ES2299476T3 - Expresion hibrida de proteinas de neisseria. - Google Patents
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Abstract
Una proteína híbrida de fórmula NH2-A-B-COOH, en la que A comprende la proteína BG287 de Neisseria, y B comprende la proteína 953 de Neisseria, y en la que la secuencia de aminoácidos de la proteína híbrida es la descrita en SEQ ID NO:6, o es una secuencia que tiene más de 70% de coincidencia de secuencia con ésta.
Description
Expresión híbrida de proteínas de
Neisseria.
Esta invención pertenece al campo de la
expresión de proteínas. En particular, se refiere a la expresión
heteróloga de proteínas de Neisseria (por ejemplo, N.
gonorrhoeae o, preferiblemente, N. meningitidis).
\vskip1.000000\baselineskip
Las solicitudes de patente internacional
WO99/24578, WO99/35544, WO99/57280 y WO00/22430 describen proteínas
de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae.
Estas proteínas se describen, de forma típica, expresadas en E.
coli (es decir, una expresión heteróloga) como fusiones con GST
N-terminales o como fusiones con marcador de His
C-terminales, aunque también se describen otros
sistemas de expresión, incluyendo la expresión en Neisseria
nativa.
Guillén et al., Biotecnología aplicada,
1996, vol. 13, nº 4, pp. 271-275 describen una
proteína de fusión de la proteína P.1.15 de Neisseria con la
proteína P64K, y su expresión en E. coli.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar estrategias alternativas y mejoradas para la expresión
heteróloga de estas proteínas. Estas estrategias afectan, de modo
típico, al nivel de expresión, la facilidad de purificación, la
localización celular de la expresión y/o las propiedades
inmunológicas de la proteína expresada.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la invención, se expresan dos proteínas de
Neisseria como una única proteína híbrida. Se prefiere no
utilizar un compañero de fusión que no provenga de Neisseria
(por ejemplo, GST o poli-His).
Esto ofrece dos ventajas. En primer lugar, una
proteína que puede ser inestable, o que se expresa poco por sí
sola, puede mejorarse añadiendo un compañero de hibridación adecuado
que solucione el problema. En segundo lugar, se simplifica la
fabricación comercial, ya que sólo es necesario emplear una
expresión y purificación para producir dos proteínas útiles por
separado.
Por tanto, la invención proporciona una proteína
híbrida de fórmula
NH_{2}-A-B-COOH,
en la que A comprende la proteína \DeltaG287 de Neisseria,
y B comprende la proteína 953 de Neisseria, y en la que la
secuencia de aminoácidos de la proteína híbrida es la descrita en
SEQ ID NO:6, o es una secuencia que tiene más de 70% de
coincidencia de secuencia con ésta.
Las proteínas proceden preferiblemente de la
cepa 2996 o de la cepa 394/98.
Preferiblemente, las proteínas constituyentes (A
y B) en una proteína híbrida según la invención procederán de la
misma cepa.
Las proteínas fusionadas en el híbrido pueden
unirse directamente o pueden unirse a través de un péptido conector,
por ejemplo, mediante un conector de poliglicina (es decir, G_{n}
en el que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), o a través de
una secuencia peptídica corta que facilite la clonación.
Evidentemente, se prefiere no unir una proteína \DeltaG al
C-terminal de un conector de poliglicina.
Las proteínas fusionadas pueden carecer de los
péptidos conductores nativos, o pueden incluir la secuencia
peptídica conductora del compañero de fusión
N-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prefiere utilizar un hospedante heterólogo.
El hospedante heterólogo puede ser procariota o eucariota.
Preferiblemente es E. coli, pero otros hospedantes adecuados
incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi,
Salmonella typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea,
Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras,
etc.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también proporciona una proteína
que presenta coincidencia de secuencia con la proteína de SEQ ID NO
6. Tal como se describió anteriormente, el grado de "coincidencia
de secuencia" es preferiblemente mayor que 70% (por ejemplo,
80%, 90%, 95%, 99% o mayor).
El grado de "coincidencia de secuencia" se
determina preferiblemente mediante el algoritmo de búsqueda de
homología de Smith-Waterman, ejecutado en el
programa MPSRCH (Oxford Molecular), empleando una búsquedad de
huecos afines con los parámetros penalización de hueco abierto =
12 y penalización de extensión de hueco = 1. De forma
típica, se considera que 50% o más de coincidencia entre dos
proteínas es una indicación de equivalencia funcional.
Las proteínas de la invención se encuentran en
el serogrupo B de N. meningitidis.
Las proteínas de la invención preferidas son las
del serogrupo B de la cepa 2996 (Petterson et al., Intect.
Immun., 1993, 61(11):4724-4733) o de la cepa
394/98 (una cepa de Nueva Zelanda) (Martín et al., JID, 1998,
177:447-500) de N. meningitidis. A menos que
se indique lo contrario, las proteínas mencionadas en la presente
proceden de la cepa 2996 de N. meningitidis. Sin embargo, se
apreciará que la invención no está limitada, en general, por la
cepa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 1 a 6 muestran las proteínas
híbridas descritas en la presente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se descubrió que la deleción de la secuencia
(Gly)_{6} en 287 tiene un profundo efecto sobre la
expresión proteica. La proteína que carece de los aminoácidos
N-terminales hasta GGGGGG se denomina
"\Delta287". En la cepa MC58, su secuencia básica (el
péptido conductor está subrayado) es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La \DeltaG287, con o sin un marcador de His
("\DeltaG287-His" y "\DeltaG287K",
respectivamente) se expresa a niveles muy buenos, comparada con
"298-His" o "297^{sin \ marcar}".
Basándose en los datos de variabilidad genética,
se expresaron variantes de
\Delta-G287-His en E. coli
de una serie de cepas MenB, en particular de las cepas 2996, MC58,
1000 y BZ232. Los resultados también fueron buenos; cada uno de
ellos produjo altas valoraciones con ELISA y también unas
valoraciones bactericidas séricas >8192. La \DeltaG287K,
expresada a partir de pET-24b, produjo excelentes
valoraciones en el ensayo ELISA y bactericida sérico.
La deleción de secuencias de
poli-Gly también es aplicable a Tbp2 (NMB0460), 741
(NMB1870) y 983
(NMB1969). Cuando se clonan en el vector pET y se expresan en E. coli sin la secuencia que codifica sus péptidos conductores y sin poli-Gly (es decir, como "formas \DeltaG"), se observa el mismo efecto: la expresión es satisfactoria en clones que portan la deleción del tramo de poliglicina, y baja o ausente si las glicinas están presentes en la proteína expresada.
(NMB1969). Cuando se clonan en el vector pET y se expresan en E. coli sin la secuencia que codifica sus péptidos conductores y sin poli-Gly (es decir, como "formas \DeltaG"), se observa el mismo efecto: la expresión es satisfactoria en clones que portan la deleción del tramo de poliglicina, y baja o ausente si las glicinas están presentes en la proteína expresada.
\newpage
La \DeltaG287 se fusionó directamente dentro
de marco cadena arriba de 919, 953, 961 (las secuencias que
aparecen a continuación) y ORF46.1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
La eficacia bactericida (cepa homóloga) de
anticuerpos generados contra las proteínas híbridas se comparó con
anticuerpos generados contra mezclas sencillas de los antígenos
componentes (empleando 287-GST) para 919 y
ORF46.1:
\vskip1.000000\baselineskip
También se obtuvieron los datos para la
actividad bactericida contra cepas MenB heterólogas y contra los
serotipos A y C:
Las proteínas híbridas con \DeltaG287 en el
N-terminal son, por tanto, inmunológicamente
superiores a las mezclas sencillas, siendo
\DeltaG287-ORF46.1 particularmente eficaz, incluso
contra cepas heterólogas. La \DeltaG287-ORF46.1K
puede expresarse en pET-24b.
\newpage
Se prepararon las mismas proteínas híbridas
utilizando la cepa 394/98 de Nueva Zelanda en lugar de 2996:
\newpage
Ejemplo
2
La expresión de 287, de longitud completa con un
marcador de His C-terminal, o sin su péptido
conductor pero con un marcador de His C-terminal,
produce unos niveles de expresión bastante bajos. Se logró una mejor
expresión empleando una fusión con GST N-terminal.
Como alternativa a la utilización de GST como compañero de fusión
N-terminal, se introdujo 287 en el
C-terminal de la proteína 919
("919-287"), de la proteína 953
("953-287"), y de las proteínas ORF46.1
("ORF46.1-287"). En estos casos se delecionaron
los péptidos conductores, y los híbridos eran fusiones dentro de
marco directas.
Para generar el híbrido 953-287,
los péptidos conductores de las dos proteínas se omitieron diseñando
un cebador director cadena abajo del conductor de cada secuencia;
la secuencia del codón de fin se omitió en el cebador inverso de
953 pero se incluyó en el cebador inverso de 287. Para el gen 953,
los cebadores 5' y 3' empleados para la amplificación incluían un
sitio de restricción NdeI y BamHI, respectivamente,
mientras que para la amplificación del gen 287, los cebadores 5' y
3' incluían un sitio de restricción BamHI y XhoI,
respectivamente. De esta manera puede lograrse una clonación
direccional secuencial de los dos genes en pET21b+, empleando
NdeI-BamHI (para clonar el primer gen), y
posteriormente BamHI-XhoI (para clonar el segundo
gen).
El híbrido 919-287 se obtuvo
clonando la secuencia codificadora para la porción madura de 287 en
el sitio XhoI en el extremo 3' del clon
919-His en pET21b+. Los cebadores utilizados para la
amplificación del gen 287 se diseñaron para introducir un sitio de
restricción SalI en el extremo 5', y un sitio XhoI en
el extremo 3' del fragmento de PCR. Puesto que los extremos
cohesivos producidos por las enzimas de restricción SalI y
XhoI son compatibles, el producto de PCR de 287 digerido con
SalI-XhoI puede insertarse en el clon
pET21b-919 roto con XhoI.
El híbrido ORF46.1-287 se obtuvo
de forma similar.
Se comparó la eficacia bactericida (cepa
homóloga) de anticuerpos generados contra las proteínas híbridas,
con anticuerpos generados contra mezclas sencillas de los antígenos
componentes:
\vskip1.000000\baselineskip
También se obtuvieron los datos para la
actividad bactericida contra cepas MenB heterólogas y contra los
serotipos A y C para 919-287 y
953-287:
También se construyeron híbridos de ORF46.1 y
919. Los mejores resultados (valoración cuatro veces mayor) se
lograron con 919 en el N-terminal.
También se ensayaron los híbridos
919-519His, ORF97-225His y
225-ORF97His. Produjeron moderadas valoraciones de
ELISA y respuestas de anticuerpos bactericidas.
Puesto que los híbridos de dos proteínas A y B
pueden ser
NH_{2}-A-B-COOH o
NH_{2}-B-A-COOH,
también se prepararon los híbridos "inversos" con 287 en el
N-terminal, pero utilizando \DeltaG287. Se empleó
un panel de cepas, incluyendo la cepa homóloga 2996. Se usó FCA
como adyuvante:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las mejores valoraciones bacterianas se
obtienen, en general, con 287 en el N-terminal.
Cuando se fusiona con la proteína 961 (la
secuencia
NH_{2}-\DeltaG287-961-COOH
mostrada anteriormente), la proteína resultante es insoluble y debe
desnaturalizarse y renaturalizarse para la purificación. Después de
la renaturalización, se descubrió que aproximadamente 50% de la
proteína permanecía insoluble. Las proteínas soluble e insoluble se
compararon, y se obtuvieron unas valoraciones bactericidas mucho
mejores con la proteína soluble (FCA como adyuvante):
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, las valoraciones con la forma
insoluble mejoraron utilizando un adyuvante de alumbre:
También se usó 961c en las proteínas híbridas
(véase anteriormente). Puesto que 961 y sus variantes de dominio
dirigen una expresión eficaz, son idealmente adecuados como porción
N-terminal de una proteína híbrida.
Se entenderá que la invención se ha descrito
sólo como ejemplo y pueden realizarse modificaciones permaneciendo
dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, se prevé el uso de
proteínas procedentes de otras cepa (por ejemplo, véase el
documento WO00/66741 para secuencias polimórficas para 287 y
953).
Los genes que codifican los antígenos de interés
se amplificaron mediante PCR, utilizando oligonucleótidos diseñados
basándose en la secuencia genómica de N. meningitidis B MC58.
Siempre se utiliza ADN genómico de la cepa 2996 como molde en las
reacciones de PCR, a menos que se indique lo contrario, y los
fragmentos amplificados se clonaron en el vector de expresión
pET21b+ (Novagen) para expresar la proteína como producto marcado
con His C-terminal, o en pET-24b+
(Novagen) para expresar la proteína en forma "no marcada" (por
ejemplo, \DeltaG287K).
Cuando una proteína se expresa sin un compañero
de fusión y con su propio péptido conductor (si está presente), se
realiza una amplificación del marco de lectura abierto (codones
desde ATG hasta FIN).
Cuando una proteína se expresa en forma "no
marcada", el péptido conductor se omite diseñando el cebador de
amplificación del 5'-terminal cadena abajo de la
secuencia conductora predicha.
La temperatura de fusión de los cebadores
utilizados en la PCR depende del número y tipo de nucleótidos
hibridantes en el cebador completo, y se determinó empleando las
fórmulas:
(sin la
cola)T_{m1} = 4(G+C) +
2(A+T)
(cebador
completo)T_{m2} = 64,9 + 0,41 (GC%) -
600/N
Las temperaturas de fusión de los
oligonucleótidos seleccionados eran normalmente de
65-70ºC para el oligonucleótido completo, y de
50-60ºC para la región de hibridación sola.
Se sintetizaron oligonucleótidos utilizando un
sintetizador de ADN/ARN Perkin Elmer 394, se eluyeron de las
columnas en 2,0 ml de NH_{4}OH, y se desprotegieron mediante 5
horas de incubación a 56ºC. Los oligonucleótidos se precipitaron
mediante la adición de acetato de Na 0,3 M y 2 volúmenes de etanol.
Las muestras se centrifugaron y los sedimentos se resuspendieron en
agua.
\vskip1.000000\baselineskip
En todos los constructos que comienzan con un
ATG no seguido por un sitio NheI exclusivo, el codón ATG es
parte del sitio NheI utilizado para la clonación. Los
constructos fabricados utilizando NheI como sitio de
clonación en el extremo 5' (por ejemplo, los que contienen 287 en el
N-terminal) tienen dos codones más (GCT AGC)
fusionados a la secuencia codificadora del antígeno.
Las cepas 2996, MC58, 394.98, 1000 y BZ232 (y
otras) de N. meningitidis se cultivaron hasta la fase
exponencial en 100 ml de medio GC, se recogieron mediante
centrifugación, y se resuspendieron en 5 ml de tampón (sacarosa al
20% p/v, Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM, pH 8). Después
de 10 min de incubación en hielo, las bacterias se lisaron
añadiendo 10 ml de disolución de lisis (NaCl 50 mM,
Na-Sarkosyl al 1%, proteinasa K 50 \mug/ml), y la
suspensión se incubó a 37ºC durante 2 horas. Se realizaron dos
extracciones con fenol (equilibrado a pH 8) y una extracción con
CHCl_{3}/alcohol isoamílico (24:1). El ADN se precipitó mediante
la adición de acetato de sodio 0,3 M y 2 volúmenes de etanol, y se
recogió mediante centrifugación. El sedimento se lavó una vez con
etanol al 70% (v/v) y se redisolvió en 4,0 ml de tampón TE
(Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). Se midió la
concentración de ADN mediante una lectura de DO_{260}.
El protocolo de PCR convencional fue el
siguiente: se utilizó como molde 200 ng de ADN genómico procedente
de las cepas 2996, MC581000 o BZ232, o 10 ng de preparación de ADN
de plásmido de clones recombinantes, en presencia de 40 \muM de
cada uno de los cebadores oligonucleotídicos, disolución de dNTP
400-800 \muM, 1x tampón de PCR (que incluye
MgCl_{2} 1,5 mM), 2,5 unidades de TaqI ADN polimerasa
(utilizando Perkin-Elmer AmpliTaQ, molde largo
Boehringer Mannheim Expand^{TM}).
Después de una incubación preliminar de 3
minutos de la mezcla completa a 95ºC, cada muestra se sometió a una
amplificación en dos etapas: los primeros 5 ciclos se realizaron
utilizando la temperatura de hibridación que excluye la cola de
enzimas de restricción del cebador (T_{m1}). Después siguieron 30
ciclos según la temperatura de hibridación calculada para los
oligonucleótidos de longitud completa (T_{m2}). Los tiempos de
alargamiento, realizado a 68ºC o 72ºC, varían según la longitud del
Orf (marco de lectura abierto) que se va a amplificar. En el caso
de Orf1, el tiempo de alargamiento, comenzando a partir de 3
minutos, aumento en 15 segundos cada ciclo. Los ciclos se
completaron con una etapa de extensión de 10 minutos a 72ºC.
El ADN amplificado se cargó directamente sobre
un gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADN que corresponde a la
banda del tamaño correcto se purificó del gel utilizando el kit de
extracción de gel de Qiagen, siguiendo el protocolo del
fabricante.
El ADN purificado que corresponde al fragmento
amplificado se digirió con las enzimas de restricción apropiadas
para clonarlo en pET-21b+, pET22b+ o
pET-24b+. Los fragmentos digeridos se purificaron
utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (siguiendo las
instrucciones del fabricante) y se eluyeron con H_{2}O, o con
Tris 10 mM, pH 8,5. Los vectores plásmidos se digirieron con las
enzimas de restricción apropiadas, se cargaron sobre un gel de
agarosa al 1,0%, y la banda correspondiente al vector digerido se
purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick de
Qiagen.
Los fragmentos que correspondían a cada gen,
previamente digeridos y purificados, se acoplaron a
pET-21b+, pET22b+ o pET-24b+. Se
empleó una proporción molar de fragmento/vector 3:1 con ADN ligasa
de T4 en el tampón de acoplamiento suministrado por el
fabricante.
El plásmido recombinante se transformó en E.
coli DH5 o HB101 competente mediante la incubación de la
disolución de reacción de ligasa y bacterias durante 40 minutos en
hielo, y después a 37ºC durante 3 minutos. A esto le siguió la
adición de 800 \mul de caldo de cultivo LB y una incubación a 37ºC
durante 20 minutos. Las células se centrifugaron a velocidad máxima
en una microcentífuga Eppendorf, se resuspendieron en
aproximadamente 200 \mul del sobrenadante, y se colocaron en
placas con agar con ampicilina y LB (100 mg/ml).
La selección de los clones recombinantes se
realizó cultivando colonias, seleccionadas aleatoriamente, durante
la noche a 37ºC en 4,0 ml de caldo de cultivo LB + ampicilina 100
\mug/ml. Las células se sedimentaron y el ADN del plásmido se
extrajo utilizando el kit de minipreparaciones de centrifugación
QIAprep de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se
digirió aproximadamente 1 \mug de cada minipreparación individual
con las enzimas de restricción apropiadas, y el digerido se cargó
sobre un gel de agarosa al 1-1,5% (dependiendo del
tamaño esperado del inserto), en paralelo con el marcador de peso
molecular (1 kb de DNA Ladder, GIBCO). Los clones positivos se
seleccionaron basándose en el tamaño del inserto.
Después de clonar cada gen en el vector de
expresión, los plásmidos recombinantes se transformaron en cepas de
E. coli adecuadas para la expresión de la proteína
recombinante. Se empleó 1 \mul de cada constructo para
transformar E. coli BL21-DE3 como se
describió anteriormente. Se inocularon colonias recombinantes
individuales en 2 ml de LB + ampicilina (100 \mug/ml), se
incubaron a 37ºC durante la noche, después se diluyeron 1:30 en 20
ml de LB + ampicilina (100 \mug/ml) en matraces de 100 ml, para
producir una DO_{600} entre 0,1 y 0,2. Los matraces se incubaron
a 30ºC o a 37ºC en un agitador de baño de agua giratorio hasta que
la DO_{600} indicó un crecimiento exponencial adecuado para la
inducción de la expresión (0,4-0,8 DO). La
expresión de las proteínas se indujo mediante la adición de IPTG 1,0
mM. Después de 3 horas de incubación a 30ºC o a 37ºC, se midió la
DO_{600} y se estudió la expresión. Se centrifugaron 1,0 ml de
cada muestra en una microcentrífuga, el sedimento se resuspendió en
PBS y se analizó mediante SDS-PAGE y tinción con
azul de Coomassie.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonaron diversas formas de 287 a partir de
las cepas 2996 y MC58. Se construyeron con una fusión de un
marcador de His C-terminal e incluían una forma
madura (aa 18-427), constructos con deleciones
(\Delta1, \Delta2, \Delta3 y \Delta4), y clones compuestos
de dominios B o C. Para cada clon purificado como una fusión con
His, se realizó una siembra en estría de una única colonia y se
cultivó durante la noche a 37ºC sobre una placa de agar con
LB/ampicilina (100 \mug/ml). Una colonia aislada de esta placa se
inoculó en 20 ml de medio líquido de LB/ampicilina (100 \mug/ml)
y se cultivó durante la noche a 37ºC con agitación. El cultivo de
la noche se diluyó 1:30 en 1,0 l de medio líquido de LB/ampicilina
(100 \mug/ml) y se dejó que creciese a la temperatura óptima
(30ºC o 37ºC) hasta que la DO_{550} alcanzó un valor de
0,6-0,8. La expresión de la proteína recombinante
se indujo mediante la adición de IPTG (concentración final 1,0 mM) y
el cultivo se incubó durante 3 horas más. Las bacterias se
recolectaron mediante centrifugación a 8000 g durante 15 min a 4ºC.
El sedimento bacteriano se resuspendió en 7,5 ml de (i) tampón A
frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 10 mM, pH 8,0)
para proteínas solubles, o (ii) tampón B (Tris-HCl
10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 8,8 y, opcionalmente, urea 8 M)
para proteínas insolubles. Las proteínas purificadas en forma
soluble incluían 287-His, \Delta1, \Delta2,
\Delta3 y \Delta4287-His,
\Delta4287MC58-His, 287c-His y
287c-MC58-His. La proteína
287bMC58-His era insoluble y se purificó en
consecuencia. Las células se rompieron mediante sonicación sobre
hielo cuatro veces durante 30 seg a 40 W utilizando un sonicador 450
Branson, y se centrifugaron a 13000 x g durante 30 min a 4ºC. Para
las proteínas insolubles, los sedimentos se resuspendieron en 2,0 ml
de tampón C (clorhidrato de guanidina 6 M, tampón fosfato 100 mM,
Tris-HCl 10 mM, pH 7,5), y se trataron con 10 pases
con un homogeneizador Dounce. El homogeneizado se centrífugo a 13000
g durante 30 min y se guardó el sobrenadante. Los sobrenadantes de
las preparaciones soluble e insoluble se mezclaron con 150 \mul de
resina Ni^{2+} (previamente equilibrada con tampón A o tampón B,
según sea apropiado) y se incubaron a temperatura ambiente con una
agitación suave durante 30 min. La resina era Chelating Sepharose
Fast Flow (Pharmacia), preparada según las instrucciones del
fabricante. La preparación discontinua se centrífugo a 700 g durante
5 min a 4ºC y se rechazó el sobrenadante. La resina se lavó dos
veces (de forma discontinua) con 10 ml de tampón A o B durante 10
min, se resuspendió en 1,0 ml de tampón A o B, y se cargó en una
columna desechable. La resina continuó lavándose con (i) tampón A a
4ºC, o (ii) tampón B a temperatura ambiente, hasta que la DO_{280}
de la corriente alcanzó un valor de 0,02-0,01. La
resina se volvió a lavar con (i) tampón C frío (NaCl 300 mM, tampón
fosfato 50 mM, imidazol 20 mM, pH 8,0), o (ii) tampón D
(Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 6,3 y,
opcionalmente, urea 8 M) hasta que la DO_{280} de la corriente
alcanzó un valor de 0,02-0,01. La proteína de
fusión-His se eluyó mediante la adición de 700
\mul de (i) tampón de elución A frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato
50 mM, imidazol 250 mM, pH 8,0), o (ii) tampón de elución B
(Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 4,5 y,
opcionalmente, urea 8 M), y las fracciones se recogieron hasta que
la DO_{280} indicó que se había obtenido toda la proteína
recombinante. Se analizaron partes alícuotas de 20 \mul de cada
fracción de elución mediante SDS-PAGE. Se estimaron
las concentraciones de proteínas utilizando el ensayo de
Bradford.
Bradford.
\vskip1.000000\baselineskip
Se requiere una desnaturalización para
solubilizar 287bMC8, por tanto se empleó una etapa de
renaturalización antes de la inmunización. Se añadió glicerol a las
fracciones desnaturalizadas obtenidas anteriormente para producir
una concentración final de 10% v/v. Las proteínas se diluyeron hasta
200 \mug/ml utilizando tampón de diálisis I (glicerol al 10% v/v,
arginina 0,5 M, tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5,0 mM,
glutatión oxidado 0,5 mM, urea 2,0 M, pH 8,8), y se dializaron
contra el mismo tampón durante 12-14 horas a 4ºC. Se
realizó otra diálisis con tampón II (glicerol al 10% v/v, arginina
0,5 M, tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5,0 mM, glutatión
oxidado 0,5 mM, pH 8,8) durante 12-14 horas a 4ºC.
Se estimó la concentración de proteína utilizando la fórmula:
Proteína
(mg/ml) = (1,55 x DO_{280}) - (0,76 x
DO_{260})
Se inmunizaron ratontes Balb/C con antígenos en
los días 0, 21 y 35, y se analizaron los sueros el día 49.
Las cepas MenB M7 acapsuladas y las capsuladas
se cultivaron en placas de agar de chocolate y se incubaron durante
la noche a 37ºC con CO_{2} al 5%. Las colonias bacterianas se
recogieron de las placas de agar utilizando un hisopo Dracon
estéril y se inocularon en caldo de cultivo
Mueller-Hinton (Difco) que contenía glucosa al
0,25%. El crecimiento bacteriano se controló cada 30 minutos
siguiendo la DO_{620}. Se dejaron crecer las bacterias hasta que
la DO alcanzó un valor de 0,4-0,5. El cultivo se
centrífugo durante 10 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se
eliminó y las bacterias se lavaron dos veces con PBS, se
resuspendieron en PBS que contenía formaldehído al 0,025%, y se
incubaron durante 1 hora a 37ºC, y después durante la noche a 4ºC
con agitación. Se añadieron 100 \mul de células bacterianas a
cada pocillo de una placa Greiner de 96 pocillos y se incubaron
durante la noche a 4ºC. Los pocillos entonces se lavaron tres veces
con tampón de lavado PBT (Tween-20 al 0,1% en PBS).
Se añadieron 200 \mul de tampón de saturación
(polivinilpirrolidona 10 al 2,7% en agua) a cada pocillo y las
placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se lavaron
tres veces con PBT. Se añadieron 200 \mul de los sueros diluidos
(tampón de dilución: BSA al 1%, Tween-20 al 0,1%,
NaN_{3} al 0,1% en PBS) a cada pocillo, y las placas se incubaron
durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con PBT.
Se añadieron 100 \mul a cada pocillo de suero antirratón de conejo
conjugado con HRP (Dako) diluido 1:2000 en tampón de dilución, y
las placas se incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Los pocillos se
lavaron tres veces con tampón PBT. Se añadieron 100 \mul de tampón
sustrato para HRP (25 ml de tampón citrato, pH 5, 10 mg de
O-fenildiamina, y 10 \mul de H_{2}O_{2}) a
cada pocillo, y las placas se dejaron a temperatura ambiente
durante 20 minutos. Se añadieron 100 \mul de H_{2}SO_{4} al
12,5% a cada pocillo y se siguió la DO_{490}. Las valoraciones de
ELISA se calcularon de manera arbitraria como la dilución de los
sueros que produce un valor de DO_{490} de 0,4 por encima del
nivel de los sueros preinmunológicos. El ELISA se consideró
positivo cuando la dilución de los sueros con una DO_{490} de 0,4
era mayor que 1:400.
La cepa MenB M7 acapsulada se cultivó en placas
de agar de chocolate y se incubó durante la noche a 37ºC con
CO_{2} al 5%. Las colonias bacterianas se recogieron de las placas
de agar utilizando un hisopo Dracon estéril y se inocularon en 4
tubos que contenían cada uno 8 ml de caldo de cultivo
Mueller-Hinton (Difco) que contenía glucosa al
0,25%. El crecimiento bacteriano se controló cada 30 minutos
siguiendo la DO_{620}. Se dejaron crecer las bacterias hasta que
la DO alcanzó un valor de 0,35-0,5. El cultivo se
centrífugo durante 10 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se
eliminó y el sedimento se resuspendió en tampón de bloqueo (BSA al
1% en PBS, NaN_{3} al 0,1% en PBS) y se centrífugo durante 5
minutos a 4000 rpm. Las células se resuspendieron en tampón de
bloqueo para alcanzar una DO_{620} de 0,05. Se añadieron 100
\mul de células bacterianas a cada pocillo de una placa Costar de
96 pocillos. Se añadieron 100 \mul de los sueros diluidos (1:100,
1:200, 1:400) (en tampón de bloqueo) a cada pocillo, y las placas
se incubaron durante 2 horas a 4ºC. Las células se centrifugaron
durante 5 minutos a 4000 rpm, el sobrenadante se aspiró y las
células se lavaron mediante la adición de 200 \mul/pocillo de
tampón de bloqueo en cada pocillo. Se añadieron 100 \mul de
F(ab)_{2} de cabra antirratón conjugado con
R-ficoeritrina, diluido 1:100, a cada pocillo, y las
placas se incubaron durante 1 hora a 4ºC. Las células se
sedimentaron mediante centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos, y
se lavaron mediante la adición de 200 \mul/pocillo de tampón de
bloqueo. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron
en 200 \mul/pocillo de PBS, formaldehído al 0,25%. Las muestras se
trasladaron a tubos FACScan y se leyeron. Los ajustes del FACScan
(potencia del láser 15 mW) fueron: FL2 activo; umbral de
FSC-H: 92; voltaje de FSC PMT: E 01; SSC PMT: 474;
ganancias de amp. 61; FL-2 PMT: 586; valores de
compensación: 0.
Se cultivó la cepa 2996 de N.
meningitidis durante la noche a 37ºC sobre placas de agar de
chocolate (a partir de una cepa congelada) con CO_{2} al 5%. Las
colonias se recogieron y se utilizaron para inocular 7 ml de caldo
de cultivo Mueller-Hinton que contenía glucosa al
0,25% hasta alcanzar una DO_{620} de 0,05-0,08.
El cultivo se incubó durante aproximadamente 1,5 horas a 37ºC con
agitación hasta que la DO_{620} alcanzó un valor de
0,23-0,24. Las bacterias se diluyeron en tampón
fosfato 50 mM, pH 7,2, que contenía MgCl_{2} 10 mM, CaCl_{2} 10
mM, y BSA al 0,5% (p/v) (tampón de ensayo) con una dilución de
trabajo de 10^{5} CFU/ml. El volumen total de la mezcla de
reacción final era de 50 \mul, con 25 \mul de dilución en dos
veces en serie del suero de ensayo, 12,5 \mul de bacterias en la
dilución de trabajo, y 12,5 \mul de complemento de cría de conejo
(concentración final 25%).
Los controles incluían bacterias incubadas con
suero de complemento, sueros inmunológicos incubados con bacterias
y con complemento inactivado mediante calentamiento a 56ºC durante
30 minutos. Inmediatamente después de la adición del complemento de
cría de conejo, 10 \mul de los controles se cultivaron en placas
de agar Mueller-Hinton utilizando el procedimiento
de plano inclinado (tiempo 0). La placa de 96 pocillos se incubó
durante 1 hora a 37ºC con rotación. Se colocaron 7 \mul de cada
muestra sobre placas de agar Mueller-Hinton como
gotas, mientras que 10 \mul de los controles se cultivaron en
placas de agar Mueller-Hinton utilizando el
procedimiento de plano inclinado (tiempo 1). Las placas de agar se
incubaron durante 18 horas a 37ºC y se contaron las colonias
correspondientes al tiempo 0 y tiempo 1.
Proteínas purificadas (500 ng/carril), vesículas
de membrana externa (5 \mug) y extractos de células totales (25
\mug) procedentes de la cepa 2996 MenB se cargaron sobre un gel de
SDS al 12%-poliacrilamida y se trasladaron a una membrana de
nitrocelulosa. La transferencia se realizó durante 2 horas a 150 mA
a 4ºC, utilizando tampón de transferencia (base Tris al 0,3%,
glicina al 1,44%, metanol al 20% (v/v)). La membrana se saturó
mediante una incubación durante la noche a 4ºC en tampón de
saturación (leche desnatada al 10%, Triton X100 al 0,1% en PBS). La
membrana se lavó dos veces con tampón de lavado (leche desnatada al
3%, Triton X100 al 0,1% en PBS) y se incubó durante 2 horas a 37ºC
con sueros de ratón diluidos 1:200 en tampón de lavado. La membrana
se lavó dos veces y se incubó durante 90 minutos con una dilución
1:2000 de anti-Ig de ratón marcada con peroxidasa
de rábano. La membrana se lavó dos veces con Triton X100 al 0,1% en
PBS y se reveló con el kit de sustrato Opti-4CN
(Bio-Rad). La reacción se detuvo añadiendo agua.
Las VME (vesículas de membrana externa) se
prepararon como sigue: la cepa 2996 de N. meningitidis se
cultivó durante la noche a 37ºC con CO_{2} al 5% en 5 placas GC,
se recolectó con un asa de siembra y se resuspendió en 10 ml de
Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM. La inactivación
con calor se realizó a 56ºC durante 45 minutos y las bacterias se
rompieron mediante sonicación durante 5 min en hielo (50% del ciclo
de servicio, 50% de salida, micropunta de 3 mm de sonicador
Branson). Las células sin romper se retiraron mediante
centrifugación a 5000 g durante 10 minutos, el sobrenadante que
contenía la fracción de la envuelta celular total se recuperó y se
volvió a centrifugar durante la noche a 50000 g a una temperatura de
4ºC. El sedimento que contenía las membranas se resuspendió en
Sarkosyl al 2%, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, y
se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos para
solubilizar las membranas internas. La suspensión se centrífugo a
1000 g durante 10 minutos para retirar los agregados, y el
sobrenadante se volvió a centrifugar a 50000 g durante 3 horas. El
sedimento, que contenía las membranas externas, se lavó en PBS y se
resuspendió en el mismo tampón. La concentración de proteínas se
midió mediante el ensayo de proteínas D.C. Bio-Rad
(procedimiento de Lowry modificado), utilizando BSA como
patrón.
Los extractos de células totales se prepararon
como sigue: la cepa 2996 de N. meningitidis se cultivó
durante la noche en una placa GC, se recolectó con un asa de siembra
y se resuspendió en 1 ml de Tris-HCl 20 mM. La
inactivación con calor se realizó a 56ºC durante 30 minutos.
<110> Chiron SpA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Expresión híbrida de proteínas de
Neisseria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P026783WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/IB01/00420
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 28 de febrero 2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0004695.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 28 de febrero 200
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> BG0027875.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 13 de noviembre 2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> SeqWin99, versión 1.02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 608
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> deltaG287
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2505
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> deltaG287-919
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 832
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> deltaG287-919
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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<210> 5
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<211> 1746
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> deltaG287-953
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> deltaG287-953
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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<400> 14
Claims (5)
1. Una proteína híbrida de fórmula
NH_{2}-A-B-COOH,
en la que A comprende la proteína \DeltaG287 de Neisseria,
y B comprende la proteína 953 de Neisseria, y en la que la
secuencia de aminoácidos de la proteína híbrida es la descrita en
SEQ ID NO:6, o es una secuencia que tiene más de 70% de coincidencia
de secuencia con ésta.
2. La proteína de la reivindicación 1, en la que
\DeltaG287 es de la cepa 2996 de N. meningitidis o de la
cepa 394/98 de N. meningitidis.
3. La proteína de la reivindicación 1, en la que
953 es de la cepa 2996 de N. meningitidis o de la cepa
394/98 de N. meningitidis.
4. La proteína de la reivindicación 1, en la que
A y B son de la misma cepa de N. meningitidis.
5. La proteína de la reivindicación 1, que
comprende la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID
NO:6.
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