JP3626181B2 - グラム陽性菌の表面上のハイブリッド表面タンパク質の供給及び発現 - Google Patents
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- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Description
関連出願
本出願は、1990年５月11日付の出願第07/522,440号の継続願である1991年８月５日付の出願第07/742,199号の継続出願である。
1991年11月23日付の出願第07/814,823号の一部継続出願である1992年３月13日付の同時係属出願第07/851,082号の一部継続出願である。最初の２つの出願は現在放棄されている。
発明の分野
本発明は、一般に、グラム陽性菌の表面に対し、タンパク質抗原を含むタンパク質を供給し、これらのタンパク質を細胞にしっかり付着させるのに有用な生成物及び方法に関する。より特定的には、本発明は、動物宿主に対して有効に投与できるあらゆるタンパク質、ペプチド又はポリペプチド及びグラム陽性表面タンパク質の細胞関連領域のアンカー領域を少なくとも含む融合タンパク質の産生に関する。以下でさらに詳しく論述するように、グラム陽性菌の表面上に置かれたタンパク質、ペプチド又はポリペプチドを含む本発明の生成物は、例えば防御抗体の産生といったような免疫原性応答を惹起させるため、又はその他の有効な目的のため、動物宿主にこのような物質を供給するのに使用することができる。タンパク質、ペプチド又はポリペプチドは、例えば、特定の目的のために必要な酵素及びその他の機能的タンパク質であってよい。これは、細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌からの抗原決定基であってよい。哺乳動物の腫瘍細胞からの又は雄の精子の表面抗原であってよい。これは、スズメバチの毒液といったアレルゲンであってもよい。本発明は同様に、このような融合タンパク質の産生において用いられる新しいプラスミド、遺伝子、染色体及び形質転換された細菌にも関する。本発明はさらに、その病原体の病原力と関連づけられ病原性微生物によりひき起こされる感染や疾病に対して宿主を防御するべく抗原を惹起させることになる病原性微生物上に通常存在する外来性抗原を動物宿主に供給するように設計されたグラム陽性菌を利用する新奇のワクチンをも提供する。
本発明の産物は、診断作用物質としても有効である。
本発明は又、特定の対象部域に対して細菌表面上に置かれた酵素を供給するための手段をも提供する。
本書で使用する「動物」という語は、人間；ウシ特に肉牛；羊及び山羊などの哺乳動物；家きん類、特にニワトリ、アヒル及び七面鳥；ならびに魚、特にサケ、マス及びナマズといった養魚場で飼養されるもの、を含む生物のことを意味する。本発明は哺乳動物にとって特に重要性をもつものである。
発明の背景
本発明の本質は、それが、共に以下でより詳しく定義づけされ論述されている２つの主要な部分すなわちアミノ酸残基から成るアンカーセグメントをＮ末端活性ポリペプチドセグメントを含むハイブリッド表面抗原でありうるハイブリッド表面タンパク質を発現する新しい非病原性グラム陽性菌の産生方法をも提供する、ということにある。
本発明は、Ｍタンパク質及びその構造を考慮することによってより良く理解できることだろう。Ｍタンパク質は、グラム陽性菌であるＡ群の連鎖球菌の病原因子（virulencefactor）である２重らせん表面抗原である。Ｍ型６のストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcu spyogenes）（化膿連鎖球菌）のＭタンパク質は、441個のアミノ酸残基を含んでいる。
その構造については以下でさらに詳しく記述するが、この点において細胞関連領域について論述することが有用であろう。アミノ酸の標準的な１文字表示を利用して、アミノ酸残基407から残基441までのM6タンパク質の細胞関連領域のアンカー領域の構造は、
LPSTGETANPFFTAAALTVMATAGVAAVVKRKEEN
として表わすことができる。
アンカー領域のＮ末端にある第１のロイシン残基（Ｌ）から読みとると、この領域は、LPSTGEセグメント;3つのアミノ酸残基TANを含むスペーサ−セグメント;20のアミノ酸の疎水性セグメント、PFFTAAALTVMATAGVAAVVとそれに続く高度に荷電したテールセグメントKRKEENを含んでいる。
M6タンパク質の上述のアンカー領域がグラム陽性菌の全ての既知の表面タンパク質の間で高レベルで保存されているということが、グラム陽性菌の多数の表面タンパク質の構造研究の結果として観察されてきた。そのうちの多くは、Fischettietal.（参考文献１）によって示されている。一般に、疎水性セグメントは、約15〜20個のアミノ酸残基を含む、荷電されたテールセグメントは約４〜６個のアミノ酸残基を含み、スペーサーセグメントは約３〜６個のアミノ酸残基を含んでいる。しかしながらさらに注目すべきことは、既知の表面タンパク質のLPSTGEセグメント内のほぼ100％という高レベルの相同性である。変動は、ほぼ排他的に３及び６の位置でのみ起こる。従って、この領域は一般にLPXTGXとして表わすことができる。
以下の表１は、グラム陽性菌の40の異なる表面タンパク質の中でかくして今までに立証されてきたこの相同性の注目すべき範囲を示している。
グラム陽性菌の表面タンパク質のこのきわめて相同性の高い領域が、細胞に対して細菌表面タンパク質を固着させる上で必要不可欠であるということは明白である（28）。ここではLPXTGXセグメントと呼ばれているこのセグメントは、グラム陽性菌の表面に対してタンパク質を固着するための表面タンパク質の細胞関連領域の非常に重要なセグメントである。
この発見は、Schneewind et al（65）により確認された、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphlococcus aureus）（黄色ブドウ球菌）のプロテインＡ分子を用いて、これらの研究者は、細胞表面にプロテインＡ分子を供給するのに、完全複合体（LPXTGXモチーフ、疎水性ドメイン及び荷電されたテール）が必要であること、そしてLPXTGXモチーフ内の変更又はその欠失が分子の発現を阻害しないものの、それが表面に固定するのを妨げるであろうということを立証した。
【図面の簡単な説明】
図１は、グラム陽性菌からのさまざまな表面抗原のＣ末端領域及びそれらを発現するのに利用される遺伝子セグメントの中のアミノ酸の配列を示している。LPSTGEモチーフには陰影が施こされ、タンパク質はこのコンセンサス配列に沿って配列された。11個のタンパク質のうち10個において、コンセンサスLPSTGE配列（囲みのあるもの）より２〜３個の残基前に、保存されたリジン残基が発見された。相同なカルボキシ末端疎水領域も同様に囲まれている。左欄内で使用されている略号は、表１のものと同じである。
図２は、Ｍタンパク質のモデルである。
図３は、M6タンパク質の完全アミノ酸配列を示す。
図４は、宿主ベクターシステムGP232−PVMB20を示す。
図５は、GP246内のM6:E7翻訳融合の構築及び染色体組込みを示している。
図６は、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptoc occus gordonii）GP246中で発現されたM6:E7融合タンパク質がその表面上に位置づけられていることを立証するべく設計された研究の結果を示す。
図７は、組換え型ストレプトコッカス・グロドニー（Streptococcus gordonii）246の細胞抽出物がM6:E7融合タンパク質を発現することを示す。
図８は、組換え型GP246で免疫化された動物がE7タンパク質との反応性をもつ抗体を産生することを示している。
図９は、本発明の汎発性プラスミドを示す。
図10は、本発明の代表的ハイブリッドタンパク質を示す。
図11及び12は、本発明のハイブリッドタンパク質を用いてマウスを処置した研究の結果を示す。
図２及び３を入念に検討すると、本発明を理解する上での一助となる。図２は、いくつかの位置及びセグメントが同定された状態でのＭタンパク質のモデルを表わす。図３は、M6タンパク質の完全な構造の中の各々のアミノ酸残基を同定している。
上記論述から、図２で細胞関連領域として同定されたＭタンパク質のセグメントが、表１に列挙されるもののようなその他のグラム陽性菌上に発見される表面タンパク質のための領域を類似していることが理解できることだろう。上述のように、特に全てのグラム陽性表面タンパク質の中に発見されるLPXTGXセグメントといったアンカー配列内に特に高度の相同性が存在する。以下で論述するように、本発明を例示する目的で、Ｍタンパク質を発現する遺伝子の領域122〜300に広がる遺伝子セグメントは、遺伝的に除去され、例えば有効な抗体を生成することになる抗原といった外来性タンパク質を発現する新しい遺伝子セグメントによって置換され、かくして新奇のハイブリッド表面タンパク質を産生する。全てのグラム陽性細菌の細胞関連領域内の高度の相同性のため、ハイブリッド遺伝子をあらゆるグラム陽性菌の中で利用することが可能である。選択された細菌は、細胞に分子を付着させるためアンカー領域を用い、細胞表面上に挿入された活性セグメントを位置づけして、設計されたハイブリッドタンパク質を発現することになる。挿入された活性セグメントを、以下では「活性ポリペプチド」と呼ぶことにする。
「活性ポリペプチド」という語を、ここでは、可能なかぎり広義で使用する。これは、あらゆる有効な目的のために動物宿主に供給することのできるあらゆるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のことを言う。例えば、以下で詳述するとおり、グラム陽性菌からのタンパク質の細胞関連領域を病原体からのウイルスタンパク質の１セグメントに融合させて、非病原性細菌により発現されることになるハイブリッド表面タンパク質を産生することができる。細菌は、動物宿主をコロニー化し、ワクチンとして機能することができる。これは、ウイルスによるその後の感染に対し防御するか又はこれを阻害するべく動物宿主の中で抗体を惹起することになる。融合されたウイルスセグメントは、本発明のこの特定の実施態様の「活性ポリペプチド」である。
便宜上、「ポリペプチド」という語は、以下では、タンパク質と呼ばれるのに充分なだけの高分子量をもつ分子、より低い分子量の通常ポリペプチドと呼ばれる産物、及びさらに低い分子量をもつ通常ペプチドと呼ばれる産物のことを意味するものとして使用されている。
「活性ポリペプチド」は、有効な目的のために動物宿主に対して供給することのできるあらゆるポリペプチドであってよい。これは、例えば、上述のウイルスセグメントである可能性がある。これは又、あらゆる病原性ウイルスからの、又は細菌、寄生虫又は真菌からの抗原でもあり得る。このような場合、活性ポリペプチドは完全抗原、抗原の抗原決定基又は抗原決定基を含む抗原の１セグメントであることが考えられる。有効な目的とは、抗体の産生により防御免疫応答を惹起すること又は、抗原に対する細胞免疫応答を惹起することである。
本明細書及び請求の範囲中で使用している「細胞関連領域」という語は、図、特に図２、３及び10を参照することによって直ちに理解できる。細胞関連領域には、アミノ酸残基の細胞壁に広がる配列と炭水化物に広がるセグメントが含まれていることがわかるだろう。壁に広がる配列は、本発明のハイブリッドタンパク質から削除することができるが、現在ではそうしない方が好ましい。
細胞関連領域は同様に、アンカーセグメント（LPXTGX）、スペーサ−セグメント、疎水性セグメント及び負荷されたテールセグメントを含むアンカー領域をも内含する。アンカー配列は、本発明のハイブリッドタンパク質にとって必要不可欠である。この配列が無いと、ハイブリッドタンパク質はグラム陽性菌キャリアの表面上に保持されなくなる。
図10は、図示されているとおり、細胞関連領域に融合された活性ポリペプチドを含む本発明の標準的なハイブリッドタンパク質の残りの部分を示す。この図は又、活性ポリペプチドのアミノ末端における小さいＮ末端セグメントとリーダーセグメントをも示している。これらのセグメントは、グラム陽性菌の表面上のハイブリッドタンパク質の適切な配置において連動する。リーダーセグメントの機能は、細胞内のハイブリッドタンパク質の適切な処理を可能にすることにある。リーダーセグメントを連動するＮ末端セグメントは、リーダーペプチダーゼ酵素がリーダーセグメントをＮ末端セグメントから分離させることができるようにし、ハイブリッドタンパク質が細菌の表面上でその適切な位置をとることを可能にする。リーダーセグメント及びＮ末端セグメントは、細胞関連領域のタンパク質と同じ表面タンパク質からのものである。Ｎ末端セグメントは、ハイブリッドタンパク質の細胞関連領域内で使用されるタンパク質のアミノ末端から誘導された最初の数個のアミノ酸残基を適切にも含んでいる。適切な処理のためには通常約10個のこのような残基で充分であるが、最高20以上のアミノ酸残基を含むセグメントを利用することも可能である。
活性ポリペプチドは、必ずしも病原性生体からの抗原である必要はない。これは、例えば酵素であってもよい。その場合、有効な目的は、非病原性細菌の表面上の酵素をこの非病原性細菌によりコロニー化された動物宿主内の特定の部位に供給することとなる。
活性ポリペプチドは、酵素を含む完全分子であってもよい。あるいは、これは単に、有効な目的を達成するのに必要とされるポリペプチドセグメントでもありうる。
活性ポリペプチドは、病原性微生物により惹起された抗体と反応することになる抗原であってもよい。このような活性ポリペプチド抗原を運ぶ本発明の細菌は、診断用試薬として有用である。
ここで非病原性細菌と言うとき、その病原性が弱化されるか又は破壊されるように通常の手順によって変更又は弱毒化されておりしかも本書に記述する方法に従ってLPXTGX領域を含むＣ末端領域を含むハイブリッドタンパク質を発現する病原菌ならびにグラム陽性共生菌を内含するものと理解すべきである。
本発明の簡単な説明
本発明は、細菌に付着されたＣ末端領域をもつ少なくとも１つのハイブリッド表面タンパク質を発現する非病原性グラム陽性菌を提供する。このＣ末端領域は、病原性のものであっても非病原性のものであってもよいグラム陽性菌によって通常発現される表面タンパク質の細胞関連領域を内含するが、これに制限されるわけではない。ハイブリッド表面タンパク質の残りの部分には、何らかの有効な目的のため動物宿主に供給されうる活性ポリペプチドが含まれる。
本発明の細菌により「通常産生」される表面タンパク質とは、本発明の方法に従って遺伝的に変性される前の細菌により産生される全タンパク質のことを言う。
以前の研究（29）からわかっており図２及び図３に示されている通り、Ｍタンパク質のアミノ酸298〜441は、細胞内に埋没され、一方残基１〜297は細菌細胞の表面上に露呈されている。本発明に従うと、本書に記述され図示されている遺伝的操作を利用することにより、Ｍタンパク質の表面露出部域のほぼ全てを除去することができ、又本発明のハイブリッド表面タンパク質を生成するべくＭタンパク質のＣ末端細胞関連領域に結合される活性ポリペプチドで置換することができる。細胞関連領域は全てのグラム陽性表面分子について基本的に同じであることから（図10）、これらの分子のいずれか１つの細胞関連領域をもう１つの供給源からの活性ポリペプチドを供給するための供給キャリヤ又は賦形剤として使用できるようにする類似の戦略を使用することが可能である。ハイブリッド表面タンパク質を発現するのに利用される新しい遺伝子は、標準的技術によりプラスミド中に挿入でき、このプラスミドは大腸菌（Escherichia Col i）又はその他のベクターを形質転換するのに使用できる。その後、大腸菌（E.Coli）は新しい融合タンパク質、すなわち本発明のハイブリッドタンパク質を発現することになる。大腸菌（E.Coli）手順はこのグラム陰性生体の周縁細胞質から分離することのできる大量のハイブリッドタンパク質の産生のために有用である。しかしながら本発明の大部分の効用にとって、グラム陽性菌の表面上のハイブリッドタンパク質の産生のためグラム陽性生体を形質転換することが好まれる。本発明に従って産生された組換え型遺伝子は、あらゆるグラム陽性菌によって処理されうる。
代替的には、融合遺伝子を含む新たに構築されたプラスミドを、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）（ミュータンス連鎖球菌）の染色体といったグラム陽性菌の染色体内に融合遺伝子を組込むのに使用することもできる。その後、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）の新たに産生された菌株は、細胞表面上での発現により本発明の新しいハイブリッドタンパク質を産生することになる。これが、本発明の産物を産生するための現在好まれている手順である。
広範な微生物からの抗原ポリペプチドを本発明の活性ポリペプチドとして利用することができる。これらには、人間及び動物を感染させる病原性微生物が含まれる。次に示すのは、本発明の実施において有用なポリペプチドを発現する典型的微生物の代表的一覧表である。本発明の形質転換された細菌は、微生物による感染に付随する疾病を治療又は予防するために使用することができる。
真菌：キャンディダ・アルビカンス（Candida albica ns）、アスペルギルス・フミガッス（Aspergillus fumi gatus）、ヒストファズマ・カプスラッム（Histoplasma capsulatum）（これらは全て内転移疾患をひき起こす）、ミクロスポリウム・カニス（Microsporum cani s）（動物白癬）
寄生性原生動物：プラスモデウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）（マラリア）、トリパノソマ・グルジ（Trypanosoma cruzi）（睡眠病）、
スピロヘータ：ボレリア・ベルグドルフェリ（Borrel ia bergdorferi）（ライム病）、トレポネマ・パリヅム（Treponema pallidum）（梅毒）、ボレリア・レクレニチス（Borrelia recurrentis）（回帰熱）、レプトスピラ・イクテロヘモラギア（Leptospira icterohaemorrha giae）（レプトスピラ症）、
細菌：ナイゼリア・ゴノラエ（Neisseria gonorrhaea e）（淋病）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staph ylococcus aureus）（心内膜炎）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（リウマチ熱）、サルモネラ・ティポサ（Salmonella typhosa）（サルモネラ症）、ヘモフィルス・インフルエンザ（He mophilus influenzae）（インフルエンザ）、ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）（百日咳）、アクチノミセス・イスレアリー（Actinomyces israeli i）（放線菌症）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）（う食症）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）腺疫（馬）、ストレプトコッカス・アガラリチア（Streptococcus agalac tiae）（ウシの乳房炎）、ストレプトコッカス・アンギノスス（Streptococcus anginosus）（イヌの生殖感染）
ウイルス：ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、口蹄疫ウイルス、オウム病ウイルス、パラミクソウイルス、ミクソウイルス、コロナウイルス。
本発明の１実施態様においては、宿主動物にとって共生生体である非病原性グラム陽性菌が、非病原性グラム陽性菌内にハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子を挿入することによって、ハイブリッドタンパク質をその表面上に発現させるために使用される。融合が、病原性生体（細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌）からの抗原である活性ポリペプチドとのものであり、結果として得られるハイブリッド抗原を発現する共生細菌が動物宿主に投与される場合、体液及び細胞を媒介とする両経路により免疫学的応答が存在することになる。考えられる１つの免疫学的応答は、抗体の産生であり、これにより病原体による感染に対する防御がもたらされる。融合が酵素とのものである場合、この酵素は、共生生物の表面上で発現されることになる。本開示を検討すれば当業者にとって明らかであるように、さまざまな活性ポリペプチドをグラム陽性菌の表面に供給することができる。
本発明の遺伝子、プラスミド、染色体及び形質転換された細菌は、当業者にとって周知の標準的組換え技術を適用することによって産生される。例えば、ウイルス外被タンパク質をコードする制限フラグメント又はオリゴヌクレオチド、細菌表面抗原（又は実際には完全抗原）の病原力因子、酵素又は本発明のハイブリッド表面タンパク質のその他の望ましい先祖を、Ｍタンパク質又は表１に列挙されているもののようなグラム陽性菌からのその他の既知の表面タンパク質の細胞関連領域を発現する遺伝子に連結させることが可能である。結果として得られるハイブリッド遺伝子は、本発明の表面ハイブリッドタンパク質の産生をもたらすべくグラム陽性菌の形質転換するのに使用されることになる。
本発明については、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）のGP246菌株によるハイブリッドタンパク質M6:E7の発現に関連してさらに詳しく記述する。
このハイブリッド抗原は、M6タンパク質のＣ末端細胞関連セグメントを含む。ポリペプチドE7を惹起する抗体は、乳頭腫ウイルス菌株からの早期タンパク質である。
ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus go rdonii）は、口腔の共生菌である。E7は、ヒト乳頭腫ウイルス６型（HPV16）のウイルス複製の間に産生された98アミノ酸早期タンパク質である。これは、子宮剄ガンを患う患者にそれに対する抗体が発見される腫瘍タンパク質である。これは、HPVにより誘発された悪性新生物に対するワクチンのための主要な抗原候補であるとみなされている。
本発明の新奇の細菌は、図４及び図５に示されている標準的な相同組換えによって産生可能である。図示されているように、新しい菌株GP246を産生するべく、大量のM6タンパク質を発現するストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）の新しい菌株GP232が宿主として利用された。
図４及び５に示されているとおりに利用される手順は、標準的なものであり、熟練した開業医により広く使用されている。図示されているように、この技術は、融合遺伝子の高い発現という結果をもたらす染色体内の任意の場所での融合遺伝子の挿入のためグラム陽性受容体生体を構築するためのものである。挿入部位は生体によって変動する可能性があり、又同じ生体内でも変動することがある。この方法の利点は、これによって、挿入された遺伝子が外来性プロモータの結果としての発現に依存するのではなくむしろ融合遺伝子の高い発現という結果をもたらすことになる部位に確実に存在するようになるという点にある。従って、この方法は、強いプロモータをもつ領域が確実に選択されるようにする。
新奇のGP246菌株を生成する方法において、M6タンパク質のHind IIIと部位Kpn Iとの間の538塩基対セグメントは、以下に記述されているように産生された新奇のプラスミドpVME20が切除され、その場所に、E7をコードする294塩基対が挿入されて、新しい遺伝子を産生し、この遺伝子は新しいプラスミドpVMB21の産生のために利用された。切除されたＭタンパク質の領域は、E7のＮ末端に融合されたリーダーセグメントを含むN6N末端の120アミノ酸セグメントと共に細胞表面にE7分子を配置する結果をもたらす。構成体は、大腸菌（E.coli）の中で作られ、組換え型プラスミドは、新しい菌株GP246によりM6:E7タンパク質を発現する遺伝子の染色体組込みをもたらすべくGP232での標準的な２重交叉手順によりS.gordoniiを形質転換するために使用された。
材料と方法
組換え型DNA技術。大腸菌（Escherichia coli）ベクター内の遺伝子融合は、標準的な手順（30）により得られ、構築された。
連鎖球菌形質転換。自然に応答能あるS.ゴルドニー・チャリス（S.gordonii Challis）の凍結細胞を、既知の手順により調製し、形質転換した（31）。既知の手順（32）を用いてオーバーレイ内に５μg/mlの濃度でエリスロマイシンを用いて、多層平板上での形質転換体の平板培養及び評点を行なった。
形質転換体の遺伝分析。選択平板からのコロニーの楊枝トランスファにより３つの血液寒天平板の表面に、形質転換体を線条接種した。第１の平板はエリスロマイシン（５μg/ml）を含み、第２の平板はクロラムフェニコール（５μg/ml）を含み、第３の平板はいかなる抗生物質も有していなかった。平板を37℃で36時間インキュベートした。インキュベーションの後、抗生物質を全く含まない平板の表面にニトロセルロース膜を適用し、20分間室温に保った。次に膜を、真空オーブン内で37℃で30分、80℃で15分インキュベートした。大腸菌（E.coli）内で産生されたMS2:E7融合タンパク質（33）で免疫化されたウサギから得た抗E7ポリクローナル抗体（1:5,000希釈）を用いて、ニトロセルロースに結合したE7タンパク質の存在を検出した。
免疫螢光検査。晩期指数増殖期で、トッド・ヒューウィット培地（Difco）内で成長させられた細菌を収穫し、ガラス平板上に適用し、メタノールで固定した。スライドをM6又はE7特異抗体（1:50希釈）で処理し、大規模に洗浄し、次にローダミンと接合させたヤギの抗ウサギ（又は抗マウス）IgG抗血清（1:100の希釈）と反応させた。共焦螢光撮像システムMRC−500 Bio−Rad顕微鏡で、結果を観察した。
細胞抽出物のウェスタンブロット分析。トッド・ヒューウィット培地（Difco）内で晩期定常期まで、連鎖球菌を成長させた。細胞を収穫し、50mMのトリス（pH8.01,50mMのMgcl2,30％スクロースの中で再懸濁させた。０℃で30分間リソチーム（100μg/ml）で細胞懸濁液を処理することにより原形質体を得た。次に原形質体を遠心分離に付し、50mMのトリス（pH8.0）中で再懸濁した。懸濁液を急速凍結／解凍するサイクル５回により、徹底的な溶解が達成された。溶解しなかった細胞及び全砕片を、15分間1,000rpmでの低速遠心分離により廃棄する一方で、膜及び細胞形質を含む上清をウェスタンブロット分析のために使用した。約５×108の連鎖球菌細胞から得られた抽出物をゲル上に走行させ、従来の方法によりウェスタンブロットを行なった。
マウスの免疫化。完全フロインドアジュバント内で乳化された５×108の生きたGP246連鎖球菌細胞（５×107のコロニー形成単位）を用いて、Balb/cマウスを皮下で免疫化させた。一次免疫化から２〜３週間後に、不完全フロインドアジュバント内で乳化させた同じ細菌用量の皮下追加免疫をマウスに施した。最後の追加免疫から一週間後に、マウスを出血させた。
結果
プラスミドpVMB3の産生：エリスロマイシン（34）に対する耐性を付与する遺伝子であるermCがemm−6.1に隣接してクローニングされ、両方の遺伝子が同じClaIフラグメント内にくるようになっている１つの構成体が、作製された。この構成体において、emm6.1の開始コドンは、Cla I部位のうちの１つの部位より下流19bpのところにあり、かくしてCla I分割がemm−6.1をプロモータの無い状態に残すようになっていた。emm−6.1コーディング配列の上流にこのCla I部位を含むプラスミドPVV3:M6（35）が、実験に使用された。ermCを含むpE194の2.0kbMsp Iフラグメントをpvv3:M6の部分Cla I消化を用いて連結させた。E.coliDH5の形質転換の後、Cla Iフラグメントを含むプラスミドpVMB3でグローンを分離した。
菌株GP230の産生:ermC及びプロモータ無しのemm6.1を含むpVMB3の3.4−kbCla Iフラグメントを、同様にCla Iで切断されたS.ゴルドニー（S.gordonii）の染色体DNAを用いて連結させた。自然に転質転換可能なS.gordonii「Challis」菌株V288を形質転換するために連結混合物を使用した。この方法により、emm−6.1/ermcCla Iフラグメントは、任意に染色体内に組込まれた。Cla Iフラグメントに連結された染色体DNAは、形質転換中の組込みについて相同性を提供した。エリスロマイシン耐性（Em−ｒ）形質転換体が選択され、「ストリークブロット」によりM6タンパク質の産生について分析された。700のEm−ｒ形質転換体のうち、196（28％）がM6タンパク質を産生した。判定量ドットブロット分析に基づくと、GP230は最良のM6産生物であると思われた。
菌株GP232の産生:S.ゴルドニー（S.gordonii）GP230を、肺炎球菌株GP69の染色体DNAを用いて形質転換させた。この肺炎球菌株は、クロラムフェニコールに対する耐性を有するが、Pozzi及びGuild（36）の手順に従って産生されたエリスロマイシンに対しては感受性をもつ。GP69染色体DNAがGP230を形質転換するために使用される場合、ermC配列のレベルで組換えが起こり、GP230染色体内に組込まれたermCのコピー内へのCAT配列の挿入が導かれる。この挿入は、以下で論述され図面に示されているようにその表面上でM6を発現し、同様にクロラムフェニコールに対する耐性とエリスロマイシンに対する感受性をもつGP232を生み出す。
S.ゴルドニー（S.gordonii）中のHPV16のE7タンパク質の発現：
GP232の染色体上に存在するemm−6.1遺伝子内への非相同DNA配列の挿入を可能にするべく、組込みベクター、pVMB20を構築した。pVMB20は、ストレプトマイセス（Streptococous）中で複製せずemm−6.1及びエクスロマイシン耐性マーカーermCを運ぶ新奇な大腸菌（Escher ichia coli）プラスミドである。宿主ベクターシステムGP232−pVMB20は、図４及び図５に詳細に示されている。特定的に言うと、新奇のプラスミドpVMB20及び新奇の細菌S.ゴルドニー（S.gordonii）GP246は、以下の手順により調製された。
非相同遺伝子発現のための宿主ベクターシステム：〔Ａ〕新奇の宿主菌株S.ゴルドニー（S.gordonii）GP232の染色体内で、プロモーターは無いものの独自のリボソーム結合部位をもつM6タンパク質遺伝子のコピー（em m−6.1）（37）が、強い染色体プロモータの下流に組込まれた。emm−6.1の隣りには、ermC（34）が見られ、このerm−Ｃのコーディング配列は、cat遺伝子（38）を含むPC221の1.8−kb M60IフラグメントのそのBC II部位内への挿入によって中断されている。GP232はその表面上でM6を発現し、クロラムフェニコールに対し耐性をもち又エリスロマイシンに対する感受性をもつ。これは、連鎖球菌染色体内に非相同DNAを組込むべく形質転換を用いて得られた。構造は図中に示されている。GP232中の染色体内に組込まれた非相同DNAのサイズ（5.2−kb）は、サザンブロット分析により決定された。組込みベクターpVMB20は、ストレプトコッカス（Streptococcus）中で複製しない6.3−kbのE.coliプラスミドである。これは、以下で説明する手順によりemm−6.1及びermCを含むプラスミドpVMB3の3.4−kbCla IフラグメントをpBLUESCRIPT（Stratagene,La Jolla,California）内でサブクローニングすることによって得られた。これは、GP232の染色体中に組込まれるのと同じCla Iフラグメントであり、唯一の違いは、GP232 ermCがcatにより中断されているという点にある。S.ゴルドニー（S.gordonii）GP232のコーピテント細胞の形質転換におけるドナーDNAとしてpVMB20が使用されるとき、エリスロマイシン耐性形質転換体は、組込みベクターと相同染色体配列の間の組換えによって得られる。cat遺伝子を含むDNAフラグメントは、これらの形質転換体の染色体の中で欠失させられ、一方無傷のermC遺伝子が回復される（図５）。
（Ｂ）HPV16（39）のE7タンパク質遺伝子は、pVMB20のe mm−6.1配列内にクローニングされpVMB21を生み出した。Kpn I及びHind IIIでpVMB20を消化させ、プラスミドpMBS21L/E7（33）上で行なわれたインビトロDNA増幅（ポリメラーゼ連鎖反応）により得られたE7配列を含むKpn I/Hind IIIでこれを連結させた。増幅プライマは、E7をコードする294bpをemm−6.1内に「枠内」挿入するように設計された。pVMB21のヌクレオチド配列分析は、M6:E7翻訳融合の予想された構造を確認した。pVMB21を線形化し、GP232を形質転換するのに用いられた。エリスロマイシン耐性形質転換体の６％においてE7が発現されていることがわかった。これらの形質転換体の中で、pVMB21配列の組込みが、cat遺伝子が関与する欠失を生成した。代表的形質転換体であるGP246の構造は、サザンブロット分析により確認された。GP246の染色体上に存在するM6:E7遺伝子融合の接合部フラグメントのヌクレオチド配列も同様に、pBLUESCRIPT内でM6:E7融合を含むCla Iフラグメントをクローニングした後決定された。
E7タンパク質の表面発現：菌株GP246の表面上のS.ゴルドニー（S.gordonii）内のHPV16のE7タンパク質の発現を、M6タンパク質キャリヤヌはE7インサートのいずれかに特異的な抗体を用いて、免疫蛍光法により確認した。M6:E7遺伝子融合を含むGP246は、M6特異的又はE7特異的ポリクローナル抗体のいずれかと反応させられたとき陽性の蛍光を示し（図６）S.ゴルドニー（S.gordoni i）の表面上のＭタンパク質及びE7分子の表面位置設定を確認する。M6:E7遺伝子融合の構築において欠失させられたKpn I/Hind III内にコーティング領域が含まれていたM6のエピトープに特異的である既知のモノクローナル抗体10A11とGP246を反応させた時点で、いかなる蛍光も観察されなかった（図６）。
E7を発現する組換え型連鎖球菌が実際にM6:E7融合タンパク質を産生することを実証するために、ウエスタンブロットによってS.ゴルドニー（S.gordonii）細胞抽出物を分析した（図７）。GP246の細胞抽出物内で、同じバンドがE7−及びM6特異的抗体と反応し、一方、抽出物がM6−特異的反応性を示した受容体GP232においてはいかなるE7特異的反応性も見られなかった。（図７）。
M6分子のＣ末端領域及びアレルゲン５を含むハイブリッドタンパク質であるM6:E7を構築するのに用いられたものを実質的に同じ手順は、S.gordoniiの表面上で成功裡に発現を起こした。アレルゲン−５特異的抗体を用いた細胞壁抽出物のウエスタンブロットは、（M6:E7の場合と同様に）アレルゲン−５が実際にゴルドニー（gordonii）の細胞壁分画内で発現されたということを立証した。アレルゲン５は、Fang et al.（66）により記述されているとおりに得られた。
連鎖球菌表面上の融合タンパク質に対する免疫応答:M6:E7融合タンパク質の免疫原性を、M6:E7融合タンパク質を発現する組換え型S.ゴルドニー（S.gordonii）GP246でマウスを免疫化することによって検査した。M6タンパク質を発現する同質遺伝子型菌株GP232で、対照マウスを免疫化した。各菌株で免疫化した３匹の動物からの血清をプールし、チゴサッカロミセス・ポンベ（Schizo saccharomyces pombe）内で産生された精製E7タンパク質とのその反応性について、ウエスタンブロットによって試験した。図８は、表面M6:E7を含む菌株GP246で免疫化された動物が、E7タンパク質との反応性をもつ抗体を産生したことを示しており、これはすなわち、E7タンパク質が連鎖球菌表面上で融合タンパク質として発現されたとき免疫原性であることを示している。M6のみを含むGP232で免疫化されたマウスの血清中には、E7タンパク質に対するいかなる抗体も見られなかった。
以上で記述されてきた手順は、新奇のハイブリッド表面抗原M6:M7といったハイブリッド表面タンパク質を発現する非病原性細菌S.ゴルドニー（S.gordonii）GP246又はその他の形質転換されたグラム陽性菌の産生を可能にする。この新奇の抗原はハイブリッドタンパク質であり、そのカルボキシ末端は細菌に付着され、上述のとおりその他のグラム陽性表面タンパク質内に通常発見されるのと実質的に同じＣ末端領域である。このハイブリッド表面タンパク質の活性ポリペプチドは、HPV16の抗原E7である。細菌が、防御を必要とする動物宿主に対して例えばコロニー化によって投与された時点で、活性ポリペプチドは、体液性及び細胞媒介の両方の応答を惹起し、結果として、乳頭腫ウイルスによる感染に対する防御免疫応答を生み出す。
上述のとおり調製された本発明のハイブリッド表面タンパク質の異種抗原がウイルスの複製中に産生されたウイルス抗原であるということに留意されたい。従って、本発明の方法は、ウイルスによる感染に対する防御免疫応答を惹起するべく充分な量で動物に対しウイルス抗原を供給するための新奇のグラム陽性菌の産生を可能にする。
本発明の新奇のM6:E7及び新奇の中間産物は、２つの出発物質から産生される。すなわちpVV3:M6とGP69である。これらは、引用した参考文献中に記された手順によって調製されうる。従って新奇の産物は全て、本書に記述された手順を利用して既知の材料から得ることができる。しかしながら、本発明の実施を助けるため、必然性はないもののpVV3:M6及びGP69は、それぞれATCC68003及びATCC という受入れ番号でアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託されている。
上述のM6:E7の例は、ウイルス感染から全身を防御する目的での哺乳動物の口腔内に通常存在する非病原性の共生グラム陽性菌の利用を例示している。類似の要領で調製された非病原性細菌を使用して、本書に記述され図示されている方法によりその他の有効な抗原を発現し供給することも又可能である。例えば、哺乳動物の腫瘍の表面上のタンパク質抗原をあらゆるグラム陽性菌の表面抗原の細胞壁関連領域と融合させ、融合遺伝子をグラム陽性共生生物内に挿入し、結果として得られた細菌を、腫瘍の治療において有用な腫瘍特異的免疫応答を生成するためのワクチンとして利用することが可能である。
これらの例は、本発明の１つの態様のみを示しているにすぎない。本発明は、実際、動物の体内の免疫応答を起こすため又はその他の有効な目的のために有用でありうるあらゆる種類のポリペプチドのための供給システムを提供する。
ワクチンとして利用される場合、選択された形質転換された共生生物は、哺乳動物をコロニー化するのに利用されることになる。これは、選択されたハイブリッド表面タンパク質を産生することになり、その活性ポリペプチドセグメントは、防御抗体の産生を惹起させることになる。
通常膣粘膜上に発見されるグラム陽性非病原性細菌を、避妊薬として利用することが可能である。この効用のためには、雄の精子の表面抗原を、膣又は子宮の粘膜の表面上に通常見られる細菌ラクトバシルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）のハイブリッド表面タンパク質上の活性ポリペプチドとして利用することができる。形質転換された細菌がこのような粘膜をコロニー化するのに利用される場合、ハイブリッドタンパク質は、精子の表面抗原に対する抗体の産生を惹起し、精子の不活性化をもたらすことになる。実際には、精子は雌の体により外来性物質として見られ、予め形成された抗体が精子細胞と反応してこれを不活性化することになる。
このタイプの避妊には２つの重要な利点がある。その１つは、精子が不活性化されるため、卵子は受精されないという点である。もう１つは、ハイブリッド抗原を発現するグラム陽性菌を一掃するべく免疫化された雌を抗生物質で処置するだけで避妊効果を中和させることができるという点である。
本発明の形質転換された細菌のさらにもう１つの効用は、AIDSを防ぐのに使用できるワクチンを提供するべくグラム陽性共生生体の表面にHIVウイルスからの表面抗原を供給することである。この効用のためには、ポリペプチドGP120,GP120のV3ループ、GP160又は、HIVウイルスからのGP120の24アミノ酸セグメントであるRP135又はGP16の配列735〜752といった関連する表面抗原とかかる抗原のセグメント。
これらのポリペプチドは、共生菌の表面への供給のため、グラム陽性表面タンパク質のリーダー及びＮ末端配列の少なくとも一部分及びそのアンカー領域に融合されることになる。その表面上でHIV抗原を発現する形質転換された共生生物が感受性ある哺乳動物に供給された時点で、HIVウイルスによる感染に対し防御するべく免疫応答が起こる。さらに、GP120といったHIV抗原を膣へ供給するべく組換え型膣共生生物を使用することにより、この抗原に対して産生されたIgA抗体はこの部位での感染に対して防御性をもつ。膣分泌内のIgA抗体は、HIV陽性の女性の分泌中のHIV粒子の数を低減し、かくしてAIDSの蔓延を低下させる。
本発明の産物は、densitization治療において有効である。このタイプの治療は、（アレルギーの分野ではアレルゲンと呼ばれる）抗原に対する過度のIgE応答を発生させるアトピー患者の不快さを軽減するために広く使用されている。IgE抗体の産生の増加は、枯草熱、ぜん息及びアナフィラキシーショックの主要原因であると考えられている。
アレルゲンは、食物、カビ、塵埃及び動物の毛を含めさまざまな供給源のいずれからでも発生しうる。バラ又はブタクサといった植物相がアレルゲンの主要な供給源である。wasps,yellow,jackets及びhornetsといったスズメバチ科の「毒針」はアレルゲンタンパク質を含んでいる。
アレルゲンに対する露呈からの免疫応答を改善するのに利用された従来の療法は、増加する用量のアレルゲンの反復注入が関与する減感作治療であった。これは、マスト（肥胖）細胞に対するアレルゲン特異的IgEの結合を遮断するアレルゲン特異的IgG抗体の増大をひき起こす。
一定数のアレルゲン特異的ペプチド及びタンパク質が同定され、分離され、クローニングされてきた。これらには、例えば、スズメバチ毒液タンパク質であるアレルゲン５が含まれる。これらのアレルゲンは、本発明のハイブリッド表面タンパク質の活性ポリペプチドとして内含されうる。このようなハイブリッドタンパク質を生成する共生菌を、アレルギー患者をコロニー化するのに用いることができる。その結果として得られるのは、脱感作療法で達成されるものと同じ防御免疫応答を惹起することになるアレルゲンの恒常的供給源である。
ハイブリッドタンパク質M6:アレルゲン５の形成及び発現について以上に記述してきた。図11及び12は、このハイブリッド表面抗原を利用した免疫化研究の結果を示している。
図11は、ハイブリッド表面タンパク質内の精製されたアレルゲン−５に対するマウス血清の血清IgG応答を例示している。マウスには、フロインドアシュバント中でハイブリッド表面アレルゲン−５（107CFU）を発現するS.ゴルドニー（S.gordonii）を用いて皮内で、又は同じ生体を用いて鼻腔内で免疫化を施した。免疫化から４週間、６週間、８週間及び10週間後に動物を出血させ、精製アレルゲン−５に対するIgGについてELISA法により血清を検査した。皮内免疫化を受けた動物（V1−V4、ハッチング付き棒）及び鼻腔内免疫化を受けた動物（V5−V8、閉じた棒）の両方が、アレルゲンに対する抗体を発現した。表面をアレルゲン−５に露呈せずにgordoniiで免疫化した対照動物は、アレルゲンに対する応答を全く示さなかった。組換え型gordoniiを用いて鼻腔内で免疫化した全ての動物は、綿棒により決定されるように、少なくとも12週間コロニー化された状態にとどまり、この期間中なおもアレルゲン５を発現した。全ての検定は血清の1:50希釈を用いて行なわれた。
図12は、鼻腔内及び皮内で免疫化を受けた動物の体内のアレルゲン−５に対するIgA応答を示している。アレルゲン−５を発現するゴルドニー（gordonii）を用いての免疫化（皮内又は鼻腔内）から12週間後に（図11参照）、唾液をとり、動物を安楽死させて肺と消化管の洗浄液を得た。唾液と洗浄液を、ELISAによりアレルゲン−５に対し特異的なIgAの存在について分析した。その結果、皮内及び鼻腔内免疫化を受けた動物において唾液IgAが存在し、鼻腔内でコロニー化された動物の方が応答が優れているということがわかった。最高のIgA応答は、鼻腔内コロニー化を受けた動物の肺の洗浄液において見られた。IgA応答は、消化管の小腸（S,I,）の中に見られたものの、これらは肺の洗浄液よりも低いものであった。全ての検定は、試料の1:1希釈を用いて行なわれた。
本発明のハイブリッド表面タンパク質の供給のためのシステムの特別な利点は、形質転換された生体が通常の共生生物であることから、これらの生体はひきつづきコロニー化し防御免疫応答の恒常的刺激として作用することになり、かくして連続的な免疫化の必要がなくなるということにある。
当業者であれば、本発明の新奇の産物のその他の応用分野を数多く、容易に考えつくことができる。例えば、マラリヤ、麻疹、百日咳及びエイズ、コクシジウム症、ジステンパー、鶏痘及びブルセラ病といったレトロウイルス感染を含むさまざまな疾病状態に対する防御抗体を惹起する表面抗原を供給するために、非病原性グラム陽性菌を産生することができる。
ワクチンとして用いられる場合の本発明の供給システムのもう１つの特別な利点は、生菌が利用されるということにある。既知のとおり、生菌は、弱毒化された細菌又は死菌に比べてはるかに強い免疫応答を刺激する。さらにもう１つの利点は、非病原性細菌が利用されることから、ワクチンが安全なものであるという点にある。さらにもう１つの利点は、複数の投与方法が可能であるということにある。
本発明は、キャリヤ細菌としてのS.ゴルドニー（S.go rdonii）又さらには連鎖球菌に制限されるものではなく、実際には、その他の非病原性グラム陽性菌が往々にして好まれる可能性もある。例えば、腸粘膜エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus fecalis）上に通常存在する細菌が、腸に活性ポリペプチドを供給するのに好まれる可能性がある。
その上、本発明は、１つのエピトープのみを含む１つのハイブリッド表面タンパク質の表面発現に制限されるわけではない。キャリヤ生体は、各々異なる活性ポリペプチドをもつ複数のハイブリッド表面タンパク質を発現するべく、又代替的には、活性ポリペプチドが複数のエピトープを含むハイブリッド表面タンパク質を発現するべく、周知の手順によって形質転換させることができる。
ここまでは、本発明は、主として防御抗体を惹起するための抗原の供給に関して記述及び図示されてきたが、前述のとおり、本発明はこのように制限されるものではない。例えば、酵素を供給するために本発明を使用することもできる。
小腸内で分泌される酵素ラクターゼが欠乏している人間は、ラクトースをその成分すなわちＤ−グルコースとＤ−ガラクトースへと適切に加水分解することができない。１つの結果として、これらの人々は牛乳又は乳製品を適切に消化することができない。これまでの治療は、欠如している酸素を含む錠剤又はその他の治療用量形態を生涯経口摂取することであった。本発明の実施態様に従うと、その活性ポリペプチドがラクターゼであるハイブリッドタンパク質を産生するべくクローニングされる共生腸内細菌が提供される。この細菌は、必要とされる酵素の連続的産生のため腸粘膜をコロニー化するために利用することができる。
ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）は、う蝕症の原因である主要な生体である。これは、グルコースを産生するためスクロースを加水分解するグルコシルトランスフェラーゼを分泌する。一方、グルコースは、歯の表面に付着しう蝕プロセスに参与するグルカン重合体へと形成される。本書に記述され請求されている手順を利用して、グルカナーゼ酵素を含むハイブリッド表面タンパク質を発現するべくS.ミュータンス（S.mutans）を形質転換することができる。形質転換された細菌は、口腔をコロニー化しグルカン重合体の形成を阻害してう蝕に対して防御するのに利用できる。代替的には、歯苔を消化してう蝕の開始を妨げる酵素を産生するように、ストレプトコッカス・ミュータンス（St reptococcus mutans）を形質転換することができる。
実質的に前述した通りの本発明の方法は、表面タンパク質の発現のための細菌としてスタフィロコッカス．アウレウス（Staphyloccus aureus）を利用して用いられた。この細菌の表面分子であるプロテインＡの（LPXTGXセグメント、疎水性セグメント及び負荷されたテールセグメントを含む）アンカー領域が酵素アルカリ性ホスファターゼ（大腸菌（E.coli）の二量体周縁細胞質タンパク質）に融合され、この融合のための遺伝子がS.アウレウス（S.aureus）内に戻された時点で分子は細胞の外側にトランスロケーションされその表面に固着された状態にあることがわかった。この手順の詳細は、本書に参考として内含されている参考文献65の中に見られる。
当業者であれば、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、そのいくつかの変形態様が可能であることが認められるであろう。
特にワクチンの生産にとって特に有用である１つの変形態様は、タンパク質を生成するのに用いられる遺伝子内の望まれるタンパク質の発現のための必要なヌクレオチド配列及びハイブリッドタンパク質の中に１つのアジュバントを含み入れることである。標準的には、既知の粘膜アジュバントであるコレラトキシンＢサブユニットを発現するための遺伝子が中でＣ−領域ポリペプチドと活性ポリペプチドの間に挿入されるようなプラスミドを産生することが可能である。代替的には、サブユニットのための遺伝子を活性ポリペプチドの上流に挿入することができる。CTBと抗体を産生する細胞との通常の相互作用においては、CTBは直接細胞と接触し、CTBがアジュバントとして機能している抗原に対する抗体の産生を刺激することから、この方向性は、IgA応答の強化を惹起しうる。細菌表面上の本発明のハイブリッドタンパク質の発現のためグラム陽性菌の染色体内にハイブリッド遺伝子を組込むために、図４及び図５内に示されている２重交叉技術においてプラスミドを利用することができる。活性ポリペプチドに対する免疫応答を高めるため、コレラトキシンＢサブユニットの代わりにその他の免疫増強タンパク質を用いることもできる。
本発明の形質転換された細菌は、診断試験において有用である。これらは、例えば、感染を受けた動物の血漿中の特定の感染に特徴的な抗体の存在について試験するのに用いることができる。
慣習的には、例えばナイゼリア・ゴノルホエア（Neis seria gonorrhoeae）によりひき起こされる感染についての試験手順には、感染性微生物の特徴でありしかも血漿中に存在する疑いのある特異性抗体と反応することになる抗原の分離及び精製が必要である。このとき、抗原は血漿又はその他の体液を用いてインキュベートされる。反応が発生した場合、それは、さまざまな既知の試験のうちのいずれかによって認識できる。
標準的な酵素結合免疫検定手順においては、分離され精製された抗原は、固相ガラス又はプラスチック支持体に付着させられる。次にこれを、血漿又は血清といった体液にさらす。この体液が、感染性生体の特徴である抗体を含んでいる場合、抗原／抗体反応が発生することになる。反応生成物は、固相上にとどまり、この固相は次にホースラディッシュペルオキシダーゼといった検出可能な酵素で標識づけされた抗抗体を用いてインキュベートされる。
本発明の形質転換された細菌は、診断試験中に使用される抗原の供給源として利用できる。このような試験においては、形質転換された細菌は抗原として利用される。当業者はこの種のいくつかの診断試験に精通することになろう。本発明に従ったこのような用途では、先行技術により必要とされるように抗原を分離し精製する必要性は無くなる。
診断試験のためには、感染をひき起こす微生物の特徴である特異的抗体のためのエピトープが活性ポリペプチドに含まれている、本発明の形質転換された細菌が調製される。この細菌は固相に付着され、診断試験の残りの部分は、通常の要領で行なわれる。当然のことながら、試験は、例えばELISA検定を用いた抗体の存在を検出するための酵素の使用に制限されるわけではない。放射性同位元素といったその他の標識を利用することもできる。
通常共に提供されるその他の試薬を含めて、標準的には再構成されるべき凍結乾燥された形態で形質転換された細菌を収納する診断用キットを提供することができる。これらのキットには、水性緩衝液、標識づけされた抗抗体、滅菌水及び、場合によってはその他の試薬が内含されている可能性がある。代替的には、水性懸濁液中の又は凍結乾燥された形質転換された細菌を、診断試験を行なう研究所により提供されるべきその他の試薬と共に診断試験で使用するために提供することができる。
本発明のハイブリッドタンパク質のさまざまなセグメントは必ずしも、タンパク質中又はそれを産生するのに用いられる遺伝子中で互いに隣接しているわけではない。当業者にとっては明白ないくつかの理由のうちの１つのため、その他のヌクレオチドの挿入によりタンパク質を発現するのに用いられるハイブリッド遺伝子上のヌクレオチドを分離しかくして、活性ポリペプチド及び細胞関連ポリペプチドが選択されたスペーサーによって分離されているハイブリッドタンパク質を発現することが適切でありうる。LPXTGXセグメントで始まり負荷されたテールセグメントで終るアンカー領域が、ハイブリッドポリペプチドを発現する細菌にこのポリペプチドを定着するために存在しているかぎりにおいて、本発明のハイブリッド表面タンパク質を構築する上で表面抗原の細胞関連領域からの完全なセグメントを利用することは必要不可欠ではない。
図９は、本発明の、特に有用な１つの実施態様を示している。これは、ポリリンカー部位を含む汎用プラスミドを示している。ポリリンカーは、いくつかの制限部位を含み、従ってさまざまな制限酵素により切除された遺伝子の挿入のために利用することができるオリゴヌクレオチド又はDNA配列である。例えば、プラスミドは、EcoR I,Cla I,Hind III,Xbo I,Pst I,BamH I又は、その他いくつかのうちのいずれかといった複数の制限部位を含むポリリンカーインサートで構築することができる。このようなポリリンカーは、市販されているか又は当業者により容易に構築されうるものである。
本発明のプラスミドを産生するためには、ポリリンカーインサートは、産生されるべきハイブリッドタンパク質の望まれる細胞関連セグメントを発現するため選択された遺伝子セグメントをすでに含んでいるプラスミドの中へ連結されることになる。プラスミドは、ハイブリッド抗原のためのリーダー配列を含むものとして示されているが、かかる配列は必ずしもプラスミド内にあるとは限らない。これは、活性ポリペプチドを発現するのに用いられるオリゴヌクレオチド配列の中に内含されている可能性もある。プラスミド内のさまざまな遺伝子セグメントが互いに隣接するものとして示されているものの、これらのセグメントはスペーサにより分離されていてもよい。プラスミドは、選択を助けるため２つの異なる抗生物質耐性領域を含むものとして示されている。ポリリンカー部位内にある１つの抗生物質耐性領域はこれを２つのセクションに分け、インサートにより置換された時点で除去されることになる。色という結果をもたらすもののようなその他のマーカーを利用することができる。ポリリンカー部位を伴うプラスミドのその他の製剤形態も、必要に応じて構築することができる。
グラム陽性菌を形質転換するために、リンカーを分離するマーカーを伴うものの有効なプロモータを伴わないプラスミドを利用することができる。図示されているプラスミドは、上述のとおり染色体と交叉できる。プラスミド又は染色体を含む形質転換された細菌が、望ましい表面ハイブリッドタンパク質を発現することになる。
前述の原特許出願内に記述され請求されているプラスミドM6.1.367−441は、本発明の実践において特に有用である。このプラスミドの調製については、原特許出願に記されている。これは、受入れ番号ATCC68235としてアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collection）の大腸菌（E.coli）菌株K561内に寄託された。
原特許出願に説明されているとおり、このプラスミドは適切なDNA配列と融合させることができ、ハイブリッド遺伝子は、大腸菌（E.coli）又は選択された非病原性グラム陽性菌といった適切なキャリヤの中に挿入されうる。結果として得られる形質転換された細菌は、本発明のポリペプチドを発現することになる。形質転換されたグラム陽性菌は、直接ワクチンとして使用することができる。代替的には、このグラム陽性菌は、上述のとおり、望ましいポリペプチドをより効率良く発現することになるもう１つの形質転換された細菌を産生するべく交叉反応で使用することができる。プラスミドは、ポリリンカーの挿入により汎用ペプチドの産生のために使用することもできる。
本発明の特殊な利点は、必要としている動物に対し、組換え型グラム陽性菌を、病原体が通常体内に侵入する粘膜部位において供給することができる、ということにある。これらの部位には、口ならびに鼻、腸及び膣部位が含まれる。このような供給は、部位における局所的免疫応答を刺激することになり、病原体に対する防御免疫反応を起こすための有効な一手段となる。利用する細菌は非病原性でその特定の部位にとって正常な生体であることから、毒性効果の危険性なくこれらを利用することができる。選択された細菌は、魚や野生動物に対して、摂取する食料又はそれらが棲む水の中に混合させることによって、投与することができる。
上述の同じ手順を利用することにより、活性ポリペプチドとして以下の表２に示されている抗原を惹起する抗体を含むハイブリッドタンパク質を調製することができる。この表は、病原体による感染に対する防御力をもつ抗体を産生することになるポリペプチド、防御すべき疾病及びこのポリペプチドについて記述している出版物を示している。いくつかのケースでは、１つのペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを惹起するのに用いられる遺伝子を調製しプラスミドの中に挿入することが必要である。手順は、上述の手順と完全に同等のものである。Ｃ末端アンカー領域は、以上で特定的に提案されているもののいずれかであってもよいし或いは又表１に記されているグラム陽性菌からの表面タンパク質のその他のいずれかの固着セグメントであってもよい。形質転換された細菌の活性ポリペプチドには、リーダー配列に融合された図示したペプチド、及び細胞表面への適切なトランスロケーションを可能にするための表面タンパク質のＮ末端の小さいセグメントが含まれる。
本発明の形質転換された細菌は、実際には治療用作用物質であり、そのように扱かわれることになる。これらは、単独で使用することもできるし、かかる治療用作用物質と共に通常利用されるタイプの薬学的に受入れ可能なキャリヤと結びつけて使用することもできる。経口又は鼻腔投与のためには、これらを、等張食塩水中に懸濁させることができ、これに香付け又は着色することも可能である。腸内供給のためには、これらは、形質転換された細菌を経口的に供給するべくカプセル中に入れることもできる。当業者にはその他の投与方法も直ちに明らかとなると思われ、これらも本発明の範囲内に入る。
本発明の産物は、選択された投与部位をコロニー化するべく生きた形質転換された細菌として利用されることから、特定の用量は全く必要とされない。標準的には、選択された用量形態には、１用量単位あたり約106〜1010の生体が含まれることになる。
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引用した出版物の各々は本書に引用により組み入れられる。
本出願は、1990年５月11日付の出願第07/522,440号の継続願である1991年８月５日付の出願第07/742,199号の継続出願である。
1991年11月23日付の出願第07/814,823号の一部継続出願である1992年３月13日付の同時係属出願第07/851,082号の一部継続出願である。最初の２つの出願は現在放棄されている。
発明の分野
本発明は、一般に、グラム陽性菌の表面に対し、タンパク質抗原を含むタンパク質を供給し、これらのタンパク質を細胞にしっかり付着させるのに有用な生成物及び方法に関する。より特定的には、本発明は、動物宿主に対して有効に投与できるあらゆるタンパク質、ペプチド又はポリペプチド及びグラム陽性表面タンパク質の細胞関連領域のアンカー領域を少なくとも含む融合タンパク質の産生に関する。以下でさらに詳しく論述するように、グラム陽性菌の表面上に置かれたタンパク質、ペプチド又はポリペプチドを含む本発明の生成物は、例えば防御抗体の産生といったような免疫原性応答を惹起させるため、又はその他の有効な目的のため、動物宿主にこのような物質を供給するのに使用することができる。タンパク質、ペプチド又はポリペプチドは、例えば、特定の目的のために必要な酵素及びその他の機能的タンパク質であってよい。これは、細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌からの抗原決定基であってよい。哺乳動物の腫瘍細胞からの又は雄の精子の表面抗原であってよい。これは、スズメバチの毒液といったアレルゲンであってもよい。本発明は同様に、このような融合タンパク質の産生において用いられる新しいプラスミド、遺伝子、染色体及び形質転換された細菌にも関する。本発明はさらに、その病原体の病原力と関連づけられ病原性微生物によりひき起こされる感染や疾病に対して宿主を防御するべく抗原を惹起させることになる病原性微生物上に通常存在する外来性抗原を動物宿主に供給するように設計されたグラム陽性菌を利用する新奇のワクチンをも提供する。
本発明の産物は、診断作用物質としても有効である。
本発明は又、特定の対象部域に対して細菌表面上に置かれた酵素を供給するための手段をも提供する。
本書で使用する「動物」という語は、人間；ウシ特に肉牛；羊及び山羊などの哺乳動物；家きん類、特にニワトリ、アヒル及び七面鳥；ならびに魚、特にサケ、マス及びナマズといった養魚場で飼養されるもの、を含む生物のことを意味する。本発明は哺乳動物にとって特に重要性をもつものである。
発明の背景
本発明の本質は、それが、共に以下でより詳しく定義づけされ論述されている２つの主要な部分すなわちアミノ酸残基から成るアンカーセグメントをＮ末端活性ポリペプチドセグメントを含むハイブリッド表面抗原でありうるハイブリッド表面タンパク質を発現する新しい非病原性グラム陽性菌の産生方法をも提供する、ということにある。
本発明は、Ｍタンパク質及びその構造を考慮することによってより良く理解できることだろう。Ｍタンパク質は、グラム陽性菌であるＡ群の連鎖球菌の病原因子（virulencefactor）である２重らせん表面抗原である。Ｍ型６のストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcu spyogenes）（化膿連鎖球菌）のＭタンパク質は、441個のアミノ酸残基を含んでいる。
その構造については以下でさらに詳しく記述するが、この点において細胞関連領域について論述することが有用であろう。アミノ酸の標準的な１文字表示を利用して、アミノ酸残基407から残基441までのM6タンパク質の細胞関連領域のアンカー領域の構造は、
LPSTGETANPFFTAAALTVMATAGVAAVVKRKEEN
として表わすことができる。
アンカー領域のＮ末端にある第１のロイシン残基（Ｌ）から読みとると、この領域は、LPSTGEセグメント;3つのアミノ酸残基TANを含むスペーサ−セグメント;20のアミノ酸の疎水性セグメント、PFFTAAALTVMATAGVAAVVとそれに続く高度に荷電したテールセグメントKRKEENを含んでいる。
M6タンパク質の上述のアンカー領域がグラム陽性菌の全ての既知の表面タンパク質の間で高レベルで保存されているということが、グラム陽性菌の多数の表面タンパク質の構造研究の結果として観察されてきた。そのうちの多くは、Fischettietal.（参考文献１）によって示されている。一般に、疎水性セグメントは、約15〜20個のアミノ酸残基を含む、荷電されたテールセグメントは約４〜６個のアミノ酸残基を含み、スペーサーセグメントは約３〜６個のアミノ酸残基を含んでいる。しかしながらさらに注目すべきことは、既知の表面タンパク質のLPSTGEセグメント内のほぼ100％という高レベルの相同性である。変動は、ほぼ排他的に３及び６の位置でのみ起こる。従って、この領域は一般にLPXTGXとして表わすことができる。
以下の表１は、グラム陽性菌の40の異なる表面タンパク質の中でかくして今までに立証されてきたこの相同性の注目すべき範囲を示している。
この発見は、Schneewind et al（65）により確認された、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphlococcus aureus）（黄色ブドウ球菌）のプロテインＡ分子を用いて、これらの研究者は、細胞表面にプロテインＡ分子を供給するのに、完全複合体（LPXTGXモチーフ、疎水性ドメイン及び荷電されたテール）が必要であること、そしてLPXTGXモチーフ内の変更又はその欠失が分子の発現を阻害しないものの、それが表面に固定するのを妨げるであろうということを立証した。
【図面の簡単な説明】
図１は、グラム陽性菌からのさまざまな表面抗原のＣ末端領域及びそれらを発現するのに利用される遺伝子セグメントの中のアミノ酸の配列を示している。LPSTGEモチーフには陰影が施こされ、タンパク質はこのコンセンサス配列に沿って配列された。11個のタンパク質のうち10個において、コンセンサスLPSTGE配列（囲みのあるもの）より２〜３個の残基前に、保存されたリジン残基が発見された。相同なカルボキシ末端疎水領域も同様に囲まれている。左欄内で使用されている略号は、表１のものと同じである。
図２は、Ｍタンパク質のモデルである。
図３は、M6タンパク質の完全アミノ酸配列を示す。
図４は、宿主ベクターシステムGP232−PVMB20を示す。
図５は、GP246内のM6:E7翻訳融合の構築及び染色体組込みを示している。
図６は、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptoc occus gordonii）GP246中で発現されたM6:E7融合タンパク質がその表面上に位置づけられていることを立証するべく設計された研究の結果を示す。
図７は、組換え型ストレプトコッカス・グロドニー（Streptococcus gordonii）246の細胞抽出物がM6:E7融合タンパク質を発現することを示す。
図８は、組換え型GP246で免疫化された動物がE7タンパク質との反応性をもつ抗体を産生することを示している。
図９は、本発明の汎発性プラスミドを示す。
図10は、本発明の代表的ハイブリッドタンパク質を示す。
図11及び12は、本発明のハイブリッドタンパク質を用いてマウスを処置した研究の結果を示す。
図２及び３を入念に検討すると、本発明を理解する上での一助となる。図２は、いくつかの位置及びセグメントが同定された状態でのＭタンパク質のモデルを表わす。図３は、M6タンパク質の完全な構造の中の各々のアミノ酸残基を同定している。
上記論述から、図２で細胞関連領域として同定されたＭタンパク質のセグメントが、表１に列挙されるもののようなその他のグラム陽性菌上に発見される表面タンパク質のための領域を類似していることが理解できることだろう。上述のように、特に全てのグラム陽性表面タンパク質の中に発見されるLPXTGXセグメントといったアンカー配列内に特に高度の相同性が存在する。以下で論述するように、本発明を例示する目的で、Ｍタンパク質を発現する遺伝子の領域122〜300に広がる遺伝子セグメントは、遺伝的に除去され、例えば有効な抗体を生成することになる抗原といった外来性タンパク質を発現する新しい遺伝子セグメントによって置換され、かくして新奇のハイブリッド表面タンパク質を産生する。全てのグラム陽性細菌の細胞関連領域内の高度の相同性のため、ハイブリッド遺伝子をあらゆるグラム陽性菌の中で利用することが可能である。選択された細菌は、細胞に分子を付着させるためアンカー領域を用い、細胞表面上に挿入された活性セグメントを位置づけして、設計されたハイブリッドタンパク質を発現することになる。挿入された活性セグメントを、以下では「活性ポリペプチド」と呼ぶことにする。
「活性ポリペプチド」という語を、ここでは、可能なかぎり広義で使用する。これは、あらゆる有効な目的のために動物宿主に供給することのできるあらゆるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のことを言う。例えば、以下で詳述するとおり、グラム陽性菌からのタンパク質の細胞関連領域を病原体からのウイルスタンパク質の１セグメントに融合させて、非病原性細菌により発現されることになるハイブリッド表面タンパク質を産生することができる。細菌は、動物宿主をコロニー化し、ワクチンとして機能することができる。これは、ウイルスによるその後の感染に対し防御するか又はこれを阻害するべく動物宿主の中で抗体を惹起することになる。融合されたウイルスセグメントは、本発明のこの特定の実施態様の「活性ポリペプチド」である。
便宜上、「ポリペプチド」という語は、以下では、タンパク質と呼ばれるのに充分なだけの高分子量をもつ分子、より低い分子量の通常ポリペプチドと呼ばれる産物、及びさらに低い分子量をもつ通常ペプチドと呼ばれる産物のことを意味するものとして使用されている。
「活性ポリペプチド」は、有効な目的のために動物宿主に対して供給することのできるあらゆるポリペプチドであってよい。これは、例えば、上述のウイルスセグメントである可能性がある。これは又、あらゆる病原性ウイルスからの、又は細菌、寄生虫又は真菌からの抗原でもあり得る。このような場合、活性ポリペプチドは完全抗原、抗原の抗原決定基又は抗原決定基を含む抗原の１セグメントであることが考えられる。有効な目的とは、抗体の産生により防御免疫応答を惹起すること又は、抗原に対する細胞免疫応答を惹起することである。
本明細書及び請求の範囲中で使用している「細胞関連領域」という語は、図、特に図２、３及び10を参照することによって直ちに理解できる。細胞関連領域には、アミノ酸残基の細胞壁に広がる配列と炭水化物に広がるセグメントが含まれていることがわかるだろう。壁に広がる配列は、本発明のハイブリッドタンパク質から削除することができるが、現在ではそうしない方が好ましい。
細胞関連領域は同様に、アンカーセグメント（LPXTGX）、スペーサ−セグメント、疎水性セグメント及び負荷されたテールセグメントを含むアンカー領域をも内含する。アンカー配列は、本発明のハイブリッドタンパク質にとって必要不可欠である。この配列が無いと、ハイブリッドタンパク質はグラム陽性菌キャリアの表面上に保持されなくなる。
図10は、図示されているとおり、細胞関連領域に融合された活性ポリペプチドを含む本発明の標準的なハイブリッドタンパク質の残りの部分を示す。この図は又、活性ポリペプチドのアミノ末端における小さいＮ末端セグメントとリーダーセグメントをも示している。これらのセグメントは、グラム陽性菌の表面上のハイブリッドタンパク質の適切な配置において連動する。リーダーセグメントの機能は、細胞内のハイブリッドタンパク質の適切な処理を可能にすることにある。リーダーセグメントを連動するＮ末端セグメントは、リーダーペプチダーゼ酵素がリーダーセグメントをＮ末端セグメントから分離させることができるようにし、ハイブリッドタンパク質が細菌の表面上でその適切な位置をとることを可能にする。リーダーセグメント及びＮ末端セグメントは、細胞関連領域のタンパク質と同じ表面タンパク質からのものである。Ｎ末端セグメントは、ハイブリッドタンパク質の細胞関連領域内で使用されるタンパク質のアミノ末端から誘導された最初の数個のアミノ酸残基を適切にも含んでいる。適切な処理のためには通常約10個のこのような残基で充分であるが、最高20以上のアミノ酸残基を含むセグメントを利用することも可能である。
活性ポリペプチドは、必ずしも病原性生体からの抗原である必要はない。これは、例えば酵素であってもよい。その場合、有効な目的は、非病原性細菌の表面上の酵素をこの非病原性細菌によりコロニー化された動物宿主内の特定の部位に供給することとなる。
活性ポリペプチドは、酵素を含む完全分子であってもよい。あるいは、これは単に、有効な目的を達成するのに必要とされるポリペプチドセグメントでもありうる。
活性ポリペプチドは、病原性微生物により惹起された抗体と反応することになる抗原であってもよい。このような活性ポリペプチド抗原を運ぶ本発明の細菌は、診断用試薬として有用である。
ここで非病原性細菌と言うとき、その病原性が弱化されるか又は破壊されるように通常の手順によって変更又は弱毒化されておりしかも本書に記述する方法に従ってLPXTGX領域を含むＣ末端領域を含むハイブリッドタンパク質を発現する病原菌ならびにグラム陽性共生菌を内含するものと理解すべきである。
本発明の簡単な説明
本発明は、細菌に付着されたＣ末端領域をもつ少なくとも１つのハイブリッド表面タンパク質を発現する非病原性グラム陽性菌を提供する。このＣ末端領域は、病原性のものであっても非病原性のものであってもよいグラム陽性菌によって通常発現される表面タンパク質の細胞関連領域を内含するが、これに制限されるわけではない。ハイブリッド表面タンパク質の残りの部分には、何らかの有効な目的のため動物宿主に供給されうる活性ポリペプチドが含まれる。
本発明の細菌により「通常産生」される表面タンパク質とは、本発明の方法に従って遺伝的に変性される前の細菌により産生される全タンパク質のことを言う。
以前の研究（29）からわかっており図２及び図３に示されている通り、Ｍタンパク質のアミノ酸298〜441は、細胞内に埋没され、一方残基１〜297は細菌細胞の表面上に露呈されている。本発明に従うと、本書に記述され図示されている遺伝的操作を利用することにより、Ｍタンパク質の表面露出部域のほぼ全てを除去することができ、又本発明のハイブリッド表面タンパク質を生成するべくＭタンパク質のＣ末端細胞関連領域に結合される活性ポリペプチドで置換することができる。細胞関連領域は全てのグラム陽性表面分子について基本的に同じであることから（図10）、これらの分子のいずれか１つの細胞関連領域をもう１つの供給源からの活性ポリペプチドを供給するための供給キャリヤ又は賦形剤として使用できるようにする類似の戦略を使用することが可能である。ハイブリッド表面タンパク質を発現するのに利用される新しい遺伝子は、標準的技術によりプラスミド中に挿入でき、このプラスミドは大腸菌（Escherichia Col i）又はその他のベクターを形質転換するのに使用できる。その後、大腸菌（E.Coli）は新しい融合タンパク質、すなわち本発明のハイブリッドタンパク質を発現することになる。大腸菌（E.Coli）手順はこのグラム陰性生体の周縁細胞質から分離することのできる大量のハイブリッドタンパク質の産生のために有用である。しかしながら本発明の大部分の効用にとって、グラム陽性菌の表面上のハイブリッドタンパク質の産生のためグラム陽性生体を形質転換することが好まれる。本発明に従って産生された組換え型遺伝子は、あらゆるグラム陽性菌によって処理されうる。
代替的には、融合遺伝子を含む新たに構築されたプラスミドを、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）（ミュータンス連鎖球菌）の染色体といったグラム陽性菌の染色体内に融合遺伝子を組込むのに使用することもできる。その後、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）の新たに産生された菌株は、細胞表面上での発現により本発明の新しいハイブリッドタンパク質を産生することになる。これが、本発明の産物を産生するための現在好まれている手順である。
広範な微生物からの抗原ポリペプチドを本発明の活性ポリペプチドとして利用することができる。これらには、人間及び動物を感染させる病原性微生物が含まれる。次に示すのは、本発明の実施において有用なポリペプチドを発現する典型的微生物の代表的一覧表である。本発明の形質転換された細菌は、微生物による感染に付随する疾病を治療又は予防するために使用することができる。
真菌：キャンディダ・アルビカンス（Candida albica ns）、アスペルギルス・フミガッス（Aspergillus fumi gatus）、ヒストファズマ・カプスラッム（Histoplasma capsulatum）（これらは全て内転移疾患をひき起こす）、ミクロスポリウム・カニス（Microsporum cani s）（動物白癬）
寄生性原生動物：プラスモデウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）（マラリア）、トリパノソマ・グルジ（Trypanosoma cruzi）（睡眠病）、
スピロヘータ：ボレリア・ベルグドルフェリ（Borrel ia bergdorferi）（ライム病）、トレポネマ・パリヅム（Treponema pallidum）（梅毒）、ボレリア・レクレニチス（Borrelia recurrentis）（回帰熱）、レプトスピラ・イクテロヘモラギア（Leptospira icterohaemorrha giae）（レプトスピラ症）、
細菌：ナイゼリア・ゴノラエ（Neisseria gonorrhaea e）（淋病）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staph ylococcus aureus）（心内膜炎）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（リウマチ熱）、サルモネラ・ティポサ（Salmonella typhosa）（サルモネラ症）、ヘモフィルス・インフルエンザ（He mophilus influenzae）（インフルエンザ）、ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）（百日咳）、アクチノミセス・イスレアリー（Actinomyces israeli i）（放線菌症）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）（う食症）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）腺疫（馬）、ストレプトコッカス・アガラリチア（Streptococcus agalac tiae）（ウシの乳房炎）、ストレプトコッカス・アンギノスス（Streptococcus anginosus）（イヌの生殖感染）
ウイルス：ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、口蹄疫ウイルス、オウム病ウイルス、パラミクソウイルス、ミクソウイルス、コロナウイルス。
本発明の１実施態様においては、宿主動物にとって共生生体である非病原性グラム陽性菌が、非病原性グラム陽性菌内にハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子を挿入することによって、ハイブリッドタンパク質をその表面上に発現させるために使用される。融合が、病原性生体（細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌）からの抗原である活性ポリペプチドとのものであり、結果として得られるハイブリッド抗原を発現する共生細菌が動物宿主に投与される場合、体液及び細胞を媒介とする両経路により免疫学的応答が存在することになる。考えられる１つの免疫学的応答は、抗体の産生であり、これにより病原体による感染に対する防御がもたらされる。融合が酵素とのものである場合、この酵素は、共生生物の表面上で発現されることになる。本開示を検討すれば当業者にとって明らかであるように、さまざまな活性ポリペプチドをグラム陽性菌の表面に供給することができる。
本発明の遺伝子、プラスミド、染色体及び形質転換された細菌は、当業者にとって周知の標準的組換え技術を適用することによって産生される。例えば、ウイルス外被タンパク質をコードする制限フラグメント又はオリゴヌクレオチド、細菌表面抗原（又は実際には完全抗原）の病原力因子、酵素又は本発明のハイブリッド表面タンパク質のその他の望ましい先祖を、Ｍタンパク質又は表１に列挙されているもののようなグラム陽性菌からのその他の既知の表面タンパク質の細胞関連領域を発現する遺伝子に連結させることが可能である。結果として得られるハイブリッド遺伝子は、本発明の表面ハイブリッドタンパク質の産生をもたらすべくグラム陽性菌の形質転換するのに使用されることになる。
本発明については、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）のGP246菌株によるハイブリッドタンパク質M6:E7の発現に関連してさらに詳しく記述する。
このハイブリッド抗原は、M6タンパク質のＣ末端細胞関連セグメントを含む。ポリペプチドE7を惹起する抗体は、乳頭腫ウイルス菌株からの早期タンパク質である。
ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus go rdonii）は、口腔の共生菌である。E7は、ヒト乳頭腫ウイルス６型（HPV16）のウイルス複製の間に産生された98アミノ酸早期タンパク質である。これは、子宮剄ガンを患う患者にそれに対する抗体が発見される腫瘍タンパク質である。これは、HPVにより誘発された悪性新生物に対するワクチンのための主要な抗原候補であるとみなされている。
本発明の新奇の細菌は、図４及び図５に示されている標準的な相同組換えによって産生可能である。図示されているように、新しい菌株GP246を産生するべく、大量のM6タンパク質を発現するストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）の新しい菌株GP232が宿主として利用された。
図４及び５に示されているとおりに利用される手順は、標準的なものであり、熟練した開業医により広く使用されている。図示されているように、この技術は、融合遺伝子の高い発現という結果をもたらす染色体内の任意の場所での融合遺伝子の挿入のためグラム陽性受容体生体を構築するためのものである。挿入部位は生体によって変動する可能性があり、又同じ生体内でも変動することがある。この方法の利点は、これによって、挿入された遺伝子が外来性プロモータの結果としての発現に依存するのではなくむしろ融合遺伝子の高い発現という結果をもたらすことになる部位に確実に存在するようになるという点にある。従って、この方法は、強いプロモータをもつ領域が確実に選択されるようにする。
新奇のGP246菌株を生成する方法において、M6タンパク質のHind IIIと部位Kpn Iとの間の538塩基対セグメントは、以下に記述されているように産生された新奇のプラスミドpVME20が切除され、その場所に、E7をコードする294塩基対が挿入されて、新しい遺伝子を産生し、この遺伝子は新しいプラスミドpVMB21の産生のために利用された。切除されたＭタンパク質の領域は、E7のＮ末端に融合されたリーダーセグメントを含むN6N末端の120アミノ酸セグメントと共に細胞表面にE7分子を配置する結果をもたらす。構成体は、大腸菌（E.coli）の中で作られ、組換え型プラスミドは、新しい菌株GP246によりM6:E7タンパク質を発現する遺伝子の染色体組込みをもたらすべくGP232での標準的な２重交叉手順によりS.gordoniiを形質転換するために使用された。
材料と方法
組換え型DNA技術。大腸菌（Escherichia coli）ベクター内の遺伝子融合は、標準的な手順（30）により得られ、構築された。
連鎖球菌形質転換。自然に応答能あるS.ゴルドニー・チャリス（S.gordonii Challis）の凍結細胞を、既知の手順により調製し、形質転換した（31）。既知の手順（32）を用いてオーバーレイ内に５μg/mlの濃度でエリスロマイシンを用いて、多層平板上での形質転換体の平板培養及び評点を行なった。
形質転換体の遺伝分析。選択平板からのコロニーの楊枝トランスファにより３つの血液寒天平板の表面に、形質転換体を線条接種した。第１の平板はエリスロマイシン（５μg/ml）を含み、第２の平板はクロラムフェニコール（５μg/ml）を含み、第３の平板はいかなる抗生物質も有していなかった。平板を37℃で36時間インキュベートした。インキュベーションの後、抗生物質を全く含まない平板の表面にニトロセルロース膜を適用し、20分間室温に保った。次に膜を、真空オーブン内で37℃で30分、80℃で15分インキュベートした。大腸菌（E.coli）内で産生されたMS2:E7融合タンパク質（33）で免疫化されたウサギから得た抗E7ポリクローナル抗体（1:5,000希釈）を用いて、ニトロセルロースに結合したE7タンパク質の存在を検出した。
免疫螢光検査。晩期指数増殖期で、トッド・ヒューウィット培地（Difco）内で成長させられた細菌を収穫し、ガラス平板上に適用し、メタノールで固定した。スライドをM6又はE7特異抗体（1:50希釈）で処理し、大規模に洗浄し、次にローダミンと接合させたヤギの抗ウサギ（又は抗マウス）IgG抗血清（1:100の希釈）と反応させた。共焦螢光撮像システムMRC−500 Bio−Rad顕微鏡で、結果を観察した。
細胞抽出物のウェスタンブロット分析。トッド・ヒューウィット培地（Difco）内で晩期定常期まで、連鎖球菌を成長させた。細胞を収穫し、50mMのトリス（pH8.01,50mMのMgcl2,30％スクロースの中で再懸濁させた。０℃で30分間リソチーム（100μg/ml）で細胞懸濁液を処理することにより原形質体を得た。次に原形質体を遠心分離に付し、50mMのトリス（pH8.0）中で再懸濁した。懸濁液を急速凍結／解凍するサイクル５回により、徹底的な溶解が達成された。溶解しなかった細胞及び全砕片を、15分間1,000rpmでの低速遠心分離により廃棄する一方で、膜及び細胞形質を含む上清をウェスタンブロット分析のために使用した。約５×108の連鎖球菌細胞から得られた抽出物をゲル上に走行させ、従来の方法によりウェスタンブロットを行なった。
マウスの免疫化。完全フロインドアジュバント内で乳化された５×108の生きたGP246連鎖球菌細胞（５×107のコロニー形成単位）を用いて、Balb/cマウスを皮下で免疫化させた。一次免疫化から２〜３週間後に、不完全フロインドアジュバント内で乳化させた同じ細菌用量の皮下追加免疫をマウスに施した。最後の追加免疫から一週間後に、マウスを出血させた。
結果
プラスミドpVMB3の産生：エリスロマイシン（34）に対する耐性を付与する遺伝子であるermCがemm−6.1に隣接してクローニングされ、両方の遺伝子が同じClaIフラグメント内にくるようになっている１つの構成体が、作製された。この構成体において、emm6.1の開始コドンは、Cla I部位のうちの１つの部位より下流19bpのところにあり、かくしてCla I分割がemm−6.1をプロモータの無い状態に残すようになっていた。emm−6.1コーディング配列の上流にこのCla I部位を含むプラスミドPVV3:M6（35）が、実験に使用された。ermCを含むpE194の2.0kbMsp Iフラグメントをpvv3:M6の部分Cla I消化を用いて連結させた。E.coliDH5の形質転換の後、Cla Iフラグメントを含むプラスミドpVMB3でグローンを分離した。
菌株GP230の産生:ermC及びプロモータ無しのemm6.1を含むpVMB3の3.4−kbCla Iフラグメントを、同様にCla Iで切断されたS.ゴルドニー（S.gordonii）の染色体DNAを用いて連結させた。自然に転質転換可能なS.gordonii「Challis」菌株V288を形質転換するために連結混合物を使用した。この方法により、emm−6.1/ermcCla Iフラグメントは、任意に染色体内に組込まれた。Cla Iフラグメントに連結された染色体DNAは、形質転換中の組込みについて相同性を提供した。エリスロマイシン耐性（Em−ｒ）形質転換体が選択され、「ストリークブロット」によりM6タンパク質の産生について分析された。700のEm−ｒ形質転換体のうち、196（28％）がM6タンパク質を産生した。判定量ドットブロット分析に基づくと、GP230は最良のM6産生物であると思われた。
菌株GP232の産生:S.ゴルドニー（S.gordonii）GP230を、肺炎球菌株GP69の染色体DNAを用いて形質転換させた。この肺炎球菌株は、クロラムフェニコールに対する耐性を有するが、Pozzi及びGuild（36）の手順に従って産生されたエリスロマイシンに対しては感受性をもつ。GP69染色体DNAがGP230を形質転換するために使用される場合、ermC配列のレベルで組換えが起こり、GP230染色体内に組込まれたermCのコピー内へのCAT配列の挿入が導かれる。この挿入は、以下で論述され図面に示されているようにその表面上でM6を発現し、同様にクロラムフェニコールに対する耐性とエリスロマイシンに対する感受性をもつGP232を生み出す。
S.ゴルドニー（S.gordonii）中のHPV16のE7タンパク質の発現：
GP232の染色体上に存在するemm−6.1遺伝子内への非相同DNA配列の挿入を可能にするべく、組込みベクター、pVMB20を構築した。pVMB20は、ストレプトマイセス（Streptococous）中で複製せずemm−6.1及びエクスロマイシン耐性マーカーermCを運ぶ新奇な大腸菌（Escher ichia coli）プラスミドである。宿主ベクターシステムGP232−pVMB20は、図４及び図５に詳細に示されている。特定的に言うと、新奇のプラスミドpVMB20及び新奇の細菌S.ゴルドニー（S.gordonii）GP246は、以下の手順により調製された。
非相同遺伝子発現のための宿主ベクターシステム：〔Ａ〕新奇の宿主菌株S.ゴルドニー（S.gordonii）GP232の染色体内で、プロモーターは無いものの独自のリボソーム結合部位をもつM6タンパク質遺伝子のコピー（em m−6.1）（37）が、強い染色体プロモータの下流に組込まれた。emm−6.1の隣りには、ermC（34）が見られ、このerm−Ｃのコーディング配列は、cat遺伝子（38）を含むPC221の1.8−kb M60IフラグメントのそのBC II部位内への挿入によって中断されている。GP232はその表面上でM6を発現し、クロラムフェニコールに対し耐性をもち又エリスロマイシンに対する感受性をもつ。これは、連鎖球菌染色体内に非相同DNAを組込むべく形質転換を用いて得られた。構造は図中に示されている。GP232中の染色体内に組込まれた非相同DNAのサイズ（5.2−kb）は、サザンブロット分析により決定された。組込みベクターpVMB20は、ストレプトコッカス（Streptococcus）中で複製しない6.3−kbのE.coliプラスミドである。これは、以下で説明する手順によりemm−6.1及びermCを含むプラスミドpVMB3の3.4−kbCla IフラグメントをpBLUESCRIPT（Stratagene,La Jolla,California）内でサブクローニングすることによって得られた。これは、GP232の染色体中に組込まれるのと同じCla Iフラグメントであり、唯一の違いは、GP232 ermCがcatにより中断されているという点にある。S.ゴルドニー（S.gordonii）GP232のコーピテント細胞の形質転換におけるドナーDNAとしてpVMB20が使用されるとき、エリスロマイシン耐性形質転換体は、組込みベクターと相同染色体配列の間の組換えによって得られる。cat遺伝子を含むDNAフラグメントは、これらの形質転換体の染色体の中で欠失させられ、一方無傷のermC遺伝子が回復される（図５）。
（Ｂ）HPV16（39）のE7タンパク質遺伝子は、pVMB20のe mm−6.1配列内にクローニングされpVMB21を生み出した。Kpn I及びHind IIIでpVMB20を消化させ、プラスミドpMBS21L/E7（33）上で行なわれたインビトロDNA増幅（ポリメラーゼ連鎖反応）により得られたE7配列を含むKpn I/Hind IIIでこれを連結させた。増幅プライマは、E7をコードする294bpをemm−6.1内に「枠内」挿入するように設計された。pVMB21のヌクレオチド配列分析は、M6:E7翻訳融合の予想された構造を確認した。pVMB21を線形化し、GP232を形質転換するのに用いられた。エリスロマイシン耐性形質転換体の６％においてE7が発現されていることがわかった。これらの形質転換体の中で、pVMB21配列の組込みが、cat遺伝子が関与する欠失を生成した。代表的形質転換体であるGP246の構造は、サザンブロット分析により確認された。GP246の染色体上に存在するM6:E7遺伝子融合の接合部フラグメントのヌクレオチド配列も同様に、pBLUESCRIPT内でM6:E7融合を含むCla Iフラグメントをクローニングした後決定された。
E7タンパク質の表面発現：菌株GP246の表面上のS.ゴルドニー（S.gordonii）内のHPV16のE7タンパク質の発現を、M6タンパク質キャリヤヌはE7インサートのいずれかに特異的な抗体を用いて、免疫蛍光法により確認した。M6:E7遺伝子融合を含むGP246は、M6特異的又はE7特異的ポリクローナル抗体のいずれかと反応させられたとき陽性の蛍光を示し（図６）S.ゴルドニー（S.gordoni i）の表面上のＭタンパク質及びE7分子の表面位置設定を確認する。M6:E7遺伝子融合の構築において欠失させられたKpn I/Hind III内にコーティング領域が含まれていたM6のエピトープに特異的である既知のモノクローナル抗体10A11とGP246を反応させた時点で、いかなる蛍光も観察されなかった（図６）。
E7を発現する組換え型連鎖球菌が実際にM6:E7融合タンパク質を産生することを実証するために、ウエスタンブロットによってS.ゴルドニー（S.gordonii）細胞抽出物を分析した（図７）。GP246の細胞抽出物内で、同じバンドがE7−及びM6特異的抗体と反応し、一方、抽出物がM6−特異的反応性を示した受容体GP232においてはいかなるE7特異的反応性も見られなかった。（図７）。
M6分子のＣ末端領域及びアレルゲン５を含むハイブリッドタンパク質であるM6:E7を構築するのに用いられたものを実質的に同じ手順は、S.gordoniiの表面上で成功裡に発現を起こした。アレルゲン−５特異的抗体を用いた細胞壁抽出物のウエスタンブロットは、（M6:E7の場合と同様に）アレルゲン−５が実際にゴルドニー（gordonii）の細胞壁分画内で発現されたということを立証した。アレルゲン５は、Fang et al.（66）により記述されているとおりに得られた。
連鎖球菌表面上の融合タンパク質に対する免疫応答:M6:E7融合タンパク質の免疫原性を、M6:E7融合タンパク質を発現する組換え型S.ゴルドニー（S.gordonii）GP246でマウスを免疫化することによって検査した。M6タンパク質を発現する同質遺伝子型菌株GP232で、対照マウスを免疫化した。各菌株で免疫化した３匹の動物からの血清をプールし、チゴサッカロミセス・ポンベ（Schizo saccharomyces pombe）内で産生された精製E7タンパク質とのその反応性について、ウエスタンブロットによって試験した。図８は、表面M6:E7を含む菌株GP246で免疫化された動物が、E7タンパク質との反応性をもつ抗体を産生したことを示しており、これはすなわち、E7タンパク質が連鎖球菌表面上で融合タンパク質として発現されたとき免疫原性であることを示している。M6のみを含むGP232で免疫化されたマウスの血清中には、E7タンパク質に対するいかなる抗体も見られなかった。
以上で記述されてきた手順は、新奇のハイブリッド表面抗原M6:M7といったハイブリッド表面タンパク質を発現する非病原性細菌S.ゴルドニー（S.gordonii）GP246又はその他の形質転換されたグラム陽性菌の産生を可能にする。この新奇の抗原はハイブリッドタンパク質であり、そのカルボキシ末端は細菌に付着され、上述のとおりその他のグラム陽性表面タンパク質内に通常発見されるのと実質的に同じＣ末端領域である。このハイブリッド表面タンパク質の活性ポリペプチドは、HPV16の抗原E7である。細菌が、防御を必要とする動物宿主に対して例えばコロニー化によって投与された時点で、活性ポリペプチドは、体液性及び細胞媒介の両方の応答を惹起し、結果として、乳頭腫ウイルスによる感染に対する防御免疫応答を生み出す。
上述のとおり調製された本発明のハイブリッド表面タンパク質の異種抗原がウイルスの複製中に産生されたウイルス抗原であるということに留意されたい。従って、本発明の方法は、ウイルスによる感染に対する防御免疫応答を惹起するべく充分な量で動物に対しウイルス抗原を供給するための新奇のグラム陽性菌の産生を可能にする。
本発明の新奇のM6:E7及び新奇の中間産物は、２つの出発物質から産生される。すなわちpVV3:M6とGP69である。これらは、引用した参考文献中に記された手順によって調製されうる。従って新奇の産物は全て、本書に記述された手順を利用して既知の材料から得ることができる。しかしながら、本発明の実施を助けるため、必然性はないもののpVV3:M6及びGP69は、それぞれATCC68003及びATCC という受入れ番号でアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託されている。
上述のM6:E7の例は、ウイルス感染から全身を防御する目的での哺乳動物の口腔内に通常存在する非病原性の共生グラム陽性菌の利用を例示している。類似の要領で調製された非病原性細菌を使用して、本書に記述され図示されている方法によりその他の有効な抗原を発現し供給することも又可能である。例えば、哺乳動物の腫瘍の表面上のタンパク質抗原をあらゆるグラム陽性菌の表面抗原の細胞壁関連領域と融合させ、融合遺伝子をグラム陽性共生生物内に挿入し、結果として得られた細菌を、腫瘍の治療において有用な腫瘍特異的免疫応答を生成するためのワクチンとして利用することが可能である。
これらの例は、本発明の１つの態様のみを示しているにすぎない。本発明は、実際、動物の体内の免疫応答を起こすため又はその他の有効な目的のために有用でありうるあらゆる種類のポリペプチドのための供給システムを提供する。
ワクチンとして利用される場合、選択された形質転換された共生生物は、哺乳動物をコロニー化するのに利用されることになる。これは、選択されたハイブリッド表面タンパク質を産生することになり、その活性ポリペプチドセグメントは、防御抗体の産生を惹起させることになる。
通常膣粘膜上に発見されるグラム陽性非病原性細菌を、避妊薬として利用することが可能である。この効用のためには、雄の精子の表面抗原を、膣又は子宮の粘膜の表面上に通常見られる細菌ラクトバシルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）のハイブリッド表面タンパク質上の活性ポリペプチドとして利用することができる。形質転換された細菌がこのような粘膜をコロニー化するのに利用される場合、ハイブリッドタンパク質は、精子の表面抗原に対する抗体の産生を惹起し、精子の不活性化をもたらすことになる。実際には、精子は雌の体により外来性物質として見られ、予め形成された抗体が精子細胞と反応してこれを不活性化することになる。
このタイプの避妊には２つの重要な利点がある。その１つは、精子が不活性化されるため、卵子は受精されないという点である。もう１つは、ハイブリッド抗原を発現するグラム陽性菌を一掃するべく免疫化された雌を抗生物質で処置するだけで避妊効果を中和させることができるという点である。
本発明の形質転換された細菌のさらにもう１つの効用は、AIDSを防ぐのに使用できるワクチンを提供するべくグラム陽性共生生体の表面にHIVウイルスからの表面抗原を供給することである。この効用のためには、ポリペプチドGP120,GP120のV3ループ、GP160又は、HIVウイルスからのGP120の24アミノ酸セグメントであるRP135又はGP16の配列735〜752といった関連する表面抗原とかかる抗原のセグメント。
これらのポリペプチドは、共生菌の表面への供給のため、グラム陽性表面タンパク質のリーダー及びＮ末端配列の少なくとも一部分及びそのアンカー領域に融合されることになる。その表面上でHIV抗原を発現する形質転換された共生生物が感受性ある哺乳動物に供給された時点で、HIVウイルスによる感染に対し防御するべく免疫応答が起こる。さらに、GP120といったHIV抗原を膣へ供給するべく組換え型膣共生生物を使用することにより、この抗原に対して産生されたIgA抗体はこの部位での感染に対して防御性をもつ。膣分泌内のIgA抗体は、HIV陽性の女性の分泌中のHIV粒子の数を低減し、かくしてAIDSの蔓延を低下させる。
本発明の産物は、densitization治療において有効である。このタイプの治療は、（アレルギーの分野ではアレルゲンと呼ばれる）抗原に対する過度のIgE応答を発生させるアトピー患者の不快さを軽減するために広く使用されている。IgE抗体の産生の増加は、枯草熱、ぜん息及びアナフィラキシーショックの主要原因であると考えられている。
アレルゲンは、食物、カビ、塵埃及び動物の毛を含めさまざまな供給源のいずれからでも発生しうる。バラ又はブタクサといった植物相がアレルゲンの主要な供給源である。wasps,yellow,jackets及びhornetsといったスズメバチ科の「毒針」はアレルゲンタンパク質を含んでいる。
アレルゲンに対する露呈からの免疫応答を改善するのに利用された従来の療法は、増加する用量のアレルゲンの反復注入が関与する減感作治療であった。これは、マスト（肥胖）細胞に対するアレルゲン特異的IgEの結合を遮断するアレルゲン特異的IgG抗体の増大をひき起こす。
一定数のアレルゲン特異的ペプチド及びタンパク質が同定され、分離され、クローニングされてきた。これらには、例えば、スズメバチ毒液タンパク質であるアレルゲン５が含まれる。これらのアレルゲンは、本発明のハイブリッド表面タンパク質の活性ポリペプチドとして内含されうる。このようなハイブリッドタンパク質を生成する共生菌を、アレルギー患者をコロニー化するのに用いることができる。その結果として得られるのは、脱感作療法で達成されるものと同じ防御免疫応答を惹起することになるアレルゲンの恒常的供給源である。
ハイブリッドタンパク質M6:アレルゲン５の形成及び発現について以上に記述してきた。図11及び12は、このハイブリッド表面抗原を利用した免疫化研究の結果を示している。
図11は、ハイブリッド表面タンパク質内の精製されたアレルゲン−５に対するマウス血清の血清IgG応答を例示している。マウスには、フロインドアシュバント中でハイブリッド表面アレルゲン−５（107CFU）を発現するS.ゴルドニー（S.gordonii）を用いて皮内で、又は同じ生体を用いて鼻腔内で免疫化を施した。免疫化から４週間、６週間、８週間及び10週間後に動物を出血させ、精製アレルゲン−５に対するIgGについてELISA法により血清を検査した。皮内免疫化を受けた動物（V1−V4、ハッチング付き棒）及び鼻腔内免疫化を受けた動物（V5−V8、閉じた棒）の両方が、アレルゲンに対する抗体を発現した。表面をアレルゲン−５に露呈せずにgordoniiで免疫化した対照動物は、アレルゲンに対する応答を全く示さなかった。組換え型gordoniiを用いて鼻腔内で免疫化した全ての動物は、綿棒により決定されるように、少なくとも12週間コロニー化された状態にとどまり、この期間中なおもアレルゲン５を発現した。全ての検定は血清の1:50希釈を用いて行なわれた。
図12は、鼻腔内及び皮内で免疫化を受けた動物の体内のアレルゲン−５に対するIgA応答を示している。アレルゲン−５を発現するゴルドニー（gordonii）を用いての免疫化（皮内又は鼻腔内）から12週間後に（図11参照）、唾液をとり、動物を安楽死させて肺と消化管の洗浄液を得た。唾液と洗浄液を、ELISAによりアレルゲン−５に対し特異的なIgAの存在について分析した。その結果、皮内及び鼻腔内免疫化を受けた動物において唾液IgAが存在し、鼻腔内でコロニー化された動物の方が応答が優れているということがわかった。最高のIgA応答は、鼻腔内コロニー化を受けた動物の肺の洗浄液において見られた。IgA応答は、消化管の小腸（S,I,）の中に見られたものの、これらは肺の洗浄液よりも低いものであった。全ての検定は、試料の1:1希釈を用いて行なわれた。
本発明のハイブリッド表面タンパク質の供給のためのシステムの特別な利点は、形質転換された生体が通常の共生生物であることから、これらの生体はひきつづきコロニー化し防御免疫応答の恒常的刺激として作用することになり、かくして連続的な免疫化の必要がなくなるということにある。
当業者であれば、本発明の新奇の産物のその他の応用分野を数多く、容易に考えつくことができる。例えば、マラリヤ、麻疹、百日咳及びエイズ、コクシジウム症、ジステンパー、鶏痘及びブルセラ病といったレトロウイルス感染を含むさまざまな疾病状態に対する防御抗体を惹起する表面抗原を供給するために、非病原性グラム陽性菌を産生することができる。
ワクチンとして用いられる場合の本発明の供給システムのもう１つの特別な利点は、生菌が利用されるということにある。既知のとおり、生菌は、弱毒化された細菌又は死菌に比べてはるかに強い免疫応答を刺激する。さらにもう１つの利点は、非病原性細菌が利用されることから、ワクチンが安全なものであるという点にある。さらにもう１つの利点は、複数の投与方法が可能であるということにある。
本発明は、キャリヤ細菌としてのS.ゴルドニー（S.go rdonii）又さらには連鎖球菌に制限されるものではなく、実際には、その他の非病原性グラム陽性菌が往々にして好まれる可能性もある。例えば、腸粘膜エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus fecalis）上に通常存在する細菌が、腸に活性ポリペプチドを供給するのに好まれる可能性がある。
その上、本発明は、１つのエピトープのみを含む１つのハイブリッド表面タンパク質の表面発現に制限されるわけではない。キャリヤ生体は、各々異なる活性ポリペプチドをもつ複数のハイブリッド表面タンパク質を発現するべく、又代替的には、活性ポリペプチドが複数のエピトープを含むハイブリッド表面タンパク質を発現するべく、周知の手順によって形質転換させることができる。
ここまでは、本発明は、主として防御抗体を惹起するための抗原の供給に関して記述及び図示されてきたが、前述のとおり、本発明はこのように制限されるものではない。例えば、酵素を供給するために本発明を使用することもできる。
小腸内で分泌される酵素ラクターゼが欠乏している人間は、ラクトースをその成分すなわちＤ−グルコースとＤ−ガラクトースへと適切に加水分解することができない。１つの結果として、これらの人々は牛乳又は乳製品を適切に消化することができない。これまでの治療は、欠如している酸素を含む錠剤又はその他の治療用量形態を生涯経口摂取することであった。本発明の実施態様に従うと、その活性ポリペプチドがラクターゼであるハイブリッドタンパク質を産生するべくクローニングされる共生腸内細菌が提供される。この細菌は、必要とされる酵素の連続的産生のため腸粘膜をコロニー化するために利用することができる。
ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）は、う蝕症の原因である主要な生体である。これは、グルコースを産生するためスクロースを加水分解するグルコシルトランスフェラーゼを分泌する。一方、グルコースは、歯の表面に付着しう蝕プロセスに参与するグルカン重合体へと形成される。本書に記述され請求されている手順を利用して、グルカナーゼ酵素を含むハイブリッド表面タンパク質を発現するべくS.ミュータンス（S.mutans）を形質転換することができる。形質転換された細菌は、口腔をコロニー化しグルカン重合体の形成を阻害してう蝕に対して防御するのに利用できる。代替的には、歯苔を消化してう蝕の開始を妨げる酵素を産生するように、ストレプトコッカス・ミュータンス（St reptococcus mutans）を形質転換することができる。
実質的に前述した通りの本発明の方法は、表面タンパク質の発現のための細菌としてスタフィロコッカス．アウレウス（Staphyloccus aureus）を利用して用いられた。この細菌の表面分子であるプロテインＡの（LPXTGXセグメント、疎水性セグメント及び負荷されたテールセグメントを含む）アンカー領域が酵素アルカリ性ホスファターゼ（大腸菌（E.coli）の二量体周縁細胞質タンパク質）に融合され、この融合のための遺伝子がS.アウレウス（S.aureus）内に戻された時点で分子は細胞の外側にトランスロケーションされその表面に固着された状態にあることがわかった。この手順の詳細は、本書に参考として内含されている参考文献65の中に見られる。
当業者であれば、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、そのいくつかの変形態様が可能であることが認められるであろう。
特にワクチンの生産にとって特に有用である１つの変形態様は、タンパク質を生成するのに用いられる遺伝子内の望まれるタンパク質の発現のための必要なヌクレオチド配列及びハイブリッドタンパク質の中に１つのアジュバントを含み入れることである。標準的には、既知の粘膜アジュバントであるコレラトキシンＢサブユニットを発現するための遺伝子が中でＣ−領域ポリペプチドと活性ポリペプチドの間に挿入されるようなプラスミドを産生することが可能である。代替的には、サブユニットのための遺伝子を活性ポリペプチドの上流に挿入することができる。CTBと抗体を産生する細胞との通常の相互作用においては、CTBは直接細胞と接触し、CTBがアジュバントとして機能している抗原に対する抗体の産生を刺激することから、この方向性は、IgA応答の強化を惹起しうる。細菌表面上の本発明のハイブリッドタンパク質の発現のためグラム陽性菌の染色体内にハイブリッド遺伝子を組込むために、図４及び図５内に示されている２重交叉技術においてプラスミドを利用することができる。活性ポリペプチドに対する免疫応答を高めるため、コレラトキシンＢサブユニットの代わりにその他の免疫増強タンパク質を用いることもできる。
本発明の形質転換された細菌は、診断試験において有用である。これらは、例えば、感染を受けた動物の血漿中の特定の感染に特徴的な抗体の存在について試験するのに用いることができる。
慣習的には、例えばナイゼリア・ゴノルホエア（Neis seria gonorrhoeae）によりひき起こされる感染についての試験手順には、感染性微生物の特徴でありしかも血漿中に存在する疑いのある特異性抗体と反応することになる抗原の分離及び精製が必要である。このとき、抗原は血漿又はその他の体液を用いてインキュベートされる。反応が発生した場合、それは、さまざまな既知の試験のうちのいずれかによって認識できる。
標準的な酵素結合免疫検定手順においては、分離され精製された抗原は、固相ガラス又はプラスチック支持体に付着させられる。次にこれを、血漿又は血清といった体液にさらす。この体液が、感染性生体の特徴である抗体を含んでいる場合、抗原／抗体反応が発生することになる。反応生成物は、固相上にとどまり、この固相は次にホースラディッシュペルオキシダーゼといった検出可能な酵素で標識づけされた抗抗体を用いてインキュベートされる。
本発明の形質転換された細菌は、診断試験中に使用される抗原の供給源として利用できる。このような試験においては、形質転換された細菌は抗原として利用される。当業者はこの種のいくつかの診断試験に精通することになろう。本発明に従ったこのような用途では、先行技術により必要とされるように抗原を分離し精製する必要性は無くなる。
診断試験のためには、感染をひき起こす微生物の特徴である特異的抗体のためのエピトープが活性ポリペプチドに含まれている、本発明の形質転換された細菌が調製される。この細菌は固相に付着され、診断試験の残りの部分は、通常の要領で行なわれる。当然のことながら、試験は、例えばELISA検定を用いた抗体の存在を検出するための酵素の使用に制限されるわけではない。放射性同位元素といったその他の標識を利用することもできる。
通常共に提供されるその他の試薬を含めて、標準的には再構成されるべき凍結乾燥された形態で形質転換された細菌を収納する診断用キットを提供することができる。これらのキットには、水性緩衝液、標識づけされた抗抗体、滅菌水及び、場合によってはその他の試薬が内含されている可能性がある。代替的には、水性懸濁液中の又は凍結乾燥された形質転換された細菌を、診断試験を行なう研究所により提供されるべきその他の試薬と共に診断試験で使用するために提供することができる。
本発明のハイブリッドタンパク質のさまざまなセグメントは必ずしも、タンパク質中又はそれを産生するのに用いられる遺伝子中で互いに隣接しているわけではない。当業者にとっては明白ないくつかの理由のうちの１つのため、その他のヌクレオチドの挿入によりタンパク質を発現するのに用いられるハイブリッド遺伝子上のヌクレオチドを分離しかくして、活性ポリペプチド及び細胞関連ポリペプチドが選択されたスペーサーによって分離されているハイブリッドタンパク質を発現することが適切でありうる。LPXTGXセグメントで始まり負荷されたテールセグメントで終るアンカー領域が、ハイブリッドポリペプチドを発現する細菌にこのポリペプチドを定着するために存在しているかぎりにおいて、本発明のハイブリッド表面タンパク質を構築する上で表面抗原の細胞関連領域からの完全なセグメントを利用することは必要不可欠ではない。
図９は、本発明の、特に有用な１つの実施態様を示している。これは、ポリリンカー部位を含む汎用プラスミドを示している。ポリリンカーは、いくつかの制限部位を含み、従ってさまざまな制限酵素により切除された遺伝子の挿入のために利用することができるオリゴヌクレオチド又はDNA配列である。例えば、プラスミドは、EcoR I,Cla I,Hind III,Xbo I,Pst I,BamH I又は、その他いくつかのうちのいずれかといった複数の制限部位を含むポリリンカーインサートで構築することができる。このようなポリリンカーは、市販されているか又は当業者により容易に構築されうるものである。
本発明のプラスミドを産生するためには、ポリリンカーインサートは、産生されるべきハイブリッドタンパク質の望まれる細胞関連セグメントを発現するため選択された遺伝子セグメントをすでに含んでいるプラスミドの中へ連結されることになる。プラスミドは、ハイブリッド抗原のためのリーダー配列を含むものとして示されているが、かかる配列は必ずしもプラスミド内にあるとは限らない。これは、活性ポリペプチドを発現するのに用いられるオリゴヌクレオチド配列の中に内含されている可能性もある。プラスミド内のさまざまな遺伝子セグメントが互いに隣接するものとして示されているものの、これらのセグメントはスペーサにより分離されていてもよい。プラスミドは、選択を助けるため２つの異なる抗生物質耐性領域を含むものとして示されている。ポリリンカー部位内にある１つの抗生物質耐性領域はこれを２つのセクションに分け、インサートにより置換された時点で除去されることになる。色という結果をもたらすもののようなその他のマーカーを利用することができる。ポリリンカー部位を伴うプラスミドのその他の製剤形態も、必要に応じて構築することができる。
グラム陽性菌を形質転換するために、リンカーを分離するマーカーを伴うものの有効なプロモータを伴わないプラスミドを利用することができる。図示されているプラスミドは、上述のとおり染色体と交叉できる。プラスミド又は染色体を含む形質転換された細菌が、望ましい表面ハイブリッドタンパク質を発現することになる。
前述の原特許出願内に記述され請求されているプラスミドM6.1.367−441は、本発明の実践において特に有用である。このプラスミドの調製については、原特許出願に記されている。これは、受入れ番号ATCC68235としてアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collection）の大腸菌（E.coli）菌株K561内に寄託された。
原特許出願に説明されているとおり、このプラスミドは適切なDNA配列と融合させることができ、ハイブリッド遺伝子は、大腸菌（E.coli）又は選択された非病原性グラム陽性菌といった適切なキャリヤの中に挿入されうる。結果として得られる形質転換された細菌は、本発明のポリペプチドを発現することになる。形質転換されたグラム陽性菌は、直接ワクチンとして使用することができる。代替的には、このグラム陽性菌は、上述のとおり、望ましいポリペプチドをより効率良く発現することになるもう１つの形質転換された細菌を産生するべく交叉反応で使用することができる。プラスミドは、ポリリンカーの挿入により汎用ペプチドの産生のために使用することもできる。
本発明の特殊な利点は、必要としている動物に対し、組換え型グラム陽性菌を、病原体が通常体内に侵入する粘膜部位において供給することができる、ということにある。これらの部位には、口ならびに鼻、腸及び膣部位が含まれる。このような供給は、部位における局所的免疫応答を刺激することになり、病原体に対する防御免疫反応を起こすための有効な一手段となる。利用する細菌は非病原性でその特定の部位にとって正常な生体であることから、毒性効果の危険性なくこれらを利用することができる。選択された細菌は、魚や野生動物に対して、摂取する食料又はそれらが棲む水の中に混合させることによって、投与することができる。
上述の同じ手順を利用することにより、活性ポリペプチドとして以下の表２に示されている抗原を惹起する抗体を含むハイブリッドタンパク質を調製することができる。この表は、病原体による感染に対する防御力をもつ抗体を産生することになるポリペプチド、防御すべき疾病及びこのポリペプチドについて記述している出版物を示している。いくつかのケースでは、１つのペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを惹起するのに用いられる遺伝子を調製しプラスミドの中に挿入することが必要である。手順は、上述の手順と完全に同等のものである。Ｃ末端アンカー領域は、以上で特定的に提案されているもののいずれかであってもよいし或いは又表１に記されているグラム陽性菌からの表面タンパク質のその他のいずれかの固着セグメントであってもよい。形質転換された細菌の活性ポリペプチドには、リーダー配列に融合された図示したペプチド、及び細胞表面への適切なトランスロケーションを可能にするための表面タンパク質のＮ末端の小さいセグメントが含まれる。
本発明の産物は、選択された投与部位をコロニー化するべく生きた形質転換された細菌として利用されることから、特定の用量は全く必要とされない。標準的には、選択された用量形態には、１用量単位あたり約106〜1010の生体が含まれることになる。
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引用した出版物の各々は本書に引用により組み入れられる。
Claims (39)
- グラム陽性菌のハイブリッド表面タンパク質をコードする遺伝子配列において、このタンパク質が通常この細菌により発現される表面抗原のアンカー領域のカルボキシ末端に付着されており、ハイブリッド表面タンパク質の残りの部分が、有効な目的のために動物宿主へと供給されうる活性ポリペプチドを含んでなり、前 記アンカー領域がアミノ酸配列:LPXTGX（この配列中Ｘ は任意のアミノ酸である）を含んで成る、ことを特徴と する、前記遺伝子配列。
- 請求項１に記載の遺伝子配列を含むプラスミド。
- 請求項１に記載の遺伝子配列を含む染色体。
- 下記の構造：
- 下記の構造：
- 下記の構造：
- 有効な目的のため哺乳動物宿主に供給することのできる活性ポリペプチドに融合されたグラム陽性菌によって通常発現される表面抗原のアンカー配列を含み、当該アンカー領域がアミノ酸配列:LPXTGX（この配 列中Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成る、ことを 特徴とする、ハイブリッド表面タンパク質。
- 前記活性ポリペプチドが酵素である、請求項７に記載のハイブリッド表面タンパク質。
- 前記活性ポリペプチドが哺乳動物腫瘍細胞の表面抗原である、請求項７に記載のハイブリッド表面タンパク質。
- 前記活性ポリペプチドが雄の精子の表面抗原である、請求項７に記載のハイブリッド表面タンパク質。
- 前記活性ポリペプチドがアレルゲンである、請求項７に記載のハイブリッド表面タンパク質。
- 前記活性ポリペプチドが細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌の表面抗原の抗原決定基を含む、請求項７に記載のハイブリッド表面タンパク質。
- 前記アンカー配列が連鎖球菌性のＭタンパク質のアンカー配列である、請求項７に記載のハイブリッド表面タンパク質。
- 前記活性ポリペプチドに、細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌の表面抗原の抗原決定基が含まれる、請求項13に記載のハイブリッド表面タンパク質。
- M6タンパク質にE7タンパク質が挿入されているハイブリッド表面タンパク質M6:E7。
- M6タンパク質にアレルゲン５が挿入されているハイブリッド表面タンパク質M6:アレルゲン５。
- 細菌に付着され、有効な目的のため動物宿主に供給され得る活性ポリペプチドに融合された、グラム陽性菌により通常発現される表面抗原のアンカー配列を有するハイブリッド表面タンパク質を発現する非病原性グラム陽性菌：ここで、前記アンカー配列は、アミ ノ酸配列:LPXTGX（この配列中Ｘは任意のアミノ酸であ る）を含んで成る、ことを特徴とする。
- 前記活性ポリペプチドが酵素である、請求項17に記載の非病原性グラム陽性菌。
- 前記活性ポリペプチドが哺乳動物腫瘍細胞の表面抗原である、請求項17に記載の非病原性グラム陽性菌。
- 前記活性ポリペプチドが雄の精子の表面抗原である、請求項17に記載の非病原性グラム陽性菌。
- 前記活性ポリペプチドがアレルゲンである、請求項17に記載の非病原性グラム陽性菌。
- 前記活性ポリペプチドが細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌の表面抗原の抗原決定基を含む、請求項17に記載の非病原性グラム陽性菌。
- 前記アンカー配列が連鎖球菌性Ｍタンパク質のアンカー配列である、請求項17に記載の非病原性グラム陽性菌。
- 前記活性ポリペプチドが細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌の表面抗原の抗原決定基を含む、請求項23に記載の非病原性グラム陽性菌。
- 前記ハイブリッド表面タンパク質がプラスミドによって発現される、請求項17に記載の非病原性グラム陽性菌。
- 前記ハイブリッド表面タンパク質が染色体遺伝子により発現される、請求項17に記載の非病原性グラム陽性菌。
- M6タンパク質にE7タンパク質が挿入され ているハイブリッド抗原M6:E7を発現するストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）GP246。
- プラスミドpVMB21を利用して、M6タンパ ク質にE7タンパク質が挿入されているハイブリッド抗原M6:E7を発現するストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）GP246。
- 染色体GP246を利用して、M6タンパク質 にE7タンパク質が挿入されているハイブリッド抗原M6:E7を発現するストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）GP246。
- 病原菌による感染に対し動物宿主を防御 するための免疫原において、当該免疫原は、薬学的に受 容できるキャリヤ及びハイブリッド表面タンパク質を発 現する非病原性グラム陽性菌を含んで成り、前記タンパク質はグラム陽性菌により通常発現される表面抗原のアンカー配列のカルボキシ末端で細菌に付着されており、ハイブリッド表面タンパク質の残りの部分は、前記病原菌による動物宿主の感染を阻害するのに充分な量での防御抗体の産生を刺激するための病原菌の表面抗原の抗原決定基を含む活性ポリペプチドであり、前記アンカー配 列がアミノ酸配列:LPXTGX（この配列中Ｘは任意のアミ ノ酸である）を含んで成る、ことを特徴とする、前記免疫原。
- 前記活性ポリペプチドが、連鎖球菌の表面抗原の抗原決定基を含む、請求項30に記載の免疫原。
- 前記非病原性細菌がストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）である、請求項30に記載の免疫原。
- 前記非病原性細菌が、M6タンパク質にE7 タンパク質が挿入されているハイブリッド表面タンパク質M6:E7を発現するべく形質転換されたストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）である、請求項30に記載の免疫原。
- 前記連鎖球菌がプラスミドpVMB21により形質転換される、請求項30に記載の免疫原。
- 前記ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）が染色体GP246により形質転換される、請求項32に記載の免疫原。
- 請求の範囲第30項に記載の免疫原の投与を含む、グラム陽性病原菌による感染に対する防御を必要としている非ヒト動物の体内でかかる防御を行なう方法。
- マーカーによって２つのセクションに分離されるポリリンカーセグメントと共に、グラム陽性菌によって通常発現される表面抗原のアンカー配列を発現するための遺伝子セグメントを含むプラスミド：ここ で、前記アンカー領域がアミノ酸配列:LPXTGX（この配 列中Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成ることを特 徴とする。
- 動物の体液中の抗体の存在により特徴づけられる感染について試験するための方法において、前記抗体が感染生体の特徴であり、前記試験には、細菌に付着されグラム陽性細菌により通常発現される表面抗原のアンカー配列をもつハイブリッド表面タンパク質を発現する非病原性グラム陽性菌と共に体液をインキュベートする段階が含まれ、このハイブリッド表面タンパク質の残りの部分には前記抗体と反応することになる抗原が含まれており、反応が起こったか否かを決定する段階がさらに含まれている、試験方法：ここで、前記アンカー 領域がアミノ酸配列:LPXTGX（この配列中Ｘは任意のア ミノ酸である）を含んで成る、ことを特徴とする。
- 動物の体液中の抗体の存在により特徴づけされる感染の存在を決定するべく試験するのに有用な試験キットにおいて、当該キットは細菌に付着されグラム陽性菌により通常発現される表面抗原のアンカー配列をもつハイブリッド表面タンパク質を発現する非病原性グラム陽性菌を含み、このハイブリッド表面タンパク質の残りの部分には前記抗体と反応することになる抗原が含まれ、前記アンカー配列がアミノ酸配列:LPXTGX（こ の配列中Ｘは任意のアミノ酸である）を含んで成る、こ とを特徴とする試験用キット。
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