RU2279889C2

RU2279889C2 - ВАКЦИНА ВЕЗИКУЛ НАРУЖНЫХ МЕМБРАН (OMV), СОДЕРЖАЩАЯ БЕЛКИ НАРУЖНОЙ МЕБРАНЫ N.Meningitidis СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ГРУППЫ В

Info

Publication number: RU2279889C2
Application number: RU2002122111/15A
Authority: RU
Inventors: Мари граци ПИЦЦА (IT); Марияграция ПИЦЦА; Рино РАППУОЛИ (IT); Рино РАППУОЛИ; Марци ДЖУЛИАНИ (IT); Марция ДЖУЛИАНИ
Original assignee: Чирон С.Р.Л.
Priority date: 2000-01-17
Filing date: 2001-01-17
Publication date: 2006-07-20
Also published as: EP2281571A2; AU2009200692A1; DK1248647T3; JP2013181036A; AU2009200692B2; US20160030546A1; PT1248647E; EP2289545A2; ES2588917T3; EP1248647B1; DK1897555T3; JP2011116793A; CA2871789A1; CA2397508A1; AU784518B2; CA2871789C; BRPI0107679B8; WO2001052885A1; CY1117957T1; ES2507100T3

Abstract

Изобретение относится к области иммунологии. Сущность его заключается в разработке композиций, включающих в качестве первого активного агента везикулу наружной мембраны N.meningitidis серологической группы В, в качестве второго - иммуногенный компонент лечения, связанный с менингитом или заражением другими видами ниссерий. Технический результат - повышение эффективности иммунотерапии при развитии при поражении различными видами ниссерий. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к вакцинам против Neisseria meningitidis, серологической группы В (NmB).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все цитируемые здесь документы включены в качестве ссылки в их полном виде.

Neisseria meningitidis является неподвижным грамотрицательным диплококковым патогеном человека. Она колонизирует глотку, вызывая менингит, и изредка при отсутствии менингита септицемию. В Соединенных Штатах Америки уровень заражения равен 0,6-1 на 100000 человек в год, и он может быть более высоким во время вспышек эпидемии (см. Lieberman et al. (1996) JAMA 275 (19). 1499-1503; Schuchat et al. (1997) N Engl J Med 337 (14):970-976). В развивающихся странах темпы эндемического заболевания являются гораздо более высокими и во время эпидемий "уровни" заболеваемости могут достигать 500 случаев на 100000 человек в год. Смертность является крайне высокой, 10-20% в Соединенных Штатах и гораздо более высокой в развивающихся странах. После введения конъюгированной вакцины против Haemophilus influenzae, N. meningitidis является главной причиной бактериального менингита для всех возрастов в Соединенных Штатах (Schuchat et al. (1997) supra).

На основании капсулярного полисахарида данного организма были идентифицированы 12 серологических групп N. meningitidis. Менингококковая вакцина, применяемая в настоящее время, является четырехвалентной вакциной, составленной из серологических групп А, С, Y и W135. Однако после успеха вакцинации против Н. influenzae были разработаны конъюгатные вакцины против серологических групп А и С.

Однако серологическая группа В остается проблемой, и она является в настоящее время ответственной за приблизительно 50% случаев общего менингита в Соединенных Штатах, Европе и Южной Африке. Полисахаридный подход не может быть использован, так как капсулярный полисахарид menB является полимером α (2-8)-связанной N-ацетилнейраминовой кислоты, который также присутствует в тканях млекопитающих. Это приводит к устойчивости к этому антигену; в самом деле, если бы ответная реакция индуцировалась, она была бы реакцией против аутоантигена и, следовательно, нежелательной. Во избежание индукции аутоиммунитета и для индукции защитной иммунной реакции этот капсулярный полисахарид был, например, химически модифицирован заменой N-ацетильных групп N-пропионильными группами, с сохранением неизмененной специфической антигенности (Romero & Outschoorn (1994) Clin Microbiol Rev 7(4):559-575).

Эффективная вакцина пузырьков (везикул) наружных мембран (OMV) против серологической группы В была получена Норвежским Национальным Институтом Общественного Здравоохранения [см., например, Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-96]. Хотя эта вакцина является безопасной и предупреждает заболевание NmB, ее эффективность ограничена штаммом, используемым для приготовления этой вакцины. Сообщалось также о других вакцинах на основе препаратов наружных мембран. Целью данного изобретения является расширение действия этих вакцин на другие штаммы.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданно было обнаружено, что дополнительное добавление определенных компонентов к вакцинам OMV значительно расширяет их эффективность.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую (а) препарат наружной мембраны NmB и (b) иммуногенный компонент, выбранный из одного или нескольких из следующих компонентов:

- белок, раскрытый в WO 99/57280, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/36544, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/24578, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/66791, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в работе Tettelin et al. [Science (2000) 287:1809-1815], или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в работе Parkhill et al. [Nature (2000) 404:502-506], или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 97/28273, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 96/29412, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 95/03413, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/31132, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/58683, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/55873,или его иммуногенный фрагмент; и/или

- белок PorA, TbpA, TbpB, PilC, ОрА или Omp85 Neisseria meningitidis.

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/24578, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890 и 892, как описано в WO 99/24578 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих SEQ ID, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих SEQ ID).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/36544, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 и 90, как описано в W099/36544 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих SEQ ID, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих SEQ ID).

Если эта композиция содержит белок, описанный в работе Tettelin et al. (т.е. белок, кодируемый одним из генов, описанных в этой работе), указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из NMB0001-NMB2160 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одного или нескольких из этих 2160 генов, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одним из этих 2160 генов).

Если эта композиция содержит белок, описанный в работе Parkhill et al., указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 2121 кодирующих последовательностей, описанных в этой работе (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих 2121 последовательностей, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих 2121 последовательностей).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/57280, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974, 976, 978, 980, 982, 984, 986, 988, 990, 992, 994, 996, 998, 1000, 1002, 1004, 1006, 1008, 1010, 1012, 1014, 1016, 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090, 1092, 10.94, 1096, 1098, 1100, 1102, 1104, 1106, 1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126, 1128, 1130, 1132, 1134, 1136, 1138, 1140, 1142, 1144, 1146, 1148, 1150, 1152, 1154, 1156, 1158, 1160, 1162, 1164, 1166, 1168, 1170, 1172, 1174, 1176, 1178, 1180, 1182, 1184, 1186, 1188, 1190, 1192, 1194, 1196, 1198, 1200, 1202, 1204, 1206, 1208, 1210, 1212, 1214, 1216, 1218, 1220, 1222, 1224, 1226, 1228, 1230, 1232, 1234, 1236, 1238, 1240, 1242, 1244, 1246, 1248, 1250, 1252, 1254, 1256, 1258, 1260, 1262, 1264, 1266, 1268, 1270, 1272, 1274, 1276, 1278, 1280, 1282, 1284, 1286, 1288, 1290, 1292, 1294, 1296, 1298, 1300, 1302, 1304, 1306, 1308, 1310, 1312, 1314, 1316, 1318, 1320, 1322, 1324, 1326, 1328, 1330, 1332, 1334, 1336, 1338, 1340, 1342, 1344, 1346, 1348, 1350, 1352, 1354, 1356, 1358, 1360, 1362, 1364, 1366, 1368, 1370, 1372, 1374, 1376, 1378, 1380, 1382, 1384, 1386, 1388, 1390, 1392, 1394, 1396, 1398, 1400, 1402, 1404, 1406, 1408, 1410, 1412, 1414, 1416, 1418, 1420, 1422, 1424, 1426, 1428, 1430, 1432, 1434, 1436, 1438, 1440, 1442, 1444, 1446, 1448, 1450, 1452, 1454, 1456, 1458, 1460, 1462, 1464, 1466, 1468, 1470, 1472, 1474, 1476, 1478, 1480, 1482, 1484, I486, 1488, 1490, 1492, 1494, 1496, 1498, 1500, 1502, 1504, 1506, 1508, 1510, 1512, 1514, 1516, 1518, 1520, 1522, 1524, 1526, 1528, 1530, 1532, 1534, 1536, 1538, 1540, 1542, 1544, 1546, 1548, 1550, 1552, 1554, 1556, 1558, 1560, 1562, 1564, 1566, 1568, 1570, 1572, 1574, 1576, 1578, 1580, 1582, 1584, 1586, 1588, 1590, 1592, 1594, 1596, 1598, 1600, 1602, 1604, 1606, 1608, 1610, 1612, 1614, 1616, 1618, 1620, 1622, 1624, 1626, 1628, 1630, 1632, 1634, 1636, 1638, 1640, 1642, 1644, 1646, 1648, 1650, 1652, 1654, 1656, 1658, 1660, 1662, 1664, 1666, 1668, 1670, 1672, 1674, 1676, 1678, 1680, 1682, 1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1706, 1708, 1710, 1712, 1714, 1716, 1718, 1720, 1722, 1724, 1726, 1728, 1730, 1732, 1734, 1736, 1738, 1740, 1742, 1744, 1746, 1748, 1750, 1752, 1754, 1756, 1758, 1760, 1762, 1764, 1766, 1768, 1770, 1772, 1774, 1776, 1778, 1780, 1782, 1784, 1786, 1788, 1790, 1792, 1794, 1796, 1798, 1800, 1802, 1804, 1806, 1808, 1810, 1812, 1814, 1816, 1818, 1820, 1822, 1824, 1826, 1828, 1830, 1832, 1834, 1836, 1838, 1840, 1842, 1844, 1846, 1848, 1850, 1852, 1854, 1856, 1858, I860, 1862, 1864, 1866, 1868, 1870, 1872, 1874, 1876, 1878, 1880, 1882, 1884, 1886, 1888, 1890, 1892, 1894, 1896, 1898, 1900, 1902, 1904, 1906, 1908, 1910, 1912, 1914, 1916, 1918, 1920, 1922, 1924, 1926, 1928, 1930, 1932, 1934, 1936, 1938, 1940, 1942, 1944, 19.46, 1948, 1950, 1952, 1954, 1956, 1958, 1960, 1962, 1964, 1966, 1968, 1970, 1972, 1974, 1976, 1978, 1980, 1982, 1984, 1986, 1988, 1990, 1992, 1994, 1996, 1998, 2000, 2002, 2004, 2006, 2008, 2010, 2012, 2014, 2016, 2018, 2020, 2022, 2024, 2026, 2028, 2030, 2032, 2034, 2036, 2038, 2040, 2042, 2044, 2046, 2048, 2050, 2052, 2054, 2056, 2058, 2060, 2062, 2064, 2066, 2068, 2070, 2072, 2074, 2076, 2078, 2080, 2082, 2084, 2086, 2088, 2090, 2092, 2094, 2096, 2098, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2110, 2112, 2114, 2116, 2118, 2120, 2122, 2124, 2126, 2128, 2130, 2132, 2134, 2136, 2138, 2140, 2142, 2144, 2146, 2148, 2150, 2152, 2154, 2156, 2158, 2160, 2162, 2164, 2166, 2168, 2170, 2172, 2174, 2176, 2178, 2180, 2182, 2184, 2186, 2188, 2190, 2192, 2194, 2196, 2198, 2200, 2202, 2204, 2206, 2208, 2210, 2212, 2214, 2216, 2218, 2220, 2222, 2224, 2226, 2228, 2230, 2232, 2234, 2236, 2238, 2240, 2242, 2244, 2246, 2248, 2250, 2252, 2254, 2256, 2258, 2260, 2262, 2264, 2266, 2268, 2270, 2272, 2274, 2276, 2278, 2280, 2282, 2284, 2286, 2288, 2290, 2292, 2294, 2296, 2298, 2300, 2302, 2304, 2306, 2308, 2310, 2312, 2314, 2316, 2318, 2320, 2322, 2324, 2326, 2328, 2330, 2332, 2334, 2336, 2338, 2340, 2342, 2344, 2346, 2348, 2350, 2352, 2354, 2356, 2358, 2360, 2362, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2374, 2376, 2378, 2380, 2382, 2384, 2386, 2388, 2390, 2392, 2394, 2396, 2398, 2400, 2402, 2404, 2406, 2408, 2410, 2412, 2414, 2416, 2418, 2420, 2422, 2424, 2426, 2428, 2430, 2432, 2434, 2436, 2438, 2440, 2442, 2444, 2446, 2448, 2450, 2452, 2454, 2456, 2458, 2460, 2462, 2464, 2466, 2468, 2470, 2472, 2474, 2476, 2478, 2480, 2482, 2484, 2486, 2488, 2490, 2492, 2494, 2496, 2498, 2500, 2502, 2504, 2506, 2508, 2510, 2512, 2514, 2516, 2518, 2520, 2522, 2524, 2526, 2528, 2530, 2532, 2534, 2536, 2538, 2540, 2542, 2544, 2546, 2548, 2550, 2552, 2554, 2556, 2558, 2560, 2562, 2564, 2566, 2568, 2570, 2572, 2574, 2576, 2578, 2580, 2582, 2584, 2586, 2588, 2590, 2592, 2594, 2596, 2598, 2600, 2602, 2604, 2606, 2608, 2610, 2612, 2614, 2616, 2618, 2620, 2622, 2624, 2626, 2628, 2630, 2632, 2634, 2636, 2638, 2640, 2642, 2644, 2646, 2648, 2650, 2652, 2654, 2656, 2658, 2660, 2662, 2664, 2666, 2668, 2670, 2672, 2674, 2676, 2678, 2680, 2682, 2684, 2686, 2688, 2690, 2692, 2694, 2696, 2698, 2700, 2702, 2704, 2706, 2708, 2710, 2712, 2714, 2716, 2718, 2720, 2722, 2724, 2726, 2728, 2730, 2732, 2734, 2736, 2738, 2740, 2742, 2744, 2746, 2748, 2750, 2752, 2754, 2756, 2758, 2760, 2762, 2764, 2766, 2768, 2770, 2772, 2774, 2776, 2778, 2780, 2782, 2784, 2786, 2788, 2790, 2792, 2794, 2796, 2798, 2800, 2802, 2804, 2806, 2808, 2810, 2812, 2814, 2816, 2818, 2820, 2822, 2824, 2826, 2828, 2830, 2832, 2834, 2836, 2838, 2840, 2842, 2844, 2846, 2848, 2850, 2852, 2854, 2856, 2858, 2860, 2862, 2864, 2866, 2868, 2870, 2872, 2874, 2876, 2878, 2880, 2882, 2884, 2886, 2888, 2890, 2892, 2894, 2896, 2898, 2900, 2902, 2904, 2906, 2908, 2910, 2912, 2914, 2916, 2918, 2920, 2922, 2924, 2926, 2928, 2930, 2932, 2934, 2936, 2938, 2940, 2942, 2944, 2946, 2948, 2950, 2952, 2954, 2956, 2958, 2960, 2962, 2964, 2966, 2968, 2970, 2972, 2974, 2976, 2978, 2980, 2982, 2984, 2986, 2988, 2990, 2992, 2994, 2996, 2998, 3000, 3002, 3004, 3006, 3008, 3010, 3012, 3014, 3016, 3018 и 3020, как описано в WO 99/572.80 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих SEQ ID, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих SEQ ID).

Если эта композиция содержит белок, описанный в W099/28273, указанный белок является предпочтительно белком, представленным на фигуре 4 или фигуре 13 WO 97/28273.

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 96/29412, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-8, описанных в WO 96/29412 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих SEQ ID, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих SEQ ID).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 95/03413, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-23, описанных в WO 95/03413 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих SEQ ID, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих SEQ ID).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/31132, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, описанной в WO 99/31132 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент SEQ ID NO:2, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с SEQ ID NO:2).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/58683, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, описанных в WO 99/58683 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/55873, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, описанных в WO 99/55873 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с SEQ ID.NO:2 или SEQ ID NO:4).

Подробности относительно Ора и PorA могут быть найдены в работе Wiertz et al. [Infect. Iinmun. (1996) 61:298-304]. PilC описан в работе Nassif et al. [PNAS USA (1994) 91:3769-73]. Omp85 описан в работе Manning et al. [Microb. Pathog. (1998) 25:11-21]. TbpA и TbpB описаны в работе Ala'Aldeen & Borriello [Vaccine (1996) 14:49-53], а также в работе Legrain et al. [Protein Expr Purif (1995) 6:570-578].

Предпочтительными белками для компонента (b) являются:

- белок '919', представляемый SEQ ID NO:3069-3074 и 3207-3241 WO 99/57280 (см. также фигуру 23 и пример 15 в нем).

- белок '235', представляемый SEQ ID NO:869-874 и 3149-3178 WO 99/57280 (см. также фигуру 20 и пример 12 в нем).

- белок '519', представляемый SEQ ID NO:3045-3056 и 3185-3206 WO 99/57280 (см. также фигуру 22 и пример 14 в нем).

- белок '225', представляемый SEQ ID NO:793-804 и 3115-3148 WO 99/57280 (см. также фигуру 19 и пример 11 в нем).

- белок 'ORF40', представляемый примером 1 (SEQ ID NO:1-6) WO 99/36544 (см. также фигуру 1 WO 00/66741; см. также WO 99/31132 и WO 99/58683).

- белок '287', представляемый примером 9 W099/57280 (см. SEQ ID NO:1199-1204, 3103-3108 и 3179-3184 в нем).

- белок 'ORF1', представляемый примером 77 (SEQ ID NO:647-654) WO 99/24578 (см. также WO 99/55873 и номер доступа AJ 242535).

- белок 'ORF4', представляемый примером 26 (SEQ ID NO:215-2.26) WO 00/24578 (см. также фигуру 2 WO 00/66741).

- белок 'ORF46', представляемый примером 55 (SEQ ID. NO:457-466) WO 99/24578 (см. также фигуру 12 WO 00/66741).

Компонент (b) этой композиции является предпочтительно белком NmB. Предпочтительно компонент (b) включает в себя белок из штамма NmB, отличающегося от штамма, из которого получен компонент OMV (а), т.е. OMV в компоненте (а) предпочтительно дополняется иммуногенным компонентом (b) из отличающегося штамма NmB.

Один или несколько компонентов (или все компоненты) могут быть адсорбированы на Al(ОН)₃.

Компонент препарата наружной мембраны

Композиции данного изобретения включают в себя препарат наружной мембраны NmB в качестве компонента (а). Предпочтительно он находится в форме пузырьков (везикул) наружных мембран (OMV).

Получение OMV из NmB хорошо известно в данной области. Способы получения подходящих препаратов описаны, например, в работах: Claassen et al. [Vaccine (1996) 14:1001-1008]; Cartwright et al. [Vaccine (1999) 17:2612-2619]; Peeters et al. [Vaccine (1996) 14:1009-1015]; Fu et al. [Biotechnology NY (1995) 12:170-74]; Davies et al. [J.Immunol. Meth. (1990) 134:215-225]; Saunders et al. [Infect. Immun. (1999) 67:113-119]; Draabick et al. [Vaccine (2000) 18:160-172]; Moreno et al. [Infect. Immun. (1985) 47:527-533]; Milagres et al. [Infect. Immun. (1998) 66:959-965]; Rosenqvist et al. [Dev. Biol. Stand. (1998) 92:323-333]; Haneberg et al. [Infect. Iinmun. (1994) 62:4419-4424]; Naess et al. [Infect. Immun. (1998).66:1334-41]; Andersen et al. [Vaccine (1997) 15:1225-34]; Bjune et al. [Lancet (1991) 338:1093-96] ets.

OMV представляют собой предпочтительно дезоксихолатный экстракт из NmB (т.е. полученный из NmB экстракцией дезоксихолатом). Предпочтительным протоколом экстракции является протокол, который описан Fredriksen et al. [Production, characterization and control of MenB-vaccine "Folkehelsa": an outer membrane vesicle vaccine against group В meningococcal disease (1991) NIPH Ann. 14(2):67-80].

Предпочтительным штаммом, из которого следует экстрагировать OMV, является штамм 44/76 (В:15:Р1.1,16:P5.5:L3,7,9) N. meningitidis.

Дополнительные подробности в отношении компонента OMV могут быть найдены, например, в работах Bjune et al. [Lancet (1991) 338(8775):1093-96] или Fredriksen et al. [Characterization of high molecular weight component in MenB-vaccine "Folkehelsa": an outer membrane vesicle vaccine against group В meningococcal disease. Pages 818-824 of Pathobiology and Immunology of Neisseriaceae (eds. Conde-Glez et al.) ISBN 968-6502-13-0].

Компонент OMV может быть адсорбирован на адъюванте гидроксиде алюминия. Предпочтительное отношение белок : адъювант равно 1:67 (масса/масса).

Типичная доза вакцины для человека содержит 25 мкг белка, 2 мкг LPS и 1,67 мг Al(ОН)₃ и может быть инъецирована в объемах 0,5 мл в дельтовидную мышцу.

Компонент OMV (например, полученный экстракцией дезоксихолатом) может быть обработан для удаления определенных компонентов. Например, могут быть удалены пирогены или токсичные компоненты (например, LPS).

Предпочтительно компонент OMV должен сохранять антигенный компонент 80 кДа, описанный Fredriksen et al. [pages 818-824 of Pathobiology and Immunobiology of Neisseriaceae].

Более предпочтительно компонент OMV должен сохранять белок, содержащий одну или несколько следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 [или (i) белок, имеющий идентичность последовательности с SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13 в зависимости от конкретной SEQ ID, степень идентичности последовательности предпочтительно является большей, чем 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более), который включает в себя мутанты и аллельные варианты, или (ii) белок, содержащий иммуногенный фрагмент SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13 фрагмент должен содержать по меньшей мере п последовательных аминокислот из этой последовательности, и, в зависимости от конкретной последовательности, n равно 7 или большему числу (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или большему числу)].

Комбинирование компонентов (а) и (b)

Компоненты (а) и (b) могут комбинироваться простым смешиванием компонента (а) с препаратом наружных мембран (например, смешиванием ORF4 с Норвежскими OMV).

В качестве альтернативы, они могут комбинироваться" манипулированием бактерии таким образом, что она продуцирует (предпочтительно сверхпродуцирует) компонент (а) в ее наружной мембране - препарат наружных мембран из такой рекомбинантной бактерии будет содержать как компонент (а), так и компонент (b).

Подходящие бактерии для манипуляции, таким образом, включают в себя Neisseria meningitidis (любую серологическую группу или штамм), Neisseria lactamica, Neisseria cinerea или любую другую не позволяющую типирования Neisseria. Могут быть также использованы грамотрицательные бактерии, такие как Е. coli, Salmonella, Shigella, Bordetella, Yersinia, Helicobacter и т.д. Способы трансформации хорошо известны в данной области.

Поливалентные вакцины

Необязательно, композиция данного изобретения может также содержать один или несколько из следующих компонентов:

- защитный антиген против серологической группы А Neisseria meningitidis;

- защитный антиген против серологической группы С Neisseria meningitidis;

- защитный антиген против серологической группы У Neisseria meningitidis;

- защитный антиген против серологической группы W Neisseria meningitidis;

- защитный антиген "против Haemophilus influenzae;

- защитный антиген против Pneumococcus;

- защитный антиген против дифтерии;

- защитный антиген против столбняка;

- защитный антиген против коклюша;

- защитный антиген против Helicobacter pylori;

- защитный антиген против полиомиелита; и/или

- защитный антиген против вируса гепатита В.

Предпочтительными примерами этих необязательных компонентов являются:

- полисахаридный антиген против серологической группы А Neisseria meningitidis;

- полисахаридный антиген против серологической группы С Neisseria meningitidis, такой как антиген, описанный Constantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698;

- полисахаридный антиген против серологической группы У Neisseria meningitidis;

- полисахаридный антиген против серологической группы W Neisseria meningitidis;

- полисахаридный антиген против Haemophilus influenzae;

- полисахаридный антиген против Pneumococcus;

- защитный антиген против дифтерии, состоящий из дифтерийного токсоида, например мутанта CRM197 [см., например, Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70].

- защитный антиген против столбняка, состоящий из столбнячного токсоида [см., например, Wassilak & Orenstein, Chapter 4 of Vaccine (eds. Plotkin & Mortimer), 1988].

- защитный антиген против коклюша, содержащий голотоксин коклюша (РТ) и нитевидный гемагглютинин (FHA); необязательно содержащий дополнительно пертактин и/или агглютиногены 2 и 3 [см., например, Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355; Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238].

- защитный антиген против Н. pylori, содержащий один или несколько из CagA (например, WO 93/18150), VacA (например, WO 93/18150), NAP (например, WO 99/53310), НорХ (например, WO 98/04702), HopY (например, WO 98/04702), уреазы.

- защитный антиген против вируса гепатита В, состоящий из поверхностного антигена HBV и/или корового антигена HBV.

Если композиция содержит антиген против дифтерии, она предпочтительно содержит также антигены против столбняка и полиомиелита. Если композиция содержит антиген против столбняка, она предпочтительно содержит также антигены против дифтерии и полиомиелита. Если композиция содержит антиген против полиомиелита, она предпочтительно содержит также антигены против дифтерии и столбняка.

Токсин коклюша является токсичным белком и, если он присутствует в композиции, он предпочтительно является детоксифицированным. Детоксификация может быть химической и/или может проводиться генетическими способами. Предпочтительным детоксифицированным мутантом является двойной мутант 9K/129G [см., например, Rappuoli (1997) Nature Medicine 3:374-376].

Если композиция включает в себя белок, который существует в различных насцентных и зрелой формах, используют предпочтительно зрелую форму этого белка. Например, если включен белок NspA (WO 96/29412; см. также Martin et al. (1997) J. Exp. Med. 185 1173-1183), предпочтительно используют зрелую форму этого белка, лишенную сигнального пептида.

Если композиция включает в себя полисахаридный антиген, этот полисахарид предпочтительно конъюгирован с белком-носителем.

Терапия, профилактика, диагностика

Композиция данного изобретения предпочтительно является вакциной. Вакцины в соответствии с данным изобретением могут быть либо профилактическими (т.е. для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (т.е. для лечения заболевания после инфицирования).

Данное изобретение обеспечивает также композиции данного изобретения для применения в качестве лекарственных средств (предпочтительно вакцин) или диагностических реагентов. Оно обеспечивает также использование композиции в соответствии с данным изобретением в приготовлении: (i) лекарственного средства для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой бактериями Neisseria; (ii) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria; и/или (iii) реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria. Указанные бактерии Neisseria могут быть любым видом или штаммом (таким как Neisseria gonorrhoeae), но предпочтительно они являются N. meningitidis, в частности, серологической группы В (NmB).

Данное изобретение обеспечивает также способ лечения пациента, предусматривающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции данного изобретения. Этот способ предпочтительно является иммунизацией.

Способы

Согласно следующим аспектам, данное изобретение обеспечивает различные способы.

Обеспечен способ получения композиции данного изобретения, предусматривающий стадию экстракции (например, экстракции дезоксихолатом) OMV из N. meningitidis.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

В списке последовательностей представлены следующие последовательности:

SEQ ID NO:	ОПИСАНИЕ
1	N-концевая последовательность белка 80-85 кДа N. meningitidis серологической группы В
2	Полный ген из N. meningitidis серологической группы В
3	Кодируемый белок из SEQ ID NO:2
4	Сигнальная последовательность белка из SEQ ID NO:3
5	Зрелый белок из SEQ ID NO:3
6	Полный ген из N. gonorrhoeae, гомологичный SEQ ID NO:2
7	Кодируемый белок из SEQ ID NO:6
8	Сигнальный пептид белка из SEQ ID NO:7
9	Зрелый белок из SEQ ID NO:7
10	Полный ген из N. meningitidis серологической группы А, гомологичный SEQ ID NO:2
11	Кодируемый белок из SEQ ID NO:10
12	Сигнальный пептид белка из SEQ ID NO:11
13	Зрелый белок из SEQ ID NO:11
14	Белок '919' из штамма 2996 NmB

СПОСОБЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее следует краткое изложение стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для выполнения данного изобретения (например, применение описанных последовательностей для вакцинации или для диагностических целей). Это краткое изложение не является ограничением в отношении данного изобретения, а скорее дает примеры, которые могут быть использованы, но не являются обязательными.

Общая часть

Практика данного изобретения будет использовать, если нет других указаний, общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие способы объясняются в полном виде в литературе, например, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and ii (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); В. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds 1986).

В данной заявке используются стандартные аббревиатуры для нуклеотидов и аминокислот.

Белки, используемые с данным изобретением, могут быть получены различными способами (например, рекомбинантной экспрессией, очисткой из культуры клеток, химическим синтезом и т.д.) и в различных формах (например, нативные белки, слитые белки и т.д.). Предпочтительно их получают по существу в чистом виде (т.е. по существу не содержащими других белков Neisseria или белков клетки-хозяина).

Нуклеиновые кислоты, используемые с данным изобретением, могут быть получены многими способами (например, химическим синтезом, из библиотек геномной ДНК или кДНК, из самого организма и т.д.) и могут быть в разных формах (например, в виде одноцепочечных, двухцепочечных ДНК, в виде векторов, зондов и т.д.). Термин "нуклеиновая кислота" включает в себя ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные скелеты, а также пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.

Определения

Композиция, содержащая X, является "по существу не содержащей" Y, когда по меньшей мере 85% по весу от общего количества X+Y в этой композиции составляет X. Предпочтительно Х составляет по меньшей мере около 90% по весу от общей суммы X+Y в композиции, более предпочтительно по меньшей мере около 95% или даже 99% по весу.

Термин «содержащий» означает «включающий», а также «состоящий», например, композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно из Х или может включать в себя что-либо дополнительно к X, например, X+Y.

Термин «гетерологичный» относится к двум биологическим компонентам, которые не находятся вместе в природе. Этими компонентами могут быть клетки-хозяева, гены или регуляторные районы, такие как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты не обнаруживаются вместе в природе, они могут функционировать вместе, как, например, когда промотор, гетерологичный для гена, функционально связан с этим геном. Другим примером является случай, когда последовательность Neisseria является гетерологичной для мышиной клетки-хозяина. Дополнительными примерами могли бы быть два эпитопа из одного и того же или различных белков, которые были собраны в единый белок в расположении, не обнаруживаемом в природе.

«Точка начала репликации» (ориджин) является полинуклеотидной последовательностью, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Точка начала репликации ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотидов в клетке, способной к репликации под ее собственным контролем. Точка начала репликации может быть необходимой для репликации вектора в конкретной клетке-хозяине. С определенными точками начала репликации экспрессирующий вектор может быть репродуцирован с высоким числом копий в присутствии подходящих белков в клетке. Примерами точек начала репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, которые являются эффективными в дрожжах; и вирусный Т-антиген, эффективный в клетках COS-7.

Идентичность между белками предпочтительно определяют с использованием алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, осуществляемого в программе MPSRCH (Oxford Molecular) с применением поиска аффинных гэпов с параметрами штрафа открытого гэпа=12 и штрафа удлинения гэпа=1. Обычно 50%-ная или более высокая идентичность между двумя белками считается указанием на функциональную эквивалентность.

В применении здесь, «аллельный вариант» молекулы нуклеиновой кислоты или района нуклеиновой кислоты, для которого обеспечена здесь последовательность нуклеиновой кислоты, является молекулой нуклеиновой кислоты или районом нуклеиновой кислоты, которые встречаются по существу в том же самом локусе в геноме другого или второго изолята, и молекулой, которая вследствие природной изменчивости, обусловленной, например, мутацией или рекомбинацией, имеет сходную, но не идентичную последовательность нуклеиновой кислоты. Аллельный вариант кодирующего района обычно кодирует белок, имеющий сходную активность с активностью белка, кодируемого геном, с которым его сравнивают. Аллельный вариант может также содержать изменение в 5'- или 3'-нетранслируемых районах этого гена, например, в регуляторных районах (например, см. патент США US 5753235).

Системы экспрессии

Нуклеотидные последовательности Neisseria могут быть экспрессированы в разнообразных системах экспрессии; например, системах экспрессии, которые используются клетками млекопитающих, бакуло вирусами, растениями, бактериями и дрожжами.

i. Системы млекопитающих

Системы экспрессии млекопитающих известны в данной области. Промотором млекопитающих является любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих и инициировать в направлении хода транскрипции (3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь район инициации транскрипции, который обычно расположен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности, и ТАТА-блок, обычно расположенный на 25-30 пар оснований (п.н.) выше (против хода транскрипции) от сайта инициации транскрипции. Предполагается, что ТАТА-блок определяет начало синтеза РНК РНК-полимеразой II в правильном месте. Промотор млекопитающих содержит также левый промоторный элемент, обычно расположенный на 100-200 п.н. выше ТАТА-блока. Левый промоторный элемент определяет скорость, при которой инициируется транскрипция и может действовать в любой ориентации [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. (1989)].

Гены вирусов млекопитающих часто являются высокоэкспрессируемыми и имеют широкий спектр хозяев; таким образом, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают в себя ранний Промотор SV40, LTR-промотор мышиного вируса опухоли молочной железы, основной поздний промотор аденовируса (Ad MLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, произведенные из невирусных генов, таких как ген мышиного металлотионеина, также обеспечивают применимые промоторные последовательности. Экспрессия может быть либо конститутивной, либо регулируемой (индуцируемой), в зависимости от того, может ли данный промотор индуцироваться глюкокортикоидом в чувствительных к гормону клетках.

Присутствие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с описанными выше промоторными элементами, будет обычно увеличивать уровни транскрипции. Энхансер является регуляторной последовательностью ДНК, которая может стимулировать транскрипцию до 1000-кратного уровня при связывании с гомологичным или гетерологичным промоторами, причем синтез начинается в нормальном стартовом (инициирующем) сайте РНК. Энхансеры являются также активными, когда они помещены против хода транскрипции (выше) или по ходу транскрипции (ниже) от сайта инициации транскрипции либо в нормальной, либо в обратной ориентации или на расстоянии более 1000 нуклеотидов от промотора [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of Cell, 2^nd ed.]. Энхансерные элементы, произведенные из вирусов, могут быть особенно применимыми, так как они обычно имеют широкий спектр хозяев. Примеры включают в себя энхансер раннего гена SV40 [Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761] и энхансер/промоторы, произведенные из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] и из цитомегаловируса человека [Boshart et al. (1989) Cell 41:521]. Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в клетках млекопитающих. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с этой молекулой ДНК, и в этом случае первая аминокислота на N-конце рекомбинантного белка всегда будет метионином, который кодируется инициирующим кодоном ATG. Если желательно, этот N-конец может быть отщеплен от белка инкубацией in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, чужеродные белки могут быть также секретированы из клетки в среду для выращивания посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих. Предпочтительно имеются сайты процессинга, кодируемые между этим лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут быть отщеплены in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией белка из клетки. Аденовирусный лидер, состоящий из трех частей, является примером лидерной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих.

Обычно последовательности терминации и полиаденилирования, узнаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными районами, расположенными 3' (справа) относительно стоп-кодона трансляции и, следовательно, вместе с промоторными элементами, фланкируют кодирующую последовательность. 3'-конец зрелой мРНК образуется сайт-специфическим посттрансляционным расщеплением и полиаденилированием [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukariotic RNA. In Transcription and splicing (ed. B.D. Hames and D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Эти последовательности направляют транскрипцию мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примеры сигналов терминатора транскрипции/полиаденилирования включают в себя сигналы, произведенные из SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Cultured Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. (1989)].

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессионные конструкции. Энхансеры, интроны с функциональными донорным и акцепторным сайгами сплайсинга и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессионную конструкцию, если желательно. Экспрессионные конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, таком как клетки млекопитающих или бактерии. Репликационные системы млекопитающих включают в себя системы, происходящие из вирусов животных, которые требуют транс-действующих факторов для репликации. Например, плазмиды, содержащие репликационные системы паповавирусов, таких как SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] или полиомавирус, реплицируются до исключительно высокой копийности в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительные примеры репликонов млекопитающих включают в себя репликоны, происходящие из бычьего папилломавируса и вируса Эпштейна-Барр. Дополнительно репликон может иметь две системы репликации, что позволяет ему сохраняться, например, в клетках млекопитающих для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных (млекопитающее-бактерии) векторов включают в себя рМТ2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] и pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074].

Используемая процедура трансформации зависит от подлежащего трансформации хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны в данной области и включают в себя опосредованную декстраном трансфекцию, кальций-фосфатную преципитацию, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.

Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, известны в данной области и включают в себя многочисленные иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской Коллекции Типовых культур (АТСС), в том числе, но не только, клетки яичника китайского хомячка (СНО), HeLa-клетки, клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер G2.) и ряд других клеточных линий.

ii. Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, может быть также встроен в подходящий экспрессирующий вектор насекомого и функционально (оперативно) связан с регуляторными элементами в этом векторе. Конструирование векторов использует способы, которые известны в данной области. Обычно компоненты экспрессионной системы включают в себя вектор-переносчик, обычно бактериальную плазмиду, который содержит как фрагмент бакуловирусного генома, так и удобный сайт рестрикции для встраивания гетерологичного гена или гетерологичных генов, которые должны быть экспрессированы; бакуловирус дикого типа с последовательностью, гомологичной бакуловирус-специфическому фрагменту в векторе-переносчике (это позволяет осуществить гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в геном бакуловируса); и подходящие клетки-хозяева насекомого и среды для выращивания.

После встраивания ДНК-последовательности, кодирующей данный белок, в вектор-переносчик, этот вектор и геном вируса дикого типа трансфицируют в клетку-хозяин насекомого, где этому вектору и вирусному геному дают рекомбинировать. Упакованный рекомбинантный вирус экспрессируется и рекомбинантные бляшки идентифицируют и очищают. Материалы и способы для систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными в форме наборе из, inter alia, Invitrogen, San Diego CA (набор "MaxBac"). Эти способы обычно известны специалистам в данной области и в полном виде описаны в Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (далее называемом "Summers and Smith").

Перед встраиванием ДНК-последовательности, кодирующей данный белок, в бакуловирусный геном, описанные выше компоненты, содержащие промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, обычно собирают в промежуточную перемещающую конструкцию (вектор-переносчик). Эта конструкция может содержать единственный ген и функционально связанные регуляторные элементы; множественные гены, каждый со своим собственным набором функционально связанных регуляторных элементов; или множественные гены, регулируемые одним и тем же набором регуляторных элементов. Промежуточные перемещающие конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, таком как бактерия. Репликон будет иметь систему репликации, что позволяет ему сохраняться в подходящем хозяине для клонирования и амплификации.

В настоящее время, наиболее обычно используемым вектором-переносчиком для введения чужеродных генов в AcNPV является рАс373. Многие другие векторы, известные специалистам в данной области, также были сконструированы. Они включают в себя, например, pVL985 (который изменяет инициирующий кодон полиэдрина с ATG на АТТ и который вводит клонирующий сайт BamHI в 32 п.н. по ходу транскрипции (справа) от АТТ; см. Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31.

Эта плазмида обычно содержит также сигнал полиаденилирования полиэдрина (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) и прокариотический ген устойчивости к ампициллину (атр) и точку начала репликации для отбора и размножения в Е.coli.

Бакуловирусные векторы-переносчики обычно содержат промотор бакуловируса. Промотором бакуловируса является любая ДНК-последовательность, способная связывать бакуловирусную РНК-полимеразу и инициировать по ходу транскрипции (5'→3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь район инициации транскрипции, который обычно помещен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности. Этот район инициации транскрипции обычно включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный вектор-переносчик может также иметь второй домен, называемый энхансером, который в случае его присутствия находится обычно дистально от структурного гена. Экспрессия может быть либо регулируемой, либо конститутивной.

Структурные гены, обильно транскрибируемые в поздние периоды цикла вирусной инфекции, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают в себя последовательности, происходящие из гена, кодирующего вирусный белок полиэдрон, Friesen et al., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression," in: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127839 и 155476; и гена, кодирующего белок р10, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть получена из генов для секретируемых белков насекомых или бакуловируса, таких как ген полиэдрина бакуловируса (Carbonell et al., (1988) Gene, 73:409). Альтернативно, поскольку сигналы для посттрансляционных модифицикаций клеток млекопитающих (таких как отщепление сигнального пептида, протеолитическое расщепление и фосфорилирование) узнаются, по-видимому, клетками насекомых, и сигналы, требующиеся для секреции и ядерного накопления, также, по-видимому, являются консервативными между клетками беспозвоночных и клетками позвоночных, то лидеры, происходящие не из насекомых, такие как полученные из генов, кодирующих α-интерферон человека, Maeda et al., (1985), Nature 315:592; гастрин-высвобождающий пептид человека, Lebacq-Verheyden et al., (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 человека. Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404; мышиный IL-3 (Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; и глюкоцереброзидазу человека, Martin et al. (1988) DNA, 7:99, могут быть также использованы для обеспечения секреции в насекомых.

Рекомбинантный полипептид или полипротеин может экспрессироваться внутриклеточно или, если он экспрессируется с правильными регуляторными последовательностями, он может быть секретирован. Хорошая внутриклеточная экспрессия неслитых чужеродных белков обычно требует гетерологичных генов, которые в идеале имеют короткую лидерную последовательность, содержащую подходящие сигналы инициации трансляции, находящиеся впереди стартового (инициирующего) сигнала ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от зрелого белка инкубированием in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, рекомбинантные полипротеины или белки, которые природно не секретируются, могут быть секретированы из клетки насекомого посредством создания химерных ДНК-молекул, которые кодируют слитый (гибридный) белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, который обеспечивает секрецию чужеродного белка в насекомых. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют транслокацией этого белка в эндоплазматический ретикулум.

После встраивания последовательности ДНК и/или гена, кодирующего экспрессионный продукт-предшественник этого белка, клетку-хозяина насекомого котрансформируют гетерологичной ДНК вектора-переносчика и геномной ДНК бакуловируса дикого типа - обычно посредством котрансфекции. Промотор и последовательность терминации транскрипции этой конструкции будет обычно содержать участок 2-5 т.п.н. генома бакуловируса. Способы введения гетерологичной ДНК в желаемый сайт в бакуловирусе известны в данной области (См. Summers and Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; и Luckow and Summers (1989)). Например, инсертирование может производиться в ген, такой как ген полиэдрина, гомологичной рекомбинацией с двойным кроссинговером; инсертирование может производиться также в сайт рестрикционного фермента (рестриктазы), введенный генной инженерией в желаемый ген бакуловируса. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. Эта ДНК-последовательность при клонировании вместо гена полиэдрина в экспрессирующий вектор фланкирована как со стороны 5' (слева), так и 3' (справа) полиэдрин-специфическими последовательностями и расположена ниже (по ходу транскрипции) от промотора полиэдрина.

Затем новообразованный бакуловирусный экспрессирующий вектор упаковывают в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит с низкой вероятностью (между около 1% и около 5%); таким образом, большая часть вируса, продуцируемого после котрансфекции, все еще является вирусом дикого типа. Таким образом, необходим способ для идентификации рекомбинантных вирусов. Преимуществом этой экспрессионной системы является визуальный скрининг, позволяющий отличать рекомбинантные вирусы. Белок полиэдрин, который продуцируется нативным вирусом, продуцируется при очень высоких уровнях в ядрах инфицированных клеток в поздние периоды после вирусной инфекции. Накопленный белок полиэдрин образует тела включения, которые также содержат погруженные в них частицы. Эти тела включения размером до 15 мкм являются высокопреломляющими свет, что придает им яркий блестящий вид, который легко визуализируется под световым микроскопом. Клетки, инфицированные рекомбинантными вирусами, не имеют тел включения. Для отличения рекомбинантного вируса от вируса дикого типа супернатант после трансфекции наносят в виде пятен на монослой клеток насекомых способами, известными специалистам в данной области. А именно, бляшки подвергают скринингу под световым микроскопом на присутствие (являющееся признаком вируса дикого типа) или отсутствие (являющееся признаком рекомбинантного вируса) тел включения. "Current Protocols in Microbiology" Vol.2 (Ausubel et al. eds) at 16.8 (Suppl. 10, 1990); Summers and Smith, supra; Miller et al. (1989).

Рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы были разработаны для инфицирования некоторых клеток насекомых. Например, рекомбинантные бакуловирусы были разработаны, inter alia, для: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; и см. в общем, Fraser, et al., (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Клетки и среды для культур клеток являются коммерчески доступными как для прямой, так и для слитой экспрессии гетерологичных полипептидов в бакуловирусной системе экспрессии; технология культуры клеток в общем известна специалистам с квалификацией в данной области. См., например, Summers and Smith, supra.

Затем модифицированные клетки насекомых могут выращиваться в подходящей питательной среде, которая позволяет стабильное поддержание плазмиды (плазмид), присутствующих в модифицированном насекомом-хозяине. Если ген продукта экспрессии находится под индуцируемым контролем, хозяин может выращиваться до высокой плотности и затем экспрессию индуцируют. Альтернативно, если экспрессия является конститутивной, продукт будет непрерывно экспрессироваться в среду и питательная среда должна постоянно циркулировать с удалением представляющего интерес продукта и пополнением количества истощаемых питательных веществ. Продукт может быть очищен такими способами, как хроматография, например, ВЭЖХ, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и т.д.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция растворителями или т.п. В случае необходимости продукт может быть дополнительно очищен, если требуется, с тем чтобы удалить по существу любые белки насекомого, которые также секретируются в среду или происходят из-за лизиса клеток насекомых, с тем чтобы обеспечить продукт, который по существу не содержит по меньшей мере клеточных остатков (дебриса) хозяина, например белков, липидов и полисахаридов.

Для получения экспрессии белка рекомбинантные клетки-хозяева, полученные из трансформантов, инкубируют в условиях, которые позволяют экспрессию кодирующей рекомбинантный белок последовательности. Эти условия будут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако эти условия могут быть легко определены специалистами с обычной квалификацией в данной области на основе того, что известно в данной области.

iii. Растительные системы

Существует много генетических экспрессионных систем с использованием культуры клеток растений и целого растения, известных в данной области. Примеры генетических экспрессионных систем с использованием клеток растений включают в себя системы, описанные в патентах, таких как: патент США US 5693506; патент США 5659122 и патент США US 5608143. Дополнительные примеры генетической экспрессии в культуре клеток растений были описаны в работе Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Описания сигнальных пептидов белков растений могут быть найдены, кроме ссылок, описанных выше, в работе Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al., Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al., Gene 55:353-356 (1987); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Описание регуляции экспрессии генов растений фитогормоном, гибберелловой кислотой и секретируемыми ферментами, индуцируемыми гибберелловой кислотой, можно найти в работе R.L. Jones and J. MacMillin, Gibberellins: in: Advanced Plant Physiology, Malcolm B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp.21-52. Ссылки, которые описывают другие метаболически регулируемые гены: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel and Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1337-1339 (1987).

Обычно с использованием способов, известных в данной области, желаемую полинуклеотидную последовательность встраивают в экспрессионную кассету, содержащую генетические регуляторные элементы, сконструированные для функционирования в растениях. Экспрессионную кассету вставляют в желаемый экспрессирующий вектор с вспомогательными последовательностями против хода транскрипции и по ходу транскрипций от этой экспрессионной кассеты, пригодными для экспрессии в растении-хозяине. Эти вспомогательные последовательности имеют плазмидное или вирусное происхождение и обеспечивают необходимые характеристики вектору для создания возможности этим векторам перемещать ДНК из исходного клонирующего хозяина, такого как бактерии, в желательное растение-хозяина. Основная конструкция бактериального/растительного вектора будет предпочтительно обеспечивать прокариотическую точку начала репликации широкого круга хозяев; прокариотический селектируемый маркер и для трансформаций с использованием Agrobacterium Т-ДНК-последовательности для опосредованного Agrobacterium переноса в хромосомы растений. Когда гетерологичный ген не поддается легко детектированию, эта конструкция будет предпочтительно иметь также ген селектируемого маркера, пригодный для определения, было ли растение трансформировано. Общий обзор подходящих маркеров, например, для членов семейства злаковых, можно найти в работе Wilmink and Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11(2):165-185.

Рекомендуются также последовательности, подходящие для интеграции гетерологичной последовательности в геном растений. Они могут содержать последовательности транспозонов и т.п. для гомологичной рекомбинации, а также Ti-последовательности, которые делают возможном случайное инсертирование гетерологичной экспрессионной кассеты в геном растения. Подходящие прокариотические селектируемые маркеры включают в себя гены устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин или тетрациклин. Другие ДНК-последовательности, кодирующие дополнительные функции, как это известно в данной области, могут также присутствовать в таком векторе.

Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть включены в экспрессионную кассету для экспрессии представляющего интерес белка (представляющих интерес белков). Обычно это будет только одна экспрессионная кассета, хотя возможными являются две или более кассет. Рекомбинантная экспрессионная кассета будет содержать кроме последовательности, кодирующей гетерологичный белок, следующие элементы: промоторный район, 5'-нетранслируемые последовательности растения, инициирующий кодон, зависящий от того, снабжен ли структурный ген этим районом или не снабжен, и последовательность терминации транскрипции и трансляции. Уникальные сайты рестрикционных ферментов на 5'- и 3'-концах этой кассеты делают возможным легкое инсертирование в предсуществующий вектор.

Гетерологичная кодирующая последовательность может быть любым белком, относящимся к данному изобретению. Последовательность, кодирующая представляющий интерес белок, будет кодировать сигнальный пептид, который делает возможными процессинг и транслокацию данного белка, как целесообразно, и обычно не будет содержать последовательности, которая может привести к связыванию желаемого белка данного изобретения с мембраной. Поскольку преимущественно район инициации транскрипции будет функционировать для гена, который экспрессируется и транслоцируется во время прорастания, с использованием сигнального пептида, который обеспечивает транслокацию, можно также обеспечить транслокацию представляющего интерес белка. Таким образом, представляющий интерес белок (белки) будут транслоцироваться из клеток, в которых они экспрессируются, и могут быть эффективно собраны. Обычно секреция в семенах происходит через алейроновый слой и скутелярный эпителий в эндосперм семени. Хотя и не является обязательным, чтобы этот белок секретировался из клеток, в которых данный белок продуцируется, это облегчает выделение и очистку рекомбинантного белка.

Поскольку окончательная экспрессия желаемого генного продукта будет происходить в эукариотической клетке, желательно определить, содержит ли какая-либо часть клонированного гена последовательности, которые будут процессироваться в виде интронов аппаратом сплайсосом хозяина. Если это так, может быть проведен сайт-направленный мутагенез "интронного" района для предотвращения потери части генетической матрицы в виде ложного интронного кода, см. Reed and Maniatis, Cell 41:95-105, 1985.

Вектор может быть микроинъецирован непосредственно в растительные клетки с использованием микропипеток для механического переноса рекомбинантной ДНК. См. Crossway, Mol. Gen. Genet, 202:179-185, 1985. Генетический материал может быть также перенесен в растительную клетку с использованием полиэтиленгликоля, см. Krens, et al., Nature, 296, 72-74, 1982. Другим способом введения сегментов нуклеиновых кислот является высокоскоростное баллистическое проникновение малых частиц с нуклеиновой кислотой либо в матриксе, либо на поверхности небольших гранул или частиц, см. Klein, et al., Nature, 327, 70-73, 1987 и Knudsen and Muller, 1991, Planta, 185:330-336, описывающие бомбардировку частицами эндосперма ячменя для создания трансгенного ячменя. Еще одним способом введения могло бы быть слияние протопластов с другими компонентами либо миниклетками, клетками, лизосомами либо другими способными к слиянию тельцами, имеющими липиды на поверхности, см. Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863, 1982.

Вектор может быть также введен в растительные клетки электропорацией (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985). В этом способе протопласты растений электропорируют в присутствии плазмид, содержащих генную конструкцию. Электрические импульсы поля с высокой напряженностью делают биомембраны обратимо проницаемыми, что позволяет вводить эти плазмиды. Электропорированные растительные протопласты восстанавливают клеточную стенку, делятся и образуют растительный каллус.

Все растения, из которых протопласты могут быть выделены и культивированы для получения целых регенерированных растений, могут быть трансформированы согласно данному изобретению таким образом, что образуются целые растения, которые содержат перенесенный ген. Известно, что практически все растения могут быть регенерированы из культивируемых клеток или тканей, в том числе, но не только, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых и овощных культур. Некоторые подходящие растения включают в себя, например, виды из родов Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum и Datura.

Способы регенерации варьируются от вида к виду растений, но обычно сначала обеспечивают суспензию трансформированных протопластов, содержащих копии гетерологичного гена. Образуется каллусная ткань и проростки могут быть индуцированы из каллуса и затем они укореняются. Альтернативно из суспензии протопластов может быть индуцировано образование зародышей. Эти зародыши прорастают как природные зародыши с образованием растений. Культуральные среды обычно будут содержать различные аминокислоты и гормоны, такие как ауксин и цитокинины. Предпочтительно также добавление к среде глутаминовой кислоты и пролина, особенно для таких видов, как кукуруза и люцерна. Проростки и корни обычно развиваются одновременно. Эффективная регенерация будет зависеть от среды, от генотипа и от истории культуры. Если эти три переменные контролируются, то регенерация будет полностью воспроизводимой и повторяемой.

В некоторых системах культур клеток растений желаемый белок данного изобретения может экскретироваться или, альтернативно, этот белок может быть экстрагирован из целого растения. Если желаемый белок данного изобретения секретируется в среду, он может быть собран. Альтернативно, зародыши и не содержащие зародышей половинки семян или другие растительные ткани могут быть механически разрушены для высвобождения всего секретируемого белка между клетками и тканями. Эта смесь может быть суспендирована в буферном растворе для извлечения растворимых белков. Затем используют общепринятые способы выделения и очистки для очистки рекомбинантного белка. Параметры времени, температуры, рН, кислорода и количеств корректируют посредством рутинных способов по оптимизации экспрессии и выделения гетерологичного белка.

iv. Бактериальные системы

Способы бактериальной экспрессии известны в данной области. Бактериальным промотором является любая последовательность ДНК, способная связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать в направлении хода транскрипции (3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь район инициации транскрипции, который обычно расположен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности. Этот район инициации транскрипции обычно включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бактериальный промотор может также иметь второй домен, называемый оператором, который может перекрываться с соседним сайтом связывания РНК-полимеразы, с которого начинается синтез РНК. Оператор делает возможной негативно регулируемую (индуцируемую) транскрипцию, так как белок-репрессор гена может связывать оператор и тем самым ингибировать транскрипцию конкретного гена. Конститутивная экспрессия может происходить в отсутствие негативных регуляторных элементов, таких как оператор. Кроме того, позитивная регуляция может быть достигнута посредством последовательности, связывающей белок-активатор гена, который, если он присутствует, находится обычно проксимально (5') относительно связывающей РНК-полимеразу последовательности. Примером белка-активатора гена является катаболический активаторный белок (CAP), который споособствует инициации транскрипции оперона lac в Escherichia coli (E.coli) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. Таким образом, регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, посредством этого либо усиливающей, либо снижающей транскрипцию.

Последовательности, кодирующие ферменты метаболических путей, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают в себя промоторные последовательности, полученные из ферментов, метаболизирующих сахара, такие как галактоза, лактоза (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056] и мальтоза. Дополнительные примеры включают в себя промоторные последовательности, полученные из биосинтетических ферментов, такие как триптофан (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; US patent 4738921; ЕР-А-0036776 и ЕР-А-0121775]. Промоторная система g-ластамазы (Na) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (ed. I. Grosser)], промоторная система бактериофага лямбда PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] и промоторная система Т5 [патент США US 4689406] также обеспечивают применимые промоторные последовательности.

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве бактериальных промоторов. Например, последовательности активации транскрипции одного бактериального промотора или промотора бактериофага могут быть соединены с последовательностями оперона другого бактериального промотора или промотора бактериофага с образованием синтетического гибридного промотора [патент США 4551433]. Например, промотор tac является гибридным trp-lac-промотором, состоящим как из промотора trp, так и последовательностей оперона lac, который регулируется репрессором lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Кроме того, бактериальный промотор может включать в себя природно встречающиеся промоторы небактериального происхождения, которые имеют аффиность для связывания бактериальной РНК-полимеразы и инициации транскрипции. Природно встречающийся промотор небактериального происхождения может быть также связан с совместимой РНК-полимеразой для продуцирования высоких уровней экспрессии некоторых генов в прокариотах. Система РНК-полимераза бактериофага Т7/промотор является примером сопряженной промоторной системы [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Кроме того, гибридный промотор может быть также составлен из промотора бактериофага и операторного района Е.coli (ЕРО-А-0267851).

Кроме функционирования промоторной последовательности эффективный сайт связывания рибосом также применим для экспрессии чужеродных генов в прокариотах. В Е.coli сайт связывания рибосом называют последовательностью Шайна-Далгарно (SD), и он включает в себя инициирующий кодон (ATG) и последовательность с длиной 3-9 нуклеотидов, расположенной на 3-11 нуклеотидов слева (против хода транскрипции) от инициирующего кодона [Shine et al. (1975) Nature 254:34]. Считается, что SD-последовательность стимулирует связывание мРНК с рибосомой посредством спаривания оснований между SD-последовательностыо и 3'-концом рРНК 16S Е. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F.Goldberger)]. В отношении экспрессии эукариотических генов и прокариотических генов со слабым сайтом связывания рибосом см. Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с ДНК-молекулой, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце всегда будет метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от белка инкубацией in vitro с цианогенбромидом или инкубацией in vivo или in vitro с бактериальной метионин-N-концевой-пептидазой (ЕРО-А-0219237).

Слитые белки обеспечивают альтернативу прямой экспрессии. Обычно ДНК-последовательность, кодирующую N-концевую часть эндогенного бактериального белка или другой стабильный белок, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. При экспрессии эта конструкция будет обеспечивать слияние двух аминокислотных последовательностей. Например, ген клетки бактериофага лямбда может быть связан на 5'-конце чужеродного гена и экспрессироваться в бактериях. Полученный слитый белок предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (фактора Ха) для отщепления белка бактериофага от чужеродного гена [Nagai et al. (1984) Nature 309:810]. Слитые (гибридные) белки могут быть также изготовлены с последовательностями из генов lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60:197], trpE [Alien et al. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11] и Chey [EP-A-0324647]. Последовательность ДНК в месте соединения двух аминокислотных последовательностей может кодировать или может не кодировать сайт расщепления. Другим примером является слитый белок убиквитина. Такой слитый белок готовят с районом убиквитина, который предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (например, специфической для убиквитина процессирующей протеазы) для отщепления убиквитина от чужеродного белка. С использованием этого способа нативный чужеродный белок может быть выделен [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7:698].

Альтернативно, чужеродные белки могут также секретироваться из клетки посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента сигнальной пептидной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка в бактериях [патент США US 4336336]. Фрагмент сигнальной последовательности обычно кодирует пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией этого белка из клетки. Этот белок секретируется либо в среду для выращивания (в случае грамположительных бактерий), либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и наружной мембранами клетки (в случае грамотрицательных бактерий). Предпочтительно имеются сайты процессинга, которые могут расщепляться in vivo или in vitro, кодируемые между фрагментом сигнальной последовательности и чужеродным геном.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов секретируемых бактериальных белков, таких как ген белка наружной мембраны Е.coli (ompA) [Masui et al. (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] и сигнальной последовательности щелочной фосфатазы Е.coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212]. В качестве дополнительного примера, сигнальная последовательность гена альфа-амилазы из различных штаммов Bacillus может быть использована для секреции гетерологичных белков из В. subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0244042].

Обычно последовательности терминации транскрипции, узнаваемые бактериями, являются регуляторными районами, расположенными в положении 3' относительно стоп-кодона трансляции, и таким образом, они вместе с промотором фланкируют кодирующую последовательность. Эти последовательности направляют транскрипцию мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Последовательности терминации транскрипции часто включают в себя ДНК-последовательности из приблизительно 50 нуклеотидов, способные к образованию структур типа «стебель-петля», которые способствуют терминации транскрипции. Примеры включают в себя последовательности терминации транскрипции, полученные из генов с сильными промоторами, такие как ген trp в Е.coli, a также другие биосинтетические гены.

Обычно описанные выше компоненты, включающие в себя промотор, сигнальную последовательность (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессионные конструкции. Экспрессионные конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, например, в бактерии. Репликон может иметь систему репликации, которая позволяет ему сохраняться в прокариотическом хозяине либо для экспрессии, либо для клонирования и амплификации. Кроме того, репликон может быть плазмидой либо с высокой, либо с низкой копийностью. Плазмида с высоким числом копий будет обычно иметь число копий в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 200 и обычно приблизительно 10 - приблизительно 150. Хозяин, содержащий плазмиду высокой копийности, будет содержать по меньшей мере 10 и более предпочтительно по меньшей мере 20 плазмид. Может быть выбран вектор с высоким или низким числом копий в зависимости от действия этого вектора и чужеродного белка на хозяина.

Альтернативно экспрессионные конструкции могут быть интегрированы в бактериальный геном интегрирующим вектором. Интегрирующие векторы обычно содержат по меньшей мере одну последовательность, гомологичную бактериальной хромосоме, что позволяет этому вектору интегрироваться. Интеграции, по-видимому, происходят вследствие рекомбинаций между гомологичной ДНК в векторе и бактериальной хромосоме. Например, интегрирующие векторы, сконструированные с ДНК из различных штаммов Bacillus, интегрируются в хромосому Bacillus (ЕР-А-0127328). Интегрирующие векторы могут также состоять из последовательностей бактериофага или транспозонов.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессионные конструкции могут содержать селектируемые маркеры для возможности отбора бактериальных штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут экспрессироваться в бактериальном хозяине и могут включать в себя гены, которые делают бактерии устойчивыми к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин (неомицин) и тетрациклин [Davies et al. (1978) Ann. Rev. Microbiol. 32:469]. Селектируемые маркеры могут также включать в себя биосинтетические гены, такие как гены, участвующие в путях биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.

Альтернативно некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в трансформирующие векторы. Трансформирующие векторы обычно содержат селектируемый маркер, который либо сохраняется в репликоне, либо развивается в интегрирующий вектор, как описано выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы, либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы были разработаны для трансформации многих бактерий. Например, экспрессирующие векторы были разработаны, inter alia, для следующих бактерий: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 и ЕР-А-0063953; WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP-A-0036776, EP-A-0136829 и EP-A-0136907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Micribiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [патент США US 474556056].

Способы введения экзогенной ДНК "в бактериальные хозяева хорошо известны в данной области и обычно включают в себя трансформацию бактерий, обработанных либо CaCl₂, либо другими агентами, такими как двухвалентные катионы и ДМСО. ДНК может быть также введена в бактериальные клетки электропорацией. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от бактериальных видов, которые должны быть трансформированы. См., например, [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 and EP-A-0063953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds: H.W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus].

v. Экспрессия в дрожжах

Экспрессионные системы дрожжей также известны специалисту с обычной квалификацией в данной области. Промотором дрожжей является любая последовательность ДНК, способная связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать в направлении хода транскрипции (3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь район инициации транскрипции, который обычно расположен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности. Этот район инициации транскрипции обычно включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы ("ТАТА-блок") и сайт инициации транскрипции. Дрожжевой промотор может также иметь второй домен, называемый правой (3')-активаторной последовательностью (UAS), которая, если она присутствует, обычно расположена дистально относительно структурного гена. UAS делает возможной регулируемую (индуцибельную) экспрессию. Конститутивная экспрессия происходит в отсутствие UAS. Регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, вследствие этого либо усиливающей, либо понижающей транскрипцию.

Дрожжи являются ферментирующимся организмом с активным метаболическим путем, поэтому последовательности, кодирующие ферменты в этом метаболическом пути, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают в себя алкогольдегидрогеназу (ADH) (ЕР-А-0284044), енолазу, глюкокиназу, глюкозо-6-фосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAP или GAPDH), гексокиназу, фосфофруктокиназу, 3-фосфоглицератмутазу и пируваткиназу (РуК) (ЕРО-А-0329203). Ген РНO5 дрожжей, кодирующий кислую фосфатаэу, также обеспечивает применимые промоторные последовательности [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1].

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве дрожжевых промоторов. Например, последовательности UAS одного дрожжевого промотора могут быть соединены с районом активации транскрипции другого дрожжевого промотора с образованием синтетического гибридного промотора. Примеры таких гибридных промоторов включают в себя регуляторную последовательность ADH, связанную с районом активации транскрипции GAP (патенты США US 4876197 и 4880734). Другие примеры гибридных промоторов включают в себя промоторы, которые состоят из регуляторных последовательностей генов ADH2, GAL4, GAL10 или РНO5, объединенных с районом активации транскрипции гена гликолитического фермента, такого как GAP или РуК (ЕР-А-0164556). Кроме того, дрожжевой промотор может включать в себя природно встречающиеся промоторы недрожжевого происхождения, которые способны связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Примеры таких промоторов включают в себя, inter alia, [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 196:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," in Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis and "A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в дрожжах. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с ДНК-молекулой, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце рекомбинантного белка всегда будет метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от белка инкубацией in vitro с цианогенбромидом.

Слитые белки обеспечивают альтернативу дрожжевым экспрессионным системам, так же как в случае экспрессионных систем млекопитающих, бакуловирусных и бактериальных систем. Обычно ДНК-последовательность, кодирующую N-концевую часть эндогенного дрожжевого белка или другой стабильный белок, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. При экспрессии эта конструкция будет обеспечивать слияние двух аминокислотных последовательностей. Например, ген супероксиддисмутазы (SOD) дрожжей или человека может быть связан на 5'-конце чужеродного гена и экспрессироваться в дрожжах. Последовательность ДНК в месте соединения двух аминокислотных последовательностей может кодировать или может не кодировать сайт расщепления. См., например, ЕР-А-0196056. Другим примером является слитый белок убиквитина. Такой слитый белок получают с районом убиквитина, который предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (например, специфической для убиквитина процессирующей протеазы) для отщепления убиквитина от чужеродного белка. Таким образом, с использованием этого способа нативный чужеродный белок может быть выделен (например, WO 88/024066).

Альтернативно, чужеродные белки могут также секретироваться из клетки в среду для выращивания посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, который обеспечивает секрецию чужеродного белка в дрожжах. Предпочтительно имеются сайты процессинга между лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут расщепляться in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией этого белка из клетки.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов для секретируемых дрожжевых белков, таких как ген инвертазы дрожжей. (Европейский патент ЕР-А-0012873; патент Японии JPO 62096086) и ген А-фактора. (патент США US 4588684). Альтернативно, существует лидеры недрожжевого происхождения, такие как лидер интерферона, которые также обеспечивают секрецию в дрожжах (ЕР-А-0060057).

Предпочтительным классом секретирующих лидеров являются лидерные последовательности, которые используют фрагмент гена альфа-фактора дрожжей, который содержит как «пре»-сигнальную последовательность, так и «про»-район. Типы фрагментов альфа-фактора, которые могут быть использованы, включают в себя полноразмерный пре-про-лидер альфа-фактора (приблизительно 83 аминокислотных остатка), а также укороченные лидеры альфа-фактора (обычно приблизительно 25 - приблизительно 50 аминокислотных остатков) (патенты США US 4546083 и 4870008; ЕР-А-0324274). Дополнительные лидеры, использующие фрагмент лидера альфа-фактора, который обеспечивает секрецию, включают в себя гибридные лидеры альфа-фактора, полученные с пре-последовательностыо первых дрожжей, но с про-районом из альфа-фактора других дрожжей (например, см. WO 89/02463).

Обычно последовательности терминации транскрипции, узнаваемые дрожжами, являются регуляторными районами, расположенными со стороны 3' относительно стоп-кодона трансляции, и таким образом, они вместе с промотором фланкируют кодирующую последовательность. Эти последовательности направляют транскрипцию мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примерами последовательности терминации транскрипции и других узнаваемых дрожжами последовательностей терминации транскрипции являются последовательности, кодирующие гликолитические ферменты.

Обычно описанные выше компоненты, включающие в себя промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессионные конструкции. Экспрессионные конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, например в дрожжах или бактерии. Репликон может иметь две системы репликации, что следовательно, позволяет ему сохраняться, например, в дрожжах для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов дрожжи-бактерии включают в себя YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17-24], pCl/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646] и YRpl7 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Кроме того, репликон может быть плазмидой либо с высокой, либо с низкой копийностыо. Плазмида с высоким числом копий будет обычно иметь число копий в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 200 и обычно приблизительно 10 - приблизительно 150. Хозяин, содержащий плазмиду высокой копийности, будет содержать по меньшей мере 10 и более предпочтительно по меньшей мере 20 плазмид. Может быть выбран вектор с высоким или низким числом копий в зависимости от действия этого вектора и чужеродного белка на хозяина. См., например. Brake et al., supra.

Альтернативно, экспрессионные конструкции могут быть интегрированы в дрожжевой геном интегрирующим вектором. Интегрирующие векторы обычно содержат по меньшей мере одну последовательность, гомологичную дрожжевой хромосоме, что позволяет этому вектору интегрироваться, и предпочтительно содержат две гомологичные последовательности, фланкирующие эту экспрессионную конструкцию. Интеграции, по-видимому, происходят вследствие рекомбинаций между гомологичной ДНК в векторе и дрожжевой хромосоме [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Интегрирующий вектор может быть направлен на специфический локус в дрожжах посредством выбора подходящей гомологичной последовательности для включения в вектор. См. Orr-Weaver et al., supra. Могут интегрироваться одна или несколько экспрессионных конструкций, возможно, влияя на уровни продуцируемого рекомбинантного белка [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750]. Хромосомные последовательности, включенные в вектор, могут встречаться либо в виде единственного сегмента в этом векторе, что приводит к интеграции всего вектора, либо в виде двух сегментов, гомологичных смежным сегментам в хромосоме и фланкирующих экспрессионную конструкцию в этом векторе, что может приводить к стабильной интеграции только этой экспрессионной конструкции.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессионные конструкции могут содержать селектируемые маркеры для возможности отбора дрожжевых штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут включать в себя биосинтетические гены, которые могут экспрессироваться в дрожжевых клетках-хозяевах, такие как ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, и ALG7, и ген устойчивости G418, которые придают дрожжевым клеткам устойчивость к туникамицину и G418 соответственно. Кроме того, подходящий селектируемый маркер может также обеспечивать дрожжи способностью расти в присутствии токсичных соединений, таких как металлы. Например, присутствие CUP1 позволяет дрожжам расти в присутствии ионов меди [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51:351].

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в трансформирующие векторы. Трансформирующие векторы обычно содержат селектируемый маркер, который либо сохраняется в репликоне, либо развивается в интегрирующий вектор, как описано выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы, либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы, были разработаны для трансформации многих дрожжей. Например, экспрессирующие векторы были разработаны, inter alia, для следующих дрожжей: [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze, et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis (Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; US Patent Nos. 4837148 and 4929555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983) A Bacteriol. 153-163], Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse (1981) Nature 500:706], and Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin, el al. (1985) Curr. Genet. 10-49].

Способы введения экзогенной ДНК в дрожжевые хозяева хорошо известны в данной области и обычно включают в себя либо трансформацию сферопластов, либо трансформацию интактных дрожжевых клеток, обработанных катионами щелочных металлов. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от видов дрожжей, которые должны быть трансформированы. См., например, [Kurtz et a2. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J. Bacleriol. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology.8:135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; US Patent Nos. 4837148 и 4929555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163 Saccharomyces]; [Beach and Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow el al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia].

Антитела

В применении здесь, термин «антитела» относится к полипептиду или группе полипептидов, состоящей "из по меньшей мере одного антигенсвязывающего центра антитела (антидетерминанты). «Антигенсвязывающий центр» является трехмерным связывающим пространством с внутренней конфигурацией поверхности и распределением зарядов, комплементарными признакам эпитопа антигена, что обеспечивает связывание антитела с антигеном. «Антитело» обозначает, например, антитела позвоночных, гибридные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, измененные антитела, неполные (моновалентные) антитела, Fab-белки и антитела с единственным доменом.

Антитела против белков данного изобретения применимы для аффинной хроматографии, иммуноанализов и отличения/идентификации белков Neisseria.

Антитела к белкам данного изобретения, как поликлональные, так и моноклональные, могут быть получены общепринятыми способами. В общем виде, белок сначала используют для иммунизации подходящего животного, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики и козы являются предпочтительными для получения поликлональных сывороток вследствие объема получаемой сыворотки и доступности меченых анти-кроличьих и анти-козьих антител. Иммунизацию обычно выполняют смешиванием или эмульгированием белка в солевом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фрейнда, и инъекцией этой смеси или эмульсии парентерально (обычно подкожно или внутримышечно). Обычно достаточной является доза 50-200 мкг на инъекцию. Иммунизацию обычно повторяют спустя 2-6 недель с одной или несколькими инъекциями данного белка в солевом растворе, предпочтительно с использованием неполного адъюванта Фрейнда. Альтернативно можно генерировать антитела иммунизацией in vitro с использованием способов, известных в данной области, которые считаются для целей данного изобретения эквивалентными иммунизации in vivo. Поликлональные антисыворотки получают путем отбора крови от иммунизированных животных в стеклянный или пластиковый контейнер с инкубированием крови при 25°С в течение одного часа с последующей инкубацией при 4°С в течение 2-18 часов. Сыворотку извлекают центрифугированием (например, 1000 g в течение 10 минут). Из кроликов можно получать 20-50 мл крови за один отбор.

Моноклональные антитела получают с использованием стандартного способа Kohler & Millstein [Nature (1975) 256:495-96] или его модификации. Обычно мышь или кролика иммунизируют, как описано выше. Однако предпочтительнее отбирают кровь от животного для экстракции сыворотки, а удаляют селезенку (и в случае необходимости крупные лимфатические узлы) и разрушают на отдельные клетки. Если желательно, клетки селезенки могут быть подвергнуты скринингу (после удаления неспецифически прилипших клеток) нанесением суспензии клеток на чашку или лунку, покрытую белковым антигеном. В-клетки, экспрессирующие мембраносвязанный иммуно глобулин, специфический для антигена, связываются с этой чашкой и не вымываются с остальной суспензией. Затем полученные В-клетки или все клетки разрушенной селезенки индуцируют для слияния с миеломными клетками с образованием гибридом и культивируют в селективной среде (например, в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин, тимидин, «HAT»). Полученные гибридомы высевают по способу лимитирующего разведения и анализируют на продуцирование антител, которые специфически связываются с иммунизирующим антигеном (и которые не связываются с посторонними антигенами). Затем отобранные mAb-секретирующие гибридомы культивируют in vitro (например, в культуральных флаконах для ткани или реакторах с полыми волокнами) или in vivo (в виде асцитов в мышах).

Если желательно, антитела (поликлональные или моноклональные) могут быть помечены с использованием общепринятых способов. Подходящие метки включают в себя флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы (в частности, ³²P и ¹²⁵I), реагенты с повышенной электроной плотностью, ферменты и лиганды, имеющие специфические партнеры связывания. Ферменты детектируют обычно по их активности. Например, пероксидазу хрена обычно детектируют по ее способности превращать 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, определяемый количественно при помощи спектрофотометра. "Партнером специфического связывания" называют белок, способный связывать молекулу-лиганд с высокой специфичностью, как например, в случае антигена и специфического для него антитела. Другие партнеры специфического связывания включают в себя биотин и авидин или стрептавидин, IgG и белок А и многочисленные пары рецептор-лиганд, известные в данной области. Должно быть понятно, что приведенное выше описание не предназначается для распределения многочисленных меток на четко определенные классы, так как одна и та же метка может служить в нескольких различных механизмах действия. Например, ¹²⁵I может служить в качестве радиоактивной метки или в качестве реагента с повышенной электронной плотностью. HRP (пероксидаза хрена) может служить в качестве фермента или в качестве антигена для mAb. Далее, можно объединять различные метки для желательного эффекта. Например, mAb и авидин также требуют меток в практике данного изобретения: так, можно пометить mAb биотином и детектировать их присутствие авидином, меченным ¹²⁵I, или моноклональными антителами против биотина, меченными HRP. Другие перестановки и возможности будут вполне очевидными специалистам с обычной квалификацией в данной области и рассматриваются как эквиваленты в рамках данного изобретения.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции могут содержать либо полипептиды, либо антитела, либо нуклеиновую кислоту данного изобретения. Фармацевтические композиции будут содержать терапевтически эффективное количество либо полипептидов, либо антител, либо полинуклеотидов данного изобретения.

Термин "терапевтически эффективное количество" в применении здесь обозначает количество терапевтического агента для лечения, ослабления или предупреждения рассматриваемого заболевания или состояния или для проявления терапевтического или превентивного действия. Это действие может быть обнаружено, например, посредством химических маркеров или уровней антигенов. Терапевтические эффекты включают в себя также уменьшение физических симптомов, таких как уменьшение температуры тела. Точное эффективное количество для субъекта будет зависеть от размера и здоровья субъекта, характера и степени состояния и терапевтических средств или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения. Таким образом, нет смысла определять точное количество заранее.

Однако эффективное количество для конкретной ситуации может быть определено рутинным экспериментированием и находится в пределах возможности оценки лечащим врачом.

Для целей данного изобретения эффективная доза будет находиться между приблизительно 0,01 мг/кг и 50 мг/кг или 0,05 мг/кг и приблизительно 10 мг/кг конструкций ДНК для индивидуума, которому она вводится.

Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" обозначает носитель для введения терапевтического агента, такого как антитела или полипептид, гены и других терапевтических агентов. Этот термин относится к любому фармацевтическому носителю, который сам не индуцирует образования антител, вредных для индивидуума, принимающего эту композицию, и который может вводиться без нежелательной токсичности. Подходящими носителями могут быть большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области.

В них могут использоваться фармацевтически приемлемые соли, например минеральные соли, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. В таких носителях могут дополнительно присутствовать вспомогательные вещества, например увлажняющие или эмульгирующие агенты, буферящие рН вещества и т.п. Обычно, эти терапевтические композиции готовят в виде инъекционных растворов, в виде жидких растворов или суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. В определение фармацевтически приемлемый носитель включены также липосомы.

Способы доставки

После приготовления композиции данного изобретения могут вводиться непосредственно субъекту. Подлежащими лечению субъектами могут быть животные, в частности могут лечиться люди.

Прямую доставку композиций данного изобретения обычно выполняют посредством инъекции, подкожно, внутрибрюшинно, внутивенно или внутримышечно или доставкой в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут также вводиться в повреждение. Другие способы введения включают в себя оральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальные или чрескожные введения (например, см. WO 98/20734), при помощи игл, генных ружей или гипоспреев. Дозированное лечение может быть схемой введения единственной дозы или схемой с введением множественных доз.

Вакцины

Вакцины содержат иммунизирующий антиген (антигены), иммуноген (иммуногены), полипептид (полипептиды), белок (белки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с «фармацевтически приемлемыми носителями», которые включают в себя любой носитель, который сам не индуцирует образования антител, вредных для индивидуума, принимающего эту композицию. Подходящими носителями являются обычно большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты (такие как масляные капли или липосомы) и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области. Кроме того, эти носители могут функционировать как иммуностимулирующие агенты ("адъюванты"). Кроме того, антиген или иммуноген могут быть конъюгированы с бактериальным токсином, например токсоидом из дифтерийного, столбнячного, холерного, Н. pylori и других патогенов.

Предпочтительные. адъюванты для усиления эффективности композиции включают в себя, но не ограничиваются ими: (1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.; (2) эмульсионные композиции типа масло в воде (с другими специфическими иммуностимулирующими агентами, такими как мурамилпептиды (см. ниже) или компоненты стенок бактериальных клеток, или без них), такие как, например, (a) MF59™ (WO 90/14837; Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell and Newman, Plenum Press 1995), содержащий 5% сквалена, 0,5% Твина 80 и 0,5% Span 85 (необязательно содержащий различные количества МТР-РЕ (см. ниже), хотя это не является обязательным), приготовленный в виде субмикронных частиц при помощи микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели HOY (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, содержащий 10% сквалена, 0,4% Твина 80, 5% плуроник-блокполимера L121, и thr-MDP (см. ниже), либо микрофлюидизированный до субмикронной эмульсии, либо обработанный в вихревом смесителе до получения эмульсии с частицами большего размера, и (с) система адъюванта Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащая 2% сквалена, 0,2% Твина 80 и один или несколько компонентов стенок бактериальных клеток из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), трегалозодимиколата (TDM) и каркаса клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL + CWS (Detox™); (3) сапониновые адъюванты, такие как Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), могут быть использованы, или частицы, полученные из них, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); (4) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (5) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и т.д.), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-GSF), фактор некроза опухолей (TNF), и т.д.; и (6) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты для усиления эффективности композиции. Предпочтительными являются MF59™ и квасцы.

Как упоминалось выше, мурамилпептиды включают в себя, но не ограничиваются ими, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ) и т.д.

Иммуногенные композиции (например, иммунизирующий антиген/иммуноген/полипептид/белок/нуклеиновая кислота, фармацевтически приемлемый носитель и адъювант) обычно должны содержать разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин, этанол и т.д. В таких носителях могут дополнительно присутствовать вспомогательные вещества, например смачивающие или эмульгирующие агенты, буферящие рН вещества и т.п.

Обычно эти иммуногенные композиции готовят в виде инъекционных растворов, в виде либо жидких растворов, либо суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат может быть также эмульгирован или инкапсулирован в липосомах для усиленного адъювантного эффекта, как обсуждалось выше в отношении фармацевтически приемлемых носителей.

Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигенных или иммуногенных полипептидов, а также любые другие вышеуказанные компоненты в случае необходимости. Под «иммунологически эффективным количеством» имеют в виду, что введение этого количества индивидууму, в виде одной дозы или последовательно дробными частями дозы является эффективным для лечения или предупреждения заболевания. Это количество варьируется в зависимости от состояния здоровья и физического состояния подлежащего лечению индивидуума, таксономической группы подлежащего лечению индивидуума (например, примата нечеловека, примата и т.д.), способности иммунной системы человека к синтезу антител, степени желаемой защиты, состава вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других релевантных факторов. Ожидается, что это количество будет находится в относительно широком диапазоне, который может быть определен при помощи рутинных испытаний.

Иммуногенные композиции обычно вводят парентерально, например инъекцией, подкожно, внутримышечно или трансдермально/чрескожно (например, WO 98/20734). Дополнительные композиции, пригодные для других форм введения, включают в себя оральные и легочные композиции, суппозитории и трансдермальные приспособления. Дозированное лечение может быть схемой введения отдельной дозы или схемой введения множественных доз. Вакцина может вводиться в сочетании с другими иммунорегуляторными агентами.

В качестве альтернативы вакцинам на основе белков может быть использована вакцинация ДНК [например, Robinson and Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283; Donelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648; см. здесь ниже].

Носители для доставки генов

Генотерапевтические носители для доставки конструкций, содержащих кодирующую последовательность терапевтического агента данного изобретения, которая должны быть доставлена в млекопитающее, могут вводиться либо локально, либо системно. Эти конструкции могут использовать приемы с вирусным или невирусным вектором в способах in vivo или ex vivo. Экспрессия такой кодирующей последовательности может быть индуцирована с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности in vivo может быть конститутивной или регулируемой.

Данное изобретение включает в себя носители доставки генов, способные экспрессировать рассматриваемые последовательности нуклеиновых кислот. Носителем доставки генов является предпочтительно вирусный вектор и более предпочтительно ретровирусный, аденовирусный, аденоассоциированный вирусный (AAV), герпесвирусный или альфавирусный вектор. Вирусным вектором может быть также астровирусный, коронавирусный, ортомиксовирусный, паповавирусный, парамиксовирусный, парвовирусный, пикорнавирусный, поксвирусный или тогавирусный вектор. См., в общем. Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connely (1995) Human Gene Therapy 6:185-193 и Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153.

Ретровирусные векторы хорошо известны в данной области и авторы изобретения предполагают, что любой вектор ретровирусной гемотерапии является применимым в данном изобретении, в том числе ретровирусы типов В, С и D, ксенотропные ретровирусы (например, NZB-X1, NZB-X2 и NZB9-1 (см. O'Neill (1985) J. Virol. 53:160), политропные ретровирусы, например, MCF и MCF-MLV (см. Kelly (1983) J. Virol. 45:291), спумавирусы и лентивирусы. См. RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Части ретровирусного вектора для генотерапии могут быть получены из различных ретровирусов. Например, ретровектор LTR может быть произведен из вируса мышиной саркомы, сайта связывания тРНК из вируса саркомы Рауса, сигнала упаковки из вируса мышиного лейкоза и точки начала синтеза второй цепи из вируса лейкоза птиц.

Эти рекомбинантные ретровирусные векторы могут быть использованы для генерирования частиц трансдукционно-компетентного ретровирусного вектора введением их в подходящие упаковывающие клеточные линии (см. патент США US 5591624). Ретровирусные векторы могут быть сконструированы для сайт-специфической интеграции в ДНК клетки-хозяина включением химерного фермента интегразы в эту ретровирусную частицу (см. WO 96/37626). Предпочтительно, чтобы рекомбинантный вирусный вектор был репликационно-дефектным (т.е. дефектным по репликации) рекомбинантным вирусом.

Упаковывающие клеточные линии, пригодные для применения с вышеописанными ретровирусными векторами, хорошо известны в данной области, их легко получить (см. WO 95/30763 и WO 92/05266), и они могут быть использованы для создания линий клеток-продуцентов (также называемых векторными клеточными линиями или «VCL») для получения рекомбинантных векторных частиц. Предпочтительно упаковывающие клеточные линии готовят из исходных клеток человека (например, клеток НТ1080) или исходных клеточных линий норки, что исключает инактивацию в сыворотке человека.

Предпочтительные ретровирусы для конструирования ретровирусных векторов для генотерапии включают в себя вирус лейкоза птиц, вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус мышиного лейкоза, вирус, индуцирующий очаги в клетках норки, вирус мышиной саркомы, вирус ретикулоэндотелиоза и вирус саркомы Рауса. Особенно предпочтительные вирусы мышиного лейкоза включают в себя 4070А и 1504А (Hartley and Rowe (1976) J Virol 19:19-25), Abelson (ATCC No. VR-999), Friend (ATCC No. VR-245), Graffi, Gross (ATCC No. VR-590), вирус саркомы Kirsten, Harvey и вирус Раушера (вирус эритролейкозов и лимфатических лейкозов мышей) (ATCC No. VR-998) и вирус лейкоза мышей Молони (ATCC No. VR-190). Такие ретровирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как Американская Коллекция Типовых Культур («ATCC») в Роквилле, Мериленд, или выделены из известных источников при помощи общедоступных способов.

Примеры известных ретровирусных векторов генотерапии, используемые в данном изобретении, включают в себя векторы, описанные в патентных заявках GB 2200651, ЕР 0415731, ЕР 0345242, ЕР 0334301, WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, WO 91/02825, WO 95/079994, US 5219740, US 4405712, US 4861719, US 4980289, US 4777127, US 5591624. См. также Vile (1993) Cancer Res 53:3860-3864; Vile (1993) Cancer Res 53:962-967; Ram (1993) Cancer Res 53:83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79:729-735; Mann (1983) Cell 33:153; Cane (1984) Proc Nati Acad Sci 81:6349; и Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Аденовирусные векторы для генотерапии человека также известны в данной области и могут быть использованы в данном изобретении. См., например, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 и Rosenfeld (1991) Science 252:431 и WO 93/07283, WO 93/06223 и WO 93/07282. Примеры известных векторов для аденовирусной генотерапии, используемые в данном изобретении, включают в себя векторы, описанные в цитируемых выше документах и в WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984, WO 95/00655, WO 95/27071, WO 95/29993, WO 95/34671, WO 96/05320, WO 94/08026, WO 94/11506, WO 93/06223, WO 94/24299, WO 95/14102, WO 95/24297, WO 95/02697, WO 94/28152, WO 94/24299, WO 95/09241, WO 95/25807, WO 95/05835, WO 94/18922 и WO 95/09654. Альтернативно, может быть использовано введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано в Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154. Примерами носителей для доставки генов данного изобретения являются также аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы. Главными и предпочтительными примерами таких векторов для применения в данном изобретении являются векторы на основе AAV-2, описанные Srivastava в WO 93/09239. Наиболее предпочтительные AAV-векторы содержат два инвертированных концевых повтора AAV, в которых нативные D-последовательности модифицированы заменой нуклеотидов, так что по меньшей мере от 5 природных нуклеотидов и до 18 природных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере от 10 природных нуклеотидов до 18 природных нуклеотидов, наиболее предпочтительно 10 природных нуклеотидов сохранены, а остальные нуклеотиды D-последовательности делетированы или заменены неприродными нуклеотидами. Природными D-последовательностями инвертированных концевых повторов AAV являются последовательности 20 последовательных нуклеотидов в каждом инвертированном концевом повторе AAV (т.е. имеется одна последовательность на каждом конце), которые не участвуют в образовании HP. Неприродным заменяющим нуклеотидом может быть любой нуклеотид, иной, чем нуклеотид, обнаруживаемый в природной D-последовательности в том же самом положении. Другими применяемыми примерами AAV-векторов являются pWP-19, pWN-1, оба описаны в работе Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Другим примером такого AAV-вектора является psub201 (см. Samulski (198.7) J. Virol. 61:3096). Другим примером применяемого AAV-вектора является вектор Double-D ITR. Конструирование вектора Double-D ITR описано в патенте США US 5478745. Другими векторами являются векторы, описанные в патенте США 4797368, выданном Carter, и патенте США 5139941, выданном Muzyczka, патенте США 5474935, выданном Chartejee, и WO 94/288157, Kotin. Еще одним примером AAV-вектора, применимого в данном изобретении, является SSV9AFABTKneo, который содержит энхансер AFP и альбуминовый промотор и регулирует экспрессию преимущественно в печени. Его структура и конструирование описаны в работе Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Дополнительные AAV-векторы генотерапии описаны в патентах США US 5354678, US 5173414, US 5139941 и US 5252479.

Векторы для генотерапии данного изобретения включают в себя также герпесвирусные векторы. Основными и предпочтительными примерами являются векторы на основе вируса простого герпеса, содержащие последовательность, кодирующую полипептид тимидинкиназы, такие, как описанные в патенте США US 5288641 и в Европейском патенте ЕР 0176170 (Roizman). Дополнительные примеры векторов на основе вируса простого герпеса включают в себя HFEM/ICP6-LacZ, описанный в WO 95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac, описанный в работе Geller (1988) Science 241:1661-1669 и в WO 90/09441 и WO 92/07945, HSV Us3::pgC-lacZ, описанный в работе Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 и HSV 7134, 2 RH 105 и GAL4, описанные в Европейском патенте ЕР 0453242 (Breakefield), и векторы, депонированные АТСС под номерами доступа АТСС VR-977 и АТСС VR-260.

Рассматриваются также векторы генотерапии на основе альфавируса, которые могут быть использованы в данном изобретении. Предпочтительными альфа вирусными векторами являются векторы на основе вируса лихорадки Синдбис, тогавирусы, вирус лесов Семлики (АТСС VR-67; АТСС VR-1247), вирус Миддлеберга (АТСС VR-370), вирус реки Росс (АТСС VR-373; ATCC VR-1246), Венесуэльский вирус лошадиного энцефалита (АТСС VR-923; ATCC VR-1250); ATCC VR-1249; ATCC VR-532) и векторы, описанные в патентах США US 5091309, 5217879 и WO 92/10578. Более конкретно, могут использоваться векторы на основе альфавируса, описанные в патенте US с регистрационным номером 08/405627, поданном 15 марта 1995 года, WO 94/21792, WO 92/10578, WO 95/07994, US 5091309 и US 5217879. Такие альфавирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как Американская Коллекция Типовых Культур («ATCC») в Роквилле, Мериленд, или выделены из известных источников при помощи общедоступных способов. Предпочтительно используются альфавирусные векторы с пониженной цитотоксичностью (см. US 08/679640).

Векторные системы ДНК, такие как эукариотические многоэлементные экспрессионные системы, также применимы для экспрессии нуклеиновых кислот данного изобретения. См. WO 95/07994 в отношении подробного описания эукариотических многоэлементных экспрессионных систем. Предпочтительно эукариотические многоэлементные экспрессионные системы данного изобретения произведены из альфавирусных векторов и наиболее предпочтительно из векторов на основе вируса лихорадки Синдбис.

Другие вирусные векторы, пригодные для применения в данном изобретении, включают в себя вирусные векторы, полученные из полиовируса, например, ATCC VR-58, и векторы, описанные в работе Evans, Nature 339 (1989) 385 и Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115; риновирус, например, ATCC VR-1110, и векторы, описанные в работе Arnold (1990) J Cell Biochem L401; поксвирусы, такие как вирус оспы канареек или вирус коровьей оспы, например, АТСС VR-111 и АТСС VR-2010, и векторы, описанные в работе Fisher-Hoch (1989) Proc Natl Acad Sci 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; в патентах США US 4603112 и US 4769330 и WO 89/01973; вирус SV40, например, АТСС VR-305 и векторы, описанные в работе Mulligan (1979) Nature 277:108 и Madzak (1992) J Gen Virol 73:1533; вирус гриппа, например, АТСС VR-797 и рекомбинантные вирусы гриппа, полученные с использованием способов обратной генетики, как описано в патенте США US 5166057 и в работе Enami (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3802-3805; Enami and Palese (1991) J. Virol 65:2711-2713 и Luytjes (1989) Cell 59:110, (см. также McMichael (1983) NEJ Med 309:13 и Yap (1978) Nature 273:238 и Nature (1979) 277:108); вирус иммунодефицита человека, описанный в ЕР-0386882 и в работе Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; вирус кори, например, АТСС VR-67 и VR-1247, и вирусы, описанные в ЕР-0440219; ауравирус, например, АТСС VR-368; вирус Бебару, например, АТСС VR-600 и АТСС VR-1240; вирус Кабассу, например, АТСС VR-922; вирус Чикунгунья, например, АТСС VR-64 и АТСС VR-1241; вирус Форт-Морган, например, АТСС VR-924; вирус Гета, например, АТСС VR-369 и АТСС VR-1243; вирус Кизилагач, например, АТСС VR-927; вирус Майяро, например, АТСС VR-66; вирус Мукамбо, например, АТСС VR-580 и АТСС VR-1244; вирус Ндуму, например, АТСС VR-371; вирус Пиксуна, например, АТСС VR-372 и АТСС VR-1245; вирус Тонате, например, АТСС VR-925; вирус Тринити, например, АТСС VR-469; вирус Уна, например, АТСС VR-374; вирус Уотароа, например, АТСС VR-926; вирус Y-62-33, например, АТСС VR-375; вирус O-Ньонг-Ньонг, вирус Восточного энцефалита, например, АТСС VR-65 и АТСС VR-1242; вирус Западного энцефалита, например, АТСС VR-70, АТСС VR-1251, АТСС VR-622 и АТСС VR-1252; и коронавирус, например, АТСС VR-740 и вирусы, описанные в работе Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121:190.

Доставка композиций данного изобретения в клетки не ограничивается вышеупомянутыми вирусными векторами. Другие способы и среды доставки могут быть использованы, такие как, например, экспрессионные векторы нуклеиновых кислот, конденсированная поликатионами ДНК, связанная или не связанная с убитым аденовирусом, например, см. заявку США номер 08/366787, поданную 30 декабря 1994 года и работу Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154, связанная лигандом ДНК, например, см. Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987, клетки-носители для доставки в эукариотические клетки, например, по заявке США номер 08/240030, поданной 9 мая 1994 года, и заявке США номер 08/404796, нанесение полимеризуемых под действием света гидрогельных материалов, портативный пистолет для частиц-переносчиков генов, как описано в патенте США US 5149655, ионизирующая радиация, описанная в патенте США US 5206152 и в WO 92/11033, нейтрализация заряда нуклеиновой кислоты или слияние с клеточными мембранами. Дополнительные подходы описаны в работах Philip (1994) Mol Cell Biol 14:2411-2418 и Woffendin (1994) Proc Nati Acad Sci 91:1581-1585.

Может быть использован опосредованный частицами перенос генов, например, см. заявку США номер 60/023867. Вкратце, последовательность может быть встроена в общепринятые векторы, которые содержат обычные регуляторные последовательности для экспрессии высокого уровня, и затем инкубирована с синтетическими молекулами переноса генов, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как полилизин, протамин и альбумин, связанные с нацеливающими на клетки лигандами, такими как асиалоорозомукоид, как описано в работе Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432, инсулин, как описано в работе Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253-263, галактоза, как описано в работе Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:533-539, лактоза или трансферрин.

Может быть также использована «голая» ДНК. Примеры способов введения «голой» ДНК описаны в WO 90/11092 и патенте США US 5580859. Эффективность поглощения может быть улучшена с использованием биодеградируемых латексных гранул. Покрытые ДНК латексные гранулы эффективно транспортируются в клетки после инициации эндоцитоза этими гранулами. Этот способ может быть улучшен дополнительно обработкой гранул для увеличения гидрофобности и тем самым облегчения разрушения эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму.

Липосомы, которые могут действовать в качестве носителей генной доставки, описаны в патенте США US 5422120, WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 и ЕР 0524968. Как описано в US 60/023867, в случае невирусной доставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид, могут быть введены в обычные векторы, которые содержат обычные регуляторные последовательности для экспрессии высокого уровня, и затем инкубированы с синтетическими молекулами переноса генов, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как полилизин, протамин и альбумин, связанные с нацеливающими на клетки лигандами, такими как асиалоорозомукоид, инсулин, галактоза, лактоза или трансферрин. Другие системы доставки включают в себя применение липосом для инкапсулирования ДНК, содержащей ген под контролем различных тканеспецифических или убикватно-активных промоторов. Дополнительная невирусная доставка, пригодная для использования, включает в себя системы механической доставки, такие как подход, описанный в работе Woffendin et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):11581-11585. Кроме того, кодирующая последовательность и продукт ее экспрессии могут быть доставлены посредством полимеризуемых под действием света гидрогельных материалов. Другие традиционные способы доставки генов, которые могут быть использованы для доставки этой кодирующей последовательности, включают в себя, например, применение портативного пистолета для частиц-переносчиков генов, как описано в патенте США US 5149655, применение ионизирующей радиации, как описано в патенте США US 5206152 и в WO 92/11033.

Примерами липосомных и поликатионных носителей для доставки генов являются носители, описанные в патенте США US 5422120 и 4762915; в WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 и ЕР-0524968; и в работах Stryer, Biochemistry, pages 236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc Nati Acad Sci 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.

Полинуклеотидная композиция может содержать терапевтически эффективное количество носителя для генотерапии, как этот термин определен выше. Для целей данного изобретения эффективная доза будет равна от приблизительно 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг конструкций ДНК для индивидуума, которому ее вводят.

Способы доставки

После приготовления полинуклеотидные композиции данного изобретения могут быть введены (1) непосредственно субъекту; (2) доставлены ex vivo к клеткам, полученным из субъекта; или (3) in vitro для экспрессии рекомбинантных белков. Субъектами, которые должны лечиться, могут быть млекопитающие или птицы. Могут также лечиться субъекты-люди.

Прямую доставку композиций обычно выполняют инъекцией, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно или доставкой во внутристициальное пространство ткани. Композиции могут также вводиться в повреждение. Другие способы введения включают в себя оральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальные или чрескожные введения (например, см. WO 98/20734), при помощи игл, генных ружей или гипоспреев. Дозированное лечение может быть схемой введения единственной дозы или схемой с введением множественных доз.

Способы для доставки ех vivo и повторной имплантации трансформированных клеток субъекту известны в данной области и описаны, например, в WO 93/14778. Примеры клеток, которые могут быть использованы в применениях ex vivo, включают в себя, например, стволовые клетки, в частности, гематопоэтические, лимфатические клетки, макрофаги, дендритные клетки или опухолевые клетки.

Обычно доставка нуклеиновых кислот в применениях как ех vivo, так и in vitro может выполняться с использованием следующих процедур, например, опосредованной декстраном трансфекции, кальций-фосфатной преципитации, опосредованной полибреном трансфекции, слияния протопластов, электропорации, инкапсулирования полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямой микроинъекции ДНК в ядра, как хорошо известно в данной области.

Полинуклеотидные и полипептидные фармацевтические композиции

Кроме фармацевтически приемлемых носителей и солей, описанных выше, следующие дополнительные агенты могут быть использованы с полинуклеотидными и/или полипептидными композициями.

А. Полипептиды

Одним примером являются полипептиды, которые включают в себя, без ограничения: асиалоорозомукоид (ASOR); трансферрин; асиалогликопротеины; антитела; фрагменты антител; ферритин; интерлейкины; интерфероны; гранулоцитарно-макрафагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Могут быть также использованы вирусные антигены, такие как белок оболочки, а также белки из других инвазивных организмов, такие как пептид из 17 аминокислот из циркумспорозоитного белка Plasmodium falciparum, известный как RII.

В. Гормоны, витамины и т.д.

Другими группами, которые могут быть включены, являются, например, гормоны, стероиды, андрогены, эстрогены, тиреоидный гормон, или витамины, фолиевая кислота.

С. Полиалкилены, полисахариды и т.д.

Полиалкиленгликоль может быть включен с желаемыми полинуклеотидами/полипептидами. В предпочтительном варианте полиалкиленгликоль является полиэтиленгликолем. Кроме того, могут быть включены моно-, ди- или полисахариды. В предпочтительном варианте этого аспекта полисахаридом является декстран или ДЭАЭ-декстран, а также хитозан и полимеризованный сополимер лактида и гликолида.

D. Липиды и липосомы

Желаемый полинуклеотид/полипептид может быть также инкапсулирован в липидах или упакован в липосомы перед доставкой субъекту или полученным из него клеткам.

Липидную инкапсуляцию выполняют с использованием липосом, которые способны стабильно связывать или заключать в себя и удерживать нуклеиновую кислоту. Отношение конденсированного полинуклеотида к липидному препарату может варьироваться, но обычно будет около 1:1 (мг ДНК:микромоли липида) или с большим количеством липида. В отношении обзора применения липосом в качестве носителей для доставки нуклеиновых кислот см. Hug and Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta, 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.

Липосомные препараты для применения в данном изобретении включают в себя катионные (положительно заряженные), анионные (отрицательно заряженные) и нейтральные препараты. Было показано, что катионные липосомы опосредуют внутриклеточную доставку плазмидной ДНК (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416); мРНК (Malone (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081); и очищенных факторов транскрипции (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192) в функциональной форме.

Катионные липосомы являются легкодоступными. Например, N-[1-2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триэтиламмоний (DOTMA)-липосомы доступны под товарным названием Липофектин от GIBCO BRL, Grand Island, NY. (См. также Felgner supra). Другие коммерчески доступные липосомы включают в себя Transfectace (DDAB/DOPE) и DOTAP/DOPE (Boerhinger). Другие катионные липосомы могут быть получены из легкодоступных материалов при помощи способов, хорошо известных в данной области. См., например, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; WO 90/11092 в отношении описания синтеза DOTAP (1,2-бис(олеилокси)-3-(триметиламмонио)пропан)-липосом.

Подобным образом, анионные и нейтральные липосомы являются легкодоступными, например, от Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), или могут быть получены с использованием легкодоступных материалов. Такие материалы включают в себя фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеилфосфатидилхолин (DOPC), диолеилфосфатидилглицерин (DOPG), диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE) в том числе. Эти материалы могут быть также смешаны с исходными материалами DOTMA и DOTAP в подходящих соотношениях. Способы приготовления липосом с использованием этих материалов известны в данной области.

Липосомы могут содержать многослойные везикулы (MLV) и однослойные везикулы (SUV) или большие однослойные везикулы

(LUV). Различные комплексы липосома-нуклеиновая кислота готовят при помощи способов, известных в данной области. См., например, Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 76:3348); Enoch & Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145; and Schaefer-Ridder U982) Science 215:166.

E. Липопротеины

Кроме того, липопротеины могут включать подлежащие доставке полинуклеотид/полипептид. Примеры липопротеинов, которые могут быть использованы, включают в себя: хиломикроны, HDL, IDL, LDL и VLDL. Могут быть также использованы мутанты, фрагменты или слияния (гибриды) этих белков. Могут быть также использованы модификации природно встречающихся липопротеинов, такие как ацетилированный LDL. Эти липопротеины могут нацеливать доставку полинуклеотидов в клетки, экспрессирующие рецепторы липопротеинов. Предпочтительно, если липопротеины включают полинуклеотид, который должен быть доставлен, в эту композицию не включают никакого другого нацеливающего лиганда.

Природно встречающиеся липопротеины содержат липидную и белковую часть. Белковая часть называется апопротеином. В настоящее время были выделены и идентифицированы апопротеины А, В, С, D и Е. По меньшей мере два из них содержат несколько белков, обозначаемых римскими цифрами, AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.

Липопротеин может содержать более одного апопротеина. Например, природно встречающиеся хиломикроны содержат А, В, С и Е, со временем эти липопротеины теряют А и приобретают апопротеины С и Е. VLDL содержит апопротеины А, В, С и Е, LDL содержит апопротеин В; HDL содержит апопротеины А, С и Е.

Аминокислоты этих апопротеинов известны и описаны, например, в работах Breslow (1985) Annu Rev. Biochem 54:699; Law (1986) Adv. Exp. Med. Biol. 151:162; Chen (1986). J Biol Chem 261:12928; Kane (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:2465 и Uterman (1984) Hum Genet 65:232.

Липопротеины содержат различные липиды, в том числе триглицериды, холестерин (свободный и эфиры) и фосфолипиды. В природно встречающихся липопротеинах состав липидов варьируется. Например, хиломикроны содержат в основном триглицериды. Более подробное описание липидного содержания природно встречающихся липопротеинов может быть найдено, например, в Meth. Enzymol. 128 (1986). Состав липидов выбирают таким образом, чтобы они способствовали созданию требуемой конформации апопротеина для рецептор-связывающей активности. Состав липидов может быть также выбран для облегчения гидрофобного взаимодействия и связи с полинуклеотид-связывающей молекулой.

Природно встречающиеся липопротеины могут быть выделены из сыворотки, например, ультрацентрифугированием. Такие способы описаны в Meth. Enzymol. (supra); Pitas (1980) J. Biochim. 255:5454-5460 и Mahey (1979) J Clin. Invest 64:743-750. Липопротеины могут быть также получены in vitro или рекомбинантными способами экспрессией генов апопротеинов в желаемой клетке-хозяине. См, например, работы Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15:403 и Radding (1958) Biochim Biophys Acta 39:443. Липопротеины могут быть также куплены у коммерческих поставщиков, таких как Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA. Дополнительное описание липопротеинов может быть найдено в W098/06437 (Zuckermann et al.).

F. Поликатионные агенты

Поликатионные агенты, с липопротеином или без липопротеина, могут быть включены в композицию с желаемым полинуклеотидом/полипептидом.

Поликатионные агенты обычно проявляют в целом положительный заряд при физиологическом рН и способны нейтрализовать электрический заряд нуклеиновых кислот для облегчения доставки в желаемое местоположение. Эти агенты имеют применения как in vitro, ex vivo, так и in vivo. Поликатионные агенты могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот живому субъекту внутримышечно, подкожно и т.д.

Далее приводятся примеры применимых полипептидов в качестве поликатионных агентов: полилизин, полиаргинин, полиорнитин и протамин. Другие примеры включают в себя гистоны, протамины, человеческий сывороточный альбумин, ДНК-связывающие белки, негистоновые белки хромосом, белки оболочки ДНК-вирусов, такие как X174, факторы транскрипции, которые также содержат домены, которые связывают ДНК и, следовательно, могут быть использованы в качестве конденсирующих нуклеиновую кислоту агентов. Вкратце, факторы транскрипции, такие как С/СЕВР, c-jun, c-fos, АР-1, АР-2, АР-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP и TFIID, содержат основные домены, которые связывают ДНК-последовательности.

Органические поликатионные агенты включают в себя: спермин, спермидин и путресцин.

Размеры и физические свойства поликатионного агента могут быть экстраполированы из приведенного выше перечня для конструирования других поликатионных агентов или для получения синтетических поликатионных агентов.

Синтетические поликатионные агенты, которые являются применимыми, включают в себя, например, ДЭАЭ-декстран, полибрен. Липофектин™ и липофектАМИН™ являются мономерами, которые образуют поликатионные комплексы при объединении с полинуклеотидом/полипептидом.

Иммунодиагностические анализы

Антигены Neisseria данного изобретения могут быть использованы в иммуноанализах для детектирования уровней антител (или, наоборот, анти-Neisseria антитела могут быть использованы для детектирования уровней антигенов). Иммуноанализы на основе хорошо определенных рекомбинантных антигенов могут быть разработаны для замены инвазивных диагностических способов. Антитела к белкам Neisseria могут детектироваться в биологических пробах, в том числе, например, пробах крови или сыворотки. Создание иммуноанализов является предметом большого числа вариаций, и многие из них известны в данной области. Протоколы для иммуноанализа могут быть основаны, например, на конкуренции или на прямой реакции или на анализах типа сэндвич-анализа. Протоколы могут также использовать, например, твердые носители или могут включать в себя иммунопреципитацию. Большинство анализов включают в себя применение меченого антитела или полипептида; метки могут быть, например, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными или в виде молекул-красителей. Анализы, которые усиливают сигналы из зонда, также известны; примерами их являются анализы, которые используют биотин и авидин, и меченые и опосредованные ферментом иммуноанализы, такие как анализы ELISA.

Наборы, пригодные для иммунодиагностики и содержащие подходящие меченые реагенты, составляют упаковкой подходящих материалов, в том числе композиций данного изобретения, в подходящих контейнерах, вместе с остальными реагентами и материалами (например, подходящими буферами, солевыми растворами и т.д.), требующимися для проведения данного анализа, а также соответствующего комплекта инструкций к анализу.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Термин "гибридизация" относится к связыванию двух последовательностей нуклеиновых кислот друг с другом посредством водородных связей. Обычно одну последовательность фиксируют на твердом носителе, а другая находится свободной в растворе. Затем эти две последовательности помещают в контакт друг с другом при условиях, которые благоприятствуют образованию водородных связей. Факторы, которые влияют на образование водородных связей, включают в себя: тип и объем растворителя; температуру реакции; время гибридизации; перемешивание; агенты для блокирования неспецифического присоединения последовательности из жидкой фазы к твердому носителю (реагента Денхардта или BLOTTO); концентрацию последовательностей; применение соединений, увеличивающих скорость связывания последовательностей (декстрансульфата или полиэтиленгликоля); и строгость условий промывки после гибридизации. См. Sambrook et al. [supra] Volume 2, chapter 9, pages 9.47-9.57.

Термин «строгость» относится к условиям в реакции гибридизации, которые благоприятствуют преимущественной связи очень сходных последовательностей в сравнении с последовательностями, которые отличаются. Например, должна быть выбрана комбинация температуры и концентрации соли, при которой температура находится приблизительно на 120-200°С ниже рассчитанной Tm (температуры плавления) исследуемого гибрида. Температура и солевые условия часто могут быть определены эмпирически в предварительных экспериментах, в которых пробы геномной ДНК, иммобилизованные на фильтрах, гибридизуют с представляющей интерес последовательностью и затем промывают при условиях различной строгости. См. Sambrook et al., page 9.50.

Переменными, которые следует учитывать, например, при выполнении Саузерн-блотт анализа, являются: (1) сложность ДНК, подлежащей блоттингу, и (2) гомология между зондом и детектируемыми последовательностями. Общее количество фрагмента (фрагментов), подлежащих исследованию, может варьироваться с амплитудой 10, от 0,1-1 мкг для продукта расщепления плазмиды или фага до 10^-9-10^-8 г для малокопийного гена в высокосложном эукариотическом геноме. Для полинуклеотидов низкой сложности могут быть использованы существенно более короткие периоды блоттинга, гибридизации и экспонирования, меньшее количество исходных полинуклеотидов и более низкая удельная активность зондов. Например, малокопийный ген может быть детектирован со временем экспонирования только 1 час с исходным 1 мкг дрожжевой ДНК, блоттингом в течение двух часов и гибридизацией в течение 4-8 часов с зондом при 10⁸ имп/мин/мкг. Для малокопийного гена млекопитающего консервативный подход начинается с 10 мкг ДНК в качестве исходного материала, блоттинг проводят в течение ночи и гибридизацию в течение ночи в присутствии 10% декстрансульфата с использованием зонда с более чем 10⁸имп/мин/мкг, что приводит к времени экспонирования ~24 часа.

Несколько факторов могут влиять на температуру плавления (Tm) гибрида ДНК-ДНК между зондом и представляющим интерес фрагментом и, следовательно, подходящие условия гибридизации и промывки. Во многих случаях зонд не является на 100% гомологичным фрагменту. Другие обычно встречающиеся переменные включают в себя длину и общее содержание G+C гибридизующихся последовательностей и ионную силу и содержание формамида в гибридизационном буфере. Действия всех этих факторов могут быть аппроксимированы одним уравнением:

Tm=81+16,6(logioCi)+0,4 [%(G+C)]-0,6(%формамида)-600/n-1,5(%ошибочного спаривания)

где Ci обозначает концентрацию соли (одновалентных ионов), а n обозначает длину гибрида в п.н. (слегка модифицировано в сравнении с работой Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284).

В планировании эксперимента гибридизации некоторые факторы, влияющие на гибридизацию нуклеиновых кислот, могут быть изменены подходящим образом. Легче всего корректировать температуру гибридизации и промывки и концентрацию соли во время промывок. По мере увеличения температуры гибридизации (т.е. строгости) гибридизации между цепями, которые являются негомологичными, становится труднее происходить, и вследствие этого уменьшается фон. Если радиоактивно меченный зонд является не полностью гомологичным с иммобилизованным фрагментом (как это часто имеет место в случае экспериментов с гибридизацией в семействе генов и межвидовой гибридизацией), температура гибридизации должна быть понижена и фон будет увеличиваться. Температура промывок влияет на интенсивность полосы гибридизации и степень фона сходным образом. Строгость промывок также увеличивается с уменьшением концентраций соли.

Обычно подходящими температурами гибридизации в присутствии 50% формамида являются 42°С для зонда, который на 95%-100% гомологичен фрагменту-мишени, 37°С для гомологии 90%-95% и 32°С для гомологии 85%-90%. Для более низких гомологий содержание формамида должно быть понижено, а температура скорректирована соответствующим образом с использованием приведенного выше уравнения. Если гомология между зондом и фрагментом-мишенью неизвестна, самый простой подход заключается в том, чтобы начать с условиями гибридизации и промывок, которые являются нестрогими. Если после авторадиографии наблюдаются неспецифические полосы или высокий фон, фильтр может быть промыт при высокой строгости и повторно экспонирован на пленке. Если время, требующееся для экспонирования, делает этот подход непрактичным, нужно тестировать параллельно несколько степеней строгости гибридизации и/или промывок.

Идентификация менингококкового белка 80-85 кДа

Наблюдали, что различные препараты пузырьков (везикул) наружных мембран из N. meningitidis серологической группы В содержали компонент приблизительно 80-85 кДа. Этот белок очищали гель-электрофорезом в ДСН-ПААГ и N-терминально секвенировали (SEQ ID NO:1).

Антитела, индуцированные против очищенного при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ белка, перекрестно-реагировали с эквивалентными белками в более чем 50 штаммах N. meningitidis различных серологических групп и серотипов. Наблюдали также перекрестную реактивность с N. gonorrhoeae, N. polysaccharia и N. lactamica. Постиммунные сыворотки из вакцинированных пациентов также реагировали с этим белком.

Полный ген был клонирован из N. meningitidis серотипа В (SEQ ID NO:2), и была расшифрована последовательность кодируемого белка (SEQ ID NO:3). Посредством сравнения с N-концевым секвенированием, описанным выше, были расшифрованы сигнальный пептид (SEQ ID NO:4} и зрелая последовательность (SEQ ID NO:5).

Идентификация соответствующих генов в N. meningitidis серологической группы А и N. gonorrhoeae

На основе последовательности N. meningitidis серологической группы В были клонированы и секвенированы соответствующие гены из N. meningitidis серологической группы А и N. gonorrhoeae.

Полный ген из N. meningitidis серологической группы А показан как SEQ ID NO: 6, кодируемый белок как SEQ ID NO: 7. Сигнальный пептид и зрелая последовательность показаны как SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9.

Полный ген из N. gonorrhoeae показан как SEQ ID NO: 10, кодируемый белок как SEQ ID NO:11. Сигнальный пептид и зрелая последовательность показаны как SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13.

Сравнение последовательностей

Белковые последовательности сравнивали, и они являются высокогомологичными.

Последовательность N. meningitidis серологической группы В и последовательность N. gonorrhoeae обнаруживают идентичность 95,4% в перекрывании 797 аминокислот:

Последовательности N. meningitidis серологической группы А и В обнаруживают идентичность 99,9% в перекрывании 797 аминокислот:

Высокая степень консервативности обусловливает, что единственный белок может быть способен индуцировать иммунные реакции против множества видов Neisseria.

Вакцины

Три белка, идентифицированные, как описано выше, экспрессировали и использовали для иммунизации. Наблюдали хорошие иммунные реакции против этих белков.

Комбинированные вакцины

Кроме того, каждый из этих белков комбинировали с антигенами против других патогенных организмов (например, полисахаридной вакциной Chiron против менингита серологической группы С) и использовали для иммунизации. Наблюдали хорошие иммунные реакции.

Дополнительные компоненты NmB

Хотя она и является эффективной, защита, индуцируемая Норвежской вакциной OMV, ограничена штаммом, используемым для приготовления вакцины. Клинические испытания на этой вакцине получили только 57,2% эффективности после 29 месяцев у подростков, хотя IgG-реакции наблюдали почти в 100% пациентов [см. например, Rosenqvist et al. (1995) Infect. Immun. 63:4642-4652].

Неожиданно было обнаружено, что добавление дополнительно определенных компонентов к Норвежской вакцине OMV значительно расширяло ее эффективность.

Норвежская вакцина не индуцирует защиту против штамма 2996 NmB. Определенные белки из штамма 2996 добавляли к Норвежской вакцине, и было показано, что эффективность этой вакцины увеличивалась до удивительной степени. Кроме того, добавление полисахаридного конъюгатного антигена NmB [см., например, Constantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698] давало превосходные результаты.

Бактерицидные активности этих комбинаций показаны в следующей таблице:

Группа	Норвежская OMV	Антиген NmB*	Антиген NmC	Бактерицидная активность против штамма 2996 NmB
1	+	-	-	<4
2	+	#1	-	512
3	+	#2	-	>2048
4	+	#3	-	1024
5	+	#3	+	256
6	-	#3	-	2048
7	-	#3	+	2048
* Использовали три разных антигена NmB:

№1: ORF1 например, пример 77 из WO 99/24578 (см. также WO 99/55873)

№2: белок '287' например, фигура 21 из WO 99/57280 (также SEQ ID NO:3103-3108)

№3: смесь в Al(ОН)₃ #1, #2 и белка '919' (SEQ ID NO:14, как указано здесь; см. также фигуру 23 из WO 99/57280 и SEQ ID NO:3069-3074 там же).

Легко можно видеть, что неэффективность Норвежской вакцины против штамма 2996 (группа 1) может быть преодолена добавлением определенных антигенов из штамма 2996. Результаты с использованием белка '287' NmB являются особенно хорошими. Таким образом, Норвежская вакцина может быть улучшена без необходимости получения OMV из ряда различных штаммов.

Эта вакцина обеспечивает также защиту против гетерологичных штаммов МепВ. Те же самые вакцины, полученные с использованием белков штамма 2996, испытывали против пяти других штаммов. Титры были следующими:

Группа	2996	BZ133	BZ232	1000	МС58	NGH38
1	<4	-1024	<4	>2048	>2048	32
2	512	512	<4	>2048	>2048	256
3	4096	4096	256	1024	>2048	1024
4	1024	2048	<4	2048	>2048	64
5	256	>32000	<4	>2048	>2048	128
6	2048	2048	4	<4	64	4
7	2048	>32000	4	128	1024	128
Контроль*	32768	4096	8192	16384	16384	8192
* Контроли: штаммы 2996, BZ133 и 1000=OMV, приготовленные из гомологичного штамма; штамм BZ232=OMV, приготовленная из 2996; МС58 & NGH38=SEAM3.

Второе испытание "Норвежских" OMV, дополненных белками из штамма 2996 NmB:

- белок 919, экспрессируемый в Е. coli без слитого партнера

- ORF1, экспрессируемый в Е. coli в виде His-слитого белка

- белок 287, экспрессируемый в виде GST-слитого белка

- смесь этих трех белков, необязательно с NmC-конъюгатом

Препараты объединяли с адъювантом Al(ОН)з и испытывали против гомологичного штамма с использованием бактерицидного анализа. Результаты были следующими:

	NmB			NmC
Антиген	2996	NGH38	394/98	С11	BZ133
ОМУ	<4	32	1024*	<4	1024
+919	<4	<4	4	<4	512
+ORF1	512	256	2048	4096	512
+287	4096	1024	1024	512	4096
+mix	1024	64	4	64	2048
+mix +NmC	256	128	2048	64000	>32000
* антитела были бактериостатическими, а не бактерицидными

Дополнительное исследование с антигеном 287

Комбинации Норвежских OMV с антигеном 287 исследовали дополнительно. 20 мкг антигена 287 объединяли с Норвежской вакциной ОМР (15 мкг ОМР + Al(ОН)₃) и использовали "для иммунизации мышей. Эти антитела испытывали в бактерицидном анализе, и они были эффективными против всех испытанных штаммов. Результаты были следующими:

	NmB							NmA	NmC
Антиген	2996	BZ133	BZ23A	1000	МС58	NGH38	NZ	F6124	С11
CMV	<4	1024	<4	>2048	32768	32	<4	-	-
287	8000	4096	256	<4	512	2048	1024	1024	2048
OMV+ 287	4096	4096	256	1024	4096	1024	1024	-	-

Таким образом, почти во всех случаях комбинация OMV + белок 287 неожиданно дает лучшие результаты, чем одна OMV.

Рекомбинантные ОМУ

Е.coli трансформировали для экспрессии ORF1, ORF40 и ORF46. OMV, полученные из рекомбинантной Е.coli, были способны индуцировать бактерицидные антитела против N. meningitidis.

ORF1, ORF40 и ORF46 (штамм 2996) экспрессировали в виде His-меченых слияний в Е.coli и получали либо в виде чистых белков либо в форме OMV. Бактерицидные титры против обоих препаратов испытывали с использованием штамма 2996 в качестве антигенной стимуляции:

Антиген	ORF1	ORF40	ORF46
Очищенный	64	2048	16000
ОМУ	1024	256	128000

Измеряли также бактерицидные титры с использованием гетерологичных штаммов для антигенной стимуляции. ORF46 дает титр 4096 против штамма МС58 в чистой форме, но титр повышается до 32000 при предоставлении в форме OMV. ORF1 дает титр 128 против штамма F6124 NmA в чистом форме, но он повышается до 512 при использовании в форме OMV. ORF40 дает титр 512 против штамма МС58 в чистой форме, но этот результат удваивается при использовании его в форме OMV.

Эти данные показывают, что антигены NmB сохраняют иммуногенность при получении в Е. coli в виде OMV и, кроме того, что иммуногенность может быть действительно повышена.

Должно быть понятно, что данная заявка описывает изобретение только посредством примера, и могут быть произведены модификации, которые будут оставаться в пределах притязаний и сути данного изобретения.

Claims

1. Композиция для индуцирования иммунного ответа, содержащая (а) везикулы наружной мембраны из N. meningitidis серологической группы В и (b) иммуногенный компонент, содержащий

(i) аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

MFKRSVIAMACIFPLSACGGGGCGSPDVKSADTPSKPAAPVVAENAGEGVLPKEKKDEEAAGGAPQADTQDATAGEGSQDMAAVSAENTGNGGAATTDNPKNEDAGAQNDMPQNAAESANQTGNNQPAGSSDSAPASNPAPANGGSDFGRTNVGNSVVIDGPSQNTLTHCKGDSCNGDNLLDEEAPSKSEFEKLSDEEKIKRYKKDEQRENFVGLVADRVKKDGTNKYIIFYTDKPPTRSARSRRSLPAEIPLLPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLVGTAVYNGEVLHFHMENGRPYPSGGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSGRFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKDRD,

MFKRSVIAMACIFALSACGGGGGGSPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAVSEENTGNGGAVTADNPKNEDEVAQNDMPQNAAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANAADGMQGDDPSAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSDPIPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVYNGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGSGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQD

и

MFKRSVLAMACIVALSACGGGGGGSPDVKSADTLSKPAAPVVTEDVGEEVLPKEKKDEEAVSGAPQADTQDATAGKGGQDMAAVSAENTGNGGAATTDNPENKDEGPQNDMPQNAADTDSSTPNHTPAPNMPTRDMGNQAPDAGESAQPANQPDMANAADGMQGDDPSAGENAGNTADQAANQAENNQVGGSQNPASSTNPNATNGGSDFGRINVANGIKLDSGSENVTLTHCKDKVCDRDFLDEEAPPKSEFEKLSDEEKINKYKKDEQRENFVGLVADRVEKNGTNKYVIIYKDKSASSSSARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNlFAPEGNYRYLTYGAEKLSGGSYALSVQGEPAKGEMLAGTAVYNGEVLHFHMENGRPSPSGGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAVIDGNGFKGTWTENGGGDVSGRFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQD.

(ii) иммуногенный фрагмент (i) из 10 или более аминокислот и/или

(iii) аминокислотная последовательность, имеющая идентичность по отношению к (i), равную 70% или выше.

2. Композиция по п.1, где компонент (b) включает в себя белок из штамма N. meningitidis, отличающегося от штамма, из которого получен компонент (а).

3. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где везикулы наружной мембраны (OMV) представляют собой дезоксихолатный экстракт из N. meningitidis.

4. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где один или несколько из ее компонентов адсорбированы на Al(ОН)₃.

5. Композиция по п.4, где компонент (а) адсорбирован на Al(ОН)₃.

6. Композиция по любому предыдущему пункту, дополнительно содержащая один или несколько из следующих компонентов:

защитный антиген против Neisseria meningitidis серологической группы А;

защитный антиген против Neisseria meningitidis серологической группы С;

защитный антиген против Neisseria meningitidis серологической группы Y;

защитный антиген против Neisseria meningitidis серологической группы W;

защитный антиген против Haemophilus influenzae;

защитный антиген против Pneumococcus;

защитный антиген против дифтерии;

защитный антиген против столбняка;

защитный антиген против коклюша;

защитный антиген против Helicobacter pylori;

защитный антиген против полиомиелита и/или

защитный антиген против вируса гепатита В.

7. Композиция по любому предыдущему пункту, где композиция представляет собой вакцину.

8. Композиция по любому предыдущему пункту для применения в качестве лекарственного средства.

9. Способ лечения пациента, предусматривающий введение этому пациенту терапевтически эффективного количества композиции, индуцирующей иммунный ответ, по любому из пп.1-8.