ES2588917T3 - Vacuna de VME suplementada contra meningococo - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende (a) una preparación de membrana externa del serogrupo B de N. meningitidis y (b) un componente inmunogénico que comprende una proteína que comprende: (i) SEC ID Nº 2944 como se divulga en el documento WO99/57280, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene más de un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2944 como se divulga en el documento WO99/57280, en el que la SEQ ID NO: 2944 del documento WO99/57280 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:**Fórmula**

Description

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Los medios para la regeneración varían de una especie otra de plantas, pero generalmente, se proporciona en primer lugar una suspensión de protoplastos transformados que contienen copias del gen heterólogo. Se forma el tejido del callo y se pueden inducir brotes a partir del callo y posteriormente enraizarse. Como alternativa, se puede inducir la formación del embrión a partir de la suspensión de protoplastos. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo contendrán generalmente algunos aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citocinas. Es también ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y alfalfa. Los brotes y las raíces se desarrollan normalmente de manera simultánea. La regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo y del historial del cultivo. Si se controlan estas tres variables, la regeneración es completamente reproducible y repetible.

En algunos sistemas de cultivo de células vegetales, se puede excretar la proteína deseada de la invención o, como alternativa, se puede extraer la proteína de la planta completa. Cuando se secreta la proteína deseada de la invención en el medio, se puede recoger. Como alternativa, los embriones y las semillas sin medio embrión u otros tejidos de la planta se pueden alterar mecánicamente para liberar cualquier proteína secretada entre las células y los tejidos. Se puede suspender la mezcla en una solución tampón para recuperar las proteínas solubles. A continuación, se usarán procedimientos convencionales de aislamiento y purificación de proteínas para purificar la proteína recombinante. Se ajustarán los parámetros de tiempo, temperatura, pH, oxígeno y los volúmenes mediante procedimientos rutinarios para optimizar la expresión y la recuperación de la proteína heteróloga.

iv. Sistemas bacterianos

En la técnica se conocen técnicas de expresión en bacterias. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unir la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción posterior (3’) de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que normalmente está proximal al extremo 5’ de la secuencia de codificación. Esta región de iniciación de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión para la ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano puede también tener un segundo dominio denominado operador que puede solaparse con un sitio de unión a la ARN polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción negativa regulada (inducible), ya que una proteína represora génica se puede unir al operador y, de este modo, inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva se puede producir en ausencia de elementos reguladores negativos, tal como el operador. Además, la regulación positiva se puede conseguir con una secuencia de unión a una proteína activadora génica, que, si está presente, normalmente está proximal (5’) a la secuencia de unión de la ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora génica es la proteína activadora de catabolitos (CAP), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud y col. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. Por tanto, la expresión regulada puede ser positiva o negativa, de modo que potencia o reduce la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de la vía metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas del metabolismo del azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang y col. (1977) Nature 198:1056], y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas, tales como triptófano [Goeddel y col. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton y col. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; patente de EE.UU. 4.738.921; documento EP-A-0036776 y documento EP-A-0121775]. El sistema promotor de la β-lactamasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." en Interferon 3 (ed.1. Gresser)], los sistemas promotores del bacteriófago lambda PL [Shimatake y col. (1981) Nature 292:128] y T5 [patente de EE.UU. 4.689.406] también proporcionan secuencias promotoras útiles.

Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o de bacteriófago se pueden unir con las secuencias operones de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, lo que crea un promotor híbrido sintético [patente de EE.UU. 4.551.433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor híbrido trplac compuesto por el promotor trp y las secuencias del operón lac, que está regulado por el represor lac [Amann y col. (1983) Gene 25:167; de Boer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores naturales de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unir la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor natural de origen no bacteriano también se puede acoplar a una ARN polimerasa compatible para producir niveles altos de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema promotor/ARN polimerasa del bacteriófago T7 es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier y col. (1986)

J. Mol. Biol. 189:113; Tabor y col. (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Además, un promotor híbrido también puede estar compuesto por un promotor de bacteriófago y una región operador de E. coli (EPO-A-267.851).

Además de una secuencia promotora funcionante, un sitio de unión al ribosoma eficiente también es útil para la expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli, el sitio de unión al ribosoma se denomina secuencia de Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos antes del codón de iniciación [Shine y col., (1975) Nature 254:34]. Se piensa que la secuencia SD estimula la unión del ARNm al ribosoma mediante el apareamiento de las bases entre la secuencia SD y el extremo 3’ y del ARNr 16S de E. coli [Steitz y col. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." en Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)]. Para

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expresar genes eucarióticas y genes procarióticas con un sitio de unión al ribosoma débil [Sambrook y col. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." en Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Una molécula de ADN se puede expresar intracelularmente. Una secuencia promotora puede estar unida directamente a la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N siempre será una metionina, que está codificada por el codón de iniciación ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o in vitro con una metionina N-terminal peptidasa bacteriana (documento EP-A-0219237).

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para dirigir la expresión. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se fusiona al extremo 5' de las secuencias de codificación heterólogas. Tras la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, se puede unir el gen celular del bacteriófago lambda en el extremo 5' de un gen extraño y expresarse en la bacteria. La proteína de fusión resultante retiene, preferentemente, un sitio para una enzima de procesamiento (factor Xa) para escindir la proteína del bacteriófago del gen extraño [Nagai y col., (1984) Nature 309:810]. Las proteínas de fusión también se pueden preparar con secuencias del lacZ [Jia y col., (1987) Gene 60:197], trpE [Allen y col., (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff y col., (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11], y Chey [EP–A–0 324 647] y los genes. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede codificar o no un lugar escindible. Otro ejemplo es la proteína de fusión con ubiquitina. Dicha proteína de condensación se prepara con la región de la ubiquitina que retiene, preferentemente, un sitio para un enzima de procesamiento (por ejemplo, la proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina procedente de la proteína extraña. Mediante este procedimiento, se puede aislar la proteína extraña natural [Miller y col., (1989) Bio/Technology 7:698].

Como alternativa, también se pueden secretar proteínas extrañas desde la célula al medio crecimiento creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de la secuencia del péptido señal que proporciona la secreción de la proteína extraña en bacterias [patente de Estados Unidos 4.336.336]. El fragmento de la secuencia señal codifica normalmente un péptido señal comprendido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. La proteína se secreta tanto en los medios de crecimiento (bacterias grampositivas) como en el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la célula (bacterias gramnegativas). Preferentemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento del péptido señal y el gen extraño que se pueden escindir tanto in vivo como in vitro. Se puede derivar el ADN que codifica las secuencias señal adecuadas a partir de genes para proteínas bacterianas secretadas, tal como el gen de la proteína de la membrana externa de E. coli (ompA) [Masui y col., (1983), en: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb y col., (1984) EMBO J. 3:2437] y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) [Oka y col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212]. Como ejemplo adicional, se puede usar la secuencia señal del gen de la alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus para secretar las proteínas heterólogas de B. subtilis [Palva y col., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. Documento USA 79:5582; documento EP–A–0 244 042].

Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras localizadas en 3’ del codón de terminación de la traducción y, por tanto, junto con promotor que flanquea la secuencia de codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen con frecuencia secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de tipo bucle en tallo que ayudan a terminar la transcripción. Ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli, así como otros genes biosintéticos.

Normalmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, una secuencia señal (si se desea), la secuencia de codificación de interés y la secuencia de terminación de la transcripción, se introducen en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces del mantenimiento estable en un huésped, como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, de modo que le permite mantenerse en un huésped procariota para la expresión o para clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido con un número alto o bajo de copias. Generalmente, un plásmido con un número alto de copias tendrá un número de copias que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 y, normalmente, de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de número alto de copias contendrá, preferentemente, al menos aproximadamente 10 y, más preferentemente, al menos aproximadamente 20 plásmidos. Se puede seleccionar un vector de número alto o bajo de copias, en función del efecto del vector y la proteína extraña del huésped.

Como alternativa, las construcciones de expresión se pueden integrar en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración normalmente contienen al menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con ADN de varias cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (documento EP-A-0127328). Los vectores de integración también pueden estar compuestos del bacteriófago o las secuencias del transposón.

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Normalmente, las construcciones extracromosómicas y de la expresión de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que se han transformado. Los marcadores seleccionables se pueden expresar en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que hacen a la bacteria resistente a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, Eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina [Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Los marcadores seleccionables pueden también incluir genes biosintéticos, tales como los que están en las vías biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.

Como alternativa, algunos de los componentes descritos anteriormente se pueden introducir en vectores de transformación. Los vectores de transformación están comprendidos normalmente por un marcador seleccionable que se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, tal como se ha descrito anteriormente.

Los vectores de expresión y de transformación, bien replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para la transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, los vectores de expresión se han desarrollado para, entre otras, las bacterias siguientes: Bacillus subtilis [Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; documento EP-A-36.259 y documento EPA-63.953; documento WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake y col. (1981) Nature 292: 128; Amann y col., (1985) Gene 40:183; Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; documento EP–A–0 036 776,EP–A–0 136 829 y documento EP–A–0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell y col., (1988) Appl. Environ. Microbiol 54:655]; Streptococcus lividans-[Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [patente de Estados Unidos 4.745.056]. Los procedimientos para introducir ADN exógeno en huéspedes bacterianos son bien conocidos en la técnica y normalmente incluyen la transformación de bacterias tratadas con CaCb u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El ADN también se puede introducir en células bacterianas mediante electroporación. Normalmente los procedimientos de transformación varían con la especie bacteriana que se va a transformar. Véase, por ejemplo, [Masson y col. (1989) FEMS Microbio/. Lett. 60:273; Palva y col., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; documento EP-A-36.259 y documento EP-A-63.953; documento WO 84/04541, Bacillus], [Miller y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang y col. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter], [Cohen y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower y col., (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE 1–derived plasmids. en Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H. W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler y col. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin y col. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany y col. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, en: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry y col. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti y col. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus].

v. Expresión en levaduras

En la materia se conocen sistemas expresión en levaduras. Un promotor de levadura cualquier secuencia de ADN capaz de unir la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción en dirección 3’ (3’) de una secuencia de codificación (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que normalmente está proximal al extremo 5’ de la secuencia de codificación. Esta región de iniciación de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión para la ARN polimerasa (la “caja TATA”) y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor de levadura puede tener también un segundo dominio denominado secuencia activadora en dirección 5’ (UAS), que, si está presente, normalmente está distal al gen estructural. La UAS permite la expresión regulada (inducible). La expresión constitutiva se produce en ausencia de una UAS. La expresión regulada puede ser positiva o negativa, de modo que potencia o reduce la transcripción.

La levadura es un organismo fermentador con una ruta metabólica activa, por tanto, las secuencias que codifican enzimas en la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen alcohol deshidrogenada (ADH) (documento EP-A-0284 044), enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfoglicerato mutasa y piruvato quinasa (PyK) (documento EPO-A-0 329 203). El gen PH05 de levadura, que codifica la fosfatasa ácida, proporciona también secuencias promotoras útiles [Myanohara y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1].

Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también funcionan como promotores de levadura. Por ejemplo, las secuencias UAS de un promotor de levadura se pueden unir con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de dichos promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de ADH unida a la región de activación de la transcripción GAP (patentes de Estados Unidos n.º 4.876.197 y 4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que están constituidos por secuencias reguladoras de cualquiera de los genes ADH2, GAL4, GAL10, OR PHO5, combinados con la región de activación transcripcional de un gen de enzima glicolítica tal como GAP o PyK (documento EP–A–0 164 556). Además, un promotor de levadura puede incluir promotores naturales cuyo origen no es de levadura, que tienen la capacidad de unir la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Los ejemplos de dichos promotores incluyen, entre otros, [Cohen y col., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff y col., (1981) Nature 283:835; Hollenberg y col., (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg y col., (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," en:

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técnica, que, para los objetivos de esta invención, se consideran equivalentes a la inmunización in vivo. Se obtienen antisueros policlonales mediante la extracción de sangre del animal inmunizado en un recipiente de vidrio o plástico, incubando la sangre a 25 ºC durante una hora, seguido de incubación a 4 ºC durante 2-18 horas. El suero mediante se recupera mediante centrifugación (por ejemplo, 1.000 g durante 10 minutos). Se pueden obtener aproximadamente 20-50 ml por extracción de sangre de los conejos.

Los anticuerpos monoclonales se preparan usando el método estándar de Kohler-Milstein [Nature (1975) 256:495– 96], o una modificación del mismo. Normalmente, se inmuniza un ratón o rata tal como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en lugar de obtener sangre del animal para extraer el suero, se extirpa el bazo (y opcionalmente algunos ganglios linfáticos grandes) y se separa en células únicas. Si se desea, se pueden cribar las células de bazo (tras la retirada de las células adherentes no específicas) aplicando una suspensión celular a una placa o bien recubierta con el antígeno de la proteína. Las células B que expresan inmunoglobulina unida a membrana específica del antígeno se unen a la placa y no se eliminan mediante lavado con el resto de la suspensión. A continuación se induce la fusión de las células B resultantes, o todas las células de bazo disociadas, con las células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio de hipoxantina, aminopterina, timidita, "HAT"). Los hibridomas resultantes se siembran en placas mediante dilución limitante y se analiza la producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno inmunizante (y que no se unen a antígenos no relacionados). Los hibridomas que secretan AcMo seleccionados se cultivan a continuación tanto in vitro (por ejemplo, en botellas de cultivo de tejido o reactores de fibra hueca) como in vivo (como ascitis en ratones).

Si se desea, se pueden marcar los anticuerpos (tanto policlonales como monoclonales) usando técnicas convencionales. Los marcadores adecuados incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos (particularmente 32P y 125I), reactivos densos para los electrones, enzimas y ligandos que tienen compañeros de unión específicos Las enzimas normalmente se detectan por su actividad. Por ejemplo, normalmente la peroxidasa de rábano se detecta por su capacidad para convertir la 3,3',5,5'–tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento azul cuantificable con un espectrofotómetro. "Compañero de unión específico" se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula ligando con elevada especificidad, como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico del anterior. Otros compañeros de unión específicos incluyen biotina y avidina o estreptavidina, lgG y proteína A, y las numerosas parejas receptor-ligando conocidas en la técnica. Debe entenderse que con la descripción anterior no se pretende clasificar los diversos marcadores en distintos tipos, ya que el mismo marcador puede servir de diversos modos diferentes. Por ejemplo, 125I puede servir como marcador radiactivo o como reactivo denso a los electrones. El HRP puede servir como enzima o como antígeno para un AcMo. Además, se pueden combinar diversos marcadores para el efecto deseado. Por ejemplo, los AcMo y avidina requieren también marcadores en la práctica de la presente invención. Por tanto, se puede marcar un AcMo con biotina y detectar su presencia con avidina marcada con 125I o con un AcMo anti-biotina marcado con HRP.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender polipéptidos, anticuerpos o ácido nucleico. Las composiciones farmacéuticas comprenderán una cantidad terapéuticamente efectiva de polipéptidos, anticuerpos o polinucleótidos.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar o evitar una enfermedad o dolencia deseada, o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. Se puede detectar el efecto mediante, por ejemplo, marcadores químicos o niveles de antígenos. Los efectos terapéuticos incluyen también la reducción de los síntomas físicos, tal como la disminución de la temperatura corporal. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del tamaño y la salud del sujeto, la naturaleza y duración de la dolencia, y el tratamiento terapéutico o combinación de tratamientos terapéuticos seleccionados para la administración. De esta manera, no es útil especificar una cantidad eficaz exacta por adelantado. Sin embargo, la cantidad eficaz para una situación dada se puede determinar mediante experimentación rutinaria y está dentro del juicio del médico especialista

Para los objetivos de la presente invención, una dosis eficaz estará entre aproximadamente 0, 01 mg/kg y 50 mg/kg

o entre 0,05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de las construcciones de ADN en el individuo al que se administra.

Una composición farmacéutica puede contener también un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo para la administración de un agente terapéutico, tal como anticuerpos o un polipéptido, genes y otros agentes terapéuticos. La expresión se refiere a cualquier vehículo farmacéutico que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales al individuo que recibe la composición, y que se pueda administrar sin toxicidad indebida. Vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes de metabolización lenta, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, y partículas de virus inactivos. Dichos vehículos son bien conocidos para los expertos en la materia.

En ellas también se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares, y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Se dispone de una exhaustiva discusión de excipientes

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farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Vehículos farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, en dichos vehículos también puede haber sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tampón del pH y similares. Normalmente, las composiciones terapéuticas se preparan en forma de inyectables, bien en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección. Los liposomas se incluyen dentro de la definición de vehículo farmacéuticamente aceptable.

Procedimientos de administración

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos que se van a tratar pueden ser animales, en particular, se puede tratar a sujetos humanos.

La administración directa de las composiciones se llevará a cabo generalmente mediante inyección, tanto por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, como administrada en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas (por ejemplo, véase el documento W098/20734), agujas, y pistolas génicas o hipopulverizadores. La posología del tratamiento puede ser un calendario de dosis única o un calendario de múltiples dosis.

Vacunas

Las vacunas comprenden antígeno o antígenos inmunizantes, inmunógenos, polipéptidos, proteínas o ácido nucleico, normalmente en combinación con "vehículos farmacéuticamente aceptables", que incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales en el individuo que recibe la composición. Normalmente, los transportadores adecuados son macromoléculas grandes que se metabolizan despacio, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas) y partículas víricas inactivas. Los expertos en la materia conocen bien dichos vehículos. Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes ("adyuvantes"). Adicionalmente, el antígeno o el inmunógeno se pueden conjugar con un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de los patógenos de la difteria, el tétano, el cólera,

H. pylori, etc. Los adyuvantes preferentes para potenciar la efectividad de la composición incluyen, pero no se limitan

a: (1) sales de aluminio (alúmina), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc, (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos, tales como péptidos de muramilo (véase a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo, (a) MF59™ (documento W090/14837; capítulo 10 en Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell y Newman, Plenum Press 1995), que contiene 5 % de escualeno, 0,5 % de Tween 80 y 0,5 % de Span 85 (que opcionalmente contiene diversas cantidades de MTP–PE (véase más adelante), aunque no es necesario) formulado en partículas submicrónicas usando un microfluidificador tal como el microfluidificador de Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene 10 % de escualeno, 0,4 % de Tween 80, 5 % de polímero bloqueado con pluronic L121 y thr–MDP (véase más adelante) microfluidificado en una emulsión submicrónica o agitado en vórtex para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula y (c) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene 2 % de escualeno, 0,2 % de Tween 80, y se pueden usar uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en lípido de monofosforilo A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y el esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); (3) adyuvantes de saponina, tales como Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas con los mismos, tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (4) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (5) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL–1, IL–2, IL–4, IL–5, IL–6, IL–7, IL–12, etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulante de las colonias de macrófagos (M– CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc; y (6) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para potenciar la eficacia de la composición. Son preferentes la alúmina y MF59™.

Tal como se ha mencionado anteriormente, los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MOP), N-acetilmuramil-L -alanil-D-isoglutaminil-L -alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc. Las composiciones inmunógenas (por ejemplo, el antígeno inmunizante/inmunógeno/polipéptido/proteína/ácido nucleico, vehículo y adyuvante farmacéuticamente aceptables) contendrán normalmente diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras del pH, y similares.

Normalmente, las composiciones inmunógenas se preparan en forma de inyectables, bien en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas para potenciar el efecto adyuvante, tal y como se ha tratado en lo que antecede en vehículos farmacéuticamente aceptables.

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Kirsten, Virus del Sarcoma de Harvey y Rauscher (N.º en la ATCC VR-998) y Virus de la Leucemia Murina de Moloney (N.º en la ATCC VR-190). Se pueden obtener dichos retrovirus de depositarios o colecciones tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") en Rockville, Maryland, se pueden aislar de fuentes conocidas usando las técnicas disponibles habitualmente.

Entre los ejemplos de vectores de retrovirus para terapia génica que se pueden usar en la presente invención se incluyen los descritos en las solicitudes de patente GB2200651, EP0415731, EP0345242, EP0334301, WO89/02468; WO89/05349 WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, WO93/25698, WO93/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, US 5.219.740, US 4.405.712, US 4.861.719, US 4.980.289, US 4.777.127, US 5.591.624. Véase también Vile (1993) Cancer Res 53:3860–3864; Vile (1993) Cancer Res 53:962–967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993) 83–88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493–503; Baba (1993) J Neurosurg 79:729–735; Mann (1983) Cell 33:153; Cane (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6349; y Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

En la materia también se conocen vectores de adenovirus humanos para terapia génica y se pueden usar en la presente invención. Véase, por ejemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 y Rosenfeld (1991) Science 252:431 y WO93/07283, WO93/06223 y WO93/07282. Entre los ejemplos de vectores de adenovirus para terapia génica conocidos que se pueden usar en la presente invención incluyen los descritos en los documentos a los que se ha hecho referencia anteriormente y en los documentos WO94/12649, WO93/03769, WO93/19191, WO94/28938, WO95/11984 WO95/00655, WO95/27071, WO95/29993, WO95/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506 WO93/06223, WO94/24299, WO95/14102, WO95/24297, WO95/02697, WO94/28152, WO94/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, WO94/1892 y WO95/09654. Como alternativa, se puede usar la administración de ADN unido a adenovirus muertos como se describe en Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147–154. Los vehículos de administración de genes de la invención incluyen también vectores de virus asociados a adenovirus (AAV). Los ejemplos principales y preferentes de dichos vectores para su uso en la presente invención son los vectores basados en AAV-2 dados a conocer en Srivastava, documento W093/09239. Los vectores de AAV más preferentes comprenden las dos repeticiones terminales invertidas de AAV en las que las secuencias D nativas están modificadas por sustitución de nucleótidos, de tal manera que se retienen al menos 5 nucleótidos nativos y hasta 18 nucleótidos nativos, preferentemente al menos 10 nucleótidos nativos hasta 18 nucleótidos nativos, lo más preferentemente 10 nucleótidos nativos y los nucleótidos restantes de la secuencia D se eliminan o sustituyen con nucleótidos no nativos. Las secuencias D nativas de las repeticiones terminales invertidas de AAV son secuencias de 20 nucleótidos consecutivos en cada repetición terminal invertida de AAV (es decir, existe una secuencia en cada extremo) que no están implicadas en la formación de HP. El nucleótido de sustitución no nativo puede ser cualquier nucleótido diferente del nucleótido que se encuentra en la secuencia D nativa en la misma posición. Otros vectores de AAV de ejemplo que se pueden usar son pWP-19, pWN-1, ambos cuales se dan a conocer en Nahreini (1993) Gene 124:257–262. Otro ejemplo de dicho vector de AAV es psub201 (véase Samulski (1987) J. Virol. 61:3096). Otro vector de AAV de ejemplo es el vector ITR Doble–D. La construcción del vector ITR Doble D se divulga en la patente de Estados Unidos 5.478.745. Todavía otros vectores son los divulgados en Carter, patente de Estados Unidos 4.797.368 y Muzyczka, patente de Estados Unidos 5.139.941; Chartejee, patente de Estados Unidos 5.474.935, y Kotin, documento WO94/288157. Un ejemplo más adicional de un vector de AAV que se puede usar en la presente invención es SSV9AFABTKneo, que contiene el potenciador AFP y el promotor de la albúmina y dirige la expresión predominantemente en el hígado. Su estructura y su construcción se dan a conocer en Su (1996) Human Gene Therapy 7: 463-470. Se describen vectores de AAV para terapia génica adicionales en los documentos US 5.354.678, US 5.173.414, US 5.139.941, y US 5.252.479.

Los vectores para terapia génica de la invención incluyen también vectores del herpes. Los ejemplos principales y preferentes son vectores del virus del herpes simple que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de timidina cinasa, tales como los divulgados en los documentos US 5.288.641 y EP0176170 (Roizman). Ejemplos adicionales de vectores del virus del herpes simple incluyen HFEM/ICP6-LacZ, dado a conocer en el documento WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac descrito en Geller (1988) Science 241:1667–1669 y en el documento WO90/09441 y el documento WO92/07945, VHS Us3::pgC–lacZ descrito en Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11–19 and HSV 7134, 2 RH 105 y GAL4 descrito en EP 0453242 (Breakefield), y los depositados con la ATCC como números de acceso ATCC VR–977 y ATCC VR–260.

También se contemplan los vectores de alfavirus para terapia génica que se pueden emplear en la presente invención. Los vectores de alfavirus preferentes son los vectores de virus Sindbis. Togavirus, virus del bosque Semliki (ATCC VR–67; ATCC VR–1247), virus de Middleberg (ATCC VR–370), virus del río Ross (ATCC VR–373; ATCC VR–1246), virus de la encefalitis equina de Venezuela (ATCC VR923; ATCC VR–1250; ATCC VR–1249; ATCC VR–532), y los descritos en las patentes de Estados Unidos 5.091.309, 5.217.879, y el documento WO92/10578. Más particularmente, se pueden usar los vectores de alfavirus descritos en el n.º de serie, 08/405.627, presentado el 15 de marzo de 1995, los documentos WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, US 5.091.309 y US

5.217.879. Se pueden obtener dichos alfa virus de depositarios o colecciones tales como la ATCC en Rockville, Maryland, se pueden aislar de fuentes conocidas usando las técnicas disponibles habitualmente. Preferentemente, se usan vectores de alfavirus con citotoxicidad reducida (véase el documento USSN 081679640, disponible como documento de prioridad en el registro de la EPO para EP0907746).

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Los sistemas de vectores de ADN tales como los sistemas eucariotas de expresión en capas son también útiles para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Véase el documento WO95/07994 para una descripción detallada de los sistemas eucariotas de expresión en capas. Preferentemente, los sistemas eucariotas de expresión en capas de la invención derivan de vectores de alfavirus y, lo más preferentemente, de vectores de virus Sindbis.

Otros vectores víricos adecuados para su uso en la presente invención incluyen los derivados de poliovirus, por ejemplo ATCC VR–58 y los descritos en Evans, Nature 339 (1989) 385 y Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115; rinovirus, por ejemplo ATCC VR–1110 y los descritos en Arnold (1990) J Cell Biochem L401; poxvirus, tales como el virus de la viruela del canario o el virus vacunal, por ejemplo ATCC VR–111 y ATCC VR–2010 y los descritos en Fisher–Hoch (1989) Proc Natl Acad Sci 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; en los documentos US 4.603.112 y US 4.769.330 y WO89/01973; virus SV40, por ejemplo ATCC VR–305 y los descritos en Mulligan (1979) Nature 277:108 y Madzak (1992) J Gen Virol 73:1533; virus de la gripe, por ejemplo, ATCC VR–797 y los virus de la gripe recombinantes fabricados con técnicas de genética inversa como se describe en el documento US 5.166.057 y en Enami (1990) Proc Natl Acad Sci 87:3802–3805; Enami & Palese (1991) J Virol 65:2711–2713 y Luytjes (1989) Cell 59:110, (véase también McMichael (1983) NEJ Med 309:13, y Yap (1978) Nature 273:238 y Nature (1979) 277:108); viirus de la inmunodeficiencia humana, como se describe en el documento EP–0386882 y en Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; virus del sarampión, por ejemplo ATCC VR–67 y VR–1247 y los descritos en el documento EP–0440219; virus Aura, por ejemplo, ATCC VR–368; virus Bebaru, por ejemplo ATCC VR–600 y ATCC VR–1240; virus Cabassou, por ejemplo ATCC VR–922; Chikungunya virus, por ejemplo ATCC VR–64 y ATCC VR–1241; virus de Fort Morgan, por ejemplo, ATCC VR–924; virus Getah, por ejemplo ATCC VR–369 y ATCC VR–1243; virus de Kyzylagach, por ejemplo ATCC VR–927; virus de Mayaro, por ejemplo ATCC VR–66; virus de Mucambo, por ejemplo ATCC VR–580 y ATCC VR–1244; virus Ndumu, por ejemplo ATCC VR–371; virus Pixuna, por ejemplo ATCC VR–372 y ATCC VR–1245; virus Tonate, por ejemplo ATCC VR–925; virus Triniti, por ejemplo ATCC VR–469; virus Una, por ejemplo ATCC VR–374; virus Whataroa, por ejemplo ATCC VR–926; virus Y–62–33, por ejemplo ATCC VR–375; virus de O'Nyong, virus de la encefalitis oriental, por ejemplo ATCC VR– 65 y ATCC VR–1242; virus de la encefalitis occidental, por ejemplo ATCC VR–70, ATCC VR–1251, ATCC VR–622 y ATCC VR–1252; y coronavirus, por ejemplo ATCC VR–740 y los descritos en Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med

121:190.

La administración de las composiciones de la presente invención en células no se limita a los vectores víricos mencionados anteriormente. Se pueden emplear otros procedimientos y medios de administración tales como, por ejemplo, vectores de expresión de ácidos nucleicos, ADN condensado policatiónico unido o no unido a solo adenovirus muertos, por ejemplo, véanse los documentos US con n.º de serie 08/366.787, presentado el 30 de diciembre de 1994 y Curiel (1992) Hum Gene Ther 3. 147-154, ADN unido a ligando, por ejemplo, véase Wu (1989) J Biol Chem 264: 16985-16987, vehículos de administración de células eucariotas, por ejemplo, véase el documento US con n.º de serie 081240.030, presentado el 9 de mayo de 1994, y el documento US con nº de serie 08/404.796, depósito de materiales de hidrogel fotopolimerizados, pistola manual de partículas de transferencia génica, tal como se describe en la patente de Estados Unidos 5.149.655, radiación ionizante, tal como se describe en el documento US 5.206.152 y en el documento W092/11 033, neutralización o fusión de carga nucleica con membranas celulares. Se describen abordajes adicionales en Philip (1994) Mol Cell Biol 14:2411–2418 y en Woffendin (1994) Proc Natl Acad Sci 91:1581–1585.

Se puede emplear la transferencia génica mediada por partículas, por ejemplo, véase el documento US con n. de serie 60/023.867. Brevemente, se puede insertar la secuencia en vectores convencionales que contienen secuencias control convencionales para un nivel de expresión elevado y, a continuación, se puede incubar con moléculas sintéticas de transferencia génica tales como cationes poliméricos de unión al ADN del tipo polilisina, protamina, y albúmina, unidos a ligandos dirigidos a células tales como asialoorosomucoides, tal como se describe en Wu y Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429–4432, insulina como se describe en Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253–263, galactosa como se describe en Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:533–539, lactosa o transferrina. También se puede utilizar ADN desnudo. En el documento W090/11 092 y en el documento US. 5.580.859 se describen procedimientos de introducción de ADN desnudo de ejemplo. Se puede mejorar la eficacia de la captación usando perlas de látex biodegradables. Las perlas de látex recubiertas de ADN se transportan eficazmente en las células tras el inicio de la endocitosis por las perlas. Se puede mejorar más el procedimiento mediante tratamiento de las perlas para aumentar la hidrofobicidad y, de este modo, facilitar la alteración del endosoma y la liberación del ADN en el citoplasma.

Los liposomas que pueden actuar como vehículos de liberación de genes se describen en los documentos US 5.422.120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 y EP–524.968. Tal como se describe en el documento USSN. 60/023.867 (disponible como documento de prioridad en el registro de la EPO para EP0941122), sobre la administración no vírica, las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido se pueden insertar en vectores convencionales que contienen secuencias control convencionales para un nivel de expresión elevado, y, a continuación, se pueden incubar con moléculas sintéticas de transferencia de genes, tales como cationes poliméricos de unión a ADN como polilisina, protamina y albúmina, unidos a ligandos que se dirigen a células tales como asialoorosomucoides, insulina, galactosa, lactosa o transferrina. Otros sistemas de administración incluyen el uso de liposomas para encapsular el ADN que comprende el gen bajo el control de diversos promotores específicos de tejidos o activos ubicuamente. Además, la administración no vírica adecuada para su uso incluye sistemas de administración mecánica, tal como el abordaje descrito en Woffendin y col., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

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91(24):11581–11585.

Además, la secuencia de codificación y el producto de expresión de la misma se pueden administrar mediante deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizados. Otros procedimientos convencionales para la administración de genes que se pueden usar para la administración de la secuencia de codificación incluyen, por ejemplo, el uso de pistola manual de transferencia génica, tal como se describe en el documento US 5. 149.655; uso de radiación ionizante para la activación del gen transferido, tal como se describe en los documentos US 5.206.152 y WO92/11033.

Los liposomas y los vehículos de administración de genes policatiónicos de ejemplo son los descritos en los documentos US 5.422.120 y 4.762.915; en los documentos WO 95/13796; WO94/23697; y WO91/14445: en el documento EP–0524968; y en Stryer, Biochemistry, páginas 236–240 (1975) W. H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol

149: 119; Wang (1987) Proc Natl Acad Sci 84: 7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.

Una composición de polinucleótidos puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un vehículo de terapia génica, tal como se ha definido la expresión anteriormente. Para los objetivos de la presente invención, una dosis eficaz estará entre aproximadamente 0, 01 mg/kg y 50 mg/kg o entre 0,05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de las construcciones de ADN en el individuo al que se administra.

Procedimientos de administración

Una vez formuladas, las composiciones de polinucleótidos de la invención se pueden administrar (1) directamente al sujeto, (2) administrarse ex vivo, a las células derivadas procedentes del sujeto, o (3) in vitro para la expresión de proteínas recombinantes. Los sujetos que se van a tratar pueden ser mamíferos o aves. Asimismo, se pueden tratar seres humanos.

La administración directa de las composiciones se llevará a cabo generalmente mediante inyección, tanto por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, como administrada en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas (por ejemplo, véase el documento W098/20734), agujas, y pistolas génicas o hipopulverizadores. La posología del tratamiento puede ser un calendario de dosis única o un calendario de múltiples dosis. En la materia se conoce procedimientos para la administración y reimplante ex vivo de células transformadas en un sujeto y se describen en, por ejemplo, el documento W093/14778. Los ejemplos de células útiles en aplicaciones ex vivo incluyen, por ejemplo, células madre, particularmente hematopoyéticas, células linfoides, macrófagos, células dendríticas, o células tumorales.

Generalmente, se puede llevar a cabo la administración de ácidos nucleicos para aplicaciones ex vivo e in vitro mediante los siguientes procedimientos, por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido o polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en núcleos, todos bien conocidos en la materia.

Composiciones farmacéuticas de polinucleótidos y polipéptidos

Además de los vehículos y sales farmacéuticamente aceptables descritos anteriormente, se pueden usar los siguientes agentes adicionales con las composiciones de polinucleótidos y/o polipéptidos.

A. Polipéptidos

Un ejemplo son los polipéptidos que incluyen, sin limitación: asioloorosomucoides (ASOR), transferrina; asialoglicoproteínas; anticuerpos; fragmentos de anticuerpos, ferritina; interleucinas, interferones, factor estimulante de las colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de las colonias de macrófagos (M-CSF), factor de células madre y eritropoyetina. También ee pueden usar antígenos víricos, tales como proteínas de la cubierta. Asimismo, las proteínas de otros organismos invasivos, tales como el péptido de 17 aminoácidos de la proteína del circumsporozoíto de Plasmodium falciparum conocido como Rll.

B. Hormonas, vitaminas, etc.

Otros grupos que se pueden incluir son, por ejemplo: hormonas, esteroides, andrógenos, estrógenos, hormona tiroidea, o vitaminas, ácido fólico.

C. Polialquilenos, polisacáridos, etc.

Asimismo, se puede incluir polialquilenglicol con los polinucleótidos/polipéptidos deseados. En una forma de realización preferente, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Adicionalmente, se pueden incluir monosacáridos, disacáridos o polisacáridos. En una realización de este aspecto, el polisacárido es dextrano o DEAE-dextrano. También, quitosán y poli(láctido-co-glicólido).

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unión al polinucleótido.

Las lipoproteínas de origen natural se pueden aislar de suero mediante ultracentrifugación, por ejemplo. Dichos procedimientos se describen en Meth. Enzymol. (citado anteriormente); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454–5460 y Mahey (1979) J Clin. Invest 64:743–750. Las lipoproteínas también se pueden producir mediante procedimientos in vitro o recombinantes mediante la expresión de los genes de apoproteína en una célula huésped deseada. Véase, por ejemplo, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15:403 y Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30: 443. Las lipoproteínas también se pueden adquirir en suministradores comerciales, tales como Biomedical Technologies, Inc.,

Stoughton, Massachusetts, EE.UU. Zuckermann y col. WO98/06437.

Se puede encontrar una descripción adicional de las lipoproteínas en

F. Agentes policatiónicos

Los agentes policatiónicos se pueden incluir con polinucleótido/polipéptido deseado que se va a administrar.

o sin lipoproteína, en una com posición con el

Los agentes policatiónicos presentan, normalmente, una carga neta positiva a pH fisiológicamente relevante y son capaces de neutralizar la carga eléctrica de los ácidos nucleicos para facilitar la administración en una localización deseada. Estos agentes tienen aplicaciones in vitro, ex vivo, e in vivo. Los agentes policatiónicos se pueden usar para administrar ácidos nucleicos a un sujeto vivo por vía intramuscular, subcutánea, etc.

Los siguientes son ejemplos de polipéptidos útiles como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina, poliornitina y protamina. Otros ejemplos incluyen histonas, protaminas, seroalbúmina humana, proteínas de unión al ADN, proteínas cromosómicas no histónicas, proteínas de recubrimiento de virus de ADN, tales como (X174, los factores de transcripción contienen también regiones que se unen al ADN y, por tanto, pueden ser útiles como agentes de condensación de ácidos nucleicos. Brevemente, los factores de transcripción tales como C/CEBP, c–jun, c–fos, AP– 1, AP–2, AP–3, CPF, Prot–1, Sp–1, Oct–1, Oct–2, CREP y TFIID contienen dominios básicos que se unen a las secuencias de ADN.

Los agentes policatiónicos orgánicos incluyen: espermina, espermidina y putrescina.

Las dimensiones y las propiedades físicas de un agente policatiónico se pueden extrapolar a partir de la lista anterior, para construir otros agentes policatiónicos polipéptidicos o para producir agentes policatiónicos sintéticos.

Los agentes policatiónicos sintéticos que son útiles incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno. Lipofectin™ y Lipofectamine™ son monómeros que forman complejos policatiónicos cuando se combinan con polinucleótidos/polipéptidos.

Ensayos inmunodiagnósticos

Los antígenos de Neisseria de la invención se pueden usar en inmunoensayos para detectar los niveles de anticuerpos (o, al contrario, se pueden usar anticuerpos contra Neisseria para detectar los niveles de antígeno). Se pueden desarrollar inmunoensayos basados en antígenos recombinantes bien definidos para sustituir procedimientos diagnósticos invasivos. Se pueden detectar anticuerpos contra proteínas de Neisseria comprendidas dentro de las muestras biológicas, incluyendo, por ejemplo, muestras de sangre o suero. El diseño de los inmunoensayos está sujeto a un grado de variación considerable y en la materia se conocen diversos de estos. Los protocolos para el inmunoensayo pueden basarse en, por ejemplo, competición, o reacción directa, o ensayos de tipo sándwich. Los protocolos pueden usar también, por ejemplo, soportes sólidos o pueden ser mediante inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos implican el uso de anticuerpos o polipéptidos marcados; los marcadores pueden ser, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o colorantes. También se conocen ensayos amplifican las señales de la sonda, ejemplos de los cuales son los ensayos que usan biotina y avidina, e inmunoensayos marcados y mediados por enzimas, tales como ensayos ELISA.

Los kits adecuados para el inmunodiagnóstico y que contienen los reactivos marcados apropiados se construyen mediante el empaquetamiento de los materiales apropiados, incluyendo las composiciones de la invención, en recipientes adecuados, junto con los reactivos y materiales restantes (por ejemplo, tampones adecuados, soluciones salinas, etc.) requeridos para la realización del ensayo, así como el conjunto adecuado de instrucciones del ensayo.

Hibridación de ácido nucleico

"Hibridación" se refiere a la asociación de dos secuencias de ácido nucleico entre sí mediante puentes de hidrógeno. Normalmente, se fijará una secuencia a un soporte sólido y la otra estará libre en la solución. A continuación, se pondrán en contacto las dos secuencias entre sí en condiciones que favorezcan los puentes de hidrógeno. Los factores que afectan a esta unión incluyen: el tipo y el volumen del disolvente; la temperatura de reacción; el tiempo de hibridación; la agitación, los agentes que bloquean la unión no específica de la secuencia de la fase líquida con el soporte sólido (reactivo de Denhard o BLOTTO); la concentración de las secuencias; el uso de compuestos para aumentar la velocidad de asociación de las secuencias (sulfato de dextrano o polietilenglicol); y la rigurosidad de las condiciones de lavado tras la hibridación. Véase Sambrook y col., [citado anteriormente] Volumen 2, capítulo 9,

Claims (1)

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