HU220420B - Gram-pozitív baktériumok hibrid sejtfelszíni fehérjéje, eljárás és készlet fertőzés kimutatására - Google Patents

Description

A találmány tárgyát fehéijéknek, beleértve a fehéije antigéneket is, Gram-pozitív baktériumok felszínére való eljuttatására, és a sejt felszínéhez való erős kötésére alkalmas termékek és eljárások képezik. Még pontosabban, a találmány tárgyát olyan fúziós fehéije előállítása képezi, 5 amely legalább egy Gram-pozitív sejtfelszíni fehéije horgonyzórégióját és bármely olyan fehéijét, peptidet vagy polipeptidet tartalmaz, amelyet hasznos céllal lehet egy állati gazdaszervezetbe bejuttatni. A találmány szerinti termékeket, amelyek fehéijéket, peptideket vagy 10 polipeptideket tartalmaznak, amint azt a későbbiekben részletesen tárgyaljuk, egy Gram-pozitív baktérium felszínére juttatjuk, amely arra használható, hogy ezt az anyagot immunogén válasz, például védő antitestek termelése, vagy egyéb hasznos eredmény kiváltása céljából 15 egy állati gazdaszervezetbejuttassuk. A fehéije, a peptid vagy a polipeptid lehet például egy enzim, vagy egyéb, speciális célokra szükséges funkcionális fehérje. Lehet egy baktériumból, vírusból, parazitából vagy gombából származó antigén determináns. Lehet emlőstumorsejtből 20 származó, vagy sperma eredetű sejtfelszíni antigén. Lehet egy allergén, azaz például egy méhméreg. A találmány tárgyát képezik az ilyen fúziós fehérjék előállításában alkalmazott új plazmidok, gének, kromoszómák és transzformált baktériumok. A találmány tárgyát továbbá 25 olyan új vakcinák képezik, amelyek olyan Gram-pozitív baktériumokat alkalmaznak, amelyeket arra terveztek, hogy egy állati gazdaszervezetbe egy olyan idegen antigént juttassanak el, amely normális körülmények között egy patogén mikroorganizmuson található, amely kap- 30 csolatban áll a patogén mikroorganizmus virulenciájával, és amely bemutatja az antigéneket, azzal a céllal, hogy a gazdaszervezetet megvédjék a patogén mikroorganizmus által okozott fertőzés vagy betegség ellen.

A találmány szerinti termékek diagnosztikai reagen- 35 sekként is használhatók.

A találmány tárgyát képezik azok az eljárások, amelyekkel a baktérium felszínére juttatott enzimeket számunkra lényeges specifikus területekre lehet eljuttatni.

Az „állat” szakkifejezés a továbbiakban élőlények- 40 re vonatkozik, beleértve az emlősöket, azaz például az embert; szarvasmarhákat, főleg a szarvasmarhaboijakat; birkákat és kecskéket; szárnyasokat, főleg a csirkéket, kacsákat és pulykákat; valamint a halakat, főleg azokat, amelyeket halgazdaságokban termelnek, ilyen 45 például a lazac, a pisztráng és a törpeharcsa. A találmány különösen fontos az emlősök számára.

A találmány lényege, hogy eljárást ad új, apatogén Gram-pozitív baktériumok előállítására, amelyek egy hibrid felszíni fehérjét expresszálnak, amely lehet egy hibrid sejtfelszíni antigén, amely két fő részből áll, azaz egy rögzítőrészből, amely aminosavcsoportokból és egy N-terminális aktív polipeptid szegmentből, amelyeket az alábbiakban külön-külön meghatározunk és részletesen megtárgyalunk.

A találmány jobban érthető lesz, ha megismerjük az M fehérjét és szerkezetét. Az M fehéije egy hurkokat képező sejtfelszíni antigén, amely az A csoportba tartozó sztreptokokkuszok, azaz Gram-pozitív baktériumok virulenciafaktora. Az M6 típusú Streptococcus pyogenes 441 aminosavat tartalmaz.

A szerkezetét az alábbiakban részletesebben meghatározzuk, de hasznos lesz az is, hogy megbeszéljük ennél a pontnál a sejthez kapcsolódó régiót. A aminosavak standard egybetűs kódját alkalmazva, az M6 fehérje sejthez kapcsolódó régiója horgonyzórégiójának szerkezetét a 407-es és a 441-es aminosavak között az alábbiakban ismertetjük:

LPSTGETANPPFFTAAALTVMATAGVAAWK

RKEEN.

A horgonyzórégió N-terminálisa első leucincsoportjától olvasva a régió tartalmazza az LPSTGE szegmentet, a TAN térkitöltő szegmentet, amely három aminosavból áll, egy húsz aminosavból álló hidrofób szegmentet, PFFTAAALTVMATAGVAAVV-t, ezt követi egy erősen töltött farokszegment, a KRKEEN.

Gram-pozitív baktériumokból származó nagyszámú fehérje szerkezetének tanulmányozása során megfigyelték, hogy az M6 fehérje előzőkben említett horgonyzórégiója erősen konzerválódik a Gram-pozitív baktériumok összes ismert sejtfelszíni fehérjéi között. Ezek közül számosat Fischetti és munkatársai mutatnak be [Fischetti, V. A., V. Pancholi and O. Schneewind, Mól. Microbiol., 4, 1603 (1990)]. A hidrofób szegmens általában körülbelül 15-20 aminosavat tartalmaz, a töltött farokszegment körülbelül 4-6 aminosavat tartalmaz, a térkitöltő szegment pedig körülbelül 3-6 aminosavat tartalmaz. A legfigyelemreméltóbb azonban az igen nagy mértékű, gyakorlatilag 100%-os homológia az ismert sejtfelszíni fehérjék LPSTGE szegmentjében. Az előforduló variációk majdnem kizárólag a 3-as és 6-os pozícióban találhatók. Tehát a régiót tulajdonképpen LPXTGX formájában írhatjuk le.

Az alábbi 1. táblázatban ennek a homológiának az igen jelentős mértéke látható, ez idáig negyven, Grampozitiv baktériumból származó, különböző sejtfelszíni fehérjét megvizsgálva.

1. táblázat

Ncv/gén	Sejtfelszíni fehérje	Szervezet	LPSTGE	Ref.
1.	M6	M fehérje	S. pyogenes	LPSTGE	(2)
2.	M5	M fehéije	S. pyogenes	LPSTGE	(3)
3.	M12	M fehérje	S. pyogenes	LPSTGE	(4)
4.	M24	M fehérje	S. pyogenes	LPSTGE	(5)
5.	M49	M fehérje	S. pyogenes	LPSTGE	(6)
6.	M57	M fehérje	S. pyogenes	LPSTGE	(7)

HU 220 420 Β1

1. táblázat (folytatás)

Név/gén	Sejtfelszíni fehérje	Szervezet	LPSTGE	Ref.
7.	M2	M fehétje	S. pyogenes	LPSTGE	(8)
8.	ARP2	IgA-kötő fehérje	S. pyogenes	LPSTGE	(8)
9.	ARP4	IgA-kötő fehéije	S. pyogenes	LPSTGE	(9)
10.	FcRA	Fc-kötő fehéije	S. pyogenes	LPSTGE	(10)
11.	ProtH	humán IgG Fc kötő	S. pyogenes	LPSTGE	(Π)
12.	SCP	C5a peptidáz	S. pyogenes	LPTTND	(12)
13.	T6	proteázrezisztens fehéije	S. pyogenes	LPSTGS	(13)
14.	bac	IgA-kötő fehérje	Gr. B strep	LPYTGV	(14)
15.	ProtG	IgG-kötő fehérje	Gr, G strep	LPTTGE	(15)
16.	PAc	felszíni fehérje	S. mutáns	LPNTGE	(16)
17.	spaP	felszíni fehérje	S. mutáns	LPNTGE	(17)
18.	spaA	felszíni fehétje	S. sobrinus	LPATGD	(18)
19.	wapA	sejtfalhoz kötött protein A	S. mutáns	LPSTGE	(19)
20.	Sec 10	felszíni fehétje	E. fecalis	LPQTGE	(20)
21.	AsclO	felszíni fehéije	E. fecalis	LPKTGE	(20)
22.	Asal	aggregációs anyag	E. fecalis	LPQTGE	(21)
23.	ProtA	IgG-kötő fehérje	S. aureus	LPETGV	(22)
24.	FnBP	fibronectinkötő fehéije	S. aureus	LPETGG	(23)
25.	wg2	sejtfalproteáz	S. CTemoris	LPKTGE	(24)
26.	InlA	intemalizáló fehérje	L. monocitogenes	LPTTGE	(25)
27.	Rojt	1-es típusú rojt	A. viscosis	LPLTGA	(26)
28.	Rojt	2-es típusú rojt	A. naeslundi	LPLTGA	(27)
29.	Mrp4	IgG/fibrinogén kötés	S. pyogenes	LPSTGE	(10)
30.	sof22	szérumopacitási faktor	S. pyogenes	LPASGD	(54)
31.	Sfb	fibronektinkötés	S. pyogenes	LPATGD	(55)
32.	ProtL	könnyűlánckötés	P. magnus	LPKAGS	(56)
33.	bca	alfa-antigén	Gr. B strep	LPATGE	(57)
34.	ínba	fibronectinkötés	S.dysgalactiae	LPQTGT	(58)
35.	fnbB	fibronectinkötés	S.dysgalactiae	LPAAGE	(59)
36.	EmmGl	M fehéije	Gr. G strep	LPSTGE	(60)
37.	DG12	albuminkötő fehérje	Gr. G strep	LPSTGE	(61)
38.	MRP	felszíni fehéije	S. suis	LPNTGE	(62)
39.	FnBp	fibronektinkötő fehéije	S. aureus	LPETGG	(63)
40.	cna	kollagénkötő fehérje	S. aureus	LPKTGM	(64)

Referenciák:

(2) Hollingshead, S. K., V. A. Fischetti and J. R. Scott,

J. Bioi. Chem., 261, 1677 (1986) (3) Miller, L., L. Gray, Ε. H. Beachey and M. A. Kehoe, J. Bioi. Chem., 263, 5668 (1988) (4) Robbins, J. C., J. G. Spanier, S. J. Jones, W. J. Simpson and P. P. Cleary, J. Bacteriol., 169, 5633 (1987) (5) Mouw, A. R., Ε. H. Beachey and V. Burdett, J. Bacteriol., 170, 676 (1988) (6) Haanes, E. J. and P. P. Cleary, J. Bacteriol., 171, 6397 (1989) (7) Manjula, B. N., K. M. Khandke, T. Fairwell, W. 50 A. Relf and K. S. Srikapash, J. Protein Chem., 10,

369(1991) (8) Bessen, D. E. and V. A. Fischetti, Infect. Immun., 60, 124 (1992) (9) Frithz, E., L-O. Heden and G. Lindahl, Molec. 55 Microbiol.,3, 111 (1989) (10) Heath, D. G. and P. P. Cleary, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4741 (1989) (11) Gomi, Η., T. Hozumi, S. Hattori, C. Tagawa, F. Kishimoto and L. Bjorck, J. Immunoi., 144, 4046 (1990)

HU 220 420 Bl (12) Chen, C. C. and P. P. Cleary, J. Bioi. Chem., 265, 3161 (1990) (13) Schneewind, Ο., K. F. Jones and V. A. Fischetti, J. Bacteriol., 172, 3310(1990) (14) Heden, L-O., Frithz and G. Lindahl, Eur. J. Immunoi. (1991) (15) Olsson, A., M. Ellásson, B. Guss, B. Nilsson, U. Hellman, M. Lindberg and M. Uhlen, Eur. J. Biochem., 168, 319 (1987) (16) Okahashi, N., C. Sasakawa, S. Yoshikawa, S. Hamada and T. Koga, Molec Microbiol., 3, 673 (1989) (17) Kelly, C., P. Evans, L. Bergmeier, S. F. Lee, -Fox Progulske, A., A. C. Harris, A. Aitken, A. S. Bleiweis and T. Lemer, FEBS Lett., 258, 127 (1990) (18) Tokuda, Μ., N. Okahashi, I. Takahashi, M. Nakai, S. Nagaoka, M. Kawagoe and T. Koga, Infec. Immun., 59, 3309 (1991) (19) Ferretti, J. J., R. R. B. Russell and M. L. Dao, Molec. Microbiol., 3, 469 (1989) (20) Kao, S-M., S. B. Olmsted, A. S. Viksnis, J. C. Gallo and G. M. Dunny, J. Bacteriol., 173, 7650 (1991) (21) Galli, D, F. Lottspeich and R. Wirth, Molec. Microbiol., 4, 895 (1990) (22) Guss, B., M. Uhlen, B. Nilsson, M. Lindberg, J. Sjoquist and J. Sjodahl, Eur. J. Biochem., 138, 413 (1984) (23) Signas, C., G. Raucci, K. Jonsson, P. Lindgren, G. M. Anantharamaiah, M. Hook and M. Lindbergh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 699 (1989) (24) Kok, J., K. J. Leenhuts, A. J. Haandrikman, A. M. Ledeboer and G. Venema, Appl. Environ. Microbiol., 54, 231 (1988) (25) Gaillard, J. K, P. Berche, C. Frehel, E. Gouin and P. Cossart, Cell, 65, 1 (1991) (26) Yeung, Μ. K. and J. O. Cisar, J. Bacteriol., 172, 2462 (1990) (27) Yeung, Μ. K. and J. O. Cisar, J. Bacteriol., 170, 3803 (1988) (54) O’Toole, P., L. Stenberg, M. Rissler and G. Lindahl, „Two major classes in the M protein family in group A streptococci”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8661 (1992) (55) Rakonjac, J. V., J. C. Robbins and V. A. Fischetti, „Cloning and sequencing of the gene encoding the serum opacity factor of Streptococcus pyogenes: variadon among different M types” (submitted) (1992) (56) Talay, R. S., P. Valentin-Weigand, P. G. Jerlstrom,

K. N. Timmis and G. S. Chhatwal, „Fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes: sequence of the binding domain involved in adherence of streptococci to epithelial cells”, Infect. Immun., 60, 3837 (1992) (57) Kastem, W., U. Sjobring and L. Bjorck, „Structure of peptostreptococcal protein L and Identification of a repeated immunoglobin light chain-binding domain”, J. Bioi. Chem. (1992) (58) Michel, J. L., L. C. Madoff, K. Olson, D. E. Kiing, D. L. Kasper and F. M. Ausubel, „Large, identical, tandem repeating units in the C protein alpha antigén gene, bca, of group B streptococci”, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 89, 10060 (1992) (59) Lindgren, P-E., M. J. McGavln and C. Signas,“The nucleotide sequences of two different genes coding fór fibronectin-binding proteins írom Streptococcus dysgalactiae and Identification of the binding domain”, Molec. Microbiol. (1992) (60) Collins, C. M., A. Kimura and A. L. Bisno, „Group G streptococcal M protein exhibits structural features analogous to those of calss I M protein of group A streptococci”, Infect. Immun., 60, 3689 (1992) (61) Sjobring, U. „Isolation and molecular characterization fór a növel albumin-binding protein írom group G streptococci”, Infect. Immun., 60, 3601 (1992) (62) Smith, Η. E., U. Vecht, A. L. J. Gielkens and M. A. Smits, „Cloning and nucleotide sequence of the gene encoding the 136 kilodalton surface protein (muramidase-released protein) of Streptococcus suis type 2”, Infect. Immun., 60, 2361 (1992) (63) Jonsson, J., C. Signas, H-P. Muller and M. Lindberg, „Two different genes encode fibronectin binding proteins in Staphylococcus aureus, Eur. J. Biochem., 202, 1041 (1991) (64) Patti, J. Μ., H. Jonsson, B. Guss, L. M. Switalski, K. Wiberg and M. Hook, „Molecular characterization and expression of a gene encoding a Staphylococcus aureus collagen adhesin”, J. Bioi. Chem., 267, 4766 (1992)

Az nyilvánvaló, hogy a Gram-pozitív baktériumok felszíni fehérjéi eme nagyon homológ régiója lényeges ahhoz, hogy a bakteriális felszíni fehéqéket a sejthez horgonyozzuk [Schneewind, Ο. V., Pancholi, and V. A. Fischetti, In: Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci. G. M. Dunny, P. P. Cleary and L. L. McKay. ASM Publications, Washington, 152 (1991)]. Ez a szegment, amelyet a továbbiakban LPXTGX szegmentnek nevezünk, a felszíni fehérje sejthez kötődő régiójának lényeges szegmentje, ahhoz, hogy a fehérjéket a Gram-pozitív baktériumok felszínéhez rögzítsük.

Ezt a felfedezést Schneewind és munkatársai megerősítették [Schneewind et al., Cell, 70, 267 (1992)]. A Staphylococcus aureus Protein A molekula felhasználásával ezek a kutatók megállapították, hogy a komplett komplex (LPXTGX motívum, hidrofób dómén és töltött farok) szükséges ahhoz, hogy a Protein A molekulát eljuttassuk a sejt felszínére, és az LPXTGX motívumban tett változtatások, illetve az ebben végzett deléciók nem gátolják a molekula expresszióját, de megakadályozzák, hogy a felszínhez rögzüljön.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékletben megadott ábrákat.

Az 1. ábrán Gram-pozitív baktériumokból származó különböző sejtfelszíni antigének C-terminális régiói aminosavszekvenciái és az expresszálásukra használt génszegmentek láthatók egymás alá helyezve. Az LPSTGE motívumot árnyékoltuk, és a fehérjéket ennek a konszenzusszekvenciának megfelelően Igazítottuk egymás alá. 11 fehérjéből tízben egy konzerválódott lizincsoport volt található 2-3 csoporttal a konszenzus

HU 220 420 Β1

LPSTGE szekvencia előtt (keretezve). A homológ karboxiterminális hidrofób régiók is be vannak keretezve. A bal oldali oszlopban használt rövidítések ugyanazok, mint amiket az 1. táblázatban használtunk.

A 2. ábrán az M fehérje modellje látható.

A 3. ábrán az M6 fehérje komplett aminosavszekvenciája látható.

A 4. ábrán a GP232-pVMB20 gazdavektorrendszer látható.

Az 5. ábrán az M6:E7 transzlációs fúzió készítése és GP246-ba való integrálódása látható.

A 6. ábrán azoknak a vizsgálatoknak az eredménye látható, amelyeket arra terveztünk, hogy igazoljuk azt, hogy a Streptococcus gordonii 246-ban expresszálódott M6: E7 fúziós fehérje a sejt felszínén található.

A 7. ábra azt mutatja be, hogy a rekombináns Streptocuccus gordonii 246 sejtkivonatai expresszálják az M6: E7 fúziós fehérjét.

A 8. ábrán az látható, hogy a rekombináns GP246tal immunizált állatok az E7 fehérjével reagáló antitesteket termelnek.

A 9. ábrán a találmányban szereplő univerzális plazmid látható.

A 10. ábrán a találmány egy tipikus hibrid fehérjéje látható.

A 11. és 12. ábrán azoknak a vizsgálatoknak az eredményei láthatók, amelyekben egereket kezeltünk a találmány szerinti hibrid fehérjével.

A 2. és 3. ábra alapos tanulmányozása hozzásegít a találmány megértéséhez. A 2. ábrán az M fehérje modellje látható, amelyen bizonyos szegmenteket és pozíciókat azonosítottak. A 3. ábrán az M6 fehérje teljes szerkezetében található egyes aminosavak azonosítása látható.

Az alábbiakból nyilvánvaló lesz, hogy az M fehérjének az a szegmentje, amelyet a 2. ábrán úgy azonosítottunk, mint a sejthez kötődő régiót, analóg más Grampozitív baktériumokon, például amelyeket az 1. táblázatban listáztunk, talált sejtfelszíni fehérjék régióival. Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, magas fokú homológia létezik, különösen a rögzítőszekvenciában, és főleg az LPXTGX szegmentben, amely az összes Gram-pozitív sejtfelszíni fehérjében megtalálható. Amint azt az alábbiakban ismertetjük, valamint a találmány illusztrálása céljából, az M fehérjét expresszáló gén 122-300as régióját genetikai módszerekkel eltávolítjuk, majd egy új, egy idegen fehérjét, például egy antigént, amely hasznos antitesteket termel, expresszáló géndarabbal helyettesítjük, ezáltal egy új, hibrid sejtfelszíni fehérjét hozunk létre. Az összes Gram-pozitív baktérium sejthez kapcsolódó régióiban meglevő magasfokú homológra következtében a hibrid gént bármely Gram-pozitív baktériumban használhatjuk. A kiválasztott baktériumok expresszálják a tervezett hibrid fehérjét, és a rögzítőrégiót használják arra, hogy a molekulát a sejthez rögzítsék, és a beépített aktív szegmentet a sejt felszínéhez juttassák. A beépített aktív szegmentet a továbbiakban az „aktív polipeptid” kifejezéssel említjük.

Az „aktív polipeptid” szakkifejezést a továbbiakban a lehető legszélesebb értelemben használjuk. Bármely olyan pepiidre, polipeptidre vagy fehérjére vonatkozik, amelyet egy állati szervezetbe bármely hasznos céllal el lehet juttatni. Például, amint azt a továbbiakban részletesen ismertetjük, a Gram-pozitív baktériumok egy fehérjéjének sejthez kötődő régióját egy patogén virális fehérje egy szegmentjéhez lehet fuzionáltatok és így hibrid sejtfelszíni fehéijét lehet előállítani, amelyet apatogén baktériumok expresszálnak. A baktériumok megtelepednek egy állati gazdaszervezetben és vakcinaként működnek. Ezáltal az állati szervezetben antitestek képződését váltják ki, amely védelmet nyújt, illetve gátolja a vírusfertőzést. A fuzionáltatott virális szegment az „aktív polipeptid”-je a találmány eme megvalósítási módjának.

Az egyszerűség céljából a „polipeptid” szakkifejezést a továbbiakban alkalmazzuk olyan molekulákra, amelyek elég nagy molekulasúllyal rendelkeznek ahhoz, hogy fehérjéknek lehessen nevezni őket, valamint alacsonyabb molekulasúlyú termékekre, amelyeket általában polipeptideknek nevezünk, valamint olyan termékekre, amelyeknek még ennél is kisebb a molekulasúlyuk, és általában peptideknek nevezzük őket.

Az „aktív polipeptid” bármely olyan polipeptid lehet, amelyet egy állatnak hasznos céllal be lehet juttatni. Lehet például az előzőkben említett virális szegment. Lehet emellett egy antigén, bármely patogén vírusból, baktériumból, parazitából vagy gombából. Az ilyen esetekben az aktív polipeptid lehet a komplett antigén, az antigén antigén determinánsa vagy az antigén egy szegmentje, amely tartalmazza az antigén determinánst. A hasznos cél az, hogy védő immunválaszt váltsunk ki antitestek termelődése révén, illetve sejtes immunválaszt váltsunk ki az antigénnel szemben.

A „sejthez kapcsolódó régió” szakkifejezést a leírásban és az igénypontokban könnyen meg lehet érteni az ábrák, főleg a 2., 3. és 10. ábra alapján. Látható, hogy a sejthez kapcsolódó régió tartalmaz egy, a sejtfalon átnyúló aminosavszekvenciát és egy szénhidráthoz kötődő szegmentet. A falon átnyúló szekvenciát ki lehet hagyni a találmány szerinti hibrid fehérjékből, jóllehet pillanatnyi ismereteink szerint ez nem előnyös.

A sejthez kapcsolódó régió tartalmazza a rögzítőrégiót is, amely a rögzítő szegmentet (LPXTGX), a térkitöltő szegmentet, a hidrofób szegmentet és a töltött farokszegmentet tartalmazza. A rögzítőszekvencia lényeges eleme a találmány szerinti hibrid fehérjéknek. A rögzítőszekvencia nélkül a hibrid fehérje nem marad a Gram-pozitív bakteriális hordozó felszínén.

A 10. ábrán egy, a találmány szerinti tipikus hibrid fehérje összetételét látjuk, amely, amint látható, tartalmazza az aktív polipeptidet, a sejthez kötődő régióhoz fuzionáltatva. Az ábrán látható még egy leader szegment és egy kis N-terminális szegment az aktív polipeptid aminoterminális részén. Ezek a szegmentek együttműködnek abban, hogy a hibrid fehérjét a Grampozitív baktériumok felszínén megfelelően elhelyezzék. Ennek a leader szegmentnek az a szerepe, hogy lehetővé tegye a hibrid fehérje megfelelő processzálását a sejten belül. Az N-terminális szegment a leader szegmenttel együttműködve lehetővé teszi, hogy a leader

HU 220 420 Bl peptidázenzim leválassza a leader szegmentet az N-terminális szegmentről, és lehetővé teszi, hogy a hibrid fehérje a megfelelő pozíciót felvegye a baktériumok felszínén. A leader szegment és az N-terminális szegment ugyanabból a sejtfelszíni fehérjéből származik, mint a sejthez kapcsolódó régió fehérjéje. Az N-terminális szegment megfelelő módon tartalmazza az első néhány aminosavat, amelyek a hibrid fehéijesejthez kapcsolódó régiójában használt fehéije N-terminálisáról származnak. A helyes processzáláshoz körülbelül tíz ilyen csoport elegendő, de olyan szegmentek is használhatók, amelyek húsz, vagy még több aminosavcsoportot tartalmaznak.

Az aktív polipeptid nem szükségszerűen egy patogén szervezetből származó antigén. Lehet például egy enzim is. Ebben az esetben a hasznos cél az, hogy az enzimet egy apatogén baktérium felszínén az állati gazdaszervezet specifikus pontjára juttassuk el, amely pontban ez az apatogén baktérium megtelepedett.

Az aktív polipeptid lehet a komplett molekula, amely tartalmazza az enzimet. Egy másik lehetőség az lehet, hogy csak azt a szegmentet tartalmazza, amely a hasznos cél eléréséhez szükséges.

Az aktív polipeptid lehet egy antigén, amely reakcióba lép a patogén mikroorganizmusok által kiváltott antitestekkel. Az ilyen aktív polipeptid antigéneket hordozó, a találmány szerinti baktériumok diagnosztikai reagensekként használhatók.

Amikor a továbbiakban apatogén baktériumokra hivatkozunk, akkor ezek természetesen lehetnek Grampozitív együtt élő baktériumok, valamint patogén baktériumok, amelyeket úgy módosítottunk vagy attenuáltunk a szokványos eljárások alkalmazásával, hogy patogenitásuk legyengüljön vagy megszűnjön, és amelyek hibrid fehéijéket expresszálnak az alábbiakban ismertetett eljárás szerint, és ezek a hibrid fehérjék az LPXTGX régiót tartalmazó C-terminális régióval rendelkeznek.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmány szerinti eljárást.

A találmány tárgyát apatogén Gram-pozitív baktériumok képezik, amelyek legalább egy hibrid sejtfelszíni fehérjét expresszálnak, amelynek a C-terminális régiója a baktériumokhoz kötődik. A C-terminális régió tartalmazza anélkül, hogy csak erre korlátoznánk magunkat, egy, normális körülmények között Gram-pozitív baktériumok (ezek lehetnek patogének és apatogének is) által expresszált sejtfelszíni fehéijesejthez kapcsolódó régiójának C-terminális régióját. A hibrid sejtfelszíni fehérje tartalmaz egy aktív polipeptidet, amely az állati gazdaszervezetbe bármely hasznos cél elérése érdekében bejuttatható. A jelen találmány szerinti baktériumok által „normális körülmények között előállított” sejtfelszíni fehérje a baktériumok által termelt teljes fehérjére vonatkozik, arra az állapotra, amelyben akkor volt, mielőtt a jelen találmány szerinti eljárással genetikailag megváltoztattuk volna.

Amint az a korábbi vizsgálatokból ismert [Pancholi, V. and V. A. Fischetti, J. Bacteriol., 170, 2618-2624 (1988)], és a 2. valamint a 3. ábrán jelezzük, az M fehérje 298-441-es aminosavait a sejt borítja, míg az

1-297-es aminosavcsoportok a bakteriális sejt felszínén találhatók. A jelen találmány szerint az alábbiakban ismertetett és illusztrált genetikai manipulációk alkalmazásával az M fehérjének majdnem az összes, a sejtfelszínen található régiója eltávolítható, és egy olyan aktív polipeptiddel helyettesíthető, amely az M fehéije C-terminális sejthez kapcsolódó régiójához kötődik, és így állítható elő egy, a találmány szerinti hibrid sejtfelszíni fehéije. Mivel a sejthez kapcsolódó régió lényegében azonos az összes Gram-pozitív sejtfelszíni molekulában (10. ábra), hasonló stratégia használható, mely szerint bármely említett molekula, sejthez kapcsolódó régiója használható hordozóként arra, hogy egy aktív polipeptidet egy más forrásból a célba juttasson. A hibrid sejtfelszíni fehéije expresszálására használt új gént standard technikák alkalmazásával beépíthetjük egy plazmidba, és a plazmidot arra használhatjuk, hogy Escherichia colit vagy egyéb hordozót transzformáljunk vele. Az Escherichia coli azután expresszálja az új fúziós fehérjét, azaz a találmány szerinti hibrid fehérjét. Az Escherichia coli-eljárás jól használható arra, hogy nagy mennyiségű hibrid fehéijét állítsunk elő, amelyet azután ennek a Gram-negatív szervezetnek a periplazmatikus régiójából lehet izolálni. A jelen találmány legtöbb alkalmazása szempontjából az az előnyös, ha a hibrid fehéijét Gram-pozitív baktérium felszínén állítjuk elő. A találmány szerint készített rekombináns géneket bármely Gram-pozitív baktérium képes processzálni.

Egy másik lehetőség, hogy a fúziós gént tartalmazó, újonnan készített plazmidot használhatjuk arra, hogy a fúziós gént egy Gram-pozitív baktérium kromoszómájába integráljuk, például a Streptococcus mutáns kromoszómájába. Az újonnan készített Streptococcus mutáns törzs azután termeli a találmány szerinti új hibrid fehérjét, a sejt felszínére expresszálva. Jelenleg ezt az eljárást tekintjük előnyösnek a jelen találmány szerinti termékek előállítására.

Számos különböző mikroorganizmusból származó antigénpolipeptidet használhatunk a találmány szerinti aktív polipeptidként. Ezek közé tartoznak embereket és állatokat fertőző patogén mikroorganizmusok. Az alábbiakban közöljük azt a jellemző listát, amelyben azok a tipikus mikroorganizmusok találhatók, amelyek a jelen találmány gyakorlata szempontjából hasznos polipeptideket expresszálnak. A találmány szerinti transzformált baktériumok használhatók a mikroorganizmus fertőzés által okozott betegségek kezelésére vagy megelőzésére.

Gombák: Candida albicans, Aspergillus fúmigatus, Histoplasma capsulatum (mindegyik megtermékenyítés! problémákat okoz), Microsporum canis (állati gyűrűféreg)

Parazitaprotozoák: Plasmodium falciparum (malária), Trypanosoma cruzi (álomkór)

Spirochéták: Borrelia bergdorferi (Lyme-betegség), Trepanoma pallidum (szifilisz), Borrelia recurrentis (váltóláz), Leptospira icterohaemorrhagie (leptospirózis)

Baktériumok: Neisseria gonorrhoea (gonorrea), Staphylococcus aureus (szívbelhártya gyulladás), Streptococcus pyogenes (reumás

HU 220 420 Bl láz), Salmonella typhosa (szalmonellózis), Hemophilus influenzáé (influenza), Bordetella pertussis (szamárköhögés), Actinomyces israelii (aktinomiózis), Streptococcus mutáns (fogszuvasodás)

Streptococcus equi - takonykór (lovak)

Streptococcus agalactiae - (szarvasmarha-tőgygyulladás)

Streptococcus anginosus - (kutya-genitálisfertőzés)

Vírusok: humán immunhiányos tünetegyüttest okozó vírus (HÍV), poliovirus, influenzavírus, rabies vírus, herpeszvírus, száj- és körömfájásvírus, papagájkórvírus, paramyxovírus, Myxovírus, koronavírus.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint egy apatogén Gram-pozitív baktériumot, amely a gazdaszervezettel együtt él, használunk arra, hogy a hibrid fehéqét expresszáljuk a felszínén, oly módon, hogy a hibrid fehérjét kódoló gént az apatogén Gram-pozitív baktériumba építjük be. Ha a fúziót egy olyan aktív polipeptiddel hajtjuk végre, amely egy aktív polipeptid, azaz egy patogén szervezetből (baktérium, vírus, parazita vagy gomba) származó antigén, és a kapott, a hibrid antigént expresszáló együtt élő baktériumot egy állati gazdaszervezetbe juttatjuk be, akkor immunológiai választ kapunk, mind humorális, mind celluláris úton. Az egyik lehetséges immunológiai válasz az antitestek termelése, és ezáltal a patogén fertőzéssel szemben való védekezés. Ha a fúziót egy enzimmel hajtjuk végre, akkor az enzim az együtt élő baktérium felszínén expresszálódik. Számos különböző aktív polipeptidet lehet Gram-pozitív baktériumok felszínére eljuttatni, amint az az alábbi leírásból nyilvánvaló lesz a szakterületen jártas szakember számára.

A találmány szerinti géneket, plazmidokat, kromoszómákat és transzformált baktériumokat a szakterületen jártas szakember számára jól ismert rekombináns technikákkal állítjuk elő. Például egy oligonokleotidot vagy egy vírus-burokfehérjét kódoló restrikciós ffagmentet, egy bakteriális sejtfelszíni antigén virulenciafaktorát (vagy tulajdonképpen a komplett antigént), egy enzimet, vagy egyéb, a találmány szerinti hibrid sejtfelszíni fehéije számunkra fontos egyéb alkotóelemét ligálhatjuk ahhoz a génhez, amely az M fehérje, vagy egyéb, Gram-pozitív baktériumokból (ezeknek listája az 1. táblázatban látható) származó ismert sejtfelszíni fehérjesejthez kapcsolódó régióját kódolja. A keletkező hibrid gént használjuk egy Gram-pozitív baktérium transzformálására, hogy ezzel egy, a találmány szerinti sejtfelszíni fehérje termelését elindítsuk.

A jelen találmány tovább értelmezhető az M6:E7 hibrid fehérje Streptococcus gordonii GP246 törzs által való expressziójával. Ez a hibrid antigén tartalmazza az M6 fehérje C-terminális sejthez kapcsolódó szegmentjét. Az antitestek termelődését kiváltó E7 polipeptid a papillomavírus törzs egy korai fehérjéje.

A Streptococcus gordonii egy a szájüregben élő baktérium. Az E7 egy 98 aminosavból álló korai fehérje, amely a 16-os típusú humán papillomavírus (HPV16) replikációja során keletkezik. Ez egy onkofehérje, amellyel szembeni antitestek megtalálhatók a nyakrákban szenvedő betegekben. Ezt az egyik legjelentősebb antigénjelöltnek tekintik a HPV által okozott rosszindulatú neopláziák elleni vakcinákban.

A jelen találmány szerinti új baktériumokat a 4. és 5. ábrán bemutatott standard homológ rekombinációval lehet előállítani. Amint azt bemutatjuk, a Streptococcus gordonii egy új törzsét, a GP232-t, amely nagy mennyiségben expresszálja az M6 fehérjét, használjuk gazdaszervezetként az új, GP246 törzs előállítására.

Az alkalmazott, a 4. és 5. ábrán bemutatott eljárás standard eljárás, és a szakterületen jártas szakemberek széles körben alkalmazzák. A technológia, amint azt bemutatjuk, arra szolgál, hogy egy Gram-pozitiv gazdaszervezetet hozzunk létre a fúziós génnek a kromoszóma random pozíciójába való beillesztése céljából, aminek az az eredménye, hogy a fúziós gén magas szinten expresszálódik. Az inszerciós pont szervezetről szervezetre változhat, illetve még az adott szervezeten belül is más lehet. A módszer előnye, hogy biztosítja azt, hogy a beillesztett gén egy olyan pozícióban legyen, amely biztosítja a fúziós gén magas szintű expresszióját, ahelyett, hogy az expressziót egy idegen promoterről biztosítaná. Azaz a módszer biztosítja, hogy egy erős promotert tartalmazó régiót válasszunk.

Az új GP246 törzs előállítása során az M6 fehérének a KpnI és HindlII hasítási helyek közötti 538 bázispárméretű szegmentjét kivágjuk az új, pVMB20 plazmidból, amelyet az alábbiak szerint állítunk elő, majd az E7-et kódoló 294 bázispárt illesztjük erre a helyre, így kapunk egy új gént, amelyet az új, pVMB21 plazmid előállítása során használunk. Az M fehérjéből kivágott régió azt eredményezi, hogy az E7 molekulát a sejt felszínén az M6 N-terminálisának egy 120 aminosavból álló szegmentje helyettesíti, beleértve az E7 Nterminálisához fuzionált leader szegmentet is. A konstrukciót Escherichia coliban készítjük el, és a rekombináns plazmidot használjuk a S. gordonii transzformálására, a GP232-vel végzett standard dupla átkeresztezéses eljárással, hogy ezzel előidézzük a gén kromoszomális integrációját, amely gén az új, GP246 jelű törzsben az M6: E7 fehéqét expresszálja.

Anyagok és módszerek

Rekombináns DNS-technikák

A génfúziókat Escherichia coli-vektorokban standard eljárásokkal hozzuk létre [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1982)].

Streptococcus transzformáció

A természetes kompetenciával rendelkező S. gordonii Challis fagyasztott sejtjeit ismert eljárásokkal állítjuk elő és transzformáljuk [Pozzi, G., R. A. Musmanno, P. M. Lievens, M. R. Oggioni, P. Plevani and R. Manganelli, Rés. Microbiol., 141, 659-670 (1990)]. A szélesztést és a transzformánsok megszámlálását a többrétegű lemezeken 5 pg/ml eritromícinnek a rétegzőagarban való alkalmazásával végeztük [Pozzi, G., R. A. Musmanno, M. Stellini and A. M. Molina, FEMS Microbiol. Lett., 48, 189 (1987)].

HU 220 420 Β1

A transzformánsok genetikai elemzése

A transzformánsokat 3 véres agarlemezre kenjük ki, a telepeket fogpiszkálóval vive át a szelekciós lemezről. Az első lemez 5 pg/ml eritromicint tartalmaz, a második 5 pg/ml kloramfenikolt tartalmaz, míg a harmadik nem tartalmaz antibiotikumot. A lemezeket 36 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. Az inkubálás után egy nitrocellulózmembránt teszünk annak a lemeznek a felszínére, amely nem tartalmaz antibiotikumot, majd 20 percig szobahőmérsékleten hagyjuk. A membránt azután 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd 15 percre 80 °C-os vákuum szárítószekrénybe tesszük. A nitrocellulózhoz kötődött E7 fehérje jelenlétét anti-E7 poliklonális antitestekkel mutatjuk ki (1:5000 hígítás), amelyet Escherichia coliban termelt MS2: E7 fúziós fehérjével immunizált nyulakból nyertünk [Tommasino, Μ., M. Contomi, V. Scurlato, M. Bugnoli, K. Maundell, and P. Cavalieri, Gene 93, 265 (1990)].

Immunfluoreszcencia

Todd-Hewitt-tápfolyadékban (Difco) szaporított baktériumokat a késői exponenciális fázisban kinyerjük, üveglemezekre visszük, majd metanollal fixáljuk. A lemezeket M6- vagy E7-specifikus antitestekkel kezeljük (1:50 hígításban), alaposan mossuk, majd kecske-antinyúl (vagy antiegér) IgG antiszérummal reagáltatjuk (1:1000 hígításban), rodaminnal konjugáltatva. Az eredményeket Confocal Fluorescence Imaging System MRC-500 Bio-Rad mikroszkóppal figyeljük meg.

A sejtkivonatok Western-blot elemzése

A sztreptokokkuszokat Todd-Hewitt-féle táptalajon (Difco) késői stacioner fázisig szaporítjuk. A sejteket ekkor kinyerjük, majd 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0, 50 mmol/1 MgCl₂, 30% szacharóz összetételű pufferben szuszpendáljuk. A protoplasztokat úgy állítjuk elő, hogy a sejtszuszpenziót 100 pg/ml koncentrációjú lizozimmel kezeljük 30 percig 0 °C-on. A protoplasztokat azután centrifugáljuk, és 50 mmol/1 TRISHC1 pH = 8,0 pufferben szuszpendáljuk. Az alapos lízist a szuszpenzió ötször egymás után való gyors lefagyasztásával-felolvasztásával érjük el. A nem lizálódott sejteket, valamint a nagy törmeléket 15 percig tartó 1000/perc fordulatszámú centrifugálással elválasztjuk, míg a membránokat és a citoplazmát tartalmazó felülúszót használjuk a Western-blot elemzéshez. A körülbelül 5 χ 10⁸ sztreptokokkuszsejtből kapott kivonatot gélen futtatjuk, majd a Westem-blotot szokványos módszerekkel végrehajtjuk.

Egerek immunizálása

Balb/c egereket immunizálunk szubkután beadott 5 χ 10⁸ élő GP246 sztreptokokkuszsejttel (5 χ 10⁷ telepképző egység), komplett Freund-féle adjuvánsban emulgeálva. A primer immunizálás után két-három héttel az állatoknak ugyanazt a baktériumdózist adjuk be erősítőként, inkomplett Freund-féle adjuvánsban. Az állatokat az utolsó erősítő injekció után egy héttel kivéreztetjük. Eredmények

A pVMBSplazmid előállítása

Egy olyan konstrukciót készítünk, amelyben az ermC gént, amely eritromicinrezisztenciát kódol [Horinouchi, S. and B. Weisblum, J. Bacteriol, 150, 804 (1982)], az emm-6.1 után klónozzuk, így mindkét gén ugyanazon a Clal fragmenten lesz található. Ebben a konstrukcióban az emm-6.1 iniciációs kodonja 19 bp távolságban van egy Clal hasítási hely után, ily módon a Clal enzimmel való emésztés az emm-6.1-et promoter nélkül hagyja. A pW3: M6 plazmidot [Hruby, Dennis F., V. M. Hodges, E. M. Wilson, C. A. Franké and V. A. Fischetti, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 85, 5714 (1988)], amely ezt a Clal hasítási helyet az emm-6.1 kódolószekvencia előtt tartalmazza, használjuk a kísérletben. A pE194 plazmid 2,0 kb méretű Mspl fragmentjét, amely az ermC-t tartalmazza, a pW3:M6 plazmid részleges Clal emésztésével Egáljuk. Miután Escherichia coli DH5 törzset transzformáltunk, egy kiónt izolálunk, amely a pVMB3 plazmidot tartalmazza, benne a Clal fragmenttel.

A GP230 törzs előállítása

A pVMB3 plazmid 3,4 kb méretű Clal fragmentjét, amely az ermC és a promoter nélküli emm-6.1 géneket tartalmazza, a S. gordonii Clal enzimmel hasított kromoszomális DNS-ével Egáljuk. A ligálóelegyet használjuk a természetesen transzformálható S. gordonii „Challis” V288 törzs transzformálására. Ezzel a módszerrel az emm-6.1/ermC Clal fragmentet random módon integráljuk a kromoszómába. A Clal fragmenthez ligáit kromoszomális DNS szolgáltatja azt a homológiát, amelynek segítségével a transzformálás után az integrációt el lehet érni. Az eritromicinrezisztens (Em-r) transzformánsokat szelektáljuk, majd az M6 fehérje termelése szempontjából elemezzük a „streak-blot” módszerrel. A 700 Em-r transzformáns közül 196 (28%) termelt M6 fehérjét. A szemikvantitatív dot-blot elemzés alapján a GP230 tűnt a legjobb M6 termelőnek.

A GP232 törzs előállítása

A S. gordonii GP230 törzset a GP69 pneumokokkusz törzs kromoszomális DNS-ével transzformáljuk. Ez a pneumokokkusz törzs rezisztens kloramfenikollal szemben, de érzékeny a Pozzi és Guild által leírt módszerrel [Pozzi, G., W. R. Guild, J. Bacteriol., 161, 909 (1985)] termelt eritromicinre. Ha a GP69 kromoszomális DNS-t használjuk a GP230 transzformálására, akkor a rekombináció az ermC szekvencia szintjén játszódik le, ezáltal a CAT szekvencia integrálódik a kromoszómába integrálódott ermC szekvencia egy kópiájába. Ez az inszerció eredményezi a GP232-t, amely, amint azt tárgyaltuk, és az ábrákon is bemutatjuk, expresszálja az M6 fehérjét a felszínén, és emellett rezisztens kloramfenikolra, illetve érzékeny eritromicinre.

A HPV16 E7 fehérje expressziója S. gordonii-ban

A pVMB20 integrációs vektort úgy állítjuk össze, hogy lehetővé tegye heterológ DNS-szekvenciák inszercióját a GP232 kromoszómáján található heterológ emm-6.1 gén DNS-szekvenciájába. A pVMB20 egy új Escherichia coli plazmid, amely nem replikálódik Streptococcusban, és hordozza az emm-6.1 valamint az eritromicinrezisztenciát kódoló ermC gént. A GP232pVMB20 gazdavektorrendszert részletesen a 4. és 5. ábrán mutatjuk be. Specifikusan, az új pVMB20 plazmidot és az új S. gordonii GP246 törzset az alábbi eljárással állítjuk elő.

HU 220 420 Bl

Gazdavektorrendszer a heterológ génexpresszióhoz [A] Az új S. gordonii GP232 gazdatörzs kromoszómájába az M6 fehérjét kódoló gén (emm-6.1) [Hollingshead, S. K., V. A. Fischetti and J. R. Scott, J. Bioi. Chem., 261, 1677-1686 (1986)] egy kópiáját építjük be - amelynek nincs promotere, de megvan a saját riboszomális kötőhelye - egy erős kromoszomális promoter után. Az emm-6.1 mellett található az ermC [Horinouchi, S. and B. Weisblum, J. Bacteriol, 150, 804 (1982)], amelynek kódolószekvenciáját a pC221 plazmid egy cat gént [Wilson, C. R., S. E. Skinner and W. V. Shaw, Plasmid, 5, 245-258 (1981)] tartalmazó 1,8 kb méretű Mbol ffagmentjének beillesztésével szakítjuk meg. A GP232 M6 fehérjét expresszál a felszínén, és rezisztens kloramfenikolra, illetve érzékeny eritromicinre. Ezt transzformációval kapjuk, hogy a heterológ DNS integrálódjon a sztreptokokkusz-kromoszómába. A szerkezetet az ábrán mutatjuk be. A GP232 kromoszómába integrálódott heterológ DNS méretét (5,2 kb) Southem-blot elemzéssel határozzuk meg. A pVMB20 jelű integrációs vektor egy 6,3 kb méretű Escherichia coli-plazmid, amely nem replikálódik Streptococcusban. Ezt úgy állítjuk elő, hogy a pVMB3 plazmidnak egy 3,4 kb méretű Clal fragmentjét, amely az emm-6.1 és ermC géneket tartalmazza, szubklónozzuk a pBluescript plazmidban (Stratagene, La Jolla, Kalifornia), az alábbiakban ismertetett eljárás alkalmazásával. Ez ugyanaz a Clal fragment, mint amelyik a GP232 kromoszómájába integrálódott, az egyetlen különbség az, hogy a GP232-ben az ermC gént a cat gén szakítja meg. Ha a pVMB20 plazmidot használjuk donor-DNSként a S. gordonii GP232 kompetens sejtek transzformálására, akkor eritromicinrezisztens transzformánsokat kapunk az integrációs vektor és a homológ kromoszomális szekvenciák közötti rekombináció révén. A cat gént tartalmazó DNS-fragment ki vágódik ezeknek a transzformánsoknak a kromoszómájából, míg az ermC gén helyreállítódik (5. ábra).

[B] A HPV16 [Schwarz, E, U. K. Freese, L. Gissmann, W. Mayer, B. Roggenbuck, A. Stremlau and H. zűr Hausen, Natúré, 314,111-114 (1985)] E7 fehérjéjének génjét a pVMB20 plazmid emm-6.1 szekvenciájába klónozzuk, így kapjuk a pVMB21 plazmidot. A pVMB20 plazmidot KpnI és HindlII restrikciós enzimekkel, majd egy, az E7 szekvenciákat tartalmazó olyan KpnI/HindlII szegmenttel ligáljuk, amelyet in vitro DNS-amplifikálással (polimeráz láncreakció) állítottunk elő, a pMBS21L/E7 plazmidot [Tommasino, M., M. Contomi, V. Scurlato, M. Bugnoli, K. Maundell, and P. Cavalieri, Gene 93, 265 (1990)] használva templátként. Az indítómolekulákat úgy terveztük, hogy az E7-et kódoló 294 bp méretű fragment leolvasási fázisban épüljön be az emm-6.1. A pVMB21 nukleotidszekvenciájának elemzése megerősítette, hogy az M6:E7 transzlációs fúzió várt struktúráját kaptuk. A pVMB21 plazmidot linearizáljuk, majd a GP232 törzs transzformálására használjuk. Az E7-ről kiderült, hogy az eritromicinrezisztens transzformánsok 6%-ában expresszálódik. Ezekben a transzformánsokban a pVMB21 szekvenciák integrációja deléciót okoz, amely érinti a cat gént is. A GP246, amely egy jellegzetes transzformáns, struktúráját Southem-blot elemzéssel erősítettük meg. A GP246 kromoszómáján található M6:E7 génfúzió kapcsolódási pontját tartalmazó ffagmentek nukleotidszekvenciáját is meghatározzuk, az M6:E7 fúziót tartalmazó Clal fragment pBluescript plazmidban való klónozása után.

Az E7 fehérje sejtfelszíni expressziója

A HPV16 E7 fehérjéjének S. gordonii GP246 sejt felszínén való expresszióját immunfluoreszcenciával igazoljuk, olyan antitesteket alkalmazva, amelyek vagy az M6 hordozó fehérjére vagy az E7 inszertre specifikusak. Az M6:E7 génfúziót tartalmazó GP246 pozitív fluoreszcenciát mutatott, amikor vagy M6-specifikus vagy E7-specifíkus poliklonális antitestekkel reagáltattuk (6. ábra), megerősítve ezzel az E7 molekula és az M fehéije sejtfelszíni lokalizálását a S. gordonii felszínén. Fluoreszcencia nem figyelhető meg, ha a GP246 az ismert 10A11 monoklonális antitesttel reagált, amely az M6 egy olyan epitopjára specifikus, amelynek kódolószekvenciája az M6: E7 génfüzió készítése során kivágódó KpnI/HindlII fragmenten található (6. ábra).

Annak igazolására, hogy az E7-et expresszáló rekombináns sztreptokokkuszok valóban M6:E7 fúziós fehérjét termelnek, a S. gordonii sejtkivonatokat Westem-blottal elemezzük (7. ábra). A GP246 sejtkivonataiban ugyanaz a sáv reagál mind az E7-, mind az M6-specifíkus antitestekkel, míg E7-specifikus reaktivitás nem figyelhető meg a GP232 gazdasejtben, amelynek a kivonata M6-specifikus reakciót mutat (7. ábra).

Lényegében ugyanezt az eljárást használjuk az M6:E7 hibrid fehéqe készítése során, amely az M6 molekula C-terminális régióját tartalmazza, és az allogén 5 sikeresen expreszálódik az S. gordonii felszínén. A sejtfalextraktumok Westem-blotja, allergén-5 specifikus antitestek felhasználásával kiderítette (csakúgy mint az M6: E7 esetében), hogy az allergén-5 valóban expresszálódik az S. gordonii sejtfalfrakciójában. Az allergén-5-öt Fang és munkatársai leírása alapján állítjuk elő [Fang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 895 (1988)].

Immunválasz a sztreptokokkusz-sejtfelszínen található fúziós fehérjére

Az M6:E7 fúziós fehéqe immunogenitását úgy vizsgáljuk, hogy egereket immunizálunk rekombináns S. gordonii GP246 sejtekkel, amelyek az M6:E7 fúziós fehérjét expresszálják. A kontrollegereket az izogén GP232 törzzsel immunizáljuk, amely az M6 fehérjét expresszálja. Az egyes törzsekkel immunizált három-három állatból származó szérumot egyesítjük, és Westem-blottal vizsgáljuk a Schizosaccharomyces pombe-ben termelt, tisztított E7 fehérjével szembeni reakcióképességét. A 8. ábrán látható, hogy a sejtfelszíni Μ6.Έ7 GP246 törzzsel immunizált állatok az E7 fehérjével reagáló antitesteket termelnek, jelezve ezzel, hogy az E7 fehéqe immunogén, ha a sztreptokokkuszok felszínén fúziós fehérjeként expresszáljuk. A csak M6 fehérjét tartalmazó GP232-vel immunizált egerek szérumában nem látható E7 elleni antitest.

Az ismertetett eljárás lehetővé teszi az apatogén S. gordonii GP246, vagy egyéb transzformált Gram-pozi9

HU 220 420 Bl tív baktérium előállítását, amely egy hibrid sejtfelszíni fehérjét, például az új, hibrid sejtfelszíni antigént, az M6: E7-et expresszálja. Ez az új antigén egy hibrid fehérje, amelynek a C-terminálisa a baktériumokhoz kapcsolódik, és lényegében ugyanaz a C-terminális régió, amely normális körülmények között megtalálható más Gram-pozitív sejtfelszíni fehérjékben, amint azt az előzőkben ismertettük. Ennek a hibrid sejtfelszíni fehérjének az aktív polipeptidje a HPV16 E7 antigénje. Ha a baktériumokat például telepképzés útján bejuttatjuk egy védelemre szoruló állati gazdaszervezetbe, akkor az aktív polipeptid mind humorális, mind sejtek által közvetített választ kivált, aminek eredménye egy védő immunválasz kialakulása papillomavírus-fertőzéssel szemben.

Meg kell jegyezni, hogy a jelen találmány szerinti, és a fentiek szerint előállított hibrid sejtfelszíni fehéije heterológ antigénje egy virális antigén, amely a vírus szaporodása során keletkezik. Tehát a jelen találmány szerinti eljárás lehetővé teszi új Gram-pozitív baktériumok készítését azzal a céllal, hogy virális antigéneket juttassunk egy állatba megfelelő mennyiségben, hogy ezzel védő immunválaszt váltsunk ki egy vírusfertőzéssel szemben.

A jelen találmány szerinti új M6: E7-et és a új intermedier termékeket két kiindulási anyagból állítjuk elő. Ezek a pW3: M6 és a GP69. Ezeket az idézett cikkekben közölt eljárások alapján lehet előállítani. Tehát mindegyik új terméket ismert anyagokból kiindulva állíthatjuk elő, az itt ismertetett eljárások alkalmazásával. Azonban azzal a céllal, hogy a találmány szerinti eljárás végrehajtását megkönnyítsük, anélkül, hogy ennek szükségességét elismernénk, a pW3:M6-ot és a GP69-et letétbe helyeztük az American Type Culture Collection-nél.

Az előző M6: E7 példa illusztrálja az apatogén, az emlősszájüregben normális körülmények között jelen levő, együtt élő Gram-pozitív baktériumok használhatóságát a teljes test megvédésére virális fertőzéssel szemben. Az analóg módon készített apatogén baktériumok használhatók más hasznos antigének expresszálására és a megcélzott területre való eljuttatására, az alábbiakban ismertetett eljárás segítségével. Például emlőstumorok felszínén található fehérje antigének fuzionáltathatók bármely Gram-pozitív baktérium egy sejtfelszíni antigénje sejtfalhoz kötődő régiójával, a fúziós gén beépíthető egy együtt élő Gram-pozitív baktériumba, majd a kapott baktérium vakcinaként használható tumorspecifikus immunválasz keltésére, amely a tumorterápiában használható.

Ezek a példák a találmánynak csak egyik aspektusát illusztrálják. A találmány valójában egy célba juttató módszert szolgáltat bármely polipeptidre, amely arra használható, hogy immunválaszt váltsunk ki egy állatban, illetve szolgálhat bármely hasznos célokat.

Vakcinaként használva a kiválasztott együtt élő baktérium használható arra, hogy egy emlősszervezetben megtelepedjen. A kiválasztott hibrid sejtfelszíni antigént termeli, amelynek az aktív polipeptidszegmentje védő antitestek termelődését váltja ki.

Normális körülmények között a vagina nyálkahártyájában megtalálható apatogén Gram-pozitív baktériumok fogamzásgátlás céljára használhatók. Ebből a célból a sperma sejtfelszíni antigénjei használhatók aktív polipeptidként a vagina vagy a méh nyálkahártyája felszínén normális körülmények között megtalálható Lactobacillus acidophilus baktérium hibrid sejtfelszíni fehérjében. Ha a transzformált baktériumokat használjuk arra a célra, hogy az ilyen nyálkahártyában megtelepedjen, akkor a hibrid fehéijék a sperma sejtfelszíni antigénjével szembeni antitestek termelődését okozzák, és ezáltal a sperma inaktiválódását okozzák. Valójában a spermát a női test idegen anyagnak tekinti, és az előre létrejött antitestek reakcióba lépnek és inaktiválják a spermasejteket.

Az ilyen típusú fogamzásgátlásnak két fontos előnye van. Az egyik az, hogy mivel a spermák inaktiválódnak, ennek következtében a peték nem termékenyülnek meg. A másik előny az, hogy a fogamzásgátló hatást nagyon egyszerűen semlegesíteni lehet, egyszerűen oly módon, hogy az immunizált nőt egy olyan antibiotikummal kezeljük, amellyel a hibrid antigént expresszáló Gram-pozitív baktériumokat ki lehet irtani.

A jelen találmány szerinti transzformált baktériumok egyéb előnye, hogy egy HÍV vírusból származó sejtfelszíni antigént egy együtt élő Gram-pozitív baktérium felületére lehet juttatni, és így egy olyan vakcinát lehet előállítani, amely az AIDS megelőzésére használható. Ehhez a HÍV vírusból származó gpl20 polipeptidet, a gpl20 polipeptid V3 hurokrészét, vagy egy rokon sejtfelszíni antigént, vagy ilyen antigének szegmentjeit, például a gpló vagy az rpl35 735-752-es szekvenciáját, vagy a gpl20 24 aminosavas szekvenciáját használjuk.

Ezeket a polipeptideket egy Gram-pozitív baktérium sejtfelszíni fehéije leader szekvenciájához és legalább az N-terminális egy részéhez, valamint annak sejthez rögzítő régiójához fuzionáltatjuk, hogy egy együtt élő baktérium felszínére eljuttassuk. Ha a felszínén HÍV antigéneket expresszáló transzformált együtt élő baktériumot egy érzékeny emlősállatba juttatjuk, akkor immunválasz keletkezik, amely megvéd a HÍV vírus által okozott fertőzéstől. Továbbá, egy rekombináns vaginális együtt élő baktériumnak egy HÍV antigénnek, például a gp 120-nak a vaginába való eljuttatására való használatával az ilyen antigén ellen termelt IgA antitestek ezen a ponton megvédenék a fertőzés ellen. A vaginális szekréciókban levő IgA antitestek csökkentik a HIV-részecskék számát egy HIV-pozitív nő vaginális szekréciójában, és ezáltal gátolják az AIDS terjedését.

A jelen találmány szerinti termékek használhatók az érzéketlenítő terápiákban is. Az ilyen típusú terápia szélesen használható az olyan egyedek kellemetlenségeinek enyhítésére, akik eltúlzott IgE-válasszal reagálnak az antigénekre (az allergia területén ezeket allergéneknek hívják). Az IgE antitestek fokozott termeléséről az a vélemény, hogy ez a fő okozója az allergiás válaszoknak, például a szénanáthának, asztmának és az anafilaxiás sokknak.

Az allergének számos különböző forrásból származhatnak, például ételből, gombákból, porból és állati szőr10

HU 220 420 Β1 bői. A flóra, azaz a rózsák vagy a gyomok az allergének fő forrásai. A darazsak „szaga” például allergén fehérjéket tartalmaz.

Az allergénekkel való érintkezésre adott immunválasz enyhítésére használt konvencionális kezelés a hiposzenzitizálás, amely az allergén anyag ismételt dózisokban való beadásából áll. Ennek az a következménye, hogy nő az allergénspecifikus IgG antitestek mennyisége, ami blokkolja az allergénspecifikus IgE kötődését az emlősejtekhez.

Számos allergénspecifikus peptidet és fehérjét azonosítottak, izoláltak és klónoztak. Ezek közé tartozik például az allergin 5, egy darázsméreg fehérje. Ezeket az allergéneket tartalmazhatják aktív polipeptidként a találmány szerinti hibrid sejtfelszíni fehéijék. Az ilyen hibrid fehérjéket termelő együtt élő baktériumokat lehet arra használni, hogy elszaporítsuk őket egy allergiás betegben. Az eredmény az allergének állandó forrása lesz, amely ugyanazt a védő immunválaszt fogja kiváltani, mint amit az érzéketlenítő kezeléssel lehetett elérni.

Az M6:allergén-5 hibrid fehérje képződését és expresszióját az előzőkben ismertettük. A 11. és 12. ábrákon ennek a hibrid sejtfelszíni antigénnek a felhasználásával végzett immunizálási vizsgálatok eredményei láthatók.

A 11. ábrán egérszérumból származó szérum-IgG reakciója látható hibrid sejtfelszíni fehérjében levő tisztított allergén-5-tel. Az egereket vagy intradermálisan immunizáltuk hibrid sejtfelszíni allergén-5-öt expresszáló

S. gordonii-val (10⁷ CFU) Freund-féle adjuvánsban, vagy intranazálisan, ugyanazzal a mikroorganizmussal. Az állatokat az immunizálás után 4, 6, 8 és 10 héttel elvéreztettük, majd a szérumot ELISA-val vizsgáltuk, hogy mennyi, a tisztított allergén-5-tel reagáló IgG található benne. Mind az intradermálisan immunizált egerek (VI-V4, vonalkázott oszlopok), mind az intranazálisan immunizált egerek (V5-V8, fekete oszlopok) antitesteket expresszáltak az allergénnel szemben. A sejtfelszíni allergén-5-öt nem tartalmazó S. gordonii-val immunizált kontrollállatok nem reagáltak az allergénre. Mindegyik, a rekombináns S. gordonii-val intranazálisan immunizált állatban legalább 12 hétre megtelepedett a mikroorganizmus, amint azt kénetekkel meg lehetett határozni, és az allergén-5-öt ezalatt a periódus alatt expresszálták. Az összes vizsgálatot a szérum 1:50-es hígításával végeztük.

A 12. ábrán az allergin-5-re adott IgA-választ látjuk intradermálisan és intranazálisan immunizált állatokban. Tizenkét héttel az allergin-5-öt expresszáló S. gordoniival való immunizálás után (intradermális vagy intranazális) (lásd 11. ábra), nyálmintát vettünk, és az állatokat levágtuk, hogy tüdő- és bélmosó folyadékot kapjunk. A nyálat és a mosófolyadékokat ELISA-val megvizsgáltuk az allergén-5-re specifikus IgA jelenléte szempontjából. Az eredményekből kiderült, hogy a nyál-IgA jelen van az intradermálisan és intranazálisan immunizált állatokban, de jobb választ lehet kapni az intranazálisan megtelepedett állatokban. A legjobb IgA-választ az intranazálisan megtelepedett mikroorganizmusokat tartalmazó állatok tüdő-mosófolyadékából lehetett kapni. Jóllehet IgA-választ lehetett kapni az emésztőrendszer vékonybélrészében, ez azonban alacsonyabb volt mint a tüdő-mosófolyadékban. Minden vizsgálatot a minták 1:1 arányú hígításával végeztünk.

A találmány szerinti, a sejtfelszíni hibrid fehérjék célba juttatására szolgáló rendszerek különös előnye, hogy mivel a transzformált mikroorganizmusok normális körülmények között is megtalálhatók a szervezetben (együtt élő mikroorganizmusok), ezek hosszabb ideig is megmaradnak a szervezetben, és a védő immunválasz konstans serkentőjeként hatnak, és így el lehet kerülni a folyamatos immunizálás iránti igényt.

A szakterületen jártas szakember azonnal felismeri, hogy a találmány szerinti új termékek számos egyéb területen is használhatók. Például apatogén Gram-pozitív baktériumok készíthetők, hogy olyan sejtfelszíni antigéneket juttassanak be a szervezetbe, amelyek védő antitestek keletkezését váltják ki számos különböző kóros állapottal szemben, beleértve a maláriát, a szamárköhögést és a retrovirális fertőzéseket, mint például az AIDS, kokcidiózis, szopornyica, számyashimlő és brucellózis.

A találmány szerinti célba juttató rendszer egyéb előnye abban az esetben, ha vakcinaként alkalmazzuk, hogy élő baktériumokat használunk. Amint az közismert, az élő baktériumok sokkal erősebb immunválaszt váltanak ki, mint az attenuált vagy elpusztított baktériumok. Egy további előny az, hogy mivel apatogén baktériumokat használunk, ezért a vakcina biztonságos. Még további előny, hogy számos adagolási módszer alkalmazható.

A találmány nem korlátozódik a S. gordonii-ra mint hordozóbaktériumra, vagy éppen a sztreptokokkuszokra, valójában bármely más apatogén Gram-pozitív baktérium is gyakran előnyösen használható. Például a bél nyálkahártyájában normális körülmények között megtalálható baktériumok (Enterococcus fecalis) előnyösek lehetnek, ha egy aktív polipeptidet a bélbe kell eljuttatni.

A találmány emellett nem korlátozódik egy, csak egyetlen epitópot tartalmazó hibrid sejtfelszíni fehéqe expressziójára. A hordozó mikroorganizmus az ismert módszerekkel transzformálható, hogy számos hibrid sejtfelszíni fehérjét expresszáljon, és mindegyik különböző aktív polipeptidet tartalmaz, illetve egy másik megoldási mód, ha egy olyan hibrid sejtfelszíni fehérjét expresszáltatunk, amelyben az aktív polipeptid egynél több epitópot tartalmaz.

Ez idáig a találmányt főleg az antigéneknek védő antitestek kiváltása céljából végzett célba juttatásával kapcsolatban írtuk le és illusztráltuk, de mint azt a fentiekben jeleztük, a találmány nem korlátozódik ezekre. Például a találmány használható enzimek célba juttatására is.

Azok az emberek, akik a laktáz enzimre, amely a vékonybélben szekretálódik, deficiensek, nem képesek megfelelően komponenseire, D-glükózra és D-galaktózra hidrolizálni a laktózt.

Ennek az a következménye, hogy nem képesek rendesen megemészteni a tejet, vagy a tejtermékeket. En11

HU 220 420 Β1 nélfogva a kezelést az jelenti, hogy az élet során végig szedni kell a hiányzó enzimet tartalmazó tablettákat vagy egyéb terápiás dózisformákat. A jelen találmány gyakorlatával összhangban együtt élő bélbaktériumokat készítünk, amelyek azt a hibrid fehérjét tartalmazzák, amelyiknek az aktív polipeptidje a laktáz. A baktériumok használhatók arra, hogy megtelepedjenek a bél nyálkahártyájában, és folyamatosan termeljék a szükséges enzimet.

A Streptococcus mutáns a fogak romlásáért felelős mikroorganizmus. Glükoziltranszferáz enzimeket szekretál, amelyek a szacharózt hidrolizálják, glükóz termelése közben. A glükóz ezután glükán polimerré alakul, amely a fogak felszínéhez tapad, és részt vesz a lebomlási folyamatban. Az alábbiakban ismertetett, és igénypontokkal védett eljárások szerint a S. mutáns úgy transzformálható, hogy glükanáz enzimeket termelő hibrid sejtfelszíni fehérjéket expresszáljon. A transzformált baktérium arra használható, hogy megtelepítsük a szájüregben, ezáltal meggátoljuk a glükán polimerek képződését, és így megakadályozzuk a fogak romlását. Egy másik eljárás szerint a Streptococcus mutáns oly módon transzformálható, hogy a fogplakkokat emésztő enzimeket termeljen, és ezzel a fogromlás iniciálását lehet megakadályozni.

A jelen találmány szerinti eljárást lényegében a fentiekben leírt módon alkalmaztuk, Staphylococcus aureust használva a sejtfelszíni fehérjét expresszáló baktériumként. Ha a Protein A (amely ennek a baktériumnak a sejtfelszíni molekulája) rögzítőrégióját (amely az LPXTGX szegmentet, a hidrofób szegmentet és a töltött farokszegmentet tartalmazza) az alkalikus foszfatáz enzimhez (amely az Escherichia coli dimer periplazmatikus fehérjéje) fuzionáltatjuk, majd az ezt a fúziót kódoló gént visszavisszük Staphylococcus aureusba, akkor a molekulát a sejt külsején találjuk meg, a felszínhez rögzítve. Ennek az eljárásnak a részleteit a szakirodalomban megtaláljuk [Schneewind et al., Cell, 70, 267 (1992)], amit a továbbiakban referenciaként kezelünk.

A szakterületen jártas szakember felismeri, hogy a jelen találmánynak számos variációja létezhet anélkül, hogy a szellemétől vagy az igénypontok által lefedett területtől eltérnénk.

Az egyik variáció, amely különösen hasznos, főleg vakcinák termelésében, ha egy adjuvánst építünk be a hibrid fehérjébe, majd a kívánt fehérjét expresszáló szükséges nukleotidszekvenciát a fehérje előállítására alkalmas génbe juttatjuk. Tipikus esetben egy plazmid készíthető, amelyben a koleratoxin B alegységét (amelyről köztudott, hogy egy nyálkahártyában működő adjuváns) kódoló gént, beépítjük a polipeptid Cterminálisa és az aktív polipepid közé. Egy másik eljárás szerint az alegységet kódoló gént az aktív polipeptid elé építjük be. Ez az orientáció fokozott IgA-választ válthat ki, mivel a CTB és a sejt szokásos kölcsönhatásában, amely antitestek keletkezését eredményezi, a CTB közvetlenül érintkezésbe lép a sejttel, és azokkal az antigénekkel szembeni antitestek keletkezését serkenti, amelyekkel szemben a CTB adjuvánsként működik. A plazmid alkalmazható kettős cross-over technikában, amelyet a 4. és 5. ábrán mutatunk be, hogy ezzel a hibrid gént egy Gram-pozitív baktérium kromoszómájába építjük be, hogy egy, a találmány szerinti hibrid fehérjét expresszáljunk a baktérium felszínén. Más immunfokozó fehéijék is használhatók a koleratoxin B alegysége helyett, hogy ezzel fokozzuk egy aktív polipeptiddel szemben kialakuló immunválaszt.

A jelen találmány szerinti transzformált baktériumok jól használhatók diagnosztikai tesztekben. Például arra használhatók, hogy egy specifikus fertőzés meglétére utaló antitestek jelenlétét mutassuk ki velük fertőzött állatok plazmájában.

A szokványos eljárás szerint, egy például a Neisseria gonorrhoeae által okozott fertőzés vizsgálata megkívánja egy antigén izolálását és tisztítását, amely reakcióba lép egy specifikus, a fertőző mikroorganizmusra jellemző antitesttel, és feltehető, hogy megtalálható a plazmában. Az antigént azután plazmával vagy egyéb testfolyadékkal inkubáljuk. Ha reakció játszódik le, akkor az bármely ismert teszt segítségével felismerhető.

A standard enzimhez kötött immunesszé-eljárásban az izolált és tisztított antigén egy szilárd fázisú üvegvagy műanyag szubsztráthoz tapad. Ezt azután a testfolyadékkal, például plazmával vagy szérummal hozzuk érintkezésbe. Ha a testfolyadék egy, a fertőzésre jellemző antitestet tartalmaz, akkor egy antigén-antitest reakció játszódik le. A reakciótermék a szilárd fázison marad, amit azután egy kimutatható enzimmel, például torma-peroxidázzal jelzett antitesttel inkubálunk.

A jelen találmány szerinti transzformált baktériumok használhatók a diagnosztikai tesztben alkalmazott antigén forrásaiként is. Az ilyen tesztekben a transzformáit baktériumok használhatók antigénként. A szakterületen jártas szakember számára számos ilyen természetű diagnosztikai teszt ismert. Az ilyen alkalmazás, a jelen találmány szerint eliminálja az antigén izolálásénak és tisztításának szükségességét, amit a korábbi módszerek megkívántak.

A diagnosztikai teszteléshez a találmány szerinti transzformált baktériumokat készítünk, amelyekben az aktív polipeptid tartalmazza egy specifikus antitest egy epitópját, amely jellemző a fertőzést okozó mikroorganizmusra. A baktérium a szilárd fázisra tapad, és diagnosztikai tesztet a szokásos módon hajtjuk végre. Természetesen a teszt nem korlátozódik az enzimekre, hogy azokkal egy antitest jelenlétét mutassuk ki, például ELISA módszerrel. Más jelzések, például radioaktív izotópok is használhatók.

Diagnosztikai kitek készíthetők, amelyek a transzformáit baktériumokat tartalmazzák, tipikusan liofílezett formában, amelyből életre kelthetők, valamint más, egy ilyen kitben általában megtalálható reagenssel együtt. Ezek közé tartozhat egy vizes puffer, egy jelzett antiantitest, steril víz és adott esetben egyéb reagensek. Egy másik eljárás szerint a transzformált baktériumokat, akár vizes szuszpenzió vagy liofilizátum formájában is szolgáltathatjuk a diagnosztikai tesztben való alkalmazás céljára, más reagensekkel együtt, amelyeket a diagnosztikai tesztet végrehajtó laboratórium szolgáltat.

HU 220 420 Β1

A találmány szerinti hibrid sejtfelszíni fehérjék különböző szegmentjei nem szükségszerűen szomszédosak egymással a fehérjében, illetve az előállítására használt génben. A szakterületen jártas szakember számára számos okból kényelmes lehet, ha a fehérje expressziójára használt hibrid génben levő nukleotidokat más nukleotidok beépítésével egymástól elválasztjuk, és ezáltal olyan hibrid fehérjéket expresszálunk, amelyekben az aktív polipeptidet és a sejthez kötődő polipeptidet egy kiválasztott távolságtartó rész választja el. Az nem lényeges, hogy a sejtfelszíni antigén sejthez kötődő régiójának teljes szegmentjét használhatjuk a találmány szerinti hibrid sejtfelszíni fehéije készítése során, ameddig egy rögzítőrégió, amely az LPXTGX szegmenttel kezdődik, és a töltött farokszegmenttel végződik, jelen van, hogy a hibrid polipeptidet az őt expresszáló baktérium felszínéhez rögzítse.

A 9. ábrán a jelen találmány egy különösen előnyös megvalósítási módját láthatjuk. Ez egy univerzális plazmidot ábrázol, amelyben egy polilinkerhely található. A polilinker egy olyan oligonukleotid, vagy DNS-szekvencia, amely számos restrikciós hasítási helyet tartalmaz, és ennek következtében használható számos különböző restrikciós enzimmel kihasított gének beépítésénél. Például a plazmid úgy állítható elő, hogy a benne levő polilinkerinszert számos restrikciós hasítási helyet tartalmazzon, például EcoRI, Clal, Hindlll, Xbol, PstI, BamHl, vagy bármely más hasítási helyet. Az ilyen polilinkerek vagy kereskedelmi forgalomban vannak, vagy a szakterületen jártas szakember számára könnyen előállíthatok.

Egy, a találmány szerinti plazmid előállításához a polilinkerinszertet egy olyan plazmidba ligáljuk, amely már tartalmazza a termelendő hibrid fehétje sejthez kötődő szegmentjét expresszáló, kiválasztott géndarabot. A plazmid úgy ábrázolható, mint amely tartalmazza a hibrid antigén leader szekvenciáját, de az ilyen szekvenciának nem kell feltétlenül a plazmidon lennie. Be lehet építeni az aktív polipeptid expresszálására használt oligonukleotidszekvenciába. Jóllehet a plazmidon található különböző géndarabokat egybefüggően ábrázoljuk, ezeket térkitöltő szegmentek választhatják el egymástól.

A plazmidot úgy ábrázoljuk, mint amely két különböző antibiotikumrezisztencia-régiót tartalmaz a szelekcióhoz. Az egyik, amely a polilinkerben található, két szekcióra bontja azt, és egy inszert beépítésekor kiszakad. Más genetikai bélyegek, például elszíneződést adó markerek is használhatók. A polilinkerhelyekkel rendelkező plazmidok szükség esetén más konstrukcióval is elkészíthetők.

Egy olyan plazmidot, amelyen nincs a linkért elválasztó genetikai bélyeg, de hatékony promoterrel rendelkezik, használhatunk Gram-pozitív baktériumok transzformálására. A bemutatott plazmid az előzőekben ismertetett módon adhat cross-over-t egy kromoszómával. A plazmidot vagy a kromoszómát tartalmazó transzformáit baktériumok expresszálják a kívánt sejtfelszíni hibrid fehérjét.

Az M6.1 367-441 jelű plazmid, amelyet egy korábbi szabadalmi bejelentésben leírtunk és igénypontokkal védtünk, különösen hasznos a jelen találmány gyakorlata szempontjából. Ennek a plazmidnak az előállítását az említett szabadalmi bejelentésben írtuk le. Letétbe helyeztük az Escherichia coli K561 törzsben az American Type Culture Collectionnél, ATCC68235 letéti számon.

Amint azt az említett bejelentésben elmagyaráztuk, ez a plazmid egy megfelelő DNS-szekvenciával fuzionáltatható, majd a hibrid gént egy megfelelő hordozóba, például Escherichia coliba lehet bevinni, illetve egy kiválasztott apatogén Gram-pozitív baktériumba. A keletkező transzformált baktériumok közvetlenül vakcinaként használhatók. Egy másik eljárás szerint cross-over reakcióban is használható, amint azt az előzőkben leírtuk, más transzformált baktériumok előállítása céljából, amelyek a kívánt polipeptidet hatékonyabban expresszálják. A plazmid használható egy univerzális peptid előállítására is, egy polilinker beépítésével.

A találmány szerinti eljárás egy speciális előnye az, hogy a rekombináns Gram-pozitív baktériumok bejuttathatok az ilyen kezelést igénylő állatok nyálkahártyájába, ahol a patogén általában megfertőzi a testet. Ezek közé tartozik a száj, az orr, a belek és a vagina nyálkahártyája. Az ilyen bejuttatás serkenti a helyi immunválaszt az adott ponton, és hatékony eszköz ahhoz, hogy a patogénnel szemben védő immunválasz jöjjön létre. Mivel az alkalmazott baktériumok apatogének, és az adott ponton normális körülmények között is előforduló szervezetek, ezeket minden veszély vagy toxikus hatás nélkül alkalmazni lehet. A kiválasztott baktériumokat be lehet adni halaknak vagy vadon élő állatoknak is, belekeverve a táplálékukba, vagy a vízbe, amelyben élnek.

Az előzőkben ismertetett eljárás alkalmazásával hibrid fehérjék készíthetők, amelyek az antitest keletkezését kiváltó, a 2. táblázatban aktív polipeptidként bemutatott antigént tartalmazzák. A táblázatban látható a polipeptid, amely egy patogén által okozott fertőzéssel szemben védő antitestek keletkezését okozza, látható továbbá a betegség, amellyel szemben védelmet kell nyújtani, és a publikáció, amelyben a polipeptidet leírták. Néhány esetben az egy pepiidet kódoló oligonukleotidot el kell készíteni, és be kell illeszteni egy plazmidba. Az eljárások teljesen hasonlóak az előzőkben ismertetett eljárásokhoz. A C-terminális horgonyzórégió lehet bármelyik, az előzőkben specifikusan javasoltak közül, vagy egy, az 1. táblázatban bemutatott Gram-pozitív baktériumból származó sejtfelszíni fehérje horgonyzórégiója. A transzformált baktériumok aktív polipeptidje tartalmazza a bemutatott peptidet, a leader szekvenciához és egy sejtfelszíni fehérje N-terminálisának kis szegmentjéhez íüzionáltatva, hogy ezzel lehetővé tegyük a pepiidnek a sejt felszínére való eljutását.

HU 220 420 BI

Ref.

o\

©

CM

3

00

49 I

o

r—t V*)

CM ΟΊ

Patogén/betegség (fehérje)

1 Malária, a Plasmodium falciparum cs fehéqéje

Malária, a Plasmodium vivax cs fehétjéje

1 Malária, a Plasmodium falciparum Pf 155 fehétjéje

Malária, a Plasmodium falciparum Merozoita sejtfelszíni fehérjéje 1

Hepatitisz, pre S(l)

Hepatitisz, pre S(2) 1

Hepatitisz sejtfelszíni antigén 1

Poliovírus replikáz fehérje 1

Poliovírus replikáz fehérje j

Polivírus, VPg I

Száj- és körömfájás VPI 1

Száj- és körömfájás VPI 1

Influenza, HA2 hemagglutinin fehéije |

Peptid

1 A. H-(ASN-Ala-ASN-Pro)„-OH n=3

CM II G O 1 E Λ < 2 e. 1 G δ >, δ 1 ο. (Λ < «ί < 2> < 1 CL ΙΛ < 1 δ ώ CB

| C. Glu-Gln-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala |

1 D. Asn-Ala-Glu-Asn-Lys-Glu-Glu-Leu-Thr-Ser-Ser-Asp-Pro-Glu-Gly-Gln-Ile-Met |

Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Thr-Leu-Gln-Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr- Leu-Tyr-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly

| F. Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser-Gly-Thr-Val |

1 G. Cys-Thr-Lys-Pro-Thr-Asp-Gly-Asn-Cys-Thr-Cys |

1 H. Tyr-Ser-Thr-Leu-Tyr-Arg-Trp-Leu-Asp-Asp-Ser-Phe |

| I. Asn-Ala-Pro-Ser-Lys-Thr-Lys-Leu-Glu-Pro-Ser-AIa-Phe j

| J. Lys-Lys-Pro-Asn-Val-Pro-Thr-Ile-Arg-Thr-Ala-Lys-Val-Gln |

| K. Gly-Ser-Gly-Val-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Ser-Leu-Ala-Leu-Arg-Val-Ala-Arg-Gln-Leu-Pro |

1 L. Arg-His-Lys-Gln-Lys-Ile-Val-Ala-Pro-Val-Lys-Gln-Thr-Leu |

| M. Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu |

Referenciák:

(39) Schwarz, E. U. K. Freese, L. Gissmann, W. Mayer,

B. Roggenbuck, A. Stremlau and H. zűr Hausen,

Natúré, 314, 111-114(1985) (40) Zavala et al., Science, 228, 1436 (1985) (41) McCutchan et al., Science, 230, 1381 (1985) (42) Udomsangpetch et al., Science, 231, 57 (1986) (43) Ravetch et al., Science, 227, 1593 (1984) (44) Neurath et al., Science, 224, 392 (1984) (45) Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9174 (1986) (46) Prince et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 579 (1982) (47) Bhatnager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,

4400 (1982) (48) Báron et al., Journal of Virology, 43, 969 (1982) (49) Báron et al., Cell, 28, 395 (1982) (50) Bittle et al., Natúré (London), 298, 30 (1983) (51) Atassi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 840 (1982) (52) Muller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 569 (1982)

A találmány szerinti baktériumok valójában terápiás ágensek, és így is kell kezelni őket. Használhatók egyedül, vagy gyógyászatilag elfogadható hordozókkal kombinálva, amelyeket általában az ilyen terápiás ágensekhez használnak. Az orális vagy nazális alkalmazásokhoz a baktériumokat vizes izotóniás sóoldatban szuszpendálhatjuk, amelyet ízesíthetünk vagy szagosíthatunk. A bélbe való eljuttatás céljából betehetjük egy kapszulába, hogy a transzformált baktériumot orálisan tudjuk beadni. Más adagolási módszerek nyilvánvalóak a szakterületen jártas szakember számára, és a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

Mivel a találmány szerinti termékeket élő transzformáit baktériumok formájában alkalmazzuk, ezért nincs szükség specifikus dozírozásra. A dózis általában körülbelül 10⁶-10¹⁰ mikroorganizmust tartalmaz dózisonként.

Claims (17)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy hibrid sejtfelszíni fehérje, azzal jellemezve, hogy egy Gram-pozitív baktérium által normális körülmények között expresszált sejtfelszíni antigént tartalmaz egy aktív polipeptidhez fuzionáltatva, amelyet egy emlős gazdaszervezetbe lehet bejuttatni.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti hibrid sejtfelszíni fehérje, amelyben az aktív polipeptid egy enzim.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti hibrid sejtfelszíni fehérje, amelyben az aktív polipeptid egy emlőstumorsejt sejtfelszíni antigénje.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti hibrid sejtfelszíni fehérje, amelyben az aktív polipeptid hím sperma sejtfelszíni antigénje.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti hibrid sejtfelszíni fehérje, amelyben az aktív polipeptid egy allergén.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti hibrid sejtfelszíni fehérje, amelyben az aktív polipeptid egy baktérium, egy ví14

   HU 220 420 Β1 rus, egy parazita vagy egy gomba sejtfelszíni antigénjének antigén determinánsát tartalmazza.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti hibrid sejtfelszíni fehérje, amelyben a horgonyzószekvencia egy sztreptokokkusz M fehérje horgonyzószekvenciája.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti hibrid felületi fehérjét kódoló génszekvencia.
9. 9. A 8. igénypont szerinti génszekvenciát tartalmazó plazmid.
10. 10. A 8. igénypont szerinti génszekvenciát tartalmazó kromoszóma.
11. 11. Egy apatogén Gram-pozitív baktérium, azzal jellemezve, hogy az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti hibrid sejtfelszíni fehérjét expresszálja, amelyben a fehérje horgonyzószekvenciája a baktériumhoz kötődik.
12. 12. A 11. igénypont szerinti apatogén Gram-pozitív baktérium, amelyben a hibrid sejtfelszíni fehérjét egy 9. igénypont szerinti plazmid expresszálja.
13. 13. A 11. igénypont szerinti apatogén Gram-pozitív baktérium, azzal jellemezve, hogy a hibrid sejtfelszíni fehérjét egy kromoszomális gén expresszálja.
14. 14. Állati gazdaszervezet patogén baktériumok okozta fertőzéstől védő vakcina, azzal jellemezve, hogy egy, a 11-13. igénypontok bármelyike szerinti baktériumot és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
15. 15. Plazmid, azzal jellemezve, hogy egy Gram-pozitív baktérium által normális körülmények között expresszált sejtfelszíni antigén LPXTGX horgonyzószekvenciáját expresszáló génszegmenst tartalmaz, egy olyan polilinker szegmenssel együtt, amelyet egy marker választ el két részre.
16. 16. Eljárás egy fertőzés in vitro kimutatására, amelyet egy állati szervezet testfolyadékában található, a fertőző szervezetre jellemző antitestek jelenléte jellemez, és amely abból áll, hogy a testfolyadékot egy, a 11-13. igénypontok bármelyike szerinti apatogén Gram-pozitív baktériummal inkubáljuk, amely reagál az antitestekkel, majd meghatározzuk, hogy lejátszódott-e valamilyen reakció.
17. 17. Fertőzés kimutatására használható készlet, amely fertőzésre jellemző, hogy egy állat valamely testfolyadékában antitestek jelennek meg, amely készlet egy 11-13. igénypontok bármelyike szerinti apatogén Gram-pozitív baktériumot tartalmaz, amely a hibrid sejtfelszíni fehéijét expresszálja, és ez reagál az antitestekkel.