JP2002515455A - ワクチン送達系 - Google Patents

ワクチン送達系

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JP2002515455A JP2000549289A JP2000549289A JP2002515455A JP 2002515455 A JP2002515455 A JP 2002515455A JP 2000549289 A JP2000549289 A JP 2000549289A JP 2000549289 A JP2000549289 A JP 2000549289A JP 2002515455 A JP2002515455 A JP 2002515455A
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シー. スタイン,ダニエル
ストーヴァー,チャールズ,ケー.
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ワクチン送達ビヒクルとして又は診断用試薬として使用するための抗原含有ブレボソームの生産に有用な多量のブレブを生産する淋菌の過剰ブレブ形成種に関する。また本発明は淋菌の過剰ブレブ形成種を使用して、精製形態の所望のタンパク質を多量に生産する方法、及び所望の抗原を発現するブレボソームを含有するワクチン送達系に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 (関連出願に対するクロスリファレンス) 本出願は、1995年5月18日に出願された同時係属中の米国特許出願第0
8/443514の一部継続出願である。
【0002】 (政府の支援) この研究は国立保健研究所の助成AI24452により支援された。政府はこ
の出願に対して所定の権利を有しうる。
【0003】 (発明の背景) (発明の分野) 本発明は、ある病気に対して特異的な免疫原性ポリペプチドを発現するブレボ
ソーム(blebosomes)を含有する組成物、その製造方法、上記免疫原性ポリペプチ
ドに対して特異的な抗体を検出する方法、及び上記ブレボソームを使用する動物
の免疫化方法を提供する。
【0004】 (背景の考察) 免疫化は幼児及び小さな子供の健康を改善するために重要なものである。一般
的な子供の病気の殆どのものに対して様々な成功したワクチン剤が利用可能であ
るにもかかわらず、感染症は子供が死に至る主要な原因のままである。現存する
ワクチンに固有の重要な問題には、繰り返し免疫化する必要があることと、広範
囲の病気に対して現在のワクチン送達系が無効であることが含まれる。
【0005】 ワクチン開発に対する成功したアプローチの数は、ほとんど病原菌の数と同じ
ほど広範である。技術が発達すると、感染防御免疫原の性質を分子レベルで定め
ることができるようになった。近年、無細胞ワクチンが、様々な病原体からのサ
ブユニット(すなわち多成分ワクチン)で投与することができ、有害反応の数を低
減できる可能性を有していることから、ワクチン開発のための選択方法となって
いる。サブユニットワクチンは病原体微生物からの定まった精製防御抗原からな
る。
【0006】 おそらく、サブユニットワクチンの最良の成功例は、インフルエンザ菌(H. in
fluenzae)に起因する病気を予防する現在のワクチンである。髄膜炎菌(N. menin
gitidis)からの外膜タンパク質複合体(OMPC)にコンジュゲートさせたインフ
ルエンザ菌ポリリボシル-リビトール-ホスファート(PRP)莢膜多糖類からなる
コンジュゲートワクチンは、2ヶ月と幼い幼児において安全で防御免疫反応を生
じせしめるのに有効であることが証明された。OMPCにPPCを共有結合させ
ると、担体初回刺激を効果的に媒介するコンジュゲートが得られ、さらにアジュ
バント活性を有するリポオリゴ糖(LOS)を含有する不溶性の粒状抗原が提供さ
れる。このワクチンは安全でインフルエンザ菌に起因する病気に関連した罹患率
と死亡率を有効に低減すると広く認定されている(Stover, C.K.ら, Nature 351
:456-460, 1991;Husson, R.N.ら, J. Bacteriol. 172:519-524, 1990;Jacob
s, W.R.ら, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 155:153-160, 1990;Jacobs, W.
R.ら, Nature 327:532-535, 1987。ここに引用した全ての文献は出典明示によ
りここに取り込まれる)。
【0007】 いつくかの驚くべき成功例はあるものの、現在は少しのサブユニットワクチン
しか使用されていない。おそらく、サブユニットワクチンの使用を妨げる最も主
だった理由は抗原送達の問題にある。最適な抗原送達のためには、抗原は、その
生物学的意味で抗原提示細胞まで抗原を送達せしめる必要があり、又は抗原が容
易に認識され、貪食細胞に取り込まれることが必要である。殆どの抗原は、寄生
生物-宿主細胞相互作用に重要な3次元構造を有しており、これらの構造の多く
は抗原精製中に失われる。
【0008】 サブユニットワクチンの製造に伴う問題の多くを解消するために取られる一つ
のアプローチ法は、遺伝的にインビボで防御抗原を発現するように操作された弱
毒化ウイルス及び細菌に基づく、生組換えワクチンビヒクルの開発である(すな
わち、ワクチン用ウイルス、アデノウイルス、サルモネラ(Salmonella)及びmyco
bacterium tuberculosis typhus bonivur var. Bacille-Calmette-Guerin又はB
CGの組換え体)(Snapper, S.B.ら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:6987-6991
, 1988;Jackett, P.S.ら, J. Clin. Micro. 26:2313-2318, 1988;Lamb, J.R.
ら, Rev. Infect. Dis. 11:S443-S447, 1989;Shinnick, T.M.ら, Infect. Imm
un. 56:446-451, 1988)。
【0009】 生ワクチンには、抗原が生来的に免疫原性の形態で発現され;生送達系が複製
され、宿主内に存続し、宿主免疫系を再刺激し、複数回投与の必要性が回避され
;生ベクター系は抗原を精製する必要性をなくし、製造が安価であり;生ベクタ
ーは多重抗原を送達するように設計することが可能で、個体がワクチン接種しな
ければならない回数を低減するという利点がある。
【0010】 生ワクチンビヒクルとして大腸菌及びサルモネラを開発する研究者は、細菌ワ
クチンビヒクルの表面に防御エピトープを移送するためのキャリアとして、鞭毛
、線毛又は主な外膜タンパク質(OmpA及びLamB)を利用する移送ベクター
を開発した(Stover, C.K.ら, Infect. Immun. 58:1360-1475, 1990;Thole, J.
E.R.ら, Infect. Immun. 55:1466-1475, 1988)。しかし、小さいエピトープし
か挿入されず、エピトープは天然高次構造を呈する能力を制限しうる外来タンパ
ク質の関係において提示されるので、これらの表面にエピトープをグラフトする
アプローチ法には限界がある。
【0011】 ワクチン開発が困難であった病原体に対するワクチンを開発するために、及び
/又は十分に利用されていないことによる市販ワクチンの失敗を克服するために
、少ない回数で免疫化が可能になり、及び/又はワクチンの副作用が少ない抗原
提示のための新規な方法が開発されなければならない。自然にその外膜を越えて
容易に分離される免疫原性ブレブになる細菌である、淋菌を宿主としてベースと
する新規なワクチン送達系が本出願において記載される。
【0012】 淋菌は粘膜表面のヒト病原体である。淋菌は二重層構造体として現われる波状
の外膜を有するグラム陰性菌である(The Gonococcus, P.B. Roberts(編), Wiley
, New Yorkにおいてレビュー)。淋菌の染色体は約2.1x10のヌクレオチ
ド対を含む。対数期の間、淋菌は外膜の出芽により生成される細胞壁ブレブ(小
気胞)を形成する(Schorr, J.B.ら, Cold Spring Harbor Laboratory Press Vacc
ines 91:387-392, 1991)。これらのブレブは球形で二重層膜様の構造体で取り
囲まれている。ナイセリアから取り出されたブレブは、リポソーム3次元構造を
有し、それらに共有結合により結合した抗原を免疫刺激する(アジバント活性)(B
randt, M.E.ら, Infect. Immun. 58:983-991, 1989)。淋菌ブレブからのタン
パク質の性質はリン菌外膜に見られるタンパク質によく似ている(Melchers, F.
ら, J. Erp. Med. 142:473-482, 1975)。淋菌ブレブはそれらの表面タンパク質
I(Pistor, S.及びG. Hobom, Wochenschr. 66:110, 1988)、II(Bakker, D.ら,
Microb. Path. 8:343-352, 1990)、及びH8(Charbit, A.ら, EMBO 5(11):30
29-3037, 1986)を含む。さらに、それらは淋菌リポオリゴ多糖類(LOS)も含む
【0013】 淋菌の細胞表面抗原を特徴付けるための多くの研究がなされており、タンパク
質抗原をコードする多くの遺伝子がクローニングされ、そのDNA配列が決定さ
れている(Vodkin, M.H.及びWilliams, J.C. J. Bact. 170:1227-1234, 1988;Y
oung, D.L.ら, Infect. Immun. 54(1):177-183, 1986;Young, D.R.ら, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A 85:4267-4270, 1998;Newton, S.M.ら, Science 244
:70-244, 1989)。生合成及び各LOS成分の生合成の基礎となる遺伝学に対す
る研究は、定まったLOS構造及び安定した細胞表面を有する菌株の成功した作
成を可能にするのに十分に沿っている。LOSと他の細胞表面タンパク質が不足
したナイセリア変異体はよく記述されており、容易に生産することができる。さ
らに、淋菌ブレブは分離が容易で、ナイセリアの遺伝子操作のためのベクターは
既に存在している。
【0014】 ブレボソームは抗原の担体としてリポソームよりも有利である。リポソームは
人工的に作成され、興味あるタンパク質がそれらに捕捉されるか、又はそれらの
表面に化学的にコンジュゲートされる。本発明のブレボソームは特定の処理を必
要とせず、タンパク質は天然の酵素により自然に折り畳まれ、ブレブ内部又は外
部において発現されるように操作することができる。
【0015】 本発明は、操作された淋菌を含んでなるワクチン送達系を提供するものであり
、該細菌は発現して任意の異種性標的抗原をその外膜に対して向ける。抗原タン
パク質を持つ外膜は、細胞成長中に淋菌ブレブにおいて自然にとれる。得られた
標的抗原-膜ブレブ複合体又はブレボソームは分離が容易で、生きてはいないが
、防御免疫反応を顕現化させるために使用可能な免疫原性細胞様粒子となる。
【0016】 フリーのブレブ形成、又は過剰ブレブ形成種は、ワクチンに使用するために必
要な多量のブレボソームの生成を可能にする。淋菌ブレブをベースとするワクチ
ンを商業的に生産するためには、多量のブレボソームを生産可能としなければな
らない。全ての淋菌種がブレブを生産するが、収率は低くなりがちで、ワクチン
送達システムとしての使用は考えられない。過剰ブレブを形成する菌株がワクチ
ンの経済的生産のために必要なブレブの高収率をもたらす。このような過剰ブレ
ブ形成種は文献にはまだ記載されていない。よって、ワクチン送達系として使用
するのに十分な量で標的抗原を含む多量のブレボソームを経済的に生産するため
に、過剰ブレブ形成が可能な淋菌の菌種に対する必要性がある。
【0017】 (発明の概要) 本発明は、未知の成長パラメータに欠陥がある淋菌種WR302の変異体に対
するものである。この欠陥は淋菌を異常に成長させ、非常に高頻度で外膜を落と
すか過剰ブレブ形成をなす。この菌種は、他の菌種よりもより多くの外膜小胞(
ブレブ)を生成し、そのブレブは電子顕微鏡で容易に可視化される。 また、本発明は、非選択的スポット形質転換技術を使用することにより過剰ブ
レブ形成フェノタイプを有する他の淋菌種の生産にも関する。この技術により選
択圧の不在下での淋菌の形質転換体の同定が容易になる。該技術は、過剰な量の
DNAと限られた数の細胞を混合し、寒天プレートの表面上に混合物を斑点状に
付着させ、混合物をインキュベートし、再画線し、形質転換細胞を選択する工程
を含んでなる。過剰ブレブ形成菌種はリポオリゴ糖(LOS)の発現が改変されて
いる。形質転換体は、コロニーから離れる方向へのブレブの拡散、及び新規なモ
ノクローナル抗体反応性の獲得に基づき、フェノタイプ的に同定することができ
る。
【0018】 異なる変異体を有し、及び/又は異なる抗原に対する遺伝子を既に有する淋菌
種に対して上述したスポット形質転換技術を使用することにより、異なる疾患に
対する抗原を発現する淋菌の過剰ブレブ形成種を生産することができる。これら
の過剰ブレブ形成種から収集されたブレボソームはこれらの疾患に対する免疫化
のためのワクチンを製造するために使用することができる。このようにして生成
されたワクチンは、抗原が他の細胞成分の不在下で存在するため、全細胞ワクチ
ンよりも有利である。さらに、抗原は、天然の生物膜に構築され、抗原が天然の
高次構造を形成することが可能になり、天然生物で遭遇するものをより近く模倣
している。
【0019】 これらのブレボソームは診断アッセイにおいて使用することができ、病気に対
する抗体の存在は、病気を患っていると思われる患者からの試料中で検出するこ
とができる。 また、ブレボソームは、他の生物学的に作成された分子、例えば、化学療法に
使用される化学療法剤、又は免疫エンハンサー/サプレッサーのための送達系と
して使用することができる。
【0020】 さらに、ブレボソームは(天然又は操作された)淋菌からの膜タンパク質の生成
を促進させるために使用することができる。ブレボソームは、殆どの細胞におい
て細胞質成分が無いために、淋菌の外膜タンパク質に有意に富んでいる。よって
、ブレボソームの分離は、その淋菌の膜タンパク質の有意な精製を表す。同様に
、ブレボソームは、ブレボソームにおいて発現するように操作されたタンパク質
、例えばレセプタータンパク質に対して濃縮されており、このようなタンパク質
の生産と精製における補助において顕著な改善を提供する。 よって、ワクチン送達ビヒクルとしての又は診断剤としての使用のための特定
の抗原を含むブレボソームの生産に有用な多量のブレブを製造する淋菌のブレブ
形成種を提供することが本発明の目的である。
【0021】 また、淋菌の過剰ブレブ形成種の生産方法を提供することが本発明の他の目的
である。 さらに、精製された形態での多量の所望のタンパク質の生産方法を提供するこ
とが本発明の他の目的であり、該方法は、タンパク質がブレボソーム内で発現す
るように淋菌の過剰ブレブ形成種に所望の遺伝子を導入し、該ブレボソームを分
離することを含んでなる。 疾患に対する免疫を提供する、上記疾患に特異的な抗原を発現するブレボソー
ムを含んでなるワクチン送達系を提供することが本発明のまた他の目的である。
【0022】 (発明の説明) (過剰ブレブ形成種) 本発明は過剰ブレブ形成淋菌に関する。ここで使用されるところの「過剰ブレ
ブ形成」とは、変異菌種が、それが得られた親株よりも多くのブレブを形成する
ことを意味する。一般的に、過剰ブレブ形成変異体はそれらの親菌種よりも10
%、好ましくは20%、さらに好ましくは30%を越えて、より多くのブレブを
形成する。 過剰ブレブ形成淋菌は以下の実施例に記載されたようにして調製し、選択する
ことができる。例えば、過剰ブレブ形成種を作成するために2つのアプローチ法
を使用しうる。最も厳密なアプローチ法はこの変異体の遺伝的ベースを同定し、
遺伝子をクローンするものである。
【0023】 第2のアプローチ法は、以下の実施例に記載した非選択的スポット形質転換方
法である。簡単に言うと、過剰ブレブ形成種から単離された染色体DNAを野生
型菌種を形質転換するのに使用する。過剰ブレブ形成フェノタイプは、過剰ブレ
ブが、例えばコロニーブロット上でLOS-特異性モノクローナル抗体2-1-L
8及び1B2と反応する菌種であるため、容易に同定される。モノクローナル抗
体2-1-L8は、Wendel Zollinger博士, Walter Reed Army Institute for Res
earch, Washington DCから得ることができる。抗体1B2はATCC受託番号2
199として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得ることがで
きる。
【0024】 本発明の過剰ブレブ形成淋菌は、非過剰ブレブ形成種WR302の派生物であ
るWR302+−と命名された新しい菌種により例証される。WR302はDani
el Stein博士から得ることができる。WR302+−は、ATCC受託番号55
857で、1996年10月16日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション, 12301 Parklawn Drive, Rockville MDにブタペスト条約に従って
寄託された。
【0025】 ブレボソームは非線毛化(non-piliated)細胞から容易に分離することができる
。例えば、ブレボソームは差次的遠心分離及び濾過により回収することができる
。また、高速遠心分離を使用することもできる。ブレブの分離の一般的な参考と
してはBuchanan & Arko, 1977, J. Infect. Dis. 135:879-887を参照されたい
【0026】 ブレボソームは使用前に4℃で貯蔵されるか、又は固定化がタンパク質生産系
、診断試薬、又はワクチン送達系のいずれであろうと、ブレボソームの最終的な
有用性を著しくは妨害しないならば、固定化することもできる。また、所望の抗
原を有するブレボソームをつくる淋菌コロニーは、それ自体を寒天で成長させつ
つ、アッセイで使用することもできる。さらに、細菌を凍結乾燥して、再構成後
に使用するために貯蔵することもできる。
【0027】 (ブレボソームを使用するタンパク質の生産方法) 一実施態様では、本発明は多量のタンパク質の生産方法に関する。所望のタン
パク質の遺伝子は、淋菌において複製可能なベクターを使用して、ナイセリアに
導入することができ、形質転換又はコンジュゲーションにより淋菌に導入するこ
とができる。 タンパク質は、機能的にシグナル配列の存在又は不在に応じて、ブレボソーム
表面又は内部で発現し、所望のタンパク質の近傍でクローン化されうる。ブレボ
ソームの表面で所望のタンパク質を発現するのに適切なシグナル配列には、H8
リポタンパク質シグナル配列、PIII移出配列又はpiliA移入配列が含ま
れる。
【0028】 所望のタンパク質を発現するブレボソームは上述した方法に従って収集するこ
とができ、直接的に使用されるか、又は選択された他の薬剤に伴って使用される
。好ましくは、タンパク質は興味あるタンパク質に特異的なモノクローナル抗体
を使用して、免疫沈降により収集することができる。 発現のための適切なタンパク質には、サイトカイン類、例えばインターロイキ
ン1-12、及び外膜タンパク質、例えばOspA、p6又はPspAが含まれ
る。いくつかの異なる抗原又はタンパク質は、所望される場合は、同じ淋菌中で
同時に発現させることができる。
【0029】 (ナイセリアの遺伝子操作のためのベクター) この発明で使用可能なベクターの例には、限定されるものではないが、pLE
S2(Steinら. 1983, Gene 25:241-247)及びpLEE10(Sandlinら. 1993, I
nfect. Immun. 61:3360-3368)が含まれる。 上記ベクターを導入し、形質転換体を分析するための方法は、当業者の技量の
範囲内にある。
【0030】 (ブレボソームをベースとするワクチン送達系) さらなる実施態様では、本発明は、ヒト及び動物の患者におけるワクチン送達
系としてのブレボソームの使用に関し、動物患者には獣医学的動物、家畜動物、
及びコンパニオンペットが含まれる。本発明の理想的な菌種は、免疫優性成分を
持たないでブレボソームのアジュベンシー(adjuvency)能力を維持するために、
切断したLOSを生成する能力(Chamberlainら, Infect. Immun. 57:2872-2877
, 1989);淋菌ワクチン中に存在するならば、ワクチン中に存在する他の抗原の
免疫原性を妨害する免疫反応を刺激することが示されているPIIIタンパク質
の不在性(Young & Garbe, Res. Microbiol. 142:55-65, 1991);体液性及び細
胞免疫反応の両方の発達を刺激し、全身及び粘膜免疫の両方を提供する能力;容
易に成長し、種々の組換えタンパク質を安定して発現する能力;及び最後に最も
重要なことではあるが、自由にブレブ生成する能力を含む、所定の特徴を有する
ものである。 本発明のワクチンは、破傷風菌(Clostridium tetani)、肺炎連鎖球菌(Strepto
coccus pneumoniae)及びボレリア属ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)等
の細菌によって引き起こされる疾患に対して防御免疫反応を顕出させるために使
用することができる。
【0031】 本発明の淋菌は、患者に免疫応答を誘発させる所望の抗原の任意の異種性遺伝
子を発現し指示するように操作することができる。 本発明の淋菌は上記所望の抗原を有する多数のブレブを生成する。ついで、ブ
レボソームは細菌屑から精製し、ワクチンとして患者又は動物に賦形剤と共に又
は賦形剤なしに投与することができる。また抗原はブレボソームからも精製され
て、ワクチンとして使用される抗原をさらに提供することができる。 また、ワクチンは、公知の技術を使用し、担体にナイセリア変異体をコンジュ
ゲートさせることにより、作成することもできる。例えば、インフルエンザ菌莢
膜多糖類のための化学的にコンジュゲートした担体としてナイセリア誘導プロテ
オソームを使用するワクチンが、ヒトに使用されるものとして米国食品医薬品庁
によって認可されており、現在入手可能である。また、同様の方法で、本発明の
変異体を細菌性多糖類にコンジュゲートさせることもできる。
【0032】 ワクチンを一又は複数の免疫原性抗原又はブレボソームから調製することがで
きる。活性成分としての免疫原性抗原(類)を含有するワクチンの調製物は当業者
に既知である。典型的には、このようなワクチンは、溶液又は懸濁物のいずれか
として、注入可能なように調製され;また、注入前に液体に入れられる溶液又は
懸濁物に好適な固形形態を調製してもよい。活性な免疫原性成分は、しばしば、
製薬的に許容可能で活性成分と適合性のある賦形剤と混合される。適切な賦形剤
は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール等々、及びその組み
合わせである。さらに、所望される場合は、ワクチンは少量の補助物質、例えば
湿潤剤、pH緩衝剤、及び/又はワクチンの有効性を高めるためのアジュバント
を含有しうる。
【0033】 ワクチンは、常套的に、非経口的、注射、例えば皮下又は筋内注射により投与
される。投与の他の形態に適切なさらなる製剤には坐薬、及びある場合には経口
用製剤が含まれる。さらに、そこから精製される抗原(類)又はブレボソームを含
有するワクチンは他の免疫調節剤、例えば免疫グロブリンと共に投与してもよい
。 ワクチンは投与製剤と融和性のある方法で、かつ予防的に及び/又は治療的に
有効な量で投与されうる。投与されるべき量は、一般的に1回の投与当たり精製
された抗原又はブレボソームが5マイクログラム〜250マイクログラムの範囲
であり、これは治療される患者、抗体を合成する患者の免疫系の能力、及び所望
される保護度合いに依存する。投与されるのに必要な活性成分の厳密な量は医者
の判断に依存し、各患者に特有である。
【0034】 (ブレボソームを使用するアッセイ) 他の実施態様では、本発明は試料中における疾患に対する抗体の存在を検出す
る方法に関する。診断アッセイは、当該技術でよく知られている標準的な方法を
用いて、マイクロタイタープレート又は膜(例えばニトロセルロース膜)等の表面
(すなわち固体支持体)を被覆し、ここでブレボソームの全て又は一部は検出され
る疾患に特異的な抗原を含み、該疾患を患っていると推量される患者又は動物か
らの試料とそれを接触させることにより、構成されうる。試料中に、ブレボソー
ムとそれに特異的な抗体との間に結果として形成された複合体の存在は、当該分
野において一般的な任意の既知の方法、例えば蛍光抗体分光法又は測色法により
検出することができる。この方法は、例えばウイルス性疾患、例えば狂犬病又は
肝炎、細菌性疾患、例えばサルモネラ又は肺炎、真菌性疾患及び寄生虫性疾患の
診断に使用することができる。
【0035】 他の実施態様では、本発明は、当該分野においてよく知られており、疾患に対
する抗体の存在の検出における使用に適切である補助試薬及び所望の抗原(類)を
有するブレボソームを含む診断キットに関し、上記抗体は疾患が疑われる患者か
らの試料中に存在する。
【0036】 (実施例) 次の非限定的な実施例は本発明をより詳細に説明するものである。与えられた
実施例は、欠失誘導体の生産のための、非選択的スポット形質転換技術の使用を
記述している。形質転換体を検出するために過剰ブレブ形成フェノタイプを使用
し、過剰ブレブ形成淋菌中への淋菌種の形質転換方法を適用することは当業者に
は困難なことではない。 次の材料及び方法が以下の実施例で使用された。
【0037】 (菌株とプラスミド) この研究で利用された組換えクローンは以前より記載されており(Gunnら, 199
2, J. Bacteriol. 174:5654-5660)、図1に図示されている。FA19菌株はW.
Shafer博士、 Emory Universityから得られたものである。明確化のために、こ
の研究で使用された淋菌DNA R/M系に対して使用した命名法を表1に示す
【0038】 (培地とバッファー) 全ての淋菌培養は、ケロッグサプリメント(Kelloggら, 1963, J. Bacteriol.
85:1274-1279)及び炭酸水素ナトリウム(0.042%)が添加されたGCPブロ
ス中で、又はGCK寒天上で成長させた。大腸菌培養をLBブロス中で又はLB
プレート上で成長させた(Miller, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.)。必要な場合は、アンピシリン(35μg/ml)、カナ
マイシン(30μg/ml)又はクロラムフェニコール(35μg/ml)を成長培
地に添加した。ナリジキシン酸(1μg/ml)又はエリスロマイシン(2μg/
ml)を、必要に応じて淋菌成長培地に添加した。
【0039】 (化学薬品、試薬及び酵素) 化学薬品は分析用グレード又はそれ以上のものであり、Sigma Chemical社(St.
Louis, MO)から購入した。制限エンドヌクレアーゼはNew England Biolabs社(B
everly, MA)又はPromega社(Madison, MI)から購入し、製造者の使用説明書に従
い、供給されたバッファーと共に使用した。
【0040】 (遺伝子形質転換) 大腸菌の形質転換は、標準的なCaCl法によって達成した(Sambrookら, 1
989, Molecular cloning:a laboratory manual, 第2版. Cold Spring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。M13mp18及びM13
mp19複製型を標準的なCaCl法によってJM101に形質転換し、0.
3mMのIPTG、1mgのX-gal及び100μlの一晩のJM101培養
を含む3mlのオーバーレイにプレーティングした。淋菌を2つの方法の一方で
形質転換した。線毛化細胞を10mlのMgCl、1xケロッグ及び0.04
2%のNaHCOを含有するGCPブロス中に約1x10細胞/mlになる
まで再懸濁させた。DNA(1μg)がプラスされた細胞を、適切な培地にプレー
ティングする前に、37℃で3時間攪拌しつつインキュベートした。スポット形
質転換技術と呼ばれる第2の方法では、線毛化細胞を再懸濁し、10mMのMg
ClがプラスされたGCPにおける濁度(Klett=35)を緩和させた。この培
養を10−5及び10−6に希釈し(GCP+MgCl)、各希釈液10μlを
DNA(100ngの線形化又は高次コイル形態)と混合し、DNA/細胞混合物
を寒天プレート上に斑点状に付着させた。一晩インキュベートした後、斑点内の
個々のコロニーを取り出し、数回、分離のために画線を行った。ついで、一回分
離したコロニーを所望の遺伝子形成のためにスクリーニングした。
【0041】 (ENアーゼ/MTアーゼ活性の検出) 淋菌酵素と同じ部位を認識する市販のENアーゼ(イソ制限酵素)を使用して、
クローンが機能的MTアーゼ遺伝子を担持しているかどうかを決定した。機能的
MTアーゼを担持するクローンはその対応するENアーゼ又はイソ制限酵素によ
る切断に対して耐性があるべきである。S. NgoVIIを除く全ての系が、こ
の方法による検出を可能にするイソ制限酵素を有する。S. NgoVII系[5'
-GC(G/C)GC-3']に対して完全なイソ制限酵素は知られていないが、MT
アーゼは、その認識配列にシトシンが続くか、又はグアニンが先行し、可変位置
に適切な塩基を有しているならば、R. HaeIII(5'-GGCC-3')に対し
て防御する。また、S. NgoVII MTアーゼは全てのFnu4HI部位(5
'-GCNGC-3')の約半分での消化に対して防御する。
【0042】 またメチラーゼ活性はAP1-200-9菌株で検出された(Piekarowiczら, 19
91, Nucl. Acids Res. 19:1831-1835)。この菌株は、許容温度でメチル化され
たDNAにより活性化された場合にDNA損傷を生じる温度感受性mcrB対立
遺伝子を含む。ついで、DNA損傷は染色体dinD::lacZ融合を誘発する
。細胞は、潜在的MTアーゼ遺伝子を含むプラスミドで形質転換され、LB+A
mp(100μg/ml);X-gal(35μg/ml)プレートで、一晩42℃
で成長させられた。ついで、プレートを3時間の間、30℃にシフトさせ、42
℃で再度インキュベートした。機能的MTアーゼ遺伝子を有するプラスミドを含
むコロニーが、dinD::lacZ融合を活性化させ、結果としてブルーのコロ
ニーが得られる。
【0043】 ENアーゼ活性の存在は、一又は複数の次の方法:(1)λファージのEOPの
低減、(ii)pFT180の形質転換効率の低減、又は(iii)タンパク質単離
技術、により決定された。DH5αMCRから収集したλファージを使用し、ベ
クター単独又は推測ENアーゼコードクローンを有するDH5αMCRを感染さ
せた。EOPの低減をENアーゼ活性の測定として使用した。プラスミドpFT
180(DH5αMCRから単離)を、推測ENアーゼクローンを含むDH5αM
CR、及びベクターを単独で含むDH5αMCRを形質転換させるために使用し
た。対照に対する実験の形質転換頻度の低減をENアーゼ活性の評価として使用
した。ENアーゼはENアーゼ遺伝子を含む大腸菌から、Piekarowiczら, 1988,
Nucl. Acids Res. 16:5957-5972の方法により、FPLCを介して精製した。
【0044】 (サザンブロット分析) 消化された染色体DNAを、1%のTBEアガロースゲル上で電気泳動にかけ
、ReedとMann(1985, Nucl. Acids Res. 13:7207-7221)のアルカリ移動法を使用
してGenescreen(DuPont, Wilmington, DE)膜に移し、UV照射(1.5J/sq.
cm)により膜に固定した。ハイブリッド形成とブロットの可視化をLumi-P
hos及びGeniusキット(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を使
用して実施した。全ての工程は、次の事項を除いて製造者のプロトコールに従っ
た:膜を1xSSC、0.1%のSDS及び0.1xSSC、0.1%のSDS
を用いて65℃で洗浄し、1%の脱脂乾燥乳を阻止剤として、ハイブリッド形成
溶液中で使用し:抗ジゴキシゲニン抗体を1:5000の代わりに1:1000
0で希釈すること。コロニーブロッティングをSambrookら(1989)の方法により行
った。
【0045】 (pUP1-1の作成) 2つのプライマーをアニールし、ホスホリル化し、BamHI消化pUC19
にライゲートさせた。これらのアニール化プライマーのpUC19への導入は、
DNA配列決定により確認した。このベクターにおける多重クローニング部位の
配列は:5'..GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCAGA
ATTCAGACGGCTGATCC.......TCTAGAGTCGACCTG
CAGGCATGCAAGCTTGG..3'(配列番号:1及び配列番号:2)で
ある。上述した配列において、プライマー配列には下線を付し、淋菌取り込み配
列は濃くなっている。このプライマーはその内部にEcoRI部位を有しており
、よって、EcoRIでの消化は多重クローニング部位の半分が失われるが、淋
菌取り込み配列では失なわれない。
【0046】 (DNA配列決定/DNA配列分析) S.NgoI、II、及びVII R/M系の酵素をコードする遺伝子を、Se
quenaseキットを使用し、サンガー・ジデオキシ法により配列決定した(US
Biochemicals, Cleveland, OH)。DNAを一本鎖M13クローンと二本鎖プ
ラスミドクローンの組合せを使用して配列決定した。二本鎖鋳型を、次のプロト
コ−ルにより標識する前に変性させた。変性溶液(2μlのN NaOH、2mM
のEDTA)を、最終容量が22μlの1μgのプラスミドDNAに添加した。
室温での5分のインキュベート後、8μlの1Mトリス(pH4.5)を添加し、
DNAを沈殿させた。メリーランド大学バイオポリマー研究所及びウォルター・
リード陸軍研究所から得られたプライマーを、S.NgoI、II、VII及び
VIII遺伝子の配列決定に使用した。配列化反応を、LKB配列装置において
、4%のポリアクリルアミド、8Mの尿素ウェッジゲル上で電気泳動にかけた。 DNA配列決定をコンピュータプログラムGENEPRO(Riverside Scienti
fic, Seattle, WA)及びPC/GENE(Intelligenetics)を使用して分析した。
【0047】 (R/M 欠失変異体の作成) (S. NgoII) S. NgoIIクローン、pLV155をNcoI及びHpaIで消化し、N
coI末端をクレノウで満たした。この反応混合物を希釈し、ライゲートさせ、
DNAをDH5αMCP菌株に形質転換した。1272bpのNcoI-Hpa
I断片(pLV156)が欠失したクローンを含む形質転換体を同定した。このク
ローンはHaeIII消化に対する感受性と、これらのプラスミドを含む大腸菌
へのλファージのプレーティング効率の6の対数増加により証明されるMTアー
ゼ及びENアーゼ活性を欠いている(データ示さず)。FA19菌株をスポット技
術によりこのプラスミドで形質転換させ、得られたコロニーを取り出し、成長さ
せ、殆どの淋菌(陰性プラスミド)で見出される自然に生じる4.2Kbのプラス
ミド(陰性プラスミド)を単離した。陰性プラスミドがHaeIII消化を受けや
すい菌株が同定された(JUG025と呼ぶ)。
【0048】 (S. NgoV) S.NgoVクローン、pJM5をSspIで完全に消化し再ライゲートさせ
たが、これはMTアーゼ遺伝子及び推定ENアーゼ遺伝子に重複する722bp
領域が欠失していた。このプラスミド、pJM10は、BamHIでの消化に感
受性で、MTアーゼ活性の損失を実証している(データは示さず)。プラスミドp
JM10を淋菌株JUG025の形質転換に使用した。淋菌陰性プラスミドはS
. NgoVを含んでいないので、染色体中にこの欠失を導入した形質転換体を、
欠失SspI断片の一つを含む、プラスミドpUCV51に対するハイブリッド
形成の欠乏度合いにより同定した。このプラスミドにハイブリダイズしていない
いくつかのコロニーを同定した。一つの菌株がさらなる研究のために選択され、
これをJUG026と称する。
【0049】 (S. NgoIV) S. NgoIVクローン、pCBB49.1をBg1Iを用いて完全に、Ss
pIにより部分的に消化した。Bg1I末端をT4DNAポリメラーゼで平滑に
し、DNAをライゲートさせた。形質転換体をスクリーニングし、200bpの
Bg1I-SspI断片を失なったクローンを同定した(pCBB49.17)。
このクローンはMTアーゼ及びENアーゼ活性の両方が欠乏している(データは
示さない)。pCBB49.17の全挿入物を含むNotI断片をp[Blues
cript SK-中にクローニングした。全挿入物を再度含む、このクローン
のKpnI-SacI断片を、プラスミドpUP1-1中にクローニングし、プラ
スミドpUP49.17を生成した。この工程は、淋菌取り込み配列がこのクロ
ーンにおいて同定されなかったので必要であった。菌株JUG026をスポット
技術によってこの作成物で形質転換させた。いくつかのコロニーを取り出し、成
長させ、陰性プラスミドをこれらの培養から単離した。NgoMI消化を受けや
すい陰性プラスミドを含む菌株JUG027を同定した。
【0050】 (S. NgoVII) S. NgoVIIクローン、pE63をSalIで消化した(5'伸長部をクレ
ノウで満たした)。このDNAをSspIで部分的に消化した(ベクターには一つ
のSspI部位が存在する)。DNAをライゲートさせ、ENアーゼとMTアー
ゼ活性を両方とも欠くクローンを同定したところ、1159bpのSalI-S
spIフラグメント(pE640)を損失していた(データは示さない)。プラスミ
ドpE640をプラスミドpUP1-1にライゲートさせ、両方のプラスミドの
EcoRI二量体を同定した(pPUF7)。菌株JUG027をプラスミドpP
UP7形質転換させ、欠失が取り込まれた形質転換体をプラスミドpE641(
欠失Sal-SspI断片を含む)に対するハイブリッド形成の欠乏度合いにより
、コロニーブロッティングにより同定した。得られた菌株をJUG028と標識
した。
【0051】 (S. NgoI) S. NgoIクローン、pUPK30をDraIで消化した。挿入物には3つ
のDraI部位が存在しており、プラスミドベクター(pK18)にはなかった。
部分的(652bp)DraI欠失を含むクローンを同定し、pUPK32と名付
けた。このクローンはHaeII消化に対する感受性により示されるMTアーゼ
及びENアーゼ活性を欠いており、これらのプラスミドを含む大腸菌へのλファ
ージのプレーティング効率が3対数減少している(データは示さない)。菌株JU
G028をpURK32で形質転換させ、可能な形質転換体を、652bpのD
raI断片を含むプラスミドで、コロニーブロットを探査することにより欠失の
取り込みをスクリーニングした。プローブとハイブリッド形成していなかったい
くつかのコロニーが同定された。さらに分析するために取り上げたコロニーをJ
UG029と呼んだ。
【0052】 (結果) (R/M遺伝子クローンの分析) S.NgoI、II、IV、V及びVII系のDNA MTアーゼをコードす
る組換えクローンは以前に報告されている(Gunnら, 1992; Sullivan及びSaunder
s, 1988; Steinら, 1995)。これらの系の特異性は表1に示す。S.NgoII
及びS.NgoIV R/M系をコードするこれらの組換えクローンの二つは特
徴づけられ配列決定されている(Sullivan及びSaunders, 1988; Stein等, 1992
)。組換えプラスミドからのS.NgoI、II、IV及びV系のMTアーゼ遺
伝子の発現は、調べられている系のイソ制限酵素での消化に対するこれらのプラ
スミドの耐性を実証することにより証明された。NgoVII R/M系におけ
る欠失の検出は、この酵素に対する完全なイソ制限酵素がないので、間接的であ
る。酵素Fnu4HIは配列GGNCCを認識する。これは、Fnu4HI部位
の1/2がM.NgoVIIにより保護されることを意味している。淋菌からの
M.MgoVIIの喪失により、より多くの部位がこの酵素により切断されるこ
とになる。M.NgoVIIを欠く菌株由来の染色体DNAがFnu4HIで消
化されると、得られるバンドは一般に低分子量のものになる。
【0053】 これらのプラスミド上でのメチラーゼ遺伝子の位置は、DNAメチラーゼテス
ター株において陽性のシグナルを誘発する様々な欠失サブクローンの能力を試験
することにより決定することができる。機能的ENアーゼ遺伝子の存在は次の手
順の少なくとも一つにより決定することができる:そのクローンを含む大腸菌細
胞によるλファージのプラーク形成効率の減少を証明する;トランスフォーミン
グDNAを制限するクローン含有細胞の能力を示す;又はプラスミドを含む細胞
からENアーゼ活性を持つタンパク質を単離する。各系に対するこれらのアッセ
イの少なくとも一つを使用して、我々はNgoI、II、IV及びVIIをコー
ドするクローンにおけるENアーゼ及びMTアーゼ活性の双方を検出することが
できたが、NgoVクローンに対するENアーゼ活性は検出できなかった(デー
タは示さず)。欠失及びサブクローン分析を使用して、我々はこれらの遺伝子を
コードしているDNAを局在化した(制限酵素切断地図に対する図1を参照)。
DNA配列分析により、NgoVクローンはENアーゼ活性を欠いていたが、M
Tアーゼ遺伝子の下流に部分的ORFを含み、このORFが他のR/M系中でE
Nアーゼ遺伝子と同様に位置していることが示された。
【0054】 (プラスミド欠失の作成と染色体欠失を含む淋菌性形質転換体の同定) 形質転換技術でR/M欠乏淋菌性株を作成するためには、トランスフォーミン
グDNAは、淋菌性取り込み配列を含まなければならない。NgoIV及びNg
oVII R/M系をコードする我々のクローンのDNA配列において淋菌性取
り込み配列は同定されなかったので(データ示さず)、淋菌性取り込み配列を含
むプラスミドベクターを作成した(pUP1-1)。これは、pUC19のBa
mHI部位中にこの配列を含むリンカーを挿入することにより達成された。pU
C19は淋菌において複製しないので、対象のDNA欠失がこのプラスミド中に
クローニングされ、ついで形質転換により淋菌中に導入され、欠失が、相同的組
換えを介して染色体に入るか、細胞から失われる。
【0055】 同義遺伝子を分裂させることを望んだので、選択可能マーカーの挿入による所
望の遺伝子の不活性化は実際的ではなかった。制限酵素切断地図からの情報を使
用して、S.NgoI、II、IV、V、及びVII系の連鎖MTアーゼ及びE
Nアーゼ遺伝子をオーバーラップさせる欠失を作成した。図1は各プラスミドク
ローンのDNA挿入断片と各挿入断片で欠失したセグメントを示す。これらの欠
失は予想されたENアーゼ及びMTアーゼORFに対して特異的であり、1.8
Kb(NgoII)から200bp(NgoIV)の範囲のサイズであった。全
ての欠失は、少なくとも100bpの淋菌性DNAが欠失に隣接して存在するよ
うに作成された。これは染色体の相同的領域での効率的な組換えに対して必要な
最小サイズである(DCS、未発表見解)。
【0056】 染色体上へのこれらの欠失の成功した組換えに対する選択はないので、所望の
欠失を獲得した形質転換体を同定するために次の技術を使用した。この手順は全
ての淋菌性細胞がコンピテントで、細胞外DNAを取り上げるという事実に基づ
いている。このため、限られた数の細胞を過剰量のDNAと共にインキュベート
した場合、全ての細胞がトランスフォーミングDNAを獲得すべきである。欠失
を獲得した形質転換体を同定するチャンスはその染色体中へ欠失を導入する淋菌
の効果によってのみ制限される。線毛化細胞をプレートから拭き取り、GCPブ
ロス+10mMのMgCl中に再懸濁させ、濁度を調節した(Klett=35)
。細胞をボルテックスし、GCP+MgClに希釈した。細胞の10倍の希釈
液を調製し、各希釈液の10μlの一定分量をおよそ0.1−0.5μgのDN
Aと混合し、DNA/細胞混合物の斑点を寒天板の表面上につけた。一晩のイン
キュベーション後に、斑点内の分離されたコロニーを取り上げ、再び画線した。
単一のコロニーを、欠失の導入についてコロニーを試験する前に少なくとも2回
再び画線した。これは二つの理由から必要である:(i)DNAを獲得する前に
細胞は分割され得、その染色体中に欠失を組換えたものと、組換えなかったもの
の細胞の混合集団が得られる;及び(ii)線毛化された淋菌凝集塊と殆どのコ
ロニーは単一細胞から取り出されない。この方法を使用して、淋菌種FA19が
各欠失作成物で首尾よく形質転換された。この形質転換法はうまく機能し、各実
験において調べたコロニーの少なくとも20%が所望の欠失を獲得した。
【0057】 二つの方法を使用して、所望の欠失が染色体中に導入されたことを証明した。
染色体DNAを可能性のある形質転換体から単離し、欠失されている系のイソ制
限酵素と共にインキュベートした。このDNAの消化の成功はMTアーゼの機能
の喪失を示しており、欠失が導入されたことを立証している。機能の喪失が欠失
によるものであり挿入不活化によるものではないことを証明するために、我々は
、プラスミドクローンから欠失されたDNA断片の一部で可能な形質転換体のコ
ロニーブロットを探索した。プローブにハイブリダイズできなかったコロニーは
欠失を組み込んだに違いない。研究下のメチラーゼをもはや発現しなかった試験
されたコロニーの全てがメチラーゼ特異的プローブに結合した。
【0058】 サザンブロット法を実施してFA19及びJUG029(NgoI、II、I
V、V及びVII R/M系の欠失を含む株)の消化を比較した。各セットが適
当な酵素で消化され、電気泳動され、ブロットされた。膜を条片に切断し、各条
片を、5つのR/M系の各々の欠失領域を横切るDNAで探索した。セット1を
DraIで消化し、pUPC30のPstI-XhoI断片で探索した。JUG
029からの染色体DNAは652bpのDraI断片を失っていた。セット2
では、NgoIIを調べた。JUG029は欠失の橋を架ける1414bpのS
au3AIバンドを失っていた。第2のハイブリダイズバンドはFA19バンド
より大きかった。他の酵素での染色体DNAのサザンブロットの続く分析により
、欠失がNcoI部位の更に上流に伸長することが証明される(データは示さず
)。セット3ではNgoIV系を調べた。SspI消化染色体DNAは、400
bpのSspI断片の予想された喪失と、最も大なるSspI断片のサイズの続
く250bpの増加を示した。セット4では、染色体DNAをRsaIで消化し
てNgoV欠失を確認した。欠失株は、位置1075と1527のRsaI部位
の喪失のため452bpと684bpの断片を欠いている。最も大なる断片の予
想されたサイズの増大をまた観察することができる。染色体DNAをEcoRI
+HindIIIで消化した。ハイブリダイズするEcoRI+HindIII
断片はFA19のものより1.2Kb小さい。
【0059】 JUG029において欠失した5つのR/M系の生物MTアーゼ活性の喪失を
証明するために、染色体DNAを単離し、欠失した系のイソ制限酵素と共にイン
キュベートした。染色体DNAの消化の成功はMTアーゼの機能喪失を示してい
る。FA19染色体DNAはNgoI、II、IV及びVのイソ制限酵素で消化
されないまま残る一方、JUG029の消化は完了したように見えた。NgoV
II系を分析すると、JUG029から単離された染色体DNAが、FA19か
ら単離された染色体DNAより大なる度合いまで消化されるように思われる。併
せると、これらのデータは、適切な欠失が染色体中に全て成功裡に導入され、J
UG029が適切なメチル化欠陥フェノタイプを保有していることを証明する。
【0060】 (FA19対JUG029の形質転換頻度の比較) 5つのENアーゼの喪失により淋菌が大腸菌中で増殖したDNAでの形質転換
により受け入れられるようになるかどうかを決定するために、JUG029及び
FA19をpSY6及びpRDL2で形質転換した。プラスミドpSY6は変異
体DNAジャイレースをコードするDNAを含む(Steinら, 1991)。この変異
体が染色体中に導入されると、細胞はナリジクス酸に対して耐性になる。このプ
ラスミドでの形質転換は、耐ナリジクス酸形質転換体が線形化プラスミドDNA
と宿主染色体の間での組換えの結果得られるので、内因性ENアーゼにより影響
を受けるべきではない。表2に示したデータは、pSY6でのNalへの形質
転換頻度は両方の菌種に対して同様であった(FA19に対して1.8x10 対JUG029に対して1.7x10−4)。
【0061】 表2 FA19とJUG029によるインビボでの制限の試験 a 淋菌種を、適当な培地上に配する前に振盪して、35ngのpSY6又は0
.5μgのpRDL2で形質転換した。形質転換頻度は1CFU、1ml当たり
の形質転換体の数である。示した頻度は一回の実験からのものである;しかし、
実験を3回繰り返したが、試験の間に有意な差異はなかった。 b pSY6は、宿主染色体との組換え時に、耐ナリジクス酸性を細胞にもたら
すDNAジャイレース遺伝子の変異体型を含む。 c pRDL2は、取り込み配列を含む456bpの淋菌DNA挿入断片を含む
pLEE20誘導体(Ery)である。このプラスミドが十分にMTアーゼ成
熟淋菌種(この場合はF62)から単離される場合、それはメチル化され、形質
転換時に宿主の制限を受けるべきではない。
【0062】 プラスミドが淋菌を首尾よく形質転換するためには、再び円形化し機能性プラ
スミドを形成しなければならない。取り込み配列の一つのコピーを含む456b
pの淋菌DNA断片を有するpLEE20誘導体であるプラスミドpRDL2は
、大腸菌又は淋菌中で成長させうる。従って、メチル化(淋菌由来)及び非メチ
ル化(大腸菌由来)pRDL2の双方を形質転換アッセイにおいて使用すること
ができる。メチル化pRDL2は淋菌の形質転換時に制限されるべきではないが
、非メチル化pRDL2は宿主制限を受けうる。メチル化pRDL2を使用する
プラスミド形質転換頻度はFA19とJUG029に対して同様であった(それ
ぞれ2.2x10−6と4.1x10−6)。非メチル化pRDL2での形質転
換の結果、JUG029では少しの形質転換体(1.5x10−6)が得られた
が、FA19では得られなかった(<1.6x10−9)。このデータは、JU
G029はトランスフォーミングDNAをなお制限することができるが、その制
限能力に計測可能な減少が検出されうることを立証している。これは、残りのE
Nアーゼの少なくとも幾らかが宿主媒介性制限に関与しうることを示している。
【0063】 (参考文献) Biswasら, (1977) J. Bacteriol. 129:983-992。 Biswas及びSparling, (1981) J. Bacteriol. 145:638-640。 Butler及びGotschlich, (1991) J. Bacteriol. 173:5793-5799。 Drazekら, (1995) J. Bacteriol. 。 Goodman及びScocca, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:6982-6986。 Gunnら, (1992) J. Bacteriol. 174:5654-5660。 Kelloggら, (1963) J. Bacteriol. 85:1274-1279。 Korchら, (1983) J. Bacteriol. 155:1324-1332。 Mathis及びScocca, (1984) J. Gen. Microbiol. 130:3165-3173。 Miller, (1982) Experiments in molecular genetics。Cold Spring Harbor Lab
oratory, Cold Spring Harbor, N.Y.。 Piekarowiczら, (1988) Nucl. Acids Res. 16:5957-5972。 Piekarowiczら, (1991) Nucl. Acids Res. 19:1831-1835。 Reed及びMann, (1985) Nucl. Acids Res. 13:7207-7221。 Sambrookら, (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2版, Cold Sp
ring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.。 Sandlin及びStein, (1994) J. Bacteriol. 176:2930-2937。 Soxら, (1979) J. Bacteriol. 138:510-518。 Sparling (1966) J. Bacteriol;. 124:1364-1371。 Steinら, (1988) Role of restriction and modification on genetic exchange
in Neisseria gonorrhoeae. In Gonococci and Menigococci. Poolmanら(編),
5th International Neisseria Conference. Kluwer Academic Publishers, Dord
recht, Netherlands. pp.323-327。 Steinら, (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:622-626。 Stein (1991) Can. J. Microbiol. 37:345-349。 Steinら, (1992) J. Bacteriol. 174:4899-4906。 Sullivan及びSaunders, (1988) Determination of the endonuclease and methy
lase content of Neisseria gonorrhoeae strain P9 and the cloning therefro
m of two functional methylase genes. In Gonococci and Meningococci. Pool
manら編 5th International Neisseria Conference. Kluwer Academic Publishe
rs, Dordrecht, Netherlands. pp.329-334。
【0064】 (実施例2) (材料と方法) (細菌種) 淋菌F62はP. Frederick Sparling(University of North Carolina
, Chapel Hill, NC)から得た。大腸菌DH5MCRはBethesda Research Labora
tories(Bethesda, MD)から得た。淋菌は、エリスロマイシン(2μg/ml)、
バンコマイシン(3μg/ml)、コリスチン(7.5μg/ml)、及び必要
に応じてニスタチン(1.25単位/ml)を含むGCK寒天上のケロッグ溶液
(White,L.A., D.S.Kellogg,Jr., 1965, Appl. Micro. 13:171-74)及び0.0
42%の炭酸水素ナトリウムを補填したGCPブロスで成長させた。大腸菌DH
5MCRはアンピリシン(30μg/ml)、カナマイシン(30μg/ml)
、エリスロマイシン(300μg/ml)、及び必要に応じてx−ガル(35μ
g/ml)を含むLB寒天又はLブロス中で成長させた。
【0065】 (化学薬品、試薬、及び酵素) 制限酵素とT4DNAリガーゼをNew England Bi
olabs(Beverly, MA)から購入した。形質転換に使用する化学薬品は試薬グレード
又はそれ以上のものであり、特に他のものと特記しない場合は、Sigma Chemical
Co.(St. Louis, MO)から購入した。 (DNA操作) プラスミドDNAはアルカリ法の手順によって単離し、塩化セシ
ウム−臭化エチジウム勾配で精製した(Birnboim & Doly, 1979, Nucl. Acids.
Res. 7:1513-1523)。プラスミドDNAはCaCl形質転換法(Sambrookら,
1989, Molecular Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring H
arbor, NY.)を使用して大腸菌中に導入した。
【0066】 (DNA配列決定) SequenaseバージョンII配列決定キット(United States Bio
chemicals, Clevelan, OH)及び−[35S]DATP(New England Nuclear, DuP
ont, Bostonm MA)を使用してDNA配列決定反応をサンガージデオキシ法(Sang
erら, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74:5463-5467)により実施した。
PCR配列決定は、CircumVent熱サイクルジデオキシDNA配列決定キット(Ne
w England Biolabs, Beverly, MA)を使用して指示されたようにしてPCR産物
に対して直接実施した。配列決定産物を、最後の10cmに0.6mmのウェッ
ジ(最大厚み)を持つ55cmx0.2mmの4%のアクリルアミドゲル(1x
TBEバッファー(100mMトリス、0.083Mホウ酸、1mMのEDTA
)中の7Mの尿素)で分離した。ゲルを固定し、乾燥し、36時間XOMATx
線フィルム(コダック)にさらした。
【0067】 (ポリメラーゼ連鎖反応法) 推奨された条件下でPerkin Elmer Cetus (Norwalk,
CT)からのGeneAmpPCRキットを使用して実施した。100lの反応を94℃
での一分の変性で実施し、続いて50℃で一分のアニールと72℃で一分の伸展
を全体で30サイクル実施した。PCR及び配列分析の双方に対してこの実験で
使用したプライマーはMedImmuneで作成された。H.8RS1を増幅するために
使用したプライマーの配列は:H.8−5’、CCCTGAATTCAAATCATACTGAATTAT(
配列番号:3);H.8−3’、CCGATCAGTTCAAAACTGC(配列番号:4)であっ
た。H.8中にSphI部位を付加するために使用したプライマーの配列は、GG
CTGCATGCGGCGGAG及びCCGCCGCATGCAGCCAAAG(配列番号:5)であった。ospA
を増幅するために使用したプライマーの配列は:OspA−5’、ATTCCAGTCGAC
AAGCAAAATGTTAGCAGC(配列番号:6);OspA−3’、ATTCCAGCATGCTTATTTTA
AAGCGTTTTTAATTTC(配列番号:7)であった。
【0068】 (コンジュゲーション) プラスミドは大腸菌S17−1とのコンジュゲーション
により淋菌種F62中に導入された(Nassif, X.,D.Puaoi,及びM.So.1991. Tran
sposition of TN1545-3 in the pathogenic Neisseriae: a genetic tool for m
utagenesis. J. Bact. 173:2147-2154)。コンジュゲーションはフィルタ接合に
より実施し、3時間の間進めた。淋菌トランスコンジュガントを選択するために
、フィルタ上の細胞をGCPブロス中に再懸濁させ、エリスロマイシン、バンコ
マイシン、ニスタチン及びコリスチンを含むGCK上にプレーティングした。
【0069】 (ブレボソーム分離) (ウェスタンブロット法) ブレボソームライセート(およそugの全タンパク質
)をOspA特異的mAb H5332でのSDS-PAGE及びウェスタンブロ
ットにより分析した(Green, B.A., T. Quinn-Dey,及びG.W. Zlotnick. 1987. B
iologic activities of antibody to a peptidoglycan-associated lipoprotein
of Haemophilus influenzae against multiple clinical isolates of H. infl
uenzae type b. Infect. Immun. 55:2878.)。OspAの発現を、L. Erdile博
士(Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA)により親切にも提供され
た精製OspA糖タンパク質と比較した。H5332と反応するタンパク質バン
ドを、増強化学発光検出(ECL)システム(Amersham Corp., Arlington Heig
hts, IL)を製造者の指示に従って使用して二次抗体(西洋わさびペルオキシダ
ーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG)とのインキュベーション後に可
視化した。
【0070】 (トリトンX-114分画) ブレボソームをPBS中に懸濁させ、超音波処理に
より分裂させ、トリトンX-114(TX114)を2%(容積/容積)になる
まで添加して4℃で溶解した。不溶性材料(細胞壁リッチ化画分)を10000
0xgでの遠心分離により沈降させ、上清を洗浄剤相分割にかけた(Bordier, C
. 1981. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 s
olution, J. Biol. Chem. 265:1604.)。TX114溶液を簡単に暖めた後(3
7℃)、水性相と洗浄剤相の分離を短い遠心分離により達成した。2相を3回逆
抽出し、代表的なタンパク質を9容量のアセトンを添加して沈殿させた。各培養
上清の一部をSDS-PAGEにかけ、ニトロセルロースに移し、抗OspA m
Ab H5332でブロットした。
【0071】 (ブレボソーム作成物の免疫原性) 血清を免疫化後の様々な時間に免疫マウスの
尾静脈から収集して、ELISAによる抗体応答をモニターするために各グルー
プのマウスに対してプールした。ELISAプレート(Immunolon4)を4℃で
一晩かけて又はその温度で又は10μg/mlで炭酸塩バッファー(pH9.6
)に懸濁した50ulの全ボレリア(株31)で被覆した。ついで抗原溶液を取
り除き、プレートを室温で1時間、0.1%のTween-20(PBS-T20)を
有するPBS中の阻止溶液(0.5%BSA及び0.5%の脱脂乾燥乳)と共に
インキュベーションした。1/200で初めて血清の2倍の連続希釈を阻止溶液
において行って、各希釈液50ulを抗原被覆プレートの二つ組のウェルに加え
た。1時間の室温でのインキュベーション後に、プレートをPBS-T20で洗
浄し、0.5ulのペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスIgG(Kirkegaard及び
Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD)二次抗体の1:1000のPB
S-T20希釈でインキュベートした。2,2'-アジノ-dif[3-エチル-ベンズチ
アゾリンスルホナート]基質試薬(Kirkegaard及びPerry Laboratories, Inc.)
で発色させ、ELISAリーダー(dynatech)で405nmの吸光度により色を
測定した。終末点力価はA405値が等価な濃度に希釈された正常なマウス血清
に対する値の2倍であった最も高い希釈度として定義した。
【0072】 (抗原投与研究) 抗原投与用量は低域通過B.ブルグドルフェリsh.2株の単
一コロニーの増殖により導いた(Schwan, T.G., W. Burgdorfer, M.E. Crumpf,
及びR.H. Karstens. 1988. The urinary bladder, a consistent source of Bor
relia burgdorferi in experimentally infected white-footed mice (Peromysc
us leucopus). J. Clin. Microbiol。免疫化したマウスと対照マウスに尾の基
部に10スピロヘータで皮内的に抗原投与した。これはB.ブルグドルフェリ
Sh.2株のおよそ100ID50単位を示した。マウスは抗原投与後13日で
殺し、膀胱と脛骨関節組織を収集し、以前に記載されているように(Erdile, L.
F., M. Brandt, D.J. Warakomski, G.J. Westrack, A. Sadziene, A.G. Barbour
,及びJ.P. Mays. 1993. Role of attached lipid in immunogenicity of Borrel
ia burgdorferi OspA. Infect. Immu. 61:81)BSK-II培地で培養した。ス
ペロヘータの存在に対して異相差顕微鏡分析により培養を14日間モニターした
。任意の培養における20高倍率当たりの一又は複数のスペロヘータの存在は陽
性感染として評点がつけられた。
【0073】 (結果) (OspAを発現する淋菌の作成) 淋菌はその正常な外膜タンパク質の一つとし
てリポタンパク質H.8を生産する。淋菌の外膜においてこのタンパク質を過剰
発現することができるかどうかを決定するために、このタンパク質をコードする
遺伝子を高コピー数のプラスミドpLEE20上にクローニングした。このタン
パク質をコードするDNA配列を、株R10に対して発表された配列情報(Baeh
retら, 19 , Mol. Microbiol. 3:49-55)に基づいて淋菌種F62からPCRを
介して増幅させた。コード配列のDNA配列5’がEcoRI部位を含み、遺伝
子のDNA配列3’がHindDIII部位を含むようにしてプライマーを設計
した。増幅されたDNAを消化し、EcoRIで消化されHinDIIIで部分
的に消化されたpLEE20中に挿入した。ライゲートしたDNAを大腸菌DH
5MCR中に導入し、単位複製配列を含むエリスロマイシン耐性形質転換体が同
定された。DNA配列をこれらのクローンの一つから決定し、増幅したDNAが
H.8をコードしていたことを証明した。データは、クローン化遺伝子がH.8
であったことを示している(データは示さず)。
【0074】 H.8コード作成物を形質転換により大腸菌株S17-2中に導入した。この
株を使用して、コンジュゲーションにより淋菌F62中にpLEE20-H.8
を移動させた。トランスコンジュガントを、エリスロマイシンを補填したセイヤ
ーマーチン培地上で選択した。F62(pLEE20-H.8)のSDS-PAG
Eプロフィールは、この株が野生型株にみられるよりも多くのH.8を発現した
ことを示している。これらの実験は、淋菌においてリポタンパク質を過剰発現さ
せることができることを実証している。 淋菌がボレリア属OspAシグナル配列を正しくプロセシングすることができ
ることを確実にするために、タンパク質は融合タンパク質として発現された。こ
の融合を行わしめるために、SphI部位を、H.8配列中の、脂質化シグナル
となるシステインに対応する部位に導入した。OspAをコードしているDNA
配列をPCRによりpTRH44(Bergstrometら, 1989, Mol. Microbiol. 3:4
79-486)から増幅させた。プライマーは、OspAにおいて脂質化されるシステ
インに対応する位置にSphI部位を導入するように設計された。遺伝子の3’
末端に対応するプライマーはまたSphI部位を含んでいた。単位複製配列とク
ローニングベクターをSphIで消化させ、ライゲートさせ、大腸菌DH5MC
R中に導入した。挿入断片を含むプラスミドを同定し、作成物のDNA配列をD
NA配列分析により証明した。このプラスミドを大腸菌S17-2中に導入し、
ついで上述のようにして、コンジュゲーションにより淋菌中に導入した。
【0075】 (定量化と局在化) ブレボソームにおいて発現されたOspAの量を、ブレボソ
ームへの抗OspA mAbの結合のレベルを精製OspAへの結合と比較した
定量的ウェスタンブロットアッセイを使用して定量化した。その分析の結果は、
OspAが全ブレボソームタンパク質のおよそ0.2%を占めていることを示唆
している。 リポタンパク質発現ベクターからのOsoA遺伝子の発現により組換えOsp
Aの脂質アシル化が生じるかどうかを決定するために、ブレボソームをトリトン
X-114洗浄剤相分割分析にかけ、膜結合リポタンパク質に対して濃縮した(B
ordier, 1981, J. Biol. Chem. 256:1604; Radolfら, 1988, Infect. Immun. 56
:490.)。H8脂質化シグナル配列と共同してのOspAタンパク質の発現によ
り、洗浄剤可溶性画分に専ら位置した生成物が得られ、これは脂溶性タンパク質
が高度に濃縮されていた。この発見は、OspAとのH8シグナル配列の融合に
より、効率的に搬出され、ブレボソーム膜において翻訳後的に修飾された生成物
が得られることを示している。
【0076】 (免疫化実験) 5つの異なったマウス株のパネルを、OspA発現ブレボソーム
での免疫化に続く抗OspA抗体応答について分析した(記号sdlfdjas
llkfj)。結果は、耐エンドトキシン座と他の座の両方がOspA発現ブレ
ボソームに対する免疫応答を調節しうることを示唆している。しかして、C3H
/HejLPS反応性低下菌株はOspAブレボソームでの追加免疫に続いて実
質的な抗OspA応答を生じたが、関連したC3HeB/Fej LPS応答性
菌株は生じなかったが、これは、ブレボソームに応答してのエンドトキシン耐性
座の関与を示唆している。また、幾つかの菌株は、それらが全てLps対立遺伝
子持っていても、ブレボソーム発現OspAに対して異なった応答を生じ、この
現象における非Lps関連座の関与を示唆している。しかして、BALB/cマ
ウスは、OspAブレブでの追加免疫に続いて大幅なOspA応答を生じたがS
JL/JとC57BL/6は生じなかった。
【0077】 (抗原投与研究) 保護性免疫応答を誘発するOspA発現ブレボソームの能力を
、動物を免役し、2回の追加免疫に続く2週のOspA及びボレリア全細胞ライ
セートに対するその抗体応答を評価することにより調べた。結果は、OspAブ
レブで免役された全ての動物が検出可能な抗OspA応答を生じたことを示し、
4/5の動物が1/3200を越える抗体価を証明した。これらの同じ4種の動
物はまた全ボレリアから調製されたライセートに対して反応性を示した(5番目
の動物は検出可能な抗ボレリア応答を示さなかった)。非組換えブレボソームで
免役された動物の何れも検出可能な抗OspA又は抗ボレリア応答を生じなかっ
た。 これらの動物は、生ボレリア属に暴露された。暴露2週間後に、非組換えブレ
ボソームで免役した動物の全てがその膀胱及び脛骨関節中に回収可能なボレリア
属を含んでいた。これに対して、回収可能なボレリア属はOspAブレボソーム
で免疫された1/5の動物からのみ得られた。このグループにおいて培養可能な
ボレリア属は最も低い抗OspA価を持つ動物からのみ得られた。 免役されたマウスのおよそ40%が1:400を越える抗体価を達成した。こ
の抗体価を持つマウスの100%が暴露から防御された。
【0078】 (考察) この実施例のデータは組換え淋菌ブレボソームのワクチン送達系としての使用
可能性を実証している。ブレボソームは生きている送達系と生きていない送達系
の双方の多くの望ましい特徴を表す:それらは、若い又は免疫無防備状態の個体
での生送達系の使用に付随する多くの不具合を解消する一方、面倒な変性の恐れ
のある精製手順を使用しないで容易に精製される生体膜において抗原を発現する
ように操作されうる。 ここに示した実験では、ナイセリアH8表面抗原の脂質化シグナル配列に結合
したボレリア属ブルグドルフェリのOspA抗原からなる融合タンパク質が発現
された。内因性脂質化シグナルを使用してこの融合タンパク質を作成する意図は
ナイセリア内の異種シグナルの伝達及び/又はプロセシングにおける潜在的な問
題を避けることにあった。しかし、インフルエンザ菌からの脂質化表面タンパク
質P6がまたそれ自身の脂質化シグナル配列の制御下で成功裡に発現され、洗浄
剤可溶型でのブレボソーム表面へのこの抗原の局在化を証明し、ナイセリアが異
種細菌脂質化シグナルを認識しプロセシングしうることを示唆している。
【0079】 同義遺伝子座が淋菌ブレボソームにより提示される抗原に対する応答性を決定
することに関与していることは明らかである。限られた株のレビューでは、Lp
s座と他の地図にない座の双方がOspAに対する応答性を制御するように思わ
れる。LPSに関連する既知のアジュバント特性のために、この作成物により誘
発される免疫応答に対するLps座の効果をみるのはおそらく驚くべきことでは
ない。 ここに記載した実験では、この抗原に対する応答がOspA発現ボレリア属分
離体での投与に対して保護性であることが分かったので、試験免疫原として使用
された。しかし、必ずしも全てのボレリア属ブルゴドルフェリ分離体がこの抗原
を発現するのではなく、最初はOspAを発現するいくつかのマダニが持つ分離
体が血液食餌に続いて発現を停止することが分かった。他のボレリア属の抗原は
、OspAとの組み合わせで、OspA単独の場合よりもより広範に効果的な免
疫応答を誘発しうる。
【0080】 これらの免疫原性実験の結果は、ブレブソームの表面上に発現された異種リポ
タンパク質に対してIgG応答が誘発されうることを示している。OspA特異
性Th又はCTLを誘発するこれらの調製物の能力は調べなかった。高レベルの
IFN-g及びIL-2が、ブレボソーム免疫化マウスからのナイセリアライセー
ト刺激リンパ節細胞の培養上清に観察されたがIL-4は観察されなかったが、
これはブレボソームが強いTh1応答を刺激しうることを示唆している。これら
の調製物がCTL応答を刺激するという可能性はナイセリア中への既知のCTL
エピトープをコードする抗原のクローニングを待つ。ブレブソーム発現抗原は主
にエンドサイトーシス経路を通じてプロセシングされ、よってMHCクラスII
分子において主に提示されるようである。
【0081】 これらの研究において使用されたブレボソームは明らかな毒性のない保護性の
抗体応答性を作り出した。しかし、ここで報告されたものよりも3−5倍多い用
量では有意な毒性が生じた。柔皮波打ちが30mg/動物を越える用量で伴い、
あるブレブソーム調製物は、特に追加免疫後に腹腔内に与えられると、100m
g/動物又はそれ以上の用量で致命的であった。これらの毒性効果は、抗原を鼻
腔内的に与えることによっても、あるいは腹腔内的にミョウバンで与えられる場
合にも消失しなかった。将来の実験は、毒性に対する他の投与経路の効果、並び
にブレブソームの表面上のLOSの変調レベルがブレブソーム調製物の毒性に対
して示す影響を調べるものである。この点において、種々のレベルのLOSをそ
の表面上に発現する一連のナイセリア変異体が最近産生された。表面LOSの減
少した量を発現する菌株が毒性を減少させながら免疫原性を維持するかどうかを
決定することは興味深い。 要約すると、異種細菌表面タンパク質、ボレリア属ブルグドルフェリからのO
spAを発現する淋菌ブレボソームはボレリア属への暴露に対してマウスを保護
する免疫応答を誘発しうる。
【0082】 (実施例3) (インフルエンザ菌のP6遺伝子のクローニング) インフルエンザ菌のP6遺伝子を、PCRを使用してクローニングした。簡単
に言えば、それぞれEcoRI部位が隣接した二つのプライマーを使用して、お
よそ500bpの断片を増幅させた(図6A)。増幅断片をpLEE20中にク
ローニングした(図7A)。制限分析によりクローンを分析した。両方向に挿入
断片を含むクローンを得た。P6タンパク質に対するポリクローナル抗体とコロ
ニーを反応させることにより発現を分析した。 pLEE20-p6を大腸菌株SB17-2中に導入した。大腸菌から得られた
プラスミドを淋菌F62中にコンジュゲーションにより導入した。トランスコン
ジュガントを抗体との反応性についてスクリーニングし、SDS-PAGE(図
8)及びウェスタンブロット(図9)を使用して発現を証明した。
【0083】 (実施例4) (肺炎連鎖球菌のpspA遺伝子のクローニング) 肺炎連鎖球菌のpspA遺伝子を、PCRを使用してクローニングした。簡単
に言えば、それぞれEcoRI部位が隣接した二つのプライマーを使用して、お
よそ1kbの断片を増幅させた(図6B)。増幅断片の配列決定をしてpLEE
20中にクローニングした(図7B)。制限分析によりクローンを分析した。 pLEE20-pspAが大腸菌株SB17-2中に導入される。大腸菌から得
られたプラスミドが淋菌F62中にコンジュゲーションにより導入される。トラ
ンスコンジュガントが、抗体との反応性についてスクリーニングされ、SDS-
PAGE及びウェスタンブロットを使用して発現が証明される。
【0084】 この出願は1995年5月18日に出願した「ワクチン送達系」なる名称の米
国出願第08/443514号の継続出願とその包袋継続出願(弁護士事件整理
番号第2747−095−27FWC号)である。その出願のテキストの全体が
出典明示によりここに取り込まれる。 明らかに、本発明の数多くの変更と変形が上記の教唆に鑑みて可能である。従
って、特許請求の範囲の範囲内においてここに特に記載した以外の方法で本発明
を実施することができるものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【Fig1】 過剰ブレブ形成淋菌の免疫ブロットを示す。
【Fig2】 部分的な制限マップと、S. NogI、II、IV、V及び
VII R/M系クローンに対して作成された欠失の記載を示すものである。矢
印は、予想されたメチルトランスフェラーゼ(M)及び制限エンドヌクレアーゼ(
R)のオープンリーディングフレームを示す。黒い箱は各クローン上の欠失領域
を表す。制限部位の略号はB, Ba1I;C, C1aI;D, DraI;E,
EcoRI;H, Hind1II;Hp, HpaI;N, NcoIII;P, P
stI;R, RsaI;S, Sa1I;Sm, SmaI;Sp, SphI;Ss
, SspI;St, StyI;Su, Sau3AI;U, 淋菌取り込み配列;及
びX, XhoIである。
【Fig3】 スポット形質転換法を例証する。
【Fig4】 染色体へのR/M欠失の取り込みを確認するためのサザンブ
ロットのオートラジオグラムを表す。各セットの第1レーンはFA19からのD
NAであり、第2レーンはJUG029からのものである。セット1, NgoI
欠失(pLJPC30のPstI-XhoI断片による探査);セット2, NgoII欠失体(pLV1
55による探査);セット3, NgoIV欠失体(pCBB49.0による探査);セット4,
NgoV欠失体(pJM5による探査);セット5, NgoVII欠失体(pF,63によ
る探査)。DNAはセット1, DraI;セット2, Sau3AI;セット3,
SspI;セット4, RsaI;セット5, EcoRI+HindIIIで消化
した。
【Fig5】 JUG029菌株における、S, NgoI、II、IV、V
及びVIIMTアーゼ活性の欠損に対するアッセイを示す。各セットの第1レー
ンはFA19から単離されたDNAであり、第2レーンはJUG029からのも
のである。各セットはイソ制限酵素(又は重複する認識配列を有する酵素)で消化
される。セット1, HaeII(NgoI);セット2, HaeI11(NgoI
I);セット3, HaeMI(NgoIV);セット4,BamHI(NgoV);
セット5, Fnu4HI(NgoVII)。レーンMはλHindIIIマーカー
である。
【Fig6】 p6及びpspA遺伝子を増幅させるために使用されるPC
Rプライマーを示す。図6Aはp6遺伝子を増幅させるために使用されるPCR
プライマーを示す。図6BはpspA遺伝子を増幅させるために使用されるPC
Rプライマーを示す。
【Fig7】 p6及びpspA挿入物を含むpLEE20のプラスミドマ
ップを示す。図7Aは約6.6kbのpLEE20-p6を示す。p6遺伝子は
それ自身のリポタンパク質配列を有し、それ自身のATGから翻訳される。Er
m=エリスロマイシン(登録商標)。図7BはpLEE20-pspAを示す。ま
た、pspAはそれ自身のATGから翻訳される。
【Fig8】 クーマシーブルーで染色されたSDS-PAGEゲルである
。A#8、#18及び#19はpLEE20-p6クローンである。
【Fig9】 図8のSDS-PAGEゲルのウエスタンブロットである。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成12年3月6日(2000.3.6)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 31/10 A61P 31/12 31/12 A61K 37/02 C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),EA(AM,AZ ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL ,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR, BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,E E,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR ,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG, KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,L U,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO ,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG, SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,UA,U G,UZ,VN,YU,ZW Fターム(参考) 4B024 AA01 4C084 AA02 AA03 BA44 CA53 CA56 DA01 DA41 DA45 MA05 MA21 NA13 NA14 ZB321 ZB331 ZB351 4C085 AA03 BA07 BA16 BB11 BB17 EE05

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 疾患に対する免疫を患者に付与するためのワクチンであって
    、上記疾患に対して特異的な免疫原性ポリペプチドが製薬的に許容可能な賦形剤
    中に薬理学的に有効な用量で存在するブレボソームを含んでなるワクチン。
  2. 【請求項2】 患者がヒトである請求項1に記載のワクチン。
  3. 【請求項3】 患者が動物である請求項1に記載のワクチン。
  4. 【請求項4】 上記疾患が微生物により引き起こされる請求項1に記載のワ
    クチン。
  5. 【請求項5】 上記疾患が微生物により引き起こされる請求項2に記載のワ
    クチン。
  6. 【請求項6】 上記疾患が微生物により引き起こされる請求項3に記載のワ
    クチン。
  7. 【請求項7】 上記疾患が細菌により引き起こされる請求項1に記載のワク
    チン。
  8. 【請求項8】 上記疾患がウィルスにより引き起こされる請求項1に記載の
    ワクチン。
  9. 【請求項9】 上記疾患が真菌により引き起こされる請求項1に記載のワク
    チン。
  10. 【請求項10】 上記疾患がプロトゾアにより引き起こされる請求項1に記
    載のワクチン。
  11. 【請求項11】 疾患に対して活性なポリペプチドが製薬的に許容可能な賦
    形剤中に薬理学的に有効な用量で存在するブレボソームを含んでなる、疾患の治
    療のための製薬組成物。
  12. 【請求項12】 上記ポリペプチドがサイトカインである請求項11に記載
    の製薬組成物。
  13. 【請求項13】 上記ポリペプチドがレセプターである請求項11に記載の
    製薬組成物。
  14. 【請求項14】 上記ポリペプチドが抗生物質である請求項11に記載の製
    薬組成物。
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