PT2270030E

PT2270030E - Expressão heteróloga de proteínas de neisseria

Info

Publication number: PT2270030E
Application number: PT10178586T
Authority: PT
Inventors: Maria B Arico; Maurizio Comanducci; Cesira Galeotti; Vega Masignani; Marzia Monica Giuliani; Mariagrazia Pizza
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2012-07-24
Also published as: CA2400562C; CY1107447T1; CN1426473A; CA2689666A1; EP2270031A2; DK1947187T5; ATE352631T1; CA2744921C; PT1947187E; US20170080076A1; US20140294885A1; ES2360746T9; RU2304617C2; EP1947187B1; JP2013005816A; EP1261723B1; LU92240I2; JP2011083287A; CA2400570A1; CY1106532T1

Description

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DESCRIÇÃO "EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS DE NEISSERIA"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção insere-se no campo da expressão de proteínas. Em particular, refere-se à expressão heteróloga de proteínas de Neisseria (por exemplo, N. gonorrhoeae ou, preferentemente, N. meningitidis).

ANTECEDENTES

Os pedidos de patente internacional W099/24578, W099/36544, WO99/57280 e WO00/230 revelam proteínas de

Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeae. Estas proteínas são tipicamente descritas como sendo expressas em E. coli (isto é, expressão heteróloga) como fusões de GST N terminal ou fusões de cauda de His C terminal, embora outros sistemas de expressão, incluindo a expressão em Neisseria nativa, sejam também revelados. É um objecto da presente invenção proporcionar uma abordagem alternativa e melhorada para a expressão heteróloga de estas proteínas. Esta abordagem afectará tipicamente o nível de expressão, a facilidade de purificação, a localização celular de expressão, e/ou as propriedades imunológicas da proteína expressa. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Nomenclatura no presente documento

As convenções de denominação usadas no documento WO99/57280 são usadas no presente documento (por exemplo, 'm287', 'g287' e 'a287' etc.).

Sequências A invenção também proporciona uma proteína ou um ácido nucleico que tem qualquer uma das sequências estabelecidas nos seguintes exemplos. Também proporciona proteínas e ácido nucleico que tem identidade de sequências a estas. 0 grau de 'identidade de sequências' é preferentemente mais 2 de 50 % (por exemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou mais) .

Identidade é preferentemente determinada pelo algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman como é implementado no programa de MPSRCH (Oxford Molecular), usando uma pesquisa de lacuna afim com parâmetros penalidade de lacuna aberta = 12 e penalidade de extensão de lacuna = 1. Tipicamente, 50 % de identidade ou mais entre duas proteínas é considerado como sendo uma indicação de equivalência funcional.

Além disso, a invenção proporciona ácido nucleico que pode hibridar ao ácido nucleico revelado nos exemplos, preferentemente sob condições de "alta restringência" (por exemplo, 65C num 0,lxSSC, 0,5 % de solução de SDS). A invenção também proporciona ácido nucleico que codifica proteínas de acordo com a invenção.

Deve também ser apreciado que a invenção proporciona ácido nucleico que compreende sequências complementares a aquelas descritas anteriormente (por exemplo, para antissense ou propósitos de sondagem). Ácido nucleico de acordo com a invenção pode, claro, ser preparado de muitas maneiras (por exemplo, por meio de síntese química, a partir de bibliotecas genómicas ou de ADNc, do próprio organismo etc.) e pode assumir várias formas (por exemplo, cadeia simples, cadeia dupla, vectores, sondas etc.).

Além disso, o termo "ácido nucleico" inclui ADN e ARN, e também os seus análogos, tais como aqueles que contém estruturas principais modificadas, e também ácidos nucleicos peptídicos (PNA) etc.

Proteínas preferidas para utilização de acordo com a invenção são aquelas de estirpe 2996 ou estirpe 394/98 (uma estirpe Nova Zelândia) de N. meningitidis serogrupo B. A não ser que indicado de outra maneira, as proteínas mencionadas no presente documento são da estirpe 2996 de N. 3 meningitidis. Será apreciado, no entanto, que a invenção não é em geral limitada pela estirpe. Referências a uma proteina particular (por exemplo, '287', '953' etc.) podem ser consideradas que incluam proteina de qualquer estirpe. Proteínas híbridas

Numa abordagem para a expressão heteróloga, proteínas 287 e 953 são expressas como uma única proteína híbrida. É preferido que nenhum parceiro de fusão não de Neisseria (por exemplo, GST ou poli-His) seja usado.

Isto oferece duas vantagens. Em primeiro lugar, uma proteína que pode ser instável ou pobremente expressa por si mesma pode ser assistida por meio da adição de um parceiro híbrido adequado que supere o problema. Em segundo lugar, o fabrico comercial é simplificado - somente uma expressão e purificação precisa ser utilizada com a finalidade de produzir duas proteínas separadamente úteis.

As proteínas fusionadas no híbrido podem ser unidas directamente, ou podem ser unidas via um péptido ligante, por exemplo, via um ligante de poli· - glicina (isto é, Gn onde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) ou via uma sequência de péptido curta que facilita a clonagem. É evidentemente preferido não unir uma proteína AG ao terminal C de um ligante de poli-glicina.

As proteínas fusionadas podem não possuir péptidos líder nativos ou podem incluir a sequência de péptido líder do parceiro de fusão N terminal. 0 método é bem adequado à expressão de proteínas 287 e 953.

As proteínas 287 e 953 podem ser usadas na sua forma essencialmente de comprimento completo, ou formas de deleções de poli-glicina (AG) podem ser usadas (por exemplo, AG-287, etc.), ou formas truncadas podem ser usadas (por exemplo, Δΐ-287, Δ2-287 etc.), ou versões de domínio deletado podem ser usadas (por exemplo, 287B, 287C, 287BC, etc.). 4 287 está preferentemente na extremidade C terminal de um híbrido; se for para ser usado no terminal N, se for preferido usar uma forma AG de 287, é usado (por exemplo, como o terminal N de um híbrido com 953). 287 é preferentemente da estirpe 2996 ou da estirpe 394/98 .

Alinhamentos de formas polimórficas de 287 e 953 são revelados no documento WOOO/66741. Qualquer um destes polimorfos pode ser usado de acordo com a presente invenção.

Hospedeiro heterólogo

Embora a expressão das proteínas da invenção possa ocorrer no hospedeiro nativo (isto é, o organismo em que a proteína é expressa na natureza), a presente invenção utiliza um hospedeiro heterólogo. 0 hospedeiro heterólogo pode ser procariótico ou eucariótico. É preferentemente E. coli, mas outros hospedeiros adequados incluem Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonenna typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria einerea, Mycobateria (por exemplo, M. tuberculosis), levedura etc.

Vectores etc.

Tal como os métodos descritos anteriormente, a invenção proporciona (a) ácido nucleico e vectores úteis nestes métodos (b) células hospedeiras que contêm os ditos vectores (c) proteínas expressas ou expressáveis pelos métodos (d) composições que compreendem estas proteínas, que podem ser adequadas como vacinas, por exemplo, ou como reagentes de diagnóstico, ou como composições imunogénicas (e) estas composições para utilização como medicamentos (por exemplo, como vacinas) ou como reagentes de diagnóstico (f) a utilização destas composições no fabrico de (1) um medicamento para tratar ou prevenir infecção devido a bactérias do género Neisseria (2) um reagente de diagnóstico para detectar a presença de bactérias do género 5

Neisseria ou de anticorpos produzidos contra bactérias do género Neisseria, e/ou (3) um reagente que pode produzir anticorpos contra bactérias do género Neisseria e (g) um método de tratamento de um paciente, que compreende administrar ao paciente um quantidade terapeuticamente eficaz destas composições.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra duas proteínas híbridas de acordo com a invenção. MODOS PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO Exemplo 1 - proteína 287 A proteína 287 de N. meningitidis (serogrupo B, estirpe 2996) tem a seguinte sequência: r*AG287 1 MFERSVIAMA CIFALSACGG GGGGSPDVKS ADTLSKPAAP WAEKETEVK 51 EDAPQAGSQG QGAPSTQGSQ DMAAVSAENT GNGGAATTDK PKNEDEGPQN 101 DMPQNSAESA NQTGNNQPAD SSDSAPASNP APANGGSNFG RVDLANGVLI 151 DGPSQN1TLT HCKGDSCNGD NLLDEEAPSK SEFENLNESE RIEKYKKDGK 201 SDKFTNLVAT AVQANGTNKY VIIYKDKSAS SSSARFRRSA RSRRSLPAEM 251 PLIPVNQADT LIVDGEAVSL TGHSGNIFAP EGNYRYLTYG AEKLPGGSYA 301 LRVQGEPAKG EMLAGTAVYN GEVLHFHTEN GRPYPTRGRF AAKVDFGSKS 351 VDGIIDSGDD LHMGTQKFKA AIDGNGFKGT WTENGGGDVS GRFYGPAGEE 401 VAGKYSYRPT DAEKGGFGVF AGKKEQD* O péptido líder é mostrado sublinhado.

As sequências de 287 de outras estirpes podem ser encontradas nas Figuras 5 e 15 do documento WOOO/66741. O Exemplo 9 do documento WO99/57280 revela a expressão de 287 como uma fusão de GST em E. coli.

Um número de abordagens adicionais para expressar 287 em E. coli foi usado, incluindo: 1) 287 como uma fusão de cauda de His ('287-His'); 2) 287 com o seu próprio péptido líder, mas sem qualquer parceiro de fusão ('287L'); 3) 287 com o péptido líder ORF4 e sem qualquer parceiro de fusão ( '287LOrf4'); e 4) 287 sem o seu péptido líder e sem qualquer parceiro de fusão ('28 7nâo etiauetada - ) ; 6

1 CGGGGGGSPD VKSADTLSKP AAPWAEKET EVKEDAPQAG SQGQGAPSTQ 51 GSQDMAAVSA ENTGNGGAAT TDKPKNEDEG PQNDMPQNSA ESANQTGNNQ 101 PADSSDSAPA SNPAPANGGS NFGRVDLANG VLIDGPSQNI TLTHCKGDSC 151 NGDNLLDEEA PSKSEFENLN ESERIEKYKK DGKSDKFTNL VATAVQANGT 201 NKYVIIYKDK SASSS3ARFR RSARSRRSLP AEMPLIPVNQ ADTLIVDGEA 251 VSLTGHSGNI FAPEGNYRYL TYGAEKLPGG SYALRVQGEP AKGEMLAGTA 301 VYNGEVLHFH TENGRPYPTR GRFAAKVDFG SKSVDGIIDS GDDLHMGTQK 351 FKAAIDGNGF KGTWTENGGG DVSGRFYGPA GEEVAGKYSY RPTDAEKGGF 401 GVFAGKKEQD *

Todas estas proteínas poderiam ser expressas e purificadas. '287L' e '287LOrf4' foram confirmados como lipoproteínas.

Como mostrado na Figura 2, '287LOrf4' foi construído por meio da digestão de 919LOrf4 com Nhel e Xhol. O péptido líder inteiro ORF4 foi restaurado pela adição de uma sequência de ADN que codifica os aminoácidos que faltam, como uma cauda, no iniciador de extremidade 5' (287LOrf4 for), fusionada à sequência codificante 287. O gene de 287 que codifica a proteína madura foi amplificado usando os oligonucleótidos 287LOrf4 For e Rev (incluindo os locais Nhel e Ahol, respectivamente) , digeridos com Nhel e Xhol e ligados ao fragmento pETOrf4 purificado.

Exemplo 2 - ÁG287 e híbridos A proteína que não possui os aminoácidos N terminal até GGGGGG é denominada 'AG 287'. Na estirpe MC58, a sua sequência (péptido líder sublinhado) é r* AG287

1 MFKRSVIAMA CIFALSACGG GGGGSPDVKS ADTLSKPAAP WSEKETEAK 51 EDAPQAGSQG QGAPSAQGSQ DMAAVSEENT GNGGAVTADN PKNEDEVAQN 101 DMPQNAAGTD SSTPNHTPDP NMLAGNMENQ ATDAGESSQP ANQPDMANAA 151 DGMQGDDPSA GGQNAGNTAA QGANQAGNNQ AAGSSDPIPA SNPAPANGGS 201 NFGRVDLANG VLIDGPSQNI TLTHCKGDSC SGNNFLDEEV QLKSEFEKLS 251 DADKISNYKK DGKNDKFVGL VADSVQMKGI NQYIIFYKPK PTSFARFRRS 301 ARSRRSLPAE MPLIPVNQAD TLIVDGEAVS LTGHSGNIFA PEGNYRYLTY 351 GAEKLPGGSY ALRVQGEPAK GEMLAGAAVY NGEVLHFHTE NGRPYPTRGR 401 FAAKVDFGSK SVDGIIDSGD DLHMGTQKFK AAIDGNGFKG TWTENGSGDV 451 SGKFYGPAGE EVAGKYSYRP TDAEKGGFGV FAGKKEQD* AG287, com ou sem cauda de His ('AG287-His' e 'AG287K', respectivamente), são expressas em níveis muito bons em comparação com a '287-His' ou ' 28 7nao etiquetada ' .

As proteínas AG287 foram feitas e purificadas para as 7 estirpes MC58, 1000 e BZ232. Cada uma destas deu titulações elevadas de ELISA e também titulações bactericidas em soro de >8192. ÀG287K, expressa a partir de pET-24b, deu excelentes titulações em ELISA e no ensaio bactericida em soro. AG287 foi também fusionada directamente na grelha a montante de 953, (sequências mostradas a seguir). ÚG287—953

1 ATGGCTAGCC CCGATGTTAA 51 TCCTGTTGTT GCTGAAAAAG 101 CAGGTTCTCA AGGACAGGGC 151 GCGGCAGTTT CGGCAGAAAA 201 CAAACCCAAA AATGAAGACG 251 CCGCCGAATC CGCAAATCAA 301 GATTCCGCCC CCGCGTCAAA 351 TGGAAGGGTT GATTTGGCTA 401 ATATAACGTT GACCCACTGT 451 TTGGATGAAG AAGCACCGTC 501 TGAACGAATT GAGAAATATA 551 ATTTGGTTGC GACAGCAGTT 601 ATTTATAAAG ACAAGTCCGC 651 TGCACGGTCG AGGAGGTCGC 701 ATCAGGCGGA TACGCTGATT 751 CATTCCGGCA ATATCTTCGC 801 CGGGGCGGAA AAATTGCCCG 851 AACCGGCAAA AGGCGAAATG 901 GTGCTGCATT TTCATACGGA 951 GTTTGCCGCA AAAGTCGATT 1001 ACAGCGGCGA TGATTTGCAT 1051 GATGGAAACG GCTTTAAGGG 1101 TTCCGGAAGG TTTTACGGCC 1151 GCTATCGCCC GACAGATGCG 1201 AAAAAAGAGC AGGATGGATC 1251 CGAATATCAC GCCAACGCCC 1301 CCAACGTCGG CGGTTTTTAC 1351 GCAAAACGCG ACGGTAAAAT 1401 AAGCGGTTCG CAACACTTTA 1451 ATGCCGCCCA ATATCCGGAC 1501 AACGGCAAAA AACTGGTTTC 1551 AACCGCCCCC GTCAAACTCA 1601 CGATGGCGAA AACCGAAGTT 1651 CGCACCAAAT GGGGCGTGGA 1701 CGTCCGCATC GACATCCAAA 1 MASPDVKSAD TLSKPAAPW 51 AAVSAENTGN GGAATTDKPK 101 DSAPASNPAP ANGGSNFGRV 151 LDEEAPSKSE FENLNESER1 201 1YKDKSASSS SARFRRSARS 251 HSGNIFAPEG NYRYLTYGAE 301 VLHFHTENGR PYPTRGRFAA 351 DGNGFKGTWT ENGGGDVSGR 401 KKEQDGSGGG GATYKVDEYH 451 AKRDGKIDIT IPVANLQSGS 501 NGKKLVSVDG NLTMHGKTAP 551 RTKWGVDYLV NVGMTKSVRI

ATCGGCGGAC ACGCTGTCAA AACCGGCCGC AGACAGAGGT AAAAGAAGAT GCGCCACAGG GCGCCATCCA CACAAGGCAG CCAAGATATG TACAGGCAAT GGCGGTGCGG CAACAACGGA AGGGACCGCA AAATGATATG CCGCAAAATT ACAGGGAACA ACCAACCCGC CGATTCTTCA CCCTGCACCT GCGAATGGCG GTAGCAATTT ATGGCGTTTT GATTGATGGG CCGTCGCAAA AAAGGCGATT CTTGTAATGG TGATAATTTA AAAATCAGAA TTTGAAAATT TAAATGAGTC AGAAAGATGG GAAAAGCGAT AAATTTACTA CAAGCTAATG GAACTAACAA ATATGTCATC TTCATCTTCA TCTGCGCGAT TCAGGCGTTC TTCCTGCCGA GATGCCGCTA ATCCCCGTCA GTCGATGGGG AAGCGGTCAG CCTGACGGGG GCCCGAAGGG AATTACCGGT ATCTGACTTA GCGGATCGTA TGCCCTCCGT GTGCAAGGCG CTTGCTGGCA CGGCCGTGTA CAACGGCGAA AAACGGCCGT CCGTACCCGA CTAGAGGCAG TCGGCAGCAA ATCTGTGGAC GGCATTATCG ATGGGTACGC AAAAATTCAA AGCCGCCATC GACTTGGACG GAAAATGGCG GCGGGGATGT CGGCCGGCGA GGAAGTGGCG GGAAAATACA GAAAAGGGCG GATTCGGCGT GTTTGCCGGC CGGAGGAGGA GGAGCCACCT ACAAAGTGGA GTTTCGCCAT CGACCATTTC AACACCAGCA GGTCTGACCG GTTCCGTCGA GTTCGACCAA CGACATCACC ATCCCCGTTG CCAACCTGCA CCGACCACCT GAAATCAGCC GACATCTTCG ATCCGCTTTG TTTCCACCAA ATTCAACTTC CGTTGACGGC AACCTGACCA TGCACGGCAA AAGCCGAAAA ATTCAACTGC TACCAAAGCC TGCGGCGGCG ACTTCAGCAC CACCATCGAC CTACCTCGTT AACGTTGGTA TGACCAAAAG TCGAGGCAGC CAAACAATAA CTCGAG AEKETEVKED APQAGSQGQG APSTQGSQDM NEDEGPQNDM PQNSAESANQ TGNNQPADSS DLANGVLIDG PSQNITLTHC KGDSCNGDNL EKYKKDGKSD KFTNLVATAV QANGTNKYVI RRSLPAEMPL IPVNQADTLI VDGEAVSLTG KLPGGSYALR VQGEPAKGEM LAGTAVYNGE KVDFGSKSVD GIIDSGDDLH MGTQKFKAAI FYGPAGEEVA GKYSYRPTDA EKGGFGVFAG ANARFAIDHF NTSTNVGGFY GLTGSVEFDQ QHFTDHLKSA DIFDAAQYPD IRFVSTKFNF VKLKAEKFNC YQSPMAKTEV CGGDFSTTID DIQIEAAKQ* ELISA Bactericida AG287-953-HÍS 3834 65536 são

As proteínas híbridas com AG287 no terminal N 9 portanto imunologicamente superiores às misturas simples.

As mesmas proteínas híbridas foram feitas usando a estirpe de Nova Zelândia 394/98 ao invés de 2996:

AG287NZ-953 1 ATGGCTAGCC CCGATGTCAA 51 CCCTGTTGTT TCTGAAAAAG 101 CAGGTTCTCA AGGACAGGGC 151 GCGGCGGTTT CGGAAGAAAA 201 CAAACCCAAA AATGAAGACG 251 CCGCCGATAC AGATAGTTTG 301 CCGGCCGGAA ATATGGAAAA 351 GCCGGCAAAC CAACCGGATA 401 ACGATCCGTC GGCAGGCGGG 451 ACAAATCAAG CCGAAAACAA 501 TTCAACCAAT CCTAGCGCCA 551 ACGTGGGCAA TTCTGTTGTG 601 ACCCACTGTA AAGGCGATTC 651 AGTACAGCTA AAATCAGAAT 701 GTAATTACAA GAAAGATGGG 751 GGTTTGGTTG CCGATAGTGT 601 CTTTTATAAA CCTAAACCCA 851 GGTCGAGGCG GTCGCTTCCG 901 GCGGATACGC TGATTGTCGA 951 CGGCAATATC TTCGCGCCCG 1001 CGGAAAAATT GCCCGGCGGA 1051 TCAAAAGGCG AAATGCTCGC 1101 GCATTTTCAT ACGGAAAACG 1151 CCGCAAAAGT CGATTTCGGC 1201 GGCGATGGTT TGCATATGGG 1251 AAACGGCTTT AAGGGGACTT 1301 GAAAGTTTTA CGGCCCGGCC 1351 CGCCCAACAG ATGCGGAAAA 1401 AGAGCAGGAT GGATCCGGAG 1451 ATCACGCCAA CGCCCGTTTC 1501 GTCGGCGGTT TTTACGGTCT 1551 ACGCGACGGT AAAATCGACA 1601 GTTCGCAACA CTTTACCGAC 1651 GCCCAATATC CGGACATCCG 1701 CAAAAAACTG GTTTCCGTTG 1751 CCCCCGTCAA ACTCAAAGCC 1801 GCGAAAACCG AAGTTTGCGG 1851 CAAATGGGGC GTGGACTACC 1901 GCATCGACAT CCAAATCGAG

GTCGGCGGAC ACGCTGTCAA AGACAGAGGC AAAGGAAGAT GCGCCATCCG CACAAGGCGG TACAGGCAAT GGCGGTGCGG AGGGGGCGCA AAATGATATG ACACCGAATC ACACCCCGGC CCAAGCACCG GATGCCGGGG TGGCAAATAC GGCGGACGGA GAAAATGCCG GCAATACGGC TCAAACCGCC GGTTCTCAAA CGAATAGCGG ATTGACGGGC TTGTAGTGGC

AACCTGCCGC GCGCCACAGG TCAAGATATG CAGCAACGGA CCGCAAAATG TTCGAATATG AATCGGAGCA ATGCAGGGTG TGCCCAAGGT ATCCTGCCTC TGGTGATTTT GGAAGGACGA CGTCGCAAAA TATAACGTTG AATAATTTCT TGGATGAAGA TTGAAAAATT AAGTGATGCA GACAAAATAA AAGAATGACG GGAAGAATGA TAAATTTGTC GCAGATGAAG GGAATCAATC AATATATTAT CTTCATTTGC GCGATTTAGG CGTTCTGCAC GCCGAGATGC CGCTGATTCC CGTCAATCAG TGGGGAAGCG GTCAGCCTGA CGGGGCATTC AAGGGAATTA CCGGTATCTG ACTTACGGGG TCGTATGCCC TCCGTGTTCA AGGCGAACCT GGGCACGGCA GTGTACAACG GCGAAGTGCT GCCGTCCGTC CCCGTCCAGA GGCAGGTTTG AGCAAATCTG TGGACGGCAT TATCGACAGC TACGCAAAAA TTCAAAGCCG CCATCGATGG GGACGGAAAA TGGCGGCGGG GATGTTTCCG GGCGAGGAAG TGGCGGGAAA ATACAGCTAT GGGCGGATTC GGCGTGTTTG CCGGCAAAAA GAGGAGGAGC CACCTACAAA GTGGACGAAT GCCATCGACC ATTTCAACAC CAGCACCAAC GACCGGTTCC GTCGAGTTCG ACCAAGCAAA TCACCATCCC CGTTGCCAAC CTGCAAAGCG CACCTGAAAT CAGCCGACAT CTTCGATGCC

CTTTGTTTCC accaaattca acttcaacgg ACGGCAACCT GACCATGCAC GGCAAAACCG GAAAAATTCA ACTGCTACCA AAGCCCGATG CGGCGACTTC AGCACCACCA TCGACCGCAC TCGTTAACGT TGGTATGACC AAAAGCGTCC GCAGCCAAAC AATAAAAGCT T 1 51 ιοί 151 201 251 301 351 401

MASPDVKSAD

AAVSEENTGN

PAGNMENQAP

TNQAENNQTA

THCKGDSCSG

GLVADSVQMK

ADTLIVDGEA

SKGEMLAGTA

GDGLHMGTQK

TLSKPAAPW

GGAAATDKPK

DAGESEQPAN

GSQNPASSTN

NNFLDEEVQL

GINQYIIFYK

VSLTGHSGNI

VYNGEVLHFH

FKAAIDGNGF

SEKETEAKED

NEDEGAQNDM

QPDMANTADG

PSATNSGGDF

KSEFEKLSDA

PKPTSFARFR

FAPEGNYRYL

TENGRPSPSR

KGTWTENGGG

APQAGSQGQG

PQNAADTDSL

MQGDDPSAGG

GRTNVGNSW

DKISNYKKDG

RSARSRRSLP

TYGAEKLPGG

GRFAAKVDFG

DVSGKFYGPA

APSAQGGQDM

TPNHTPASNM

ENAGNTAAQG

IDGPSQNITL

KNDGKNDKFV

AEMPLIPVNQ

SYALRVQGEP

SKSVDGIIDS

GEEVAGKYSY 10 451 rptdaekggf gvfagkkeqd gsggggatyk vdeyhanarf aidhfntstn 501 vggfygltgs vefdqakrdg kiditipvan lqsgsqhftd hlksadifda 551 AQYPDIRFVS TKFNFNGKKL VSVDGNLTMH GKTAPVKLKA EKFNCYQSPM 601 AKTEVCGGDF STTIDRTKWG VDYLVNVGMT KSVRIDIQIE AAKQ*

Exemplo 3 - fusões C terminal ('híbridos') com 287M/AG287 287 & 953 Estirpe AG287-953 953-287 2996 65536 8192 BZ232 128 <4 1000 <4 <4 MC58 16384 1024 NGH38 >2048 4096 394/98 256 128 MenA (F6124) >2048 32 MenC (BZ133) >8192 <16

De acordo com a invenção, híbridos de duas proteínas A & B podem ser NH2-A-B-COOH ou NH2-B-A-COOH. O efeito desta diferença foi investigado usando proteína 287 terminal C (na forma '287-His') ou terminal N (na forma AG287 sequências mostradas acima) a 953. Um painel de estirpes foi usado, incluindo estirpe homóloga 2996. FCA foi usado como adjuvante:_

Melhores titulações bactericidas são geralmente vistas com 287 no terminal N (na forma AG)

Exemplo 4 - fusões N terminal ('híbridos') a 287 A expressão de proteína 287 como comprimento completo com uma cauda de His C terminal, ou sem o seu péptido líder, mas com uma cauda de His C terminal, dá níveis de expressão francamente baixos. A melhor expressão é alcançada usando uma fusão de GST N terminal.

Como uma alternativa à utilização de GST como um parceiro de fusão N terminal, 287 foi colocado no terminal C de proteína 953 ('953-287'). Em ambos os casos, os péptidos líder foram deletados, e os híbridos eram fusões in-frame (na mesma grelha de leitura) directas.

Para gerar o híbrido 953-287, os péptidos líder das 11 duas proteínas foram omitidos desenhando-se o iniciador directo a jusante do líder de cada sequência; a sequência do codão de terminação foi omitida no iniciador reverso 953, mas incluída no iniciador reverso 287. Para o gene de 953, os iniciadores 5' e 3' usados para a amplificação incluíam um local de restrição Ndel e um local de restrição BamHI respectivamente, ao passo que para a amplificação do gene de 287 os iniciadores 5' e 3' incluíam um local de restrição BamHI e local de restrição aXhol respectivamente. Nesse sentido, uma clonagem direccional sequencial dos dois genes em pET21b+, usando Ndel-BamHI (para clonar o primeiro gene) e subsequentemente BamHI-Xhol (para clonar o segundo gene) poderia ser alcançada.

Mistura com 287 Hibrido com 287 953 8192 8192 A eficácia bactericida (estirpe homóloga) de anticorpos produzidos contra as proteínas híbridas foi comparada com anticorpos produzidos contra misturas simples dos antigénios componentes:_ 953 Estirpe Mistura Hibrido MC58 512 1024 NGH38 2048 4096 BZ232 1024 16 MenA (F6124) 2048 32 MenC (Cll) >2048 n. d. MenC (BZ133) >4096 <16

Dados para a actividade bactericida contra estirpes heterólogas MenB e contra serotipos A e C foram também obtidos para 953-287 :_

DETALHES EXPERIMENTAIS

Purificação de proteína FPLC 0 seguinte quadro sumariza a purificação de proteína FPLC que foi usada: 12

Proteína PI Coluna Tampão PH Protocolo 953-287 4, 92 Mono Q Bis-Tris propano 6, 2 A

As soluções de tampão incluíam 20-120 mM de NaCl, 5,0 mg/ml de CHAPS e 10 % v/v de glicerol. O dialisado foi centrifugado a 13000g durante 20 min e aplicado a uma resina de permuta iónica mono Q ou mono S FPLC. Tampão e resinas de permuta iónica foram escolhidos de acordo com o pi da proteína de interesse e as recomendações do manual de protocolo de FPLC [Pharmacia: FPLC Ion Exchange and Chromatofocussing; Principies and Methods. Pharmacia Publication]. As proteínas foram eluídas usando um gradiente etapa por etapa de NaCl. A purificação foi analisada por SDS-PAGE e a concentração de proteínas determinada pelo método de Bradford. A letra na coluna 'protocolo' refere-se ao seguinte: FPLC-A: 953-287 foi purificada a partir da fracção solúvel de E. coli obtida após quebra das células. Colónias individuais que abrigavam o plasmídeo de interesse foram crescidas durante a noite a 37 °C em 20 ml de cultura líquida de LB/Amp (100 mg/ml). As bactérias foram diluídas 1:30 em 1,0 L de meio fresco e crescidas a 30 °C ou 37 °C até a OD55o atingir 0,6-08. A expressão de proteína recombinante foi induzida com IPTG a uma concentração final de 1,0 mM. Após a incubação durante 3 horas, as bactérias foram colhidas por centrifugação a 8000g durante 15 minutos a 4 °C. Quando necessário as células eram armazenadas a -20 °C. Todos os procedimentos subsequentes foram realizados em gelo ou a 4 °C. As células foram lisadas por meio de sonicação usando um Branson Sonifier 450. As células quebradas foram centrifugadas a 8000g durante 30 min para sedimentar as células não quebradas e corpos de inclusão e o sobrenadante levado a 35 % v/v de saturação pela adição de 3,9 M (NH4)2S04. O precipitado foi sedimentado a 8000g durante 30 minutos. O sobrenadante foi levado a 70 % v/v de 13 saturação pela adição de 3,9 M (NH4)2S04 e o precipitado colhido como anteriormente. Os peletes que contêm a proteína de interesse foram identificados por SDS-PAGE e dialisados contra o tampão de permuta iónica apropriado (veja-se a seguir) durante 6 horas ou durante a noite. A fracção periplasmática de E. coli que expressa 953L foi preparada de acordo com o protocolo de Evans et al.

[Infert. Iiranun. (1974) 10:1010-1017] e dialisada contra o tampão de permuta iónica apropriado. O tampão e resina de permuta iónica foram escolhidos de acordo com o pi da proteína de interesse e as recomendações do manual de

protocolo de FPLC (Pharmacia). As soluções de tampão incluíam 20 mM de NaCl, e 10 % (v/v) de glicerol. O dialisado foi centrifugado a 13000g durante 20 min e aplicado a uma resina de permuta iónica mono Q ou mono S FPLC. O tampão e resina de permuta iónica foram escolhidos de acordo com o pi da proteína de interesse e as recomendações do manual de protocolo de FPLC (Pharmacia). As proteínas foram eluídas a partir da resina de permuta iónica usando gradientes etapa por etapa ou contínuos de NaCl. A purificação foi analisada por SDS-PAGE e a concentração de proteínas determinada pelo método de Bradford. A clivagem do péptido líder de proteínas periplasmáticas foi demonstrada por meio da sequenciação do terminal NH2 (veja-se a seguir).

Estratégia de clonagem e projecto de oligonucleótido

Os genes que codificam antigénios de interesse foram amplificados por PCR, usando oligonucleótidos projectados com base na sequência genómica de B MC58 de N. meningitidis. ADN genómico da estirpe 2996 tem sido sempre usado como um molde em reacções de PCR, a não ser que de outro modo especificado, e os fragmentos amplificados foram clonados no vector de expressão pET21b+ (Novagen) para expressar a proteína como produto com cauda de His C terminal, ou em pET-24b+ (Novagen) para expressar a 14 proteína na forma 'não etiquetada' (por exemplo, ÁG 287K).

Onde uma proteína foi expressa sem um parceiro de fusão e com o seu próprio péptido líder (se estiver presente), a amplificação da grelha de leitura aberta (ATG a codões STOP) foi realizada.

Onde uma proteína foi expressa na forma 'não etiquetada', o péptido líder foi omitido por meio do projecto do iniciador de amplificação de extremidade 5' a jusante da sequência líder predita. A temperatura de fusão dos iniciadores usados em PCR dependeu do número e tipo de nucleótidos de hibridação no iniciador completo, e foi determinado usando as fórmulas:

Tmi = 4 (G+C)+ 2 (A+T) (cauda excluída)

Tm2 = 64,9 + 0,41 (% GC)-600/N(iniciador completo)

As temperaturas de fusão dos oligonucleótidos seleccionados foram usualmente 65-70 °C para o oligo completo e 50-60 °C para a região de hibridação em separado.

Oligonucleótidos foram sintetizados usando um

Sequências Local de restrição 287 Fwd CTAGCTAGC-GGGGGCGGCGGTGGCG Nhel Rev CCCGCTCGAG- TCAATCCTGCTCTTTTTTGCC Xhol 953L Fwd GGGAATTCCATATG- AAAAAAATCATCTTCGCCG Ndel

Sintetizador de ADN/ARN Perkin Elmer 394, eluídos das colunas em 2,0 ml de NH4OH, e desprotegidos por incubação durante 5 horas a 56 °C. Os oligos foram precipitados por meio da adição de 0,3M de Acetato de sódio e 2 volumes de etanol. As amostras foram centrifugadas e os peletes ressuspensos em água.__ 15 (continuação)

Sequências Local de restrição Rev CCCGCTCGAG- TTATTGTTTGGCTGCCTCGAT Xhol 953- fu Fwd GCCACCTACAAAGTGGACG- GCCACCTACAAAGTGGACG Ndel Rev CGGGGATCC- TTGTTTGGCTGCCTCGATTTG BamHI NB - Todas as reacções de PCR usam a estirpe 2996 a não ser que de outro modo especificado (por exemplo, estirpe MC58)

Em todas as construções que começam com um ATG não seguido por um único local Nhel, o codão ATG é parte do local Ndel usado para a clonagem. As construções feitas usando Nliel como um local de clonagem na extremidade 5' (por exemplo, todas àquelas que contêm 287 no terminal N) têm dois codões adicionais (GCT AGC) fusionados à sequência codificante do antigénio.

Preparação de modelos de ADN cromossómico

As estirpes 2996, MC58, 394.98, 1000 e BZ232 (e outras) de N. meningitidis foram crescidas à fase exponencial em 100 ml de meio GC, colhidas por centrifugação, e ressuspensas em 5 ml de tampão (20 % p/v de sacarose, 50 mM de Tris-HCl, 50 mM de EDTA, pH8) . Após 10 minutos de incubação em gelo, as bactérias foram lisadas por meio da adição de 10 ml de solução de lise (50 mM de NaCl, 1 % de Sarcosilo de sódio, 50 mg/ml de Proteinase K), e a suspensão incubada a 37 °C durante 2 horas. Duas extracções de fenol (equilibradas até pH 8) e uma extracção com CHCls/isoamilálcool (24:1) foram realizadas. O ADN foi precipitado por meio da adição de 0,3M de acetato de sódio e 2 volumes de etanol, e colhido por centrifugação. O pelete foi lavado uma vez com 70 % (v/v) de etanol e redissolvido em 4,0 ml de tampão TE (10 mM de Tris-HCl, 1 16 mM de EDTA, pH 8,0). A concentração de ADN foi medida pela leitura de OD260 .

Amplificação de PCR O protocolo de PCR padrão foi como se segue: 200 ng de ADN genómico das estirpes 2996, MC58 1000, ou BZ232 ou 10 ng de preparação de ADN plasmidico de clones recombinantes foram usados como molde na presença de 40 mM de cada iniciador de oligonucleótido, 400-800 mM de solução de dNTPs, lx tampão de PCR (incluindo 1,5 mM de MgCl2), 2,5 unidades de polimerase de ADN Taql (usando o Modelo Perkin-Elmer AmpliTaQ, Boerhingher Mannheim Expand™ Long).

Após uma incubação preliminar de 3 minutos da mistura completa a 95 °C, cada amostra passou por uma amplificação de duas etapas: os primeiros 5 ciclos foram realizados usando a temperatura de hibridação que excluiu a cauda de enzima de restrição do iniciador (Tmi). Isto foi seguido por 30 ciclos de acordo com a temperatura de hibridação calculada para os oligos de comprimento inteiro (Tm2) . Tempos de alongamento, realizados a 68 °C ou 72 °C, variaram de acordo com o comprimento da Orf a ser amplificada. No caso da Orfl, o tempo de alongamento, que começa desde 3 minutos, foi aumentado em 15 segundos cada ciclo. Os ciclos foram completados com uma etapa de extensão de 10 minutos a 72 °C. O ADN amplificado foi carregado directamente num gel de agarose a 1 %. O fragmento de ADN correspondente à banda de tamanho correcto foi purificado do gel usando o Kit de Extracção em Gel de Qiagen, seguindo o protocolo do fabricante.

Digestão de fragmentos de PCR e dos vectores de clonagem O ADN purificado correspondente ao fragmento amplificado foi digerido com as enzimas de restrição apropriadas para a clonagem em pET-21b+, pET22b+ ou pET-24b+. Os fragmentos digeridos foram purificados usando o kit de purificação QIAquickPCR (seguindo as instruções do 17 fabricante) e eluídos com H20 ou 10 mM de Tris, pH 8,5. Os vectores de plasmídeo foram digeridos com as enzimas de restrição apropriadas, carregadas num gel de agarose a 1,0 % e a banda correspondente ao vector digerido purificada usando o Kit de Extracção em Gel Qiagen QIAquick.

Clonagem

Os fragmentos correspondentes a cada gene, anteriormente digeridos e purificados, foram ligados em pET21b+, pET22b+ ou pET-24b+. Uma razão molar de 3:1 fragmento/vector foi usada com ligase de ADN T4 no tampão de ligação fornecido pelo fabricante. O plasmideo recombinante foi transformado em DH5 competente de E. coli ou HB101 por meio da incubação da solução de reacção de ligase e bactérias durante 40 minutos em gelo, então a 37 °C durante 3 minutos. Isto foi seguido pela adição de 800 ml de caldo LB e incubação a 37 °C durante 20 minutos. As células foram centrifugadas a velocidade máxima num micrófugo Eppendorf, ressuspensas em aproximadamente 200 ml do sobrenadante e colocadas em placa em agar com ampicilina e LB (100 mg/ml). O rastreio para clones recombinantes foi realizado por meio do crescimento de colónias aleatoriamente seleccionadas durante a noite a 37 °C em 4,0 ml de caldo LB + 100 mg/ml ampicilina. As células foram agrupadas em peletes e o ADN de plasmideo extraído usando o Kit Qiagen QIAprep Spin Miniprep, seguindo as instruções do fabricante. Aproximadamente 1 mg de cada miniprep individual foi digerido com as enzimas de restrição apropriadas e o digerido foi carregado num gel de agarose a 1-1,5 % (dependendo do tamanho de inserção esperada), em paralelo com o marcador de peso molecular (1 kb ADN Ladder, GIBCO). Os clones positivos foram seleccionados com base no tamanho da inserção.

Expressão

Após a clonagem de cada gene no vector de expressão, 18 os plasmídeos recombinantes foram transformados em estirpes de E. coli adequadas para a expressão da proteína recombinante. 1 ml de cada construção foi usado para transformar BL21-DE3 de E. coli como foi descrito anteriormente. As colónias recombinantes individuais foram inoculadas em 2 ml LB+Amp (100 mg/ml), incubadas a 37 °C durante a noite, então diluídas 1:30 em 20 ml de LB+Amp (100 mg/ml) em balões de 100 ml, para dar um OD60o entre 0,1 e 0,2. Os balões foram incubados a 30 °C ou a 37 °C num agitador de banho de água giratório até que a OD60o indicasse crescimento exponencial adequado para a indução de expressão (0,4-0,8 OD) . A expressão de proteínas foi induzida por meio da adição de 1,0 mM de IPTG. Após 3 horas de incubação a 30 °C ou 37 °C a OD60o foi medida e a expressão examinada. 1,0 ml de cada amostra foi centrifugado num micrófugo, o pelete ressuspenso em PBS e analisado por SDS-PAGE e coloração com Coomassie Blue. Clonagem Gateway e expressão

As sequências marcadas GATE foram clonadas e expressas usando a Tecnologia de Clonagem GATEWAY (GIBCO- BRL) . A clonagem recombinacional (RC) baseia-se nas reacções de recombinação que medeiam a integração e excisão de fago em e a partir do genoma de E. coli, respectivamente. A integração envolve a recombinação do local attP do ADN de fago dentro do local attB localizado no genoma bacteriano (reacção de BP) e gera um genoma de fago integrado flanqueado por locais attL e attR. A excisão recombina locais attL e attR de volta a locais attP e attB (reacção de LR) . A reacção de integração requer duas enzimas [a Integrase de proteína de fago (Int) e o factor de hospedeiro de integração de proteína bacteriana (IHF)] (clonase de BP) . A reacção de excisão requer Int, IHF, e uma enzima de fago adicional, Excisionase (Xis) (LR clonase). Derivados artificiais do local de recombinação bacteriana de 25 pb attB, denominado como BI e B2, foram 19 adicionados à extremidade 5' dos iniciadores usados nas reacções de PCR para amplificar as ORFs de Neisseria. Os produtos resultantes foram BP clonados num "Vector dador" que contém derivados complementares do local de recombinação de fago attP (PI e P2) usando clonase de BP. Os "Clones de entrada" resultantes contêm ORFs flanqueadas por derivados do local attL (LI e L2) e foram subclonados em "vedores de destino" de expressão que contêm derivados dos locais attR compatíveis com attL (RI e R2) usando clonase de LR. Isto teve como resultado "clones de expressão" em que as ORFs são flanqueadas por BI e B2 e fusionadas na grelha ao GST ou as caudas de His N terminal. A estirpe de E. coli usada para a expressão GATEWAY é BL21-SI. As células desta estirpe são induzidas para a expressão da polimerase de T7 ARN por meio do crescimento em meio que contém sal (0,3 M de NaCl).

Nota-se que este sistema dá caudas de His N terminal. Preparação de proteínas de membrana.

As fracções compostas principalmente de membrana interna, externa ou total foram isoladas com a finalidade de obter proteínas recombinantes expressas com sequências líder de localização de membrana. O método para a preparação de fracções de membrana, enriquecidas para proteínas recombinantes, foi adaptado de Filip et al. [J. Bact. (1973) 115:717-722] e Davies et al. [J. Immunol. Met. (1990) 143:215-225]. As colónias individuais que abrigavam o plasmídeo de interesse foram crescidas durante a noite a 3 7 °C em 2 0 ml de LB/Amp (100 mg/ml) cultura líquida. As bactérias foram diluídas 1:30 em 1,0 L de meio fresco e crescidas a 30 °C ou 37 °C até a OD550 atingir 0,6-0, 8. A expressão de proteína recombinante foi induzida com IPTG a uma concentração final de 1,0 mM. Após a incubação durante 3 horas, as bactérias foram colhidas por centrifugação a 8000 g durante 15 minutos a 4 °C e ressuspensas em 20 ml de 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e inibidores de protease 20 completa (Boehringer-Mannheim). Todos os procedimentos subsequentes foram realizados a 4 °C ou em gelo.

As células foram quebradas por sonicação usando um Sonificador Branson 450 e centrifugadas a 5000 g durante 20 min para sedimentar as células não quebradas e corpos de inclusão. 0 sobrenadante, que contém membranas e detritos celulares, foi centrifugado a 50000 g (Beckman Ti50, 29000 rpm) durante 75 min, lavado com 20 mM de Bis-tris propano (pH 6,5), 1,0 M de NaCl, 10 % (v/v) de glicerol e sedimentado de novo a 50000 g durante 75 minutos. O pelete foi ressuspenso em 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 2,0 % (v/v) Sarcosilo, inibidor de protease completa (1,0 mM de EDTA, concentração final) e incubado durante 20 minutos para dissolver a membrana interna. Os detritos celulares foram agrupados em peletes por centrifugação a 5000 g durante 10 min e o sobrenadante centrifugado a 75000 g durante 75 minutos (Beckman Ti50, 33000 rpm). As vesículas de membrana externa obtidas a partir do pelete de 75000 g foram lavadas com 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e centrifugadas a 75000 g durante 75 minutos ou durante a noite. A OMV foi finalmente ressuspensa em 500 ml de 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 % v/v de glicerol. Orfl L e Orf40L foram ambas localizadas e enriquecidas na fracção de membrana externa que foi usada para imunizar ratinhos. A concentração de proteínas foi estimada por Ensaio de Bradford padrão (Bio-Rad), enquanto a concentração de proteínas de fracção de membrana interna foi determinada com o ensaio de proteína DC (Bio-Rad). Várias fracções do procedimento de isolamento foram analisadas por SDS-PAGE.

Purificação de proteínas com cauda de His Várias formas de 287 foram clonadas das estirpes 2996 e MC58. Foram construídas com uma fusão com cauda de His C terminal e incluídas uma forma matura (aa 18-427), construções com deleções (Δΐ, Δ2, Δ3 e Δ4) e clones compostos de domínios B ou C. Para cada clone purificado 21 como uma fusão de His, uma única colónia foi esgotada e crescida durante a noite a 37 °C numa placa de agar LB/Amp (100 pg/ml). Uma colónia isolada desta placa foi inoculada em 20 ml de meio liguido LB/Amp (100 pg/ml) e crescida durante a noite a 37 °C com agitação. A cultura de uma noite foi diluída 1:30 em 1,0 L de meio liquido LB/Amp (100 mg/ml) e deixada que crescesse a temperatura óptima (30 ou 37 °C) até a OD550 atingir 0,6-0,8. A expressão de proteína recombinante foi induzida por meio da adição de IPTG (concentração final 1,0 mM) e a cultura incubada durante umas 3 horas adicionais. As bactérias foram colhidas por centrifugação a 8000 g durante 15 min a 4 °C. O pelete bacteriano foi ressuspenso em 7,5 ml de (i) tampão frio A (300 mM de NaCl, 50 mM de tampão fosfato, 10 mM de imidazol, pH 8,0) para proteínas solúveis ou (ii) tampão B (10 mM de Tris-HCl, 100 mM de tampão fosfato, pH 8,8 e, opcionalmente, 8M ureia) para proteínas insolúveis. Os sobrenadantes foram misturados com 150 μΐ de Ni2+-resina (anteriormente equilibrados com tampão A ou tampão B, conforme apropriado) e incubados a temperatura ambiente com agitação suave durante 30 min. A resina foi Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia), preparada de acordo com o protocolo do fabricante. A preparação descontínua foi centrifugada a 700 g durante 5 min a 4 °C e o sobrenadante descartado. A resina foi lavada duas vezes (descontinuamente) com 10 ml de tampão A ou B durante 10 min, ressuspensa em 1,0 ml de tampão A ou B e carregada numa coluna descartável. A resina continuou a ser lavada com (i) tampão A a 4 °C ou (ii) tampão B a temperatura ambiente, até a OD28o do fluxo passante atingir 0,02-0,01. A resina foi lavada adicionalmente com (i) tampão frio C (300 mM de NaCl, 50 mM de tampão fosfato, 20 mM de imidazol, pH 8,0) ou (ii) tampão D (10 mM de Tris-HCl, 100 mM de tampão fosfato, pH 6,3 e, opcionalmente, 8M de ureia) até OD28o do fluxo passante atingir 0,02-0,01. A proteína de fusão de 22

His foi eluída por meio da adição de 700 ml de (i) tampão de eluição frio A (300 mM de NaCl, 50 mM de tampão fosfato, 250 mM de imidazol, pH 8,0) ou (ii) tampão de eluição B (10 mM de Tris-HCl, 100 mM de tampão fosfato, pH 4,5 e, opcionalmente, 8M de ureia) e fracções colhidas até a OD280 indicar que toda a proteína recombinante foi obtida. 20 ml de alíquotas de cada fracção de eluição foram analisados por SDS-PAGE. As concentrações de proteína foram estimadas usando o ensaio de Bradford.

Análise de sequência de aminoácidos. A análise de sequência automatizada do terminal NH2 de proteínas foi realizada num sequenciador de Beckman (LF 3000) equipado com um analisador de aminoácido feniltiohidantoína em linha (Sistema Gold) de acordo com as recomendações do fabricante.

Imunização

Ratinhos Balb/C foram imunizados com antigénios nos dias 0, 21 e 35 e os soros analisados no dia 49.

Análise de soros - ELISA O MenB M7 não encapsulado e as estirpes encapsuladas foram cultivados em placas de agar chocolate e incubados durante a noite a 37 °C com 5 % de C02. As colónias bacterianas foram colhidas das placas de agar usando uma zaragatoa dracon estéril e inoculadas em Caldo Mueller-Hinton (Difco) que contém 0,25 % de glucose. O crescimento bacteriano foi monitorizado a cada 30 minutos pela OD620 seguinte. As bactérias foram deixadas para que crescessem até a OD ter atingido o valor de 0,4-0,5. A cultura foi centrifugada durante 10 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante foi descartado e as bactérias foram lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em PBS que contêm 0,025 % formaldeído, e incubadas durante 1 hora a 37 °C e então durante a noite a 4 °C com agitação. 100 μΐ de células bacterianas foram adicionados a cada poço de uma placa Greiner de 96 poços e incubados durante a noite a 4 °C. Os poços foram então 23 lavados três vezes com tampão de lavagem PBT (0,1 % de

Tween-20 em PBS). 200 μΐ de tampão de saturação (2,7 % de polivinilpirrolidona 10 em água) foram adicionados a cada poço e as placas incubadas durante 2 horas a 37 °C. Os poços foram lavados três vezes com PBT. 200 μΐ de soros diluídos (Tampão de diluição: 1 % de BSA, 0,1 % de Tween-20, 0,1 % de NaN3 em PBS) foram adicionados a cada poço e as placas incubadas durante 2 horas a 37 °C. Os poços foram lavados três vezes com PBT. 100 μΐ de soro anti-ratinho de coelho conjugado com HRP (Dako) diluídos 1:2000 em tampão de diluição foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas durante 90 minutos a 37 °C. Os poços foram lavados três vezes com tampão PBT. 100 μΐ de tampão de substrato para HRP (25 ml de tampão citrato pH 5, 10 mg de O-f enildiamina e 10 μΐ de H2O2) foram adicionados a cada poço e as placas foram deixadas a temperatura ambiente durante 20 minutos. 100 μΐ de H2S04 a 12,5 % foram adicionados a cada poço e OD490 foi seguida. As titulações

de ELISA foram calculadas arbitrariamente como a diluição de soros que deu um valor de OD490 de 0,4 acima do nível de soros pré-imunes. A ELISA foi considerada positiva quando a diluição de soros com OD490 de 0,4 foi mais alta que 1 : 400 . Análise de soros - Ensaio de ligação de bactérias por Exame de FA CS A estirpe encapsulada MenB M7 foi cultivada em placa em placas de agar chocolate e incubada durante a noite a 37 °C com 5 % de C02. As colónias bacterianas foram colhidas das placas de agar usando uma zaragatoa dracon estéril e inoculadas em 4 tubos que contêm 8 ml cada de Caldo

Mueller-Hinton (Difco) que contém 0,25 % de glicose. O crescimento bacteriano foi monitorizado a cada 30 minutos pela OD62o seguinte. As bactérias foram deixadas que

crescessem até a OD ter atingido o valor de 0,35-0,5. A cultura foi centrifugada durante 10 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o pelete foi ressuspenso em tampão de bloqueio (1 % de BSA em PBS, 0,4 % de NaN3) e centrifugado durante 5 minutos a 4000 rpm. As células foram ressuspensas em tampão de bloqueio para atingir a OD620 de 0,05. 100 ml de células bacterianas foram adicionados a cada poço de um Costar 96 poço placa. 100 μΐ de soros diluídos (1:100, 1:200, 1:400) (em tampão de bloqueio) foram adicionados a cada poço e as placas incubadas durante 2 horas a 4 °C. As células foram centrifugadas durante 5 minutos a 4000 rpm, o sobrenadante aspirado e as células lavadas por meio da adição de 200 μΐ/poço de tampão de bloqueio em cada poço. 100 μΐ de anti-ratinho de cabra F(ab)2 conjugado com R-Ficoeritrina, diluídos 1:100, foram adicionados a cada poço e as placas incubadas durante 1 hora a 4 °C. As células foram centrif ugadas a 4000 rpm durante 5 minutos e lavadas por meio da adição de 200 μΐ/poço de tampão de bloqueio. O sobrenadante foi aspirado e as células ressuspensas em 200 μΐ/poço de PBS, 0,25 % de formaldeído. As amostras foram transferidas a tubos de FACScan e lidas. A condição para FACScan (Laser Power 15 mW) os ajustes foram: FL2 ligado; FSC-H limite:92; FSC PMT Voltagem: E 01; SSC PMT: 474; Ganhos de Amp. 6,1; FL-2 PMT: 586; valores de compensação: 0.

Análise de soros - ensaio bactericida A estirpe 2996 de N. meningitidis foi crescida durante a noite a 37 °C em placas de agar chocolate (partindo de um stock congelado) com 5 % de C02. As colónias foram colhidas e usadas para inocular 7 ml de caldo Mueller-Hinton, que contém 0,25 % de glicose para atingir uma OD620 de 0,05-0,08. A cultura foi incubada durante aproximadamente 1,5 horas a 37 graus com agitação até a OD620 atingir o valor de 0,23-0,24. As bactérias foram diluídas em 50 mM de tampão fosfato pH 7,2 que contém 10 mM de MgCl2, 10 mM de CaCl2 e 0,5 % (p/v) de BSA (tampão de ensaio) na diluição de trabalho de 105 CFU/ml. O volume total da mistura de reacção final foi 50 μΐ com 25 μΐ de diluição seriada de 25 duas vezes de soro de teste, 12,5 μΐ de bactérias na diluição de trabalho, 12,5 μΐ de complemento de filhote de coelho (concentração final 25 %).

Os controlos incluíram bactérias incubadas com soro complemento, soros imunes incubados com bactérias e com complemento inactivado por aquecimento a 56 °C durante 30'. Imediatamente após a adição do complemento de filhote de coelho, 10 μΐ dos controlos foram cultivados em placas de agar Mueller-Hinton usando o método de inclinação (tempo 0). A placa de 96 poços foi incubada durante 1 hora a 37 °C com rotação. 7 μΐ de cada amostra foram cultivados em placas de agar Mueller-Hinton como manchas, ao passo que 101 μΐ dos controlos foram cultivados em placas de agar Mueller-Hinton usando o método de inclinação (tempo 1). As placas de agar foram incubadas durante 18 horas a 37 graus e as colónias correspondentes ao tempo 0 e ao tempo 1 foram contadas.

Análise de soros - western blots

As proteínas purificadas (500 ng/pista), vesículas de membrana externa (5 pg) e extractos de célula total (25 pg) derivados da estirpe MenB 2996 foram carregadas num gel de poliacrilamida SDS a 12 % e transferidas a uma membrana de nitrocelulose. A transferência foi realizada durante 2 horas a 150 mA a 4 °C, usando tampão de transferência (0,3 % de Tris base, 1,44 % de glicina, 20 % (v/v) de metanol) . A membrana foi saturada por incubação durante a noite a 4 °C em tampão de saturação (10 % de leite magro, 0,1 % de Triton X 100 em PBS). A membrana foi lavada duas vezes com tampão de lavagem (3 % de leite magro, 0,1 % de Triton X100 em PBS) e incubada durante 2 horas a 37 °C com soros de ratinhos diluídos 1:200 em tampão de lavagem. A membrana foi lavada duas vezes e incubada durante 90 minutos com uma diluição 1:2000 de peroxidase de rábano silvestre marcada com Ig anti-ratinho. A membrana foi lavada duas vezes com 0,1 % de Triton X 100 em PBS e desenvolvida com o Kit de 26

Substrato 0pti-4CN (Bio-Rad). A reacção foi interrompida por meio da adição de água.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> NOVARTIS VACINAS E DIAGNOSTICS S.R.L.

<120> EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS DE NEISSERIA <130> P055385EP <140> EP <141> 2001-02-28 <150> GB 000469.3 <151> 2000-02-28 <150> GB 0027675.8 <151> 2000-11-13 <160> 10

<170> Seqwin99, versão 1.02 <210> 1 <211>1746 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína híbrida <400> 1 27 atggctagcc gctgaaaaag gcgccatcca ggcggtgcgg ccgcaaaatt gattccgccc gatttggcta aaaggcgatt tttgaaaatt aaatttacta atttataaag aggaggtcgc gtcgatgggg aattaccggt gtgcaaggcg gtgctgcatt aaagtcgatt atgggtacgc gaaaatggcg ggaaaataca aaaaaagagc gccaacgccc ggtctgaccg atccccgttg gacatcttcg aacggcaaaa gtcaaactca tgcggcggcg aacgttggta ctcgag <210>2

<211>579 <212> PRT ccgatgttaa agacagaggt cacaaggcag caacaacgga ccgccgaatc ccgcgtcaaa atggcgtttt cttgtaatgg taaatgagtc atttggttgc acaagtccgc ttcctgccga aagcggtcag atctgactta aaccggcaaa ttcatacgga tcggcagcaa aaaaattcaa gcggggatgt gctatcgccc aggatggatc gtttcgccat gttccgtcga ccaacctgca atgccgccca aactggtttc aagccgaaaa acttcagcac tgaccaaaag atcggcggac aaaagaagat ccaagatatg caaacccaaa cgcaaatcaa ccctgcacct gattgatggg tgataattta tgaacgaatt gacagcagtt ttcatcttca gatgccgcta cctgacgggg cggggcggaa aggcgaaatg aaacggccgt atctgtggac agccgccatc ttccggaagg gacagatgcg cggaggagga cgaccatttc gttcgaccaa aagcggttcg atatccggac cgttgacggc attcaactgc caccatcgac cgtccgcatc acgctgtcaa gcgccacagg gcggcagttt aatgaagacg acagggaaca gcgaatggcg ccgtcgcaaa ttggatgaag gagaaatata caagctaatg tctgcgcgat atccccgtca cattccggca aaattgcccg cttgctggca ccgtacccga ggcattatcg gatggaaacg ttttacggcc gaaaagggcg ggagccacct aacaccagca gcaaaacgcg caacacttta atccgctttg aacctgacca taccaaagcc cgcaccaaat gacatccaaa aaccggccgc caggttctca cggcagaaaa agggaccgca accaacccgc gtagcaattt atataacgtt aagcaccgtc agaaagatgg gaactaacaa tcaggcgttc atcaggcgga atatcttcgc gcggatcgta cggccgtgta ctagaggcag acagcggcga gctttaaggg cggccggcga gattcggcgt acaaagtgga ccaacgtcgg acggtaaaat ccgaccacct tttccaccaa tgcacggcaa cgatggcgaa ggggcgtgga tcgaggcagc tcctgttgtt aggacagggc tacaggcaat aaatgatatg cgattcttca tggaagggtt gacccactgt aaaatcagaa gaaaagcgat atatgtcatc tgcacggtcg tacgctgatt gcccgaaggg tgccctccgt caacggcgaa gtttgccgca tgatttgcat gacttggacg ggaagtggcg gtttgccggc cgaatatcac cggtttttac egacatcacc gaaatcagcc attcaacttc aaccgccccc aaccgaagtt ctacctcgtt caaacaataa 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1746 <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína híbrida <400>2 28

Met Ala ser Pro Asp val Lys ser Ala Asp Thr Leu Ser Lys Pro Ala 1 5 10 15 Ala Pro val val Ala Glu Lys Glu Thr Glu val Lys Glu Asp Ala Pro 20 25 30 Gin Ala Gly Ser Gin Gly Gin Gly Ala Pro Ser Thr Gin Gly Ser Gin 35 40 45 ASp Met Al a Ala Val Ser Ala Glu Asn Thr Gly Asn Gly Gly Ala Ala 50 55 60 Thr Thr Asp Lys Pro Lys Asn Glu Asp Glu Gly Pro Gin Asn Asp Met 65 70 75 80 pro Gin Asn Ser Ala Glu Ser Ala Asn Gin Thr Gly Asn Asn Gin Pro 85 90 95 Ala Asp Ser ser Asp Ser Ala Pro Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Asn 100 105 110 Gly Gly ser Asn Phe Gly Arg Val Asp Leu Ala Asn Gly val Leu ile 115 120 125 ASp Gly pro ser Gin Asn lie Thr Leu Thr His Cys Lys Gly Asp Ser 130 135 140 Cys Asn Gly ASp Asn Leu Leu Asp Glu Glu Ala Pro Ser Lys Ser Glu 145 150 155 160 Phe Glu Asn Leu Asn GlU ser Glu Arg ile Glu Lys Tyr Lys Lys Asp 165 170 175 Gly Lys Ser Asp Lys Phe Thr Asn Leu Val Ala Thr Ala Val Gin Ala 180 185 190 Asn Gly Thr Asn Lys Tyr Val Ile Ile Tyr Lys Asp Lys Ser Ala Ser 195 200 205 Ser Ser Ser Ala Arg phe Arg Arg Ser Al a Arg Ser Arg Arg Ser Leu 210 215 220 ΡΓΟ Ala Glu Met Pro Leu ile Pro Val Asn Gl n Ala Asp Thr Leu Ile 225 230 235 240 Vai Asp Gly Glu Ala val Ser Leu Thr Gly His ser Gly Asn Ile Phe 245 2S0 255 Ala Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Tyr Leu Thr Tyr Gly Al a Glu Lys Leu 260 265 270 Pro Gly Gly 275 Ser Tyr Ala Leu Arg 280 Val Gin Gly Glu Pro 285 Ala Lys Gly Glu Met Leu Ala Gly Thr Ala val Tyr Asn Gly Glu val Leu His Phe 290 295 300 Hl S 305 Thr Glu Asn Gly Arg 310 Pro Tyr Pro Thr Arg 315 Gly Arg Phe Ala Ala 320 Lys Val Asp Phe Gly 325 Ser Lys ser val Asp 330 Gly ile Ile Asp Ser 335 Gly ASp Asp Leu Hi s 340 Met Gly Thr Gl n Lys 345 Phe Lys Al a Ala Ile 350 ASP Gly Asn Gly Phe 355 Lys Gly Thr Trp Thr 360 Glu Asn Gly Gly Gly 365 Asp val ser 29

Gly Arg 370 Phe Tyr Gly pro Ala 375 Gly Tyr 385 Arg Pro Thr ASp Ala 390 Glu Lys Lys Lys Glu Gin Asp 405 Gly Ser Gly Asp Glu Tyr His 420 Ala Asn Ala Arg ser Thr Asn val Gly Gly Phe Tyr 435 440 ASP Gin 450 Ala Lys Arg Asp Gly 455 Lys Asn Leu Gin Ser Gly Ser Gin Hi S 465 470 ASP lie Phe ASP Ala 485 Ala Gin Tyr Lys phe Asn Phe Asn Gly Lys Lys 500 Thr Met His Gly Lys Thr Ala Pro 515 520 Asn Cys Tyr Gin ser Pro Met Ala 530 535 Phe Ser Thr Thr ile Asp Arg Thr 545 550 Asn Vai Gly Met Thr Lys ser val 565 Ala Lys Gin

<210>3 <211> 1941 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína híbrida <400> 3

Glu Glu val Ala Gly Lys Tyr Ser 380 Gly Gly phe Gly val Phe Ala Gly 395 400 Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Lys Val 410 415 Phe Ala lie Asp Hi S phe Asn Thr 425 430 Gly Leu Thr Gly Ser 445 Val Glu Phe ile Asp He Thr ile pro val Ala 460 Phe Thr Asp HÍS Leu Lys Ser Ala 475 480 pro ASP lie Arg Phe Val Ser Thr 490 495 Leu Val Ser val Asp Gly Asn Leu 505 510 val Lys Leu Lys Ala Glu Lys phe 525 Lys Thr Glu val cys Gly Gly Asp 540 Lys Trp Gly 555 val Asp Tyr Leu val 560 Arg il e Asp Ile Gin ile Glu Ala 570 575 30 atggctagcc ccgatgtcaa gtcggcggac tctgaaaaag agacagaggc aaaggaagat gcgccatccg cacaaggcgg tcaagatatg ggcggtgcgg cagcaacgga caaacccaaa ccgcaaaatg ccgccgatac agatagtttg ccggccggaa atatggaaaa ccaagcaccg caaccggata tggcaaatac ggcggacgga gaaaatgccg gcaatacggc tgcccaaggt ggttctcaaa atcctgcctc ttcaaccaat ggaaggacga acgtgggcaa ttctgttgtg acccactgta aaggcgattc ttgtagtggc aaatcagaat ttgaaaaatt aagtgatgca aagaatgacg ggaagaatga taaatttgtc ggaatcaatc aatatattat cttttataaa cgttctgcac ggtcgaggcg gtcgcttccg gcggatacgc tgattgtcga tggggaagcg ttcgcgcccg aagggaatta ccggtatctg acgctgtcaa aacctgccgc ccctgttgtt gcgccacagg caggttctca aggacagggc gcggcggttt cggaagaaaa tacaggcaat aatgaagacg agggggcgca aaatgatatg acaccgaatc acaccccggc ttcgaatatg gatgccgggg aatcggagca gccggcaaac atgcagggtg acgatccgtc ggcaggcggg acaaatcaag ccgaaaacaa tcaaaccgcc cctagcgcca cgaatagcgg tggtgatttt attgacgggc cgtcgcaaaa tataacgttg aataatttct tggatgaaga agtacagcta gacaaaataa gtaattacaa gaaagatggg ggtttggttg ccgatagtgt gcagatgaag cctaaaccca cttcatttgc gcgatttagg gccgagatgc cgctgattcc cgtcaatcag gtcagcctga cggggcattc cggcaatatc acttacgggg cggaaaaatt gcccggcgga 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 tcgtatgccc tccgtgttca aggcgaacct gtgtacaacg gcgaagtgct gcattttcat ggcaggtttg ccgcaaaagt cgatttcggc ggcgatggtt tgcatatggg tacgcaaaaa aaggggactt ggacggaaaa tggcggcggg ggcgaggaag tggcgggaaa atacagctat ggcgtgtttg ccggcaaaaa agagcaggat gtggacgaat atcacgccaa cgcccgtttc gtcggcggtt tttacggtct gaccggttcc aaaatcgaca tcaccatccc cgttgccaac cacctgaaat cagccgacat cttcgatgcc accaaattca acttcaacgg caaaaaactg ggcaaaaccg cccccgtcaa actcaaagcc gcgaaaaccg aagtttgcgg cggcgacttc gtggactacc tcgttaacgt tggtatgacc gcagccaaac aataaaagct t <210>4 <211>644

<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína híbrida <400>4 tcaaaaggcg aaatgctcgc gggcacggca acggaaaacg gccgtccgtc cccgtccaga agcaaatctg tggacggcat tatcgacagc ttcaaagccg ccatcgatgg aaacggcttt gatgtttccg gaaagtttta cggcccggcc cgcccaacag atgcggaaaa gggcggattc ggatccggag gaggaggagc cacctacaaa gccatcgacc atttcaacac cagcaccaac gtcgagttcg accaagcaaa acgcgacggt ctgcaaagcg gttcgcaaca ctttaccgac gcccaatatc cggacatccg ctttgtttcc gtttccgttg acggcaacct gaccatgcac gaaaaattca actgctacca aagcccgatg agcaccacca tcgaccgcac caaatggggc aaaagcgtcc gcatcgacat ccaaatcgag 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1941 31

Met Ala Ser Pro Asp Val Lys ser Ala Asp Thr Leu ser Lys pro 15 Ala 1 5 10 Ala Pro val Val Ser Glu Lys Glu Thr Glu Ala Lys Glu ASP 30 Ala pro 20 25 Gl n Gin Ala Gly 35 Ser Gin Gly Gin Gly 40 Ala Pro ser Ala Gin 45 Gly dy Asp Met 50 Ala Ala Val ser Glu 55 Glu Asn Thr Gly Asn 60 Gly Giy Ala Ala Ala Thr Asp Lys pro Lys Asn Glu Asp Glu Gly Ala Gin Asn ASp Met 80 65 70 75 Pro Gin Asn Ala Ala Asp Thr Asp Ser Leu Thr Pro Asn HÍS Thr 95 pro 85 90 Ala Ala Ser Asn Met 100 Pro Ala Gly Asn Met 105 Glu Asn Gl n Ala Pro 110 ASP Gly Glu Ser Glu Gin pro Ala Asn Gin Pro Asp Met Ala Asn Thr Ala 115 120 125 Asp Gly Met Gin Gly ASp Asp Pro Ser Ala Gly Gly Glu Asn Ala Gly 130 135 140 Asn Thr Ala Ala Gin Gly Thr Asn Gin Ala Glu Asn Asn Gin Thr Ala 160 145 150 155 Gly Ser Gl n Asn pro Ala Ser ser Thr Asn Pro ser Ala Thr Asn ser 165 170 175 Gly Gly Asp Phe Gly Arg Thr Asn val Gly Asn ser Val val Ile Asp ISO 185 190 Gly Pro Ser Gin Asn ile Thr Leu Thr HÍS cys Lys Gly Asp ser Cys 195 200 205 ser Gly Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu val Gin Leu Lys Ser Glu phe 210 215 220

Glu Lys Leu Ser Asp Ala Asp Lys Ile Ser Asn Tyr Lys Lys Asp Gly 32 225 230 235 240 Lys Asn Asp Gly Lys 245 Asn ASP Lys phe val 250 Gly Leu val Ala ASP 255 Ser Vai Gin Met Lys 260 Gly Ile Asn Gin Tyr 265 Ile Ile Phe Tyr Lys 270 Pro Lys Pro Thr Ser 275 phe Ala Arg phe Arg 280 Arg Ser Ala Arg Ser 285 Arg Arg Ser Leu Pro 290 Ala Glu Met Pro Leu 295 Ile pro val Asn Gin 300 Ala Asp Thr Leu ile 305 Vai ASP Gly Glu Al a 310 Val ser Leu Thr Gly 315 His Ser Gly Asn ile 320 Phe Ala Pro Glu Gly 325 Asn Tyr Arg Tyr Leu 330 Thr Tyr Gly Ala Glu 335 Lys Leu Pro Gly Gly 340 Ser Tyr Ala Leu Arg 345 val Gin Gly Glu Pro 350 ser Lys Gly Glu Met 355 Leu Ala Gly Thr Ala 360 Val Tyr Asn Gly Glu 365 Val Leu Hi S Phe His 370 Thr Glu Asn Gly Arg 375 pro ser Pro Ser Arg 380 Gly Arg Phe Ala Ala 385 Lys Vai Asp Phe Gly 390 Ser Lys Ser Val Asp 395 Gly Ile Ile Asp Ser 400 Gly Asp Gly Leu His 405 Met Gly Thr Gin Lys 410 Phe Lys Ala Ala Ile 415 Asp Gly Asn Gly Phe 420 Lys Gly Thr Trp Thr 425 Glu Asn Gly Gly Gly 430 ASP val ser Gly Lys 435 Phe Tyr Gly Pro Ala 440 Gly Glu Glu Val Ala 445 Gly Lys Tyr Ser Tyr 450 Arg Pro Thr Asp Ala 455 Glu Lys Gly Gly Phe 460 Gly val phe Al a Gly 465 Lys Lys Glu Gin ASP 470 Gly ser Gly Gly Gly 475 Gly Ala Thr Tyr Lys 480 Vai Asp Glu Tyr Hi s 485 Ala Asn Ala Arg Phe 490 Ala Ile Asp His Phe 495 Asn Thr Ser Thr Asn 500 Vai Gly Gly Phe 3; Gly Leu Thr Gly ser 510 val Glu Phe Asp Gin 515 Al a Lys Arg Asp Gly 520 Lys ile Asp ile Thr 525 Ile pro val Ala Asn 530 Leu Gl n ser Gly ser 535 Gin His Phe Thr Asp 540 His Leu Lys Ser Ala 545 ASp He Phe ASp Ala 550 Ala Gin Tyr Pro Asp 555 Ile Arg Phe Val Ser 560 Thr Lys Phe Asn Phe 565 Asn Gly Lys Lys Leu 570 Val Ser val ASP Gly Asn 575 Leu Thr Met Hl s 580 Gly Lys Thr Ala Pro 585 Val Lys Leu Lys Ala 590 Glu Lys phe Asn cys Tyr Gin ser Pro Met Ala Lys Thr Glu vai Cys Gly Gly 33 595 600 605

Asp Phe ser Thr Thr ile Asp Arg Thr Lys Trp Gly vai Asp Tyr Leu 610 615 620 vai Asn Vai Gly Met Thr Lys ser vai Arg Ile Asp Ile Gin Ile Glu 625 630 635 640

Ala Ala Lys Gin

<210>5 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador <400> 5

ctagctagcg ggggcggcgg tggcg 25 <210>6 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador <400> 6

cccgctcgag tcaatcctgc tcttttttgc c 31 <210>7 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador <400> 7

gggaattcca tatgaaaaaa atcatcttcg ccg 33 <210>8 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador 34 <400> 8

cccgctcgag ttattgtttg gctgcctcga t 31 <210>9 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador <400> 9

gggaattcca tatggccacc tacaaagtgg acg 33 <210> 10 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador <400> 10 cggggatcct tgtttggctg cctcgatttg 30 35

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente Europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente citados na descrição • WO 9924578 A [0002] • WO 9936544 A [0002] • WO 9957280 A [0002] [0004] [0028] • WO 00230 A [0002] • WO 0066741 A [0021] [0027] • GB 000469 A [0079] • GB 0027675 A [0079]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Evans. Infert.Immun., 1974, vol. 10, 1010-1017 [0049] • Filip. J.Bact., 1973, vol. 115, 717-722 [0069] • Davies. J. Immunol.Meth., 1990, vol. 143, 215-225 [0069]

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína híbrida, em que a proteína compreende: a) uma das sequências SEQ ID NO 2 ou 4; ou b) uma sequência que tem mais de 70 % de identidade de sequência com uma das SEQ ID NO 2 ou 4.

2. Uma proteína híbrida de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína compreende uma sequência que tem 80 % de identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs: 2 ou 4.

3. Uma proteína híbrida de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína compreende uma sequência que tem 90 % de identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs: 2 ou 4.

4. Um ácido nucleico que codifica a proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3.

5. Um vector que contém o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4.

6. Uma célula hospedeira que contém o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4 ou o vector de acordo com a reivindicação 5.

7. Uma composição imunogénica ou de diagnóstico que compreende a proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3.

8. A proteína de acordo com a reivindicação 1, ou a composição de acordo com a reivindicação 7 para utilização num método de tratamento ou prevenção de infecção devido a bactérias do género Neisseria. 2 2 em

9. Um método para a expressão de uma proteína híbrida, que a proteína compreende: a) uma das sequências SEQ ID NO: 2 ou 4; ou de b) uma sequência que tem mais de 70 % de identidade sequência com uma das SEQ ID NO 2 ou 4. a de

10. O método de acordo com a reivindicação 9, em que proteína compreende uma sequência que tem 80 % identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs: 2 ou 4. a de

11. O método de acordo com a reivindicação 9, em que proteína compreende uma sequência que tem 90 % identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs: 2 ou 4.