PT832093E - Expressão de lipoproteínas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "EXPRESSÃO DE LIPOPROTEÍNAS"

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito à engenharia genética para efectuar a expressão de lipoproteínas OspC de uma espécie Borrelia a partir de vectores contendo moléculas de ácidos nucleicos codificando as lipoproteínas. De um modo mais particular, a presente invenção refere-se à expressão de uma lipoproteína recombinante OspC de uma espécie Borrelia em que a sua lipidação é proveniente da expressão de uma primeira sequência de ácido nucleico codificando um sequência líder OspA de uma espécie Borrelia e a sua proteína é proveniente da expressão de uma segunda sequência de ácido nucleico, a primeira e a segunda sequências de ácidos nucleicos, as quais não ocorrem juntas naturalmente, sendo contíguas. A invenção refere-se igualmente a proteínas recombinantes OspC lipidadas de uma espécie Borrelia, expressas utilizando a sequência de ácido nucleico codificando a sequência líder OspA de uma espécie Borrelia, métodos de preparação e utilização dessas mesmas composições e métodos de utilização das composições. A invenção refere-se adicionalmente a sequências de ácidos nucleicos codificando lipoproteínas recombinantes OspC de uma espécie Borrelia, vectores contendo e/ou expressando as sequências, métodos para expressão das lipoproteínas e métodos de preparação das sequências de ácidos nucleicos e vectores; composições 1 empregando as lipoproteínas, incluindo composições imunogénicas ou vacinais tais composições possuindo, de um modo preferido, imunogenicidade melhorada; e métodos de utilização de tais composições para dedução de uma resposta imunológica ou protectora.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A borreliose de Lyme é a doença provocada por carraça mais predominante nos Estados Unidos bem como uma das doenças infecciosas provocadas por carraça mais importantes mundialmente. 0 espiroquetideo Borrelia burgdorferi é o agente causativo da doença de Lyme. A infecção com B. burgdorferi produz manifestações locais e sistémicas. Os sintomas locais que surgem logo após a infecção são uma lesão na pele no sitio da mordedura da carraça, designado eritrema migrante. Semanas a meses após a infecção, surgem manifestações sistémicas que incluem sintomas reumáticos, cardíacos e neurológicos. A fase local precoce da infecção do B. burgdorferi é facilmente tratável com antibióticos. Todavia, as fases sistémicas tardias provaram ser mais refractárias a antibióticos.

Foi direccionado um esforço considerável para o desenvolvimento de uma vacina para a doença de Lyme. Foram utilizadas duas abordagens distintas no desenvolvimento vacinai. Uma abordagem consiste na utilização de uma vacina composta de espiroquetídeos intactos inactivados, como descrito por Johnson na Pat. U.S. N°. 4721617. Demonstrou-se que uma vacina inactivada intacta protege hamsters de provocação e foi aprovada para utilização em cães. 2

Em virtude das preocupações acerca de antigénios de reactividade cruzada no seio de uma preparação de células intactas, a investigação de vacinas humanas concentrou-se na identificação e desenvolvimento de antigénios protectores de reactividade não cruzada expressos por B. burgdorferi. Até à data foram identificados vários candidatos a antigénios. Muito deste esforço concentrou-se na proteína de superfície externa mais abundante de B. burgdorferi, nomeadamente a proteína de superfície externa A (OspA), como descrito no pedido de patente PCT publicado WO 92/14488, dos presentes requerentes. Várias versões desta proteína demonstraram induzir imunidade protectora em estudos de provocação no murganho, hamster e cão. Ensaios clínicos em humanos demonstraram que as formulações de OspA são seguras e imunogénicas em humanos [Keller et al., JAMA (1994) 271:1764-1768]. De facto, uma formulação contendo OspA lipidada recombinante, como descrito no supracitado documento WO 92/14488, está agora a ser submetida a ensaios de segurança/eficácia de Fase III em humanos.

Embora a OspA seja expressa na grande maioria de isolados clínicos de B. burgdorferi da América do Norte, emergiu um quadro diferente a partir da análise dos isolados clínicos de Borrelia na Europa. Na Europa, a doença de Lyme é causada por três genoespécies de Borrelia, nomeadamente B. burgdorferi, B. garinii e B. afzelli. Em aproximadamente metade dos isolados Europeus, a OspA não é a proteína de superfície externa mais abundante. Uma segunda proteína de superfície externa C (OspC) é o principal antigénio de superfície encontrado nestes espiroquetídeos. De facto, foram identificados vários isolados clínicos Europeus que não expressam OspA. A imunização de gerbos e murganhos com OspC recombinante purificada produz imunidade protectora a estirpes B. burgdorferi expressando a proteína OspC 3 homóloga [V. Preac-Mursic et al., INFECTION (1992) 20:342-349; W. S. Probert et al., INFECTION AND IMMUNITY (1994) 62:1920-1926]. A proteína OspC está actualmente a ser considerada como um componente possível de uma formulação vacinai de Lyme de segunda geração.

As proteínas recombinantes são candidatos a composições vacinais ou imunogénicas promissores, porque podem ser produzidas com elevado rendimento e pureza e manipuladas para maximizar as actividades desejáveis e minimizar as indesejáveis. Todavia, porque podem ser insuficientemente imunogénicas, métodos para melhorar a resposta imune a proteínas recombinantes são importantes no desenvolvimento de composições vacinais ou imunogénicas.

Um estimulador imune muito promissor é a unidade lipídica N-palmitoil-S-(2RS)-2,3-bis-(palmitoiloxi)propil-cisteína, abreviado Pam3Cys. Esta unidade encontra-se na extremidade amino das lipoproteínas bacterianas que são sintetizadas com uma sequência sinal que especifica a ligação e clivagem lipídica pela peptidase sinal II. Peptídeos sintéticos que, por eles próprios, não são imunogénicos, induzem uma forte resposta de anticorpos quando conjugados covalentemente a Pam3Cys [Bessler et al., Research Immunology (1992) 143:548-552].

Além de uma resposta de anticorpos, é necessário, frequentemente, induzir uma resposta imune celular, particularmente de linfócitos T citotóxicos (CTLs). Peptídeos sintéticos conjugados a Pam3Cys são indutores extremamente potentes de CTLs, mas ainda ninguém relatou indução CTL por lipoproteínas recombinantes grandes. 4 A sequência de ácidos nucleicos e a sequência codificada de aminoácidos de OspA são conhecidas para vários isolados clínicos de B. burgdorferil e é descrito, por exemplo, no pedido PCT publicado WO 90/04411 (Symbicom AB) para a estirpe B31 de B. burgdorferi e em Johnson et al., Infect. Immun. 60:1845-1853 para uma comparação dos operões ospA de três isolados de B. burgdorferi de diferentes origens geográficas, nomeadamente B31, ACA1 e Ip90.

Como descrito no documento WO 90/04411, uma análise à sequência de ADN da estirpe B31 mostra que a OspA é codificada por uma estrutura de leitura aberta de 819 nucleotídeos com início na posição 151 da sequência de ADN e terminando na posição 970 da sequência de ADN (ver Figura 1 desse documento). Os primeiros dezasseis resíduos de aminoácidos de OspA constituem uma sequência sinal hidrofóbica de OspA. O primeiro produto de tradução do gene completo de B. burgdorferi contém uma sequência sinal hidrofóbica N-terminal a qual é um substrato para a ligação de um diacilglicerol à cadeia lateral sulfidrilo do resíduo de cisteína adjacente. No seguimento desta ligação, dá-se a clivagem pela peptidase sinal II e a ligação de um terceiro ácido gordo à extremidade N-terminal. A unidade lipídica completa é designada Pam3Cys. Demonstrou-se que a lipidação de OspA é necessária para a imunogenicidade, visto que a lipoproteína OspA com uma unidade Pam3Cys N-terminal estimulou uma forte resposta de anticorpos, ao passo que a OspA que carece do lípido ligado não induziu quaisquer anticorpos detectáveis [Erdile et al., Infect. Immun., (1993), 61:81-90]. O pedido de patente internacional publicado WO 91/09870 (Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-GmbH) descreve a sequência de ADN do gene ospC da estirpe Pko de B. burgdorferi e 5 a proteína OspC (designada pC nesta referência) codificada desse modo, de peso molecular de 22 KDa. Esta sequência revela que a OspC é uma lipoproteína que emprega uma sequência sinal semelhante àquela utilizada para OspA. Com base nas verificações relativamente a OspA, pode esperar-se que a lipidação de OspC recombinante seria útil para melhorar a sua imunogenicidade; mas, como abaixo discutido, os requerentes experimentaram dificuldades na obtenção de expressão detectável de OspC recombinante. A Pat. U.S. N°. 4624926 de Inouye refere-se a vectores de clonagem plasmídicos, incluindo uma sequência de ADN codificando para um polipeptídeo desejado ligado a um ou mais fragmentos derivados funcionais de um gene de uma lipoproteína de membrana externa de uma bactéria gram negativa. 0 polipeptídeo expresso pelas células hospedeiras E. coli transformadas compreende o peptídeo sinal da lipoproteína, seguido pelos primeiros oito resíduos de aminoácidos da lipoproteína que, por sua vez, são seguidos pela sequência de aminoácidos da proteína desejada. 0 peptídeo sinal pode, então, ser translocado naturalmente através da membrana citoplasmática e os primeiros oito aminoácidos da lipoproteína podem, então, ser processados posteriormente e inseridos na membrana externa da célula de forma análoga à inserção normal da lipoproteína na membrana externa. A imunogenicidade da proteína expressa não foi demonstrada. Além disso, Inouye não estava absolutamente nada preocupado com a lipidação recombinante, particularmente para melhorar a imunogenicidade. 0 pedido de patente internacional publicado WO91/09952 descreve plasmídeos para a expressão de proteínas lipidadas. Tais plasmídeos envolvem uma sequência de ADN codificando um 6 peptídeo sinal de uma lipoproteína ligado aos codões para um dos tetrapept ideos QANY ou IEGR, de espiras-β que, por sua vez, é ligado à sequência de ADN codificando a proteína desejada. De novo, a imunogenicidade das proteínas expressas não foi demonstrada. 0 Streptoccus pneumoniae causa mais infecções fatais à escala global do que quase qualquer outro patogénio. Nos E.U.A., as mortes causadas por S. pneumoniae rivalizam em número com aquelas causadas pela SIDA. A maioria das infecções pneumocócicas fatais nos E.U.A. ocorrem em indivíduos com mais de 65 anos de idade, em quem o S. pneumoniae é a causa mais comum de pneumonia adquirida em comunidade. Nos países desenvolvidos, a maior parte das mortes pneumocócicas ocorrem nos idosos, ou em doentes imunodeficientes incluindo aqueles com drepanocitose. Nas áreas menos desenvolvidas do globo, a infecção pneumocócica é uma das maiores causas de morte entre as crianças com menos de 5 anos de idade. 0 aumento da frequência da resistência múltipla aos antibióticos entre os pneumococos e o custo proibitivo do tratamento com fármacos nos países subdesenvolvidos tornam a perspectiva actual para o controlo das doenças pneumocócicas problemática. O reservatório dos pneumococos que infectam o homem é mantido principalmente via transporte nasofaríngeo humano. Os humanos adquirem os pneumococos, em primeiro lugar, através de aerossóis ou por contacto directo. Os pneumococos colonizam primeiro as vias aéreas superiores e podem permanecer na mucosa nasal durante semanas ou meses. Tanto como 50% ou mais de crianças jovens e idosos são colonizados. Na maioria dos casos, esta colonização resulta numa infecção inaparente. Em certos indivíduos, todavia, o organismo transportado na nasofaringe 7 pode provocar sinusite sintomática de infecção do ouvido médio. Se os pneumococos são aspirados para dentro do pulmão, sobretudo com partículas de comida ou muco, podem causar pneumonia. Infecções nestes locais libertam geralmente alguns pneumococos para o sangue onde podem conduzir a sepsia, sobretudo se continuarem a ser libertados em grande número a partir do foco original de infecção. Os pneumococos no sangue podem alcançar o cérebro onde podem causar meningite. Embora a meningite pneumocócica seja menos comum que outras infecções causadas por estas bactérias, é particularmente devastadora; cerca de 10% dos doentes morre e mais de 50% dos restantes ficam com sequelas neurológicas para toda a vida.

Nos adultos idosos, a actual vacina polissacárida capsular de valência 23 é cerca de 60% eficaz contra doença pneumocócica invasiva com estirpes dos tipos capsulares incluídos na vacina. A vacina de valência 23 não é eficaz em crianças com menos de 2 anos de idade em virtude da sua incapacidade para produzir respostas adequadas contra a maioria dos polissacáridos. Vacinas aperfeiçoadas que podem proteger crianças e adultos contra infecções invasivas com pneumococos ajudariam a reduzir alguns dos aspectos mais perniciosos desta doença. A proteína de superfície celular PspA de S. pneumoniae demonstrou ser um factor de virulência e um antigénio protector. No pedido de patente internacional publicado WO 92/14488, estão descritas as sequências de ADN para o gene pspA de S. pneumoniae Rxl, a produção de uma forma truncada de PspA por engenharia genética e a demonstração que esta forma de PspA truncada confere protecção nos murganhos a provocação com pneumococos vivos.

Num esforço para desenvolver uma vacina ou uma composição imunogénica baseada em PspA, a PspA foi expressa recombinantemente em E. coli. Foi verificado que para expressar eficazmente a PspA, é útil truncar a molécula madura de PspA da estirpe Rxl do seu comprimento normal de 58 9 aminoácidos para o de 314 aminoácidos compreendendo os aminoácidos 1 a 314. Esta região da molécula de PspA contém a maioria, se não todos, os epitopos protectores de PspA. Todavia, estudos de imunogenicidade e de protecção em murganhos demonstraram que a forma recombinante truncada de PspA não é imunogénica em murganhos naive. Deste modo, seria útil melhorar a imunogenicidade de PspA recombinante e seus fragmentos.

Muitos patógenos bacterianos e virais, tais como S. pneumoniae e Helicobacter pylori, e HIV, vírus herpes e papiloma conseguem entrar através das superfícies das mucosas. 0 determinante principal de imunidade específica nas superfícies das mucosas é a IgA secretória (S-IgA) que está fisiológica e funcionalmente separada dos componentes do sistema imunitário circulatório. As respostas S-IgA nas mucosas são predominantemente produzidas pelo sistema imunitário da mucosa comum (CMIS) [Mestecky, J. Clin. Immunol. (1987), 7:265-276], no qual imunogénios são capturadas por estruturas linfo-epiteliais especializadas, colectivamente referidas como tecido linfóide associado a mucosa (MALT). 0 termo sistema imunitário de mucosa comum refere-se ao facto que a imunização em qualquer local de mucosa pode deduzir uma resposta imune em todos os outros locais de mucosa. Deste modo, a imunização no intestino pode deduzir imunidade de mucosa nas vias aéreas superiores e reciprocamente. Além disso, é importante registar que a imunização oral pode induzir uma resposta IgA específica de antigénio no compartimento sistémico, além de anticorpos IgA de mucosa 9 [McGhee, J. R, et al., (1993), Infect. Agents and Disease 2:55-73] . A maior parte dos antigénios solúveis e não replicativos são fracos imunogénios de mucosa, especialmente pela via perorai, provavelmente porque são degradados por enzimas digestivas e possuem pouco ou nenhum tropismo para o tecido linfóide associado ao intestino (GALT), Deste modo, seria desejável um método para a produção de imunogénios de mucosa eficazes, e vacinas e composições imunogénicas contendo-os.

De interesse especial é a H. pylori, a bactéria espiral que coloniza selectivamente células gástricas humanas secretoras de mucina e que é o agente causativo na maioria dos casos de gastrite não erosiva em humanos. Investigação recente indica que a H. pylori, que possui uma elevada actividade urease, é responsável pela maioria das úlceras gástricas bem como muitos cancros gástricos. Muitos estudos sugeriram que a urease, um complexo dos produtos dos genes ureA e ureB, pode ser um antigénio protector. Todavia, até agora não se soube como produzir uma resposta imune de mucosa suficiente à urease.

Antigénios, tais como OspC, PspA, UreA, UreB ou os seus fragmentos imunogénicos, estimulam uma resposta imune quando administrados a um hospedeiro. Tais antigénios, sobretudo quando produzidos recombinantemente, podem deduzir uma resposta mais forte quando administrados em conjunto com um adjuvante. Actualmente, o alum é o único adjuvante aprovado para utilização humana, embora estejam a ser testados centenas de adjuvantes experimentais tais como a toxina B da cólera. Todavia, estes adjuvantes possuem deficiências. Por exemplo, embora a toxina B da cólera não seja tóxica no sentido de causar cólera, existe um mal-estar geral sobre a administração de uma toxina associada a 10 uma doença tão perniciosa como a cólera, sobretudo se existir até a mais remota hipótese de impurezas menores.

Deste modo, seria desejável melhorar a imunogenicidade de antigénios, por métodos que não a utilização de um adjuvante, especialmente em preparações monovalentes; e, em preparações multivalentes, ter a capacidade de empregar este meio para imunogenicidade melhorada com um adjuvante, de forma a obter até uma maior resposta imunológica.

Quanto à expressão de proteínas recombinantes, espera-se que o especialista na técnica esteja familiarizado com os diferentes sistemas de vectores disponíveis para esta expressão, e. g., bactérias, tais como E. coli e semelhantes.

Acredita-se que até agora a técnica não ensinou ou sugeriu a expressão de uma lipoproteína recombinante OspC de uma espécie Borrelia em que a sua lipidação é proveniente da expressão de uma primeira sequência de ácido nucleico codificando uma sequência líder OspA de uma espécie Borrelia, a proteína desta é proveniente da expressão de uma segunda sequência de ácido nucleico, a primeira e segunda sequências, as quais não ocorrem naturalmente juntas, sendo contíguas, ou genes contendo tais sequências; ou vectores contendo tais sequências; ou métodos para tal expressão; ou tais lipoproteínas recombinantes; ou composições contendo tais lipoproteínas recombinantes; ou métodos para a utilização de tais composições; ou métodos para o melhoramento da imunogenicidade de uma proteína por lipidação a partir de uma sequência de ácido nucleico não ocorrendo naturalmente com a sequência de ácido nucleico codificando a parte proteica da lipoproteína. 11

OBJECTIVOS Ε SUMÁRIO DA INVENÇÃO É um objectivo da invenção proporcionar uma lipoproteina recombinante OspC de uma espécie Borrelia em que a sua lipidação é proveniente da expressão de uma primeira sequência de ácido nucleico codificando uma sequência lider OspA de uma espécie Borrelia e a sua parte proteica é proveniente da expressão de uma segunda sequência de ácido nucleico e a primeira e segunda sequências não ocorrem juntas naturalmente. É um outro objectivo da invenção proporcionar a expressão de genes e/ou sequências codificando uma tal lipoproteina recombinante, vectores para esse fim e métodos para efectuar tal expressão. É ainda um objectivo da invenção proporcionar composições imunogénicas, incluindo vacinas, contendo as lipoproteínas recombinantes OspC de uma espécie Borrelia e/ou vectores para a sua expressão.

Verificou-se, surpreendentemente, que uma proteína recombinante OspC lipidada imunogénica de uma espécie Borrelia, pode ser expressa a partir de um sistema vector, de um modo preferido E. coli, sem a toxicidade do sistema vector evidente quando a região codificante da sequência sinal da lipoproteina nativa está presente. Este resultado foi alcançado substituindo a sequência nucleotídica codificando a sequência líder nativa ou sequência sinal de uma lipoproteina com a sequência nucleotídica codificando uma líder ou sinal de lipoproteina OspA de uma espécie Borrelia. Estas proteínas recombinantes lipidadas demonstraram deduzir uma resposta imune, incluindo uma resposta imune de mucosa. 12 É surpreendente que a fusão de ADN codificando uma sequência lider de uma lipoproteína OspA de uma espécie Borrelia directamente com o ADN codificando uma proteína OspC de uma espécie Borrelia, sem quaisquer sequências nucleotídicas intermédias, pode conduzir à expressão de uma lipoproteína recombinante imunogénica em quantidades significativas sem a toxicidade evidente da sequência líder nativa, porque tentativas anteriores para expressar proteínas recombinantes lipidadas foram infrutíferas. Por exemplo, Fuchs et al. relataram que OspC formada recombinantemente (referida como pC nesta referência) com a sua proteína líder nativa foi apenas mediocremente expressa em E. coli [Mol. Microbiology (1992) 6 (4) :503-509].

Os requerentes, em aditamento a Fuchs, tentaram obter OspC recombinante lipidada por expressão da sequência codificando OspC em E. coli utilizando o sistema vector pET descrito no supracitado documento WO 92/14488 para a expressão de OspA e utilizando os sistemas plasmídicos pDS12 descritos. Todavia, OspC foi escassamente detectável por imunotransferência de extractos celulares utilizando estes sistemas para expressar OspC.

Além disso, como discutido supra, acreditava-se que uma sequência nucleotídica adicional, de preferência uma que codificasse uma sequência peptídica formando uma espira-β, fosse necessária para a expressão de lipoproteínas recombinantes e a imunogenicidade de lipoproteínas recombinantes expressas anteriormente não tivesse sido demonstrada. O processo da presente invenção possibilita, por conseguinte, que sejam obtidas grandes quantidades de recombinantes puros, de proteínas OspC lipidadas imunogénicas de 13 uma espécie Borrelia, o qual não foi até agora possível. As proteínas lipidadas formadas recombinantemente aqui proporcionadas são significativamente mais imunogénicas que um análogo recombinante não lipidado.

Acredita-se que a presente invenção representa o primeiro caso de realização da expressão de uma proteína OspC lipidada heteróloga de uma espécie Borrelia utilizando a sequência líder OspA não nativa. Por conseguinte, a invenção inclui a utilização de uma sequência líder OspA, não nativa, para a expressão de proteínas OspC heterólogas da sequência líder.

Consequentemente, numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma molécula híbrida de ácido nucleico isolada, de um modo preferido ADN, compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico codificando a sequência sinal de uma proteína OspA de uma espécie Borrelia, conjugada numa relação traducional de estrutura de leitura aberta com uma segunda sequência de ácido nucleico codificando uma lipoproteína OspC madura de uma espécie Borrelia heteróloga da sequência sinal.

De um modo mais preferido, a primeira e segunda sequências são contíguas quando a proteína madura é naturalmente lipidada, e separada por um codão codificando para um aminoácido, de um modo preferido cisteína, quando a proteína madura não é naturalmente lipidada. A lipoproteína OspC madura codificada pela segunda sequência de ácido nucleico é, de um modo preferido, uma lipoproteína antigénica e, de um modo mais preferido, uma estirpe de B. burgdorferi, de um modo mais preferido uma estirpe 14 de B. burgdorferi seleccionada a partir das famílias do subtipo OspC. O gene híbrido aqui proporcionado pode ser construído num vector de expressão, de um modo preferido sob o controlo de um promotor adequado para expressão da lipoproteína OspC madura de uma espécie Borrelia, de acordo com um aspecto adicional da invenção, o qual, num organismo hospedeiro adequado, tal como E. coli, causa a tradução inicial de uma molécula quimérica compreendendo a sequência líder OspA de uma espécie Borrelia e a proteína OspC heteróloga desejada na forma lipidada, seguida por clivagem da molécula quimérica pela peptidase sinal II e ligação de unidades lipídicas à nova extremidade da proteína, pelos quais a lipoproteína OspC madura é expressa no organismo hospedeiro. A presente invenção proporciona, pela primeira vez, uma molécula híbrida de ácido nucleico que permite a produção de proteína recombinante OspC lipidada de uma espécie Borrelia.

Consequentemente, num aspecto adicional desta invenção, é proporcionada uma molécula híbrida de ácido nucleico, compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico codificando uma proteína OspC de uma espécie Borrelia, de um modo mais preferido uma estirpe de B. burgdorferi, ainda de um modo mais preferido uma estirpe de B. burgdorferi seleccionada a partir das famílias do subtipo OspC; e uma segunda sequência de ácido nucleico codificando uma sequência sinal OspA de uma proteína expressa de uma espécie Borrelia conjugada numa relação traducional de estrutura de leitura aberta com a referida primeira sequência de ácido nucleico. 15

Como acima descrito, o gene híbrido pode ser construído num vector de expressão sob o controlo de um promotor adequado para expressão da lipoproteína OspC, a qual, num organismo hospedeiro adequado, tal como E. coli, causa a expressão da lipoproteína OspC a partir do organismo hospedeiro.

Verificou-se igualmente, surpreendentemente, que imunogenicidade melhorada pode ser obtida por uma lipoproteína recombinante OspC de uma espécie Borrelia quando a lipoproteína OspC é expressa por um gene híbrido ou quimérico compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico codificando uma sequência OspA líder ou sinal de uma espécie Borrelia e uma segunda sequência de ácido nucleico codificando a parte proteica da lipoproteína OspC, em que a primeira e segunda sequências não ocorrem juntas naturalmente.

Consequentemente, a presente invenção proporciona igualmente uma lipoproteína recombinante OspC de uma espécie Borrelia expressa por um gene híbrido ou quimérico compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico codificando uma sequência OspA líder ou sinal de uma espécie Borrelia contígua a uma segunda sequência de ácido nucleico codificando a parte proteica da lipoproteína OspC, e a primeira e segunda sequências não ocorrem juntas naturalmente. A segunda sequência pode codificar um antigénio OspC. A primeira e segunda sequências podem estar presentes num gene; e o gene e/ou a primeira e segunda sequências podem estar num vector adequado para expressão. 0 vector pode ser um ácido nucleico na forma de, e. g., plasmídeos, bacteriófagos e ADN integrado, em bactérias, de um modo muito preferido um utilizado para expressão, e. g., E. coli, 16

Bacillus subtilis, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, etc., ou um utilizado como vector vivo, e. g. Lactobacillus, Mycobacterium, Salmonella, Streptococcus, etc. Quando é utilizado um hospedeiro de expressão, a lipoproteína recombinante pode ser obtida colhendo o produto expresso In vitro; e. g., isolando a lipoproteína recombinante a partir de um extracto bacteriano. 0 gene pode estar, de um modo preferido, sob o controlo de e, por conseguinte, ligado operacionalmente a um promotor adequado; e o promotor pode ser endógeno ao vector, ou ser inserido no vector com o gene. A invenção proporciona ainda vectores contendo o ácido nucleico codificando a lipoproteína recombinante OspC e métodos para a obtenção das lipoproteínas recombinantes OspC e métodos de preparação do vector.

Como mencionado, a lipoproteína recombinante pode possuir imunogenicidade melhorada. Deste modo, formas de realização adicionais da invenção proporcionam composições imunogénicas ou vacinais para a indução de uma resposta imunológica, compreendendo a lipoproteína recombinante OspC isolada, ou vector adequado para expressão in vivo desta num hospedeiro não animal, ou ambos, e um veículo adequado, e a utilização das referidas composições na preparação de um medicamento para a profilaxia ou tratamento da doença de Lyme.

Documentos citados nesta divulgação, incluindo os pedidos acima referenciados, proporcionam ingredientes, tipicamente adicionais, para tais composições, tal que não é requerida experimentação indevida pelo especialista na técnica para formular uma composição a partir desta divulgação. Tais composições devem conter, de um modo preferido, uma quantidade 17 da lipoproteina recombinante OspC de uma espécie Borrelia ou vector expressando tal suficiente para deduzir uma resposta adequada. Uma tal quantidade de lipoproteina recombinante OspC ou vector pode ser baseada em quantidades conhecidas de antigénios administradas. Por exemplo, se existir uma quantidade conhecida para administração de um antigénio correspondendo à segunda sequência expressa para a lipoproteina recombinante OspC inventiva, a quantidade de lipoproteina recombinante pode ser ajustada em torno daquela quantidade conhecida, e a quantidade de vector pode ser tal de modo a produzir um número suficiente de unidades de formação de colónia (cfu) de forma a resultar em expressão in vivo num hospedeiro não animal da lipoproteina recombinante OspC em torno daquela quantidade conhecida. Do mesmo modo, a quantidade de lipoproteina recombinante pode ser baseada em quantidades de antigénio administradas a animais nos exemplos abaixo e nos documentos aqui citados, sem experimentação indevida. A presente invenção inclui também, em outros aspectos, processos para a produção de uma lipoproteina recombinante OspC de uma espécie Borrelia, pela construção de um vector de expressão, expressão da lipoproteina a partir de um organismo hospedeiro não animal contendo o vector de expressão, e opcionalmente isolar e/ou purificar a lipoproteina OspC expressa. 0 isolamento/purificação podem ser de forma a obter lipoproteina recombinante isenta de impurezas tais como lipopolissacáridos e outras proteínas bacterianas. A presente invenção inclui ainda composições imunogénicas para a indução de uma resposta imunológica, tais como vacinas, contendo a lipoproteina recombinante bem como a utilização das referidas composições na preparação de um medicamento para a profilaxia ou tratamento da doença de Lyme. 18

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Na descrição detalhada seguinte, é feita referência às figuras acompanhantes, em que: A figura 1 é uma representação esquemática de um processo para a construção do plasmídeo pLFIOO; A figura 2 é uma representação esquemática de um processo para a construção dos vectores plasmidicos pPko9a (estirpe Pko) e pB319a (estirpe B31); A figura 3 é uma representação esquemática do processo empregue para o isolamento e purificação de OspC lipidada; A figura 4 é uma representação esquemática do processo empregue para o isolamento e purificação de OspC não lipidada para propósitos comparativos; A figura 5 mostra uma análise SDS-PAGE de OspC lipidada aqui produzida em diferentes etapas do processo de purificação ilustrado esquematicamente na Figura 3; A figura 6 mostra uma análise SDS-PAGE de OspC não lipidada aqui produzida em diferentes etapas do processo de purificação como descrito no documento WO 91/09870; A Figura 7 é uma representação gráfica da resposta imune de murganhos imunizados com formulações OspC contendo antigénios de dois subtipos de OspC como medido num ensaio ELISA anti-OspC; 19 A Figura 8 é uma representação gráfica da resposta imune de murganhos imunizados com uma formulação de dois subtipos de OspC que contém adjuvante alum como medido num ensaio ELISA anti-OspC; A figura 9 é uma representação esquemática de um processo para a construção do vector plasmídico pPA321-L; A figura 10 é uma representação esquemática de um processo para a construção do vector plasmídico pPA321-NL; A figura 11 é uma representação esquemática do processo empregue para o isolamento e purificação de PspA lipidada; A figura 12 é uma representação esquemática do processo empregue para o isolamento e purificação de PspA não lipidada para propósitos comparativos; A figura 13 mostra uma análise SDS-PAGE de PspA lipidada aqui produzida em diferentes etapas do processo de expressão e fraccionamento de células do hospedeiro ilustrado esquematicamente na Figura 11; A figura 14 mostra uma análise SDS-PAGE de PspA não lipidada aqui produzida em diferentes etapas do processo de expressão e fraccionamento de células do hospedeiro ilustrado esquematicamente na Figura 12; e A figura 15 mostra uma análise SDS-PAGE dos resultados da coluna de cromatografia de PspA ilustrados esquematicamente nas Figuras 11 e 12. 20

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como acima registado, a invenção diz respeito à utilização de uma sequência de ácido nucleico codificando a sequência sinal OspA para a expressão de uma proteína OspC lipidada de um espécie Borrelia heteróloga a uma proteína OspA, e à utilização de uma sequência de ácido nucleico codificando a sequência sinal OspA de uma espécie Borrelia de uma proteína heteróloga à proteína OspC a ser expressa, para expressar a proteína OspC lipidada de uma espécie Borrelia. A sequência de aminoácidos líder e sequência de ADN codificante para a estirpe ACA de B. burgdorferi são como segue:

MKKYLLGIGLILALIAC (SEQ ID NO: 1)

ATG AAA AAA TAT TTA TTG GGA ATA GGT CTA ATA TTA GCC TTA ATA

GCA TGC (SEQ ID NO: 2)

As sequências de aminoácidos líderes e sequências de ADN codificantes correspondentes para a OspA de outras estirpes de B burgdorferi são conhecidas na técnica e podem ser empregues na presente invenção a partir desta divulgação, sem qualquer experimentação indevida.

Uma molécula genética híbrida é construída compreendendo a sequência codificante líder OspA e o gene codificando a proteína heteróloga a ser expressa, de um modo preferido o gene ospC ou pspA, organizado numa relação traducional de estrutura de leitura aberta com o fragmento genético ospA. 21

Para produção da proteína lipidada, a molécula genética híbrida apropriada pode ser incorporada num vector de expressão e o plasmídeo resultante incorporado numa estirpe de expressão de E. coli ou outro organismo hospedeiro adequado. 0 vector pode ser igualmente um bacteriófago ou ADN integrado. A proteína lipidada é expressa pelas células durante o crescimento do organismo hospedeiro. A proteína lipidada pode ser recuperada do organismo hospedeiro na forma purificada por qualquer processo conveniente que separe a proteína lipidada na forma não desnaturada. Um esquema de um processo de acordo com este aspecto da invenção é mostrado na Figura 3.

Depois do crescimento celular e indução da proteína, as células são sujeitas a uma lise de congelação-descongelação e tratamento com DNase I. 0 lisado é tratado com um detergente que é selectivo para a solubilização da proteína recombinante lipidada, de preferência para as outras proteínas bacterianas no lisado. Embora a presente invenção utilize, de um modo preferido, éter tert-octilfenilo polietilenoglicol possuindo a fórmula t-Oct-C6H4 (OCH2CH2) X0H, em que x=7-8, como detergente (disponível comercialmente como, e referido em seguida como, TRITON” X-114), podem ser utilizados outros materiais exibindo uma solubilidade selectiva semelhante para a proteína de lipidação bem como a propriedade de separação de fases sob condições moderadas, como abaixo discutido.

Depois da adição do TRITON” X-114, a mistura é aquecida a uma elevação moderada de temperatura, de um modo preferido em torno de 35 °C a 40 °C, tempo a que a solução se torna turva à medida que ocorre a separação de fases. O processo de purificação para tal separação de fases deveria ocorrer sob 22 condições para evitar qualquer desnaturação substancial ou qualquer outro enfraquecimento substancial das propriedades imunológicas da lipoproteína recombinante. A centrifugação da mistura turva resulta na separação da mistura em três fases, nomeadamente uma fase detergente contendo cerca de 50% ou mais da proteína recombinante lipidada e uma pequena quantidade (aproximadamente 5% p) de outras proteínas, uma fase aquosa contendo a proporção das outras proteínas, e um sedimento sólido de resíduo celular. A fase detergente é separada da fase aquosa e do sedimento sólido para posterior processamento. A purificação final da proteína é efectuada, de um modo preferido, pelo processamento da fase detergente para proporcionar uma proteína recombinante lipidada possuindo uma pureza de pelo menos cerca de 80% p, e que é substancialmente isenta de outros contaminantes tais como proteínas bacterianas, e lipopolissacáridos (LPS), e que possui níveis de endotoxinas compatíveis com administração humana.

Tal purificação é convenientemente efectuada por cromatografia em coluna. Tal purificação cromatográfica pode incluir uma primeira purificação cromatográfica utilizando uma primeira coluna cromatográfica possuindo o pH, força iónica e hidrofobicidade para ligar proteínas bacterianas, mas não a proteína recombinante lipidada.

Tal primeira purificação cromatográfica pode ser efectuada carregando a fase detergente na primeira coluna cromatográfica e o escoamento, que contém a proteína lipidada purificada, é recolhido. A fracção ligada contém substancialmente todas as 23 impurezas proteicas bacterianas da fase detergente. 0 meio cromatográfico utilizado em tal primeira operação de purificação pode ser uma coluna DEAE-Sephacel ou DEAE-Sepharose. 0 escoamento proveniente da primeira operação de purificação cromatográfica pode ser sujeito a uma purificação posterior numa segunda coluna cromatográfica. 0 escoamento é carregado na coluna possuindo o pH, força iónica e hidrofobicidade gue irá selectivamente ligar a proteína recombinante lipidada à segunda coluna cromatográfica, enguanto contaminantes bacterianos e LPS passam através da coluna. 0 meio cromatográfico para a segunda coluna cromatográfica pode ser S-Sepharose.

De um modo preferido, a lipoproteína recombinante OspC de uma espécie Borrelia é purificada para 80% de pureza ou maior que 80% de pureza, e. g., 85-90% ou até mesmo 90-95% ou maior que 95% de pureza. O material proteináceo lipidado pode então ser formulado em composições imunogénicas, de um modo preferido vacinas. A vacina ou composição imunogénica deduz uma resposta imune num sujeito hospedeiro o qual produz uma resposta imunológica, tal como anticorpos que podem ser opsonizantes ou bactericidas. Caso um sujeito imunizado com uma lipoproteína recombinante da invenção seja então provocado, tal resposta imunológica pode inactivar o organismo provocador. Além disso, anticorpos opsonizantes ou bactericidas também podem proporcionar protecção por mecanismos alternativos. 24

Composições imunogénicas incluindo vacinas podem ser preparadas como injectáveis, como soluções ou emulsões liquidas, ou como formulações para administração oral, nasal ou outro orifício, e. g., vaginal, rectal, etc. Formulações orais podem ser soluções líguidas, emulsões e semelhantes, e. g., elixires, ou preparações sólidas, e. g., comprimidos, cápsulas de fecho, cápsulas, grânulos, cápsulas com enchimento de líquido, gelatina e semelhantes. Preparações nasais podem ser líquidas e podem ser administradas via aerossol, dispensadores nebulizadores de compressão ou bomba. Os documentos aqui citados proporcionam tipos de formulação exemplares e ingredientes para esse fim, incluindo os pedidos acima citados.

Os imunogénios podem ser misturados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis os quais são compatíveis com os imunogénios. Tais excipientes podem incluir água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, e suas combinações, As composições imunogénicas e vacinas podem conter ainda substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes de tamponização de pH, ou adjuvantes para melhorar a sua eficácia. As composições imunogénicas e vacinas podem ser administradas parentericamente, por injecção subcutaneamente ou intramuscularmente. As preparações imunogénicas e vacinas são administradas de um modo compatível com a formulação da dosagem, e numa tal quantidade que será terapeuticamente eficaz, imunogénica ou protectora. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imunitário do indivíduo para sintetizar anticorpos e, se necessário, para produzir uma resposta imune mediada por células. Quantidades exactas de ingrediente activo requeridas para serem administradas dependem do parecer do médico, tomando em consideração tais factores como a idade, peso, 25 sexo, estado do hospedeiro ou doente a quem deve fazer-se uma administração. Todavia, gamas de dosagens adequadas são prontamente determinadas pelo especialista na técnica e podem ser da ordem de microgramas dos imunogénios. Regimes adequados para administração inicial e doses de reforço são também variáveis, mas podem incluir uma administração inicial seguida por administrações subsequentes. A dosagem pode depender igualmente da via de administração e variará de acordo com o tamanho do hospedeiro. A concentração dos imunogénios numa composição compreendendo a lipoproteína OspC de acordo com a invenção para a indução de uma resposta imunológica é em geral de cerca de 1 a cerca de 95%. Uma vacina ou composição imunogénica que contém material antigénico de apenas um patógeno é uma vacina monovalente. Vacinas ou composições compreendendo a lipoproteína OspC da presente invenção para a indução de uma resposta imunológica, as quais são multivalentes ou que contêm material antigénico de vários patógenos (também conhecidas como vacinas combinadas ou composições imunogénicas combinadas) pertencem igualmente à presente invenção. Tais composições imunogénicas ou vacinais combinadas contêm, por exemplo, material de vários patógenos ou de várias estirpes do mesmo patógeno, ou de combinações de vários patógenos.

Agentes ou adjuvantes imunoestimulatórios foram utilizados durante muitos anos para aperfeiçoar as respostas imunes de hospedeiros a, por exemplo, vacinas ou composições imunogénicas. Adjuvantes intrínsecos, tais como lipopolissacáridos, são normalmente os componentes das bactérias mortas ou atenuadas utilizados como vacinas ou composições imunogénicas. Adjuvantes extrínsecos são imunomoduladores os quais estão tipicamente 26 ligados não covalentemente a antigénios e são formulados para melhorar as respostas imunes de hospedeiros, Todavia, alguns destes adjuvantes são tóxicos e podem causar efeitos adversos indesejáveis, tornando-os desadequados para utilização em humanos e muitos animais. De facto, apenas o alum é utilizado rotineiramente como um adjuvante em vacinas humanas e veterinárias.

Em virtude das dificuldades associadas à utilização de adjuvantes é, deste modo, uma vantagem da presente invenção que as proteínas recombinantes OspC lipidadas de uma espécie Borrelia sejam as formas mais imunogénicas, e sejam capazes de dedução de respostas imunes tanto sem qualquer adjuvante como com alum.

Os exemplos seguintes ilustram mas não limitam o âmbito da invenção divulgada nesta especificação.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Construção de vim Vector Contendo vim Gene Codificando a Sequência Lider OspA 0 plasmideo pBluescript KS+ (Stratagene) foi digerido com Xbal e BamHI e ligado a uma fragmento de ADN de Xbal-BamHI com 900 pb contendo a região codificante completa do gene ospA da estirpe ACA1 de B. burgdorferi, para formar um vector pLFIOO de fusão da lipoproteina. Este processo é mostrado esquematicamente na Figura 1. 27 0 vector pLFIOO, foi depositado na American Type Culture Collection 10801 University Blvd., Mansas, Va. 20110-2209 a 2 de Fevereiro de 1995 sob o N°. de Acesso 69750. Este depósito foi feito segundo os termos do Tratado de Budapeste.

Exemplo 2

Construção de vim Vector de Expressão Contendo vim Gene Híbrido ospA-ospC

Iniciadores nucleotidicos concebidos especificamente foram utilizados numa reacção de polimerização em cadeia (PCR) para amplificar a parte do gene ospC a jusante do codão codificante da cisteina interrompendo a sequência de reconhecimento codificante do peptídeo sinal da extremidade C-terminal da região codificante das estirpes Pko e B31 de B. burgdorferi. O iniciador da extremidade 5' possuía as sequências nucleotídicas respectivamente para as estirpes Pko e B31: 5' -GGC GCG CAT GCA ATA ATT CAG GGA AAG G-3' (Pko) (SEQ ID NO: 3) 5'-GGC GCG CAT GCA ATA ATT CAG GGA AAG A-3' (B31) (SEQ ID NO: 4) enquanto o iniciador da extremidade 3' possuía a sequência nucleotídica: 5'-CGC GGA TCC TTA AGG TTT TTT TGG-3' (B31 & Pko) (SEQ ID NO: 5) 28 A amplificação por PCR foi efectuada num Thermal Cycler de ADN (Perkins-Elmer Cetus) durante 25 ciclos com desnaturação durante 30 segs a 94 °C., hibridação a 37 °C durante 1 minuto e extensão a 72 °C. durante minuto. Uma extensão final foi efectuada a 72 °C. durante 5 minutos na conclusão dos ciclos. O produto foi purificado utilizando um kit Gene Clean II (B10 101) e o material purificado foi digerido com Sphl e BamHI. Este processo introduziu uma mutação silenciosa no gene ospC de Pko o qual muda o codão para o aminoácido 60 da proteína madura de ATT em ATA.

Os materiais produzidos para as estirpes Pko e B31 de B. burgdorferi foram manipulados de forma idêntica deste ponto em diante e, por este motivo, apenas é descrita a manipulação posterior do material OspC da estirpe Pko. O plasmídeo pLFIOO (Exemplo 1) foi digerido com Sphl e BamHI e a sequência Pko amplificada foi ligada ao plasmídeo para formar o plasmídeo pPko 100 (pB31 100 para a estirpe B31) contendo um gene híbrido ospA/ospC. O gene híbrido foi excisado do plasmídeo pPko 100 por digestão com Ndel e BamHI e clonado nos sítios Ndel e BamHI do vector plasmídico pET9 para colocar o gene híbrido ospA/ospC sob controlo de um promotor T7 e sinais de iniciação de tradução eficientes do bacteriófago T7, como visto na Figura 2. O plasmídeo resultante é designado pPko9a (pB319a para a estirpe B31). 29

Exemplo 3

Expressão e Purificação de OspC llpldada 0 plasmídeo pPko9a, preparado como descrito no Exemplo 2, foi utilizado para transformar estirpes de E. coli BL21(DE3) (pLysS) e HMS174(DE3) (pLysS) . A E. coli transformada foi inoculada em meio LB com sulfato de canamicina a 30 pq/mL e cloranfenicol a 25 gg/mL a uma razão de 12 mL de cultura por cada litro preparado. A cultura foi crescida de um dia para o outro num balão de agitação a 37 °C.

Na manhã seguinte, 10 mL de meio de cultura que ficou de um dia para o outro foram transferidos para 1 L de meio LB contendo sulfato de canamicina a 30 ^g/mL e a cultura foi crescida num balão de agitação a cerca de 37 °C até um nivel de OD6oo=0,6-1,0 (embora crescimento até OD6oo=l,5 possa ser efectuado) , em aproximadamente 3-5 horas.

Ao meio de cultura foi adicionado isopropiltiogalactosídeo (IPTG) a uma concentração final de 0,5 mM e o meio de cultura foi crescido durante mais duas horas a cerca de 30 °C. As culturas foram colhidas e as amostras analisadas em géis de SDS-PAGE corados com Coomassie (Figura 5) . O meio de cultura foi arrefecido para cerca de 4 °C e centrifugado a 10.000 xG durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado enquanto o sedimento foi recolhido. OspC lipidada purificada foi recuperada do sedimento efectuando o processo mostrado esquematicamente na Figura 3 e abaixo descrito. O sedimento celular foi primeiramente ressuspendido em 1/10 do volume de PBS. A suspensão celular foi congelada e armazenada 30 a -20 °C ou abaixo, se desejado. Depois da congelação da suspensão celular, as células foram descongeladas para a temperatura ambiente (cerca de 20 a 25 °C) que causa a lise das células. Foi adicionada DNase I ao material descongelado a uma concentração de 1 yg/mL e a mistura foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente, que resultou numa diminuição na viscosidade do material. O material incubado foi arrefecido sobre gelo a uma temperatura abaixo de 10 °C e foi adicionado TRITON™ X-114 como uma solução stock a 10% p, a uma concentração final de 0,3 a 1% p. A mistura foi mantida em gelo durante 20 minutos. A mistura arrefecida foi, depois, aquecida a cerca de 37 °C e mantida a essa temperatura durante 10 minutos. A solução ficou muito turva à medida que a separação de fases ocorria. A mistura turva foi depois centrifugada a cerca de 20 °C durante 10 minutos a 12.000 xG, o que causou a separação da mistura numa fase detergente inferior, uma fase aquosa clara superior e um sedimento sólido. A análise das fases fraccionadas por SDS-PAGE (Figura 5) revelou que a OspC se particionou na fase detergente, mostrando que está na forma lipidada. A fase detergente foi separada das outras duas fases e arrefecida a 4 °C., sem perturbar o sedimento.

Tampão A, nomeadamente Tris a 50 mM pH 7,5, EDTA a 2 mM e NaCl a 10 mM e 0,3% de éter terc-octilfenilopolietilenoglicólico possuindo a fórmula t-Oct-Cefb- (OCfbCl·^) xOH em que x=9-10, como detergente (disponível comercialmente como e referido em seguida como TRITON™ X-100), foi adicionado à fase detergente arrefecida para reconstituir de volta a 1/3 do volume original. A solução resultante pode ser congelada e armazenada para processamento 31 posterior como abaixo descrito ou pode ser imediatamente submetida a tal processamento.

Uma coluna CL-6B DEAE-Sepharose foi preparada num volume de 1 mL/10 mL de fase detergente e foi lavada com 2 volumes de Tampão C, nomeadamente Tris a 50 mM pH 7,5, EDTA a 2 mM, NaCl a 1 M, 0,3% p de TRITON™ X-100, e a seguir com 4 volumes de Tampão B, nomeadamente Tris a 50 mM pH 7,5, EDTA a 2 mM, 0,3% p de TRITON™ X-100. A fase detergente foi depois carregada na coluna e o escoamento contendo a OspC, foi recolhido, A coluna foi lavada com 2 volumes de Tampão B e o escoamento foi recolhido novamente. Os escoamentos combinados eram uma solução aquosa de OspC purificada, a qual pode ser congelada para armazenamento. A coluna pode ser libertada de proteínas bacterianas para reutilização por eluição com 4 volumes de Tampão C.

Purificação posterior e final do escoamento proveniente da coluna foi efectuado por cromatografia em S-Sepharose Fast Flow. O escoamento proveniente da coluna DEAE-Sepharose foi primeiro acidificado para pH 4,3 pela adição de ácido cítrico a 1 M e o material acidificado foi carregado na coluna S-Sepharose. A coluna S-Sepharose Fast Flow tinha sido lavada com 3 volumes de coluna de tampão A e depois com 5 volumes de coluna de Tampão A feita para pH 4,3. A OspC liga-se à coluna. A coluna carregada foi lavada com 4 volumes de coluna de pH 4,3 de tampão A seguido por 4 volumes de coluna de pH 5,5 de Tampão A.

OspC altamente purificada foi eluída da coluna utilizando Tampão A, ajustado para pH 6,0 com 1 N HC1. Um esquema de um 32 processo de purificação descrito neste Exemplo é mostrado na Figura 3. A solução aquosa de OspC lipidada altamente purificada obtida pelos processos cromatográficos foi analisada por géis corados com Coomassie (Figura 5) , e confirmados como OspC na forma altamente purificada por análise de imunotransferência utilizando antisoro policlonal de coelho anti-OspC. A pureza do produto foi calculada como superior a 80%.

Por este processo, cerca de 2 a 4 mg de OspC pura foi recuperada a partir de uma cultura de 1 litro do hospedeiro BL21 e cerca de 1 a 2 mg de OspC pura foi recuperada a partir de uma cultura de 1 litro do hospedeiro HMS 174.

Exemplo 4

Expressão e Purificação de OspC não lipidada

Transf ormantes de E. coli JM 10 9 contendo o vector plasmidico contendo fragmento genético cromossómico codificando OspC não lipidada foram preparados e crescidos como descrito no documento WO 91/09870. As culturas foram colhidas, o meio de cultura centrifugado 10.000 xG durante 10 minutos a 4 °C., o sobrenadante descartado e o sedimento recolhido. O sedimento celular foi primeiramente ressuspendido em tampão de lise A, nomeadamente Tris-HCl a 50nM pH 8,0, EDTA a 2mM, DTT a 0,1 mM, 5% de glicerol e 0,4mg/mL de lisozima, e a suspensão agitada durante 20 minutos à temperatura ambiente. TRITON™ X-100 foi a seguir adicionado à suspensão celular a uma 33 concentração de 1% p, DAase I foi adicionada a uma concentração de 1 yg/mL, e a suspensão agitada à temperatura ambiente durante mais 20 minutos para efectuar a lise celular. Cloreto de sódio foi a seguir adicionado à suspensão celular a uma concentração de 1 M e a suspensão agitada novamente a 4 °C durante mais 20 minutos. A suspensão foi a seguir centrifugada a 20.000 xG durante 30 minutos, o sobrenadante resultante separado do sedimento e o sedimento foi descartado. O sobrenadante separado foi dialisado contra um tampão compreendendo Tris a 50 mM a pH 8, EDTA a 2 mM. O sobrenadante foi depois carregado numa coluna CL-6B DEAE-Sepharose e a OspC não lipidada foi recolhida no escoamento da coluna. O escoamento foi dialisado contra um tampão de fosfatos a 0,1 M, pH 6,0. O escoamento dialisado foi a seguir ligado a uma coluna S-Sepharose fast flow equilibrada com tampão de fosfatos a 0,1 M, pH 6,0. OspC purificada não lipidada foi depois eluida da coluna S-Sepharose utilizando o tampão de diálise com NaCl a 0,15 M adicionado. Um esquema de um processo de purificação é mostrado na Figura 4. A solução aquosa de OspC lipidada altamente purificada foi analisada por géis corados com Coomassie (Figura 6). A pureza do produto foi calculada como superior a 80%. 34

Exemplo 5

Imunogenicidade de OspC Recomblnante Lipidada

OspC recombinante lipidada purificada, preparada como descrito no Exemplo 3, foi testada para imunogenicidade em murganhos e comparada àquela de OspC não lipidada preparada com descrito no Exemplo 4. Para este estudo, murganhos fêmea C3H/He de 4 a 8 semanas de idade foram imunizados no dia 0 e reforçados no dia 21 e 42. Foi dado a todos os animais 1 pg cada de OspC expressa a partir dos genes B31 e Pko por dose. Foram testadas as formas lipidada e não lipidada do antigénio. Foram testadas formulações com e sem alum como adjuvante.

Animais representativos foram sangrados nos dias 21, 42, 63 e 91. Foram realizados testes ELISA nestes soros utilizando OspC não lipidada purificada como antigénio de revestimento.

Os resultados dos testes de murganhos imunizados com antigénio sem adjuvante (Figura 7) mostram que apenas animais imunizados com o antigénio lipidado produzem uma resposta ELISA detectável. Todavia, a resposta imune de animais imunizados com antigénios formulados com alum (Figura 8) mostra que dois tipos de antigénio dão respostas ELISA comparáveis e estas respostas desenvolvem-se mais rapidamente.

Construção de um Vector de Expressão pET9a Contendo um Gene Hibrldo ospA/pspA (Apenas para Informação de fundo)

Iniciadores nucleotidicos concebidos especificamente foram utilizados numa reacção de PCR para amplificar a parte do gene 35 pspA de interesse (neste caso desde os aminoácidos 1 a 321) da estirpe RX1 de S. pneumoniae. A extremidade 5' do iniciador possuía a sequência nucleotídica: 5'-GGG ACA GCA TGC GAA GAA TCT CCC GTA GCC AGT-3' (PspNl) (SEQ ID NO: 6). A extremidade 3' do iniciador possuía a sequência nucleotídica: 5'-GAT GGA TCC TTT TGG TGC AGG AGC TGG TTT-3' (PspC370) (SEQ ID NO: 7). A reacção de PCR foi como segue: 94 °C durante 30 segundos para desnaturar ADN; 42 °C durante um minuto para hibridação de ADN; e 72 °C durante um minuto para extensão de ADN. Isto foi efectuado durante 35 ciclos, seguido por extensão de 5 minutos a 72 °C. Este processo introduziu um codão de terminação no aminoácido 315. O produto de PCR foi purificado utilizando o método Gene Clean II (BiolOl), e digerido com Sphl e BamHI. O plasmídeo pLFIOO (Exemplo 1) foi digerido com Sphl e BamHI e o gene pspA amplificado foi ligado a este plasmideo para formar o plasmídeo pLF321, o qual continha o gene híbrido ospA-pspA. O gene híbrido foi excisado de pLF321 por digestão com Ndel e BamHI e clonado nos sítios Ndel e BamHI do vector plasmídico pET9a para colocar o gene híbrido ospA-pspA sob o controlo de um promotor T7. O plasmídeo resultante é designado pPA321-L. Este processo é mostrado esquematicamente na Figura 9. 36

Construção de um Vector de Expressão pETda Contendo o Gene pspA (Apenas para informação de fundo)

Iniciadores nucleotídicos concebidos especificamente foram utilizados numa reacção de PCR para amplificar a parte do gene pspA de interesse (neste caso desde os aminoácidos 1 a 321) da estirpe RX1 de S. pneumoniae utilizando o plasmídeo pPA321-L do

Exemplo 6. A extremidade 5' do iniciador possuía a sequência nucleotídica: 5' -GCT CCT GCA TAT GGA AGA ATC TCC CGT AGC C-3' (PspNL-2) (SEQ ID NO: 8) A extremidade 3' do iniciador possuía a sequência nucleotídica: 5'-GAT GGA TCC TTT TGG TGC AGG AGC TGG TTT-3' (PspC370) (SEQ ID NO: 7). A reacção de PCR foi como segue: 94 °C durante 30 segundos para desnaturar ADN; e 72 °C durante um minuto para hibridação e extensão de ADN, Isto foi efectuado durante 25 ciclos, o qual foi seguido por uma extensão de 5 minutos a 72 °C Este processo introduziu um codão de terminação no aminoácido 315. O produto de PCR foi purificado utilizando o método Gene Clean II (Bio 101), e digerido com Ndel e BamHI. O produto de PCR digerido foi clonado nos sítios Ndel e BamHI do vector plasmídico pET9a para colocar o gene pspA sob o controlo de um promotor T7. O plasmídeo resultante é designado pPA321-NL. Este processo é mostrado esquematicamente na Figura 10. 37

Expressão e Purificação de PspA Lipidada (Apenas para informação de fundo) 0 plasmídeo pPA321-L foi utilizado para transformar a estirpe BL21 (DE3) pLyS de E. coli. A E. coli transformada foi inoculada em meio LB contendo sulfato de canamicina a 30 yg/mL e cloranfenicol a 25 yg/mL. A cultura foi crescida de um dia para o outro num balão de agitação a 37 °C.

Na manhã seguinte, 50 mL de cultura que ficou de um dia para o outro foram transferidos para 1 L de meio LB contendo sulfato de canamicina a 30 yg/mL e a cultura foi crescida num balão de agitação a 37 °C até um nivel de OD 600 de 0,6-1,0, em aproximadamente 3-5 horas. Ao meio de cultura foi adicionado IPTG a uma concentração final de 0,5 mM e a cultura foi crescida durante duas horas adicionais a 30 °C. As culturas foram colhidas por centrifugação a 4 °C a lO.OOOxG e o sedimento recolhido. PspA lipidada foi recuperada do sedimento celular. O sedimento celular foi ressuspendido em PBS a 30 g de pasta celular húmida por litro de PBS. A suspensão celular foi congelada e armazenada a -20 °C. As células foram descongeladas para a temperatura ambiente para efectuar a lise celular. Foi adicionada DNase I ao material descongelado a uma concentração final de 1 yg/mL e a mistura incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente, que resultou numa diminuição na viscosidade do material. O material foi depois arrefecido num banho de gelo para abaixo de 10 °C. e foi adicionado TRITON™ X-114 como uma solução stock a 10% p para uma concentração final de 0,3 a 1%. A mistura foi mantida em gelo durante 20 minutos. A mistura arrefecida foi 38 a seguir aquecida a 37 °C e mantida a essa temperatura durante 10 minutos. Isto causou que a solução ficasse muito turva à medida que a separação de fases ocorria. A mistura turva foi depois centrifugada a cerca de 20 °C durante 10 minutos a 12.000xG, o que causou uma separação da mistura numa fase detergente inferior, uma fase aquosa clara superior e um sedimento. A PspA lipidada particionou-se na fase detergente. A fase detergente foi separada das outras duas fases, diluída 1:10 com um tampão compreendendo Tris a 50mM, EDTA a 2mM, NaCl a lOmM pH 7,5, e foi armazenada a -20 °C.

Foi preparada uma coluna Q-Sepharose num volume de 1 mL por 5 mL de fase detergente diluída. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de um tampão compreendendo Tris a 50 mM, EDTA a 2mM, 0,3% de TRITON™ X-100, NaCl a 1M pH 4,0, e depois equilibrada com 5 a 10 volumes de coluna de Tris a 50mM, EDTA a 2mM, 0,3% de TRITON” X-100, NaCl a lOmM pH 4,0. O pH do material da fase detergente diluída foi ajustado para 4,0, tempo a que ocorreu uma precipitação. Este material foi passado através de uma unidade de filtração de acetato de celulose de 0,2 μΜ para remoção do material precipitado. A fase detergente filtrada diluída foi aplicada na coluna Q-Sepharose e o escoamento (contendo PA321-L) foi recolhido. A análise de SDS-PAGE desta etapa é mostrada na Figura 15. A coluna foi lavada com 1-2 volumes de coluna de Tris a 50mM, EDTA a 2mM, 0,3% de TRITON X-100, NaCl a lOmM pH 4,0, e o escoamento foi agregado com a fracção anterior do escoamento. O pH do escoamento agregado foi ajustado para 7,5. O material ligado, proteínas de E. coli contaminantes, foi eluído da coluna Q-Sepharose com 2 volumes de coluna de Tris a 50mM, EDTA a 2mM, 0,3% de TRITON” X-100, NaCl a 1M pH 4,0. Um esquema do processo de purificação descrito neste Exemplo é mostrado na Figura 11. 39

Expressão e Purificação de PspA Não Lipidada (Apenas para informação de fundo) 0 plasmídeo pPA321-NL foi utilizado para transformar a estirpe BL21 (DE3) pLyS de E. coli. A E. coli transformada foi inoculada em meio LE contendo sulfato de canamicina a 30 pg/mL e cloranfenicol a 25 pg/mL. A cultura foi crescida de um dia para o outro num balão de agitação a 37 °C.

Na manhã seguinte, 50 mL de cultura que ficou de um dia para o outro foram transferidos para 1 L de meio LB contendo sulfato de canamicina a 30 pg/mL e a cultura foi crescida num balão de agitação a 37 °C até um nivel de OD 600 de 0,6-1,0, em aproximadamente 3-5 horas. Ao meio de cultura foi adicionado IPTG a uma concentração final de 0,5 mM e a cultura foi crescida durante duas horas adicionais a 30 °C. As culturas foram colhidas por centrifugação a 4 °C a lO.OOOxG e o sedimento celular recolhido. PspA não lipidada foi recuperada do sedimento celular. O sedimento celular foi ressuspendido em PBS a 30g de pasta celular húmida por litro de PBS. A suspensão celular foi congelada e armazenada a -20 °C. As células foram descongeladas para a temperatura ambiente para efectuar a lise celular. Foi adicionada DNase I ao material descongelado a uma concentração final de 1 pg/mL e a mistura incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente, que resultou numa diminuição na viscosidade do material. A mistura foi centrifugada a 4 °C a lO.OOOxG, e o sobrenadante celular guardado, o qual continha PspA não lipidada. O sedimento foi lavado com PBS, centrifugado a 4 °C a lO.OOOxG e o sobrenadante celular agregado ao sobrenadante celular anterior. 40

Foi preparada uma coluna MonoQ (Pharmacia) num volume de 1 mL por 2 mL de sobrenadante celular. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de um tampão compreendendo Tris a 50mM, EDTA a 2 mM, NaCl a 1 M pH 7,5, e depois equilibrada com 5 a 10 volumes de coluna de um tampão compreendendo Tris a 50 mM, EDTA a 2 mM, NaCl a 10 mM pH 7,5. O sobrenadante celular agregado foi aplicado na coluna Q-Sepharose e o escoamento recolhido. A coluna foi lavada com 2-5 volumes de coluna de Tris a 50 mM, EDTA a 2 mM, NaCl a 10 mM pH 7,5, e o escoamento agregado com o escoamento anterior. A eluição de proteínas ligadas começou com a primeira etapa de uma lavagem de 5-10 volumes de coluna com Tris a 50 mM, EDTA a 2 mM, NaCl a 100 mM pH 7,5. A segunda etapa de eluição foi uma lavagem de 5-10 volumes de coluna com Tris a 50 mM, EDTA a 2 mM, NaCl a 200 mM pH 7,5. A PspA não lipidada ficou contida nesta fracção. A análise de SDS-PAGE desta etapa é mostrada na Figura 15. As restantes proteínas contaminantes ligadas foram removidas com Tris a 50 mM e EDTA a 2 mM pH 7,5 com NaCl a 300 mM-Ι M.

Um esquema do processo de purificação descrito neste Exemplo é mostrado na Figura 12. (Apenas para informação de fundo) Imunogenicidade de PapA Recombinante Lipidada

PspA recombinante lipidada purificada, preparada como descrito no Exemplo 8, foi testada para imunogenicidade em murganhos e comparada àquela de PspA não lipidada preparada como descrito no Exemplo 9. Para este estudo, murganhos C3A/N 41 imunizados subcutaneamente na parte de trás do pescoço com 0,5 mL das seguintes formulações às concentrações indicadas de antigénios PspA.

Formulação Concentração de antigénio PspA Molécula de PspA nativa da estirpe RX1 (RX1 nativa) 200 ng/mL PspA Recombinante Não Lipidada (ρΡΑ-321-NL) Apenas em PBS* 200 e 1000 ng/mL PspA Recombinante Não Lipidada (ρΡΑ-321-NL) Adsorvida a Alum 200 e 1000 ng/mL PspA Recombinante Lipidada (pPA-321-L) Apenas em PBS 200 e 1000 ng/mL PspA Recombinante Lipidada (pPA0321-NL) Adsorvida a Alum* 200 e 1000 ng/mL Alum* 0 ng/mL PBS 0 ng/mL *Alum foi Hidrogel a uma concentração de 200 pg/mL

Foram imunizados quatro murganhos nos dias 0 e 21 para cada dosagem das formulações. Os murganhos foram depois sangrados no dia 35 e subsequentemente provocados com S. pneumoniae de estirpe A66. Os dias de sobrevivência após provocação dos murganhos foram registados e os murganhos sobreviventes foram sangrados nos dias 36, 37, 42 e 46. A partir destes sangramentos subsequentes o sangue foi ensaiado para o número de unidades de 42 formação de colónia (CFU) de S. pneumoniae/mL. Os soros retirados no dia 35 foram ensaiados por ELISA para anticorpos contra PspA utilizando ELISA. Os dias para a morte para os murganhos provocados são mostrados na seguinte tabela.

Sobrevivência em Murganhos CBA/M Imunes e Não Imunes Grupo Imunização Eficácia Antigénio Dose em pg Alum Dias para a Morte Valor p do tempo para a morte* Valor p de Vivos: Sobrevivên Mortos cia* #1A ρΡΑ-321-L 1,0 4x>14 0,01 4:04:0 0,01 #1B Pa-321-L 0,2 4x>14 0,01 0,01 #2A ρΡΑ-321-L 1,0 + 4x>14 0,01 4:0 0,01 #23 ρΡΑ-321-L 0,2 + 4x>14 0,01 4:0 0,01 #3A pPR-321-NL 1,0 1,1,2,2 n . s . 0:4 n.s. #3B ρΡΑ-321-NL 0,2 1, 1, 2, n. s . >15 1:3 n.s. #4A ρΡΑ-321-NL 1,0 + 4x>14 0,01 4:0 0,01 #4B ρΡΑ-321-NL 0,2 + 4x>14 0,1 4:0 0,01 #5 FL-Rx1 0,2 4x>14 0,01 4:0 0,01 #6 nenhum 0,0 + 1,1,3,6 n. s . 0:4 n.s. #7 nenhum 0,0 1, 1, 1,>15 n.s. 1:3 n.s. Nenhum 0,0 agrupado 5x1, 3, 6. > 15 1: 7 Nota: *indica versus controlos agrupados; tempo para a morte, por um teste de duas amostras unilateral; sobrevivência, por um teste Exacto de Fisher unilateral. Os cálculos foram feitos utilizando "unilateral" já que nuca se observou imunidade anti-PspA para causar susceptibilidade consistentemente. 0 número de CFU no sangue dos murganhos é mostrado na tabela abaixo. 43

Bacteriemia em Murganhos CBA/M Imunes e Não Imunes Grupo Imunização Cog xoCFU Antigénio dose em ng Alum 1 dia 2 dias 6 dias 7 dias #1A ρΡΑ-321-L 1, 0 - £1,6, 1,9, 2,1, 2,5 4x<l,6 4x<l,6 n.d. #1B ρΡΑ-321-L 0,2 - 3x<l,6, 1,7 4x<l,6 4x<l,6 n. d. #2A ρΡΑ-321-L 1, 0 + 2x<7,6, 1,7, 2,9 3x<l,6, 1,7 4x<l,6 n.d. #2B ρΡΑ-321-L 0,2 + 2x<l,6, 1,7, 1,7 4x<l,6 4x<l,6 n.d. #3A ρΡΑ-321-NL 1, 0 - <1,6, 1,7, d, d d, d, d, d d,d,d,d d,d,d,d #3B ρΡΑ-321-NL 0,2 - 2x>7,d,d <1,6, d,d,d <1, 6,d,d,d n . d-, d,d,d #4A ρΡΑ-321-NL 1-0 + 2x<l-6, 6,7, >7 3x <1,6, 1,7 4x<l,6 n.d. #4B ρΡΑ-321-NL 0,2 + <1,6, 1,7, 2,1 2-4 4x<l,6 4x<l-6 n.d. #5 FL-Rxl 0,2 - 2x<l,6, 2,6, 2,7 4x<l,6 4x<l,6 n.d. #6 nenhum 0,0 + <1,6, 4,1,>7,d <1,6, 5-1,d,d 6,1, d,d,d d,d,d,d #7 nenhum 0,0 - 1-7, >7, >7,d <1,6, d,d,d <1,6, d,d,d n-d.,d,d,d Nenhum agrupado 0,0 <1,6, 4,1, >7, >7, d 2x<l,6, 5,1, d, d, d, d, d <1,6, 6,1 d, d, d, d, d, d n.d., d d, d, d, d, d Nota: 1 colónia à concentração mais elevada de sangue calculou em 47 CFU ou Log 1,7. Deste modo, "<1,6" indica nenhuma colónia contada >107 indica que o murganho estava vivo mas o número de colónias à diluição mais elevada era demasiado elevado para se contar, "d" indica que os murganhos tinham morrido antes do ensaio.

Estes resultados indicam que a proteína recombinante não foi protectora quando injectada isolada. 0 antigénio recombinante com adjuvante alum e/ou lipidação PAM3cys foi 44 imunogénico e protector. 0 antigénio PspA nativo de comprimento completo não necessitou de um adjuvante para ser protector. Os resultados CFU indicam que murganhos protegidos por imunização eliminaram a provocação S. pneumoniae do sangue em dois dias. A análise ELISA dos soros retirados no dia 35 indicaram que existia uma boa correlação entre protecção dos murganhos de provocação S. pneumoniae e a indução de respostas de anticorpos mensuráveis. Não foram observadas respostas de anticorpos detectáveis nos soros de murganhos imunizados com o antigénio não lipidado (ρΡΑ-321-NL) em solução salina ou aos controlos negativos que não continham antigénio PspA, (como mostrado na tabela abaixo) . Foram detectadas boas respostas de anticorpos ao antigénio PspA RX1 Nativo e ao PspA recombinante quando estava lipidado com PAM3cys e/ou adsorvido a alum.

Análise ELISA de Soros de Murganho do Dia 35 Antigénio Adsorção de Dose de PspA OD Resultante c Diluição Indicada dos Antisoros* PspA Alum (pg/murganho) 600 1200 2400 4800 9600 19200 ρΡΑ-321-L Não 0,1 0, 885 0,497 0,271 0, 146 0, 075 0,039 (0, 082) (0,043) (0,025) (0,017) (0,012) (0,009) ρΡΑ-321-L Não 0,5 1, 857 1,437 1, 108 0,750 0,459 0,284 (0, 060) (0,137) (0,150) (0,139) (0, 092) (0, 009) ρΡΑ-321-L Sim 0,1 1,373 1, 048 0,745 0,490 0,288 0,171 (0,325) (0,376) (0,362) (0,304) (0,197) (0,147) ρΡΑ-321-L Sim 0,5 1,202 0,787 0,472 0,296 0,162 0,087 (0,162) (0,184) (0,187) (0,102) (0,061) (0,035) ρΡΑ-321-NL Não 0,1 0,022 0, 030 0, 014 0,007 0,006 0,001 (0,035) (0 060) (0, 024) (0,018) (0, 005) (0,001) 45

Continuação

Análise ELISA de Soros de Murganho do Dia 35 Antigénio Adsorção de Dose de PspA OD Resultante õ Diluição Indicada dos Antisoros* PspA Alum (pg/murganho) 600 1200 2400 4800 9600 19200 ρΡΑ-321-NL Não 0,5 0, 029 0,014 0,008 0,003 0,002 0,002 (0,035) (0,014) (0,007) (0,004) (0,002) (0,002) ρΡΑ-321-NL Sim 0,1 0, 822 0,481 0,278 0,154 0,082 0,042 (0,181) (0,166) (0,085) (0,051) (0,029) (0,015) ρΡΑ-321-NL Sim 0,5 1, 017 0,709 0,447 0,253 0,141 0,075 (0,139) (0,128) (0,101) (0,057) (0,034) (0,020) RX1 Nativa Não 0, 1 1,367 1,207 0,922 0,608 0,375 0,209 (0, 084) (0, 060) (0, 070) (0,077) (0,048) (0,029) Nenhum Não 0 0, 018 0,012 0, 009 0,005 0,005 0,005 (0,003) (0, 008) (0,003) (0,002) (0,002) (0,002) Nenhum Sim 0 0,013 0,009 0-004 0,004 0,001 0,000 (0,006) (0,008) (0,004) (0,003) (0,001) (0,000) *A OD é a média do resultado dos quatro animais testados e o desvio padrão está entre parênteses.

Para determinar se a protecção foi, pelo menos em parte, mediada pelas respostas de anticorpos anti-PspA, organizou-se uma experiência passiva. Imunizaram-se murganhos BALB/c com 0,5 μg de PspA recombinante lipidada, isolada ou adsorvida a alum, ou com PspA recombinante não lipidada adsorvida a alum nos dias 0 e 21; e foram sangrados no dia 35. Os antisoros foram diluídos 1:3 ou 1:15 em solução salina e 0,1 mL da diluição foram injectados i.p. em dois murganhos para cada diluição. Uma diluição 1/3 de soro de murganhos BALB/c normal foi utilizado como controlo negativo. Subsequentemente, uma hora após imunização passiva, os animais foram provocados i.v. com a 46 estirpe WU2 de S. pneumoniae (15.000 CFU). Murganhos imunizados passivamente com soros anti-PspA foram protegidos em comparação com agueles gue receberam diluições de soros de murganhos normais como mostrado na seguinte tabela.

Imunização Passiva de BALB/c a WU2 Formulação de Imunização Antigénio Alum PspA Dose de PspA (yg/animal) Diluição Soro Do Dia para a Morte Pós Provocação ρΡΑ-321-L Não 0,5 3 4, >7 15 2, 4 ρΡΑ-321-L Sim LO O 3 >7, >7 15 4, >7 PPA-321-NL Sim 0,5 3 2, 4 15 >7, >7 Nenhum Não 0 3 2, 2

Lisboa, 19 de Outubro de 2006 47

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES Molécula híbrida de ácido nucleico, compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico codificando uma sequência sinal de uma lipoproteína e uma segunda sequência de ácido nucleico codificando uma proteína madura, que é heteróloga da lipoproteína codificada pela referida primeira sequência de ácido nucleico, referida primeira sequência de ácido nucleico sendo contígua à referida segunda sequência de ácido nucleico quando a proteína madura é naturalmente lipidada, ou as referidas primeira e segunda sequências de ácido nucleico estando separadas por um codão codificando para um aminoácido quando a proteína madura não é naturalmente lipidada; em que a referida sequência sinal é a sequência sinal de uma proteína OspA de uma espécie Borrelia e em que a referida proteína madura é uma lipoproteína OspC de uma espécie Borrelia. Molécula híbrida de ácido nucleico da reivindicação 1 em que a referida primeira sequência de ácido nucleico e referida segunda sequência de ácido nucleico estão conjugadas numa relação traducional de estrutura de leitura aberta. Molécula híbrida da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a referida lipoproteína OspC é aquela de uma estirpe de B. burgdorferi. Molécula híbrida da reivindicação 3, em que a referida estirpe de B. burgdorferi é seleccionada a partir das famílias do subtipo OspC. 1
2. 5. Molécula híbrida da reivindicação 1, em que a referida proteína OspC é aquela de uma estirpe de B. burgdorferi.
3. 6. Molécula híbrida da reivindicação 5, em que a referida estirpe de B. burgdorferi é seleccionada a partir das famílias B31, ACA1 e Ip90 de estirpes.
4. 7. Vector de expressão contendo a molécula híbrida de ácido nucleico da reivindicação 1 sob controlo de um promotor para a expressão da referida proteína madura.
5. 8. Método de formação de uma proteína recombinante, que compreende: incorporação do vector de expressão da reivindicação 7 num organismo hospedeiro não animal; e realização da expressão da referida proteína madura a partir do organismo hospedeiro não animal.
6. 9. Método da reivindicação 8, em que o referido organismo hospedeiro não animal é E. coli.
7. 10. Processo para a produção de uma lipoproteína recombinante, que compreende: construção de uma molécula híbrida de ácido nucleico compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico codificando uma sequência sinal de uma lipoproteína e uma segunda sequência de ácido nucleico codificando uma proteína madura, que é heteróloga da lipoproteína codificada pela referida primeira sequência de ácido 2 nucleico, referida segunda sequência de ácido nucleico sendo contígua à referida primeira sequência; em que a referida sequência sinal é a sequência sinal de uma proteína OspA de uma espécie Borrelia e em que a referida proteína madura é uma lipoproteína OspC de uma espécie Borrelia, formação de um vector de expressão contendo a referida molécula híbrida de ácido nucleico sob controlo de um promotor para a expressão da referida proteína madura; incorporação do referido vector de expressão num organismo hospedeiro não animal; realização da expressão da referida lipoproteína recombinante pelo referido organismo hospedeiro não animal; lise das células do organismo hospedeiro não animal; tratamento das células lisadas com um tensioactivo que solubiliza selectivamente a referida lipoproteína recombinante de preferência a proteínas bacterianas e outras proteínas e que é capaz de efectuar separação de fases de uma fase detergente sob condições moderadas; realização da separação de fases numa fase detergente contendo a lipoproteína recombinante solubilizada, uma fase aquosa contendo proteínas bacterianas e outras proteínas e uma fase sólida contendo resíduo celular; 3 separação e recuperação da referida fase detergente da referida fase sólida e referida fase aquosa; colocação em contacto da referida fase detergente com uma primeira coluna cromatográfica, sob condições que resultem na ligação de proteínas com excepção da referida lipoproteína recombinante à referida coluna para proporcionar um escoamento proveniente da referida primeira coluna cromatográfica contendo a lipoproteína recombinante da referida recuperação do referido escoamento proveniente da referida primeira coluna cromatográfica; colocação em contacto do escoamento proveniente da referida primeira coluna cromatográfica, com uma segunda coluna, sob condições que resultem na ligação da lipoproteína recombinante à segunda coluna cromatográfica, de preferência a proteínas contaminantes e lipopolissacáridos que passam através da referida segunda coluna cromatográfica; eluição da referida lipoproteína recombinante da referida segunda coluna cromatográfica para proporcionar um eluente contendo a referida lipoproteína recombinante, substancialmente isenta de lipopolissacáridos e de proteínas contaminantes; e recuperação a partir do eluente.
8. 11. Processo da reivindicação 10, em que a referida primeira sequência de ácido nucleico e referida segunda sequência de 4 ácido nucleico estão conjugadas numa relação transducional de estrutura de leitura aberta.
9. 12. Processo da reivindicação 11 em que o referido tensioactivo é TRITON™ X-114.
10. 13. Processo da reivindicação 12, em que o referido tratamento de células lisadas é efectuado a uma temperatura de cerca de 0 °C a cerca de 10 °C, a mistura resultante é tratada a uma temperatura moderadamente elevada de cerca de 35 °C a cerca de 40 °C para efectuar a separação da referida fase detergente, e a referida fase detergente é separada da referida fase aquosa e da referida fase sólida por centrifugação.
11. 14. Processo da reivindicação 12 em que a referida primeira coluna cromatográfica é ainda colocada em contacto com um meio tampão a um pH para proporcionar um liquido contendo a lipoproteina recombinante OspC proveniente da primeira coluna cromatográfica enquanto as outras proteínas são retidas na primeira coluna cromatográfica, e o escoamento proveniente do contacto seguinte é recolhido e combinado com aquele proveniente da primeira etapa de contacto, na referida primeira coluna cromatográfica e o escoamento combinado é colocado em contacto com a referida segunda coluna cromatográfica.
12. 15. Processo da reivindicação 10, em que a referida lise do organismo hospedeiro não animal é efectuada por congelação e descongelação do organismo hospedeiro não animal. 5 16. Lipoproteína produzida por recombinação, isolada e purificada, produzida pelo processo da reivindicação 10, em que a lipoproteína compreende a sequência sinal de uma proteína OspA de uma espécie Borrellia e uma lipoproteína OspC madura de uma espécie Borrellia.
13. 17. Vector de fusão de lipoproteína PLF100 possuindo o N°. de Acesso referência ATCC No. 69750.
14. 18. Utilização de uma composição compreendendo a lipoproteína da reivindicação 16 na preparação de um medicamento para a profilaxia ou tratamento da doença de Lyme.
15. 19. Composição para a indução de uma resposta imunológica compreendendo a lipoproteína da reivindicação 16. Lisboa, 19 de Outubro de 2006 6