MXPA06007164A - Vello de haemophilus influenzae tipo iv - Google Patents

Abstract

La invención descrita en la presente se relaciona con un regulador que codifica vello tipo IV de Haemophilus influenzae (H. influenzae). En particular, la invención se relaciona con vello tipo IV de H. influenzae no tipificable (NTHi) y de H. influenzae cepas a, b, c, e y f. La invención proporciona polinucleótidos de vello de H. influenzae aislados y polipéptidos codificados por los polinucleótidos asícomo polinucleótidos y polipéptidos codificados por los polinucleótidos involucrados en el ensamblado/desensamblado de la estructura. La invención también se relaciona con usos de estos polinucleótidos y/o polipéptidos que incluyen métodos para producir una respuesta inmune a H. influenzae y métodos para tratar y prevenir H. influenzae relacionada con condiciones patológicas.

Description

VELLO DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE TIPO IV El trabajo experimental relacionado con la invención descrita en la presente fue sustentado por las concesiones ROÍ DC03915 y ROÍ DC00 980 de NIH/NIDCD. El gobiernos de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la invención. Campo de la Invención. La invención descrita en la presente se relaciona con un vello de regulación de codificación tipo IV de Haemophilus influenzae (H- influenzae). En particular, la invención se relaciona con pelos tipo IV de H. influenzae (NTHi) no tipificable y de cepas a, b, c, e y f de H. influen.zae.. La invención proporciona polinucleótidos y polipéptidos de vello de H. influenzae aislados codificados por los polinucleótidos asi como polinucleótidos y polipéptidos codificados por los polinucleótidos involucrados en el ensamblado/desensamblado de la estructura. La invención también se relaciona con usos de estos polinucleótidos y/o polipéptidos incluyendo métodos para elucidar una respuesta inmune a H. influenzae y métodos para tratar y prevenir condiciones patológicos relacionadas con HX influenzae. Antecedentes El término clínico para infecciones del oido medio es otitis media {OMA De conformidad con Klein, Vaccine, 19 (Supple. 1): S2-S8, 2000, OM es la razón más común para que un niño obtenga cuidado de salud y para que un niño en los Estados Unidos reciba antibióticos o se someta a un anestésico general.. Las estadísticas indican que 24.5 millones de visitas al consultorio médico se hicieron por OM en 1990, representando un aumento mayor del 200% sobre aquellos reportados en los años 1980. Mientras que raramente están asociados con mortalidad, la morbidez asociada con OM es significativa. La pérdida del oido es un problema común asociado con esta enfermedad, que afecta frecuentemente el comportamiento, educación y desarrollo de capacidad de lenguaje de niños (Baldwin, Am. J. Otol. 14: 601-604, 1393; Bunter y col. , ?nn. Otol. Rhinol. Laryngol. Suppl., 163: 59-61, 1994; Teele y col., J. Infect . Dis., 162: 685-694, 1990). El impacto socioeconómico de OM también es grande, con costos directos e indirectos de diagnóstico y manejo de OM excedente $ 5 billones anualmente en E.U.A. solamente (Kaplan y col., Pediatr. Infecí., Dis. J., 16: S9-11, 1937). Se cree que OM resulta de factores infecciosos, ambientales y de genética de huésped. Las bacterias tales como üaemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis son los organismos infecciosos más comunes en OM. La OM aguda es una enfermedad caracterizada por el principio rápido y duración corta de señales y síntomas de inflamación en el oido medio, mientras que la OM crónica se refiere a una condición que se define por la presencia relativamente asintomática de fluido (o efusión) en el oido medio- Sin embargo, en QM crónica, a pesar de la ausencia de ciertas señales de infección aguda (es decir, dolor de oido o fiebre) , estos fluidos anormales de oido medio pueden persistir durante periodos que exceden tres meses . El tratamiento de OM aguda por terapia de antibiótico es común, para han surgido bacterias resistentes al antibiótico- El manejo quirúrgico de OM crónica involucra la inserción de tubos de timpanostomia a través de la membrana timpánica del oido mientras que un niño está bajo anestesia general. Mientras que este procedimiento es común (los regímenes de prevalencia son -13%; Bright y col., Am. J. Public Health, 83(7): 1026-8, 1993) y es altamente efectiva en térm os de aliviar los síntomas dolorosos drenando el oido medio de fluidos acumulados, es invasiva y lleva riesgos incumbentes (Berman y col., Pediatriqs, 93 (3) .-353-63, 1334; Bright y col., supra; Ci ons, ASM News, 60: 527-528; Paap, Ann. Pharmacother., 30(11): 1291-7, 1996). De esta manera existe la necesidad de acercamientos adicionales para el manejo y, de preferencia, la prevención de OM. El desarrollo de vacuna de OM esta más avanzado para S, peneumoniae, el agente causante primario de OM aguda (AOM) , como se evidencia por la reciente aprobación y liberación de una vacuna de conjugado capsular de valente siente, PREVNAR(R> (Eskola y Kilpi, Pedriatr. Infec. Dis. J. 16: S72-78, 200Q) . Mientras que PREVNARÍR) ha sido altamente eficaz para enfermedad de neumococos invasivos, el cubrimiento para OM ha sido decepcionante (6-8%) con reportes de un número aumentado de casos de OM debido a serotipos no incluidos en la vacuna (Black y col., Pedriatr. Infect. Dis J, 19: 187-195, 2000; Eskola y col., Pedriatr- Infect- Dis J. , 19: S72-78, 2000; Eskola y col-, N. Engl. J. Med., 344: 403-409, 2001; Snow y col., Otol. Neurotol., 23: 1-2, 2002). JEL Influenza-e es una bacteria gram-n-egativa que, como se anotó arriba, juega un papel en OM. Los aislados clínicos de H. influenzae se clasifican ya sea como serotipos "a" a "f" o no tipificables dependiendo de la presencia o ausencia, respectivamente, de cápsulas de polisacárido de tipo especifico en la bacteria. Una vacuna para Jí. influen ae tipo b se ha desarrollado, Como PrevnarÍR), las vacunas de H. influenzae tipo b se dirigen a la cápsula de polisacárido de este organismo y de esta manera la vacuna está comprendida de polisacárido en cápsula que se ha conjugado a un portador de proteina. Se ha hecho menos progreso para una vacuna para H. influenzae no tipificable (NTHi) que ocasiona aproximadamente 20% de OM aguda en niños y predomina en OM crónica con efusión (Coleman y col., Inf and Immunity, 59(5), 1716-1722, 1991; Klein, Pedriatr. Infect. Dis J. , 16, S5-8, 1997; Spinola y col-, J- Oinfect- Dis-, 154, 100-109, 1986)- NTHi también puede ocasionar neumonía, sinusitis, septicemia, endocarditis, epigiotitis, artritis séptica, meningitis, infecciones después de parto y neonatales, sepsis después del parto y neonatal, salpingitis aguda y crónica, apiglotis, pericardis, celulitis, osteomielitis, endocarditis, colecistitis, infecciones intraabdominales, infección de tracto urinario, mastoiditis, infección de injerto aórtico, conjuntivitis, fiebre púrpura brasileña, bacteremia oculta y exacerbación de enfermedades de pulmón subyacentes tales como bronquitis crónica, bronquietasis y fibrosis cistica. El aislado ?THi de prototipo es el aislado de pasaje bajo 8 -028NP que fue recuperado de un niño con OM crónico. Esta cepa se ha caracterizado bien in vitro (Bakaletz y col., Infect. Immun., 53:331-5, 1988; Holmes y col-, Microb- Pathog., 23: 157-66, 1997) asi como en un modelo de OM de chinchilla (Bakeletz y col., Vaccine, 15:955-61, 1997; Suzuki y col., Infect. Immun., 63: 1710-8, 1334; DeMaria y col., Infect. Xmmun., 64: 5187-92, 1996). La cepa de ?THi 86-026?P fue depositada con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, el 16 de octubre de 2001 y se le asignó el número de acceso PIA-4764. Un juego contiguo del genoma de la mancha 86-028NP se puede encontrar en La adherencia y colonización son los primeros pasos reconocidos en la patogénesis de H- influenzae- Como tal, H. influenzae expresa múltiples adhesinas incluyendo pelos hemaglutinantes, adhesinas de fimbra y no fi bra (Gilsdorf y col., P-ediatr Res 39, 343-348, 1996Í Gilsdorf. , Infect. Im un., 65, 2997-3002, 1997; y St . Geme III, Cell. Microbiol., 4, 191-200, 2002). Notablemente, ninguna de las adh-esivas descritas se La asociado previamente con una función de motilidad. Además. H. influenzae no expresa flagelos con los que están también asociados con motilidad. La motilidad de contracción es una forma independiente de flagelos de traslocación bacterial sobre superficies húmedas y ocurre por extensión, trabado, y luego retracción de -estructuras polares conocidas como pelos tipo IV (Bardy., Microbiology, 149, 295-304, 2003; Tonjum y Koomey, Gene, 192, 155-163, 1997; Wolfgang y col., EMBO J. r 19, 6408-6418; Mattick, Annu. Rev. Micriobiol-, 5ßf 289-314, 2002) . Los pelos tipo IV son típicamente de 5-7 nm de diámetro, varios micrómetros de longitud y comprendidos de una sola subunidad de proteina ensamblada hacia una conformación helicoidal con 5 subunidades por vuelta (Bardy y col., Microbiology, 149, 295-304, 2003; Wall and Kaiser, Mol. Microbiol., 32, 1-10, 1999 ) . Las subunidades de pelos tipo IV son usualmente 145-160 aminoácidos de longitud y pueden estar glicosiladas o fosforiladas. Hay dos clases de subunidades de pelos, tipo IVa y tipo IVb, que se distinguen uno del otro por la longitud promedio del péptido conductor y la subunidad madura, cuyo aminoácido N-metilado ocupa la posición N-terminal de la proteina madura, y la longitud promedio de la región D (para la región de disulfuro) . La mayoría de los pelos clase IVA expresan patógenos respiratorios, mientras que los enteropatógenos expresan más típicamente pelos clase IVb. Los pelos tipo IVa se distinguen por la presencia de una fenilalanina altamente conservada, hidrofóbica ?-terminal, metilada. Los pelos tipo IV sirven como un medio de colonización rápido de nuevas superficies- De esta manera, la expresión de pelo tipo IV es importante tanto a la adherencia como formación de biopelicula por muchas -bacterias (Mattick, ?nnu. Rßv. Microbiol. , 56, 283-314 2002); O' Toóle y Kolter, Mol. Microbiol., 30, 295-304, 1998; Klausen y col, Mol. Microbiol., 50, 61-68, 2003; Jesaitis y col-, J- Immunol., 171, 4329-4339, 2003), así como virulencia de especies ?eisseria, Moraxwlla bovis, Vibrio cholerae, Escherichia coli enteropatógena y Pseudomonas aeruginosa, entre otros (O' Toóle y Koler, supra; Klausen y col., supra; Klausen y col., Mo. Microbiol., 48, 1511-1524, 2003; Strom y Lory, Annu. Rev. Microbiol., 47, 565-596, 1993). Una biopelicula es una organización compleja de bacterias que están ancladas a una superficie a través de una matriz de exopolisacárido bacterialmente extruida. L matriz envuelve la bacteria y la prot-eg-ß del sistema inmune humano. Ehrlich y col., JAMA, -287(13), 1710-1715 (2002) describe formación de biopelicula por H. influenzae. Se ha postulado que bloqueando la interacción entre pelos tipo IV y el cuerpo humano puede evitar o detener la infección bacerial (Meyer y col., Patente de E.U.A. No. 6268,171, expedida el 31 de julio de 2001) . La expresión de pelo tipo IV es una función bacterial compleja y altamente regulada. En P. aeruginosa, la biogénesis y función de pelos tipo IV se controla por más de cuarenta genes (Strom y Lory, supra) . A la fecha, solamente un subjuego del vasto número de genes de pelos tipo IV relacionados (Tanjum y Koo ey, supra; Darzins y Russell, Gene, 192, 109-115, 1997) se ha encontrado en varios miembros de la familia HAP (Haemophilus, -Actinobacillus y Past urell ) (Stevenson y col., Vet. Microbiol., 92, 121-134, 2003; Foughty y col., Vet. Microbiol., 72, 79-90, 2000; Dougherty y Smith, Microbiology, 145, 401—109 1999) , pero ninguna expresión de pelo tipo IV ni motilidad de trabado se ha descrito para cualquier aislado de H. influenzae. De hecho, H. influenzae se describe de manera clásica como una bacteria qu-e no expresa estas estructuras ( riedrich y col. Appl. Environ. Microbiol., 69, 3695-3700, 2003; Fussenegger y col., Gene, 192, 125-134, 1997), a pesar de la presencia de un grupo de gene críptico dentro del genoma de cepa Rd (Fleischmann y col., Science, 269, 496-512, 1995). La cepa Rd es un derivado no encapsulado de un organismo de serotipo d de H. influenzae (Zwahlen y col., Infect. Immun, 42, 708-715, 1983; Bendler y Goodgal, J. Microbiol., 70, 411-422, 1972; Risberg y col., Eur. J. Biochem., 261, 171-180, 1999). Aún cuando la cepa Rd tiene algunas propiedades de virulencia, las cepas de serotipo d se consideran generalmente como comensales; no ocasionan enfermedad frecuentemente (Daines y col., J. Med. Microbiol. 52, 277-282, 2003) . Por lo tanto, es importante hacer la distinción entre cepas que ocasionan enfermedad de H. influenza-e y cepa Rd. Compendio de la Invención La presente invención se relaciona con grupos de gene de pelo Tipo IV de H. influ-enza-e, en particular H. influenzae no tipificable (NTHi) y cepas a, b, c, e y f de H. influenzae. Polinucleótidos y Polipéptidos de la Invención La presente invención proporciona polinucleótidos de H. influenzae y particularmente cuadros de lectura abiertos de un regulador dispuesto en dos grupos de gene más un otro gene. El regulador incluye un gene (pilA) que codifica la subunidad principal de un pelo tipo IV de H. influenzae hasta ahora no caracterizado. El regulador incluye polinucleótidos de un grupo de gene que codifica polipéptidos de pelo PilA (subunidad de pelo mayor), PilD (peptidasa conductora), PilB y PilC (involucrados en el ensamblado/desensamblado de la estructura de pelo) ; otro grupo de gene que codifica ComA, ComB, ComC, ComD, Co E, y ComF (involucrados en competencia para transformación y expresión de pelos); y un gene que codifica PilF (requerido para biogénesis de pelos tipo IV) (Watson y col., Gene, 49: 56, 1996) . En una modalidad, el regulador de pelos es aquel de la cepa 86-028NP de NTJJi H. influenzae. Los polinucleótidos que codifican el juego de polipéptidos de pelo ?THi 86-028?P en las siguientes SEQ ID NOs se proporcionan por la invención. Polipéptido PilA en SEQ ID ?O: 2, polipéptido PilB en SEQ ID ?O: 4, polipéptido PilC en SEQ ID ?O: 6, polipéptido PilD en SEQ ID ?O: 8, polipéptido ComA en SEQ ID NO: 10, polipéptido ComB en SEQ ID ?O: 12, polipéptido ComC en SEQ ID ?O: 14, polipéptido ComD en SEQ ID ?O: 16, polipéptido ComE en SEQ ID ?O: 18, polipéptido ComF en SEQ ID ?O. 20 y polipéptido PilF en SEQ ID NO: 22. El uso de codón alternativo de esta manera se contempla especifico por la invención. En una modalidad, los polinucleótidos comprenden las secuencias de gene ?THi 86-0328NP expuestas en las siguientes SEQ ID NO que codifican respectivamente los polipéptidos anteriores : pilA en SEQ ID ?O: 1, pilB en SEQ ID ?O: 3, pilC en SEQ ID ?O: 5, pilD en SEQ ID NO: 7, comA en SEQ ID NO: 3, comB en SEQ ID ?O: 11, comC en SEQ ID ?O: 13, comD en SEQ ID ?O: 15, comE en SEQ ID ?O: 17, comF en SEQ ID ?O: 19; y pilF en SEQ ID ?O: 21. Cada una de las secuencias de polinucleótido incluye tres nucleótidos finales que representan un codón de detención. También se proporcionan polinucleótidos que codifican polipéptidos PilA de aislados clínicos de ?THi 1728MEE, 1729MEE, 3224A, 10548MEE, 1060MEE, 1885MEE, 1714MEE, 1236MEE, 1128MEE y 214NP. Las secuencias de aminoácido de estos polipéptidos PilA se exponen en SEQ ID OS: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 44, respectivamente- De nuevo, la posibilidad de uso de codón alternativo se contempla específicamente en polinucleótidos que codifican los polipéptidos . En una modalidad, los polipéptidos se codifican respectivamente por las secuencias de nucleótido expuestas en SEQ ID NOS. 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 y 43. La invención provee polinucleótidos que se nibridizan bajo condiciones estrictas a (a) el complemento de las secuencias de nucleótido expuestas en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 43; (b) un polinuleótido que es una variante alélica de cualquiera de los polinucleótidos arriba mencionados; (c) un polinucleótido que codifica una especie homologa de cualquiera de las proteínas arriba mencionadas; o (d) un polinucleótido que codifica que polipéptido que comprende un dominio específico o truncado de los polipéptidos de la presente invención. Los polinucleótidos de pelo Tipo IV de otras cepas de H. influenzae no tipificable y de cepas de H. influenzae a, b, c, e y f se contemplas específicamente. Estos polinucleótidos se pueden identificar y aislar mediante técnicas convencionales en el ramo tales como hibridización y reacción de cadena de polimerasa usando parte o todos los polinucleótidos de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 43 como sondas o imprimadores, respectivamente. Los polinucleótidos de la invención también incluyen secuencias de nucleótido que son substancialmente equivalentes a los polinucleótidos arriba mencionados- Los polinucleótidos de conformidad con la invención pueden tener, v.gr., cuando menos 65%, cuando menos 70%, cuando menos 75%, cuando menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 99%, u 89%, más típicamente cuando menos 90%, 91%, 92%, 93%, o 94% o aún más típicamente cuando menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los polinucleótidos NTHi arriba mencionados- Incluidos dentro del alcance de las secuencias de ácido nucleico de la invención se encuentran fragmentos de secuencia de ácido nucleico que se hibridizan bajo condiciones estrictas a las secuencias de nucleótido ?THi de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 43, o complementos de las mismas, cuyo fragmento es mayor de aproximadamente 5 nucleótidos, de preferencia 7 nucleótidos, más preferentemente mayor de 9 nucleótidos y de manera más preferible mayor de 17 nucleótidos. Los fragmentos de, v.gr., 15, 17 o 20 nucleótidos o más son selectivos para (es decir, se hibridizan específicamente a cualquiera de los polinucleótidos de la invención) se contemplan. Estos fragmentos de secuencia de ácido nucleico capaces de hibridizarse específicamente a un polinucleótido NTHi de la invención se pueden utilizar como sondas para detectar polinucleótidos NTHi de la invención y/o pueden diferenciar polinucleótido NTHi de la invención de otros genes bacteriales, y de preferencia asados en secuencias de nucleótido únicas. El término "estricto" se utiliza en la presente para hacer referencia a condiciones que se entiende comúnmente en el ramo como estrictas. Lo estricto de hibridización se determina principalmente por temperatura, resistencia iónica, y la concentración de agentes de desnaturalización tales como formamida. Los ejemplos de condiciones estrictas para hibridización y lavado son 0.015 M de cloruro de sodio, 0.0015 M de citrato de sodio a 65-68°C o 0.015 M de cloruro de sodio, 0.0015 M de citrato de sodio, y 50% de formamida a 42°C. Ver Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989) . Las condiciones más estrictas (tales como temperatura superior, resistencia iónica inferior, formamida superiores, u otro agente de desnaturalización) también se pueden usar, sin embargo, el régimen de hibridización será afectado- En casos en donde la hibridización de deoxioligonucléotidos se refiere, las condiciones de hibridización estrictas de ejemplo adicionales incluyen lavado en 6X SSC 0.05% de pirofosfato de sodio a 37°C (para 14 oligos de base), 48°C (para 17 oligos de base) , 55°C (para 20 oligos de base) , y 60°C (para 23 oligos de base) . Otros agentes se pueden incluir en la hibridización y tampones de lavado para el propósito de reducir la hibridización no específica y/o de antecedente.

Los ejemplos son Q-1% de albúmina de suero bovino, 0-1% de pblivinil-pirrolidona, 0.1% de pirofosfato de sodio, 0.1% de dodeciisulfato de sodio, NaDodS04 (SDS), ficol, solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (u otro ADN no complementario) , y sulfato de dextrano, aún cuando otros agentes apropiados también se pueden usar. La concentración y tipos de estos aditivos se puede cambiar sin afectar substancialmente la rigidez de las condiciones de hibridización. Los experimentos de hibridización se llevan a cabo usualmente a pH 6.8-7.4, sin embargo, a condiciones de resistencia iónica típica, el régimen de hibridización es casi independiente de pH. Ver Anderson y col., Nucleic Acid JJibridisation^ A Practical Approach, Cap. 4, IRL Press Limited (Oxford, Inglaterra) . Las condiciones de hibridización se pueden ajustar por un experto en el ramo a fin de acomodar estas variables y permitir AD?s de diferente relación de secuencia para formar híbridos . Como se anotó arriba, los polinucleótidos contemplados por la presente invención no están limitados a los polinucleótidos específicos de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 111 19, 21, 25, 27, 29f 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 43, sino también incluyen, por ejemplo, alélicos y variaciones de especie de los mismos. Los alélicos y variaciones de especie se pueden determinar rutinariamente comparando la secuencia proporcionada en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 43, de preferencia los cuadros de lectura abierta en las mismas, un fragmento representativos de las mismas, o una secuencia de nucleótido cuando menos 90% idéntica, de preferencia 95% idéntica, a los cuadros de lectura abiertos dentro de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 43 con una secuencia de otro aislado de la misma especie o de otra especie. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar la identidad y similaridad entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, el paquete de programa GCG, incluyendo GAP (Devereux y col.. Nucí. Acid. Res., 12,: 387, 1984; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altsc ul y col., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). El programa BLAßTX está públicamente disponible del National Center for biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BL^ST Manual, Altschul y col., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Atschul y col., supra). El algoritmo de Smith-Waterman bien conocido también se puede usar para determinar la identidad. Los polinucleótidos de la invención se pueden aislar de fuentes naturales o se pueden sintetizar mediante técnicas químicas convencionales, v.gr., el método de fosfotriéster descrito en Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc., 103: 3185 (1981) . Los polinucleótidos de contrasentido complementarios a los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de pelo de la invención también se proporcionan . Los po^Lipéptidos de la invención incluhen polipéptidos de pelos PilA, PilD, PilB, PilC, ComA, ComB, ComC, ComD, ComE, ComF y PilF. En una modalidad, los polipéptidos comprenden las secuencias de aminoácido NTHi 86-028NP respectivamente expuestas en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 1$, 18, 20 o 22. Los polipéptidos de la invención también incluyen los polipéptidos PilA expuestos en SEQ ID NOS: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44. En modalidades adicionales, los polipéptidos de pelo Tipo IV de la invención son aquellos de otras cepas de H. influenzae no tipificable y de cepas a, b, c, e y f de H. influenzae. Los polipéptidos de la invención incluyen específicamente fragmentos de péptido (es decir, péptidos) que retienen una o más propiedades biológicas o inmunogénicas a uµ polipéptido de longitud completa de la invención. En una modalidad, fragmentos de péptido PilA proporcionados por la invención se designan TfpQ2, TFPQ3, TfpQ4 y 0LP3 y comprenden respectivamente aminoácidos 35 a 68 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 69 a 102 de seq id no: 2, aminoácidos 103 A 137 DE seq id no: 2, y aminoácidos 21 a 35 de SEQ ID NO: 2. La invención también proporciona polipéptidos con una o más substituciones de aminoácido conservadoras que no afectan la actividad biológica y/o inmunogénica del polipéptido. Alternativamente, los polipéptidos de la invención se contemplan que tienen substituciones de aminoácidos conservadoras que pueden o no pueden alterar la actividad biológica. El término "substitución de aminoácido conservador" se refiere a una substitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo, incluyendo aminoácidos que ocurren naturalmente y que ocurren no naturalmente, de modo que hay poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Por ejemplo, una substitución conservadora resulta de la reposición de un residuo no polar en un polipéptido con cualquier otro residuo no polar. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también se puede substituir con alanina, de conformidad con los métodos de "mutagenesis de exploración de alanina". Los aminoácidos que ocurren naturalmente se caracterizan basados en sus cadenas laterales como sigue: básico: arginina, lisina, histidina; ácido glutámico, ácido aspártico; glutamina polar no cargada, asparagina, serina, trionina, tirosina; y fenilalanina no polar, triptofán cisteína, glicina, alanina, valina, prolina, metionina, leucina, norleucina, isoleucina. Las reglas generales para substituciones de aminoácido se exponen en el Cuadro 1 abajo . Cuadro 1 Substituciones de Aminoácido Residuos Substituciones de Substituciones Originales Ejemplo Preferidas Ala Val, Leu, He Val Arg Lys, Gln, Asn Lys Asn Gln Gln Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gln Asn Asn Glu Asp Asn Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Arg He Leu, Val, Met, Ala, Phe, Leu Leu Norleucina, ile, Val, Met Leu Lys Arg, 1, 4-diaminobut;írico Arg Met Leu, Phe, He Leu Phe Leu, Val, He, Ala, Tyr Arg Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys - Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe ' Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val He, Met, Leu, Phe, Ala Leu La invención también proporciona variantes de los polipéptidos de la presente invención (v.gr., un polipéptido que exhibe cuando menos alrededor de 65% cuando menos alrededor de 70%, cuando menos alrededor de 75%, cuando menos alrededor de 80%, cuando menos alrededor de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, cuando menos alrededor de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, típicamente cuando menos alrededor de 95%, 96%, 97%, más típicamente cuando menos alrededor de 98%, o de manera más típica cuando menos alrededor de 99% de identidad de aminoácido a un polipéptido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o 22) que retienen actividad biológica y/o inmunológica. La invención contempla que los polinucleótidos de la invención se pueden insertar en un vector para amplificación o expresión. Para expresión, los polinucleótidos se enlazan operativamente a secuencias de control de expresión apropiadas tales como secuencias de promotor y de señal de poliadenilación. Se proporcionan además células huésped que comprenden polinucleótidos de la invención. Las células huésped procariótias de ejemplo incluyen bacterias tales como E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella y Serratia. Los métodos para producir polipéptidos de la invención haciendo crecer las células huésped y aislando polipéptido de las células huésped o medio de crecimiento se contemplan específicamente. Uno o más polinucleótidos del regulador de pelo se puede expresar en una célula huésped. Por ejemplo, la expresión del gene pilA solo y la expresión de múltiples polinucleótidos del regulador de pelo a fin de afectar el conjunto de la estructura de pelos nativa se contemplan ambas específicamente. Alternativamente, los polipéptidos de la invención se pueden preparar mediante síntesis química utilizando medios convencionales. Son particularmente cpnvenientes las técnicas de fase sólida (ver, v.gr., Erikson y col., The Proteins (1976) v.2, Academic Press, New York, p. 255) . Los sintetizadores de fase sólida automatizados se encuentran comercialmente disponibles. Además, las modificaciones en la secuencia se hacen fácilmente mediante substitución, adición u omisión de residuos apropiados. Por ejemplo, un residuo de cisteína se puede añadir al término carboxi para proporcionar un grupo sulhidrilo para enlace conveniente a la proteína portador, o elementos espaciadores, tales como un residuo de glicina adicional, se puede incorporar en la secuencia entre en aminoácido de enlace en el término C y el resto del péptido.

El término "aislado" se refiere a una substancia removida de, y esencialmente libre de, los otros componentes del ambiente en el que existe naturalmente. Por ejemplo, un polipéptido se separa de otras proteínas celulares o un ADN se separa de otro ADN flanqueándolo en un genoma en el que ocurre naturalmente. Anticuerpos La invención proporciona anticuerpos que se ligan a epítopes antígenos únicos a (es decir, son específicos para) polipéptidos de pelo de H. influenzae de la invención. Asimismo se proporcionan anticuerpos que se ligan a epítopes antígenos comunes entre múltiples subtipos de H. influenzae pero únicos con respecto a cualesquiera otros epítopes antígenos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo que retienen su capacidad de ligar su epítope único (v.gr., fragmentos de Fv, Fab y F(ab)2), anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos humanos o humanizados. Los anticuerpos que pueden generar mediante técnicas convencionales en el ramo usando polipéptído de pelo de la invención o células huésped que expresan polipéptidos de pelo de la invención como antígenos. La presente invención proporciona anticuerpos específicos para los polipéptidos de pelillo de la presente invención y fragmentos de los mismos, que exhiben la capacidad de exterminar tanto bacteria de H. influenzae como proteger humanos de la infección. La presente invención también proporciona anticuerpos específicos para los polipéptidos de la invención que reducen la virulencia, inhibir la adherencia, inhibir la formación de biopelícula, inhibir la motilidad de trabado, inhibir la división de célula, y/o inhibir la penetración hacia el epitelio de bacteria de H. influenzae y/o mejorar la fagocitosis de la bacteria H. influenzae Los sistemas de ensayo bactericida mediados de complemente in vitro (Musher y col., Infect. Immun. 39: 297-304, 1983; Anderson y col., J. Clin. Invest. 51: 31-38, 1972) se puede usar para medir la actividad bactericida de anticuerpos contra pelo. También es posible conferir la protección de término corto a un huésped por inmunoterapia pasiva a través de la administración de anticuerpo preformado contra un polipéptido de H. influenzae de la invención. De esta manera, los anticuerpos de la invención se pueden usar en inmunoterapia pasiva. La ínmunoglobulina humana se prefiere en medicina humana debido a que una inmunoglobulina heteróloga puede provocar una respuesta inmune a sus componentes inmunogénicos extranjeros. Esta inmunización pasiva se podría utilizar sobre una base de emergencia para protección inmediata de individuos no inmunizados sujetos a riesgos especiales. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar en la producción de anticuerpo anti-idiotípica, que a su vez se puede utilizar como un antígeno para estimular una respuesta inmune contra epítopes de pelo. Métodos para Producir una Respuesta Inmune y Composiciones para lo Mismo La invención contempla métodos para producir en un individuo una respuesta inmune a uno o más polipéptidos de pelo tipo IV de H. influenzae. En ciertas modalidades, los métodos producen una o más respuestas inmunes, incluyendo pero no limitado a, respuestas inmune que inhiben la réplica bacterial, respuestas inmunes que bloquean adherencia de H. influenzae a células, respuestas inmunes que impiden el trabado de H. influenzae y respuestas inmunes que previenen la formación de biopelícula. En una modalidad, los métodos comprenden un paso de administrar una dosis inmunogénica de una composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención. En otra modalidad, los métodos comprenden administrar una dpsis inmunogénica de una composición que comprende una célula que expresa uno o más polipéptidos de la invención. En todavía otra modalidad, los métodos comprenden administrar una dosis inmunogénica de una composición que gomprende uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos de la invención. El polinucleótido puede ser un polinucleótido desnudo no asociado con ningún otro ácido nucleico o puede estar en un vector tal como un plásmido o vector viral (v.gr., vector de virus adeno-asociado o vector de adenovirus) . Los métodos se pueden usar en combinación en un solo individuo. Los métodos se pueden utilizar antes o subsecuente a la infección de H. influenzae de un individuo. En una modalidad de métodos de la invención, una composición de la invención se administra como una dosis de imprimación seguida por una o más dosis fomentadoras. La coadministración de proteínas o polipéptidos que mejoran benéficamente la respuesta inmune tales como citoquinas (v.gr., IL-2, IL-12, GM-CSF), moléculas que inducen citoquina (v.gr., Leaf) o moléculas coestimulantes también se contempla. Una "dosis inmunogénica" de una composición de la invención es una que genera, después de la administración, una respuesta humoral (anticuerpo) y/o celular (célula T) inmune en comparación con la respuesta inmune detectable antes de la administración o en comparación con una respuesta inmune convencional antes de la administración. La invención contempla que la respuesta inmune que resulta de los métodos pueden ser protectores y/o terapéuticos- En una modalidad preferida, el anticuerpo y/o la respuesta inmune de célula T protege al individuo de infección de H. influenzae, partisularmente la infección del oído medio y/o la nasofaringe o vía aérea inferior- En este uso, la dosis precisa depende del estado de salud y peso del paciente, el modo de administración, la naturaleza de la formulación, etc-, pero generalmente varía de alrededor de 1.0 ug a alrededor de 5000 ug por paciente de 70 kilogramos, más comúnmente de alrededor de 10 a alrededor de 500 ug por 70 kg de peso corporal. La respµesta inmune humoral se puede medir por muchos métodos bien conocidos, tales como Ensayo de Inmunodifusión Radial Sencilla (SRID) , Inmunoensayo e, Enzima (EIA) y Ensayo de Inhibición de Hemaglutinación (HAI) . En particular, SRID utiliza una capa de un gel, tal como agarosa, que contiene el inmunógeno que se está probando. Se corta un pozo en el gel y el suero que se está probando se coloca en el pozo. La difusión del anticuerpo hacia el gel conduce a la formación de un anillo de precipitación cuya área es proporcional a la concentración del anticuerpo en el suero que se está probando. EIA, también conocido como ELISA (Inmunoensayo Enlazado con Enzima) , se usa para determinar anticuerpos totales en la muestra. El inmunógeno se adsorbe a la superficie de una placa de microtítulo. El suero de prueba se expone a la placa seguido por una -inmunoglobulina enlazada con enzima, tal como IgG. La actividad de enzima adherente a la placa se cuantifica mediante cualquier medio conveniente, tal como espectrofotometría y es proporcional a la concentración de anticuerpo dirigido contra el inmunógeno presente en la muestra de prueba. HAI utiliza la capacidad de un inmunógeno tal como proteínas virales para aglutinar células de sangre roja de pollo (o lo semejante) . El ensayo detecta neutralizar anticuerpos, es decir, aquellos anticuerpos capaces de inhibir la hemaglutinación. Las diluciones del suero de prueba se incuban con una concentración convencional de inmunógeno, seguido por la adición de las células de sangre roja- La presencia de anticuerpos de neutralización inhibirán la aglutinación de las células de sangre roja por el inmunógeno- Las pruebas para medir la respuesta inmune celular incluyen determinación de hipersensibilidad de tipo retrasado o medir la respuesta proliferativa de linfocitos a inmunógeno de meta. La invención, correspondientemente, proporcionar composiciones apropiadas para producir una respuesta inmune a polipéptidos de pelo de la invención. Como se anota arriba, las composiciones comprenden uno o más polipéptidos de pelo, células que expresan uno o más polipéptidos, o uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polípéptidos de pelo- Las composiciones también pueden comprender otros ingredientes tales como portadores y adyuvantes . En composiciones de la invención, un polipéptido velloso se puede fundir a otra proteína cuando se produce mediante métodos recombinantes. En una modalidad, la otra proteina, por sí, puede no producir anticuerpos, pero estabiliza la primera proteína y forma una actividad inmunogénica que retiene la proteína de fusión. En otra modalidad, la proteína de fusión comprende otra proteína que es inmunogé?ica, tal como Glutationa-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, coproteínas relativamente grandes que solubilizan la proteína de fusión y facilitan la producción y purificación de la misma- La otra proteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar un estímulo generalizado del sistema inmune. La otra proteína se puede .fundir a ya sea el término amino o carboxi de la proteína NTHi de la invención. En otras composiciones de la invención, .polipéptidos vellosos pueden estar enlazados de otra manera a substancias portadoras . Cualquier método de crear estos enlaces conocido en el ramo se puede usar. Los enlaces se pueden formar con agentes iieterobi funcionales que generan un enlace de disulfuro en un extremo de grupo funcional y un enlace de péptido en el otro, tal como un agente de formación de amida de disulfuro, v.gr-, N-succidimidil-3- (2-piridiltio) propionato (SPDP) (Ver, v.gr., Jansen y col., Immun. Rev. 62:185, 1982) y agentes de copulación bifuncionales que formar un tioéter en lugar de un enlace de disulfuro tal como esteres reactivos de ácido 6-maleimidocaproico, ácido 2-bromoacético, ácido 2-yodoacético, ácido 4- (N-maleimido-metil) ciclohexano-1- carboxílico y lo semejante, y agente de copulación que activan grupos carboxilo combinándolos con succinimida o ácido l-hidroxi-2-tnitro-4-sulfónico, para sal de sodio tal como 4- (N-maleimido-metil) ciclohexano-1-carboxilato de succínimidilo (SMCC) . Los polipéptidos vellosos se pueden formular como formas neutras o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, v.gr., ácidos clorhídricos o fosfóricos, o dichos ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libre también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, v.gr., hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina y procaina. Las composiciones de la invención pueden comprender además adyuvantes. Los adyuvantes conocidos incluyen, por ejemplo, emulsiones tales como Adyuvantes de Freund y otras emulsiones de aceite, Botdetella pertussis, MF59, saponina purificada de Quillaja saponaria (QS21), sales de aluminio tales como hidróxido, fosfato y alumbre, fosfato de calcio (y otras sales de metal), geles tales como sales de hidróxido de aluminio, productos micobacterianos que incluyen dipéptidos de muramilo, materiales sólidos, partículas tales como liposomas y virosomas. Los ejemplos de productos naturales y bacterianos conocidos para usarse como adyuvantes incluyen lípido A de monofosforilo (MPL) , RC-529 (MPL sintético semejante a monosacárido acilado), OM-174 que es un lípido A derivado de E. coli, holotoxinas tales como toxina de cólera (CT) o uno de sus derivados, toxina pertusis (PT) y toxina lábil al calor (LT) de E. coli o uno de sus derivados, y oligonucleótidos de CpG. La actividad adyuvante se puede afectar por un número de factores, tales como efecto portador, formación de depósito, recirculación de linfocito alterado, estímulo de T-linfocitos, estímulo directo de B-linfocitos y estímulo de macrofagos . Las composiciones de la invención se formulan típicamente como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas apropiadas para solución en, o suspensión en líquido antes e inyección también se pueden preparar. La preparación también se puede emulsionar. El ingrediente inmunogénico activo frecuentemente se mezcla con excipientes, que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes apropiados son, v.gr., agua, salina, dextrosa, glicerol, etanol, o lo semejante y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de substancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsificación, agentes de tampón de pH, o adyuvantes, que mejoran la efectividad de la vacuna. Las vacunas se administran de manera convencional parenteralmente, por inyección, por ejemplo, ya sea subcutánea o intramuscularmente . Las formulaciones adicionales que son apropiadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para supositorios, los aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialcanglicoles o triglicéridos; tales como supositorios se pueden formar de mezclas que contienen el ingrediente activo en la escala de 0.5% a 10%, de preferencia 1-2%. Las formulaciones orales incluyen los excipientes normalmente empleados tales como por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y lo semejante. Estas composiciones tomar la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones o polvos de liberación sostenida y contienen 10%-95% de ingrediente activo, de preferencia 25-70%. Las composiciones también se pueden administrar a través de rutas transdérmicas utilizando inyectores de chorro, microagujas, electroporación sonoporación microencapsulación, polímeros o liposomas, rutas transmucosales y rutas intranasales utilizando nebulizadores, aerosoles y rociaduras nasales. La microencapsulación que utiliza polímeros naturales o sintéticos tales como almidón, alginato y quitosán, D-poli L-lactato (PLA) , microesferas de D-poli DL-láctico-coglicólico, polieaprolactonas, poliortoésteres, polianhídridos y polifosfatazanos de polifosfazanos son útiles para ambas, administración transdérmica y transmucosa. Los complejos poliméricos que comprenden poliornitato sintético, poli-lisina y poli-arginina o péptidos antipáticos son útiles para sistemas de entrega transdérmica. Además, debido a su naturaleza antipática, las liposomas se contemplan para sistemas de entrega de vacuna transdérmica, transmucosal e intranasal. Los lípidos comunes usados para entrega de vacuna incluyen sulfato de N- (I) 2,3- (dioleil-dihidroxipropil) -N,N,N, -trimetilamonio-metilo (DOTAP) , cloruro de dioleiloxi- propil-trimetilamonio (DOTMA) , amonio de dimistiloxipropil- 3-dimetil-hidroxietilo (DMRIE) , bromuro de dimetildioctadecilo amonio (DDAB) y 9N(N'N-dimetilaminoeta-no) carbamoil) colesterol (DC-Col) . La combinación de lípidos de ayuda y liposomas mejorará la admisión de las liposomas a través de la piel. Estos lípidos de ayuda incluyen, fosfatidiletanolamina de dioleoilo (DOPE) , dilauroilfosfatidiletanolamina (DLPE) , fosftidiletanolamina de dimiristoilo (DMPE) , dipalmrtoilfosfatidiletanolamina (DPPE) . Además, glicósidos de triterpenoide o saponinas derivadas de la corteza de árbol de jabón chileno (Quillaja saponaria) y quitosán (quitan desacetilado) se han contemplado como adyuvantes útiles para entrega de vacuna intranasal y transmucosal . Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o múltiples dosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales y se pueden almacenar en una condición secada por congelación que requiere solamente la aclición del portador líquido estéril inmediatamente antes del uso. Métodos para Inhibir H. influenzae Alternativamente, la invención incluye métodos para inhibir función vellosa tipo IV de H. influenzae en un individuo. Los métodos comprenden administrar al individuo, por ejemplo, uno o más anticuerpos de la invención; uno o más polipéptidos de la invención; uno o más polinucleótidos antisentido de la invención; una o más moléculas RNAi; y/o una o más moléculas pequeñas, en una cantidad que inhibe la función de los pelos. Los ensayos in vitro se pueden usar para demostrar la habilidad de inhibir la función de pelos. Las modalidades de estos métodos incluyen, por ejemplo, métodos que usan inhibidores" de síntesis de polipéptido de pelo y/o conjunto de pelo, inhibidores de adherencia mediada a través de pelos tipo IV, inhibidores qµe interrumpen las biopelículas existentes mediadas por pelos tipo IV, e inhibidores de trabado. La inhibición se contempla para cualquier condición patológica que involucre H. influenzae, por ejemplo, OM, neumonía, sinusitis, septicemia, endocarditis, epiglotitis, artritis séptica, maningitis, infecciones después del parto y neonatales, sepsis después del parto y neonatales y salpingitis crómica, epiglotis, pericardis, celulitis, osteomielitis, endocarditis, colecistitis, infecciones intraabdominales, infección de tracto urinario, mastoiditis, infección de injerto aórtico, conjuntivitis, fiebre púpura brasileña, bacteremia oculta y exacerbación de enfermedades de pulmón subyacentes tales como bronquitis crónica, bronquiestasis y fibrosis cística. Se proporcionan composiciones que comprenden inhibidores de función de vello tipo IV de H. influenzae.

Las composiciones pueden consistir de uno de los ingredientes activos anteriores solo, pueden comprender combinaciones de los ingredientes activos anteriores o pueden comprender ingredientes activos adicionales usados para tratar infecciones bacteriales. Como se discute arriba, las. composiciones pueden comprender uno o más ingredientes adicionales tal como portadores farmacéuticamente efectivos. También como se discute arriba, la dosificación y frecuencia de la administración de las composiciones se determinan por técnicas convencionales y dependen, por ejemplo, del peso y edad del individuo, la ruta de administración, y la severidad de síntomas. La administración de las composiciones farmacéuticas puede ser por rutas convencionales en el ramo, por ejemplo, parenteral, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, rectal, intranasal o vaginal. Modelo Animal Los método de la invención se pueden demostrar en un modelo de chinchilla ampliamente aceptado como un modelo experimental parta OM. En particular, un modelo de chinchilla de OM inducida por NTHi se ha caracterizado bien (Bakaletz y col., J. Infect. Dis., 168: 865-872, 1993; Bakaletz y Holmes, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 4: 223-225, 1997; Suzuki y Bakaletz, Infect . Im un., 62: 1710-1718, 1994; Masón y col., Infect. Immun., 71:3454-3462, 2003), y se ha usado para determinar la eficacia protectora de varias proteínas de membrana externa NTHi, combinaciones de proteínas de membrana externa, componentes de vacuna de péptido sintético quimérico, y formulaciones adyuvantes contra OM (Bakaletz y col., Vaccine, 15:955-961, 1997; Bakaletz y col., Infect. Immun., 67: 2746-2762, 1999; Kennedy y col., Infect. Immun., 68: 2756-2765, 2000; Kyd y col., Infect. Immun., 66:2272-2278, 2003; Novotny y Bakaletz, J. Immunol., 171, 1978-1983, 2003). En el modelo, el adenovirus predispone a las chinchillas a medio de OM inducido por H. ínfluenzae, que permitió el establecimiento de célula relevante , tejido y sistemas de cultivo de órgano para la determinación biológica de NTHi (Bakaletz y col., J. Infect. Dis., 168: 865-72, 1993; Suzuki y col., Infect. Immunity 62: 1710-8, 1994) . La infección de adenovirus sola se ha usado para determinar las transducción de anticuerpos de suero inducidos hacia el tímpano (Bakaletz y col., Clin. Diagnostic Lab Immunol., 482) :223-5, 1997) y se ha usado como un copatógeno con NTHi, para determinar la eficacia protectora de varios regímenes de inmunización activa y pasiva que se dirige a varias proteínas de membrana externa de NTHi, combinaciones de OMPs, componentes de vacuna de péptido sintético quimérico, y formulaciones adyuvantes como vacunógenos contra otitis media (Bakeletz y col., Infec Immunity, 67(6): 2746-62, 1999; Kennedy y col., Infect. Immun., 68(5): 2756-65, 2000; Novotny y col., Infect Imunity 68(4): 2119-28, 2000; Poolman y co., Vaccine 19 (Suppl. 1): S108-15, 2000). Métodos para Detectar bacteria de H. influenzae Asimismo se proporcionan por la invención métodos para detectar bacterias en un individuo. En una modalidad, los métodos comprenden detectar polinucleótidos vellosos de la invención en una muestra biológica que usa imprimadores o sondas que se ligan específicamente a los polinucleótidos . La detección del polinucleótido se puede lograr mediante numerosas técnicas de rutina en el ramo que involucran, por ejemplo, hibridización y/o PCR. En otra modalidad, los métodos comprenden detectar polipéptidos vellosos de la invención en una muestra biológica utilizando anticuerpos de la invención que se ligan específicamente a los polipéptidos. Los anticuerpos se pueden usar en cualquier sistema de inmunoensayo conocido en el ramo incluyendo, pero no limitado a, radioinmunoensayos, ensayos ELISA, ensayos de emparedado, reactivos de precipitina, reacciones de precipitina de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis . Las muestras biológicas a utilizar en los métodos incluyen, pero no están limitados a, sangre, suero, fluido del oído, fluido espinal, esputo, orina, fluido linfático y fluido cerebroespinal . Breve Descripción del Dibujo La Figura 1 es un alineamiento de secuencias de aminoácido de polpéptidos PilA de NTHi Rd, 86-028NP (SEQ ID NO: 2), 1728MEE (SEQ ID NO: 26), 1729MEE (SEQ ID NO: 28), 3224A (SEQ ID NO: 30), 10548MEE (SEQ ID NO:32), 1060MEE (SEQ ID NO: 34), 1885MEE (SEQ ID NO: 36), 1714MEE (SEQ ID NO: 38), 1236MEE (SEQ ID NO: 40), 1128MEE (SEQ ID NO: 42), 214NP (SEQ ID NO: 44) . Descripción Detallada de la Invención Los siguientes ejemplos ilustran la invención en donde el Ejemplo 1 describe secuencias de genes vellosos tipo IV de NTHi cepa 86-028NP de la invención y detección del gene pilA en trece aislados de H. influenzae clínicos, el Ejemplo 2 demuestra formación de agregado dependiente de pelo tipo IV clásico mediante NTHi cepa 86-028NP, el Ejemplo 3 demuestra motilidad de trabado en cepa de NTHi 86-028NP, el Ejemplo 4 describe la observación de vellos tipos VI en cepa NTHi 8 -928NP por manchado negativo y microscopía electrónica de transmisión, el Ejemplo 5 describe la generación de un mutante de pilA, el Ejemplo 6 describe experimentos en un modelo de chinchilla de infección con NTHi y NTHi mutante de pilA, el Ejemplo 7 describe genes de pilA de diez aislados clínicos de NTHi, el Ejemplo 8 describe experimentos que demuestran una respuesta inmune a vellos de NTHi en niños y el Ejemplo 9 describe la identificación de fragmentos de péptido NTHi para uso como inmunógenos. Ejemplo 1 Un regulador de vellos tipo IV se identificó en un aislado OM de NTHi. Muchas cepas de NTHi, incluyendo la cepa 86-028NP, no posee la ubicación hif requerida para la expresión de hemaglutinación de vellos LKP (Mhlanga-Mutangadura y col., J. Bacteriol., 180(17), 4693-4703, 1988), aún más biopelículas de forma. Debido que los vellos son importantes para la formación de biopelícula en otros sistemas bacteriales, el juego contiguo del NTHi cepa 86-028NP genímica el esfuerzo de secuencia (ver o la N.S. De E.U.A. Coposeída 60/453,134) se analizó para genes que codifican potencialmente otro tipo de pelos. El juego de datos fue BLAST usando el algoritmo blasn que parámetros de falla utilizando las proteínas de Pseudomonas aeruginosa anotadas como se relaciona con los vellos tipo IV o motilidad de trabado para P. aeruginosa incluyendo PilQ y PilT en www.Pseudomonas.com. El polipéptido trasladado para la proteína PilA de P. multocida, también se usó en esta búsqueda (Doughty y col., Vet. Microbiol. 72, 69-90, 2000). Lo que pareció inicialmente ser una ubicación de gene velloso tipo Iv críptico se identificó. Específicamente, en la cepa 86-028NP, hay cuatro genes que son altamente homólogos a aquellos en la H. influenzae cepia Rd, A. pleuropneumoniae y P. multocida (Stevenson y col., Vet. Microbiol., 92, 121-134, 2003; Doughty y col., supra; Zhang y col., FEMS Microbio lett, 189, 15-18, 2000; y Ruffolo y col;, Infect. Imun., 65, 339-343, 1997). Estos genes codifican PilA, PilB, PilC y PilD en cepa Rd (Dougherty y Smith, Microbiology, 145(2), 401-409, 1999). El regulador de NTHi cepa 86-028NP incluye un haz de genes de polinucleótidos que codifican polipéptidos vellosos Pila (subunidad vellosa mayor), PilD (peptidasa conductora) , PilB y PilC (contemplada que se transcribe del mismo mRNA y se involucran en el ensamblado/desensamblado de la estructura vellosa) ; un grupo de gene de polinucleótidos que codificación polipéptidos vellosos Coma, Comb, ComC^ ComD, ComE, y ComF (involucrados en competencia para transformación y expresión vellosa) ; y otro gene que codifica PilF (requerido para biogénesis vellosa tipo IV) . Las secuencias de aminoácido de los polipéptidos vellosos expuestos en la siguiente SE ID NOS: PilA en SEQ ID NO: 2, PilB en SEQ ID NO: 4; PilC en SEQ ID NO: 6, PilD en SEQ ID NO: 8, ComA en SEQ ID NO: 10, ComB en SEQ ID NO: 12, ComC en SEQ ID NO: 14, ComD en SEQ ID NO: 16, ComE en SEQ ID NO: 18, ComF en SEQ ID NO: 20 y PilF en SEQ ID NO: 22. Las secuencias de gene que codifican los polipéptidos se exponen en las siguientes SEQ ID NOS que codifican respectivamente los polipéptidos anteriores: pilA en SEQ ID NO: 1, pilB en SEQ ID NO: 3, pHC en SEQ ID NO: 5, pilD en SEQ ID NO: 7, comA en SEQ ID NO: 9, comB en SEQ ID NO: 11, comC en SEQ ID NO: 13, comd en SEQ ID NO: 15, ComE en SEQ ID NO: 17, ComF en SEQ ID NO: 19, y pilF en SEQ ID NO: 21. Cada una de las secuencias de polinucleótidos incluye un final de tres nucleótidos que representan un codón de detención. En estudios de perfil de expresión de gene que emplean microdisposiciones de cADN para caracterizar la regulación de los genes NTHi durante el desarrollo de competencia (es decir, la capacidad natural de NTHi de admitir ADN extraño que mejora potencialmente o expande su diversidad genética) , los genes como así como los genes pil se regulan ascendentemente durante el desarrollo de competencia. En un experimento de mancha del sur usando secuencias pilA como una sonda, trece aislados NTHi OM clínicos de pasaje bajo recuperados de pacientes que se someten a timpanostomía e inserción de tubo para otitis media crónica y un aislado clínico recuperado de un paciente con fibrosis cística tuvo una sola copia de pilA dentro de su genoma. Estos catorce aislados totales se designaron por los siguientes números de cepa, respectivamente: 86-028NP; 1728MEE; 1729MEE; 1714MEE; 214NP; 1236MEE; 165NMP; 1060MEE; 1128MEE; 10548MEE, 3224A; 3185A, 1885MME y 27W11679INI. En el experimento, ADN de cromosoma bacterial se aisló usando un equipo de aislamiento PUREGENE ADN de Gentra Systems (Minneapolis, MN) , digerido con Mfel y las digestiones se corrieron en un gen de agarosa al 0.8%. El ADN se transfirió a una membrana Nytron SuPerCharge usando el equipo Turbo Blotter (Schleicher & Schuell, Keen, NH) . La sonda se generó mediante amplificación de PCR de la secuencia de codificación del gene pilA 86-028 usando los primos 5' tgtgacattccgcaaaaa (SEQ ID NO: 23) y -taataaaaggaaaatgaatga (SEQ ID NO: 24) . El amplicón se purificó usando un equipo de purificación QIAquick PCR (Qiagen Inc. Valencia, CA) . Siguiendo las direcciones del fabricante, 100 ng de producto de PCR purificado se etiquetó con peroxidasa de rábano usando el Sistema de Etiquetado y Detección de Ácido Nucleico Directo ECL (Amersham Biosciences UK Ltd., Little Chalfont, Buck, RU) .

Las manchas desarrolladas se expusieron a película Fuji Super RX de rayos X (Fuji Photo Film Co., Tokio, Japón) .

El polipétido PilA de NTHi cepa 86-028NP tiene una masa molecular predicha y aparente de aproximadamente 14 dKa, contiene una fenilalanina metilada N-terminal. Ejemplo 2 NTHi cepa 86-028NP formó agregados clásicos en un ensayo de traslocación de superficie de sub-agar y un ensayo de desarrollo superficial cuando se hicieron crecer bajo condiciones de agotamiento de nutriente. NTHi cepa 86-028NP se desarrolló en agar de chocolate durante 18-20 horas 37°C, 5% de C02, en una atmósfera humedecida) antes de todos los experimentos. Subsecuentemente, este organismo se inoculó hacia ya sea sBHI, un medio rico en el que el NTHi crece muy bien, o un medio químicamente definido que soporta el crecimiento de H. influenzae (Coleman y col. J. Clin. Micro., 41:4408-4410, 2003) que comprometió 83% de medio RPMI1640 (Gibco BRL, Rockville, MD) , piruvato de sodio (87.3 mM) (Gibco BRL), ß-NAD (0.087 mg/ml) (Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO) , HEME-histidina (0.0175 mg/ml) ( Sigma), uracilo (0.087 mg/ml) (Sigma), e inosina (1.75 mg/ml) (Sigma). Ambos agares se vertieron hacia uno de dos formatos, en portaobjetos de cámara de 8 pozos estériles (Lab-tech, Naperville, IL) o hacia 35 mm de platos petri de vidrio estériles (Fisher Scientific, ubicación) . Cuando el portaobjetos de vidrio se separó de los portaobjetos de cámara de 8 pozos, el agar permaneció dentro de las cámaras, permitiendo de esta manera el uso de la superficie "inferior" del agar para inoculación, que es óptima para ensayo de motilidad de trabado debido a la uniformidad relativa de su superficie (Semmler y col., Microbiology, 145, 2863-2873, 1999 y Mattick, ann. Rev. Microbio., 56, 289-314, 2002) . Miuentras que los agares de vaciaron hacia los .portaobjetos de cámara de 8 pozos se usaron para demostrar un fenotipo de crecimiento superficial, los agares vertidos en los platos petrí se usaron para demostración de traslocación de agar subsuperficial (Semmler y col., supra), mientras que los agares vertidos en los portaobjetos de cámara de 8 pozos se usaron para demostrar el fenotipo de crecimiento de superficie de agar. Todos los ensayos se repitieron un mínimo de tres veces, en días separados . Los agares que se habían vertido hacia platos petri de vidrio, estériles, se inocularon subsuperficialmente con 0.5 ul de una suspensión de NTHi desarrollada como se describió arriba, usando una punta de micropipeta estéril. Las placas se observaron después de incubación de 24 horas (37°C, 5% de C0) y luego se retuvieron a temperatura ambiente (25°C) durante 24 horas adicionales antes de leer nuevamente para signos de traslocación bacterial entre la superficie inferior del agar y el plato petri de vidrio. En medio de sBHI, 24 horas después de la inoculación, NTHi se observó que ha crecido en una área pequeña (radio de - 0.5) que rodea el sitio de inoculación entre el agar y el fondo de plato petri de vidrio. Después de 24 horas adicionales, el patrón de crecimiento permaneció similar a aquel observado a 24 horas. En el medio químicamente definido después de 24 horas de incubación, el crecimiento de NTHi se observó entre la superficie de agar y el fondo de plato petri de vidrio, a una distancia de 2 a 5 mm desde el sitio de inoculación. La bacteria también se había agregado en colonias pequeñas en un patrón semejante a halo que rodea el sitio de inoculación. Después de 48 horas, NTHi había formado una disposición muy distinga de microcolonias con muchas ocurriendo a una distancia de > 5 mm desde el sitio de inoculación. La formación de microsatélites hasta distancia de 5 mm del sitio original de inoculación fue un descubrimiento de marca de crecimiento en medio químicamente definido que nunca se había visto con la cepa 86-028NP que creció en agar rico. Los portaobjetos de cámara se inocularon con 0.5 ul de una suspensión de 18-20 horas de agar de chocolate-NTHi desarrollado [suspendido en salina libre de pirógeno estéril (American Pharmaceutícal Partners Inc., Schaumburg, IL) ] , o una sola colonia se cortó para transferencia a la superficie del agar con un palillo de dientes estéril. En medio sBHI, treinta minutos después de inoculación, NTHi pareció en asociación cercana con la superficie de agar y estaba creciendo en un patrón semejante a hoja. A 2.5 horas, aproximadamente 80-90% del área superficial se cubrió con una hoja delgada de bacteria. Asimismo en este momento, microagregados de NTHi empezaron a aparecer. A 6 - 7 horas después de inoculación, estos microagregados fueron discernibles a simple vista y fueron aproximadamente 3-5 microagregados por pozo. Además, NTHi todavía se observó que está creciendo como una hoja que cubrió aproximadamente 50-70% de la superficie de agar. Veinticuatro horas después de la inoculación, el NTHi apareció como colonias sencillas grandes en cada sitio de inoculación. En medio químicamente definido, como aquel observado en sBHI, treinta minutos después de inoculación, NTHi pareció estar creciendo en hoja, sin embargo la densidad de la bacteria apareció mucho menos que la observada en agar de sBHI . A 2.5 horas después de la inoculación, numerosos microagregados fueron evidentes a través de la superficie de agar. En contraste con aquellos anotados cuando NTHi se inoculó hacia agar sBHI, estos microagregados fueron mayores y mucho más densos en apariencia. Aproximadamente 30-40 microagregados se pudieron ver en cada pozo. Todavía había una área grande de crecimiento semejante a hoja de NTHi en este punto de tiempo, con aproximadamente 80% del área superficial cubierta por bacterias . A 6-7 horas después de inoculación, los microagregados fueron mayores, más densos, y fácilmente vistos a simple vista. Asimismo, las áreas de crecimiento radial o halos se vieron radiando hacia afuera de colonias grandes, similar a los patrones de crecimiento descritos para Neisseria y Pseudomonas sp. (refs) . Por este período de tiempo, la mayoría de la bacteria pareció estar dispuesta en grupos pequeños de microagregados con una proporción muy pequeña vista cubriendo la superficie de agar como una hoja o monocapa. Después de 24 horas, hubo colonias sencillas grandes en cada sitio de inoculación, sin embargo también hubo muchas colonias satélite pequeñas presentes sobre la superficie de agar completa, incluyendo sitios remotos de los puntos de inoculación. De esta manera, NTHi cepa 86-028NP demuestra una formación de agregado clásica similar a aquella reportada para vellos tipo IV que expresan P. aeruginosa (Semmler y col., Microbiology, 145(10), 2863-2873, 1999). Cuando crecieron bajo condiciones de agotamiento de nutriente. Ejemplo 3 El movimiento de células NTHi individuales entre una cubierta corrediza de vidrio y una superficie de agar lisa se siguió mediante microscopía de video. Las células se movieron a aproximadamente 0.42 u /seg, consistente con aquel reportado para trabar P. aeruginosa (Skerker y Berg, Proc. Nati. Acad., Sci. USA, 98, 6901-6904, 2001) y Neisseria gonorrhoeae (Merz y col., Nature, 207, 98-102, 2000) . Un lazo completo de NTHi mancha 86-028NP, desarrollada sobre agar de chocolate a 37°C y 5% de C02 durante 20 horas y luego retenido a temperatura ambiente durante 24 horas adicionales, se suspendió en agua estéril y 0.5 ul de la suspensión resultante se colocó hacia un portaobjetos de vidrio estéril. Para proporcionar contraste y de esta manera ayudar a la visualización, 0.5 ul de tripan azul (0.4%, Sigma, St. Louis MO) se añadieron a la suspensión bacterial. La gota luego se cubrió con una cubierta deslizante estéril y se vio a través de microscopio de luz (Axioskope 40, Zeiss, Thornwood, NY) . Se observaron muestras a temperatura ambiente durante un período de aproximadamente 15-20 minutos. Las bacterias fueron fácilmente observables y el movimiento direccional de varias, aún cuando no todas, las células o microagregados de células se observó. A fin de estimular la actividad, se añadieron 0.5 ul de una solución heme (1 mg/ml) (Sigma, St. Louis, MO) a un lado de la cubierta deslizante estéril . La actividad de trabado se documentó mediante la captura de ambos vídeo [sistema de otoscopía de video (MEDRx Inc, Seminóle FL) fijada a un VCR] e imágenes fijas a fin de determinar longitud y régimen de excursiones . Las células individuales, o microagregados de células, viajaron una distancia lineal total de aproximadamente 11.0 um durante un período de 51 segundos (régimen de aproximadamente 0.22 um/seg). Sin embargo, durante el período completo de observación, el régimen de motilidad de trabajo observado varió de 0.14 a 0.48 um/seg. Ejemplo 4 Velos Tipo IV se visualizaron mediante manchado negativo y microscopia de electrones de transmisión. Cultivos durante la noche de NTHi cepa 86-028NP se inocularon en sBHI y placas de agar definidas y se incubaron durante 2, 6 o 24 horas a 37°C, 5% de C02. Adicionalmente, los cultivos se inocularon hacia caldo de sBHI y caldo definido y se incubaron durante 2.5 o 5.5 horas . Estos últimos puntos de tiempo representan entrada hacia fases exponencial " y retraso de crecimiento, respectivamente. Las bacterias luego se mancharon negativamente usando solución filtrada Whatman que contiene 2.0% de acetato de amonio (p/v (Sigma) y 20% de molíbdato de amonio p/v (Sigma) en agua estéril (Bakaletz y col., infect Immun, 1988 52:331-5). Rejillas de cobre revestidas con formvar y carbono, malla 300, (Electron Microscopy Sciences) se tocaron a colonias individuales desarrolladas sobre placas de agar, y luego se hicieron flotar sobre una gota de la solución de mancha negativa. Los cultivos crecidos en caldo se granularon, las bacterias se resuspendieron en agua estéril y las rejillas se hicieron flotan en volúmenes iguales de suspensión bacterial y mancha negativa. Después de 5 minutos, las rejillas se mancharon y dejaron secar al aire antes de verlo en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi modelo H-600 con monitor de video fijado (Gatan, inc., Pleasanton, CA) y sistema de formación de imagen digital (Gatan, Inc.). Cuando NTHi se desarrolló en sBHIU, ningunas estructuras semejantes a vellos tipo IV se observaron. Inversamente, cuando se desarrollaron bajo condiciones nutrientes definidas, se vio que NTHi expresa estructuras de aproximadamente 6 - 7 nm de diámetro. Muchas de estas estructuras también se encontraron libres sobre la superficie de rejilla. Hubo aproximadamente 5 a 6 vellos por célula bacterial y estas fueron polares en ubicación. Ejemplo 5 Un mutante deficiente en la expresión PilA se generó para caracterizar adicionalmente componentes de las estructuras observadas cuando la cepa 86-028NP se desarrolló en condiciones alcalinas en medios químicamente definidos. El gene de pilA y aproximadamente Ikb 5' y 3' del gene de cepa 86-028NP se amplificó mediante PCR, se clonó hacia pGEM-T Easy (Promega) y la secuencia de ADN determinó verificar que no hubo cambios en la secuencia en el clon como resultado de la amplificación de PCR. Como no había sitio de restricción conveniente en el gene pilA, un sitio BamHl se hizo especialmente hacia el gene utilizando el Equipo de Mutagenesis Stratagene QuikChange Site-Directed. La construcción resultante se linealizó con Ba Hl y el gene se inactivo a manera de inserción con el cassette OKn-2 (Pérez-Casal y col., J. Bacteriol., 173: 2617-2624, 1991). La construcción resultante se linealizó y transformó en la cepa 86-028NP usando el método MIV (Poje y Redfield, p. 57-70 en Herbert y col. (Eds.), Protocolos Haemophilus influenzae, Humana Press Inc., Toronto, 2003). Clones resistentes de canamicina se seleccionaron e inactivación de inserción del gene pila 86-028NP se verificó en clones seleccionados mediante hibridización del sur. Cuando el mutante de pilA se evaluó para expresión de vellos tipo IV después de crecer bajo condiciones que indujeron la expresión aumentada de vellos tipos IV en el aislado parental (Ejemplo 4), no se observó célula asociada o vellos tipo IV de tipo libre confirmando que el producto de gene pila (y/o los productos de gen pilBCD puesto que la mutación es pilA es probable que interrumpa los productos de gene corriente abajo) se requieren para expresión de vellos . Ejemplo 6 Para determinar si los vellos tipo IV son necesarios para colonización de la nasofaringe, así como supervivencia en y/o capacidad de formar una biopelícula en el oído medio, retamos catorce chinchillas adultas tanto intranasal como transbularmente con ya sea la cape original 86-028NP o con un mutante de pilA isogénico (Ejemplo 5) . En los días 2, 5, 10, 15 y 20 después del reto, lavados nasofaríngeos y tapas epitímpánicas se realizaron, y ambas mucosas nasal y de oído medio se retiraron de 1-2 chinchillas por cohorte para determinar cfu de NTHi en cada uno de estos sitios anatómicos . Ambos el original como el mutante pilA fueron capaces de sobrevivir en el huésped de chinchilla durante veinte días. Sin embargo, mientras que ambas cepas estaban presentes en cantidades equivalentes en lavado y fluidos de tapa, cuando se ensayaron para una subpoblación adherente en homogenatos de tejido de mucosa nasal, el mutante pilA estuvo ausente de, o por debajo de nuestra capacidad de detectar, en 80% de los homogenados recuperados después del día 5, mientras que 87% de mucosa nasal similar recuperada de animales retados con aislado original fueron de cultivo positivo. La microscopia se realizó en tejido congelado a presión para determinar si estaba presente una biopelícula. La biomasa formada por el mutante pilA en el oído medio fue de un carácter diferente que la biopelicula bien estructurada característica del aislado original. Los datos indican que los vellos tipo IV de NTHi juegan un papel clave en el curso de enfermedad de OM. Ejemplo 7 El gene pílA de diez aislados clínicos de NTHi se han puesto en secuencias . El nucleótido y secuencias de aminoácido de los aislados se exponen respectivamente como sigue: 1728MEE en SEQ ID NOS: 25 y 25, 1729 MEE en SEQ ID NOS: 27 y 28, 3224A en SEQ ID NOS: 29 y 320, 10548MEE en SEQ ID NOS: 31 y 32, 1060MEE en SEQ ID NOS: 33 y 34; 1885MEE en SEQ ID NOS: 35 Y 36, 1714MEE en SEQ ID NOS: 37 Y 38, 1236MEE en SEQ ID NOS: 39 Y 40, 1128MEE en SEQ ID NOS: 41 y 42 y 214NP en SEQ ID NOS 43 y 44. Un alineamiento de las secuencias de aminoácido con aquellas de los polipéptidos de pilA de Rd y 86-028NP se presentan en la Figura 1. Los genes pilA de todos los aislados codifican un péptido conductor de 12 residuos que es en gran parte invariable salvo una substitución Q a L en la posición 6 en dos aislados así como en la cepa Rd. PilA madura contiene 137 residuos y se predice que contiene una fenilalanina metilada característica en la posición +1. Los residuos de tirosina en las posiciones +24 y +27, y se cree que están involucrados en interacciones de subunidad-subunidad, se conservan altamente así como cuatro residuos Cys en las posiciones +50, +60, +119 y +132. De manera interesante, las proteínas NTHi PilA parecen representar una nueva clase de vellos tipos IV. El péptido conductor es mayor que aquel característico para vellos tipo IVa (típicamente 5-6 residuos de longitud) , todavía más cortos que el péptido conductor típico IVb (15-30 residuos) . A 137 residuos, el vello NTHi maduro es más corto que cualquier clase IVa o vellos IVb (150 y 190 residuos, respectivamente) . Puesto que las proteínas NTHi PilA empiezan con fenilalanima N-metilada, son más semejantes a los vellos IVa sin embargo en micrografías electrónicas, libres de vellos pili NTHi tipo IV en haces lateralmente asociados, un fenotipo más clásicamente asociado con los vellos clase IVb debido a su capacidad de auto asociado a través de interacciones antiparalelas . En términos de diversidad de secuencia de NTHi PilA, sobre todas estas secuencias son altamente homologas. Ver la Figura 1. Dos áreas de diversidad potencialmente importante, si es accesible superficialmente y también dirigida para desarrollo de vacuna debido a imunodominancia protectora o función de enlace de adhesina, existen en las posiciones 55-64 y 79-87. Dentro de la primera región, centro los aislados clínicos, parece haber dos variantes principales, una que representa la mayoría (siente de once aislados, 64%), y caracterizados por la siguiente secuencia: NET/ITNCT/MGGK y la otra representando la minoría (cuatro de once aislados, 36%) y caracterizada por la secuencia: GKP/LST/SCSGGS . Sin embargo, hay algunas variaciones menores adicionales en las posiciones +57 y +61 en la agrupación de mayoría y en las posiciones +57 y +59 para la agrupación de minoría. La diversidad observada en la posición +61 ßolamente se ve en un aislado hasta la fecha (cepa #1885), en donde hay una substitución T a M. Dentro de la segunda región enfocada de diversidad (posición 79-87), parece haber dos variantes igualmente distribuidas entre los aislados NTHi clínicos. La secuencia ASVKTQSGG está presente en cinco de once aislados clínicos (-45%), mientras que la secuencia KSVTTSNGA está presente en seis de once aislados clínicos (-55%) . Sobre todo, de los siete aislados con la secuencia de mayoría en la posición 55-64, cinco aislados también tienen el motivo KSVTTSNGA en la región 79-87, con los dos aislados restantes teniendo el motivo ASVKTQSGG en esta región. De los cuatro aislados clínicos restantes con la secuencia de minoría en la posisión 55-64, tres de estos también tienen el motivo ASVKTQSGG en la región 79-87, con solamente un aislado teniendo la secuencia KSVTTSNGA en este dominio. De esta manera, dependiendo de si estas son substituciones conservadoras o no y si las secuensias residen dentro de la superfisie accesible, las áreas hidrofílisas de elevado índice antigénico y de esta manera son blancos para desarrollo de vasuna, pueden o no neeesitar ser incluidas como componentes basados en vellos tipo IV para inducir una respuesta inmune a NTHi . Ejemplo 8 Para examinar el papel de vellos tipo IV en OM inducido por NTHi y determinar si los anticuerpos de niños durante la enfermedad natural reconosen los vellos tipo IV, euatro péptidos ßintéticos en secuencia se sintetizaron representando aminoácidos 21-137 de SEQ ID NO: 2 de PilA maduro de cepa de NTHi 86-028NP y ensayados a través de biosensor contra un panel de suero pediátrico y efusiones de oído medio obtenidas de niños son OM. El suero de niños a 2, 6-7, o 18-19 meses y 4-6 años de edad son OM debido a NTHi se segregaron en grupos de insidencia baja y elevada, como se determina por el número de episodios de OM. A la fecha, los anticuerpos en suero obtenidos de niños de 2 y 7-7 meses de edad de ya sea incidencia alta o baja de OM demostraron reaotividad limitada son cualquiera de los pépticos de vello tipo IV, con valores de 3-38 y 4-61 unidades de resonancia (RU), respectivamente. Sin embargo, una diferencia notoria entre estos grupos se vio con suero obtenido a 18-19 meses de edad. Mientras que los valores obtenidos con sueros del grupo de baja incidencia de 18-19 meses fueron 44-105 RU, los sueros de 1 panel de alta incidensia resonosieron el tipo de péptidos de vello tipo IV hasta sinso veses mayor (81-528 RU) . A 4-6 años de edad, a medida que los niños resuelven naturalmente OM, la reastividad de los péptidos de vellos tipo IV fue nuevamente similar entre dos grupos de insideneia. Para confirmar que la reactividad observada aquí fue específica para enfermedad debido a NTHi, el suero de niños con OM debida a S. pneuminiae también se ensayaron. En todos los casos, los valores de 16-120 se obtuvieron contra todo tipo de péptidos de vellos tipo IV. Para ensayar la presencia de anticuerpos dirigidos contra vellos tipo IV en efusiones obtenidas de los oídos medios, también se ensayaron estos fluidos a través de biosensor. Mientras que las efusiones de niños son OM debida a Streptosossus fueron no reastivas, aquellas recuperadas de niños con OM debida a NTHi fueron altamente reactivas con péptidos de vello tipo IV. Colectivamente, el dato sugiere fuertemente que vellos tipo IV de NTHi se expresan in vivo, durante el curso de enfermedad de OM y que estas estructuras son inmunogénicas . Ejemplo 9 Identifisación de inmunógenos que confieren respuestas inmunes protectoras cruzadas amplias contra NTHi se puede llevar a cabo como sigue. Síntesis de péptidos de vellos NTHi A fin de hacer mapa de ambos dominios inmunodominantes y de enlace de adhesiva de PilA, un panel de péptidos en sesuensia traslapantes así somo péptidos derivados de dos áreas enfosados de diversidad sonocida (ver el Ejemplo 6 arriba) se sintetizan. Por ejemplo, trece péptidos 15-mer con un traslape de 5 residuos se sintetizará para trazar la proteína de vello maduro de 137 residuos sompleta. El péptido terminal C final en realidad será una expansión 17-mer de 121-137 residuos a fin de ineorporar los dos aminoásidos finales de PilA maduro. Para acomodar las dos regiones descritas de diversidad dos variantes del péptido que expande residuos 51-65 y dos variantes del péptido que expande los residuos 79-95 se sintetizarán. A fin de acomodar completamente esta última región de diversidad, dos péptidos se hacen variando en longitud por un aminoácido en el término N puesto que la región de diversidad en realidad expande residuos 79-87. Debido al residuo adicional, cada uno de estos últimos dos péptidos será 16-mers de longitud. De esta manera un total de quince péptidos se sintetizarán: doce serán 15-mers, uno sería uno de 17-mer y dos serán péptidos de 16-mer. Los péptidos se exponen en el cuadro 2 abajo en donde los números de residuo de aminoácido corresponden a aminoácidos en SEQ ID NO: 2. Cuadro 2 Péptido Sesuencia OLP1 [Residuos 1 - 15] FTLIELMIVIAIIAI OLP2 [Residuos 11 - 25] AIIAILATIAIPSYQ OLP3 [Residuos 21 - 35] IPSYQNYTKKAAVSE OLP4 [Residuos 31 - 45] AAVSELLOASAPYKA OLP5 [Residuos 41 - 55] APYKADVELCVYSTN OLP6vA [Residuos 51 - 65] VYSTNETTNCTGGKN OLP6vB [Residuos 51 - 65] VYSTGKPSTCSGGSN 0LP7 [Residuos 61 - 75] TGGKNGIAADITTAK 0LP8 [Residuos 61-75] ITTAKGYVKSVTTSN OLP9vA [Residuos 79-94] 77-95 YVKSVTTSNGAITVKGDGT OLP9vB [Residuos 79-94] 77-95 YVASVKTQSGGITVKGNGT OLP10 [Residuos 91 - 105] KGDGTLANMEYILQA OLP11 [Residuos 101 - 115] YILQATGNAATGVTW OLP12 [Residuos 111-125] TGVTWITTTCKGTDAS OLP13 [Residuos 121-137] GTDASLFPANFCGSVTQ Generación de vello NTHi recombinante (rPilA) Proteína Pila recombinante (rPilA) se puede generar para servir somo un produsto fásilmente renovable para uso en ensayos para representar la proteína de subunidad de vello sompleta. Para haser esto, el protocolo publicado de Keizer y col. (J. Biol. Chem., 276: 24186-14193, 2001), que estudiaron un vello que también tenía cuatro residuos Cys como será crítiso que rPilA de manera similar se doble apropiadamente de manera de poseer sualidades funcionales de la subunidad de vello nativo, se utiliza. Brevemente, un vello truncado se hace en donde los primeros 28 residuos se remueven del término N para impedir agregación, y este vello trunsado se hará adicionalmente para ser transportado al periplasma por medio de la incorporasión de una sesuensia sondustora OmpA en la sonstrussión. Utilizando esta estrategia, keizer y sol . , generaron una proteína de vello de P. aeruginosa monomérisa soluble resombinante que fue sapaz de ligarse a su reeeptor (asialo GM1) en ensayos in vitro y disminuir la morbidez y mortalidad en ratones cuando el péptido se entregó 15 mins antes de reto heterólogo. Esta forma soluble, monomérisa trunsada de NTHi PilA será útil en los estudios abajo dessritos. Mapeo de dominios inmunodominantes de PilA Los péptidos y proteínas nativas y PilA resombinantes se usaron en sombínasión son ambas shinshilla aguda y sonvalesiente y suero pediátriso además de fluidos de oído medio de chinchillas y niños que experimentan ya se OM experimental o natural debido a NTHi (todos disponibles dentro de nuestra astual solessión de muestras o planeados para solessión somo parte de una inisiativa separada) para formar el mapa de dominios inmunodominantes de PilA a través de ELISA y también ensayos de biosensor. Brevemente, los péptidos PilA, rPilA y vellos nativos se ligan a plasas de microtítulo de 96 pozos o a una superficie de chip de biosensor, luego se ensayó para la cantidad relativa de antisuerpo dentro del suero o fluido de oído medio que se liga a cada péptido. Estos estudios identifican aquellas regiones de la subunidad de vello que son relativamente más inmunodominantes que otras como se reconoce por ambos, el huésped de chinchilla y el niño humano. Debido al hecho de que el péptido sintético más N terminal está somprendido de aminoácidos altamente no polares (hidrofóbicos) y es de esta manera probablemente enterrado dentro de la fibra de vello e inacsesible al antisuerpo, este péptido de 15-mer se espera que sirva somo un control negativo interno para los ensayos descritos aquí. Suero pediátriso normal y suero de shinchilla inocente servirán somo sontroles de suero negativo y fluidos de lavado de oído medio resuperados de un animal inocente se usarán como un control negativo para efusiones recuperadas durante infecsión de NTHi del oído medio.

Formación de mapa de dominios de enlace de adhesina de PilA En orden de trazar los dominios de enlace de célula eusariótisa de PilA, ensayos ELISA sompetitivos se conducen así co o evaluaciones de la capacidad de los péptidos de vello sintético para inhibir NTHi que se liga a células eusariótisas en sultivo de sélula a través de misrossopía sonfocal. Para ensayos de tamizado iniciales, las células de meta eucariótisas relevantes se desarrollan dentro de platos de mitrotítulo de 96 pozos. Las eélulas se lavarán, luego se preinsuban son péptidos de vello sintétiso, rPilA o vellos NTHi nativos [0.2 ug en PBS] para determinar su sapasidad relativa para bloquear enlase de NTHi cepa 8 -029NP (desarrollada bajo condiciones conocidas que promueven expresión de vello) a estas células eucariótisas. La adherencia relativa de NTHi se determinará usando antisueros policlonales dirigidos contra una preparación de NTHi OMP entera homologa y proteína A conjugada con HRP con solor desarrollado con tetrametilbencidina (TMB) . Para estos ensayos las células de meta epiteliales relevantes [es decir, células epiteliales de oído medio de chinchilla (CMEEs), células bronquiales/traqueales humanas normales (NHuBr) , línea de célula epitelial alveolar tipo II humana (A549s)], una célula de meta epitelial clínicamente irrelevante a la que NTHi no se adhiere (CHOs) así como una célula de meta endotelial [células endoteliales de vena umbilisal humana (HUVECs)] se usarán. Para esos . péptidos que muestran aetividad inhibitoria (típisamente el sorto es a >15% de inhibisión de adherensia son relasión a sontroles), sualquier dependensia de dosis a la capacidad de bloqueo de adherencia bacterial observada se determina. La interacción se puede evaluar adicionalmente condusiendo ensayos de bloqueo de adherensia usando un sistema Transwell en donde las sélulas epiteliales de tracto respiratoria (CMEEs y NHuBrs) se desarrollan en la interfaz de aire-fluido. Estas células se incuban con primero péptidos sintéticos de interés (o controles apropiados, es decir OMP P5 y P2 aislados como controles positivo y negativo para proteínas de superfisie de NTHi involusradas o no en adhereneia, respectivamente y rPilA) para tratar de bloquear los receptores Tfp disponibles, luego se lavarán 5X con medio de desarrollo fresco seguido por inoculación con -2-5 x 107 NTHi desarrollado bajo condiciones que sabemos promoverán la expresión de Tfp. Los cultivos se lavarán para remover la basteria no adherénte, luego se fijarán son metanol en hilo durante 5 min, se sesan al aire, se enjuagan son PBS y las membranas se remueven del Transwell y se solocan sobre deslizadores de subierta de vidrio para formar imagen a través de microscopía confocal.

Para detestar NTHi adherente, suero anti-NTHi OMP hiperinmune dé shinshilla y FITC-Proteína A se usará para documentar la interacsión de NTHi son su sélula de meta epitelial, o inversamente el bloqueo de esta interasción por péptidos que representan dominios de enlace de adhesina putativos de PilA. Selección de ínmunógeno Basado en el dato adquirido arriba, los péptidos inmunogénicos se seleccionan basados en ambas, inmunodominancia- relativa así como capasidad de inhibir la adherensia de NTHi a células de meta epiteliales respiratorias. Dependiendo de las carasterísticas bioquímicas y estructurales de las regiones de interés, los péptidos se producirán ya sea como péptidos sintéticos o péptidos reso binantes. La inmunogenisidad y efieacia protectora de los inmunógenos de PilA se evalúa inicialmente en el modelo animal de chinshilla dessrito en la presente y en pruebas humanas . Resumen de Ejemplo La evidensia anterior indisa que NTHi expresa vellos tipo IV funcionales en su superficie. Las proteínas codifisadas por estos genes se sabe que son importantes para sompetensia de transformasión de H. influenzae tipifisable y se sontemplan en la presente que son importantes para formación de biopelícula por NTHi también. Colectivamente, estas observasiones indisan que NTHi es probable que regule assendentemente la expresión de vellos tipo IV en el ambiente restringido en nutriente del huésped humano. De esta manera, los vellos tipo IV representan un blanco excelente para una vacuna y/o para una estrategia antimicrobiana para condiciones patógenas ocasionadas por NTHi así como H. influenzae cepas a, b, c, e y f.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1.- Un polinueleótido aislado que somprende una sesuensia de nusleótido que sodifisa una sesuensia de aminoácido de cualquiera de: polpéptido PilA SEQ ID NO: 2, polipéptido PilB SEQ ID NO: 4, polipéptido PilC SEQ ID NO: 6, polipéptido PilD SEQ ID NO: 8, polipéptido ComA SEQ ID NO: 10, polipéptido ComB SEQ ID NG: 12, polipéptido ComC SEQ ID NO: 14, polipéptido Comd SEQ ID NO: 16, polipéptido ComE SEQ ID NO: 18, polipéptido ComF SEQ ID NO: 20, polipéptido PilF SEQ ID NO: 22, polipéptído PilA SEQ ID NO: 26, polipéptido PilA SEO ID NO: 26, polipéptido PilA SEQ ID NO: 28, polipéptido Pila SEQ ID NO: 30, polipéptido PilA SEQ ID NO: 32, polipéptido PilA SEQ ID NO: 34, polipéptido PilA SEQ ID NO: 36, polipéptido Pila SEA ID NO: 38, polipéptido Pila SEQ ID NO: 40, polipéptido Pila SEQ ID CO: 42, o polipéptido pilA SEQ ID NO: 44.
2. 2.- Un polinucleótido aislado que comprende una secuensia de nucleótido de cualquiera de: pilA SEQ ID NO: 1,' pilB SEQ ID NO? 3, pilC SEQ ID NO: 5, pilD SEQ ID NO: 7, comA SEA ID NO: 9, oomB SEQ ID NO: 11, somC SEQ ID NO: 13, somD SEQ ID NO: 15, oomE SEQ ID NO: 17, somF SEQ ID NO: 19, pilF SEQ ID NO: 21, pilA SEQ ID NO: 25, pilA SEQ ID NO: 27, pilA SEQ ID NO: 29, pilA SEQ ID NO: 31, pila SEQ ID NO: 33, pilA SEQ ID NO: 35, pilA SEQ ID NO: 37, pilA SEQ ID NO: 39, - pila SEQ ID NO: 41 o pilA SEQ ID NO: 43.
3. 3. - Un vector que comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicasión 1 o 2.
4. 4.- Un polipéptido aislado que somprende una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de nucleótido de conformidad con la reivindicasión 1, o un fragmento de la misma.
5. 5.- ü? polipéptido aislado que comprende una secueneia de aminoásido de sualquiera de polipéptido Pila SEQ ID NO: 2, polipéptido PilB SEQ ID NO: 4, polipéptido PilC SEQ ID NO: 6, polipéptido PilD SEQ ID NO: 8, polipéptido ComA SEQ ID NO: 10, polipéptido ComB SEO ID NO: 12, polipéptido ComC SEQ ID NO: 14, polipéptido ComD SEQ ID NG: 16, polipéptido ComE SEQ ID NO: 18, polipéptido ComF SEQ ID NO: 20, polipéptido Pílf SEQ ID NO: 22, polipéptido PilA SEQ ID NO: 26, polipéptido PilA SEQ ID NO: 26, polipéptido Pila SEQ ID NO: 28, polipéptido PilA SEQ ID NO: 30, polipéptido PilA SEQ ID NO: 32, polipéptido Pila SEQ ID NO: 34, polipéptido Pila SEQ ID NO: 36, polipéptido PilA SEQ ID NO: 38, polipéptido PilA SEQ ID NO: 40, polipéptido PilA SEQ ID NO: 42, o polipéptido pilA SEQ ID NO: 44, o un fragmento de péptido de los mismos.
6. 6.- Una composición que comprende un polipéptido o fragmento de péptido de conformidad con la reivindicación 5, y un portador farmacéuticamente aceptable.
7. 7.- Un anticuerpo que se liga específisamente a un polipéptido o fragmento de péptido de conformidad con la reivindicasión 5.
8. 8.- Una composición que comprende un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8 y un portador farmacéutisamente aseptable.
9. 9.- Un método para detectar bacteria NTHi en una muestra biológica, que comprende (a) poner en contasto un polinusleótido de sonformidad son la reivindisasión 1 o un fragmento del mismo son una muestra biológisa, y (b) detestar la hibridízación del polinucleótido dentro de la muestra, en donde la hibridización indica la presencia de bacteria NTHi.
10. 10.- Un método para detectar basteria NTHi en una muestra biológica que comprende (a) poner en contacto un polínucleótido de sonformidad son la reivindisasión 2 o un fragmento del mismo con una muestra biológica, y (b) detectar la hibridización del polinusleótido dentro de la muestra, en donde la hibridización indica la presencia de bacteria NTHi.
11. 11.- Un método para detectar bacteria NTHi en una muestra biológica, que comprende: (a; poner en contacto un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7 con una muestra biológica, y (b) detectar en enlace del anticuerpo dentro de la muestra, en donde en enlace indica la presencia de bacteria NTHi.
12. 12.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindícasiones 9, 10 u 11, en donde la muestra biológisa se selessiona del grupo que sonsiste en suero, esputo, fluido del oído, sangre, orina, fluido linfático, y fluido cerebroespinal .
13. 13.- Un método para produsir una respuesta inmune a bacteria NTHi que comprende administrar una dosis inmunogénisa de uno o más polipéptidos o fragmentos de péptido de sonformidad son la reivindisasión 5 a un pasiente en riesgo de infección bacterial de NTHi.
14. 14.- Un método para producir una respuesta inmune a bacteria NTHi que comprende administrar una dosis inmunogénica de uno o más polinucleótídos de conformidad con la reivindisación 1 a un paciente en riesgo de infección bacterial de NTHi.
15. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el polinucleótido está en un plásmido o vector viral.
16. 16.- Un método para tratar o prevenir la infección bacerial NTHi que comprende administrar una molécula que inhibe la expresión o actividad de un polipéptido de sonformidad son la reivindicación a un paciente en necesidad del mismo.
17. 17.- El método de conformidad con la reivindicasión 16, en donde la molésula administrada al paciente en necesidad es un oligonucléotido antisentido.
18. 18.- El método de conformidad con la reivindicasión 16, en donde la molésula administrada al pasiente en nesesidad es un anticuerpo.
19. 19.- El método de conformidad con la reivindicasión 16, en donde la molésula administrada al paciente en necesidad es una molécula pequeña.
20. 20.- El método de sonformidad son la 15 reivindisasión 26, en donde la infesción de NTHi está en el oiao eaio. 20 ZD RESsMEN DE LA INVENCIÓN La invención descrita en la presente se relaciona con un regulador que codifica vello tipo IV de Haemophilus influenzae (H. influenzae) . En particular, la invención se relaciona con vello tipo IV de H. influenzae no tipificable (NTHi) y de H. influenzae cepas a, b, c, e y f. La invención proporciona polinucleótidos de vello de H. influenzae aislados y polipéptidos codifísados por los polinusleótidos así somo polinusleótidos y polipéptidos codificados por los polinucleótidos involucrados en el ensamblado/desensamblado de la estructura. La invención también se relaciona con usos de estos polinucleótidos y/o polipéptidos que insluyen métodos para producir una respuesta inmune a H. influenzae y métodos para tratar y prevenir H. influenzae relacionada con condisiones patológicas.