infectividad y la
viabilidad del virus recombinante. Los procedimientos actuales para
almacenar virus recombinantes implican generalmente el
almacenamiento en forma líquida a bajas temperaturas. Dichos
procedimientos presentan problemas en los países del Tercer Mundo,
que normalmente no disponen de capacidades de refrigeración
adecuadas. Por ejemplo, cada año en África, millones de niños
mueren por enfermedades infecciosas tales como el sarampión. Las
vacunas necesarias para la prevención de estas enfermedades no se
pueden distribuir a la mayoría de estos países debido a que la
refrigeración no es fácilmente accesible.
Además del almacenamiento en forma de líquido y
a bajas temperaturas, las formulaciones víricas actuales contienen
a menudo componentes de los medios que no son deseables para la
inyección en pacientes. En consecuencia, hay una necesidad en la
técnica de un procedimiento para preservar el vector vírico
recombinante purificado (y en concreto, los vectores de alfavirus)
en forma liofilizada a elevadas temperaturas y de esta forma, y que
además sea adecuado para la inyección en pacientes.
La presente invención desvela vectores de
alfavirus recombinantes que son adecuados para el uso en una
variedad de aplicaciones, que incluyen por ejemplo, la terapia
génica, y proporciona además otras ventajas relacionadas.
El documento WO 92/10578 desvela sistemas de
expresión de ADN basados en alfavirus. Describe una molécula una
molécula de ARN auxiliar transcrita in vitro procedente un
vector de ADN auxiliar que comprende la región que codifica las
proteínas estructurales víricas.
Suomalainen y col. (Journal of Virology 1992,
66(8): 4737-4747) describen un ADNc que
dirige la síntesis de un ARN que codifica únicamente la proteína de
la cápsida de un alfavirus.
Frolov y Schlesinger (Journal of Virology 1994,
68(3): 1721-1727) describen varios ADNc que
codifican la proteína de la cápsula de un alfavirus y parte de la
proteína E3.
La invención proporciona casetes de expresión de
proteína estructural de un ADN de alfavirus según se define en las
reivindicaciones.
En un aspecto, la invención proporciona un
casete de expresión de proteína estructural de un ADN de alfavirus
que comprende un promotor que dirige la síntesis de una molécula de
ARN en una célula eucariota, comprendiendo dicha molécula de ARN la
secuencia de codificación de la proteína de la cápsida de un
alfavirus, pero no las secuencias de codificación de las
glicoproteínas E1 y E2 del alfavirus.
En otro aspecto, la invención proporciona un
casete de expresión de proteína estructural de un ADN de alfavirus
que comprende un promotor que dirige la síntesis de una molécula de
ARN en una célula eucariota, comprendiendo dicha molécula de ARN
las secuencias de codificación de las glicoproteínas E1 y E2 del
alfavirus, pero no una secuencia de codificación de la proteína de
la cápsida de un alfavirus.
Los aspectos de la siguiente divulgación que no
se refieren específicamente a la invención reivindicada se incluyen
únicamente por comparación e ilustración.
Definida en resumen, la presente divulgación se
refiere a constructos de vector de alfavirus y partículas de
alfavirus, así como a los procedimientos para preparar y utilizar
los mismos. Comprendidos dentro de un aspecto de la presente
divulgación se proporcionan constructos de vector de alfavirus que
comprenden un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis del
ARN vírico in vitro a partir del ADNc. Una secuencia 5' que
es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia
de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del
alfavirus, una región de unión vírica que se ha inactivado de tal
manera que se evita la transcripción vírica del fragmento
subgenómico, y una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa
del alfavirus. En otros aspectos de la presente divulgación, la
región de unión vírica se ha modificado de tal manera que se reduce
la transcripción vírica del fragmento
subgenómico.
subgenómico.
En otros aspectos más de la presente
divulgación, se desvela que los constructos de vector de alfavirus
comprenden un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis del
ARN vírico in vitro a partir del ADNc, un promotor 5' que es
capaz de iniciar la síntesis del ARN vírico in vitro a partir
de la secuencia 5' del ADNc que es capaz de iniciar la
transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que
codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una primera
región de unión vírica que se ha inactivado de tal manera que se
evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico, una segunda
región de unión vírica que se ha modificado de tal manera que se
reduce la transcripción vírica del fragmento subgenómico, y una
secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus.
En otros aspectos adicionales de la presente
divulgación, se desvelan constructos de vector de ADNc de alfavirus
que comprenden un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis de
ARN vírico in vitro a partir del ADNc, un promotor 5' que es
capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a partir del ADNc seguido
por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un
alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas
no estructurales del alfavirus, una región de unión que se ha
inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del
fragmento subgenómico, una secuencia de reconocimiento de la ARN
polimerasa, y una secuencia 3' que controla la terminación de la
transcripción.
En otro aspecto de la presente divulgación, se
desvelan constructos de vector de ADNc, que comprenden un promotor
5' que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a partir del
ADNC seguido por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la
transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que
codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una región
de unión vírica que se ha modificado de tal manera que se reduce la
transcripción vírica del fragmento subgenómico, una secuencia de
reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus, y una secuencia
3' que controla la terminación de la transcripción.
En otro aspecto de la presente divulgación, se
desvelan constructos de vector de ADNc, que comprenden un promotor
que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a partir del ADNC
seguido por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la
transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que
codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una primera
región de unión vírica que se ha inactivado de tal manera que se
evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico, seguido
por una segunda región de unión vírica que se ha modificado de
manera que se reduce la transcripción vírica del fragmento
subgenómico, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa
del alfavirus, y una secuencia 3' que controla la terminación de la
transcripción.
En una forma de realización, los constructos de
vector descritos anteriormente contienen una secuencia heteróloga.
Normalmente, dicho constructo de vector contiene una secuencia de
nucleótidos heteróloga de más de 100 bases, generalmente, la
secuencia de nucleótidos heteróloga es mayor de 3 kb, y
preferiblemente la secuencia de nucleótidos heteróloga es mayor de
5 kb, y más preferiblemente la secuencia de nucleótidos heteróloga
es mayor de 8 kb. En diversas formas de realización, la secuencia
heteróloga es una secuencia que codifica una proteína seleccionada
entre el grupo constituido por IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11, IL-12, IL-13,
IL-14, IL-15, \alpha, \beta, y
\gamma-IFN, G-CSF, y
GM-CSF.
En otras formas de realización más, los
constructos de vector descritos anteriormente incluyen una secuencia
heteróloga seleccionada que puede ser de un virus seleccionado
entre el grupo constituido por el virus de la gripe, VPH, VHB, VHC,
VEB, VIH, VHS, FeLV, VIF, virus Hanta, HTLV I, HTLV II y CMV. En una
forma de realización preferida, la secuencia heteróloga obtenida de
VPH codifica una proteína seleccionada entre el grupo constituido
por E5, E6, E7 y L1.
En otras formas de realización más, los
constructos de vector descritos anteriormente incluyen una secuencia
heteróloga seleccionada que codifica una proteína VIH seleccionada
entre el grupo constituido por VIH gp 120 y gag.
Las secuencias heterólogas seleccionadas
descritas anteriormente pueden ser secuencias de sentido contrario.
En las formas de realización preferidas, la secuencia de sentido
contrario se seleccionan entre el grupo constituido por las
secuencias que codifican el virus de la gripe, VPH, VHB, VHC, VEB,
VIH, VHS, FeLV, VIF, virus Hanta, HTLV I, HTLV II y CMV.
En otra forma de realización, los constructos de
vector descritos anteriormente no contienen proteínas estructurales
de alfavirus. En otras formas de realización, la secuencia
heteróloga seleccionada se localiza en la dirección 3' de la región
de unión vírica. En los constructos de vector descritos
anteriormente que tienen una segunda unión vírica, la secuencia
heteróloga seleccionada puede, dentro de algunas formas de
realización, localizarse en la dirección 3' de la segunda región de
unión vírica. Cuando la secuencia heteróloga se localiza en la
dirección 3' de la región de unión vírica, el constructo de vector
puede comprender además un poliligante localizado posteriormente en
la región de unión vírica. En las formas de realización de
realización preferidas, dichos poliligantes no contienen una
secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción del
virus alfavirus de tipo natural.
En otra forma de realización más, en los
constructos de vector descritos anteriormente la secuencia
heteróloga seleccionada puede localizarse en el interior de la
secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales
del alfavirus.
En formas de realización concretas, los
constructos de vector descritos anteriormente incluyen una región
de unión vírica constituida por la secuencia de nucleótidos que se
muestra en la Figura 1, desde el nucleótido número 7579, al
nucleótido número 7597 (SEC DE ID Nº 1). En las formas de
realización alternativas, cuando el constructo de vector incluye
una segunda región de unión vírica, el constructo de vector incluye
un gen de adenovirus E3 localizado en la dirección 3' de la segunda
región de unión vírica, y puede comprender además una secuencia de
empaquetado retrovírico localizada entre la primera región de unión
vírica y la segunda región de unión vírica.
En aspectos adicionales, se desvela en el
presente documento un vector de alfavirus recombinante aislado que
no contiene una región de unión vírica funcional, y que en las
formas de realización preferidas produce la transcripción vírica
reducida del fragmento subgenómico.
En un aspecto adicional más, se desvela en el
presente documento un casete de expresión, que comprende un promotor
y una o más proteínas estructurales de alfavirus, siendo el promotor
capaz de dirigir la expresión de las proteínas estructurales de
alfavirus.
En diversas formas de realización, el casete de
expresión es capaz de expresar la proteína de la cápsida del
alfavirus, tal como la proteína estructural Sindbis seleccionada
entre el grupo constituido por 6K, E3, E2, y E1.
En otro aspecto más, se desvela en el presente
documento un casete de expresión que comprende un promotor, una o
más proteínas estructurales de alfavirus, y una secuencia ligando
heteróloga, siendo el promotor capaz de dirigir la expresión de las
proteínas estructurales de alfavirus y la secuencia heteróloga. En
diversas formas de realización, la secuencia ligando heteróloga se
selecciona entre el grupo constituido por VSVG, HIH gp120, el
anticuerpo, insulina, y CD4.
En algunas formas de realización, los casetes de
expresión descritos anteriormente incluyen un promotor seleccionado
entre el grupo constituido por MuL V, MMTV, la región de unión del
alfavirus, CMV y el ARN de VA1.
En otro aspecto adicional más, se desvela en el
presente documento una partícula de alfavirus que, tras introducción
en una célula diana, produce una célula infectada que es viable al
menos 72 horas después de la infección. Se desvelan también células
diana que, tras la infección mediante una partícula de alfavirus de
la presente invención, son viables al menos 72 horas después de la
infección.
En otro aspecto, se desvela en el presente
documento una partícula de alfavirus recombinante que, tras la
introducción en una célula diana, produce una célula infectada que
es viable al menos 72 horas después de la infección, transportando
también la partícula un constructo de vector que dirige la expresión
de un antígeno o su forma modificada en las células diana
infectadas con la partícula de alfavirus, siendo capaz el antígeno
o su forma modificada de estimular una respuesta inmune en el
interior de un animal. En diversas formas de realización, el
antígeno o su forma modificada expresada estimula una respuesta
inmune mediada por células, preferiblemente una respuesta inmune
restringida a la clase I de HLA.
En otro aspecto más, se desvela en el presente
documento una partícula de alfavirus recombinante que transporta un
constructo de vector capaz de dirigir la expresión de un agente
patogénico necesario para la patogenicidad. En diversas formas de
realización, el agente patogénico es un virus, hongo, protozoo, o
bacteria, y la función inhibida se selecciona entre el grupo
constituido por adsorción, replicación, expresión génica,
ensamblaje, y salida del agente patogénico de las células
infectadas. En otras formas de realización, el agente patogénico es
una célula cancerosa, un factor de crecimiento que promueve el
cáncer, un trastorno autoinmune, trastornos cardiovasculares tales
como restenosis, osteoporosis, modelo de calvicie masculina, y la
función inhibida se selecciona entre el grupo constituido por
viabilidad celular y replicación celular. En otras formas de
realización, el constructo de vector dirige la expresión de un
tóxico paliativo en células diana infectadas en respuesta a la
presencia en dichas células de una entidad asociada con el agente
patogénico; preferentemente el paliativo es capaz de inhibir
selectivamente la expresión de un gen patogénico o inhibir la
actividad de una proteína producida por el agente patogénico. En
formas de realización más adicionales, el paliativo comprende un
péptido de inhibición específico de la proteasa vírica, un ARN de
sentido contrario complementario con las secuencias de ARN
necesarias para la patogenicidad, un ARN de sentido directo
complementario con las secuencias de ARN necesarias para la
patogenicidad, o una proteína estructural defectiva de un agente
patogénico, siendo capaz dicha proteína de inhibir el ensamblaje del
agente patogénico.
En formas de realización más adicionales, la
partícula de alfavirus descrita anteriormente dirige la expresión
de un paliativo, más concretamente, dirige la expresión de un
producto génico capaz de activar un precursor inactivo de otra
manera en un inhibidor activo del agente patogénico, por ejemplo, el
producto génico de la timidina quinasa del herpes, un gen supresor
del tumor, o una proteína que activa un compuesto con poca o
ninguna citotoxicidad en un producto tóxico en presencia de un
agente patogénico, efectuando por tanto una terapia localizada del
agente patogénico. Alternativamente, la partícula de alfavirus
dirige la expresión de una proteína que es tóxica tras el
procesamiento o la modificación por una proteína derivada de un
agente patogénico, un producto indicador en la superficie de las
células diana infectadas con el alfavirus y que contiene el agente
patogénico, o una molécula de ARN que funciona como de sentido
contrario o ribozima específica de una molécula de ARN
patogénica.
En algunas formas de realización, en la
partícula de alfavirus descrita anteriormente, la proteína es la
timidina quinasa o CD4 de herpes.
En aspectos más adicionales, se desvela en el
presente documento una partícula de alfavirus que dirige la
expresión de un gen capaz de suprimir uno o más elementos del
sistema inmune en la células diana infectadas con el alfavirus, y
una partícula de alfavirus que dirige la expresión de un elemento de
bloqueo en las células infectadas con el virus Sindbis, siendo
capaz el elemento de bloqueo de unirse tanto a un receptor como a un
agente de tal manera que se bloquea la interacción
receptor/agente.
En otros aspectos, se desvela en el presente
documento un procedimiento para estimular una respuesta inmune a un
antígeno, que comprende infectar las células diana susceptibles con
una partícula de alfavirus que dirige la expresión de al menos un
antígeno o su forma modificada en las células diana infectadas con
el alfavirus, siendo capaz el antígeno o su forma modificada de
estimular una respuesta inmune en el interior de un animal. En una
forma de realización preferida, las células diana se infectan in
vivo.
En aspectos más adicionales de la presente
divulgación, se desvela un procedimiento de estimulación de una
respuesta inmune da un agente patogénico, que comprende infectar
células diana susceptibles con una partícula de alfavirus que
dirige la expresión de una forma modificada de un agente patogénico
en las células diana infectadas con el alfavirus, siendo capaz el
antígeno modificado de estimular una respuesta inmune en el interior
de un animal pero teniendo patogenicidad reducida con respecto al
antígeno patogénico.
\newpage
En otros aspectos adicionales de la presente
divulgación, se desvela un procedimiento para estimular una
respuesta inmune a un antígeno, que comprende infectar las células
diana susceptibles con una partícula de alfavirus que dirige la
expresión de un péptido que tiene múltiples epitopos, derivados uno
o más de los epitopos de diferentes proteínas.
En otro aspecto más de la divulgación, se
desvela la estimulación de una respuesta inmune en un animal de
sangre caliente, que comprende infectar las células diana
susceptibles asociadas con un animal de sangre caliente con
secuencias de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las
proteínas MHC de clase I o clase II, o sus combinaciones, e
infectar las células con una partícula de alfavirus que dirige la
expresión de al menos un antígeno o su forma modificada en las
células diana infectadas con la partícula de alfavirus, siendo capaz
el antígeno o su forma modificada de estimular una respuesta inmune
en el interior del animal.
En otro aspecto de la presente divulgación, se
desvela un procedimiento para inhibir un agente patogénico, que
comprende infectar células diana susceptibles con una partícula de
alfavirus que dirige la expresión de un paliativo en las células
infectadas con la partícula de alfavirus, siendo el paliativo capaz
de inhibir una función de un agente patogénico necesaria para la
patogenicidad.
En otros aspectos de la presente divulgación, se
desvelan sistemas de iniciación de vectores eucarióticos en capas.
De manera resumida, En una forma de realización de la divulgación,
el sistema de iniciación del vector eucariótico en capa comprende
un promotor 5', un constructo que es capaz de expresar una secuencia
de nucleótidos heteróloga que es capaz de la replicación en una
célula tanto de manera autónoma, como en respuesta a uno o más
factores, y una secuencia de terminación de la transcripción. En
otro aspecto, se desvela un sistema de iniciación del ADD de un
vector en capas eucariótico, que comprende un promotor 5', un
constructo que es capaz de expresar una secuencia de ARN heteróloga
que es capaz de la replicación en una célula tanto de manera
autónoma como en respuesta a uno o más factores, y una secuencia de
terminación de la transcripción. En una forma de realización
preferida, el constructo que es capaz de expresar una o más
secuencias de nucleótidos heterólogas es un constructo de un vector
de ADNc de Sindbis. En otras formas de realización, el constructo
es un vector vírico seleccionado entre el grupo constituido por
poliovirus, rinovirus, pox virus, retrovirus, virus de la gripe,
adenovirus, virus adeno asociado, virus del herpes, virus SV40, VIH,
sarampión, astrovirus, Virus del Bosque Semliki y coronavirus. En
otra forma de realización de realización, el sistema de iniciación
de vector en capas eucariótico comprende además una secuencia de
poliadenilación.
En otro aspecto más, se desvela en el presente
documento una molécula de vector de ARN de alfavirus descrita
anteriormente, capaz de dirigir la expresión de un paliativo en una
célula diana. El paliativo en esta configuración de vector de
expresión de ARN de alfavirus, cuando se expresa, tiene el mismo
efecto que los aspectos descritos anteriormente para una partícula
de alfavirus. El vector de expresión de ARN de alfavirus incluye, en
orden, una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de
un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las
proteínas no estructurales del alfavirus, una región de unión
vírica, una secuencia heteróloga, una secuencia de reconocimiento
de las ARN polimerasa del alfavirus, y una extensión de 25 restos
poliadenilados consecutivos, y se introduce en las células diana
directamente mediante medios físicos como una molécula de ARN, como
un complejo con diversas formulaciones de liposomas, o como un
complejo de ligando de ARN que incluye la molécula del vector de
ARN del alfavirus, un compuesto policatiónico tal como polilisina,
un ligando específico del receptor, y, opcionalmente, un virus
inactivado con psoraleno tal como Sendai o Adenovirus: Se desvelan
también en el presente documento las líneas celulares de empaquetado
y las líneas celulares productoras adecuadas para producir
partículas de alfavirus recombinante. Dichas líneas celulares de
empaquetado o productoras pueden ser tanto de mamíferos como de no
mamíferos (por ejemplo, células de insecto tales como células
de mosquito).
Se pueden utilizar una amplia variedad de
alfavirus dentro del contexto de la presente invención. Los ejemplos
representativos incluyen, Aura, Encefalitis Equina de Venezuela,
Fort Morgan, Ross River, Virus del Bosque Semliki y Mayaro.
Estos y otros aspectos de la presente invención
serán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción
detallada y a los dibujos adjuntos. Además, se muestran a
continuación diversas referencias que describen con más detalle
algunos procedimientos o composiciones (por ejemplo,
plásmidos, etc.).
Las Figuras que no se refieren específicamente a
la invención reivindicada son únicamente para comparación e
ilustración.
La Figura 1 es una ilustración esquemática de la
organización genómica del virus Sindbis.
La Figura 2 es una ilustración que representa
gráficamente un procedimiento para la amplificación del genoma de
ARN de Sindbis mediante la RT-PCR.
Las Figuras 3A-H muestran la
secuencia de un Sistema de Iniciación de Vector en Capas Eucariótico
representativo derivado de Sindbis (véase también la SEC DE ID Nº
89).
La Figura 4 es una ilustración esquemática de un
Vector Sindbis Básico y un Vector
Sindbis-Luciferasa.
La Figura 5 es una ilustración de la
Construcción del Vector Auxiliar de Sindbis.
La Figura 6 es una representación gráfica que
ilustra la expresión y el rescate de un Vector
Sindbis-Luciferasa.
La Figura 7 es una ilustración de un
procedimiento para modificar una región de unión de Sindbis.
La Figura 8 es una ilustración esquemática de
los Casetes de Expresión de Empaquetado de Sindbis.
La Figura 9 es un gráfico de barras que ilustra
el Empaquetamiento del Vector Sindbis-luciferasa en
células LTR/SinddLBspE.
Las 20 bases 3' terminales del primer producto
amplicón de la PCR primaria solapan con las 20 bases 5' terminales
del segundo producto de amplicón de la PCR primaria, los 2.742 pb
que solapaban del producto de amplicón de la PCR secundaria se
purificaron mediante electroforesis con agarosa/TBE al 0,8%, se
digirieron con BglII, y el producto de 2.734 pb se ligó en
pcDNAS-INbgl/xba (véase el Ejemplo 3) y se trató con
BglII y CIAP. La construcción resultante tiene 16.641 pb y se
conoce como ELVIS-PySIN. Con el fin de construir un
vector de expresión de la proteína estructural similar a
pLTR/Sind1Bsp para la derivación de las líneas celulares de
empaquetado del vector, la construcción ELVIS-PySIN
se digirió hasta finalización con Bsp EI, y se volvió a ligar en
condiciones de dilución, con el fin de llevar a cabo la delección de
las proteínas no estructurales entre las bases
422-7054. Esta construcción se conoce como
ELVIS-PySINdIBspE.
Se complejó el ADN plásmido de
ELVIS-PySIN con Lipofectamina
(GIBCO-BRL, Gaithersbery, MD) de acuerdo con las
condiciones sugeridas por el suministrador (circa 5 \mug de ADN/8
mg de reactivo lípido) y se añadió a pocillos de 35 mm que
contenían células PCC4 o F9 no diferenciadas con una confluencia
aproximadamente del 75%. El desarrollo de efectos citopáticos
(CPE), y el nivel de infección productiva de Sindbis, cuantificados
mediante el ensayo de placas de los medios sobrenadantes, se
determinan a intervalos regulares de 5 días en células PCC4 o F9 no
diferenciadas y diferenciadas. La diferenciación de las células F9 y
PCC4 se lleva a cabo mediante la adición de ácido retinoico (Sigma
Chemical Co., St. Louis, Mo), hasta una concentración final de 1
\muM.
Si las células EC no diferenciadas demuestran
una respuesta heteróloga a la transfección con
ELVIS-PySIN, las células restantes no lisadas por
la propagación del virus Sindbis tras la selección de G418, se
clonan y expanden las células EC no diferenciadas transfectadas con
pVGELVIS. A continuación se ensayan los clones celulares para la
producción del virus Sindbis tras la diferenciación, mediante la
adición de ácido retinoico (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo),
hasta una concentración final de 1 \muM.
El aislamiento de las líneas celulares de
empaquetado del vector transfectadas de manera estable con
ELVIS-PySINd1BspE, que tienen un estado de
diferenciación celular dependiente del modelo de expresión de las
proteínas estructurales en presencia de Sindbis NSP, se lleva a
cabo tal como se ha descrito anteriormente para el plásmido
pLTR/SindIBspE.
\vskip1.000000\baselineskip
El tercer ejemplo de esta estrategia usa la
región control del locus de la \beta-globina. El
grupo multigen de la \beta-globina contiene cinco
genes regulados de forma desarrollada. En las primeras etapas del
desarrollo humano, el saco vitelino embriónico es el tejido
hematopoyético y expresa el gen de la
\varepsilon-globina. Esto va seguido por un cambio
en el gen de la \gamma-globina.
La Figura 10 es una ilustración esquemática de
cómo se pueden usar Astrovirus u otros virus heterólogos para
expresar las proteínas estructurales Sindbis.
La Figura 11 es una ilustración esquemática del
mecanismo de activación de una región de unión vírica inactivada por
el "ARN de bucle externo".
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de establecer la invención, puede ser útil
para su comprensión establecer en primer lugar las definiciones de
algunos términos que se usarán más adelante en el presente
documento.
"Constructo de vector de alfavirus"
se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de
una(s) secuencia(s) o gen(es) de interés. El
constructo de vector debería incluir un promotor 5' que sea capaz de
iniciar la síntesis de ARN vírico in vitro a partir del
ADNc, una secuencia 5' que sea capaz de iniciar la transcripción de
un alfavirus, así como una(s) secuencia(s) que cuando
se expresa(n), codifica(n) las proteínas no
estructurales del alfavirus biológicamente activo (es decir, NSP1,
NSP2, NSP3, y NSP4). Además, el constructo de vector debería
incluir una región de unión vírica que puede, en algunas formas de
realización, modificarse con el fin de evitar, inhibir o reducir la
transcripción vírica del fragmento subgenómico, y una secuencia de
reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus. El constructo de
vector puede incluir también una(s) molécula(s) de
ácido nucleico que son de tamaño suficiente para permitir la
producción del virus viable, así como uno o más emplazamientos de
restricción. Cuando el constructo de vector de alfavirus es un
constructo de vector de ADNc, debería incluir adicionalmente un
promotor 5' que sea capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a
partir del ADNc, y una secuencia 3' que controle la terminación de
la transcripción y el reconocimiento del corte y empalme.
"Casete de expresión" se refiere a
una molécula producida de manera recombinante que es capaz de
expresar la(s) proteína(s) estructural(es) del
alfavirus. El casete de expresión debe incluir un promotor y una
secuencia que codifique la(s) proteína(s)
estructural(es) del alfavirus. Opcionalmente, el casete de
expresión puede incluir la terminación de la transcripción, el
reconocimiento del corte y empalme, y los emplazamientos de adición
de la poliadenilación. Los promotores preferidos incluyen los
promotores CMV y VAIRNA de adenovirus. Además, el casete de
expresión puede contener marcadores seleccionables tales como Neo,
SV2Neo, higromicina, fleomicina, histidinol, y DHFR.
"Partícula de alfavirus" se refiere
a una cápsida que contiene un vector de alfavirus. Una variedad de
vectores puede estar contenida en el interior de la partícula de
alfavirus, incluyendo los constructos de vector de alfavirus de la
presente invención. Preferiblemente, la cápsida del alfavirus está
contenida en el interior de una bicapa lípida, tal como una membrana
celular, en la que están embebidas las proteínas víricas
codificadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha señalado anteriormente, la
presente invención se refiere a constructos de vector de alfavirus,
las partículas de alfavirus que contienen dichos constructos, así
como a los procedimientos para usar dichos constructos y partículas
de vector. De manera resumida, las secuencias que codifican los
alfavirus de tipo natural adecuados para uso en la preparación de
los constructos de vector y partículas anteriormente descritos se
pueden obtener fácilmente dada la divulgación proporcionada en el
presente documento a partir de fuentes que se producen
naturalmente, o a partir de depositantes (por ejemplo, la American
Type Culture Collection, Rockville, Maryland).
Los ejemplos representativos de alfavirus
adecuados incluyen Aura (ATCC VR-368), virus Bebaru
(ATCC VR-600, ATCC VR-1240),
Cabassou (ATCC VR-922), virus Chikungunya (ATCC
VR-64, ATCC VR-1241), virus de la
encefalomielitis equina oriental (ATCC VR-65, ATCC
VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924),
virus Getah (ATCC VR-369, ATCC
VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927),
Mayaro (ATCC VR-66), virus Mayaro (ATCC
VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370),
virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC
VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), virus
Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245),
virus Ross River (ATCC VR-373, ATCC
VR-1246), virus del Bosque Semliki (ATCC
VR-67, ATCC VR-1247), virus Sindbis
(ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate
(ATCC VR-925), Triniti (ATCC
VR-469), Una (ATCC VR-374),
encefalomielitis equina de Venezuela (ATCC VR-69),
virus de la encefalomielitis equina de Venezuela (ATCC
VR-923, ATCC VR-1250 ATCC
VR-1249, ATCC VR-532),
encefalomielitis equina occidental (ATCC VR-70, ATCC
VR-1251, ATCC VR-622, ATCC
VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926), e
Y-62-33 (ATCC
VR-375).
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de un aspecto particularmente preferido
de la presente divulgación, se pueden obtener las secuencias que
codifican el alfavirus de tipo natural a partir del virus Sindbis.
En concreto, En una forma de realización de la divulgación (y tal
como se describe con más detalle a continuación en el Ejemplo 1), se
puede obtener un clon de ADNc de Sindbis uniendo el extremo 5' de
un clon de ADNc del virus Sindbis a un promotor de la ARN
polimerasa de bacteriófago, y el extremo 3' del clon de ADNc a una
extensión de poli-adenosina (poli A) de al menos 25
nucleótidos. En concreto, la síntesis de la primera cadena de ADNc a
partir de la plantilla de ARN vírico puede llevarse a cabo con un
cebador de oligonucleótido 3' que tiene una secuencia consecutiva
que comprende una secuencia de reconocimiento de la enzima, una
secuencia de 25 nucleótidos de desoxitimidina, y una extensión de
aproximadamente 18 nucleótidos que es complementaria del extremo 3'
vírico y del cebador 5' que contiene los nucleótidos tampón, una
secuencia de reconocimiento de la enzima, un promotor de
bacteriófago, y una secuencia complementaria del extremo 5' vírico.
Los emplazamientos de reconocimiento de la enzima presentes en cada
uno de estos cebadores deberían ser diferentes entre sí, y no se
encuentran en el virus Sindbis. Además, el primer nucleótido unido
al extremo 3' del promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago
debería ser el primer nucleótido auténtico del virus de ARN. El ARN
transcrito in vitro a partir del clon de ADNc vírico, que
tiene la construcción descrita anteriormente y se linealizó mediante
digestión con el único enzima de restricción 3' distal dT:dA
iniciará, tras la introducción en la célula eucariota apropiada, el
mismo ciclo de infección que es característico de la infección por
el virus de tipo natural a partir del cual se clonó el ADNc. Este
clon de ADNc vírico, que da como resultado ARN capaz de iniciar la
infección después de la transcripción in vitro, se denomina a
continuación como "clon de ADNc infeccioso".
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede utilizar fácilmente un clon de ADNc
infeccioso preparado tal como se ha descrito anteriormente (o
utilizando secuencias que codifican un alfavirus obtenido,
procedentes de otras fuentes) para preparar constructos de vector
de alfavirus tal como se describe en el presente documento. De
manera resumida, dentro de un aspecto de la presente divulgación,
se proporcionan constructos de vector de alfavirus recombinante, que
comprenden una secuencia 5' que es capaz de iniciar la
transcripción de un alfavirus, una secuencia de alfavirus que
codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una región de
unión vírica que se ha inactivado de tal manera que se evita la
transcripción vírica del fragmento subgenómico, y una secuencia de
reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus. Tal como se
discutirá con más detalle a continuación, los constructos de vector
de alfavirus que han inactivado las regiones de unión vírica no
transcriben el fragmento subgenómico, haciéndoles adecuados para una
amplia variedad de aplicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha señalado anteriormente, dentro de
algunas formas de realización de la divulgación, los constructos de
vector de alfavirus de la presente divulgación contienen un promotor
5' que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico in
vitro a partir del ADNc. Concretamente, los promotores 5'
preferidos incluyen promotores de la ARN polimerasa tales como T7,
T3 y SP6.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha señalado anteriormente en las
formas de realización de realización preferidas, los constructos de
vector de alfavirus de la presente divulgación contienen una
secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un
alfavirus. Los ejemplos representativos de dichas secuencias
incluyen los nucleótidos 1-60 del virus Sindbis de
tipo natural (véase la Figura 3), los nucleótidos
10-75 de la Asparagina del ARNt (Schlesinger y
col., Patente de los Estados Unidos Nº. 5.091.309), y las secuencias
5' de otros Togavirus que inician la transcripción.
\vskip1.000000\baselineskip
Los constructos de vector de alfavirus de la
presente divulgación deberían contener también las secuencias que
codifican las Proteínas No Estructurales de Alfavirus (NSP). Como
ejemplo, para el virus Sindbis existen cuatro proteínas no
estructurales: Sindbis, NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4, que codifican las
proteínas que permiten al virus autorreplicarse. Las proteínas no
estructurales 1 a 3 (NSP1-NSP3) están, En una forma
de realización de la divulgación, codificadas por los nucleótidos
60 a 5750 del virus Sindbis de tipo natural (véase la Figura
3). Estas proteínas se producen en forma de poliproteína y
posteriormente se rompen en las proteínas no estructurales NSP1,
NSP2, y NSP3. NSP4 está, En una forma de realización, codificada por
los nucleótidos 5928 a 7579 (véase la Figura 3).
Será evidente para una persona normalmente
experta en la técnica que se pueden utilizar una amplia variedad de
secuencias que codifican las proteínas no estructurales de alfavirus
además de las descritas anteriormente, y por tanto, considerarse
comprendidas dentro del alcance de la frase "Proteínas No
Estructurales de Alfavirus". Por ejemplo, en una forma de
realización de la divulgación, debido a la degeneración del código
genético, más de un codón puede codificar un aminoácido dado. Por
tanto, se pueden generar una amplia variedad de secuencias de ácido
nucleico que codifican proteínas no estructurales de alfavirus. En
otras formas de realización de la divulgación, se pueden preparar
una variedad de diferentes derivados de proteínas no estructurales,
que incluyen por ejemplo, diversas sustituciones, inserciones, o
delecciones, el resultado neto de las cuales no altera la actividad
biológica de las proteínas no estructurales de alfavirus. Dentro del
contexto de la presente divulgación se considera que las proteínas
no estructurales de alfavirus son "biológicamente activas"
in toto si promueven la autorreplicación del constructo de
vector. La autorreplicación, que se refiere a la replicación de
ácidos nucleicos víricos y no a la producción de virus infecciosos,
se puede determinar fácilmente mediante los ensayos de protección
de la RNasa llevados a cabo durante un periodo de tiempo. Se pueden
llevar a cabo fácilmente los procedimientos para preparar dichos
derivados por una persona normalmente experta en la técnica dada la
divulgación proporcionada en el presente documento (véase
también, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), Cold
Spring Harbor Laboratory Press).
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de este aspecto de la divulgación, los
constructos de vector de alfavirus incluyen también una región de
unión vírica que se ha inactivado, de tal manera que se evita la
transcripción vírica del fragmento subgenómico. De manera resumida,
la región de unión vírica del alfavirus controla normalmente la
iniciación de la transcripción del fragmento subgenómico. En el
caso del virus Sindbis, la región de unión vírica normal comienza
usualmente en aproximadamente el nucleótido número 7579 y continúa
hasta al menos el nucleótido número 7612 (y posiblemente más allá).
Como mínimo, se creen necesarios los nucleótidos 7579 a 7602
(5'-ATC TCT ACG GTG GTC CTA AAT
AGT-SEC DE ID Nº. I) para la transcripción del
fragmento subgenómico. Esta región (nucleótidos 7579 a 7602) se
denomina a partir de ahora en el presente documento como "núcleo
mínimo de la región de unión".
En las formas de realización de realización
preferidas de la divulgación (y tal como se describe con más detalle
a continuación), la región de unión vírica está inactivada con el
fin de evitar la transcripción vírica del fragmento subgenómico.
Tal como se utiliza dentro del contexto de la presente divulgación,
"inactivada" significa que el fragmento correspondiente al
punto de iniciación del fragmento subgenómico, tal como se mide
mediante el ensayo de protección de la RNasa, no se detecta. (Se
describen los ensayos representativos por Melton y col., Nuc. Acids
Res. 12: 7035-7056, 1984; Calzon y col., Methods in
Enz. 152:611-632, 1987; y Kekule y col., Nature 343:
457-461, 1990.)
\global\parskip0.870000\baselineskip
En una forma de realización de la divulgación,
la región de unión vírica está inactivada por el truncamiento de la
región de unión vírica en el nucleótido 7597 (es decir, la región de
unión vírica estará constituida entonces por la secuencia que se
muestra en la Figura 3, desde el nucleótido 7579 al nucleótido
7597). Este truncamiento evita la transcripción del fragmento
subgenómico, y adicionalmente permite la síntesis de la región NSP4
completa (que está codificada por los nucleótidos 5928 a 7579).
Como será evidente para una persona normalmente
experta en la técnica dada la divulgación proporcionada en el
presente documento, se puede preparar una amplia variedad de
diferentes delecciones, sustituciones o inserciones con el fin de
inactivar la región de unión vírica. Por ejemplo, En otras formas de
realización de la divulgación, la región de unión vírica puede
estar truncada además en la región que codifica NSP4, evitando por
tanto la transcripción vírica del fragmento subgenómico mientras
que retiene la actividad biológica de NSP4. Alternativamente, En
otras formas de realización, debido a la redundancia del código
genético, se pueden realizar sustituciones de nucleótidos en la
secuencia que codifica NSP4, el efecto neto de las cuales no altera
aún la actividad biológica de NSP4, sin embargo, evita la
transcripción del fragmento subgenómico.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha señalado anteriormente, los
constructos de vector de alfavirus de la presente divulgación
deberían incluir también una secuencia de reconocimiento de la ARN
polimerasa de alfavirus (denominada también "secuencia de
reconocimiento de la replicasa de alfavirus"). De manera
resumida, la secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa de
alfavirus proporciona un emplazamiento de reconocimiento en el que
el virus comienza la replicación de la cadena negativa. Se puede
utilizar una amplia variedad de secuencias tal como una secuencia
de reconocimiento de la ARN polimerasa de alfavirus. Por ejemplo, en
una forma de realización, los constructos de vector Sindbis de la
presente divulgación incluyen una secuencia de reconocimiento de la
polimerasa de Sindbis que está codificada por los nucleótidos
11.647 a 11.703 (véase la Figura 3). En otras formas de
realización, el reconocimiento de la polimerasa de Sindbis está
truncado en una región más pequeña que puede funcionar aún como
secuencia de reconocimiento (por ejemplo, los nucleótidos
11.684 a 11.703 de la Figura 3).
En las formas de realización de realización
preferidas de la divulgación, el constructo de vector puede contener
adicionalmente una cola poli A. de manera resumida, la cola poli A
puede ser de cualquier tamaño con tal de que sea suficiente para
promover la estabilidad en el citoplasma, aumentando por tanto la
eficiencia de iniciación del ciclo de vida vírico. En diversas
formas de realización de la divulgación, la cola poli A comprende al
menos 10 nucleótidos adenosina, y lo más preferible, al menos 25
nucleótidos adenosina.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de los constructos de vector que han
descrito en general anteriormente, se puede preparar también una
amplia variedad de otros constructos de vector de alfavirus
utilizando la divulgación proporcionada en el presente
documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de un aspecto de la presente divulgación,
se desvelan constructos de vector de alfavirus en los que se ha
modificado la región de unión vírica, de tal manera que la
transcripción vírica del fragmento subgenómico está reducida. De
manera resumida, la infección de células con alfavirus de tipo
natural da como resultado normalmente la muerte celular como
resultado de la abundante transcripción vírica del fragmento
subgenómico iniciada desde la región de unión vírica. Esta gran
abundancia de moléculas de ARN puede arrollar la maquinaria
transcripcional de la célula infectada, dando como resultado
finalmente la muerte de la célula. En las aplicaciones en las que
se desea que la infección de la célula diana deba dar como resultado
un efecto terapéutico (por ejemplo, la escisión de la cadena de un
ácido nucleico diana o la expresión prolongada de una proteína
heteróloga) en lugar de la muerte de la célula, se pueden hacer
diversas modificaciones en el constructo de vector de alfavirus
(además de inactivar el constructo de vector, tal como se describe
anteriormente) con el fin de reducir el nivel de transcripción
vírica del fragmento subgenómico, y prolongar por tanto la vida de
la célula diana infectada con el vector. Dentro del contexto de la
presente divulgación, se considera que la transcripción vírica del
fragmento subgenómico se va a "reducir" si esta produce menos
fragmento subgenómico que un alfavirus estándar de tipo natural
(por ejemplo, virus Sindbis ATCC Nº VR-1248) tal
como se determina mediante el ensayo de protección de la RNasa.
Se pueden modificar las regiones de unión vírica
mediante una variedad de procedimientos con el fin de reducir el
nivel de la transcripción vírica del fragmento subgenómico. Por
ejemplo, en una forma de realización de la divulgación, debido a la
redundancia del código genético, se pueden realizar sustituciones de
nucleótidos en la región 7579 a 7597 de unión vírica, el efecto
neto de las cuales no altera la secuencia de aminoácidos de NSP4
(o, En otras formas de realización, la actividad biológica de NSP4),
y reduce además el nivel de la transcripción vírica del fragmento
subgenómico. Si el constructo de vector modificado incluye
nucleótidos más allá del 7597 (por ejemplo, a 7602 0 7612), se
pueden hacer además igualmente sustituciones de nucleótidos,
aunque, debido a que NSP4 termina en el 7597, dichas sustituciones
no necesitan estar basadas en la redundancia genética. Los ejemplos
representativos de regiones de unión vírica modificada se describen
con más detalle a continuación en el Ejemplo 3.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En otros aspectos de la divulgación, se desvelan
constructos de vector de alfavirus, que comprenden una secuencia 5'
que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una
secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no
estructurales del alfavirus, una primera región de unión vírica que
se ha inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica
del fragmento subgenómico, una segunda región de unión vírica que se
ha modificado de tal manera que se reduce la transcripción vírica
del fragmento subgenómico, y una secuencia de reconocimiento de la
ARN polimerasa del alfavirus. Dichos constructos de vector se
denominan como constructos de vector "en tándem" debido a que
comprenden una primera región de unión vírica inactivada (o
"deshabilitada"), así como una segunda región de unión vírica
modificada (o "sintética"). En las formas de realización de
realización preferidas de la divulgación, la región de unión
inactivada está seguida directamente por la segunda región de unión
vírica modificada.
En aplicaciones en las que se requiere un bajo
nivel de transcripción subgenómica, se puede insertar un núcleo
mínimo de región de unión en la dirección 3' en tándem a la región
de unión inactivada. Con el fin de aumentar gradualmente el nivel
de transcripción subgenómica para el efecto deseado, se pueden
añadir secuencias que corresponden a la región de unión completa a
la región de unión en tándem, en incrementos.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto de la divulgación, un gen E3 de
adenovirus se inserta en un constructo de vector en tándem tras la
segunda región de unión vírica, con el fin de infrarregular la
expresión de HLA en las células infectadas con alfavirus. De manera
resumida, en diversas formas de realización de la divulgación, son
deseables las inoculaciones repetidas de una terapéutica génica en
el mismo individuo. Sin embargo, las inoculaciones repetidas de
alfavirus tales como el virus Sindbis pueden conducir al desarrollo
de anticuerpos específicos o la respuesta inmune mediada por
células contra a la proteína vírica no estructural Sindbis (NSP). De
esta manera, puede ser necesario disminuir la respuesta inmune del
huésped dirigida a las proteínas específicas del vector con el fin
de administrar dosis repetidas al mismo individuo.
Por tanto, En una forma de realización de la
divulgación, se utilizan los productos del gen 3 de la región
temprana de tipo 2 de Adenovirus con el fin de infrarregular la
expresión de los antígenos de histocompatibilidad integrales
expresados sobre la superficie de las células infectadas. De manera
resumida, la proteína E3 de 19.000 dalton (E3/19K) se une a, y
forma un complejo molecular con, los antígenos
H-2/HLA de tipo I en el retículo endoplásmico,
evitado la glicosilación terminal de las rutas necesarias para la
maduración completa y el posterior transporte de los antígenos
H-2/HLA de tipo I a la membrana celular. En las
células diana infectadas con un vector de alfavirus que codifica la
proteína Ad 2 E3 no se producirá la expresión simultánea de las
proteínas no estructurales víricas en el contexto de los antígenos
de tipo I. de esta manera, es posible administrar dosis repetidas
de un vector de alfavirus que expresa la proteína Ad 2 E3 como
componente de su paliativo terapéutico en el mismo individuo. Un
ejemplo representativo del uso del gen E3 de Adenovirus se muestra
con más detalle a continuación en el Ejemplo 4A.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden utilizar también otros procedimientos
con el fin de disminuir una respuesta inmune del huésped contra las
NSP víricas. Por ejemplo, en otro aspecto de la divulgación, el gen
H301 de Citomegalovirus Humano ("HCMV") se clona en un
constructo de vector de alfavirus, preferiblemente inmediatamente
después de la segunda región de unión vírica en un vector en
tándem, con el fin de inhibir la respuesta CTL del huésped dirigida
contra las proteínas específicas víricas expresadas en las células
infectadas del vector.
De manera resumida, la proteína
\beta2-Microglobulina (\beta2m) se une a las
regiones \alpha1, \alpha2 y \alpha3 de la cadena a de las
moléculas de histocompatibilidad mayor de tipo I de los eucariotas
superiores. Evitar la interacción entre \beta2m y los productos
MHC de tipo I vuelve las células infectadas no reconocibles por las
células T citotóxicas. Por tanto, tal como se describe con mayor
detalle a continuación en el Ejemplo 4B, se puede utilizar la
expresión del producto génico H301 de HCMV como componente de un
paliativo terapéutico con el fin de disminuir la respuesta inmune
del huésped a la NSP vírica.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto de la divulgación, una secuencia
de empaquetado retrovírico se inserta en un vector en tándem y se
sitúa entre la primera región de unión vírica (inactivada) y la
segunda región de unión vírica modificada. De manera resumida, las
secuencias de empaquetado retrovírico señalan el empaquetamiento de
un genoma de ARN en una partícula retrovírica. Tal como se describe
con más detalle a continuación, se puede utilizar una secuencia de
de empaquetado retrovírico con el fin de empaquetar un vector de
alfavirus en una partícula retrovírica usando una línea celular de
empaquetado retrovírico. Esto se lleva a cabo con el fin de aumentar
la eficiencia de la transferencia del vector de alfavirus en una
línea celular que empaqueta el alfavirus.
\vskip1.000000\baselineskip
La longitud genómica y la longitud subgenómica
de los ARNm transcritos en las células infectadas con alfavirus de
tipo natural son policistrónicas, codificando, respectivamente, las
cuatro proteínas no estructurales víricas (NSP) y las cuatro
proteínas estructurales (SP). Los ARNm genómicos y subgenómicos se
traducen en forma de poliproteínas, y el procesamiento en proteínas
no estructurales y estructurales individuales se lleva a cabo
mediante rotura proteolítica post traduccional catalizada por las
proteasas específicas de NSP y SP codificadas víricas.
En algunas aplicaciones de los vectores de
alfavirus descritos en el presente documento, se desea la expresión
de más de un gen heterólogo. Por ejemplo, con el fin de tratar
trastornos metabólicos tales como el síndrome de Gaucher, se pueden
requerir administraciones múltiples de vectores o partículas de
alfavirus, debido a que la duración de la terapéutica paliativa
puede ser limitada, Por tanto, con algunas formas de realización de
la divulgación puede ser deseable expresar simultáneamente en una
célula diana el gen Ad 2 E3 (véase el Ejemplo 4), junto con
una terapéutica paliativa, tal como el gen de la glucocerbrocidasa
(véase el Ejemplo 11). En el virus de tipo natural, sin
embargo, el mensaje policistrónico de la proteína estructural
("SP") se traduce en una poliproteína única que se procesa
posteriormente en proteínas individuales mediante rotura con las
proteasas codificadas por SP. De esta manera, la expresión de
múltiples genes heterólogos a partir de un mensaje policistrónico
requiere un mecanismo diferente del virus de tipo natural, debido a
que el gen de la proteasa SP, o los péptidos reconocidos para la
rotura, no están presentes en la región de sustitución de los
vectores de alfavirus.
Por tanto, en una forma de realización de la
divulgación, se pueden construir vectores de alfavirus mediante la
colocación de señales apropiadas tanto en la lectura del ribosoma
como en la entada interna del ribosoma entre los cistrones. Se
muestra más adelante en el Ejemplo 5 uno de dichos procedimientos
representativos de expresión de múltiples genes heterólogos.
En otra forma de realización más de la
divulgación, se describe la colocación de señales promotoras tanto
en la lectura del ribosoma como en la entrada interna del ribosoma
inmediatamente en la dirección 3' del vector pKSSINBdlJR de la
región de unión inactivada (véase el Ejemplo 3). En esta
configuración del vector, no se puede producir la síntesis del
mensaje subgenómico; sin embargo, las proteínas heterólogas se
expresan a partir del ARNm de longitud genómica tanto en la lectura
ribosómica (detección) como en la entrada interna del ribosoma. Con
respecto al tipo natural, el bajo nivel de transcripción vírica con
este vector de alfavirus prolongaría la vida de la célula diana
infectada.
En otra forma de realización más de la
divulgación, se describe la colocación de señales promotoras tanto
en la lectura del ribosoma como en la entrada interna del ribosoma
inmediatamente en la dirección 3' de los vectores pKSSINBVdIJRsjr o
pKSSINBV. De manera resumida, debido a que la síntesis de ARNm
subgenómico se produce en las células infectadas con los vectores
pKSSINBVdIJRsjr y pKSSINBV la colocación tanto de una secuencia de
lectura del ribosoma como de una secuencia de entrada interna del
ribosoma entre dos genes heterólogos permite la traducción de ambas
proteínas codificadas mediante el mensaje policistrónico del ARNm
subgenómico. Además, se pueden colocar genes heterólogos
adicionales en la región del ARNm subgenómico, con la condición de
que una señal de iniciación de la traducción adecuada resida en el
extremo 5' del codón de inicio AUG traduccional: el número de
gene(s) heterólogos que se puede insertar en la región del
ARNm subgenómico, tal como se describe aquí, está limitado
únicamente por las restricciones de empaquetado del vector.
Se pueden colocar diferentes secuencias que
permiten tanto la lectura del ribosoma, la traducción independiente
de la caperuza, como la entrada interna del ribosoma en los vectores
Sindbis pKSSINBVdIR, pKSSINBV, o pKSSrNBVdIRsjrc, en las
configuraciones que se desvelan anteriormente. La fuente de estas
secuencias control de la traducción son los picornavirus de la
polio y EMCV, la región 50 no codificada de la proteína de unión a
la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, y la secuencia
sintética de al menos 15 pb que corresponde en parte a la secuencia
consenso de Kozak para la iniciación traduccional eficiente. Aunque
no se describe en detalle aquí, estas señales que afectan la
iniciación de la traducción se pueden colocar también en la
dirección 3' de la región de unión y entre los genes heterólogos en
todos los vectores de la región de unión modificada descritos en el
Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha señalado anteriormente, se
desvelan en el presente documento constructos de vector de ADNc de
alfavirus. Por ejemplo, dentro de un aspecto de la divulgación se
desvelan constructos de vector de ADNc de alfavirus que comprenden
un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a
partir del ADNc, seguido por una secuencia 5' que es capaz de
iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de
nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del
alfavirus, una región de unión vírica que es o bien activa o que se
ha inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del
fragmento subgenómico, una secuencia de reconocimiento de la ARN
polimerasa del alfavirus, y una secuencia 3' que controla la
terminación de la transcripción. En diversas formas de realización,
se puede modificar la región de unión vírica, de tal manera que se
puede reducir únicamente la transcripción vírica del fragmento
subgenómico, más bien que inactivarla. En otras formas de
realización, se puede insertar una segunda región de unión vírica
tras la primera región de unión vírica inactivada, modificándose la
segunda región de unión vírica de tal manera que se reduce la
transcripción vírica del fragmento subgenómico.
\newpage
Se han descrito anteriormente diversos aspectos
de los constructos de vector de ADNc de alfavirus, incluyendo la
secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un
alfavirus, la secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas
no estructurales del alfavirus, la región de unión vírica que se ha
inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del
fragmento subgenómico, y la secuencia de reconocimiento de la ARN
polimerasa de alfavirus. Además, se han descrito también
anteriormente las regiones de unión modificadas y las regiones de
unión en tándem. Los constructos de vector de ADNc de alfavirus, sin
embargo, difieren por la adición de un promotor 5' que es capaz de
iniciar la síntesis de ARN vírico a partir del ADNc. Los ejemplos
representativos de promotores adecuados incluyen el promotor
lac, el promotor de la metalotiona, el promotor CMV y el
promotor del choque térmico.
Tal como se ha señalado anteriormente, el
constructo de vector de ADNc de alfavirus incluye también una
secuencia 3' que controla la terminación de la transcripción. Se
muestra con más detalle a continuación en el Ejemplo 2 un ejemplo
representativo de dicha secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En otros aspectos de la presente divulgación, se
desvelan constructos de vector de alfavirus que son capaces de
expresar una secuencia heteróloga deseada únicamente en un tejido
seleccionado. Se muestra en la Figura 11 uno de dichos ejemplos
representativos. De manera resumida, tal como se muestra en la
Figura 11A, se construye un vector de alfavirus recombinante de tal
manera que tras la introducción del vector (Figura 11 A) en la
célula diana, las secuencias de repetición invertidas internas que
flanquean las regiones de control transcripcional (por
ejemplo, la región de unión modificada) forman un bucle externo
(véase la Figura 11B), evitando por tanto la transcripción
vírica de las secuencias subgenómicas ("G.O.I.") de la región
de unión sintética.
Por otra parte, se puede conseguir la activación
del vector si se diseñan las repeticiones invertidas para hibridar
también una secuencia de ARN celular específica que es
característica de un tejido o tipo celular seleccionado. Dicho ARN
celular interrumpe la estructura de tallo y bucle inactivada,
permitiendo por tanto la formación de una estructura de tallo y
bucle secundaria más estable (Figuras 11C y 11D). Esta estructura
de tallo y bucle secundaria permite la transcripción del mensaje
subgenómico colocando la región de unión posterior en su correcta
configuración posicional.
Se pueden transcribir también vectores de
alfavirus de longitud completa usando la estructura de tallo y bucle
secundaria aprovechando la ventaja de la capacidad de la polimerasa
vírica de cambiar las plantillas durante la síntesis de la cadena
negativa usando un mecanismo de salto de cadena denominado selección
de la copia (King. RNA genetics II, CRC Press, Inc., Boca Raton
Fla. Domingo y col. (ed.), pp. 150-185, 1988). Una
vez se ha producido una vuelta satisfactoria única de la
transcripción, el transcripto de ARN resultante no contiene
repeticiones invertidas puesto que se borran debido al episodio de
selección de la copia de la polimerasa. Esta molécula de ARN
nuevamente sintetizada funciona ahora como transcripto de vector de
ARN primario que se transcribirá y expresará como cualquier otro
vector de alfavirus genómico inactivado anteriormente descrito. En
esta configuración de vector de ARN, se puede conseguir la
activación específica de célula o tejido del vector Sindbis
inactivado si las secuencias específicas de ARN, que están presentes
sólo en los tipos de células o tejidos diana, se usan en el diseño
de las repeticiones invertidas. De esta manera, se pueden diseñar
alfavirus tales como Sindbis mediante ingeniería genética para que
sean vectores de expresión específicos de tejido usando secuencias
invertidas similares a las descritas anteriormente.
El uso de este sistema de vector para conseguir
la expresión específica de tejido permite a un terapeuta liberar
sistemáticamente el vector o la partícula de alfavirus en un
paciente. Si el vector debe infectar una célula que no expresa las
especies de ARN apropiadas, el vector sólo será capaz de expresar
las proteínas no estructurales y no el gen de interés.
Eventualmente, el vector se degradará perjudicialmente.
El uso de los vectores anteriormente descritos
permite la expresión virtual específica del tejido para una
variedad de aplicaciones terapéuticas, que incluyen por ejemplo, el
direccionamiento de vectores para el tratamiento de diversos tipos
de cánceres. Este fundamento depende de la expresión específica de
marcadores específicos del tumor tales como el antígeno específico
del tumor carcinoembriónico (CEA) y el marcador tumoral de la
alfa-fetoproteína. De manera resumida, utilizar
dicho ARN específico del tumor en tumores diana específicos permite
la expresión de moléculas tóxicas específicas del tumor, linfoquinas
o profármacos descritos a continuación. Se pueden utilizar dichos
procedimientos para una amplia variedad de tumores, que incluyen por
ejemplo, los cánceres colorrectal, de pulmón, de mama, de ovarios,
de vejiga y de próstata debido a que estos tumores expresan el CEA.
Se muestra con más detalle a continuación en el Ejemplo 15 una
ilustración representativa de los vectores adecuados para el uso
comprendido en este aspecto de la presente divulgación.
De manera resumida, CEA fue uno de los primeros
marcadores específicos de tumor que se describió, junto con el
marcador tumoral de la alfa-fetoproteína. CEA es una
glicoproteína normal en el tejido embriónico del intestino,
páncreas e hígado durante los dos primeros trimestres del desarrollo
fetal (Pathologic Basis of Disease, 3ª edición 1984, Robbins y col.
editor). Anteriormente, se pensaba que CEA era específico de los
adenocarcinomas de colon, sin embargo, con el desarrollo posterior
de radioinmunoensayos más sensibles ha llegado a ser evidente que
CEA estaba presente en el plasma de muchos cánceres endodérmicamente
derivados, concretamente el pancreático, gástrico y
broncogénico.
\newpage
Dentro de los aspectos relacionados de la
presente divulgación, se pueden construir vectores de expresión
específicos de células de alfavirus para expresar antígenos víricos,
ribozimas, secuencias de sentido contrario o factores
inmunoestimuladores tales como el interferón gamma
(\gamma-IFN) o IL-2 para el
tratamiento dirigido de los tipos celulares infectados con virus.
En concreto, con el fin de dirigir vectores de alfavirus a
organismos extraños específicos o células infectadas con patógenos,
se pueden seleccionar repeticiones invertidas del vector de
alfavirus para hibridar cualquier ARN específico de patógeno, por
ejemplo, las células dianas infectadas por patógenos tales como VIH,
CMV, VHB, VPH y VHS.
En otros aspectos más de la divulgación, se
pueden dirigir tejidos específicos de órganos para el tratamiento
de enfermedades metabólicas específicas de tejidos utilizando las
terapias de sustitución génica. Por ejemplo, el hígado es un tejido
diana importante debido a que es responsable de muchas funciones
metabólicas corporales y se asocia con muchos trastornos genéticos
metabólicos. Dichas enfermedades incluyen muchas de las enfermedades
de almacenamiento de glicógeno, fenilcetonuria, enfermedad de
Gaucher e hipercolesterolemia familiar. Actualmente, existen muchos
enzimas y marcadores específicos de hígado que se han secuenciado,
que se pueden usar para diseñar mediante ingeniería genética
repeticiones invertidas apropiadas para los vectores de alfavirus:
Dichos ADNc específicos de hígado incluyen las secuencias que
codifican la S-adenosilmetiona sintetasa (Horikawa
y col., Biochem. Int. 25: 81, 1991); lecitina: colesterolacil
transferasa (Rogne y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 148: 161,
1987); así como otros ADNc específicos de hígado (Chin y col., Ann.
N.Y. Acad. Sci. 478:120, 1986). Dicho vector de alfavirus
específico de hígado se podría usar para liberar el receptor de la
lipoproteína de baja densidad (Yamamoto y col., Cell 39: 27, 1984)
en las células de hígado para el tratamiento de la
hipercolesterolemia familiar (Wilson y col., Mol. Biol. Med. 7: 223,
1990).
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha señalado anteriormente, los
constructos de vector de alfavirus de la presente divulgación pueden
transportar una amplia variedad de secuencias de nucleótidos.
Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos deberían ser de un
tamaño suficiente para permitir la producción de virus viables.
Dentro del contexto de la presente divulgación, la producción de
cualquier título medible de virus infeccioso en monocapas
susceptibles se considera que es "producción de virus viable".
Esto puede ser, como mínimo, un constructo de vector de alfavirus
que no contiene ninguna secuencia heteróloga adicional. Sin embargo,
En otras formas de realización, el constructo de vector puede
contener secuencias externas o heterólogas adicionales. En las
formas de realización de realización preferidas, la secuencia
heteróloga comprenderá una secuencia heteróloga de al menos
aproximadamente 100 bases, 2 kb, 3,5 kb, 5 kb, 7 kb, o incluso una
secuencia heteróloga de al menos aproximadamente 8 kb.
Como será evidente para una persona normalmente
experta en la técnica, dada la divulgación proporcionada en el
presente documento, la eficiencia del empaquetado y, por tanto, el
título vírico, es dependiente en algún grado del tamaño de la
secuencia que se va a empaquetar. De esta manera, con el fin de
aumentar la eficiencia del empaquetado y la producción del virus
viable, se pueden añadir secuencias no codificantes adicionales al
constructo de vector. Además, dentro de algunas formas de
realización de la divulgación se puede desear aumentar o disminuir
el título vírico. Este aumento o disminución se puede llevar a cabo
aumentando o disminuyendo el tamaño de la secuencia heteróloga, y
por tanto, la eficiencia del empaquetado.
Se puede incluir una amplia variedad de
secuencias heterólogas en el constructo de vector, incluyendo por
ejemplo las secuencias que codifican paliativos tales como
linfoquinas, toxinas, profármacos, antígenos que estimulan una
respuesta inmune, ribozimas, y proteínas que ayudan o inhiben una
respuesta inmune, así como secuencias de sentido contrario (o
secuencias de sentido directo para "aplicaciones de sentido
contrario"). Tal como se ha señalado anteriormente, en diversas
formas de realización de la divulgación los constructos de vector
de alfavirus desvelados en el presente documento pueden contener (y
expresan, dentro de algunas formas de realización) dos o más
secuencias heterólogas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización de la divulgación,
la secuencia heteróloga codifica una linfoquina. De manera resumida,
las linfoquinas actúan para proliferar, activar o diferenciar las
células efectoras inmunes. Los ejemplos representativos de
linfoquinas incluyen el interferón gamma, el factor de necrosis
tumoral, IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12, IL-13, IL-14,
IL-15, GM-CSF, CSF-1
y G-CSF.
En las formas de realización de realización
relacionadas de la divulgación, la secuencia heteróloga codifica un
cofactor inmunomodulador. De manera resumida, tal como se utiliza
dentro del contexto de la presente divulgación, "cofactor
inmunomodulador" se refiere a los factores que, cuando se
fabrican por una o más de las células implicadas en una respuesta
inmune, o cuando se añaden exógenamente a las células, hacen que la
respuesta inmune sea diferente en calidad o potencia de la que se
produciría en ausencia del cofactor. Se puede medir la calidad o
potencia de una respuesta mediante una variedad de ensayos conocidos
por una persona experta en la técnica que incluyen, por ejemplo,
ensayos in vitro que miden la proliferación celular (por
ejemplo, captación de ^{3}H timidina), y ensayos citotóxicos
in vitro (por ejemplo, que miden la liberación de
^{51}Cr) (véase Warner y col., AIDS Res. and Human Retroviruses 7:
645-655, 1991).
Los ejemplos representativos de cofactores
inmunomoduladores incluyen (Finter y col., Drugs 42(5):
749-765, 1991; Patente de los Estados Unidos Nº.
4.892.743; Patente de los Estados Unidos Nº. 4.966.843; documento
WO 85/02862; Nagata y col., Nature 284: 316-320,
1980; Familletti y col., Methods in Enz. 78:
387-394, 1981; Twu y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 86: 2046-2050, 1989; Faktor y col., Oncogene
5: 867-872, 1990), interferón beta (Seif y col., J.
Virol. 65:664-671, 1991), interferones gamma
(Radford y col., American Society of Hepatology: 2008.2015, 1991;
Watanabe y col. PNAS 86: 9456-9460, 1989; Gansbacher
y col., Cancer Research 50:7820-7825. 1990. Maio y
col., Can. Immuno/.Immunother. 30: 34-42, 1989;
Patentes de los Estados Unidos N^{os}. 4.762.791 y 4.727.138),
G-CSF (Patentes de los Estados Unidos N^{os}.
4.999.291 y 4.810.643), GM-CSF (documento WO
85/04188), TNFs (Jayaraman y col., J. Immunology 144:
942-951, 1990), Interleuquina-2
(IL-2) (Karupiah y col., J. Immunology 144:
290-298, 1990; Weber y col., J Exp. Med 166:
1716-1733, 1987; Gansbacher y col., J. Exp. Med.
172: 1217-1224, 1990; Patente de los Estados Unidos
Nº. 4.738.927), IL-4 (Tepper y col., Cell 57:
503-512, 1989; Golumbek y col., Science 254:
713-716, 1991; Patente de los Estados Unidos Nº.
5.017.691), IL-6 (Brakenhof y col., J. Immuno/. 139:
4116-4121, 1987; documento WO 90/06370),
IL-12, IL-15,
ICAM-1 (Altman y col., Nature 338:
512-514, 1989), ICAM-2,
LFA-1, LFA-3, moléculas MHC de tipo
I, moléculas MHC de tipo II,
\beta_{2}-microglobulina, chaperonas, CD3,
B7/BB1, proteínas transportadoras unidas a MHC o sus análogos.
La elección de qué cofactor inmunomodulador
incluir dentro de un constructo de vector de alfavirus puede basarse
en los efectos terapéuticos conocidos del cofactor, o en los
determinados experimentalmente. Por ejemplo, en infecciones por
hepatitis B crónicas se ha encontrado que el interferón alfa es
eficaz para compensar el déficit inmunológico de un paciente y
ayuda por tanto a la recuperación de esta enfermedad.
Alternativamente se puede determinar experimentalmente un cofactor
inmunomodulador adecuado. De manera resumida, se toman en primer
lugar muestras de sangre de pacientes con enfermedad hepática. Se
vuelven a estimular in vitro los linfocitos de la sangre
periférica (PBL) con células autólogas o compatibles con HLA (por
ejemplo, células EBV transformadas), y se transducen con un
constructo de vector de alfavirus que dirige la expresión de una
porción inmunogénica de un antígeno de la hepatitis y el cofactor
inmunomodulador. Los PBL estimulados se usan como efectores en un
ensayo CTL con las células transducidas compatibles con HLA como
dianas. Un aumento de la respuesta CTL sobre el observado en el
mismo ensayo llevado a cabo usando el estimulador compatible con
HLA y las células dianas transducidas con un vector que codifica
únicamente el antígeno, indica un cofactor inmunomodulador útil.
Otro ejemplo de un cofactor inmunomodulador es
el factor coestimulador B7/BB1. De manera resumida, la activación
de la actividad funcional completa de las células T requiere dos
señales. Una señal se proporciona mediante la interacción del
receptor de células T específico de antígeno con péptidos que se
unen a las moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor
(MHC), y la segunda señal, denominada como coestimulación, se libera
en la célula T mediante las células que presentan el antígeno. De
manera resumida, se necesita la segunda señal para la producción de
interleucina-2 (IL-2) por las
células T y parece implicar la interacción de la molécula B7/BB1
con las células que presentan antígeno con los receptores CD28 y
CTLA-4 en los linfocitos T (Linsley y col., J Exp.
Med. 173: 721-730. 1991a. y J. Exp Med., 174:
561-570, 1991). En una forma de realización de la
divulgación, se puede introducir B7/BB1 en células tumorales con el
fin de producir la coestimulación de las células CD8^{+} T, de
tal manera que las células T CD8^{+} produzca suficiente
IL-2 para expandirse y llegar a activarse
completamente. Estas células T CD8^{+} pueden eliminar células
tumorales que no expresan B7 debido a que no se requiere una
coestimulación más larga para la función CTL adicional. Se pueden
hacer vectores que expresen el factor B7/BB1 coestimulador y, por
ejemplo, una proteína de núcleo HBV inmunogénica, utilizando los
procedimientos que se desvelan en el presente documento. Las células
transducidas con estos vectores volverán más efectivas las células
que presentan antígenos. La respuesta CTL específica del núcleo de
VHB aumentará a partir de la célula T CD8^{+} completamente
activada mediante el ligando coestimulador B7/BB1.
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En otra forma de realización de realización de
la divulgación, la secuencia heteróloga codifica una toxina. De
manera resumida, las toxinas actúan inhibiendo directamente el
crecimiento de una célula. Los ejemplos representativos de toxinas
incluyen ricina (Lamb y col., Eur. J. Biochem. 148:
265-270, 1985), abrina (Wood y col., Eur. J.
Biochem. 198: 723-732, 1991; Evensen y col., J. of
Biol. Chem. 266: 6848-6852, 1991; Collins y col.,
J. of Biol. Chem. 265: 8665-8669, 1990; Chen y col.,
Fed. of Eur. Biochem Soc. 309:115-118, 1992),
toxina de la difteria (Tweten y col., J. Biol. Chem. 260:
10392-10394, 1985), toxina de cólera (Mekalanos y
col., Nature 306: 551-557, 1983; Sanchez y Holmgren,
PNAS 86:481-485, 1989), gelonina (Stirpe y col., J.
Biol. Chem. 255:6947-6953, 1980), hierba carmín
(Irvin, Pharmac. Ther. 21: 371-387, 1983), proteína
antivírica (Barbieri y col., Biochem. J. 203:
55-59, 1982; Irvin y coll., Arch. Biochem. &
Biophys. 200: 418-425, 1980; Irvin, Arch. Biochem.
& Biophys. 169: 522-528, 1975), tritina, toxina
de Shigella (Calderwood y col., PNAS 84:4364-4368,
1987; Jackson y col., Microb. Path. 2: 147-153,
1987), exotoxina A de Pseudomonas (Carroll y Collier, J. Biol.
Chem. 262: 8707-8711, 1987), timidina quinasa del
virus del herpes simple (HSVTK) (Field y col., J. Gen. Virol.
49:115-124, 1980), y guanina fosforibosil
transferasa de E. coli.
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En otras formas de realización de la
divulgación, la secuencia heteróloga codifica un "profármaco".
De manera resumida, tal como se utiliza dentro del contexto de la
presente divulgación, "profármaco" se refiere a un producto
génico que activa un compuesto con poca o ninguna citotoxicidad en
un producto tóxico. Los ejemplos representativos de dichos
productos génicos incluyen HSVTK y VZVTK, que monofosforilan
selectivamente algunos arabinósidos de purina y los compuestos de
pirimidina sustituidos, convirtiéndolos en metabolitos citotóxicos
o citostáticos. Más específicamente, la exposición a los fármacos
ganciclovir, aciclovir, o cualquiera de sus análogos (por ejemplo,
FIAU, FIAC, DHPG) y HSVTK fosforila el fármaco en su forma de
nucleótido trifosfato activo correspondiente.
Los ejemplos representativos de otros
profármacos que se pueden utilizar dentro del contexto de la
presente divulgación incluyen guanina fosforibosil transferasa de
E. coli que convierte la tioxantina en monofosfato de
tioxantina tóxico (Besnard y col., Mol. Cell. Biol. 7:
4139-4141, 1987); fosfatasa alcalina, que convertirá
los compuestos fosforilados inactivos tales como fosfato de
mitomicina y fosfato de doxorubicina en compuestos desfosforilados
tóxicos, citosina desaminasa fúngica (por ejemplo, Fusarium
oxysporum) o bacteriana, que convertirá la
5-fluorocitosina en el compuesto tóxico
5-fluoroacilo (Mullen, PNAS 89:33, 1992);
carboxipeptidasa G2, que romperá el ácido glutámico del ácido
para-N-bis
(2-cloroetil) aminobenzoil glutámico, creando por
tanto una mostaza de ácido benzoico tóxica; y
Penicilina-V amidasa, que convertirá los derivados
de fenoxiacetabida de doxorubicina y melfalan en compuestos tóxicos
(véanse generalmente, Vrudhula y col., J. of Med. Chem.
36(7): 919-923, 1993; Kern y col., Canc.
Immun. Immunother. 31(4): 202-206, 1990).
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización de realización de
la divulgación, la secuencia heteróloga es una secuencia de sentido
contrario. De manera resumida, las secuencias de sentido contrario
se diseñan para unirse a los transcriptos de ARN, y evitan por
tanto la síntesis celular de una proteína concreta o evitan el uso
de esta secuencia de ARN por la célula. Los ejemplos
representativos de dichas secuencias incluyen la timidina quinasa de
sentido contrario, la dihidrofolato reductasa de sentido contrario
(Maher y Dolnick, Arch. Biochem. & Biophys. 253:
214-220, 1987; Bzik y col., PNAS 84:
8360-8364, 1987), HER2 de sentido contrario
(Coussens y col., Science 230: 1132-1139, 1985),
ABL de sentido contrario (Fainstein y col., Oncogene 4:
1477-1481, 1989), Myc de sentido contrario (Stanton
y col., Nature 310:423-425, 1984) y ras de
sentido contrario, así como las secuencias de sentido contrario que
bloquean cualquiera de las enzimas en la ruta biosintética de los
nucleótidos. Además, En otras formas de realización de la
divulgación, se pueden utilizar las secuencias de sentido contrario
del interferón \gamma y \beta-2 microglobulina
con el fin de disminuir la respuesta inmune.
Además, en una forma adicional de la
divulgación, se puede utilizar ARN de sentido contrario como agente
antitumoral con el fin de inducir una potente respuesta restringida
de Tipo I. De manera resumida, además de unirse al ARN y evitar por
tanto la traducción de un ARNm específico, se cree que niveles
elevados de secuencias de sentido contrario específicas inducen el
aumento de expresión de los interferones (incluyendo el interferón
gamma) debido a la formación de grandes cantidades de ARN de doble
cadena. El aumento en la expresión del interferón gamma, a la vez,
estimula la expresión de los antígenos MHC de Tipo I. Las secuencias
de sentido contrario preferidas para el uso a este respecto
incluyen el ARN de actina, el ARN de miosina, y el ARN de histona.
El ARN de sentido contrario que forma un emparejamiento incorrecto
con el ARN de actina es particularmente preferido.
\vskip1.000000\baselineskip
En otros aspectos de la presente divulgación, se
desvelan vectores de alfavirus que producen ribozimas tras la
infección de una célula huésped. De manera resumida, las ribozimas
se usan para romper ARN específicos y se diseñan de tal manera que
sólo pueden afectar un ARN específico. Generalmente, la secuencia de
unión al sustrato de una ribozima está entre 10 y 20 nucleótidos de
longitud. La longitud de esta secuencia es suficiente para permitir
una hibridación con el ARN diana y la disociación de la ribozima a
partir del ARN roto. Los ejemplos representativos para crear
ribozimas incluyen los descritos en las Patentes de los Estados
Unidos N^{os} 5.116.742; 5.225.337 y 5.246.921. Las ribozimas
particularmente preferidas para el uso dentro de la presente
divulgación incluyen las desveladas con más detalle a continuación
en los Ejemplos (por ejemplo, Ejemplo 18).
\vskip1.000000\baselineskip
En otros aspectos de la presente divulgación, el
constructo de vector de alfavirus puede transportar una amplia
variedad de proteínas u otros constituyentes celulares. Los ejemplos
representativos de dichas proteínas incluyen los componentes
celulares naturales o alterados; así como proteínas o constituyentes
celulares extraños, que se encuentran por ejemplo en, virus,
bacterias, parásitos u hongos.
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En una forma de realización, se desvelan
constructos de vector de alfavirus que dirigen la expresión de un
componente celular alterado inmunogénico no tumorogénico. Tal como
se utiliza en el presente documento, el término "inmunogénico"
se refiere a componentes celulares alterados que son capaces, en las
condiciones apropiadas, de producir una respuesta inmune. Esta
respuesta debe ser mediada por células, y puede incluir también una
respuesta humoral. El término "no tumorogénico" se refiere a
componentes celulares alterados que no producirán la transformación
celular o inducen la formación del tumor en ratones sin pelo. La
frase "componente celular alterado" se refiere a proteínas y
otros constituyentes celulares que están asociados tanto con la
reversión de una célula tumorogénica como asociados con las células
tumorogénicas en general, pero no se requiere o son esenciales para
revertir la célula tumorogénica.
Antes de la alteración, los componentes
celulares pueden ser esenciales para el crecimiento y regulación
celular normal e incluyen, por ejemplo, proteínas que regulan la
degradación de las proteínas intracelulares, la regulación
transcripcional, el control del ciclo celular, y la interacción
célula-célula. Tras la alteración, los componentes
celulares no llevan a cabo durante más tiempo sus funciones
reguladoras y, por tanto, la célula puede experimentar un
crecimiento no controlado. Los ejemplos representativos de
componentes celulares alterados incluyen ras*, p53*, Rb*, la
proteína alterada codificada por el gen del tumor de Wilms,
ubiquitina*, mucina*, la proteína codificada por los genes DCC,
APC, y MCC, el gen BRCA1* del cáncer de mama, así como los
receptores o estructuras similares a receptores tales como neu,
receptor de la hormona tiroidea, el receptor del factor de
crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el receptor de la
insulina, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y
el receptor del factor de estimulación de colonias (CSF).
En una forma de realización de la presente
divulgación, se desvelan constructos de vector de alfavirus que
dirigen la expresión de un gen ras alterado (ras*) no tumorogénico.
De manera resumida, el gen ras* es una diana atractiva debido a que
se une causalmente al fenotipo neoplásico, y a la vez, puede ser
necesario para la inducción y mantenimiento de la tumorogénesis en
una amplia variedad de distintos cánceres, tales como carcinoma
pancreático, carcinoma de colon y adenocarcinoma de pulmón. Además,
los genes ras* se encuentran en tumores
pre-neoplásicos y, por tanto, se puede aplicar la
terapia de intervención inmune antes de la detección de un tumor
maligno.
Los genes ras normales son no tumorogénicos y
ubicuos en todos los mamíferos. Están muy conservados en la
evolución y parecen jugar un importante papel en el mantenimiento
del ciclo celular y las propiedades de crecimiento normales. La
proteína ras normal es una proteína G que se une a GTP y tiene
actividad GTPasa, y está implicada en la transmisión de las señales
desde el medio externo al interior de la célula, permitiendo por
tanto a una célula responder a su entorno. Los genes ras*, por otra
parte, alteran la regulación del crecimiento normal de las células
neoplásicas mediante un desacoplamiento del comportamiento celular
respecto de su entorno, conduciendo de esta manera a la
proliferación no controlada de células neoplásicas. Se cree que la
mutación del gen ras es un episodio temprano en la carcinogénesis
(Kumar y col., Science 248: 1101-1104, 1990) que, si
se trata pronto, puede evitar la tumorogénesis.
Los genes ras* se producen en una amplia
variedad de cánceres, que incluyen, por ejemplo, los adenocarcinomas
pancreático, de colon, y de pulmón.
El espectro de mutaciones que se producen en los
genes ras* que se encuentra en una variedad de cánceres es muy
limitado. Estas mutaciones alteran la actividad de la GTPasa de la
proteína ras convirtiendo el interruptor normal de on/off en una
posición ON constitutiva. Las mutaciones tumorogénicas en ras* se
producen principalmente (in vivo) en sólo 3 codones, 12, 13 y
61. Las mutaciones del codón 12 son las más prevalentes en los
tumores de seres humanos y animales.
La Tabla 1 a continuación resume las mutaciones
in vivo conocidas (codones 12, 13 y 61) que activan el ras
humano, así como las mutaciones potenciales que tienen actividad
transformante in vitro. Las mutaciones potenciales con
actividad transformante in vitro se produjeron por la
sustitución sistemática de aminoácidos para el codón normal (por
ejemplo, se sustituyeron otros aminoácidos por la glicina normal
en la posición 12). Las mutaciones in vitro, aunque no se
sabe actualmente que se produzcan en seres humanos o animales,
pueden servir como base para una inmunoterapéutica anticancerosa si
se encontrara eventualmente que se producen in vivo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las alteraciones que se describen anteriormente
dan como resultado la producción de proteínas que contienen
secuencia(s) de codificación novedosas. Las proteínas
novedosas codificada por estas secuencia(s) se pueden usar
como un marcador de células tumorogénicas, y se puede utilizar una
respuesta inmune dirigida contra estas regiones de codificación
novedosas para destruir las células tumorogénicas que contienen las
secuencias alteradas (ras*).
En otra forma de realización de realización de
la presente divulgación, se desvelan constructos de vector de
alfavirus que dirigen la expresión de un gen p53 (p53*) alterado. De
manera resumida, p53 es una fosfoproteína nuclear que se descubrió
originalmente en extractos de células transformadas y de esta
manera, se clasificó inicialmente como un oncogén (Linzer y Levine,
Cell 17: 43-52, 1979; Lane y Crawford, Nature 278:
261-263, 1979). Se descubrió posteriormente que los
clones de ADNc de p53 originales eran formas mutantes de p53 (Hinds
y col., J. Virol. 63: 739-746, 1989). Parece ahora
que p53 es un gen supresor tumoral que regula negativamente el
ciclo celular, y que la mutación de este gen puede conducir a la
formación del tumor. De los carcinomas que se han estudiado, el
75%-80% muestra una pérdida de ambos alelos p53, uno mediante
delección y el otro mediante mutación puntual. Mutaciones similares
se encuentran en el cáncer de pulmón, y en tumores de cerebro y
mama.
La mayoría de las mutaciones de p53 (por
ejemplo, p53*^{1}, p53*^{2}, etc.) se agrupan entre los restos
de los aminoácidos 130 a 290 (véase Levine y col., Nature 351:
453-456, 1991; véanse también las siguientes
referencias que describen las mutaciones específicas con más
detalle. Baker y col., Science 244: 217-221, 1989;
Nigro y col., Nature 342: 705-708, 1989 (grupo de
mutaciones p53 en cuatro "puntos calientes" que coinciden con
las cuatro regiones muy conservadas de los genes y estas mutaciones
se observan en tumores de cerebro, mama, pulmón y colon humanos);
Vogelstein, Nature 348: 681-682, 1990; Takahashi y
col., Science 246: 491-494, 1989; Iggo y col.,
Lancet 335: 675-679, 1990; James y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 86: 2858-2862, 1989; Mackay y
col., Lancet 11: 1384-1385,1988; Kelman y col.,
Blood 74: 2318-2324, 1989; Malkin y col., Science
250: 1233-1238, 1990; Baker y col., Cancer Res. 50:
7717-7722, 1991; Chiba y col., Oncogene 5:
1603-1610, 1990 (La patogénesis del cáncer de
pulmón de células no pequeñas en la Etapa temprana se asocial con
mutaciones somáticas en el gen p53 entre los codones 132 a 283);
Prosser y col., Oncogene 5: 1573-1579, 1990 (se
identificaron en el gen p53 que codificaba los aminoácidos 126 a
224 en cáncer de mama primario); Cheng y Hass, Mol. Cell. Biol. 10:
5502-5509, 1990; Bartek y col. Oncogene 5:
893-899, 1990; Rodrigues y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 87: 7555-7559, 990; Menon y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 5435-5439, 1990;
Mulligan y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 87:
5863-5867, 1990; y Romano y col. Oncogene 4:
1483-1488, 1990 (identificación de una mutación p53
en el codón 156 en la línea celular HOS-SL derivada
de osteosarcoma humano).
Algunas alteraciones del gen p53 pueden ser
debidas a algunas toxinas específicas. Por ejemplo, Bressac y col.
(Nature 350: 429-431, 1991) describen mutaciones de
G a T específicas en el codón 249 en pacientes afectados con
carcinoma hepatocelular. Un agente causante sugerido de esta
mutación es la alfatoxina B_{1}, un carcinógeno del hígado del
que se sabe que es un contaminante de los alimentos en África.
Cuatro regiones del gen que están
particularmente afectadas se producen en los restos
132-145, 171-179,
239-248, y 272-286. Tres "puntos
calientes" que se encuentran en el interior de estas regiones que
son de particular interés se producen en los restos 175, 248 y 273
(Levine y col., Nature 351: 453-456, 1991). Estas
alteraciones, así como otras que se desvelan anteriormente dan como
resultado la producción de proteína(s) que contienen
secuencia(s)
de codificación novedosas. Se pueden usar las novedosas proteínas codificadas por estas secuencias como un marcador de células tumorogénicas y se puede utilizar una respuesta inmune dirigida contra estas novedosas regiones de codificación para destruir las células tumorogénicas que contienen la secuencia alterada (p53*).
de codificación novedosas. Se pueden usar las novedosas proteínas codificadas por estas secuencias como un marcador de células tumorogénicas y se puede utilizar una respuesta inmune dirigida contra estas novedosas regiones de codificación para destruir las células tumorogénicas que contienen la secuencia alterada (p53*).
Una vez que se ha obtenido una secuencia que
codifica el componente celular alterado, es necesario asegurar que
la secuencia codifica una proteína no tumorogénicas. Se conocen
diversos ensayos y se pueden llevar a cabo fácilmente para evaluar
la tumorogenicidad de un componente celular concreto. Los ensayos
representativos incluyen un ensayo de fibroblastos de ratas, la
formación del tumores en ratones o ratas sin pelo, la formación de
colonias en agar blando, y la preparación de animales transgénicos,
tales como ratones transgénicos.
La formación de tumor en ratones o ratas sin
pelo es un procedimiento particularmente importante y sensible para
determinar la tumorogenicidad de un componente celular concreto. Los
ratones sin pelo carecen de un sistema inmune celular funcional
(es decir, no poseen CTL), y proporcionan por tanto un modelo
in vivo útil en el que ensayar el potencial tumorogénico de
las células. Las células no tumorogénicas normales no muestran
propiedades de crecimiento no controladas si se infectan en ratones
sin pelo. Sin embargo, las células transformadas proliferarán
rápidamente y generarán tumores en ratones sin pelo. De manera
resumida, en una forma de realización el constructo de vector de
alfavirus se administra se administra a células de murino sigénico,
seguido por la inyección en ratones sin pelo. Los ratones se
examinan visualmente durante un periodo de 2 a 8 semanas tras la
inyección con el fin de determinar el crecimiento del tumor. Se
pueden sacrificar también los ratones y someterse a autopsia con el
fin de determinar si están presentes los tumores. (Giovanella y
col., J. Natl. Cancer Inst. 48: 1531-1533, 1972;
Furesz y co., Abnormal Cells, New Products and Risk, Hopps y
Petricciani (eds.). Tissue Culture Association, 1985; y Levenbook y
col., J. Biol. Std. 13: 135-141, 1985.).
Se puede evaluar también la tumorogenicidad
visualizando la formación de colonias en agar blando (Macpherson y
Montagnier, Vir. 23 :291-294, 1964). De manera
resumida, una propiedad de las células no tumorogénicas normales es
la "inhibición por contacto" (es decir, células que detienen la
proliferación cuando tocan las células adyacentes). Si se plaquean
las células en medio de soporte de agar semisólido, las células
normales entrarán rápidamente en contacto inhibiendo y deteniendo
la proliferación, mientras que las células tumorogénicas continuarán
proliferando y formando colonias en agar blando.
Se pueden utilizar también animales
transgénicos, tales como ratones transgénicos, para evaluar la
tumorogenicidad de un componente celular alterado. (Stewart y col.,
Cell 38: 627-637, 1984; Quaife y col., Cell 48:
1023-1034, 1987; y Koike y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 86: 5615-5619, 1989.). En animales
transgénicos, se puede expresar el gen de interés en todos los
tejidos del animal. Esta expresión desregulada del transgen puede
servir como modelo para el potencial tumorogénico del gen nuevamente
introducido.
Si el componente celular alterado está asociado
con la preparación de la célula tumorogénica, entonces es necesario
preparar el componente celular alterado no tumorogénico. Por
ejemplo, en una forma de realización, la secuencia o gen de interés
que codifica el componente celular alterado está truncado con el fin
de volver el producto génico no tumorogénico. El gen que codifica
el componente celular alterado puede estar truncado en una variedad
de tamaños, aunque es preferible retener tanto como sea posible el
componente celular alterado. Además, es necesario que cualquier
truncamiento deje intacta al menos algunas de las secuencias
inmunogénicas del componente celular alterado. Alternativamente, se
pueden introducir múltiples codones de terminación traduccionales
en la dirección 3' de la región inmunogénica. La inserción de
codones de terminación finalizará prematuramente la expresión de la
proteína, evitando de esta manera la expresión de la porción
transformante de la proteína.
En una forma de realización, el gen ras* está
truncado con el fin de volver la proteína ras* no tumorogénica. De
manera resumida, los aminoácidos carboxi-terminales
de la funcionalidad ras* permiten a la proteína unirse a la
membrana celular. El truncamiento de estas secuencias vuelve el
componente celular alterado no tumorogénico. Preferiblemente, el
gen ras* está truncado en el emplazamiento de unión al anillo de la
purina, por ejemplo alrededor de la secuencia que codifica el
aminoácido número 110. La secuencia del gen ras* que puede estar
truncada de tal manera que sea tan pequeñas como de aproximadamente
20 aminoácido (que incluyen el(los) aminoácido(s)
alterado(s))
que están codificados por el constructo de vector de alfavirus, aunque preferiblemente, deberían expresarse tantos aminoácidos como sea posible (manteniendo a la vez la tumorogenicidad).
que están codificados por el constructo de vector de alfavirus, aunque preferiblemente, deberían expresarse tantos aminoácidos como sea posible (manteniendo a la vez la tumorogenicidad).
En otra forma de realización de realización, la
proteína p53* está modificada por truncamiento con el fin de volver
el componente celular no tumorogénico. Tal como se ha señalado
anteriormente, no todas las mutaciones de la proteína p53 son
tumorogénicas, y por tanto, no todas las mutaciones tendrían que
truncarse. Sin embargo, En una forma de realización preferida, p53*
está truncado en una secuencia que codifica los aminoácidos 100 a
300, incluyendo por tanto los cuatro "puntos calientes"
mayores.
Otros componentes celulares alterados que son
oncogénicos pueden estar truncados con el fin de volverlos no
tumorogénicos. Por ejemplo neu y bcr/abl pueden estar truncados con
el fin de volverlos no tumorogénicos. Se puede confirmar la no
tumorogenicidad ensayando el componente celular alterado truncado
tal como se describe anteriormente.
Debería señalarse, sin embargo, que si el
componente celular alterado está únicamente asociado con células no
tumorogénicas en general, y no se requiere o es esencial para
preparar la célula tumorogénica, entonces no es necesario volver el
componente celular no tumorogénico. Los ejemplos representativos de
dichos componentes celulares alterados que no son tumorogénicos
incluyen Rb*, ubiquitina*, y mucina*.
Tal como se ha señalado anteriormente, con el
fin de generar una respuesta inmune apropiada, el componente
celular alterado debe ser también inmunogénico. La inmunogenicidad
de una secuencia concreta es a menudo difícil de predecir, aunque
los epitopos de las células T poseen a menudo un componente alfa
hélice anfifático inmunogénico. En general, sin embargo, es
preferible determinar la inmunogenicidad en un ensayo. Los ejemplos
representativos incluyen un ELISA, que detecta la presencia de
anticuerpos contra el vector nuevamente introducido, así como los
ensayos que ensayan las células T auxiliares tales como loe ensayos
del interferón gamma, los ensayos de producción de
IL-2, y los ensayos de proliferación.
Tal como se ha señalado anteriormente, en otro
aspecto de la presente divulgación, algunos componentes celulares
alterados diferentes se pueden expresar simultáneamente con el fin
de formar una terapéutica anticancerosa general. Generalmente, será
evidente para una persona normalmente experta en la técnica que se
pueden hacer una variedad de combinaciones. En las formas de
realización de realización preferidas, se puede dirigir esta
terapéutica a un tipo concreto de cáncer. Por ejemplo, casi todos
los cánceres de colon poseen en los genes mutaciones en ras, p53,
DCC, APC o MCC. Se puede administrar un constructo de vector de
alfavirus que expresa simultáneamente numerosos de estos
componentes celulares alterados a un paciente con cáncer de colon
con el fin de tratar todas las mutaciones posibles. Se puede
utilizar también esta metodología para tratar otros cánceres. De
esta manera, se puede utilizar el constructo de vector de alfavirus
que expresa simultáneamente la mucina*, ras*, neu, BRCA1* y p53*
para tratar el cáncer de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
En otros aspectos de la presente divulgación, se
proporcionan constructos de vector de alfavirus que dirigen la
expresión de porciones inmunogénicas de antígenos de organismos
extraños u otros patógenos. Los ejemplos representativos de
antígenos extraños incluyen antígenos bacterianos (por ejemplo,
E. coli, estreptocócico, estafilocócico, micobacteriano, etc),
antígenos fúngicos, antígeno parasíticos, y antígenos víricos (por
ejemplo, virus de la gripe, Virus de la Inmunodeficiencia Humana
("VIH"), Virus de la Hepatitis A, B y C ("VHA",
"VHB2" y "VHC", respectivamente. Virus del Papiloma
Humano ("VPH"), Virus de
Epstein-Barr/"VEB"), Virus del Herpes Simple
("VHS", virus Hanta, HTLV I, HTLV II y Citomegalovirus
("CMV"). Tal como se utiliza dentro del contexto de la
presente divulgación, "porción inmunogénica" se refiere a una
porción del antígeno respectivo que es capaz, en las condiciones
apropiadas, de producir una respuesta inmune, es decir, mediada por
células o humoral). "Porciones" puede ser de tamaño variable,
pero tienen preferiblemente al menos 9 aminoácido de longitud, y
pueden incluir el antígeno completo. Las respuestas inmunes mediadas
por células pueden ser mediadas a través de la presentación del
Complejo De Histocompatibilidad Mayor ("MHC") de Tipo I, la
presentación de MHC de Tipo II, o ambos.
Dentro de un aspecto de la divulgación, se
proporcionan constructos de vector de alfavirus que dirigen la
expresión de porciones inmunogénicos de antígenos de la Hepatitis B.
de manera resumida, el genoma de la Hepatitis B está comprendido
por ADN circular de aproximadamente 3,3 kilobases de longitud y se
ha caracterizado bien (Tiollais y col., Science 213:
406-411, 1981; Tiollais y col., Nature 317:
489-495, 1985; y Ganem y Varmus, Ann. Rev. Biochem.
56: 651-693, 1987; véanse también los documentos EP
0 278.940, EP 0 241.021, WO 88/10301, y las Patentes de los Estados
Unidos N^{os}. 4.696.898 y 5.024.938).
\newpage
El virus de la Hepatitis B presenta algunos
antígenos diferentes, que incluyen entre otros, tres antígenos HB
"S" (HBsAg), un antígeno HBc (HBcAg), un antígeno HBe (HBeAg) u
un antígeno HBx (HBxAg) (véase Blum y col., TIG 5(5):
154-158, 1989). De manera resumida, HBeAg es el
resultado de la rotura proteolítica del intermedio
pre-núcleo P22 y se secreta a partir de la célula.
HBeAg se encuentra en el suero como una proteína de 17 kD. HBcAg es
una proteína de 183 aminoácidos, y HBxAg es una proteína de 145 a
154 aminoácidos, dependiendo del subtipo.
Los HBsAg (designados "grande",
"mediano" y "pequeño") están codificados por tres regiones
del genoma de la Hepatitis B: S, pre-S2 y
pre-S1. La proteína grande, que tiene una longitud
que varía entre 389 y 400 aminoácidos, está codificada por las
regiones pre-S1, pre-S2, y S, y se
encuentra en las formas glicosilada y no glicosilada. La proteína
mediana tiene 281 aminoácidos de longitud y está codificada por las
regiones pre-S2 y S. la proteína pequeña tiene 226
aminoácidos de longitud y está codificada por la región S. Existe en
dos formas, glicosilada (GP 27^{S}) y no glicosilada (P24^{S}).
Si cada una de estas regiones se expresa separadamente, la región
pre-S1 codificará una proteína de aproximadamente
119 aminoácidos, la región pre-S2 codificará una
proteína de aproximadamente 55 aminoácidos, y la región S codificará
una proteína de aproximadamente 226 aminoácidos.
Como será evidente por una persona normalmente
experta en la técnica, se pueden combinar diversas porciones
inmunogénicas de los antígenos S anteriormente descritos con el fin
de inducir una respuesta inmune cuando se administran mediante uno
de los constructos de vector descritos en el presente documento.
Además, debido a la gran variabilidad inmunológica que se encuentra
en diferentes regiones geográficas para el marco de lectura abierto
S de VHB, se pueden preferir combinaciones concretas de antígenos
para la administración en regiones geográficas concretas. De manera
resumida, se definen los epitopos que se encuentran en todas las
muestras S del virus de la hepatitis B humano como determinante
"a". Se han identificado también, sin embargo, determinantes
mutuamente exclusivos de subtipo mediante inmunodifusión doble
bidimensional (Ouchterlony, Progr. Allergy 5:1, 1958). Se han
designado estos determinante "d" o "y" y
"w" o "r" (LeBouvier, J. Infect. 123: 671,
1971; Bancroft y col., J. Immunol. 109: 842, 1972; y Courouce y
col., Bibl. Haematol. 42: 1-158, 1976). La
variabilidad inmunológica es debida a las sustituciones de
nucleótidos únicos en dos zonas del marco de lectura abierto S del
virus de la hepatitis B, dando como resultado los siguientes cambios
de aminoácidos: (1) intercambio de lisina-122 por
arginina en el marco de lectura abierto S del virus de la hepatitis
B que produce un cambio de subtipo de d a y, y (2)
intercambio de arginin-160 por lisina que produce el
cambio del subtipo r a w. En africanos, es
predominante el subtipo ayw, mientras que en los estados
unidos y Europa del Norte es más abundante el subtipo
adw_{2} (Molecular Biology of the Hepatitis B Virus,
McLachlan (ed.), CRC Press, 1991). Como será evidente para una
persona normalmente experta en la técnica, se prefiere generalmente
construir un vector para la administración que sea apropiado para el
subtipo concreto de virus de la hepatitis B que es prevalente en la
región geográfica de administración. Se pueden determinar los
subtipos de una región concreta mediante inmunodifusión doble
bidimensional o, preferiblemente, mediante secuenciación del marco
de lectura abierto S del virus VHB aislado de individuos dentro de
esta región.
Presentados también por VHB están los antígenos
pol ("VHB pol"), ORF 5, y ORF 6. De manera
resumida, el marco de lectura abierto de la polimerasa de VHB
codifica la actividad de la transcriptasa inversa que se encuentra
en viriones y partículas similares a núcleo en hígados infectados.
La proteína polimerasa está constituida al menos por dos regiones.
La región amino terminal que codifica la proteína que ceba la
transcripción inversa, y la región carboxiterminal que codifica la
actividad de la trancriptasa inversa y RNasa H. se pueden
determinar las regiones inmunogénicas de VHB pol utilizando
los procedimientos descritos en el presente documento (por ejemplo,
a continuación y en los Ejemplos 12Aii y 13), utilizando los
constructos de vector de alfavirus descritos a continuación, y
administrados con el fin de generar una respuesta inmune en el
interior de un animal de sangre caliente. Similarmente, se pueden
expresar otros antígenos de VHB, tales como ORF 5 y ORF 6 (Miller y
col., Hepatology 9: 322-327, 1989) utilizando los
constructos de vector de alfavirus que se desvelan en el presente
documento. Se muestran a continuación los ejemplos representativos
de constructos de vector de alfavirus que utilizan ORF 5 y ORF 6 en
los ejemplos.
Tal como se ha señalado anteriormente, al menos
una porción inmunogénica de un antígeno de la hepatitis B se
incorpora en un constructo de vector de alfavirus. La(s)
porción(es) inmunogénica(s) que se incorporan en el
constructo de vector de alfavirus puede(n) ser de longitud
variable, aunque se prefiere generalmente que la porciones sean al
menos de 9 aminoácidos de longitud y puedan incluir el antígeno
completo. La inmunogenicidad de una secuencia concreta es a menudo
difícil de predecir, aunque se pueden predecir los epitopos de las
células T utilizando algoritmos informáticos tales como TSITES
(MedImmune, Maryland), con el fin de escanear las regiones de
codificación de los emplazamientos T auxiliares potenciales y los
emplazamientos CTL. A partir de este análisis se sintetizan los
péptidos y se usan como dianas como dianas en un ensayo citotóxico
in vitro. Se pueden utilizar también, sin embargo, otros
ensayos, que incluyen, por ejemplo, ELISA, que detecta la presencia
de anticuerpos contra el vector nuevamente introducido, así como
ensayos que ensayan las células T auxiliares, tales como los ensayos
del interferón gamma, los ensayos de producción de
IL-2 y los ensayos de proliferación.
Se pueden seleccionar también porciones
inmunogénicas mediante otros procedimientos. Por ejemplo, se ha
demostrado que el ratón transgénico HLA A2.1 es útil como modelo
para el reconocimiento de antígenos víricos en las células T
humanas. De manera resumida, en los sistemas víricos de la gripe y
la hepatitis B, el repertorio de receptores de las células T de
murino reconoce los mismos determinantes antigénicos reconocidos por
las células T humanas. En ambos sistemas, la respuesta CTL generada
en el ratón transgénico HLA A2.1 se dirige virtualmente hacia el
mimo epitopo que la reconocida por los CTL humanos del haplotipo HLA
A2.1 (Vitiello y col., J Exp. Med 173: 1007-1015,
1991; Vitiello y col., Abstract of Molecular Biology of Hepatitis B
Virus Symposia, 1992).
Se pueden obtener las porciones inmunogénicas
particularmente preferidas del virus de la hepatitis B en los
constructos de vector de alfavirus que incluyen HBeAg, HBcAg y
HBsAg, tal como se describe en mayor detalle a continuación en el
Ejemplo 10.
Se pueden obtener porciones inmunogénicas
adicionales del virus de la hepatitis B truncando la secuencia de
codificación en diversas localizaciones que incluyen, por ejemplo,
los siguientes emplazamientos: Bst UI, SspI, Ppu M1, y MspI
(Valenzuela y col., Nature 280: 815-19, 1979;
Valenzuela y col., Animal Virus Genetics: ICN/UCLA Symp. Mol. Cell
Biol., 1980, B. N. Fields y R. Jaenisch (eds.), pp.
57-70, New York: Academic). Se describen también a
continuación procedimientos adicionales para determinar las
porciones inmunogénicas adecuadas así como los procedimientos en el
contexto de la hepatitis C.
Tal como se ha señalado anteriormente, se puede
incorporar más de una porción inmunogénica en el constructo de
vector de alfavirus. Por ejemplo, un constructo de vector de
alfavirus puede expresar (tanto separadamente como un constructo)
todas o las porciones inmunogénicas de HBcAg, HBeAg, los HBsAg,
HBxAg, así como las porciones inmunogénicas de los antígenos de
VHC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias que codifican las proteínas
anteriormente descritas se pueden obtener fácilmente de una variedad
de fuentes, que incluyen por ejemplo, depositantes tales como la
American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland), o de
fuentes comerciales tales como British
Bio-Technology Limited (Cowley, Oxford, Inglaterra).
Los ejemplos representativos incluyen BBG 12 (que contiene el gen
GM-CSF que codifica la proteína madura de 127
aminoácidos); BBG 6 (que contiene las secuencias que codifican el
interferón gamma), ATCC Nº 39656 (que contiene las secuencias que
codifican TNF), ATCC Nº 20663 (que contiene las secuencias que
codifican el interferón alfa), ATCC N^{os} 31902, 31902 y 39517
(que contienen las secuencias que codifican el interferón beta),
ATCC Nº 67024 (que contiene una secuencia que codifica la
Interleucina-1b); ATCC N^{os} 39405, 39452, 39516,
39626 y 39673 (que contienen las secuencias en codifican la
Interleucina-2); ATCC N^{os} 59399, 59398 y 67326
(que contienen las secuencias que codifican la
Interleucina-3); ATCC Nº 57592 (que contiene las
secuencias que codifican la Interleucina-4), ATCC
N^{os} 59394 y 59395 (que contienen las secuencias que codifican
la Interleucina-5), y ATCC Nº 67153 (que contiene
las secuencias que codifican la Interleucina-6).
Las secuencias que codifican los componentes
celulares alterados que se desvelan anteriormente se pueden obtener
fácilmente de una variedad de fuentes. Por ejemplo, los plásmidos
que contienen las secuencias que codifican los productos celulares
alterados se pueden obtener de un depositante tal como la American
Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland), o de fuentes
comerciales tales como Advanced Biotechnologies (Columbia,
Maryland). Los ejemplos representativos de plásmidos que contienen
alguna de las secuencias anteriormente descritas incluyen ATCC Nº
41000 (que contiene una mutación de G a T en el codón 12º de ras) y
ATCC Nº 41049 (que contiene una mutación de G a A en el codón
12º).
Alternativamente, los plásmidos que codifican
componentes celulares normales se pueden obtener también de
depositantes, tales como la ATCC (véase, por ejemplo, ATCC Nº
41001, que contiene una secuencia que codifica la proteína ras
normal; ATCC Nº 57103, que codifica abl, ATCC N^{os} 59120 o
59121, que codifica el locus bcr) y mutarse para formar el
componente celular alterado. Los procedimientos para mutagenizar
emplazamientos concretos se pueden llevar a cabo fácilmente usando
procedimientos conocidos en la técnica (véase Sambrook y
col., más arriba, 15.3 y sig.). En concreto, se pueden llevar
fácilmente a cabo mutaciones puntuales de componentes celulares
normales tales como ras, mediante mutagénesis dirigida al
emplazamiento del codón concreto, por ejemplo, los codones 12, 13 ó
61.
Las secuencias que codifican los antígenos
víricos anteriormente descritos pueden igualmente obtenerse de una
variedad de fuentes. Por ejemplo, los genomas clonados
molecularmente que codifican el virus de la hepatitis B se pueden
obtener de fuentes tales como la American Type Culture Collection
(ATCC, Rockville, Maryland). Por ejemplo, ATCC Nº 45020 contiene el
ADN genómico total de la hepatitis B (extraído de partículas Dane
modificadas) (véase la Figura 3 de Blum y coll., TIG 5(5):
154-158, 1989) en el emplazamiento BamHI de pBR322
(Moriarty y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 78:
2606-2610, 1981).
Alternativamente, las secuencias de ADNc que
codifican las secuencias heterólogas anteriormente descritas se
pueden obtener de células que expresan o contienen las secuencias.
De manera resumida, En una forma de realización, el ARNm de una
célula que expresa el gen de interés se transcribe de manera inversa
con la transcriptasa inversa usando el oligonucleótido dT o
cebadores aleatorios. A continuación, se puede amplificar el ADNc de
cadena única mediante la PCR (véanse las Patentes de los Estados
Unidos N^{os} 4.683.202; 4.683.195 y 4.800.159. Véase
también PCR Technology: Principles and Applications for DNA
Amplification, Erlich (ed.), Stockton Press, 1989) que utiliza
cebadores de oligonucleótidos complementarios con las secuencias
sobre cualquier lado de las secuencias deseadas. En concreto, un
ADN de doble cadena se desnaturaliza calentando en presencia de la
polimerasa Taq térmicamente estable, los cebadores de ADN
específicos de secuencia, dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Se produce ADN
de doble cadena cuando finaliza la síntesis. Este ciclo se puede
repetir muchas veces, dando como resultado una amplificación
factorial del ADN deseado.
Se pueden sintetizar también las secuencias que
codifican las proteínas descritas anteriormente, por ejemplo, en un
sintetizador de ADN de Applied Biosystems Inc. (por ejemplo,
sintetizador de ADN de APB modelo 392 (Foster City, CA)).
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha señalado anteriormente, se
desvelan también en el presente documento los sistemas de iniciación
de vector eucariota en capas, que están comprendidos por un
promotor 5', un constructo (por ejemplo, un constructo de
vector de alfavirus) que es capaz de expresar una secuencia de
nucleótidos heteróloga que es capaz de replicación en una célula
tanto de manera autónoma como en respuesta a uno o más factores, y
una secuencia de terminación de la transcripción. De manera
resumida, los sistemas de iniciación de vector eucariota en capas
proporcionan un mecanismo en dos etapas o "en capa" que
controla la expresión de las secuencias de nucleótidos heterólogas.
La primera capa inicia la transcripción de la segunda capa, y
comprende un promotor 5', el emplazamiento de terminación de la
transcripción, así como, si se desea, uno o más emplazamientos de
corte y empalme y un emplazamiento de poliadenilación. Los ejemplos
representativos de promotores adecuados para el uso a este respecto
incluyen cualquiera de los promotores víricos o celulares tales como
CMV, los LTR retrovíricos, SV40, \beta-actina,
los promotores de la inmunoglobulina, y los promotores inducibles
tales como el promotor de la metalotioneína y el promotor
glucocorticoide. La segunda capa comprende un constructo que es
capaz de expresar una o más secuencias de nucleótidos heterólogas, y
de replicación en una célula tanto de manera autónoma como en
respuesta de uno o más factores. En una forma de realización de la
divulgación, el constructo puede ser un constructo de vector de ADNc
de Sindbis tal como se describe anteriormente.
Se puede utilizar también una amplia variedad de
otros constructos de vector de ADNc y ADN en los sistemas de
iniciación de vector eucariota en capas que incluyen, por ejemplo,
constructos de vectores víricos desarrollados a partir de
poliovirus (Evans y col., Nature 339: 385-388, 1989;
y Sabin, J. Biol. Standardization 1:115-118, 1973);
rinovirus; poxvirus, tales como el virus del canario o el virus de
vaccinia (Fisher-Hoch y col., PNAS 86:
317-321, 1989; Flexner y col., Ann. N. Y. Acad. Sci.
569: 86-103, 1989; Flexner y col., Vaccine 8:
17-21, 1990; Patentes de los Estados Unidos
N^{os}. 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; documento WO 89/01973);
SV40 (Mulligan y col., Nature 277: 108-114, 1979);
retrovirus (Patente de los Estados Unidos Nº. 4.777.127, documentos
GB 2.200.651, EP 0.345.242 y WO 91/02805); virus de la gripe
(Luytjes y col., Cell 59: 1107-1113, 1989; McMicheal
y col., N. Eng. J. Med. 309: 13-17, 1983; y Yap y
col., Nature 273:238-239, 1978); adenovirus
(Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld
y col., Science 252: 431-434, 1991); parvovirus
tales como los virus adeno asociados (Samulski y col., J Vir. 63:
3822-3828, 1989; Mendelson y col., Virol. 166:
154-165, 1988; PA 7/222,684); herpes (Kit, Adv.
Exp. Med. Biol. 215: 219-236, 1989); SV40; VIH
(Poznansky, J. Virol. 65: 532-536, 1991); sarampión
(documento EP 0.440.219); astrovirus (Munroe y coll., J. Vir. 67:
3611-3614, 1993); Virus del Bosque Semliki, y
coronavirus, así como otros sistemas víricos (por ejemplo,
documentos EP 0.440.219; WO 92/06693; Patente de los Estados Unidos
Nº. 5.166.057).
Tal como se ha señalado anteriormente, En otras
formas de realización de la divulgación, se desvelan sistemas de
iniciación de vector eucariota en capas que comprenden una secuencia
5' que es capaz de iniciar la transcripción in vitro de un
alfavirus en un extremo 5' auténtico, una secuencia 5' que es capaz
de iniciar la transcripción de un virus de alfavirus, una secuencia
de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales de alfavirus,
una región de unión vírica, una secuencia de nucleótidos
heteróloga, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa de
alfavirus, y una secuencia poliadenilada. Tras la transcripción
in vitro de un constructo de vector de ADNc de alfavirus, la
molécula de vector de ARN de alfavirus resultante está comprendida
por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un
alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas
no estructurales de alfavirus, una región de unión vírica, una
secuencia de nucleótidos heteróloga, un alfavirus, una secuencia de
reconocimiento de la ARN polimerasa, y una secuencia
poliadenilada.
En otros aspectos de la presente divulgación se
desvelan los procedimientos para liberar una secuencia de
nucleótidos heteróloga en un animal de sangre caliente, que
comprende la etapa de administrar un sistema de iniciación de
vector eucariota en capas a un animal de sangre caliente. Se pueden
administrar los sistemas de iniciación de vector eucariota en capas
a animales de sangre caliente tanto directamente (por ejemplo, por
vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, oral,
rectal, intraocular, intranasal), como mediante diversos
procedimientos físicos tales como lipofección (Felgner y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84: 7413-7417, 1989),
inyección directa de ADN (Acsadi y col., Nature
352:815-818. 1991); bombardeo de microproyectiles
(Williams y col., PNAS 88: 2726-2730, 1991);
liposomas de diversos tipos (véase, por ejemplo, Wang y col., PNAS
84: 7851-7855, 1987); CaPO_{4} (Dubensky y col.,
PNAS 81: 7529-7533, 1984); ligando de DNA (Wu y col,
J. of Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989);
administración de ácidos nucleico sólo (documento WO 90/11092); o
administración de ADN unido a adenovirus inductor de muerte (Curiel
y col., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992);
compuestos de policatión tales como polilisina, ligandos específicos
de receptor; así como virus inactivados con psoraleno tales como
Sendai o Adenovirus.
Se pueden administrar los sistema de iniciación
de vector eucariota en capas a un animal de sangre caliente para
los objetivos de estimular una respuesta inmune específica; inhibir
la interacción de un agente con un receptor celular del huésped,
expresar un paliativo tóxico, incluyendo por ejemplo, paliativos
tóxicos condicionales; regular inmunológicamente un sistema inmune;
expresar marcadores, y para la terapia génica de sustitución. Estos
y otros usos se desvelan con más detalle a continuación.
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En otras formas de realización adicionales de la
divulgación, se desvelan líneas celulares que empaquetan el
alfavirus. En concreto, dentro de un aspecto de la presente
divulgación se desvelan líneas celulares que empaquetan el
alfavirus en las que las proteínas estructurales víricas se
suministran en trans procedentes de un vector de expresión
integrado de manera estable. La transfección o infección posterior
de los transcriptos de ARN de vector de alfavirus crea una línea
celular que produce el vector de alfavirus. Por ejemplo, en una
forma de realización de la divulgación, las moléculas de vector de
ARN de alfavirus se producen inicialmente usando un sistema de ARN
polimerasa T6 in vitro para transcribir a partir de un clon
de ADNc que codifica el gen de interés y las proteínas no
estructurales de alfavirus. A continuación se puede transfectar el
ARN del vector en una línea celular que empaqueta el alfavirus, en
la que los transcriptos de ARN del vector se replican a altos
niveles, y se empaquetan posteriormente mediante las proteínas
estructurales víricas, dando como resultado partículas víricas
infecciosas. Por la naturaleza de la longitud extendida de la
molécula de ADNc del alfavirus, el proceso de transcripción in
vitro es ineficiente. Además, sólo el 1%-10% de las células
contenidas en una placa petri se pueden transfectar
satisfactoriamente. En consecuencia, para optimizar el rendimiento
y el título de la línea celular productora del vector, se pueden
llevar a cabo dos ciclos sucesivos de transferencia génica. Para
llevar a cabo esto, se puede transfectar en primer lugar el vector
en una línea celular primaria que empaqueta el alfavirus. Esta línea
celular transfectada produce a continuación títulos bajos de
partículas víricas infecciosas en los sobrenadantes del cultivo.
Estos sobrenadantes infecciosos se usan a continuación para
transducir una monocapa fresca de células que empaquetan el
alfavirus. Se prefiere la infección del vector de alfavirus en la
línea celular de empaquetado sobre la transfección debido a su
mayor eficiencia de transferencia de ARN en las células y a la
colocación biológica optimizada del vector en la célula. Esta
solución en dos etapas conduce a una mayor expresión y título mayor
del vector Sindbis recombinante infeccioso empaquetado.
Dentro de algunas formas de realización de la
divulgación, las partículas de alfavirus pueden fracasar en
transducir la misma línea celular de empaquetado debido a que la
línea celular produce un aumento en las proteínas de la envoltura
celular que bloquean los receptores celulares para la unión del
vector de alfavirus. En dichos casos, se puede crear un segundo
tipo de partícula vírica de alfavirus que es capaz de infectar las
células que empaquetan el alfavirus. Este segundo tipo de partícula
vírica debe producirse mediante una línea celular de empaquetado
conocida como "línea celular de salto", que produce partículas
de vector transitoria como resultado de transfectarse con
transcriptos de vector de ARN de alfavirus transcritas in
vitro. Esta línea celular de salto se diseña mediante
ingeniería genética para redirigir el tropismo de la envoltura de la
partícula de vector producida transitoriamente proporcionando
proteínas de envoltura vírica alternativas que redirige los
vectores de alfavirus hacia diferentes receptores celulares en un
proceso denominado pseudotipificación. Actualmente, se han
concebido dos soluciones para la pseudotipificación de partículas de
vector de alfavirus. La primera solución está constituida por una
línea celular que empaqueta alfavirus (descrita anteriormente) que
expresa simultáneamente la proteína G del virus de la estomatitis
vesicular (VSV-G). Se ha demostrado que la
pseudotipificación de VSV-G infecta una amplia
variedad de tipos celulares (Marsh, Adv. Virus Res. 36:
107-151, 1989). La segunda solución para producir
una partícula de vector de alfavirus pesudotipificada es utilizar
líneas celulares de empaquetado retrovírico (por ejemplo, documento
WO 92/05266) que contienen secuencias gag/pol y env
retrovíricas que son capaces de empaquetar un vector de ARN de
alfavirus que contiene una secuencia de empaquetado retrovírico.
En otros aspectos de la presente divulgación, se
usan vectores de expresión de ADN de alfavirus integrado de manera
estable par producir la molécula de ARN de vector de alfavirus que
mantiene la capacidad de autoreplicarse. Esta solución puede
probarse útil para mantener altos niveles de expresión durante
largos periodos de cultivo debido a que el vector de ADN integrado
expresará constitutivamente vectores de ARN no alterado. En esta
configuración, los vectores anteriormente transcritos a partir de
un plásmido que contiene el emplazamiento de reconocimiento de la
ARN polimerasa SP6 se sustituyen con la secuencia del promotor
apropiado definida por la línea celular parental usada. Esta
secuencia de plásmido puede contener también un marcador
seleccionable diferente de los usados para crear la línea celular
de empaquetado. En esta configuración, los vectores de alfavirus
basados en ADN se introducen mediante transfección en la línea
celular de empaquetado, tal como se ha descrito anteriormente
seguido por la clonación por dilución para encontrar las líneas
celulares que producen títulos más elevados.
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Un aspecto adicional de la presente divulgación
se refiere a la expresión de vectores suicida de alfavirus para
evitar la diseminación de alfavirus de tipo natural en las líneas
celulares de empaquetado/productoras. De manera resumida, En una
forma de realización el vector suicida de alfavirus comprendería una
secuencia de ribozima o de sentido contrario, específica de la
secuencia de alfavirus de tipo natural generada a partir de un
episodio de recombinación del ARN entre las secuencias 3' de la
región de unión del vector, y las secuencias estructurales 5' del
alfavirus del vector de expresión de la línea celular de
empaquetado. La molécula de ribozima o de sentido contrario sería
únicamente termoestable en presencia de la secuencia de
recombinación específica y no tendría ningún otro efecto en la
línea celular de empaquetado/productora de alfavirus.
Alternativamente, se puede expresar también una molécula tóxica
(tal como la descrita a continuación) en el contexto de un vector
que se expresaría únicamente en presencia del alfavirus de tipo
natural.
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Un aspecto adicional de la presente divulgación
se refiere al uso de vectores de alfavirus para inhibir o reducir
la invasividad de los neoplasmas malignos. De manera resumida, la
extensión de la neoplasia maligna se refiere normalmente a la
vascularización del tumor. Una causa de la vascularización del tumor
es la producción de factores de angiogénesis tumoral solubles (TAF)
(Paweletz y col., Crit. Rev. Oncol. Hematol 9: 197, 1989)
expresados por algunos tumores. Dentro de un aspecto de la presente
divulgación, se puede ralentizar la vascularización del tumor
usando vectores de alfavirus para expresar las moléculas de ARN de
ribozima o de sentido contrario específicas de TAF.
Alternativamente, se pueden expresar factores
anti-angiogénesis (Moses y col., Science 248: 1408,
1990; Shapiro y col., PNAS 84: 2238, 1987) tanto sólo como en
combinación con la ribozimas o secuencias de sentido contrario
anteriormente descritas con el fin de ralentizar o inhibir la
vascularización del tumor. Alternativamente, se pueden usar también
vectores de alfavirus para expresar un anticuerpo específico de los
receptores TAF o los tejidos que los rodean.
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En otros aspectos de la presente divulgación, se
proporcionan composiciones y procedimientos para administrar un
constructo de vector de alfavirus que sea capaz de evitar, inhibir,
estabilizar, o revertir enfermedades infecciosas, cancerosas,
autoinmunes o inmunes. Los ejemplos representativos de dichas
enfermedades incluyen infecciones víricas tales como VIH; VHB, HTLV
I, HTLV II, CMV, VEB y VPH, melanomas, diabetes, injerto frente a
enfermedad del huésped, enfermedad de Alzheimer y enfermedad
cardíaca.
Más específicamente, dentro de un aspecto de la
presente divulgación, se proporcionan composiciones y procedimientos
para estimular una respuesta inmune (tanto humoral como mediada por
células) a un agente patogénico, de tal manera que el agente
patogénico sea tanto muerto como inhibido. Los ejemplos
representativos de agentes patogénicos incluyen bacterias, hongos,
parásitos, virus y células cancerosas.
En una forma de realización de la divulgación el
agente patogénico es un virus, y se desvelan los procedimientos
para estimular una respuesta inmune específica e inhibir la
diseminación vírica usando partículas víricas de alfavirus
recombinante diseñadas para liberar un constructo de vector que
dirige la expresión de un antígeno o su forma modificada en células
diana susceptibles capaces tanto de (1) iniciar una respuesta inmune
a un antígeno vírico como (2) evitar la diseminación vírica
mediante los receptores celulares ocupantes requeridos para las
interacciones víricas. La expresión de la proteína codificada por el
ácido nucleico del vector puede ser transitoria o estable con el
tiempo. Cuando se va a estimular una respuesta inmune a un antígeno
patogénico, el alfavirus recombinante se diseña preferiblemente
para expresar una forma modificada del antígeno que estimulará una
respuesta inmune y que tiene patogenicidad reducida con respecto al
antígeno natural. Se consigue esta respuesta inmune cuando las
células presentan antígenos en la manera correcta, es decir, en el
contexto de las moléculas MHC de tipo I y/o II junto con moléculas
accesorias tales como CD3, ICAM-1,
ICAM-2, LFA-1, o sus análogos (por
ejemplo., Altmann y col., Nature 338:512, 1989). Se espera que las
células infectadas con Vectors de alfavirus hagan esto eficazmente
porque imitan estrechamente una infección vírica genuina y porque:
(a) son capaces de infectar células no replicantes, (b) no se
integran en el genoma celular del huésped, (c) no se asocian con
ninguna enfermedad que amenaza la vida, y (d) expresan altos niveles
de proteínas heterólogas. Debido a estas diferencias, puede
pensarse fácilmente en los vectores de alfavirus como vectores
víricos seguros que se pueden usar sobre individuos sanos para uso
de vacunas.
Este aspecto de la divulgación tiene una ventaja
adicional sobre otros sistemas que puede esperarse que funcionen de
una manera similar, en que las células presentadoras son
completamente viables y sanas y se expresan bajos niveles de
antígenos víricos, con respecto a los genes heterólogos. Esto
presenta una ventaja distinta debido a que los epitopos antigénicos
expresados se pueden alterar mediante clonación selectiva de
subfragmentos del gen para el antígeno en el alfavirus
recombinante, conduciendo a respuestas contra los epitopos
inmunogénicos que pueden de otra manera empequeñecerse mediante
epitopos inmunodominantes. Dicha solución se puede extender a la
expresión de un péptido que tiene múltiples epitopos, estando uno o
más de los epitopos derivados de proteínas diferentes. Además, este
aspecto de la divulgación permite la estimulación eficiente de los
linfocitos T citotóxicos (CTL) dirigida contra los epitopos
antigénicos, y los fragmentos de péptidos de los antígenos
codificados por los subfragmentos de genes, mediante la síntesis y
asociación intracelular de estos fragmentos de péptidos con
moléculas MHC de Tipo I. Se puede utilizar esta solución para mapear
los epitopos inmunodominantes mayores para la inducción de CTL. Se
puede conseguir también una respuesta inmune transfiriendo a una
célula inmune apropiada (tal como un linfocito T) el gen del
receptor específico de las células T que reconoce el antígeno de
interés (en el contexto de una molécula MHC apropiada si es
necesario), de una inmunoglobulina que reconoce el antígeno de
interés, o de un híbrido de los dos que proporcionan una respuesta
CTL en ausencia del contexto MHC: de esta manera, se pueden usar
células infectadas con alfavirus recombinante como
inmunoestimulante, inmunomodulador, o vacuna.
En otra forma de realización de la divulgación,
se desvelan los procedimientos para producir paliativos inhibidores
en los que los vectores de alfavirus liberan y expresan proteínas
estructurales víricas interferentes defectivas, que inhiben el
ensamblaje vírico, dichos vectores pueden codificar gag, pol,
env defectivos u otras proteínas o péptidos de partículas
víricas, y estos inhibirían de manera dominante el ensamblaje de
las partículas víricas. Esto se produce debido a que a la
interacción de subunidades normales de la partícula vírica está
perturbado por la interacción con las subunidades defectivas.
En otra forma de realización de la divulgación,
se desvelan los procedimientos para la expresión de la inhibición
de los péptidos o proteínas específicos de la proteasa vírica. De
manera resumida, la proteasa vírica rompe las proteínas gag
y gag/pol víricas en numerosos péptidos más pequeños. El
fracaso de esta rotura en todos los casos conduce a la inhibición
completa de la producción de partículas retrovíricas infecciosas.
Como ejemplo, se sabe que la proteasa de VIH es un aspartil proteasa
y se sabe que ésta se inhibe por los péptidos preparados a partir
de los aminoácidos de la proteína o los análogos. Los vectores para
inhibir VIH expresarán una o múltiples copias fusionadas de dichos
inhibidores péptidos.
Otra forma de realización implica la liberación
de genes supresores que, cuando se borran, mutan o no se expresan
en un tipo celular, conducen a la tumorogénesis en este tipo
celular: La reintroducción del gen borrado por medio de un vector
vírico conduce a la regresión del fenotipo del tumor en estas
células. Los ejemplos de dichos cánceres son retinoblastoma y Tumor
de Wilms. Debido a que las neoplasias malignas se pueden considerar
que son una inhibición de la diferenciación celular terminal en
comparación con el crecimiento celular, la liberación del vector de
alfavirus y la expresión de los productos génicos que conducen a la
diferenciación de un tumor, deberían también, en general, conducir a
la regresión.
En otra forma más de realización, el vector de
alfavirus proporciona un efecto terapéutico codificando una
ribozima (una enzima de ARN) (Haseloff y Gerlach, Nature 334: 585,
1989) que romperá e inactivará por tanto las moléculas de ARN que
corresponden a una función patogénica. Debido a que las ribozimas
funcionan reconociendo una secuencia específica en el ARN diana y
esta secuencia es normalmente de 12 a 17 pb, esto permite el
reconocimiento específico de una especie de ARN concreta tal como
un ARN o un genoma retrovírico. Se puede conseguir especificidad
adicional en algunos casos teniendo ésta un paliativo tóxico
condicional.
Un medio para aumentar la efectividad de los
paliativos inhibidores es expresar los genes inhibidores víricos en
conjunción con la expresión de los genes que aumentan la
probabilidad de infección de la célula resistente por el virus en
cuestión. El resultado es un episodio "final con muerte" que
competería para los episodios de infección productiva. En el caso
específico de VIH, se pueden liberar vectores que inhiben la
replicación de VIH (expresando tat de sentido contrario, etc, tal
como se describe anteriormente) y también sobreexpresando las
proteínas requeridas para la infección, tales como CD4. De esta
manera, un número relativamente pequeño de células resistentes a
VIH infectadas con el vector actúan como un "colector" o
"imán" de los múltiples episodios de fusión no productivos con
virus libres o células infectadas víricamente.
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Muchas enfermedades infecciosas, cánceres,
enfermedades autoinmunes, y otras enfermedades implican la
interacción de partículas víricas con células, células con células,
o células con factores. En las infecciones víricas, los virus
entran en las células mediante receptores sobre la superficie de
células susceptibles. En los cánceres, las células pueden responder
inapropiadamente o no a todas las señales de otras células o
factores. En la enfermedad autoinmune, hay un reconocimiento
inapropiado de "automarcadores". Dentro de la presente
divulgación, dichas interacciones pueden estar bloqueadas
produciendo, in vivo, un análogo a cualquiera de los
compañeros en una interacción.
Se puede producir esta acción de bloqueo
intracelularmente, en la membrana celular, o extracelularmente. La
acción de bloqueo de un virus o, en concreto, un vector de alfavirus
que transporta un gen de un agente de bloqueo, se puede mediar
tanto desde el interior de una célula susceptible como secretando
una versión de, la proteína de bloqueo para bloquear localmente la
interacción patogénica.
En el caso de VIH, los dos agentes de
interacción son la proteína de envoltura gp 120/gp 41 y la molécula
del receptor CD4. De esta manera un bloqueante apropiado sería un
constructo de vector que expresara cualquiera de un análogo
env de VIH que bloquea la entrada de VIH sin producir efectos
patogénicos, o un análogo del receptor CD4. El análogo de CD4 se
secretaría y funcionaría para proteger las células adyacentes,
mientras que gp 120/gp 41 se secreta o produce sólo
intracelularmente de tal manera que protege únicamente la célula
que contiene el vector. Puede ser ventajoso añadir cadenas pesadas
de inmunoglobulina humana u otros componentes a CD4 con el fin de
potenciar la estabilidad o complementar la lisis. La liberación de
un vector de alfavirus que codifica dicho CD4
soluble-híbrido en un huésped da como resultado un
suministro continuo de una molécula híbrida estable. Se puede
ensayar la eficacia del tratamiento midiendo los indicadores
normales de progresión de la enfermedad, que incluyen el nivel de
anticuerpos, la producción de antígeno vírico, los niveles de VIH
infeccioso, o los niveles de infecciones no específicas.
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Se pueden usar técnicas similares a las
descritas anteriormente para producir alfavirus recombinante con
constructos de vector que dirija la expresión de un agente (o
"paliativo") que sea capaz de inhibir una función de un agente
o gen patogénico. Dentro de la presente divulgación, "capaz de
inhibir una función" significa que el paliativo inhibe tanto
directa como indirectamente la función, esto es, por ejemplo,
convirtiendo un agente presente en las células de uno que no
inhibiría normalmente una función del agente patogénico en uno que
sí. Los ejemplos de dichas funciones para las enfermedades víricas
incluyen la adsorción, la replicación, la expresión génica, el
ensamblaje, y la salida del virus de las células infectadas. Los
ejemplos de dichas funciones para una célula cancerosa o factor de
crecimiento que promueve el cáncer incluyen la viabilidad, la
replicación celular, susceptibilidad alterada a señales externas
(por ejemplo, la inhibición por contacto) y la ausencia de
producción de formas mutadas de proteínas
anti-oncogénicas.
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En un aspecto de la presente divulgación, el
constructo de vector de alfavirus dirige la expresión de un gen que
puede interferir con una función de un agente patogénico, por
ejemplo, en enfermedades víricas o malignas. Dicha expresión puede
ser tanto esencialmente continua como en respuesta de la presencia
en la célula de otro agente asociado tanto con la dolencia
patogénica como con un tipo celular específico (un "agente de
identificación"). Además, se puede controlar la liberación del
vector dirigiendo la entrada del vector específicamente en el tipo
celular deseado (por ejemplo, una célula maligna o víricamente
infectada) tal como se describe anteriormente.
Un procedimiento de administración es la
leucoforesis, en la que aproximadamente el 20% de un PBL individual
se retira en un momento cualquiera y se manipula in vitro. De
esta manera, se pueden tratar y sustituir aproximadamente 2 x
10^{9} células. Se pueden llevar a cabo también tratamientos
repetidos. Alternativamente, se puede tratar la médula ósea y
permitir amplificar el efecto tal como se describe anteriormente.
Además, se pueden inyectar directamente en un sujeto líneas
celulares de empaquetado que producen un vector, permitiendo la
producción continua de viriones recombinantes.
En una forma de realización, Se pueden usar
vectores de alfavirus que expresan ARN complementario para los
transcriptos génicos patogénicos clave (por ejemplo, un producto
génico vírico o un oncogen celular activado) para inhibir la
traducción de este transcripto en la proteína, tal como la
inhibición de la traducción de la proteína tat de VIH. Debido a que
la expresión de esta proteína es esencial para la replicación
vírica, las células que contienen el vector deberían ser resistentes
a la replicación de VIH.
En una segunda forma de realización, en la que
el agente patogénico es un virus de cadena única que tiene una
señal de empaquetado, se expresa el ARN complementario con la señal
de empaquetado vírica (por ejemplo, una señal de empaquetado de VIH
cuando el paliativo se dirige contra VIH), de tal manera que la
asociación de estas moléculas con la señal de empaquetado vírica,
en el caso de los retrovirus inhibe la formación del talo y bucle o
la unión con el cebador de ARNt requerida para la encapsidación o
replicación apropiadas del genoma de ARN de alfavirus.
En una tercera forma de realización, se puede
introducir un vector de alfavirus que exprese un paliativo capaz de
inhibir selectivamente la expresión de un gen patogénico, o un
paliativo capaz de inhibir la actividad de una proteína producida
por el agente patogénico. En el caso de VIH, un ejemplo es una
proteína tat mutante que carece de la capacidad de transactivar la
expresión del LTR de VIH e interfiere (de una manera transdominante)
con el funcionamiento normal de la proteína tat. Se ha identificado
dicho mutante de la proteína tat de HTLV II (mutante "XII
Leu^{5}"; véase Wachsman y col., Science 235: 674, 1987). Un
mutante transrepresor que debería inhibir la replicación tanto como
se ha mostrado para un represor mutante análogo en el
VHS-1 (Friedmann y col., Nature 335: 452, 1988).
Se puede seleccionar dicha proteína represora
transcripcional para un cultivo de tejido usando cualquier promotor
transcripcional específico vírico cuya expresión esté estimulada por
una proteína transactivadora específica de virus (tal como se
describe anteriormente). En el caso específico de VIH, una línea
celular que expresa la proteína tat de VIH y el gen HSVTK impulsado
por el promotor de VIH desaparecerá en presencia de ACV. Sin
embargo, si una serie de genes tat mutados se introducen en el
sistema, un mutante con las propiedades apropiadas (es decir,
reprimir la transcripción a partir del promotor de VIH en presencia
de tat de tipo natural) crecerá y se seleccionará. El gen mutante
puede, a continuación, volver a aislarse a partir de estas células.
Se puede usar una línea celular que contenga múltiples copias del
sistema vector/tat condicionalmente letal para asegurar que los
clones celulares que sobreviven no se producen mediante mutaciones
endógenas en estos genes. A continuación se introduce una batería
de genes tat aleatoriamente mutagenizados usando un vector de
alfavirus "rescatable" (es decir, uno que expresa la proteína
tat mutante y que contiene un origen bacteriano de replicación y un
marcador de la resistencia a fármacos para el crecimiento y la
selección en la bcteria). Esto permite evaluar un gran número de
mutaciones aleatorias y permite una fácil clonación molecular
posterior de la línea celular mutante deseada. Se puede usar este
procedimiento para identificar y utilizar las mutaciones en una
variedad de sistemas de activador/promotor vírico transcripcional
vírico para terapias antivíricas potenciales.
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Otra solución para inhibir un agente patogénico
es expresar un paliativo que sea tóxico para la célula que expresa
la dolencia patogénica. En este caso, la expresión del paliativo a
partir del vector debería estar limitada por la presencia de una
entidad asociada con el agente patogénico, tal como una secuencia de
ARN vírico específica que identifica el estado patogénico, con el
fin de evitar la destrucción de células no patogénicas.
\newpage
En una forma de realización de este
procedimiento, un vector de alfavirus recombinante transporta un
constructo de vector que contiene un gen tóxico (tal como se
describe anteriormente) expresado a partir de un vector responsable
específico de célula. De esta manera, las células que se replican
rápidamente, que contienen secuencias de ARN capaces de activar los
vectores responsables específicos de célula, se destruyen
preferentemente por el agente citotóxico producido por el constructo
de vector de alfavirus.
De una manera similar a la forma de realización
anterior, el constructo de vector de alfavirus puede transportar un
gen para la fosforilación, fosforibosilación, ribosilación, u otro
metabolismo de un fármaco basado en purina o pirimidina. Este gen
puede no tener equivalente en células de mamíferos y puede provenir
de organismos tales como virus, bacterias, hongos, o protozoos. Un
ejemplo de esto sería el producto génico de la guanina fosforibosil
transferasa de E. coli , que es letal en presencia de
tioxantina (véase Besnard y col., Mol. Cell. Biol. 7:
4139-4141, 1987). Los productos génicos
condicionalmente letales podrían también metabolizar un fármaco no
tóxico que no sea un análogo de purina o pirimidina a una forma
citotóxica (véase Searle y col., Brit. J Cancer 53:
377-384, 1986). Los virus de mamíferos en general
tienden a tener genes "tempranos inmediatos" que son
necesarios para la activación transcripcional posterior de oros
elementos promotores víricos. Las secuencias de ARN de esta
naturaleza con candidatos excelentes para la activación de las
señales intracelulares de vectores de alfavirus (o "agentes de
identificación") de la infección vírica. De esta manera, los
genes condicionalmente letales de los vectores específicos de
células de alfavirus responsables de estos productos génicos
``tempranos inmediatos víricos matarían específicamente las células
infectadas con cualquier virus concreto. Adicionalmente, debido a
que los elemento promotores del interferón \alpha y \beta humano
están trancripcionalmente activados en respuesta a la infección
mediante una amplia variedad de virus no relacionados, la
introducción de vectores que expresan un producto génico
condicionalmente letal de tipo HSVTK, por ejemplo, en respuesta a
la produc-
ción de interferón daría como resultado la destrucción de las células infectadas con una variedad de virus diferentes.
ción de interferón daría como resultado la destrucción de las células infectadas con una variedad de virus diferentes.
En otro aspecto de la presente divulgación, el
vector vírico de alfavirus recombinante transporta un constructo de
vector que dirige la expresión de un producto génico capaz de
activar o inactivar de otra manera el precursor en un inhibidor
activo del agente patogénico. Por ejemplo, se puede usar el producto
génico HSVTK para metabolizar más efectivamente análogos de
nucleósidos potencialmente antivíricos tales como AZT o ddC. El gen
HSVTK se puede expresar bajo el control de un vector responsable
específico de célula e introducirse en estos tipos celulares. AZT
(y otros antivíricos nucleósidos) deben metabolizarse mediante
mecanismos celulares en forma del nucleótido trifosfato con el fin
de inhibir específicamente la transcriptasa inversa retrovírica, y
de esta manera, la replicación de VIH (Furmam y col., Proc. Natl.
Acad Sci. EE.UU. 83: 8333-8337, 1986). La expresión
constitutiva de HSVTK (un nucleósido y la nucleósido quinasa con una
especificidad por el sustrato muy amplia) da como resultado un
metabolismo más efectivo de estos fármacos, toxicidad menos
generalizada y mayor potencia contra la infección productiva. Los
análogos de nucleósido adicionales, cuyas formas de nucleótido
trifosfato muestran selectividad por la transcriptasa inversa
retrovírica pero, como resultado de la especificidad por el
sustrato del nucleósido celular, y las nucleótido quinasas que no
están fosforiladas, se prepararán más eficazmente.
La administración de estos vectores de alfavirus
en células T humanas y líneas celulares de macrófagos/monocitos
puede aumentar su resistencia a VIH en presencia de AZT y ddC en
comparación a las mismas células sin tratamiento del vector
retrovírico.
El tratamiento con AZT podría ser a niveles
inferiores al normal para evitar efectos secundarios tóxicos pero
inhibir aún de manera eficiente la diseminación de VIH. El curso del
tratamiento sería tal como se describe para el bloqueante.
En una forma de realización, el vector de
alfavirus recombinante que transporta un gen que especifica un
producto que no es en sí mismo tóxico, cuando se procesa o modifica
por una proteína tal como una proteasa específica de un patógeno
vírico u otro, se convierte en una forma tóxica. Por ejemplo, el
alfavirus recombinante transportaría un gen que codifica una
proproteína de la cadena A de ricino, que se vuelve tóxico tras el
procesamiento por la proteasa de VIH. Más específicamente, una
forma de proproteína inactiva sintética de la toxina ricina o de
las cadenas de difteria A se rompería en la forma activa disponiendo
que la proteasa codificada víricamente por VIH reconozca y elimine
por rotura un elemento "pro" apropiado.
En otra forma de realización, el constructo de
alfavirus puede expresar un "producto indicador" en la
superficie de las células diana en respuesta a la presencia de un
agente de identificación en las células (tal como la expresión de
un gen vírico). Esta proteína superficial puede ser reconocida por
un agente citotóxico, tal como anticuerpos de la proteína
indicadora, o mediante células T citotóxicas. De una manera similar,
se puede usar dicho sistema como sistema de detección (véase a
continuación) para identificar de manera simple aquellas células que
tienen un gen concreto que expresa una proteína de
identificación.
Similarmente, en otra forma de realización, una
proteína superficial expresaría que podría ser por sí misma
terapéuticamente beneficiosa, En el caso concreto de VIH, la
expresión de la proteína CD4 humana específicamente en células
infectadas por VIH puede ser beneficiosa de dos maneras:
- 1.
- La unión de CD4 y env de VIH intracelularmente inhibiría la formación de partículas víricas viables, por mucho que se haya demostrado que CD4 soluble acabe con los virus libres, pero sin el problema del aclaramiento sistemático y la posible inmunogenicidad, debido a que la proteína permanecerá unida a la membrana y es estructuralmente idéntica a la CD4 endógena (a la cual el paciente debería ser inmunológicamente tolerante).
- 2.
- Debido a que el complejo env de CD4/VIH se ha implicado como una causa de la muerte celular, la expresión adicional de CD4 (en presencia de VIH-env en exceso presente en las células infectadas con VIH) conduce a una muestre celular más rápida e inhibe de esta manera la diseminación vírica. Esto puede ser particularmente aplicable a monocitos y macrófagos, que actúan como reservorio para la producción de virus como resultado de su refractilidad relativa a la citotoxicidad inducida por VIH (que, a la vez, se debe aparentemente a la ausencia relativa de CD4 sn sus superficies celulares.
En otra forma de realización, el vector de
alfavirus codifica una ribozima que romperá e inactivará las
moléculas de ARN esenciales para la viabilidad de las células
infectadas por el vector. Haciendo la producción de ribozima
dependiente de una secuencia de ARN específica que corresponde al
estado patogénico, tal como tat de VIH, la toxicidad es específica
del estado patogénico.
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Se puede modificar también la técnica
anteriormente descrita de expresar un paliativo en una célula en
respuesta a una secuencia de ARN específica para permitir la
detección de un gen concreto en una célula que expresa una proteína
de identificación (por ejemplo, un gen transportado por un virus
concreto), y por tanto, permitir la detección de células que
transportan este virus. Además, esta técnica permite la detección de
virus (tales como VIH) en una muestra clínica de células que
transportan una proteína de identificación asociada con el
virus.
Se puede llevar a cabo esta modificación
proporcionando un genoma que codifica un producto, la presencia del
cual se puede identificar fácilmente (el "marcador del
producto"), en un vector de alfavirus que responde a la
presencia de una proteína de identificación en las células
infectadas. Por ejemplo, VIH, cuando infecta las células adecuadas
crea tat y rev. Se pueden proporcionar de esta manera células
indicadoras con un genoma (tal como mediante infección con un
alfavirus recombinante apropiado) que codifica un gen marcador, tal
como el gen de la fosfatasa alcalina, el gen de la
\beta-galactosidasa, o el gen de la luciferasa que
se expresa mediante el alfavirus recombinante tras la activación
por el transcripto de ARN de tat y/o rev. En el caso de la
\beta-galactosidasa o de la fosfatasa alcalina, la
exposición de las células a los análogos del sustrato da como
resultado un cambio de color o fluorescencia si la muestra es
positiva para VIH. En el caso de la luciferasa, la exposición de la
muestra a la luciferina dará como resultado luminiscencia si la
muestra es positiva para VIH. Para las enzimas celulares tales como
la \beta-galactosidasa, se puede medir el título
vírico directamente por recuento de las células coloreadas o
fluorescentes, o preparando extractos de células y llevando a cabo
un ensayo adecuado. Para la forma de unión a la membrana de la
fosfatasa alcalina, se puede medir también el título vírico
llevando a cabo los ensayos de enzima en la superficie celular
usando un sustrato fluorescente. Para las enzimas secretadas, tales
como en una forma diseñada mediante ingeniería de la fosfatasa
alcalina, se ensayan muestras pequeñas de sobrenadante del cultivo
para la actividad, permitiendo el seguimiento continuo de un
cultivo único a lo largo del tiempo. De esta manera, se pueden usar
diferentes formas de este sistema marcador para diferentes
objetivos. Estos incluyen el recuento de virus activos, o la medida
sensible y simple de la diseminación vírica en un cultivo y la
inhibición de esta diseminación mediante diversos fármacos.
Se puede incorporar especificidad adicional en
el sistema anterior ensayando la presencia del virus tanto con cómo
sin anticuerpos neutralizantes para este virus. Por ejemplo, en una
porción de la muestra clínica que se está ensayando, pueden estar
presentes anticuerpos neutralizantes de VIH; mientras que en otra
porción no habría anticuerpos neutralizantes. Si los ensayos fueron
negativos en el sistema en el que hubo anticuerpos y positivo cuando
no hubo anticuerpos, esto ayudará a confirmar la presencia de
VIH.
Dentro de un sistema análogo para un ensayo
in vitro, se puede determinar la presencia de un gen
concreto, tal como un gen vírico en una muestra de células. En este
caso, las células de la muestra se infectan con un vector de
alfavirus adecuados que transporta el gen indicador que sólo se
expresa en presencia del transcripto de ARN vírico apropiado. El
gen indicador, tras penetrar en las células de la muestra, expresará
su producto indicador (tal como la
\beta-galactosidasa o la luciferasa) sólo si la
célula huésped expresa las proteínas víricas apropiadas.
Estos ensayos son más rápidos y sensibles,
debido a que el gen indicador puede expresar una cantidad mayor de
producto indicador que el agente de identificación presente, lo que
da como resultado un efecto de amplificación.
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Tal como se describe anteriormente de manera
resumida, se desvelan en el presente documento alfavirus
recombinantes que transportan un constructo de vector capaz de
suprimir uno o más elementos del sistema inmune en células diana
infectadas con el alfavirus.
De manera resumida, la infrarregulación
específica de respuestas inmunes inapropiadas o no buscadas, tales
como en la hepatitis crónica o en los trasplantes de tejidos
heterólogos tales como médula ósea, se puede diseñar mediante
ingeniería genética usando productos génicos víricos
inmunosupresores que suprimen la expresión superficial del antígeno
de trasplante (MHC). Los adenovirus Ad2 y Ad5 del grupo C poseen una
glicoproteína de 19 kd (gp 19) codificada por la región E3 del
virus. Esta molécula gp 19 se une a las moléculas MHC de tipo I en
el retículo endoplásmico de las células, y evita la glicosilación
terminal y la translocación de MHC de tipo I en la superficie
celular. Por ejemplo, antes del trasplante de médula ósea, las
células de médula ósea donantes pueden estar infectadas con los
constructos del vector que codifica gp 19 que, tras la expresión de
gp 19, inhiben la expresión superficial de los antígenos de
trasplante MHC de tipo I. estas células donantes se pueden
trasplantar con riesgo bajo de rechazo al injerto y pueden requerir
un régimen inmunosupresor mínimo para el paciente del trasplante.
Esto puede permitir un estado quimérico
donante-huésped aceptable que existe con pocas
complicaciones. Se pueden usar tratamientos similares para tratar el
intervalo de las así denominadas enfermedades autoinmunes que
incluyen lupus eritematoso, esclerosis múltiple, artritis reumatoide
o infección por hepatitis B crónica.
Un procedimiento alternativo implica el uso del
mensaje de sentido contrario, la ribozima u otra expresión génica
específica inhibidora específica de los clones de células T que son
autoreactivos en la naturaleza. Estos bloquean la expresión del
receptor de las células T de clones no deseados concretos
responsables de una respuesta autoinmune. La ribozima de sentido
contrario, u otro gen se pueden introducir usando el sistema de
liberación de vector vírico.
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Un aspecto adicional de la presente divulgación
se refiere a las células transformantes de un animal con vectores
de alfavirus recombinantes que sirven como vehículos de
transferencia génica para suministrar secuencias genéticas capaces
de expresar una proteína terapéutica. En una forma de realización de
la presente divulgación, del constructo de vector vírico se diseña
para expresar una proteína terapéutica capaz de evitar, inhibir,
estabilizar o revertir un defecto genético heredado o no heredado
en el metabolismo, la regulación inmune, la regulación hormonal, y
la función estructural enzimática o asociada a la membrana. Esta
forma de realización describe también dicho vector vírico capaz de
transducir células individuales, por lo cual la proteína terapéutica
es capaz de expresarse sistemáticamente o localmente a partir de
una célula o tejido específico, por lo cual, la proteína
terapéutica es capaz de (a) la sustitución de una proteína o enzima
celular ausente o defectivo, o (b) suplementar la producción de una
proteína o enzima celular expresado de manera defectiva o baja.
Dichas enfermedades pueden incluir fibrosis cística, enfermedad de
Parkinson, hipercolesterolemia, deficiencia de adenosina desaminasa,
trastornos de la \beta-globina. Hemofilia A y B.
Enfermedad de Gaucher, diabetes y leucemia.
Como ejemplo, se puede usar un vector vírico de
alfavirus recombinante para tratar la enfermedad de Gaucher. De
manera resumida, la enfermedad de Gaucher es un trastorno genético
que está caracterizado por la deficiencia de la enzima
glucocerebrosidasa. Este tipo de terapia es un ejemplo de una
terapia de sustitución génica única que proporciona una enzima
celular funcional. Esta deficiencia dl enzima conduce a la
acumulación de glucocerebrósido en los lisosomas de todas las
células en el cuerpo. Sin embargo, el fenotipo de la enfermedad se
manifiesta únicamente en los macrófagos, excepto en formas
neuropáticas muy raras de la enfermedad. La enfermedad condice
normalmente a un engrosamiento del hígado y del bazo y a lesiones en
los huesos (para una revisión, véase Science 256: 794, 1992 y The
Metabolic Basis of Inherited Disease, 6ª ed., Scriver y col., vol.
2, p. 1677).
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En otros aspectos de la presente divulgación, se
desvelan los procedimientos para administrar vectores o partícula
de alfavirus recombinantes. De manera resumida, el modo final de
administración del vector vírico depende de la aplicación
terapéutica específica, el mejor modo de aumentar la potencia del
vector, y la ruta más conveniente de administración. Generalmente,
esta forma de realización incluye vectores de alfavirus recombinante
que se pueden diseñar para ser liberados mediante, por ejemplo, (1)
inyección directa en la corriente sanguínea; (2) inyección directa
en un tejido o tumor específico; (3) administración oral, (4)
inhalación nasal; (5) aplicación directa a tejidos mucosales; o (6)
administración ex vivo de células autólogas transducidas en
el animal. De esta manera, el vector de alfavirus terapéutico se
puede administrar de tal manera que el vector pueda (a) transducir
una célula sana normal y, y transformar la célula en una productora
de proteína o agente terapéutico que se secreta sistémicamente o
localmente, (b) transformar una célula anormal o defectiva,
transformar la célula en un fenotipo de funcionamiento normal, (c)
transformar una célula anormal de tal manera que se destruya, y/o
(d) transducir células para manipular la respuesta inmune.
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En otra forma más de realización, se pueden
utilizar vectores de alfavirus para regular la actividad de control
del crecimiento de los factores de transcripción en la célula
infectada. De manera resumida, los factores de transcripción
influencian directamente el modelo de expresión génica a través de
la trans-activación o la represión específica de secuencia
(Karin, New Biologist 21:126-131, 1990). De esta
manera, no es sorprendente que los factores de transcripción
mutados represente una familia de oncogenes. Se puede usar la
terapia de transferencia génica de alfavirus, por ejemplo, para
volver a controlar las células tumorales cuyo crecimiento no
regulado está activado por los factores de transcripción
oncogénicos, y las proteínas que promueven o inhiben la unión
cooperativamente en la formación de homo y heterodímeros que
trans-activan o reprimen la transcripción de complejos de
factores.
Un procedimiento para revertir la proliferación
celular sería inhibir la trans-activación potencial del
complejo de factor de transcripción del heterodímero
c-myc/Max. De manera resumida, el oncogen
nuclear c-myc se expresa mediante células
proliferante y se puede activar mediante diversos mecanismos
distintos, que incluyen la inserción retrovírica, la amplificación,
y la translocación cromosómica. La proteína Max que se expresa en
células quiescentes y, independientemente de
c-myc, tanto sólo como en conjunción con un
factor no identificado, funciona para reprimir la expresión de los
mismos genes activados por el heterodímero myc/Max (Cole, Cell 65:
715-716, 1991).
La inhibición de la proliferación de
c-myc o c-myc/Max de
las células tumorales se puede llevar a cabo mediante la
sobreexpresión de Max en las células diana controladas por los
vectores de alfavirus. La proteína Max tiene sólo 160 aminoácidos
(que corresponden a una longitud de 480 nucleótidos del ARN) y se
incorpora fácilmente en un vector de alfavirus tanto
independientemente, como en combinación con otros genes y/o restos
de sentido contrario/ribozimas dirigidos a los factores que liberan
el control del crecimiento de la célula.
La modulación del complejo homo/hetero en
asociación es otra solución para controlar la expresión génica
activada por el factor de transcripción. Por ejemplo, se evita a la
vez el transporte desde el citoplasma al núcleo del factor de
transcripción trans-activante NF-\kappaB en
un complejo heterodímero con la proteína inhibidora
NF-\kappaB. tras la inducción por una variedad de
agentes, que incluyen algunas citoquinas, I\kappaB llega a
fosforilarse y se libera NF-\kappaB y se
transporta al núcleo, en el que puede ejercer su función de
trans-activación específica de secuencia (Baeuerle y
Baltimore, Science 242:540-546, 1988). Se puede
evitar la disociación del complejo
NF-\kappaB/I\kappaB enmascarando con un
anticuerpo el emplazamiento de fosforilación de I\kappaB. esta
solución inhibiría efectivamente la actividad de
trans-activación del factor de transcripción
NF-I\kappaB evitando su transporte al núcleo. Se
puede llevar a cabo la expresión del anticuerpo o la proteína
específicos del emplazamiento de fosforilación de I\kappaB en las
células diana con un vector de transferencia génica de alfavirus.
Se podría usar una solución similar a la descrita aquí para evitar
la formación del factor del heterodímero de transcripción
trans-activante AP-1 (Turner y Tijan, Science
243: 1689-1694, 1989), inhibiendo la asociación
entre las proteínas jun y fos.
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Tal como se ha señalado anteriormente se
desvelan en el presente documento composiciones farmacéuticas que
comprenden una partícula o virus Sindbis recombinante, o constructo
de vector Sindbis, en combinación con un vehículo, diluyente, o
huésped farmacéuticamente aceptable.
De manera resumida, se puede preservar el virus
recombinante infecciosos (denominado también y anteriormente como
partículas) tanto en bruto como en formas purificadas: Con el fin de
producir virus en forma bruta, se pueden cultivar en primer lugar
células que producen virus en un biorreactor, en el que las
partículas víricas se liberan a partir de las células en los medios
de cultivo. A continuación se pueden preservar los virus en forma
bruta añadiendo en primer lugar una cantidad suficiente de una
formulación tampón a los medios de cultivo que contienen el virus
recombinante para formar una suspensión acuosa. Dentro de algunas
formas de realización preferidas, la formulación tampón es una
solución acuosa que contiene un sacárido, un aditivo estructural de
elevado peso molecular, y un componente tamponante en agua. La
solución acuosa puede contener también uno o más aminoácidos.
Se puede preservar también el virus recombinante
en forma purificada. Más específicamente, antes de la adición de la
formulación tampón, se puede clarificar el virus recombinante bruto
descrito anteriormente pasando éste a través de un filtro y a
continuación concentrándolo, tal como mediante un sistema de
concentración de flujo cruzado (Filtron Technology Corp.,
Nortborough, Mass.). En una forma de realización, se añade DNasa al
concentrado para digerir el ADN exógeno. El digerido se diafiltra a
continuación con el fin de eliminar los componentes de los medios
en exceso y establecer el virus recombinante en una solución
tamponada más deseable: A continuación se pasa el diafiltrado sobre
una columna de gel Sephadex S-500 y se eluye un
virus recombinante purificado. A continuación se añade a este
eluato una cantidad suficiente de formulación tampón con el fin de
alcanzar una concentración final deseada de los constituyentes y
diluir mínimamente los virus recombinantes. A continuación se puede
almacenar la solución acuosa, preferiblemente a -70ºC, o secarse
inmediatamente. Tal como anteriormente, la formulación tampón puede
ser una solución acuosa que contiene un sacárido, un aditivo
estructural de elevado peso molecular, y un componente tamponante en
agua. La solución acuosa puede contener también uno o más
aminoácidos.
Se puede purificar el virus recombinante bruto
mediante cromatografía en columna de intercambio iónico. De manera
resumida, el virus recombinante bruto se puede clarificar pasando en
primer lugar éste a través de un filtro, seguido por cargar el
filtrado sobre una columna que contiene una matriz de celulosa
altamente sulfonada. A continuación se puede eluir el virus
recombinante de la columna en forma purificada usando un tampón de
sal alta, e intercambiar el tampón de sal alta por un tampón más
deseable pasando el eluato sobre una columna de exclusión
molecular. A continuación se añade una cantidad suficiente de
formulación tampón, tal como se describe anteriormente, al virus
recombinante purificado y la suspensión acuosa se seca
inmediatamente o se almacena, preferiblemente a -70ºC.
La suspensión acuosa en forma bruta o purificada
se puede secar mediante liofilización o evaporación a temperatura
ambiente. De manera resumida, la liofilización implica las etapas de
enfriar la suspensión acuosa por debajo de la temperatura de
transición vítrea o por debajo de la temperatura del punto eutéctico
de la suspensión acuosa, y eliminar el agua de la suspensión
enfriada mediante sublimación para formar un virus liofilizado. En
una forma de realización, se colocan alícuotas del virus
recombinante formulado en una Cámara Refrigerada Edwards (unidad
RC3S estantería 3) unida a un criocongelador (Supermodulyo 12K). Se
usa un procedimiento de criocongelación multietapas tal como se
describe por Phillips y col. (Cryobiology 18: 414, 1981) para
liofilizar el virus recombinante formulado, preferiblemente entre
una temperatura de -40ºC a -45ºC. la composición resultante
contiene menos de un 10% de agua en peso del virus liofilizado. Una
vez liofilizado, el virus recombinante es estable y se puede
almacenar a -20ºC a 25ºC, tal como se describe con más detalle a
continuación.
Dentro del procedimiento evaporativo, se elimina
el agua de la suspensión acuosa a temperatura ambiente mediante
evaporación. En una forma de realización, se elimina el agua
mediante secado por pulverización (documento EP 520.748). Dentro
del procedimiento de secado por pulverización, la suspesión acuosa
se libera en un flujo de gas precalentado, usualmente aire, en el
que el agua se evapora rápidamente a partir de gotitas de la
suspensión. El equipo de secado por pulverización está disponible
de numerosos fabricantes (por ejemplo, Drytec, Ltd.,
Tonbridge, England; Lab-Plant, Ltd., Huddersfield,
Inglaterra). Una vez deshidratado, el virus recombinante es estable
y se puede almacenar a -20ºC a 25ºC. dentro de los procedimientos
descritos en el presente documento, se puede determinar el
contenido de humedad resultante del virus seco o liofilizado
mediante el uso de un equipo Karl-Fischer
(titulador volumétrico Aquastar^{TM} V 1 B de EM Science, Cherry
Hill, NJ), o mediante un procedimiento gravimétrico.
La suspensión acuosa usada para la formulación,
tal como se ha descrito anteriormente, se compone preferiblemente
de un sacárido, un aditivo estructural de elevado peso molecular, un
componente tamponante, y agua. La solución puede incluir también
uno o más aminoácidos. La combinación de estos componentes actúa
para preservar la actividad del virus recombinante tras la
congelación y la liofilización o el secado mediante evaporación.
Aunque un sacárido preferido es lactosa, se pueden usar otros
sacáridos, tales como sacarosa, manitol, glucosa, trehalosa,
inositol, fructosa, maltosa o galactosa. Además, se pueden usar
combinaciones de sacáridos, por ejemplo, lactosa y manitol, o
sacarosa y manitol. Una concentración particularmente preferida de
lactosa es 3%-4% en peso. Preferiblemente, la concentración del
sacárido oscila entre 1% y 12% en peso.
El aditivo estructural de elevado peso molecular
ayuda en la prevención de la agregación vírica durante la
congelación y proporciona soporte estructural en el estado
liofilizado o seco. Dentro del contexto de la presente divulgación,
se consideran los aditivos estructurales por ser de "elevado peso
molecular" si son mayores de un PM mayor de 5000. Un aditivo
estructural de elevado peso molecular preferido es la albúmina de
suero humano. Sin embargo, se pueden usar también otras sustancias,
tales como hidroxietilcelulosa, hidroximetilcelulosa, dextrano,
celulosa, gelatina, o povidona. Una concentración particularmente
preferida de albúmina de suero humano es 0,1% en peso.
Preferiblemente, la concentración de aditivo estructural de elevado
peso molecular oscila entre 0,1% y 10% en peso.
Los aminoácidos, si están presentes, funcionan
para preservar además la infectividad vírica tras el enfriamiento y
la descongelación de la suspensión acuosa. Además, los aminoácidos
funcionan para preservar además la infectividad vírica durante la
sublimación de la suspensión acuosa enfriada y a la vez en el estado
liofilizado. Un aminoácido preferido es arginina, pero se pueden
usar también otros aminoácidos tales como lisina, ornitina, serina,
glicina, glutamina, asparagina, ácido glutámico o ácido aspártico.
Una concentración de arginina particularmente preferida es 0,1% en
peso. Preferiblemente, la concentración de aminoácidos oscila entre
0,1% y 10% en peso.
El componente tamponante actúa para tamponar la
solución manteniendo un pH relativamente constante. Se puede usar
una variedad de tampones, dependiendo del intervalo de pH deseado,
preferiblemente entre 7,0 y 7,8. Los tampones adecuados incluyen
tampón fosfato y tampón citrato. Un pH particularmente preferido de
la formulación de virus recombinante es 7,4, y un tampón preferido
es trometamina.
Además, es preferible que la solución acuosa
contenga una sal neutra que se usa para ajustar el alfavirus
recombinante formulado final en una concentración de sal isoosmótica
apropiada. Las sales neutras adecuadas incluyen cloruro de sodio,
cloruro de potasio o cloruro de magnesio. Una sal preferida es
cloruro de sodio.
Se pueden preparar soluciones acuosas que
contengan la concentración deseada de los componentes descritos
anteriormente como soluciones de almacenamiento concentradas.
Será evidente para las personas expertas en la
técnica, dada la divulgación proporcionada en el presente documento,
que puede ser preferible utilizar algunos sacáridos dentro de la
solución acuosa cuando se pretende almacenar el virus liofilizado a
temperatura ambiente. Más específicamente, es preferible utilizar
disacáridos, tales como lactosa o trehalosa, particularmente para el
almacenamiento a temperatura ambiente.
Los virus liofilizados o deshidratados
desvelados en el presente documento se pueden reconstituir usando
una variedad de sustancias, pero se reconstituyen preferiblemente
usando agua. En algunos ejemplos, se pueden usar también soluciones
de sal diluida que llevan la formulación final a la isotonicidad.
Además, puede ser ventajoso usar soluciones acuosas que contengan
componentes conocidos para potenciar la actividad del virus
reconstituido. Dichos componentes incluyen citoquinas, tales como
IL-2, policationes, tales como sulfato de
protamina, u otros componentes que potencian la eficiencia del virus
reconstituido. El virus recombinante liofilizado o deshidratado
puede reconstituirse con cualquier volumen conveniente de agua o de
los agentes de reconstitución señalados anteriormente que permiten
sustancial y preferiblemente la solubilización total de la muestra
liofilizada o deshidratada.
Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de
ilustración, y no a modo de limitación. Los aspectos de los ejemplos
que no se refieren específicamente a la invención reivindicada son
únicamente para ilustración y comparación.
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La naturaleza de los virus que tienen un genoma
de ARN con polaridad positiva es tal que cuando se introducen en una
célula eucariota que sirve como huésped permisivo, el ácido nucleico
genómico purificado sirve como una molécula de ARN mensajero
funcional (ARNm). De esta manera, este ARN genómico, purificado a
partir del virus, puede iniciar el mismo ciclo de infección que es
característico de la infección del virus de tipo natural a partir
del cual se purificó el ARN.
La cepa Ar-339 del virus Sindbis
(ATCC Nº VR-1248, Taylor y col., Am. J. Trop. Med
Hyg. 4: 844 1955), aislada del mosquito Culexus univittatus
se propagó en células de riñón de cría de hámster (BHK), infectadas
a baja multiplicidad (0,1 UFP/cél). Alternativamente, se puede usar
la cepa hr del virus Sindbis (Lee Biomolecular, San Diego, CA) y
propagarse mediante los mismos procedimientos. Los viriones Sindbis
se precipitan de un lisado clarificado a las 48 horas después de la
infección con 10% (p/v) de polietilenglicol
(PEG-8000) a 0ºC, tal como se ha descrito
anteriormente. Los viriones Sindbis contenidos en el aglomerado de
PEG se lisaron con SDS al 2%, y se aisló el ARNm poliadenilado
mediante cromatografía usando columnas de oligo dT comercialmente
disponibles (Invitrogen). Se llevaron a cabo dos vueltas de síntesis
de la primera cadena de ADNc sobre el ARNm seleccionado con poliA,
usando un cebador de oligonucleótidos con la secuencia que se
muestra a continuación:
5'-TATATTCTAGA(dT)25-GAAATG-3' | (SEC DE ID Nº. 2) |
El cebador contiene en su extremo 5' una
"secuencia tampón" de cinco nucleótidos para la digestión
eficiente de la endonucleasa de restricción, seguido por la
secuencia de reconocimiento XbaI, 25 nucleótidos dT consecutivos y
seis nucleótidos que son precisamente complementarios con el extremo
3' de Sindbis extremo. De esta manera, la selección para la primera
vuelta de síntesis del ADNc es a dos niveles: (1) moléculas
poliadeniladas, un prerrequisito para el ARNm funcional, y (2)
cebado selectivo de las moléculas de ARNm de Sindbis, en una mezcla
que contiene múltiples especies de ARNm. Adicionalmente, la
transcripción inversa se lleva a cabo en presencia de MeHgOH 10 mM
para mitigar la frecuencia de las paradas artificiales durante la
transcripción inversa.
El ADNc primario de longitud genómica de Sindbis
se amplificó mediante la PCR en seis segmentos distintos usando
seis pares de cebadores solapantes. Además de las secuencias
complementarias víricas, el cebador directo del extremo 5' de
Sindbis contiene la secuencia de 19 nucleótidos que corresponde al
promotor de la ARN polimerasa de SP6 bacteriano y la secuencia de
reconocimiento de la endonucleasa de restricción ApaI unida en su
extremo 5' a una "secuencia tampón" de cinco nucleótidos para
la digestión eficiente que precede a la secuencia de reconocimiento
de ApaI. La ARN polimerasa de SP6 bacteriano se equilibró de tal
manera que la transcripción in vitro dio como resultado la
inclusión de sólo un ribonucleótido G no vírico único unido al
ribonucleótido A, que corresponde al extremo 5' de Sindbis
auténtico. La inclusión de la secuencia de reconocimiento ApaI
facilita la inserción del amplicón de la PCR en la secuencia
poliligante del vector plásmido (pKS II^{+}, Strategene). Se
muestran a continuación la secuencia del cebador directo
SP6-5' de Sindbis y todas las parejas de cebadores
necesarias para amplificar el genoma de Sindbis completo. La
secuencia de referencia (GenBank nº de acceso. SINCG) es de Strauss
y col., Virology 133:92-110.
(Continuación)
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Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR
del ADNc de Sindbis con los seis primeros conjuntos que se muestran
anteriormente en reacciones separadas, usando la ADN polimerasa
termoestable Thermalase (Amresco Inc., Solon, Ohio) y el tampón que
contenía MgCl_{2} 1,5 mM, proporcionados por el suministrador.
Adicionalmente, las reacciones contienen DMSO al 5%, y las perlas
Hot Start Wax (Perkin-Elmer), usando el siguiente
protocolo de amplificación mediante la PCR que se muestra a
continuación:
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\vskip1.000000\baselineskip
Tras la amplificación, los seis productos de la
reacción se insertaron en primer lugar en el vector pCR II
(Invitrogen), usando a continuación las enzimas apropiadas que se
muestran anteriormente, se insertaron, por etapas, en el vector pKS
II^{+} (Stratagene), entre los emplazamientos ApaI y XbaI. Este
clon se designó como pVGSP6GEN.
El clon pVGSP6GEN del ADNc genómico de Sindbis
se linealizó mediante digestión con XbaI, que corta
pVGSP6GEN una vez, inmediatamente adyacente y en la dirección 3' de la extensión poli dA:dT de 25 nucleótidos de longitud. El clon pVGSP6GEN linealizado se purificó con Gene Clean (BIO 101, La Jolla, CA), y se ajustó a una concentración de 0,5 mg/ml. Se llevó a cabo la transcripción del clon pVGSP6GEN linealizado in vitro a 40ºC durante 90 min de acuerdo con las siguientes condiciones de reacción: 2 ml de ADN/4,25 ml de H_{2}O/10 ml de NTP 2,5 mM (UTP, ATP, GTP, CTP)/1,25 ml de análogo de caperuza m7G(5')ppp(5')G 20 mM/1,25 ml de DTT 100 mM/5 ml de tampón de transcripción 5X (Promega)/0,5 ml de RNasin (Promega)/0,25 ml 10 mg/ml de albúmina de suero bovino/0,5 ml de ARN polimerasa de SP6 (Promega). Los productos de la reacción de transcripción in vitro se pueden digerir con DNasaI (Promega) y purificarse mediante extracción secuencial de fenol/CHCl_{3} y éter, seguido por precipitación con etanol, o alternativamente, se puede usar directamente para la transfección. Los productos de la reacción de transcripción in vitro o el ARN purificado se complejaron con un compuesto lípido catiónico comercial (Lipofectin, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), y se aplicaron a células de Riñón de Cría de Hámster-21 (BHK-21) mantenidas a 60 mM en una placa petri en una confluencia del 75%. Las células transfectadas se incubaron a 30ºC. tras 94 horas después de la transfección, se observaron citopatológicos extensos (CPE). No se observó CPE obvio en las placas que no recibieron el ARN transcrito a partir del clon de ADNc de Sindbis. Adicionalmente, 1 ml de sobrenadante tomada de las células transfectadas, añadido a las monocapas frescas de las células BHK-21, e incubado a 30ºC o 37ºC dio como resultado CPE obvio en 18 horas. Esto demuestra que el clon pVGSP6GEN del ADNc de Sindbis es de hecho infeccioso.
pVGSP6GEN una vez, inmediatamente adyacente y en la dirección 3' de la extensión poli dA:dT de 25 nucleótidos de longitud. El clon pVGSP6GEN linealizado se purificó con Gene Clean (BIO 101, La Jolla, CA), y se ajustó a una concentración de 0,5 mg/ml. Se llevó a cabo la transcripción del clon pVGSP6GEN linealizado in vitro a 40ºC durante 90 min de acuerdo con las siguientes condiciones de reacción: 2 ml de ADN/4,25 ml de H_{2}O/10 ml de NTP 2,5 mM (UTP, ATP, GTP, CTP)/1,25 ml de análogo de caperuza m7G(5')ppp(5')G 20 mM/1,25 ml de DTT 100 mM/5 ml de tampón de transcripción 5X (Promega)/0,5 ml de RNasin (Promega)/0,25 ml 10 mg/ml de albúmina de suero bovino/0,5 ml de ARN polimerasa de SP6 (Promega). Los productos de la reacción de transcripción in vitro se pueden digerir con DNasaI (Promega) y purificarse mediante extracción secuencial de fenol/CHCl_{3} y éter, seguido por precipitación con etanol, o alternativamente, se puede usar directamente para la transfección. Los productos de la reacción de transcripción in vitro o el ARN purificado se complejaron con un compuesto lípido catiónico comercial (Lipofectin, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), y se aplicaron a células de Riñón de Cría de Hámster-21 (BHK-21) mantenidas a 60 mM en una placa petri en una confluencia del 75%. Las células transfectadas se incubaron a 30ºC. tras 94 horas después de la transfección, se observaron citopatológicos extensos (CPE). No se observó CPE obvio en las placas que no recibieron el ARN transcrito a partir del clon de ADNc de Sindbis. Adicionalmente, 1 ml de sobrenadante tomada de las células transfectadas, añadido a las monocapas frescas de las células BHK-21, e incubado a 30ºC o 37ºC dio como resultado CPE obvio en 18 horas. Esto demuestra que el clon pVGSP6GEN del ADNc de Sindbis es de hecho infeccioso.
El análisis de la secuencia de pVGSP6GEN, que se
muestra en la Tabla 1, revela diferencias de secuencia múltiples
entre el clon genómico de Sindbis descrito en el presente documento,
y el clon vírico contenido en el Genbank. Muchas diferencias de
secuencia dan como resultado cambios de sustitución de aminoácidos
no conservativos en las proteínas de Sindbis. Para resolver qué
cambios de secuencia son únicos en el clon descrito en el presente
documento, o son un resultado del artefacto de la clonación, se
amplificó el virión de ARN mediante la RT-PCR tal
como se ha descrito anteriormente, y se determinó la relación de la
secuencia con los nucleótidos en cuestión mediante secuenciación
directa del producto de amplicón de la RT-PCR,
usando un kit comercialmente disponible (Promega, Madison WI) y se
comparó con la secuencia PVGSP6GEN correspondiente. En la Tabla 2,
se facilitan los resultados de este estudio. De manera resumida, se
observaron cambios de tres aminoácidos no conservativos
Gly->Glu, Asp->Gly, y Tyr->Cys, que son como resultado del
artefacto de la clonación respectivamente en los nucleótidos
víricos 2245, 6193, y 6730. Estos cambios de nucleótidos dan como
resultado cambios en los aminoácidos no conservativos en todo el
mapa del gen de la proteína no estructural vírica (NSP), nt 2245 de
NSP 2, y nt 6193 y 6730 de NSP4.
Se llevó a cabo la reparación de los genes NSP 2
y NSP 4 mediante la RT-PCR, tal como se ha descrito
anteriormente, usando ARN de virión de un depósito purificado en
placa 5 veces. Se usó la pareja de cebadores
SP6-1A/1B descrita anteriormente para reparar el
cambio en el nt 2245. El producto amplicón de la
RT-PCR se digirió con Eco 47III y BglII, y se
purificó el fragmento de 882 pb mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1%/TBE, y se intercambió en la región correspondiente
del clon pVGSP6GEN, preparado mediante digestión con Eco 47III y
BglII, y tratamiento con CIAP. Se usó la pareja de cebadores
3A/7349R descrita anteriormente para reparar los cambios en el nt
6193 y el nt 6730. El producto amplicón de la RT-PCR
se digirió con EcoRI y HpAI, y se purificó el fragmento de 1.050 pb
mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%/TBE, y se
intercambió en la región correspondiente del clon pVGSP6GEN. Se
conoce este clon como pVGSP6GENrep. La transfección de células BHK
con ARN transcrito in vitro del ADN de pVGSP6GENrep
linealizado mediante digestión con XbaI, tal como se describe
anteriormente, dio como resultado un CPE extenso 18 horas después de
la transfección.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Debido al tamaño del clon de ADNc genómico de
longitud completa de Sindbis, la transcripción in vitro de
moléculas de longitud completa es más bien poco eficiente. Esto da
como resultado una eficiencia de transfección disminuida, en
términos de centros infecciosos del virus, tal como se midió
mediante la formación de placas, con respecto a la cantidad de ARN
transfectado transcrito in vitro. Esta preocupación es
también relevante en la transcripción in vitro de los
vectores de expresión de Sindbis. Los clones de ADNc y otros
vectores de expresión de ADNc de Sindbis candidatos de ensayo para
su capacidad de iniciar un ciclo infeccioso o para dirigir la
expresión de una secuencia heteróloga se facilitarían mucho si el
clon de ADNC se transfectó en células susceptibles como una
molécula de ADN que dirige a continuación la síntesis de ARN in
vivo. Se ha informado de eficiencias de transfección tan altas
como un 100% en células transfectadas con ADN complejado con
diversas preparaciones lípidas sintéticas comerciales o mediante
electroporación. También, se ha demostrado que el ADNc de los
picornavirus es capaz de iniciar un ciclo infeccioso cuando se
transfecta en células susceptibles (van der Werf y col., PNAS 83:
2330-2334, 1986). No se ha descrito en la
bibliografía, sin embargo, si el ADNc genómico de Sindbis, cuando
se coloca próximo a un promotor de mamíferos y se transfecta en las
células, da como resultado ARN que es capaz de iniciar el ciclo
infeccioso característico del virus de tipo natural.
Se sabe bien que las moléculas de ADN que tienen
las señales apropiadas se pueden replicar in vivo cuando se
introduce directamente en animales (Dubensky y col., PNAS 81:
7429-7533, 1984). La administración de vectores de
ADNc de Sindbis directamente como moléculas de ADN es factible en
algunas aplicaciones en las que la expresión de paliativos dirigida
a Sindbis tiene un efecto trans.
Estas aplicaciones incluyen la inmunomodulación
y la expresión de citoquinas u otras proteínas terapéuticas. Dentro
del alcance de Sindbis, la administración directa de vectores de
expresión de ADNc de Sindbis ofrece una utilidad que es más simple
que la generación de una partícula de Sindbis.
Los constructos de vector de ADNc de Sindbis que
contienen una secuencia paliativa terapéutica heteróloga se
insertan en el interior de un casete de expresión de la ARN
polimerasa II eucariota. Esta construcción se conoce como Sistema
de Inicio del Vector Eucariota en Capas y está comprendida por los
siguientes elementos ordenados: un promotor 5' eucariota capaz de
iniciar la síntesis de ARN vírico en el extremo 5' de Sindbis
auténtico, una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción
de un virus Sindbis, una secuencia de nucleótidos que codifica las
proteínas no estructurales de Sindbis, una región de unión vírica,
una secuencia heteróloga, una secuencia de reconocimiento de la ARN
polimerasa de Sindbis, una secuencia de terminación de la
transcripción y una señal 3' de poliadenilación. El vector de
expresión del ADNc de Sindbis descrito en el presente documento
puede incluir también las señales de corte y empalme apropiadas
localizadas, por ejemplo, entre Sindbis y las regiones génicas
heterólogas.
Se determinó en primer lugar la capacidad del
clon pVGSP6GENrep del ADNc de Sindbis se iniciar un ciclo infeccioso
característico del virus de tipo natural mediante la colocación del
ADNc vírico genómico en el interior de un casete de expresión de la
ARN polimerasa II de mamífero. Se llevó a cabo esta construcción tal
como se describe seguidamente en detalle. Se digirió el clon
pVGSP6GENrep con BglII y XbaI, los productos de la reacción se
sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa/TBE al 0,8%, y
el fragmento de 9.438 pb resultante se escindió, se purificó con
Gene Clean (BIO 101, Vista, CA), y se ligó en el fragmento de vector
de 4.475 pb resultante del tratamiento de pcDNA3 (Invitrogen, San
Diego, CA) con BglII, XbaI, y CIAP. Esta construcción se conoce como
pcDNASINbgI/xba.
La repetición de longitud terminal (LTR) del
virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV) se
situó en el extremo 5' vírico de tal manera que el primer nucleótido
transcrito es un resto G único, que se completó in vivo,
seguido por el extremo 5' de Sindbis Se sabe que los ARN transcritos
in vitro que contienen tres nucleótidos no víricos en su
extremo 5' son infecciosos (Rice y col., J. Virol. 61:
3809-3819, 1987). La yuxtaposición de la LTR de
Mo-MLV y el extremo 5' de Sindbis se lleva a cabo
mediante la PCR solapante tal como se describe seguidamente en
detalle. La amplificación de la LTR de Mo-MLV en la
reacción primaria de la PCR se lleva a cabo en una reacción que
contiene el vector BAG (Price y col., PNAS
84:156-160, 1987) y la siguiente pareja de
cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo: BAGBg12F1 (secuencia
tampón/secuencia de reconocimiento de BglII/LTR de
Mo-MLV nt 1-22):
5'-TATATAGATCTAATGAAAGACCCCACCTGTAGG
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso: BAGwt441 R2 (SIN nt
5-1/LTR de Mo-MLV nt
441-406):
5'-TCAATCCCCGAGTGAGGGGTTGTGGGCTCTTTTATTGAGC
\newpage
Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR
de la LTR de Mo-MLV con la pareja de cebadores que
se muestra anteriormente usando la ADN polimerasa termoestable
Thermalase (Amresco Inc., Solon, Ohio) y el tampón que contenía
MgCl_{2} 1,5 mM, facilitado por el suministrador. Adicionalmente,
la reacción contiene DMSO al 5%, y las perlas Hot Start Wax
(Perkin-Elmer), usando el siguiente protocolo de
amplificación mediante la PCR que se muestra a continuación:
Se llevó a cabo la amplificación del extremo 5'
de Sindbis en la segunda reacción primaria de la PCR en una reacción
que contenía el clon pVGSP6GENrep y la siguiente pareja de
cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo: LTR de
Mo-MLV nt 421-441/SIN nt
1-16):
5'-CCACAACCCCTCACTCGGGGATTGACGGCGTAGTAC
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso: (SIN nt
3182-3160):
5'-CTGGCAACCGGTAAGTACGATAC
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación mediante la PCR de la LTR de
Mo-MLV es con la pareja de cebadores y las
condiciones de reacción de la amplificación que se muestran
anteriormente, y usando el siguiente protocolo de amplificación
mediante la PCR que se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos del pb 457 y el pb 3202 de las
reacciones primarias de la PCR se purificaron con Gene Clone, y se
usaron conjuntamente en una reacción mediante la PCR con la
siguiente pareja de cebadores
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo: BAGBgl2F (secuencia
tampón/secuencia de reconocimiento de BglII/LTR de
Mo-MLV nt 1-22):
5'-TATATAGATCTAATGAAAGACCCCACCTGTAGG
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso: (SIN nt
2300-2278):
5'-GGTAACAAGATCTCGTGCCGTG
\newpage
La amplificación mediante la PCR de los
productos del amplicón de la PCR del cebador es con la pareja de
cebadores y las condiciones de reacción de la amplificación que se
muestran anteriormente, y usando el siguiente protocolo de
amplificación mediante la PCR que se muestra a continuación:
Las 25 bases 3' terminales del primer producto
amplicón de la PCR primaria solapan con las 25 bases 5' terminales
del segundo producto amplicón de la PCR primaria. Los 2.752 pb
resultantes que solapan con el producto amplicón de la PCR
secundaria se purificaron mediante electroforesis en gel de
agarosa/TBE al 0,8%, se digirieron con BglII, y el producto de los
2.734 pb se ligó en pcDNASINbgI/xba tratado con BglII y CIAP. La
construcción resultante tiene 16.656 pb y se conoce como pVGELVIS.
Se proporciona la secuencia de pVGELVIS en la Figura 3. Los
nucleótidos de Sindbis están contenidos en el interior de las bases
1-11.700 de la secuencia.
El ADN plásmido de pVGELVIS se complejó con
Lipofectamina (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) de
acurdo con las condiciones sugeridas por el suministrador (circa 5
\mug de ADN/8mg de reactivo lípido) y se añadió a pocillo de 35 mm
que contenían células BHK-21 en una confluencia
aproximadamente del 75%. Se observaron efectos citopáticos (CPE),
característicos de la infección por virus Sindbis de tipo natural en
las 48 horas después de la infección. Estos datos demuestran la
correcta yuxtaposición de las señales del casete de expresión del
ADNc vírico y la ARN polimerasa II en el constructo pVGELVIS, dando
como resultado el inicio de novo de un virus de ARN a partir
de un módulo de expresión de ADN. Esta innovación no sólo potencia
la utilidad del sistema Sindbis en general, sino que también
proporciona otro procedimiento para un Vector Físico de
Transferencia Génica.
La eficiencia de la replicación del vector tras
la transcripción inicial del ARN de longitud genómica de pVGELVIS se
potencia también por las modificaciones que dan como resultado un
extremo 3' más auténtico. Para este objetivo, se llevan a cabo dos
modificaciones diferentes en el constructo de vector ELVIS. La
primera utiliza la secuencia de la ribozima antigenómica del virus
de la hepatitis delta (VHD), situado adyacente a la extensión
poliadenilada de Sindbis. El segundo implica una delección de la
extensión poliadenilada de Sindbis y las secuencias del vector en la
dirección 3'. Dando como resultado la fusión de 11.700 nucleótidos
de Sindbis en la secuencia de terminación de la transcripción del
gen de la hormona del crecimiento bovina/de poliadenilación.
El constructo que contiene la ribozima de VHD se
genera usando las técnicas de la PCR y solapando los cebadores de
oligonucleótidos que contienen la secuencia completa de la ribozima
antigenómica de 84 nucleótidos (Perotta y Been, Nature 350:
434-6, 1991). Además de la secuencia del VHD, los
cebadores contienen los emplazamientos que flanquean la enzima de
restricción para los objetivos de la inserción en el vector ELVIS.
Se llevaron a cabo dos vueltas de la PCR. La primera usando los
cebadores de oligonucleótidos HDV49-XC y
HDV17-68 (se muestran a continuación).
seguido por la dilución de la primera reacción
de la PCR, y su uso posterior como plantilla en una segunda vuelta
de la PCR con los cebadores HDV49-XC (de la primera
reacción) y HDVX-36 (se muestra a continuación).
Tras la síntesis, el fragmento de la ribozima
HDV se digirió con XbaI, que rompe en las secuencias que flanquean
(itálicas), y se liga en el ADN del vector ELVIS, que se ha digerido
parcialmente con XbaI para romper sólo uno de sus dos
emplazamientos. Se lleva a cabo la detección sistemática para la
inserción en el emplazamiento apropiado y la correcta orientación
mediante el emplazamiento de restricción y el análisis de la
secuencia. Esta construcción se conoce como pVGELVISHDV.
En el segundo procedimiento, se lleva a cabo la
fusión de 11.700 nucleótidos de Sindbis con la secuencia de
terminación de la transcripción del gen de la hormona del
crecimiento bovina/poliadenilación mediante la delección de la
extensión poliadenilada de Sindbis y se llevó a cabo la
secuenciación del vector pVGELVIS en la dirección 3' mediante la PCR
solapante. Se llevó a cabo la amplificación del extremo 3' de
Sindbis en la primera reacción de la PCR primaria en una reacción
que contenía pVGELVIS y la siguiente pareja de cebadores:
Cebador directo: SIN10349F (SIN nt
10394-10372):
5'-GACAGTGAGAACAGCCAGATGAG
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso: SINBGH11700R (BGH nt
13-1/SIN nt 11700-11675):
5'-CAGCGAGCTCTAGGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGTTG
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR
de pVGELVIS con la primera pareja de cebadores que se muestra
anteriormente usando la ADN polimerasa termoestable Thermalase
(Amresco Inc., Solon, Ohio) y el tampón que contenía MgCl_{2} 1,5
mM, facilitada por el suministrador. Adicionalmente, la reacción
contiene DMSO al 5%, y las perlas Hot Start Wax
(Perkin-Elmer), usando el siguiente protocolo de
amplificación mediante la PCR que se muestra a continuación:
Se llevó a cabo la amplificación de la secuencia
de terminación de la transcripción del gen BGH/poliadenilación en la
segunda reacción de la PCR primaria en una reacción que contenía el
clon pVGELVIS y la siguiente pareja de cebadores:
Cebador directo: pCSIN1018F (SIN nt
11.687-11.700/PCDNA3 nt
1018-1039):
5'-CCACAACCCCTCACTCGGGGATTGACGGCGTAGTAC
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso: pCDNA1633R (pCDNA3 nt
1633-1608):
5'-GTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCAC
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación mediante la PCR del extremo 5'
del gen BGH es con la primera pareja de cebadores y las condiciones
de la reacción de la amplificación que se muestran anteriormente, y
usando el siguiente protocolo de amplificación mediante la PCR que
se muestra a continuación:
Se purificaron los productos de 1.634 pb y 629
pb de las reacciones de la PCR primaria con Gene Clean, y se usaron
conjuntamente en una reacción de la PCR con la siguiente pareja de
cebadores
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo: SIND310374F (tampón de 5
nt/emplazamiento de reconocimiento de HindIII/SIN nt
10374-10394):
5'-TATATAAGCTTGAGGCGTACGTCGAATTGTCAG
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso: pCDNA1575R (pCDNA3 nt
1575-1552):
5'-GAAAAACCGTCTATCAGGGCGATG
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación mediante la PCR de los
productos del amplicón de la PCR del cebador es con la pareja de
cebadores y las condiciones de la reacción de la amplificación que
se muestran anteriormente, y usando el siguiente protocolo de
amplificación de la PCR que se muestra a continuación.
Las 27 bases 3' terminales del producto amplicón
de la PCR primaria solapan con las 27 bases 5' terminales del
producto amplicón de la PCR primaria; los 1.976 pares de bases
resultantes que solapan el producto amplicón de la PCR secundaria
se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa/TBE al
0,8%, se digirieron con HindIII y DraIII, y el producto de 1,941 pb
se ligó en pcDNA3 digerido con HindIII y DraIII, y se trató con
CIAP. Se conoce esta construcción como pCDNAELVIS3'. La construcción
pCDNAELVIS3' se digirió con Bsi WI y PvuI y el fragmento de 5197 pb
resultante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa/TBE
al 0,8%, y se ligó con el fragmento de 11.398 pb aislado mediante
digestión de pVGELVIS con Bsi WI y PvuI, y tratamiento con CIAP,
seguido por electroforesis en gel de agarosa/TBE al 0,8% y Gene
Clean. La construcción resultante tiene 16.595 pb y se conoce como
pVGELVISHDVd13'.
Para ensayar la capacidad de los plásmidos
pVGELVISHDV y pVGELVISd13' de iniciar las características de
infección del virus Sindbis de tipo natural, se complejaron los
clones de ADN con Lipofectamina (GIBCO-BRL,
Gaithersburg, MD) de acuerdo con las condiciones sugeridas por el
suministrador (circa 5 \mug de ADN/8 mg de reactivo lípido) y se
añadieron a pocillos de 35 mm que contenían células
BHK-21 en una confluencia aproximadamente del 75%.
Si se observó CPE mediante este procedimiento, se puede usar 1 ml de
sobrenadante de la transfección para infectar monocapas de
BHK-21 frescas, o alternativamente, se puede
cuantificar el nivel de virus Sindbis en los sobrenadantes
directamente mediante el ensayo de placas.
En otras aplicaciones, es deseable situar el
promotor CMV contenido en el plásmido pCDNA3 próximo al ADNc
genómico de Sindbis, de tal manera que el inicio de la transcripción
in vivo corresponde al nucleótido vírico auténtico del
extremo 5'. El emplazamiento inicial del promotor CMV en el plásmido
pcDNA3 se determina mapeando el punto de inicio de la transcripción
in vitro. Esto se lleva a cabo digiriendo en primer lugar el
plásmido pcDNA3 con la endonucleasa de restricción DraIII (New
England Biolabs Inc., Beverly, MA) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. DraIII rompe el plásmido una vez en el nucleótido
1546 dando como resultado una molécula de ADN lineal con 5446 pares
de bases. Se purificó el ADN usando el kit Geneclean II (BIO 10 San
Diego, CA) exactamente como se establecía en las instrucciones.
pcDNA3 linealizado se transcribió con el Sistema de Transcripción
in vitro del Extracto Nuclear HeLa (Promega Corp., Madison,
WI) en una reacción que contenía 3 \mug de pcDNA3 linealizado,
400 \muM de cada ribonucleótido en MgCl_{2} 3 mM, y 8 unidades
de extracto nuclear celular HeLa. Los 25 \mul de la reacción se
incubaron durante una hora a 35ºC. Se añadieron una unidad de ADNsa
RQ1 (Promega Corp., Madison, WI) y 40 unidades de RNasin (Promega
Corp. Madison, WI) a la reacción y se incubaron a 37ºC durante 30
minutos para eliminar la plantilla de ADN. Se finalizó la reacción
mediante la adición de 175 \mul de Stop Mix (suministrado con el
extracto HeLa). Se extrajo la reacción con un volumen igual de
alcohol de fenolcloroformisoarnilo (25:24:1) seguido por una
extracción con alcohol de cloroformisoarnilo (24:1). Se precipitó
la reacción con 500 \mul de etanol absoluto. Se aglomeró el ARN
mediante centrifugación a 12.000 x G durante 15 minutos. El
aglomerado se enjuagó con etanol al 80% y se volvió a suspender en
20 \mul de agua.
Se marcó un cebador complementario para el
promotor SP6 (ATTTAGGTGACACTATAG, BRL Corp., Bethesda, MD) en el
extremo 5' con ^{32}P mezclando 10 pmol de cebador con un exceso
de dos veces de gamma ^{32}P ATP (ICN Corp. Irvine, CA), diez
unidades de Polinucleótido Quinasa T4 (Promega Corp., Madison, WI),
y Tampón Quinasa 1X (suministrado con la Quinasa T4). Se incubó la
reacción durante 30 minutos a 37ºC y a continuación durante 5
minutos a 95ºC.
El ARN transcrito in vitro se templó con
el cebador marcado mezclando 10 \mul del ARN con 1,5 pmol de
cebador. Se calentó la mezcla a 90ºC y se dejó enfriar lentamente.
Se llevó la mezcla a Tris-HCl 50 mM pH 8,3,
MgCl_{2} 10 mM, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, 40 mM de cada dNTP, y 15
unidades de Transcriptasa Inversa AMV (USB Corp., Cleveland, OH).
Se incubó la mezcla de reacción a 42ºC durante 30 minutos. Se
finalizó la reacción mediante la adición de un tercio del volumen
de Formamida al 95%, EDTA 20 mM, Azul de Bromofenol al 0,05%, y
Xileno Cianol FF al 0,05%.
Se secuenció el plásmido pcDNA3 usando el mismo
cebador marcado con ^{32}P descrito anteriormente, utilizando el
Sistema de Secuenciamiento del ADN fmol (Promega Corp., Madison, WI)
exactamente tal como se describe en las instrucciones. Las
reacciones de secuenciación se introdujeron en un gel de
desnaturalización al 6% adyacente a 2 \mul del cebador extendido
en la reacción in vitro del ARN. Se sometió a electroforesis
el gel durante una hora a 1600 V, se secó, y se expuso a la
película durante la noche. Se puede comparar la banda de ADNc de
longitud completa con las hileras de la secuencia de pcDNA3 para
determinar el emplazamiento de inicio de la transcripción. Usando
este procedimiento, se puede determinar que el emplazamiento de
inicio de la transcripción del promotor CMV es exactamente de 39
bases en la dirección 3' del promotor CMV en el resto G del
nucleótido número 858 (de acuerdo con la numeración del vector
pcDNA3 de Invitrogen).
A continuación se yuxtapuso el promotor CMV
procedente del plásmido pCDNA3 en el ADNc de Sindbis mediante la PCR
solapante, usando los procedimientos descritos anteriormente para la
construcción de pVGELVIS. Se puede determinar el punto preciso de
inicio de la transcripción de cualquier promotor de la ARN
polimerasa 11 mediante los procedimientos descritos anteriormente,
permitiendo la yuxtaposición apropiada del promotor en la
configuración ELVIS. El uso de promotores inducibles en la
configuración ELVIS permite el inicio de la infección en las líneas
celulares transfectadas que se van a controlar.
\vskip1.000000\baselineskip
La primera etapa en la construcción del vector
Sindbis básico es la generación de dos subclones plásmidos que
contienen elementos separados de los extremos 5' y 3' víricos que se
usan posteriormente para ensamblar el vector básico de transferencia
génica. El primer subclón plásmido contiene 40 nucleótidos
terminales en el extremo 3' vírico y una extensión de 25 bases de
nucleótidos dA:dT. El extremo 3' del vector se sintetizó
químicamente para tener la secuencia de la pareja de cebadores que
se muestra a continuación.
Cebador directo: SIN11664F: (secuencia
tampón/emplazamiento NotI/SIN nt
11664-11698):
5'-TATATGCGGCCGCTTTCTTTTATTAATCAACAAAATTTTGTTTTTAA
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso: SINXba11700R (secuencia
tampón/emplazamiento SacI dT25/SIN nt
11700-11692):
5'-TATATGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAATGTTAAAA
\vskip1.000000\baselineskip
Los anteriores oligonucleótidos se mezclaron
juntos a concentraciones molares iguales en presencia de MgCl_{2}
10 mM, se calentaron a 100ºC durante 5 min y se enfriaron lentamente
a temperatura ambiente. La molécula parcialmente de doble cadena se
rellenó a continuación usando ADN polimerasa Klenow y los dNTP 50
\muM. A continuación se digirió la molécula de 89 pb con NotI y
SacI, se purificó en un gel de NuSieve al 2%/agarosa al 1%, se ligó
en el plásmido pKS II+, se digirió con NotI y SacI, y se trató con
CIAP en un exceso molar 10:1 de la relación inserto:vector. La
construcción se conoce como pKSII3'SIN.
El segundo subclón plásmido contiene 7.643 pb 5'
que incluyen un promotor de la ARN polimerasa 5' de Sindbis. El
extremo 3' de este clon se derivó mediante amplificación mediante la
PCR con un cebador inverso que tenía la secuencia que se muestra a
continuación.
Cebador inverso: Primer: SINXho7643R
(secuencia tampón/emplazamiento XhoI/SIN nt
7643-7621):
5'TATATCTCGAGGGTGGTGTTGTAGTATTAGTCAG
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador inverso mapea los nucleótidos víricos
7643-762 y tiene 42 pb en la dirección 3' del
extremo 3' del elemento del núcleo de unión. Adicionalmente, el
nucleótido vírico 7643 tiene 4 nucleótidos en la dirección 5' del
punto de inicio de la traducción de las proteínas estructurales. Los
primeros cinco nucleótidos 5' en este cebador, que están seguidos
por 6 nucleótidos que comprenden la secuencia de reconocimiento de
XhoI, se incluyen para servir como "secuencia tampón" para la
digestión eficiente de los productos del amplicón de la PCR.
El cebador directo en esta reacción es el
cebador 2A (descrito en el Ejemplo 1) que tiene la siguiente
secuencia:
ATACTAGCCACGGCCGGTATC
\vskip1.000000\baselineskip
El producto amplicón de 4510 pb, resultante del
experimento de la PCR que usa los cebadores tal como se muestra
anteriormente con el plásmido pVGSP6GENrep, se digirió con las
enzimas SfiI y XhoI. El fragmento de 2526 pb resultante se purificó
en gel. El clon pVGSP6GENrep del ADNc de Sindbis se digirió con ApaI
y SfiI. El fragmento de 5144 pb se purificó en gel y se ligó junto
con el fragmento digerido de Sfi/XhoI de 2526 pb y los plásmidos
pKS II+ tratados con CIAP digerido con ApaI y XhoI. se aisló un clon
que tenía los nucleótidos I-7643 de Sindbis que
incluía el promotor de la ARN polimerasa en el extremo 5' contenido
en el plásmido pKSII+. Se conoce esta construcción como pKSII5'SIN.
Se llevó a cabo el ensamblaje del vector básico completo digiriendo
pKS5'SIN con XhoI y SacI, tratándolo con CIAP, y la purificación en
gel del fragmento grande de 10.533 pb. El fragmento pKS5'SIN de
10.533 pb se ligó junto con el fragmento pequeño de 168 pb
resultante de la digestión de pKSII3'SIN con XhoI y SacI. Se conoce
esta construcción como pKSSINBV, y se muestra esquemáticamente en la
Figura 4.
Se insertó el gen indicador de la luciferasa de
la luciérnaga en el vector Sindbis básico con el fin de demostrar la
expresión de un gen heterólogo en las células transfectadas con ARN
resultantes de la transcripción in vitro del clon del vector
Sindbis. Este experimento demuestra la funcionalidad total del
vector Sindbis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la construcción del vector
Sindbis luciferasa ensamblando conjuntamente los componentes de 3
plásmidos independientes pKSII5'SIN, pKSII3'SIN, y el vector pGL2
básico. El plásmido del vector pGL2 básico (Promega, Madison, WI)
contiene el gen completo de la luciferasa de luciérnaga. El gen de
la luciferasa se insertó en primer lugar en el plásmido pKSII3'SIN.
Esto se llevó a cabo mediante la purificación en gel del fragmento
que contenía los 2689 pb de la luciferasa resultante de la digestión
del vector pGL2 básico con BamHI e HindIII, y la ligadura del
fragmento grande de 3008 pb purificado en gel resultante de la
digestión con BamHI e HindII y el tratamiento con CIAP de
pKSII3'SIN. Se conoce esta construcción como
pKSII3'SIN-luc.
Se llevó a cabo el ensamblaje final del vector
Sindbis luciferasa digiriendo pKS5'SIN con XhoI y SacI, tratando
con CIAP, y la purificación en gel del fragmento grande de 10.533
pb. El fragmento de 10.533 pb de pKS5'SIN se ligó junto con el
fragmento pequeño de 2854 pb resultante de la digestión de
pKSII3'SIN-luc con XhoI y SacI. esta construcción
contiene la región de codificación del gen no estructural de Sindbis
completo y los elementos 3' víricos necesarios para la replicación
del genoma. El gen de la luciferasa de luciérnaga se colocó entre
estos dos elementos 5' y 3' víricos. Se conoce este vector como
pKSSINBVluc, y se muestra esquemáticamente en la Figura 4. Los
constructos SIN-BV entre FfiI y SacI se
intercambiaron en pGVELVIS entre los emplazamientos FfiI y XbaI. Se
observó la expresión de genes heterólogos tras la transfección en
células BHK.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de ensayar la funcionalidad del
vector Sindbis básico, se linealizó la expresión de la luciferasa
en células transfectadas con ARN transcrito in vitro, tal
como se describe en el Ejemplo 1, a partir de
pKSSINBV-luc mediante digestión con SacI. Además, se
construyó un vector de empaquetado complementario, que se eliminó
de la mayor parte de la región génica no estructural mediante
digestión de pVGSP6GENrep con Bsp EI y se ligó en condiciones de
dilución. Se conoce esta construcción como pVGSP6GENd1Bsp y está
eliminada de las secuencias génicas no estructurales entre las
bases 422-7.054. Este clon tiene 8.008 pb y se
muestra esquemáticamente en la Figura 5. La transcripción in
vitro de pVGSP6GENd1Bsp es tal como se describe en el Ejemplo
1; la linealización es con XbaI. Se ensayó la expresión de la
luciferasa en las células transfectadas en las 24 horas después de
la transfección. Se llevaron a cabo transfecciones y transfecciones
simultáneas complejando directamente los productos de la
transcripción in vitro con lipofectina
(Gibco-BRL, Gaithersberg, MD). Adicionalmente, se
usó 1 ml de sobrenadante para infectar una monocapa confluente de
células BHK y se ensayó la expresión de la luciferasa en las 24
horas después de la infección. En la Figura 6 se muestran los
resultados de este experimento. Los resultados demuestran claramente
la abundante expresión del gen indicador tras la transfección de
células BHK, y la transferencia (por ejemplo, empaquetado) de la
actividad de la expresión cuando las células se transfectan
simultáneamente con pVGSP6GENd1Bsp transcrito in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Con el fin de inactivar la región de unión,
se cambiaron los nucleótidos en el interior del término carboxi de
NSP4 y el solapamiento de la región de unión, y se finalizaron los
nucleótidos del vector que correspondían a Sindbis antes del punto
de inicio subgenómica en el nt 7598 de Sindbis. En la Figura 7, se
muestra esta construcción esquemáticamente.
De manera resumida, se amplificó un fragmento
mediante la PCR procedente del clon pKSSINBV en condiciones no
restrictivas del ciclo de reacción utilizando un cebador inverso que
tenía la siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
TATATGGGCCCTTAAGACCATCGGAGCGATGCTTTATTTCCCC
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las bases subrayadas en el cebador inverso
se refieren a cambios de nucleótidos en la región de unión sin que
afecten a los aminoácidos codificados (véase a continuación). Todos
los cambios de nucleótidos son transversiones.
Extremo 3' de NSP 5 (nt víricos
7580-7597).
\vskip1.000000\baselineskip
TCT CTA CGG TGG TCC TAA
(que dan como resultados cambios de
nucleótidos en el cebador
inverso)
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador inverso es complementario con los nt
7597-7566 de Sindbis (excepto en los nucleótidos,
tal como se muestra, en los que se hicieron cambios en la región de
unión), e incluye en su extremo 5' la secuencia de reconocimiento de
ApaI en el nucleótido 6 a la que sigue una "secuencia tampón"
de la cola TATAT 5' terminal para la digestión eficiente de la
enzima.
El cebador directo en esta reacción es el
cebador 2A (descrito en el Ejemplo 1), que tiene la siguiente
secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
ATACTAGCCACGGCCGGTATC
\vskip1.000000\baselineskip
El amplicón de 4.464 pb resultante de una
reacción de la PCR con pKSSfNBV usando la pareja de cebadores
descrita anteriormente se digirió con SfiI y ApaI y el fragmento de
2.480 pb purificado en gel se ligó junto con el fragmento de 5.142
pb purificado en gel resultante de la digestión de pKSSINBV con ApaI
y SfiI, y con el fragmento de 2.961 pb purificado en gel resultante
de la digestión de pKSII+ con ApaI y del tratamiento con CIAP. Esta
construcción, comprendida por los nucleótidos 1-7597
de Sindbis, que incluye los cambios en la región de unión descrita
anteriormente, y que incluye el promotor T7 bacteriano unido al nt.
1 de Sindbis se denomina como pKS5'SINdIJR.
La construcción final del vector de la región de
unión inactivada se llevó a cabo mediante ligadura del fragmento
grande de 7.622 pb de Sindbis resultante de la digestión de
pKS5'SINdIJR con ApaI, con el fragmento de 3.038 pb resultante de la
digestión con ApaI y tratamiento con CIAP de pKSII3'SIN. Se confirmó
la orientación positiva del elemento 5' de Sindbis, con respecto al
elemento 3' de Sindbis mediante el análisis de la endonucleasa de
restricción. Esta construcción se denomina como pKSSINBVdIJR.
No se puede producir el inicio y la síntesis de
ARNm subgenómico a partir del vector pKSSINBVdIJR. Con el fin de
probar esta suposición, se llevaron a cabo ensayos comparativos de
protección de la RNasa en los vectores pKSSINBV y pKSSINBVdIJR.
Se usó una sonda de ARN marcada en el extremo
con ^{32}P complementaria en parte con la región de unión, que
incluía el punto de inicio del ARN subgenómico en el nt vírico 7.589
para hibridar con el ARN vírico resultante de la transfección de
células BHK-21 con los vectores pKSSINBV y
pKSSINBVdIJR. El ensayo de protección de la RNasa demuestra que las
células transfectadas con pKSSINBV tienen dos fragmentos, de
especificidad genómica y subgenómica, mientras que las células
transfectadas con pKSSINBVdIJR tienen sólo un fragmento único de
especificidad genómica. Estos resultados prueban que la región de
unión en el vector pKSSINBVdIJR esta así mismo inactivada.
2. Con el fin de ensayar esta traducción del ARN
genómico de la región que corresponde al ARN mensajero subgenómico,
se insertó el gen indicador de la luciferasa en la región de unión
inactivada del vector pKSSINBVdIJR descrito anteriormente. Se llevó
a cabo esta construcción digiriendo con XhoI y SacI y tratando con
CIAP el plásmido pKSSINBVdIJR y purificando en gel el fragmento 10
de 197 pb resultante. El fragmento pKSSINBVdIJR se ligó junto con
el fragmento pequeño de 2854 pb resultante de la digestión de
pKSII3'SIN-luc con XhoI y SacI. esta construcción
contiene la región de codificación completa del gen no estructural
de Sindbis que termina en una región de unión inactivada en el nt
7597 de Sindbis, y los elementos 3' víricos necesarios para la
replicación del genoma; se colocó el gen de la luciferasa de
luciérnaga entre estos dos elementos 5' y 3' víricos. Se conoce este
vector como pKSSINBVdIJR-luc.
Se ensayó la expresión del gen indicador
procedente del vector pKSSINBVdIJR-luc en células
BHK-21 transfectadas. Se determinó la traducción de
la proteína de la luciferasa funcional mediante el ensayo
luminiscente de la luciferina, usando un luminómetro para la
detección. La sensibilidad en este ensayo es de 1 x
10-20 moles de luciferasa. Dado que el peso
molecular de la luciferasa es de 62.000 daltons, este límite de
detección transforma a 6.020 moléculas. De esta manera, en un
experimento típico si sólo un 0,6% de las 1 x 10^{6} células
contenidas en una placa petri a 60 mM se transfectan con el vector
pKSSINBVdIJR-luc, y si estas células transfectadas
expresan únicamente una molécula funcional única de luciferasa, la
actividad enzimática es detectada por el ensayo usado. Es
importante demostrar en este experimento que la región de unión del
vector pKSSINBVdIJR-luc está inactivada. Esto se
llevó a cabo mediante un ensayo de protección de la RNasa,
comparando los ARN víricos sintetizados en las células
transfectadas con los vectores pKSSINBVdIJR-luc y el
pKSSINBV-luc, usando la sonda descrita
anteriormente.
3. Se sintetizó la pareja de oligonucleótidos
del núcleo mínimo de la región de unión -19->+5, comprendida por
los nt. 7579-7602 de Sindbis, tal como se ha
definido anteriormente (Levis y col., J. Virol. 64:
1726-1733, 1990), y se flanqueó con las secuencias
de reconocimiento de ApaI y XhoI tal como se muestra:
oligonucleótido 1:
CATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTC
\vskip1.000000\baselineskip
oligonucleótido 2:
TCGAGACTATTTAGGACCACCGTAGAGATGGGCC
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos anteriores se mezclaron
conjuntamente en presencia de Mg^{2+} 10 mM, se calentaron a
100ºC durante 5 min. y se enfriaron lentamente a temperatura
ambiente, los oligonucleótidos templados se ligaron en una relación
molar 25:1 para insertarlos al vector pKSSINBVdIJR, se prepararon de
acuerdo con esto: digestión completa con XhoI, seguida por
digestión con ApaI en condiciones parciales, dando como resultado
una rotura por molécula inducida por ApaI (o dos roturas posibles)
purificación en gel del fragmento de 10.655 pb, y tratamiento con
CIAP. Este vector que contiene la región de codificación de NSP
completa que termina en un núcleo de la región de unión inactivada,
unido al núcleo de la región de unión sintética y seguido por los
elemento 3' víricos necesarios para la replicación, y contenido en
el plásmido pKSII+, se conoce como pKSSINdIJRsjrc.
Con el fin de regular el nivel de síntesis de
ARNm subgenómico, se llevaron a cabo modificaciones adicionales del
núcleo de la región de unión sintética insertada en tándem en el
plásmido pKSSINdIJRsjrc. Estas modificaciones del núcleo de la
región de unión se llevaron a cabo mediante dos soluciones; cambios
de nucleótidos en el interior del núcleo de la región de unión, o
extensión en los términos 5' y 3' del núcleo de la región de unión
de los nucleótidos que flanquean Sindbis, de acuerdo con la
secuencia vírica auténtica. Se muestra a continuación el núcleo
mínimo de la región de unión, que se extiende desde los nt. víricos
7579-7602:
ATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGT
\vskip1.000000\baselineskip
Comparando la secuencia genómica entre ocho
alfavirus, se ha demostrado anteriormente que existe diversidad de
la secuencia en el interior del núcleo de la región de unión. Lo que
se muestra a continuación, para localizaciones concretas de la
región de unión, es el nucleótido de Sindbis seguido por el
nucleótido correspondiente en otros alfavirus.
(Continuación)
Los cambios en la región de unión de los nt.
7579, 7580, 7581, 7583, 7589, 7590, 7591, 7592, de Sindbis, dan como
resultado cambios potenciales en la codificación de los aminoácidos
en interior de los 5 codones del término carboxi de NSP 4 que solapa
en la región de unión.
Estos cambios observados en la región de unión
entre los alfavirus al nivel de la codificación potencial de NSP 4 y
al nivel de la actividad cis de la región de unión pueden
representar cualquiera, o ambos, de cambios permitidos en NSP 4 y la
región de unión que no afectan la funcionalidad, o por otra parte,
virus simplemente diferentes. En cualquier episodio, los cambios en
la región de unión presentados en el presente documento son con
respecto al núcleo de la región de unión insertada en tándem, a
partir de los cuales no se produce la síntesis de la proteína NSP.
Descrita anteriormente, se produce la traducción de la región de NSP
completa procedente del constructo pKSSINBVdIJR. Los cambios en la
región de unión en los nt. 7600 y 7602 de Sindbis son en la
dirección 3' del codón de terminación de NSP 4 y en la dirección 5'
del codón de inicio de las proteínas estructurales.
Las localizaciones de las diferencias de
nucleótidos en el interior del núcleo de la región de unión
observadas entre diversas cepas de alfavirus se denominan aquí como
cambios permitidos. Las localizaciones de nucleótidos en el interior
del núcleo de la región de unión que corresponden a las secuencias
conservadas entre las diversas cepas de alfavirus se denominan aquí
como cambio no permitidos.
Para disminuir el nivel de inicio del ARNm
subgenómico procedente del núcleo de la región de unión sintética,
los cambios se llevan a cabo separadamente en el interior de los
nucleótidos que corresponden a cambios permitidos, y en el interior
de los nucleótidos que corresponden a cambios no permitidos. Se
facilitan en la tabla anterior los nucleótidos de la región de unión
que corresponden a los cambios permitidos. Se facilitan a
continuación catorce nucleótidos de la región de unión para los
cuales no se observaron cambios entre los ocho alfavirus
secuenciados (virus del Bosque Semliki, virus Middleburg, virus Ross
River, virus O'Nyong Nyong, virus de la Encefalitis Equina Oriental,
virus de la Encefalitis Equina Occidental, y virus de la Encefalitis
Equina de Venezuela):
Los cambios en el interior de la región de unión
observados entre los alfavirus pueden reflejar una interacción
específica entre una ARN polimerasa vírica dada y su región de unión
análoga. De esta manera, los cambios entre los nucleótidos
"permitidos" pueden dar como resultado una marcada disminución
el los niveles de síntesis de ARNm subgenómico como cambios entre
nucleótidos "no permitidos" de la región de unión. Por otra
parte, estos pueden ser por tanto emplazamientos de cambios
permitidos en el interior del núcleo de la región de unión.
El cambio no permitido auténtico único en el
interior del núcleo de la región de unión es probablemente en el nt.
7598 de Sindbis, que corresponde al punto de inicio del ARNm
subgenómico. No se describen aquí los cambios de este nucleótido en
el núcleo de la región de unión insertada en tándem del plásmido
pKSSINdIJRsjrc.
La sustitución de los nucleótidos permitidos in
toto en el núcleo mínimo de la región de unión -19->+5 sintética,
se llevaron a cabo con la siguiente pareja de oligonucleótidos,
sintetizada in vitro, y flanqueda con las secuencias de
reconocimiento de ApaI y XhoI, tal como se muestra:
oligonucleótido 1:
CCCTTGTACGGCTAACCTAAAGGAC
\vskip1.000000\baselineskip
oligonucleótido 2:
TCGAGTCCTTTAGGTTAGCCGTACAAGGGGGCC
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos anteriores se mezclaron
conjuntamente en presencia de Mg mM, se calentaron a 100ºC durante 5
min, y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente. Los
oligonucleótidos templados se ligaron en una relación molar 25: 1
para insertar al vector pKSSINBVdIJR, preparado de acuerdo con esto:
digestión completa con XhoI seguida por digestión con Apa en
condiciones parciales, dando como resultado una rotura por molécula
inducida por ApaI (de dos roturas posibles), purificación en gel del
fragmento de 10.655 pb, y tratamiento con CIAP. Se conoce este
vector como pKSSINdIJRsjrPc.
Cada uno de los 13 (nt. 7598 no cambiado)
nucleótidos no permitidos en el núcleo de la región de unión están
intercambiados individualmente, usando las siguientes reglas, dando
como resultado una sustitución transversional más drástica.
A -> C
T -> G
G -> T
C -> A
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, el nt. 7582 está cambiado de T
-> G, usando la siguiente pareja de oligonucleótidos,
sintetizados in vitro, y flanqueada con las secuencia de
reconocimiento de ApaI y XhoI tal como se muestra:
oligonucleótido 1
CATCGCTACGGTGGTCCTAAATAGTC
\vskip1.000000\baselineskip
oligonucleótido 2
TCGAGACTATTTAGGACCACCGTAGCGATGGGCC
\vskip1.000000\baselineskip
(Los nucleótidos que efectúan la transversión en
los emplazamientos no permitidos de la región de unión se muestran
en negrita).
Los oligonucleótidos anteriores se mezclaron
conjuntamente en presencia de Mg^{2+} 10 mM, se calentaron a 100ºC
durante 5 min. y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente. Los
oligonucleótidos templados se ligaron en una relación molar 25:1
para insertar el vector pKSSINBVdIJR, preparado de acuerdo con esto:
digestión completa con XhoI, seguida por digestión con Apa 1 en
condiciones parciales, dando como resultado una rotura por molécula
inducida por ApaI (de dos roturas posibles), purificación en gel del
fragmento de 10.655 pb, y tratamiento con CIAP. Se conoce este
vector como pKSSINdIJRsjrNP7582.
\newpage
Usando las reglas de cambio de la transversión
que se muestran anteriormente, se llevaron a cabo cambios en cada
uno de los 12 emplazamientos no permitidos restantes en el núcleo de
la región de unión con 12 parejas de oligonucleótidos diferentes,
flanquedas con las secuencias de reconocimiento de ApaI y XhoI, tal
como se describe anteriormente. Se conocen estos vectores como:
pKSSINdIJRsjrNP7584
pKSSINdIJRsjrNP7585
pKSSINdIJRsjrNP7586
pKSSINdIJRsjrNP7587
pKSSINdIJRsjrNP7588
pKSSINdIJRsjrNP7593
pKSSINdIJRsjrNP7594
pKSSINdIJRsjrNP7595
pKSSINdIJRsjrNP7596
pKSSINdIJRsjrNP7597
pKSSINdIJRsjrNP7599
pKSSINdIJRsjrNP7601
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de ensayar los niveles relativos de
síntesis de ARNm subgenómico, se insertó el gen indicador de la
luciferasa en los vectores en tándem modificados de la región de
unión. Se llevó a cabo esta construcción digiriendo con XhoI y SacI
y tratando co CIAP los vectores insertados en tándem del núcleo de
la región de unión sintética y purificando en gel el fragmento de
aproximadamente 10.200 pb resultante. Este fragmento de vector
tratado de esta manera se ligó conjuntamente con el fragmento
pequeño de 2854 pb resultante de la digestión de
pKSII3'SIN-luc con XhoI y SacI. Estas construcciones
contienen el gen completo no estructural de Sindbis que codifica la
región que finaliza en una región de unión inactivada en el nt. 7597
de Sindbis, el núcleo de la región de unión sintética insertado en
tándem (modificado o no modificado), el gen de la luciferasa de
luciérnaga, y los elementos 3' víricos necesarios para la
replicación del genoma. Siguen los nombres de estos vectores:
Suponiendo que las eficiencias de la traducción
sean equivalentes en todos los vectores de la luciferasa que se
muestra inmediatamente antes, se determinaron los niveles relativos
de síntesis subgenómica comparando los niveles de producción de
luciferasa a las 16 h. después de la transfección de las células
BHK-21. Los niveles relativos de transcripción
subgenómica se determinaron comparando la producción de luciferasa
por los vectores pKSSINBV-luc y
pKSSINdIJRsjrc-luc con todos los vectores de la
luciferasa de la región de unión modificada que se muestran
anteriormente.
Se espera que los vectores que contiene el
núcleo de la región de unión sintética insertado en tándem
(pKSSINdIJRsjrc, y sus derivados) tendrán un nivel bajo de
expresión del ARNm subgenómico, con respecto al constructo pKSSINBV.
En algunas formas de realización, puede ser necesario aumentar el
nivel de expresión del ARNm subgenómico observado procedente del
vector pKSSINdIJRsjrc vector. Esto se llevó a cabo en los términos
5' y 3' del núcleo de la región de unión sintética con 11
nucleótidos adicionales que flanquean Sindbis, de acuerdo con la
secuencia vírica auténtica.
La pareja de oligonucleótidos sintéticos que se
muestra a continuación se sintetizó in vitro y contiene los
46 nt de Sindbis, que incluyen los 24 nt. del núcleo mínimo de la
región de unión. Los nt. de Sindbis están flanqueados con las
secuencias de reconocimiento ApaI y XhoI tal como se muestra:
\vskip1.000000\baselineskip
oligonucleótido 1
CGGAAATAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTCAGCATAGT
\vskip1.000000\baselineskip
oligonucleótido 2
TCGAGGTACTATGCTGACTATTTAGGACCACCGTAGAGATGCTTTA
TTTC-CGGGC
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos anteriores se mezclaron
conjuntamente en presencia de Mg 10 mM, s calentaron a 100ºC
durante 5 min. y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente, Los
oligonucleótidos templados se ligaron en una relación molar 25:1
para insertar el vector pKSSINBVdIJR, preparado de acuerdo con esto:
digestión completa con XhoI, seguida por digestión con ApaI en
condiciones parciales, dando como resultado una rotura por molécula
inducida por ApaI (de dos roturas posibles), purificación en gel del
fragmento de 10.655 pb, y tratamiento con CIAP. Este vector que
contiene la región de codificación de NSP completa que termina en
un núcleo de la región de unión inactivada, unido a una región de
unión sintética extendida, y seguido por los elementos 3' víricos
necesarios para la replicación, y contenida en el plásmido pKSII+,
se conoce como pKSSINdIJRsexjr.
Con el fin de ensayar los niveles relativos de
síntesis de ARNm subgenómico, se insertó el gen indicador de la
luciferasa en el vector pKSSINdIJRsexjr de la región de unión en
tándem extendida. Se llevó a cabo esta construcción digiriendo con
XhoI y SacI y tratando con CIAP el plásmido pKSSINdIJRsexjr y
purificando en gel el fragmento de aproximadamente10.2000 pb
resultante. El fragmento de vector tratado de esta manera se ligó
conjuntamente con el fragmento pequeño de 2854 pb resultante de la
digestión de pKSII3'SIN-luc con XhoI y SacI. Esta
construcción contiene la región de codificación del gen no
estructural de Sindbis completo que termina en una región de unión
inactivada en el nt. 7597 de Sindbis, la región de unión sintética
extendida insertada en tándem, el gen de la luciferasa de
luciérnaga, y los elementos 3' víricos necesarios para la
replicación del genoma. El nombre de este vector es
pKSSINd-IJRsexjr-luc.
Se determinaron los niveles relativos de
transcripción subgenómica comparando la producción de luciferasa por
el vector pKSSINdIJRsexjr-luc con los vectores
pKSSINBV-luc y
pKSSINdIJRsjrc-luc.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de inhibir la respuesta CTL dirigida
del huésped contra las proteínas específicas víricas expresadas en
las células infectadas con el vector en aplicaciones en las que se
desea la administración repetida del agente terapéutico, se clonó el
Adenovirus de tipo 2 (Ad 2) gen E3/19K ATCC Nº
VR-846 en el plásmido pKSSINdIJRsjrc, inmediatamente
en la dirección 3' del núcleo de la región de unión.
De manera resumida, Ad 2 se propagó en una línea
celular permitida, por ejemplo, células HeLa o Vero, y tras la
evidencia de efectos citopatológicos, se purificaron los viriones
del lisado celular, y se purificó el ADN de Ad 2 procedente del
virus.
El gen E3/19K del ADN de Ad 2, que incluye la
secuencia amino terminal de la señal, seguido por la región
intraluminal y la cola citoplásmica carboxiterminal que permite a la
proteína E3 19K embeberse por sí misma en el retículo endoplásmico,
se localizó entre los nucleótidos víricos 28.812 y 29.288. El
aislamiento del gen E3 19K de Ad2 procedente del ADN genómico vírico
se llevó a cabo mediante amplificación mediante la PCR, con la
pareja de cebadores que se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo Ad 2 E3 (nucleótidos
28.812-28.835 de Ad 2):
5'-TAT ATC TCC AGA TGA GGT ACA TGA TTT TAG GCT TG-3' | (SEC DE ID Nº. 14) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso Ad 2 E3 (nucleótidos
29.241-29.213 de Ad 2):
5'-TAT ATA TCG ATT CAA GGC ATT TTC TTT TCA TCA ATA AAA C-3' | (SEC DE ID Nº. 15) |
\vskip1.000000\baselineskip
Además de la secuencia complementaria de Ad 2,
ambos cebadores contienen una "secuencia tampón" de cinco
nucleótidos en sus extremos 5' para la digestión eficiente de la
enzima de los productos del amplicón de la PCR. Ésta secuencia en el
cebador directo está seguida por el emplazamiento de reconocimiento
de XhoI, y en el cebador inverso ésta secuencia está seguida por el
emplazamiento de reconocimiento ClaI. De esta manera, en la
dirección 5' a 3', el gen E3/19k está flanqueado por los
emplazamientos de reconocimiento de XhoI y ClaI. Se llevó a cabo la
amplificación del gen E3/19K del ADN de Ad 2 con el siguiente
protocolo de ciclo de la PCR.
Tras la amplificación, se purificó el amplicón
de 451 pb sobre un gel de agarosa al 1,5%, y se digirió
posteriormente con las enzimas XhoI y ClaI y se ligó en el plásmido
pKSSINdIJRsjrc tratado con CIAP, digerido previamente con XhoI y
ClaI, Este clon se designó pKSSINdIJRsjrcAdE3. Usando la misma
estrategia de clonación, el gen E3/19K de Ad 2 se insertó en todos
los vectores de la región de unión sintética modificada descritos en
el Ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de inhibir la respuesta CTL dirigida
del huésped contra las proteínas específicas víricas expresadas en
las célula infectadas con el vector en aplicaciones en las que se
desea la administración repetida del agente terapéutico, se clonó el
gen H301 de citomegalovirus (HCMV) en el plásmido pKSSINdIJRsjrc,
inmediatamente en la dirección 3' del núcleo de la región de
unión.
De manera resumida, la cepa AD 169 de HCMV (ATCC
No. VR-538), se propagó en una línea celular
permitida, por ejemplo, fibroblastos primarios de prepucio humano
(HFF) (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), y tras la evidencia de efectos
citopatológicos, se purificaron los viriones procedentes del lisado
celular, y se purificó posteriormente el ADN de HCMV procedente de
los viriones.
El gen H301 de HCMV se localizó entre los
nucleótidos víricos 26.637 y 24.742. Se llevó a cabo el aislamiento
del gen H301 de HCMV a partir del ADN genómico mediante la
amplificación mediante la PCR, con la pareja de cebadores que se
muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso HCMV H301 (secuencia
tampón/emplazamiento de XhoI/nucleótidos
23.637-23.660 de HCMV):
5'-TAT ATC TCC AGA TGA TGA CAA TGT GGT GTC TGA CG-3' | (SEC DE ID Nº. 16) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso HCMV H301 (secuencia
tampón/emplazamiento de ClaI/nucleótidos
24.744-24.722 de HCMV):
5'-TAT ATA TCG ATT CAT GAC GAC CGG ACC TTG CG-3' | (SEC DE ID Nº. 17) |
\vskip1.000000\baselineskip
Además de las secuencias complementarias del gen
H301 de HCMV, ambos cebadores contienen una "secuencia tampón"
de cinco nucleótidos en sus extremos 5' par la digestión eficiente
de la enzima de los productos del amplicón de la PCR. Esta secuencia
en el cebador directo estás seguidas por el emplazamiento de
reconocimiento de XhoI, y en el cebador inverso ésta secuencia está
seguida por el emplazamiento de reconocimiento de ClaI. De esta
manera, en la dirección 5' a 3', el gen H301 de HCMV está flanqueado
por los emplazamientos de reconocimiento de XhoI y ClaI. Se llevó a
cabo la amplificación del gen H301 de HCMV a partir del ADN de HCMV
con el siguiente protocolo de ciclo de la PCR:
Tras la amplificación, se purificó el producto
amplicón de 1.129 pb sobre un gel de agarosa al 1,0%, y se digirió
posteriormente con las enzimas de XhoI y ClaI y se ligó en el
plásmido pKSSINdIJRsjrc tratado con CIAP, digerido previamente con
XhoI y ClaI. Se designó este clon como pKSSINdIJRsjrcH301. Usando la
misma estrategia de clonación, el gen H301 de HCMV se insertó en
todos los vectores de la región de unión sintética modificada
descritos en el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pBS-ECAT (Jang y
col., J. Virol 63:1651, 1989) incluye la región 5' no traducida del
virus de la Encefalomiocarditis (EMCV) de los nt
260-848 del genoma vírico, que contienen el
emplazamiento interno de entrada al ribosoma (IRES). Los
nucleótidos 260-827 de EMCV se amplificaron a partir
de pBS-ECAT mediante la PCR, usando la siguiente
pareja de cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo A EMCV IRES (para inserción
próxima a la región de unión inactivada en el vector pKSSINBVdIJR en
el emplazamiento de ApaI):
5'-TAT ATG GGC CCC CCC CCC CCC CCC AAC G-3' | (SEC DE ID Nº. 18) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso EMCV IRES (Que se va a usar con
cualquier cebador A o B):
5'-TAT ATC CAT GGC TTA CAA TCG TGG TTT TCA AAG G-3' | (SEC DE ID Nº. 20) |
\vskip1.000000\baselineskip
El amplicón resultante de la amplificación con
el cebador directo A y el cebador inverso está flanqueado por los
emplazamientos de reconocimiento de ApaI y NcoI, en el interior de
una "secuencia tampón" de 5 pb.
El amplicón resultante de la amplificación con
el cebador directo B y el cebador inverso está flanqueado por los
emplazamientos de reconocimiento de ClaI y NcoI, en el interior de
la "secuencia tampón" de 5 pb.
\newpage
Se llevó a cabo la amplificación de la secuencia
IRES DE EMCV procedente del plásmido pBS-ECAT con el
siguiente protocolo de ciclo de la PCR:
Para la inserción en el vector pKSSINBVdIJR, el
amplicón de 589 pb se digirió con ApaI y NcoI, se purificó sobre un
gel de agarosa al 1%, y se ligó en el vector tratado con CIAP
diferido con ApaI y NcoI. El ATG correspondiente al codón de inicio
del gen heterólogo que se va a insertar inmediatamente en la
dirección 3' del inserto de IRES DE EMCV está modificado para
contener un emplazamiento de NcoI (CCATGG).
Para la inserción en los vectores pKSSINBV o
pKSSrNBVdIJRsjrc entre los genes heterólogos, se digirió el amplicón
de 589 pb con ClaI y NcoI, se purificó sobre un gel de agarosa al
1%, y se ligó en el vector del gen heterólogo bicistrónico digerido
con ClaI y NcoI y se trató con CIAP. En una configuración del gen
heterólogo bicistrónico, el extremo 3' del gen heterólogo en la
dirección 5' está modificado para finalizar en un emplazamiento de
reconocimiento de ClaI. El ATG correspondiente al codón de inicio
del segundo gen heterólogo en la dirección 3' que se va a insertar
inmediatamente en la dirección 3' del inserto de IRES DE EMCV está
modificado para contener un emplazamiento de NcoI (CCATGG). De esta
manera, de 5' a 3', el orden de los componentes es pKSSINBV o
pKSSINBVdIJRsjrc- gen nº 1- Cla/Nco gen EMCV IRES nº
2-3' SIN. La inserción en todos los vectores de la
región de unión modificada descritos en el Ejemplo 2 siguen la
estrategia dada aquí para los vectores pKSSINBV o
pKSSINBVdIJRsjrc.
El vector pKSSINBVdIJR que contiene una
configuración heteróloga bicistrónica está construido con cada uno
de los amplicones IRES de EMCV descritos anteriormente. El primer
amplicón IRES de EMCV está flanqueado por los emplazamientos de
ApaI y de Nco y se inserta inmediatamente en la dirección 3' de la
región de unión inactivada en el emplazamiento de APAI, tal como se
describe anteriormente. Esta secuencia IRES DE EMCV está seguida
por el primer gen heterólogo, que termina en un emplazamiento de
reconocimiento de ClaI. El primer gen heterólogo está seguido por
la segunda secuencia IRES de EMCV, que usa el amplicón flanqueado
por los emplazamientos de reconocimiento de ClaI y de NcoI. El
segundo gen heterólogo sigue a la segunda secuencia IRES de EMVC.
De esta manera, de 5' a 3', el orden de los componentes es
SINBVdIJR-Apa/Nco gen EMCV IRES Nº
1-Cla/Nco EMCV IRES Nº 2-3' SIN.
El plásmido pP2-5' (Pelletier y
col., Mol. Cell Biol. 8: 1103. 1988) incluye la región 5' no
traducida de la de cepa P2/Lansing de poliovirus procedente de los
nucleótidos 1-1.872 del genoma vírico, que contiene
el IRES de polio. Los nucleótidos 320-631 de
poliovirus se amplificaron a partir de pP2-5'
mediante la PCR, usando la siguiente pareja de cebadores:
Cebador directo A Polio IRES (Para la inserción
próxima a la región de unión inactivada en el vector pKSSINBVdIJR en
el emplazamiento de ApaI):
5'-TAT ATG GGC CCT CGA TGA GTC TGG ACG TTC CTC-3' | (SEC DE ID Nº. 21) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo B Polio IRES (Para la inserción
entre los genes heterólogos que finalizan con los emplazamientos de
ClaI y que se inician con los emplazamientos de NcoI):
5'-TAT ATA TCG ATT CGA TGA GTC TGG ACG TTC CTC-3' | (SEC DE ID Nº. 22) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso Polio IRES (Que se va a usar con
cualquiera de los cebadores A o B):
5'-TAT ATC CAT GGA TCC AAT TTG CTT TAT GAT AAC AAT C-3' | (SEC DE ID Nº. 23) |
\vskip1.000000\baselineskip
El amplicón resultante de la PCR con el Cebador
inverso A Polio IRES/pareja de cebadores inversos que se muestra
anteriormente está flanqueado por los emplazamientos de
reconocimiento de ApaI y de NcoI, en el interior de una "secuencia
tampón" de 5 pb.
El amplicón resultante de la PCR con el cebador
directo B Polio IRES/pareja de cebadores inversos que se muestra
anteriormente está flanqueado por los emplazamientos de
reconocimiento de ClaI y de NcoI, en el interior de una "secuencia
tampón" de 5 pb.
Se llevó a cabo la amplificación de la secuencia
polio IRES a partir del plásmido pP2-5' con el
protocolo de la PCR que se muestra en el Ejemplo 5:
Para la inserción en el vector pKSSINBVdIJR, se
digirió el amplicón de 333 pb con ApaI y NcoI, se purificó sobre un
gel de agarosa al 1,5%, y se ligó en el vector digerido con ApaI y
NcoI y se trató con CIAP. El ATG correspondiente al codón de inicio
del gen heterólogo que se va a insertar inmediatamente en la
dirección 3' del inserto polio IRES está modificado para contener
el emplazamiento de NcoI (CCATGG).
Para la inserción en los vectores pKSSINBV o
pKSSINBVdIJRsjrc entre los genes heterólogos, se digirió el amplicón
de 333 pb con ClaI y NcoI purificado sobre un gel de agarosa al
1,5%, y se ligó en el vector del gen heterólogo bicistrónico
digerido con ClaI y NcoI y se trató con CIAP. En una configuración
del gen heterólogo bicistrónico, el extremo 3' del gen heterólogo
en la dirección 5' está modificado para finalizar en un
emplazamiento de reconocimiento de ClaI. El ATG correspondiente al
codón de inicio del segundo gen heterólogo en la dirección 3' que
se va a insertar inmediatamente en la dirección 3' del inserto polio
IRES está modificado para contener un emplazamiento de NcoI
(CCATGG). De esta manera, de 5' a 3', el orden de los componentes es
pKSSINBV o pKSSINBVdIJRsjrc- gen nº 1- Cla/Nco gen polio IRES nº
2-3' SIN. La inserción en todos los vectores de la
región de unión modificada descritos en el Ejemplo 3 sigue la
estrategia proporcionada aquí para los vectores pKSSINBV o
pKSSINBVdIJRsjrc.
El vector pKSSINBVdIJR que contiene una
configuración heteróloga bicistrónica está construido con cada uno
de los amplicones polio IRES descritos anteriormente. El primer
amplicón polio IRES está flanqueado por los emplazamientos de ApaI
y de NcoI y se inserta inmediatamente en la dirección 3' de la
región de unión inactivada en el emplazamiento de ApaI, tal como se
describe anteriormente. El primer gen heterólogo está seguido por
la segunda secuencia polio IRES, que usa el amplicón flanqueado por
los emplazamientos de reconocimiento de ClaI y NcoI. El segundo gen
heterólogo sigue a la segunda secuencia polio IRES. De esta manera,
de 5' a 3', el orden de los componentes es: SINBVdIJRApa/Nco gen
polio IRES nº 1-Cla/Nco EMCV IRES nº
2-3' SIN.
El ADNc de BiP de 220 pb, correspondiente a la
región 5' líder del ARNm de la proteína de unión de cadena pesada
de la inmunoglobulina humana, está amplificado a partir del clon
pGEM5ZBiP5', usando la PCR. Se determinó la secuencia
correspondiente al ADNc de BiP originalmente en el clon del
bacteriófago lambda hu28-1 del gen GRP78 humano
(Ting y Lee, DNA 7: 275-286, 1988). El cebador
directo que se va a usar en la reacción de la PCR varía,
dependiendo del vector Sindbis en el que se inserta el ADNc de BiP.
El cebador inverso de la reacción de la PCR es el mismo para todos
los vectores Sindbis. La amplificación de la secuencia de ADNc de
BiP procedente del plásmido pGEM5ZBiP5' para la inserción en el
vector pKSSINBVdIJR de Sindbis inmediatamente en la dirección 3' de
la región de unión inactivada, se llevó a cabo mediante la
amplificación con el siguiente cebador directo:
5'-TAT ATG GGC CCG GTC GAC GCC GGC CAA GAC-3' | (SEC DE ID Nº. 24) |
\vskip1.000000\baselineskip
En adición a las secuencias complementarias del
ADNc de BiP, comenzando en el nucleótido 12, el cebador contiene una
"secuencia tampón" de cinco nucleótidos en su extremo 5' para
la digestión eficiente de la enzima de los productos del amplicón de
la PCR. Esta secuencia está seguida por el emplazamiento de
reconocimiento de ApaI.
Se llevó a cabo la amplificación de la secuencia
del ADNc de BiP procedente del plásmido pGEM5ZBiP5 para la inserción
en los vectores Sindbis pKSSINBV, o pKSSrNBVdIJRsjrc, mediante la
amplificación con el siguiente cebador directo que se muestra a
continuación. Para estos vectores, el ADNc de Bip se inserta entre
dos genes heterólogos, que se colocan en la región correspondiente a
los genes estructurales de Sindbis.
5'-TAT ATA TCG ATG GTC GAC GCC GGC CAA GAC-3' | (SEC DE ID Nº. 25) |
\vskip1.000000\baselineskip
En adición a las secuencias complementarias del
ADNc de BiP, comenzando en el nucleótido 12, el cebador contiene una
"secuencia tampón" de cinco nucleótidos en su extremo 5' para
la digestión eficiente de la enzima de los productos del amplicón de
la PCR.
El cebador inverso para la amplificación de la
secuencia de ADNc de BiP procedente de pGEM5ZBiP5' para la inserción
en los vectores pKSSINBVdIJR, pKSSINBV, o pKSSINBVdIJRsjrc, de
Sindbis, es:
5'-TAT ATC CAT GGT GCC AGC CAG TTG GGC AGC AG-3' | (SEC DE ID. 26) |
\vskip1.000000\baselineskip
En adición a las secuencias complementarias del
ADNc de BiP, comenzando en el nucleótido 12, el cebador inverso
contiene una "secuencia tampón" de cinco nucleótidos en su
extremo 5' para la digestión eficiente de la enzima de los productos
del amplicón de la PCR. Esta secuencia está seguida por el
emplazamiento de reconocimiento de NcoI.
Se llevó a cabo la amplificación del ADNc de BiP
procedente de pGEM5ZBiP5' con el protocolo de la PCR que se describe
anteriormente:
Para la inserción en el vector pKSSINBVdIJR, se
digirió el amplicón de 242 pb con ApaI y NcOI, purificado en un gel
de agarosa al 2%, y se ligó en el vector digerido con ApaI y NcoI y
tratado con CIAP. El ATG correspondiente al codón de inicio del gen
heterólogo que se va a insertar inmediatamente en la dirección 3'
del inserto de ADNc de BiP está modificado para contener un
emplazamiento de NcoI (CCATGG).
Para la inserción en los vectores pKSSINBV o
pKSSINBVdIJRsjrc entre los genes heterólogos, se digirió el amplicón
de 242 pb con ClaI y NcoI, se purificó sobre un gel de agarosa al
2%, y se ligó en el vector del gen heterólogo bicistrónico digerido
con ClaI y NcoI y se trató con CIAP. En una configuración del gen
heterólogo bicistrónico, el extremo 3' del gen heterólogo en la
dirección 5' está modificado para finalizar en un emplazamiento de
reconocimiento de ClaI. El ATG correspondiente al codón de inicio
del segundo gen heterólogo en la dirección 3' que se va a insertar
inmediatamente en la dirección 3' del inserto de ADNc de BiP para
contener un emplazamiento de NcoI (CCATGG). De esta manera, de 5' a
3', el orden de los componentes es: pKSSINBV o
pKSSINBVdIJRsjrc-gen nº 1-Cla/Nco
BiP-gen nº 2-3' SIN. La inserción en
todos los vectores de la región de unión modificada descritos en el
Ejemplo 2 sigue la estrategia proporcionada aquí para los vectores
pKSSINBV o pKSSINBVdIJRsjrc.
El vector pKSSINBVdIJR que contiene una
configuración heteróloga bicistrónica está construido con cada uno
de los amplicones de ADNc de BiP descritos anteriormente. El primer
amplicón de ADNc de BiP está flanqueado por los emplazamientos de
ApaI y Nco y se inserta inmediatamente en la dirección 3' de la
región de unión inactivada en el emplazamiento de ApaI, tal como se
describe anteriormente. Esta secuencia BiP está seguida por el
primer gen heterólogo, que finaliza en el emplazamiento de
reconocimiento de ClaI. El primer gen heterólogo está seguido por
la segunda secuencia del ADNc de BiP, que usan el amplicón
flanqueado por los emplazamientos de reconocimiento de ClaI y NcoI.
El segundo gen heterólogo sigue a la segunda secuencia BiP. De esta
manera, de 5' a 3', el orden de los componentes es: SINBVdIJRApa/Nco
BiP-gen nº 1-Cla/Nco
BiP-gen nº 2-3' SIN.
Las secuencias que promueven la lectura
ribosómica se colocan inmediatamente en la dirección 3' de la región
de unión inactivada en el vector pKSSINBVdIJR, lo que permite el
escaneo en el ARNm genómico de la terminación de los genes no
estructurales de los genes heterólogos. Las proteínas heterólogas se
expresan a partir del ARNm de longitud genómica mediante el escaneo
ribosómico. Esto debería extender la vida de la célula diana
infectada debido a que no se produce la transcripción subgenómica en
las células infectadas con este vector. Además, estas mismas
secuencias de escaneo ribosómico se colocan entre los genes
heterólogos contenidos en los ARNm subgenómicos policistrónicos. La
secuencia de expansión ribosómica que se va a usar en el vector
pKSDINBVdIJR y entre los genes heterólogos en la región del ARNm
policistrónico es:
5'-TTA ATT AAC GGC CGC CAC CAT GG-3' | (SEC DE ID Nº. 27) |
\vskip1.000000\baselineskip
Los codones en negrita se refieren al codón de
detención ocre y al codón de inicio AUG, respectivamente. Las bases
subrayadas que rodean el codón de detención se refieren al
emplazamiento de reconocimiento de PacI y las bases subrayadas que
rodean el codón de inicio se refieren al emplazamiento de
reconocimiento de NcoI. la distancia intercistrónica de 15 pb entre
los codones de inicio y de detención permiten la lectura ribosómica
eficiente, tal como se muestra anteriormente (Levine y col., Gene
108: 167-174, 1991). Las secuencias que rodean el
codón de inicio ATG entre las bases -9 a +1 conforman la secuencia
consenso de Kozak para el inicio eficiente de la traducción (Kozak,
Cell 44: 283-292, 1986). Cuando es posible, el
nucleótido 3' terminal que corresponde al aminoácido
carboxiterminal se cambia por T, mediante la mutagénesis dirigida al
emplazamiento. También, el nucleótido 5' terminal que corresponde
al aminoácido amino terminal en la dirección 3' del cistrón, se
cambia por G, mediante la mutagénesis dirigida al emplazamiento.
La inserción de la secuencia intercistrónica
entre los genes heterólogos, o en la dirección 3' de la región de
unión inactivada en el vector pKSDINBVdIJR, modificado tal como se
describe anteriormente, se lleva a cabo mediante la inserción de la
pareja de oligonucleótidos de doble cadena, en los extremos
compatibles PacI/NcoI compatibles:
Oligonucleótido de sentido directo de
lectura:
5'-TAA CGG CCG CCA C-3' | (SEC DE ID Nº. 28) |
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótido de sentido contrario de
lectura:
5'-CCA TGG TGG CGG CCG TTA AT-3' | (SEC DE ID Nº. 29) |
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos anteriores se mezclaron en
cantidades molares iguales en presencia de MgCl_{2} 10 mM, se
calentaron a 95ºC durante 5 min, y a continuación se dejaron enfriar
lentamente a temperatura ambiente, dando como resultado la secuencia
intercistrónica deseada flanqueda por los emplazamientos de PacI y
NcoI. A continuación se ligó la secuencia intercistrónica en el
vector apropiado que contenía los emplazamientos PacI y NcoI
compatibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha señalado anteriormente dentro de
un aspecto de la divulgación, los genes de las proteínas no
estructurales y los genes de las proteínas estructurales de Sindbis
se pueden empaquetar simultáneamente como moléculas de ARN de
sentido directo positivas que mantienen su
replicación-competencia, si cada uno de los ARN
contiene las secuencias cis-actuantes requeridas
para la replicación y el empaquetado. Por tanto, dentro de este
aspecto todos los fragmentos de ARN de virus Aura empaquetados
simultáneamente deberían contener también una secuencia 5' que sea
capaz de iniciar la transcripción del ARN de Aura, una secuencia de
reconocimiento de la ARN polimerasa del virus Aura, y al menos una
copia de la secuencia de empaquetamiento del ARN. Al menos una de
las moléculas de ARN empaquetada simultáneamente debe contener las
secuencias que codifican las proteínas no estructurales del virus
Aura: En las formas de realización de realización preferidas de la
divulgación, uno o más de los fragmentos de ARN que se van a
empaquetar simultáneamente puede contener también una región vírica
seguida por un gen heterólogo.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de demostrar la factibilidad del
empaquetamiento simultáneo para permitir la expresión de múltiples
genes heterólogos, se crearon dos constructos de vector. El primer
constructo constituido por una secuencia 5' que es capaz de iniciar
la transcripción del ARN de Sindbis, las secuencias de ARN de
Sindbis requeridas para el empaquetamiento, las secuencias que
codifican la síntesis de las proteínas no estructurales
1-4, una región de unión de Sindbis, el gen de la
luciferasa, y las secuencias 3' de Sindbis requeridas para la
síntesis del ARN de la cadena -. El segundo constructo constituido
por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un
virus Sindbis, una región de unión de Sindbis, las secuencias de
Sindbis requeridas para el empaquetamiento, las secuencias que
codifican el gen LacZ y las secuencias 3' requeridas para la
síntesis del ARN de cadena menos. Los transcriptos de ARN de estos
constructos transfectados en una línea celular de empaquetamiento
se empaquetaron simultáneamente para producir una partícula de
vector capaz de transferir la expresión de la luciferasa y la
\beta-galactosidasa en la misma célula
eucariota.
Se insertó el gen indicador de la
\beta-galactosidasa en el Vector Sindbis Básico
(pKSSINBV) seguido por la delección de una porción de las proteínas
no estructurales de Sindbis procedentes del vector. El ARN de este
constructo se transfectó simultáneamente con ARN del Vector de la
Luciferasa de Sindbis (pKSSINBV-luc) y se empaquetó
simultáneamente mediante uno de los procedimientos descritos a
continuación. La infección de las células BHK-21
frescas con las partículas del vector que contenían los casetes de
expresión del ARN empaquetado simultáneamente deberían dar como
resultado la expresión de la luciferasa y la
\beta-galactosidasa en la misma célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo el gen lacZ mediante digestión del ADN
del vector pSV-\beta-galactosidasa
(Promega Corp., Madison, WI) con las enzimas HindIII y SAlI. El
fragmento de 3749 pb que contenía el gen LacZ se purificó en un gel
de agarosa al 1%. Posteriormente, se ligó este fragmento en el
plásmido pSP72 (Promega Corp.) que está también digerido con
HindIII y SalI y se purificó usando Geneclean (Bio101 Corp., San
Diego, CA). Se conoce este constructo como
pSP72-lacZ. Se digirió el plásmido pSP72 con las
enzimas XhoI y XbaI, y el fragmento de 3767 pb que contenía LacZ se
purificó en un gel de agarosa al 1%. A continuación se ligó este
fragmento en pKSSINBV que está también digerido con XhoI y XbaI y
se purificó usando Geneclean. Este constructo de Sindbis, que
contenía LacZ, se conoce como pKSSINBV-lacZ. El
plásmido pKSSINBV-lacZ se digirió posteriormente con
la enzima Agel, que corta en los nucleótidos 3172 y 6922 de las
secuencias génicas de la proteína no estructural de Sindbis. El
fragmento restante del vector se purificó mediante Geneclean y se
volvieron a ligar sus extremos. El plásmido tiene ahora una
delección de 3750 pb en los genes de la proteína no estructural de
Sindbis, que los inactivan funcionalmente. Se conoce este constructo
como pKSSINBVdINSP-lacZ.
Se prepararon los transcriptos SP6 de
pKSSINBVdINSP-lacZ y pKSSINBV-luc
tal como se describe anteriormente. Estos transcriptos de ARN se
transfectaron simultáneamente en las células de empaquetamiento que
expresan las proteínas estructurales de Sindbis mediante uno de los
mecanismos descritos anteriormente. Cada transcripto de ARN
contiene una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción
de un virus Sindbis, las secuencias de ARN requeridas para el
empaquetamiento, una región de unión de Sindbis, un gen indicador, y
las secuencias 3' de Sindbis requeridas para la síntesis del ARN de
la cadena menos. El transcripto pKSSINBV-luc
contiene también las proteínas no estructurales de Sindbis. En las
células transfectadas simultáneamente, ambos transcriptos de ARN se
replican y algunas partículas víricas contendrán ambos transcriptos
de ARN empaquetados simultáneamente en la misma partícula. La
infección de las células frescas con las partículas de ARN
empaquetadas simultáneamente dará como resultado una célula que
expresa la luciferasa y la
\beta-galactosidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Grandes genes tales como el Factor VIII pueden
beneficiarse del empaquetamiento simultáneo. La inserción del ADNc
que codifica el Factor VIII en el Vector Sindbis Básico (pKSSINBV)
da como resultado un transcripto de ARN de aproximadamente 16 kb de
longitud, Debido al aumento de longitud, este ARN puede no
replicarse o empaquetarse eficientemente. Usando las soluciones
descritas anteriormente, las proteínas no estructurales de Sindbis y
el gen del Factor VIII se dividirían en moléculas de ARN
diferenciadas de aproximadamente 8 kb y 9 kb de longitud, y
empaquetadas simultáneamente en las mismas partículas.
\vskip1.000000\baselineskip
El constructo pKSSINBV se digirió con la enzima
SacI, que rompe inmediatamente después el extremo 3' y la secuencia
poli A de Sindbis. Se prepararon los extremos 3' sobresalientes
enromados mediante la adición de la enzima ADN polimerasa T4 y los
dNTP e incubación durante 10 minutos a 16ºC. El fragmento digerido
se purificó usando Geneclean y se ligó a un ligante
autocomplementario de 12 nucleótidos
(5'-GTCACCGGTGAC-3') (SEC DE ID Nº.
30) que contenía el emplazamiento de reconocimiento de SgrAI. Esta
etapa es necesaria debido a que el Factor VIII contiene los
emplazamientos de SacI, y el emplazamiento de reconocimiento de
SgrAI está sustituido por el emplazamiento de SacI con el fin de
crear un emplazamiento para la linealización del plásmido antes de
la transcripción de SP6. Se conoce este constructo como
pKSSINBV-SgrAI. El constructo
pKSSINBV-SgrAI se digirió con las enzimas XbaI y
NotI, y se purificó usando Geneclean. Se obtuvo la secuencia de ADNc
del Factor VIII mediante digestión con las enzimas XbaI y NotI. El
fragmento de 8 kb que codificaba el Factor VII se purifico en un
gel de agarosa al 1% y se ligó posteriormente con el
pKSSINBV-SgrAI digerido con XbaI/NotI. Se conoce
este constructo como pKSSINBV-Factor VIII.
El constructo pKSSINBV-Factor
VIII se digirió con AgeI, que corta en las proteínas no
estructurales de Sindbis en los nucleótidos 3172 y 6922, se
purificó usando Geneclean, y se volvió a ligar por sí mismo. El
constructo tiene ahora una delección de 3750 pb en las proteínas no
estructurales de Sindbis que lo inactiva funcionalmente. Se conoce
este constructo como pKSSINBVdINSP-Factor VIII. Se
prepararon los transcriptos SP6 de
pKSSINBVdINSP-Factor VIII y de pKSSINBV tal como se
describe anteriormente. Estos transcriptos de ARN se transfectaron
simultáneamente en células de empaquetado que expresan las
proteínas estructurales de Sindbis mediante uno de los mecanismos
descritos anteriormente. Ambos transcriptos de ARN contiene una
secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción del ARN de
Sindbis, las secuencias requeridas para el empaquetado del ARN, una
región de unión de Sindbis, y las secuencias 3' de Sindbis
requeridas para la síntesis del ARN de cadena menos. Además, el
transcripto pKSSINBV contiene los genes de la proteína no
estructural de Sindbis, y el constructo
pKSSINBV-Factor VIII contiene el gen del Factor
VIII, pero no los genes de la proteína no estructural de Sindbis. En
las células transfectadas simultáneamente, ambos transcriptos de
ARN están replicados y algunas partículas víricas contendrán ambos
transcriptos de ARN empaquetados simultáneamente en la misma
partícula del vector. La infección de células
BHK-21 frescas con el ARN empaquetado
simultáneamente dará como resultado la expresión del Factor VIII
únicamente si están presentes ambas moléculas de ARN en la misma
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Para desarrollar sistemas de expresión del virus
Aura análogos a los descritos para Sindbis, se utilizarán las
técnicas estándar conocidas en la técnica, así como las soluciones
específicas descritas en el interior de esta patente, para las
construcciones. Se obtendrá el virus de la ATCC, células cultivadas
propagadas, su ARN de virión extraído, y expandiendo el ADNc del
genoma completo sintetizado y clonado siguiendo las técnicas
convencionales. Se usará este ADNc para construir los sistemas del
vector de transferencia génica similares en lo principal a los
descritos para la patente de Sindbis, incluyendo, pero sin limitarse
a, un replicón capaz de transportar el(los) gen(es)
heterólogo(s), las líneas celulares de empaquetado que
expresan los genes de la proteína estructural, y único en este
sistema, un vector subgenómico competente para empaquetado separado
capaz de transportar el(los) gen(es)
heterólogo(s) adicional(es).
Debido a que el ARN subgenómico del virus Aura contiene una señal de empaquetado, deben llevarse a cabo experimentos preliminares para identificar esta secuencia, con el fin de evitar su inactivación durante las sustituciones con el(los) gen(es) heterólogo(s). Tras la identificación de la secuencia de empaquetado, se generarán los elementos individuales de este sistema basado en Aura.
Debido a que el ARN subgenómico del virus Aura contiene una señal de empaquetado, deben llevarse a cabo experimentos preliminares para identificar esta secuencia, con el fin de evitar su inactivación durante las sustituciones con el(los) gen(es) heterólogo(s). Tras la identificación de la secuencia de empaquetado, se generarán los elementos individuales de este sistema basado en Aura.
Se construirá un vector de replicón básico para
contener los siguientes requisitos mínimos: las secuencias 5' de
Aura necesarias para la replicación, las regiones de codificación de
la proteína no estructural, una región de unión modificada o no
modificada para la síntesis del ARNm subgenómico, un emplazamiento
de clonación múltiple para la inserción del(de los)
gen(es) heterólogo(s), una o más copias de la señal de
empaquetado, y las secuencias 3' de Aura necesarias para la
replicación, incluyendo una secuencia poliadenilada. Se utilizará
una ARN polimerasa de bacteriófago en la dirección 5' para la
transcripción in vitro del ARN del replicón;
alternativamente, se utilizará un promotor de la ARN polimerasa de
eucariota para la transcripción directamente a partir del ADNc.
Se construirá un vector subgenómico competente
para el empaquetado para contener los siguientes requisitos
mínimos: una región de unión modificada o no modificada, un
emplazamiento de clonación múltiple para la inserción del(de
los) gen(es) heterólogos, una o más copias de la señal de
empaquetado, y las secuencias 3' de Aura necesarias para la
replicación/síntesis de la cadena menos, incluyendo una secuencia
poliadenilada. El vector subgenómico puede, en algunos casos,
construirse con las secuencias 5' de replicación de Aura situadas en
la dirección 5' de la región de unión, de tal manera que el vector
funcionará como un amplicón. Se llevará a cabo la transcripción del
ARN del vector subgenómico in vitro usando un promotor de ARN
polimerasa de bacteriófago. Además, el transcripto inicial puede
ser de configuración de sentido directo o de configuración de
sentido contrario.
Se construirán líneas celulares de empaquetado
tal como se ha descrito anteriormente para los vectores Sindbis, de
tal manera, de tal manera que el ARNm de una o más de las proteínas
estructurales se transcribirá a partir de la región de unión y será
inducible por el replicón de Aura. En otros casos, una o más de las
proteínas estructurales se expresarán bajo el control de un
promotor eucariota inducible o constitutivo. En cada caso, se
llevarán a cabo mutaciones inactivantes específicas en cualquier
secuencia de empaquetado presentes en los genes de la proteína
estructural, con el fin de evitar la encapsidación de estas
secuencias con el replicón. Estas mutaciones serán cambios
silenciosos, normalmente en la tercera posición del codón, que no
afectarán al aminoácido codificado.
Se explotará la capacidad para empaquetar
múltiples genes heterólogos para muchas aplicaciones terapéuticas,
que incluyen, pero no se limitan a, la expresión de múltiples
citoquinas, múltiples epitopos CTL, combinaciones de citoquinas y
epitopos CTL para potenciar la presentación inmune, múltiples
subunidades de una proteína terapéutica, combinaciones de proteínas
terapéuticas y ARN de sentido contrario. En adición a su utilidad
para la expresión de múltiples genes heterólogos, el empaquetado de
ARNm subgenómicos en viriones permitirá a este sistema de vector la
transferencia de secuencias extremadamente largas, que pueden ser
imposibles en otros sistemas de alfavirus. Adicionalmente, la
solución multipartido puede ser útil en el desarrollo de líneas
celulares productoras, en las que se expresan de manera estable
proteínas replicasa y proteínas estructurales, y cualquier gen
heterólogo contenido en el interior de un vector subgenómico podría
entonces introducirse fácilmente como un integrante estable.
\vskip1.000000\baselineskip
Una forma de realización adicional del sistema
de transferencia génica de Sindbis inmediatamente anterior al
desarrollo de las líneas de empaquetado de Sindbis. Debido a que el
ciclo de replicación normal de Sindbis tiene lugar completamente en
el citoplasma, una solución para crear un sistema de línea celular
que empaqueta Sindbis es modelar el sistema tras su ciclo de
replicación natural. Usando esta solución, se diseña el sistema de
línea celular que empaqueta Sindbis en el que las proteínas
estructurales, suministradas en trans a partir de uno o más
vectores de expresión integrados de manera estable, son capaces de
encapsidar los transcriptos del ARN del vector transfectado o
transducido en el citoplasma y liberar partículas infecciosas
empaquetadas del vector a través de la membrana celular, creando de
esta manera una línea celular productora del vector Sindbis. Las
moléculas del vector de ARN de Sindbis, capaces de replicarse en el
citoplasma de la célula se producen inicialmente mediante un
sistema de la ARN polimerasa T7 usado para transcribir in
vitro un clon de vector de ADNc que codifica el gen de interés
y las proteínas no estructurales de Sindbis (descritas
anteriormente). Los transcriptos de ARN del vector se transfectan a
continuación en la línea celular empaquetada de Sindbis, de tal
manera que el ARN del vector se replica a altos niveles, y se
empaqueta posteriormente por las proteínas estructurales víricas,
dando como resultado partículas de vector infecciosas. Debido a la
longitud extendida de la molécula de ADNc de Sindbis, el proceso de
transcripción in vitro es ineficiente. Además, sólo una
fracción de las células contenidas en una monocapa se transfecta
normalmente mediante la mayoría de procedimientos. En un esfuerzo
por optimizar el rendimiento y la valoración de la línea celular
productora del vector, se llevaron a cabo dos ciclos sucesivos de
transferencia génica. Más bien que transfectando directamente las
moléculas del vector de ARN de Sindbis en la línea celular
productora, se transfectó el vector en primer lugar en una línea
celular primaria de empaquetado de Sindbis. La línea celular
transfectada secreta partículas de vector infecciosas en los
sobrenadantes del cultivo y estos sobrenadantes infecciosos se usan
a continuación para transducir una monocapa fresca de células
empaquetadas de Sindbis, Se prefiere la transducción del vector
Sindbis en la línea celular de empaquetado sobre la transfección
debido a su mayor eficiencia de transferencia de ARN en las
células, y la sustitución biológica optimizada del vector en la
célula. Esto conduce a una mayor expresión y mayor valoración del
vector Sindbis recombinante infeccioso empaquetado.
En el ejemplo en el que las partículas del
vector Sindbis fracasan en transducir la misma línea celular de
empaquetado, la línea celular produce las proteínas de la envoltura
extracelular que bloquean los receptores celulares para la unión
del vector Sindbis, debe crearse un segundo tipo de partícula vírica
Sindbis que sea capaz de transducir las células de empaquetado de
Sindbis. Este segundo tipo de partícula vírica debe producirse
mediante una línea celular de empaquetado conocida como "línea
celular de salto", que produce partículas de vector transitorias
como resultado de transfectarse con transcriptos del vector de ARN
de Sindbis transcritos in vitro. La línea celular de salto
se diseña mediante ingeniería genética par redirigir el tropismo del
receptor de las partículas del vector producido transitoriamente
proporcionando proteínas de la envoltura vírica alternativas que
redirigen los vectores Sindbis a receptores celulares diferentes en
un proceso denominado pseudotipificación. Actualmente se han
propuesto dos soluciones para la pseudotipificación de las
partículas del vector Sindbis. La primera solución consiste en una
línea celular que empaqueta Sindbis que expresa simultáneamente la
proteína G del virus de la estomatitis vesicular
(VSV-G). Para los inventores, ha funcionado
anteriormente bien la pseudotipificación de VSV-G
para redirigir el tropismo del receptor de los vectores retrovíricos
y se ha demostrado que infecta una amplia variedad de tipos
celulares. La segunda solución para producir una partícula de
vector Sindbis pesudotipificada es usar las líneas celulares de
empaquetado retrovírico actualmente disponibles que contienen las
secuencias gag/pol y env retrovíricas que serían capaces de
empaquetar un vector de ARN de Sindbis que contiene una secuencia de
empaquetado retrovírica.
La modelación de la línea celular de empaquetado
de Sindbis tras el ciclo de replicación natural del virus Sindbis
debería dar como resultado en una línea celular altos niveles de
rendimiento de la expresión génica basados en el número de
moléculas de ARN disponibles para la traducción que se generan a
partir de la molécula de ARN que se replica. Por otra parte, los
virus de ARN de cadena positiva tienden a producir ARN interferentes
defectivos que pueden tender a alterar el vector de ARN,
disminuyendo de esta manera la efectividad global de las partículas
del vector, y que pueden disminuir también los altos niveles de
expresión durante períodos de cultivo extendidos. Por tanto, se ha
propuesto una segunda solución en la que se usa un vector de
expresión de ADN integrado de manera estable para producir la
molécula de ARN del vector Sindbis, que, como en la primera
solución, mantiene la capacidad de autoreplicarse. Esta solución
permite la expresión continua del vector durante largos periodos de
cultivo debido a que el sistema integrado de expresión del vector de
ADN se mantiene mediante un marcador de selección del fármaco y el
sistema de ADN expresará constitutivamente los vectores de ARN no
alterado que no se pueden diluir por las copias de ARN defectivo. En
esta configuración celular productora, el vector Sindbis basado en
ADN se introduce inicialmente en la línea celular de empaquetado
mediante transfección, debido a que las restricciones de tamaño
podrían evitar el empaquetado del vector de expresión en una
partícula de vector vírica para la transducción. También, para esta
configuración, el emplazamiento de reconocimiento de la ARN
polimerasa T7 del plásmido, usado anteriormente para transcribir el
ARN del vector, está sustituido con otra secuencia promotora
apropiada definida por la línea celular parental usada. Esta
secuencia de plásmido contendría también un marcador de selección
diferente del usado para crear la línea celular de empaquetado.
La expresión de las proteínas de Sindbis y/o el
ARN del replicón a ciertos niveles pude dar como resultado efectos
citotóxicos en las líneas celulares de empaquetado. Por tanto, en
algunos ejemplos, puede ser deseable para estos elementos
expresarse sólo después que las células se han propagado hasta una
cierta densidad crítica. Para este objetivo, se llevaron a cabo
modificaciones adicionales en las que las proteínas estructurales
necesarias para el empaquetado se sintetizaron sólo después de la
inducción mediante el vector de ARN por sí mismo o algún otro
estímulo. También, algunas modificaciones permiten la expresión
individual de estas proteínas bajo el control de elementos
inducibles diferentes, utilizando vectores de expresión que separan
los genes que codifican estas proteínas. Además, se puede controlar
la expresión de la molécula integrada del vector por sí misma
mediante otro sistema inducible adicional. Esta configuración da
como resultado una cascada de episodios tras la inducción, que
conduce de manera última a la producción de partículas de vector
empaquetadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Un criterio importante para seleccionar
potenciales líneas celulares parentales para crear líneas celulares
que empaquetan Sindbis, es la elección de las líneas celulares que
no se lisan durante la replicación y producción del vector Sindbis.
Este criterio es esencial para el desarrollo de un vector Sindbis
que produzca que la línea celular se pueda propagar durante largos
periodos de tiempo y usarse como fuente estable del vector: Se sabe
que la infección por Sindbis de la mayor parte de células de
mamíferos da como resultado la lisis de la célula; sin embargo, la
utilización de diversas líneas celulares de insectos debería
solventar este problema. Como ejemplo, la infección de células del
mosquito Aedes albopictus con virus Sindbis da como resultado el
crecimiento persistente o crónico del virus no citopático en el que
las células infectadas permanecen viables y el virus difunde
continuamente. Otras líneas celulares de insectos, tales como Aedes
albopictus o la línea celular de Drosophila, contienen un vector de
expresión transfectado de manera estable que expresa las proteínas
estructurales de Sindbis bajo el control de promotores inducibles o
no inducibles activos en estos tipos celulares, y expresan
simultáneamente un marcador seleccionable.
Recientemente, se ha identificado y purificado
una proteína de origen celular inducida por el virus Sindbis, que
se ha asociado con la infrarregulación de la producción de virus
Sindbis en células de Aedes albopictus infectadas (Virology
194:44). La proteína es un péptido hidrófobo pequeño de
aproximadamente 3200 Da., que puede inducir el estado antivírico e
inhibir la síntesis de ARN vírico de 49S y 26S. Las células tratadas
con el péptido antivírico demuestran normalmente la detención
inactiva de la división celular durante 96 horas en células no
infectadas, y a continuación se restauran las velocidades de
crecimiento normales. Las células que se han expuesto a este
péptido antes de la infección son incapaces de replicar el virus
Sindbis y parecen mantener este fenotipo produciendo
constitutivamente la proteína antivírica durante 10 meses de paso
continuo.
Se reconoce que esta respuesta celular a la
infección por Sindbis en células de Aedes albopictus puede disminuir
la eficiencia óptima de un sistema de producción de vector Sindbis
recombinante. Para mejorar la eficiencia de producción del vector
Sindbis, se han propuesto dos procedimientos para inactivar la
proteína antivírica celular inducida por virus, evitando de esta
manera cualquier reducción de los títulos de partículas del vector.
El primer procedimiento implica la purificación de esta proteína
celular descrita anteriormente, y la determinación de una porción
de la secuencia de aminoácidos primaria a partir de su término
carboxi usando las técnicas establecidas conocidas en la técnica. A
continuación se usa la secuencia de aminoácidos resultante para
derivar las posibles secuencias genómicas correspondientes
permitiendo diseñar una pareja de cebadores de la PCR degenerados
que se puede usar para amplificar la secuencia celular específica. A
continuación se clona esta secuencia amplificada usando las
técnicas estándar conocidas en la técnica, para obtener una región
discreta del gen que codifica esta proteína inhibidora. La
determinación de la secuencia de nucleótidos de este clon permite a
continuación diseñar un vector que se integrará específicamente en
el interior del gen inhibidor de Sindbis mediante recombinación
homóloga, y "desactivar" su capacidad para expresar una
proteína funcional. Se pueden seleccionar clones que contengan la
secuencia de desactivación mediante la inserción de un marcador
seleccionable en la región clonada discreta de la proteína
inhibidora, antes de transfectar las células con el vector.
Un segundo procedimiento par inactivar esta
proteína inhibidora del virus Sindbis implica la mutagénesis de las
células de Aedes albopictus con, por ejemplo, BUDR
(5-bromodesoxiuridina). Esta población de la línea
celular empaquetada mutagenizada se infecta a continuación con un
vector Sindbis, que es capaz de expresar el marcador de la
resistencia a la neomicina. Con elevadas concentraciones de fármaco
G418, sólo aquellas células que producen grandes cantidades de
vector Sindbis, y de esta manera incapaces de expresar el gen
inhibidor Sindbis, serán capaces de sobrevivir. Tras la selección,
las colonias resistentes se combinan, se clonan por dilución, y se
ensayan par la producción de de elevados títulos de Sindbis.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque la mayor parte de líneas celulares de
mamíferos se lisan normalmente durante la infección por el virus
Sindbis, recientes experimentos han demostrado la conversión de la
infección de lítica a persistente de Sindbis en una línea celular de
adenocarcinoma prostático (AT-3) de rata.
Se llevó a cabo esta conversión expresando
constitutivamente el producto del oncogen bcl-2 en
la línea celular anterior de infección por Sindbis. La infección
por Sindbis de las células AT-3 que expresan el
oncogen bcl-2 da como resultado la producción de
virus sin citopatología obvia (Nature 361:739).Esta modificación de
la línea celular podría probar ser útil para convertir líneas
celulares tales como las líneas celulares caninas
D-17 y Cf2; las líneas celulares humanas HT1080 y
293; la línea celular de codorniz QT6; la línea celular de riñón de
cría de hámster BHK-21; la línea celular de
neuroblastoma de ratón N18; y el adenocarcinoma prostático de rata
AT-3 en el estado infectable persistentemente para
uso como líneas celulares productoras y que empaquetan Sindbis
potenciales similares a los de las líneas celulares de
retrovectores.
Se ha descrito anteriormente un vector de
expresión retrovírica del oncogen bcl-2 (Nature
361:739). Se construyó un nuevo vector de expresión
bcl-2 usando las técnicas estándar de ADN
recombinante conocidas en la técnica para insertar el fragmento de
ADNc de EcoRI de 910 parejas de bases del fragmento derivado del
plásmido p84 (Nature 336:259) en cualquier vector de expresión
comercialmente disponible que contenga un promotor constitutivo y
codifique un marcador seleccionable. Debe tomarse una consideración
cuidadosa en evitar cualquier tipo de homología entre las
secuencias de ácido nucleico de Sindbis y otros vectores
transducidos. Debería tomarse esta precaución con el fin de evitar
episodios de recombinación que puedan conducir a marcadores
seleccionables de empaquetado indeseables del oncogen
bcl-2 en las partículas de Sindbis recombinantes.
Este es un punto importante a realizar debido a que el sistema de
vector Sindbis descrito en el presente documento se diseña para el
uso como terapéutica biológica. Una vez que se construye el vector
de expresión bcl-2, la línea celular parental de
mamífero (es decir, las células BHK-21) se
transfecta usando cualquier técnica estándar y se selecciona para
el marcador apropiado. A continuación se combinan las colonias
resistentes, seguido por la clonación por dilución. A continuación
se propagan los clones individuales y se detectan sistemáticamente
para la expresión de bcl-2. Una vez se ha
verificado la expresión, se ensaya la infección persistente de
Sindbis, seguido por su uso como línea celular parental para el
desarrollo de la línea celular que empaqueta Sindbis.
La infección por Sindbis de células BHK da como
resultado cambios morfológicos y modelos de fragmentación del ADN
diagnósticos de la apoptosis y la conversión de la infección de
lítica a persistente por el oncogen bcl-2, que
puede mediar mediante una supresión de esta muerte celular
programada (Nature 361:739). Además, la infección de células de
mamíferos con otros virus que incluyen adenovirus, Poliomavirus,
SV40, y VIH a dado como resultado citotoxicidad debida a la
apoptosis. Por tanto, otros productos génicos, además del oncogen
bcl-2, que suprime la apoptosis serían deseables
para la expresión en una línea celular productora o que empaqueta
Sindbis. Inicialmente, tres genes víricos, que muestran suprimir la
apoptosis, se expresarán en las líneas celulares que empaquetan
Sindbis: el gen E1B de adenovirus que codifica la proteína de
19-kD (Rao y col., PNAS 89:
7742-7746. 1992), el gen g_{1} 34.5 de tipo 1 del
virus del herpes simple (Chou y Roizman. PNAS 89:
3266-3270, 1992), y el gen p35 de baculovirus AcMNPV
(Clem y col., Science 254.1: 1388-1390, 1991). Los
genes individuales se insertan en vectores de expresión plásmida,
bajo el control de promotores transcripcionales eucariotas
constitutivos y que contienen un marcador seleccionable, usando las
técnicas estándar conocidas en la técnica. Estos vectores de
expresión se transfectan posteriormente en líneas celulares tal como
se ha descrito anteriormente, y se aplica la selección apropiada.
La selección para la integración estable de estos genes y la
expresión constitutiva de sus productos debería permitir una
producción del vector más extensa en las líneas celulares conocidas
por ser susceptibles a los episodios apópticos inducidos por
Sindbis. Además, es factible que cada producto génico pueda inhibir
la apoptosis mediante su propio mecanismo único. Por tanto, los
genes se introducirán también en las líneas celulares de empaquetado
en diversas combinaciones para obtener un efecto supresor más
fuerte. Finalmente, otros productos génicos que tienen efectos
similares sobre la apoptosis se pueden incorporar fácilmente en las
líneas celulares de empaquetado que se han descubierto.
\newpage
Se establecen líneas celulares transformadas de
SV40 y Py, y la cinética y el nivel de producción de Sindbis, y la
citopatología tras la infección vírica determinada. Si los episodios
apópticos característicos de la proliferación de Sindbis en células
de hámster están disminuidos, cada prototipo de línea celular que
empaqueta Sindbis se transforma posteriormente con Py o SV40 con el
fin de aumentar el rendimiento del vector empaquetado procedente de
estas células.
\vskip1.000000\baselineskip
La glicoproteína E2 de Sindbis se sintetiza como
precursor, PE2. Este Precursor PE2 y la segunda glicoproteína
vírica, E1, se asocian en el retículo endoplásmico y se procesan y
transportan a la membrana celular infectada como un heterodímero
para la incorporación del virión En algún punto durante este
procesamiento, PE2 se rompe en E3 y E2 maduras. E3 tiene 64 restos
amino terminales de PE2 y se pierde en el espacio extracelular
durante la maduración. El producto de la rotura más grande, E2, se
asocia con E1 y se ancla en lo que se convierte en la envoltura
vírica. Una proteasa celular del huésped es responsable del
procesamiento del precursor de PE2, que rompe en el emplazamiento
que sigue inmediatamente a un motivo de resto de cuatro aminoácidos
(aa) clásicamente muy conservados, los aa
básico-X-básico-básico.
Una línea celular mutante de la cepa CHO-K1,
designada RPE.40 (Watson y col., (1991) J. Virol 65:
2332-2339), es defectiva en la producción de la cepa
AR339 de virus Sindbis, debido a su incapacidad para procesar el
precursor PE2 en las formas E3 y E2 maduras. Las envueltas de los
viriones Sindbis producidos en la línea celular RPE.40 contienen por
tanto el heterodímero PE2/E1 Las células RPE.40 son al menos 100
veces más resistentes a la infección por virus Sindbis que las
células CHO-K1 parentales, sugiriendo una
ineficiencia en la capacidad de PE2 de contener viriones para
infectar las células. Estos viriones defectivos producidos por la
línea celular RPE.40 se pueden convertir en formas completamente
infecciosas mediante tratamiento con
tripsina.
tripsina.
En las líneas celulares de empaquetado o
productoras, cualquier virus de tipo natural producido mediante
recombinación reinfectará las células y se amplificará rápidamente:
contaminando significativamente, de esta manera, las preparaciones
de vector empaquetadas. Las células productoras desarrolladas a
partir de la línea RPE.40 serían una mejora significativa sobre
otras líneas permitidas para la infección del virus Sindbis, debido
a la amplificación ineficiente de cualquier virus de tipo natural
generado durante la producción y empaquetado del vector. De esta
manera, las preparaciones de vector no están significativamente
contaminadas con el virus de tipo natural. Además, se puede
extender este sistema a otras líneas celulares mediante el
desarrollo de mutantes "de desactivación" en la proteasa
celular análoga.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usan líneas celulares de salto de Sindbis,
tal como se ha descrito anteriormente, para producir
transitoriamente partículas de vector de ARN infecciosas que se han
pseudotipificado para un tropismo diferente del receptor celular.
Una vez que la línea celular de salto produce las partículas del
vector, no se requiere más debido a que sólo se necesitan los
sobrenadantes de los cultivos infecciosos para transducir las líneas
celulares originales que empaquetan Sindbis tal como se describe
anteriormente.
Por tanto, la línea celular de salto no necesita
presentar infección persistente por Sindbis con el fin de producir
transitoriamente partículas de vector. En este ejemplo, la línea
celular parental puede ser tanto una línea celular de insecto que
presente infección persistente, como una línea celular de mamífero
que probablemente lise en las 72 horas después de una infección
productora de Sindbis. El único criterio es que las líneas celulares
sean capaces de expresar y procesar las proteínas estructurales de
Sindbis expresando simultáneamente a la vez tanto la proteína
VSV-G como las proteínas gag-pol y
env retrovíricas sin afectar el crecimiento celular antes de la
transfección con el vector de ARN de Sindbis. Por tanto, la línea
celular de salto de Sindbis puede ser cualquiera de las líneas
celulares parentales anteriormente mencionadas capaces de soportar
tanto a Sindbis como la replicación retrovírica, sin modificaciones
celulares adicionales, tal como se ha descrito anteriormente, tales
como la expresión del oncogen bcl-2.
La creación del vector Sindbis pseudotipificado
con VSV-G requiere la transfección simultánea del
ARN del vector Sindbis transcrito in vitro o el ADN, junto
con el vector pMLP-G, que expresa la proteína de la
envoltura VSV-G en la línea celular que empaqueta
Sindbis. Se describen las condiciones de crecimiento celular y los
procedimientos de transfección bajo el encabezado "ensamblaje de
los componentes" y se usan cualquiera de las configuraciones
celulares de empaquetado descritas. Los sobrenadantes, que contienen
el vector Sindbis pseudotipificado con VSV-G se
cosechan a las 24 horas después de la transfección y se usan a
continuación para transducir monocapas frescas de la línea celular
idéntica que empaqueta Sindbis, para superar la reducción en la
eficiencia de la transducción.
Para la pseudotipificación de los vectores
Sindbis en las líneas celulares de empaquetado retrovírico, se
puede usar cualquier línea celular referenciada en la bibliografía
que exprese las secuencias gag-pol y env
retrovíricas para empaquetar un vector de ARN de Sindbis, que se han
diseñado mediante ingeniería genética para contener una secuencia
de empaquetado retrovírico. La secuencia psi de empaquetado
retrovírico se inserta entre la región de unión inactivada y una
repetición en tándem de la región de unión sintética, de tal manera
que sólo el vector de longitud genómica, y el ARNm no subgenómico,
se empaqueten mediante las proteínas de la envoltura retrovírica.
Las partículas retrovíricas que contienen un ARN del vector Sindbis
se producen transfectando in vitro el ARN transcrito del
vector Sindbis usando los procedimientos que se han descrito
anteriormente. Los sobrenadantes con partículas víricas
pseudotipificadas que contienen el vector de ARN de Sindbis se
cosechan a las 24 horas después de la transfección, y a continuación
se pueden usar estos sobrenadantes para transducir una línea celular
que empaqueta Sindbis.
\vskip1.000000\baselineskip
El desarrollo de las líneas celulares que
empaquetan Sindbis es dependiente de la capacidad para sintetizar
altos niveles intracelulares de las proteínas estructurales
necesarias; la cápsida, E2, y E1. Desafortunadamente, el elevado
nivel de expresión de estas proteínas, en concreto, las
glicoproteínas E2 y E2 de la envoltura, puede conducir a
citopatología concomitante y muerte celular eventual. Por tanto, se
han diseñado casetes de expresión de la proteína estructural con
elementos reguladores inducibles que controlan los niveles de
expresión génica, además de otros que mantienen los niveles de
expresión constitutivos.
En la primera configuración, la expresión de las
proteínas estructurales de Sindbis está bajo el control del LTR de
RSV, en conjunción con las secuencias inducibles del operón lac.
Esto se consigue mediante la inserción de ADNc de Sindbis
correspondiente a los genes de la proteína estructural vírica en los
vectores pOP13 y pOPRSV1 (Stratagene). Estos vectores, usados
separadamente, se transfectan simultáneamente con el vector p3'SS
(Stratagene), que expresa la proteína "i" del represor de lac.
En ausencia de inductor, por ejemplo
Isopropil-B-D-tiogalactopiranósido
(IPTG), se ha informado que el nivel de expresión, basal, o
constitutivo, de un gen indicador de la luciferasa es de
10-20 copias por célula. La adición de IPTG, da como
resultado un cambio conformacional de la proteína represora, que da
como resultado una disminución en la afinidad de la proteína i de
lac para las secuencias del operador lac, permitiendo un elevado
nivel de expresión del gen heterólogo. Se ha informado de niveles de
inducción en presencia de IPTG de 95 veces para los genes
heterólogos contenidos en el vector pOP13.
Específicamente, el ADNc del gen de la proteína
estructural de Sindbis (SP) se inserta en los vectores pOP13 y
pORVSV1 como sigue. La región de codificación de SP se amplifica in
toto con una pareja de cebadores cuyos extremos 5' mapean,
respectivamente, el codón traduccional AUG auténtico y los
emplazamientos de detención traduccional UGA, que incluyen los
nucleótidos que los rodean, que corresponden a la secuencia consenso
de Kozak, para el inicio traduccional eficiente en el nt. 7638 de
Sindbis. El cebador directo es complementario de los nucleótidos
7638-7661 de Sindbis y el cebador inverso es
complementario de los nt. 11.384-11.364 de Sindbis.
Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR del ADNc de Sindbis
correspondiente a los genes de la proteína estructural mediante un
protocolo de ciclación estándar a doble temperaturas, usando la
siguiente pareja de oligonucleótidos:
Cebador directo (7638F):
5'-TATATGCGGCCGCACCACCACCATGAATAGAGGATTCTTTAACATGC-3' | (SEC DE ID Nº. 38) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso (11384R):
5'-TATATGCGGCCGCTCATCTTCGTGTGCTAGTCAG-3' | (SEC DE ID Nº. 39) |
\vskip1.000000\baselineskip
Además de sus complementariedades respectivas
con los nt. de Sindbis indicados, una "secuencia tampón" de 5
nucleótidos seguida por la secuencia de reconocimiento de NotI se
une a los extremos 5' de cada cebador. Tras la amplificación
mediante la PCR, se purificó el fragmento de 3.763 pb en un gel de
agarosa al 1%, y a continuación se digirió posteriormente con la
enzima NotI. El fragmento de 3.749 pb se ligó a continuación,
separadamente, en los vectores pOP13 y POPRSV1, que se digirieron
con NotI y se trataron con fosfatasa alcalina de intestino de
ternero. Estos vectores de casete de expresión, que contienen la
capacidad completa de codificación de las proteínas estructurales
de Sindbis se conocen como pOP13-SINSP y
pOPRSV1-SINSP.
Se pueden construir también variaciones de los
casetes de expresión génica de la proteína estructural operón
lac-Sindbis usando otros promotores víricos,
celulares o de insectos. Usando las técnicas de biología molecular
comunes en la técnica, el operón lac y el promotor LTR de RSV, o
sólo el promotor LTR de RSV, se pueden interrumpir las secuencias
de los vectores pOP13 y pORSV1 de Stratagene y sustituirse por otras
secuencias de promotores, tales como el promotor inmediato mayor de
citomegalovirus (pOCMV-SINSP), el promotor tardío
mayor de adenovirus (pOPAMLP-SINSP); o las
secuencias promotoras de insectos, que incluyen el promotor
inducible de la metalotioneína de Drosophila
(pMET-SINSP), el promotor distal 5C de la actina de
Drosophila (pOPASC-SINSP), los promotores del choque
térmico HSP65 o HSP70 (pHSP-SINSP), o el promotor de
la polihedrina de baculovirus
(pPHED-SFNSP).
(pPHED-SFNSP).
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede aumentar la expresión de la proteína
estructural de Sindbis si se aumenta el nivel de transcriptos de
ARNm. Se puede llevar a cabo el aumento del nivel de los
transcriptos de ARNm modificando el casete de expresión de tal
manera que las proteínas no estructurales de Sindbis reconozcan
estos transcriptos, y a la vez, repliquen el mensaje a niveles
mayores. Se lleva a cabo esta modificación añadiendo el núcleo
mínimo de la región de unión de tipo natural (nucleótidos 7579 a
7602) al extremo 5' de la región de codificación de la proteína
estructural de Sindbis, entre el primer emplazamiento ATG de inicio
para la traducción y el casete de expresión de las secuencias del
promotor. Se puede llevar a cabo esto siguiendo la misma técnica de
amplificación mediante la PCR descrita anteriormente para colocar el
ADNc de la proteína estructural de Sindbis en los vectores de
expresión pOP13 y pOPRSV1. La única modificación de este
procedimiento es la sustitución del cebador directo 7638F con un
cebador similar que incluya los nucleótidos
7579-7602 del núcleo de la región de unión entre el
emplazamiento de la enzima de restricción NotI y el primer ATG de la
región de codificación como sigue:
Tras la amplificación mediante la PCR, el
fragmento de 3.787 pb resultante se purificó en un gel de agarosa
al 1%, y a continuación se digirió posteriormente con la enzima
NotI. A continuación se ligó el fragmento de 3.773 pb resultante,
separadamente, en los vectores pOP13 y pOPRSV1 que se digirieron con
NotI y se trataron con fosfatasa alcalina de intestino de ternero.
Los vectores de casete de expresión resultantes se conocen como
pOP13-JUNSINSP y pOPRSV1-JUNSINSP.
Sin embargo, debe establecerse que la introducción de las secuencias
de la región de unión en los casetes de expresión de la proteína
estructural introducirán secuencias que pueden conducir
posiblemente a episodios de recombinación indeseables, conduciendo a
la generación de virus Sindbis de tipo natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a los potenciales efectos citotóxicos de
la expresión de la proteína estructural, el establecimiento de
líneas celulares de empaquetado inducibles que expresen incluso
niveles basales modestos de estas proteínas puede no ser el mejor
procedimiento. Por tanto, los casetes de expresión de la línea
celular de empaquetado se construyen de tal manera que contengan
elementos reguladores para la inducción elevada del nivel de la
síntesis de proteína estructural mediante las proteínas no
estructurales suministradas en trans por el vector Sindbis,
pero sin nivel basal de síntesis hasta que se estimuló
apropiadamente.
En esta configuración, se construyó un casete
génico de proteína estructural, en el que la transcripción de los
genes de la proteína estructural se produce a partir de una
secuencia adyacente a la región de unión de Sindbis. Las
características principales de este casete son: un promotor de la
ARN polimerasa II situado inmediatamente adyacente al nucleótido 1
de Sindbis, de tal manera que el inicio de la transcripción comienza
con el nucleótido 1 de Sindbis auténtico, las secuencias del
extremo 5' de Sindbis requeridas para el reconocimiento de la
transcripción, la secuencia de la región de unión de Sindbis para
la expresión del ARNm del gen de la proteína estructural, las
secuencias del gen de la proteína estructural de Sindbis, las
secuencias del extremo 3' de Sindbis requeridas para la
replicación, y una secuencia de terminación/poliadenilación de la
transcripción. Debido al marco de lectura abierto en la dirección
5' que finaliza en los codones de terminación de la traducción antes
del emplazamiento de inicio de AUG de los gens de la proteínas
estructurales, se puede producir la expresión de las proteínas
estructurales de Sindbis únicamente después de la síntesis de ARNm
de cadena menos mediante la proteínas no estructurales
suministradas con el vector y la transcripción posterior de un ARNm
del gen de la proteína estructural a partir de la región de unión.
Por tanto, la inducibilidad de este sistema es dependiente
completamente de la presencia de proteínas no estructurales,
suministradas por el vector Sindbis por sí mismo, introducidas en
cualquier ARN transcrito in vitro, o ADNc situado en la
dirección 3' de un elemento promotor apropiado. Además, las
secuencias Sindbis de los extremos 5' y 3' permiten amplificarse al
transcripto de ARN del casete génico de la proteína estructural
mediante las mismas proteínas no estructurales suministradas con el
vector.
Específicamente, la construcción de un casete de
empaquetado inducible mediante vector, de sentido directo positivo
se llevó a cabo como sigue. El vector pVGELVIS descrito
anteriormente se digirió con la enzima BspEI para eliminar los
nucleótidos 422 a 7054 que incluían la mayor parte de las secuencias
de codificación de los genes no estructurales, y el fragmento de
9925 pb restantes se purificó en un gel de agarosa al 0,8%, y se
volvió a ligar posteriormente por sí mismo para generar el
constructo conocido como pLTR/SindIBspE. Esta delección deja el
codón auténtico de inicio de la traducción en el extremo de los nt
60-62 intactos, y crea codones de detención UAA y
UGA en la dirección 3' en marco en los nt. 7130-7132
y 7190-7192 (numeración original), respectivamente,
evitando de esta manera la traducción del marco de lectura abierto
del gen de la proteína estructural en la dirección 3'. El
constructo del casete de empaquetado pLTR/SindIBspE se transfectó
posteriormente en células BHK (ATCC nº CCL 10) y se seleccionaron
los transfectantes positivos usando el fármaco G418 a 400 \mug/ml
tal como se ha descrito anteriormente. Los datos que se muestran en
la figura 4 demuestran que la transfección del ARN del vector
Sin-luc en estas células que empaquetan
LTR/SindIBspE da como resultado la producción de partículas de
Sindbis infecciosas que contienen el ARN de Sin-luc,
como se muestran los sobrenadantes recuperados para transferir el
ARN del vector Sin-luc a las monocapas frescas de
las células BHK.
Se preparó también un constructo de empaquetado
similar usando el clon pVg-ELVIS (descrito
anteriormente) como material inicial par creación de la delección
de BspEI. En este clon, la secuencia del extremo 3' de Sindbis está
seguida por una secuencia de ribozima catalítica para permitir un
procesamiento más preciso del transcripto primario adyacente a las
secuencias dl extremo 3' de Sindbis. Además, se pueden llevar a cabo
variaciones de estas construcciones de casete de empaquetado usando
las técnicas estándar conocidas en la técnica, que incluyen: la
sustitución de otros promotores de la ARN polimerasa para el LTR de
MuLV actual, la adición de 1 o más nucleótidos entre el promotor de
la ARN polimerasa y el primer nucleótido de Sindbis, o la
sustitución de un marco de lectura abierto no codificado por Sindbis
en la dirección 5' de las secuencias génicas de la proteína
estructural, que puede o no retener las secuencias del extremo 5' de
Sindbis requeridas para el reconocimiento de la transcriptasa.
En otra configuración de empaquetado inducible
mediante vector, los casetes de expresión contienen una copia de
ADNc de las secuencias génicas de la proteína estructural de Sindbis
flanqueadas por su unión natural y las regiones 3' no traducidas, e
insertadas en un vector de expresión en una orientación, de tal
manera que la transcripción primaria del promotor produce las
moléculas de ARN del gen de la proteína estructural. Adicionalmente,
estos constructos también contienen, adyacentes a la región de
unión las secuencias del extremo 5' de Sindbis necesarias para el
reconocimiento mediante la transcriptasa vírica, y una secuencia de
la ribozima catalítica situada inmediatamente adyacente al
nucleótido 1 de Sindbis de la secuencia del extremo 5'. Como tal,
esta ribozima rompe el transcripto de ARN primario precisamente
después del primer nucleótido de Sindbis. En esta orientación de
sentido contrario, no se pueden traducir los genes de la proteína
estructural, y son completamente dependientes se la presencia de
las proteínas no estructurales del virus Sindbis para la
transcripción en el ARNm de cadena positiva, antes de su expresión.
Se proporcionan estas proteínas no estructurales por el propio
vector Sindbis. Además, debido a que esta configuración contiene el
genoma y las secuencias 5' y 3' precisas de Sindbis, los
transcriptos del gen de la proteína estructural experimentan la
amplificación utilizando las mismas proteínas no estructurales
proporcionadas por el vector Sindbis.
Específicamente, el ADNc del gen de la proteína
estructural de Sindbis se eliminó del clon pVGSP6GEN genómico y se
digirió con las enzimas ApaI y BamHI para eliminar todas las
secuencias de Sindbis debidas al nucleótido 7335, que incluyen los
genes que codifican las proteínas no estructurales 1, 2, 3 y la
mayor parte de 4. El fragmento de vector de 7285 pb restante, que
contiene los genes de la proteína estructural de Sindbis, se
purificó en un gel de agarosa al 0,8%, y se ligó posteriormente con
una secuencia poliligante, denominada SinMCS, que se obtuvo
templando dos oligonucleótidos sintéticos. Los oligonucleótidos
SinMCSI y SinMCSII, contienen los emplazamientos de
reconocimien-
to para ClaI, BglII, y SpeI, y tienen los extremos de ApaI y BamHI tras el templado. Sus secuencias son como sigue:
to para ClaI, BglII, y SpeI, y tienen los extremos de ApaI y BamHI tras el templado. Sus secuencias son como sigue:
El constructo resultante, conocido como
pMCS-26s, se modificó a continuación para contener
los 229 nucleótidos del extremo 5' de Sindbis, fusionados con una
secuencia de ribozima de 84 nucleótidos procedente de la cadena
antigenómica del virus de la hepatitis delta (VHD) (Nature 350:
434), usando la amplificación mediante la PCR solapante. Se usaron
dos parejas de cebadores inicialmente en reacciones separadas,
seguido por su síntesis solapante en una segunda vuelta de la PCR.
En la reacción nº 1, el cebador directo (HDV49-XC)
es complementario a los nucleótidos 823-859 del
genoma de VHD, y el cebador inverso (HDV17-68) es
complementario a los nucleótidos 839-887 del genoma
de VHD, con las secuencias como sigue:
Además de sus complementariedades respectivas,
el cebador HDV49-XC contiene las secuencias de
reconocimiento que flanquean XbaI y ClaI en el extremo 5'. Se llevó
a cabo la amplificación mediante la PCR de las secuencias de VHD
mediante un protocolo de ciclación estándar a doble temperatura con
estos cebadores y la polimerasa Vent. En la reacción nº 2, el
cebador directo (SIN-HDV), que se une precisamente
con las secuencias de VHD y Sindbis, e complementario a los
nucleótidos 1-21 de Sindbis, y los nucleótidos
871-903 genómicos de VHD, y solapa la secuencia del
cebador HDV 17-68 (de la anterior) en 20
nucleótidos, y el cebador inverso (SIN276-SP6) es
complementario con los nucleótidos 299-276 de
Sindbis, con las secuencias como sigue:
Además de sus complementariedades respectivas,
el cebador SIN276-SPE contiene un codón de inicio de
la traducción que flanquea UAA y la secuencia de reconocimiento de
SpeI en su extremo 5'. Se llevó a cabo la amplificación mediante la
PCR del fragmento que contenía las secuencias del extremo 5' de
Sindbis fusionadas a las secuencias de la ribozima de VHD mediante
un protocolo de ciclación estándar a doble temperatura, usando la
polimerasa Vent, estos cebadores y el plásmido pVGSP6GEN como
plantilla. Tras la primera vuelta de la amplificación mediante la
PCR 1/20º de las cantidades totales de cada reacción nº 1 y reacción
nº 2 se combinaron y usaron como plantilla en una segunda vuelta de
amplificación mediante la PCR con entradas adicionales de los
cebadores HDV49-XC y SIN276-SPE y
un protocolo de ciclación estándar a doble temperatura. Tras la
segunda vuelta de la PCR, se purificó el amplicón de 414 pb con el
Kit Mermaid (Bio101, La Jolla, CA), y se digirió con las enzimas
ClaI y SpeI. El amplicón digerido se purificó en un gel de agarosa
al 1%, y se ligó posteriormente en el plásmido
pMCS-26s, que se digirió también con ClaI y SpeI y
se purificó en un gel de agarosa al 1%. El constructo resultante,
que contenía los elementos del casete de expresión de la ribozima
antigenómica de VHD/los 229 nt. del extremo 5' de Sindbis/la región
de unión de Sindbis/los genes de la proteína estructural de
Sindbis/la región no traducida del extremo 3' de Sindbis, se conoce
como p\delta5'26s.
La inserción del casete génico de la proteína
estructural de p\delta5'26s en el vector pcDNA3 se llevó a cabo
como sigue. Se digirió el plásmido p\delta5'26s. con la enzima
XbaI y los extremos 3' rebajados se enromaron mediante la adición
de enzima Klenow y los dNTp: El casete génico completo de la
proteína estructural de 4798 pb se purificó en un gel de agarosa al
1%. El plásmido pcDNA3 se digirió con las enzimas HindIII y ApaI y
se enromaron los extremos mediante la adición de la enzima ADN
polimerasa T4 y los dNTP, y el vector de 5342 pb se purificó en
geles de agarosa al 1%. Los dos purificados, los fragmento de ADN
del extremo enromado, se ligaron posteriormente, y el vector del
casete de expresión génica de la proteína estructural resultante se
conoce como pCMV-p\delta5'26s (véase la figura 8).
La transfección de este ADNc en células y la selección para la
resistencia a G418 se llevaron a cabo tal como se ha descrito
anteriormente.
Se pueden construir también modificaciones del
vector promotor CMC/proteína estructural de Sindbis de sentido
contrario usando otros promotores víricos, celulares, o basados en
insectos. Usando las técnicas de biología molecular comunes
conocidas en la técnica, se puede interrumpir el promotor CMV del
vector pcDNA3 de Invitrogen y sustituirse por promotores tales como
los relacionados anteriormente. Otra variaciones de este casete de
empaquetado de sentido contrario puede incluir, pero no limitarse a:
la adición de 1 o más nucleótidos entre el primer nucleótido de
Sindbis y la ribozima catalítica, el uso de otras secuencia de
ribozima catalítica para el procesamiento del transcripto, la
sustitución de una señal de terminación de la transcripción precisa
par la secuencia de la ribozima catalítica, o la expresión de
sentido contrario de los casetes génicos de la proteína estructural
usando cualquier secuencia en la dirección 3' reconocida por una ARN
polimerasa que da como resultado la transcripción de un ARNm del gen
de la proteína estructural.
Además, debería señalarse que cada uno de los
constructos inducibles mediante vector contiene las secuencias
homólogas del propio vector Sindbis. Por tanto, existe el potencial
para la generación del virus de tipo natural mediante la
recombinación entre las dos moléculas de ARN. Se hicieron
modificaciones adicionales para eliminar esta posibilidad tal como
se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras demostrar la utilidad de las soluciones
descritas aquí, se generaron líneas celulares de empaquetado
adicionales basadas en estos principios. Estas líneas adicionales
secretan la integración y la expresión de los genes de la proteína
estructural, permitiendo su transcripción como moléculas de ARN
independientes no solapantes. La expresión de la proteína de la
cápsida independientemente de las glicoproteínas E2 y E1, de cada
una de las tres proteínas independientes entre sí, elimina la
posibilidad de recombinación con el ARN del vector y la posterior
generación de virus de tipo natural contaminante.
Específicamente, la proteína de la cápsida se
expresa independientemente de un vector de expresión inducible, de
tal manera que se eliminan las secuencias que pueden dar como
resultado la recombinación con el ARN del vector. Como ejemplo, se
amplificó el gen de la proteína de la cápsida a partir del plásmido
pVGSP6GEN con una pareja de cebadores complementaria a los
nucleótidos 7632-7655 (cebador directo) y
8415-8439 (cebador inverso), con las secuencia como
sigue:
Cebador directo:
5'-GTCAAGCTTGCTAGCTACAACACCACCACCATGAATAGAG-3' | (SEC DE ID Nº. 37) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso:
5'-CAGTCTCGAGTTACTACCACTCTTCTGTCCCTTCCGGGGT-3' | (SEC DE ID Nº. 41) |
\vskip1.000000\baselineskip
Además de sus respectivas complementariedades,
el cebador directo contiene las secuencias de reconocimiento de
NheI e HindIII en su extremo 5', y el cebador inverso contiene ambos
codones de detención de la traducción UAG y UAA y la secuencia de
reconocimiento de XhoI en su extremo 5'. Se llevó a cabo la
amplificación usando un protocolo de ciclación estándar a doble
temperatura, y el amplicón resultante se digirió con las enzimas
NheI y XhoI, y se purificó en un gel de agarosa al 1%. El plásmido
de expresión pMAM (Clontech), que contiene la secuencia del
promotor LTR de MMTV inducible por dexametasona, se digirió con las
enzimas NheI y XhoI, y el ADN plásmido se purificó en un gel de
agarosa al 1%. El fragmento génico de la proteína de la cápsida s
ligó en el vector pMAM, y el constructo resultante se conoce como
pMAM-SinC. El plásmido pMAM-SinC se
transfectó en la línea celular apropiada tal como se describe
anteriormente y se llevó a cabo la selección de los transfectantes
estables usando medios HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) tal
como se describe por el fabricante.
Los genes de la glicoproteína, E1 y E2, se
expresaron conjuntamente usando uno de los sistemas inducibles
anteriormente descritos. Por ejemplo, los genes E1 y E2 se
amplificaron a partir del plásmido pVGSP6GEN usando una pareja de
cebadores complementaria con los nucleótidos
8440-8549 de Sindbis (cebador directo) y los nt.
11.384-11.364 de Sindbis (cebador inverso). Se llevó
a cabo la amplificación mediante la PCR usando un protocolo de
ciclación estándar a doble temperatura y la siguiente pareja de
oligonucleótidos:
Cebador inverso (11384R):
5'-TATATGCGGCCGCTCATCTTCGTGTGCTAGTCAG-3' | (SEC DE ID Nº. 39) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo (8440F):
5'-TATATGCGGCCGCACCACCATGTCCGCAGCACCACTGGTCACG-3' | (SEC DE ID Nº. 42) |
\vskip1.000000\baselineskip
Además de sus respectivas complementariedades,
el cebador directo contiene un codón de inicio de la traducción AUG
"en marco", y ambos cebadores contienen una secuencia de
reconocimiento de NotI en sus extremos 5'. Tras la amplificación
mediante la PCR, se digirió el amplicón con la enzima NotI y se
purificó en un gel de agarosa al 1%. A continuación se ligó el
fragmento resultante separadamente en los vectores pOP13 y pOPRSV1
(Stratagene), se digirió con NotI y se trató con fosfatasa alcalina
de intestino de ternero, tal como se ha descrito anteriormente.
Estos vectores de expresión de la glicoproteína se usaron para
transfectar las células que se habían transfectado anteriormente con
el constructo de expresión de la proteína de la cápsida.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los objetivos del ejemplo, se usará la
línea celular del mosquito Aedes albopictus para demostrar el
ensamblaje de los componentes. Sin embargo, se pueden usar otras
posibles líneas celulares parentales para crear las líneas
celulares que empaquetan Sindbis y que se han descrito
anteriormente. Se hicieron crecer células del mosquito Aedes
albopictus (ATCC No. CRL 1660) a 28ºC en CO_{2} al 5% en medio
esencial mínimo (Eagle) con aminoácidos no esenciales,
L-glutamina 2 mM, solución de sal equilibrada de
Earle, bicarbonato de sodio al 0,11%, y suero bovino fetal al 10%
(medios óptimos). Aproximadamente, 5 x 10^{5} células de
mosquito, se hicieron crecer en placas petri a 35 mM, se
transfectaron con 5 \mug de p3'SS usando 5 \mul del reactivo
lípido catiónico Transfectam (Promega), en condiciones de los medios
libres de suero, tal como sugirió el suministrador. Se puede llevar
a cabo, sin embargo, cualquier procedimiento de transfección, es
decir, mediante electroporación, precipitación con fosfato de
calcio, o usando cualquiera de las formulaciones de liposomas
catiónicos comercialmente disponibles y los procedimientos
comúnmente conocidos en la técnica. A las 24 h. después de la
transfección, las células se recubrieron con 4 ml de medios óptimos,
tal como se describe anteriormente, se suplementaron con 200
\mug/ml del antibiótico higromicina y se seleccionaron durante un
periodo de 10 a 14 días. A continuación se aislaron los clones
expandidos y se ensayaron para la expresión del represor Lac
mediante la hibridación de transferencia Northern. A continuación se
volvió a transfectar un clon individual que expresaba niveles
satisfactorios del ARNm del represor Lac con un constructo de vector
del operón Lac que expresaba las proteínas estructurales de Sindbis
(es decir, pOP13-SINSP o
pOPRSV1-SINSP), seguido por la selección del
fármaco con 200-800 \mug/ml de geneticina y se
continuó la selección con higromicina. A continuación se combinaron
las colonias que mostraron resistencia a ambos antibióticos, se
clonaron por dilución, y se propagaron. A continuación se indujeron
los clones individuales con 5 mM de IPTG durante 12 horas y se
detectaron sistemáticamente elevados niveles de expresión de la
proteína estructural de Sindbis. Se pudo ensayar la expresión
mediante análisis de transferencia western usando anticuerpos
específicos (disponible en la bibliografía), o mediante
cuantificación del ARN específico de Sindbis en un ensayo de
protección de la RNasa, usando sondas de ARN marcadas en el extremo
con ^{32}P complementarias con el ARN de la región génica de la
proteína estructural de Sindbis. Estos procedimientos de ensayo
revelan clones con niveles muy altos de expresión de la proteína
estructural en respuesta a la inducción con IPTG. A continuación se
ensayaron varios de los clones de mosquito que expresaban los más
altos (denominados como células Albopictus SINpak) para la
actividad funcional. Se ensayó la actividad funcional demostrando la
capacidad de la línea celular de empaquetar el vector que expresa
la luciferasa, y la posterior capacidad del sobrenadante de los
medios para volver a infectar las células BHK-21 y
transferir la actividad de la luciferasa.
Específicamente, se hicieron crecer células
Albopictus SINpak en placas petri de 35 mm con los medios de
selección descritos anteriormente, que contenían higromicina y
geneticina, se transfectaron con ARN sintetizado mediante
transcripción in vitro (Promega) del ADNc de
pSKSINBV-luc descrito anteriormente. 1 h. después de
la transfección, los medios se suplementaron con IPTG 5 mM. Se
cosechó el sobrenadante a las 24 h. después de la transfección y se
usó para infectar células BHK-21 directamente y se
indujo una monocapa fresca de células Albopictus SINpak tal como
anteriormente con IPTG mM durante al menos 12 h. Se cosecharon los
sobrenadantes de la infección a las 24 h. después de la infección y
se usaron a continuación para infectar una segunda monocapa de
células BHK-21, creciendo en placas petri de 35 mm.
A las 16 h. después de la infección, las células
BHK-21 se lisaron y se ensayaron para la actividad
de la luciferasa tal como se ha descrito (Promega). La comparación
de las actividades de la luciferasa obtenida de las células
BHK-21 infectadas tras la primera vuelta de
producción del vector frente a las células BHK-21
infectadas tras la segunda vuelta de producción del vector debería
demostrar al menos una diferencia de diez veces en los niveles de
expresión. Si las diferencias en los niveles son menores de las
diez veces, la reducción en la eficiencia de la transducción tras la
transferencia puede ser debida a los receptores celulares ocupados
en la línea celular idéntica que empaqueta Sindbis a partir de la
cual se produjo el vector transitorio. Esto puede indicar la
necesidad de regeneración de los vectores Sindbis pseudotipificados
para mejorar la eficiencia de la transducción en las líneas
celulares de empaquetado relacionadas con la envoltura.
\vskip1.000000\baselineskip
El estímulo para desarrollar líneas celulares
productoras del vector Sindbis queda en la pregunta de si un virus
cuya infección en células de mamíferos da como resultado casi
exclusivamente la muerte celular lítica productiva puede de algún
modo convertirse en infección persistente establecida en estas
mismas células. Una posibilidad es generar líneas celulares
productoras del vector Sindbis a partir de células de mosquito, en
las que la persistencia vírica resulta después de la infección. Sin
embargo, el título de virus infeccioso producido en las células de
mosquito infectadas persistentemente es sólo de aproximadamente 1 x
10^{4} UFP/ml, al menos cinco órdenes de magnitud menos que el
observado tras la infección lítica de las células BHK. De esta
manera, puede no ser comercialmente factible desarrollar líneas
celulares productoras del vector Sindbis derivadas de mosquito.
Se han descrito muchas estrategias para la
inducción las líneas celulares productoras del vector Sindbis,
contienen el vector y los casetes del gen estructura, de tal manera
que la infección citolítica productiva se produce sólo después del
estímulo correcto. Debido a que estas soluciones operan sobre un
nivel de "alimentación hacia delante", cualquier debilidad en
el sistema dará como resultado el inicio del ciclo de vida de
Sindbis y la muerte celular.
El hito del desarrollo es el estado de
diferenciación dependiente del modelo de expresión génica. Los
modelos de expresión génica difieren ampliamente entre los estados
no diferenciados y terminalmente diferenciados. De esta manera, es
posible que una célula, cuyo estado de diferenciación se puede
controlar sea un huésped ideal en el que derivar una línea celular
productora del vector Sindbis. En dicha configuración, el vector y
los componentes estructurales se acoplan a los promotores que
inducen el estado de diferenciación terminal, de acuerdo con la
estrategia ELVIS descrita, y se usan para transformar de manera
estable una célula huésped no diferenciada. La diferenciación
terminal de la célula huésped productora tras la inducción con los
estímulos apropiados da resultados coincidentes en la inducción del
ciclo de replicación de Sindbis y la producción del vector
empaquetado. Otras estrategias descritas en el presente documento,
que incluyen los genes estructurales de sentido contrario y los
sistemas de expresión vírica heterólogos, se acoplarían con los
promotores dependientes del estado de diferenciación celular
descritos a continuación.
\newpage
En esta solución, se describen tres ejemplos,
usando tanto un promotor vírico como uno celular que son activos
sólo en células terminalmente diferenciadas.
Se ha demostrado que Poliomavirus de ratón (Py),
SV40, y el virus de la leucemia murina de Moloney)
(M-MuLV), son capaces de infectar y entrar en las
células no diferenciadas de carcinoma embriónico de ratón (EC),
pero está bloqueada la expresión de sus genes (y los genes
heterólogos) y el establecimiento de la infección productiva
(Swartzendruber y Lehman, J. Cell. Physiol. 85:
179-188, 1975; Peries y col., J. Natl. Cancer Inst.
59: 463-465, 1977). Está propiedades de crecimiento
vírico se han demostrado en dos líneas celulares, PCC4 y F9, que se
derivan de las células troncales malignas de teratocarcinomas de
ratón. El bloqueo de la propagación vírica se produce al nivel de
la transcripción y la replicación, y lo mapas de los potenciadores,
contenidos en el interior de las regiones de control de la no
codificación (Linney y col., Nature 308: 470-472,
1984; Fujimura y col., Cell 23: 809-814, 1981;
Katinka y Yaniv, Cell 20: 393-399, 1980).
Cuando M-MuLV infecta células EC
no diferenciadas, el ADN vírico se integra en el genoma. Sin
embargo, tal como se ha establecido anteriormente, la expresión de
los genes víricos o de los genes heterólogos está bloqueada. Este
bloqueo de la expresión vírica se libera de la diferenciación
terminal de las células EC mediante la adición de ácido retinoico al
medio de crecimiento.
Para ensayar las propiedades de expresión del
ARN del constructo pVGELVIS en las células EC, se complejó ADN
plásmido con Lipofectamina (GIBCO-BRL, Gaithersburg,
MD) de acuerdo con las condiciones sugeridas por el suministrador
circa 5 \mug de ADN/8 mg de reactivo lípido) y se añadió a
pocillos de 35 mm que contenían células PCC4 o F9 no diferenciadas
(Fujimura y col. 1981. Cell 23: 809-814) a
aproximadamente una confluencia del 75%. El desarrollo de efectos
citopáticos (CPE), y el nivel de infección productiva de Sindbis,
cuantificado mediante el ensayo de placas del sobrenadante de los
medio, se determinó a intervalos regulares durante 5 días en células
PCC4 o F9 transfectadas no diferenciadas y diferenciadas. Se llevó
a cabo la diferenciación de las células F9 y PCC4 mediante la
adición de ácido retinoico (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), a
una concentración final de 1 \muM.
Se ha propuesto que la jerarquía de la expresión
relativa de los genes heterólogos observada en células EC no
diferenciadas con vectores M-MuLV puede ser en parte
dependiente de la inserción (Linney y col. 1987. J. virol. 61:
3248-3253). De esta manera, las células EC no
diferenciadas transfectadas co pVGELVIS producirán probablemente
diferentes resultados, en términos de transcripción del ADNc
genómico de Sindbis y, a la vez, las células restantes se clonaron
y expandieron. Los clones celulares se ensayaron a continuación para
la producción de virus Sindbis tras la diferenciación mediante la
adición de ácido retinoico (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), a
una concentración final de 1 \muM.
Para aislar las líneas celulares que empaquetan
el vector, cuya producción de proteínas estructurales en presencia
de NSP de Sindbis es dependiente del estado de diferenciación
celular, se transfectaron células P9 o PCC4 no diferenciadas con
pLTR/SINdIBspE y G418 seleccionados tal como se describe
anteriormente. Los clones sensibles al estado de diferenciación se
seleccionaron mediante infección de elevada multiplicidad con el
vector SIN-luc empaquetado: Los clones que son
resistentes a la lisis celular o que no producen partículas de
vector SIN-LUC empaquetado son los clones
candidatos que empaquetan el vector. Estos clones candidatos se
ensayaros para la producción de partículas del vector
SIN-luc tras la diferenciación terminal con ácido
retinoico, tal como se describe.
El poliomavirus de tipo natural de murino (Py)
es incapaz de replicarse en las líneas celulares PCC4 o F9 de
teratocarcinoma. Este bloqueo de la replicación se produce en
células no diferenciadas al nivel de la transcripción de los genes
de la región temprana (es decir, el antígeno T), y se libera
mediante la inducción de la diferenciación terminal con vitamina A.
Los mutantes Py que son capaces de establecer la infección
productiva en células PCC4 y F9 no diferenciadas mapean la región
potenciadora vírica. La génesis de un elemento potenciador
transcripcional específico del tejido embriónico ha dado como
resultado estos mutantes. Con el fin de aprovechar esta propiedad
de inhibición de la replicación de Py en líneas celulares no
diferenciadas de teratocarcinoma, la región no codificante
reguladora vírica, que incluye el potenciador, se acopla al ADN
genómico del virus Sindbis, de acuerdo con la estrategia ELVIS. Se
ha determinado el emplazamiento de inicio transcripcional preciso de
la región temprana de Py (véase Tooze, DNA Tumor Viruses). La
líneas celulares PCC4 y F9 se transforman de manera estable con los
vectores Py-Sindbis. En este modelo, se produce la
infección productiva de Sindbis tras la adición de ácido retinoico
al medio de cultivo y la inducción de la diferenciación
terminal.
La región no codificante de Py entre las bases
5021-152, que incluye las secuencias que
corresponden a los potenciadores víricos, las repeticiones de 21
pb, el origen de la replicación, las secuencias CAAT y TATA, y el
emplazamiento de la caperuza 5' de transcripción del ARNm temprano,
se sitúan en el extremo 5' vírico tal como in vivo,
únicamente se añade un resto C en caperuza único al extremo 5' de
Sindbis. Se llevo á cabo la yuxtaposición de la región no
codificante de Py y el extremo 5' de Sindbis solapando la PCR tal
como se describe con el siguiente detalle. Se llevó a cabo la
amplificación de la región no codificante de Py en la primera
reacción de la PCR primaria en una reacción que contenía el plásmido
pBR322/Py de la cadena A2 (ATCC número
45017-p53.A6.6 (pPy-1)) y la
siguiente pareja de cebadores:
Cebador director: Pybg15021F (Secuencia
tampón/secuencia de reconocimiento de BglII/Py nt
5021-5043):
5'-TATATAGATCTCTTGATCAGCTTCAGAAGATGGC | (SEC DE ID Nº. 43) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso: SINPy152R (SIN nt
5-1/Py nt 152-134):
5'-TCAATGGCGGGAAGAGGCGGTTGG | (SEC DE ID Nº. 44) |
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR
de la región no codificante de Py con la pareja de cebadores que se
muestra anteriormente usando la ADN polimerasa termoestable
Thermalase (Amresco Inc., Solon, Ohio) y el tampón que contenía
MgCl_{2} 1,5 mM, facilitado por el suministrador. Adicionalmente,
la reacción contiene DMSO al 5%, y las perlas Hot Start Wax
(Perkin-Elmer), usando el siguiente protocolo de
amplificación de la PCR que se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la amplificación del extremo 5'
de Sindbis en la segunda reacción de la PCR primaria en una reacción
que contenía el clon pVGSP6GEN y la siguiente pareja de
cebadores:
Cebador directo: (Py nt
138-152/SIN nt 1-16):
5'-CCGCCTCTTCCCGCCATTGACGGCGTAGTAC | (SEC DE ID Nº. 45) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso: (SIN nt
3182-3160):
5'-CTGGCAACCGGTAAGTACGATAC | (SEC DE ID Nº. 46) |
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación mediante la PCR de la región
del extremo 5' de Sindbis con la pareja de cebadores que se muestra
anteriormente es con las condiciones de reacción descritas
anteriormente, usando el siguiente protocolo de amplificación de la
PCR que se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de 442 pb y 3202 pb de las
reacciones de la PCR primaria se purificaron con Gene Clean (BIO
101), y se usaron conjuntamente en una reacción de la PCR con la
siguiente pareja de cebadores:
Cebador directo: Pybg15021F (Secuencia tampón
secuencia de reconocimiento de BglII/Py nt
5021-5043):
5'-TATATAGATCTCTTGATCAGCTTCAGAAGATGGC | (SEC DE ID Nº. 47) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso: (SIN nt
2300-2278):
5'-GGTAACAAGATCTCGTGCCGTG | (SEC DE ID Nº. 48) |
\newpage
La amplificación de la PCR de los productos del
amplicón de la PCR del cebador con la pareja de cebadores que se
muestra anteriormente es con las condiciones de reacción descritas
anteriormente, usando el siguiente protocolo de amplificación de la
PCR que se muestra a continuación:
el hígado fetal y los genes
\delta y \beta-globina en médula ósea de adulto
(Collins y Weissman, 1984, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Bio.31:
315).
Al menos dos líneas de eritroleucemia de ratón,
MEL y Friend, sirven como modelos para la expresión dependiente de
la diferenciación terminal de \beta-globina. Se
observó la expresión de \beta-globina en éstas
líneas sólo tras la inducción de la diferenciación terminal mediante
la adición de DMSO al 2% al medio de crecimiento.
El locus completo de la
\beta-globina está regulado por la región control
del locus (LCR). En el interior de LCR está la región control
dominante (DCR) que reside en el interior de la región de la DNasaI
hipersensible, que es la región de codificación de 5'. La DCR
contiene cinco emplazamientos de la DNAsaI hipersensible
(HS1-HS5). La DCR dirige el emplazamiento de alto
nivel independiente de la integración, el número de copias
dependiente de la expresión en un gen de
\beta-globina humano unido en ratones transgénicos
y células de eritroleucemia de ratón transfectadas de manera
estable (MEL) (Grosveld y col., 1993, CSHSQB 58:
7-12). En un reciente estudio (Ellis y col. 1993
EMBO 12: 127-134), concatámeros de un núcleo
sintético coincidentes en las secuencias en el interior de HS2
demostraron funcionar como una región control del locus.
Con el fin de llevar a cabo la expresión
dependiente del estado de diferenciación de los vectores Sindbis,
se yuxtapuso el ADNc genómico vírico con un promotor que contenía un
núcleo sintético en tándem que correspondía al emplazamiento HS2 de
LCR. Alternativamente, se puede insertar el constructo de vector
Sindbis deseado en la dirección 3' de la LCR en el gen de la
\beta-globina endógeno mediante recombinación
homóloga. En dicha estrategia, se determinaría en primer lugar el
emplazamiento de inicio de la transcripción de la
\beta-globina tras la diferenciación terminal,
con el fin de que el vector Sindbis se colocara precisamente en el
emplazamiento de inicio.
La estrategia propuesta en el presente documento
en el que la iniciación de un ciclo de vida lítico vírico está
controlada por el estado de diferenciación de las células del
huésped debería encontrar aplicación en otros sistemas, en los que
se desea el control de la citopatología vírica inducida.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la generación de clones cuya
expresión de los genes heterólogos a partir de los vectores Sindbis
situados en la configuración ELVIS tal como se describe en el
Ejemplo 3 es dependiente del estado de diferenciación, tal como se
describe a continuación para los plásmidos pVGELVIS, pLTR/Sind1BspE.
Se llevó a cabo la generación de clones cuya producción de
partículas de vector es dependiente del estado de diferenciación
transfectando los clones aislados que empaquetan el vector
dependiente de la diferenciación descritos anteriormente con
vectores de expresión de genes heterólogos ELVIS. Los clones que
tenían el fenotipo deseado o la producción del vector tras la
diferenciación inducida por ácido retinoico se aislaron tal como se
ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Entre las propiedades críticas de un sistema que
empaqueta un vector están una línea celular que expresa los
componentes estructurales necesarios para generar una partícula
infecciosa, sin la creación del virus de tipo natural mediante la
recombinación entre el vector y los componentes del gen estructural.
Estas dos propiedades deseadas de la línea celular de empaquetado
se llevaron a cabo en los sistemas basados en retrovirus mediante
la expresión constitutiva de los genes gag/pol y env en casetes de
expresión heterólogos individuales de la ARN polimerasa II.
Otro aspecto importante de las líneas celulares
que empaquetan vectores es derivar un sistema que mimetice tan
estrechamente como sea posible la estrategia de replicación normal
del virus de tipo natural. Esta característica es importante en
términos del nivel del título observado del vector recombinante
empaquetado. Se llevó a cabo la síntesis de proteínas estructurales
víricas durante la infección de Sindbis tras la transcripción de
altos niveles de ARNm subgenómico procedente del promotor de la
región de unión, seguido por la traducción eficiente en las
proteínas estructurales. El promotor de la región de unión es
funcional únicamente en la orientación de sentido contrario y se
produce la síntesis del ARN antigenómico tras la traducción de la
proteínas no estructurales, retrasando de esta manera la expresión
de la proteínas estructurales. Resulta que, con respecto a Sindbis,
sería deseable construir una línea celular de empaquetado cuya
síntesis de proteínas estructurales se inicie desde el promotor de
la región de unión, que a la vez está activado por las proteínas no
estructurales expresadas procedentes de la molécula del vector
recombinante.
Se sabe que se produce una frecuencia
relativamente alta de recombinación entre las moléculas de ARN
genómico durante la infección con el virus Sindbis mediante un
mecanismo de elección de la copia (PNAS 1991
88:3253-3257). La recombinación entre el vector y
la región de unión/casetes del gen estructural daría como resultado
la generación de virus Sindbis de tipo natural, quizás a un nivel
de 1 virus de tipo natural por millón de partículas de vector
empaquetadas (Liljestrom Bio/Technology 1991 9:
1356-1361). Una manera de mitigar la generación de
virus de tipo natural es separar los genes estructurales en casetes
de expresión separados, una solución que se ha usado muy
satisfactoriamente con líneas celulares que empaquetan retrovirus, y
se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7.
Una solución adicional para disminuir el nivel
de producción de virus de tipo natural en las líneas celulares que
empaquetan el vector Sindbis sería expresar las proteínas
estructurales bajo el control de los elementos genéticos de
Astrovirus. En la figura 10 se representa gráficamente un esquema de
esta configuración. Virus similar a Sindbis, la expresión de las
proteínas estructurales de Astrovirus incorpora una estrategia de
región de unión, en la que se sintetizan altos niveles de proteínas
estructurales procedentes de un mensajero subgenómico. El casete de
expresión de Astrovirus podría estar constituido por uno de los
siguientes elementos ordenados: (1) Promotor inducible/extremo 5'
de Astrovirus/región de unión de Astrovirus/gen estructural de
Sindbis/extremo 3' de Astrovirus, o (2) extremo 3' de Astrovirus de
sentido contrario/gen estructural de Sindbis de sentido
contrario/región de unión de Astrovirus de sentido contrario/extremo
5' de Astrovirus de sentido contrario/ribozima del virus de la
Hepatitis Delta, u otras configuraciones descritas en el Ejemplo 7.
En ambas configuraciones, la unidad de expresión está amplificada
por las proteínas no estructurales de Astrovirus mediante el mimo
mecanismo que se produce durante la replicación vírica. Debido a las
múltiples vueltas de síntesis del ARNm subgenómico iniciadas desde
la región de unión que se produce de cada unidad de expresión, la
amplificación de la unidad de expresión por las proteínas no
estructurales de Astrovirus dará como resultado la producción de
niveles muy altos de proteínas estructurales de Sindbis. La segunda
configuración del casete de expresión de la proteína estructural de
Sindbis descrito anteriormente puede funcionar mejor que la primera,
debido a que el transcripto primario del gen estructural de Sindbis
tóxico es de sentido contrario. Aunque no se debería producir la
expresión de los genes estructurales en la primera configuración
hasta la síntesis de la cadena negativa seguida por la síntesis del
ARN subgenómico procedente de la región de unión, la naturaleza de
sentido contrario del transcripto primario en la segunda
configuración representa un nivel adicional de control para evitar
la expresión de la proteína citotóxica.
Es probable que no se generara virus de tipo
natural en una línea celular de empaquetado en la que s sintetizaron
las proteínas estructurales del virus Sindbis individualmente
procedentes de los casetes de expresión de la región de unión de
Astrovirus. La recombinación entre la región de la proteína no
estructural del vector y un casete de expresión de la proteína
estructural de Astrovirus daría como resultado una molécula en la
que los elementos cis de Astrovirus se acoplarían con los genes del
virus Sindbis, una combinación no viable. El acoplamiento correcto
de los elementos cis y trans de Sindbis requeriría dos
episodios precisos de recombinación entre el vector y el casete de
expresión de Astrovirus, entre la región de unión de Astrovirus y el
ATG del gen estructural, y entre el codón de terminación del gen
estructural y el extremo 3' de Astrovirus. Con el fin de generar el
virus de tipo natural, este episodio de doble recombinación tendría
que producirse tres veces en la misma molécula (seis episodios en
total), para incorporar los tres genes separados de Sindbis.
Con el fin de disminuir cualquier posible
toxicidad de las proteínas de Astrovirus, la síntesis de los casetes
de expresión de Astrovirus está controlada por promotores
inducibles. Una posibilidad es usar el operón lac, de
acuerdo con el sistema "lac-interruptor"
descrito anteriormente en el Ejemplo 7 (Stratagene). El nivel
constitutivo de expresión del gen controlado por el operón lac en
ausencia del inductor IPTG gratuito es aproximadamente de 10 copias
de ARN por célula. El promotor inducible correspondiente al casete
de expresión de Astrovirus/gen estructural de Sindbis puede ser el
operón lac u otros promotores adecuados que tienen un nivel muy bajo
de expresión constitutiva. La construcción de líneas celulares de
empaquetado de estas configuraciones, en las que el control de las
proteínas de Sindbis está dirigido por un virus heterólogo debería
dar como resultado la generación de un título elevado de partículas
de vector empaquetadas libres de virus de tipo natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden usar diversos sistemas alternativos
para produciré los virus Sindbis recombinantes que transportan el
constructo de vector. Cada uno de estos sistemas tiene la ventaja
del hecho de que el baculovirus, y los virus de mamíferos, vaccinia
y adenovirus, se han adaptado recientemente para preparar grandes
cantidades de cualquier proteína dada para lo cual se ha clonado el
gen (Smith y col., Mol. Cell. Biol. 3: 12, 1983; Piccini y coll.,
Meth. Enzymology 153: 545, 1987; y Mansour y coll., Proc. Natl. Acad
Sci. EE.UU. 82: 1359, 1985.)
Se pueden usar estos vectores víricos para
producir proteínas en células de cultivo de tejidos mediante la
inserción de los genes apropiados en el vector vírico y se pueden
adaptar para preparar partículas de vector Sindbis.
Los vectores de adenovirus se derivan de virus
de replicación nuclear y pueden ser defectivos. Se pueden insertar
genes en los vectores y usarse para expresar proteínas en células de
mamíferos tanto mediante construcción in vitro (Ballay y
col.; EMBO J. 4: 3861, 1985), como mediante recombinación en células
(Thummel y col., J. Mol. Appl. Genetics 1:435, 1982).
Una forma de realización preferida es construir
plásmidos usando el impulso del promotor tardío mayor de adenovirus
(MLP): (1) las proteínas no estructurales de Sindbis, y (2) un
constructo de vector Sindbis modificado. Un vector Sindbis
modificado en esta configuración podría contener aún una región de
unión modificada, que permitiría al vector de ARN transcrito,
autorreplicarse como sería en un escenario natural.
A continuación s pueden usar estos plásmidos
para preparar genomas de adenovirus in vitro (Ballay y col.
Embo. J. 4: 3861, 1985). Estos genomas adenovíricos, que son de
replicación defectiva, se transfectan en células 293 (una línea
celular humana que fabrica la proteína E1A de adenovirus), para dar
como resultado depósitos de proteínas estructurales de Sindbis y el
vector Sindbis se transporta separadamente en los vectores de
adenovirus defectivos. Debido a que los títulos de dichos vectores
son normalmente de 10^{7}-10^{11}/ml, se pueden
usar estos depósitos para infectar células de cultivo de tejidos a
una elevada multiplicidad de infección. A continuación las células
producen proteínas Sindbis y genomas del vector Sindbis en niveles
elevados. Debido a que los vectores de adenovirus son defectivos,
no se producirán grandes cantidades de lisis celular directa y se
pueden cosechar los vectores Sindbis procedentes de los
sobrenadantes del cultivo.
Se pueden usar también otros vectores víricos
tales como los derivados de vectores Sindbis no relacionados (por
ejemplo, VSR, MMTV o VIH) de la misma manera para generar vectores
de células primarias. En una forma de realización, estos vectores
adenovíricos se usan en conjunción con las células primarias,
proporcionando un aumento de las preparaciones de vector
Sindbis.
Se han descrito sistemas de expresión
alternativos en los que genomas quiméricos de VIH/poliovirus dan
como resultado la generación de minireplicones quiméricos (J.
Virol. 65: 2875, 1991), capaces de expresar proteínas de fusión.
Estos minireplicones de poliovirus quiméricos se demostró
posteriormente que se encapsidaban y producían partículas
infecciosas usando un virus de vaccinia recombinante
(VV-P1) que expresa la proteína P1 precursora de la
cápsida del poliovirus sustituido que es defectiva en el
minireplicón quimérico (J. Virol. 67: 3712. 1993). En el estudio se
sustituyeron secuencia gag-pol de
VIH-1 por los genes de la cápsida VP2 y VP3 de la
cápsida P1 de poliovirus. De una manera similar, se puede sustituir
el genoma del vector Sindbis por las secuencias de la cápsida P1 y
usarse en este sistema como un medio para proporcionar vectores
Sindbis polio pseudotipificados tras transfectar in vitro
los transcriptos de ARN de Sindbis transcritos en la línea celular.
A la inversa, se pueden sustituir también proteínas estructurales de
Sindbis por las secuencias de VP2 y VP3, proporcionando
posteriormente un sistema alternativo de línea celular de
empaquetado para los vectores basados en Sindbis.
En un sistema alternativo, se usan los
siguientes componentes:
- 1.
- proteínas estructurales de Sindbis preparadas en el sistema del baculovirus de una manera similar a la descrita en Smith y col. (más arriba) (o en otros sistemas de producción de proteínas, tales como levaduras o E. coli);
- 2.
- ARN de vector vírico preparado en el conocido T7 o SP6 u otro sistema de generación de ARN in vitro (Flamant y col., J. Virol. 62: 1827, 1988);
- 3.
- ARNt preparado como en (2) o purificado de células de levadura o de cultivo de tejidos de mamíferos;
- 4.
- liposomas (con proteína env embebida); y
- 5.
- componentes necesarios de extracto celular o purificado cuando se identifican (normalmente de células de ratón) para proporcionar el procesamiento del ARN, y cualquiera de otras funciones necesarias derivadas de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de este procedimiento, se mezclaron (1),
(2) y (3) y a continuación se añadieron las proteínas de Sindbis
asociadas con env, el extracto celular y una mezcla de preliposomas
(lípido en un disolvente adecuado). Puede ser necesario embeber las
proteínas env de Sindbis en los liposomas antes de añadir el
env embebido con liposomas resultante a la mezcla de (1), (2), y
(3). Se trató la mezcla (por ejemplo, mediante sonicación,
manipulación de la temperatura, o diálisis rotatoria) para permitir
la encapsidación de las partículas víricas nascentes con la
proteína env de Sindbis embebida más el líquido de una manera
similar a la de para la encapsidación de los liposomas de los
compuestos farmacéuticos (Gould-Fogerite y col.,
Anal. Biochem. 148: 15, 1985). Este procedimiento produce títulos
elevados de replicación de vectores víricos de Sindbis incompetentes
sin la necesidad de establecer líneas celulares de empaquetado
intermedias.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la especificidad del tejido y del
tipo celular de virus Sindbis principalmente mediante las proteínas
de la envoltura codificadas por el virus, E1 y E2. Estas proteínas
estructurales de virión son glicoproteínas trasnsmembrana embebidas
en una envoltura lípida derivada de la célula huésped que se obtiene
cuando la partícula vírica brota de la superficie de la célula
infectada. La envoltura rodea una nucleocápsida icosahédrica,
comprendida por ARN genómico complejado con múltiples copias muy
ordenadas de una proteína de cápsida única. Las glicoproteínas de
envoltura E1 y E2 están complejadas como heterodímeros que parecen
ensamblarse en estructuras triméricas, formando las características
"espigas" sobre la superficie del virión. Además, las colas
citoplásmicas de estas proteínas interactúan con las
nucleocápsidas, iniciando el ensamblaje de nuevas partículas víricas
(Virology 193: 424, 1993). Las propiedades adscritas a las
glicoproteínas Sindbis individuales, unión al receptor mediante la
glicoproteína E2 (Virology 181: 694, 1991), y fusión mediada por la
glicoproteína E1 de la envoltura del virión y la membrana
endosómica, dando como resultado la liberación de la partícula de
nucleocápsida en el citoplasma (New Aspects of
Positive-Stranded RNA Virus, pp.
166-172, 1990).
La presente divulgación reconoce que perturbando
la actividad de la glicoproteína (en concreto, pero sin limitarse a
E2) y expresan simultáneamente una glicoproteína heteróloga intacta,
o creando productos génicos de envoltura híbrida (es decir,
específicamente una glicoproteína de envoltura de Sindbis que tiene
sus regiones citoplásmicas y de expansión de la membrana naturales
y las regiones de unión exógena que no se encuentran naturalmente
en la misma molécula de proteína), o sustituyendo las glicoproteínas
E2 y/o E1 con los otros alfavirus o sus derivados que difieren de
Sindbis en su tropismo de tejido, se puede alterar el intervalo de
especificidad del huésped sin interrumpir las funciones
citoplásmicas requeridas para el ensamblaje del virión. De esta
manera, se pueden producir partículas de vector Sindbis recombinante
que se unirán específicamente a las células diana preseleccionadas,
dependiendo del tropismo de la molécula de proteína o la región
introducida.
En la primera configuración, se usó la
sustitución de las glicoproteínas E1 y/o E2 de envoltura análoga
procedentes de otros alfavirus o de sus variantes para alterar el
tropismo del tejido. Por ejemplo, el virus de la encefalitis equina
de Venezuela (VEE) es un alfavirus que presenta tropismo para las
células de origen linfoide, a diferencia de su contraparte del
virus Sindbis. Por tanto, los vectores Sindbis empaquetados en las
líneas celulares que expresan la proteínas estructurales VEE
mostrarán las mismas propiedades linfotrópicas que el virus VEE
parental del cual se obtuvo el casete del gen de la proteína
estructural celular empaquetada.
Específicamente, la cepa del mono de Trinidad
del virus VEE (ATCC Nº VR-69) se propagó en células
BHK, y se extrajo el ARN del virión usando procedimientos similares
a los descritos para la clonación de Sindbis. La región de
clonación de la proteína estructural completa se amplificó con una
pareja de cebadores cuyos extremos 5' mapean, respectivamente, el
emplazamiento de inicio traduccional AUG auténtico, que incluye la
secuencia consenso de Kozak circundante, y el emplazamiento de
detención traduccional UGA. El cebador directo es complementario
con los nucleótidos 7553-7579 de VEE, y el cebador
inverso es complementario con los nucleótidos
11206-11186 de VEE (secuencia procedente de
Virology 170: 19). Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR
del ADNc de VEE correspondiente a los genes de la proteína
estructural usando un protocolo de la transcriptasa
inversa-PCR en dos etapas tal como se describe para
Sindbis, el ARN del genoma de VEE como plantilla, y la siguiente
pareja de oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo (VEE 7553F):
5'-TATATGCGGCCGCACCGCCAAGATGTTCCCGTTCCAGCCA-3' | (SEC DE ID Nº. 49) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso (VEE 11206R):
5'-TATATGCGGCCGCTCAATTATGTTTCTGGTTGGT-3' | (SEC DE ID Nº. 50) |
\vskip1.000000\baselineskip
Además de sus complementariedades respectivas
con los nucleótidos VEE indicados, cada cebador incluye una
secuencia de reconocimiento de NotI en sus extremos 5'. Tras la
amplificación mediante la PCR, se purificó el fragmento de 3800 pb
en un gel de agarosa al 1%, y a continuación se digirió
posteriormente con la enzima NotI. A continuación se ligó el
fragmento resultante separadamente en los vectores pOP13 y pOPRSV1
(Stratagene) descritos anteriormente, que se digirieron con NotI y
se trataron con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. Estos
vectores resultantes, que contienen la secuencia de codificación de
la proteína estructural de VEE completa se conocen como
pOP13-VEESP y pOPRSV1-VEESP. El uso
de estos clones en el desarrollo de las líneas celulares de
empaquetado sigue al descrito para las líneas de empaquetado de
Sindbis. Además, se construyeron también variaciones de los
vectores de expresión del gen de la proteína estructural de operón
lac-VEE usando los sistemas destacados para Sindbis
en esta patente, y las técnicas estándar conocidas en la técnica.
Además, las variantes de VEE, y otros alfavirus y sus variantes que
difieren en el tropismo del tejido, son útiles cuando se sigue esta
solución.
En la segunda configuración, se expresa una
glicoproteína heteróloga o ligando celular en la bicapa lípida de
una línea celular que es capaz de producir partículas de vector
Sindbis envueltas. Esta configuración es similar a una descrita en
el Ejemplo 6, para la producción de vectores Sindbis
pseudotipificados con VSV-G, excepto que en esta
configuración, la función de unión al receptor de E2 está inactivada
para restringir el tropismo de la partícula del vector a la cual se
suministra por la glicoproteína heteróloga o ligando celular.
Además del ejemplo de la pseudotipificación de
VSV-G, se utilizaron otras glicoproteínas víricas
que dirigen receptores celulares específicos (tales como la
proteína gp120 de VIH retrovírico para el direccionamiento de las
células CD4) cuando se expresaron de vectores estándar transfectados
de manera estable en las líneas celulares que empaquetan
Sindbis.
En la tercera configuración, se prepararon
también glicoproteínas quiméricas, que permiten el direccionamiento
de los vectores víricos Sindbis en líneas células concretas in
vitro o tipos de tejidos in vivo. Para construir dicha
glicoproteína quimérica, se usaron oligocebadores específicos que
contenían la región de unión al ligando del receptor deseado, más
las secuencias de Sindbis homólogas (que incluyen un emplazamiento
único de la endonucleasa de restricción específica), para
amplificar una secuencia de inserto que se puede sustituir en el
vector de expresión de la proteína estructural de Sindbis.
Alternativamente, se llevaron a cabo digestiones de
Bal-31 limitadas de un emplazamiento de enzima de
restricción conveniente, con el fin de volver a digerir un
emplazamiento de inserción permitido, seguido por el enromado del
extremo de la ligadura de un fragmento que codifica la región
pequeña de unión al receptor, o una glicoproteína vírica completa o
ligando superficial celular. Como ejemplo, se pueden usar los
péptidos correspondientes a la región de neutralización principal
de la proteína de envoltura gp120 de VIH (Virology 185:820, 1991)
para interrumpir el tropismo normal de E2 y proporcionar el
direccionamiento celular de CD4.
Mientras que el ejemplo de la gp120 de VIH
ilustra una proteína híbrida, la posibilidades no se limitan a las
glicoproteínas híbridas. Por ejemplo, la porción de unión al
receptor de la interleucina-2 humana está combinada
con la(s) proteína(s) de la envoltura de Sindbis para
dirigir los vectores en las células con los receptores de
Il-2- Además, se usó la técnica anterior para crear
una partícula de vector Sindbis recombinante con las proteínas de
la envoltura que reconocen las porciones Fc de los anticuerpos. A
continuación se unieron los anticuerpos monoclonales que reconocían
únicamente las células diana preseleccionadas e infectaron
únicamente aquellas células diana preseleccionadas (por ejemplo,
células tumorales). Alternativamente, se usó una envoltura híbrida
con la región de unión de la avidina para dirigir las células que se
habían recubierto con anticuerpos biotinilados u otros ligandos. El
paciente es inundado en primer lugar con anticuerpos, y a
continuación se permitió eliminar el anticuerpo no enlazado y no
específicamente enlazado antes de administrar el vector. La elevada
afinidad (10-15) del emplazamiento de unión de la
avidina para la biotina permitirá el direccionamiento parecido y
eficiente del tejido original identificado mediante la "imagen"
monoclonal.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de administrar la dosis terapéutica
apropiada de vectores a individuos, es deseable derivar un
procedimiento por el cual se puedan determinar fácilmente las
unidades infecciosas del vector contenidas en una preparación. Se
lleva esto a cabo mediante la generación de una línea celular que
expresa \beta-galactosidasa u otro gen indicador
únicamente cuando la proteínas no estructurales de Sindbis funcional
están presentes en la célula. Se puede infectar la línea celular
con diluciones crecientes de una preparación de vector Sindbis de
tal manera que las células individuales no se infecten con más de
una partícula de vector, permitiendo determinar el título, o las
unidades de vector, De esta manera, la línea celular es un ensayo de
las partículas funcionales presentes en una preparación de
vector.
\vskip1.000000\baselineskip
En una configuración, se construyó un casete de
expresión eucariota que contenía la secuencia del extremo 5' capaz
de iniciar la transcripción del ARN de Sindbis, una región de unión
de Sindbis, un gen indicador, una secuencia de reconocimiento de la
ARN polimerasa del extremo 3' de Sindbis para la síntesis de la
cadena menos. Este casete se sitúa en una orientación de sentido
contrario, adyacente al promotor transcripcional eucariota.
Adicionalmente, estos constructos pueden contener también una
secuencia de ribozima catalítica inmediatamente adyacente al
nucleótido 1 de la secuencia del extremo 5' de Sindbis que dará como
resultado la rotura del transcripto de ARN primario precisamente
después del nucleótido de Sindbis. En esta orientación de sentido
contrario, no se puede traducir el gen indicador y es dependiente
completamente de la presencia de las proteínas no estructurales de
Sindbis para la transcripción en el ARNm de la cadena positiva antes
de la expresión del gen indicador. Estas proteínas no estructurales
proporcionarán que se titule la preparación del vector Sindbis.
Además, esta configuración, si se diseña para contener el genoma y
las secuencias 5' y 3' precisas de Sindbis, permitirá a los
transcriptos del gen indicador experimentar la amplificación
utilizando las mismas proteínas no estructurales proporcionadas por
el vector Sindbis.
Un ejemplo de esta construcción de valoración de
sentido contrario es como sigue. Se digirió el plásmido pSKSINB
V-lacZcon la enzima SacI, que rompe inmediatamente
después del extremo 3' y la secuencia poli A de Sindbis. Se enromó
el extremo 3' sobresaliente, mediante la adición de la enzima ADN
polimerasa T4 y los dNTP, seguido por la incubación durante 10
minutos a 16ºC. Se inactivó térmicamente la ADN polimerasa T4
mediante la incubación a 75ºC durante 15 minutos. El plásmido
linealizado posteriormente se digirió con la enzima BamHI, se cortó
en el nucleótido 7335, en la dirección 5' de la región de unión de
Sindbis. El fragmento resultante se purificó en un gel de agarosa
al 1% y se ligó con pMCS-26s (descrito en el Ejemplo
7) que se había digerido con la enzima XbaI, con el extremo
enromado tal como se describe anteriormente, se digirió con el
BamHI, se purificó en un gel de agarosa al 1%, y se desfosforiló
con fosfatasa alcalina de intestino de ternero.
El constructo resultante, conocido como
pMCS-LacZ, se modificó a continuación para contener
los 299 nucleótidos del extremo 55' de Sindbis, fusionados con una
secuencia de ribozima de 84 nucleótidos procedente de la cadena
antigenómica del virus de la hepatitis delta (VHD), usando la
amplificación mediante la PCR solapante (descrita en detalle,
Ejemplo 7). Se usaron dos parejas de cebadores inicialmente en las
reacciones separadas de la PCR, seguido por su síntesis solapante
en la segunda vuelta de la PCR. La reacción nº 1 contiene los
cebadores HDV17-68 y HDV49-XC y la
reacción nº 2 contiene los cebadores SIN-HDV y
SIN276-SPE y el plásmido pVGSP6GEN como plantilla.
Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR mediante un
protocolo de ciclación estándar a doble temperatura. Tras la
primera vuelta de amplificación mediante la PCR, 1/20º de las
cantidades totales de cada reacción nº 1 y reacción nº 2 se combinó
y se usó como plantilla en una segunda vuelta de amplificación
mediante la PCR con los cebadores HDV49-XC y
SIN276-SPE y un protocolo de ciclación estándar a
doble temperatura. Tras la segunda vuelta de la PCR, se purificó el
amplicón de 414 pb con el Kit Mermaid (Bio101, La Jolla, CA), y se
digirió con las enzimas Cla y SpeI. El amplicón digerido se purificó
en un gel de agarosa al 1%, y se ligó posteriormente en el plásmido
pMCS-LacZ, que se digirió también con ClaI y SpeI y
se purificó en un gel de agarosa al 1%. El constructo resultante,
que contenía los elementos del casete de expresión de la ribozima
antigenómica de VHD/299 nt del extremo 5' de Sindbis/región de
unión/gen LacZ/región no traducida del extremo 3', se conoce como
pd5'LacZ.
El casete de expresión de LacZ del plásmido
pd5'LacZ se insertó posteriormente en pcDNA3 (Invitrogen Corp., San
Diego, CA).El plásmido pd5'LacZ se digirió con la enzima NotI, con
el extremo enromado tal como se describe anteriormente, y se
digirió a continuación con la enzima XbaI. Se purificó el fragmento
en un gel de agarosa al 1% y se ligó con pcDNA3 que se digirió con
la enzima HindIII, con el extremo enromado, y a continuación se
digirió con XbaI. El constructo resultante, que contenía un promotor
CMV que transcribe un ARN del casete indicador de sentido contrario
de la configuración secuencia del extremo 3' de Sindbis/gen
LacZ/región de unión/secuencia del extremo 5' de Sindbis/ribozima
de VHD, se conoce como pSINjra\beta-gal.
Se derivaron las células
BHKSINjra\beta-gal mediante transfección de 5 x
10^{5} células BHK-21, se hicieron crecer en una
placa petri de 60 mm, con 5 \mug del vector
pSINjra\beta-gal complejado con el reactivo
policatiónico Transfectam (Promega, Madison WI). A las 24 h después
de la transfección, se suplementaron los medios con 400 \mug/ml
de G418 (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Después que hubieran muerto
todas las células transfectadas y las colonias resistentes a G418
comenzaran a dividirse, se retiraron las células de la placa
mediante tripsinización, se combinaron, y a continuación se clonaron
por dilución limitante. Se ensayaron varios clones par la
producción de \beta-galactosidasa funcional,
mediante la infección con un título conocido de un depósito de
virus Sindbis de tipo natural. Se determinó la producción de
\beta-galactosidasa en los clones
BHKSINjra\beta-gal candidatos a la 6 h. después de
la infección fijando en primer lugar células creciendo en PBS con
una solución que contenía formaldehído al 2% (solución madre al
37%)/glutaraldehído al 0,2%, tiñendo a continuación la células con
una solución que contenía ferricianuro de potasio 0,5
mM/ferrocianuro de potasio 0,5 mM/MgCl_{2} 2 mM/1 mg/ml de X.gal.
Son claramente visible células azules a las 3 h. con la condición
de que el depósito de virus Sindbis no contenga un nivel elevado de
partículas interferentes defectivas (DI), se determinó que el
título del virus mediante el ensayo de placas en células
BHK-21 debería ser similar al del título observado
mediante la tinción X-gal en las células
BHKSINjra\beta-gal.
Se determinó el título de diversas preparaciones
de vector Sindbis, en unidades de vector, producidas de líneas
celulares de empaquetado tales como las descritas en el Ejemplo 7,
mediante la infección de monocapas confluentes de células
BHKSINjra\beta-gal.
Con varias diluciones del vector. Se determinó
el título de la preparación del vector a las 6 h. después de la
infección mediante la visualización de las células que producen la
proteína \beta-galactosidasa, tal como se
describe anteriormente. Debido a que los vectores Sindbis descritos
no contienen la región vírica correspondiente a los genes
estructurales, no es posible determinar el título de una preparación
de vector mediante el ensayo de placas en células
BHK-21.
Alternativamente, se produjo una línea celular
de valoración usando una configuración de casete indicador
diferente, que está constituida por un promotor eucariota/secuencia
del extremo 5' de Sindbis reconocida por la transcriptasa
vírica/región de unión de Sindbis/gen indicador/secuencia de
reconocimiento de la ARN polimerasa de Sindbis para la síntesis de
la cadena menos, y se expresa en una orientación de sentido directo.
Este casete de expresión indicador requiere la síntesis, mediante
las proteínas no estructurales de Sindbis suministradas por el
vector, en una molécula de ARN de sentido contrario, antes de la
transcripción del mensajero subgenómico que codifica el gen
indicador.
Específicamente, se creó el constructo
empaquetado con orientación de sentido directo como sigue. Se
digirió el plásmido PVGELVIS con la enzima ApaI, que rompe en el
nucleótido 11737, justo en la dirección 3' del extremo 3' de
Sindbis. El ADN digerido con ApaI se enromó en el extremo mediante
la adición de ADN polimerasa T4 y los DNTp y la incubación a 16ºC
durante 10 minutos. Tras la inactivación térmica de la polimerasa,
el fragmento de ADN se digirió con la enzima SfiI, y el fragmento
de 10041 pb se purificó en un gel de agarosa al 1%. El plásmido
pSKSINBV-lacZ se digirió con la enzima SacI y s
enromó en el extremo tal como se describe anteriormente. A
continuación se digirió el fragmento con SfiI, y el fragmento de
7pkb se purificó en un gel de agarosa al 1%. El fragmento
pSKSINBVlacZ de 7 kb se ligó a continuación en el fragmento pVGELVIS
purificado para crear el plásmido pELVIS-bgaI. Este
plásmido contiene las proteínas no estructurales de Sindbis
completo, la región de unión, el gen LacZ y la secuencia de
reconocimiento de la replicasa del extremo 3' de Sindbis, bajo el
control del promotor LTR de MuLV. El plásmido
pELVIS-bgaI se digirió con BspEI, se purificó
mediante Geneclean (Bio 101 corp., San Diego, CA) y se volvió a
ligar por sí mismo. BspEI elimina las secuencias génicas de la
proteína no estructural de Sindbis entre los nt
422-7054. El constructo vuelto a enlazar contiene
una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción del ARN
de Sindbis, la región de unión de Sindbis, las secuencias que
codifican el gen LacZ, y las secuencias del extremo 3' de Sindbis
necesarias para la síntesis de un ARN de cadena menos, todas en la
dirección 3', y bajo el control transcripcional de un promotor
MuLV-LTR. Se conoce este constructo como
pELVISdINSP-bgal.
Se transfectó el plásmido
pELVISdINSP-bgal en células BHK y se ensayó tal como
se ha descrito anteriormente. Las células BHK
pELVISdINSP-bgal producen un transcripto de ARN con
una secuencia del extremo 5' que está reconocida por la
transcriptasa de Sindbis, una región de unión de Sindbis, las
secuencias que codifican el gen LacZ, y las secuencias del extremo
3' de Sindbis necesarias para la síntesis del ARN de la cadena
menos. Se evitó la expresión de la
\beta-galactosidasa del transcripto primario a que
el marco de lectura abierto y los codones de detención en la
dirección 5' creados, darán como resultado la transcripción de los
transcriptos de LacZ activos procedentes de la región de unión de
Sindbis, tras la síntesis inicial de un intermedio de sentido
contrario. Además, esta configuración, se diseña para contener el
genoma y las secuencias 5' y 3' precisas de Sindbis, que permitirán
a los transcriptos del gen indicador experimentar la amplificación
utilizando las mismas proteínas no estructurales proporcionadas por
el vector Sindbis.
En otra configuración, se produjo una línea
celular de valoración usando un casete de expresión que contenía un
gen indicador de sentido contrario seguido por las secuencias de
reconocimiento de la replicasa del extremo 3' de Sindbis, situadas
en la orientación de sentido directo. Este constructo, bajo el
control de un promotor eucariota, produce un transcripto de ARN que
está reconocido y se transcribe mediante las proteínas no
estructurales de Sindbis proporcionadas por el vector que se va a
valorar. Las proteínas no estructurales de Sindbis reconocen las
secuencias en el transcripto indicador primario, y a la vez,
sintetizan un transcripto indicador de sentido directo. Este
constructo no se beneficia de la amplificación del transcripto del
gen indicador, pero debería proporcionar aún suficientes
transcriptos para permitir la valoración del vector.
La construcción de este tipo de casete de
valoración es como sigue. Se digirió el vector
pSV-B-galactosidasa (Promega Corp.,
Madison, WI) con la enzima HindIII y se enromó el extremo tal como
se describe anteriormente. Se digirió adicionalmente el plásmido
con las enzimas BamHI y XmnI para eliminar el gen LacZ, y reducir el
tamaño del fragmento restante. El fragmento de 3737 nt., que
contiene el gen LacZ, se purificó en un gel de agarosa al 1% y se
ligó en pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) que se había digerido con
las enzimas BamHI y EcoRV. El nuevo constructo de plásmido se
conoce como pcDNAaLacZ. Se digirió el plásmido con la enzima ApaI,
se enromó en el extremo tal como anteriormente, y se digirió
adicionalmente con la enzima XhoI. El plásmido pSKSINBV (descrito
anteriormente) se digirió con SacI, se enromó en el extremo tal como
anteriormente, y a continuación se digirió con XhoI.
El fragmento de 146 nt. resultante que contenía
la secuencia de reconocimiento 3' de la replicasa de Sindbis se
purificó en un gel de agarosa al 1,2%, se ligó en el vector
pcDNAaLacZ digerido. El constructo vuelto a enlazar contiene un gen
LacZ de sentido contrario y una secuencia de reconocimiento 3' de la
proteína replicasa de Sindbis en la dirección 3' de un promotor
CMV. Se conoce el constructo resultante como
pcDNAaLacZ-3'Sin. Se transfectó el constructo en
células BHK y se utilizó tal como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un fragmento de BamHI de 1,8 kb que
contenía la región precore/core completa de la hepatitis B
procedente del plásmido pAM6 (ATCC Nº 45020) y se ligó en el
emplazamiento BamHI de KS II^{+} (Stratagene, La Jolla, CA). Se
designó este plásmido como KS II+ HBpc/c. Se añadieron los ligantes
XhoI al emplazamiento Stu del prenúcleo/núcleo en el KS II^{+}
HBpc/c (en el nucleótido 1.704 de la secuencia), seguido por rotura
con HincII (en el nucleótido 2.592 de la secuencia). Se clonó el
fragmento precore/core XhoI-HincII de 877 pares de
bases resultante en el emplazamiento XhoI/HincII de SK II^{+}. Se
designó este plásmido como SK^{+}HBe.
\vskip1.000000\baselineskip
Se secuenció el gen precore/core en el plásmido
KS II^{+} HB pc/c para determinar si la región de codificación
precore/core es correcta. Se encontró que esta secuencia tenía una
delección en la pareja de bases única que producía un cambio de
marco en el codón 79 que daba como resultado dos codones de
detención TAG en marcos consecutivos en los codones 84 y 85. Se
corrigió esta delección mediante la extensión del solapamiento de
la PCR (Ho y col., Gene 77: 51, 1989) de la región de codificación
precore/core en el plásmido SK^{+} HBe. Se usaron cuatro
oligonucleótidos para las 3 reacciones de la PCR llevadas a cabo
para corregir la delección.
La primera reacción utiliza dos cebadores: La
secuencia del cebador de sentido directo corresponde a la secuencia
de los nucleótidos 1.805 a 1.827 de la cadena adw y contiene
dos emplazamientos de restricción XhoI en el extremo 5'. La
numeración de la secuencia de nucleótidos se obtuvo del Genbank
(Intelligenics, Inc., Mountain View, CA).
5' CTC GAG CTC GAG GCA CCA GCA CCA TGC AAC TTT TT-3' | (SEC DE ID Nº. 51) |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia del segundo cebador corresponde a
la secuencia de los nucleótidos de sentido contrario 2.158 a 2.130
de la cadena adw del virus de la hepatitis B, e incluye los
codones 79, 84 y 85.
5'-CTA CTA GAT CCC TAG ATG CTG GAT CTT CC-3' | (SEC DE ID Nº. 52) |
\vskip1.000000\baselineskip
La segunda reacción utiliza también dos
cebadores. El cebador de sentido directo corresponde a la secuencia
de los nucleótidos 2.130 a 2.158 de la cadena adw, e incluye
los codones 79, 84 y 85.
5'-GGA AGA TCC AGC ATC TAG GGA TCT AGT AG-3' | (SEC DE ID Nº. 53) |
\vskip1.000000\baselineskip
El segundo cebador corresponde a la secuencia de
nucleótido de sentido contrario del poliligante del plásmido
SK^{+} y contiene un emplazamiento ClaI de 135 pb en la dirección
3' del codón de detención de la región de codificación precore/core
de VHB.
5'-GGG CGA TAT CAA GCT TAT CGA TAC CG-3' | (SEC DE ID Nº. 54) |
\vskip1.000000\baselineskip
La tercera reacción utiliza también dos
cebadores. El cebador de sentido directo corresponde a la secuencia
de los nucleótidos 5 a 27 de la cadena adw, y contiene dos
emplazamientos de restricción XhoI en el extremo 5'
5'-CTC GAG CTC GAG GCA CCA GCA CCA TGC AAC TTT TT | (SEC DE ID Nº. 55) |
\vskip1.000000\baselineskip
La segunda secuencia del cebador corresponde a
la secuencia de nucleótidos de sentido contrario del poliligante del
plásmido SK^{+} y contiene un emplazamiento ClaI de 135 pb en la
dirección 3' del codón de detención de la región de codificación
precore/core de VHB
5'-GGG CGA TAT CAA GCT TAT CGA TAC CG-3' | (SEC DE ID Nº. 56) |
\vskip1.000000\baselineskip
La primera reacción de la PCR corrige la
delección en la cadena de sentido contrario y la segunda reacción
corrige la delección en las cadenas de sentido directo. Las
reacciones de la PCR una y dos corrigen la mutación de CC a CCA que
se produce en el codón 79 y la sustitución de un par de bases de TCA
a TCT en el codón 81. El cebador 1 contiene dos emplazamientos XhoI
consecutivos de 10 pb en la dirección 5' del codón ATG de la región
de codificación de VHB e y el cebador 4 contiene un emplazamiento
ClaI de 135 pb en la dirección 3' del codón de detención de la
región de codificación precore/core de VHB. Los productos de la
primera y segunda reacciones de la PCR se extienden en una tercera
reacción de la PCR para generar una región de codificación
precore/core completa de VHB con la secuencia correcta.
Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo
usando las siguientes condiciones de ciclación: la muestra se
calentó inicialmente a 94ºC durante 2 minutos. Esta etapa,
denominada etapa de fusión, separa el ADN de doble cadena en
cadenas únicas par la síntesis. A continuación se calentó la muestra
a 56ºC durante 30 segundos. Esta etapa, denominada etapa de
templado, permite a los cebadores templar el ADN de cadena única
producido en la primera etapa. A continuación se calentó la muestra
a 72ºC durante 30 segundos. Esta etapa, denominada etapa de
extensión, sintetiza la cadena complementaria del ADN de cadena
única producido en la primera etapa. Se llevó a cabo una segunda
etapa de fusión a 94ºC durante 30 segundos, seguida por una etapa de
templado a 56ºC durante 30 segundos que se continuó por una etapa
de extensión a 72ºC durante 30 segundos. A continuación se repitió
este procedimiento durante 35 ciclos dando como resultado la
amplificación del producto de ADN deseado.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El producto de reacción de la PCR se purificó
mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y se transfirió
sobre un papel NA 45 (Schleicher and Schuell, Keene, New Hampshire).
El fragmento de ADN de 787 pb deseado se eluyó del papel NA 45
incubando durante 30 minutos a 65ºC en 400 \mul de tampón de sal
alta (NaCl 1,5 M, Tris 20 mM, pH 8,0, y EDTA 0,1 mM). Tras la
elución, se añadieron 500 \mul de fenol:cloroformo:alcohol
isoamílico (25:24:1) a la solución. Se sometió la mezcla a
vortización y a continuación se centrifugó a 14.000 rpm durante 5
minutos en centrífuga Brikmann Eppendorf (5415L). La fase acuosa,
que contenía el fragmento de ADN deseado, se transfirió a un tubo
de micrófuga de 1,5 ml nuevo y se añadieron 1,0 ml de EtOH al 100
%. Se incubó la solución en hielo seco durante 5 minutos, y a
continuación se centrifugó durante 20 minutos a 10.000 rpm. Se
decantó el sobrenadante, y se enjuagó el residuo con 500 \mul de
EtOH al 70%. Se secó el residuo mediante centrifugación a 10.000
rpm a vacío, en un concentrador
Savant-Speed-Vac, y a continuación
se volvió a suspender en 10 \mul de H_{2}O desionizada. Se
analizó un microlitro del producto de la PCR mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1,5% El fragmento amplificado
mediante la PCR precore/core de XhoI-ClaI de 787 pb
se clonó en el emplazamiento XhoI-ClaI del plásmido
SK^{+}. Se designó este plásmido como
SK^{+}HBe-c. Se transformó E. coli (DH5
alpha, Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD) con el plásmido
SK^{+}HBe-c y se propagó para generar el ADN
plásmido. A continuación se aisló y purificó el plásmido,
esencialmente tal como se describe por Bimboim y col. (Nuc. Acid
Res. 7: 1513, 1979; véase también Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Sambrook y col. (eds.), Cold Spring Harbor Press, 1989). Se
analizó el plásmido SK+HBec para confirmar la secuencia del gen
precore/core (figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
La delección del par de bases único en el
plásmido SK^{+} HBe se corrigió mediante la extensión del
solapamiento de la PCR tal como se describe en el Ejemplo 9B. Se
usaron cuatro cebadores de oligonucleótidos para las reacciones de
la PCR llevadas a cabo para corregir la mutación.
La primera reacción utiliza dos cebadores. El
cebador de sentido directo corresponde a la secuencia de nucleótidos
del promotor T-7 del plásmido SH^{+}HBe.
5'-AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3' | (SEC DE ID Nº. 57) |
\vskip1.000000\baselineskip
La segunda reacción corresponde a la Secuencia
de sentido contrario de 2.158 a 2.130 de la cadena adw, e
incluye los codones 79, 84 y 85.
5'-CTA CTA GAT CCC TAG ATG CTG GAT CTT CC-3' | (SEC DE ID Nº. 58) |
\vskip1.000000\baselineskip
La segunda reacción utiliza dos cebadores. El
cebador de sentido contrario corresponde a la secuencia de
nucleótidos del promotor T-3 presente en el plásmido
SK^{+}HBe.
5'-3': ATT AAC CCT CAC TAA AG | (SEC DE ID Nº. 59) |
\vskip1.000000\baselineskip
El segundo cebador corresponde a la secuencia de
nucleótidos de sentido directo 2.130 a 2.158 de la cadena
adw, e incluye los codones 79, 84 y 85.
5'-GGA AGA TCC AGC ATC TAG GGA TCT AGT AG-3' | (SEC DE ID Nº. 60) |
\vskip1.000000\baselineskip
La tercera reacción utiliza dos cebadores. El
cebador de sentido contrario corresponde a la secuencia de
nucleótidos del promotor T-3 presente en el plásmido
SK^{+}HBe.
5'-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3' | (SEC DE ID Nº. 61) |
\vskip1.000000\baselineskip
El segundo cebador corresponde a la secuencia de
sentido directo del promotor T-7 presente en el
plásmido SK^{+}HBe.
5'-AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3' | (SEC DE ID Nº. 62) |
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de la PCR de la tercera reacción dio
como resultado la secuencia correcta de la región de codificación
precore/core de VHB.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aislar la región de codificación core de
BHB, se diseñó un cebador para introducir el emplazamiento de
restricción XhoI en la dirección 5' del codón de inicio ATG de la
región de codificación core, y eliminar los 29 aminoácidos de la
secuencia líder de la región de codificación precore de VHB. En una
cuarta reacción, se produjo la región de codificación core de VHB
usando el producto de la PCR de la reacción y los dos siguientes
cebadores.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El cebador de sentido directo corresponde a la
secuencia de los nucleótidos 1.885 a 1.905 de la cadena adw y
contiene dos emplazamientos XhoI en el extremo 5'.
5'-CCT CGA GCT CGA GCT TGG GTG GCT TTG GGG CAT G-3' | (SEC DE ID Nº. 63) |
\vskip1.000000\baselineskip
El segundo cebador corresponde a la secuencia de
nucleótidos de sentido contrario del promotor T-3
presente en el plásmido SK^{+} HBe. El producto de la PCR de
aproximadamente 600 pb de la cuarta reacción contiene la región de
codificación core de VHB y emplazamientos de restricción XhoI
novedosos en el extremo 5' y los emplazamientos de restricción ClaI
en el extremo 3' que estaban presente en el emplazamiento
multiclonación del plásmido SK+ HBe
5'-ATT ACC CCT CAC TAA AG-3' | (SEC DE ID Nº. 64) |
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la cuarta reacción de la PCR, se transfirió
la solución a un tubo de micrófuga de 1,5 ml nuevo. Se añadieron
cincuenta microlitros de acetato de sodio 3 M a esta solución
seguido por 500 \mul de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Se
sometió la mezcla a vortización y a continuación se centrifugó a
14.000 rpm durante 5 minutos. La fase acuosa se transfirió a un
tubo de micrófuga reciente y se añadieron 1,0 ml de EtOH al 100%. Se
incubó esta solución a -20ºC durante 4,5 horas, y a continuación se
centrifugó a 10.000 rpm durante 20 minutos.
Se decantó el sobrenadante, y se enjuago el
residuo con 500 \mul de EtOH al 70%. Se secó el residuo mediante
centrifugación a 10.000 rpm a vacío y a continuación se volvió a
suspender en 10 \mul de H_{2}O desionizada. Se analizó un
microlitro del producto de la PCR mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1,5%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un fragmento NCOI TaqI de 642 pb que
contenía el marco de lectura abierto X del virus de la hepatitis B
procedente del plásmido pAM6 (adw) (ATCC 45020), enromado mediante
el fragmento Klenow, y se ligó en el emplazamiento HincII de
SK^{+} (Stratagene, La Jolla, California). Se transformó E.
coli (DH5 alpha, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg,
MD) con la reacción de ligadura y se propagó. A continuación se
aisló y purificó ADN miniprep, esencialmente tal como se describe
por Birnboim y col. (Nuc. Acid Res. 7: 15134, 1979; Molecular
Cloning A Laboratory Manual, Sambrook y col. (eds.), Cold Spring
Harbor Press, 1989).
Debido a que este fragmento se puede insertar en
cualquier orientación, se seleccionaron clones que tenían la
orientación de sentido directo con respecto a los emplazamientos
XhoI y ClaI en el emplazamiento multiclonación SK^{+}. Más
específicamente, se digirieron los ADN miniprep con la enzima de
restricción diagnóstico, BamHI. Los insertos en la orientación
correcta dieron como resultado dos fragmentos de 3,0 kb y 0,6 kb de
tamaño. Los insertos en la orientación incorrecta dieron como
resultado dos fragmentos de 3,6 kb y 0,74 kb. Se seleccionó un clon
con la orientación correcta y se designó como SK-X
Ag.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la construcción de un vector
Sindbis que expresaba la secuencia VHBe-c digiriendo
el plásmido SK^{+}HBe-c con los emplazamientos de
las enzimas de restricción XhoI y ClaI para liberar un fragmento de
ADNc que codifica las secuencias VHBe-c. A
continuación se aisló el fragmento mediante electroforesis en gel
de agarosa, se purificó con Gene Clean^{TM} (BIO101, San Diego,
CA), y se insertó en el esqueleto del vector Sindbis deseado,
preparado mediante digestión con XhoI y ClaI, y se trató con CIAP.
Los vectores Sindbis descritos en el Ejemplo 2, son adecuados para
la inserción de las secuencias del antígeno de VHB. Dichos vectores
Sindbis incluyen pKSSINBV, pKSSINdIJRsjrc, pKSSINdIJRsjrPC,
pKSSINdIJRsjrNP(7582-7601) y
pKSSINdIJRsexjr.
Se llevó a cabo la construcción de un vector
Sindbis que expresaba la secuencia core de VHB mediante tratamiento
con Gene Clean^{TM} del producto de la PCR descrito anteriormente.
A continuación se digirió el producto amplificado con los
emplazamientos de la enzima de restricción XhoI y ClaI, se aisló con
electroforesis en gel de agarosa, se purificó mediante Gene
Clean^{TM} y se ligó en los mismos vectores Sindbis descritos
anteriormente pretratados con las enzimas XhoI y ClaI.
[Se llevó a cabo la construcción de un vector
Sindbis que expresaba la secuencia del antígeno de
VHB-X digiriendo el plásmido SK-X
Ag con los emplazamientos de la enzima de restricción XhoI y ClaI
para liberar el fragmento de ADNc que codificaba las secuencias
VHB-X. Se aisló el fragmento mediante electroforesis
en gel de agarosa, se purificó usando Gene Clean^{TM}, y se
insertó en los esqueletos de los vectores Sindbis deseados,
descritos anteriormente, pretratados con las enzimas XhoI y
ClaI.
Los vectores que expresan VHB de Sindbis
anteriores se pueden también modificar para expresar simultáneamente
un marcador de la resistencia a un fármaco seleccionable
dependiente de las necesidades del experimento o el tratamiento de
las células infectadas con el vector. Se puede diseñar cualquiera de
los vectores de expresión de VHB de Sindbis anteriores descritos
para expresar simultáneamente la resistencia a G418. Se llevó esto
a cabo mediante la incorporación de un emplazamiento interno de
entrada de la ribozima (Ejemplo 5) seguido por el gen de la
neomicina fosfotransferasa bacteriano colocado a 3' de las
secuencias de codificación de VHB y a 5' del extremo 3' terminal
del vector que usa el emplazamiento de clonación múltiple del
vector. Se pueden usar estos constructos de vector resistentes a
G418 para seleccionar células infectadas con vectores par la
generación de dianas CTL específicas de VHB en las siguientes
secciones.]
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon lisados celulares de células
infectadas mediante cualquiera de los vectores que expresan VHB
lavando 1,0 x 10^{7} células cultivadas con PBS, volviendo a
suspender las células en un volumen total de 600 \mul en PBS, y
sonicandolas durante dos periodos de 5 segundos en un sonicador
Branson Modelo 350 (Fisher, Pittsburgh, PA) con un ajuste de 30 in,
o mediante congelación y descongelación tres veces. Los lisados se
clarificaron mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 5
minutos.
Se ensayaron el antígeno core y el antígeno
precore en los lisados celulares y se secretó antígeno e en el
sobrenadante del cultivo usando el kit rDNA EIA para HBe de Abbot
(Abbott Laboratories Diagnostic Division, Chicago, IL). Se llevó a
cabo otro ensayo EIA sensible para antígeno precore en lisados
celulares y antígeno e secretado en el sobrenadante del cultivo
usando el kit ETI-EB de Incstar (Incstar
Corporation, Stillwater, MN). Se generó una curva patrón de las
diluciones del antígeno core de hepatitis B recombinante y el e
obtenido de Biogen (Ginebra, Suiza).
Usando estos procedimientos se expresaron
aproximadamente 10 ng/ml de antígeno e en las líneas celulares
transducidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la caracterización de los
antígenos precore/core y e expresado por células infectadas con
vector mediante inmunoprecipitación seguida por análisis de
transferencia Western. Específicamente, se mezclaron
0,5-1,0 ml de lisado celular en PBS o el
sobrenadante del cultivo con antígeno core de
anti-hepatitis B de conejo policlonal (DAKO
Corporation, Carpinteria, California) unido a
G-Sefarosa (Pharmacia LKB, Uppsala, Suecia) y se
incubaron durante la noche a 4ºC. Las muestras se lavaron dios veces
en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM
y se hirvieron en tampón de carga de muestra con \beta
2-mercaptoetanol al 0,5%: En primer lugar se
resolvieron las proteínas mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS, y a continuación se transfirieron a Immobilon
(Millipore Corp., Bedford, ME) y se sondaron con el antígeno core
anti-hepatitis de conejo policlonal DAKO, seguido
por ^{125}I-proteína A.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones hembra Balb/C, C57B1/6 y C3H de seis a
ocho semanas de edad (Harlan Sprague-Dawley,
Indianapolis, IN) se inyectaron dos veces por vía intraperitoneal
(i.p.) a intervalos de 1 semana con 1 x 10^{7}
L-M(TK^{-}) (ATCC CLL 1.3) células
irradiadas (10.000 rads a temperatura ambiente) infectadas con el
vector Sindbis. Se sacrificaron los animales 7 días después y se
cultivaron los esplenocitos in vitro con sus respectivas
células (6 x 10^{4}/ml) irradiadas infectadas con el vector
Sindbis en matraces T-25 (Corning, Coming, NY). El
medio de cultivo estaba constituido por RPMI 1640, suero bovino
fetal inactivado con calor al 5%, piruvato de sodio 1 mM, 50
\mug/ml de gentamicina y \beta 2 mercaptoetanol 10^{-5} M
(Sigma, St. Louis, MO). Se cosecharon las células efectoras
4-7 días después y se ensayaron usando diversas
relaciones efector:células diana en placas de microvaloración de 96
pocillos (Coming, Corning, NY) en un ensayo estándar de liberación
de cromo. Las dianas son las células
L-M(TK^{-}) infectadas con vectores y las
células no infectadas con vectores mientras que las líneas
celulares no transducidas se usaron como controles negativos.
Específicamente, células diana (1 x 10^{4} células/pocillo)
marcadas con Na_{2}^{51}CrO_{4} (Amersham, Arlington Heights,
IL) (100 uCi, 1 hora a 37ºC) se mezclaron con células efectoras a
diversas relaciones de efector a célula diana en un volumen final
de 200 \mul. Tras la incubación, se retiraron 100 \mul del medio
de cultivo y se analizaron en un espectrómetro gamma de Beckman
(Beckman, Dallas, TX). Se determinó la liberación espontánea (SR)
en forma de CPM de las diana más el medio y se determinó la
liberación máxima (MR) en forma de CPM de las diana más HCl 1 M. Se
calculó el porcentaje de lisis de las célula diana como: [(Célula
efectora + diana CPM) - (SR)/(MR) - (SR)] x 100. Los valores de
liberación espontáneos de las dianas son normalmente 10%-20% de la
MR. Para algunos ensayos CTL, se pueden estimular in vitro
los efectores múltiples veces, por ejemplo, en el día
8-12 después de la primera estimulación in
vitro. Más específicamente, 10^{7} células efectoras se
mezclaron con 6 x 10^{5} células estimuladoras irradiadas (10.000
rads) y 2 x 10^{7} células de "relleno" irradiadas (3.000
rads) preparadas tal como se describe a continuación en 10 ml de
medio RPMI "completo". (RPMI que contenía Suero Bovino Fetal
térmicamente inactivado al 5%. L-glutamina 2 mM,
piruvato de sodio I mM, aminoácidos no esenciales 1X, y \beta 2
mercaptoetanol 5 x 10^{5} M): Se generaron células estimuladores
para la estimulación in vitro de las células efectoras para
infectar las células L-M (TK-) con un vector VHB de
Sindbis que expresaban simultáneamente la resistencia a G418: Las
células infectadas con vector se seleccionaron para la selección
del marcador usando 800 \mug/ml de G418 durante dos semanas. Las
células resistentes a G418 se irradiaron a continuación a 10.000
rads y se usaron a continuación para volver a estimular las células
efectoras in vitro tal como se ha descrito. Se prepararon
células de "relleno" procedentes de células de bazo de ratones
singénicos sin tratamiento previo y vueltas a suspender en RPMI,
irradiadas con 3.000 rads a temperatura ambiente. Se lavaron los
esplenocitos con RPMI, se centrifugaron a 3.000 rpm durante 5
minutos a temperatura ambiente, y el aglomerado se volvió a
suspender en RPMI. Las células vueltas a suspender se trataron con
1,0 ml de tricloruro de amonio (100 ml de base tris 0,17 M, pH 7,65,
más 900 ml de NH_{4}Cl 0,155 M; la solución final se ajustó a un
pH de 7,2) a 37ºC durante 3-5 minutos. La
reestimulación secundaria in vitro se cultivó a continuación
durante 5-7 días antes de ensayar en un ensayo CTL.
Cualquier reestimulación posterior se cultivó tal como se ha
descrito anteriormente con la adición
de 2-10 U de IL-2 humana recombinante (200 U/ml, nº de catálogo 799068, Boehringer Mannheim, W. Alemania).
de 2-10 U de IL-2 humana recombinante (200 U/ml, nº de catálogo 799068, Boehringer Mannheim, W. Alemania).
Usando estos procedimientos, se puede demostrar
que se pueden inducir las CTL en el antígeno e de VHB.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones transgénicos HLA A2.1 hembras de seis a
ocho semanas de edad (V. Engelhard, Charlottesville, VA) se
inyectaron dos veces por vía intraperitoneal (i.p.) a intervalos de
una semana con 1,0 x 10^{7} células EL4 A2/K^{b} (ATCC Nº
TIB-39) irradiadas (10.000 rads a temperatura
ambiente) transducidas con vector. Se sacrificaron los animales 7
días después y los esplenocitos (3 x 10^{6}/ml) cultivados in
vitro con células A2/K^{b} irradiadas (10.000 rads)
transducidas o con células Jurkat A2/K^{b} (6 x 10^{4}/ml)
recubiertas con péptido en matraces (T-25, Coming,
Corning, NY). Se llevó a cabo el resto del ensayo de liberación de
cromo tal como se describe e el Ejemplo 9E 1.a en el que las dianas
se transdujeron y las células EL4A2/K^{b} y Jurkat A2/K^{b} no
se transdujeron. Las líneas celulares no transducidas se utilizaron
como controles negativos. Las dianas pueden ser células EL4
A2/K^{b} recubiertas con péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se establecieron líneas celulares
linfoblastoides (LCL) para cada paciente infectando (transformando)
sus células B con virus de Epstein-Barr (VBE)
reciente tomado del sobrenadante de un cultivo de 3 semanas de
leucocitos B95-8 de monos tití transformados con
VEB (ATCC CRL 1612). Tres semanas después de la transformación con
VEB, las LCL se infectaron con vector Sindbis que expresaba el
antígeno core ó e de VHB y resistencia a G418. Se llevó a cabo la
infección con el vector de las LCL mediante cultivo simultáneo de
1,0 x 10^{6} células LCL con 1,0 x 10^{6} productoras de vector
Sindbis irradiadas (10.000 rads) en una placa de 6 cm que contenía
4,0 ml de medio o añadiendo sobrenadante con el vector infeccioso.
El medio de cultivo está constituido por RPMI 1640, suero bovino
fetal térmicamente inactivado al 20% (Hyclone, Logan, UT), piruvato
de sodio 5,0 mM y aminoácidos no esenciales 5,0 mM. Tras el cultivo
simultáneo durante la noche a 37ºC y CO_{2} al 5 %, la suspensión
de células LCL se retiró de las células productoras de vector
Sindbis irradiadas (10.000). Se seleccionaron las células LCL
infectadas añadiendo 800 \mug/ml de G418. Las células Jurkat
A2/K^{b} (L. Sherman, Scripps Institute, LCL. San Diego, CA) se
infectaron esencialmente tal como se describe para la infección de
las células.
\vskip1.000000\baselineskip
PBMC humanas se separaron mediante
centrifugación en gradiente de Ficoll (Sigma, St. Louis, MO).
Específicamente, las células se centrifugaron a 3.000 rpm a
temperatura ambiente durante 5 minutos. Las PBMC se volvieron a
estimular in vitro con sus LCL autólogas transducidas,
Ejemplo 9E 1.c, en una relación efector:diana de 10:1 durante 10
días. El medio de cultivo está constituido por RPMI 1640 con lotes
predetectados sistemáticamente de suero bovino fetal térmicamente
inactivado al 5%, piruvato de sodio 1 mM y 50 \mug/ml de
gentamicina. Los efectores CTL estimulados resultantes se ensayaron
para la actividad CTL usando células LCL autólogas o emparejadas
con HLA infectadas como dianas en el ensayo de liberación de cromo
estándar, Ejemplo 9E 1.a. Debido a que la mayor parte de pacientes
tienen inmunidad al VEB , las células B transformadas (LCL) con VEB
no transducido se usaron como controles negativos, que serán
reconocidas también como dianas por los CTL específicos de VEB con
las LCL transducidas. Con el fin de reducir los elevados
antecedentes debidos a muerte de las células dianas marcadas por
los CTL específicos, es necesario añadir LCL no transducidas a las
células diana marcadas en una relación 50:1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se detectaron en ratones las respuestas inmunes
humorales específicas de los antígenos core y e de VHB mediante
ELISA. El protocolo ELISA utiliza 100 \mug/pocillo de antígeno
core de VHB recombinante y e de VHB recombinante (Biogen, Ginebra,
Suiza) para recubrir placas de 96 pocillos. Los sueros de ratones
inmunizados con células o antígeno core de VHB ó e de VHB que
expresan el vector de manera directa se diluyeron en serie a
continuación en los pocillos recubiertos con antígeno y se
incubaron durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Tras la
incubación, se añadió a los pocillos una mezcla de IgGI, IgG2a,
gG2b, e IgG3 de conejo anti-ratón con títulos
equivalentes. Se añadió antisuero de cabra
anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano
picante ("HRP") a cada pocillo y se incubaron durante 1 a 2
horas a temperatura ambiente. Tras la incubación, se visualizó la
reactividad añadiendo la sustancia apropiada. Se desarrollará color
en los pocillos que contienen los anticuerpo IgG específico del
antígeno core de VHB ó é de VHB.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió in vitro la actividad T auxiliar
inducida por el antígeno resultante de dos o tres inyecciones de
preparaciones directas de vector que expresaba el antígeno core ó e
de VHB. Específicamente, esplenocitos de ratones inmunizados se
volvieron a estimular in vitro a una relación predeterminada
con células que expresaban el antígeno core ó e de VHB o con
células que no expresaban el antígeno core ó e de VHB como control
negativo. Tras cinco días a 37ºC y CO_{2} al 5% en medio de
cultivo RPMI 1640 que contenía FBS al 5%, piruvato de sodio 1,0 mM
y \beta 2-mercaptoetanol 10^{-5,} se ensayó el
sobrenadante para la actividad de IL-2.
IL-2 se secretó específicamente por las células T
auxiliares estimuladas por el antígeno core ó e de VHB, y se midió
su actividad usando el clon CTL CTLL-2 (ATCC TIB
214). De manera resumida, el clon CTLL-2 es
dependiente de IL-2 para el crecimiento y no
proliferará en ausencia de IL-2. Se añadieron
células CTLL-2 a diluciones en serie de las
muestras de ensayo del sobrenadante en una placa de 96 pocillos y se
incubaron a 37ºC y CO_{2} al 5%; CO_{2} durante 3 días.
Posteriormente, se añadieron 0,5 \muCi de
^{3}H-timidina a las células
CTLL-2. Se incorporaron 0,5 \muCi de
^{3}H-timidina únicamente en el proliferado de
células CTLL-2. Tras incubación durante la noche,
se cosecharon las células usando un cosechador celular PHD
(Cambridge Technology Inc., Watertown, MA) y se contaron en un
contador beta de Beckman. Se determinó la cantidad de
IL-2 en una muestra procedente de una curva patrón
generada a partir de una IL-2 estándar recombinante
obtenida de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN).
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede usar también el sistema ratón para
evaluar la inducción de respuestas inmunes humorales y mediadas por
células con la administración directa del vector que codifica el
antígeno core ó e de VHB. De manera resumida, ratones hembra
Balb/C, C57B16 o C3H de seis a ocho semanas de edad se inyectaron
intramuscularmente (i.m.) con 0,1 ml de vector Sindbis que
expresaba core de VHB ó e de VHB liofilizado reconstituido (con agua
destilada desionizada estéril). Se proporcionaron dos inyecciones
con una separación de una semana. Siete días después de la segunda
inyección, se sacrificaron los animales. Se llevaron a cabo a
continuación los ensayos CTL de liberación de cromo esencialmente
tal como se describe en el Ejemplo 9E 1.a.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los datos generados en el sistema
ratón descrito anteriormente para determinar el protocolo de
administración del vector en chimpancés crónicamente infectados con
el virus de la hepatitis B. Basándose en la inducción de CTL
específicos de VHB en ratones, los sujetos en los ensayos con
chimpancés recibieron tres dosis de antígeno core ó e que
codificaba el vector en intervalos de 28 días proporcionados en dos
grupos de dosificación escalonados sucesivamente. Los sujetos
control recibieron un placebo comprendido por medios de formulación
HBV-IT (V). La dosificación será tanto de 10^{6}
como de 10^{7} ufc de HBV-IT (V) proporcionadas en
cuatro inyecciones de 0,5 ml i.m. en cada día de inyección. Se
extraerán muestras de sangre en los días 4, 12, 24, 36, 52, 70 y 84
y los meses 6, 12, 18, 24, 30, y 36 con el fin de medir los niveles
de alanina aminotransferasa (ALT) en suero, la presencia de
antígeno e de la hepatitis B, la presencia de anticuerpos dirigidos
contra el antígeno e de la hepatitis B y para evaluar la seguridad
y tolerabilidad del tratamiento. El antígeno e de la hepatitis B y
los anticuerpos para el antígeno e de HB se detectaron mediante el
kit rDNA EIA para Hb e de Abbott (Abbott Laboratories Diagnostic
Division, Chicago, IL). Se puede determinar
la eficacia de la inducción de los CTL contra el antígeno core ó e de la hepatitis B tal como en el Ejemplo 9E 1.c.
la eficacia de la inducción de los CTL contra el antígeno core ó e de la hepatitis B tal como en el Ejemplo 9E 1.c.
Basándose en los resultados de seguridad y
eficacia de los estudios en chimpancés, se determino la dosificación
y el calendario de inoculación para la administración del vector a
los sujetos en ensayos en seres humanos. Se siguieron estos sujetos
para los niveles de ALT en suero, presencia de antígeno e de VHB y
presencia de anticuerpos dirigidos contra el antígeno e de VHB,
esencialmente tal como se describe anteriormente. Se determinó la
inducción de los CTL humanos contra el antígeno core ó e de la
hepatitis B tal como en el Ejemplo 9E 1.c.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente ejemplo describe los procedimientos
para construir vectores Sindbis capaces de generar una respuesta
inmune expresando un antígeno vírico de VIH. Se proporcionan también
procedimientos para ensayar la expresión y la inducción de una
respuesta inmune.
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Se aisló un fragmento de ADN de
KpnI-XhoI de 2,7 Kb procedente del clon provírico
BH10-R3 de VIH (para la secuencia, véase Ratner y
col., Nature 313: 277, 1985) y un fragmento de ADN de
SalI-KpnI de \sim 400 pb de IIIexE7deltaenv (una
delección en Bal31 en el nt 5496) se ligó en el emplazamiento SalI
en el plásmido SK^{+}. De este clon, se purificó un fragmento de
ADN de env de 3,1 kb (XhoI-ClaI) y se ligó en
los vectores Sindbis anteriormente descritos predigeridos con XhoI y
ClaI.
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Para construir una línea celular productora de
vector que exprese env derivado de VIH IIIB a partir del vector
descrito anteriormente, se transfectaron transcriptos de ARN
transcritos in vitro en una línea celular que empaqueta
Sindbis (Ejemplo 7). Específicamente, las moléculas de vector de ARN
de Sindbis se produjeron inicialmente usando un sistema de ARN
polimerasa transcrito in vitro de SP6 usado para trascribir
de un clon de ADNc de vector Sindbis que codificaba las secuencias
específicas de VIH. Los productos de vector de ARN generados in
vitro, se transfectaron a continuación en una línea celular de
salto o empaquetado de Sindbis que conduce a la producción de
partículas de vector infecciosas transitorias en 24 horas. A
continuación, estas partículas de vector se recogieron de los
sobrenadantes de los cultivos de la línea celular y a continuación
se filtraron a través de un filtro de 0,45 micrómetros para evitar
la contaminación celular. Los sobrenadantes filtrados se usaron a
continuación para infectar una monocapa reciente de células que
empaquetan Sindbis. En las 24 horas de la infección, se produjeron
partículas de vector Sindbis que contenían ARN recombinante de
Sindbis de cadena positiva que codificaba proteínas no estructurales
de Sindbis y secuencias específicas de VIH.
Una configuración alternativa de un vector
env de VIH IIIB de Sindbis es un promotor que impulsa el ADNc
del constructo Sindbis que contiene un marcador seleccionable. En
esta configuración, el fragmento XhoI a ClaI descrito anteriormente
que contenía la secuencia env de VIH IIIB se colocó en un
ADNc de vector Sindbis similar impulsado por un promotor
constitutivo en lugar de una secuencia de reconocimiento de la
polimerasa de bacteriófago. Usando esta configuración, los
plásmidos del vector de expresión se transfectaron en la línea
celular de empaquetado y se seleccionaron para la resistencia l
fármaco 24 a 48 horas después de la transfección. A continuación
las colonias resistentes se combinaron 14 días después (dependientes
del marcador de selección usado) y se clonó por dilución. A
continuación se propagaron varios clones por dilución, y se
ensayaron para el título más alto del vector. Los clones con el
título más alto se expandieron a continuación y se almacenaron
congelados. Los clones almacenados se ensayaron para la producción
de proteína específica de VIH y la inducción de la respuesta
inmune.
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Los lisados celulares de la línea productora de
VIH de Sindbis se ensayaron para la producción de proteína
específica de VIH mediante análisis de transferencia Western. Para
ensayar la capacidad del vector para transferir la expresión in
vitro, se infectaron células BHK-21 con
sobrenadante filtrado que contenía el vector vírico y se ensayó
mediante el análisis de transferencia Western 24 hora después de la
infección. Una vez que se ha verificado la expresión in vivo
de la proteína en ratón y primates, se llevaron a cabo los estudios
para demostrar la capacidad de las células singénicas de expresar un
gen extraño tras el tratamiento del vector para. (a) estimular una
respuesta CTL en ratones inyectando tanto células singénicas
infectadas como preparaciones de vector infeccioso; (b) estimular
respuestas CTL en un sistema de cultivo in vitro en seres
humanos; (c) para infectar células humanas, de chimpancés y
macacos, incluyendo las células primarias, de tal manera que se
puedan usar éstas para estimular respuestas CTL y puedan servir como
dianas en ensayos CTL; (d) mapear los epitopos de respuestas
inmunes; y (e) estimular y medir respuestas CTL y otras de antígenos
no de VIH tales como CMV de ratón (MCMV).
\vskip1.000000\baselineskip
Para ensayar la respuesta inmune estimulada
procedente de una línea celular transducida con un vector env
de VIH IIIB de Sindbis, se infectó una línea celular de tumor en
murino (B/C10ME) (H-2^{d}) (Patek y col., Cell.
Immunol. 72: 113, 1982) con un virus Sindbis recombinante que
transportaba el vector VIH IIIB. La línea celular que expresaba
env de VIH (B/C10ME-IIIB) se utilizó a
continuación para estimular ratones Balb/c
(H-2^{d}) singénicos (es decir, MHC idéntico) en
CTL específico de env de VIH. Se inmunizaron los ratones con
células B/C10MEIIIB (1 x 10^{7} células) y se estimularon en el
día 7-14. (La estimulación puede no ser necesaria)
Se prepararon suspensiones respondedoras de células de bazo
procedentes de estos ratones inmunizados y se cultivaron las
células in vitro durante 4 días en presencia tanto de células
B/C10MEIIIB (BCenv) como de B/C10ME (BC) tratadas con mitomicina C
a una relación de estimulador: respondedor de 1:50. Se cosecharon
las células efectoras procedentes de estos cultivos, se contaron, y
se mezclaron con células diana radiomarcadas (^{51}Cr) (es decir,
B/C10MEenv-29 o B/C10ME) a diversas relaciones de
células efectoras: respondedoras (E:T) en un ensayo estándar de
liberación de ^{51}Cr de 4-5 horas. Tras la
incubación, las placas de microvaloración se centrifugaron, se
retiraron 100 \mul del sobrenadante del cultivo, se cuantificó la
cantidad de células lisadas de las retiradas radiomarcadas en un
espectrómetro gamma de Beckman. Se calculó la lisis de las células
diana como% de Lisis de Dianas = CPM Exp - SR CPM/MR CPM - SR CPM x
100, en el que los recuentos experimentales por minuto (CPM Exp)
representan los efectores más las dianas; la liberación
espontánea/SR CPN representa las dianas únicamente; y la liberación
máxima (MR) CPM representa las dianas en presencia de HCl 1 M.
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Se llevaron a cabo experimentos para evaluar la
capacidad de los vectores víricos de Sindbis recombinantes de
inducir la expresión de las proteínas de la envoltura de VIH tras la
inyección directa en ratones. Se inyectaron aproximadamente
10^{4} a 10^{5} (ufp) de virus recombinante Sindbis que
transportaba el constructo de vector env de VIH IIIB dos
veces (2x) a intervalos de 3 semanas tanto mediante ruta
intraperitoneal (i.p.) como intramuscular (i.m.). Se determinó que
esta cantidad de virus Sindbis era inferior a la cantidad
considerada para estimular una respuesta inmune. Se prepararon
células de bazo para CTL aproximadamente de 7 a 14 días después de
la segunda inyección de vector.
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Muchas enfermedades infecciosas, cánceres,
enfermedades autoinmunes, y otras enfermedades implican la
interacción de partículas víricas con células, células con células,
o células con factores. En las infecciones víricas, los virus
entran habitualmente en las células mediante los receptores de la
superficie de las células susceptibles. En Los cánceres, las
células pueden responder inapropiadamente o no a todas las señales
procedentes del resto de células o factores. En la enfermedad
autoinmune, existe un reconocimiento de los "auto" marcadores.
Estas interacciones pueden estar bloqueadas produciendo un análogo
de cualquiera de los compañeros en la interacción, in
vivo.
Esta acción de bloqueo se puede producir
intracelularmente, en la membrana celular, o extracelularmente. La
acción de bloqueo de un virus o, en particular, un vector Sindbis
que transporta un gen de un agente de bloqueo, puede estar mediada
tanto desde el interior de una célula susceptible como por la
secreción de la proteína de bloqueo para bloquear localmente la
interacción patogénica.
En el caso de VIH, los dos agentes de la
interacción son la proteína de envoltura gp 120 (gp 41 y la molécula
del receptor CD4. De esta manera, un bloqueante adecuado sería un
constructo de vector que expresa cualquiera de un análogo de
env de VIH que bloquea la entrada de VIH sin producir efectos
patogénicos, o un análogo del receptor CD4. El análogo de CD4 se
secretaría y funcionaría para proteger las células adyacentes,
mientras que gp 120/gp 141 se secreta o produce únicamente
intracelularmente de tal manera que protege sólo la células que
contiene el vector. Esto puede ser ventajoso para añadir cadenas
pesadas de inmunoglobulina humana u otros componentes de CD4 con el
fin de potenciar la estabilidad o complementar la lisis. La
liberación de un vector retrovírico que codifica dicho CD4 soluble
híbrido en un huésped da como resultado un suministro continuo de
una molécula híbrida estable.
Se pueden construir también partículas de vector
que conducen a la expresión de análogos de env de VIH tal como se
describe anteriormente. Será evidente para una persona experta en la
técnica que las porciones son capaces de bloquear la adsorción del
virus sin manifestar efectos secundarios patogénicos (Willey y col.,
J. Virol. 62: 139, 1988; Fisher y col., Science 233: 655, 1986).
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Se generó en primer lugar un clon de ADNc de
glucocerebrosidasa (GC) que contenía una enzima de restricción XhoI
en el emplazamiento 5' de la secuencia de codificación del ADNc y
una enzima de restricción ClaI en el emplazamiento 3' de la
secuencia de codificación del ADNc. Se puede generar el clon
digiriendo pMFG-GC (Ohashi y col., PNAS 89: 11332,
1992) con NcoI, se enromó con ADN polimerasa Vent (New England
Biolabs, Beverly, MA), y se ligó a continuación con los ligantes
XhoI. A continuación se digirió el plásmido con BamHI, se enromó
con ADN polimerasa Vent, y se ligó a continuación con los ligantes
ClaI. A continuación se digirió el fragmento con XhoI y ClaI y se
ligó en el emplazamiento XhoI-ClaI del vector
Sindbis deseado.
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Se presentaron dos soluciones para crear la
línea celular productora, dependiendo del clon de vector de ADNc de
Sindbis usado. Un tipo de vector Sindbis usa una secuencia de
reconocimiento de la ARN polimerasa SP6 para la producción de
transcriptos de ARN in vitro de replicación competente. Se
usó este tipo de vector para crear una línea celular productora de
vector basada en un vector no integrante que se replicaría
persistentemente en la línea celular de empaquetado. El segundo
tipo de vector usa un promotor heterólogo (Ejemplo 7) en un
constructo de plásmido que permitió la integración estable en la
línea celular de empaquetado. A continuación se transcribieron los
transcriptos de vector de replicación competente en la línea celular
de empaquetado transfectada.
Si el vector vírico GC de Sindbis usa una
secuencia de reconocimiento del ARN de SP6, el ADNc debe
transcribirse in vitro en primer lugar usando cualquiera de
los sistemas de transcripción in vitro disponibles
comercialmente (kit de transcripción Megascript^{TM}; Ambion
Inc., Austin, TX) seguido por la transfección del ARN de longitud
completa mediante liposomas o precipitación con fosfato de calcio en
la línea celular que empaqueta Sindbis. Tal como se ha descrito
anteriormente, los sobrenadantes filtrados que contenían partículas
de vector infecciosas de la línea celular de empaquetado
transfectada se usaron a continuación para volver a infectar una
monocapa reciente de células que empaquetan Sindbis que sirvió a
continuación como fuente del vector vírico. Aproximadamente,
deberían usarse 10 ml de sobrenadante infeccioso para infectar 5 x
10^{6} células en una placa de 10 cm.
Si el vector vírico GC de Sindbis usa un
promotor heterólogo en una configuración de plásmido de expresión
con un marcador seleccionable (gen de resistencia a la neomicina),
entonces el vector de ADNc debe transfectarse en la línea celular
de empaquetado seguido por la selección de la resistencia al
fármaco. A continuación se combinaron las colonias resistentes y se
clonaron por dilución. A continuación se propagaron los clones
individuales y se congelaron. Los clones se detectaron
sistemáticamente individualmente, para título alto, expresión de GC
mediante análisis de transferencia Western, y para la actividad
funcional de la proteína.
Para aquellos vectores que no tienen un marcador
seleccionable, se debe llevar a cabo la selección de clones
transfectados de manera estable o persistente mediante clonación por
dilución de las células transducidas con DA uno o dos días después
de la transfección de las células con el vector Sindbis. A
continuación, los clones por dilución se detectaron
sistemáticamente para la presencia de GC usando la transcripción
inversa del ARN mensajero, seguido por la amplificación del mensaje
del ADNc mediante la técnica de la reacción en cadena de la
polimerasa. Se conoce este procedimiento como la técnica
R-PCR y está disponible un kit comercial para
llevar a cabo este ensayo de Invitrogen Corp. (San Diego, CA). Se
llevó a cabo la RT-PCR sobre clones que se habían
propagado durante al menos 10 días. Se detectaron sistemáticamente
aproximadamente de 50 a 100 clones con el fin de encontrar un
número razonable de clones estables infectados persistentemente. Con
el fin de llevar a cabo la RT-PCR, se necesitaron
cebadores específicos para que el mensaje deseado sea detectado
sistemáticamente mediante la amplificación del producto de ARN. Los
cebadores designados para amplificar un producto de 521 pares de
bases para la detección sistemática son:
Cebadores para la detección sistemática de
GC
GC PCR cebador nº 1: 5'-TTT CTG
GCT CCA GCC AAA GCC ACC CTA GGG GAG-3' (SEC DE ID
Nº. 69)
GC PCR cebador nº 2: 5'-AAT GGA
GTA GCC AGG TGA GAT TGT CTC CAG GAA-3' (SEC DE ID
Nº. 70)
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Estos clones que demuestran una expresión y
título muy altos se ensayaron a continuación para la transferencia
de la expresión en células BHK-2 seguido por el
análisis de transferencia Western y un ensayo funcional para la
actividad de GC. Se usó un anticuerpo monoclonal específico (8E4)
contra la GC humana para el análisis de transferencia Western para
determinar la presencia de la proteína (Ohashi y col., PNAS 89:
11332, 1992; Barneveld y col. Eur. J. Biochem. 134:310, 1983. ). Se
ensayó la actividad enzimática de GC tal como se describe por
Correll y col. (Blood 80: 331, 1992). Se realizaron estudios
animales un vez se hubo identificado el clon apropiado.
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Se puede administrar un vector Sindbis
terapéutico usado para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher
(Ejemplo 13) mediante las células CD34^{+} autólogas
transductoras en un protocolo ex vivo o mediante inyección
directa del vector en la médula ósea del paciente. Para conseguir la
expresión terapéutica más larga de GC procedente del vector
multivalente recombinante, el mejor modo de administración es
transducir precursores celulares de vida larga del tipo celular
clínicamente afectado, por ejemplo, monocitos o macrófagos.
Transduciendo los precursores más tempranos, los
precursores celulares son capaces de autorenovarse y repoblar la
sangre periférica con células GC positivas en maduración.
Las células troncales hematopoyéticas
pluripotentes más tempranas estudiadas hasta el momento son las
células CD34^{+} que constituyen hasta un 1%-4% de la población
sana de la médula ósea o un 0,1% en la población de la sangre
periférica. Ser capaz de transducir células CD34^{+} es importante
para sostener la expresión a largo plazo no sólo para el linaje
monocito/macrófago sino para cualquier célula hematopoyética
dirigida por una proteína terapéutica. Dos soluciones par
transducir células CD34^{+} incluyen un protocolo ex vivo
y un in vivo. El protocolo in vivo se centra en
transducir una población indiscriminada de células de médula ósea
mediante inyección directa del vector en la médula ósea de los
pacientes. El protocolo ex vivo se centra en el aislamiento
de células troncales CD34^{+} positivas, procedentes de la médula
ósea del paciente, o de la sangre del cordón umbilical de un
paciente recién nacido, transduciendo las células con el vector, y
a continuación, inyectando posteriormente las células autólogas en
el paciente. Ambas soluciones son factibles, pero el protocolo
ex vivo permite usar el vector más eficientemente
transduciendo una población cultivada específica de células
CD34^{+}. En la siguiente sección, se proporcionan los detalles de
un procedimiento ex vivo.
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Se recogieron células CD34^{+} de la médula
ósea de un paciente mediante evacuación de jeringa llevada a cabo
por un médico familiarizado con la técnica. Alternativamente, se
pueden obtener también células CD34^{+} de la sangre del codón
umbilical de un recién nacido si el paciente se diagnostica antes
del nacimiento. Generalmente, si la médula ósea es la fuente de
células CD34^{+}, se obtuvieron 20 aspiraciones de la médula ósea
mediante punción del eje femoral o de la cresta ilíaca posterior
bajo anestesia local o general. A continuación se combinaron las
aspiraciones de la médula ósea, se suspendieron en solución salina
equilibrada de Hank tamponada con Herpes que contenía heparina a
100 unidades por ml y desoxirribonucleasa I a 100 \mug/ml y a
continuación se sometió separación mediante gradiente de Ficoll. A
continuación se recogieron las células de la capa leucocitaria de
la médula ósea y se lavaron de acuerdo con el sistema de Separación
CellPro's CEPRATE^{TM} LC (CellPro. Bothell, WA) (CD34). A
continuación se tiñeron secuencialmente las células de la capa
leucocitaria con anticuerpo monoclonal anti-CD34, a
continuación se lavaron y se tiñeron con anticuerpo secundario
biotinilado suministrado con el sistema CEPRATE^{TM}. A
continuación se introdujo la mezcla celular en la columna de avidina
de CEPRATE^{TM}. Las células marcadas con biotina se adsorbieron
en la columna mientras que las células no marcadas pasaron a través
de ella. A continuación se lavó la columna de acuerdo con las
instrucciones del sistema CEPRATE^{TM} y se eluyeron las células
CD34^{+} mediante agitación de la columna apretando manualmente el
lecho de gel. Una vez que se purificaron las células CD34^{+}, se
contaron las células troncales purificadas y se plaquearon a una
concentración de 1 x 10^{5} células/mil en un medio de Dulbecco
modificado por Iscove (JMDM; Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que
contenía suero AB humano no inactivado térmicamente combinado al 20%
(suero hAB).
Tras la purificación, [?] se pueden llevar a
cabo diversos procedimientos para transducir células troncales
purificadas. Una solución implica la transducción inmediata de la
población de células troncales modificadas con las células que
producen el vector derivadas de los cultivos del sobrenadante que
contienen el vector. Una segunda solución implica el cultivo
simultáneo de una monocapa irradiada de células que producen el
vector con la población purificada de células CD34^{+} no
adherentes. Una tercera y preferida solución implica una solución
de cultivo simultáneo similar, sin embargo, la células CD34^{+} se
preestimulan con diversas citoquinas y se cultivan 48 horas antes
del cultivo simultáneo con las células que producen el vector
irradiado. Publicaciones recientes han demostrados que la
preestimulación de las células troncales antes de la transducción
de las células con vectores retrovíricos aumenta el nivel de
transferencia génica en estos tipos celulares (Nolta y col., Exp.
Hematol. 20:1065, 1992). El aumento del nivel de la transducción se
atribuye a un aumento en la proliferación de células troncales
necesarias para la eficiente transducción retrovírica. Debido a que
los vectores Sindbis son capaces de infectar células no replicantes,
puede no necesitarse la preestimulación de estas células, sin
embargo, la preestimulación de estos cultivos que producen la
proliferación proporcionará un aumento de las poblaciones celulares
para la reinfusión en el paciente. Se llevó a cabo la
preestimulación de las células CD34^{+} incubando la células con
una combinación de citoquinas y factores de crecimiento que
incluyen IL-1, IL-3,
IL-6 y el factor de crecimiento celular de los
mastocitos (MGF). Se llevó a cabo la preestimulación cultivando
1-2 x 10^{5} células CD34^{+}/de medio en
matraces de cultivo de tejido T25 que contenían medio de
estimulación de la médula ósea durante 48 horas. El medio de
estimulación de la médula ósea está constituido por IMDM que
contiene suero hAB no inactivado térmicamente al 30%,
L-glutamina 2 mM, \beta
2-mercaptoetanol 0,1 mM, hidrocortisona 1 \muM, y
albúmina de suero bovino desionizada al 1%. Todos los reactivos
usados en los cultivos de médula ósea deberían detectarse
sistemáticamente para su capacidad de soportar números máximos de
granulocitos, eritrocitos, macrófagos, megacariocitos, unidades
formadoras de colonias de la médula normal. Se deberían usar
citoquinas humanas recombinantes purificadas y factores de
crecimiento (Immunex Corp., Seattle. WA) para la preestimulación a
las siguientes concentraciones: IL-1\alpha
derivada de E. coli (100 U/ml), IL-3 derivada
de levadura (5 ng/ml), IL-6 (50 U/ml), y MGF (50
ng/ml) (Anderson y col., Cell Growth Differ. 2: 373,1991).
Tras la preestimulación de las células
CD34^{+}, se infectaron a continuación mediante cultivo simultáneo
con la línea celular productora de Sindbis irradiada (que expresa
el vector terapéutico GC) en presencia continua de medio de
estimulación. En primer lugar, se tripsinizó la línea celular que
producía el vector DA, se irradió (10.000 Rads) y se volvió a
plaquear a 1-2 x 10^{5} células/ml de medio de
estimulación de médula ósea. El siguiente día, se añadieron
1-2 x 10^{5} células CD34^{+} preestimuladas a
la monocapa de la línea celular que producía el vector Sindbis. Se
llevó a cabo el cultivo simultáneo de las células durante 48 horas.
Tras el cultivo simultáneo, se recogieron las células CD34^{+} de
la monocapa celular productora de vector Sindbis adherente mediante
lavado vigoroso con medio y se plaquearon durante 2 horas para
permitir la adherencia de cualquier célula que produzca el desalojo
del vector. A continuación se recogieron las células y se
expandieron durante 72 horas más. A continuación se recogieron las
células y se congelaron en nitrógeno líquido usando un
crioprotector en alícuotas de 1 x 10^{7} células por vial. Una vez
se han ensayado las células CD34^{+} transformadas para la
ausencia de agentes eventuales, se pueden descongelar las células
CD34^{+} transformadas congeladas, plaquear hasta una
concentración de 1 x 10^{5} células/ml y se cultivaron durante 48
horas más en medio de estimulación de médula ósea. A continuación
se recogieron las células transformadas, se lavaron dos veces y se
volvieron a suspender en solución salina normal.
El número de células transducidas usado para
volver a infundir en el paciente por infusión se proyecto que fuera
un mínimo de 1-10 x 10^{7} células por paciente
por punto de la inyección requiriendo hasta de cuatro puntos de
inyección. Se puede devolver la infusión directamente a la médula
ósea del paciente o directamente en el torrente sanguíneo
periférico. Los pacientes que reciben células de médula ósea
transducidas autólogas pueden ser tanto parcial como completamente
irradiados corporalmente, para disminuir las poblaciones de médula
ósea existentes. Se puede evaluar el tratamiento en diversos puntos
temporales después de la infusión para determinar la actividad de
GC para alargar la expresión en los tipos celulares diferenciados.
Si en algún momento durante el curso de los procedimientos de
seguimiento, disminuyen o son no existentes, se pueden volver a
inyectar en el paciente células autólogas transducidas.
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Para producir una partícula de vector Sindbis
inactivada, en una línea celular de empaquetado de Sindbis, se debe
impulsar el vector Sindbis mediante un promotor de la ADN
polimerasa. La opción de usar la transcripción in vitro del
ARN del vector, seguido por la transfijación del ARN en la línea
celular que empaqueta Sindbis, no se recomienda debido a que la
estructura terciaria generada por el transcripto de ARN inactivado
puede evitar que los transcriptos genómicos completos limiten la
replicación del vector y los títulos en la línea celular de
empaquetado. Por esta razón, se usó un vector Sindbis de inicio que
contenía el promotor MIEP de CMV (pCMV-SIN) o el
promotor de la metalotioneína de Drosophila
(pMET-CMV) dependiendo de la línea celular de
empaquetado (es decir, insecto o mamífero).
Tal como se ha descrito anteriormente, se
construyó el modelo de bucle externo de unión desactivado con la
región de unión del vector flanquedas por secuencias de repetición
invertidas que son homólogas al ARN de elección. En este ejemplo,
se usaron las secuencias del ADNc del antígeno tumoral CEA
(Beauchemin y col., Molec. and Cell. Biol. 7: 3221, 1987) en las
repeticiones invertidas. Para construir un vector Sindbis
responsable del ARN de CEA, la región de unión estaba precedida por
dos regiones con secuencias de sentido contrario de CEA (A^{1} y
B^{1}) separadas por una región bisagra de seis pares de bases.
Una secuencia de sentido directo (CEA) de veinte pares de bases
(A2), que es complementaria a A1, se coloca en el extremo 3' de la
región de unión. En la elección correcta de las secuencias de
sentido contrario A1 y B1, los únicos requerimientos son que sean
específicas de la secuencia de ARN dirigida y que las secuencias de
sentido contrario hibriden las dos regiones de la secuencia de ARN
separadas por tres nucleótidos. Estas tres caperuzas de nucleótidos
servirán como una región bisagra para que la polimerasa salte e
interrumpa la lectura que une la región de la proteína no
estructural del vector con la región de unión del vector (Figura 5).
Para construir dicha configuración, se sintetizaron dos
oligonucleótidos complementarios entre sí para crear un fragmento de
inserto que contiene los emplazamientos de la enzima de restricción
convenientes al final de los extremos 5' y 3'. A continuación se
ligó el inserto del fragmento de oligonucleótido en el vector
Sindbis entre la región de unión inactivada y los emplazamientos de
clonación múltiples del vector Sindbis. La cadena de
oligonucleótidos de sentido directo, entre 5' y 3', debería
contener un emplazamiento de restricción ApaI, seguido por la región
A1 de sentido contrario, una región bisagra de seis pb, una región
B1 de sentido contrario, un dominio sintético de la región de
unión, y la región A2 de sentido directo, seguida por un
emplazamiento de la enzima de restricción XhoI. Se usó la siguiente
secuencia de oligonucleótidos para diseñar un vector Sindbis
responsable del ARN de CEA. El número de nucleótidos de la secuencia
se obtuvo de Beauchemin y col., Molec. and Cell Biol. 7: 3221,
1987.
Cadena de sentido directo
5'-3' CEA
\vskip1.000000\baselineskip
La cadena de sentido contrario
5'-3' CEA es complementaria del oligonucleótido
anterior. Después que se sintetizaran ambos nucleótidos, los
oligonucleótidos se mezclaron conjuntamente en presencia de Mg 10
mM, se calentaron a 1000ºC durante 5 min y se enfriaron lentamente
a temperatura ambiente. A continuación se digirió la pareja de
oligonucleótidos con las enzimas de restricción ApaI y XhoI, se
mezclaron y ligaron a una relación molar de 25:1 de inserto a
plásmido, pCMV-SIN o pMET-SIN
predigerido con los mismos enzimas. Estos constructos se designaron
pCMV/SIN-CEA y pMET/SIN-CEA,
respectivamente.
\global\parskip0.900000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se derivó el ADNc de g-IFN
humano de ARN aislado de células T de Jurkat estimuladas con PHA
mediante extracción de tiocianato de guanidinio seguido por
ultracentrifugación con un gradiente de CsCl. A continuación, se
transcribió de manera inversa el ARN (Sigma, St. Louis, MO) in
vitro y se usó una pareja de oligonucleótidos específica del
gen para amplificar el ADNc de g-IFN mediante la
reacción en cadena de la polimerasa usando polimerasa Tac. Se
reparo el ADN mediante la PCR con la ADN polimerasa T4 y Klenow y se
clonó en el emplazamiento HincII del plásmido SK^{+} (Stratagene,
San Diego, CA) tratado con CIAP. En la orientación de sentido
directo, el extremo 5' del ADNc es adyacente al emplazamiento XhoI
del poliligante SK^{+} y el extremo 3' adyacente al emplazamiento
ClaI. Se colocó el fragmento de 512 pares de bases que codificaba la
molécula \gamma-IFN humana en el emplazamiento
XhoI/ClaI de cualquiera de los vectores pCMV/SIN-CEA
o pMET/SIN-CEA. Estos nuevos plásmidos se designaron
pCMV/SIN-CEA/\gammaIFN o
pMET/SIN-CEA/\gammaIFN, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un producto amplificado mediante la
PCR que contenía el clon de ADNc de la timidina quinasa del herpes
simple ("HSVTK"), flanqueado con los emplazamientos de las
enzimas de restricción 5' XhoI y 3' ClaI usando el clon pHSITK3KB
(Mcknight y col., Nuc. Acids Res. 8: 5949, 1980) como ADN diana. Las
secuencias de los cebadores usados para la amplificación mediante
la PCR se obtuvieron de secuencias publicadas (Wagner y col., PNAS
78:1442, 1981). A continuación se digirió el producto amplificado de
1.260 pares de bases con XhoI y ClaI ligado en el emplazamiento
XhoI/ClaI de cualquiera de los vectores pCMV/SIN-CEA
o pMET/SIN-CEA. Estos nuevos plásmidos se
designaron pCMV/SIN-CEA/HSVTK o
pMET/SIN-CEA/HSVTK, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
A diferencia de los ejemplos anteriores de
creación de líneas productoras (Ejemplo 7) puede que sólo sea
posible una única vuelta de transferencia génica en la línea
celular de empaquetado mediante la transfección del vector. Debido
a que estos vectores se inactivarán y evitarán la síntesis de
vectores genómicos completos, la reinfección de una capa reciente
de líneas celulares que empaquetan Sindbis terminará en una
infección abortada debido a que estos vectores son ahora
dependientes de la presencia de ARN de CEA para llegar a ser
activos. Se pueden conseguir títulos mayores mediante clonación por
dilución de líneas celulares productoras transfectadas usando la
técnica de la RT-PCR descrita anteriormente en el
Ejemplo 11.
\vskip1.000000\baselineskip
La enfermedad de la hemofilia A se caracteriza
por la ausencia de factor VIII, un factor de coagulación en el
plasma sanguíneo. Aproximadamente 1 de cada 20.000 varones tiene
hemofilia A en la que el estado de enfermedad se presenta como un
trastorno de sangrado, debido a la incapacidad de los individuos
afectados de completar la cascada de coagulación de la sangre.
El tratamiento de los individuos con hemofilia A
es la sustitución con la proteína del factor VIII. La única fuente
de factor VIII humano es el plasma humano. Con el fin de procesar
plasma humano para la purificación del factor VIII, se combinaron
muestras de donantes humanos en lotes de aproximadamente 1000
donantes. Debido a la inestabilidad de la proteína del factor VIII,
los productos farmacéuticos resultantes son muy impuros y con una
pureza en peso estimada de aproximadamente 0,04%. Además, existe un
riesgo serio de que dichas enfermedades infecciosas como el virus
de la hepatitis B y el Virus de la Inmunodeficiencia Humana, entre
otros, contaminen el suministro de sangre y de esta manera se puedan
purificar simultáneamente con la proteína del factor VIII.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Por las razones presentadas anteriormente, una
fuente de producción recombinante de factor VII marcaría un progreso
seminal hacia el tratamiento de la hemofilia A.
El tratamiento ideal de la hemofilia A sería la
terapia de sustitución génica; esto es, la sustitución en los
individuos afectados del gen del factor VIII normal, lo que
permitiría asegurar la cascada de coagulación normal.
La divulgación presentada anteriormente es bien
conocida por las personas expertas en la técnica del posible
tratamiento del trastorno de la hemofilia A. Los retrovirus son un
vector de terapia génica posible que se ha desarollado para la
expresión del factor VIII. Sin embargo, por razones que se entienden
mal el nivel de expresión de factor VIII recombinante con este y
otros procedimientos es relativamente bajo.
Una posibilidad para la baja expresión del
factor VIII recombinante en las células transducidas por el
retrovirus y otros vectores es la baja eficiencia relativa de
procesamiento y trasporte del ARN del factor VII maduro desde el
núcleo hasta el citoplasma. Conocida por aquellos en el área, la
delección en la región B del factor VIII aumenta el nivel al cual
se produce y secreta este factor de coagulación. Para evitar los
problemas asociados con los bajos niveles de producción de proteína
del factor VIII, debidos a los bajos niveles de expresión del ARN y
al procesamiento ineficiente, se describió la inserción de ADNc del
factor VIII en vectores Sindbis; Debido a que el ciclo de vida de
Sindbis se produce completamente en el citoplasma de las células
infectadas, se solventan los problemas asociados con el factor VII
expresados a partir del núcleo. Además, dada la eficiencia con la
que Sindbis se autorreplica, en teoría, el nivel de producción de
factor VII en células infectadas con Sindbis/factor VII podría ser
tan alto como 1 x 10^{8} moléculas/célula de proteína del factor
VIII.
Un problema potencial asociado con la inserción
del factor VIII en vectores Sindbis es el tamaño físico resultante
de la construcción del gen del vector/heterólogo, y la posible
restricción del empaquetado del constructo de vector de factor VII
en una partícula de Sindbis infecciosa funcional. El tamaño genómico
de Sindbis de tipo natural es de 11.703 nucleótidos, más una cola
poli A. El tamaño del constructo de vector Sindbis básico
(pKSSINBV, véase el Ejemplo 2) es de 7.830 nucleótidos, incluyendo
una cola poli A de 25-mer. De esta manera, el
tamaño permisible del material genético heterólogo que se va a
insertar en pKSSINBV que da como resultado en un complemento
genómico el mismo tamaño físico que el del virus de tipo natural, es
de 3.898 nucleótidos.
Sin embargo, una pieza clave de evidencia
sugiere que la capacidad del material genético heterólogo que se
puede insertar en pKSSINBV y empaquetarse en una partícula de
Sindbis infecciosa funcional es considerablemente mayor de 3.898
pb. En un trabajo publicado en la bibliografía
(Geigenmuller-Gnirke y col., PNAS 88:
3253-3257, 1991), se describe el empaquetado de dos
moléculas, conteniendo cada una la señal de empaquetado cis
requerida, en las partículas de Sindbis funcionales únicas. El
tamaño físico total de los dos genomas empaquetados en este estudio
es de 14.600 pb. Este resultado indica fuertemente que la capacidad
de los vectores Sindbis para el material genético heterólogo es
mucho mayor que el anteriormente previsto. El potencial de inserción
de grandes genes celulares en los vectores Sindbis extiende
sustancialmente la utilidad de este sistema.
El clon de ADNc del factor VIII tiene
aproximadamente 8.000 pb. La inserción del ADNc del factor VII en
pKSSINBV da como resultado un tamaño genómico de vector/heterólogo
de aproximadamente 15.830 pb. Si el empaquetado de esta partícula
es ineficiente, se puede disminuir el tamaño del inserto eliminando
adicionalmente la "región" del inserto del factor VIII. Se ha
demostrado que la región del dominio B del factor VIII se puede
eliminar desde el ADNc sin afectar la funcionalidad de la proteína
expresada posteriormente. La fuente de ADNc del factor VIII es el
clon pSP64-VIII, un clon de la ATCC con el número de
acceso 39812 que tiene un ADNc que codifica la proteína humana de
longitud completa: Se digirió pSP64-VIII con SalI,
se enromaron los extremos con ADN polimerasa T4 y 50 \muM de cada
dNTP y el fragmento de circa 7700 pb se sometió a electroforesis en
un gel de agarosa al 1%/TBE y se purificó con Gene Clean^{TM}. A
continuación se ligó el ADNc del factor VII que contenía los
extremos enromados en pKSII3'SIN (Ejemplo 2), preparado mediante
digestión con HincII, tratado con CIAP, y se purificó con Gene
Clean^{TM}. Se conoce este plásmido como pF83'SIN.
Para la inserción del factor VIII en los
diversos vectores Sindbis descritos en el Ejemplo 2, se digirió el
plásmido pF83'SIN con XhoI y SacII, y se aisló el fragmento de 7.850
pb resultante en un gel de agarosa al 1%/TBE y se purificó mediante
Gene Clean^{TM}. Este fragmento factor VII-3'SIN
se insertó en cada uno de los vectores relacionados a continuación.
Antes de la inserción de este fragmento se prepararon los plásmidos
mediante digestión con XhoI y SacII, se trataron con CIAP, se
aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%/TBE, y se
purificaron con Gene Clean^{TM}.
Tras la inserción del ADNc del factor VIII,
estos vectores se designaron
pKSSINBVF8
pKSSINdIJRsjrcF8
pKSSINdIJRsjrPCF8
pKSSINdIJRsjrNP(7,582-7,601)F8
pKSSINdIJRsexjrF8
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
El empaquetado del ADNc del factor VIII que
contenía los vectores se llevó a cabo infectando células
transfectadas tanto con vector/factor VIII: virus de tipo natural
con ARN transcrito in vitro:, como alternativamente mediante
transfección con ARN de vector/factor VIII transcrito in
vitro de las líneas células de empaquetado descritas en el
Ejemplo 7. Se determinó la eficiencia del empaquetado midiendo el
nivel de expresión del factor VIII en las células infectadas y
comparándolo con los niveles de expresión observados en los mismos
experimentos llevados a cabo con el vector
pKSSIN-luc descrito en el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generó en primer lugar un clon de ADNc de
glucocerebrosidasa (GC) que contenía un emplazamiento 5' de la
enzima de restricción del ADNc que codifica la secuencia y un
emplazamiento 3' de la enzima de restricción ClaI del ADNc que
codifica la secuencia. Se puede generar el clon digiriendo
pMFG-GC (PNAS 89: 11332; 1992) con NcoI, enromado
con la ADN polimerasa Vent, a continuación se ligó con los ligantes
XhoI. A continuación se digirió el plásmido con BamHI, enromado con
la ADN polimerasa Vent, y a continuación se ligó con los ligantes
ClaI. Para la inserción del factor VII en los diversos vectores
Sindbis descritos en el Ejemplo 2, a continuación se digirió el
fragmento con XhoI y ClaI y se aisló el gel en un gel de agarosa al
1%/TBE y se purificó mediante Gene Clean. El fragmento GC se
insertó en cada uno de los vectores a continuación, preparados
mediante digestión con XhoI y ClaI, tratamiento con CIAP,
aislamiento mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%/TBE, y
purificación con Gene Clean:
Tras la inserción del ADNc del factor VII, estos
vectores se conocen tal como se muestra a continuación:
pKSSINBV-GC
pKSSINdIFRsjrc-GC
pKSSINdIFRsjrPC-GC
pKSSINdIFRsjrNP(7582-7601)-GC
pKSSINdIFRsexjr-GC
\vskip1.000000\baselineskip
El vector Sindbis de glucocerebrosidasa (GC) se
usará para expresar el ADNc de GC en estudios animales y se usará
eventualmente para tratar seres humanos mediante inyección directa.
Si se requieren múltiples inyecciones para sostener la expresión de
GC en el individuo tratado sería ideal si el vector Sindbis se
diseñara para que fuera mínimamente antigénico o se diseñara de tal
manera que no indujera una respuesta inmune en el vector: Los
ejemplos de vectores Sindbis que se diseñan de tal manera y son
capaces de expresar múltiples proteínas se describen en los
Ejemplos 3 (Región E3 Temprana de Adenovirus), Ejemplo 4 (HCMV
H301); Ejemplo 5 (Expresión de genes múltiples) y Ejemplo 17
(Expresión de la ribozima de interferón A). Usando los anteriores
ejemplos, se puede diseñar un vector Sindbis para expresar el ADNc
de GC en dicha configuración en la que la ribozima de horquilla del
interferón A se sigue por el gen E3 de AD o H301 de CMV, seguido por
un emplazamiento de entrada de la ribozima interna seguido por el
ADNc de GC u otro paliativo terapéutico, usando los mismos
emplazamientos de clonación XhoI y ClaI en el emplazamiento de
clonación múltiple del vector.
\vskip1.000000\baselineskip
Se presentaron dos soluciones para crear la
línea celular productora dependiendo del tipo de clon de vector de
ADNc de Sindbis, descrito en el Ejemplo 7. Un tipo de vector Sindbis
usa la secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa SP6 para la
síntesis de los transcriptos in vitro. Este tipo de vector se
usa para crear una línea celular productora de vector basándose en
el vector no integrante que se replicaría persistentemente en la
línea celular de empaquetado. El segundo tipo de vector usa un
promotor heterólogo en lugar de la secuencia Sp6 en un constructo
de plásmido lo que podría permitir la integración estable en la
línea celular de empaquetado (véase el Ejemplo 7 para
revisión). A continuación se expresó la replicación de los
transcriptos de vector Sindbis competentes a partir del nivel del
ADN y se transfectarían en la línea celular que empaqueta
Sindbis.
Si el vector vírico GC de Sindbis usa una
secuencia de reconocimiento del ARN T7, el ADNc debe transcribirse
in vitro en primer lugar usando cualquiera de los sistemas de
transcripción in vitro comercialmente disponibles
(Megascript transcription kit; Ambion Inc., Austin, Texas) seguido
por la transfección del transcripto de ARN de longitud completa
mediante liposomas o precipitación con fosfato de calcio en la línea
celular que empaqueta Sindbis. Tal como se describe anteriormente
(Ejemplo 7), se filtraron los sobrenadantes que contenían las
partículas de vector infecciosas procedentes de la línea celular de
empaquetado transfectada y se usaron a continuación para volver a
infectar una monocapa reciente de células que empaquetan Sindbis que
sirve a continuación como fuente del vector vírico. Deberían usarse
aproximadamente 10 ml de sobrenadante infeccioso para infectar 5 x
10^{6} células en placas de 10 cm.
Si el vector vírico GC de Sindbis usa un
promotor heterólogo en una configuración de plásmido de expresión
con un marcador seleccionable (gen de resistencia a la neomicina),
entonces, el vector de ADNc debe transfectarse en la línea celular
de empaquetado seguido por la selección de resistencia al fármaco, A
continuación se combinaron las colonias resistentes y se clonaron
por dilución. A continuación de propagaron los clones individuales
y se congelaron. A continuación se detectaron sistemáticamente los
clones individuales para título alto tal como se describe en el
Ejemplo 9, para la expresión de la glucocerebrosidasa mediante
análisis de transferencia Western, y a continuación se ensayaron
para la actividad funcional de la proteína (Correll y col.; Blood
80:331, 1992).
Para aquellos vectores que no tienen un marcador
seleccionable, se debe llevar a cabo la selección de los clones
transfectados de manera estable o persistente mediante clonación por
dilución de la línea celular de empaquetado uno o dos día después
de transfectar las células con el vector Sindbis. A continuación se
detectaron sistemáticamente los clones por dilución para la
presencia de glucocerebrosidasa usando la transcripción inversa del
ARN mensajero seguido por la amplificación del mensaje del ADNc
mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa. Este
procedimiento se conoce como la técnica RT-PCR y
está disponible un kit comercial para llevar a cabo este ensayo de
Invitrogen Corp. (San Diego, CA). Se llevó a cabo la
RT-PCR sobre clones que se habían propagado durante
al menos 10 días. Se detectaron sistemáticamente aproximadamente 50
a 100 clones con el fin de encontrar un número razonable de clones
infectados de manera estable, persistente. Con el fin de llevar a
cabo la RT-PCR, se requieren cebadores específicos
para el mensaje deseado que se van a detectar sistemáticamente
mediante la amplificación del producto del ARN. Los cebadores
designados para amplificar un producto de 521 pares de bases para
la detección sistemática de la glucocerebrosidasa son:
Aquellos clones que demostraron la expresión y
título más altos se ensayaron a continuación para la transferencia
de expresión infectando células BHK-2 seguida por
análisis de transferencia Western y un ensayo funcional para la
actividad de la glucocerebrosidasa (GC) en las células
BHK-2. Se usó un anticuerpo monoclonal (8E4) contra
GC humana para las transferencias Western (PNAS 89:11332, 1992) y se
describe en Barneveld, R.A. y col (Eur. J. Biochem. 134: 310,
1983). Una vez se ha identificado el clon apropiado, se usaron los
sobrenadantes procedentes de los cultivos de crecimiento para
obtener el vector, se filtraron a través de un filtro de 45 \muC
para comenzar los estudios animales mediante la inyección directa en
animales. Después que se llevaron a cabo los estudios animales, se
pueden usar protocolos de inyección directa escalados derivados de
los estudios animales, para el tratamiento de pacientes humanos con
Enfermedad de Gaucher. Se proporcionan protocolos de administración
para este vector en el siguiente ejemplo.
\vskip1.000000\baselineskip
Hasta la fecha se han aislado y caracterizado
más de sesenta tipos del virus del papiloma humano (VPH), que tiene
un pronunciado tropismo por las células de origen epitelial. Entre
el grupo de VPH se encuentran un número sustancial de virus de los
tipos que infectan el tracto anogenital humano. Este grupo de VPH se
pueden subdividir adicionalmente en tipos que están asociados con
la proliferación benigna o maligna en el tracto anogenital.
Se producen cada año en los Estados Unidos entre
13.000 y 20.000 fallecimientos por cáncer. En los países en
desarrollo, el cáncer cervical es la neoplasia maligna más
frecuente, y en los países desarrollados el cáncer cervical se
coloca detrás de los cánceres de mama, pulmón, útero y ovario. Una
estadística que apoya especialmente la noción de que la
proliferación anogenital es un problema sanitario creciente es que
las consultas médicas por problemas genitales se incrementaron de
169.000 en 1966 a más de 2 millones en 1988.
Existen varias líneas de evidencia que
relacionan el VPH con la patogénesis de enfermedades proliferativas
cervicales. Un subconjunto de tipos, denominado específicamente
"VPH de bajo riesgo", se han asociado con dolencias
proliferativas benignas del cérvix (por ejemplo, VPH 6, 11, 43, 44),
mientras que otro subconjunto de tipos los "VPH de alto
riesgo" se asocian con lesiones que pueden progresar hacia el
estado maligno (por ejemplo, VPH 16, 18, 31, 33, 35, etc.).
Aproximadamente un 95% de los tumores cervical cervicales contienen
VPH, encontrándose el tipo de ADN del VPH tipo 16 ó 18 DNA en
aproximadamente el 70% de estos.
La frecuencia de VPH entre la población de
jóvenes sexualmente activas parece ser bastante elevado. De esta
manera, en un reciente estudio entre 454 universitarias, 213, o 46%
eran VPH positivas. Entre el grupo VPH positivo, un 3% era VPH 6/11
positivo, y un 14% era VPH 16/18 positivo. De estas 454 mujeres, 33
(7,3%) tenían una proliferación cervical anormal, según se determinó
mediante citología.
Con respecto al diseño de agentes terapéuticos
de sentido contrario y ribozimas dirigidos al VPH, se deben
considerar parámetros importantes relacionados con los tipos de VPH
a los que dirigirse (es decir, tipos asociados con condiloma
acuminatum o tipos asociados con la proliferación cervical maligna)
y los genes expresados por VPH a los que dirigirse, incluyendo pero
sin limitarse a, genes de E2, E6, o E7. En general, la expresión de
los genes de VPH está definida temporalmente en dos fases, genes
expresados tempranamente (E) antes de la replicación del ADN
vírico, y genes expresados tardíamente (L) tras la replicación del
ADN vírico. Existen 7 genes enzimáticos tempranos de VPH y 2 genes
estructurales tardíos de VPH.
Basándose en la discusión presentada más arriba,
se pueden construir moléculas terapéuticas de sentido
contrario/ribozima enviadas contra los grupos de VPH 6/11 que se
dirigen al gen vírico E2. Parece posible que la diana génica E2
pueda resultar precaria con respecto al grupo de VPH 16/18 debido a
un mecanismo de integración impulsada del virus con respecto a la
inhibición de la expresión de la proteína E2. De esta manera, parece
que los genes E6/E7 de los tipos de VPH 16/18 deberían ser dianas
directas. Se describe a continuación la construcción de una
molécula terapéutica de sentido contrario y ribozima en vectores de
virus Sindbis (descritos en el Ejemplo 2) específicos para el ARN
de E6 y E7 en VPH tipo 16. La inserción de los restos de sentido
contrario y ribozima de VPH entre los emplazamientos ClaI y XbaI del
vector Sindbis.
\vskip1.000000\baselineskip
El clon genómico vírico de VPH 16,
pHPV-16 [0540] (número ATCC 45113) se usó como
plantilla en una reacción de la PCR para la amplificación de
secuencias específicas procedentes de los genes víricos E6/E7. El
resto de sentido contrario de VPH 16 se inserta en primer lugar en
el vector plásmido pKSII^{+}; la eliminación de la molécula
terapéutica de sentido contrario del vector plásmido y la inserción
en los diferentes esqueletos del vector Sindbis se lleva a cabo
mediante en único resto terminal de sentido contrario ClaI y los
emplazamientos de la endonucleasa de restricción XbaI. La
amplificación de una parte de los genes E6/E7 de VPH 16 se lleva a
cabo con el par de cebadores mostrado a continuación:
Cebador directo (secuencia tampón/emplazamiento
XbaI/VPH 16 nucleótidos 201-222):
TATATTCTAGAGCAAGCAACAGTTACTGCGACG | (SEC DE ID Nº. 76) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso (secuencia tampón/emplazamiento
ClaI/nucleótidos 759-738 de VPH 16):
TATATATCGATCCGAAGCGTAGAGTCACACTTG | (SEC DE ID Nº. 77) |
\vskip1.000000\baselineskip
El producto amplicón de 580 bp de E6/E7 de VPH
16 se purificó en primer lugar mediante Gene Clean (Bio 101, San
Diego, CA), digerido con las enzimas de restricción ClaI y XbaI, y
sometido a electroforesis en gel de agarosa al 1%/TBE. La banda de
568 bp se escindió del gel, el ADN se purificó mediante Gene Clean,
y se ligó en el plásmido pKSII^{+} preparado a partir de la
digestión con ClaI y XbaI, tratamiento con CIAP, y tratamiento con
Gene Clean. Este plásmido se conoce como pKSaHPV16E6/E7.
Además de las secuencias complementarias de
E6/E7 de VPH 16, ambos cebadores contienen "secuencias tampón"
de cinco nucleótidos en sus extremos 5' para una digestión
enzimática eficaz de los productos amplicón de la PCR. La
generación del amplicón de VPH 16 con los cebadores anteriormente
mostrados se lleva a cabo con el protocolo de la PCR descrito en el
Ejemplo 4. Se ha demostrado anteriormente que el ARNm de E6/E7 en
epitelios cervicales infectados está presente de tres formas, no
cortado y empalmado y dos alternativas cortadas y empalmadas (E6* y
E6**), una con los nucleótidos 226-525 de E6 que no
está presente en el mensaje maduro (Smotkin y col, J. Virol
63:1441-1447, 1989). La región de complementariedad
entre el resto de sentido contrario descrito aquí u el genoma de
VPH 16 son los nucleótidos víricos 201-759. Así, el
resto de sentido contrario será capaz de unirse e inhibir la
traducción del mensaje no cortado y empalmado de E6/E7 y los
mensajes cortados y empalmados de E6* y E6**.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de inhibir eficazmente la expresión
de las proteínas E6 y E7 de VPH 16 se construyó una ribozima de
horquilla (HRBZ) con diana específica en el ARNm de E6. El resto
ribozima de VPH 16 se inserta en primer lugar en el vector plásmido
pKSII^{+}; la retirada de la molécula terapéutica de ribozima del
vector plásmido y la inserción en los diferentes esqueletos del
vector Sindbis se lleva a cabo vector La inserción de los restos de
sentido contrario y ribozima de VPH entre los emplazamientos ClaI y
XbaI.
HRBZ es homóloga del ARN E6 de VPH 16 (nt.
414-431) mostrado a continuación:
TT AACTGTCAAAAGCCAC | (SEC DE ID Nº. 78) |
\vskip1.000000\baselineskip
HRBZ está diseñada para escindirse tras el resto
T de TCTC en el bucle 5 del sustrato motivo de la ribozima de
horquilla, mostrado subrayado más adelante. Tras la escisión, la
HRBZ se recicla y es capaz de hibridarse con, y escindirse de, otra
molécula de ARNm no cortada y empalmada de E6/E7 o la molécula de
ARNm de E6* cortada y empalmada.
La HRBZ de doble cadena, como se ha definido
anteriormente (Hampel y col, Nucleic Acids Research
18:299-304, 1990), que contiene el "tetrabucle"
3 de 4 bases y una hélice extendida 4, con especificidad para el ARN
de E6 de VPH 16 RNA anteriormente mostrado, se sintetiza
químicamente e incluye ambos extremos 5' y 3', respectivamente,
los emplazamientos ClaI y XbaI. La secuencia de las cadenas
de la HRBZ de E6 de VPH 16 químicamente sintetizada se muestran a
continuación:
\newpage
Con el fin de formar la HRBZ de doble cadena
específica de E6 de VPH 16 con extremos cohesivos ClaI y XbaI, se
mezclaron cantidades iguales de oligonucleótidos en Mg^{2+} 10 mM,
se calentó hasta 95ºC durante 5 min, a continuó se enfrió lentamente
hasta temperatura ambiente para permitir la fusión de las
cadenas.
La HRBZ de doble cadena específica de E6 de VPH
16 con extremos cohesivos ClaI y XbaI, se ligó en el plásmido
pKSII^{+} preparado a partir de la digestión con ClaI y XbaI,
tratamiento con CIAP, y tratamiento con Gene Clean. Este plásmido se
conoce como pKSHPV16E6HRBZ.
Los restos ribozima de horquilla y de sentido
contrario de VPH 16 se liberaron de sus vectores plásmidos,
pKSaHPV16E6/E7 y pKSHPV16E6HRBZ, respectivamente, por digestión con
ClaI y XbaI, purificación mediante electroforesis en gel de agarosa
y Gene Clean, e inserción en el esqueleto del vector deseado,
preparado por digestión con ClaI y XbaI, y tratamiento con CIAP.
Algunos posibles vectores Sindbis, alguno de los cuales se muestra
a continuación, y cuya construcción detallada se describe en el
Ejemplo 2, son adecuados para la inserción de los restos
terapéuticos de sentido contrario y ribozima de VPH 16:
Puesto que los agentes terapéuticos de sentido
contrario y ribozimas operan en el ARN, no es necesario que los
vectores que contienen estos restos contengan una región de unión
funcional. Esto es, la traducción de la región correspondiente a
las proteínas estructurales de Sindbis se produce únicamente a
partir del ARN subgenómico. Sin embargo, debido a que la traducción
de los agentes terapéuticos sentido contrario y ribozima de
horquilla no es un problema, estos restos ejercerán su efecto desde
el nivel de ARN de cadena positiva del vector genómico de
Sindbis.
Por otra parte, puede desearse administrar dosis
repetidas a un individuo; así, el paliativo de horquilla se
insertaría en la dirección 3' de los genes E3 de adenovirus o H301
de citomegalovirus humano, que infrarregulan la expresión de las
moléculas MHC de clase I en células infectadas. La inserción de los
paliativos de sentido contrario y horquilla se lleva a cabo en los
vectores de los Ejemplos 3 y 4 mostrados a continuación, entre los
emplazamientos ClaI y XbaI:
Se sintetizó ARNm subgenómico a partir de estos
vectores, que sirven como plantilla de traducciones para los genes
E3 de Ad y H301 de CMV. De esta manera, en estas construcciones los
paliativos de sentido contrario y ribozimas de horquilla de VPH 16
estarán presenten en los niveles tanto subgenómico como genómico de
cadena positiva del ARN del vector Sindbis vector.
Además, los paliativos de sentido contrario y
ribozima de horquilla de VPH 16 se pueden insertar en la dirección
3' de un gen heterólogo insertado en los vectores Sindbis descritos.
Por ejemplo, se puede insertar los paliativos de sentido contrario
y ribozima de horquilla de VPH 16 en la dirección 3' de un gen
heterólogo que codifica un epitopo inmunogénico de VPH 16
procedente de, por ejemplo, las proteínas E6/E7 o L1. En estos
vectores, no sería deseable incluir los genes inmunorreguladores E3
de Ad y H301 de CMV.
La expresión de los genes E6/E7 durante la
infección con los grupos de VPH de riesgo tanto alto como bajo es
necesaria para la proliferación en el epitelio cervical. La proteína
E7 de VPH procedente de todos los tipos de VPH ensayados forma un
complejo con la proteína del retinoblastoma, y la proteína E6 del
VPH tipos 16 y 18 se asocia con y degrada la proteína celular p53.
Los genes celulares de p53 y retinoblastoma están implicados en el
control del crecimiento de las células, y la alteración de la
expresión o el funcionamiento de estas proteínas puede liberar el
control del crecimiento de las células afectadas. Así, un agente
terapéutico de sentido contrario o ribozima para ambos grupos de
VPH debería directa o indirectamente disminuir la expresión de uno
o ambos de estos genes. La expresión de los genes E6/E7 está
trans-activada por la proteína vírica E2. Sin
embargo, utilizando una estrategia alternativa de corte y empalme,
la proteína E2 puede actuar también como transrepresor. La
integración de los tipos oncogénicos de VPH se produce en la región
vírica E2 e impide la expresión de la proteína E2. La integración
de los tipos oncogénicos de VPH parece ser un episodio clave en la
inducción completa y/o mantenimiento del carcinoma cervical. Este
episodio da como resultado la expresión constitutiva de los genes
E6/E7. En el estado integrado, la expresión de los genes E6/E7 está
trans-activada por factores presentes en los
queratinocitos infectados. La inactivación del mecanismo de control
de E2 vírico en respuesta al factor de activación celular de
queratinocitos de la expresión de E6/E7 debería ser un episodio
crítico en la integración vírica.
Se describe a continuación la construcción de
los agentes terapéuticos de sentido contrario y ribozimas, dentro
de vectores de virus Sindbis (descritos en el Ejemplo 2) específico
para ARN de E6 y E7 de VPH de 16. La inserción de los restos de
sentido contrario y ribozima de VPH se produce entre los
emplazamientos ClaI y XbaI del vector Sindbis.
\vskip1.000000\baselineskip
El clon genómico vírico de VPH 16,
pHPV-16 (número ATCC 45113) se usó como plantilla en
una reacción de la PCR para la ampliación de secuencias específicas
procedentes de los genes víricos E6/E7. El resto de sentido
contrario de VPH 16 se insertó en primer lugar en el vector plásmido
pKSII^{+}; la eliminación del agente terapéutico de sentido
contrario del vector plásmido y la inserción en los diferentes
esqueletos del vector Sindbis se lleva a cabo mediante el único
resto de sentido contrario terminal ClaI y los emplazamientos de la
endonucleasa de restricción XbaI. La amplificación de una parte de
los genes de E6/E7 VPH 16 se lleva a cabo con el par de cebadores
siguiente:
VPH 16 Cebador directo (secuencia
tampón/emplazamiento XbaI/nucleótidos 201-222 de VPH
16):
5'-TAT ATT CTA GAG CAA GCA ACA GTT ACT GCG ACG-3' | (SEC DE ID Nº. 81) |
\vskip1.000000\baselineskip
VPH 16 Cebador inverso (secuencia
tampón/emplazamiento ClaI/nucleótidos 759-738 de VPH
16):
5'-TAT ATA TCG ATC CGA AGC GTA GAG TCA CAC TTG-3' | (SEC DE ID Nº. 82) |
\vskip1.000000\baselineskip
El producto amplicón de 580 bp de E6/E7 de VPH
16 se purificó en primer lugar con Gene Clean (Bio 101, San Diego
CA), se digirió con las enzimas de restricción ClaI y XbaI, y se
aisló mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%/FBE. La banda
de 568 bp se escindió del gel, se purificó con Gene Clean^{TM}, y
se ligó en el plásmido pKSII^{+} preparado mediante digestión con
ClaI y XbaI, se trató con CIAP, y se purificó mediante Clean^{TM}.
Este plásmido se designa como pKS\alphaHPV16E6/E7.
Además de las secuencias complementarias de
E6/E7 de VPH 16, ambos cebadores contienen "secuencias tampón"
de cinco nucleótidos en sus extremos 5' para una digestión
enzimática eficaz de los amplicones producto de la PCR. La
generación del amplicón de VPH 16 con los cebadores anteriores se
lleva a cabo usando el protocolo de la PCR descrito en el Ejemplo
4. Se sabe que el ARNm de E6/E7 del epitelio cervical infectado está
presente entre formas, no cortado y empalmado y dos alternativas
(E6* y E6**), en las que los nucleótidos 226-525 de
E6 no están presentes en el mensaje maduro (Smotkin y col, J. Virol
63:1441, 1989). La región de complementariedad entre el de sentido
contrario y el genoma de VPH 16 son los nucleótidos víricos
201-759. Así, el resto de sentido contrario será
capaz de unirse e inhibir la traducción del mensaje de E6/E7 no
cortado y empalmado y los mensajes cortados y empalmados de E6* y
E6**.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de inhibir de manera eficaz la
expresión de las proteínas E6 y E7 de VPH 16, se construyó un
ribozima de horquilla (HRBZ) con diana específica en el ARNm de E6.
El resto ribozima de VPH 16 se insertó en primer lugar en el vector
plásmido pKSII^{+}; la eliminación de la ribozima terapéutica del
vector plásmido e inserción en los diferentes esqueletos del vector
Sindbis se lleva a cabo mediante el único el resto ribozima terminal
ClaI y los emplazamientos de la endonucleasa de restricción
XbaI.
HRBZ es homóloga de la secuencia de nucleótidos
16 414-431 de ARN de E6 de VPH mostrada a
continuación:
5'-TTA ACT GTC AAA AGC CAC-3' | (SEC DE ID Nº. 83) |
\vskip1.000000\baselineskip
HRBZ está diseñada para escindirse tras el resto
T de TCTC en el bucle 5 del sustrato motivo de la ribozima de
horquilla, mostrado subrayado anteriormente. Tras la escisión, la
HRBZ se recicla y es capaz de hibridarse con, y escindirse de, otra
molécula de ARNm no cortada y empalmada de E6/E7 o la molécula de
ARNm de E6* cortada y empalmada.
\newpage
La HRBZ de doble cadena (Hampel y col, Nucleic
Acids Research 18:299-304, 1990), que contiene el
"tetrabucle" 3 de 4 bases y una hélice extendida 4, con
especificidad para el ARN de E6 de VPH 16 anteriormente mostrado, se
sintetiza químicamente e incluye los emplazamientos ClaI y
XbaI en ambos extremos 5' y 3', respectivamente. La secuencia de las
cadenas de la HRBZ de E6 de VPH 16 químicamente sintetizada se
muestra a continuación:
Con el fin de formar la HRBZ de doble cadena
específica de E6 de VPH 16 con extremos cohesivos ClaI y XbaI, se
mezclaron cantidades iguales de oligonucleótidos en MHCl_{2}10 mM,
se calentó hasta 95ºC durante 5 min, a continuó se enfrió lentamente
hasta temperatura ambiente para permitir la fusión de las
cadenas.
La HRBZ de doble cadena con extremos cohesivos
ClaI y XbaI, se ligó en el vector plásmido pKSII^{+} El vector
preparado pKSII^{+} se digirió en primer lugar con ClaI y XbaI, se
trató con CIAP, y se purificó con Gene Clean antes de la ligadura.
Este plásmido se denominó pKSHPV16E6HRBZ.
Los restos ribozima de horquilla y de sentido
contrario de VPH 16 se liberaron de sus vectores plásmidos,
pKSaHPV16E6/E7 y pKSHPV16E6HRBZ,, respectivamente, por digestión con
ClaI y XbaI, aislamiento mediante electroforesis en gel de agarosa
y se purificaron usando Gene Clean^{TM}. Se ligaron en el
esqueleto del vector deseado. El esqueleto del vector se preparó
por digestión con ClaI y XbaI, y se trató con CIAP. Algunos posibles
vectores Sindbis son adecuados para la inserción de los restos
terapéuticos de sentido contrario y ribozima de VPH 16. Alguno de
los vectores del Ejemplo 2 se presenta a continuación:
Puesto que los terapéuticos de sentido contrario
y ribozima operan en el ARN, no es necesario que los vectores que
contienen estos restos contengan también una región de unión
funcional. Específicamente, la traducción de la región
correspondiente a las proteínas estructurales de Sindbis se produce
únicamente a partir del ARN subgenómico. Sin embargo, debido a que
la traducción de los agentes terapéuticos de sentido contrario y
ribozima de horquilla no es un problema, estos restos ejercerán su
efecto desde el nivel de ARN de cadena positiva del vector genómico
de Sindbis.
Por otra parte, puede desearse administrar dosis
repetidas a un individuo; así, el paliativo de horquilla se
insertaría en la dirección 3' de los genes E3 de adenovirus o H301
de citomegalovirus humano, que infrarregulan la expresión de las
moléculas MHC de clase I en células infectadas. La inserción de los
paliativos de sentido contrario y horquilla se lleva a cabo en los
vectores de los Ejemplos 3 y 4 mostrados a continuación, entre los
emplazamientos ClaI y XbaI:
Se sintetizó ARNm subgefnómico en estos
vectores, que sirven como plantilla de traducciones para los genes
E3 de Ad y H301 de CMV. De esta manera, en estas construcciones los
paliativos de sentido contrario y ribozima de horquilla de VPH 16
estarán presenten en los niveles tanto subgenómico como genómico de
cadena positiva del ARN del vector Sindbis vector.
Además, los paliativos de sentido contrario y
ribozima de horquilla de VPH 16 se pueden insertar en la dirección
3' de un gen heterólogo insertado en los vectores Sindbis descritos.
Por ejemplo, se puede insertar los paliativos de sentido contrario
y ribozima de horquilla de VPH 16 en la dirección 3' de un gen
heterólogo que codifica un epitopo inmunogénico de VPH 16
procedente de, por ejemplo, las proteínas E6/E7 o L1. En estos
vectores, no sería deseable incluir los genes inmunorreguladores E3
de Ad y H301 de CMV.
\vskip1.000000\baselineskip
Los interferones (IFN) comprenden una familia de
pequeñas proteínas que realizan un amplio intervalo de actividades
biológicas en las células de mamífero, incluyendo la expresión de
antígenos de MHC, la expresión de varios genes que modulan el
control del crecimiento celular y la resistencia a las infecciones
víricas (Pestka y col, Ann. Rev. Biochem.
56:727-777, 1987). De las tres clases de IFN, a, b,
y g, IFN-a, o interferón leucocítico, es
responsable de la actividad que limita la replicación vírica en la
célula infectada.
Los efectos antivirales del
IFN-a se han asociado con la inducción de dos
enzimas celulares que inhiben el ciclo de vida vírico en la célula
infectada. Una enzima es una proteína quinasa de 68 kDa dependiente
de un ARN de doble cadena que cataliza la fosforilación de la
subunidad a del factor de iniciación de la síntesis de proteínas
eIF-2. El Segundo enzima inducido por el IFNa es la
2',5'-oligoadenilato sintetasa
(2',5'-OAS), que en presencia del ARN de doble
cadena activa la endonucleasa latente, RNasa L, que es responsable
de la degradación de los ARN víricos y celulares (Johnston y
Torrence, Interferons 3:189-298, Friedman (ed.),
Elsevier Science Publishers, B.V., Ámsterdam, 1984).
Debido a que su estrategia de replicación
incluye un intermedio de ARN de doble cadena, los virus de ARN en
particular son fuertemente inductores de interferón. Con respecto al
virus Sindbis, las moléculas de ARN de doble cadena están presentes
durante la replicación de las moléculas de longitud genómica de
cadenas tanto positiva como negativa y durante la transcripción del
ARNm subgenómico. Se ha demostrado que la infección de células por
el virus Sindbis da como resultado la inducción de interferón
(Saito, J. Interferon Res. 9:23-24, 1989).
En aplicaciones en las que se desea una
expresión extendida del paliativo terapéutico, se inhibe la
expresión de IFN en la célula infectada mediante la inclusión de un
ribozima de horquilla con especificidad para el ARNm de
IFN-a h en el vector Sindbis vector. La inhibición
de la expresión IFN-a mitiga de esta manera la
inducción de la cascada de proteínas celulares, incluyendo la
proteína quinasa de IF-2 y
2'.5'-OAS, que inhiben la extensión en la que el
virus se puede replicar en la célula infectada. Se desea una
expresión prolongada del paliativo sin inducción de una respuesta
inmune dirigida hacia la célula infectada por el vector para todas
las aplicaciones distintas de la presentación de antígeno e incluye,
por ejemplo, producción sistémica de proteínas, de sentido contrario
y ribozima, y moléculas ocasionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de inhibir eficazmente la expresión
de la proteína interferón A en células infectadas con vectores
Sindbis, se construyó un ribozima de horquilla (HRBZ) con
especificidad dirigida al ARNm de interferón A. El resto ribozima
de IFN-a se inserta en primer lugar en el vector
plásmido pKSII^{+} (Stratagene, La Jolla, CA); la eliminación de
la ribozima terapéutica del vector plásmido e inserción en los
diferentes esqueletos del vector Sindbis se lleva a cabo mediante el
único el resto ribozima terminal ClaI y los emplazamientos de la
endonucleasa de restricción XbaI.
HRBZ es homóloga de la secuencia de nucleótidos
1026-1041 del gen alfa del interferón humano
IFN-alfa 4b mostrado a continuación, de todos los
genes de IFN-a secuenciados, incluyendo 5, 6, 7, 8,
y 14, pero no el gen 16 (Henco y col. J. Mol. Biol.
185:227-260, 1985):
TCT CTG TCC TCC ATG A | (SEC DE ID Nº. 86) |
\vskip1.000000\baselineskip
HRBZ está diseñada para escindirse tras el resto
T de TCTC en el bucle 5 del sustrato motivo de la ribozima de
horquilla, mostrado subrayado anteriormente. Tras la escisión, la
HRBZ se recicla y es capaz de hibridarse con, y escindirse de, otra
molécula de ARNm.
La HRBZ de doble cadena como se ha definido
anteriormente (Hampel y col, Nucleic Acids Research
18:299-304, 1990), contiene un tetrabucle 3 de 4
bases, y una hélice extendida 4, con especificidad para el ARNm de
IFN-a anteriormente mostrado, se sintetiza
químicamente e incluye en los extremos 5' y 3', respectivamente, los
emplazamientos ClaI y XbaI. La secuencia de las cadenas de la HRBZ
de IFN-a se muestran a continuación:
Con el fin de formar la HRBZ de doble cadena
específica de IFN-a con extremos cohesivos ClaI y
XbaI, se mezclaron cantidades iguales de oligonucleótidos en
Mg^{2+} 10 mM, se calentó hasta 95ºC durante 5 min, a continuó se
enfrió lentamente hasta temperatura ambiente para permitir la fusión
de las cadenas.
La HRBZ-IFN-a de
doble cadena con extremos cohesivos ClaI y XbaI, se ligó en primer
lugar en el vector plásmido pKSII+, preparado por digestión con ClaI
y XbaI, tratamiento con CIAP, y tratamiento con Gene Clean. Este
plásmido se conoce como pKSIFNaHRBZ.
El resto ribozima de horquilla de
IFN-a se liberó del plásmido pKSIFNaHRBZ por
digestión con purificación mediante electroforesis en NuSieve al
2%/agarosa al 1% y Gene Clean, e inserción en el esqueleto del
vector deseado, preparado por digestión con ClaI y XbaI, y
tratamiento con CIAP. Algunos posibles vectores Sindbis alguno de
los cuales se muestra a continuación, y cuya construcción detallada
se describe en los Ejemplos 2, 3, y 4 son adecuados para la
inserción en el resto ribozima de horquilla de
IFN-a:
Puesto que la actividad de la ribozima opera en
el ARN, no es necesario que esta región se exprese en forma de ARNm
de una porción subgenómica. Sin embargo, cuando se ubica en la
dirección 3' de una región funcional de unión, el nivel de ribozima
sintetizada es mucho mayor y quizás más eficaz para escindir la
diana ARN de IFN-a.
Además, en algunas aplicaciones, por ejemplo la
expresión sistémica de proteínas, se necesita una administración de
dosis múltiple a un individuo. En estas aplicaciones se desea una
expresión prolongada del paliativo sin inducción de una respuesta
inmune dirigida hacia la célula infectada por el vector. En esta
configuración, el resto IFN-aHRBZ podría insertarse
en dirección 5' de los genes E3 de adenovirus o de H301 de
citomegalovirus humano que infrarregulan la expresión de las
moléculas MHC de clase I en células infectadas. Siguiendo al gen
que modula la expresión de las moléculas MHC de clase I,
consecutivamente, se encuentra un elemento IRES seleccionado entre
el grupo descrito en el Ejemplo 5, y el terapéutico paliativo. La
inserción ordenada de los componentes ribozima de horquilla, Ad E3
o CMV H301, IRES, y gen heterólogo de interés a lo largo de la
secuencia de clonación múltiple localizada en el vector entre la
región de unión del vector y el extremo 3' se lleva a cabo por
modificación con los emplazamientos de reconocimiento adecuados de
la enzima de restricción en los extremos 5' y 3' de los
componentes. En estas construcciones los paliativos funcionales de
ribozima de horquilla de INF-a estarán presentes a
nivel tanto subgenómico como genómico de cadena positiva en el ARN
del vector Sindbis RNA.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de alfavirus recombinante bruto se
obtuvo en un biorreactor Celligan (New Brunswick, NJ) conteniendo
células de empaquetado transfectadas o transducidas con el vector de
alfavirus recombinante, y unido a las perlas de la matriz del
biorreactor. Las células liberaron el vector de alfavirus
recombinante al medio de crecimiento que pasa por las células en un
procedimiento de flujo continuo. Se recogió el medio que sale del
biorreactor y se hizo pasar inicialmente por un filtro de 0,8
micrómetros y posteriormente por un filtro de 0,65 micrómetros para
tamizar el vector de alfavirus recombinante bruto. El filtrado se
concentró utilizando un sistema de concentración de flujo cruzado
(Filtron, Boston, MA). Se añadieron aproximadamente 50 unidades de
DNasa (Intergen, Nueva York, NY) por ml de concentrado para digerir
el ADN exógeno. El digerido se diafiltró usando el mismo sistema de
flujo cruzado hasta NaCl 150 mM, trometamina 25 mM, pH 7,2. El
diafiltrado se cargó en una columna de gel Sephadex
S-500 (Pharmacia, Piscataway, NJ), se equilibró en
NaCl 50 mM, trometamina 25 mM, pH 7,4. El vector de alfavirus
recombinante purificado se eluyó de la columna de gel Sephadex
S-500 en NaCl 50 mM, trometamina 25 mM, pH 7,4.
Se preparó el tampón de formulación conteniendo
lactosa en forma de disolución de almacenamiento 2X. El tampón de
formulación contenía trometamina 25 mM, NaCl 70 mM, 2 mg/ml de
arginina, 10 mg/ml de albúmina de suero humano (HSA), y 100 mg/ml de
lactosa en un volumen final de 100 ml a pH 7,4.
El vector de alfavirus recombinante purificado
se formula añadiendo una parte del tampón de formulación de lactosa
2X a una parte del vector de alfavirus recombinante purificado
mediante S-500. El vector de alfavirus recombinante
formulado se puede almacenar de -70ºC a -80ºC o seco.
El vector de alfavirus formulado se liofilizó en
una cámara refrigerante Edwards (Unidad RC3S de 3 baldas) unido a
un criodesecador Supermodulyo 12K (Edwards High Vacuum, Tonawanda.
NY). Cuando se completó el ciclo de criodesecación, los viales se
detuvieron bajo vacío tras un ligero purgado con nitrógeno. Tras la
retirada, los tapones se sellaron con cápsulas de aluminio. El
retrovirus recombinante liofilizado se reconstituyó con 1,0 ml de
agua.
A partir de lo anterior, se apreciara que,
aunque se han descrito en el presente documento formas de
realización específicas de la invención a efectos de ilustración, se
pueden hacer varias modificaciones. Según esto, la invención no está
limitada salvo por las reivindicaciones adjuntas.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CHIRON CORPORATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4650 Horton Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CITY: Emeryville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92121
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VECTORES DE ALFAVIRUS RECOMBINANTES
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 89
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A9
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: WO US95/07994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTCTACGG TGGTCCTAAA TAGT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATTCTAG ATTTTTTTTT TTTTTTGAAA
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATGGGCC CGATTTAGGT GACACTATAG ATTGACGGCG TAGTACAC
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGCAACCG GTAAGTACGA TAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA; SEC DE ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATACTAGCCA CGGCCGGTAT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTCTTTCG ACGTGTCGAG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCTTGGAGC GCAATGTCCT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTTTCAGG GGATCCGCCA C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGCGGATC CCCTGAAAAG G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGCCGTGT GGTCGCATG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGTCTTCA ACTCACCGGA C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATTCGACG TACGCCTCAC TC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGTGAGGCG TACGTCGAAT TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATCTCCA GATGAGGTAC ATGATTTTAG GCTTG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATATCGA TTCAAGGCAT TTTCTTTTCA TCAATAAAAC
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATCTCCA GATGATGACA ATGTGGTGTC TGACG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATATCGA TTCATGACGA CCGGACCTTG CG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATGGGCC CCCCCCCCCC CCCCAACG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATATCGA TCCCCCCCCC CCCCCCAACG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATCCATG GCTTACAATC GTGGTTTTCA AAGG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATGGGCC CTCGATGAGT CTGGACGTTC CTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATATCGA TTCGATGAGT CTGGACGTTC CTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATCCATG GATCCAATTT GCTTTATGAT AACAATC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATGGGCC CGGTCGACGC CGGCCAAGAC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATATCGA TGGTCGACGC CGGCCAAGAC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATCCATG GTGCCAGCCA GTTGGGCAGC AG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTAATTAACG GCCGCCACCA TGG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAACGGCCGC CAC
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATGGTGGC GGCCGTTAAT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCACCGGTG AC
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCATCGATC AGATCTGACT AGTTG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCAACTA GTCAGATCTG ATCGATGAGG GCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTTATCGAT GGTTCTAGAC TCCCTTAGCC ATCCGAGTGG ACGTGCGTCC TCCTTC
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCACCTCCT CGCGGTCCGA CCTGGGCATC CGAAGGAGGA CGCACGTCCA CT
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGGACCGCG AGGAGGTGGA GATGCCATGC CGACCCATTG ACGGCGTAGT ACACACT
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGACTAGT TAATACTGGT GCTCGGAAAA CATTCT
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCAAGCTTG CTAGCTACAA CACCACCACC ATGAATAGAG
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATGCGGC CGCACCACCA CCATGAATAG AGGATTCTTT AACATGC
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATGCGGC CGCTCATCTT CGTGTGCTAG TCAG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 61 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCTCGAG TTACTACCAC TCTTCTGTCC CTTCCGGGGT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATGCGGC CGCACCACCA TGTCCGCAGC ACCACTGGTC ACG
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATAGATC TCTTGATCAG CTTCAGAAGA TGGC
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAATGGCGG GAAGAGGCGG TTGG
\hfill24
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCCTCTTC CCGCCATTGA CGGCGTAGTA C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGCAACCG GTAAGTACGA TAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATAGATC TCTTGATCAG CTTCAGAAGA TGGC
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTAACAAGA TCTCGTGCCG TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATGCGGC CGCACCGCCA AGATGTTCCC GTTCCAGCCA
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATGCGGC CGCTCAATTA TGTTTCTGGT TGGT
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCGAGCTCG AGGCACCAGC ACCATGCAAC TTTTT
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTACTAGATC CCTAGATGCT GGATCTTCC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAAGATCCA GCATCTAGGG ATCTAGTAG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCGATATC AAGCTTATCG ATACCG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCGAGCTCG AGGCACCAGC ACCATGCAAC TTTTT
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCGATATC AAGCTTATCG ATACCG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATACGACTC ACTATAGGG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTACTAGATC CCTAGATGCT GGATCTTCC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTAACCCTC ACTAAAG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAAGATCCA GCATCTAGGG ATCTAGTAG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTAACCCTC ACTAAAG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATACGACTC ACTATAGGG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCGAGCTC GAGCTTGGGT GGCTTTGGGG CATG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTACCCCTC ACTAAAG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCACCTCCT CGCGGTCCGA CCTGGGCATC CGAAGGAGGA CGCACGTCCA CT
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTTATCGAT GGTTCTAGAC TCCCTTAGCC ATCCGAGTGG ACGTGCGTCC TCCTTC
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGGACCGCG AGGAGGTGGA GATGCCATGC CGACCCATTG ACGGCGTAGT ACACACT
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGACTAGT TAATACTGGT GCTCGGAAAA CATTCT
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTCTGGCTC CAGCCAAAGC CACCCTAGGG GAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATGGAGTAG CCAGGTGAGA TTGTCTCCAG GAA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGCGGGCC CTGTGACATT GAATAGAGTG AGGGTCCTGT TGGG
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAGGTTTCA CATTTGTAGC TTGCTGTGTC ATTGCGATCT CTACG
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTCCTAA ATAGTTCACT CTATTCAATG TCACACTCGA GCCGG
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTCTGGCTC CAGCCAAAGC CACCCTAGGG GAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATGGAGTAG CCAGGTGAGA TTGTCTCCAG GAA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATTCTAG AGCAAGCAAC AGTTACTGCG ACG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATATCGA TCCGAAGCGT AGAGTCACAC TTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTAACTGTCA AAAGCCAC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATTCTAG AGCAAGCAAC AGTTACTGCG ACG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATATCGA TCCGAAGCGT AGAGTCACAC TTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTAACTGTCA AAAGCCAC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 85:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTCTGTCCT CCATGA
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 87:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 88:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16656 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 89:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Un casete de expresión de proteína
estructural de un ADN de alfavirus que comprende un promotor que
dirige la síntesis de una molécula de ARN en una célula eucariota,
comprendiendo dicha molécula de ARN la secuencia de codificación de
la proteína de la cápsida de un alfavirus, pero no las secuencias de
codificación de las glicoproteínas E1 y E2 del alfavirus.
2. Un casete de expresión de proteína
estructural de un ADN de alfavirus que comprende un promotor que
dirige la síntesis de una molécula de ARN en una célula eucariota,
comprendiendo dicha molécula de ARN las secuencias de codificación
de las glicoproteínas E1 y E2 del alfavirus, pero no una secuencia
de codificación de la proteína de la cápsida de un alfavirus.
3. Un casete de expresión como se reivindica en
la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende además una
cola poli A.
4. Un casete de expresión como se reivindica en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es capaz de dirigir
la expresión de una o más proteínas estructurales del alfavirus
derivadas de un alfavirus seleccionado entre el virus de la
encefalitis equina de Venezuela, el virus Ross River o el virus del
Bosque Semliki.
5. Un casete de expresión como se reivindica en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es capaz de dirigir
la expresión de una o más proteínas estructurales derivadas del
virus Sindbis.
6. Un casete de expresión como se reivindica en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el promotor
es un promotor eucariota inducible.
7. Un casete de expresión como se reivindica en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el promotor
es un promotor eucariota constitutivo.
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