ES2224097T3 - Suministro y expresion de una proteina de superficie hibrida sobre la superficie de bacterias gram positivas. - Google Patents

Suministro y expresion de una proteina de superficie hibrida sobre la superficie de bacterias gram positivas.

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ES2224097T3 ES93908349T ES93908349T ES2224097T3 ES 2224097 T3 ES2224097 T3 ES 2224097T3 ES 93908349 T ES93908349 T ES 93908349T ES 93908349 T ES93908349 T ES 93908349T ES 2224097 T3 ES2224097 T3 ES 2224097T3
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Abstract

SE DESCRIBE UN PROCESO PARA LA DISTRIBUCION Y EXPRESION DE PROTEINA DE SUPERFICIE HIBRIDA A LA SUPERFICIE DE BACTERIAS. LAS BACTERIAS TRANSFORMADAS SON UTILES COMO VACUNA, PARA LA DISTRIBUCION DE OTROS PEPTIDOS ACTIVOS A HUESPEDES ANIMALES, COMO REACTIVO DE DIAGNOSTICO Y PARA OTROS USOS.

Description

Suministro y expresión de una proteína de superficie híbrida sobre la superficie de bacterias gram positivas.
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud en tramitación número de serie 07/851.082 presentada el 13 de marzo de 1992, que es una continuación en parte de la solicitud número de serie 07/814.823 presentada el 23 de diciembre de 1991, que es una continuación de la solicitud número de serie 07/742.199 presentada el 5 de agosto de 1991 que, a su vez, es una continuación de la solicitud número de serie 07/522.440 presentada el 11 de mayo de 1990. Estas dos últimas solicitudes están ahora abandonadas.
Campo de la invención
Esta invención se refiere en general a productos y a procedimientos útiles para suministrar proteínas, incluidos antígenos de proteínas, a la superficie de bacterias gram-positivas y para fijarles firmemente a la célula. Más específicamente, se refiere a la producción de una proteína de fusión que contiene al menos la región de anclaje de la región asociada a la célula de una proteína de la superficie gram-positiva y cualquier proteína, péptido o polipéptido que pueda ser útilmente administrado a un huésped animal. Los productos de la invención que comprenden proteínas, péptidos o polipéptidos, según se discutirá adicionalmente en lo que sigue, dispuestos sobre la superficie de una bacteria gram-positiva, pueden ser utilizados para suministrar materiales de este tipo al huésped animal para educir una respuesta inmunogénica, por ejemplo la producción de anticuerpos protectores, o para otro fin útil. La proteína, péptido o polipéptido puede ser, por ejemplo, una enzima u otra proteína funcional necesaria para un fin específico. Puede ser un determinante antigénico procedente de una bacteria, virus, parásito u hongo. Puede ser un antígeno de superficie procedente de una célula tumoral de un mamífero o de esperma masculino. Puede ser un alergeno tal como veneno de véspidos. La invención se refiere también a nuevos plásmidos, genes, cromosomas y bacterias transformadas empleados en la producción de proteínas de fusión de este tipo. Adicionalmente, la invención proporciona nuevas vacunas que emplean bacterias gram-positivas diseñadas para suministrar a un huésped animal un antígeno extraño normalmente presente en un microorganismo patógeno que está asociado con la virulencia de ese patógeno y que educirá antígenos para proteger al huésped frente a la infección o enfermedad provocada por el microorganismo patógeno.
Los productos de la invención son también útiles como agentes de diagnóstico.
La invención proporciona también medios para suministrar enzimas, dispuestas sobre la superficie de la bacteria, a zonas específicas de interés.
El término "animal", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a seres vivos incluidos mamíferos tales como el hombre; ganado bovino especialmente ganado vacuno; ovejas y cabras; aves de corral, especialmente pollos, patos y pavos, así como peces, especialmente los criados en piscifactorías tales como salmón, trucha y barbo. La invención es de especial importancia para mamíferos.
Antecedentes de la invención
La esencia de esta invención es que proporciona un método para la producción de nuevas bacterias gram-positivas no patógenas que expresan una proteína de la superficie híbrida que puede ser un antígeno de superficie híbrido, que comprende dos partes principales, un segmento de anclaje constituido por residuos aminoácidos, y un segmento de polipéptido con actividad N-terminal, los cuales se definirán y discutirán con mayor detalle en lo que sigue.
Esta invención se comprenderá mejor considerando la proteína M y su estructura. La proteína M es un antígeno de superficie de ovillo enrollado que es el factor de virulencia de estreptococos del grupo A, una bacteria gram-positiva. La proteína M de Streptococcus pyogenes de M tipo 6 contiene 441 residuos aminoácidos.
Su estructura se comentará con mayor detalle en lo que sigue, pero será útil discutir en este punto la región asociada a la célula. Utilizando la representación estándar de una letra de aminoácidos, la estructura de la región de anclaje de la región asociada a la célula de la proteína M6 desde el residuo aminoácido 407 al residuo 441 se puede representar como:
LPSTGETANPFFTAAALTVMATAGVAAVVKRKEEN
Empezando desde el primer residuo leucina (L) en el extremo N de la región de anclaje, la región incluye el segmento LPSTGE; un segmento espaciador que contiene tres residuos aminoácidos TAN; un segmento hidrófobo de veinte aminoácidos PFFTAAALTVMATAGVAAVV: seguido por un segmento de cola con elevada carga KRKEEN.
Se ha observado, como resultado de estudios estructurales de un gran número de proteínas de superficie de bacterias gram-positivas, que la región de anclaje anteriormente descrita de la proteína M6 está muy conservada entre todas las proteínas de superficie conocidas de bacterias gram-positivas. Muchas de ellas se muestran por Fischetti et al (referencia 1). En general, el segmento hidrófobo contiene aproximadamente 15 a 20 residuos aminoácidos, el segmento de cola cargado, aproximadamente 4 a 6 residuos aminoácidos y el segmento espaciador de aproximadamente 3 a 6 residuos aminoácidos. Sin embargo, lo más notorio es el alto grado de homología, prácticamente del 100% en el segmento LPSTGE de las proteínas de superficie conocidas. Las variaciones que aparecen se encuentran, casi exclusivamente, en las posiciones 3 y 6. Por lo tanto, la región se puede representar en general como LPXTGX.
La siguiente Tabla 1 muestra el efecto notorio de esta homología hasta ahora establecida entre cuarenta proteínas de superficie diferentes de bacterias gram-positivas.
TABLA 1
1
Es evidente que esta región muy homóloga de las proteínas de superficie de bacterias gram-positivas es esencial para anclar proteínas de la superficie bacteriana a la célula (28). Este segmento, al que aquí se alude como el segmento LPXTGX, es el segmento crucial de la región asociada a la célula de la proteína de superficie para anclar las proteínas a la superficie de bacterias gram-positivas.
Este descubrimiento ha sido confirmado por Schneewind et al (65). Al utilizar la molécula de proteína A de Staphylococcus aureus, estos investigadores han establecido que el complejo completo (motivo LPXTGX, dominio hidrófobo y cola cargada) es necesario para suministrar la molécula de proteína A a la superficie de la célula y que cambios en el motivo LPXTGX o la deleción del mismo no inhibirán la expresión de la molécula, sino que evitarán que se ancle a la superficie.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la alineación de los aminoácidos en las regiones C-terminales de una diversidad de antígenos de superficie procedentes de bacterias gram-positivas, y los segmentos de genes que se emplean para expresarlos. El motivo LPSTGE está sombreado, y las proteínas se alinearon a lo largo de esta secuencia consenso. En 10 de 11 proteínas, se encontró un residuo lisina conservado, 2 ó 3 residuos antes de la secuencia LPSTGE consenso (enmarcada). Las regiones hidrófobas carboxi-terminales homólogas también están enmarcadas. Las abreviaturas utilizadas en la columna de la izquierda son las mismas que las de la Tabla 1.
La figura 2 es un modelo de la proteína M.
La figura 3 muestra la secuencia completa de aminoácidos de la proteína M6.
La figura 4 muestra el sistema de vector huésped GP232-pVMB20.
La figura 5 muestra la construcción y la integración cromosómica de la fusión de traslación M6:E7 en GP246.
La figura 6 muestra los resultados de estudios diseñados para demostrar que la proteína de fusión M6:E7 se expresó en Streptococcus gordonii GP246 situado sobre su superficie.
La figura 7 muestra que extractos de células de Streptococcus gordonii 246 recombinantes expresan la proteína de fusión M6:E7.
La figura 8 muestra que animales inmunizados con GP246 recombinante producen un anticuerpo reactivo con la proteína E7.
La figura 9 muestra un plásmido universal de la invención.
La figura 10 muestra una proteína híbrida típica de la invención.
Las figuras 11 y 12 muestran los resultados de estudios en los que ratones fueron tratados con una proteína híbrida de la invención.
El estudio cuidadoso de las figuras 2 y 3 ayudará a comprender esta invención. La figura 2 representa un modelo de la proteína M con determinadas posiciones y segmentos identificados. La figura 3 identifica cada residuo aminoácido en la estructura completa de la proteína M6.
Por la discusión que antecede se comprenderá que el segmento de la proteína M identificado como la región asociada a la célula en la figura 2 es análoga a regiones de proteínas de superficie encontradas en otras bacterias gram-positivas tales como las listadas en la Tabla 1. Tal como se ha discutido anteriormente, existe un alto grado de homología, en particular dentro de la secuencia de anclaje, especialmente el segmento LPXTGX encontrado en todas las proteínas de superficie gram-positivas. Como se describirá más abajo, y con el fin de ilustrar esta invención, el segmento de gen que abarca la región 122 a 300 del gen que expresa la proteína M está genéticamente separado y está reemplazado por un nuevo segmento de gen que expresa una proteína extraña, por ejemplo un antígeno que generará anticuerpos útiles, produciendo con ello una nueva proteína de la superficie híbrida. Dado el alto grado de homología dentro de las regiones asociadas a la célula de todas las bacterias gram-positivas, el gen híbrido se puede emplear en cualquier bacteria gram-positiva. Las bacterias seleccionadas expresarán la proteína híbrida diseñada utilizando la región de anclaje para fijar la molécula a la célula y situar el segmento activo insertado sobre la superficie de la célula. Al segmento activo insertado se le alude en lo que sigue como el "polipéptido activo".
La expresión "polipéptido activo" se utiliza en esta memoria en su sentido más amplio posible. Se refiere a cualquier péptido, polipéptido o proteína que pueda ser suministrado a un huésped animal para cualquier fin útil. Por ejemplo, según se describe en detalle en lo que sigue, la región asociada a la célula de una proteína procedente de una bacteria gram-positiva se puede fusionar a un segmento de una proteína viral procedente de un patógeno para producir una proteína de superficie híbrida que será expresada por bacterias no patógenas. Las bacterias pueden colonizar un huésped animal y actuar como vacuna. Educirán anticuerpos en un huésped animal para protegerlos frente o inhibir la subsiguiente infección por parte del virus. El segmento viral fusionado es el "polipéptido activo" de esa realización particular de la invención.
Por conveniencia, el término "polipéptido" se utilizará en lo que sigue para aludir a moléculas que tendrán un peso molecular lo suficientemente elevado como para ser denominadas proteínas, a productos de menor peso molecular, habitualmente denominados polipéptidos, y a productos de incluso pesos moleculares menores, a los que normalmente se alude como péptidos.
El "polipéptido activo" puede ser cualquier polipéptido que pueda ser suministrado a un huésped animal para un fin útil. Podría ser, por ejemplo, el segmento viral al que se alude anteriormente. También podría ser un antígeno procedente de cualquier virus patógeno, o procedente de una bacteria, parásito u hongo. En tales casos, el polipéptido activo puede ser el antígeno completo, el determinante antigénico del antígeno o un segmento del antígeno que incluya el determinante antigénico. El fin útil será educir una respuesta inmune protectora mediante la producción de anticuerpos o educir una respuesta inmune celular al antígeno.
La expresión "región asociada a la célula", tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y reivindicaciones, se comprenderá fácilmente haciendo referencia a las figuras, especialmente a las figuras 2, 3 y 10. Se observará que la región asociada a la célula incluye una secuencia de residuos aminoácidos que abarca la pared celular y un segmento que abarca un hidrato de carbono. La secuencia que abarca la pared puede ser omitida de las proteínas híbridas de esta invención, aunque actualmente se prefiere no hacerlo.
La región asociada a la célula también incluye la región de anclaje que contiene el segmento de anclaje (LPXTGX), el segmento de espaciador, el segmento hidrófobo y el segmento de cola cargado. La secuencia de anclaje es esencial para las proteínas híbridas de esta invención. Sin esta secuencia la proteína híbrida no quedara retenida sobre la superficie del soporte bacteriano gram-positivo.
La figura 10 muestra el equilibrio de una proteína híbrida típica de la invención que, tal como se muestra, incluye el polipéptido activo fusionado a la región asociada a la célula. La figura también muestra un segmento conductor y un pequeño segmento N-terminal en el extremo amino del polipéptido activo. Estos segmentos cooperan en el lugar adecuado de la proteína híbrida sobre la superficie de las bacterias gram-positivas. La función del segmento conductor es permitir el tratamiento adecuado de la proteína híbrida dentro de la célula. El segmento N-terminal, en cooperación con el segmento conductor, permite que la enzima peptidasa conductora separe el segmento conductor del segmento N-terminal, y permita que la proteína híbrida asuma su posición adecuada sobre la superficie de la bacteria. El segmento conductor y el segmento N-terminal proceden de la misma proteína de superficie que la proteína de la región asociada a la célula. Adecuadamente, el segmento N-terminal contiene los primeros pocos residuos aminoácidos derivados del extremo amino de la proteína utilizada en la región asociada a la célula de la proteína híbrida. Normalmente, son suficientes aproximadamente diez residuos de este tipo para el tratamiento adecuado, pero también se pueden emplear segmentos que contengan hasta veinte o más residuos aminoácidos.
El polipéptido activo no es necesariamente un antígeno procedente de un organismo patógeno. Por ejemplo, también puede ser una enzima. En ese caso, el fin útil será suministrar la enzima a la superficie de una bacteria no patógena a un sitio específico en el huésped animal colonizado por esa bacteria no patógena.
El polipéptido activo puede ser la molécula completa que comprende la enzima. Alternativamente, puede ser sólo el segmento de ese polipéptido que se requiere para lograr el fin útil.
El polipéptido activo puede ser un antígeno que reaccionará con anticuerpos educidos por microorganismos patógenos. Bacterias de la invención que portan antígenos de polipéptidos activos de este tipo son útiles como reactivos de diagnóstico.
Cuando se hace referencia en esta memoria a bacterias no patógenas debe entenderse que éstas incluyen bacterias comensales gram-positivas, así como bacterias patógenas que han sido modificadas o atenuadas por los procesos habituales, de modo que su patogenicidad ha sido debilitada o destruida y que expresan proteínas híbridas de acuerdo con el procedimiento descrito en esta memoria, conteniendo proteínas híbridas de este tipo una región C-terminal que incluye la región LPXTGX.
Breve descripción de la invención
Esta invención proporciona bacterias gram-positivas no patógenas que expresan al menos una proteína de superficie híbrida, cuya región C-terminal está fijada a la bacteria. La región C-terminal incluye, pero no se limita a la región asociada a la célula de una proteína de superficie normalmente expresada por una bacteria gram-positiva que puede ser patógena o no patógena. El resto de la proteína de superficie híbrida incluye un polipéptido activo que puede ser suministrado a un huésped animal para cualquier fin útil. La proteína de superficie "normalmente producida" por la bacteria de esta invención hace referencia a la proteína completa producida por la bacteria antes de ser genéticamente alterada de acuerdo con el procedimiento de esta invención.
Como se conoce de estudios previos (29) y se indica en las figuras 2 y 3, los aminoácidos 289-441 de la proteína M están sepultados dentro de la célula, mientras que los residuos 1-297 están expuestos sobre la superficie de la célula bacteriana. De acuerdo con esta invención, empleando manipulaciones genéticas descritas e ilustradas en esta memoria, casi toda la región expuesta de la superficie de la proteína M puede ser separada y reemplazada por un polipéptido activo que está enlazado a la región asociada a la célula C-terminal de la proteína M para producir una proteína de superficie híbrida de la invención. Dado que la región asociada a la célula es esencialmente la misma para todas las moléculas de superficie gram-positivas (figura 10), se puede utilizar una estrategia similar, con lo que la región asociada a la célula de una cualquiera de estas moléculas puede utilizarse como un soporte de suministro o vehículo para suministrar un polipéptido activo procedente de otra fuente. El nuevo gen empleado para expresar la proteína de superficie híbrida puede insertarse en un plásmido por técnicas convencionales, y el plásmido se puede utilizar para transformar una Escherichia coli u otro vector. La E. coli expresará después la nueva proteína de fusión, es decir la proteína híbrida de esta invención. El proceso de E. coli es útil para la producción de grandes cantidades de proteína híbrida que pueden aislarse del periplasma de este organismo gram-negativo. Sin embargo, para la mayoría de las utilidades de esta invención se prefiere transformar un organismo gram-positivo para la producción de la proteína híbrida sobre la superficie de las bacterias gram-positivas. Los genes recombinantes producidos de acuerdo con la invención se procesarán por cualquier bacteria gram-positiva.
Alternativamente, el plásmido recientemente construido que contiene el gen de fusión puede utilizarse para integrar el gen de fusión en el cromosoma de una bacteria gram-positiva, por ejemplo el cromosoma de Streptococcus mutans. La cepa de Streptococcus mutans recientemente producida, producirá después de ello la nueva proteína híbrida de esta invención expresándola sobre la superficie de la célula. Este es el proceso actualmente preferido para preparar los productos de esta invención.
En calidad de los polipéptidos activos de la invención se pueden emplear polipéptidos antigénicos procedentes de una amplia diversidad de microorganismos. Estos incluyen microorganismos patógenos que infestan al hombre y a los animales. Sigue a continuación una lista representativa de microorganismos típicos que expresan polipéptidos útiles en la práctica de esta invención. Las bacterias transformadas de la invención pueden utilizarse para tratar o prevenir las enfermedades asociadas con la infección por parte del microorganismo.
Hongos: Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum (todos ellos causan una enfermedad diseminante), Microsporum canis (serpigo animal)
Protozoos parásitos: Plasmodium falciparum (malaria), Trypanosoma cruzi (enfermedad del sueño),
Espiroquetas: Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme), Treponema pallidum (sífilis), Borrelia recurrentis (fiebre recurrente), Leptospira icterohaemorrhagiae (leptospirosis)
Bacterias: Neisseria gonorrhoeae (gonorrea), Staphylococcus aureus (endocarditis), Streptococcus pyogenes (fiebre reumática), Salmonella typhosa (salmonelosis), Hemophilus influenzae (influenza), Bordetella perfussis (tosferina), Actinomyces israelii (actimomiosis), Streptococcus mutans (caries dental)
Streptococcus equi - estrangol (caballos), Streptococcus agalactiae (mastitis bovina), Streptococcus anginosus (infecciones genitales caninas)
Virus: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la polio, virus influenza, virus de la rabia, virus herpes, virus de la glosopeda, virus psittacosis, paramixovirus, moxovirus, coronovirus.
En una realización de esta invención, una bacteria gram-positiva no patógena, que es un organismo comensal para el animal huésped, se utilizará para expresar la proteína híbrida sobre su superficie insertando el gen que codifica la proteína híbrida en la bacteria gram-positiva no patógena. Si la fusión se realiza con un polipéptido activo que es un antígeno procedente de un organismo patógeno (bacteriano, vírico, parásito o fúngico), y la bacteria comensal resultante que expresa el antígeno híbrido se administra a un huésped animal, se producirá una respuesta inmunológica tanto por la vía humoral como por la mediada por las células. Una respuesta inmunológica posible es la producción de anticuerpos, efectuando con ello la protección contra la infección por parte del patógeno. Si la fusión es con una enzima, la enzima se expresará sobre la superficie del comensal. Una amplia diversidad de polipéptidos activos puede ser suministrada a la superficie de bacterias gram-positivas, como resultará evidente para los expertos a partir de un estudio de esta descripción.
Los genes, plásmidos, cromosomas y bacterias transformados de esta invención se producen mediante la aplicación de técnicas recombinantes convencionales, bien conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, un oligonucleótido o un fragmento de restricción que codifica una proteína de revestimiento viral, el factor de virulencia de un antígeno de superficie bacteriano (o, de hecho, el antígeno completo), una enzima u otro progenitor deseado de una proteína de superficie híbrida de la invención se puede ligar al gen que expresa la región asociada a la célula de la proteína M u otra proteína de superficie conocida procedente de una bacteria gram-positiva, tal como las listadas en la Tabla 1. El gen híbrido resultante se utilizará para transformar una bacteria gram-positiva para efectuar la producción de una proteína híbrida de superficie de la invención.
Esta invención se explicará adicionalmente en relación con la expresión de la proteína híbrida M6:E7 por parte de la cepa GP246 de Streptococcus gordonii. Este antígeno híbrido contiene el segmento asociado a la célula C-terminal de la proteína M6. El anticuerpo que educe el polipéptido E7 es una proteína temprana procedente de una cepa de papilomavirus.
Streptococcus gordonii es una bacteria comensal de la cavidad oral. E7 es un proteína temprana de 98 aminoácidos producida durante la aplicación viral del papilomavirus humano tipo 16 (HPV 16). Es una oncoproteína, y anticuerpos contra la misma se encuentran en pacientes con cáncer cervical. Se considera un antígeno candidato principal para vacunas contra neoplasias malignas inducidas por HPV.
Las nuevas bacterias de esta invención se pueden producir por recombinación homóloga convencional mostrada en la figuras 4 y 5. Como se ilustra, una nueva cepa de Streptococcus gordonii, GP232, que expresa grandes cantidades de proteína M6 se empleó como el huésped para producir una nueva cepa GP246.
El proceso empleado, según se ilustra en las figuras 4 y 5, es convencional y se utiliza ampliamente por parte del practicante experto. La tecnología, según se ilustra, consiste en construir un organismo receptor gram-positivo para la inserción del gen de fusión en una localización al azar en el cromosoma que da como resultado una expresión del gen de fusión. El sitio de inserción puede variar de organismo a organismo, e incluso dentro del mismo organismo. La ventaja del método es que asegura que el gen insertado se encuentre en un sitio que de como resultado una elevada expresión del gen de fusión, más que se base en la expresión como resultado de un promotor extraño. Así, el método asegura que se seleccione una región con un promotor fuerte.
En el procedimiento para producir la nueva cepa GP246, el segmento de 538 pares de bases entre los sitios KpnI y HindIII de la proteína M6 se escindió del nuevo plásmido pVMB20, producido según se describe a continuación, y los 294 pares de bases que codifican E7 se insertaron en su lugar para producir el nuevo gen que se utilizó para la producción del nuevo plásmido pVMB21. La región de la proteína M que se escindió da como resultado el reemplazamiento de la molécula E7 en la superficie de la célula con un segmento de 120 aminoácidos del extremo N de M6 que incluye el segmento conductor fusionado al extremo N de E7. La construcción se realizó en E. coli, y el plásmido recombinante se utilizó para transformar S. gordonii por el proceso de doble cruzamiento convencional con GP232 para efectuar la integración cromosómica del gen que expresa la proteína M6:E7 por parte de la nueva cepa
GP246.
Materiales y métodos
Técnicas de ADN recombinante. Las fusiones de genes en vectores de Escherichia coli se obtuvieron y construyeron por procesos convencionales (30).
Transformación de estreptococos. Células congeladas de S. gordonii Challis competente por naturaleza se prepararon y transformaron por procesos conocidos (31). La extensión en placas y el recuento de transformantes en placas multiestratificadas se realizaron utilizando eritromicina a una concentración de 5 \mug/ml en la capa superior utilizando procesos conocidos (32).
Análisis genético de transformantes. Los transformantes se rayaron sobre la superficie de 3 placas de agar de sangre mediante transferencia con un palillo de colonias a partir de la placa de selección. La primera placa contenía eritromicina (5 \mug/ml), la segunda cloranfenicol (5 \mug/ml) y la tercera no tenía antibiótico. Las placas se incubaron durante 36 horas a 37ºC. Después de la incubación, una membrana de nitrocelulosa se aplicó a la superficie de la placa que no contenía antibiótico y se mantuvo durante 20 min a la temperatura ambiente. A continuación, la membrana se incubó durante 30 min a 37ºC y durante 15 min a 80ºC en una estufa de vacío. La presencia de proteína E7 unida a la nitrocelulosa se detectó utilizando anticuerpos policlonales anti-E7 (dilución 1:5000), obtenidos de conejos inmunizados con una proteína de fusión MS2:E7 producida en E. coli (33).
Imnunofluorescencia. Bacterias desarrolladas en caldo Todd-Hewitt (Difco) se recolectaron en la fase exponencial tardía, se aplicaron sobre un portaobjetos de vidrio y se fijaron con metanol. Los portaobjetos se trataron con anticuerpos específicos para M6 o E7 (dilución 1:50), se lavaron ampliamente y luego se hicieron reaccionar con antisuero de IgG anti-conejo (o anti-ratón) de cabra (dilución 1:100), conjugados con cianamina. Los resultados se observaron bajo un microscopio Bio-Rad Confocal Fluorescence Imaging System MRC-500.
Análisis de transferencia Western de extracto de células. Los estreptococos se desarrollaron hasta la fase estacionaria tardía en caldo Todd-Hewitt (Difco). Las células se recolectaron y resuspendieron en Tris 50 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 50 mM, sacarosa al 30%. Se obtuvieron protoplastos tratando la suspensión de células con lisozima (100 \mug/ml) durante 30 min a 0ºC. Luego, los protoplastos se centrifugaron y resuspendieron en Tris 50 mM (pH 8,0). Se consiguió una lisis a fondo mediante cinco ciclos de congelación/descongelación rápida de la suspensión. Las células que no lisaban y los desechos toscos se desecharon mediante centrifugación a baja velocidad a 1000 rpm durante 15 min, mientras que el sobrenadante, que contenía membranas y citoplasmas, se utilizó para el análisis de la transferencia Western. El extracto obtenido a partir de aproximadamente 5 x 10^{8} células de estreptococos se dejó actuar sobre un gel y la transferencia Western se efectuó por métodos convencionales.
Inmunización de ratones. Ratones BALB/c se inmunizaron por vía subcutánea con 5 x 10^{8} células de estrepococos GP246 vivas (5 x 10^{7} unidades formadoras de colonias) emulsionadas en adyuvante de Freund completo. Dos y tres semanas después de la inmunización primaria, se les administró a los animales inyecciones de la misma dosis bacteriana emulsionada en adyuvante de Freund incompleto. Los animales fueron desangrados una semana después de la última inyección.
Resultados
Producción del plásmido pVMB3: Se realizó una construcción en la que ermC, un gen que confiere resistencia a eritromicina (34), se clonó junto a emm-6.1, de modo que ambos genes estarían dentro del mismo fragmento ClaI. En esta construcción, el codón de iniciación de emm-6.1 se encontraba 19 pb más abajo de uno de los sitios ClaI, de modo que la escisión de ClaI dejaría sin promotor a emm-6.1. En los experimentos se utilizó el plásmido pVV3:M6 (35), que contenía el sitio ClaI más arriba de la secuencia codificadora de emm-6.1. El fragmento MspI de 2,0 kb de pE194, que contenía ermC, se ligó con una digestión parcial con ClaI de pVV3:M6. Después de la transformación de E. coli DH5, se aisló un clon con un plásmido, pVMB3, que contenía el fragmento ClaI.
Producción de la cepa GP230: El fragmento ClaI de 3,4 kb de pVMB3, que contenía ermC y emm 6.1 sin promotor, se ligó con el ADN cromosómico de S. gordonii, cortado también con ClaI. La mezcla de ligación se utilizó para transformar la cepa V288 de S. gordonii "Challis" transformable de modo natural. Mediante este método, el fragmento de ClaI emm-6.1/ermC se integró aleatoriamente en el cromosoma. El ADN cromosómico ligado al fragmento ClaI proporcionó la homología para la integración durante la transformación. Se seleccionaron transformantes resistentes a eritromicina (Em-r) y se analizaron en cuanto a la producción de proteína M6 mediante "transferencia de rayado". De los 700 transformantes Em-r 196 (28%) producía proteína M6. Basado en el análisis de la transferencia por puntos semicuantitativa, GP230 pareció ser el mejor productor de M6.
Producción de la cepa GP232: S. gordonii GP230 se transformó con el ADN cromosómico de la cepa de neumococos GP69. Esta cepa de neumococos es resistente a cloranfenicol, pero susceptible a eritromicina producida de acuerdo con el proceso de Pozzi y Guild (36). Cuando el ADN cromosómico de GP69 se utiliza para transformar GP230, la recombinación se produce en el nivel de la secuencia ermC que conduce a la inserción de la secuencia CAT en la copia de ermC integrada en el cromosoma de GP230. Esta inserción proporciona GP232 que, como se ha comentado y mostrado en las figuras, expresa M6 sobre su superficie, y es también resistente a cloranfenicol y sensible a eritromicina.
Expresión de la proteína E7 de HPV16 en S. gordonii : El vector de integración, pVMB20, se construyó para permitir la inserción de secuencias de ADN heterólogas en el gen emm-6.1 presente en el cromosoma de GP232. pVMB20 es un nuevo plásmido de Escherichia coli que no replica en Streptococcus y que porta emm-6.1 y el marcador de resistencia a eritromicina ermC. El sistema de huésped-vector GP232-pVMB20 se muestra en detalle en las figuras 4 y 5. Específicamente, el nuevo plásmido pVMB20 y la nueva bacteria S. gordonii GP246 se prepararon mediante el siguiente proceso.
Sistema de huésped-vector para la expresión del gen heteróloga: [A] en el cromosoma de la nueva cepa huésped S. gordonii GP232, una copia del gen de la proteína M6 (emm-6.1) (37), sin promotor pero con su propio sitio de unión al ribosoma, se integró más abajo de un promotor cromosómico fuerte. Junto a emm-6.1 se encuentra ermC (34), cuya secuencia codificante está interrumpida por la inserción en su sitio BclI del fragmento MboI de 1,8 kb de pC221 que contiene un gen cat (38). GP232 expresa M6 sobre su superficie y es resistente a cloranfenicol y sensible a eritromicina. Se obtuvo utilizando la transformación para integrar ADN heterólogo en el cromosoma del estreptococo. La estructura se muestra en la figura. El tamaño (5,2 kb) del ADN heterólogo integrado en el cromosoma en GP232 se determinó mediante análisis de transferencia Southern. El vector de integración pVMB20 es un plásmido de E. coli de 6,3 kb que no replica en Streptococcus. Se obtuvo subclonando en pBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, California) un fragmento ClaI de 3,4 kb del plásmido pVMB3 que contenía emm-6.1 y ermC mediante el proceso explicado a continuación. Este es el mismo fragmento ClaI que está integrado en el cromosoma de GP232, siendo la única diferencia que en GP232 ermC está interrumpido por cat. Cuando pVMB20 se utiliza como ADN donante en la transformación de células competentes de S. gordonii GP232, se obtienen transformantes resistentes a eritromicina por recombinación entre el vector de integración y las secuencias cromosómicas homólogas. El fragmento de ADN que contiene el gen cat se suprime en el cromosoma de estos transformantes, mientras que se restaura un gen ermC intacto (figura 5).
(B) El gen de la proteína E7 de HPV16 (39) se clonó en la secuencia emm-6.1 de pVMB20 para proporcionar pVMB21. pVMB20 se digerió con KpnI y HindIII y se ligó con un segmento KpnI/HindIII que contenía las secuencias E7 obtenidas por la amplificación de ADN in vitro (reacción en cadena de la polimerasa) realizadas en el plásmido pMBS21L/E7 (33). Los cebadores de la amplificación se diseñaron con el fin de obtener la inserción "en marco" de las 294 pb que codifican E7 en emm-6.1. El análisis de la secuencia de nucleótidos de pVMB21 confirmó la estructura esperada de la fusión por translación de M6:E7. pVMB21 se linearizó y utilizó para transformar GP232. Se encontró que E7 se expresaba en el 6% de los transformantes resistentes a eritromicina. En estos transformantes, la integración de las secuencias de pVMB21 producía una deleción que implicaba el gen cat. La estructura de GP246, un transformante representativo, se confirmó mediante análisis de transferencia Southern. La secuencia de nucleótidos de los fragmentos de unión de la fusión del gen M6:E7 presentes en el cromosoma de GP246 también se determinó después de clonar en pBLUESCRIPT el fragmento ClaI que contenía la fusión M6:E7.
Expresión en superficie de la proteína E7: La expresión de la proteína E7 de HPV16 en S. gordonii en la superficie de la cepa GP246 se verificó por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos contra el soporte de la proteína M6 o el inserto E7. GP246, que contenía la fusión del gen M6:E7, exhibía una fluorescencia positiva cuando reaccionaba con anticuerpos policlonales específicos para M6 o específicos para E7 (figura 6), confirmando la localización en superficie de la molécula E7 y la proteína M en la superficie de S. gordonii. No se observó ninguna fluorescencia cuando GP246 se hizo reaccionar con el anticuerpo monoclonal conocido 10A11 que es específico para un epítopo de M6, cuya región codificante estaba contenida en el fragmento KpnI/HindIII en la construcción de la fusión del gen de M6:E7 (figura 6).
Para demostrar que los estreptococos recombinantes que expresan E7 producen de hecho una proteína de fusión M6:E7, extractos de células de S. gordonii se analizaron mediante transferencia Western (figura 7). En los extractos de células de GP246, las mismas bandas reaccionaban con anticuerpos específicos para E7 y M6, mientras que no se encontró ninguna reactividad específica para E7 en la GP232 receptora, cuyos extractos mostraron una reactividad específica para M6 (figura 7).
Se utilizaron sustancialmente los mismos procesos para construir M6:E7, una proteína híbrida que contenía la región C-terminal de la molécula M6 y el alergeno 5 se expresó con éxito sobre la superficie de S. gordonii. Transferencias Western del extracto de la pared celular utilizando anticuerpos específicos para el alergeno 5 establecieron, (al igual que con M6:E7) que el alergeno 5 estaba de hecho expresado en la fracción de pared celular de gordonii. Alergeno 5 se obtuvo según se describe por Fang, et al (66).
Respuesta inmune a la proteína de fusión en la superficie de estreptococos: La inmunogenicidad de la proteína de fusión M6:E7 se examinó inmunizando ratones con GP246 de S. gordonii recombinante que expresan la proteína de fusión M6:E7. Ratones de control se inmunizaron con la cepa isogénica GP232, que expresa proteína M6. Sueros procedentes de tres animales inmunizados con cada cepa se agruparon y ensayaron mediante transferencia Western en cuanto a su reactividad con proteína E7 purificada producida en Schizosaccharomyces pombe. La figura 8 muestra que los animales inmunizados con la cepa GP246 que contenían M6:E7 de superficie producían anticuerpos reactivos con la proteína E7, indicando que la proteína E7 es inmunogénica cuando se expresa como una proteína de fusión sobre la superficie de estreptococos. No se observaron anticuerpos contra la proteína E7 en los sueros de ratones inmunizados con GP232 que contenía sólo M6.
El proceso que se ha descrito permite la producción de la bacteria no patógena S. gordonii GP246 u otras bacterias gram-positivas transformadas que expresan una proteína de la superficie híbrida tal como el nuevo antígeno de superficie híbrido M6:E7. Este nuevo antígeno es una proteína híbrida, cuyo extremo carboxi está fijado a la bacteria y es esencialmente la misma región C-terminal que normalmente se encuentra en otras proteínas de la superficie gram-positivas según se explica anteriormente. El polipéptido activo de esta proteína de superficie híbrida es el antígeno E7 de HPV 16. Cuando la bacteria se administra, por ejemplo por colonización, a un huésped animal que necesita protección, el polipéptido activo educirá respuestas tanto humorales como mediadas por células que dan como resultado la producción de una respuesta inmune protectora frente a la infección por papilomavirus.
Se observará que el antígeno heterólogo de la proteína de superficie híbrida de esta invención, preparado según se ha descrito anteriormente, es un antígeno viral producido durante la replicación del virus. Así, el procedimiento de esta invención hace posible la producción de nuevas bacterias gram-positivas para el suministro de antígenos virales a un animal en cantidades suficientes para educir una respuesta inmunogénica protectora frente a la infección por un virus.
El nuevo M6:E7 y productos intermedios nuevos de esta invención se producen a partir de dos materiales de partida. Estos son pVV3:M6 y GP69. Estos se pueden preparar por los procedimientos descritos en las referencias citadas. Por lo tanto, los nuevos productos pueden todos obtenerse a partir de materiales conocidos utilizando los procesos descritos en esta memoria. Sin embargo, para ayudar a la práctica de la invención y sin admitir ninguna necesidad de hacerlo así, pW3:M6 y GP69 han sido depositados en la American Type Culture Collection bajo los números de acceso ATCC 68003 y ATCC......, respectivamente.
El ejemplo de M6:E7 que antecede ilustra la utilización de una bacteria gram-positiva comensal no patógena, normalmente presente en la cavidad oral de mamíferos para proteger el cuerpo entero frente a la infección por virus. Bacterias no patógenas preparadas de modo análogo se pueden utilizar para expresar y suministrar otros antígenos útiles mediante los procedimientos descritos e ilustrados en esta memoria. Por ejemplo, antígenos de proteína sobre la superficie de tumores de mamíferos se pueden fusionar con la región asociada a la pared celular de un antígeno de superficie de cualquier bacteria gram-positiva, el gen de fusión se puede insertar en un comensal gram-positivo y la bacteria resultante se puede emplear como vacuna para generar respuestas inmunes específicas para tumores, útiles en la terapia de tumores.
Estos ejemplos ilustran únicamente un aspecto de la invención. De hecho, la invención proporciona un sistema de suministro para cualquier tipo de polipéptido que puede ser útil para provocar una respuesta inmune en un animal o para otros fines útiles.
Cuando se utiliza como una vacuna, el comensal transformado seleccionado se empleará para colonizar un mamífero. Éste producirá la proteína de la superficie híbrida seleccionada, cuyo segmento de polipéptido activo educirá la producción de anticuerpos protectores.
Bacterias gram-positivas no patógenas, normalmente encontradas en la mucosa de la vagina, se pueden emplear como contraceptivos. Para esta utilidad, los antígenos de superficie del esperma masculino se pueden emplear como el polipéptido activo sobre la proteína de superficie híbrida de la bacteria Lactobacillus acidophilus que normalmente se encuentra sobre la superficie de la mucosa de la vagina o del útero. Cuando las bacterias transformadas se utilizan para colonizar dichas mucosas, las proteínas híbridas educirán la producción de anticuerpos contra los antígenos de superficie del esperma y conseguirán la inactivación del esperma. En efecto, el esperma será considerado por el cuerpo femenino como una sustancia extraña, y los anticuerpos preconformados reaccionarán con e inactivarán las células del esperma.
Existen dos importantes ventajas de este tipo de contracepción. Una es que, dado que el esperma será inactivado, los óvulos no serán fertilizados. La otra es que el efecto contraceptivo se puede neutralizar simplemente tratando la hembra inmunizada con un anticuerpo para purificar las bacterias gram-positivas que expresan el antígeno híbrido.
Todavía otra utilidad de las bacterias transformadas de esta invención es el suministro de un antígeno de superficie procedente de un virus VIH a la superficie de un organismo comensal gram-positivo para proporcionar una vacuna que pueda utilizarse para prevenir el SIDA. Para esta utilidad, se puede utilizar el polipéptido GP120, el bucle V3 de GP120, GP160 o un antígeno de superficie relacionado o segmentos de antígenos de este tipo tales como la secuencia 735 a 752 de GP16 o RP135, un segmento de 24 aminoácidos de GP120 procedente del virus de VIH. Estos polipéptidos se fusionarán al conductor y al menos una parte de la secuencia N-terminal de una proteína de superficie gram-positiva y su región de anclaje para el suministro a la superficie de las bacterias comensales. Cuando el comensal transformado que expresa los antígenos de VIH sobre su superficie se suministra a un mamífero susceptible, se provoca una respuesta inmune para su protección frente a la infección por virus VIH. Además, al utilizar un comensal vaginal recombinante para suministrar un antígeno de VIH tal como GP120 a la vagina, los anticuerpos IgA producidos contra este antígeno protegen frente a la infección en este sitio. Los anticuerpos IgA en las secreciones de la vagina reducirán el número de partículas de VIH en las secreciones de una hembra VIH positiva y, así, reducen la propagación del SIDA.
Los productos de esta invención son útiles para la terapia de desensibilización. Este tipo de terapia se emplea ampliamente para aliviar las molestias de individuos atópicos que desarrollan respuestas IgE exageradas contra antígenos (denominados alergenos en el sector de la alergia). Se piensa que la producción incrementada de anticuerpos IgE es una causa principal de las respuestas alérgicas tales como fiebre de heno, asma y choque anafiláctico.
Los alergenos pueden surgir de una diversidad de fuentes incluidos los alimentos, mohos, polvo y pieles de animales. La flora tales como rosas o ambrosía son una fuente principal de alergenos. El "aguijón" de véspidos tales como avispas y avispones contiene proteínas alergéncias.
La terapia convencional empleada para mejorar la respuesta inmune de la exposición a alergenos ha sido el tratamiento por hiposensibilización que implica inyecciones repetidas de dosis incrementadas de alergeno. Esto provoca un incremento en anticuerpos IgG específicos para alergenos que bloquea la unión de IgE específica para alergenos a células cebadoras.
Un cierto número de péptidos y proteínas específicos para alergenos han sido identificados, aislados y clonados. Estos incluyen, por ejemplo, el alergeno 5, una proteína del veneno de véspidos. Estos alergenos se pueden incluir como el polipéptido activo de las proteínas de superficie híbrida de esta invención. Bacterias comensales que generan proteínas híbridas de este tipo se pueden utilizar para colonizar un paciente alérgico. El resultado será una fuente constante de alergenos que educirá la misma respuesta inmune protectora que la conseguida con la terapia de desensibilización.
La formación y expresión de la proteína híbrida M6:alergeno 5 ha sido descrita anteriormente. Las figuras 11 y 12 muestran los resultados de estudios de inmunización que utilizan este antígeno de superficie híbrida.
La figura 11 ilustra la respuesta de IgG de sueros de ratones al alergeno 5 purificado en la proteína de superficie híbrida. Ratones se inmunizaron por vía intradérmica con S. gordonii que expresa el alergeno 5 de la superficie híbrida (10^{7} UFC) en adyuvante de Freund, o por vía intranasal con los mismos organismos. Los animales se desangraron a las 4, 6, 8 y 10 semanas después de la inmunización y el suero se verificó mediante ELISA en cuanto a IgG contra alergeno 5 purificado. Ambos, los ratones inmunizados por vía intradérmica (V1-V4, barras sombreadas) y animales inmunizados por vía intranasal (V5-V8, columnas en negro) expresaban anticuerpos contra el alergeno. Animales control inmunizados con S. gordonii sin alergeno 5 expuesto a la superficie no mostraron respuesta al alergeno. Los animales control inmunizados con S. gordonii sin alergeno 5 expuesto en la superficie no mostraron respuesta al alergeno. Todos los animales inmunizados por vía intranasal con el S. gordonii recombinante permanecieron colonizados durante al menos 12 semanas, según se determina mediante fregados, y seguían expresando el alergeno 5 durante este período. Todos los ensayos se llevaron a cabo con una dilución 1:50 de los sueros.
La figura 12 muestra la respuesta de IgA al alergeno 5 en animales inmunizados por vía intranasal e intradermal. Doce semanas después de la inmunización (por vía intradermal o intranasal) con gordonii que expresa el alergeno 5 (véase la figura 11) se tomó la saliva y los animales se sacrificaron para obtener líquidos de lavado de los pulmones y del intestino. La saliva y los líquidos de lavado se analizaron en cuanto a la presencia de IgA específica para el alergeno 5 mediante ELISA. Los resultados revelaron que la IgA de la saliva estaba presente en los animales inmunizados por vía intradermal e intranasal con una mejor respuesta en los animales colonizados por vía intranasal. La mejor respuesta de IgA se observó en los líquidos de lavado de pulmones de los animales colonizados por vía intranasal. Mientras que se observó una respuesta de IgA en el intestino delgado (ID), ésta era menor que los líquidos de lavado de los pulmones. Todos los ensayos se llevaron a cabo con una dilución 1:1 de las muestras.
Una ventaja particular de los sistemas para el suministro de las proteínas de superficie híbrida de esta invención es que, dado que los organismos transformados son comensales normales, éstos continuarán colonizando y actuando como un estímulo constante de una respuesta inmune protectora, evitando con ello la necesidad de una inmunización continua.
El experto concebirá fácilmente numerosas otras aplicaciones de los nuevos productos de esta invención. Por ejemplo, bacterias gram-positivas no patógenas se pueden producir para suministrar antígenos de superficie que educirán anticuerpos protectores contra una amplia diversidad de estados patológicos, incluidos malaria, sarampión, tosferina, infecciones retrovirales tales como SIDA, coccidiosis, moquillo, viruela loca y brucelosis.
Otra ventaja particular del sistema de suministro de esta invención cuando se utiliza como vacuna es que se emplean bacterias vivas. Como es sabido, las bacterias vivas estimulan una respuesta inmune mucho más intensa que las bacterias atenuadas o muertas. Todavía otra ventaja es que debido a que se emplean bacterias no patógenas, la vacuna es segura. Todavía otra ventaja es que son posibles varios métodos de administración.
La invención no se limita a S. gordonii como bacterias de soporte o incluso a estreptococos, de hecho a menudo se pueden preferir otras bacterias gram-positivas no patógenas. Por ejemplo, bacterias normalmente presentes en la mucosa intestinal (Enterococcus fecalis) pueden preferirse para suministrar un polipéptido activo al intestino.
Además de ello, la invención no se limita a la expresión en superficie de una proteína de superficie híbrida que contiene sólo un epítopo. El organismo de soporte se puede transformar por procesos bien conocidos para expresar una pluralidad de proteínas de superficie híbrida, cada una con un polipéptido activo diferente o, alternativamente, para expresar una proteína de superficie híbrida en la que el polipéptido activo incluya más de un epítopo.
Hasta ahora, esta invención se ha descrito e ilustrado principalmente con respecto al suministro de antígenos para educir anticuerpos protectores, pero, según se indica anteriormente, la invención no está limitada de esta forma. Por ejemplo, la invención se puede utilizar para suministrar enzimas.
Seres humanos deficientes en la enzima lactasa, que es segregada en el intestino delgado, son incapaces de hidrolizar adecuadamente lactosa en sus componentes, D-glucosa y D-galactosa. Un resultado de ello es que son incapaces de digerir adecuadamente leche o productos lácteos. Por lo tanto, el tratamiento ha sido la ingestión durante toda la vida de comprimidos u otras formas de dosificación terapéutica que contienen la enzima que falta. De acuerdo con la práctica de esta invención, se proporcionan bacterias del intestino comensales que se clonan para producir una proteína híbrida, cuyo polipéptido activo es lactasa. Las bacterias se pueden emplear para colonizar la mucosa intestinal para la producción continua de la enzima requerida.
Streptococcus mutans son organismos principales responsables del deterioro de los dientes. Éstos segregan glucosiltransferasas que hidrolizan sacarosa para producir glucosa. A su vez, la glucosa se transforma en polímeros de glucano que se adhieren a las superficies de los dientes y participan en el proceso de deterioro. Al utilizar los procesos descritos y reivindicados en esta memoria, S. mutans se puede transformar para expresar proteínas de superficie híbrida que contienen enzimas glucanasa. Las bacterias transformadas se pueden emplear para colonizar la cavidad oral e inhibir la formación de polímeros de glucano, protegiendo así frente al deterioro de los dientes. Alternativamente, Streptococcus mutans se puede transformar para producir enzimas que digieran la placa dental, previniendo así la iniciación del deterioro.
El procedimiento de esta invención, sustancialmente según se describe anteriormente, se empleó utilizando Staphylococcus aureus como bacteria para la expresión de la proteína de superficie. Cuando la región de anclaje (que contiene el segmento LPXTGX, el segmento hidrófobo y el segmento de cola cargado) de la proteína A, una molécula de superficie de esta bacteria se fusionó a la enzima fosfatasa alcalina (una proteína periplásmica dimérica de E. coli) y el gen de esta fusión se colocó de nuevo en S. aureus, se encontró que la molécula se translocaba hacia el exterior de la célula y se anclaba a su superficie. Los detalles de este proceso se encuentran en la referencia 65.
El experto reconocerá que son posibles varias variaciones de esta invención.
Una variación que es particularmente útil, especialmente para la producción de vacunas, es incluir un adyuvante en la proteína híbrida y la secuencia de nucleótidos necesaria para la expresión de la proteína deseada en el gen utilizado para generar la proteína. Típicamente, se podría producir un plásmido en el que el gen que expresa la subunidad B de la toxina cólera, que es un adyuvante de la mucosa conocido, se inserta entre el polipéptido de la región C y el polipéptido activo. Alternativamente, el gen para la subunidad podría insertarse más arriba del polipéptido activo. Esta orientación puede educir una respuesta incrementada de IgA, debido a que en la interacción habitual de CTB y la célula que produce anticuerpos, CTB contacta directamente con la célula y estimula la producción de anticuerpos contra el antígeno para el que el CTB actúa como un adyuvante. El plásmido se puede emplear en la técnica de doble cruzamiento ilustrada en las figuras 4 y 5 para incorporar el gen híbrido en el cromosoma de una bacteria gram-positiva para la expresión de una proteína híbrida de la invención sobre la superficie bacteriana. Otras proteínas que refuerzan la inmunología pueden utilizarse en lugar de la subunidad B de toxina cólera para reforzar la respuesta inmune a un polipéptido activo.
Las bacterias transformadas de esta invención son útiles en ensayos de diagnóstico. Estos se pueden utilizar, por ejemplo, para someter a ensayo la presencia de anticuerpos característicos de una infección específica en el plasma de animales infestados.
Convencionalmente, el proceso de someter a ensayo una infección causada, por ejemplo, por Neisseria gonorrhoeae requiere el aislamiento y la purificación de un antígeno que reaccionará con un anticuerpo específico característico del microorganismo infectante y que se sospecha esté presente en el plasma. A continuación, el antígeno se incuba con el plasma u otro fluido corporal. Si tiene lugar una reacción, ésta se puede reconocer por cualquiera de una diversidad de ensayos conocidos.
En el proceso de análisis con enzima unida a inmunoabsorbente convencional, el antígeno aislado y purificado se adhiere a un sustrato de vidrio o plástico en fase sólida. Después se expone al fluido corporal tal como plasma o suero. Si el fluido contiene un anticuerpo característico del organismo infestante, tendrá lugar una reacción antígeno/anticuerpo. El producto de la reacción permanecerá en la fase sólida que luego se incuba con un anti-anticuerpo marcado con una enzima detectable tal como peroxidasa de rábano picante.
Las bacterias transformadas de esta invención se pueden emplear como fuente del antígeno utilizado en el ensayo de diagnóstico. En ensayos de este tipo, las bacterias transformadas se emplean como antígeno. Al experto le resultarán familiares varios ensayos diagnósticos de esta naturaleza. Un uso de este tipo, de acuerdo con esta invención, elimina la necesidad de aislar y purificar el antígeno según se requiere por métodos de la técnica anterior.
Para el ensayo diagnóstico, se prepara una bacteria transformada de la invención en la que el polipéptido activo incluye un epítopo para un anticuerpo específico que es característico del microorganismo que provoca la infección. La bacteria se adhiere a la fase sólida y el resto del ensayo diagnóstico se lleva a cabo de la manera habitual. Naturalmente, el ensayo no se limita al uso de enzimas para detectar la presencia de anticuerpos utilizando, por ejemplo, el análisis ELISA. Se pueden emplear otros marcadores tales como isótopos radiactivos.
Se pueden proporcionar kits diagnósticos que contienen las bacterias transformadas, típicamente en una forma liofilizada a ser reconstituida, junto con los otros reactivos que normalmente se proporcionan con kits de este tipo. Estos pueden incluir un tampón acuoso, un anticuerpo marcado, agua esterilizada y, posiblemente, otros reactivos. Alternativamente, las bacterias transformadas, ya sea en suspensión acuosa o liofilizadas se pueden proporcionar para uso en el ensayo diagnóstico junto con otros reactivos a proporcionar por parte del laboratorio que realice el ensayo diagnóstico.
Los diversos segmentos de las proteínas de superficie híbrida de la invención no están necesariamente adyacentes uno con otro en la proteína o en el gen utilizado para producirla. Puede ser conveniente, por cualquiera de un cierto número de motivos evidentes para el experto, separar los nucleótidos sobre el gen híbrido utilizado para expresar la proteína mediante inserción de otros nucleótidos para expresar con ello proteínas híbridas en las que el polipéptido activo y el polipéptido asociado a la célula se separan por un espaciador seleccionado. No es esencial que se emplee el segmento completo procedente de la región asociada a la célula del antígeno de superficie para construir la proteína de superficie híbrida de la invención, en tanto que esté presente una región de anclaje que comience con el segmento LPXTGX y que finalice en el segmento de cola cargado para anclar el polipéptido híbrido a la bacteria que lo expresa.
La figura 9 muestra una realización especialmente útil de esta invención. Esta figura ilustra un plásmido universal que contiene un sitio de polienlazador. Un polienlazador es una secuencia de oligonucleótidos o de ADN que codifica varios sitios de restricción y, por lo tanto, se puede emplear para la inserción de genes escindidos por una diversidad de enzimas de restricción. Por ejemplo, el plásmido se puede construir con una región de polienlazador que contiene varios sitios de restricción tales como EcoRI, ClaI, HindIII, XboI, PstI, BamHI o cualquiera de varios otros. Polienlazadores de este tipo están comercialmente disponibles o se pueden construir fácilmente por el experto.
Para producir un plásmido de esta invención, el inserto de polienlazador se ligará en un plásmido que ya contiene el segmento de gen seleccionado para expresar el segmento asociado a la célula deseado de la proteína híbrida a producir. El plásmido se muestra conteniendo la secuencia conductora para el antígeno híbrido, pero dicha secuencia no se encuentra necesariamente en el plásmido. Puede estar incluida en la secuencia de oligonucleótidos utilizada para expresar el polipéptido activo. A pesar de que los diversos segmentos de genes en el plásmido se muestran como adyacentes uno con otro, éstos pueden estar separados por espaciadores.
El plásmido se muestra como que contiene dos regiones resistentes a antibióticos diferentes para ayudar a la selección. Una, que está situada dentro del sitio del polienlazador, lo separa en dos secciones y será retirada cuando sea reemplazada por un inserto. Se pueden emplear otros marcadores tales como los que resultan en color. Según se requiera, se pueden construir otras formulaciones de un plásmido con sitios de polienlazador.
El plásmido sin el marcador que separa el enlazador, pero con un promotor eficaz, se puede emplear para transformar una bacteria gram-positiva. El plásmido mostrado puede cruzarse con un cromosoma según se ha descrito anteriormente. Una bacteria transformada que contenga el plásmido o el cromosoma expresará la proteína híbrida de superficie deseada.
El plásmido M6.1 367-441 que se describe y reivindica en la solicitud de patente antes identificada es especialmente útil en la práctica de esta invención. La preparación del plásmido se describe en la solicitud madre. Ha sido depositada en la cepa K561 de E. coli en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso ATCC68235.
Según se explica en las solicitudes madre, este plásmido se puede fusionar con una secuencia de ADN apropiada, y el gen híbrido se puede insertar en un soporte apropiado tal como E. coli o una bacteria gram-positiva no patógena seleccionada. Las bacterias transformadas resultantes expresarán un polipéptido de esta invención. Las bacterias gram-positivas transformadas se pueden utilizar directamente como vacuna. Alternativamente, estas bacterias se pueden utilizar en una reacción cruzada según se explica anteriormente para producir otra bacteria transformada que expresará el polipéptido deseado de manera más eficaz. El plásmido también se puede utilizar para la producción de un péptido universal mediante la inserción de un polienlazador.
Una ventaja especial de la invención es que las bacterias gram-positivas recombinantes se pueden suministrar al animal que lo necesite en el sitio de la mucosa en el que el agente patógeno invade normalmente el cuerpo. Estos sitios incluyen los sitios oral así como nasal, intestinal y vaginal. Un suministro de este tipo estimulará una respuesta inmune local en el sitio y constituirá un medio eficaz para provocar una respuesta inmune protectora contra el agente patógeno. Dado que las bacterias empleadas serán no patógenas, se podrán utilizar organismos normales para ese sitio particular sin el riesgo de efectos tóxicos. Las bacterias seleccionadas se pueden administrar a peces o a animales salvajes mezclándolo en el alimento que coman o en el agua en la que habiten.
Utilizando los mismos procesos descritos anteriormente se pueden preparar proteínas híbridas que contengan los antígenos eductores de anticuerpos mostrados en la siguiente Tabla 2 como polipéptidos activos. La tabla muestra el polipéptido que producirá anticuerpos protectores contra la infección con un agente patógeno, la enfermedad a ser protegida y la publicación que describe el polipéptido. En algunos casos, será necesario preparar e insertar en un plásmido el gen utilizado para educir el oligonucleótido que codifica un péptido. Los procesos son completamente paralelos a los procesos descritos anteriormente. La región de anclaje C-terminal puede ser cualquiera de las específicamente sugeridas anteriormente o cualquier otro segmento de anclaje de una proteína de superficie procedente de una bacteria gram-positiva descrita en la Tabla 1. El polipéptido activo de las bacterias transformadas incluirá el péptido mostrado, fusionado a la secuencia conductora y un pequeño segmento del extremo N de una proteína de superficie para permitir la translocación adecuada a la superficie de la célula.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 Secuencias de péptidos para el desarrollo de vacunas a partir de antígenos híbridos.
2
3
Las bacterias transformadas de la invención son, en efecto, agentes terapéuticos y serán tratadas como tales. Éstas se pueden utilizar solas o en asociación con soportes farmacéuticamente aceptables del tipo habitualmente empleado con agentes terapéuticos de este tipo. Para una administración por vía oral o nasal, éstas se pueden suspender en solución salina isotónica acuosa que se puede saborear o colorear. Para el suministro por vía intestinal, éstas se pueden disponer en una cápsula para suministrar las bacterias transformadas por vía oral. Otros métodos de administración resultarán fácilmente evidentes para el experto en la técnica y se encuentran dentro del alcance de la invención.
Dado que los productos de la invención se utilizan como bacterias transformadas vivas para colonizar el sitio seleccionado de administración, no se requiere ninguna dosificación específica. Típicamente, la forma de dosificación seleccionada contendrá de aproximadamente 10^{6} a 10^{10} organismos por unidad de dosificación.
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Claims (17)

1. Una proteína de superficie híbrida que incluye la secuencia de anclaje LPXTGX de un antígeno de superficie normalmente expresado por una bacteria gram-positiva fusionada a un polipéptido activo que se puede suministrar a un huésped mamífero para un fin útil.
2. Una proteína de superficie híbrida de la reivindicación 1, en la que el polipéptido activo es una enzima.
3. Una proteína de superficie híbrida de la reivindicación 1, en la que el polipéptido activo es un antígeno de superficie de una célula tumoral de mamífero.
4. Una proteína de superficie híbrida de la reivindicación 1, en la que el polipéptido activo es un antígeno de superficie de esperma masculino.
5. Una proteína de superficie híbrida de la reivindicación 1, en la que el polipéptido activo es un alergeno.
6. Una proteína de superficie híbrida de la reivindicación 1, en la que el polipéptido activo incluye un determinante antigénico de un antígeno de superficie de una bacteria, virus, parásito u hongo.
7. Una proteína de superficie híbrida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la secuencia de anclaje es la secuencia de anclaje de una proteína M de estreptococos.
8. Una secuencia de gen que codifica una proteína de superficie híbrida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un plásmido que comprende la secuencia de gen según la reivindicación 8.
10. Un cromosoma que comprende la secuencia de genes según la reivindicación 8.
11. Una bacteria gram-positiva no patógena que expresa una proteína de superficie híbrida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que secuencia de anclaje de dicha proteína está fijada a la bacteria.
12. Una bacteria gram-positiva no patógena según la reivindicación 11, en la que la proteína de superficie híbrida se expresa por un plásmido de acuerdo con la reivindicación 9.
13. Una bacteria gram-positiva no patógena según la reivindicación 11, en la que la proteína de superficie híbrida se expresa por un gen cromosómico.
14. Una vacuna para proteger un huésped animal frente a la infección por bacterias patógenas, que comprende una bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 y un soporte farmacéuticamente aceptable.
15. Un plásmido que comprende un segmento de gen para expresar la secuencia de anclaje LPXTGX de un antígeno de superficie normalmente expresado por una bacteria gram-positiva junto con un segmento de polienlazador que está separado en dos secciones por un marcador.
16. Un método in vitro para someter a ensayo una infección que se caracteriza por la presencia de anticuerpos en un fluido corporal de un animal, siendo dichos anticuerpos característicos del organismo infectante, comprendiendo dicho ensayo incubar el fluido corporal con una bacteria gram-positiva no patógena de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, la cual reaccionará con dichos anticuerpos y después determinar si ha tenido lugar una reacción.
17. Un kit útil para determinar la presencia de una infección, caracterizándose dicha infección por la presencia de anticuerpos en un fluido corporal de un animal, conteniendo dicho kit una bacteria gram-positiva no patógena que expresa una proteína de superficie híbrida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que reaccionará con dichos anticuerpos.
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