JP2002233390A

JP2002233390A - 溶血素群毒素に関するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来抗原性鉄抑制蛋白質

Info

Publication number: JP2002233390A
Application number: JP2001357103A
Authority: JP
Inventors: P Frederick Sparling; スパーリング，ピー．，フレデリック; Stuart Alan Thompson; トンプソン，スチュアート，アラン
Original assignee: University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina System
Priority date: 1990-07-16
Filing date: 2001-11-22
Publication date: 2002-08-20
Also published as: EP0539492A1; CA2087160A1; EP0539492A4; DE69133276D1; ATE242784T1; DE69133276T2; JPH06502394A; AU8298991A; WO1992001460A1; EP1338607A2; EP0539492B1; JP3329452B2; EP1338607A3; DK0539492T3; ES2202297T3

Abstract

(57)【要約】【解決手段】少なくとも５０アミノ酸残基を有するセ
グメントを含み、該セグメントのアミノ酸配列がN.meni
ngitidisに存在し、かつ該アミノ酸配列が溶血素群毒素
の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異なるが、実質
的には相同する、単離された抗原性ポリペプチド、また
は該ポリペプチドの抗原性フラグメント。【効果】少なくとも５０のアミノ酸残基を有するセグ
メントを含む、単離された抗原性ポリペプチド。該セグ
メントのアミノ酸配列はN.meningitidisに存在し、溶血
素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異なる
が、実質的には相同するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術分野】本発明は、Neisseria mening
itidisから単離された抗原性ポリペプチド、該ポリペプ
チドに対して生じる抗体、該ポリペプチドを含有するワ
クチンおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡに関す
る。

【０００１】

【従来の技術】ポリペプチドとは溶血素群毒素の一つで
あり、典型的なものとしてはE.coli由来のα−溶血素が
挙げられる。

【０００２】細菌性の病因は複雑であり、プロセスはほ
とんど理解されていない。多くの病因性細菌は動物細胞
の代謝や機能を損なう毒素を分泌する。様々なクラスの
分子がそのような毒素を構築する。

【０００３】蛋白質毒素の一例が、ヒトの腸外感染を引
き起こす病因性E.coli株に見出される。そのような感染
は哺乳動物赤血球の溶血を特徴とする。その溶血活性は
溶血素として知られる一群の毒素によるものである。そ
のクラスにはα−溶血素およびβ−溶血素が含まれる
（Welch ら，Infection and Immunity ４２，１７８−
１８６（１９８３）参照のこと）。

【０００４】もう一つの蛋白質毒素はアデニル酸シクラ
ーゼであり、それはBordetella pertussisおよびBacill
us anthracisに見出され、プロフェッショナル食細胞の
機能を阻害する。これらの細菌は各々百日咳および炭疽
病の原因である。第３の病因性細菌由来の蛋白質毒素類
はロイコトキシンであり、幼年期の局所的な歯周炎の病
原剤であるActinobacillus actinomycetemcomitans、お
よびウシ白血球を死滅させるPasteurella haemolytica
に見出される。

【０００５】興味深いことに、B.pertussisおよびB.ant
hracis由来のアデニル酸シクラーゼ、およびA.actinomy
cetemcomitantsおよびP.haemolytica由来のロイコトキ
シンはE.coli由来のα−溶血素のアミノ酸配列とかなり
の相同性を示すアミノ酸配列を有する(Glaser ら，Mole
cular Biology ２，１９−３０（１９８８）およびKolo
drubetzら，Infection and Immunity ５７，１４６５
−１４６９（１９８９）参照のこと)。明らかに、様々
な細菌属に見出される一連の毒素群が存在する。細胞毒
素のこの群のアミノ酸配列は、高頻度に繰り返された９
個のアミノ酸のモチーフ、すなわちＬｘＧＧｘＧＮＤｘ
（但し、ｘはいずれかのアミノ酸を示す。）に特徴があ
る。本明細書の目的は、この一連の毒素が溶血素群毒素
に関することを述べるものである。

【０００６】「溶血素群毒素」が当業者にとって一般的
な属名であり、実際には大部分が細胞毒素であるが、全
てが溶血性でないことを意味するものであると理解され
るべきである。その群としての資格は以下に定義するよ
うなアミノ酸配列の相同性である。上記に加えて、相同
する蛋白質はSerratiaおよびProteusにも見出されてい
るが、これら溶血素群のメンバーが実際に細胞毒素であ
るかどうかは不明である。

【０００７】この重要で、時には死をもたらす細菌であ
るNeisseria meningitidisは脊髄性髄膜炎および敗血症
ショックの原因であるが、この菌についてはほとんど知
られていない。N.meningitidisおよびこれが引き起こす
疾病については、PatersonによりBiologic and Clinica
l Basis of Infectious Diseases,の“Neisseria menin
gitidis and Meningococcal Disease”, W. B. Saunder
s Company, Chapter４３（１９８０）に記載されてい
る。

【０００８】N.meningitidisの遺伝子型はN.gonorrhoea
eの遺伝子型と大変よく類似しているが、表現型は全く
異なる。これらNeisseria種を区別することが重要とな
る場合がある。免疫学的種形成は、十分量のグループ特
異性抗原がないため、困難な場合がある。

【０００９】N.meningitidisは様々な血清型として存在
し、その有患率は時間と存在場所により変わる。血清型
には、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９−ＥおよびＷ
−１３５がある。

【００１０】N.meningitidis感染の３つの最も重要な公
知の抗原性および／または有毒性成分は、莢膜多糖、リ
ポ多糖−エンドトキシン細胞壁複合体およびNeisseria
−特異性蛋白質である。莢膜多糖は髄膜炎菌を、分裂し
た好中球による食作用に抵抗できるようにする主な病毒
性要因である。

【００１１】髄膜炎菌の多糖を含有するワクチンは、い
くつかのN.meningitidis血清型に対して用いる。例え
ば、Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５血清型に対する防御が
多糖ワクチンにより可能になる。しかしながら、そのよ
うなワクチンはN.meningitidisの感染に対する全般的な
防御には不十分である。例えばＡおよびＣ血清型の多糖
ワクチンに対する免疫応答は、特に髄膜炎菌性疾病に最
も感受性の高い２才以下の子供ではほとんどない。さら
に、Ｂ血清型に有効なワクチンが存在せず、おそらくそ
れはＢ群の莢膜多糖が比較的非免疫原性であることによ
る。

【００１２】N.meningitidisの病理学についてさらに研
究をする必要があることは明らかなことである。おそら
く、この病原体をさらに理解することにより、現在利用
可能なものよりもより多くの血清型に対して全般的に有
用なワクチンの発見が導かれるであろう。

【００１３】例えば、何故呼吸器系のN.meningitidisに
よる感染が激しい髄膜炎菌性疾病に進行し、時折人によ
っては死に到るのに、明らかに同様の危険な状態にある
その他大多数の人々はそうならないのか、については不
明である。莢膜多糖の量もリポ多糖−エンドトキシン複
合体の量もこの疾病の危険性とは相関しない。N.mening
itidisの莢膜多糖と交叉反応する抗原性成分を持つ微生
物にさらす方法は、一つの解釈を導いてくれた（Peters
onの同著書参照のこと）。

【００１４】それ以外の解釈もまた可能である。例え
ば、莢膜多糖とは異なる抗原への交叉免疫を除外するこ
とはできない。この点に関して、N.meningitidisと結合
する蛋白質毒素が知られていないことに注目することは
興味深いことである。この一つの理由としては、N.meni
ngitidisが、大抵はヒト宿主内には存在しない鉄過剰な
条件下、インビトロで培養されることが挙げられる。し
かしながら、いくつかの髄膜炎菌の蛋白質が鉄で抑制さ
れ、かつインビボでは発現するがインビトロでは観察さ
れないことが知られている。Black ら，Infection and
Immunity ５４，７１０−７１３（１９８６）およびBr
enerら，ibid. ３３，５９−６６（１９８１）参照のこ
と。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明における問題点
の一つは、N.meningitidisの同定およびN.gonorrhoeae
との識別を可能にする抗原性ポリペプチドおよびＤＮＡ
配列の発見である。また、本発明のもう一つの問題点
は、髄膜炎菌性疾病に対して有効な抗体の製造を可能に
する蛋白質の発見である。

【００１６】当業者にとって明白なように、これら、お
よびそれ以外の問題は、少なくとも５０アミノ酸残基を
有するセグメントを含み、かつ該セグメントのアミノ酸
配列がN.meningitidisに存在し、さらに該アミノ酸配列
が溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは
異なるが実質的に相同する、単離された抗原性ポリペプ
チドを提供することにより解決されるものである。

【００１７】ポリペプチドのもう一つの決定方法は、N.
meningitidisに存在するアミノ酸配列を有するセグメン
トを含み、かつ該アミノ酸配列が９個のアミノ酸の溶血
素共通配列の少なくとも３つの繰り返しを含み、該溶血
素共通配列が位置１のＬ；位置３のＧ；位置４のＧ；位
置６のＧ；位置７のＮ；位置８のＤ；および位置２、５
および９のｘ；（ただし、ｘは独立していかなる単一ア
ミノ酸残基を表す。）のうち少なくとも４つを含む、単
離されたポリペプチドであることを示すことである。

【００１８】さらに本発明は、前述のポリペプチドの抗
原性フラグメント、該ポリペプチドに対して生じる抗
体、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、お
よび該ポリペプチドを含有するワクチンを包含するもの
である。

【００１９】

【発明の実施の形態】ポリペプチドセグメント鉄制限条件下でN.meningitidisを生育させた時、溶血素
群毒素のセグメントとは異なるが、実質的に相同するア
ミノ酸配列を有するセグメントからなるポリペプチドが
発現することが思いがけず発見された。例えばＡ4.85
（以下参照）のように、N.meningitidisに見出されるポ
リペプチドに対して生じるモノクローナル抗体は、E.co
liのｈｌｙＡ遺伝子により産生されるα−溶血素（Ｈｌ
ｙＡ）およびBordetella pertussisにより産生されるア
デニル酸シクラーゼとウエスタン・ブロットで交叉反応
する。

【００２０】ここで用いられる溶血素群毒素としては、
Escherichia、Serratia、Pasteurella、Proteus、Actin
obacillus、およびBordetella属の細菌に見出される相
同性の、細胞障害性または蛋白質分解性ポリペプチドが
挙げられ、特にα−溶血素、ロイコトキシン、およびア
デニル酸シクラーゼが挙げられる。

【００２１】二つのアミノ酸配列が実質的に相同するか
否かの決定は、本明細書では、PearsonおよびLipmanのP
roc. Natl. Acad. Sci. USA８５，２４４４−２４４８
（１９８８）によるＦＡＳＴＡ検索法に基づいて行っ
た。本発明による実質的に相同する配列は、ここでは引
例であるPearsonおよびLipmanの方法により求めた時、
アミノ酸配列において少なくとも１５％一致しており、
好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なく
とも２５％が一致している。

【００２２】本発明のポリペプチドは、溶血素群毒素の
その他のものと同一なセグメントを含有する必要はな
い。ＦＡＳＴＡ法による同一性は９０％または９５％程
度であってよいが、通常N.meningitidisから単離された
場合には４０％または５０％以上の同一性を示すことは
ない。

【００２３】ポリペプチドの大きさに制限はなく、溶血
素群毒素の一つのセグメントと実質的に相同するセグメ
ントを含有する程度の長さであればよい。実質的に相同
するセグメントは少なくとも５０アミノ酸残基を有し、
好ましくは少なくとも１００アミノ酸残基、さらに好ま
しくは少なくとも２００アミノ酸残基を有する。本明細
書において、「ポリペプチド」という用語は「蛋白質」
や「ペプチド」のような用語と区別できないと考えられ
る。

【００２４】溶血素群毒素のセグメントと実質的に相同
する髄膜炎菌ポリペプチドのセグメントは、全ての溶血
素群毒素の特徴を示す同じ９個のアミノ酸のモチーフを
含有する。共通する配列はＬｘＧＧｘＧＮＤｘであり、
以下溶血素共通配列という。ｘで表されるアミノ酸はい
かなるアミノ酸でもよい。

【００２５】本発明のポリペプチドは、上記の実質的な
相同性基準だけでなく、溶血素共通配列により定義され
てもよい。このため、９個のアミノ酸配列が少なくとも
４個、好ましくは少なくとも５個、そしてさらに好まし
くは全６個の特定のアミノ酸残基（すなわち、Ｌ−ＧＧ
−ＧＮＤ−）を正しい位置に含有しているならば、それ
は溶血素共通配列であると考えられる。

【００２６】第２図（以下に記載されている）はN.meni
ngitidisから単離されたポリペプチドの一部であり、こ
れによれば、相同するセグメントは溶血素共通配列が多
数繰り返されている３つの範囲、すなわち４８６番目と
５１２番目のアミノ酸の間、６２３番目と７１２番目の
アミノ酸の間、および８２３番目から最後のアミノ酸の
間からなる。第２図には完全な共通配列が２１存在す
る。

【００２７】本発明のポリペプチドには、N.meningitid
isに存在し、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５
つ、さらに好ましくは少なくとも１０の溶血素共通配列
を含むセグメントが含まれる。本発明のポリペプチドは
少なくとも２１程度の溶血素共通配列を有していてもよ
い。

【００２８】ポリペプチドは単離されるが、それは本質
的にその他の蛋白質、特にN.meningitidisのその他の蛋
白質から遊離することを意味する。本質的に他の蛋白質
から遊離するということは、他の蛋白質から少なくとも
９０％が遊離していることであり、好ましくは少なくと
も９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％が遊離し
ていることを意味する。

【００２９】好ましくは、ポリペプチドは本質的に純粋
なものであり、それはポリペプチドが他のポリペプチド
からだけでなく、ポリペプチドの単離や同定に用いられ
る他の物質、例えばニトロセルロース紙だけでなくドデ
シル硫酸ナトリウムや他の洗浄剤等からも遊離している
ことを意味する。ポリペプチドはそのような物質から少
なくとも９０％が遊離しており、好ましくは少なくとも
９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％が遊離して
いるものである。

【００３０】本発明のポリペプチドは抗原性であるが、
これはポリペプチドが哺乳動物において特異的な抗体を
誘導することを意味する。好ましくは、ポリペプチドは
免疫原性である。

【００３１】ポリペプチドはN.meningitidisに存在する
ような完全なポリペプチドであってもよく、または全ポ
リペプチドの抗原性、好ましくは免疫原性のフラグメン
トであってもよい。抗原性および／または免疫原性ポリ
ペプチドの抗原性および／または免疫原性フラグメント
は、当技術分野において公知の方法により同定してもよ
い。通常、抗原性フラグメントは、溶血素群毒素の一つ
であるポリペプチドのセグメントのアミノ酸配列とは異
なるが相同するアミノ酸配列を有するセグメントの少な
くとも一部からなるか、あるいは少なくとも３つ、好ま
しくは少なくとも５つ、さらに好ましくは少なくとも１
０の溶血素共通配列を有するセグメントの少なくとも一
部からなる。

【００３２】ポリペプチドの調製本発明のポリペプチドは当技術分野で公知である方法に
より調製してもよい。そのような方法としては、ポリペ
プチドを直接N.meningitidisから単離すること；ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを単離または合成し、該ＤＮ
Ａを用いて組み換えポリペプチドを製造すること；およ
びポリペプチドを個々のアミノ酸から合成すること等が
挙げられる。

【００３３】ポリペプチド、またはポリペプチドをコー
ドするＤＮＡはN.meningitidisのいかなる血清型から単
離してもよい。そのような血清型としては、Ａ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９−ＥおよびＷ−１３５が挙げ
られる。

【００３４】ポリペプチドまたはポリペプチドをコード
するＤＮＡが単離される適当な髄膜炎菌株の入手源が利
用できる。そのような入手源としてAmerican Type Cult
ureCollection(Bethesda, MD)およびNeisseria Reposit
ory(NAMRU, University ofCalifornia, Berkeley) が挙
げられる。適当な菌株としてはＦＡＭ１８およびＦＡＭ
２０(Dyerら, Microbial Pathogenesis ３，３５１−
３６３（１９８７）)、およびＦＡＭ１９が挙げられ
る。それ以外の髄膜炎菌株はSchryversおよびMorrisに
よるInfection and Immunuty ５６，１１４４−１１４
９（１９８８）に記載されている。

【００３５】ポリペプチドはN.meningitidisから当該技
術分野で公知の方法により直接単離してもよい。まず、
髄膜炎菌の外層膜を単離し、公知の方法で調製する。We
stおよびSparlingによるInfect. Immun. ４７，３８８
−３９４（１９８５）に記載された方法、およびSchryv
ersおよびMorrisによるInfect. Immun. ５６，１１４
４−１１４９（１９８８）に記載された方法が適当であ
る。

【００３６】単離された膜蛋白質は公知の方法、例えば
洗浄剤の添加等により可溶化してもよい。通常用いられ
る洗浄剤としては、オクチル−β−グルコシド、チャッ
プス(Chaps) 、ツバイターゲント(Zwittergent) 3.14ま
たはトライトン−Ｘ(Triton−Ｘ)が挙げられる。膜蛋白
の溶解性を促進するために洗浄剤を用いることは、Jone
sらによるFinby, Solubilization and Reconstitution
of Membrane Proteins：A Practical Approach, IRL Pr
ess （１９８６）、HeleniusらによるBiochim. Biophy
s. Acta ４１５，２９（１９７５）、およびHjeimelan
dとChrambachによるMethods Enzymol. １０４，３０５
（１９８４）に記載されている。

【００３７】蛋白質は可溶化された膜分画から標準的な
方法により単離される。いくつかの適当な方法として
は、沈降法や、イオン交換、疎水性相互作用およびゲル
ろ過等の液体クロマトグラフィープロトコールが挙げら
れる。例えば、Methods Enzymol.１８２(Guide to Prot
ein Chemistry, Deutscher, Ed. Sectino VII)３０９
（１９９０）およびScopes, Protein Purification. Sp
ringer-Verlag, New York（１９８７）を参照のこと。

【００３８】一方、精製された物質は、分取ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルで蛋白質を分離し、目的のバンドを分割し、
当技術分野で公知の方法により蛋白質をアクリルアミド
のマトリックスから電気溶出させることにより得られ
る。洗浄剤ＳＤＳは、透析やPierceのExtracti−ゲルカ
ラム等の適当なカラムの使用などの公知の方法により蛋
白質から除去される。

【００３９】ポリペプチドは、ポリペプチドをコードす
るＤＮＡを単離すること；適当な宿主内でＤＮＡをクロ
ーニングすること；宿主内でＤＮＡを発現させること；
およびポリペプチドを採取することにより製造されても
よい。

【００４０】本発明のポリペプチドをコードする第１の
ＤＮＡはイムノスクリーニング法により単離された。そ
のような方法がManiatisらによる“Molecular Clonin
g：Alaboratory Manual,”Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, Cold Spring Harbor, New York（１９８
２）に記載されている。

【００４１】要約すれば、モノクローナル抗体はN.meni
ngitidis ＦＡＭ２０株の鉄抑制外層膜蛋白質に対して
産生される。モノクローナル抗体の一つであるＡ4.85は
ＦＡＭ２０の外層膜のウエスタン・ブロッツ(Western b
lots) 上のいくつかの鉄抑制蛋白質を認識した。Ａ4.85
は、発現ベクター−λ−ｇｔ１１に作られたＦＡＭ２０
の染色体ライブラリーからクローンを単離するために用
いた。このクローンの配列は決定され、隣接する染色体
抑制フラグメントをクローンするために用いた。この領
域の隣接したＤＮＡ配列は長いオープンリーディングフ
レームを含有しており、それを図１及び図２（配列番号
１）に示す。図１及び図２のヌクレオチド配列から予示
されるアミノ酸配列を図３（配列番号２）に示す。

【００４２】オープンリーディングフレーム（図３）か
ら推測されるアミノ酸配列を、PearsonおよびLipman(Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA ８５，２４４４−２４４８
（１９８８）)に従ってＦＡＳＴＡ相同性検索を行っ
た。驚くべきことに、このアミノ酸配列は、上記で議論
したように、いくつかの溶血素群毒素と実質的な相同性
を示した。

【００４３】さらにN.meningitidisから単離されたポリ
ペプチドが毒素の溶血素群の一つであることから明らか
なように、第２図に示されるポリペプチドに対して生
じ、そのペプチドを単離するために用いられる抗体、す
なわちＡ4.85はE.coli由来のα−溶血素（ＨｌｙＡ）お
よびBordetella pertusssisで産生されるアデニル酸シ
クラーゼと強く交叉反応した。

【００４４】本発明のポリペプチドをコードする遺伝子
の付加的なフラグメント、または完全なポリペプチドを
コードする遺伝子を得るために、イムノスクリーニング
法を繰り返してもよい。むろん、このイムノスクリーニ
ングプロセスを繰り返さなくともよい。完全な遺伝子ま
たは遺伝子の付加的なフラグメントは、好ましくは公知
のＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントを用いること
によりプローブとして単離される。そのために、すでに
クローン化された領域の末端の側面に位置しているか、
あるいは完全な領域を含有している髄膜炎菌のＤＮＡ制
限フラグメントを、図１及び図２に示すような予め決定
された配列、またはそれらのフラグメント由来の標識化
オリゴヌクレオチドプローブを用いて、サザンハイブリ
ダイゼーションにより同定する。

【００４５】得られるＤＮＡは当技術分野では公知の方
法により増幅してもよい。一つの適当な方法としては、
Mullisらの米国特許第4,683,195号およびSambrook, Fri
tschおよびManiatis（著者）のMolecular Cloning, A L
aboratory Manual, 第２版，Cold Spring Harbor Labor
atory Press（１９８９）に記載されているポリメラー
ゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法が挙げられる。そ
れは、アンプライマーとしてλ−ｇｔ１１−特異性オリ
ゴマー（Stratagene社製を利用できる）を用いてλ−ｇ
ｔ１１ベクターでクローンを増幅するのに便利な方法で
ある。

【００４６】制限フラグメントはプラスミドまたはバク
テリオファージ等の適当なベクターにクローンされ、当
技術分野で公知の方法により配列される。適当な配列方
法としては、SangerらによるProc. Natl. Acad. Sci. U
SA ７４，５４６３−５４６７（１９７７）に記載され
ているジデオキシチェーン・ターミネーティング法が挙
げられる。配列のための適当なベクターおよびポリメラ
ーゼは公知である。適当なベクターとしては、Stratage
ne社製のブルースクリプト(Bluescript)ベクターが挙げ
られる。適当なポリメラーゼとしては、シークエナーゼ
(Sequenase) (United States Biochemical Corp., Clev
eland, OH)が挙げられる。

【００４７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、多様なベクターを用い、多様な宿主細胞において組
み換えポリペプチドを発現するために用いてもよい。宿
主は原核性または真核性でもよい。ＤＮＡは天然から得
てもよく、場合によっては修飾されていてもよい。遺伝
子は全体または部分的に合成されてもよい。

【００４８】クローニングベクターは染色体性、非染色
体性および合成されたＤＮＡ配列からなっていてもよ
い。いくつかの適当な原核性ベクターとしては、ｃｏｌ
Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびＲＰ
４等のE.coli由来のプラスミドが挙げられる。また、原
核性ベクターとしては、Ｍ１３、ｆｄ、およびその他の
糸状一本鎖ＤＮＡファージ等のファージＤＮＡの誘導体
が含まれる。

【００４９】細菌、特にE.coliでの蛋白質発現用ベクタ
ーも公知である。そのようなベクターとしては、ｐＫ２
３３（またはプラスミドのｔａｃ群のいずれか）、Ｔ
７、およびλＰＬが挙げられる。融合蛋白質を発現す
るベクターの例としては、DieckmannおよびTzagoloffに
よるJ. Biol. Chem.２６０，１５１３−１５２０（１９
８５）に記載されているＰＡＴＨベクターが挙げられ
る。これらのベクターにはアントラニル酸シンセターゼ
（ＴｒｐＥ）をコードするＤＮＡ配列が含まれており、
そのカルボキシ末端にポリリンカーが続いている。その
他の発現ベクター系はβ−ガラクトシダーゼ（ｐＥ
Ｘ）；マルトース結合蛋白質（ｐＭＡＬ）；およびグル
タチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）に基づ
くものである(Gene ６７，３１（１９８８）およびPept
ide Resesarch ３，１６７（１９９０）参照)。

【００５０】酵母において有用なベクターを利用しても
よい。適当な例としては２ｕプラスミドが挙げられる。

【００５１】哺乳動物細胞に用いる適当なベクターも公
知である。そのようなベクターとしては、十分公知であ
るＳＶ−４０誘導体、アデノウイルス、レトロウイルス
由来のＤＮＡ配列およびプラスミドとファージＤＮＡの
結合体由来のベクターが挙げられる。

【００５２】それ以外の真核生物の発現ベクターが当技
術分野では公知である（例えば、P.J. Southernおよび
P. Berg, J. Mol. Appl. Genet.１，３２７−３４１
（１９８２）；S. Subramaniら，Mol. Cell. Biol.１，
８４５−８６４（１９８１）；R. J. KaufmannおよびP.
A. Sharp, “Amplification And Expression Of Seque
nces Cotransfected with A Modular Dihydrofolate Re
ductase ComplementaryDNA Gene ,” J. Mol. Biol.１
５９，６０１−６２１（１９８２）；R. J. Kaufmannお
よびP. A. Sharp, Mol. Cell. Biol. １５９，６０１−
６４４（１９８２）；S. I. Scahillら, “Expression
And Characterization Of The Product OfA Human Immu
ne Interferon DNA Gene InChinese Hamster Ovary Cel
ls,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８０，４６５４−４
６５９（１９８３）；G. UrlaubおよびL. A. Chasin, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA ７７，４２１６−４２２
０，（１９８０）参照）。

【００５３】有用な発現宿主としては十分公知である原
核および真核細胞が挙げられる。いくつかの適当な原核
宿主としては、例えば、E.coli ＳＧ−９３６、E.coli
ＨＢ−１０１、E.coli Ｗ３１１０、E.coli Ｘ１７
７６、E.coli Ｘ２２８２、E.coli ＤＨＩ、およびE.
coli ＭＲＣｌ等のE.coli、Pseudomonas、Bacillussub
tilis等のBacillus、およびStreptomycesが挙げられ
る。適当な真核細胞としては、酵母およびその他の菌
類、昆虫やＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞等の動物細胞、並び
に組織培養ヒト細胞および植物細胞が挙げられる。

【００５４】本発明に有用な発現ベクターは、発現さる
べきＤＮＡ配列またはフラグメントに結合する少なくと
も一つの発現制御配列を含有する。調節配合は、クロー
ン化されたＤＮＡ配列の発現を制御・調節するためにベ
クターに挿入される。有用な発現制御配列の例として
は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファー
ジλの大部分のオペレーターおよびプロモーター領域、
ｆｄコート蛋白質の制御領域、３−フォスフォグリセリ
ン酸キナーゼのプロモーター等の酵母の解糖プロモータ
ー、Ｐｈｏ５等の酵母の酸性フォスファターゼのプロモ
ーター、酵母のα−交接因子、およびＳＶ４０の初期ま
たは後期プロモーター等のポリオーマ、アデノウイル
ス、レトロウイルス、およびサルウイルス等由来のプロ
モーター、および原核または真核細胞およびそれらのウ
イルスまたはそれらを組み合わせたものの遺伝子の発現
を制御するとして知られているその他の配列が挙げられ
る。

【００５５】組み換えポリペプチドは、当技術分野で公
知の方法により精製される。適当な方法が、F. A. O. M
arston,“The Purification of Eukaryotic Polypeptid
es Expressed in Escherichia coli,"in DNA Cloning,
D. M. Glover, Ed., Vol.III, IRL Press Limited, Eng
land（１９８７）に記載されている。本発明のポリペプ
チドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡも、当技
術分野で公知の方法により個々のアミノ酸残基およびヌ
クレオチドから各々化学的に合成してもよい。ポリペプ
チド合成の適当な方法はStuartおよびYoungによる"Soli
d Phase Peptide Synthesis ,"第２版，Pierce Chemica
l Company（１９８４）に記載されている。ＤＮＡ合成
の適当な方法はCaruthersによるScience ２３０，２８
１−２８５（１９８５）に記載されている。

【００５６】ワクチン溶血素群毒素の一つのアミノ酸配列とは異なるが実質的
に相同するアミノ酸配列を有するセグメントからなるポ
リペプチドは、予想外に、哺乳動物をN.meningitidisに
よる感染性疾病から保護するのに有用な抗原である。該
哺乳動物とは、典型的にはヒトである。

【００５７】有効に用いるためには、抗原は免疫される
哺乳動物に対して非毒性である。抗原が毒性である場
合、当技術分野で公知の方法により非毒性にしてもよ
い。そのような方法としては、例えば、抗原性があり非
毒性の完全なポリペプチドのフラグメントを調製するこ
と、あるいは毒性を破壊する抗原性に影響を与えないキ
ャリヤ分子に毒素を結合させる等により、ポリペプチド
を非毒性にすることが挙げられる。キャリヤ分子は、典
型的にはそれ以外のポリペプチドである。好ましくは、
抗原のアミノ酸配列はN.meningitidisに見出されるポリ
ペプチドに存在するものである。ポリペプチド、または
哺乳動物を免疫するのに有用な非毒性で抗原性のあるフ
ラグメントは、上述のようなN.meningitidisからの単
離、組み換えＤＮＡ技術による製造、または化学合成等
の当技術分野で公知の方法により作られてもよい。

【００５８】フラグメントの長さは、フラグメントが抗
原性かつ非毒性であるかぎり、制限はない。したがっ
て、フラグメントはエピトープを決定するのに十分なア
ミノ酸残基を含有していなければならない。公知の抗原
性ポリペプチドから抗原性フラグメントを単離・同定す
る方法はSalfeldらによるJ. Virol. ６３，７９８−８
０８（１９８９）およびIsolaらによるJ. Virol. ６
３，２３２５−２３３４（１９８９）に記載されてい
る。

【００５９】フラグメントが、エピトープは決定するが
短すぎて抗原性でない場合には、キャリヤ分子に接合し
てもよい。いくつかの適当なキャリヤ分子としては、キ
ーホール・リンペット(Keyhole limpet)ヘモシアニンお
よびウシ血清アルブミンが挙げられる。接合は当技術分
野で公知の方法によって行ってもよい。そのような一つ
の方法はフラグメントのシステイン残基をキャリヤ分子
上のシステイン残基と結合させるものである。

【００６０】本発明はさらに、N.meningitidis感染に対
する哺乳動物（ヒトを含む）免疫用ワクチン組成物を包
含するものである。ワクチン組成物は適当なキャリヤ中
の上記のような免疫原性抗原を含む。適当なキャリヤと
しては、水、リン酸緩衝化塩溶液、およびエマルジョン
等の標準的薬物として許容可能ないかなるキャリヤも含
まれる。

【００６１】ワクチンには、アジュバント、例えばムラ
ミルペプチド、およびインターフェロン、インターロイ
キン−１およびインターロイキン−６等のリンホカイン
が挙げられる。抗原は、当技術分野で公知であるよう
に、酸化アルミニウム粒子のような適当な粒子に吸着し
ていてもよいし、あるいはリポソームに保持されていて
もよい。

【００６２】本発明はさらに、N.meningitidisにより引
き起こされる疾病からの保護が必要な場合、上記のワク
チン組成物を哺乳動物に投与することにより、ヒトを含
む宿主哺乳動物を免疫する方法をも包含するものであ
る。ワクチンは哺乳動物に対して非毒性な形態の免疫厳
正ポリペプチドを含む。ポリペプチドは一連の溶血素群
毒素のアミノ酸配列と相同性のあるアミノ酸配列を有す
る。アミノ酸配列は、好ましくはN.meningitidisに存在
し、通常はN.meningitidisの外層膜に見出される。しか
し、抗体は本発明のポリペプチドおよびその他の細菌属
由来の溶血素群毒素と交叉反応するので、ワクチン組成
物中の抗原はそれらの他の属のアミノ酸配列、例えばE.
coliまたはB.pertussis等由来のものからなるものであ
ってよい。

【００６３】ワクチンは当技術分野で公知の方法により
哺乳動物に投与される。そのような方法には、例えば、
静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与が挙げられ
る。

【００６４】抗体本発明は、発明のポリペプチドに対して生じる抗体を提
供するものである。ポリペプチドはエピトープを決定
し、さらに溶血素群毒素の一つのアミノ酸配列と実質的
に相同するアミノ酸配列からなる。抗体は好ましくは、
N.meningitidisに存在し、かつ他の細菌属の溶血素群毒
素とは異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対し
て産生される。

【００６５】抗体は好ましくはモノクローナルである。
モノクローナル抗体は当技術分野で公知の方法により製
造されてもよい。これらの方法としては、Kohlerおよび
MilsteinによるNatura ２５６，４９５−４９７（１９
７５）に記載された免疫学的方法、およびHuseらによる
Science ２４６，１２７５−１２８１（１９８９）に
記載された組み換えＤＮＡ法が挙げられる。

【００６６】N.meningitidis感染による疾病に悩まされ
ているヒトを含む哺乳動物を、溶血素群毒素の一つに特
異的な抗体を投与することにより治療することもでき
る。いかなる属の細菌溶血素群毒素の一つに対して生じ
る抗体も適当であるが、N.meningitidisに存在するアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドに対して生じる抗体が好
ましい。

【００６７】治療上の目的には、本発明の抗原性ポリペ
プチドが中和抗体を産生することが必要である。中和抗
体とは、細菌細胞の生育を著しく阻害あるいは死滅させ
る、および／またはポリペプチドの毒素機能をインビト
ロまたはインビボで著しく中和する抗体である。阻害ま
たは中和が疾病に感染した哺乳動物の症状をなくす、あ
るいは弱めるのに十分効果的な場合、細菌の生育が著し
く阻害されるか、またはポリペプチドの毒性機能がイン
ビボで著しく中和される。

【００６８】中和抗体は、N.meningitidis感染により引
き起こされる疾病に悩まされている哺乳動物（ヒトを含
む）免疫用ワクチンとして有用な抗イディオタイプの抗
体の調製に用いてもよい。抗イディオタイプの抗体は当
技術分野で公知の方法により調製される。

【００６９】核酸分子本発明は、本発明記載のいかるなポリペプチドをコード
する単離された核酸分子をも包含するものである。核酸
分子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。

【００７０】核酸分子の有用性は、以下で説明するよう
に、N.meningitidis検出用プローブとして用いることが
できること、あるいは上記で説明したような本発明のポ
リペプチドを製造できることにある。核酸分子は当技術
分野で公知の方法により調製されてもよい。適当な方法
としては、上記のように、ＤＮＡをN.meningitidisから
単離すること、または公知の操作法によりＤＮＡを合成
することが挙げられる。

【００７１】プローブ本発明はさらに、試料中のN.meningitidisの存在を検出
する方法を提供する。この方法は、溶血素群毒素、特に
N.meningitidisに存在する溶血素群毒素の一つであるポ
リペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードす
る遺伝子を認識するプローブを用いることを包含する。
もし試料中にN.meningitidisが存在すれば、プローブが
それを認識する。

【００７２】プローブは抗体であってもよく、好ましく
はモノクローナル抗体である。抗体は上記のように調製
してもよい。

【００７３】ポリペプチドを抗体で検出する方法は公知
である。例えば、ポリペプチドは固相の支持体上で固定
されていてもよい。ポリペプチドの固定化は、ポリペプ
チドに特異的な固定化一次抗体を介して行ってもよい。
固定化一次抗体はポリペプチドを含有していると思われ
る試料と共にインキュベートされる。もしポリペプチド
が存在すれば、一次抗体と結合する。

【００７４】二次抗体もまたポリペプチドに特異的であ
るが、これは固定化ポリペプチドに結合する。二次抗体
は当技術分野で公知である方法により標識されてもよ
い。非固定化物質は洗い出され、固定された標識が存在
すればポリペプチドが存在することになる。このイムノ
アッセイ法およびその他のイムノアッセイ法がDavidら
により米国特許第4,376,110号（Hybritech, Inc., La J
olla, Californiaに譲渡された）に記載されている。

【００７５】プローブはまた、N.meningitidisに存在す
る溶血素群毒素の一つをコードするＲＮＡまたはＤＮＡ
分子を認識する核酸分子であってもよい。核酸分子プロ
ーブが試料中の特異的な核酸分子を認識するか否かを決
定する方法は当技術分野で公知である。一般的に、試料
中に存在すると思われる核酸配列に相補性な標識化プロ
ーブを調製する。目標とする核酸分子とハイブリダイズ
したプローブの存在により、核酸分子の存在が示され
る。適当な方法がSchneiderらによる米国特許第4,882,2
69号(Princeton Universityに譲渡された。)およびSege
vによるＰＣＴ出願WO 90/01069号に記載されている。Sc
hneiderらの特許およびSegevの出願は共にImClone Syst
ems Inc., New York Cityの認可を受けている。

【００７６】上記のプローブは当技術分野で公知の方法
により標識される。抗体を標識する方法は、例えば、Hu
nterおよび GreenwoodによるNature １４４，９４５
（１９６２）、およびDavidらによるBiochemistry １
３，１０１４−１０２１（１９７４）に記載されてい
る。抗体を標識するそれ以外の方法が米国特許第3,940,
475号および同第3,645,090号に記載されている。オリゴ
ヌクレオチドプローブを標識する方法は、例えば、Lear
yらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA（１９８３）８
０：４０４５；RenzおよびKurzによるNucl. Acids Res.
（１９８４）１２：３４３５；RichardsonおよびGumpor
tによるNucl. Acids Res.（１９８３）１１：６１６
７；SmithらによるNucl. Acids Res.（１９８５）：１
３：２３９９；およびMeinkothおよびWahlによるAnal.
Biochem.（１９８４）１３８：２６７に記載されてい
る。

【００７７】標識は放射性であってもよい。有用な放射
性標識のいくつかの例としては、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉお
よび³Ｈが挙げられる。放射性標識を用いることが英国
特許第2,034,323号、米国特許第4,358,535号および同第
4,302,204号に記載されている。

【００７８】非放射性標識のいくつかの例としては、酵
素、発色団、電子顕微鏡観察法により検出可能な原子お
よび分子、および磁気特性により検出可能な金属イオン
が挙げられる。

【００７９】いくつかの有用な酵素標識には、基質に検
出可能な変化を与える酵素が挙げられる。いくつかの有
用な酵素およびそれらの基質としては、例えば、西洋ワ
サビのペルオキシダーゼ（ピロガロールおよびｏ−フェ
ニレンジアミン）、β−ガラクトシダーゼ（フルオレセ
インβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）、およびアルカリ性
フォスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルフォスフェート／ニトロブルーテトラゾリン）が
挙げられる。酵素標識を用いることは、英国特許第2,01
9,404号、欧州特許第63,879号、およびRotmanによるPro
c. Natl. Acad.Sci., ４７，１９８１−１９９１（１９
６１）が挙げられる。

【００８０】有用な発色団としては、例えば、染料以外
に、蛍光性、化学発光性、および生物発光性の分子が挙
げられる。本発明で有用ないくつかの発色団としては、
例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、
フィコエリスリン、ウンベリフェロン、ルミノールが挙
げられる。

【００８１】標識は、当技術分野で十分公知ないかなる
方法により抗体またはヌクレオチドプローブに接合され
ていてもよい。標識は官能基を介してプローブに直接結
合させてもよい。プローブはそのような官能基を含有し
ているか、または含有するようにできる。適当な官能基
のいくつかの例としては、例えば、アミノ、カルボキシ
ル、スルフヒドリル、マレイミド、イソシアナート、イ
ソチオシアナートが挙げられる。

【００８２】標識もまた、上記の方法によりプローブに
結合したリガンド、およびリガンドが標識に結合するた
めのリセプターによってプローブと接合されていてもよ
い。いかなる公知のリガンド−リセプター結合も適当で
ある。ビオチン−アビジン結合が好ましい。

【００８３】本発明のポリペプチドは、試料中のN.meni
ngitidisに特異的な抗体の存在の検出に用いられてもよ
い。その方法は、溶血素群毒素の一つと実質的に相同す
るアミノ酸配列を有するセグメントを含有するポリペプ
チドの調製からなる。ポリペプチドは上記のようにして
調製してもよい。好ましくは、ポリペプチドはN.mening
itidisに存在するアミノ酸配列を有するセグメントを含
む。

【００８４】試料は、例えば、N.meningitidisに感染し
ていると思われる患者からのものであってもよい。適当
なアッセイは、当技術分野で公知であり、例えばR. H.
Kennethにより記載されている(Kennethら，Monoclonal
Antibodies, Plenum Press,N. Y., ３７６頁（１９８
１）の"Enzyme-Linked Antibody Assay with Cells Att
ached to Polyvinyl Chloride Plates") 標準的ＥＬＩ
ＳＡプロトコール等がある。

【００８５】要約すれば、プレートは、検出可能な量の
抗体を結合させるのに十分な濃度の抗原性ポリペプチド
で被覆されている。プレートをポリペプチドと共にイン
キュベートした後、プレートは例えば１０％標準ヤギ血
清等の適当なブロッキング剤でブロンクされる。患者の
血清等の試料を添加し、終点決定のための力価測定を行
う。陽性および陰性の対照試料を同時に加えて、未知な
試料に存在する抗体量を定量する。インキュベートに続
いて、適当な酵素に接合したヤギ抗ヒトＩｇで試料をプ
ローブ化する。試料中の抗ポリペプチド抗体の存在は酵
素の存在により示される。

【００８６】本発明のポリペプチドに対して生じる抗体
はN.meningitidisを認識し、試料中の髄膜炎菌細胞を淋
菌細胞と識別することができる。例えば、Ａ4.84モノク
ローナル抗体は鉄抑制髄膜炎菌細胞により発現されるポ
リペプチドを認識することができる。しかし、Ａ4.84は
鉄抑制N.gonorrhoeae中の蛋白質を認識しない。

【００８７】抗体は上記のような公知の方法により標識
化してもよい。鉄抑制髄膜炎菌細胞を鉄抑制淋菌細胞と
識別するためのアッセイは、標準ブロットやＥＬＩＳＡ
フォーマット等の公知のフォーマットに従って行う。

【００８８】

【実施例】実施例１．Ａ4.85ＭＡｂの単離細菌の外層膜を以下のようにしてNeisseria meningitid
is ＦＡＭ２０株の鉄抑制培養から調製する。ＦＡＭ２
０をケレックス・デファインド (chelexed defined)培
地(CDM, Westら, J. Bacteriology １６９，３４１４
（１９８７）)に接種する。この培地は、細菌内に貯蔵
されている鉄がなくなるまでしか生育できないようにな
っている。この間に、鉄利用性によって調節される一組
の蛋白質が発現するようになる。細菌を採取し、外層膜
をDyerらによるInfection and Immunity ５６，９７７
（１９８８）に記載されているようにして調製する。

【００８９】３〜５匹のメスのＢＡＬＢ／ｃのマウス
を、筋肉内(im)または腹腔内(ip)経路のいづれかにより
鉄抑制ＦＡＭ２０外層膜で免疫する。im経路を用いる場
合、０日目に１００ugの抗原(Ag)を完全フロイントアジ
ュバントに乳化して二つの異なる部位に注射し、続いて
ここで不完全フロイントアジュバントに乳化したAgで２
週間後にブースター注射を行う。ip経路では、０、７、
１４および２８日目に１００ugのAgで免疫する。血清抗
体レベルを求めるために、血清抗体レベルは、ＥＬＩＳ
Ａまたはウエスタンブロッティングのいずれかにより最
後のブースターを注射した後３日チェックされる。マウ
スは融合する前にそれぞれ連続した３日間に最後のブー
スターipを注射する。融合する日にマウスを頸部脱臼に
より屠殺し、脾臓を無菌的に取出す。脾細胞は２本の曲
がった１９ゲージ針を用いて嚢から細胞を細片化して抽
出する。抽出された細胞は再懸濁して単一細胞の懸濁液
にする。

【００９０】マウスのミエローマ細胞であるＳＰ2.0−
ＡＧ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）を、Dulbecco's
Modified Eagle's Mediumu／Ham's Ｆ−１２（ＤＭＥ
Ｍ／Ｆ１２）に１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加し
た培地で生育させ、これを融合相手として用いる。脾細
胞：ミエローマ細胞を１０：１の比率で混合し、５０mL
容遠心管内で共にペレットにする。上清を吸い取り、残
った乾燥ペレットに１mLの５０％ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）（３７℃に余熱したもの）を加える。細胞
をそっと再懸濁し、室温で２分間放置した後、血清を添
加しないＤＭＥＭ／Ｆ１２を１mL加え、さらに細胞をそ
っと再懸濁する。そして、細胞をさらに希釈し、２分間
隔で２、４、８、および１６mLのＤＭＥＭ／Ｆ１２を加
えて再懸濁する。そして細胞をペレットにして、上清を
吸い取る。１５％のＦＣＳを追添した２mLのＤＭＥＭ／
Ｆ１２を注意深く加えてペレットが再懸濁しないように
し、その後３７℃で１時間インキュベートする。

【００９１】１時間のインキュベートが終了したら、懸
濁液を希釈して最終濃度を１×１０ ⁶細胞／mLにする。
この懸濁液を組織培養フラスコに注ぎ、一夜インキュベ
ートする。翌日、２×ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミジン）成分を追添した同量の培養培地
を、９６ウェルのプレートに、１×１０⁵脾細胞／ウェ
ルで２００ｕｌ／ウェルとなるように入れる。その細胞
は、融合後４〜５日毎に培地の半分をウェルから吸い取
り、新規の１×ＨＡＴ培地を添加することにより栄養補
給される。ウェルは１０〜１４日後に生育が記録され、
生育しているウェルは、培養上清をＥＬＩＳＡまたはウ
エスタンブロッティングのいずれかでスクリーニングす
ることにより、分泌された抗体の存在がテストされる。
アッセイに陽性であると判明したウェルは、生育させる
ため、ＨＴ添加物（アミノプテリンは含有せず）を含む
培養培地中の２４ウェル培養皿に広げられ、再テストさ
れる。再テストで陽性と判明したものは、さらに大きい
組織培養槽に広げられ、それから制限希釈培養法により
２度クローン化される。

【００９２】単一のマウスの脾細胞から発生した細胞系
（Ａ4.85）が単離された。Ａ4.85は、合成が細菌生育培
地中の鉄の存在によりその各合成が抑制されるいくつか
の蛋白質種（質量が７０キロダルトン〜数百キロダルト
ン）とＦＡＭ２０外層膜のウエスタン・ブロット上で反
応するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生する。

【００９３】実施例２Ａ．染色体のクローンの単離Ａ．ライブラリーの作成Neisseria meningitidis ＦＡＭ２０株の染色体ＤＮＡ
のライブラリーは、バクテリオファージベクターλ−ｇ
ｔ１１において、以下のようにして作成される。ＦＡＭ
２０株染色体ＤＮＡは標準法(Maniatisら, １９８２)
により単離される。ＤＮＡは超音波処理によりおよそ３
００〜１０００ｂｐのフラグメント長に切断される。合
成ＥｃｏＲＩリンカーをこれらの分子の末端に連結し、
続いてＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで切り出さ
れ、各分子の末端にＥｃｏＲＩ制限部位が生じる。その
結果得られたフラグメントはＥｃｏＲＩ−切断λ−ｇｔ
１１ＤＮＡ(Maniatisら, Molecular Cloning：A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, Now York（１９８２）)と連結さ
れる。連結したＤＮＡは、λパッケージング抽出物(Pro
mega Corp., Madison,Wisconsin) を用いて、業者の指
示に従ってλファージ頭部にパッケージされる。

【００９４】Ｂ．ライブラリースクリーニングおよびＤ
ＮＡの単離Ａ4.85ＭＡｂで認識されるエピトープを発現するクロー
ンを検出するために、上記で作成されたライブラリーを
Ａ4.85ＭＡｂでスクリーンする。λ−ｇｔ１１発現ライ
ブラリーからの500,000の組み換えプラークが、Maniati
sら（１９８２）の方法によりスクリーンされる。Ａ4.8
5ＭＡｂと反応する精製クローンは、反応性プラークを
再プレーティングおよびスクリーニングを２度行うこと
により単離される。精製λクローン（λ4.85）からの髄
膜炎菌挿入ＤＮＡは、ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン（ＰＣＲ）技術によりPerkin−Elmer/Cetusのキット
を用いて増幅される。ＰＣＲ増幅ＤＮＡは、配列してい
るベクターＭ１３ｍｐ１９(Maniatisら，１９８２)、お
よびSangerらのジデオキシチェーンターミネーション法
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７４，５４６３−５４６
７（１９８７）)によりシークエナーゼキット(Stratage
ne, La Jolla,CA) を用いて決定されるＤＮＡ配列にク
ローン化される。

【００９５】クローン化された髄膜炎菌ＤＮＡは、Boeh
ringer−Mannheim(Indianapolis,IN) キットを用いてラ
ンダムプライムド(random primed) 法により³²Ｐで標識
され、λ4.85にクローン化されたＤＮＡに隣接するＦＡ
Ｍ２０染色体のＤＮＡ制限フラグメントを同定するため
にサザンハイブリダイゼーション (Maniatisら，１９８
２)に用いられる。およそ５６０および１６００ｂｐの
染色体のＳａｕ３ＡＩフラグメントは、クローン化髄膜
炎菌ＤＮＡにハイブリッドする。ＦＡＭ２０ＤＮＡはＳ
ａｕ３ＡＩで切断され、準備されたアガロースゲル上
で断片化される。二つのサイズのフラグメント、すなわ
ち４００〜７００ｂｐのものと１４００〜１８００ｂｐ
のものが単離される。

【００９６】５６０ｂｐのＳａｕ３ＡＩフラグメント
は、ＦＡＭ２０−Ｓａｕ３ＡＩフラグメントの４００
〜７００ｂｐのフラクションをＢａｍＨＩ−切断プラス
ミドｐＢＲ３２２と連結することによりクローン化され
る(Maniatisら，１９８２)。所望する５６０ｂｐのフラ
グメントのクローンは、３２Ｐ標識化λ4.85挿入ＤＮＡ
を有する組み換えプラスミドを含有する細菌コロニーの
ハイブリダイゼーションにより同定される(Maniatis
ら，１９８２)。ＤＮＡプローブとハイブリッドした純
粋なコロニーのプラスミドＤＮＡ（ｐＵＮＣＨ２０１）
を調製し、二本鎖配列化に用いるために修飾されたシー
クナーゼを用いてその配列を決定する(Kraftら, Bio Te
chniques ６，５４４（１９８８）)。クローン化フラグ
メントがＦＡＭ２０ゲノムにそのままの状態で存在する
フラグメントの典型であることを確認するために、サザ
ンハイブリダイゼーションが用いられる。

【００９７】１６００ｂｐのフラグメントをクローン化
するために、ＦＡＭ２０−Ｓａｕ３ＡＩフラグメント
の１４００〜１８００ｂｐのフラクションの末端をクレ
ノウ(Klenow)酵素およびＤＮＡヌクレオチドとの反応に
より平滑にする。合成ＥｃｏＲＩリンカーをこれらの分
子に添加し、続いてλＺＡＰＤＮＡキットで提供され
る技術的情報に従って、ＥｃｏＲＩで切断されたアルカ
リ性フォスファターゼ処理λＺＡＰＤＮＡ(Stratagen
e, La Jolla, CA)と連結させる。連結したＤＮＡは、パ
ッカジーン(Packagene) λパッケージング抽出物(Prome
ga) を用いてλ頭部にパッケージされる。１４００〜１
８００ｂｐのＦＡＭ２０−Ｓａｕ３ＡＩフラグメントの
ライブラリーは³²Ｐ標識化オリゴヌクレオチド（ＳＡＴ
１）でスクリーンされ、λ4.85挿入部の一端でＤＮＡ配
列と一致するよう合成される(5' GCCATTGCCACTGTAGATA
3'：配列番号４) 。ＳＡＴ１オリゴヌクレオチドとハイ
ブリッドしているλＺＡＰプラークは上記のようにして
精製される。λＺＡＰクローン（λＺＡＰ２０２）の内
側部はヘルパーバクテリオファージの添加により“切り
出される”。その切り出しにより、クローン化髄膜炎菌
挿入部を含有する多複写プラスミド（ｐＵＮＣＨ２０
２）が得られる。クローン化フラグメントがＦＡＭ２０
ゲノムにそのままの状態で存在するフラグメントの典型
であることを確認するには、サザンハイブリダイゼーシ
ョンを用いる。クローン化ＤＮＡフラグメントの配列
は、上記のような二本鎖に配列することにより決定され
る。

【００９８】ｐＵＮＣＨ２０１、ｐＵＮＣＨ２０２、及
びλ4.85挿入部の隣接配列により、クローン化ＤＮＡ全
体を含有するオープンリーディングフレームの存在が判
明する。遺伝子の開始点も末端もクローン化ＤＮＡには
存在しない。図１及び図２にそのＤＮＡ配列を示す。オ
ープンリーディングフレームにより予示されるアミノ酸
配列は８３５個のアミノ酸（９１ｋＤ）を含有する。そ
の配列を図３に示す。ＦＡＳＴＡ配列比較検索（上記参
照）により決定されたように、ＤＮＡも、この領域から
予測されるポリペプチド配列も、細菌毒素の溶血素群と
高度に類似する。例えば、図１及び図２に示したＤＮＡ
配列はB.pertussisのｃｙａ遺伝子（アデニル酸シクラ
ーゼ）と５４％；E.coliのｈｌｙＡ、ｈｌｙＢ、ｈｌｙ
Ｃ、およびｈｌｙＤ遺伝子（溶血素）と６０％；E.coli
のｈｌｙＡ、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＣ遺伝子（溶血素）
と６５％；A.actinomycetemcomitansのロイコトキシン
遺伝子と５６％；A.pleuropneumoniaeの溶血素遺伝子と
５６％；P.haemolyticaのロイコトキシン遺伝子と６０
％；P.haemolyticaのＡ１ロイコトキシン遺伝子と６２
％；およびE.chrvsanthemiのプロテアーゼＢ遺伝子と５
７％の同一性を示す。

【００９９】このＤＮＡ配列から予示されるアミノ酸配
列は、ロイコトキシンと２５％〜２８％；溶血素と２２
％〜２８％；およびアデニル酸シクラーゼと３０％の同
一性を示す。

【０１００】髄膜炎菌ＦＡＭ２０株には、本発明ポリペ
プチドをコードするＤＮＡのコピーが少なくとも二つ含
まれる。このことは、染色体ＤＮＡを、切断頻度の低い
ＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、およびＮｈｅＩとＳ
ｐｅＩを組み合わせたもので消化することにより証明す
ることができる。パルスフィールド勾配電気泳動により
分離される消化されたＤＮＡのサザンブロッツは、厳し
い条件下、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子配
列のフラグメントを含有する遺伝子プローブとハイブリ
ッドする二つの主要なバンドを示す。

【０１０１】本発明の鉄調節ポリペプチドをコードする
遺伝子の残部は、ｐＵＮＣＨ２０１およびｐＵＮＣＨ２
０２を単離するための上記の方法と類似した方法で単離
される。すでにクローン化された領域の端に隣接する、
あるいはその完全な領域を含有するＤＮＡ制限フラグメ
ントは、予め決定されたＤＮＡ配列由来のオリゴヌクレ
オチドのプローブを用いたサザンハイブリダイゼーショ
ンにより同定される。これらのフラグメントは、ｐＵＮ
ＣＨ２０１およびｐＵＮＣＨ２０２のクローン化で上記
したようにしてプラスミドあるいはバクテリオファージ
ーベクターのいずれかにクローン化される。新たにクロ
ーン化されたフラグメントのＤＮＡ配列は上記のように
して決定され、遺伝子のいずれかの末端に到達した時判
明する。遺伝子が単一のＤＮＡフラグメントで単離され
る場合、この遺伝子によりコードされる蛋白質がＡ48.5
ＭＡｂと反応することを確認するためのインビトロのア
ッセイで発現する。その遺伝子が単一のＤＮＡフラグメ
ントで完全にクローン化されない場合は、完全な遺伝子
を得るために標準的な分子生物学的技術により再構築さ
れる(Carbonetti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８
４，９０８４（１９８７）)。

【０１０２】例えば、本発明のポリペプチドをコードし
ている構造遺伝子の二つのコピーのうちの一つからのＤ
ＮＡフラグメントがアガロースゲルで精製され、クロー
ン化および配列された。図４及び図５はそのＤＮＡ配列
を示すものであり（配列番号３）、遺伝子５’末端で完
結する。図４及び図５において下線を引いた部分は−３
５および−１０領域を有する典型的なプロモーター、リ
ボゾーム結合部位、ＡＴＧ開始部位、および共通するフ
ァーボックス(fur box) であり、グラム陰性鉄調節プロ
モーターにおいて典型的に見られるものである。

【０１０３】実施例２Ｂ．ウエスタンブロットおよび分
子量髄膜炎菌ＦＡＭ２０株から得られる完全なポリペプチド
は、ウエスタンブロット分析により２３０〜２５０ｋＤ
の分子量を示す。ウエスタンブロットは以下のようにし
て行ってもよい。すなわち：

【０１０４】鉄飢餓処理したＦＡＭ２０の全細胞を、We
stおよびSparlingによるJ. Bacteriol. １６９，３４１
４−３４２１（１９８７）の方法に従って調製する。細
胞を氷冷ディビス(Davis) 最小培地Ａ(Lederberg, Meth
ods in Med. Res., ３：５（１９５０）)中で洗浄し、
すぐに氷中で冷却し、０℃、20,000psi でフレンチ・プ
レッシャー・セル(French pressure cell)内で破裂させ
る。得られた混合物を１０分間、20,000Ｇで遠心分離
し、沸騰させたＳＤＳに溶解したペレットを得る。溶解
した膜蛋白質は、ラエムリ(Laemli)緩衝液中で標準的な
7.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されるが、そのこと
はLaemlによるNature ２２７，６８０−６８５（１９７
０）に記載されていた。蛋白質は移動して（１６時間，
８０ｕA ）オプティバインド(Optibind)ニトロセルロー
ス膜(Schleicher &Schuellのものが利用できる)上に移
る。その膜を、５％ＢＳＡのＴＢＳ（２０mM トリス，
５００mM NaCl, pH7.5）で１時間ブロックし；ＴＢＳ
で５分間すすぎ；５％ＢＳＡ中でモノクローナル抗体Ａ
48.5（上記参照）を１：２に希釈して１時間インキュベ
ートし；ＴＢＳおよび0.05％Tween２０で５分間、２度
洗浄し；５％ＢＳＡで希釈された二次抗体（ヤギ抗マウ
スＩｇＧアルカリ性フォスファターゼ接合）中で１時間
インキュベートし(BioRad社製（希釈率＝１：3000）ま
たはSigma社製（希釈率＝１：1000）が使用可能であ
る)；ＴＢＳ／Tween で５分間、３度洗浄し；再度ＴＢ
Ｓで５分間洗浄し；１０mLの炭酸緩衝液（pH9.8）(0.1M
NaHCO３；１mM MgCｌ₂)中に４５ｕｌニトロブルーテト
ラゾリン(Sigma社製（７５mg／mL）が使用できる)、３
５ｕｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォ
スフェイト、ｐ−トルニジン塩（５０mg／mL）を含有す
るアルカリフォスファターゼ基質で展開する。

【０１０５】実施例３．試料中の抗体のアッセイ蛋白質内のポリペプチドに対する抗体の存在をスクリー
ンするために、標準ＥＬＩＳＡプロトコールが用いられ
る。要約すれば、９６ウェルのマイクロタイタープレー
トを、高pH（9.6）炭酸緩衝液で、抗原を５０〜1000ｎg
／ウェルの濃度に換えて被覆する。プレートを９℃で一
昼夜インキュベートし、１０％標準ヤギ血清で３７℃で
１時間ブロックする。患者の血清を添加し、終点を決定
するために力価を測定する。対照試料の陽性および陰性
血清を同時に添加し、未知の試料中に存在する目的の抗
体量を定量する。３７℃で２〜３時間インキュベートし
た後、試料を西洋ワサビのパーオキシダーゼに接合する
ヤギ−抗ヒトＩｇでプローブ化する。ＴＭＢを用いて陽
性の試料を決定する。

【０１０６】特許請求の範囲の発明は、本明細書および
容易に利用可能の引用文献や出発物質により実施可能で
ある。さらに、本発明の実施および使用を簡便にするた
めに、以下の細胞系を１９９０年７月１２日にAmerican
Type Culture Collection,Bethesda,Maryland に寄託
している。髄膜炎菌細胞系ＦＡＭ１８（承認番号５５０７１）髄膜炎菌細胞系ＦＡＭ２０（承認番号５５０７２）ハイブリドーマ細胞系Ａ4.85（承認番号ＨＢ１０５０
４）

【０１０７】さらに、以下の有用なプロトコールおよび
情報を含むパンフレットが本明細書のファイルヒストリ
ーにおいて利用できる。 “Predigested Lambda Zap/Eco RI Cloning Kit Instru
ction Manual.”Stratagene, La Jolla, California (N
ovember 20, 1987);“Gigapack Plus”(for packaging
recombinant lambda phage), Stratagene,La Jolla, Ca
lifornia(April 25, 1988); および“picoBlue Immunos
creening Kit Instruction Manual ,”Stratagenea, La
Jolla, California (May 19,1989).

【０１０８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF NORTH CAROLINA <120> ANTIGENIC IRON REPRESSIBLE PROTEINS FROM N.MENINGITIDIS RELATED TO THE HEMOLYSIN FAMILY OF TOXINS <130> P05091311 <140> <141> <150> US 552,649 <151> 1990-07-16 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2721 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 1 gaattccctg aatgggcaag agagtggttg aaattagatc ccaaacgttc aggcaaatat 60 catgtctacg accccctcgc cctagatcta gacggcgacg gtatagaaac cgttgctgcc 120 aaaggctttg caggtggatt gttcgaccac cgcaatcaag gcatccgcac cgccaccggt 180 tgggtttctg ccgatgacgg tttactcgtc cgcgatttga acggcaacgg catcatcgac 240 aacggcgcgg aactcttcgg cgacaacacc aaactggcag acggttcttt tgccaaacac 300 ggctatgcag ctttggccga attggattca aacggcgaca acatcatcaa cgcggcagac 360 gccgcattcc aaaccctgcg tgtatggcag gatctcaacc aggacggcat ttcccaagct 420 aatgaattgc gtacccttga agaattgggt atccaatctt tggatctcgc ctataaagat 480 gtaaataaaa atctcggtaa cggtaacact ttggctcagc aaggcagcta taccaaaaca 540 gacggtacaa ccgcaaaaat gggggattta cttttagcag ccgacaatct gcacagccgc 600 ttcaaagaca aagtggaact cactgccgaa caggcaaaag ccgccaatct tgcgggcatc 660 ggccgtctgc gcgatttgcg cgaagctgcc gcattgtccg gcgatttggc caatatgctg 720 aaagcttatt ctgccgccga aactaaagaa gcacagttgg cattgttaga taatttgatt 780 cacaaatggg cggaaaccga ttcgaactgg ggcaaaaaat cgccaatgcg actttcaacc 840 gattggacgc aaacggctaa tgaaggtatt gcactgacac catcccaagt agcacaacta 900 aaaaagaacg ctttagtttc cctttctgat aaagctaaag cagctattga cgccgcccgc 960 gaccgcattg ccgtgcttga tgcctacacg gggcaggatt ccagcacact ctattacatg 1020 agcgaagaag acgcgcttaa tatcgtcaaa gtaaccaacg atacatacga ccatctcgcc 1080 aaaaacatct accaaaacct gttgttccaa acccgtttgc agccatattt gaatcaaatc 1140 agtttcaaaa tggaaaatga tacgttcact ttggatttta gtggtcttgt tcaagcattt 1200 aaccatgtca aagaaactaa tccgcaaaaa gcttttgtgg atttggccga gatgcttgca 1260 tatggcgaac ttcgttcttg gtatgaaggc cgaagactaa tggccgatta tgtggaggag 1320 gcaaaaaaag caggtaaatt tgaagattac cagaaagtgt tgggtcagga gaccgttgca 1380 ttattagcta aaacatcggg tacgcaagca gatgatatcc tgcaaaatgt aggctttggt 1440 cataataaaa atgtttcttt atatggtaat gacggcaacg acactctaat cggcggtgca 1500 ggcaatgatt acttggaggg cggcagcggt tcggatactt atgtcttcgg caaaggcttc 1560 ggtcaggata cggtctataa ttacgactac gctaccggac gcaaagacat catccgcttt 1620 accgacggta ttacagccga tatgctgact tttacccgag agggcaacca tcttcttatc 1680 aaggcaaaag acgacagtgg acaagtgact gttcagtcct atttccagaa cgatggctca 1740 ggtgcttacc gtatcgatga gattcatttc gataacggca aagtactgga tgttgccact 1800 gtcaaagaac tggtacagca atccaccgac ggttcggaca gattgtatgc ctaccaatcc 1860 ggaagtacct taaatggcgg attgggcgat gactatctgt acggtgccga cgggaatgac 1920 ctgctgaatg gtgatgcagg caacgacagt atctacagtg gcaatggcaa tgatacgctc 1980 gatggaggag aaggcaacga cgccctgtac ggctataatg gtaacgatgc actgaatggt 2040 ggcgaaggca atgatcattt gaacggcgaa gacggtaacg acactctgat cggcggtgcc 2100 ggtaatgatt acttggaggg cggcagcggt tcggatactt atgtcttcgg caaaggcttc 2160 ggtcaggata cggtctataa ttacgactac gctaccggac gcaaagacat catccgcttt 2220 accgacggta ttacagccga tatgctgact tttacccgag agggcaacca tcttcttatc 2280 aaggcaaaag acggcagtgg acaagtgact gttcagtcct atttccagaa cgatggctca 2340 ggtgcttacc gtatcgatga gattcatttc gataacggca aagtactgga tgttgccact 2400 gtcaaaaaac tggtacagca atccaccgac ggttcggaca gattgtatgc ctaccaatcc 2460 ggaagtacct taaatggcgg attgggcgat gactatctgt acggtgccga cggggatgac 2520 ctgctgaatg gtgatgcagg caacgacagt atctacagtg gcaatggcaa tgatacgctc 2580 aatggaggag aaggcaacga cgccctgtac ggctataatg gtaacgatgt actgaatggt 2640 gccgaaggca atgatcattt gaacggcgaa gacggtaacg acactctaat cggcggtgca 2700 gggcaatgat tacttggagg g 2721 <210> 2 <211> 900 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 2 Phe Pro Glu Trp Ala Arg Glu Trp Leu Lys Leu Asp Pro Lys Arg Ser 1 5 10 15 Gly Lys Tyr His Val Tyr Asp Pro Leu Ala Leu Asp Leu Asp Gly Asp 20 25 30 Gly Ile Glu Thr Val Ala Ala Lys Gly Phe Ala Gly Ala Leu Phe Asp 35 40 45 His Arg Asn Gln Gly Ile Arg Thr Ala Thr Gly Trp Val Ser Ala Asp 50 55 60 Asp Gly Leu Leu Val Arg Asp Leu Asn Gly Asn Gly Ile Ile Asp Asn 65 70 75 80 Gly Ala Glu Leu Phe Gly Asp Asn Thr Lys Leu Ala Asp Gly Ser Phe 85 90 95 Ala Lys His Gly Tyr Ala Ala Leu Ala Glu Leu Asp Ser Asn Gly Asp 100 105 110 Asn Ile Ile Asn Ala Ala Asp Ala Ala Phe Gln Thr Leu Arg Val Trp 115 120 125 Gln Asp Leu Asn Gln Asp Gly Ile Ser Gln Ala Asn Glu Leu Arg Thr 130 135 140 Leu Glu Glu Leu Gly Ile Gln Ser Leu Asp Leu Ala Tyr Lys Asp Val 145 150 155 160 Asn Lys Asn Leu Gly Asn Gly Asn Thr Leu Ala Gln Gln Gly Ser Tyr 165 170 175 Ile Lys Thr Asp Gly Thr Thr Ala Lys His Gly Asp Leu Leu Leu Ala 180 185 190 Ala Asp Asn Leu His Ser Arg Phe Lys Asp Lys Val Glu Leu Thr Ala 195 200 205 Glu Gln Ala Lys Ala Ala Asn Leu Ala Gly Ile Gly Arg Leu Arg Asp 210 215 220 Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Ser Gly Asp Leu Ala Asn Met Leu Lys 225 230 235 240 Ala Tyr Ser Ala Ala Glu Thr Lys Glu Ala Gln Leu Ala Leu Leu Asp 245 250 255 Asn Leu Ile His Lys Trp Ala Glu Thr Asp Ser Asn Trp Ser Lys Lys 260 265 270 Ser Phe Met Arg Leu Ser Thr Asp Trp Thr Gln Thr Ala Asn Glu Gly 275 280 285 Ile Ala Leu Thr Pro Ser Gln Val Ala Gln Leu Lys Lys Asn Ala Leu 290 295 300 Val Ser Leu Ser Asp Lys Ala Lys Ala Ala Ile Asp Ala Ala Arg Asp 305 310 315 320 Arg Ile Ala Val Leu Asp Ala Tyr Thr Gly Gln Asp Ser Ser Thr Leu 325 330 335 Tyr Tyr Met Ser Glu Glu Asp Ala Leu Asn Ile Val Lys Val Thr Asn 340 345 350 Asp Thr Tyr Asp His Leu Ala Lys Asn Ile Tyr Gln Asn Leu Leu Phe 355 360 365 Gln Thr Arg Leu Gln Pro Tyr Leu Asn Gln Ile Ser Phe Lys Met Glu 370 375 380 Asn Asp Thr Phe Thr Leu Asp Phe Ser Gly Leu Val Gln Ala Phe Asn 385 390 395 400 His Val Lys Glu Thr Asn Pro Gln Lys Ala Phe Val Asp Leu Ala Glu 405 410 415 Met Leu Ala Tyr Gly Glu Leu Arg Ser Trp Tyr Glu Gly Phe Arg Leu 420 425 430 Met Ala Asp Tyr Val Glu Glu Ala Lys Lys Ala Gly Lys Phe Glu Asp 435 440 445 Tyr Gln Lys Val Leu Gly Gln Glu Thr Val Ala Leu Leu Ala Lys Thr 450 455 460 Ser Gly Thr Gln Ala Asp Asp Ile Leu Gln Asn Val Gly Phe Gly His 465 470 475 480 Asn Lys Gln Val Ser Leu Tyr Gly Asn Asp Gly Asn Asp Thr Leu Ile 485 490 495 Gly Gly Ala Gly Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Gly Ser Gly Ser Asp Thr 500 505 510 Tyr Val Thr Gly Lys Gly Phe Gly Gln Asp Thr Val Tyr Asn Tyr Asp 515 520 525 Tyr Ala Thr Gly Arg Lys Asp Ile Ile Arg Phe Ile Asp Gly Ile Thr 530 535 540 Ala Asp Met Leu Thr Phe Thr Arg Glu Gly Asn His Leu Leu Ile Lys 545 550 555 560 Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Val Thr Val Gln Ser Tyr Phe Gln Asn 565 570 575 Asp Gly Ser Gly Ala Tyr Arg Ile Asp Glu Ile His Phe Asp Asn Gly 580 585 590 Lys Val Leu Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Leu Val Gln Gln Ser Ile 595 600 605 Asp Gly Ser Asp Arg Leu Tyr Ala Tyr Gln Ser Gly Ser Thr Leu Asn 610 615 620 Gly Gly Leu Gly Asp Asp Tyr Leu Tyr Gly Ala Asp Gly Asn Asp Leu 625 630 635 640 Leu Asn Gly Asp Ala Gly Asn Asp Ser Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Asn 645 650 655 Asp Thr Leu Asp Gly Gly Glu Gly Asn Asp Ala Leu Tyr Gly Tyr Asn 660 665 670 Gly Asn Asp Ala Leu Asn Gly Gly Glu Gly Asn Asp His Leu Asn Gly 675 680 685 Glu Asp Gly Asn Asp Thr Leu Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asp Tyr Leu 690 695 700 Glu Gly Gly Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Val Phe Gly Lys Gly Phe Gly 705 710 715 720 Gln Asp Thr Val Tyr Asn Tyr Asp Tyr Ala Thr Gly Arg Lys Asp Ile 725 730 735 Ile Arg Phe Thr Asp Gly Ile Thr Ala Asp Met Leu Thr Phe Thr Phe 740 745 750 Glu Gly Asn His Leu Leu Ile Lys Ala Lys Asp Gly Ser Gly Gln Val 755 760 765 Thr Val Gln Ser Tyr Phe Gln Asn Asp Gly Ser Gly Ala Tyr Arg Ile 770 775 780 Asp Glu Ile His Phe Asp Asn Gly Lys Val Leu Asp Val Ala Thr Val 785 790 795 800 Lys Lys Leu Val Gln Gln Ser Thr Asp Gly Ser Asp Arg Leu Tyr Ala 805 810 815 Tyr Gln Ser Gly Ser Thr Leu Asn Gly Gly Leu Gly Asp Asp Tyr Leu 820 825 830 Tyr Gly Ala Asp Gly Asp Asp Leu Leu Asn Gly Asp Ala Gly Asn Asp 835 840 845 Ser Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Asn Asp Thr Leu Asn Gly Gly Glu Gly 850 855 860 Asn Asp Ala Leu Tyr Gly Tyr Asn Gly Asn Asp Val Leu Asn Gly Ala 865 870 875 880 Glu Gly Asn Asp His Leu Asn Gly Glu Asp Gly Asn Asp Thr Leu Ile 885 890 895 Gly Gly Ala Gly 900 <210> 3 <211> 2784 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 3 ttatatgtct ttatttgaat atatcttacg atggggaaat atttatatat tttataataa 60 attttactca tttgctaata tgtcatggaa tattacttgt attttgtaga atttttccat 120 atgaaaatat tccatttact atttttctga actttattag tttattttta atatttttac 180 ctcttatatt taccataaga gagctaattg attcatatta tattgagtcg ataattaatt 240 tattcttaat tttaattcct cacgttattt ttttaattta cttgaaagga aagcagatat 300 gacatctgca aattttaata ttaacggttt tggagatgtg aaattaacac cctattcacc 360 actcttggga tataaagctt gggattcatt tattggttct attcaatcct tatctgattt 420 aatctataat gtggataaca atagaaataa aatggaaatt actgttaata atgctatcca 480 agctgcagat agctttttaa gcagtattgg aagagataac aaaataacaa atactgcttc 540 tttacttgca tccctcgata acattttttt aaatttaaga aatgtatctc gagatatacg 600 agaaacagga aaatttaaac ctaatgatat tcaacaagca attggtgata tattcattgc 660 tgctggtgat ggattacaat atataaaaca acaaacagag gcgatggctc aaagcaaatt 720 cttaccaact aaattaaaaa ctggtttaaa tgatgtcctt aattctagaa tgctaaaatc 780 ctctactgtt ttacagcatg aattgaatta tttgggattt aaaataaagg attatggaaa 840 cgagaggctt ggcgaatcta taatgaatat agatgatttt acaccaagta agatagcaaa 900 cttttttgcg gatcctgata catacagcaa tgtattagaa gaagtatcta ggtttatata 960 ttccttagtt cctgatgatg caaacccttg gaaagggggc gaagattata ttggacgagg 1020 gataagtgaa tggggagagt tactggaaaa atggtataaa caagattttc tcccttatct 1080 tgaaaaagaa tgggaccaat ttccgaaatt tgaagattgg ctgcctgaat tccctgaatg 1140 ggcaagagag tggttgaaat tagatcccaa acgttcaggc aaatatcatg tctacgaccc 1200 cctcgcccta gatctagacg gcgacggtat agaaaccgtt gctgccaaag gctttgcagg 1260 tgcattgttc gaccaccgca atcaaggcat ccgcaccgcc accggttggg tttctgccga 1320 tgacggttta ctcgtccgcg atttgaacgg caacggcatc atcgacaacg gcgcggaact 1380 cttcggcgac aacaccaaac tggcagacgg ttcttttgcc aaacacggct atgcagcttt 1440 ggccgaattg gattcaaacg gcgacaacat catcaacgcg gcagacgccg cattccaaac 1500 cctgcgtgta tggcaggatc gcaaccagga cggcatttcc caagctaatg cagctatacc 1560 aaaacagacg gtacaaccgc aaaaatgggg gatttacttt tagcagccga caatctgcac 1620 agccgcttca aagacaaagt ggaactcact gccgaacagg caaaagccgc caatcttgcg 1680 ggcatcggcc gtctgcgcga tttgcgcgaa gctgccgcat tgtccggcga tttggccaat 1740 atgctgaaag cttattctgc cgccgaaact aaagaagcac agttggcatt gttagataat 1800 ttgattcaca aatgggcgga aaccgattcg aactggggca aaaaatcgcc aatgcgactt 1860 tcaaccgatt ggacgcaaac ggctaatgaa ggtattgcac tgacaccatc ccaagtagca 1920 caactaaaaa agaacgcttt agtttccctt tctgataaag ctaaagcagc tattgacgcc 1980 gcccgcgacc gcattgccgt gcttgatgcc tacacggggc aggattccag cacactctat 2040 tacatgagcg aagaagacgc gcttaatatc gtcaaagtaa ccaacgatac atacgaccat 2100 ctcgccaaaa acatctacca aaacctgttg ttccaaaccc gtttgcagcc atatttgaat 2160 caaatcagtt tcaaaatgga aaatgatacg ttcactttgg attttagtgg tcttgttcaa 2220 gcatttaacc atgtcaaaga aactaatccg caaaaagctt ttgtggattt ggccgagatg 2280 cttgcatatg gcgaacttcg ttcttggtat gaaggccgaa gactaatggc cgattatgtg 2340 gaggaggcaa aaaaagcagg taaatttgaa gattaccaga aagtgttggg tcaggagacc 2400 gttgcattat tagctaaaac atcgggtacg caagcagatg atatcctgca aaatgtaggc 2460 tttggtcata ataaaaatgt ttctttatat ggtaatgacg gcaacgacac tctaatcggc 2520 ggtgcaggca atgattactt ggagggcggc agcggttcgg atacttatgt cttcggcaaa 2580 ggcttcggtc aggatacggt ctataattac gactacgcta ccggacgcaa agacatcatc 2640 cgctttaccg acggtattac agccgatatg ctgactttta cccgagaggg caaccatctt 2700 cttatcaagg caaaagacga cagtggacaa gtgactgttc agtcctattt ccagaacgat 2760 ggctcaggtg cttaccgtat cgat 2784 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: designed DNA based on Neisseria meningitidis gene <400> 4 gccattgcca ctgtagata 19

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明ポリペプチドをコードする部分塩基配列
のうち、１〜１３５１番目までを示す図である。

【図２】本発明ポリペプチドをコードする部分塩基配列
のうち、１３５２〜２７０１番目までを示す図である。

【図３】本発明ポリペプチドの部分アミノ酸配列を示す
図である。

【図４】本発明ポリペプチドをコードする部分塩基配列
のうち、１４０１〜２９５１番目までを示す図である。

【図５】本発明のポリペプチドをコードする塩基配列の
うち、２９５１〜４３０１番目を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/22 Ｃ０７Ｋ 16/12 ４Ｈ０４５ 16/12 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 ＭＮ 33/569 Ｆ 33/569 33/577 Ｂ 33/577 33/62 Ａ 33/62 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者トンプソン，スチュアート，アランアメリカ合衆国 27510 ノースカロライナ州，カールボロ，イー６オールドウェルアパートメントＦターム(参考） 2G045 CB21 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA38 CA03 4B063 QA01 QA13 QA18 QR55 QS34 4B064 AG27 CC24 4C085 AA03 AA05 AA14 BA11 BA16 BA17 BA18 BA21 BA22 BA43 CC07 DD61 DD62 DD86 4H045 AA10 BA10 CA11 DA75 DA83 EA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも５０アミノ酸残基を有するセ
グメントを含み、該セグメントのアミノ酸配列がN.meni
ngitidisに存在し、かつ該アミノ酸配列が溶血素群毒素
の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異なるが、実質
的には相同する、単離された抗原性ポリペプチド、また
は該ポリペプチドの抗原性フラグメント。
【請求項２】セグメントが少なくとも１００アミノ酸
残基を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】セグメントが少なくとも２００アミノ酸
残基を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】実質的に純粋な形態である、請求項１記
載のポリペプチド。
【請求項５】抗原性アミノ酸配列が免疫性である、請
求項１記載のポリペプチド。
【請求項６】ポリペプチドに対する抗体が、その他の
細菌属由来である溶血素群毒素の少なくとも一つと交叉
反応する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】その他の細菌の属がEscherichia、Serra
tia、Pasteurella、Proteus、Actinobacillus、およびB
ordetellaを含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項８】その他の溶血素群毒素がEscherichia co
li由来のα−溶血素；Actinobacillus actinomycetemco
mitans由来のロイコトキシン；Pasteurellahaemolytica
由来のロイコトキシン；Bordetella pertussis由来のア
デニル酸シクラーゼ；およびBacillus anthraces由来の
アデニル酸シクラーゼを含む、請求項６記載のポリペプ
チド。
【請求項９】その他の溶血素群毒素がE.coli由来のα
−溶血素である、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項１０】 (a)少なくとも５０アミノ酸残基を有
するセグメントを含み、該セグメントの該アミノ酸配列
が溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは
異なるが、実質的には相同する、単離された抗原性ポリ
ペプチド、またはそのようなポリペプチドの抗原性フラ
グメントを調製すること；および (b)該ポリペプチドまたは該フラグメントを哺乳動物に
対して非毒性にすることの工程を含むN.meningitidisの
感染から哺乳動物を保護するのに有用な抗原の製造方
法。
【請求項１１】アミノ酸配列がN.meningitidisに見出
されるポリペプチドに存在する、請求項１０記載の方
法。
【請求項１２】 (a)少なくとも５０アミノ酸残基を有
するセグメントを含み、該セグメントの該アミノ酸配列
が溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは
異なるが、実質的には相同する、単離された抗原性ポリ
ペプチド、またはそのようなポリペプチドの抗原性フラ
グメントを調製すること； (b)該ポリペプチドを哺乳動物に対して非毒性にするこ
と；および (c)該非毒性ポリペプチドを薬物上許容可能なキャリヤ
と結合させることの工程を含む、哺乳動物をN.meningit
idisの感染から保護するのに有用なワクチン組成物の製
造方法。
【請求項１３】ポリペプチドがN.meningitidisから単
離されたものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】該哺乳動物がヒトである、請求項１２
記載の方法。
【請求項１５】 (a)哺乳動物に非毒性であり、少なく
とも５０アミノ酸残基を有するセグメントを含み、該ア
ミノ酸配列が溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ
酸配列とは異なるが、実質的には相同する免疫原性ポリ
ペプチド、またはそのようなポリペプチドの抗原性フラ
グメント、 (b)薬物的に許容可能なキャリヤを含有する、N.meningi
tidis感染に対して哺乳動物を免疫することが可能なワ
クチン組成物。
【請求項１６】ポリペプチドがN.meningitidisに存在
する、請求項１５記載のワクチン組成物。
【請求項１７】ポリペプチドがN.meningitidisの外層
膜に存在する、請求項１５記載のワクチン組成物。
【請求項１８】少なくとも５０アミノ酸残基を有する
セグメントを含み、該セグメントのアミノ酸配列がN.me
ningitidisに存在し、該セグメントのアミノ酸配列が溶
血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異な
るが、実質的に相同するポリペプチド、またはそのよう
なポリペプチドの抗原性フラグメントに対して産生され
るモノクローナル抗体。
【請求項１９】少なくとも５０アミノ酸残基を有する
セグメントを含み、該セグメントの該アミノ酸配列がN.
meningitidisに存在し、該アミノ酸配列が溶血素群毒素
の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異なるが、実質
的に相同するポリペプチド、またはそのようなポリペプ
チドの抗原性フラグメントをコードする、単離された核
酸分子。
【請求項２０】 (a)少なくとも５０アミノ酸残基を有
するセグメントを含み、該セグメントの該アミノ酸配列
が実質的に溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸
配列と相同する、単離された抗原性ポリペプチド、また
はそのようなポリペプチドの抗原性フラグメントを調製
すること；および (b)該ポリペプチドが試料中の抗体を認識するかどうか
を決定することの工程を含む、試料中のN.meningitidis
に特異的な抗体の存在を検出する方法。
【請求項２１】ポリペプチドがN.meningitidisに存在
するアミノ酸配列からなる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】 N.meningitidisに存在するアミノ酸配
列を有し、該アミノ酸配列が９アミノ酸の溶血素共通配
列の少なくとも３つの繰り返しを含み、該溶血素共通配
列が位置１にあるＬ；位置３にあるＧ；位置４にある
Ｇ；位置６にあるＧ；位置７にあるＮ；位置８にある
Ｄ；および位置２、５および９にあるｘ（ｘはいずれか
の単一のアミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つ
を含むセグメントを含有する単離されたポリペプチド、
およびそのようなポリペプチドの抗原性フラグメント。
【請求項２３】セグメントが少なくとも１００アミノ
酸残基を有する、請求項２２記載のポリペプチド。
【請求項２４】セグメントが少なくとも２００アミノ
酸残基を有する、請求項２２記載のポリペプチド。
【請求項２５】実質的に純粋な形態である、請求項２
２記載のポリペプチド。
【請求項２６】抗原性アミノ酸配列が免疫原性であ
る、請求項２２記載のポリペプチド。
【請求項２７】その他の溶血素群毒素の少なくとも一
つと交叉反応するポリペプチドに対する抗体がその他の
細菌属由来である、請求項２２記載のポリペプチド。
【請求項２８】その他の細菌属がEscherichia、Serra
tia、Pasteurella、Proteus、ActinobacillusおよびBor
detellaである、請求項２２記載のポリペプチド。
【請求項２９】その他の溶血素群毒素がEscherichia
coli由来のα−溶血素；Actinobacillus actinomycetem
comitans由来のロイコトキシン；Pasteurella haemolyt
ica由来のロイコトキシン；Bordetella pertussis由来
のアデニル酸シクラーゼ；およびBacillus anthraces由
来のアデニル酸シクラーゼを含む、請求項２７記載のポ
リペプチド。
【請求項３０】その他の溶血素群毒素がE.coli由来の
α−溶血素を含む、請求項２７記載のポリペプチド。
【請求項３１】 (a)９個のアミノ酸の溶血素共通配列
の少なくとも３つの繰り返しを含み、該溶血素共通配列
が位置１にあるＬ；位置３にあるＧ；位置４にあるＧ；
位置６にあるＧ；位置７にあるＮ；位置８にあるＤ；お
よび位置２、５および９にあるｘ（ｘはいずれかの単一
アミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含むア
ミノ酸配列を有するセグメントを含む、単離されたポリ
ペプチド；またはそのようなポリペプチドの抗原性フラ
グメントを調製すること；および (b)該ポリペプチドまたはフラグメントを哺乳動物に対
して非毒性にすることの工程を含む、哺乳動物をN.meni
ngitidis感染から保護するのに有用な抗原の製造方法。
【請求項３２】アミノ酸配列がN.meningitidisに見出
されるポリペプチドに存在する、請求項３１記載の方
法。
【請求項３３】 (a)９個のアミノ酸の溶血素共通配列
の少なくとも３つの繰り返しを含み、該溶血素共通配列
が位置１にあるＬ；位置３にあるＧ；位置４にあるＧ；
位置６にあるＧ；位置７にあるＮ；位置８にあるＤ；お
よび位置２、５および９にあるｘ（ｘはいずれかの単一
アミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含むア
ミノ酸配列を有するセグメントを含む、単離されたポリ
ペプチド、またはそのようなポリペプチドの抗原性フラ
グメントを調製すること； (b)該ポリペプチドまたはフラグメントを哺乳動物に対
して非毒性にすること；および (c)該非毒性ポリペプチドを薬物的に許容可能なキャリ
ヤと結合させることの工程を含む、哺乳動物をN.mening
itidis感染から保護するのに有用なワクチン組成物の製
造方法。
【請求項３４】ポリペプチドがN.meningitidisから単
離されたものである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】 (a)９個のアミノ酸の溶血素共通配列
の少なくとも３つの繰り返しを含み、該溶血素共通配列
が位置１にあるＬ；位置３にあるＧ；位置４にあるＧ；
位置６にあるＧ；位置７にあるＮ；位置８にあるＤ；お
よび位置２、５および９にあるｘ（ｘはいずれかの単一
アミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含むア
ミノ酸配列を有するセグメントを含み、単離されたポリ
ペプチド、またはそれらの免疫原性のあるフラグメン
ト；および (b)薬物的に許容可能なキャリヤを含有する、N.meningi
tidis感染に対して哺乳動物を免疫するワクチン組成
物。
【請求項３６】ポリペプチドがN.meningitidisに存在
する、請求項３５記載のワクチン組成物。
【請求項３７】ポリペプチドがN.meningitidisの外層
膜に存在する、請求項３５記載のワクチン組成物。
【請求項３８】 N.meningitidisに存在するアミノ酸配
列を有するセグメントを含み、該アミノ酸配列が９個の
アミノ酸の溶血素共通配列の少なくとも３つの繰り返し
を含み、該溶血素共通配列が位置１にあるＬ；位置３に
あるＧ；位置４にあるＧ；位置６にあるＧ；位置７にあ
るＮ；位置８にあるＤ；および位置２、５および９にあ
るｘ（ｘはいずれかの単一アミノ酸残基を示す。）のう
ち、少なくとも４つを含む単離されたポリペプチド、ま
たはそのようなポリペプチドの抗原性フラグメントをコ
ードする、単離された核酸分子。
【請求項３９】 (a)溶血素群毒素の一つであるポリペ
プチドもしくはそれらのフラグメントまたは、該ポリペ
プチドもしくはフラグメントをコードする核酸分子を認
識するプローブを調製すること；および (b)該プローブが試料中のN.meningitidisを認識するか
どうかを確認することの工程を含む、試料中のN.mening
itidisの存在を検出する方法。
【請求項４０】プローブが抗体である、請求項３９記
載の方法。
【請求項４１】抗体がモノクローナル抗体である、請
求項３９記載の方法。
【請求項４２】プローブが核酸分子である、請求項３
９記載の方法。
【請求項４３】溶血素群毒素の一つであるポリペプチ
ドまたは該ポリペプチドをコードする核酸分子が、N.me
ningitidisに存在する、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】 (a)９個のアミノ酸の溶血素共通配列
の少なくとも３つの繰り返しを含み、該溶血素共通配列
が位置１にあるＬ；位置３にあるＧ；位置４にあるＧ；
位置６にあるＧ；位置７にあるＮ；位置８にあるＤ；お
よび位置２、５および９にあるｘ（ｘはいずれかの単一
アミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含むア
ミノ酸配列を有するセグメントを含む、単離された抗原
性ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの免疫
原性フラグメントを調製すること；および(b)該ポリペ
プチドが試料中の抗体を認識するかどうかを確認するこ
との工程を含む、試料中のN.meningitidisに特異的な抗
体の存在を検出する方法。
【請求項４５】ポリペプチドがN.meningitidisに存在
するアミノ酸配列を含む、請求項４４記載の方法。【０００１】