ES2386534T3 - Expresión heteróloga de proteínas de Neisseria - Google Patents

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Abstract

Proteína híbrida, en la que la proteína comprende:a) una de las secuencias SEC. ID. nº 2 o 4; ob) una secuencia que tiene más del 70% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.

Description

Expresión heteróloga de proteínas de Neisseria
Campo técnico
La presente invención pertenecen al campo de la expresión de proteínas. En particular, se refiere a la expresión heteróloga de proteínas de Neisseria (p. ej., N. gonorrhoeae o, preferentemente, N. meningitidis).
Antecedentes de la invención
Las solicitudes de patentes internacionales WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280 y WO 00/230 dan a conocer proteínas de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. Estas proteínas se describen normalmente como expresándose en E. coli (es decir, la expresión heteróloga) como fusiones de GST en el terminal N o fusiones con etiqueta His en el terminal C, aunque también se dan a conocer otros sistemas de expresión, incluyendo la expresión en Neisseria natural.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un enfoque alternativo y mejorado para la expresión heteróloga de estas proteínas. Este enfoque afectará normalmente el nivel de expresión, la facilidad de purificación, la localización celular de expresión y/o las propiedades inmunológicas de la proteína expresada.
Divulgación de la invención
Nomenclatura en la presente memoria
Las convenciones de nomenclatura utilizadas en el documento WO 99/57280 se utilizan en la presente memoria (por ejemplo, 'm287', 'g287' y 'a287' etc.).
Secuencias
La invención también proporciona una proteína o un ácido nucleico que tiene cualquiera de las secuencias establecidas en los siguientes ejemplos. También proporciona proteínas y ácido nucleico que tienen identidad de secuencia con éstos. El grado de 'identidad de secuencia' es preferentemente superior al 50% (p. ej. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más).
La identidad está determinado preferentemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman, ejecutado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), utilizando una búsqueda de hueco afín con penalización por hueco abierto = 12 y penalización por extensión del hueco = 1. Normalmente, 50% de identidad o más entre dos proteínas se considera que es una indicación de equivalencia funcional.
Además, la invención proporciona ácidos nucleicos que pueden hibridarse al ácido nucleico dado a conocer en los ejemplos, preferentemente en condiciones de "alta severidad" (p. ej. 65°C en una solución al 0,5% de SDS, 0,1xSSC).
La invención también proporciona ácido nucleico que codifica proteínas según la invención.
También debe apreciarse que la invención proporciona ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a las descritas anteriormente (p. ej. para complementaria o de sondeo).
El ácido nucleico según la invención puede prepararse, desde luego, de muchas maneras (p. ej. por síntesis química, a partir de bancos genómicos o de ADNc, a partir del propio organismo, etc.) y pueden adoptar diversas formas (p. ej. monocatenario, bicatenario, vectores, sondas etc.).
Además, la expresión "ácido nucleico" comprende ADN y ARN y también sus análogos, tales como los que contienen ejes centrales y también ácidos peptidonucleicos (APN), etc.
Las proteínas preferidas para su utilización según la invención son las del serogrupo b cepa 2996 o cepa 394/98 (cepa de Nueva Zelanda) de N. meningitidis. Salvo indicación contraria, las proteínas mencionadas en la presente memoria son de la cepa 2996 de N.meningilidis. Se apreciará, sin embargo, que la invención no esté limitada en general por la cepa. Las referencias a una determinada proteína (p. ej. '287', '953', etc.) podrán adoptarse para incluir esa proteína de cualquier cepa.
Proteínas híbridas
En un enfoque para expresión heteróloga, las proteínas 287 y 953 se expresan como una sola proteína híbrida. Es preferible que no se utilice ningún socio en la fusión no neisseriana (p. ej. GST o poli-His).
Esto ofrece dos ventajas. En primer lugar, una proteína que puede ser inestable o mal expresada por su cuenta puede ser asistida agregando a un acompañante híbrido adecuado que resuelve el problema. En segundo lugar, se simplifica la elaboración comercial, sólo necesitan emplearse una expresión y purificación para producir dos proteínas útiles por separado.
Las proteínas fusionadas en el híbrido puede unirse directamente, o pueden unirse a través de un péptido engarce,
p. ej. mediante un engarce de poliglicina (es decir, Gn en el que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) o mediante una secuencia corta de péptidos que facilita la clonación. Evidentemente es preferible que una proteína �G no se una al terminal C de un engarce de poli-glicina.
Las proteínas fusionadas pueden carecer de péptidos naturales principales o puede incluir la secuencia de péptidos principal del socio en la fusión del terminal N.
El procedimiento es muy adecuado para la expresión de las proteínas 287 y 953.
Las proteínas 287 y 953 pueden utilizarse en su forma esencialmente completa, o pueden utilizarse formas de eliminaciones (�G) de poli-glicina (por ejemplo, �G-287, etc.) o pueden utilizarse formas truncadas (p. ej. �1-287, �2-287 etc.) o pueden utilizarse versiones con dominio eliminado (p. ej. 287B, 287 C, 287BC, etc.).
La 287 es preferentemente al final del terminal C de un híbrido; si ha de utilizarse en el terminal N, se prefiere utilizar una forma �G de 287 (p. ej. como el terminal N de un híbrido con 953).
La 287 es preferentemente de la cepa 2996 o de la cepa 394/98.
Las alineaciones de formas polimórficas de 287 y 953 se dan a conocer en el documento WO 00/66741. Cualquiera de estos polimorfos puede utilizarse según la presente invención.
Hospedador heterólogo
Mientras que la expresión de las proteínas de la invención puede tener lugar en el hospedador natural (es decir, el organismo en el que se expresa la proteína en la naturaleza), la presente invención utiliza un hospedador heterólogo. El hospedador heterólogo puede ser procariota o eucariota. Preferentemente es E. coli, pero otros hospedadores adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae. Salmonella typhi, Salmonenna typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria einerea, Mycobateria (p. ej., M. tuberculosis), levadura, etc.
Vectores, etc.
Así como los métodos descritos anteriormente, la invención proporciona (a) ácido nucleico y vectores útiles en estos
procedimientos (b) los hospedadores que contienen dichos vectores (c) proteínas expresadas o expresables por los procedimientos (d) composiciones que comprenden estas proteínas, que puede ser adecuados como vacunas, por ejemplo, reactivos de diagnóstico o como como composiciones inmunógenas (e) estas composiciones para su utilización como medicamentos (p. ej. como vacunas) o como reactivos para diagnóstico (f) la utilización de estas composiciones en la preparación de (1) un medicamento para tratar o prevenir la infección debida a bacterias de Neisseria (2) un reactivo para diagnóstico destinado a detectar la presencia de bacterias de Neisseria o de anticuerpos aumentados contra bacterias Neisseria, y/o (3) un reactivo que puede aumentar los anticuerpos contra las bacterias Neisseria y (g) un método de tratamiento de un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de estas composiciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra dos proteínas híbridas según la invención.
Modos de realizar la invención
Ejemplo 1 - proteína 287
La proteína 287 de N. meningitidis (serogrupo B, cepa 2996) tiene la siguiente secuencia:
El péptido principal aparece subrayado. Las secuencias de 287 de otras cepas pueden encontrarse en las figuras 5 y 15 del documento WO 00/66741. El ejemplo 9 del documento WO 99/57280 da a conocer la expresión de 287 como una fusión de GST en E. coli. Se han utilizado numerosos enfoques más para expresar 287 en E. coli, incluyendo:
1) 287 como una fusión con etiqueta His ('287-His'); 2) 287 con su propio péptido principal pero sin ningún socio en la fusión ('287 L'); 3) 287 con el péptido principal ORF4 y sin ningún socio en la fusión ('287LOrf4'); y 4) 287 sin su péptido principal y sin ningún socio en la fusión ('287 sin etiqueta’):
Todas estas proteínas podrían expresarse y purificarse.
'287L' y '287LOrf4' se confirmaron como lipoproteínas.
Como se muestra en la figura 2, '287LOrf4' se construyó digeriendo 919LOrf4 con NheI y XhoI. El péptido principal ORF4 completo se restauró por adición de un secuencia de ADN que codifica los aminoácidos que faltan, como una
15 cola, en el cebador del extremo 5' (287LOrf4 for), fusionados a la secuencia de codificación de 287. El gen 287 que codifica la proteína madura se amplió utilizando los oligonucleótidos 287LOrf4 For y Rev (incluyendo las secuencias NheI y AhoI, respectivamente), digeridos con NheI y XhoI y ligados al fragmento de pETOrf4 purificado.
Ejemplo 2 - G287 e híbridos
La proteína que carece de los aminoácidos del terminal N hasta GGGGGG se denomina '�G 287'. En la cepa MC58, 20 su secuencia (péptido principal subrayado) es:
�G287, con o sin etiqueta His (' �G287-His' y '�G287K', respectivamente), se expresan en niveles muy buenos en comparación con los 287-His o '287 sin etiqueta'.
Se prepararon y se purificaron proteínas G287 para las cepas MC58, 1000 y BZ232. Cada uno de ellos dio altos valores de ELISA y también títulos bactericidas del suero de > 8192. �G287K, expresada en pET-24b, dio excelentes valores en ELISA y el ensayo bactericida del suero.
�G287 también se fusionó directamente en el marco corriente arriba de 953, (secuencias mostradas a continuación).
ELISA
Bactericida
�G287-His
3834 65536
Las proteínas híbridas con �G287-His en el terminal N son por lo tanto inmunológicamente superiores a las mezclas 10 simples.
Las mismas proteínas híbridas se prepararon utilizando la cepa 394/98 de Nueva Zelanda en lugar de 2996:
Ejemplo 3 - Fusiones ('híbridos') del terminal C con 287 M/G287
Según la invención, los híbridos de dos proteínas A y B pueden ser cualquiera de NH2-A-B-COOH o NH2-B-A-COOH. Se investigó el efecto de esta diferencia utilizando la proteína 287 ya sea el terminal C (en forma de '287-His') o terminal N (en forma de �G287 - secuencias mostrados anteriormente) para 953. Se utilizó un panel de cepas, incluyendo la cepa homóloga 2996. Se utilizó FCA como adyuvante:
287 y 953
Cepa �
G287-953 953-287
2996
65536 8192
BZ232
128 <4
1000
<4 <4
MC58
16384 1024
NGH38
>2048 4096
394/98
256 128
MenA (F6124)
>2048 32
MenC (B2133)
>8192 <16
Los mejores valores bactericidas se observan generalmente con 287 en el terminal N (en la forma �G)
Ejemplo 4 - Fusiones ('híbridos') en el terminal N a 287
La expresión de la proteína 287 en forma completa con una etiqueta His en el terminal C, o sin su péptido principal
10 pero con una etiqueta His en el terminal C, ofrece niveles de expresión bastante bajos. Se consigue mejor expresión utilizando una fusión GST en el terminal N.
Como alternativa al utilizar GST como socio en la fusión en el terminal N, se colocó la 287 en el terminal C de la proteína 953 (953-287'). En ambos casos, se eliminaron los péptidos principales y los híbridos fueron fusiones directas en el marco.
15 Para generar el híbrido de 953-287, se omitieron los péptidos principales de las dos proteínas diseñando el cebador directo aguas abajo del principal de cada secuencia; la secuencia del codón de terminación se omitió en el cebador inverso 953 pero incluida en el cebador inverso 287. Para el gen 953, los cebadores 5' y 3' utilizados para ampliación incluían enzimas de restricción una NdeI y una BamHI respectivamente, mientras que por la ampliación del gen 287 los cebadores 5' y 3' incluían enzimas de restricción una BamHI y una XhoI respectivamente. De esta manera podría
20 conseguirse una clonación en la dirección de la secuencia de los dos genes en pET21b +, utilizando NdeI-BamHI (para clonar el primer gen) y posteriormente BamHI-XhoI (para clonar el segundo gen).
Se comparó la eficacia bactericida (cepa homóloga) de anticuerpos producidos contra las proteínas híbridas con anticuerpos producidos contra mezclas simples de los antígenos componentes:
Mezcla con 287
Híbrido con 287
953
8192 8192
25 Datos de actividad bactericida contra cepas de MenB heterólogas y contra serotipos A y C se obtuvieron también para 953-287:
953
Cepa
Mezcla Híbrido
MC58
512 1024
NGH38
2048 4096
BZ232
1024 16
MenA (F6124)
2048 32
MenC (C11)
>2048 n.d.
MenC (BZ133)
>4096 >16
Detalles experimentales
Purificación de proteínas FPLC
La tabla siguiente resume la purificación de proteínas FPLC que se utilizó:
Proteína
PI Columna Tampón pH Protocolo
953-287
4,92 Mono Q Bis-Tris propano 6,2 A
Las soluciones tampón incluían NaCl 20-120 mM, 5,0 mg/ml de CHAPS y glicerol al 10% v/v. El dializado se centrifugó a 13000 g durante 20 min y se aplicó a una resina de intercambio iónico de FPLC mono Q o mono S. El tampón y las resinas de intercambio iónico se eligieron según el pI de la proteína de interés y las recomendaciones
10 del Manual del Protocolo de la FPLC [Pharmacia: FPLC Ion Exchange and Chromatofocussing; Principles and Methods. Pharmacia Publication]. Las proteínas se eluyeron mediante un gradiente gradual de NaCl. Se analizada la purificación por SDS-PAGE y se determinó la concentración de proteínas por el método de Bradford.
La letra en la columna 'protocolo' se refiere a lo siguiente:
FPLC-A: Se purificó 953-287 a partir de la fracción soluble de E. coli obtenida después de la destrucción de las
15 células. Las colonias aisladas que contienen el plásmido de interés se cultivaron durante la noche a 37°C en 20 ml de cultivo líquido LB/Amp (100 mg/ml). se diluyeron 1:30 las bacterias en 1,0 l de medio reciente y se cultivaron a 30°C o 37°C hasta la D.O.550 alcanzó 0,6-0,8. La expresión de la proteína recombinante se produjo con IPTG a una concentración final de 1,0 mM. Después de incubación durante 3 horas, se recogieron las bacterias por centrifugación a 8000 g durante 15 minutos a 4°C. Cuando fue necesario las células se almacenaron a -20°C. Todos
20 los procedimientos posteriores se realizaron en hielo o a 4°C. Se lisaron las células por exposición a ultrasonidos utilizando un Branson Sonifier 450. Las células destruidas se centrifugaron a 8000 g durante 30 minutos para sedimentar las células intactas y los cuerpos de inclusión y el sobrenadante se llevó a saturación al 35% v/v mediante la adición de (NH4)2SO4 3,9 M. El precipitado se sedimentó a 8000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se llevó a 70% v/v de saturación mediante la adición de (NH4)2SO4 3,9 M y el precipitado se recogió como
25 anteriormente. Los sedimentos que contenían la proteína de interés se identificaron por SDS-PAGE y se dializaron frente al tampón de intercambio iónico apropiado (véase más abajo) durante 6 horas o durante la noche. Se preparó la fracción periplásmica de E.coli que se expresa en 953L según el protocolo de Evans et al. [Infert. Lmmun. (1974) 10:1010 -1017] y se dializó frente al tampón de intercambio iónico apropiado. El tampón y la resina de intercambio iónico se elegidos según el pI de la proteína de interés y las recomendaciones del manual de protocolo de FPLC
30 (Pharmacia). Las soluciones tampón incluían NaCl 20 mM y glicerol al 10% (v/v). El dializado se centrifugó a 13000 g durante 20 min y se aplicó a una resina de intercambio iónico de FPLC mono Q o mono S. El tampón y la resina de intercambio iónico se eligieron según el pI de la proteína de interés y las recomendaciones del manual de protocolo de FPLC (Pharmacia). Las proteínas se eluyeron de la resina de intercambio iónico mediante gradientes de NaCl graduales o continuos. La purificación se analizó por SDS-PAGE y concentración de proteínas se determinó por el
35 método de Bradford. La escisión del péptido principal de las proteínas periplásmicas se demostró por secuenciación del terminal NH2 (véase más abajo).
Estrategia de clonación y diseño de oligonucleótidos
Los genes que codifican antígenos de interés se ampliaron por RCP, utilizando oligonucleótidos diseñados basándose en la secuencia genómica de Neisseria meningitidis B MC58. Se utilizó siempre como plantilla ADN genómico de la cepa 2996 en las reacciones RCP, salvo indicación contraria, y los fragmentos ampliados se
5 clonaron en el vector de expresión pET21b+ (Novagen) para expresar la proteína como producto etiquetado con His con terminal C, o en pET-24b+ (Novagen) para expresar la proteína en forma "no etiquetada" (p. ej., �G 287 K).
Cuando una proteína se expresaba sin un socio en la fusión y con su propio péptido principal (si existe), se realizaba la ampliación del marco de lectura abierto (ATG a codones de terminación).
Cuando una proteína se expresaba en forma 'no etiquetada', el péptido principal se omitía al diseñar el cebador de 10 ampliación por el terminal 5' aguas abajo de la secuencia principal prevista.
La temperatura de fusión de los cebadores utilizados en la RCP depende del número y tipo de nucleótidos que se hibridan en todo el cebador y se determinó mediante las fórmulas:
Tm1 = 4 (G+C) + 2 (A+T) (excluida la cola) Tm2 = 64,9 + 0,41 (% GC) - 600/N (cebador completo)
15 Las temperaturas de fusión de oligonucleótidos seleccionados solían ser de 65 a 70°C el oligo completo y de 50 a 60°C para la región de hybridación sola.
Los oligonucleótidos se sintetizaron utilizando un sintetizador de ADN y ARN 394 de Perkin Elmer, eluyeron de las columnas en 2,0 ml de NH4OH y se desprotejieron en 5 horas de incubación a 56°C. Los oligos se precipitaron por adición de acetato Na 0,3 M y 2 volúmenes de etanol. Se centrifugaron las muestras y los sedimentos se volvieron a
20 poner en suspensión en agua.
Secuencias
Enzima de restricción
287
Fwd CTAGCTAGC-GGGGGCGGCGGTGGCG NheI
Rev
CCCGCTCGAG-TCAATCCTGCTCTTTTTTGCC Xhol
953L
Fwd GGGAATTCCATATG-AAAAAAATCATCTTCGCCG NdeI
Rev
CCCGCTCGAG-TTATTGTTTGGCTGCCTCGAT Xhol
953-fu
Fwd GGGAATTCCATATG-GCCACCTACAAAGTGGACG Ndel
Rev
CGGGGATCC-TTGTTTGGCTGCCTCGATTTG BamHI
NB – Todas las reacciones RCP utilizan la capa 2996 salvo indicación contraria (p. ej. la cepa MC58)
En todas los montajes que empiezan con un ATG no seguido de una única enzima NheI, el codón ATG forma parte de la enzima NdeI utilizada para la clonación. Los montajes hechos utilizando NlieI como enzima de clonación en el extremo 5' (p. ej., todos los que contienen 287 en el terminal N) tienen dos codones adicionales (GCT AGC)
25 fusionados a la secuencia de codificación del antígeno.
Preparación de plantillas de ADN cromosómico
Las cepas 2996, MC58, 394.98, 1000 y BZ232 (y otras) de N. meningitidis se cultivaron en fase exponencial en 100 ml de medio GC, se recogieron por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en 5 ml de tampón ( sacarosa al 20% p/v (Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM, pH 8). Tras 10 minutos de incubación en hielo, las bacterias se 30 lisaron añadiendo de 10 ml de solución de lisis (NaCl 50 mM, Sarcosil Naal 1%, 50 !g/ml de proteinasa K), y la suspensión se incubó a 37°C durante 2 horas. Se realizaron dos extracciones en fenol (equilibradas a pH 8) y una extracción en CHCl3/alcohol isoamílico (24:1). Se precipitó ADN por adición de acetato de sodio 0,3 M y 2 volúmenes de etanol y se recogió por centrifugación. El sedimento se lavó una vez con etanol al 70% (v/v) y se redisolvió en 4,0 ml de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). La concentración de ADN se determinó por lectura de
35 la D.O.260.
Ampliación por RCP
El protocolo normal de RCP fue de la forma siguiente: se utilizaron como plantilla 200 ng de ADN genómico de las cepas 2996, MC58, 1000 o BZ232 o 10 ng de preparado de ADN plásmido de clones recombinantes en presencia de 40 !M de cada cebador oligonucleotídico, solución de dNTPs 400-800 !M, 1 x tampón de RCP (incluyendo MgCl2 1,5 mM), 2,5 unidades Taq/ADN polimerasa (utilizando AmpliTaQ de Perkin-Elmer, plantilla larga Expand™ de Boerhingher Mannheim).
Después de una incubación preliminar de 3 minutos de toda la mezcla en 95°C, cada muestra se sometió a una ampliación de dos etapas: los primeros 5 ciclos se realizaron utilizando la temperatura de hibridación que excluía la cola de la enzima de restricción del cebador (Tm1). Esto fue seguido de 30 ciclos según la temperatura de hibridación calculada para los oligos completos (Tm2). Los tiempos de elongación, realizados a 68°C o 72°C, variaban según la longitud de la Orf que debe ampliarse. En el caso de la Orf1 se incrementó el tiempo de prolongación, a partir de 3 minutos, en 15 segundos cada ciclo. Los ciclos se completaron con una etapa de 10 minutos extensión a 72°C.
El ADN ampliado se cargó directamente en un gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADN correspondiente a la banda de tamaño correcto se purificó en el gel utilizando el kit de extracción en gel de Qiagen, siguiendo el protocolo del fabricante.
Digestión de fragmentos de RCP y de vectores de clonación
El ADN purificado correspondiente al fragmento ampliado se digerió con enzimas de restricción apropiadas para la clonación de pET-21b+, pET22b+ o pET-24b. Los fragmentos digeridos se purificaron utilizando el kit de purificación por RCP QIAquick (siguiendo las instrucciones del fabricante) y se eluyó bien con H2O o Tris 10 mM, pH 8,5. Los vectores plásmidos se digerieron con las enzimas de restricción apropiadas, se cargaron en un gel de agarosa al 1.0% y la banda correspondiente al vector digerido se purificó utilizando el kit de extracción en gel QIAquick de Qiagen.
Clonación
Los fragmentos correspondientes a cada gen, previamente digeridos y purificados, se ligaron a pET21b+, pET22b+ o pET-24b+. Se utilizó una proporción molar fragmento/vector de 3:1 con T4 ADN ligasa en el tampón de ligadura suministrado por el fabricante.
El plásmido recombinante se transformó en DH5 o HB101 de E.coli competentes incubando la solución de la reacción de ligasa y bacterias durante 40 minutos en hielo y, a continuación, a 37°C durante 3 minutos. Esto fue seguido por adición de 800 ml de caldo LB e incubación a 37°C durante 20 minutos. Las células se centrifugaron a velocidad máxima en un microcentrifugadora Eppendorf, se volvieron a poner en suspensión en aproximadamente 200 !l de sobrenadante y se colocaron en placas sobre agar-agar con LB y ampicilina (100 mg/ml).
La identificación de clones recombinantes se realizó cultivando al azar colonias seleccionadas durante la noche a 37°C en 4,0 ml de caldo LB + ampicilina 100 !g/ml. Se sedimentaron las células y se extrajo el ADN plásmido utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 1 mg de cada minipreparado individual se digerió con las enzimas de restricción apropiadas y el producto de la digestión se cargó en un gel de agarosa al 1-1.5% (dependiendo del tamaño de la inserción esperado), en paralelo con el marcador de peso molecular (escalera de ADN de 1 kb, GIBCO). Se seleccionaron clones positivos basándose en el tamaño de la inserción.
Expresión
Después de clonar cada gen en el vector de expresión, se transformaron plásmidos recombinante en cepas de E. coli adecuadas para la expresión de la proteína recombinante. Se utilizó 1 !l de cada montaje para transformar BL21-DE3 de E. coli como se describió anteriormente. Se inocularon colonias recombinantes aisladas en 2 ml de LB + Amp (100 !g/ml), se incubaron a 37°C durante la noche, a continuación se diluyeron 1:30 en 20 ml de LB+Amp (100 !g/ml) en frascos de 100 ml, para dar un D.O.600 entre 0,1 y 0,2. Los frascos se Incubaron a 30°C o a 37°C en un agitador giratorio en baño de agua delantera hasta que la D.O.600 indicó crecimiento exponencial adecuado para la inducción de la expresión (0,4-0,8 D.O.). La expresión de proteínas se indujo por la adición de IPTG 1,0 mM. Después de 3 horas de incubación a 30°C o 37°C se midió la D.O.600 y se examinó la expresión. Se centrifugó 1,0 ml de cada muestra en una microcentrifugadora, se volvió a poner en suspensión el sedimento en PBS y se analizó por SDS-PAGE y con tinción azul de Coomassie.
Clonación y expresión Gateway
Las secuencias GATE etiquetadas se clonaron y expresaron utilizando la tecnología de clonación GATEWAY (GIBCO-BRL). La clonación de recombinación (CR) se basa en las reacciones de recombinación que median la integración y la escisión de fagos en y de un genoma de E.coli, respectivamente. La integración implica la recombinación de la enzima attP del ADN del fago dentro de la enzima attB situada en el genoma bacteriano (reacción de BP) y genera un genoma de fago integrado flanqueado por las enzimas attL y attR. La escisión vuelve a recombinar enzimas attL y attR en enzimas attP y attB (reacción de LR). La reacción de integración requiere dos enzimas [la proteína integrasa (Int) del fago y el factor de integración del hospedador (IHF, por sus siglas en inglés) de proteína bacteriana] (BP clonase). La reacción de escisión requiere Int, IHF y una enzima adicional del fago, Excisionasa (XIs) (LR clonasa). Derivados artificiales de la enzima de recombinación attB bacteriana de 25 bp, denominados B1 y B2, se agregaron al extremo 5' de los cebadores utilizados en las reacciones de RCP para ampliar los ORF de Neisseria. Los productos resultantes fueron BP clonados en un "vector donante" que contenía derivados complementarios de la enzima de recombinación attP del fago (P1 y P2) utilizando BP clonasa. Los "clones de entrada" resultantes contienen ORF flanqueados por derivados de la enzima attL (L1 y L2) y se subclonaron en "vectores de destino" de expresión, que contienen derivados de las enzimas attR compatibles con attL (R1 y R2) utilizando LR clonasa. Esto dio lugar a "clones de expresión" en los que los ORF están flanqueados por B1 y B2 y fusionados en el marco a las etiquetas GST o His del terminal N.
La cepa de E. coli utilizada para la expresión de GATEWAY es BL21-SI. Las células de esta cepa se producen para la expresión de la T7 ARN polimerasa por crecimiento en el medio que contiene sal (NaCl 0,3 M).
Obsérvese que este sistema da etiquetas His en el terminal N.
Preparación de proteínas de la membrana
Se aislaron fracciones compuestas principalmente de membrana interna, externa o total a fin de obtener proteínas recombinantes expresadas con secuencias principales de localización de la membrana. El método de preparación de las fracciones de membrana, enriquecidas para proteínas recombinantes, de Filip et al. [115:717-722 J. Bact. (1973)-722] y Davies et al. [J. Immunol. Meth. (1990) 143:215 -225]. Colonias aisladas que albergan el plásmido de interés se cultivaron durante la noche a 37°C en 20 ml de cultivo líquido LB/Amp (100 !g/ml). Las bacterias se diluyeron 1:30 en 1,0 l de medio reciente y se cultivaron a 30°C o 37°C hasta que la D.O.550 alcanzó 0,6-0,8. La expresión de la proteína recombinante se indujo con IPTG a una concentración final de 1,0 mM. Tras la incubación durante tres horas, las bacterias se recogieron por centrifugación a 8000 g durante 15 minutos a 4°C y se volvieron a poner en suspensión en 20 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) e inhibidores de proteasa completa (Boehringer-Mannheim). Todos los procedimientos posteriores se realizaron a 4°C o en hielo.
Se destruyeron las células por exposición a ultrasonidos utilizando un Sonifier 450 de Branson y se centrifugó a 5000 g durante 20 minutos para sedimentar las células intactas y cuerpos de inclusión. El sobrenadante, que contiene las membranas y restos celulares, se centrifugó a 50000 g (Beckman Ti50, 29000 rpm) durante 75 min, se lavó con propano Bis-tris 20 mM (pH 6,5), NaCl 1,0 M, glicerol al 10% (v/v) y se sedimento nuevamente a 50000 g durante 75 minutos. El sedimento fue se volvió a poner en suspensión en Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), Sarcosil al 2,0 % (v/v), inhibidor de proteasa completo (concentración final 1,0 mM del EDTA) y se incubó durante 20 minutos para disolver la membrana interna. Se sedimentaron sedimentos celulares por centrifugación a 5000 g durante 10 minutos y el sobrenadante se centrifugó a 75000 g durante 75 minutos (Beckman Ti50, 33000 rpm). Las vesículas de la membrana externa obtenidas el sedimento a 75000 g se lavaron con Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) y se centrifugaron a 75000 g durante 75 minutos o durante la noche. La OMV se volvió a poner en suspensión finalmente en 500 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), glicerol al 10% v/v. Orfl L y Orf40L estaban ambos localizados y enriquecidos en la fracción de la membrana externa que se utilizó para inmunizar ratones. La concentración de proteínas se estimó por el ensayo de Bradford (Bio-Rad) convencional, mientras que la concentración de proteínas de la fracción de la membrana interna se determinó con el ensayo de la proteína DC (Bio-Rad). Se analizaron por SDS-PAGE varias fracciones procedentes del procedimiento de aislamiento.
Purificación de proteínas con etiqueta His
Varias formas de 287 se clonaron procedentes de las cepas 2996 y MC58. Se construyeron con una fusión con etiqueta His del terminal C e incluía una forma madura (aa 18-427), montajes con eliminaciones (�1, �2, �3 y �4) y clones compuesto de dominios B o C. Para cada clon purificado como una su fusión de His, una sola colonia se rayó y cultivo durante la noche en 37°C sobre una placa de agar-agar con LB/Amp (100 !g/ml). Una colonia aislada de esta placa se inoculó en 20 ml de medio líquido LB/Amp (100 mg/ml) y se cultivó durante la noche a 37°C con agitación. El cultivo de la noche se diluyó 1:30 en 1,0 l de medio líquido LB/Amp (100 !g/ml) y se dejó cultivar a la temperatura óptima (30 o 37°C) hasta que la D.O.550 alcanzó 0,6-0,8. La expresión de la proteína recombinante fue producida por adición de IPTG (concentración final 1,0 mM) y el cultivo se incubó durante 3 horas. Las bacterias se recogieron por centrifugación a 8000 g durante 15 minutos a 4°C. El sedimento bacteriano se volvió a poner en suspensión en 7,5 ml de (i) tampón frío A (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 10 mM, pH 8,0) para las proteínas solubles o (ii) tampón B (Tris-HCl 10 mM, tampón de fosfato 100 mM, pH 8,8 y, opcionalmente, urea 8 M) para las proteínas insolubles. Se mezclaron sobrenadantes con 150 !l de resina-Ni2+ (anteriormente equilibrada con tampón A o tampón B, según corresponda) y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La resina fue Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia), preparada según el protocolo del fabricante. El preparado por lotes se centrifugó a 700 g durante 5 min a 4°C y se descartó el sobrenadante. La resina se lavó dos veces (por lotes) con 10 ml de tampón A o B durante 10 min, se volvió a poner en suspensión en 1,0 ml de tampón A
o B y se cargó en una columna desechable. La resina continuó para lavarse con (i) tampón A a 4°C o (ii) tampón B a temperatura ambiente, hasta que la D.O.280 del flujo a través alcanzó 0,02-0,01. La resina se lavó más con (i) tampón C frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 20 mM, pH 8,0) o (ii) tampón D (Tris-HCl 10 mM, tampón de fosfato 100 mM, pH 6.3 y, opcionalmente, urea 8 M) hasta que la D.O.280 de flujo a través alcanzó 0,020,01. La proteína de su fusión His se eluyó por adición de 700 ml de (i) tampón A de elución en frío un (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 250 mM, pH 8,0) o (ii) tampón B de elución (Tris-HCl 10 mM, tampón de fosfato 100 mM, pH 4,5 y, opcionalmente, urea 8 M) y fracciones recogidas hasta que la D.O.280 indicó que se obtuvo toda la proteína recombinante. Alícuotas de 20 ml de cada fracción de elución se analizaron por SDS-PAGE. Se calcularon las concentraciones de proteína utilizando el análisis de Bradford.
Análisis de la secuencia de aminoácidos
El análisis automatizado de la secuencia del terminal NH2 de proteínas se realizó en un secuenciador Beckman (LF 3000) equipado con un analizador de phenitiohidantoina-amino ácido (System Gold) según las recomendaciones del fabricante.
Inmunización
Se inmunizaron ratones Balb/C con antígenos los días 0, 21 y 35 y se analizaron los sueros el día 49.
Análisis de sueros - ELISA
La cepa MenB M7 sin capsula y las encapsuladas se colocaron en placas de agar-agar y chocolate y se incubaron durante la noche a 37°C con 5% de CO2. Las colonias bacterianas se recolectaron en placas de agar-agar utilizando un hisopo de dracon estéril y se inocularon en caldo Mueller-Hinton (Difco) que contiene glucosa de 0,25%. Se hizo el seguimiento del crecimiento bacteriano cada 30 minutos siguiendo la D.O.620. Las bacterias se dejaron crecer hasta que la D.O. alcanzó el valor de 0,4-0,5. Se centrifugó el cultivo durante 10 minutos a 4000 rpm. Se descartó el sobrenadante y se lavaron dos veces las bacterias con PBS, se volvieron a poner en suspensión en PBS que contiene formaldehído al 0,025% y se incubaron durante 1 hora a 37°C y, a continuación, durante la noche a 4°C con agitación. Se añadieron 100 !l de células bacterianas a cada pocillo de una placa Greiner de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 4°C. Los pocillos se lavaron a continuación tres veces con tampón de lavado PBT (Tween-20 al 0,1% en PBS). Se añadieron 200 !l de tampón de saturación ( polivinilpirrolidona 10 al 2,7% en agua) a cada pocillo y se incubaron las placas durante 2 horas a 37°C. Se lavaron los pocillos tres veces con PBT. Se añadieron 200 !l de sueros diluidos (tampón de dilución: BSA al 1%, Tween-20 al 0,1%, NaN3 al 0,1% en PBS) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 2 horas a 37°C. Se lavaron tres veces los pocillos con PBT. Se añadieron a cada pocillo 100 !l de suero anti-ratón en conejo conjugado con HRP (Dako) diluido 1:2000 en tampón de dilución y las placas se incubaron durante 90 minutos a 37°C. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón PBT. 100 !l de tampón de sustrato para HRP (25 ml de tampón citrato pH 5, 10 mg de O-fenildiamina y 10 !l de H2O2) se añadieron a cada pocillo y las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron a cada pocillo 100 !l de H2SO4 al 12,5% y se hizo el seguimiento de la D.O.490. Se calcularon arbitrariamente los valores de ELISA como la dilución de sueros que dio una D.O.490 de 0,4 superior al nivel de sueros preinmunes. El ELISA se consideraba positivo cuando la dilución de sueros con D.O.490 de 0,4 fue superior a 1:400.
Análisis de sueros - Ensayo de unión de bacterias FACS Scan
La cepa MenB M7 sin capsula encapsulada se colocó en placas de agar-agar y chocolate y se incubó durante la noche a 37°C con 5% de CO2. Las colonias bacterianas se recogieron de las placas de agar-agar utilizando un hisopo estéril de dracon y se inocularon en 4 tubos que contenían 8 ml cada uno de caldo de Mueller-Hinton (Difco) que contenía glucosa al 0,25%. Se supe4rvisó el crecimiento bacteriano cada 30 minutos siguiendo la D.O.620. Las bacterias se dejaron crecer hasta la D.O. alcanzó el valor de 0,35-0,5. El cultivo se centrifugó durante 10 minutos a 4000 rpm. Se descartó el sobrenadante y el sedimento fue se volvió a poner en suspensión en tampón de bloqueo (BSA al 1% en PBS, NaN3 al 0,4%) y se centrifugó durante 5 minutos a 4000 rpm. Las células se volvieron a poner en suspensión en tampón de bloqueo para alcanzar una D.O.620 de 0,05. Se añadieron 100 !l de células bacterianas a cada pocillo de una placa Costar de 96 pocillos. Se agregaron 100 !l de sueros diluidos a cada pocillo (1:100, 1:200, 1:400) (en tampón de bloqueo) y las placas se incubaron durante 2 horas a 4°C. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 4000 rpm, se aspiró el sobrenadante y se lavaron las células mediante la adición de 200 !l/pocillo de tampón de bloqueo en cada pocillo. 100 !l de F(ab)2 anti-ratón en cabra conjugado con R-ficoeritrina, diluido 1:100, se agregó a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora a 4°C. Las células se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos y se lavaron por adición de 200 !l/pocillo de tampón de bloqueo. Se aspiró el sobrenadante y las células se volvieron a poner en suspensión en 200 !l/pocillo de PBS y formaldehído al 0,25%. Las muestras se transfirieron a tubos FACScan y se leyeron. Las condiciones para la configuración de FACScan (potencia de láser 15 mW) fueron: FL2 encendido; umbral de FSC-H: 92; voltaje de FSC PMT: E 01; SSC PMT: 474; Ganancias de Amp. 6.1; FL-2 PMT: 586; valores de compensación: 0.
Análisis de sueros - Ensayo bactericida
La cepa 2996 de Neisseria meningitidis se cultivó durante la noche a 37°C en placas con agar-agar y chocolate (a partir de una solución madre congelada) con CO2 al 5%. Las colonias se recolectaron y se utilizaron para inocular 7 ml de caldo de Mueller-Hinton, que contenía glucosa al 0,25% para alcanzar una D.O.620 de 0,05-0,08. El cultivo se incubó durante aproximadamente 1,5 horas a 37 grados agitando hasta que la D.O.620 alcanzó el valor de 0,23 a 0,24. Las bacterias se diluyeron en tampón de fosfato 50 mM pH 7,2 que contenía MgCl2 10 mM, CaCl2 10 mM y BSA al 0,5% (p/v) (tampón de ensayo) a la dilución de trabajo de 105 UFC/ml. El volumen total de la mezcla de reacción final fue 50 !l con 25 !l de doble dilución en serie del suero del ensayo, 12,5 !l de bacterias en la dilución de trabajo, 12,5 !l del complemento de conejo recién nacido (concentración final 25%).
Las referencias incluyen bacterias incubadas con suero de complemento, sueros inmunes incubados con bacterias y complemento inactivado por calentamiento a 56°C durante 30'. Inmediatamente después de la adición del complemento del conejo recién nacido, 10 !l de las referencias se colocaron en placas de Mueller-Hinton con agaragar utilizando el método de basculación (tiempo 0). Se incubaron las placas de 96 pocillos durante 1 hora a 37°C con rotación. Se colocaron en placas Mueller-Hinton con agar-agar 7 !l de cada muestra en forma de puntos, mientras que 101 !l de las referencias se colocaron en placas Mueller-Hinton con agar-agar utilizando el método de basculación (tiempo 1). Las placas con agar-agar se incubaron durante 18 horas a 37 grados y se hizo el recuento de las colonias correspondientes a tiempo 0 y al tiempo 1.
Análisis de sueros – Inmunotransferencias Western
Proteínas purificadas (500 ng/banda), vesículas de la membrana externa (5 !g) y los extractos de células totales (25 P!g) procedentes de la cepa 2996 de MenB se cargaron en un gel de 12% de SDS en poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se realizó durante 2 horas a 150mA a 4°C, utilizando tampón de transferencia (0,3% de base Tris, 1,44% de glicina, 20% (v/v) de metanol). La membrana se saturó por incubación durante la noche a 4°C en tampón de saturación (10% de leche desnatada, 0,1% de Tritón X-100 en PBS). La membrana se lavó dos veces con tampón de lavado (3% de leche desnatada, 0,1% de Tritón X-100 en PBS) y se incubó durante 2 horas a 37°C con sueros de ratones diluidos 1:200 en tampón de lavado. Se lavó dos veces la membrana y se incubó durante 90 minutos con una dilución de 1:2000 de Ig anti-ratón marcada con peroxidasa de rábano picante. Se lavó dos veces la membrana con 0,1% de Tritón X-100 en PBS y se reveló con el Kit de sustrato Opti-4CN (Bio-Rad). La reacción se interrumpió por adición de agua.
Listado de secuencias
<110> NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS S.R.L.
<120> EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS NEISSERIANAS
<130> P055385EP
<140> EP
<141> 2001-02-28
<150> GB 000469.3
<151> 2000-02-28
<150> GB 0027675.8
<151> 2000-11-13
<160> 10
<170> Secwin99, versión 1.02
<210> 1 <211>1746
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Proteína híbrida
<400> 1
<210>2 <211>579
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Proteína híbrida
<400>2
<210>3
<211> 1941
<212> ADN
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Proteína híbrida
<400> 3
<210>4 <211>644
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Proteína híbrida
<400>4
<210>5
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 5 ctagctagcg ggggcggcgg tggcg 25
<210>6
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 6 cccgctcgag tcaatcctgc tcttttttgc c 31
<210>7
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 7 gggaattcca tatgaaaaaa atcatcttcg ccg 33
<210>8
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 8 cccgctcgag ttattgtttg gctgcctcga t 31
<210>9
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 9 gggaattcca tatggccacc tacaaagtgg acg 33
<210> 10
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador
<400> 10 cggggatcct tgtttggctg cctcgatttg 30

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Proteína híbrida, en la que la proteína comprende:
    a) una de las secuencias SEC. ID. nº 2 o 4; o b) una secuencia que tiene más del 70% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.
    5 2. Proteína híbrida según la reivindicación 1, en la que la proteína comprende una secuencia que tiene 80% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.
  2. 3.
    Proteína híbrida según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína comprende una secuencia que tiene 90% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.
  3. 4.
    Ácido nucleico que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
    10 5. Vector que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 4.
  4. 6.
    Célula hospedadora que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 4 o el vector de la reivindicación 5.
  5. 7.
    Composición de diagnóstico o inmunógena que comprende la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  6. 8.
    Proteína de la reivindicación 1 o composición de la reivindicación 7 para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de infección debida a bacterias neisserianas.
    15 9. Procedimiento de expresión de una proteína híbrida, en el que la proteína comprende:
    a) una de las secuencias SEC. ID. nº 2 o 4; o b) una secuencia que tiene más del 70% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.
  7. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la proteína comprende una secuencia que tiene 80% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.
    20 11. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la proteína comprende una secuencia que tiene 90% de identidad de secuencia con una de las SEC. ID. nº 2 o 4.
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