ES2271954T3 - Expresion de lipoproteinas. - Google Patents

Abstract

SE DESCUBREN Y REIVINDICAN PROTEINAS HETEROLOGAS LIPIDADAS FORMADAS DE FORMA RECOMBINANTE. EL SISTEMA DE EXPRESION PUEDE SER E. COLI. LA PROTEINA LIPIDADA HETEROLOGA POSEE UNA SECUENCIA LIDER QUE NO APARECE NATURALMENTE CON LA PORCION PROTEICA DE LA PROTEINA LIPIDADA. LA PROTEINA LIPIDADA PUEDE POSEER LA SECUENCIA LIDER DE BORRELIA OSPA. LA PORCION DE PROTEINA PUEDE SER OSPC, PSPA, UREA, UREB O UN FRAGMENTO DE LA MISMA. SE DESCUBREN Y REIVINDICAN METODOS Y COMPOSICIONES PARA FORMAR Y EMPLEAR LAS PROTEINAS.

Description

Expresión de lipoproteínas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la ingeniería genética para efectuar la expresión de lipoproteínas OspC de una especie de Borrelia de vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican las lipoproteínas. Más especialmente, la presente invención se refiere a la expresión de una lipoproteína OspC recombinante de una especie de Borrelia en la que la lipidación de la misma se produce a partir de la expresión de una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia principal de OspA de una especie de Borrelia y la proteína de la misma procede de la expresión de una segunda secuencia de ácido nucleico, siendo contiguas las primera y segunda secuencias de ácido nucleico, que no se producen conjuntamente de forma natural. La invención se refiere asimismo a proteínas OspC recombinantes lipidadas de una especie de Borrelia expresada utilizando la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia principal de OspA de una especie de Borrelia, a los métodos de preparación y utilización de las mismas composiciones de la misma y a métodos de utilización de las composiciones. La invención se refiere además a secuencias de ácido nucleico que codifican las lipoproteínas recombinantes OspC de una especie de Borrelia, a los vectores que contienen y/o expresan las secuencias, a los métodos de expresión de las lipoproteínas y a los métodos de preparación de las secuencias y vectores del ácido nucleico; a las composiciones que emplean las lipoproteínas, incluyendo las composiciones inmunógenas o de la vacuna, teniendo mejorada preferentemente la inmunogenicidad dichas composiciones; y a los métodos de utilización de dichas composiciones para provocar una respuesta inmunológica o protectora.

Antecedentes de la invención

La borrelosis de Lyme es la enfermedad transmitida por garrapatas más frecuente en los Estados Unidos así como una de las enfermedades infecciosas transmitidas por garrapatas más importante en todo el mundo. La espiroqueta Borrelia burgdorferi es el agente etiológico de la enfermedad de Lyme. La infección por B. burgdorferi produce manifestaciones locales y generalizadas. Los síntomas locales que aparecen al principio después de la infección son una lesión cutánea en el punto de la picadura de la garrapata, denominada eritema migratorio. Semanas a meses después de la infección, aparecen manifestaciones generalizadas que comprenden síntomas reumáticos, cardíacos y neurológicos. La fase local precoz de la infección por B. burgdorferi se puede tratar fácilmente con antibióticos. Sin embargo, las fases generalizadas posteriores han demostrado ser más resistentes a los antibióticos.

Se han realizado esfuerzos sustanciales dirigidos hacia el desarrollo de una vacuna para la enfermedad de Lyme. Se han utilizado dos métodos distintos para el desarrollo de la vacuna. Un método consiste en utilizar una vacuna compuesta de espiroquetas totalmente inactivadas, como describe Johnson en la patente US nº 4.721.617. Una vacuna inactivada por completo se ha demostrado que protege a los hámsters de la prueba de provocación y se ha autorizado su utilización en perros.

Debido al interés acerca de los antígenos híbridos en una preparación celular completa, la investigación de la vacuna humana se ha centrado en la identificación y desarrollo de antígenos protectores no híbridos expresados por B. burgdorferi. Varios antígenos experimentales se han identificado hasta la fecha. Mucho de este esfuerzo se ha centrado en la proteína de la superficie externa más abundante de B. burgdorferi, es decir la proteína A de la superficie externa (OspA), descrita en la solicitud de patente PCT publicada WO 92/14488, asignada al licenciatario de la misma. Se ha demostrado que varias versiones de esta proteína producen inmunidad protectora en estudios de prueba de provocación en ratones, hámster y perros. Las pruebas clínicas en el hombre han demostrado que las formulaciones de OspA son satisfactorias e inmunógenas en el hombre [Keller et al., JAMA (1994) 271:1764-1768]. De hecho, una formulación que contiene OspA recombinante lipidada descrita en la patente WO 92/14488 antes mencionada, está experimentando actualmente pruebas de seguridad/eficacia en Fase III en el hombre.

Mientras que OspA se expresa en una amplia mayoría de cepas clínicas de B. burgdorferi en América del Norte, en Europa ha surgido una imagen diferente del examen de las cepas clínicas de Borrelia. En Europa, la enfermedad de Lyme es producida por tres genoespecies de Borrelia, a saber B. burgdorferi, B. garinii y B. afzelli. En la mitad aproximadamente de las cepas europeas, OspA no es la proteína de la cepa externa más abundante. El antígeno de la superficie principal encontrado en estas espiroquetas es una segunda proteína C de la superficie externa (OspC). De hecho, se han identificado numerosas cepas clínicas europeas que no expresan OspA. La inmunización de gerbos y ratones con OspC recombinante purificada produce inmunidad protectora contra las cepas de B. burgdorferi que expresan la proteína OspC homóloga [V. Preac-Mursic et al., INFECTION (1992) 20:342-349; W. S. Probert et al., INFECTION AND IMMUNITY (1994) 62:1920-1926]. La proteína OspC está siendo considerada actualmente como un posible componente de una segunda generación de la formulación de la vacuna de Lyme.

Las proteínas recombinantes son vacunas prometedoras o candidatas para la composición inmunógena, debido a que pueden producirse con gran rendimiento y pureza y manipularse para maximizar las actividades deseables y minimizar las indeseables. Sin embargo, debido a que pueden ser poco inmunógenas, los métodos para mejorar la respuesta inmunitaria a las proteínas recombinantes son importantes en el desarrollo de vacunas o de composiciones inmunógenas.

Un estimulante inmunitario muy prometedor es el grupo lipídico N-palmitoil-S-(2RS)-2,3-bis-(palmitoiloxi)propil-cisteína, en abreviatura Pam_{3}Cys. Este grupo se encuentra en el terminal amino de las lipoproteínas bacterianas que son sintetizadas con una secuencia señal que especifica el enlace lipídico y la escisión de la peptidasa II con señal. Los péptidos sintéticos que no son inmunógenos producen una respuesta fuerte del anticuerpo cuando se acoplan por enlace covalente a Pam_{3}Cys [Bessier et al., Research Immunology (1992) 143:548-552].

Además de una respuesta del anticuerpo, se necesita con frecuencia producir una respuesta inmunitaria celular, especialmente linfocitos T citotóxicos (CTL). Los péptidos sintéticos acoplados a Pam_{3}Cys son inductores extremadamente potentes de CTL, pero no se ha descrito todavía la producción de CTL por las grandes lipoproteínas recombinantes.

La secuencia de ácido nucleico y la secuencia del aminoácido codificado por OspA son conocidas para varias cepas clínicas de B. burgdorferi y se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT publicada WO 90/04411 (Symbicom AB) para la cepa B31 de B. burgdorferi y en Johnson et al., Infect. Immun. 60:1845-1853 para una comparación de los operones ospA de tres cepas de B. burgdorferi de diferentes orígenes geográficos, a saber B31, ACA1 e
Ip90.

Como se describe en la solicitud WO 90/04411, un análisis de la secuencia de ADN para la cepa B31 demuestra que la OspA está codificada por un marco de lectura abierto de 819 nucleótidos que comienza en la posición 151 de la secuencia de ADN y termina en la posición 970 de la secuencia de ADN (véase Figura 1 en la presente memoria). Los dieciséis primeros restos de aminoácido de OspA constituyen una secuencia señal hidrófoba de OspA. El producto primario de la traducción del gen completo de B. burgdorferi contiene una secuencia señal N-terminal hidrófoba que es un sustrato para el acoplamiento de un diacil glicerol a la cadena lateral de sulfhidrilo del resto de cisteína adyacente. Después de este acoplamiento, tiene lugar la escisión mediante la peptidasa II con señal y el acoplamiento de un tercer ácido graso al terminal N. El grupo lipídico completo se denomina Pam_{3}Cys. Se ha demostrado que la lipidación de OspA es necesaria para la inmunogenicidad, ya que la lipoproteína OspA con un grupo N-terminal Pam_{3}Cys estimuló una respuesta fuerte al anticuerpo, mientras que OspA que carece del lípido unido no produjo anticuerpos detectables [Erdile et al., Infect. Immun., (1993), 61:81-90].

La solicitud de patente internacional publicada WO 91/09870 (Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-GmbH) describe la secuencia de ADN del gen ospC de la cepa Pko de B. burgdorferi y la proteína OspC (denominada pC en esta referencia) codificada por ésta de 22 kDa de peso molecular. Esta secuencia pone de manifiesto que OspC es una lipoproteína que emplea una secuencia señal similar a la utilizada para OspA. Basándose en los descubrimientos con respecto a OspA, se puede esperar que la lipidación de OspC recombinante sea útil para mejorar su inmunogenicidad; pero, como se expuso anteriormente, los solicitantes experimentaron dificultades para obtener la expresión detectable de OspC recombinante.

La patente US nº 4.624.926 de Inouye se refiere a vectores de clonación del plásmido, que incluyen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido deseado ligado a uno o más fragmentos operativos procedentes de un gen con lipoproteína de la membrana externa de una bacteria gram negativa. El polipéptido expresado por las células huésped de E. coli transformadas comprende el péptido señal de la lipoproteína, seguido de los restos de los primeros ocho aminoácidos de la lipoproteína, que a su vez van seguidos por la secuencia de aminoácidos de la proteína deseada. El péptido señal puede ser transportado a continuación de forma natural a través de la membrana citoplasmática y los primeros ocho aminoácidos de la lipoproteína pueden procesarse más a continuación e insertarse en la membrana externa de la célula de manera análoga a la inserción normal de la lipoproteína en la membrana externa. No se demostró la inmunogenicidad de las proteínas expresadas. Además, Inouye no se refirió en absoluto a la lipidación recombinante, especialmente para aumentar la inmunogenicidad.

La solicitud de patente internacional WO 91/09952 publicada describe plásmidos para expresar proteínas lipidadas. Dichos plásmidos conllevan una secuencia de ADN que incluye un péptido con señal de lipoproteína ligado a los codones por uno de los tetrapéptidos QANY o IEGR con espira \beta, que en la espira está unida a la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada. De nuevo, no se demostró la inmunogenicidad de las proteínas expresadas.

El Streptococcus pneumoniae produce infecciones más mortales en todo el mundo que casi cualquier otro patógeno. En los Estados Unidos, las muertes producidas por S. pneumoniae rivalizan en cifras con las producidas por el SIDA. Las infecciones por neumococos más mortales en los Estados Unidos, se producen en individuos de más de 65 años de edad, en los que la S. pneumoniae es la causa más frecuente de neumonía extrahospitalaria. En el mundo desarrollado, la mayoría de muertes por neumococos tiene lugar en los ancianos, o en pacientes inmunodeficientes incluyendo los que padecen anemia depranocítica. En las áreas menos desarrolladas del mundo, la infección por neumococos es una de las causas de muerte más extendidas entre los niños menores de 5 años de edad. El aumento en la frecuencia de la resistencia a múltiples antibióticos entre los neumococos y el coste prohibitivo del tratamiento farmacéutico en los países pobres hace problemática la presente expectativa de control de la enfermedad por neumococos.

El portador pasivo de los neumococos que infectan al hombre se mantiene principalmente a través del transporte nasofaríngeo humano. El hombre adquiere los neumococos en primer lugar a través de los aerosoles o por contacto directo. Los neumococos en primer lugar colonizan las vías respiratorias superiores y pueden permanecer en la mucosa nasal durante semanas o meses. Hasta el 50% o más de los niños y de los ancianos son colonizados. En muchos casos, esta colonización no produce infección visible. En algunos individuos, sin embargo, el organismo transportado en la nasofaringe puede dar lugar a sinusitis sintomática de infección del oído medio. Si los neumococos son aspirados en el interior de los pulmones, especialmente con partículas alimenticias o mocos, pueden producir neumonía, infecciones en aquellas zonas desprovistas generalmente de neumococos en la sangre donde pueden conducir a septicemia, especialmente si continúan extendiéndose en grandes cantidades desde el foco original de la infección. Los neumococos en la sangre pueden alcanzar el cerebro donde pueden producir meningitis. Aunque la meningitis neumocócica es menos frecuente que otras infecciones producidas por estas bacterias, es especialmente devastadora; un 10% de pacientes muere y más del 50% de los restantes padecen secuelas neurológicas durante la vida.

En los adultos viejos, la presente vacuna de polisacáridos capsular 23-valente es aproximadamente el 60% eficaz contra la enfermedad invasora por neumococos con cepas de tipos capsulares incluidas en la vacuna. La vacuna 23-valente no es eficaz en niños menores de 2 años debido a su incapacidad para provocar respuestas adecuadas a la mayoría de los polisacáridos. Las vacunas mejoradas que pueden proteger a niños y adultos contra las infecciones invasoras con neumocitos ayudarían a reducir algunos de los aspectos más perjudiciales de esta enfermedad.

Se ha demostrado que la proteína del PspA de la superficie celular de S. pneumoniae es un factor virulento y un antígeno protector. En la solicitud de patente internacional publicada WO 92/14488, se describen las secuencias de ADN para el gen pspA de Rx1 de S. pneumoniae, la producción de una forma truncada de PspA por ingeniería genética, y la demostración de que dicha forma truncada de PspA comunica protección en monos a la prueba de provocación con neumococos vivos.

En un esfuerzo para desarrollar una vacuna o composición inmunógena a base de PspA, PspA se ha expresado de forma recombinante en E. coli. Se ha descubierto que para expresar PspA de manera eficaz, es útil truncar la molécula PspA madura de la cepa Rx1 desde su longitud normal de 589 aminoácidos hasta la de 314 aminoácidos que comprende los aminoácidos 1 a 314. Esta zona de la molécula de PspA contiene la mayoría, si no todos, los epítopos protectores de PspA. Sin embargo, los estudios de inmunogenicidad y protección en ratones han demostrado que la forma recombinante truncada de PspA no es inmunógena en ratones naturales. Por lo tanto, sería útil mejorar la inmunogenicidad de PspA recombinante y los fragmentos de la misma.

Muchos patógenos bacterianos y víricos, tales como S. pneumoniae y Helicobacter pylori, y VIH, virus del herpes y papiloma consiguen introducirse a través de las superficies de la mucosa. El determinante principal de la inmunidad específica en las superficies de las mucosas es la IgA secretora (S-IgA) que está fisiológica y funcionalmente separada de los componentes del sistema inmunitario circulatorio. Las respuestas de S-IgA de la mucosa son generadas principalmente por el sistema inmunitario de la mucosa común (CMIS) [Mestecky, J. Clin. Immunol. (1987), 7:265-276], en el que los inmunógenos son absorbidos por estructuras linfoepiteliales denominadas en conjunto tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT). La expresión sistema inmunitario de la mucosa común se refiere al hecho de que la inmunización en cualquier punto de la mucosa puede provocar una respuesta inmunitaria en las demás zonas de la mucosa. Por lo tanto, la inmunización en el intestino puede provocar inmunidad de la mucosa en las vías respiratorias superiores y viceversa. Además, es importante indicar que la inmunización oral puede provocar una respuesta de IgG específica del antígeno en el compartimento general además de anticuerpos IgA de la mucosa [McGhee, J. R., et al., (1993), Infect. Agents and Disease 2:55-73].

La mayoría de los antígenos solubles y no replicantes son inmunógenos de la mucosa escasos, especialmente por vía bucal, probablemente debido a que están degradados por las enzimas digestivas y presentan poco o ningún tropismo para el tejido linfoide asociado al intestino (GALT). Por lo tanto, sería deseable un método para producir inmunógenos de la mucosa eficaces y vacunas y composiciones inmunógenas que los contienen.

De especial interés es H. pylori, la bacteria espiral que coloniza selectivamente las células secretoras de mucina gástrica humana y es el agente etiológico de la mayoría de los casos de gastritis no ósea en el hombre. Las investigaciones recientes indican que H. pylori, que presenta una gran actividad de ureasa, es responsable de la mayoría de las úlceras pépticas así como de muchos cánceres gástricos. Muchos estudios han sugerido que la ureasa, un complejo de los productos de los genes ureA y ureB, pueden ser un antígeno protector. Sin embargo, hasta ahora no se ha conocido cómo producir una respuesta inmunitaria suficiente de la mucosa a la ureasa.

Los antígenos tales como OspC, PspA, UreA, UreB o los fragmentos inmunógenos de los mismos, estimulan una respuesta inmunitaria cuando se administra a un huésped. Dichos antígenos, especialmente cuando se producen de manera recombinante, pueden provocar una respuesta más potente cuando se administran junto con un adyuvante. Actualmente, la alúmina es el único adyuvante autorizado para utilización humana, aunque se están probando centenares de adyuvantes experimentales tales como la toxina B del cólera. Sin embargo, estos adyuvantes presentan deficiencias. Por ejemplo, aunque la toxina B del cólera no es tóxica en el sentido de producir cólera, existe inquietud general acerca de la administración de una toxina relacionada con una enfermedad tan perjudicial como el cólera, especialmente si existe incluso la posibilidad más remota de impureza insignificante.

Por lo tanto, sería deseable aumentar la inmunogenicidad de los antígenos, mediante otros métodos aparte de la utilización de un adyuvante, especialmente en las preparaciones monovalentes; y, en las preparaciones multivalentes, tener capacidad para emplear dichos medios para aumentar la inmunogenicidad con un adyuvante, a fin de obtener una respuesta inmunológica aún mayor.

\newpage

En cuanto a la expresión de las proteínas recombinantes, es de esperar que el experto en la materia esté familiarizado con los diversos sistemas de vector disponibles para dicha expresión, p. ej., bacterias tales como E. coli y similares.

Se considera que hasta ahora la técnica no ha dado a conocer o sugerido la expresión de una lipoproteína recombinante con OspC de la especie de Borrelia en la que su lipidación procede de la escisión de una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia principal de OspA de la especie de Borrelia, su proteína procede de la expresión de una segunda secuencia de ácidos nucleicos, siendo la primera y segunda secuencias, que no se producen conjuntamente de forma natural, órganos que contienen dichas secuencias; o vectores que contienen dichas secuencias; o métodos para dicha expresión; o dichas lipoproteínas recombinantes; o composiciones que contienen dichas lipoproteínas recombinantes; o métodos para la utilización de dichas composiciones; o métodos para potenciar la inmunogenicidad de una proteína por lipidación de una secuencia de ácido nucleico no natural con la secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento de proteína de la lipoproteína.

Objetivos y sumario de la invención

Un objetivo de la invención consiste en proporcionar una lipoproteína OspC recombinante de la especie de Borrelia en la que la lipidación de la misma procede de la expresión de una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia principal de OspA de la especie de Borrelia y de la fracción proteica de la misma procede de una segunda secuencia de ácido nucleico y la primera y segunda secuencias no se producen a la vez de forma natural.

Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar la expresión de genes y/o secuencias que codifican dicha lipoproteína recombinante, vectores para éstas y métodos para efectuar dicha expresión.

Además otro objetivo de la invención consiste en proporcionar composiciones inmunógenas, incluyendo vacunas, que contienen la lipoproteína OspC recombinante de una especie de Borrelia y/o vectores para la expresión de la misma.

Se ha descubierto sorprendentemente que una proteína OspC lipidada recombinante inmunógena de una especie de Borrelia, puede expresarse en un sistema de vector, preferentemente E. coli, sin la toxicidad evidente del sistema de vector cuando la secuencia señal de la lipoproteína natural que codifica la zona está presente. Este resultado se ha conseguido sustituyendo la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia principal natural o señal de una lipoproteína con la secuencia de nucleótidos que codifica una lipoproteína principal o señal de OspA de una especie de Borrelia. Se ha demostrado que estas proteínas recombinantes lipidadas provocan una respuesta inmunitaria, que incluye una respuesta inmunitaria de la mucosa.

Es sorprendente que la fusión del ADN que codifica una secuencia principal de lipoproteína de OspA de una especie de Borrelia directamente para el ADN que codifica una proteína OspC de una especie de Borrelia, sin ninguna intervención de secuencias de nucleótido, pueda conducir a la expresión de una lipoproteína recombinante inmunógena en cantidades significativas sin la toxicidad evidente con la secuencia principal natural, porque los intentos anteriores para expresar las proteínas recombinantes lipidadas no han tenido éxito. Por ejemplo, Fuchs et al. describe que la OspC formada de manera recombinante (denominada pC en esta referencia) con su proteína principal natural se expresó sólo débilmente en E. coli [Mol. Microbiology (1992) 6 (4):503-509]. Los solicitantes, además de Fuchs, intentaron obtener OspC recombinante lipidada mediante la expresión de la secuencia de codificación de OspC en E. coli utilizando el sistema de vector pET descrito en la patente WO 92/14488 mencionada anteriormente para la expresión de OspA y utilizando los sistemas del plásmido pDS12 descritos. Sin embargo, OspC apenas fue detectable por inmunotransferencia de los extractos celulares utilizando estos sistemas para expresar a OspC.

Además, como se expuso anteriormente, se creía que una secuencia adicional de nucleótidos, preferentemente la que codifica una secuencia de péptidos que forma una espira \beta, era necesaria para la expresión de las lipoproteínas recombinantes, y la inmunogenicidad de las lipoproteínas recombinantes expresadas anteriormente no se había demostrado.

El procedimiento de la presente invención, por consiguiente, permite obtener grandes cantidades de proteínas OspC inmunógenas lipidadas, recombinantes puras de una especie de Borrelia, que no ha sido posible hasta ahora. Las proteínas lipidadas formadas de forma recombinante proporcionadas en la presente memoria son significativamente más inmunógenas que un análogo recombinante no lipidado.

Se cree que la presente invención representa el primer caso de realización de la expresión de una proteína OspC heteróloga lipidada de una especie de Borrelia utilizando la secuencia líder de OspA, no natural. La invención, por consiguiente, incluye la utilización de una secuencia principal de OspA, no natural para expresar las proteínas OspC heterólogas para la secuencia principal.

Por lo tanto, en una forma de realización, la presente invención proporciona una molécula híbrida de ácido nucleico aislada, preferentemente ADN, que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia señal de una proteína OspA de la especia Borrelia, acoplada en relación de traducción del marco de lectura abierto con una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una lipoproteína OspC madura de una especie Borrelia heteróloga a la secuencia señal.

Más preferentemente, la primera y segunda secuencias son contiguas cuando la proteína madura está lipidada de forma natural y separada mediante un codón que codifica un aminoácido, preferentemente cisteína, cuando la proteína madura no está lipidada de forma natural.

La lipoproteína madura OspC codificada por la segunda secuencia de ácido nucleico es preferentemente una lipoproteína antigénica, y más preferentemente una cepa de B. burgdorferi, más preferentemente una cepa de B. burgdorferi seleccionada de entre las familias del subtipo OspC.

El gen híbrido proporcionado en la presente memoria puede ser montado en un vector de expresión, preferentemente bajo el control de un activador adecuado para la expresión de la lipoproteína madura OspC de una especie de Borrelia, según un aspecto adicional de la invención, que, en un organismo huésped adecuado, tal como E. coli, produce la traducción inicial de una molécula híbrida que comprende una secuencia principal de OspA de una especie de Borrelia y la proteína heteróloga OspC deseada en forma lipidada, seguido de la escisión de la molécula híbrida por la peptidasa II señal y el acoplamiento de grupos lipídicos al nuevo terminal de la proteína, con lo cual la lipoproteína OspC madura se expresa en el organismo del huésped.

La presente invención proporciona, por primera vez, una molécula híbrida de ácido nucleico que permite la producción de la proteína OspC recombinante lipidada de una especie de Borrelia. Por consiguiente, en un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una molécula híbrida de ácido nucleico, que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una lipoproteína OspC de una especie de Borrelia, más preferentemente una cepa de B. burgdorferi, aún más preferentemente una cepa de B. burgdorferi seleccionada de entre las familias del subtipo OspC; y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia señal de OspA de una proteína expresada de una especie de Borrelia acoplada en la relación de traducción del marco de lectura abierto con dicha primera secuencia de ácido nucleico.

Tal como se describió anteriormente, el gen híbrido puede ensamblarse en un vector de expresión bajo el control de un activador adecuado para la expresión de la lipoproteína OspC, que, en un organismo huésped adecuado, tal como E. coli, produce la expresión de la lipoproteína OspC en el organismo del huésped.

Se ha descubierto también sorprendentemente que puede obtenerse aumento de inmunogenicidad mediante una lipoproteína OspC recombinante de una especie de Borrelia cuando la lipoproteína OspC es expresada por un gen híbrido o mixto que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia principal o señal de OspA de una especie de Borrelia y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento de proteína de la lipoproteína OspC, en la que la primera y segunda secuencias no son a la vez naturales.

Por consiguiente la presente invención proporciona también una lipoproteína OspC recombinante de una especie de Borrelia expresada por un gen híbrido o mixto que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia principal o señal de OspA de una especie de Borrelia contigua a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de proteína de la lipoproteína OspC y la primera y segunda secuencias no son a la vez naturales. La segunda secuencia puede codificar un antígeno de OspC. La primera y segunda secuencias pueden estar presentes en un gen; y el gen y/o la primera y segunda secuencias pueden estar en un vector adecuado para su expresión.

El vector puede ser un ácido nucleico en forma de, p. ej., plásmidos, bacteriófagos y ADN integrado, en una bacteria, más preferentemente el utilizado para la expresión, p. ej. E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, etc., o el utilizado como vector vivo, p. ej. Lactobacillus, Mycobacterium, Salmonella, Streptococcus, etc. Cuando se utiliza un huésped de expresión, la lipoproteína recombinante puede obtenerse recogiendo el producto expresado in vitro; p. ej., aislando la lipoproteína recombinante de un extracto bacteriano. El gen puede estar preferentemente bajo el control de un activador adecuado y por consiguiente unido funcionalmente al mismo; y el activador puede ser endógeno al vector, o estar insertado en el vector con el gen.

La invención proporciona además vectores que contienen el ácido nucleico que codifica la lipoproteína OspC recombinante y los métodos para obtener las lipoproteínas OspC recombinantes y los métodos para la preparación del vector.

Como se mencionó, la lipoproteína recombinante puede haber aumentado la inmunogenicidad. De este modo, las formas de realización adicionales de la invención proporcionan inmunogenicidad o composiciones de la vacuna para provocar una respuesta inmunológica, que comprende la lipoproteína OspC recombinante aislada, o un vector adecuado para la expresión in vivo de la misma en un huésped no animal, o ambos, y un portador adecuado, y la utilización de dichas composiciones en la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de la enfermedad de Lyme.

Los documentos citados en esta exposición, incluyendo las solicitudes mencionadas anteriormente, proporcionan ingredientes adicionales típicos para dichas composiciones, de modo que el experto en la materia, a partir de esta descripción, no requiere experimentación indebida para formular una composición. Dichas composiciones preferentemente contendrían una cantidad de lipoproteína OspC recombinante de una especie de Borrelia o del vector que expresa a la misma, suficiente para provocar una respuesta adecuada. Dicha cantidad de lipoproteína o vector OspC recombinante puede estar basada en cantidades conocidas de antígenos administrados. Por ejemplo, si existe una cantidad conocida para la administración de un antígeno correspondiente a la segunda secuencia expresada por la lipoproteína OspC recombinante de la invención, la cantidad de lipoproteína recombinante puede escalonarse hasta aproximadamente esta cantidad conocida, y la cantidad de vector puede ser tal que produzca un número suficiente de unidades formadoras de colonias (cfu) a fin de producir la expresión in vivo en un huésped no animal de la lipoproteína OspC recombinante en aproximadamente esta cantidad conocida. Asimismo, la cantidad de lipoproteína recombinante puede estar basada en las cantidades de antígeno administradas a los animales en los ejemplos siguientes y en los documentos citados en la presente memoria, sin experimentación indebida.

La presente invención comprende también, en otros aspectos, procedimientos para la producción de una lipoproteína OspC recombinante de una especie de Borrelia, mediante el montaje de un vector de expresión, la expresión de la lipoproteína de un organismo huésped no animal que contiene el vector de expresión y opcionalmente el aislamiento y/o la purificación de la lipoproteína OspC expresada. El aislamiento y la purificación pueden ser de manera que se obtenga la lipoproteína recombinante exenta de impurezas tales como lipopolisacáridos y otras proteínas bacterianas. La presente invención comprende además composiciones inmunógenas para provocar una respuesta inmunológica, tales como vacunas, que contienen la lipoproteína recombinante, así como la utilización de dichas composiciones para la preparación de un medicamento destinado a la profilaxis o el tratamiento de la enfermedad de Lyme.

Breve descripción de los dibujos

En la descripción detallada siguiente, se hace referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 es una representación esquemática de un procedimiento para el montaje del plásmido pLF100;

la Figura 2 es una representación esquemática de un procedimiento para el montaje de vectores del plásmido pPko9a (cepa Pko) y pB319a (cepa B31);

la Figura 3 es una representación esquemática del procedimiento empleado para el aislamiento y purificación de la OspC lipidada;

la Figura 4 es una representación esquemática del procedimiento empleado para el aislamiento y purificación de la OspC no lipidada, a título comparativo;

la Figura 5 presenta un análisis SDS-PAGE de OspC lipidada producida en la presente memoria en varias etapas del procedimiento de purificación ilustrado esquemáticamente en la Figura 3;

la Figura 6 presenta un análisis SDS-PAGE de OspC no lipidada producida en la presente memoria en varias etapas del procedimiento de purificación descrito en el documento WO 91/09870;

la Figura 7 es una representación gráfica de la respuesta inmunitaria de ratones inmunizados con formulaciones de OspC que contienen antígeno procedente de dos subtipos de OspC analizados en un ensayo ELISA anti-OspC;

la Figura 8 es una representación gráfica de la respuesta inmunitaria de ratones inmunizados con una formulación de dos subtipos de OspC que contiene adyuvante de alúmina analizada en un ensayo ELISA anti-OspC;

la Figura 9 es una representación esquemática de un procedimiento para el montaje del vector del plásmido pPA321-L;

la Figura 10 es una representación esquemática de un procedimiento para el montaje del vector del plásmido pPA321-NL;

la Figura 11 es una representación esquemática de un procedimiento empleado para el aislamiento y purificación de PspA lipidada;

la Figura 12 es una representación esquemática del procedimiento empleado para el aislamiento y purificación de PspA no lipidada, a título comparativo;

la Figura 13 presenta un análisis SDS-PAGE de PspA lipidada producida en la presente memoria en varias etapas del procedimiento de expresión y fraccionamiento de la célula huésped ilustrado esquemáticamente en la Figura 11;

la Figura 14 presenta un análisis SDS-PAGE de PspA no lipidada producida en la presente memoria en varias etapas del procedimiento de expresión y fraccionamiento de la célula huésped ilustrado esquemáticamente en la Figura 12; y

la Figura 15 presenta un análisis SDS-PAGE de los resultados de la cromatografía en columna de PspA ilustrados esquemáticamente en las Figuras 11 y 12.

\newpage

Descripción detallada de la invención

Como se indicó anteriormente, la presente invención se refiere a la utilización de una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia señal de OspA para expresar una proteína OspC lipidada de una especie de Borrelia heteróloga a la proteína OspA, y a la utilización de una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia señal de OspA de una especie de Borrelia de una proteína heteróloga a la proteína OspC que debe expresarse, para expresar la proteína OspC lipidada de una especie de Borrelia.

La secuencia principal de aminoácidos y la secuencia de ADN que codifica la cepa ACA de B. burgdorferi son las siguientes:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 M K K Y L L G I G L I L A L I A C \+ (SEC. ID nº: 1)\cr  ATG AAA
AAA TAT TTA TTG GGA ATA GGT CTA ATA TTA GCC TTA ATA GCA TGC \+ (SEC.
ID nº:
2)\cr}

Las secuencias correspondientes de aminoácido principales y las secuencias de ADN que codifican la OspA de otras cepas de B. burgdorferi son conocidas en la materia y pueden emplearse en la presente invención a partir de esta exposición, sin experimentación indebida.

Se monta una molécula del gen híbrido que comprende la secuencia de codificación principal de OspA y el gen que codifica la proteína heteróloga que debe expresarse, preferentemente el gen ospC o pspA, dispuestos en relación de traducción del marco de lectura con el fragmento del gen ospA.

Para la producción de la proteína lipidada, puede incorporarse la molécula apropiada del gen híbrido en un vector de expresión adecuado y el plásmido resultante incorporarse en una cepa de expresión de E. coli u otro organismo huésped adecuado. El vector puede también ser un ADN de bacteriófago o integrado.

La proteína lipidada es expresada por las células durante el crecimiento del organismo huésped. La proteína lipidada puede recuperarse del organismo huésped en forma purificada por cualquier procedimiento conveniente que separe la proteína lipidada en forma no desnaturalizada. En la Figura 3 se presenta un esquema de un procedimiento según este aspecto de la invención.

Después del crecimiento celular y de la inducción de la proteína, las células se someten a lisis por congelación-descongelación y a tratamiento de ADNasa I. El lisado se trata con un detergente que es selectivo para la solubilización de la proteína lipidada recombinante, con preferencia a las demás proteínas bacterianas en el lisado. Aunque la presente invención utiliza preferentemente éter terc-octil-fenílico de polietilenglicol de fórmula t-Oct-C_{6}H_{4}(OCH_{2}CH_{2})_{x}OH en la que x=7-8 como detergente (disponible en el mercado como TRITON^{TM} X-114 en lo sucesivo denominado de este modo), pueden utilizarse otros materiales que presentan una solubilidad selectiva similar para la proteína de lipidación así como la propiedad de separación de fases en condiciones suaves, como se expone a continuación.

Tras la adición del TRITON^{TM} X-114, se calienta la mezcla para una elevación de temperatura suave preferentemente de aproximadamente 35ºC a 40ºC, en cuyo momento la solución se vuelve turbia ya que tiene lugar la separación de fases. El procedimiento de purificación para dicha separación de fases debería tener lugar en condiciones que evitasen cualquier desnaturalización substancial de cualquier otra alteración substancial de las propiedades inmunológicas de la lipoproteína recombinante.

La centrifugación de la mezcla turbia produce la separación de la mezcla en tres fases, a saber una fase de detergente que contiene aproximadamente 50% o más de la proteína lipidada recombinante y una pequeña cantidad (aproximadamente 5% en peso) de otras proteínas, una fase acuosa que contiene el equilibrio de las demás proteínas y un aglomerado sólido del residuo celular. La fase de detergente se separa de la fase acuosa y del conglomerado sólido para el tratamiento ulterior.

La purificación final de la proteína se efectúa preferentemente mediante el tratamiento de la fase detergente para proporcionar una proteína lipidada recombinante con una pureza de por lo menos aproximadamente el 80% en peso, y que está sustancialmente exenta de otros contaminantes, tales como proteínas bacterianas y lipopolisacáridos (LPS) y que tiene concentraciones de endotoxina compatibles con la administración humana.

Dicha purificación se efectúa de manera conveniente por cromatografía en columna. Dicha purificación cromatográfica puede incluir una primera purificación cromatográfica que utiliza una primera columna cromatográfica que tiene el pH, fuerza iónica e hidrofobia para unir proteínas bacterianas, pero no a la proteína lipidada recombinante.

Dicha primera purificación cromatográfica puede efectuarse cargando la fase detergente en la primera columna cromatográfica y se recoge el flujo a través, que contiene la proteína lipidada purificada. La fracción unida contiene sustancialmente todas las impurezas de las proteínas bacterianas de la fase detergente. El medio cromatográfico utilizado para dicha primera operación de purificación puede ser una columna DEAE-Sephacel o una columna DEAE-Sepharose.

\newpage

El flujo a través de la primera operación de purificación cromatográfica puede someterse a purificación ulterior en una segunda columna cromatográfica. El flujo a través se carga en la columna que tiene el pH, la fuerza iónica y la hidrofobia que se unirá selectivamente a la proteína recombinante lipidada en la segunda columna cromatográfica, mientras que los contaminantes bacterianos y LPS pasan a través de la columna. El medio cromatográfico para la segunda columna cromatográfica puede ser S-Sepharose.

Preferentemente la lipoproteína OspC recombinante de una especie de Borrelia se purifica hasta el 80% de pureza o más del 80% de pureza, p. ej., del 85 al 90% o incluso del 90 al 95% o más de 95% de pureza. El material proteico lipidado puede formularse a continuación en composiciones inmunógenas, preferentemente vacunas.

La vacuna o composición inmunógena provoca una respuesta inmunitaria en un paciente huésped que produce una respuesta inmunológica, tal como los anticuerpos que pueden ser opsonizantes o bactericidas. Un paciente inmunizado con una lipoproteína recombinante de la invención se somete a continuación a la prueba de provocación, dicha respuesta inmunológica puede inactivar el organismo a la prueba de provocación. Además, los anticuerpos opsonizantes o bactericidas pueden también proporcionar protección por mecanismos alternativos.

Las composiciones inmunógenas que incluyen vacunas pueden prepararse como inyectables, como soluciones o emulsiones líquidas o como formulaciones para administración oral, nasal u otros orificios, p. ej., vaginal, rectal, etc. Las formulaciones orales pueden ser soluciones líquidas, emulsiones y similares, p. ej., elixires o preparaciones sólidas, p. ej., comprimidos, comprimidos oblongos, cápsulas, píldoras, cápsulas rellenas de líquido, gelatina y similares. Las preparaciones nasales pueden ser líquidas y pueden administrarse por aerosol, dispensadores de atomización a presión o de atomización con bomba. Los documentos citados en la presente memoria proporcionan tipos de ejemplos de formulación e ingredientes para los mismos, incluyendo las aplicaciones citadas anteriormente.

Los inmunógenos pueden mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables que sean compatibles con los inmunógenos. Dichos excipientes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. Las composiciones inmunógenas y las vacunas pueden contener además sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, o adyuvantes para aumentar la eficacia de los mismos. Las composiciones inmunógenas y las vacunas pueden administrarse por vía parenteral, por inyección subcutánea o intramuscular. Las preparaciones inmunógenas y las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de la dosis, y en una cantidad tal que sean terapéuticamente eficaces, inmunógenas o protectoras. La cantidad que debe administrarse depende del paciente que ha de ser tratado, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos y, si es necesario, para producir una respuesta inmunitaria mediada por células. Las cantidades exactas de ingrediente activo requeridas que deben administrarse dependen del criterio del médico general, teniendo en cuenta factores como la edad, el peso, el sexo, la enfermedad del huésped o paciente al que se ha de administrar. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados pueden ser determinados fácilmente por un experto en la materia y pueden ser del orden de microgramos de inmunógenos. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida de administraciones posteriores. La dosis puede también depender de la vía de administración y variará según la talla del huésped.

La concentración de los inmunógenos en una composición que comprende la lipoproteína OspC según la invención para provocar una respuesta inmunológica es en general aproximadamente de 1 a aproximadamente 95%. Una vacuna o composición inmunógena que contiene material antigénico de un patógeno solamente es una vacuna monovalente. Las vacunas o composiciones que comprenden la lipoproteína OspC de la presente invención para provocar una respuesta inmunológica, que son multivalentes o que contienen material antigénico de varios patógenos (también conocidos como vacunas combinadas o composiciones inmunógenas combinadas) pertenecen también a la presente invención. Dichas vacunas combinadas o composiciones inmunógenas contienen, por ejemplo, material de varios patógenos o de varias cepas del mismo patógeno o de combinaciones de varios patógenos.

Se han utilizado agentes o adyuvantes inmunoestimulantes durante muchos años para mejorar las respuestas inmunitarias del huésped a, por ejemplo, vacunas o composiciones inmunógenas. Los adyuvantes intrínsecos, tales como los lipopolisacáridos, normalmente son los componentes de las bacterias destruidas o atenuadas utilizadas como vacunas o composiciones inmunógenas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que están unidos típicamente por enlaces no covalentes a antígenos y se formulan para aumentar las respuestas inmunitarias del huésped. Algunos de estos adyuvantes son tóxicos, sin embargo, y pueden producir efectos secundarios indeseables, haciéndoles inadecuados para su utilización en el hombre y en muchos animales. De hecho, solamente la alúmina se utiliza de forma rutinaria como adyuvante en el hombre y en vacunas veterinarias.

En vista de las dificultades relacionadas con la utilización de adyuvantes, una ventaja de la presente invención consiste por lo tanto en que las proteínas OspC recombinantes lipidadas de una especie de Borrelia son las formas más inmunógenas, y son susceptibles de provocar respuestas inmunitarias tanto sin adyuvante como con alúmina.

Los ejemplos siguientes ilustran pero no limitan el alcance de la invención expuesta en la presente memoria.

\newpage

Ejemplos

Ejemplo 1

Construcción de un vector que contiene un gen que codifica la secuencia principal de OspA

Se digirió el plásmido pBluescript KS+ (Stratagene) con XbaI y BamHI y se ligaron con un fragmento de ADN de XbaI-BamHI de 900 bp que contenía la zona de codificación completa del gen ospA de la cepa ACA1 de B. burgdorferi, para formar un vector pLF100 de fusión de lipoproteína. Este procedimiento se presenta esquemáticamente en la
Figura 1.

El vector pLF100, se ha depositado en la American Type Culture Collection 10801 University Blvd., Mansas, Va. 20110-2209 el 2 de febrero de 1995 con el nº de registro 69750. Este depósito se preparó bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest.

Ejemplo 2

Construcción de un vector de expresión que contiene un gen ospA-ospC híbrido

Se utilizaron cebadores de oligonucleótido diseñados específicamente en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para ampliar la fracción del gen ospC corriente abajo del codón de codificación de la cisteína que termina la secuencia de codificación de reconocimiento del péptido señal en el extremo C-terminal de la zona de codificación de las cepas Pko y B31 de B. burgdorferi.

El cebador con extremo en 5' presentaba las secuencias nucleotídicas respectivamente para las cepas Pko y B31:

	5'-GGC GCG CAT GCA ATA ATT CAG GGA AAG G-3' (Pko)	(SEC. ID nº: 3)
	5'-GGC GCG CAT GCA ATA ATT CAG GGA AAG A-3' (B31)	(SEC. ID nº: 4)

mientras que el cebador con extremo 3' presentaba la secuencia nucleotídica:

5'-CGC GGA TCC TTA AGG TTT TTT TGG-3' (B31 y Pko)

(SEC. ID nº: 5)

La ampliación por PCR se efectuó en un DNA Termal Cycler (Perkins-Elmer Cetus) durante 25 ciclos con desnaturalización durante 30 s a 94ºC, hibridación a 37ºC durante 1 minuto y prolongación a 72ºC durante 1 minuto. Se efectuó una prolongación final a 72ºC, durante 5 minutos a la terminación de los ciclos. Se purificó el producto utilizando un kit Gene Clean II (B10 101) y se digirió el material purificado con SphI y BamHI. Este procedimiento introdujo una mutación imperceptible en el gen ospC de Pko que cambia el codón para el aminoácido 60 de la proteína madura de ATT a ATA.

Los materiales producidos por las cepas Pko y B31 de B. burgdorferi se manipularon idénticamente desde este punto y por consiguiente solamente se describe la manipulación adicional del material OspC de la cepa Pko.

Se digirió el plásmido pLF100 (Ejemplo 1) con SphI y BamHI y la secuencia de Pko ampliada se ligó al plásmido para formar el plásmido pPko 100 (pB31 100 para la cepa B31) que contenía un gen ospA/ospC híbrido. El gen híbrido se escindió del plásmido pPko 100 por digestión con NdeI y BamHI y se clonó en las secuencias NdeI y BamHI del vector pET9 del plásmido para provocar el gen híbrido ospA/ospC bajo el control de un activador T7 y las señales de iniciación de la traducción eficaces del bacteriófago T7, como se aprecia en la Figura 2. El plásmido resultante se denomina pPko9a (pB319a para la cepa B31).

Ejemplo 3

Expresión y purificación de OspC lipidada

Se utilizó el plásmido pPko9a, preparado como se describe en el Ejemplo 2, para transformar las cepas BL21 (DE3)(pLysS) y HMS174(DE3)(pLysS) de E. coli. Se inoculó E. coli transformada en medio LB con 30 \mug/ml de sulfato de kanamicina y 25 \mug/ml de cloranfenicol a un ritmo de 12 ml de cultivo por cada litro preparado. El cultivo se desarrolló toda la noche en un agitador con matraz a 37ºC.

A la mañana siguiente, se transfirieron 10 ml del medio de cultivo de toda la noche a 1 l de medio LB que contenía 30 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se desarrolló el cultivo en un matraz con agitador a aproximadamente 37ºC a un nivel de DO_{600}=0,6-1,0 (si bien puede efectuarse el cultivo hasta DO_{600}=1,5) en aproximadamente 3 a 5 horas.

Al medio de cultivo se añadió isopropiltiogalactósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,5 mM y el medio de cultivo se desarrolló durante dos horas más a aproximadamente 30ºC. Se recogieron los cultivos y se analizaron las muestras en geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie (Figura 5). El medio de cultivo se enfrió a aproximadamente 4ºC y se centrifugó a 10.000\timesG durante 10 minutos. Se descartó el sobrenadante mientras se recogía el sedimento celular. Se recuperó la OspC lipidada purificada del sedimento efectuando el procedimiento mostrado esquemáticamente en la Figura 3 y descrito a continuación.

El sedimento celular en primer lugar se volvió a poner en suspensión en 1/10 del volumen de PBS. La suspensión celular se congeló y se almacenó a -20ºC o por debajo, si se desea. Después de la congelación de la suspensión celular, las células se descongelaron a temperatura ambiente (aproximadamente 20º a 25ºC) lo que produce que las células se lisen. Se añadió ADNasa I al material descongelado a una concentración de 1 \mug/ml y se incubó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente, lo que produjo una disminución de la viscosidad del material.

El material incubado se enfrió en hielo a una temperatura inferior a 10ºC y se añadió TRITON^{TM} x-114 como solución madre al 10% en peso, hasta una concentración final de 0,3 a 1% en peso. La mezcla se mantuvo en hielo durante 20 minutos. La mezcla enfriada se calentó a continuación a aproximadamente 37ºC y se mantuvo a esta temperatura durante 10 minutos.

La solución se volvió muy turbia a medida que se producía la separación de fases. La mezcla turbia se centrifugó a continuación a aproximadamente 20ºC durante 10 minutos a 12.000\timesG, lo que produjo la separación de la mezcla en una fase detergente inferior, una fase acuosa transparente superior y un sedimento sólido. El análisis de las fases fraccionadas por SDS-PAGE (Figura 5) puso de manifiesto que la OspC se dividió en la fase detergente, demostrando que está en forma lipidada. La fase detergente se separó de las otras dos fases y se enfrió a 4ºC, sin alterar el sedimento.

El tampón A, es decir Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 2 mM y NaCl 10 mM y éter terc-octilfenílico de polietilenglicol al 0,3% de fórmula t-Oct-C_{6}-H_{4}-(OCH_{2}CH_{2})_{x}OH en la que x=9-10 como detergente (disponible en el mercado como TRITON^{TM} X-100 y denominado de esta forma en lo sucesivo) se añadió a la fase detergente enfriada para volver a reconstituir 1/3 del volumen original. La solución resultante puede congelarse y almacenarse para el tratamiento posterior como se describe a continuación o puede someterse inmediatamente a dicho tratamiento.

Se preparó una columna CL-6B de DEAE-Sepharose en un volumen de 1 ml/10 ml de fase detergente y se lavó con 2 volúmenes de tampón C, es decir Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 2 mM, NaCl 1 M, TRITON^{TM} X-100 al 0,3% en peso y a continuación con 4 volúmenes de tampón B, es decir Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 2 mM, TRITON^{TM} X-100 al 0,3%.

La fase detergente se cargó a continuación en la columna y se recogió el flujo a través que contenía la OspC. Se lavó la columna con 2 volúmenes de tampón B y se recogió de nuevo el flujo a través. El flujo a través combinado era una solución acuosa de OspC purificado, que puede congelarse para su almacenamiento.

La columna puede ser liberada de las proteínas bacterianas para la reutilización eluyendo con 4 volúmenes de tampón C.

La purificación adicional y final del flujo a través de la columna DEAE-Sepharose se efectuó por cromatografía en flujo rápido de S-Sepharose. El flujo a través de la columna DEAE-Sepharose se acidificó en primer lugar a pH 4,3 mediante la adición de ácido cítrico 1 M y el material acidificado se cargó en la columna S-Sepharose. La columna Fast Flow S-Sepharose se había lavado con 3 volúmenes de columna de tampón A y a continuación con 5 volúmenes de columna de tampón A preparados a pH 4,3. La OspC se une a la columna. La columna cargada se lavó con 4 volúmenes de columna de tampón A a pH 4,3 seguido de 4 volúmenes de columna de tampón A a pH 5,5.

La OspC muy purificada se eluyó de la columna utilizando tampón A, ajustado a pH 6,0 con HCl 1 N. Un procedimiento esquemático de purificación descrito en este Ejemplo se presenta en la Figura 3.

La solución acuosa de la OspC lipidada muy purificada obtenida por los procedimientos de cromatografía se analizó mediante geles teñidos con Coomassie (Figura 5) y se confirmó que era OspC en forma muy purificada mediante análisis de inmunotransferencia utilizando antisuero policlonal anti-OspC de conejo. Se estimó que la pureza del producto era mayor del 80%.

Mediante este procedimiento, se recuperaron aproximadamente 2 a 4 mg de OspC pura de 1 litro de cultivo del huésped BL21 y se recuperó aproximadamente 1 a 2 mg de OspC puro de 1 litro de cultivo del huésped HMS 174.

Ejemplo 4

Expresión y purificación de OspC no lipidada

Se prepararon transformantes JM 109 de E. coli que contienen el vector de plásmido que contiene el fragmento del gen cromosómico que codifica la OspC no lipidada y se cultivaron como se describe en la patente WO 91/09870. Se recogieron los cultivos, se centrifugó el medio de cultivo a 10.000\timesG durante 10 minutos a 4ºC, se descartó el sobrenadante y se recogió el sedimento.

El sedimento celular se volvió a poner en suspensión en primer lugar en tampón A de lisis, es decir Tris-HCl 50 nM pH 8,0, EDTA 2 mM, DTT 0,1 mM, glicerol al 5% y 0,4 mg/ml de lisozima, y se agitó la suspensión durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se añadió TRITON^{TM} X-100 a continuación a la suspensión celular hasta una concentración de 1% en peso, se añadió ADNasa I hasta una concentración de 1 \mug/ml y se agitó la suspensión a temperatura ambiente durante 20 minutos más para efectuar la lisis celular, a continuación se añadió cloruro sódico a la suspensión celular hasta una concentración de 1 M y se agitó otra vez la suspensión a 4ºC durante 20 minutos más. Se centrifugó a continuación la suspensión a 20.000\timesG durante 30 minutos, el sobrenadante resultante se separó del sedimento y se descartó el sedimento.

Se dializó el sobrenadante separado frente a un tampón que comprende Tris 50 mM pH 8,2, EDTA 2 mM. A continuación se cargó el sobrenadante en una columna CL-6B con DEAE-Sepharose y se recogió la OspC no lipidada en la columna de flujo a través. El flujo a través se dializó frente a un tampón de fosfato 0,1 M, pH 6,0.

El flujo a través dializado se unió a una columna de flujo rápido S-Sepharose equilibrada con tampón de fosfato 0,1 M, pH 6,0. La OspC no lipidada purificada se eluyó de la columna S-Sepharose utilizando el tampón de diálisis con NaCl 0,15 M añadido. Un esquema del procedimiento de purificación se presenta en la Figura 4.

La solución acuosa de OspC no lipidada muy purificada se analizó mediante los geles teñidos con Coomassie (Figura 6). La pureza del producto se estimó que era superior al 80%.

Ejemplo 5

Inmunogenicidad de OspC lipidada recombinante

Se preparó OspC recombinante lipidada purificada como se describe en el Ejemplo 3, se ensayó la inmunogenicidad en ratones y se comparó con la de OspC no lipidada preparada como se describe en el Ejemplo 4. Para este estudio, se inmunizaron ratones C3H/He hembra de 4 a 8 semanas el día 0 y se les administró una dosis de refuerzo los días 21 y 42. Se administró a cada uno de los animales 1 \mug de OspC expresada en B31 y los genes Pko por dosis. Se ensayaron tanto las formas lipidadas como las no lipidadas del antígeno. Se ensayaron las formulaciones con y sin alúmina como adyuvante.

Se extrajo sangre a los animales representativos los días 21, 42, 63 y 91. Se realizó el análisis ELISA de estos sueros utilizando OspC purificada no lipidada como antígeno de recubrimiento.

Los resultados del ensayo de los ratones inmunizados con antígeno sin adyuvante (Figura 7) demuestran que únicamente los animales inmunizados con el antígeno lipidado presentaron una respuesta detectable a ELISA. Sin embargo, la respuesta inmunitaria de los antígenos inmunizados de los animales formulados en alúmina (Figura 8) demuestra que dos tipos de antígeno dan respuestas a ELISA comparables y estas respuestas se desarrollan más rápidamente.

Construcción de un vector de expresión pET9a que contiene un gen híbrido ospA/pspA (únicamente para información de fondo)

Se utilizaron cebadores de oligonucleótido diseñados específicamente en una reacción PCR para ampliar el fragmento del gen pspA de interés (en este caso del aminoácido 1 al 321) de la cepa RX1 de S. pneumoniae.

El cebador del extremo 5' presentó la secuencia de nucleótidos:

5'-GGG ACA GCA TGC GAA GAA TCT CCC GTA GCC AGT-3' (PspN1)

(SEC. ID nº: 6)

El cebador del extremo 3' presentó la secuencia de nucleótidos:

5'-GAT GGA TCC TTT TGG TGC AGG AGC TGG TTT-3' (PspC370)

(SEC. ID nº: 7)

La reacción PCR fue la siguiente: 94ºC durante 30 segundos para desnaturalizar el ADN; 42ºC durante un minuto para la hibridación del ADN; y 72ºC durante un minuto para la ampliación del ADN. Esto se realizó durante 25 ciclos, seguido de una prolongación de 5 minutos a 72ºC. Este procedimiento introdujo un codón de terminación en el aminoácido 315. El producto de la PCR se purificó utilizando el método Gene Clean II (Bio101) y se digirió con SphI y BamHI.

Se digirió el plásmido pLF100 (Ejemplo 1) con SphI y BamHI y el gen pspA ampliado se ligó a este plásmido para formar el plásmido pLF321, que contenía el gen híbrido ospA-pspA. Se escindió el gen híbrido de pLF321 por digestión con NdeI y BamHI y se clonó en las secuencias NdeI y BamHI del vector del plásmido pET9a para colocar el gen híbrido ospA-pspA bajo el control de un activador T7. El plásmido resultante se denomina pPA321-L. Este procedimiento se presenta esquemáticamente en la Figura 9.

Construcción de un vector de expresión pET9a que contiene el gen pspA (únicamente para información de fondo)

Se utilizaron cebadores de oligonucleótido diseñados específicamente en una reacción PCR para ampliar el fragmento del gen pspA de interés (en este caso del aminoácido 1 al 321) de la cepa RX1 de S. pneumoniae utilizando el plásmido pPA321-L del Ejemplo 6.

El cebador del extremo 5' presentó la secuencia de nucleótidos:

5'-GCT CCT GCA TAT GGA AGA ATC TCC GCT AGC C-3' (PspNL-2)

(SEC. ID nº: 8)

El cebador del extremo 3' presentó la secuencia de nucleótidos:

5-GAT GGA TCC TTT TGG TGC AGG AGC TGG TTT-3' (PspC370)

(SEC. ID nº: 7)

La reacción PCR fue la siguiente: 94ºC durante 30 segundos para desnaturalizar el ADN y 72ºC durante un minuto para la hibridación y ampliación del ADN. Esto se realizó durante 25 ciclos, que fue seguido de una prolongación de 5 minutos a 72ºC. Este procedimiento introdujo un codón de terminación en el aminoácido 315. El producto de la PCR se purificó utilizando el método Gene Clean II (Bio101) y se digirió con NdeI y BamHI. El producto de PCR digerido se clonó en las secuencias NdeI y BamHI del vector del plásmido pET9a para colocar el gen pspA bajo el control de un activador T7. El plásmido resultante se denomina pPA321-NL. Este procedimiento se presenta esquemáticamente en la Figura 10.

Expresión y purificación de PspA lipidada (únicamente para información de fondo)

Se utilizó el plásmido pPA321-L para transformar la cepa BL21 (DE3)pLyS de E. coli. Se inoculó la E. coli transformada en medio LB con 30 \mug/ml de sulfato de kanamicina y 25 \mug/ml de cloranfenicol. El cultivo se desarrolló toda la noche en un agitador con matraz a 37ºC.

A la mañana siguiente, se transfirieron 50 ml del medio de cultivo de toda la noche a 1 l de medio LB que contenía 30 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se desarrolló el cultivo en un matraz con agitador a aproximadamente 37ºC a un nivel de DO 600 nm entre 0,6 y 1,0, en aproximadamente 3 a 5 horas. Al medio de cultivo se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM y el cultivo se desarrolló durante dos horas más a 30ºC. Se recogieron los cultivos por centrifugación a 4ºC a 10.000\timesG y se recogió el sedimento celular. Se recuperó el PspA del sedimento celular.

El sedimento celular se volvió a poner en suspensión en PBS en 30 g de pasta celular húmeda por litro de PBS. La suspensión celular se congeló y se almacenó a -20ºC. Se descongelaron las células a temperatura ambiente para efectuar la lisis. Se añadió ADNasa I al material descongelado a una concentración final de 1 \mug/ml y se incubó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente, lo que produjo una disminución de la viscosidad del material.

El material se enfrió a continuación en un baño de hielo por debajo de 10ºC y se añadió TRITON^{TM} X-114 como solución madre al 10% hasta una concentración final entre 0,3 y 1%. La mezcla se mantuvo en hielo durante 20 minutos. La mezcla enfriada se calentó a continuación a 37ºC y se mantuvo a esta temperatura durante 10 minutos. Esto dio lugar a que la solución se volviese muy turbia a medida que se producía la separación de fases. La mezcla se centrifugó a continuación a aproximadamente 20ºC durante 10 minutos a 12.000\timesG, lo que produjo la separación de la mezcla en una fase detergente inferior, una fase acuosa transparente superior y un sedimento. El PspA lipidado se dividió en la fase detergente. La fase detergente se separó de las otras dos fases, se diluyó 1:10 con un tampón que comprende Tris 50 mM, EDTA 2 mM, NaCl 10 mM pH 7,7 y se almacenó a -20ºC.

Se preparó la columna Q-Sepharose en un volumen de 1 ml por cada 5 ml de fase detergente diluida. Se lavó la columna con 2 volúmenes de columna de un tampón que comprende Tris 50 mM, EDTA 2 mM, TRITON^{TM} X-100 al 0,3%, NaCl 1 M pH 4,0, y se equilibró a continuación con 5 a 10 volúmenes de columna con Tris 50 mM, EDTA 2 mM, TRITON^{TM} X-100 al 0,3%, NaCl 10 mM pH 4,0. El pH del material de la fase detergente diluida se ajustó a 4,0, en cuyo momento se produjo precipitación. Este material se pasó a través de una unidad de filtración con acetato de celulosa 0,2 \muM para eliminar el material precipitado. La fase detergente diluida y filtrada se aplicó a la columna de Q-Sepharose y se recogió el flujo a través (que contenía PA321-L). En la Figura 15 se presenta el análisis por SDS-PAGE de esta etapa. Se lavó la columna con 1 a 2 volúmenes de columna de Tris 50 mM, EDTA 2 mM, TRITON^{TM} X-100 al 0,3%, NaCl 10 mM pH 4,0, y el flujo a través se agrupó con la fracción anterior de flujo a través. El pH del grupo de flujo a través se ajustó a 7,5. El material unido que contamina las proteínas de E. coli, se eluyó de la Q-Sepharose con 2 volúmenes de columna de Tris 50 mM, EDTA 2 mM, TRITON^{TM} X-100 al 0,3%, NaCl 1 M pH 4,0. En la Figura 11 se presenta un esquema del procedimiento de purificación descrito en este Ejemplo.

Expresión y purificación de PspA no lipidado (para información de fondo solamente)

Se utilizó el plásmido pPA321-NL para transformar la cepa BL21 (DE3)pLyS de E. coli. La cepa de E. coli transformada se inoculó en medio LB que contenía 30 \mug/ml de sulfato de kanamicina y 25 \mug/ml de cloranfenicol. El cultivo se desarrolló durante la noche en un matraz con agitador a 37ºC.

A la mañana siguiente se transfirieron 50 ml del cultivo de toda la noche a 1 l de medio LB que contenía 30 \mug/ml de sulfato de kanamicina y el cultivo se desarrolló en un matraz con agitador a 37ºC hasta un nivel de D.O. 600 nm de 0,6 a 1,0, en aproximadamente 3 a 5 horas. Se añadió IPTG al medio de cultivo hasta una concentración final de 0,5 mM y se desarrolló el cultivo durante dos horas más a 30ºC. Se recogieron los cultivos por centrifugación a 4ºC a 10.000\timesG y se recogió el sedimento celular. Se recuperó el PspA no lipidado del sedimento celular.

\newpage

Se volvió a poner en suspensión el sedimento celular en PBS en 30 g de pasta de células húmeda por litro de PBS. Se congeló la suspensión celular y se almacenó a -20ºC. Se descongelaron las células a temperatura ambiente para efectuar la lisis. Se añadió ADNasa I al material descongelado a una concentración final de 1 \mug/ml y se incubó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente, lo que produjo una disminución de la viscosidad del material. Se centrifugó la mezcla a 4ºC a 10.000\timesG, y se recuperó el sobrenadante celular, que contenía PspA no lipidado. Se lavó el sedimento con PBS, se centrifugó a 4ºC a 10.000\timesG y se agrupó el sobrenadante celular con el sobrenadante celular anterior.

Se preparó una columna MonoQ (Pharmacia) en un volumen de 1 ml por 2 ml de sobrenadante celular. Se lavó la columna con 2 volúmenes de columna de un tampón que comprendía Tris 50 mM, EDTA 2 mM, NaCl 1 M pH 7,5 y a continuación se equilibró con 5 a 10 volúmenes de columna de un tampón que comprendía Tris 50 mM, EDTA 2 mM, NaCl 10 M pH 7,5. El sobrenadante celular agrupado se aplicó a la columna Q-Sepharose y se recogió el flujo a través. La columna se lavó con 2 a 5 volúmenes de columna de Tris 50 mM, EDTA 2 mM, NaCl 10 M pH 7,5 y se agrupó el flujo a través con el flujo a través anterior.

La elución de las proteínas ligadas comenzó con la primera etapa de un lavado de 5 a 10 volúmenes de columna con Tris 50 mM, EDTA 2 mM, NaCl 10 M pH 7,5. La segunda etapa de elución fue un lavado de 5 a 10 volúmenes de columna con Tris 50 mM, EDTA 2 mM, NaCl 1 M pH 7,5. El PspA no lipidado estaba contenido en esta fracción. En la Figura 15 se presenta el análisis SDS-PAGE de esta etapa. Se eliminaron las proteínas contaminantes ligadas restantes con Tris 50 mM y EDTA 2 mM pH 7,5 con NaCl de 300 mM a 1 M.

En la Figura 12 se presenta un esquema del procedimiento de purificación descrito en este Ejemplo.

Inmunogenicidad de PspA recombinante lipidada (para información de fondo solamente)

Se determinó la inmunogenicidad en ratones de PspA lipidado recombinante purificado, preparada como se describe en el Ejemplo 8, y se comparó con la del PspA no lipidado preparado como se describe en el Ejemplo 9. Para este estudio, se inmunizaron ratones CBA/N por vía subcutánea en el dorso del cuello con 0,5 ml de las formulaciones siguientes a las concentraciones de antígeno PspA indicadas.

Formulación	Concentración de antígeno PspA
Molécula de PspA natural de la cepa RX1 (RX1 natural)	200 ng/ml
PspA recombinante no lipidado (pPA-321-NL) solo en PBS*	200 y 1.000 ng/ml
PspA recombinante no lipidado (pPA-321-NL) adsorbido en alúmina	200 y 1.000 ng/ml
PspA recombinante lipidado (pPA-321-L) solo en PBS	200 y 1.000 ng/ml
PspA recombinante lipidado (pPA0321-NL) adsorbido en alúmina*	200 y 1.000 ng/ml
Alúmina*	0 ng/ml
PBS	0 ng/ml
*La alúmina era Hidrogel a una concentración de 200 \mug/ml.

Se inmunizaron cuatro ratones los días 0 y 21 para cada dosis de las formulaciones. A continuación se extrajo sangre a los ratones el día 35 y posteriormente se les sometió a una prueba de provocación con S. pneumoniae de la cepa A66. Se registraron los días de supervivencia después de la prueba de provocación a los ratones y se extrajo sangre a los ratones supervivientes los días 36, 37, 42 y 46. Se analizó el número de unidades formadoras de colonias (CFU) de S. pneumoniae/ml en la sangre procedente de estas extracciones posteriores. En los sueros extraídos el día 35 se analizaron por ELISA los anticuerpos contra PspA utilizando ELISA. En la tabla siguiente se presentan los días hasta la muerte de los ratones sometidos a la prueba de provocación.

2

En la tabla a continuación se presenta el número de CFU en la sangre de los ratones.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

3

Estos resultados indican que la proteína recombinante no era protectora cuando se inyectó sola. El antígeno recombinante auxiliado con alúmina y/o la lipidación de PAM_{3}cis fue inmunógeno y protector. El antígeno PspA completo natural no necesitó un adyuvante para ser protector. Los resultados en CFU indican que los ratones protegidos por la inmunización eliminaron la S. pneumoniae de la sangre de la prueba de provocación en dos días.

El análisis ELISA de los sueros extraídos el día 35 indicó que existía una buena correlación entre la protección de los ratones de la prueba de provocación con S. pneumoniae y la producción de respuestas de anticuerpo mensurables. No se observó en los sueros de los ratones inmunizados ninguna respuesta de anticuerpo detectable con el antígeno no lipidado (pPA-321-NL) en solución salina o en las referencias negativas que no contenían antígeno PspA (tal como se presenta en la tabla a continuación). Se detectaron buenas respuestas del anticuerpo al antígeno PspA de RX1 natural y al PspA recombinante cuando se lipidó con PAM_{3}cys y/o se absorbió en alúmina.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

4

Para determinar si la protección fue por lo menos mediada en parte por las respuestas del anticuerpo anti-PspA, se realizó un experimento pasivo. Se inmunizaron ratones BALB/c con 0,5 \mug de PspA recombinante lipidado solo o absorbido en alúmina, o con PspA recombinante no lipidado adsorbido en alúmina los días 0 y 21; y se extrajo sangre el día 35. Se diluyeron los antisueros 1:3 ó 1:15 en solución salina y se inyectó i.p. 0,1 ml de la dilución en dos ratones para cada dilución. Una dilución 1/3 de suero normal de ratón BALB/c se utilizó como referencia negativa. Posteriormente una hora después de la inmunización pasiva, se sometieron los animales a la prueba de provocación i.v. con la cepa WU2 de S. pneumoniae (15.000 CFU). Los ratones inmunizados pasivamente con suero anti-PspA fueron protegidos en comparación con los ratones que recibieron diluciones de sueros normales de ratón como se muestra en la tabla siguiente.

Protección pasiva de BALB/c para WU2

5

Claims (19)

1. Molécula híbrida de ácido nucleico, que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal de una lipoproteína y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína madura, que es heteróloga a la proteína codificada por dicha primera secuencia de ácido nucleico, estando contigua dicha primera secuencia de ácido nucleico a dicha segunda secuencia de ácido nucleico cuando la proteína madura se lipida de manera natural o estando separadas dichas primera y segunda secuencia de ácido nucleico por un codón que codifica un aminoácido cuando la proteína madura no está lipidada de forma natural; en la que dicha secuencia señal es la secuencia señal de una proteína OspA de una especie de Borrelia y en la que dicha proteína madura es una lipoproteína OspC de una especie de Borrelia.

2. Molécula híbrida de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicha primera secuencia de ácido nucleico y dicha segunda secuencia de ácido nucleico están acopladas en una relación de traducción del marco de lectura abierto.

3. Molécula híbrida según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha lipoproteína OspC es la de una cepa de B. burgdorferi.

4. Molécula híbrida según la reivindicación 3, en la que dicha cepa de B. burgdorferi se selecciona de entre las familias del subtipo OspC.

5. Molécula híbrida según la reivindicación 1, en la que dicha proteína OspC es la de una cepa de B. burgdorferi.

6. Molécula híbrida según la reivindicación 5, en la que dicha cepa de B. burgdorferi se selecciona de entre las familias de las cepas B31, ACA1 e Ip90.

7. Vector de expresión que contiene la molécula híbrida de ácido nucleico según la reivindicación 1, bajo el control de un promotor para la expresión de dicha proteína madura.

8. Método para la formación de una proteína recombinante, que comprende: incorporar el vector de expresión según la reivindicación, en un organismo huésped no animal; y

efectuar la expresión de dicha proteína madura en el organismo huésped no animal.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicho organismo huésped no animal es E. coli.

10. Procedimiento para la producción de una lipoproteína recombinante, que comprende:

construir una molécula híbrida de ácido nucleico, que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal de una lipoproteína y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína madura, que es heteróloga a la proteína codificada por dicho primer ácido nucleico, estando contigua dicha segunda secuencia de ácido nucleico a dicha primera secuencia; en la que dicha secuencia señal es la secuencia señal de una proteína OspA de una especie de Borrelia y en la que dicha proteína madura es una lipoproteína OspC de una especie de Borrelia;

formar un vector de expresión que contiene dicha molécula híbrida de ácido nucleico bajo el control de un promotor para la expresión de dicha proteína madura;

incorporar dicho vector de expresión en un organismo huésped no animal;

efectuar la expresión de dicha lipoproteína recombinante por dicho organismo huésped no animal;

lisar las células del organismo huésped no animal;

tratar las células lisadas con un tensioactivo que solubilice selectivamente dicha lipoproteína recombinante preferentemente a las proteínas bacterianas y otras proteínas y que sea capaz de efectuar la separación de fases de una fase detergente en condiciones suaves;

efectuar la separación de fases en una fase detergente que contiene lipoproteína recombinante solubilizada, una fase acuosa que contiene proteínas bacterianas y otras proteínas y una fase sólida que contiene residuo celular;

separar y recuperar dicha fase detergente de dicha fase sólida y de dicha fase acuosa;

poner en contacto dicha fase detergente con una primera columna cromatográfica en condiciones que produzcan la unión de una proteína que no es dicha lipoproteína recombinante a dicha columna para proporcionar un flujo a través de dicha primera columna cromatográfica que contiene la lipoproteína recombinante, recuperando dicho flujo a través de dicha primera columna cromatográfica;

poner en contacto el flujo a través de dicha primera columna cromatográfica con una segunda columna cromatográfica en condiciones que produzcan la unión de la lipoproteína recombinante a la segunda columna cromatográfica preferentemente a las proteínas contaminantes y los lipopolisacáridos que pasan a través de dicha segunda columna cromatográfica;

eluir dicha lipoproteína recombinante de dicha segunda columna cromatográfica para proporcionar un eluyente que contiene dicha lipoproteína recombinante sustancialmente libre de lipopolisacáridos y proteínas contaminantes; y

recuperar del eluyente.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha primera secuencia de ácido nucleico y dicha segunda secuencia de ácido nucleico están acopladas en una relación de traducción del marco de lectura abierto.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho tensioactivo es TRITON^{TM} X-114.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho tratamiento de células lisadas se efectúa a una temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 10ºC, la mezcla resultante se trata a una temperatura moderadamente elevada de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 40ºC para efectuar la separación de dicha fase detergente, y dicha fase detergente se separa de dicha fase acuosa y de dicha fase sólida por centrifugación.

14. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicha primera columna cromatográfica se pone además en contacto con un medio tamponado a un pH para proporcionar el líquido que contiene la lipoproteína OspC recombinante de la primera columna cromatográfica mientras que las otras proteínas son retenidas en la primera columna cromatográfica y el flujo a través del contacto adicional se recoge y se combina con el de la primera etapa de contacto en dicha primera columna cromatográfica y el flujo a través combinado se pone en contacto con dicha segunda columna cromatográfica.

15. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha lisis del organismo huésped no animal se efectúa congelando y descongelando el organismo huésped no animal.

16. Lipoproteína producida de manera recombinante, aislada y purificada producida por el procedimiento según la reivindicación 10, en el que la lipoproteína comprende la secuencia señal de una proteína OspA de una especie de Borrelia y una lipoproteína OspC madura de una especie de Borrelia.

17. Vector PLF100 de fusión de lipoproteína con el nº de registro 69.750 de la ATCC.

18. Utilización de una composición que comprende la lipoproteína de la reivindicación 16 en la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de la enfermedad de Lyme.

19. Composición para provocar una respuesta inmunológica que comprende la lipoproteína según la reivindicación 16.