MXPA02000463A

MXPA02000463A - Peptidos antigenicos de meningoccocos.

Info

Publication number: MXPA02000463A
Application number: MXPA02000463A
Authority: MX
Inventors: Vega Masignani
Original assignee: Chiron Spa
Priority date: 1999-07-14
Filing date: 2000-07-13
Publication date: 2002-07-02
Also published as: CA2378547A1; DE60039050D1; JP2011142915A; BR0012424A; EP1196587B1; CA2801979A1; WO2001004316A3; WO2001004316A2; CN1373805A; ATE397068T1; CN1590404A; AU5839300A; EP1935979A3; EP1935979A2; JP2003504062A; EP1196587A2; JP2013078340A; RU2002103604A; RU2253678C2; GB9916529D0

Abstract

La WO 99/36544 describe un gran numero de proteinas .de Neisseria Mengitidis. La presente invencion se refiere a fragmentos de esas proteinas que comprenden al menos un determinante antigenico. Se describen tambien las secuencias y proteinas homologas que comprenden estos fragmentos.

Description

PEPTIDQS ANTIGENICQS DE MENINGOCCOCQS Campo de la Invención. La invención se refiere a secuencias de péptidos antigénico de la bacteria Neisseria meningi tidis . Antecedentes de la Invención. La Neisseria meningi tidis es un diplococo gram negativo, sin movimiento, que es patogénico en humanos. Con base en el polisacárido capsular del organismo, se han identificado 12 serogrupos de N. meningi tidis . El grupo A es el patógeno más comúnmente implicado en la enfermedad epidémica en el África sub-sahariana. Los serogrupos B y C son responsables de la vasta mayoría de casos en los Estados Unidos y en la mayoría de los países desarrollados. Los serogrupos 135 e Y son responsables del resto de los casos en los Estados Unidos y los países desarrollados . La vacuna meningococal actualmente en uso, es una vacuna tetravalente de polisacáridos compuesta de los serogrupos A, C, Y, y W135. Sin embargo, el meningococo B queda como un problema. El polisacárido enfocado no puede usarse debido a que el polisacárido capsular menB es un polímero de ácido N-acetil neuramínico enlazado al a(2-8) que también está presente en el tejido mamífero. Un enfoque para la vacuna menB es el uso de proteínas de membrana exterior (OMP) para superar a las vacunas Ref: 135668 multivalentes, de variabilidad antigénica, que contiene hasta nueve diferentes porinas construidas [por ejemplo, Poolman JT (1992) .Infect. Angents Dis. 4:13-28]. Se han usado proteínas adicionales en vacunas de membrana exterior que tienen las proteínas opa y opc, pero ninguno de estos enfoques ha sido capaz de superar la variabilidad antigénica [por ejemplo, Ala'Aldeen & Borriello (1996) Vaccine 1 (1) : 49-53] . Descripción de la Invención. La invención proporciona fragmentos de las proteínas descritas en la solicitud de patente internacional W099/36544, en donde los fragmentos comprenden al menos una determinante antigénica. De esta manera, si la longitud de cualquier secuencia de proteína particular descrita en la W099/36544 es aminoácidos x (ver Tabla II), la presente invención proporciona fragmentos de la mayoría de los aminoácidos x-l de tal proteína. El fragmento puede ser más corto que esto (por ejemplo, x-2, x-3, x-4, ...), y preferiblemente es de 100 aminoácidos o menos (por ejemplo, 90 aminoácidos, 80 aminoácidos etc) . El fragmento puede ser tan corto como 3 aminoácidos, pero preferiblemente es más grande (por ejemplo, hasta 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, ó 100 aminoácidos).

Los fragmentos preferidos comprenden las secuencias de péptido meningococal descritas en la Tabla I, o las sub-secuencias de los mismos. Los fragmentos pueden tan grandes como aquellos dados en la Tabla I, por ejemplo, donde un fragmento en la Tabla I parte de un residuo de aminoácido p a un residuo q de una proteína, la invención también se refiere a fragmentos que parten del residuo (p-l), (p-2), ó (p-3) al residuo (q+1), (q+2), ó (q+3) . La invención también proporciona polipéptidos que son homólogos (esto es tienen secuencias idénticas) a estos fragmentos. Dependiendo del fragmento particular, el grado de identidad de secuencia es preferiblemente mayor al 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ó más) . Estos polipéptidos homólogos incluyen mutantes y variantes alélicas de los fragmentos. La identidad entre las dos secuencias se determina preferiblemente por el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , que usa una búsqueda de afinidad del espacio con parámetros penalización de apertura de espacio=12 y penalización de extensión de espacio=l. La invención también proporciona proteínas que comprenden uno o más de los fragmentos arriba definidos.

La invención se sujeta a la condición de que no se incluye dentro sus proteínas abarcadas que comprende cualesquiera de las 45 secuencias de proteína descritas en la 099/36544 (esto es, aún las SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 8, 10, , 86, 88, 90 de la 099/36511) . Las proteínas de la invención pueden, por supuesto, prepararse por varios medios (por ejemplo expresión recombinante, purificación del cultivo celular, síntesis química etc.) y en varias formas (por ejemplo nativas, fusiones C-terminal y/o N-terminal, etc) . Estas se preparan preferiblemente de forma substancialmente pura (esto es, substancialmente libres de otras proteínas de Neisseria o de células huésped) . Las proteínas cortas se producen preferiblemente usando síntesis química del péptido. De conformidad con un aspecto adicional, la invención proporciona anticuerpo que reconocen los fragmentos de la invención, con la condición de que la invención no incluye dentro de su alcance los anticuerpos que reconocen una de las 45 secuencias de proteína completas de la W099/36544. Los anticuerpos pueden ser policlonales o, preferiblemente, monoclonales, y pueden producirse por cualquier medio apropiado. La invención también proporciona proteínas que comprenden secuencias de péptido que se reconocen por estos anticuerpos. Estas secuencias de péptido, por supuesto, incluyen fragmentos de las proteínas de meningococos de la W099/36544, pero también incluyen péptidos que imitan la estructura antigénica de los péptidos de meningococos cuando se enlazan a la inmunoglobulina . De conformidad con un aspecto adicional, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica los fragmentos y las proteínas de la invención, con la condición de que la invención no incluye dentro de su alcance, el ácido nucleico que codifica una de las 45 secuencias de proteína de la 099/36544. Además, la invención proporciona el ácido nucleico que comprende secuencias homologas (esto es, que tienen una secuencia idéntica) a estas secuencias. Adicionalmente, la invención proporciona el ácido nucleico que puede hibridizarse a estas secuencias, preferiblemente bajo condiciones de "alta severidad" (por ejemplo, 65°C en O.lxSSC, una solución de SDS al 0.5%. Se apreciará que la invención proporciona el ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a aquellas descritas arriba (por ejemplo para propósitos de antisentido o prueba) . El ácido nucleico de la invención puede, por supuesto, prepararse de varias maneras (por ejemplo, por sintesis química, a partir de colecciones genómicas o de cADN, a partir de los organismos mismos, etc.) y pueden tomar varias formas (por ejemplo, de hebra simple, hebra doble, vectores, sondas, etc) . Además, el término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tales como aquellos que contienen columnas modificadas, y también péptidos de ácidos nucleicos (PNA) etc. En consecuencia con un aspecto adicional, la invención proporciona vectores que comprende las secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo, vectores de expresión) y células huésped que transforman tales vectores. En consecuencia con un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden proteínas, anticuerpos y/o ácidos nucleicos de conformidad con la invención. Estas composiciones pueden ser apropiadas como vacunas, por ejemplo, o como reactivos de diagnóstico, o como composiciones inmunogénicas . La invención también proporciona ácidos nucleicos, proteínas, o anticuerpos de conformidad con la invención, para usarse como medicamentos (por ejemplo como vacunas o como composiciones inmunogénicas) o como reactivos de diagnóstico. También se proporciona el uso de ácidos nucleicos, proteínas o anticuerpos de conformidad con la invención, en la manufactura de: (i) un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección debida a la bacteria de Neisseria; (ii) un reactivo de diagnóstico para detectar la presencia de bacteria de Neisseria o de anticuerpos dirigidos contra la bacteria de Neisseria; y/o (iii) un reactivo que puede dirigir los anticuerpos contra la bacteria de Neisseria. Tal bacteria de Neisseria puede ser cualquier especie o cepa (tal como N. gonorrhoeae) pero preferiblemente son Neisseria meningi tidis, especialmente de la cepa A o de la cepa B.

La invención también proporciona un método para el tratamiento de un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de ácido nucleico, proteína, y/o anticuerpo, de conformidad con la invención. De conformidad con aspectos adicionales, la invención proporciona varios procesos. Se proporciona un proceso para producir proteínas de la invención, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped de conformidad con la invención bajo condiciones que inducen la expresión de la proteína. Se proporciona un proceso para producir la proteína o el ácido nucleico de la invención, en donde la proteína o el ácido nucleico se sintetiza en parte o completamente usando medios químicos. Se proporciona un proceso para detectar polinucleótidos de la invención, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una sonda nucleica de conformidad con la invención con una muestra biológica bajo condiciones de hibridización, para formar duplas; y (b) detectar tales duplas. Se proporciona un proceso para detectar proteínas de la invención, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un anticuerpo de la invención con una muestra biológica bajo condiciones apropiadas para la formación de un complejo anticuerpo-antígeno; y (b) detectar tales complejos. A continuación se da un resumen de técnicas y procedimientos estándar que pueden emplearse con objeto de realizar la invención (por ejemplo, para utilizar las secuencias descubiertas para propósitos de vacunación o diagnóstico) . Este resumen no es una limitación de la invención sino, al contrario, da ejemplos que pueden usarse, pero no se requieren. General . La práctica de la presente invención empleará a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la habilidad del arte. Tales técnicas se explican completamente en la literatura por ejemplo, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Ediction (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D,N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Traslation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente los volúmenes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principies and Practice, Segunda Edición (Springer-Verlag, N.Y.), y Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackweel eds 1986) . Se usan en esta especificación las abreviaturas estándar para los nucleótidos y aminoácidos. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente aquí citadas se incorporan completamente como referencia. Definiciones. Una composición que contiene X está "substancialmente libre de" Y cuando al menos el 85% en peso del total de X + Y en la composición es X. Preferiblemente, X comprende al menos alrededor del 90% en peso del total de X + Y en la composición, más preferiblemente al menos alrededor del 95% o aún del 99% en peso. El término "comprenden" significa que "incluyen" así como "consisten" por ejemplo, una composición que "comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir adicionalmente alguno de X, tal como X + Y. El término "determinante antigénica" incluye epítopes de célula B y epítopes de célula T. El término "heterólogo" se refiere a dos componentes biológicos que no se encuentran juntos en la naturaleza. Los componentes pueden ser células huésped, genes, o regiones reguladoras, tales como promotores. No obstante que los componentes heterólogos no se encuentran juntos por naturaleza, estos pueden funcionar juntos, como cuando un promotor heterólogo para un gen se enlaza operativamente al gen. Otro ejemplo es cuando una secuencia de meningococos es heteróloga a una célula huésped de ratón. Ejemplos adicionales pueden ser dos epítopes de la misma o diferentes proteínas que se ensamblan en una proteína simple en una colocación no encontrada en la naturaleza.

Un "origen de replicación" es una secuencia de polinucleótido que inicia y regula la replicación de polinucleótidos, tales como un vector de expresión. El origen de la replicación se comporta como una unidad autónoma de replicación de polinucleótido dentro de una célula, capaz de replicación bajo su propio control. Un origen de replicación puede necesitarse para un vector a replicar en una célula huésped particular. Con ciertos orígenes de replicación un vector de expresión puede reproducirse a un alto número de copias en presencia de las proteínas apropiadas dentro de la célula. Los ejemplos de orígenes son las secuencias autónomamente replicantes, que son efectivas en levadura; y el antígeno viral T, efectivo en células COS-7. Sistemas de Expresión . Las secuencias de nucléotidos de meningococos se pueden expresar en una diversidad de sistemas de expresión diferentes, por ejemplo aquellos usados con células de mamíferos, células de plantas, baculovirus, bacterias y levaduras. i. Sistemas de mamíferos . Los sistemas de expresión mamíferos se conocen en el arte. Un promotor mamífero es cualquier secuencia de ADN capaz de enlazar la polimerasa mamífera de ARN e iniciar la transcripción en la dirección (3' ) en una secuencia codificadora (por ejemplo un gen estructural) dentro del mARN. Un promotor tendrá una región iniciadora de la transcripción, que se coloca usualmente cercana a la terminación 5' de la secuencia codificadora, y el recuadro TATA, localizado usualmente a 25-30 pares base (bp) en la dirección 5' del sitio de iniciación de la transcripción. El recuadro TATA se piensa que dirige a la polimerasa II de ARN para comenzar la síntesis de ARN en el sitio correcto. Un promotor mamífero también contendrá un elemento promotor en la dirección 5' , usualmente localizado dentro de los 100 a 200 pares base en la dirección 5' del recuadro TATA. Un elemento promotor en la dirección 5' determina la velocidad a la cual se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación (Sambrook y colaboradores, (1989) "Expresión of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.). Los genes mamíferos virales se expresan a menudo elevadamente y tienen un amplio intervalo de huésped; por lo tanto las secuencias que codifican genes virales mamíferos proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Ejemplos incluyen el promotor temprano SV40, el promotor LTR del virus de tumor mamario de ratón, promotor tardío principal del adenovirus (Ad MLP), y promotor del virus del herpes simplex. Además, las secuencias derivadas de genes no virales tales como el gen de metalotioneína de murina, también proporciona secuencias útiles de promotores. La expresión puede ser constitutiva o regulada (inducible) , dependiendo del promotor seleccionado, pueden ser inducibles con glucocorticoides en células con respuesta a las hormonas. La presencia de un elemento enriquecedor (enriquecedor) , combinado con los elementos promotores arriba descritos, incrementarán usualmente los niveles de expresión. Un enriquecedor es una secuencia regulatoria de ADN que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando se liga a promotores homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis en el sitio de comienzo normal del ARN. Los enriquecedores son también activos cuando se colocan en la dirección 5' o en la dirección 3' a partir del sitio de iniciación de la transcripción en una orientación normal o aleteada, o a una distancia de más de 1000 nucléotidos a partir del promotor (Maniatis y colaboradores, (1987) Science 236:1237; Alberts y colaboradores,. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2nd ed.). Los elementos enriquecedores derivados de los virus pueden ser particularmente útiles, ya que tienen usualmente un intervalo de huésped más amplio. Los ejemplos incluyen el enriquecedor del gen temprano de SV40 (Dij ema y colaboradores, (1985) EMBO J. 4:761) y los promotores/enriquecedores derivados de la repetición de la terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Gorman y colaboradores, (1982b) Proc. Na ti . Acad. Sci . 79:6777) y del citomegalovirus humano (Boshart y colaboradores, (1985) Cell 41:521). Adicionalmente, se pueden regular algunos enriquecedores y se vuelven activos solamente en presencia de un inductor tal como una hormona o ion metálico (Sassone-Corsi and Borelli (1986) Treds Genet. 2:215; Maniatis y colaboradores, (1987) Science 236:1237). Una molécula de ADN se puede expresar intracelularmente en células mamíferas. Una secuencia de promotor se puede ligar directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en la terminación N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que se codifica por el codón de partida ATG. Si se desea, la terminación N se puede desdoblar de la proteína por incubación in vi tro con bromuro de cianógeno. Alternativamente, se pueden también secretar proteínas externas de la célula dentro del medio de crecimiento al crear moléculas quiméricas de ADN que codifican una proteína de fusión que comprende un fragmento de una secuencia líder que proporciona la secreción de la proteína externa en células mamíferas.

Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen externo, que se puede desdoblar in vivo o in vi tro. El fragmento de la secuencia líder codifica usualmente un péptido de señal que comprende aminoácidos hidrofóbicos que dirigen la secreción de la proteína de la célula. El líder tripartita del adenovirus es un ejemplo de una secuencia líder que suministra la secreción de una proteína extraña en células mamíferas. Usualmente, la terminación de la transcripción y las secuencias de poliadenilación reconocidas por células mamíferas son regiones regulatorias localizadas 3' al codón de detención de la traducción y así, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia codificadora. La terminación 3' del mARN maduro se forma por un desdoblamiento post-transcripcional específico del sitio y por poliadenilación (Birnstiel y colaboradores, (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukariotic RNA. In transcription and splicing (ed. B.D. Hames and D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105). Estas secuencias dirigen la transcripción de un mARN que se puede traducir en un polipéptido codificado por el ADN. Ejemplos de las señales de poliadenilación/terminador de la transcripción incluyen aquellas derivadas del SV40 (Sambrook y colaboradores, . (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Usualmente, los componentes arriba descritos que comprenden un promotor, señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción se colocan juntos en constructos de expresión. Los enriquecedores, intrones con un donador de corte funcional y sitios aceptores y secuencias líder se pueden también incluir en un constructo de expresión si se desea. Los constructos de expresión se mantienen a menudo en un replicón tal como un elemento extracromosomal (por ejemplo plásmidos) capaces de mantenerse de forma estable en un huésped tal como células mamíferas o bacterias. Los sistemas de replicación mamíferos incluyen aquellos derivados de virus animales que requieren factores de acción transversal para replicar. Por ejemplo, los plásmidos que contienen los sistemas de replicación de los papovavirus, tal como el SV40 (Gluzman (1981) Cell 23:175) o poliomavirus, se replican hasta un número extremadamente alto de copias en presencia de un antígeno apropiado viral T. Ejemplos adicionales de los replicones de mamíferos incluyen aquellos derivados del papilomavirus de bovino y el virus de Epstein-Barr. Adicionalmente, el replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo así que se mantenga por ejemplo en células mamíferas para la expresión en un huésped procariótico para clonación y amplificación. Ejemplos de tales vectores de transferencia de bacterias de mamífero incluyen el pMT2 (Kaufman y colaboradores, (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946) y pHEBO (Shimizu y colaboradores, (1986) Mol. Cell Biol. 6:1074). El procedimiento de transformación utilizado depende del huésped a ser transformado. Los métodos para la introducción de polinucléotidos heterólogos en células mamíferas se conocen en el arte e incluyen la transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroforación, encapsulación de polinucléotidos en liposomas, y microinyección directa del ADN dentro de los núcleos. Las líneas celulares mamíferas disponibles como huéspedes para la expresión se conocen en el arte e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , incluyendo pero no limitándose a células de ovario de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster recién nacido (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma humano hepatocelular (por ejemplo Hep G2) y diversas otras líneas celulares. ii. Sistemas de Baculovirus. El polinucléotido que codifica la proteína se puede también insertar dentro de un vector de expresión de insecto apropiado, y se liga operativamente a los elementos de control dentro de ese vector. La construcción de vectores emplea técnicas que se conocen en el arte. Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacteriano, que contiene un fragmento del genoma de baculovirus y un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen o genes heterólogos para expresarse; un baculovirus de tipo silvestre con una secuencia homologa al fragmento específico de baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homologa del gen heterólogo en el genoma del baculovirus) ; y células huésped de insecto apropiadas y medios de crecimiento. Después de insertar la secuencia de ADN que codifica la proteína dentro del vector de transferencia, se transfectan el vector y el genoma viral de tipo silvestre dentro de una célula huésped de insecto en donde el vector y el genoma viral se dejan recombinar. El virus recombinante empacado se expresa y se identifican y purifican las placas recombinantes. Están disponibles comercialmente materiales y métodos para sistemas de expresión de células de insecto/baculovirus en forma de kit a partir de inter alia , Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac") . Estas técnicas se conocen generalmente por aquellos hábiles en el arte y se describen completamente en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (posteriormente "Summers y Smith") . Previo a la inserción de la secuencia de ADN que codifica la proteína dentro del genoma de baculovirus, los componentes arriba descritos que comprenden un promotor, líder (si se desea) , secuencia de codificación de interés y secuencia de terminación de la transcripción, se ensamblan usualmente dentro de un constructo intermediario de transcolocación (vector de transferencia) . Este constructo puede contener un gen simple y elementos regulatorios ligados operativamente; genes múltiples, cada uno con su conjunto propio de elementos regulatorios ligados operativamente, o genes múltiples, regulados por el mismo conjunto de elementos regulatorios. Los constructos intermediarios de transcolocación se mantienen a menudo en un replicón tal como un elemento extracromosomal (por ejemplo, plásmidos) capaz del mantenimiento estable en un huésped tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo así mantenerse en un huésped apropiado para clonación y amplificación. Actualmente, el vector de transferencia más comúnmente usado para la introducción de genes externos dentro del AcNPV es el pAc373. Muchos otros vectores conocidos por aquellos de habilidad en el arte también se han diseñado. Estos incluyen por ejemplo, pVL985 (que altera el codón de partida de la polihedrina del ATG al ATT, y que introduce un sitio de clonación BamHl de 32 pares base en la dirección 3' del ATT; ver Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31. El plásmido contiene usualmente la señal de poliadenilación de la polihedrina (Miller y colaboradores, (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) y un gen procariótico de resistencia a la ampicilina (amp) y el origen de replicación para la selección y propagación en E. coli . Los vectores de transferencia del baculovirus contienen usualmente un promotor de baculovirus. Un promotor del baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de enlazarse a una polimerasa de ARN del baculovirus e iniciar la transcripción en la dirección 3' (5' a 3' ) de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) dentro del mARN. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que se coloca usualmente próxima a la terminación 5' de la secuencia codificadora. Esta región de iniciación de la transcripción incluye usualmente un sitio de enlace de la polimerasa de ARN y un sitio de iniciación de la transcripción. Un vector de transferencia del baculovirus puede también tener un segundo dominio denominado enriquecedor, el cual si está presente, es usualmente distal al gen estructural. La expresión puede ser regulada o constitutiva. Los genes estructurales, transcritos abundantemente en los tiempos finales en un ciclo de infección viral, proporcionan secuencias del promotor particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína viral del polihedrón, Friesen y colaboradores, (1986) "The regulation of Baculovirus Gene Expresión," in: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler) ; EPO Publ. Nos. 127 839 and 155 476; y el gen que codifica la proteína plO de Vlak y colaboradores, (1988), J. Gen. Virol. 69:765. El ADN que codifica las secuencias de señal apropiadas, se puede derivar de genes de las proteínas secretadas de insecto o baculovirus, tales como el gen de polihedrina del baculovirus (Carbonell y colaboradores, (1988) Gene, 73:409). Alternativamente, ya que las señales de las modificaciones posttraduccionales de las células mamíferas (tales como el desdoblamiento del péptido de señal, desdoblamiento proteolítico y fosforilación) parecen reconocerse por las células de insectos, y las señales requeridas para la secreción y la acumulación nuclear también parecen conservarse entre las células invertebradas y las células vertebradas, líderes de origen no insecto, tales como aquellos derivados de los genes que codifican el a-interferon humano, Maeda y colaboradores, (1985), Nature 315:592; péptido liberador de la gastrina humana, Lebacq-Verheyden y colaboradores, (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 humano, Smith y colaboradores, (1985) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 82:8404; IL-3 de ratón, (Miyajima y colaboradores, (1987) gene 58:273; y glucocerebrosidasa humana, Martin y colaboradores, (1988) DNA, 7:99, se pueden también usar para proporcionar la secreción en insectos. Un polipéptido o poliproteína recombinante, se puede expresar intracelularmente o si se expresa con la secuencia regulatoria adecuada se puede secretar. Una buena expresión intracelular de las proteínas externas no fundidas, requiere usualmente genes heterólogos que tienen idealmente una secuencia líder corta que contiene señales apropiadas de iniciación de la traducción que preceden a una señal de partida ATG. Si se desea, la metionina en la terminación N se puede desdoblar de la proteína madura por incubación in vi tro con bromuro de cianógeno. Alternativamente, las poliproteínas o proteínas recombinantes que no se secretan naturalmente, se pueden secretar de la célula del insecto al crear moléculas quiméricas de ADN que codifican una proteína de fusión que comprende un fragmento de secuencia líder que suministra la secreción de la proteína externa en los insectos. El fragmento de secuencia líder codifica usualmente un péptido de señal que comprende aminoácidos hidrofóbicos que dirigen la transubicación de la proteína dentro del retículo endoplásmico. Después de la inserción de la secuencia de ADN y/o el gen que codifica el precursor del producto de expresión de la proteína, se co-transforma un huésped de célula de insecto con el ADN heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico del baculovirus de tipo silvestre - usualmente por co-transfección. La secuencia de terminación de la transcripción y el promotor del constructo, comprenderán usualmente una sección de 2-5 kb del genoma de baculovirus. Los métodos para la introducción del ADN heterólogo dentro del sitio deseado en el virus del baculovirus se conocen en el arte (ver Summers and Smith supra; Ju y colaboradores, (1987); Smith y colaboradores, Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; and Luckow and Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede ser dentro de un gen tal como el gen de la polihedrina, mediante una recombinación transversal doble homologa; la inserción también puede ser dentro de un sitio de enzima de restricción preparado por ingeniería dentro del gen deseado de baculovirus. Miller y colaboradores, (1989), Bioessays 4:91. La secuencia de ADN, cuando se clona en el lugar del gen de la polihedrina en el vector de expresión, esta limitada por las secuencias específicas de polihedrina en 5' y 3' y se posiciona en la dirección 3' del promotor de polihedrina.

El vector de expresión de baculovirus recientemente formado, se empaca posteriormente dentro de un baculovirus recombinante infeccioso. La recombinación homologa sucede a una baja frecuencia (entre alrededor de 1% y alrededor 5%) ; así, la mayoría de los virus producidos después de la cotransfección es todavía de tipo silvestre. Por lo tanto, es necesario un método para identificar los virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es una separación por exclusión visual que permite distinguir a los virus recombinantes. La proteína de polihedrina, que se produce por el virus natural, se produce a niveles muy elevados en los núcleos de las células infectadas en los tiempos posteriores después de la infección viral. La proteína acumulada de polihedrina forma cuerpos de oclusión que también contienen partículas alojadas. Estos cuerpos de oclusión de hasta 15 µm de tamaño, tienen una alta capacidad de refracción, dando una apariencia brillante que se visualiza fácilmente bajo un microscopio de luz. Las células infectadas con virus recombinantes carecen de cuerpos de oclusión. Para distinguir un virus recombinante de un virus de tipo silvestre, se coloca en placas el sobrenadante de la transfección sobre una monocapa de células de insecto mediante técnicas conocidas por aquellos hábiles en el arte. Nominalmente, las placas se separan por exclusión bajo el microscopio de luz para la presencia (indicativa de un virus de tipo silvestre) o ausencia (indicativa de un virus recombinante) de cuerpos de oclusión. Current Protocols in Microbiology Vol. 2 (Ausubel y colaboradores, eds) at 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, supra; Miller y colaboradores, (1989). Se han desarrollado vectores de expresión de baculovirus recombinante para la infección dentro de diversas células de insectos. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para inter alia : Aedes aegypti , Autographa californica , Bombyx mori , Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda , y Trichoplusia ni (PCT Pub. No. WO 89/046699; Carbonell y ,*- .- , colaboradores, (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith y colaboradores, (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156; y ver generalmente, Fraser y colaboradores, (1989) In vitro Cell. Dev. Biol. 25:225). Las células y los medios de cultivo de las células están comercialmente disponibles para la expresión directa y por fusión de los polipéptidos heterólogos en un sistema de expresión/baculovirus; la tecnología de cultivo de células se conoce generalmente por aquellos hábiles en el arte. Ver por ejemplo Summers and Smith supra. Las células de insecto modificadas pueden después crecer en un medio nutriente apropiado, lo que permite el mantenimiento estable del plásmido presente en el huésped de insecto modificado. En donde el gen del producto de expresión está bajo control inducible, el huésped puede crecer hasta alta densidad e inducir la expresión. Alternativamente, en donde la expresión es constitutiva, el producto se expresará continuamente dentro del medio y el medio nutriente debe circular continuamente, mientras se separa el producto de interés y se aumentan los nutrientes eliminados. El producto se puede purificar por técnicas tales como cromatografía, por ejemplo HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de iones, etcétera; electroforesis; centrifugación por gradiente de densidad; extracción por solventes o similares. Como sea apropiado, el producto puede además purificarse como se requiera para separar sustancialmente cualesquiera proteínas de insecto que también se secretan en el medio o resultan de la lisis de células de insecto, de manera de proporcionar un producto que está al menos substancialmente libre de desechos del huésped, por ejemplo, proteínas, lípidos y polisacáridos. Con objeto de obtener la expresión de proteínas, las células huésped recombinantes derivadas de los transformantes se incuban bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína recombinante que codifica la secuencia. Estas condiciones variarán, dependiendo de la célula huésped seleccionada. Sin embargo, se pueden verificar fácilmente las condiciones por aquellos con habilidad ordinaria en el arte, con base en lo que se conoce en el arte. iii. Sistemas de Plantas. Existen muchos cultivos celulares de plantas y sistemas de expresión completos genéticos de plantas conocidos en el arte. Los sistemas de expresión genéticos celulares de plantas ejemplares incluyen aquellos descritos en patentes tales como la U.S. 5,693,506; US 5,659,122; y US 5,608,143. Ejemplos adicionales de la expresión genética en cultivos celulares de plantas han sido descritos por Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991) . Las descripciones de los péptidos de señal de proteína de plantas se pueden encontrar además de las referencias arriba descritas en Vaulcombe y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 209-33-40 (1987); Chandler y colaboradores, Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein y colaboradores, Gene 55:353-356 (1987); Whittier y colaboradores, Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel y colaboradores, Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu y colaboradores, Gene 122:247-253 (1992). Una descripción de la regulación de la expresión de los genes de plantas por la fitohormona, ácido giberélico y enzimas secretadas inducidas por el ácido giberélico se pueden encontrar en R.L. Jones and J. MacMillin, Gibberellins : in Advanced Plant Physiology, Malcolm B. Wiikins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp. 21-52. Las referencias que describen otros genes metabólicamente regulados: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038 (1990);Maas y colaboradores, EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel and Hickey, Proc . Na ti . Acad. Sci . 84:1337-1339(1987) . Típicamente, al usar las técnicas conocidas en el arte, se inserta una secuencia deseada de polinucléotidos dentro de una cinta de expresión que comprende elementos genéticos regulatorios diseñados para la operación en plantas. La cinta de expresión se inserta dentro del vector de expresión deseado con secuencias de acompañamiento en la dirección 3' y en la dirección 5' de la cinta de expresión apropiada para la expresión en un huésped de planta. Las secuencias de acompañamiento serán de origen viral o plásmido y proporcionan las características necesarias al vector para permitir que los vectores muevan el ADN desde un huésped de clonación original tal como las bacterias, hasta el huésped deseado de plantas. El constructo básico de vector bacteriano/planta proporcionará preferiblemente un origen de replicación de procariotas de amplio rango de huésped; un marcador de selección de procariotas y para transformaciones con Agrobacterium, secuencias de ADN T para la transferencia mediada por Agrobacterium a los cromosomas de las plantas. En donde el gen heterólogo no es fácilmente detectable, el constructo tendrá preferiblemente un gen marcador seleccionable apropiado para determinar si ha sido transformada una célula de planta. Una revisión general de los marcadores apropiados, por ejemplo para los miembros de la familia de los pastos, se encuentra en Wilmink and Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11 (2 ): 165-185.

Las secuencias apropiadas para permitir la integración de la secuencia heteróloga dentro de un genoma de planta, también se recomiendan. Estas pueden incluir secuencias de transposon y similares para la recombinación homologa así como secuencias Ti que permiten la inserción aleatoria de una cinta de expresión heteróloga dentro de un genoma de planta. Los marcadores de selección de procariotas apropiados incluyen, resistencia hacia antibióticos tales como la ampicilina o la tetraciclina. Otras secuencias de ADN que codifican funciones adicionales pueden también estar presentes en el vector como se conoce en el arte. Las moléculas de ácido nucleico de la invención objetivo se pueden incluir dentro de una cinta de expresión para la expresión de la proteína de interés. Usualmente, habrá solamente una cinta de expresión aunque dos o más son factibles. La cinta de expresión recombinante contendrá además de la proteína heteróloga que codifica la secuencia los siguientes elementos, una región promotora, secuencias no traducidas 5' de plantas, un codón de iniciación dependiendo de si el gen estructural viene o no equipado con uno, y una secuencia de terminación de la traducción y transcripción. Los sitios particulares de enzimas de restricción en las terminaciones 5' y 3' de la cinta permiten una fácil inserción dentro de un vector preexistente. Una secuencia de codificación heteróloga puede ser cualquier proteína relacionada con la presente invención. La secuencia que codifica a la proteína de interés codificara un péptido de señal que permite el procesamiento y transubicación de la proteína como se ha apropiado, y carecerá usualmente de cualquier secuencia que pueda resultar en el enlace de la proteína deseada de la invención a una membrana. Ya que en la mayor parte, la región de iniciación transcripcional será para un gen que se expresa y transubica durante la germinación, al emplear el péptido de señal que proporciona la transubicación, se puede también proporcionar la transubicación de la proteína de interés. De esta manera, las proteínas de interés se transubicarán a partir de las células en las cuales en que se expresan y se pueden cosechar eficientemente. Típicamente la secreción en semillas es a través de la capa epitelial de la aleurona o escutelar dentro del endosperma de la semilla. Aunque no se requiere que la proteína sea secretada de las células en las cuales se produce la proteína, esto facilita el aislamiento y la purificación de la proteína recombinante.

Ya que la expresión final del producto de gen deseado será una célula eucariótica, es deseable determinar si alguna porción del gen clonado contiene secuencias que se procesarán como intrones por la maquinaria de esplicosomas del huésped. Si es así, la mutagénesis dirigida al sitio de la región del "intron" se puede llevar a cabo para evitar la pérdida de una porción del mensaje genético como un código falso de intron, Reed and Maniatis, Cell 41:95-105, 1985. El vector se puede microinyectar directamente dentro de la célula de planta por el uso de micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genet, 202:179-185, 1985. El material genético se puede también transferir dentro de la célula de planta por el uso del polietilenglicol, Krens, y colaboradores, Nature, 296, 72-74, 1982. Otro método de introducción en los segmentos de ácido nucleico es la penetración balística de alta velocidad por partículas pequeñas con el ácido nucleico ya sea dentro de la matriz de perlas o partículas pequeñas, o sobre la superficie, Klein, y colaboradores, Nature, 327, 70-73, 1987 and Knudsen and Muller, 1991, Planta, 185:330-336 enseñan el bombardeo de partículas del endosperma de la cebada para crear cebada transgénica. Todavía otro método de introducción sería la fusión de los protoplastos con otras entidades, ya sea minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos fundibles con lípidos en la superficie, Fraley, y colaboradores, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 79, 1859-1863, 1982. El vector se puede también introducir dentro de las células de plantas por electroporación. (Fromm y colaboradores, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 82:5824, 1985). En esta técnica, los protoplastos de planta se electroporan en presencia de plásmidos que contienen el constructo del gen. Los impulsos eléctricos de alta resistencia de campo, permeabilizan de forma reversible las biomembranas permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos de plantas electroporadas reforman la pared celular, la dividen y forman callos de planta. Todas las plantas a partir de las cuales se pueden aislar protoplastos y cultivar para dar plantas regeneradas enteras, se pueden transformar por la presente invención de manera que las plantas enteras se recuperen las cuales contienen el gen transferido. Se conoce que prácticamente todas las plantas se pueden regenerar a partir de células o tejidos cultivados, incluyendo pero no limitándose a todas las especies mayores de caña de azúcar, remolacha, algodón, frutas y otros árboles, legumbres y vegetales. Algunas plantas apropiadas por ejemplo incluyen, especies de los géneros Fragaria , Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella , Vigna , Ci trus, Linum, Geranium, Manihot , Daucus, Arabidopsis, Brassica , Raphanus, Sinapis, Atropa , Capsicum, Da tura , Hyoscyamus , Lycopersion , Nicotiana , 5 Solanum , Petunia , Digi talis , Majorana , Cichorium, Helianthus , Lactuca , Bromus , Asparagus , Antirrhinum, Hererocallis , Nemesia , Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia , Glycine, Lolium , Zea , Tri ticum , Sorghum, y Da tura . 10 Los medios para la regeneración varían de especie a especie de planta, pero generalmente se suministra primero una suspensión de protoplastos transformados que contienen copias del gen heterólogo. El tejido de callo se forma y se inducen los retoños del callo y se forman raíces posteriormente. Alternativamente, se puede inducir la formación del embrión a partir de la suspensión de protoplastos. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo contendrán generalmente diversos aminoácidos y hormonas, tales como la auxina y la citoquinina. También es ventajoso agregar ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como el maíz y la alfalfa. Los retoños y las raíces se desarrollan normalmente de manera simultánea. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo y de la historia del cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces la regeneración es completamente reproducible y repetible. En algunos sistemas de cultivo de células de planta, la proteína deseada de la invención se puede excretar o alternativamente, la proteína se puede extraer de la planta entera. En donde se secreta la proteína deseada de la invención dentro del medio, se puede recolectar. Alternativamente, los embriones y las semillas medias sin embriones u otros tejidos de plantas, se pueden romper mecánicamente para liberar cualquier proteína secretada entre las células y los tejidos. La mezcla se puede suspender en una solución amortiguadora para obtener proteínas solubles. Los métodos de aislamiento y purificación convencionales de proteínas, se usarán después para purificar la proteína recombinante. Se ajustarán los parámetros de tiempo, temperatura pH, oxígeno y volúmenes a través de los métodos de rutina para optimizar la expresión y recuperación de la proteína heteróloga. iv. Sistemas Bacterianos. Se conocen en el arte las técnicas de expresión bacterianas. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de enlazarse a la polimerasa bacteriana de ARN e iniciar la transcripción en la dirección 3' (3' ) de una secuencia codificadora (por ejemplo un gen estructural) dentro del mARN. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que se coloca usualmente próxima a la terminación 5' de la secuencia codificadora. Esta región de iniciación de la transcripción incluye usualmente un sitio de enlace de la polimerasa de ARN y un sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor bacteriano puede también tener un segundo dominio denominado operador, que puede traslapar un sitio de enlace adyacente de la polimerasa de ARN en el cual comienza la síntesis de ARN. El operador permite una transcripción negativa regulada (inducible) , como una proteína represora de los genes que puede enlazarse al operador con lo cual se inhibe la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede suceder en ausencia de elementos regulatorios negativos tales como el operador. Además, se puede alcanzar la regulación positiva por una secuencia de enlace de proteínas activadoras del gen la cual, si está presente está usualmente proximal (5') a la secuencia de enlace de la polimerasa de ARN. Un ejemplo de una proteína activadora de genes es la proteína activadora del catabolito (CAP) , que ayuda a iniciar la transcripción del operon lac en la Escherichia coli (E. coli) (Raibaud y colaboradores, (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173). La expresión regulada puede por lo tanto ser positiva o negativa, con lo cual se enriquece o reduce la transcripción. Las secuencias que codifican las enzimas de trayectoria metabólica proporcionan secuencias de promotor particularmente útil. Los ejemplos incluyen secuencias de promotor derivadas de enzimas que metabolizan el azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) (Chang y colaboradores, (1997) Nature 198:1056), y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias de promotor derivadas de las enzimas biosintéticas tales como el triptofano (trp) (Goeddel y colaboradores, (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton y colaboradores, (1981) Nucí. Acids Res. 9:731; U.S. Patent 4,738,921; EPO Publ. Nos. 036 776 and 121 775). El sistema promotor de la beta-lactamasa (bla) (Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In interferon 3 (ed. I. Gresser) ) , los sistemas promotores del bacteriófago lambda PL (Shimatake y colaboradores, (1981) Nature 292:128) y de T5 (patente U.S. 4,689,406) también proporcionan secuencias promotoras útiles. Además, los promotores sintéticos que no se presentan en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago, se pueden unir con las secuencias de operon de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético (patente U.S. 4,551,433). Por ejemplo, el promotor tac es un promotor híbrido trp-lac que comprende del promotor trp y las secuencias del operon lac que se regula por el represor lac (Amann y colaboradores, (1983) gene 25:167; de Boer y colaboradores, (1983) Proc. Na ti . Acad. Sci . 80:21). Adicionalmente, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se presentan naturalmente de origen no bacteriano que tienen la capacidad de enlazar la polimerasa de ARN bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor que se presenta naturalmente de origen no bacteriano puede también acoplarse con una polimerasa compatible de ARN para producir elevados niveles de expresión de algunos genes en las procariotas. El sistema bacteriófago promotor/polimerasa de ARN T7 es un ejemplo de un sistema promotor acoplado (Studier y colaboradores, (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor y colaboradores, (1985) Proc . Na ti . Acad. Sci . 82:1074). Además, un promotor híbrido puede también comprender un promotor bacteriófago y una región operadora de la E. coli (EP-A-0267851) . Además de una secuencia promotora del funcionamiento, es también útil un sitio de enlace eficiente de ribosomas para la expresión de genes externos en procariotas. En la E. coli , el sitio de enlace de ribosomas se denomina secuencia de Shine- Dalgarno (SD) e incluye un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucléotidos de longitud localizada 3-11 nucléotidos en la dirección 5' del codón de iniciación (Shine y colaboradores, (1975) Nature 254:34). La secuencia SD se piensa que promueve el enlace del mARN al ribosoma al formar los pares de bases entre la secuencia SD y la terminación 3' del rARN 16S de E. coli (Steitz y colaboradores, (1979) "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expresión (ed. R.F.

Goldberg) ) . Para expresar los genes eucarióticos y genes procarióticos con sitios de enlace débiles a las ribosomas, a menudo es necesario optimizar la distancia entre la secuencia SD y el ATG del gen eucariótico (Sambrook y colaboradores, (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." In molecular Cloning: A laboratory Manual) . Una molécula de ADN se puede expresar intracelularmente. Una secuencia promotora se puede ligar directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en la terminación N siempre será una metionina, que se codifica por el codón de partida ATG.

Si se desea, la metionina en la terminación N se puede desdoblar de la proteína por incubación in vi tro con el bromuro de cianógeno o por incubación in vivo o in vi tro con una peptidasa N-terminal de metionina bacteriana (EPO-A-0 219 237) . Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para la expresión directa. Usualmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N-terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se funde a la terminación 5' de las secuencias codificadoras heterólogas. Con la expresión, este constructo proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen bacteriófago de la célula lambda se puede ligar a la terminación 5' de un gen externo y expresarse en bacterias. La proteína de fusión resultante retiene preferiblemente un sitio para una enzima de procesamiento (factor Xa) para desdoblar la proteína bacteriófaga del gen externo (Nagai y colaboradores, (1984) Nature 309:810). Las proteínas de fusión se pueden hacer también con secuencias de los genes la cZ (Jia y colaboradores, (1987) Gene 60:197), trpE (Alien y colaboradores, (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff y colaboradores, (1989) J. Gen Microbiol. 135:11), y Chey (EPO Publ. No. 324 647). La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar un sitio desdoblable. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubicuitina. Tal proteína de fusión se hace con la región de ubicuitina que retiene preferiblemente un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo una proteasa de procesamiento específico de la ubicuitina) para desdoblar la ubicuitina de la proteína externa. A través de este método, se puede aislar la proteína externa natural (Miller y colaboradores, (1989) Bio/Technology 7:698). Alternativamente, las proteínas externas se pueden también secretar de la célula al crear moléculas quiméricas de ADN, que codifican una proteína de fusión que comprende un fragmento de una secuencia de péptido de señal, que proporciona la secreción de la proteína externa en bacterias (patente U.S. 4,336,336). El fragmento de secuencia de señal codifica usualmente un péptido de señal que comprende de aminoácidos hidrofóbicos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. La proteína se secreta dentro de los medios de crecimiento (bacterias gram positivas) o en el espacio periplásmico localizado entre la membrana interior y exterior de la célula (bacterias gram negativas) . Preferiblemente, hay sitios de procesamiento que se pueden desdoblar in vivo o in vi tro codificados entre el fragmento del péptido de señal y el gen externo.

El ADN que codifica secuencias de señal apropiadas se puede derivar de genes de proteínas bacterianas secretadas tales como el gen de la proteína de membrana exterior de E. coli (ompA) (Másui y colaboradores, (1983), en: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2437) y la secuencia de señal de la fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) (Oka y colaboradores, (1985) Proc . Na ti . Acad. Sci . 82:7212) . Como un ejemplo adicional, la secuencia de señal del gen de alfa amilasa de diversas cepas de Bacilus se puede usar para secretar las proteínas heterólogas del B . subtilis (Palva y colaboradores, (1982) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 79:5582; EP-A-0 244 042) . Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por las bacterias, son regiones regulatorias localizadas en 3' hasta el codón de detención de la traducción, y así juntas con el flanco promotor de la secuencia de codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mARN que se puede traducir dentro del polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN desde alrededor de 50 nucléotidos capaces de formar estructuras de circuito y madre que ayudan a terminar la transcripción.

Ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos. Usualmente, los componentes arriba descritos, comprenden un promotor, secuencia de señal (si se desea) secuencia de codificación de interés, y secuencia de terminación de la transcripción, se colocan juntos en constructos de expresión. Los constructos de expresión se mantienen a menudo en un replicón tal como un elemento extracromosomal (por ejemplo plásmidos) capaces de un mantenimiento estable en un huésped tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación con lo que se permite así mantenerse en un huésped procariótico ya sea para expresión o para clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido de un número de copias altas o bajas. Un plásmido de número de copias alto tendrá generalmente un número de copias en el intervalo desde alrededor de 5 hasta alrededor de 200, y usualmente alrededor de 10 hasta alrededor de 150. Un huésped que contiene un plásmido de un número de copias elevada contendrá preferiblemente al menos alrededor de 10, y más preferiblemente al menos alrededor de 20 plásmidos. Se puede seleccionar un vector con un número de copias alta o baja, dependiendo del efecto del vector y la proteína externa en el huésped. Alternativamente, los constructos de expresión se pueden integrar dentro del genoma bacteriano con un 5 vector integrador. Los vectores integradores contienen usualmente al menos una secuencia homologa con el cromosoma bacteriano que permite integrar al vector. Las integraciones parecen resultar de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores integradores construidos con ADN a partir de diversas cepas de Bacillus se integran dentro del cromosoma Bacillus (EP-A- 0 127 328) . Los vectores integradores pueden también comprender bacteriófagos o secuencias de transposon. 15 Usualmente, los constructos de expresión integradora y extracromosomal, pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que han sido transformadas. Los marcadores seleccionables se pueden expresar en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que resultan resistentes a las bacterias para medicamentos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina (neomicina), y tetraciclina (Davies y colaboradores, (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469). Los marcadores de selección pueden también incluir genes biosintéticos -—Ja"t-_»a_1 tales como aquellos en la histidina, triptofano y las trayectorias biosintéticas de la leucina. Alternativamente, algunos de los componentes arriba descritos se pueden poner juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación comprenden usualmente un marcador de selección que se mantiene en un replicón o se desarrolla dentro de un vector integrante como se describe arriba. Los vectores de transformación y expresión, ya sea replicones extracromosomales o vectores integradores, han sido desarrollados para la transformación en diversas bacterias. Por ejemplo, los vectores de expresión se han desarrollado para inter alia las siguientes bacterias: Bacilus subtilis (Palva y colaboradores, (1982) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 79:5582; EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541), Escherichia coli (Shimatake y colaboradores, (1981) ?ature 292:128; Amann y colaboradores, (1985) Gene 40:183; Studier y colaboradores, (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 y EP-A-0 136 907), Streptococcus cremops (Powell y colaboradores, (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655); Streptococcus lividans (Powell y colaboradores, (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655), Streptomyces lividans (Patente U.S. 4,745,056).

Los métodos para la introducción de ADN exógeno dentro de huéspedes bacterianos son bien conocidos en el arte, e incluyen usualmente la transformación de bacterias tratadas con CaCl2 u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El ADN también se puede introducir dentro de las células bacterianas por electroporación. Los procedimientos de transformación variarán usualmente con la especie bacteriana a ser transformada. Ver por ejemplo, [Masson y colaboradores, (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva y colaboradores, (1982) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 79:5582; EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller y colaboradores, (1988) Proc . Na ti . Acad. Sci . 85:856; Wang y colaboradores, (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campilobacter] , [Cohén y colaboradores, (1973) Proc . Na ti . Acad. Sci . 69:2110; Dower y colaboradores, (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. En Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia) ; Mandel y colaboradores, (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318, Escherichia], [Chassy y colaboradores, (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler y colaboradores, (1988) Anal.

Biochem 170:38, Psaeudomonas] ; [Augustin y colaboradores, (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Stafilococcus] , [Barany y colaboradores, (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III) ; Perry y colaboradores, (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell y colaboradores, (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti y colaboradores, (1987) Proc. 4h Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Estreptococcus] . v. Expresión de Levaduras. Los sistemas de expresión de levadura se conocen también por aquellos con habilidad ordinaria en el arte.

Un promotor de levadura es cualquier secuencia de ADN capaz de enlazar a la polimerasa de ARN de levadura e iniciar la transcripción en la dirección (3') de una secuencia codificadora (por ejemplo gen estructural) dentro de un mARN. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que se coloca usualmente proximal a la terminal 5' de la secuencia de codificación. Esta región de iniciación de la transcripción incluye usualmente un sitio de enlace de la polimerasa de ARN (el recuadro "TATA") y un sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor de levadura puede también tener un segundo dominio denominado una . * - **- secuencia activadora en la dirección 5' (UAS) , la cual si está presente, está usualmente distal al gen estructural. La UAS permite una expresión regulada (inducible) . La expresión constitutiva sucede en ausencia de una UAS. La expresión regulada puede ser positiva o negativa con lo cual se enriquece o reduce la transcripción. La levadura es un organismo fermentador con una trayectoria metabólica activa, por lo tanto las secuencias que codifican enzimas en la trayectoria metabólica proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Ejemplos incluyen la deshidrogenasa de alcohol (ADH) (EP-A-0284044 ) , enolasa, glucocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH) , hexocinasa, fosfofructocinasa, 3-fosfoglicerato mutasa, y la piruvato cinasa (PyK) (EP-A-0329203) . El gen de levadura PH05, que codifica la fosfatasa acida, también proporciona secuencias útiles de promotor (Myanohara y colaboradores, (1983) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 80:1). Además, los promotores sintéticos que no se presentan en la naturaleza también funcionan como promotores de levadura. Por ejemplo, las secuencias UAS de un promo-tor de levadura se pueden unir con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura creando un promotor híbrido sintético. Ejemplos ^¿tei«M*-» de tales promotores híbridos incluyen la secuencia regulatoria ADH ligada a la región de activación de la transcripción GAP (patentes U.S. Nos. 4,876,197 y 4,880,734). Otros ejemplos de promotor híbridos incluyen promotores que consisten de secuencias regulatorias de los genes ADH2, GAL4, GALIO, OR PH05, combinados con la región de activación transcripcional de un gen de enzimas glicolíticas tal como GAP o PyK (EP-A-0 164 556) . Además, un promotor de levadura puede incluir promotores que se presentan naturalmente de origen no levadura, que tienen la capacidad de enlazar la polimerasa del ARN de levadura e iniciar la transcripción. Ejemplos de tales promotores incluyen inter alia, (Cohén y colaboradores, (1980) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 77:1078; Henikoff y colaboradores, (1981) Nature 283:835; Hollenberg y colaboradores, (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg y colaboradores, (1979) "The expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," in: Plasmid of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis and A. Puhler) ; Mercerau-Puigalon y colaboradores, (1980) Gene 11:163; Panthier y colaboradores, (1980) Curr. Genet. 2:109;). Una molécula de ADN se puede expresar intracelularmente en la levadura. Una secuencia de promotor se puede unir directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en la terminación N de la proteína recombinante, siempre será una metionina, la cual se codifica por el codón de partida ATG. Si se desea, la metionina en la terminación N puede desdoblarse de la proteína por incubación in vi tro con bromuro de cianógeno. Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para los sistemas de expresión de levaduras, así como en sistemas de expresión bacterianos y de baculovirus plantas y mamíferos. Usualmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N-terminal de una proteína endógena de levadura u otra proteína estable, se funde a la terminación 5' de las secuencias codificadoras heterólogas. Con la expresión, este constructo proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, la levadura o el gen humano de la superóxido dismutasa (SOD) , se puede unir en la terminación 5' de un gen externo y expresarse en levadura. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar un sitio desdoblable. Ver por ejemplo EP-A-0 196 056. Otro ejemplo es una proteína de fusión de la ubicuitina. Tal proteína de fusión se hace con la región de ubicuitina que retiene preferiblemente un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo la proteasa de procesamiento específica de la ubicuitina) para desdoblar la ubicuitina de la proteína externa. A través de este método por lo tanto, se puede aislar la proteína externa natural (por ejemplo, WO88/024066) . Alternativamente, las proteínas externas también se pueden secretar de la célula dentro de los medios de crecimiento al crear moléculas quiméricas de ADN que codifican una proteína de fusión que comprende un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción en la levadura de la proteína externa. Preferiblemente, hay sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen externo que se pueden desdoblar in vivo o in vi tro . El fragmento de secuencia líder codifica usualmente un péptido de señal que comprende aminoácidos hidrofóbicos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula. Las secuencias de señal apropiadas que codifican ADN se pueden derivar de genes para las proteínas secretadas de levadura tales como el gen de la levadura de invertasa (EP-A-0 012 873; JPO. 62,096,086) y el gen del factor A (patente U.S. 4,588,684). Alternativamente, los líderes de origen no levadura tales como el líder de interferon, existen y también proporcionan la secreción en la levadura (EP-A-0 060 057) .

Un tipo preferido de líderes de secreción son aquellos que emplean un fragmento del gen de levadura del factor alfa, que contiene tanto una secuencia de señal "pre", como una región "pro". Los tipos de fragmentos del factor alfa que se pueden emplear incluyen el líder del factor alfa pre-pro de longitud completa (alrededor de 83 residuos de aminoácidos) así como los líderes truncados del factor alfa (usualmente alrededor de 25 hasta alrededor de 50 residuos de aminoácidos) (patentes U.S. Nos. 4,546,083 y 4,870,008; EP-A-0 324 274). Los líderes adicionales que emplean un fragmento líder del factor alfa que suministra la secreción incluyen líderes híbridos de factor alfa hechos con una pre-secuencia de una primera levadura, pero una pro-región de un factor alfa de una segunda levadura, (ver por ejemplo 89/02463). Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura son regiones regulatorias localizadas 31 para el codón de detención de la traducción, y así juntas con el flanco promotor de la secuencia de codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mARN que se puede traducir dentro del polipéptido codificado por el ADN. Ejemplos de las secuencias terminadoras de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por la levadura, . . -^^a-jj tales como aquellas que codifican las enzimas glicolíticas. Usualmente, los componentes arriba descritos, comprenden un promotor, líder (si se desea) , secuencia 5 codificadora de interés y secuencia de terminación de la transcripción, se colocan juntos dentro de constructos de expresión. Los constructos de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosomal (por ejemplo plásmidos) capaz del mantenimiento estable en un huésped tal como levaduras o bacterias. El replicón puede tener dos sistemas de replicación permitiendo así que se mantenga por ejemplo, en levadura para la expresión en un huésped procariótico para clonación y amplificación. Ejemplos de tales vectores de transferencia de bacterias en levadura incluyen el Yep24 (Botstein y colaboradores, (1979) Gene8 : 17-24) , pCl/1 (Brake y colaboradores, (1984) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 81:4642-4646), y YRpl7 (Stinchcomb y colaboradores, (1982) J. Mol. Biol. 158:157). Además, un replicón puede ser un plásmido con un número de copias ya sea alto o bajo. Un plásmido con un número de copias alto tendrá generalmente un número de copias en el intervalo desde alrededor de 5 hasta alrededor de 200 y usualmente alrededor de 10 hasta alrededor de 150. Un huésped que contiene un plásmido con un número de copias alto tendrá -_-_s_a& preferiblemente al menos alrededor de 10 y más preferiblemente al menos alrededor de 20. Se puede seleccionar de entrada un vector con un número de copias alto o bajo, dependiendo del efecto del vector y la proteína externa sobre el huésped. Ver por ejemplo, Brake y colaboradores, supra. Alternativamente, los constructos de expresión se pueden integrar dentro del genoma de levadura con un vector integrador. Los vectores integradores contienen usualmente al menos una secuencia homologa a un cromosoma de levadura que permite integrar al vector, y contiene preferiblemente dos secuencias homologas que flanquean al constructo de expresión. Las integraciones parecen resultar de las recombinaciones entre el ADN homólogo en el vector y el cromosoma de levadura (Orr-Weaver y colaboradores, (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245). Un vector integrador puede dirigirse a un punto especifico en la levadura, al seleccionar la secuencia homologa apropiada para su inclusión en el vector. Ver Orr-Weaver y colaboradores, supra. Uno o más constructos de expresión se pueden integrar, afectando posiblemente los niveles de la proteína recombinante producida (Riñe y colaboradores, (1983) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 80:6750). Las secuencias cromosomales incluidas en el vector pueden suceder como un segmento simple en el vector, lo que resulta en la integración del vector completo, o dos segmentos homólogos a los segmentos adyacentes en el cromosoma y flanquear el constructo de expresión en el vector, lo cual puede resultar en la integración estable de solamente el constructo de expresión. Usualmente, los constructos de expresión integradora y extracromosomal pueden contener marcadores de selección para permitir la selección de cepas de levadura que han sido transformadas. Los marcadores de selección pueden incluir genes biosintéticos que se pueden expresar en el huésped de levadura tal como los genes ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, y ALG7 y el gen de resistencia G418, que otorgan resistencia en las células de levadura a la tuncamicina y G418 respectivamente. Además, un marcador de selección apropiado puede también suministrar levadura con la capacidad de crecer en presencia de compuestos tóxicos tales como metales. Por ejemplo la presencia del CUP1 permite crecer a la levadura en presencia de iones de cobre (Butt y colaboradores, (1987) microbiol, Rev. 51:351) . Alternativamente, algunos de los componentes arriba descritos se pueden poner juntos dentro de vectores de transformación. Los vectores de transformación comprenden usualmente un marcador de selección que se mantiene en un replicón o se desarrolla dentro de un vector integrador como se describe arriba. Los vectores de transformación y expresión, ya sea replicones extracromosomales o vectores integradores, se han desarrollado para la transformación en diversas levaduras. Por ejemplo, los vectores de expresión y los métodos de introducción de ADN exógeno en huéspedes de levadura se han desarrollado para inter alia, las siguientes levaduras: Candida albicans (Kurtz, y colaboradores, (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142); Candida mal tosa (Kunze, y colaboradores, (1985) J. Basic Microbiol. 25:141); Hansenula poly orpha (Gleeson, y colaboradores, (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp y colaboradores, (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302); Kluyveromyces fragilis (Das, y colaboradores, (1984) J. Bacteriol. 158:1165); Kl uyveromyces lactis (De Louvencourt y colaboradores, (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg y colaboradores, (1990) Bio/Technology 8:135); Pichia guillerimondii (Kunze y colaboradores, (1985) J. Basic Microbiol. 25:141); Pichia pastoris (Cregg, y colaboradores, (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; U.S. Patent Nos. 4,837,148 and 4,929,555); Saccharomyces cerevisiae (Hinnen y colaboradores, (1978) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 75:1929; Ito y colaboradores, (1983) J. Bacteriol. 153:163); Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse (1981) Nature 300:706); y Yarrowia lipolytica (Davodow, y colaboradores, (1985) Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin, y colaboradores, (1985) Curr. Genet. 10:49) . Los métodos de introducción de ADN exógeno en huéspedes de levadura son bien conocidos en el arte, e incluyen usualmente la transformación de esferoplastos o de células de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación varían usualmente con la especie de levadura a ser transformada.

Ver por ejemplo [Kurtz y colaboradores, (1986) Mol. Cell.

Biol. 6:142; Kunze y colaboradores, (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson y colaboradores, (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp y colaboradores, (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das y colaboradores, (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt y colaboradores, (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg y colaboradores, (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg y colaboradores, (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze y colaboradores, (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Patentes U.S. Nos. 4,837,148 y 4,929,555; Pichia]; [Hinnen y colaboradores, (1978) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 75; 1929; Ito y colaboradores, (1983) J. Bacteriol. 153:163 Saccharomyces]; [Beach and Nurse (1981) Neture 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow y colaboradores, (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin y colaboradores, (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia]. Anticuerpos . Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos compuestos por al menos un sitio de combinación de anticuerpos. Un "sitio de combinación de anticuerpo" es el espacio de enlace tridimensional con una forma de superficie interna y distribución de carga complementaria a las características de un epítope de un antígeno, que permite un enlace del anticuerpo con el antígeno. "Anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos vertebrados, anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos alterados, anticuerpos univalentes, proteínas Fab, y anticuerpos de dominio simple. Los anticuerpos contra las proteínas de la invención, son útiles para cromatografía de afinidad, inmunoensayos, y proteínas que distinguen/identifican meningococos . Los anticuerpos para las proteínas de la invención, tanto policlonales como monoclonales, pueden prepararse por métodos convencionales. En general, las proteínas se usan primero para inmunizar un animal apropiado, preferiblemente un ratón, rata, conejo o cabra. Los conejos y las cabras son los preferidos para la preparación de sueros policlonales, debido al volumen de suero que se obtiene, y la disponibilidad de anticuerpos anti-conejo y anti-cabra etiquetados. La inmunización se ejecuta generalmente mezclando o emulsificando la proteína en solución salina, preferiblemente en un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund, y se inyecta la mezcla o emulsión parenteralmente (generalmente subcutáneamente o intramuscularmente) . Una dosis de 50-200 µg/inyección típicamente es suficiente. La inmunización se estimula generalmente 2-6 semanas después con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, preferiblemente usando adyuvante incompleto de Freund. Se pueden generar alternativamente anticuerpos por inmunización in vi tro usando métodos conocidos en el arte, que para los propósitos de esta invención, se consideran equivalentes a la inmunización in vivo . Los antisueros policlonales se obtienen desangrando el animal inmunizado en un recipiente de vidrio o plástico, incubando la sangre a 25°C durante una hora, después se incuba a 4°C durante 2-18 horas. El suero se recupera por centrifugación (por ejemplo, 1,000 g durante 10 minutos) . Alrededor de 20-50 ml por sangrado puede obtenerse de los conejos.

Los anticuerpos monoclonales se preparan usando el método estándar de Kohler & Milstein (Nature (1975) 256:495-96), o una modificación del mismo. Típicamente, un ratón o rata se inmuniza como se describe arriba. Sin embargo, en vez de desangrar el animal para extraer el suero, el bazo (y opcionalmente varios ganglios linfáticos grandes) se remueven y se disocian en células simples. Si se desea, las células del bazo pueden separarse por exclusión (después de remover las células que no se adhieren específicamente) aplicando una suspensión de célula a la placa o pozo recubierto con el antígeno de proteína. Las células B expresan la inmunoglobulina enlazada a la membrana específica para el antígeno enlazado a la placa, y no se enjuagan con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todas las células de bazo disociadas, se inducen después para fundirse con las células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, hipoxantina, aminopterina, medio de timidina, "HAT") . Las hibridomas resultantes se recubren en placas por dilución limitante, y se evalúan para la producción de anticuerpos que se enlazan específicamente al antígeno inmunizante . (y que no se enlazan a antígenos no relacionados) . Las hibridomas que secretan MAb seleccionadas se cultivan entonces ya sea in vitro (por ejemplo, en botellas de cultivo de tejido o reactores de fibra huecos), o in vivo (como ascitos en ratones). Si se desea, los anticuerpos (ya sea policlonales o monoclonales) pueden etiquetarse usando técnicas convencionales. Las etiquetas apropiadas incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radioactivos (particularmente 32P y 125I), reactivos densos en electrones, enzimas, y ligandos que tienen patrones de enlace específicos. Las enzimas se detectan típicamente por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de raíz de rábano se detecta usualmente por su capacidad para convertir la 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbencidina (TMB) a un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. El "patrón de enlace específico" se refiere a una proteína capaz de enlazar una molécula de ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico del mismo. Otros patrones de enlace específicos incluyen la biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y numerosos acoplamientos receptor-ligando conocidos en el arte. Se entenderá que la descripción anterior no es un medio para categorizar las diferentes etiquetas en distintas clases, ya que la misma etiqueta puede servir en varios modelos diferentes. Por ejemplo, la 125I puede servir como una etiqueta radioactiva o como un reactivo denso en electrones. La HRP puede servir como una enzima o como un antígeno para una MAb. Además, se pueden combinar diferentes etiquetas para el efecto deseado. Por ejemplo, las MAb y la avidina también requieren etiquetas en la práctica de esta invención: de esta manera, se puede etiquetar una MAb con biotina, y detectar su presencia con avidina etiquetada con 125I, o con una MAb anti-biotina etiquetada con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente aparentes para aquellos de habilidad ordinaria en el arte, y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención. Composi ciones Farmacéuticas . Las composiciones farmacéuticas pueden incluir ya sea polipéptidos, anticuerpos, o el ácido nucleico de la invención. Las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de ya sea polipéptidos, anticuerpos, o polinucleótidos de la invención reivindicada. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar, o prevenir una enfermedad o condición deseada, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto puede detectarse por, por ejemplo, marcadores químicos o niveles de antígeno. Los efectos terapéuticos también incluyen la reducción en síntomas físicos, tales como reducción en la temperatura corporal, cuando se dan a un paciente que tiene fiebre. La cantidad efectiva precisa para un sujeto, depende del tamaño y salud del sujeto, la naturaleza y la extensión de la condición, y los terapéuticos o combinación de terapéuticos seleccionados para la administración. De esta manera, no es útil especificar una cantidad efectiva exacta por adelantado. Sin embargo, la cantidad efectiva para una situación dada puede determinarse por una experimentación de rutina y está dentro del juicio del médico. Para los propósitos de la presente invención, una dosis efectiva será desde alrededor de 0.01 mg/kg hasta 50 mg/kg ó 0.05 mg/kg hasta alrededor de 10 mg/kg de los constructos de ADN en el individuo al cual se le administra. Una composición farmacéutica también puede contener un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador para la administración de un agente terapéutico, tal como anticuerpos o un polipéptido, genes, y otros agentes terapéuticos. El término se refiere a cualquier portador farmacéutico que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales al individuo que recibe la composición, y que puede administrarse sin toxicidad indebida. Los portadores apropiados pueden ser macromoléculas lentamente metabolizadas, grandes, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, y partículas de virus inactivas. Tales portadores son bien conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden usarse en la presente, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorohidratos, bromohidratos, fosfatos, sulfatos, y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Una discusión a fondo de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991) . Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas, pueden contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras del pH, y similares, pueden presentarse en tales vehículos. Típicamente, las composiciones terapéuticas se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas apropiadas para su solución, o su suspensión, en vehículos líquidos antes de inyectarse. Se incluyen las liposomas dentro de la definición de un portador farmacéuticamente aceptable. Métodos de Entrega . Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a tratarse pueden ser animales; en particular, pueden tratarse sujetos humanos. La entrega en directo de las composiciones, generalmente se realiza por inyección, ya sea subcutáneamente, intraperitonalmente, intravenosamente o intramuscularmente o se entrega al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse en una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdermales y transcutáneas, agujas, y pistolas de genes o hipoatomizadores. La dosis de tratamiento puede ser un programa de dosis simple o un programa de dosis múltiple. Vacunas . Las vacunas de conformidad con la invención pueden ser ya sea profilácticas (esto es, para prevenir la infección) o terapéuticas (esto es, para tratar la enfermedad después de la infección) .

Tales vacunas comprenden antígeno (s) o inmunógeno (s) inmunizantes, polipéptido (s) , inmunógeno (s) , proteína (s) o fragmentos de proteínas, o ácidos nucleicos, usualmente en combinación con "portadores farmacéuticamente aceptables", que incluyen cualquier portador que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Tales portadores típicamente son macromoléculas lentamente metabolizadas, grandes, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas), y partículas de virus inactivas. Tales portadores son bien conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Adicionalmente, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes ("adyuvantes") . Adicionalmente, el inmunógeno o antígeno puede conjugarse para un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de difteria, tétanos, cólera, H. pylori , etc., patógenos. Los adyuvantes preferidos para aumentar la efectividad de la composición incluyen, pero no se limitan a: -(1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc; (2) formulaciones de emulsión aceite en _________ agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (ver abajo) o componentes de pared de células de bacterias) , tales como por ejemplo (a) MF59 (Publ. PCT No. WO 90/14837; capítulo 10 en Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), que contiene Squalene al 5%, Tween 80 al 0.5%, y Span 85 al 0.5% (conteniendo opcionalmente varias cantidades de MTP-PE (ver abajo) , no obstante que no se requiere) formuladas en partículas de submicrón usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo HOY (Microfluidics, Newton, MA) , (b) SAF, que contiene Squalene al 10%, Tween al 0.4%, polímero bloqueador de plurónico L121 al 5%, y thr-MDP (ver abajo) ya sea microfluidizado en una emulsión de submicrón o en vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula grande, y (c) sistema adyuvante RiBi® (RAS) , (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene Squalene al 2%, Tween al 0.2%, y uno o más componentes de pared de célula del grupo que consiste de monofosforilípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y esqueleto de pared de célula (CWS) , preferiblemente MPL + CWS (Detox®) ; (3) adyuvantes de saponina, tales como Stimulon® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) pueden usarse o generar partículas de los mismos tales como los ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (4) Adyuvante de —*"* —*8* Freund Completo (CFA) y Adyuvante de Freund Incompleto (IFA); (5) citosinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc), interferones (por ejemplo, interferon gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) , factor de necrosis del tumor (TNF), etc; (6) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para aumentar la efectividad de la composición. Se prefiere el alumbre y MF59™. Como se menciona arriba, los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1' , 2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina (MTP-PE) , etc. Las composiciones inmunogénicas (por ejemplo, el antígeno/inmunógeno/polipéptido/proteína/ácido nucleico, portador farmacéuticamente aceptable, y adyuvante) contendráne diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras del pH, y similares, pueden presentarse en tales vehículos. Típicamente, las composiciones inmunogénicas se preparan como inyectables, ya sea soluciones líquidas o suspensiones, se pueden también preparar formas sólidas apropiadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos previos a la inyección. La preparación también se puede emulsificar o encapsular en liposomas para un efecto adyuvante enriquecido, como se discute arriba bajo protadores farmacéuticamente aceptables. Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas, comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de los polipéptidos inmunogénicos o antigénicos, así como cualquier otro de los componentes arriba mencionados, como sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva" significa que la administración de tal cantidad a un individuo, ya sea en una dosis simple o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratarse, el grupo taxonómico del individuo a tratarse (por ejemplo primate no humano, primate, etc) , la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar los anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica del médico que trata, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en una rango relativamente amplio que pueda determinarse a través de ensayos de rutina.

Las composiciones inmunogénicas se administran convencionalmente de manera parenteral, por ejemplo, por inyección, ya sea subcutáneamente o intramuscularmente (por ejemplo, WO 98/20734) . Las formulaciones adicionales apropiadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdermales y transcutáneas . La dosis de tratamiento puede ser un programa de dosis simple o un programa de dosis múltiple. La vacuna puede administrarse en conjunto con otros agentes inmunoreguladores . Como una alternativa a vacunas basadas en proteínas, pueden emplearse la vacunación de ADN (por ejemplo, Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283; Donnelly y colaboradores (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648; ver posteriormente aquí). Vehí culos de Entrega de Genes . Los vehículos de la terapia de genes para entregar los constructos, incluyendo una secuencia codificadora de un terapéutico de la invención, para entregarse al mamífero para la expresión en el mamífero, pueden administrarse ya sea localmente o sistemáticamente. Estos constructos pueden utilizar enfoques de vectores virales o no virales en la modalidad in vivo o ex vivo. La expresión de tal secuencia de codificación, se puede inducir con el uso de promotores endógenos mamíferos o as * a -_ heterólogos. La expresión de la secuencia codificadora in vivo, puede ser ya sea constitutiva o reguladora. La invención incluye vehículos de entrega de gen capaces de expresar las secuencias de ácido nucleico contempladas, el vehículo de entrega de gen preferiblemente es un vector viral y, más preferiblemente, un vector retroviral, adenoviral, viral asociado con adeno (AAV), viral de herpes, o alfavirus. El vector viral también puede ser un vector viral de astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus, picornavirus, virus de la viruela, o togavirus. Ver generalmente, Jolly (1994) Cáncer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6:185-193; y Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153. Los vectores retrovirales son bien conocidos en el arte, y se contempla que cualquier terapia de genes retrovirales se pueda emplear en la invención, incluyendo retrovirus del tipo B, C y D, retrovirus xenotrópicos (por ejemplo, NZB-X1, NZB-X2 y NZB9-1 (ver O'Neill (1985) J. Virol. 53:160) retrovirus politrópicos por ejemplo, MCF y MCF-MLV (ver Kelly (1993) J. Virol. 45:291), espumavirus y lentivirus. Ver RNA Tumor Viruses, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Las porciones del vector retroviral de terapia de genes, pueden derivarse de diferentes retrovirus. Por ejemplo, los LTR retrovectores pueden derivarse de un Virus de Sarcoma de Murina, un sitio de enlace tARN de un Virus de Sarcoma Rous, una señal de empaque de un Virus de Leucemia Murina, y un origen de síntesis de la segunda hebra de un Virus de Leucosis de las Aves. Estos vectores retrovirales recombinantes pueden usarse para generar partículas de transducción de un vector retroviral competente introduciéndolas en líneas de célula de empaque apropiadas (ver Patente US 5,591,624). Los vectores de retrovirus pueden construirse para la integración al sitio específico en ADN de células huésped, por la incorporación de una enzima de integrasa quimérica en la partícula retroviral (ver W096/37626) . Es preferible que el vector viral recombinante sea un virus recombinante de replicación defectuosa. Las líneas de células de empaque apropiadas para usarse con los vectores de retrovirus arriba descritos, son bien conocidas en el arte, se preparan fácilmente (ver WO95/30763 y WO92/05266) , y pueden usarse para crear líneas de célula productoras (también llamadas líneas de célula de vector o "VCL") para la producción de partículas de vector recombinante. Preferiblemente, las líneas de células de empaque, se hacen de células padre humanas (por ejemplo, células HT1080) o líneas de células padre de visón, que eliminan la inactivación en el suero humano. Los retrovirus preferidos para la construcción de 5 los vectores de terapia de gen retroviral, incluyen Virus de la Leucosis de las Aves, Virus de Leucemia de Bovino, Virus de Leucemia Murina, Virus inductor con foco en la Célula del Visón, Virus de Reticuloendoteliosis y Virus de Sarcoma de Rous. Los Virus de Leucemia Murina particularmente preferidos incluyen 4070A y 1504A (Hartley y Rowe (1976) J Virol 19:19-25), Abelson (ATCC No. VR-999); Friend (ATCC No. VR-245) , Graffi, Gross (ATCC No. VR-590), Kirsten, Virus de Sarcoma Harvey y Rauscher (ATCC No. VR-998) y Virus de Leucemia Murina de Moloney (ATCC No. VR-190) . Tales retrovirus pueden obtenerse de depósitos o colecciones tales como la American Type Culture Collection ("ATCC") en Rockville, Maryland, o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles. 20 Los vectores retrovirales de terapia de genes ejemplarmente conocidos que se emplean en esta invención, incluyen aquellos descritos en las solicitudes de patente GB2200651, EP0415731, EP0345242, EP0334301, WO89/02468; WO89/05349, WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, W093/25698, W093/25234, WO93/11230, . *.. **.

WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, US 5,219,740, US 4,405,712, US 4,861,719, US 4,980,289, US 4,777,127, US 5,591,624. Ver también Vile (1993) Cáncer Res 53:3860-3864; Vile (1993) Cáncer Res 53:962-967; Ram (1993) Cáncer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79:729- 735; Mann (1983) Cell 33:153; Cañe (1984) Prc Nati Acad Sci 81:6349; y Miller (1990) Human Gene Therapy 1. Los vectores adenovirales de terapia de genes también son conocidos en el arte y se pueden emplear en esta invención. Ver, por ejemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 y Rosenfeld (1991) Science 252:431, y WO93/07283, WO93/06223, y WO93/07282. Los vectores adenovirales de terapia de genes ejemplarmente conocidos que se pueden emplear en esta invención, incluyen aquellos descritos en los documentos a los que se hace referencia arriba y en W094/12649, WO93/03769, W093/19191, W094/28938, W095/11984, WO95/00655, WO95/27071, W095/29993, W095/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506, WO93/06223, W094/24299, WO95/14102, W095/24297, WO95/02697, W094/28152, W094/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, W094/18922 y WO95/09654. Alternativamente, la administración de ADN enlazado a adenovirus eliminados como se describe en Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147- 154, pueden emplearse. Los vehículos de entrega de genes de la invención, también incluyen vectores de virus asociado con adenovirus (AAV) . Los ejemplos notables y preferidos de tales vectores para usarse en esta invención, son los vectores basados en AAV-2 descritos en Srivastava, WO93/09239. Los vectores AAV más preferidos comprenden las dos repeticiones terminales invertidas AAV en las cuales las secuencias D nativas se modifican por la substitución de nucleótidos, de tal manera que al menos 5 nucleótidos nativos y hasta 18 nucleótidos nativos, preferiblemente al menos 10 nucleótidos nativos hasta 18 nucleótidos nativos, más preferiblemente 10 nucleótidos nativos, se retienen y los nucleótidos restantes de la secuencia D se retiran o reemplazan con nucleótidos no nativos. Las secuencias D nativas de las repeticiones de terminal invertida AAV son secuencias de 20 nucleótidos consecutivos en cada una de las repeticiones de terminal invertida AAV (esto es, es una secuencia en cada extremo) que no están involucradas en la formación HP. El nucleótido de reemplazo no nativo puede ser cualquier nucleótido diferente al nucleótido encontrado en la secuencia D nativa en la misma posición. Otros vectores AAV ejemplares que pueden emplearse, son el pWP-19, pWN-1, ambos de los cuales se describen en Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Otro ejemplo de tal vector AAV es el psub201 (ver Samulski (1987) . Virol. 61:3096). Otro vector AAV ejemplar es el vector ITR de Doble D. La construcción del vector ITR de Doble D se describe en la Patente US 5,478,745. Todavía otros vectores se describen en la Patente US de Cárter 4,797,368 y la Patente US de Muzyczka 5,139,941, Patente US de Chartejee 5,474,935, y Kotin W094/288157. Aún un ejemplo adicional del vector AAV que se puede emplear en esta invención, es el SSV9AFABTKneo, que contiene el aumentador AFP y el promotor de albúmina y dirige la expresión predominantemente en el hígado. Su estructura y construcción se describe en Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Vectores de terapia de genes AAV adicionales se describen en US 5,354,678, US 5,173,414, US 5,139,941, y US 5,252,479. Los vectores de terapia de genes de la invención, también incluyen vectores de herpes. Los ejemplos notables y preferidos son los vectores de virus de herpes simplex que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de timidina cinasa tal como aquellos descritos en la US 5,288,641 y EP0176170 (Roizman) . Los ejemplos adicionales de vectores de virus de herpes simplex incluyen HFEM/ICP6-LacZ descrito en la WO95/04139 (Wistar Institute) , pHSVlac descrita en Geller (1988) Science 241:1667-1669 y en WO90/09441 y WO92/07945, HSV Us3: :pgC-lacZ descrito en Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 y HSV 7134, 2 RH 105 y GAL4 descritos en EP 0453242 (Breakefield) , y aquellas depositadas con el ATCC como números de acceso ATCC VR-977 y ATCC VR-260. También se contemplan los vectores de terapia de genes del virus alfa que pueden emplearse en esta invención. Los vectores de virus alfa preferidos son los vectores de virus Sindbis, Togavirus, virus de Bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus Middleberg (ATCC VR-370), virus del Río Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) , virus de encefalitis equina de Venezuela (ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532), y aquellas descritas en las patentes US 5,091,309, 5,217,879, y WO92/10578. Más particularmente, se emplean aquellos vectores de virus alfa descritos en la US No. de Serie 08/405,627, presentada el 15 de Marzo de 1995, W094/21792, WO92/10578, WO95/07994, US, 5,091,309 y US 5,217,879. Tales virus alfa pueden obtenerse de depósitos o colecciones tales como el ATTC en Rockville, Maryland o se aislan de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles. Preferiblemente, se usan los vectores de virus alfa que reducen la citotoxicidad (ver USSN 08/679640) . Los sistemas de vector de ADN tales como los sistemas de expresión eucarióticos en capas, también son útiles para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Ver WO95/07994 para una descripción detallada de los sistemas de expresión eucarióticos en capas. Preferiblemente, los sistemas de expresión eucarióticos en capas de la invención se derivan de vectores de virus alfa y más preferiblemente de vectores virales Sindbis. Otros vectores virales apropiados para usarse en la presente invención incluyen aquellos derivados del virus de la polio, por ejemplo ATCC VR-58 y aquellos descritos en Evans, Nature 339 (1989) 385 y Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115; rinovirus, por ejemplo ATTC VR-1110 y aquellos descritos en Arnold (1990) J Cell Biochem L401; virus de la viruela tales como virus de la viruela del canario o virus de vacuna, por ejemplo ATCC VR-111 y ATCC VR-2010 y aquellos descritos en Fisher-Hoch (1989) Proc Nati Acad Sci 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; en US 4,603,112 y US 4,769,330 y WO89/01973; virus SV40, por ejemplo ATCC VR-305 y aquellos descritos en Mulligan (1979) Nature 277:108 y Madzak (1992) J Gen Virol 73:1533; virus de influenza, por ejemplo ATCC VR-797 y virus de influenza recombinante hecho empleando técnicas de genética inversa como se describe en la US 5,166,057 y en Enami (1990) Proc Nati Acad Sci 87:3802-3805; Anami & Palese (1991) J Virol 65:2711-2713 y Luytjes (1989) Cell 59:110, (ver también McMichael (1983) NEJ Med 309:13, y Yap (1978) Nature 273:238 y Nature (1979) 277:108); virus de inmunodeficiencia humana como se describe en la EP- 0386882 y en Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; virus del sarampión, por ejemplo ATCC VR-67 y VR-1247 y aquellos descritos en la EP-0440219; virus Aura, por ejemplo ATCC VR-368; virus Bebaru, por ejemplo ATCC VR-600 y ATCC VR-1240; virus Cabassou, por ejemplo ATCC VR-922; virus Chikunguya, por ejemplo, ATCC VR-64 y ATCC VR-1241: virus FortMorgan, por ejemplo ATCC VR-924; virus Getah, por ejemplo ATCC VR-369 y Atcc VR-1243; virus Kyzulagach, por ejemplo ATCC VR-927; virus Mayaro, por ejemplo ATCC VR-66; virus Muca bo, por ejemplo ATCC VR-580 y ATCC VR-1244; virus Ndumu, por ejemplo ATCC VR-371; virus Pixuna, por ejemplo ATCC VR-372 y ATCC VR-1245; virus Tonate, por ejemplo ATCC VR-925; virus Triniti, por ejemplo ATCC VR-469; virus Una, por ejemplo ATCC VR-374; virus Whataroa, por ejemplo ATCC VR-926; virus Y-62-33, por ejemplo ATCC VR-375; virus O'Nyong, virus de encefalitis Eastern, por ejemplo ATCC VR-65 y ATCC VR-1242; virus de encefalitis Western, por ejemplo ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 y ATCC VR-1252; y coronavirus, por ejemplo ATCC VR-740 y aquellos descritos en Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121:190.

La entrega de las composiciones de esta invención en células no se limita a aquellos vectores virales mencionados. Pueden emplearse otros medios y métodos de entrega tales como, por ejemplo, vectores de expresión de ácido nucleico, ADN condensado policatiónico enlazado o no enlazado a solamente adenovirus eliminado, por ejemplo ver la US No. de Serie 08/366,787, presentada el 30 de Diciembre de 1994 y Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147- 154; ADN enlazado al ligando, por ejemplo ver Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987, células de vehículos de entrega de célula eucariótica, por ejemplo, ver la US No. de Serie 08/240,030, presentada el 9 de Mayo de 1994, y la US No. de Serie 08/404,796, deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizado, pistola manual de partículas de transferencia de genes, como se describe en la Patente US 5,149,655, radiación ionizada como se describe en la US 5,206,152 y en la WO92/11033, neutralización o fusión de la carga nucleica con membranas de célula. Enfoques adicionales se describen en Philip (1994) Mol Cell Biol 14:2411-2418 y en Woffendin (1994) Proc Nati Acad Sci 91:1581-1585. Puede emplearse la transferencia de genes mediada por partículas, por ejemplo ver la US No. de Serie 60/023,867. Brevemente, la secuencia puede insertarse en vectores convencionales que contienen secuencias de control convencionales para expresión de alto nivel, y entonces se incuban con moléculas de transferencia de gen sintéticas tales como cationes enlazados al ADN poliméricos tales como polilisina, protamina, y albúmina, enlazados a los ligandos objetivos de la célula tales como asialoorosomucoide, como se describe en Wu y Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432, insulina como se describe en Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253-263, galactosa como se describe en Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:533-539, lactosa o transferrina. También puede emplearse ADN despojado para transformar una célula huésped. Los métodos de introducción de ADN despojado ejemplares se describen en WO 90/11092 y US 5,580,859. La eficiencia en la incorporación puede mejorarse usando perlas de látex biodegradables. Las perlas de látex recubiertas con ADN se transportan eficientemente en las células después del inicio de la endocitosis por las perlas. El método puede mejorarse además, por el tratamiento de las perlas para incrementar la hidrofobicidad y facilitando por ello la disrupción de la endosoma y la liberación del ADN en el citoplasma. Las liposomas que pueden actuar como vehículos de liberación de genes se describen en US 5,422,120, W095/13796, W094/23697, W091/14445 y EP-524,968. Como se describe en la USSN 60/023,867, en una entrega no viral, las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido pueden insertarse en vectores convencionales que contienen secuencias de control convencionales para la expresión a alto nivel, y después incubarse con moléculas de transferencia de gen sintéticas tales como cationes enlazados al ADN polimérico, tales como polilisina, protamina, y albúmina, enlazados a ligandos objetivo de célula tales como asialoorosomucoide, insulina, galactosa, lactosa, o transferrina. Otros sistemas de entrega incluyen el uso de liposomas para encapsular el ADN que comprende el gen bajo el control de una variedad de promotores activos de la ubicuidad o específicos del tejido. Además, la entrega no viral apropiada para usarse incluye sistemas de entrega mecánicos tales como el enfoque descrito en Woffendin y colaboradores (1994), Proc. Nati. Sci. USA 91 (2 ): 11581-11585. Por otra parte, la secuencia que codifica y el producto de expresión de tal, pueden entregarse a través de la deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizado. Otros métodos convencionales para la entrega de genes que pueden usarse para la entrega de la secuencia de codificado incluyen, por ejemplo, el uso de una pistola manual de transferencia de partículas de genes, como se describe en U.S. 5,149,655; el uso de ¡¡¡^¡ y radiación ionizante para activar el gen transferido, como se describe en U.S. 5,206,152 y WO92/11033. Los vehículos de entrega de genes de liposoma y policatiónicos ejemplares, son aquellos descritos en las US 5,422,120 y 4,762,915; en W095/13796; W094/23697; y W091/14445; en EP-0524968; y en Stryer, Biochemistry, páginas 236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc Nati Acad Sci 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420. Una composición de polinucleótidos puede comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un vehículo de terapia de genes, como el término se define arriba. Para los propósitos de la presente invención, una dosis efectiva será desde alrededor de 0.01 mg/kg hasta 50 mg/kg ó de 0.05 mg/kg hasta alrededor de 10 mg/kg de los constructos de ADN en el individuo al cual se administran. Métodos de Entrega . Una vez formuladas, las composiciones de polinucleótidos de la invención pueden administrarse (1) directamente al sujeto; (2) entregarse ex vivo, a las células derivadas del sujeto; o (3) in vi tro por la expresión de proteínas recombinantes. Los sujetos a tratarse pueden ser mamíferos o aves. También, pueden tratarse sujetos humanos. La entrega en directo de las composiciones, generalmente se realiza por la inyección, ya sea subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente o entregarse en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse en una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdermales o transcutáneas (por ejemplo, ver WO98/20734), agujas, y pistolas de genes o hipoatomizados . La dosis de tratamiento puede ser un programa de dosis simple o un programa de dosis múltiple. Los métodos para la entrega ex vivo y el reimplante de las células transformadas en un sujeto, son conocidos en el arte y se describen en, por ejemplo, W093/14778. Los ejemplos de células útiles en las aplicaciones ex vivo incluyen, por ejemplo, células madre, particularmente hematopoyéticas, células linfáticas, macrófagos, células dendríticas, o células de tumor. Generalmente, la entrega de ácidos nucleicos para aplicaciones tanto ex vivo como in vi tro, puede realizarse por los siguientes procedimientos, por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación _£^|ggi g^g£¡ de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en las liposomas, y microinyección en directo del ADN en los núcleos, todos bien conocidos en el arte. Composiciones farmacéuticas de polinucleótidos y polipéptidos . Además de los portadores y sales farmacéuticamente aceptables descritas arriba, pueden usarse los siguientes agentes adicionales con las composiciones de polinucleótidos y/o polipéptidos. A. Polipéptidos. Un ejemplo son los polipéptidos que incluyen, sin limitación: asialoorosomucoide (ASOR) ; transferrina; asialoglicoproteínas; anticuerpos; fragmentos de anticuerpos; ferritina; interlecucinas; interferones, granulocitos, factor estimulante de la colonia de macrófagos (GM-CSF) , factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF) , factor estimulante de la colonia de macrófago (M-CSF) , factor de célula madre y eritropoyetina. Los antígenos virales, tales como proteínas envueltas, también pueden usarse. También, las proteínas de otros orgánicos invasores, tales como el péptido de 17 aminoácidos de la proteína circunesporozoita del falciparum plasmodium conocida como RII. B. Hormonas, Vitaminas, Etc. Otros grupos que pueden incluirse en una composición farmacéutica incluyen, por ejemplo: hormonas, esteroides, andrógenos, estrógenos, hormona de la tiroides, o vitaminas, ácido fólico. C. Polialquilenos, Polisacáridos, etc. También, el polialquilen glicol puede incluirse en las composiciones farmacéuticas con los polinucleótidos y/o polipéptidos deseados. En una modalidad preferida, el polialquilen glicol es el polietilen glicol. Además, pueden incluirse los mono-, di-, ó polisacáridos. En una modalidad preferida de este aspecto, el polisacárido es dextrano o DEAE-dextrano. También, puede incluirse quitosan y poli (lacturo-co-glicólido) en la composición farmacéutica. D. Lípidos, y Liposomas. El polinucleótido o polipéptido deseado también puede encapsularse en lípidos o empacarse en liposomas antes de entregarse al sujeto o a las células derivadas del mismo. La encapsulación de lípidos generalmente se realiza usando liposomas que son capaces de enlazarse establemente o atraparse y retener el ácido nucleico o polipéptido. La relación de polinucleótido condensado a la preparación de lípido, puede variar pero generalmente está alrededor de 1:1 (mg de ADN:micromoles de lípido), o más de lípido. Para una revisión del uso de liposomas 5 como portadores para la entrega de ácidos nucleicos, ver, Hug y Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527. Las preparaciones liposomales para usarse en la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente) , aniónicas (cargadas negativamente) y neutrales. Las liposomas catiónicas han demostrado mediar la entrega intracelular del plásmido de ADN (Felgner (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413- 7416); mARN (Malone (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6077-6081); y factores de transcripción purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192), en forma funcional . Las liposomas catiónicas están fácilmente disponibles. Por ejemplo, las liposomas de N (1-2,3- 20 dioleiloxi) propil) -N, N, N-trietilamonio (DOTMA) están disponibles bajo la marca registrada Lipofectina, de GIBCO BRL, Grand Island, NY. (Ver, también, Felgner supra ) . Otras liposomas comercialmente disponibles incluyen transfectasa (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger) . Otras liposomas catiónicas pueden prepararse a partir de materiales fácilmente disponibles usando técnicas bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Szoka (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:4194- 4198; WO90/11092 para una descripción de la síntesis de las liposomas DOTAP (1, 2-bis (oleoiloxi) -3- (trimetilamonio) propano) . Similarmente, las liposomas aniónicas y neutrales están fácilmente disponibles, tales como de Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) , o pueden prepararse fácilmente usando materiales rápidamente disponibles. Tales materiales incluye fosfatidil colina, colesterol, fosfatidil etanolamina, dioleoilfosfatidil colina (DOPC), dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG), dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales pueden mezclarse también con los materiales de partida DOTMA Y DOTAP en relaciones apropiadas. Los métodos para elaborar liposomas que usan estos materiales son bien conocidos en el arte. Las liposomas pueden comprenden vesículas multilamelares (MLV) , vesículas unilamelares pequeñas (SUV) , o vesículas unilamelares grandes (LUV) . Los diferentes complejos liposoma-ácido nucleico se preparan usando métodos conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Straubinger (1983) Meth. Immunol . 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim, Biophys, Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer y Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraley (1979) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76:3348); Enoch & Strittmatter (1979) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka y Paphadjopoulos (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:145; y Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166. E. Lipoproteínas. Además, las lipoproteínas pueden incluirse con el polinucleótido o polipéptido a entregarse. Los ejemplos de lipoproteínas a utilizarse incluyen: quilomicrones, HDL, IDL, LDL, y VLDL. Mutantes, fragmentos, o fusiones de estas proteínas pueden también usarse. También, pueden usarse modificaciones de lipoproteínas que se presentan naturalmente, tales como la LDL acetilada. Estas lipoproteínas pueden dirigir la entrega de polinucleótidos a células que expresan los receptores de lipoproteína. Preferiblemente, si las lipoproteínas se incluyen con el polinucleótido a entregarse, ningún otro ligando objetivo se incluye en la composición. Las lipoproteínas que se presentan naturalmente comprenden un lípido y una porción de proteína. Las porciones de proteína se conocen como apoproteínas. En la presente, las apoproteínas A, B, C, D, y E se han aislado e identificado. Al menos dos de estas contienen varias proteínas, designadas por los números Romanos, AI, AII, AIV; Cl, CU, CIII. Una lipoproteína puede comprender más de una apoproteína. Por ejemplo, los quilomicrones que se presentan naturalmente que comprenden A, B, C, y E; con el tiempo estas lipoproteínas pierden la A y adquieren las apoproteínas C y E. La VLDL comprende las apoproteínas A, B, C, y E, LDL comprende la apoproteína B; y HDL comprende las apoproteínas A, C, y E. Las secuencias de aminoácido de estas apoproteínas se conocen y se describen en, por ejemplo, Breslow (1985) Annu Rev. Biochem 54:699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J Biol Chem 261:12918; Kane (1980) Proc Nati Acad Sci USA 77:2465; y Utermann (1984) Hum Genet 65:2323. Las lipoproteínas contienen una variedad de lípidos, que incluyen, triglicéridos, colesterol (libre y esteres), y fosfolípidos. La composición de los lípidos varía en lipoproteínas que se presentan naturalmente. Por ejemplo, los quilomicrones comprenden principalmente triglicéridos. Una descripción más detallada del contenido de lípidos de lipoproteínas que se presentan naturalmente puede encontrarse en, por ejemplo, Meth.

Enzymol. 128(1986). La composición de los lípidos se elige para ayudar en la conformación de la apoproteína para la actividad de enlace al receptor. La composición de lípidos puede también elegirse para facilitar la interacción hidrofóbica y la asociación con la molécula enlazada al polinucleótido. Las lipoproteínas que se presentan naturalmente pueden aislarse del suero por ultracentrifugación, por ejemplo. Tales métodos se describen en Meth. Enzymol. ( supra ) ; Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 y Mahey (1979) J Clin. Invest 64:743-750. Las lipoproteínas también pueden producirse por métodos in vi tro o recombinantes por la expresión de los genes de apoproteína en las células huésped deseadas. Ver, por ejemplo, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15:403 y Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30:443. Las lipoproteínas también pueden adquirirse de proveedores comerciales, tales como Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachussets, EUA. Una descripción adicional de las lipoproteínas puede encontrarse en Zuckermann y colaboradores, WO 98/06437. F. Agentes Policatiónicos. Los agentes policatiónicos pueden incluirse, con o sin lipoproteína, en una composición con el polinucleótido y/o el polipéptido deseado a entregarse.

Los agentes policatiónicos, típicamente, exhiben una carga positiva neta a un pH fisiológico relevante y son capaces de neutralizar la carga eléctrica de los ácidos nucleicos para facilitar la entrega a una lugar deseado. Estos agentes tienen aplicaciones tanto in vi tro, ex vivo, e in vivo. Los agentes policatiónicos pueden usarse para entregar ácidos nucleicos a un sujeto vivo ya sea intramuscularmente, subcutáneamente, etc. Los siguientes son ejemplos de polipéptidos útiles como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina, poliornitina, y protamina. Otros ejemplos de polipéptidos útiles incluyen histonas, protaminas, albúmina de suero humano, proteínas enlazadas al ADN, proteínas cromosomales no de histona, proteínas recubiertas de virus de ADN, tales como FX174, los factores transcripcionales también contienen dominios que enlazan el ADN y por lo tanto pueden ser útiles como agentes condensadores auxiliares del ácido nucleico. Brevemente, los factores transcripcionales tales como C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF. Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP, y TFIID contienen dominios básicos que enlazan secuencias de ADN. Los agentes policatiónicos orgánicos incluyen: espermina, espermidina, y purtrescina.

Las dimensiones de las propiedades físicas de un agente policatiónico pueden extrapolarse de la lista anterior, para construir otros agentes policatiónicos de polipéptidos o para producir agentes policatiónicos sintéticos. Los agentes policatiónicos sintéticos que son útiles en incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno. Los Lipofectin® y lipofectAMINE® son monómeros que forman complejos policatiónicos cuando se combinan con polinucleótidos o polipéptidos. Ensayos de Inmunodiagnóstico . Los antígenos de meningococos de la invención, pueden usarse en los inmunoensayos para detectar los niveles de anticuerpos (o, a la inversa, los anticuerpo anti-meningococos pueden usarse para detectar niveles de antigenos) . Los inmunoensayos basados en antígenos recombinantes, bien definidos, pueden desarrollarse para reemplazar métodos de diagnóstico invasores. Pueden detectarse los anticuerpos para proteínas de meningococos dentro de muestras biológicas, incluyendo por ejemplo, muestras de sangre o suero. El diseño de los inmunoensayos se sujeta a un gran nivel de variación, y una variedad de éstos se conocen en el arte. Los protocolos para el inmunoensayo pueden basarse, por ejemplo, en la competencia, o reacción directa, o ensayos de tipo intercalado. Los protocolos también pueden, por ejemplo, usar soportes sólidos, o pueden ser por inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos involucran el uso de anticuerpos etiquetados o polipéptidos; las etiquetas pueden ser, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas, o de tinte. Los ensayos que amplifican las señales de la sonda también son conocidos; ejemplos de tales son los ensayos que utilizan biotina y avidina, y los inmunoensayos etiquetados y mediados por la enzima, tales como ensayos ELISA. Los kits apropiados para inmunodiagnósticos y que contienen los reactivos de etiquetado apropiados, se construyen empacando los materiales apropiados, incluyendo las composiciones de la invención, en recipientes apropiados, junto con los reactivos restantes y materiales (por ejemplo, soluciones amortiguadoras apropiadas, soluciones salinas, etc.) requeridas para conducir el ensayo, así como el juego de instrucciones de ensayo apropiadas. Hibridación del Ácido Nucleico. La "hibridación" se refiere a la asociación de dos secuencias de ácido nucleico una con la otra por enlace de hidrógeno. Típicamente, una secuencia se fija a un soporte sólido y la otra queda libre en la solución.

Entonces, las dos secuencias se colocan en contacto una con la otra bajo condiciones que favorecen el enlace de hidrógeno. Los factores que afectan este enlace incluyen: el tipo y volumen del solvente; la temperatura de reacción; tiempo de hibridación; agitación; agentes para bloquear el enlace no específico de la secuencia en fase líquida al soporte sólido (reactivo Denhardt o BLOTTO) ; concentración de las secuencias; uso de los compuestos para incrementar la relación de asociación de secuencias (sulfato de dextrano o polietilen glicol); y la severidad de las condiciones de lavado después de la hibridación. Ver Sambrook y colaboradores ( supra ) volumen 2, capítulo 9, páginas 9.47 hasta 9.57. "Severidad" se refiere a las condiciones en la reacción de hibridación que favorecen la asociación de secuencias muy similares sobre secuencias que son diferentes. Por ejemplo, la combinación de temperatura y concentración de sal deberá elegirse que sea de aproximadamente de 120 hasta 200°C debajo del Tm calculado del híbrido bajo estudio. La temperatura y las condiciones de sal, frecuentemente se determinan empíricamente en experimentos preliminares en los cuales se hibridizan muestras de ADN genómico inmovilizadas en filtros, para la secuencia de interés y entonces se lavan bajo condiciones de diferente severidad. Ver Sambrook y colaboradores, en la página 9.50. Las variables a considerar cuando se ejecuta, por ejemplo, un manchado Southern son (1) la complejidad del ADN manchado y (2) la homología entre la sonda y las secuencias detectadas. La cantidad total de los fragmentos a estudiarse puede variar en una magnitud de , desde 0.1 hasta 1 µg para un plásmido o un fago digerido hasta 10"9 hasta 10"8 g para un gen de copia simple en un genoma eucariótico altamente complejo. Para polinucleótidos de baja complejidad, pueden usarse el manchado, la hibridación, y los tiempos de exposición substancialmente más cortos, una cantidad más pequeña de polinucleótidos de partida y una actividad específica de sondas más baja. Por ejemplo, un gen de levadura de copia simple puede detectarse con un tiempo de exposición de solo 1 hora, iniciando con lµg de ADN de levadura, manchado por dos horas, e hibridizando durante 4-8 horas con una sonda de 108 cpm/µg. Para un gen de mamífero de copia simple, un enfoque conservador iniciaría con 10 µg de ADN, manchado durante la noche, e hibridizado durante la noche en presencia de sulfato de dextrano al 10% usando una sonda de más de 108 cpm/µg, resultando en un tiempo de exposición de ~24 horas.

Varios factores pueden afectar la temperatura de fusión (Tm) de un híbrido ADN-ADN entre la sonda y el fragmento de interés, y en consecuencia, las condiciones apropiadas para la hibridación y lavado. En muchos casos, la sonda no es 100% homologa al fragmento. Otras variables comúnmente encontradas incluyen la longitud y el contenido G+C total de las secuencias hibridizantes y la resistencia iónica y el contenido de formamida de la solución amortiguadora de hibridación. Los efectos de todos estos factores pueden aproximarse por una ecuación simple: Tm=81 + 16.6(loglOCi) + 0.4(%(G + C) ) - 0.6 (%formamida) -600/n - 1.5(%no correspondencia) en donde Ci es la concentración de sal (iones monovalentes) y n es la longitud del híbrido en los pares base (ligeramente modificados a partir de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284). En el diseño de un experimento de hibridación, algunos factores que afectan la hibridación del ácido nucleico pueden alterarse convenientemente. La temperatura de la hibridación y los lavados y la concentración de sal durante los lavados son simplemente ajustados. Cuando la temperatura de la hibridación se incrementa (esto es, la severidad) , esta se vuelve menos apropiada para que ocurra la hibridación entre las hebras que no son homologas, y como resultado, se reduce el respaldo. Si la sonda de radioetiquetado no es completamente homologa con el fragmento inmovilizado (como frecuentemente es el caso en la familia de genes y en experimentos de hibridación interespecies) , la temperatura de hibridación deberá reducirse, y el respaldo aumenta. La temperatura de los lavados afecta la intensidad de la banda de hibridación y el grado de respaldo de una manera similar. La severidad de los lavados también se incrementa con las concentraciones de sal reducidas. En general, las temperaturas de hibridación convenientes en la presencia de formamida al 50% son de 42 °C para una sonda que es del 95% hasta el 100% homologa con el fragmento objetivo, 37°C para un 90% hasta 95% de homología, y 32°C para un 85% hasta 90% de homología. Para homólogos inferiores, el contenido de formamida deberá reducirse y la temperatura ajustarse en consecuencia, usando la ecuación anterior. Si la homología entre la sonda y el fragmento objetivo no se conoce, el enfoque más simple es el iniciar tanto con condiciones de hibridación como de lavado que no son severas. Si las bandas no específicas o de respaldo alto se observan después de la autoradiografía, el filtro puede lavarse a alta severidad y volverse a exponer. Si el tiempo requerido para la exposición hace este enfoque no práctico, deberán probarse varias severidades de hibridación y/o lavado en paralelo. Ensayos de Sonda de Ácido Nucleico. Los métodos tales como PCR, ensayos de sonda de ADN ramificado, o técnicas de manchado que utilizan sondas de ácido nucleico de conformidad con la invención, pueden determinar la presencia de cADN o mARN. Una sonda se dice que "hibridiza" con una secuencia de la invención si esta puede formar un complejo de hebra duplas ó doble, que es lo suficientemente estable para detectarse. Las sondas de ácido nucleico se hibridizan a las secuencias de nucleótidos de meningococos de la invención (incluyendo hebras tanto sentido como anti-sentido) . Aunque muchas secuencias de nucleótido diferentes codifican la secuencia de aminoácido, la secuencia de meningococos nativa se prefiere debido a que es la secuencia actual presente en las células. El mARN representa una secuencia de codificación y así una sonda es complementaria a la secuencia de codificación; el cADN de hebra simple es complementaria al mARN, y así el cADN es complementario a la secuencia no de codificación. La secuencia de sonda no necesita ser idéntica a la secuencia de meningococos (o su complemento) - alguna variación en la secuencia y la longitud puede llevar a una sensibilidad de ensayo incrementada si la sonda de ácido nucleico puede formar un duplas con nucleótidos objetivo, que puede detectarse. También, la sonda de ácido nucleico puede incluir nucleótidos adicionales para estabilizar el duplas formado. La secuencia adicional de meningococos puede también ayudar como una etiqueta para detectar el duplas formado. Por ejemplo, una secuencia de nucleótido no complementaria puede enlazarse al extremo 5' de la sonda, con el resto de la secuencia de sonda siendo complementario a una secuencia de meningococos. Alternativamente, las bases no complementarias o secuencias más largas pueden diseminarse en la sonda, con la condición de que la secuencia de sonda sea lo suficientemente complementaria con la secuencia de meningococos con objeto de hibridizar entre ellas y por lo tanto formar un duplas que pueda detectarse. La longitud exacta y la secuencia de la sonda dependerán de las condiciones de hibridación, tales como temperatura, condición de sal y similares. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia del analito, la sonda de ácido nucleico contiene típicamente al menos 10-20 nucleótidos, preferiblemente 15-25, y más preferiblemente al menos 30 nucleótidos, no obstante que puede ser más corta que esto. Los cebadores cortos generalmente requieren temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con la plantilla. Las sondas pueden producirse por procedimientos sintéticos, tales como el método triéster de Matteucci y colaboradores (J. Am. Chem. Soc (1981) 103:3185), o de conformidad con Urdea y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1983) 80:7461), o usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados comercialmente disponibles . La naturaleza química de la sonda puede seleccionarse de conformidad con la preferencia. Para ciertas aplicaciones, son apropiados el ADN o el ARN. Para otras aplicaciones, pueden incorporarse modificaciones, por ejemplo, modificaciones en la columna, tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, pueden usarse para incrementar la vida media in vivo, alterar la afinidad del ARN, incrementar la resistencia a la nucleasa etc. (por ejemplo, ver Agrawl e Iyer (1995) Curr Opin Biotechnol 6:12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:376-.87); análogos tales como ácidos nucleicos de péptidos pueden también usarse (por ejemplo, ver Corey (1997) TIBTECH 15:224-229; Buchardt y colaboradores (1993) TIBTECH 11:384-386). Alternativamente, la reacción de cadena de polimerasa (PCR) es diferente a los medios bien conocidos para detectar cantidades pequeñas de ácidos nucleicos objetivos. El ensayo se describe en: Mullis y colaboradores (Meth. Enzymol, (1987) 155:335-350); patente US 4,683,195; y patente US 4,683,202. Dos "cebadores" nucleótidos hibridizan con los ácidos nucleótidos objetivo y se usan para cebar la reacción. Los cebadores pueden comprender secuencias que no hibridizan a la secuencia del objetivo de amplificación (o su complemento) para ayudar con estabilidad duplas o, por ejemplo, para incorporar un sitio de restricción conveniente. Típicamente, tales secuencias flanquean la secuencia de meningococos deseada. Una polimerasa termoestable crea copias de ácidos nucleicos objetivo de los cebadores usando los ácidos nucleicos objetivo originales como una plantilla. Después de que se genera una cantidad de umbral de los ácidos nucleicos objetivo por la polimerasa, estos pueden detectarse por métodos más tradicionales, tales como manchado Southern. Cuando se usa el método de manchado Southern, la sonda de etiquetado hibridiza a la secuencia de meningococos (o a su complemento) . También, el cARN o cADN pueden detectarse por técnicas de manchado tradicionales descritas en Sambrook y colaboradores ( supra ) . El mARN, o cADN generados a partir de mARN usando una enzima de polimerasa, pueden ft¿g-ájg purificarse y separarse usando electroforesis en gel. Los ácidos nucleicos en el gel se manchan después en un soporte sólido, tal como nitrocelulosa. El soporte sólido se expone a una sonda de etiquetado y se lava después para remover cualquier sonda no hibridizada. A continuación, los duplas que contienen la sonda etiquetada se detectan. Típicamente, la sonda se etiqueta con una porción radioactiva. EJEMPLOS DE FRAGMENTOS PREFERIDOS Las secuencias de proteína descritas en WO 99/36544, se han sometido a un análisis por computadora para predecir fragmentos antigénicos de péptidos dentro de proteínas de longitud completa. Estos algoritmos se han usado en el análisis: • AMPHI. Este programa ha sido utilizado para predecir los epítopes de células T (Gao et al. (1989) J. Immunol. 143: 3007; Roberts et al. (1996) AIDS Res Human Retrovir 12:593; Quakyi et al. (1992) Scand J Im unol compl .. 11:9) y está disponible en el paquete Protean de DNASTAR, Inc. (1228 Soth Parker Street, Madison, Wisconsin 53715 EUA) . • ÍNDICE ANTIGÉNICO, como se describe por Jameson y Wolf (1988) The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants . CABIOS 4:181:186.

• AFINIDAD HIDROFÍLICA, como se describe en Hopp y Woods (1981) Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. PNAS USA 78:3824-3828. La Tabla I indica fragmentos preferidos de las proteínas descritas en WO 99/36544. Los tres algoritmos identifican a menudo a los mismos fragmentos (por ejemplo, ORF38-1 - los fragmentos del residuo 37-42 y 143-146 se identifican ambos dos veces) . Son particularmente preferidos tales fragmentos identificados por multiplicación. Los algoritmos identifican a menudo fragmentos traslapantes (por ejemplo, ORF 40-1 - AMPHI identifica los residuos 161-165, y la afinidad hidrofílica identifica los residuos 163-175) . La invención incluye explícitamente fragmentos que resultan de una combinación de estos fragmentos que se traslapan ( por ejemplo, el fragmento del residuo 161 al residuo 175 en el caso de ORF40-1) . Los fragmentos separados por un aminoácido simple se identifican a menudo también (por ejemplo, ORF40-1 índice Antigénico 423-426 y 428-438) . La invención también incluye fragmentos en el intervalo de los dos extremos de tales fragmentos "adyacentes" (por ejemplo, 423-438 para ORF40-1) . a^iisg ¡ Tabla I - 1769 fragmetnos de las proteinas descritas en W099/36544. Clave: Fragmento #1 de la presente solicitud es los aminoácidos 6-14 de 0RF38-1 descritos en W099/36544, fragmento #2 de la presente solicitud es los aminoácidos 57-59 de ORF38-41 descritos en W099/36544 etc.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un fragmento de una proteína descrita en WO 99/36544, caracterizado porque el fragmento comprende al menos un determinante antigénico
2. El fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una longitud de 100 aminoácidos o menos.
3. El fragmento de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque tiene una longitud de 3 aminoácidos o más.
4. El fragmento de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es uno de los 1769 fragmentos de la tabla I.
5. Un polipéptido que tiene 50% o más de identidad de secuencia al fragmento de cualesquiera de las reivindicaciones anteriores.
6. Una proteína caracterizada porque comprende uno o más de los fragmentos de la reivindicación 1, reivindicación 2 ó reivindicación 3, con la condición de que la proteína no sea una de las 45 secuencias completas de proteínas descritas en WO 99/36544.
7. Un anticuerpo, caracterizado porque reconoce el fragmento de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la .
8. Una proteína que comprende una secuencia de péptidos, caracterizada porque la secuencia de péptidos se reconoce por un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7.
9. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica el fragmento de la reivindicación 1, reivindicación 2, o reivindicación 3, al polipéptido de la reivindicación 5 o a la proteína de la reivindicación 8.
10. Una composición que comprende el fragmento de la reivindicación 1, reivindicación 2, o reivindicación 3, al polipéptido de la reivindicación 5, a la proteína de la reivindicación 8, el anticuerpo de la reivindicación 7 y/o el ácido nucleico de la reivindicación 9, caracterizada porque la composición es una vacuna, un reactivo de diagnóstico, o una composición inmunogénica.
11. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque se usa como un medicamento.
12. El uso del fragmento de la reivindicación 1, reivindicación 2, o reivindicación 3, al polipéptido de la reivindicación 5, a la proteína de la reivindicación 8, el anticuerpo de la reivindicación 7 y/o el ácido nucleico de la reivindicación 9, en la fabricación de (i) un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección debida a las bacterias de Neisseria (ii) un reactivo de diagnóstico para detectar la presencia de 5 bacterias de Neisseria o de anticuerpos planteados contra las bacterias y/o (iii) un reactivo que puede plantear anticuerpos contra las bacterias de Neisseria.
13. Un método para el tratamiento de un paciente, caracterizado porque comprende administrar a un paciente, 10 una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de conformidad con la reivindicación 10. lfiWfa j¡g*j*jjj ljjjggg<Mj|*«-l^ - . j? ?,? * *¿- j L~?. ?M * .» - . . ,___ . ^*^t****. „ **. ** __._ - ' '^*£__