JP3423712B2 - シグナルペプチド、選択的相互作用ポリペプチド及び膜固定配列をコードする組換えｄｎａ配列 - Google Patents

シグナルペプチド、選択的相互作用ポリペプチド及び膜固定配列をコードする組換えｄｎａ配列

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、実質的に３種類の異なるDNAフラグメント
を含む組換えDNA配列及びそのような配列を含む発現ベ
クターまたはプラスミド、並びにそのようなDNA配列を
含有するかまたは示されたようなベクター若しくはプラ
スミドにより形質転換されるグラム陽性菌細胞に関す
る。本発明はさらに、グラム陽性菌細胞の同定または選
択的単離方法も包含する。
本発明は、細菌細胞上に発見された表面レセプター構
造体の使用を含む全くの新規概念に基づく新規方法を包
含する。これらの新規方法により多くの興味深い用途が
発見された。本発明の２つの主態様の一つ目は治癒的ま
たは防御免疫であり、二つ目はグラム陽性菌細胞の同定
または選択的単離の実際的な方法である。
最近のワクチン学に於いて、生有機体が死滅若しくは
サブユニットワクチン調製物に優れた免疫原性を示すこ
ともあるため、組換え免疫原の生送達系（live deliver
y system）の開発が非常に注目されてきた。多くの生組
換え弱毒化ウイルスが外来エピトープのキャリヤとして
試されて来た。これらの例としては、ワクシニアウイル
ス［Mossら,Nature 311,67−69（1984）］、アデノウイ
ルス［Ballayら,EMBO J.4,3861−3865（1985）］、ポリ
オウイルス［Evansら,Nature 339,385−388（1989）］
及びヘルペスウイルス［Shihら,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 81,5867−5870（1984）］が挙げられる。例えば、Sal
monella［Hosieth及びStocker,Nature 291,238−239（1
981）］、非定型ミコバクテリア［Jacobsら,Nature 32
7,532−535（1987）］及びE.coli［O'Callaghanら,Res.
Microbiol.141,963−969（1990）］などの生組換え細菌
を使用する細菌系も開発されており、この系では細菌全
体を組換え免疫原のキャリヤとして使用している。
さらに最近の組換えDNA方法により、免疫感作した動
物またはin vitro免疫感作したリンパ球から直接抗体遺
伝子を単離及びクローニングできるようになった（Huse
ら,Science,1989,246,1275−1280）［Borrebaeckら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 1988,85,3995−3999］。抗体能力
（repertoire）の遺伝子ライブラリーは細菌ベクター系
で確立され得、単離した免疫グロブリン遺伝子のin vit
ro操作が容易になった。
Ｈ（VH）及びＬ（VL）鎖から誘導した変異性領域と細
菌宿主中で次の発現をコードする遺伝子の『ランダム』
結合（combination）により、結合特性をスクリーニン
グし得るVH/VL対が新しく形成される［Huseら,Science,
1989,246,1275−1280］。しかしながら、この方法を使
用して産生した多くのクローンには、実際の方法で関連
クローンを単離し得る効率的なスクリーニング法が必要
である。近年、表面に露出した免疫グロブリンフラグメ
ントのキャリヤとして細菌ファージを使用する方法が記
載され、これにより所望の抗原を結合し得るVH/VLドメ
インの結合を保持する単一ファージ粒子を選択し得るよ
うになった（McCaffertyら,1990,Nature,348,552−55
4）。
単一表面に露出した構造を保持する媒質をクローン特
異的に単離するための新規方法の重要性は、ホルモン−
ホルモンレセプター認識［Bassら,Proteins:Structure,
Function and Genetics,8,309−314（1990）］及び酵素
−基質混和性［Carterら,Proteins:Structure,Function
and Genetics,6,240−248（1989）］などの分野にも関
連する。
しかし、使用したファージコート蛋白質に免疫グロブ
リンセグメントを含ませるための構造的強制により、負
の生物学的選択、続いてVH/VL結合の理論的能力が欠損
し得る。さらに、各ファージ粒子に露出した少数、１〜
約５個の分子の免疫グロブリン分子により、ファージ粒
子の低い親和性による温和な結合能を持つ結合の回収に
関して克服できない問題が発生し得る。
Escherichia coliの表面に異種蛋白質を表出する系、
例えば、鞭毛（flagellor）フィラメント（Kuwajimaら,
1988,Bio/Technology,6,1080−1083）または外部膜蛋白
質Lam B（O'Callaghanら,1990,Res.Microbiol.141,963
−969）への抗原ペプチドの融合も記載されている。や
はり、このような概念を実際の用途でそれ程有用とさせ
ない構造的強制が存在する。
本発明は、広範囲の実際的な用途のための組換え表面
レセプター構造体を使用する概念に基づく新規方法を提
供することを主な目的とする。
本発明のもう一つの目的は、免疫原を向けるキャリヤ
としてグラム陽性菌を使用することである。本発明によ
り免疫応答が非常に促進し、且つ慣用のアジュバントの
使用がそれほど重要でないかまたは余計にすらなる。
本発明のさらにもう一つの目的は、種々の組換え表面
レセプター構造体を保持するそのような細胞の異種集団
からグラム陽性菌細胞を同定及び／または単離し得る方
法を提供することである。
本発明のまたもう一つの目的は、組換えDNA配列、そ
のような配列を含む発現ベクター若しくはプラスミド及
びそのような配列を含有したりまたはそのようなベクタ
ー若しくはプラスミドにより形質転換されるグラム陽性
菌細胞を提供することである。
以下の記載により明らかになるこれら及び他の目的に
関しては、本発明は、グラム陽性菌の表面上に天然では
知見されず、且つ選択的相互作用し得る第２のアミノ酸
配列をコードする第２のDNAフラグメントに操作可能に
結合した、グラム陽性宿主中で操作可能なシグナルペプ
チドとして操作する第１のアミノ酸配列をコードする第
１のDNAフラグメントを含む組換えDNA配列であって、第
２のDNAフラグメントは、細胞壁拡張（spanning）及び
膜固定配列としてグラム陽性宿主中に操作可能な第３の
アミノ酸配列をコードする第３のDNAフラグメントに操
作可能に結合している、該組換えDNA配列を提供する。
そのような組換えDNA配列では、前記第２のアミノ酸
配列は、抗原的に作用し得るか、または抗体（免疫グロ
ブリン）若しくはその活性フラグメントにより構築され
得る。
本発明の好ましい態様により、組換えDNA配列は、前
記第３のDNAフラグメントがブドウ球菌蛋白質Ａまたは
連鎖球菌蛋白質Ｇの細胞壁拡張及び膜固定領域をコード
するような該配列である。
本発明の好ましい態様に於いて、前記第１のDNAフラ
グメントは、ブドウ球菌蛋白質Ａの単一ペプチドをコー
ドするDNAフラグメントなどのグラム陽性菌細胞由来で
ある。
前記第３のDNAフラグメントは、ブドウ球菌蛋白質Ａ
の細胞壁拡張及び膜固定領域をコードするのが好まし
い。
本発明の免疫学的態様に関しては、前記第２のDNAフ
ラグメントが、ワクチン接種目的または抗体の産生に有
用な免疫応答を誘引し得るアミノ酸配列をコードするの
が好ましい。
本発明は、概説した組換えDNA配列を含む発現ベクタ
ーまたはプラスミドも提供する。本発明によるそのよう
なベクターまたはプラスミドは、グラム陽性菌宿主中で
複製し得る。
さらに本発明は、上記定義の組換えDNA配列を含有す
るか、またはそのようなDNA配列を含むベクター若しく
はプラスミドにより形質転換されるグラム陽性菌細胞も
網羅する。
最後に、本発明は、異なる組換え表面レセプター構造
体を保持し、個々の細胞は特異的な組換え表面レセプタ
ー構造体の多重コピーを保持する、そのような細胞の異
種集団からグラム陽性菌細胞を選択的単離または同定す
る方法を提供する。そのような方法は、細胞の異種集団
を特異的な相互作用パートナー（例えば、抗原）と相互
作用させ、１個の特異的な組換え表面レセプター構造体
を保持する細胞を同定及び／または単離し得る段階を包
含する。そのような本発明の方法の一態様により、前記
レセプター構造体は、抗体またはその活性フラグメント
により構築され得る。
前記相互作用パートナーは、免疫形で使用するのが好
ましく、これにより特異的な構造体を保持する細胞は効
率的に単離され得る。このような免疫感作は、好ましく
は、例えば、カラム形の固体支持体上で実施する。
本発明は、実施例の形で表される特異的な態様の記載
により詳細に説明されよう。これらの実施例は、付記図
面１〜９を参照し、その内容は以下の説明文から図面で
明らかになろう。
出発物質 細菌株及びクローニングベクター Escherichia coli株PR1ΔM15［Ｒther,U.,Nucl.Aci
ds Res.10,5765−5772（1982）］を、E.coli発現及びプ
ラスミド構築に使用した。Staphylococcus xylosus KL1
17［Schleifer及びKloos,Int.J.Syst.Bacteriol.25,50
−61（1975）］を、細胞表面上の組換え蛋白質の発現に
使用した。pRIT28［Hultmanら,Nucleos.and Nucleot.7,
629−637（1988）］、pUC19［Yanisch−Perron C.,Viei
ra J.及びMessing J.,Gene 33,103−119（2985）］、pR
IT24［Hammarbergら,Proc.Natl.Acad.Sci.86,4367−437
1（1989）］、pHERAT及びpLERAT（Dr.Greg Winter MRC,
Cambridge,United Kingdomからの贈与）。
実施例中で使用した全ての株、ベクター、オリゴヌク
レオチド及び抗体は、Department of Biochemistry and
Biotechnology,Royal Institute of Technology,Stock
holm,Swedenで入手可能であった。
ベクターpSBB−M3−XM及びpSBB−ScFv（D1.3）−XM
は、ブタペスト条約の下に、the Deutsche Sammlung vo
n Microorganismen und Zellkuturen GmbH in Braunsch
weig,Germanyに1991年５月10日に寄託し、各々受託番号
第DSM 6516及びDSM 6517を受けた。
ブイヨン 酵母抽出物（5g/l）を含んだトリプシン大豆ブイヨン
（Tryptic Soy Broth）（30g/l）をDifco Inc.より入手
し、滅菌水中に溶解し、好適な抗体の添加前にオートク
レーブにかけた。
緩衝液 TST:Tris/HCl（25mM pH7.4）、NaCl（150mM）、0.05
％Tween 20.PBS:0.05Mリン酸ナトリウムpH7.1、0.15M N
aCl. PCR増幅 Techne Programmable Dri Block PHC−１上でPCR増幅
を実施した。
10×PCR緩衝液:100mM TRIS/HCl,pH8.3,500mM KCl,20mM
Mg2+,1％Tween 20、2mM dNTP及び実施例に記載したオリ
ゴヌクレオチドプライマー［各々5pmole］ DNAポリメラーゼ:Ampli Taq（登録商標）［Perkin Elme
r Corp.］0.5単位． PCRプログラム:97℃,0.5分;65℃,1.0分;72℃,1.0分。
DNA配列決定 Hultmanら［Nucl.Acids.Res.17,4937−4946,（198
9）］に従って固相DNA配列決定を実施した。
タンパク質のアフィニティー精製［HSA及びHEL］ 異なる構造体を含有する細胞を、アンピシリン100mg/
lを補ったブイヨン中、一晩生長させた。培地を１回目
は5000g、次いで２回目は9000gで遠心分離して透明にし
た。透明にした培地をHSA−セファロースまたはHEL−セ
ファロース上に直接装填した。１×TST次いで0.5mM NH4
Ac、pH5.0で洗浄後、タンパク質を0.5M HAc,pH2.8で溶
出した。280nmでの吸収を測定し、関連画分を凍結乾燥
した。
SDS PAGE タンパク質を、2.5％ドデシル硫酸ナトリウム［SD
S］、５％ジチオスレイトール［DTT］及び0.01％ブロモ
フェノールブルー［BFB］中に溶解し、５分沸騰させ、P
HAST（登録商標）系［Pharmacia−LKB Biotechnology,S
weden］に従って10−15％ポリアクリルアミドゲル勾配
上で10mAで、30分かけた。続いてゲルをクーマシーブリ
リアントブルーで染色した。
通常法 分子生物学で日常的に使用される方法、例えばエンド
ヌクレアーゼによるDNAの制限、DNAフラグメントの連結
などは記載しない。
プロトプラストの調製及び形質転換 S.xylosusからのプロトプラストの調製及び形質転換
を、Ｇtzら［J.Bacteriol.145,74−81（1981）］の記
載の如く実施した。
ブドウ球菌からのDNA調製 形質転換したブドウ球菌からのプラスミドDNAのミニ
プレパレーションを、アルカリ性抽出法［Birnboim and
Doly,Nucl.Acids Res.7,1513−1523（1979）］を使用
して実施した。異なる構築物を含有する細胞を、クロラ
ムフェニコール20mg/lを補ったブイヨン1.5ml中で一晩
生長させた。標準法にかける前に、細胞を生理食塩水緩
衝液（100μｌ）中リソスタフィン５μｇと共に37℃で
１時間インキュベートした。
ウサギ抗血清 ウサギ抗血清R120を、融合タンパク質ZZ−M3及び Gene 89,187−190（1990）］の混合物と共有結合で結合
した予め形成したインフルエンザ膜糖タンパク質ISCOMS
［Moreinら,Nature 308,457−460（1984）］60μｇを筋
肉内で２回免疫感作したウサギから得た。
インフルエンザISCOMSの調製及び融合タンパク質のカ
ップリングは、Ｌvgrenら［J.Immunol.Meth.98,137−
143（1987）］に記載の如く実施した。抗血清R120はELI
SA中、M3ペプチドと強く反応し、BB領域とは非反応性で
あり、続いてブドウ球菌の表面上でM3ペプチドを検出す
るのに使用した。抗血清R102は、フロインドのアジュバ
ント中、融合タンパク質 Gene 89,187−190（1990）］で２回免疫感作したウサギ
から得られた。フロインドの完全アジュバントを１回目
の注射に使用し、次いでフロインドの不完全アジュバン
トを２回目の注射に使用した。抗血清R102はELISA中でB
B領域と強く反応したが、M3ペプチドに対する反応性は
示され得なかった。従って、抗血清R102はブドウ球菌の
表面上でBBの検出に好適であった。
S.xylosusの表面上でペプチドを検出するためのイムノ
アッセイ 異なる構築物を含有する細胞を、クロラムフェニコー
ル（20mg/l）を補ったブイヨン中で37℃で一晩生長させ
た。細胞をPBS中で２回洗浄した。15−ウエルマルチテ
ストスライド（Flow laboratories）を、室温で30分湿
潤チャンバ内でコーティング緩衝液（15mM Na2CO3,35mM
NaHCO3,pH9.6）とインキュベートした。コーティング
緩衝液はPBS中細菌１滴（107細菌/ml）でディスプレイ
し、スライドを室温で30分、湿潤チャンバ内でインキュ
ベートした。未結合細菌をPBSで洗浄し、細胞１層をPBS
中１％グルタルアルデヒドで２秒間固定した。最後にス
ライドを蒸留水中で洗浄し、風乾し、−20℃で貯蔵し
た。ウサギ抗血清をPBS中1:1000に希釈し、各ウエルに
１滴ずつ加え、室温で30分湿潤チャンバ内でインキュベ
ートした。PBSで４回洗浄後、スライドをビオチン化抗
ウサギIgG−分子（15μｇ）と30分インキュベートし、P
BS中で再び洗浄後、30分のインキュベーション間にアビ
ジン−結合フルオレセインイソチオシアネート（FITC）
（50μg/ml）（Vector,USA）を添加した。最後に、スラ
イドを洗浄し、臭化エチジウムを添加して細菌DNAを可
視化し、UV−顕微鏡下で調べた。
図面の説明 図1A. ブドウ球菌タンパク質Ａをその異なる領域と共にコー
ドする遺伝子の図である。Ｓは、シグナル配列である。
E,D,A,B及びＣは、同種性の高いIgG−結合ドメインをコ
ードする。Ｘは、細胞壁拡張領域をコードし、Ｍは膜固
定領域をコードする。
図1B. ブドウ球菌の外部細胞表面に結合した加工タンパク質
Ａを示す図である。
図2A. 実施例１に記載のプラスミドpSBBmp18XM及びpSBBm3XM
を示す図である。この場合のBB−領域は、連鎖球菌タン
パク質Ｇをベースとする血清アルブミン結合領域である
のに注意されたい。
略号:bla,β−ラクタマーゼコード遺伝子； cat,クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼコード遺伝子； OriE,E.coli由来の複製物のオリジン； OriS,S.aureus由来の複製物のオリジン。
図2B. ブドウ球菌の細胞表面に結合した、プラスミドpSBBmp
18XM及びpSBBM3XMからコードされた、加工及び分泌され
た発現産生物の説明図である。
図3. 細胞表面でBBを発現する固定S.xylosus細胞の免疫蛍
光反応を示す図である。反応性はBB−特異的な抗血清
（R120）で得られた。細胞の内部部分は、臭化エチジウ
ム染色により明らかにする。
図4. 細胞表面でBBM3を発現する固定S.xylosus細胞の免疫
蛍光反応を示す図である。反応性はM3−特異的な抗血清
（R102）で得られた。細胞の内部部分は、臭化エチジウ
ム染色により明らかにする。
図5. 細胞表面でBBM3を発現する固定S.xylosus細胞の免疫
蛍光反応を示す図である。予備免疫血清を使用しても、
反応性は得られなかった。細胞の内部部分は、臭化エチ
ジウム染色により明らかにする。
図6. マウス抗リゾチーム抗体D1.3のscFvフラグメントをコ
ードする遺伝子を図示する。異なるオリゴヌクレオチド
のアニーリング部位は矢印で示されている。
図7. BB−scFv−XM融合タンパク質をコードするpSBB−scFv
−XMプラスミドを図示する。幾つかの制限酵素認識部位
が示されている。CAT:クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ。
図8. 表示の制限酵素で消化後に得られたpSBB−scFv−XMプ
ラスミドの異なるDNAフラグメントを含む、臭化エチジ
ウムで染色し、UV［254nm］で露出したゲルのポラロイ
ド像を示す図である。
パネルA:S.xylosus細胞から調製したプラスミド； パネルB:E.coli細胞から調製したプラスミド。
マーカーDNAフラグメントサイズを左側に示した。
図9. pSBB−scFv−XMプラスミドによりコードされたBB−sc
Fv−XMタンパク質のS.xylosus宿主細胞壁中の予想オリ
エンテーションを図示する。
図10. ネズミの経口投与に使用したS.xylosus細胞により含
有されたpSBBG3XMプラスミドを図示する。
S, ブドウ球菌タンパク質Ａ［SPA］から誘導したシグ
ナルペプチド； BB, 連鎖球菌タンパク質Ｇから誘導した血清アルブミ
ン結合領域； G3, ３コピーRSVエピトープ； XM, SPA由来の細胞壁固定領域； bla, β−ラクタマーゼ； OriE, E.coliに関する複製オリジン； OriS, S.xylosusに関する複製オリジン； cat, クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ； Pspa, spaオペロン由来のプロモーター。
図11. 第１回目の経口投与後、異なる時点に於ける免疫感作
したネズミの血液中に存在する抗−BBG3抗体を検出する
ためのELISAからの結果を示す図である。
実施例Ｉ E.coli−ブドウ球菌シャトルベクターpRIT16のNot I
−Nde I消化［Abrahmsｎら,Nucl.Acids Res.14,7487
−7500（1986）］により、ブドウ球菌タンパク質Ａ（SP
A）に関する遺伝子を、SPAの転写、翻訳及び分泌シグナ
ルにより先行された、合成二価IgG−結合ドメイン、ZZ
をコードするプラスミドpEZZ318T［Nygrenら,J.Molec.R
ecogn.1,69−74（1988）］から制限されたNot I−Nde I
遺伝子フラグメントと置き換えた。得られたプラスミド
pSZZmp18Tは、E.coli及びStaphylococcus aureusの両方
に関して複製のオリジンを含んでいた。SPAのIgG−結合
領域A,B及びＣと、細胞壁拡張領域Ｘ及び膜固定領域Ｍ
（図１）をコードする遺伝子フラグメントは、Hind III
及びEcoR Vを使用してプラスミドpSpA8［Uhlｎら,J.B
iol.chem.259,1695−1702（1984）］から制限し、同一
酵素で予め制限したプラスミドpSZZmp18T中のmp18マル
チクローニング部位［Yanisch−Perronら,Gene33,103−
119（1985）］の下流に挿入した。得られたベクターをp
SZZmp18ABCXMと命名した。このプラスミドはHind III及
びPst Iで消化し、SPAの領域Ｍの半分と、領域Ａ、Ｂ、
Ｃ及びＸをコードする遺伝子フラグメント欠失する。領
域Ｘ及びＭの完全配列は、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）
法を適用することにより修復され得る。上流プライマー
としてSTST34、下流プライマーとしてSTST33及びDNA鋳
型としてプラスミドpSpA8を使用してPCR増幅を実施し
た。上流プライマーは、その非アニーリング5'配列によ
りHind III認識配列を産生し、下流プライマーはSPAの
Ｍ領域中の元のPst I認識配列に重複した。従って、PCR
で増幅したフラグメントはHind III及びPst Iで制限さ
れ得、同一酵素で予め制限されたプラスミドpRIT28［Hu
ltmanら,Nucleos.and Nucleot.7,629−638（1988）］に
サブクローンし、プラスミドpRIT28XMを産生した。PCR
でサブクローンしたフラグメントのヌクレオチド配列
を、固相DNA配列決定により確認した［Hultmanら,Nucl.
and Res.17,4937−4946（1989）］。pRIT28XMのHind II
I−Pst I制限により、SPAの領域Ｍの半分と領域Ｘをコ
ードする遺伝子フラグメントを単離し得、Hind III−Ps
t Iで消化したプラスミドpSZZmp18ABCXM（上述）に融合
すると、mp18マルチクローニング部位のＭ下流とin fra
me且つ完全領域ＸをもつプラスミドpSZZmp18XMが得られ
た。プラスミドpSZZmp18XMのNot I−EcoR I消化によ
り、ZZコード遺伝子フラグメントをプラスミドpB1B2mp1
8から制限されたNot I−EcoR Iフラグメントで置き換え
得 J.Immunol.Meth.124.,43−52（1989）］、SPAの転写、
翻訳及び分泌シグナルにより先行されたBBと命名され
た、連鎖球菌タンパク質Ｇの血清アルブミン結合領域を
コードする。得られたベクターpSBBmp18XM（図2A）はE.
coli及びStaphylococcus aureusの両方に関する複製の
オリジンを含んでいた。通常の発現ベクターpSBBmp18XM
中のmp18マルチクローニング部位をEcoR I−Hind III制
限により除去した。反復性の高いペプチドM3をコードす
る遺伝子フラグメント Gene 89,187−193（1990）］をプラスミドpRIT28M3 Gene 89,187−193（1990）］から切り出した。まず、M3
配列を停止する停止コドンを特定部位の固相in vivo突
然変異［Hultmanら,Nucl.Acids Res.18,5107−5112（19
90）］により除去した。M3をコードする、EcoR I−Hind
IIIで制限された遺伝子フラグメントを同様に消化した
pSBBmp18XMに連結させて、プラスミドpSBBM3XMを産生し
た（図2A）。M3ポリペプチドは、マラリヤ血液段階抗体
Pf155/RESA［Berzinsら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83.10
65−1069（1986）］の免疫原性の高いＣ−末端部分から
誘導する。
プラスミドpSBBmp18XMは、SPA由来のシグナルペプチ
ド、連鎖球菌タンパク質Ｇから誘導した血清結合BB部分
及びSPA由来の細胞壁結合XM領域を含む３部分からなる
誘導タンパク質をコードする。細胞膜を介する分泌時
に、シグナルペプチドが切断される。プラスミドpSBBM3
XMは、マラリヤ抗原ペプチドM3がBBとXM領域の間に配置
される３部分からなる融合タンパク質をコードする（図
2B）。
プラスミドpSBBmp18XM及びpSBBM3XMは、Staphylococc
al xylosus（詳細は、以下の「出発物質」参照）から製
造したプロトプラストに形質転換される。表１に示され
ているように、BBまたはM3の各々に特異的なポリクロー
ナルウサギ抗血清を使用するイムノアッセイから、プラ
スミドpSBBmp18XMを含有するS.xylosus細胞は細胞表面
にBBを発現し（図３参照）、pSBBM3XMを含む細胞は細胞
表面にBBとM3の両方を発現し（図４）、この方法により
組換え融合タンパク質を発現する際に分泌シグナルと細
胞壁結合部分、XMの両方が機能的であることを示してい
る。プラスミドを含まないS.xylosus細胞は、BB及びM3
特異的抗血清の両方に各々陰性であり、前免疫血清は全
ての場合で陰性であった（図５）。
実施例II 抗リゾチーム抗体D1.3［McCaffertyら,1990,Nature 3
48,552−554］のＨ［pHERAT］及びＬ［pLERAT］鎖の変
異性ドメインを含有するプラスミド鋳型pHERAT及びpLER
AT上のオリゴヌクレオチドプライマー対KS1/2及びKS3/4
を各々使用するPCR増幅により、２種類の変異性ドメイ
ンをコードする遺伝子フラグメントを単離し得た。プラ
イマーを含んだ好適な制限酵素認識部位Eco R I及びBam
H Iを使用することにより、フラグメントをpRIT28に挿
入し、固相配列決定用に改造した。
正しい配列を確認後、得られたプラスミドpRIT28−VH
及びpRIT28−VLを別個に、オリゴヌクレオチドプライマ
ー対KS6/2［pRIT28−VH］及びKS3/5［pRIT28−VL］各々
を使用する続くPCR増幅中の鋳型として使用した。得ら
れたPCR産生物の約５ナノグラムを混合し、85℃に加熱
し、その後室温に冷却した。Taqポリメラーゼ［Perkin
Elmer corp.］0.5単位、PCR緩衝液を添加後、標準PCRを
２回実施し、二重鎖DNAを得た。この方法により、KS5及
びKS6オリゴヌクレオチドによる２回目のPCRの際に取り
込まれた重複配列によって２個の免疫グロブリンコード
遺伝子フラグメントが結合した。結合DNA配列は、２個
の免疫グロブリンドメイン間に柔軟性の高い15アミノ酸
残基結合ペプチドをコードする。得られた730塩基対フ
ラグメントは、式： NH2−VL−リンカー−VH−COOH に記載の如く抗リゾチーム抗体D1.3［図６］の単一鎖Fv
［ScFv］をコードし、scFvコードフラグメントをさらに
クローニングするために十分な量を得、外部プライマー
KS3及びKS2を使用してさらにPCRを20回実施した。得ら
れたPCR産物を制限酵素Eco R I及びBam H Iで制限し、
続いてクローニングベクターpUC19に連結した。配列を
確認後、正しく組み立てられたscFv遺伝子フラグメント
を含むクローンをEco R I及びBam H I制限し、730塩基
対フラグメントをE.coli発現ベクターpRIT24のEco R I
及びBam H I部位に挿入した［Hammerbergら,Proc.Natl.
Acad.Sciences,USA,86,4367−4371］。得られた構築物p
RIT24−scFcは３部分からなる融合ZZ−scFv−BBをコー
ドする。pRIT24−scFvで形質転換したE.coli細胞を、ア
ンピシリン［100ml/l］を補ったトリプシン大豆ブイヨ
ン＋酵母抽出物中、30℃で一晩生長させた。
組換えZZ−scFv−BB融合タンパク質の安定性及び生物
学的活性を調査するために、一晩発酵させた培地を、ヒ
ト血清アルブミン［HSA］及び鶏卵卵白リゾチーム［HE
L］セファロースカラムを各々通過させた。0.5M HAc/NH
4Ac pH2.8で溶出したタンパク質を凍結乾燥し、SDS−PA
GEで分析した。HSA−及びHEL−親和性精製物質の両方に
関する主要バンドは、完全長であることが知見された。
HELを用いるZZ−scFv−BBの好結果のアフィニティー精
製から、scFv免疫グロブリンフラグメントは２個の親和
性末端（tail）ZZ及びBBによりフランクされるが、自然
の生物学的に活性な構造に折り畳み（fold）得ることが
示唆されている。
実施例１に記載されているものは、E.coli及びブドウ
球菌細胞の両方に複製し得るシャトルベクターpSBBmp18
XMの構築である。scFvフラグメントの挿入に関してこの
ベクターを適用するために、mp18リンカーをM13mp8から
誘導した短いmp8リンカー［Messingら,1982,Gene 19,26
9−276］と置換して、pSBBmp8XMを産生した。scFcをコ
ードする遺伝子フラグメントをEco R I及びBam H I制限
によりUC19−scFcプラスミドから放出し、続いてpSBBmp
8XMベクターに連結した。
S.xylosus細胞を得られたpSBB−scFv−XM構築物［図
７］で形質転換し、生育し得るコロニーをプラスミド調
製用にクロラムフェニコール［20mg/l］を補ったTBS中
で37℃で一晩生長させた。形質転換したブドウ球菌細胞
から調製した、pSBB−scFv−XM構築物の制限酵素マッピ
ングは、予想した結果と一致した［図８］。このこと
は、pSBB−scFv−XM構築物がブドウ球菌宿主内で遺伝子
的に安定であることを示している。
この構築物は、宿主細胞壁に取り込まれるべきBB−sc
Fv−XM融合タンパク質をコードする［図９］。
実施例III 経口投与後のネズミに於ける特異的抗体の発達 呼吸性合胞体ウイルス［RSV］糖タンパク質Ｇエピト
ープ［Trudelら，（1991）,Virology 185:749−757］Ｃ
−末端繰り返し配列、VSICSNNPTCWAISKNの３個のコピー
を含むペプチドG3をコードする遺伝子を、実施例１に記
載のM3ペプチドの構築に関して記載された重合概念に従
って、オリゴヌクレオチド： を使用して構築し、pRIT28Eに挿入したpRIT28EG3を産生
した。G3をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、固
相DNA配列決定［Hultmanら，（1989）,Nucl.Acids Rec.
17:4937−4946］により確認した。G3遺伝子フラグメン
トをEcoR I及びHind IIIでpRIT28EG3から切り出し、同
様に消化したpBB2mp18 （1989）,J.Imm.Meth.124:43−52］に連結した。得られ
たベクター、pBBG3［5153bp］は、連鎖球菌タンパク質
Ｇ［SPG］由来の血清アルブミン結合領域とトリペプチ
ド繰り返し部分からなる、BBG3［30.9kDa］の融合タン
パク質をコードする。pBBG3プラスミドを含有するE.col
i細胞をアンピシリン［100mg/l］を補った500mlトリプ
シン大豆ブイヨン［30g/l］中、37℃で一晩生長させ
た。融合タンパク質を、Nygrenら［J.Mol.Recognit.1:6
9−74］に従ったHSA−セファロース上のアフィニティー
クロマトグラフィーによりpariplasmicスペース及び培
地から精製した。
G3をコードする遺伝子フラグメントを、実施例１のM3
遺伝子に関する記載通り、固相部位特異的突然変異によ
りG3配列を停止する停止コドンを除去後、EcoR I及びHi
nd IIIで制限したpRIT28EG3から回収した。制限フラグ
メントを同様に制限したpSBBmp18XMに連結すると、プラ
スミドpSBBG3XM［図10］が得られた。プラスミドpSBBG3
XMは、SPA由来のシグナルペプチド、SPGから誘導した血
清アルブミン結合BB領域、RSV抗原性ペプチドG3及びSPA
由来の細胞壁結合XM領域を含むテトラペプチド誘導タン
パク質をコードする。
プラスミドpSBBmp18XM及びpSBBG3XMを、Staphylococc
us xylosus［詳細に関しては、『出発物質』を参照］か
ら調製したプロトプラストに形質転換し、細胞を一晩生
長させた。実験の開始時に、６週齢のメスのネズミOFI4
匹［IFFACREDO,France］に各々、経口的に、pSBBG3XMプ
ラスミドを含有する一晩成長させた培地由来の1010S.xy
losus細菌［改良Neubauer counting chamberを使用して
顕微鏡で計測］を、３週間、続いて43日後に第２期の３
週間に、各火曜日、水曜日、木曜日及び金曜日に投与し
た。21、28、35及び63日目に血液を個々に採集し、ElIS
Aアッセイでコーティング抗原として精製BBG3タンパク
質を用いて抗BBG3抗体の存在を試験した。ミクロ滴定プ
レートをBBG3の1.25μg/ml溶液で一晩被覆し、次いでPB
S中の１％スキムミルクで２時間飽和させた。免疫感作
したネズミからの血液サンプルを装填し、インキュベー
ション後に濯ぎ、結合抗体を色素産生細菌アルカリ性フ
ォスターゼ基質と一緒に抗マウスIgG−アルカリ性フォ
スターゼ結合体［Sigma Inc.試薬No.A1902］を使用して
検出し、405nmでモニターした。試験は、負の対照とし
て０日に採取した血清で３回実施し、ウサギ抗BBG3ポリ
クローナル血清を正の対照として使用した。図11に示さ
れた結果は、処置63日間に４匹全部の動物でBBG3特異的
免疫応答が発達したことを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ユーレン，マテイアス スウエーデン国、エス−752 39・ウプ ツサラ、クバルンボガータン・30 (72)発明者 ングエン，テイアン・ンゴツク フランス国、74160・サン・ジユリアン、 リユ・ジエネラル・パクトツド・２ (56)参考文献 特開 昭62−272990（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−151886（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A61K 39/00 C12N 1/21 G01N 33/569 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】グラム陽性宿主内において作動可能なシグ
    ナルペプチドとして機能する第１のペプチドもしくはタ
    ンパク質をコードする第１のDNAフラグメントを含む組
    換えDNAであって、該第1DNAフラグメントが、グラム陽
    性菌の表面上に天然には認められない第２のペプチドも
    しくはタンパク質をコードする第２のDNAフラグメント
    に機能的に結合しており、該第2DNAフラグメントが、細
    胞壁スパンニング（cell wall spanning）および膜アン
    カリング（membrane anchoring）配列としてグラム陽性
    宿主内で作動可能な第３のペプチドもしくはタンパク質
    をコードする第３のDNAフラグメントに機能的に結合し
    ており、該第２ペプチドもしくはタンパク質が抗原とし
    て機能し得るか、または組換え表面レセプター構造体と
    成り得ることを特徴とする前記組換えDNA。
  2. 【請求項２】前記第2DNAフラグメントが、ワクチンとし
    て機能し得るかまたは抗体産生を誘導し得るアミノ酸配
    列をコードする、請求項１に記載の組換えDNA。
  3. 【請求項３】前記第3DNAフラグメントが、ブドウ球菌タ
    ンパク質Ａまたはブドウ球菌タンパク質Ｇの細胞壁スパ
    ンニングおよび膜アンカリング領域をコードする、請求
    項１または２に記載の組換えDNA。
  4. 【請求項４】前記第1DNAフラグメントがグラム陽性菌細
    胞由来である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の
    組換えDNA。
  5. 【請求項５】前記第3DNAフラグメントが、ブドウ球菌タ
    ンパク質Ａの細胞壁スパンニングおよび膜アンカリング
    領域をコードする、請求項１乃至３のいずれか１項に記
    載の組換えDNA。
  6. 【請求項６】前記第1DNAフラグメントがブドウ球菌タン
    パク質Ａのシグナルペプチドをコードする、請求項５に
    記載の組換えDNA。
  7. 【請求項７】請求項１乃至６のいずれかに記載の組換え
    DNAを含み、グラム陽性菌宿主内で複製することができ
    る発現ベクターまたはプラスミド。
  8. 【請求項８】請求項１乃至６のいずれかに記載の組換え
    DNAを有するか、または、請求項７に記載のベクターも
    しくはプラスミドによって形質転換されたグラム陽性菌
    細胞。
  9. 【請求項９】異なった組換え表面レセプター構造体を有
    する細胞の異種集団から請求項８に記載のグラム陽性菌
    細胞を選択的に単離または同定する方法であって、前記
    異種細胞集団を、１種類の特異的組換え表面レセプター
    構造体を有する細胞の同定および／または単離が可能な
    特異的に相互作用する相手と相互作用させる工程を含む
    方法。
  10. 【請求項１０】前記レセプター構造体が抗体またはその
    活性フラグメントで構成されている請求項９に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】固定形態にある前記の相互作用する相手
    を使用して前記特異的構造体を有する細胞を単離する請
    求項９または10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記の相互作用する相手が固体支持体上
    に固定されている請求項11に記載の方法。
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