JPH06502394A - 溶血素群毒素に関するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来抗原性鉄抑制蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

抗原性鉄抑制蛋白質 本発明は、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離された抗原 性ポリペプチドＳ該ポリペプチドに対して生じる抗体、該ポリペプチドを含有す るワクチンおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。ポリペプチドと は溶血素群毒素の一つであり、典型的なものとしてはＢ、ｃｏｌｉ由来のα−溶 血素が挙げられる。 細菌性の病因は複雑であり、プロセスはほとんど理解されていない。多くの病因 性細菌は動物細胞の代謝や機能を損なう毒素を分泌する。様々なりラスの分子が そのような毒素を構築する。 蛋白質毒素の一例が、ヒトの場外感染を引き起こす病因性Ｅ、ｃｏｌｉ株に見出 される。そのような感染は哺乳動物赤血球の溶血を特徴とする。その溶血活性は 溶血素として知られる一群の毒素によるものである。そのクラスにはα−溶血素 およびβ−溶血素が含まれる（ｌｌｅｌｃｈら、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ 　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　４２．　１７８−１８６　（１９８３）参照のこと）。 もう一つの蛋白質毒素はアデニル酸シクラーゼであり、それはＢｏｒｄｅｔｅｌ ｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓに見出さ れ、プロフェッショナル食細胞の機能を阻害する。これらの細菌は各々百日咳お よび炭痘病の原因である。 第３の病因性細菌由来の蛋白質毒素類はロイコトキシンであり、幼年期の局所的 な歯周炎の病原剤であるＡｃｔｉｎｏｂａｃｉ　ｌ１ｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃ ｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、およびウシ白血球を死滅させるＰａ５ｔｅｕｒｅｌ ｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａに見出される。 Ｋｏｌｏｄｒｕｂｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎ＋ｊ　Ｉｍ＋＋＋ｕｎｉｔ ｙ　５７．　１４６５−１４６９（１９８９）参照のこと）。明らかに、様々な 細菌属に見出される一連の毒素群が存在する。細胞毒素のこの群のアミノ酸配列 は、高頻度に繰り返された９個のアミノ酸のモチーフ、すなわちＬｘＧＧｘＧＮ Ｄｘ　（但し、Ｘはいずれかのアミノ酸を示す。）に特徴がある。本明細書の目 的は、この一連の毒素が溶血素群毒素に関することを述べるものである。 「溶血素群毒素」が当業者にとって一般的な属名であり、実際には大部分が細胞 毒素であるが、全てが溶血性でないことを意味するものであると理解されるべき である。その群としての資格は以下に定義するようなアミノ酸配列の相同性であ る。上記に加えて、相同する蛋白質は５ｅｒｒａｔｉａおよびｐｒｏｔｅｕｓに も見出されているが、これら溶血素群のメンバーが実際に細胞毒素であるかどう かは不明である。 この重要で、時には死をもたらす細菌であるＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇ ｉｔｉｄｉｓはを散性髄膜炎および敗血症ショックの原因であるが、この菌につ いてはほとんど知られていない。Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇ山ｄｉｓおよびこれが引き 起こす疾病については、ＰａｔｅｒｓｏｎによりＢｉｏｌｏｇｉｃ　ａｎｄ　Ｃ １１ｎｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ 、の”Ｎｅｉｓｓｅｒｉ■ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　ａｎｄ　Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　Ｄｉｓｅａ ｓｅ”、Ｗ、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃｈ≠垂狽■■ ４３（１９８０）に記載されている。 合がある。免疫学的種形成は、十分量のグループ特異性抗原がないため、困難な 場合がある。 Ｎ、　ｆｆｌｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは様々な血清型として存在し、そのを患率 は時間と存在場所により変わる。血清型には、Ａ、Ｂ、Ｃ，ＤＳＸ、ＹＳＺ、２ ９−ＥおよびＷ−１３５がある。 Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の３つの最も重要な公知の抗原性および／ま たはを毒性成分は、莢膜多糖、リポ多糖−エンドトキンン細胞壁複合体およびＮ ｅ１ｓｓｅｒｉａ−特異法蛋白質である。莢膜多糖は髄膜炎菌を、分裂した好中 球による食作用に抵抗できるようにする主な病毒性要因である。 髄膜炎菌の多糖を含有するワクチンは、いくつかのＮ、　ｍａｎｉｎｇｉｔｉｄ ｉｓ血清型に対して用いる。例えば、Ａ、Ｃ，ＹおよびＷ−１３５血清型に対す る防御が多糖ワクチンにより可能になる。しかしながら、そのようなワクチンは Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの感染に対する全般的な防御には不十分である。 例えばＡおよびＣ血清型の多糖ワクチンに対する免疫応答は、特に髄膜炎菌性疾 病に最も感受性の高い２才以下の子供ではほとんどない。さらに、Ｂ血清型に有 効なワクチンが存在せず、おそらくそれはＢ群の莢膜多糖が比較的非免疫原性で あることによる。 Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの病理学についてさらに研究をする必要がある ことは明らかなことである。おそらく、この病原体をさらに理解することにより 、現在利用可能なものよりもより多くの血清型に対して全般的に有用なワクチン の発見が導かれ進行し、時折人によっては死に到るのに、明らかに同様の危険な 状態にあるその他大多数の人々はそうならないのか、については不明である。莢 ＩＩ多糖の量もリボ多糖−エンドトキシン複合体の量もこの疾病の危険性とは相 関しない。 Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの莢膜多糖と交叉反応する抗原性成分を持つ微 生物にさらす方法は、一つの解釈を導いてくれた（Ｐｅｔｅｒｓｏｎの同著書参 照のこと）。 それ以外の解釈もまた可能である。例えば、莢膜多糖とは異なる抗原への交叉免 疫を除外することはできない。この点に関して、Ｎ、　ｍａｎｉｎｇｉｔｉｄｉ ｓと結合する蛋白質毒素が知られていないことに注目することは興味深いことで ある。この一つ（１９８１）参照のこと。 本発明における問題点の一つは、Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの同定および Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅとの識別を可能にする抗原性ポリペプチド２よび ＤＮＡ配列の発見である。また、本発明のもう一つの問題点は、髄膜炎菌性疾病 に対して有効な抗体の製造を可能にする蛋白質の発見である。 当業者にとって明白なように、これら、およびそれ以外の問題は、少なくとも５ ０アミノ酸残基を有するセグメントを含み、かつ該セグメントのアミノ酸配列が Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在し、さらに該アミノ酸配列が溶血素群毒 素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異なるが実質的に相同する、単離され た抗原性ポリペプチドを提供することにより解決されるものである。 ポリペプチドのもう一つの決定方法は、Ｎ、Φｅｎｉｎｇｉｔｉｄｊｓに存在す るアミノ酸配列を有するセグメントを含み、かつ該アミノ酸配列が９個のアミノ 酸の溶血素共通配列の少なくとも３つの繰り返しを含み、該溶血素共通配列が位 置１のＬ； 位置３０Ｇ； 位置４０Ｇ； 位置６０Ｇ； 位置７ＯＮ； 位置８のＤ；および 位置２．５および９のＸ； （ただし、Ｘは独立していかなる単一アミノ酸残基を表す。）のうち少なくとも ４つを含む、単離されたポリペプチドであることを示すことである。 さらに本発明は、前述のポリペプチドの抗原性フラグメント、該ポリペプチドに 対して住じる抗体、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および該ポ リペプチドを含有するワクチンを包含するものである。 鉄制限条件下でＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを生育させた時、溶血素群毒素 のセグメントとは異なるが、実質的に相同するアミノ酸配列を有するセグメント からなるポリペプチドが発現することが思いがけず発見された。例えばＡ４．８ ５（以下参照）のように、Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに見出されるポリペ プチドに対して生じるモノクローナルびＢｏｒｄａｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓ ｉｓにより産生されるアデニル酸シクラーゼとウェスタン。 プロットで交叉反応する。 ここで用いられる溶血素群毒素としては、ペプチドが挙げられ、特にα−溶血素 、ロイコトキシン、およびアデニル酸シクラーゼが挙げられる。 二つのアミノ酸配列が実質的に相同するか否かの決定は、本明細書では、Ｐｅａ ｒｓｏｎｋよびしｉｐｍａｎのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳ八へ５．２４４４−２４４８（１９８８）によるＦＡＳＴＡ検索法に基づい て行った。本発明による実質的に相同する配列は、ここでは引例であるＰｅａｒ ｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの方法によりめた時、アミノ酸配列において少なくと も１５％一致しており、好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なく とも２５％が一致している。 本発明のポリペプチドは、溶血素群毒素のその他のものと同一なセグメントを含 有する必要はない。ＦＡＳＴＡ法による同一性は９０％または９５％程度であっ てよいが、通常Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離された場合には４０％ または５０％以上の同一性を示すことはない。 ポリペプチドの大きさに制限はなく、溶血素群毒素の一つのセグメント、と実質 的に相同するセグメントを含有する程度の長さであればよい。実質的に相同する セグメントは少なくとも５０アミノ酸残基ををし、好ましくは少なくとも１００ アミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも２００アミノ酸残基を有する。本明 細書にふいて、「ポリペプチド」という用語は「蛋白質」や「ペプチド」のよう な用語と区別できないと考えられる。 溶血素群毒素のセグメントと実質的に相同する髄膜炎菌ポリペプチドのセグメン トは、全ての溶血素群毒素の特徴を示す同じ９個のアミノ酸のモチーフを含有す る。共通する配列はＬｘＧＧｘＧＮＤｘであり、以下溶血素共通配列という。 Ｘで表されるアミノ酸はいかなるアミノ酸でもよい。 本発明のポリペプチドは、上記の実質的な相同性基準だけでなく、溶血素共通配 列により定義されてもよい。このため、９個のアミノ酸配列が少なくとも４個、 好ましくは少なくとも５個、そしてさらに好ましくは全６個の特定のアミノ酸残 基（すなわち、Ｌ−ＧＧ−ＧＮＤ）を正しい位置に含有しているならば、それは 溶血素共通配列であると考えられる。 第２図（以下に記載されている）はＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離さ れたポリペプチドの一部であり、これによれば、相同するセグメントは溶血素共 通配列が多数操り返されている３つの範囲、すなわち４８６番目と５１２番目の アミノ酸の間、６２３番目と７１２番目のアミノ酸の間、および８２３番目から 最後のアミノ酸の間からなる。第２図には完全な共通配列が２１存在する。 本発明のポリペプチドには、Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在し、少なく とも３つ、好ましくは少なくとも５つ、さらに好ましくは少なくとも１０の溶血 素共通配列を含むセグメントが含まれる。本発明のポリペプチドは少なくとも２ １程度の溶血素共通配列を有していてもよい。 ポリペプチドは単離されるが、それは本質的にその他の蛋白質、特にＭ、　ｍｅ ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのその他の蛋白質から遊離することを意味する。本質的に 他の蛋白質から遊離するということは、他の蛋白質から少なくとも９０％が遊離 していることであり、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくと も９８％が遊離していることを意味する。 好ましくは、ポリペプチドは本質的に純粋なものであり、それはポリペプチドが 他のポリペプチドからだけでなく、ポリペプチドの単離や同定に用いられる他の 物質、例えばニトロセルロース紙だけでなくドデシル硫酸す）　ＩＪウムや他の 洗浄剤等からも遊離していることを意味する。ポリペプチドはそのような物質か ら少なくとも９０％が遊離しており、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ま しくは少なくとも９８％が遊離しているものである。 本発明のポリペプチドは抗原性であるが、これはポリペプチドが哺乳動物におい て特異的な抗体を誘導することを意味する。好ましくは、ポリペプチドは免疫原 性である。 ポリペプチドはＭｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在するような完全なポリペプ チドであってもよく、または全ポリペプチドの抗原性、好ましくは免疫原性の７ ラグメントであってもよい。抗原性および／または免疫原性ポリペプチドの抗原 性および／または免疫原性フラグメントは、当技術分野において公知の方法によ り同定してもよい。通常、抗原性フラグメントは、溶血素群毒素の一つであるポ リペプチドのセグメントのアミノ酸配列とは異なるが相同するアミノ酸配列を有 するセグメントの少なくとも一部からなるか、あるいは少なくとも３つ、好まし くは少なくとも５つ、さらに好ましくは少なくとも１０の溶血素共通配列を有す るセグメントの少なくとも一部からなる。 ポリペプチドの調製 本発明のポリペプチドは当技術分野で公知である方法により調製してもよい。 そのような方法としては、ポリペプチドを直接Ｎ、ｍｅｎｉｎｇ山ｄｉｓから単 離すること；ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離または合成し、該ＤＮＡを 用いて組み換えポリペプチドを製造すること；およびポリペプチドを個々のアミ ノ酸から合成すること等が挙げられる。 ポリペプチド、またはポリペプチドをコードするＤＮＡはＮ、ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓのいかなる血清型から単離してもよい。そのような血清型としては、Δ 、Ｂ、Ｃ，Ｄ、ｘ、ｙ、ｚ、２９−ＥおよびＷ−１３５が挙げラレル。 ポリペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡが単離される適当な髄腹炎 菌株の入手源が利用できる。そのような入手源としてｆｉａｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＯ）およ びＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＡＭＲ［１，口ｎ１ｖｅｒｓ ｉ狽凵@ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）が挙げられる。適当な菌株として はＦＡＭ１８およびＦ　ＡＭ　２０　（Ｄｙｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐａ ｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　３．　３５　Ｌ　−３６３（１９８７））、およびＦＡ Ｍ１９が挙げられる。それ以外の髄獲炎菌株は５ｃｈｒｙｖｅｒｓｉよびＭｏｒ ｒｉｓによる１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｏ＋ｍｕｎｕｔｙ　５６．　１１ ４４−１１４９　（１９８８）に記載されている。 ポリペプチドはＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｊｄｉｓから当該技術分野で公知の方法 により直接単離してもよい。まず、髄膜炎菌の外層層を単離し、公知の方法で調 製する。ＷｅｓｔおよびＳｐａｒｌｉｎｇによるＩｎｆｅｃｔ、　Ｉｗｕｎ、４ ７．　３８８−３９４　（１９８５）に記載された方法、および５ｃｈｒｙｖｅ ｒｓおよびＭｏｒｒｉｓによるＩｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、５６　。 １１４４−１１４９　（１９８８）に記載された方法が適当である。 単離された膜蛋白質は公知の方法、例えば洗浄剤の添加等により可溶化してもよ い。通常用いられる洗浄剤としては、オクチル−β−グルコシド、チャラプス（ Ｃｈａｐｓ）　、７バイターゲント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）　３．１４また はトライトン−Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）が挙げられる。腰蛋白の溶解性を促進す るために洗浄剤を用いることは、ＪｏｎｅｓらによるＦｉｎｂｙ、　５ｏｌｕｂ ｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｍｂ ｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎｓ　：＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ｒ ＲＬ　Ｐｒａｓｓ　（Ｌ　９８６）　、Ｈｅ１ｅｎｉｕｓらによる８ｉｏｃｈｉ ｍ、θ１ｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　４ユ５．２９　（１９７５）、およびＨｊｅＩ ｔｎｅｌａｎｄとＣｈｒａｍｂａｃｈによるＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、１ ０４．　３０５　（１９８４）に記載されている。 蛋白質は可溶化された膜分画から標準的な方法により単離される。いくつかの適 当な方法としては、沈降法や、イオン交換、疎水性相互作用およびゲルろ過等の 液体クロマトグラフィープロトコールが挙げられる。例えば、Ｍｅｔｈｏｃｌｓ ＢｎｚｙｍｏＬ　１　ｇ　２　（Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ、　Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、　Ｂｄ、　５ｅｃｔｉ獅潤@Ｖｌｌ） ３０９　（１９９０）および５ｃｏｐｅｓ、　Ｐｒｏｔａｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８７）を参照のこと。 一方、精製された物質は、分取５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで蛋白質を分離し、目的の バンドを分割し、当技術分野で公知の方法により蛋白質をアクリルアミドのマト リックスから電気溶出させることにより得られる。洗浄剤ＳＤＳは、透析やＰｉ ａｒｃｅの［！ｘｔｒａｃｔｉ−ゲルカラム等の適当なカラムの使用などの公知 の方法により蛋白質から除去される。 ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離すること；適当な宿主 内でＤＮＡをクローニングすること；宿主内でＤＮＡを発現させること；および ポリペプチドを採取することにより製造されてもよい。 本発明のポリペプチドをコードする第１のＤＮＡはイムノスクリーニング法によ り単離された。そのような方法がＭａｎｉａｔｉｓらによる“Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃ１ｏｒ＋＋ｎｇ　：　Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、”Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐ窒奄獅■ Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）に記載されている。 要約すれば、モノクローナル抗体はＮ、のｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ｆ　ＡＭ　 ２０株の鉄抑制外層膜蛋白質に対して産生される。モノクローナル抗体の一つで あるＡ４．８５はＦＡＭ２０の外層膜のウェスタン・ブロツッ（Ｗｅｓｔｅｒｎ 　ｂｌｏｅｓ）上のいくつかの鉄抑制蛋白質を認識した。Ａ４．８５は、発現ベ クター−λ−ｇｔｌｌに作られたＦＡＭ２０の染色体ライブラリーからクローン を単離するために用いた。このクローンの配列は決定され、隣接する染色体抑制 フラグメントをクローンするために用いた。この領域の隣接したＤＮＡ配列は長 いオープンリーディングフレームを含有しており、それを第１１ｆｆｉに示す。 第１図のヌクレオチド配列から予示されるアミノ酸配列を第２図に示す。 オーブンリーディングフレーム（第２図）から推測されるアミノ酸配列を、Ｐｅ ａｒｓｏｎおよびいｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＬＩＳ＾８５．２４４４−２４４８（１９８８））に従ってＦＡＳＴＡ相同性検 索を行った。驚くべきことに、このアミノ酸配列は、上記で議論したように、い くつかの溶血素群毒素と実質的な相同性を示した。 さらにＮ、　ｍａｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離されたポリペプチドが毒素の溶 血素群の一つであることから明らかなように、第２１！ｌに示されるポリペプチ ドに対して生じ、そのペプチドを単離するために用いられる抗体、すなわちＡｔ ８５はＥｌ、ｃｏｌｉ由来のα−溶血素（ＨｌｙＡ）および８ｏｒｄｅｔｅｌｌ ａ　ｐｅｒｔｕｓｓｓｉｓで産生されるアデニル酸シクラーゼと強く交叉反応し た。 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の付加的なフラグメント、または完全 なポリペプチドをコードする遺伝子を得るために、イムノスクリーニング法を繰 り返してもよい。むろん、このイムノスクリーニングプロセスを繰り返さなくと もよい。完全な遺伝子または遺伝子の付加的なフラグメントは、好ましくは公知 のＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントを用いることによりプローブとしτ単 離される。そのために、すでにクローン化された領域の末端の側面に位置してい るか、あるいは完全な領域を含有している髄膜炎菌のＤＮＡ制限フラグメントを 、第Ｆ図に示すような予め決定された配列、またはそれらの７ラグメント由来の 標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いて、サザンハイプリダイゼーションに より同定する。 得られるＤＮＡは当技術分野では公知の方法により増幅してもよい。一つの適当 な方法としては、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４．６８３．１９５号およびＳａ ｍｂｒｏｏｋ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ　（著者）のＭｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第 ２版。 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒａｓｓ　 （１９８９）に記載されているポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法 が挙げられる。それは、アンプライマーとしてλ−ｇｔｌｌ−特異性オリゴマー Ｃ８ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製を利用できる）を用いてλ−ｇｔｌｌベクターでク ローンを増幅するのに便利な方法である。 制限フラグメントはプラスミドまたはバクテリオファージ等の適当なベクターに クローンされ、当技術分野で公知の方法により配列される。適当な配列方法とし ては、ＳａｎｇｅｒらによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕ ｓＡ　７４．　５４６３−５４６７　（１９？？）に記載されているジデオキシ チェーン・ターミネーティング法が挙げられる。配列のための適当なベクターお よびポリメラーゼは公知である。適当なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ社製のブルースクリプト（Ｂｌｕａｓｃｒｉｐｔ）ベクターが挙げられる。適 当なポリメラーゼとしては、シンセタ−ゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）　（［Ｊｎｉ ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃ１ｅｖｅｌ ａｎｄ、　０）１）が唐■轤黷驕B 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、多様なベクターを用い、多様な宿 主趣胞に方いて組み換えポリペプチドを発現するために用いてもよい。宿主は原 核性または真核性でもよい。ＤＮＡは天然から得てもよく、場合によっては修飾 されていてもよい。遺伝子は全体または部分的に合成されてもよい。 クローニングベクターは染色体性、非染色体性および合成されたＤＮＡ配列から なっていてもよい。いくつかの適当な原核性ベクターとしては、ｃｏ！Ｅｌ、ｐ ｃＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびＲＰ４等の８．ｃｏｌｉ由来のプラス ミドが挙げられる。また、原核性ベクターとしては、Ｍ１３、ｆｄ、およびその 他の糸状−末鎖ＤＮＡファージ等のファージＤＮＡの誘導体が含まれる。 細菌、特に巳、ｃｏｌｉでの蛋白質発現用ベクターも公知である。そのようスヨ ベクターとしては、ｐＫ２３３　（またはプラスミドのｔａｃ群のいずれか）、 Ｔ７、およびλＰＬが挙げられる。融合蛋白質を発現するベクターの例としては 、Ｄｉｅｃｋ＋ｎａｎｎ′Ｊ６よびＴｚａｇｏｌｏｆｆによるＪ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、２６０．　１５１３−１５２０（１９８５）に記載されているＰＡ ＴＨベクターが挙げられる。これらのベクターにはアントラニル酸シンセターゼ （ＴｒｐＥ）をコードするＤＮＡ配列が含まれており、そのカルボキシ末端にポ ＩＪ　ＩＪンカーが続いている。その他の発現ベクター系はβ−ガラクトシダー ゼ（ｐＥＸ）；マルトース結合蛋白質（ｐＭＡＬ）；およびグルタチオン　Ｓ− ）ランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ＞に基づくものである（Ｇｅｎｅ６？、３１　（ １９８８＞およびＰｅｐｔｉｄｅ　１ｔａｓａｓａｒｃｈ　３．　１６７（１９ ９０）参照）。 酵母において有用なベクターを利用してもよい。適当な例としては２ｕプラスミ ドが挙げられる。 哺乳動物細胞に用いる適当なベクターも公知である。そのようなベクターとして は、十分公知である５Ｖ−４０誘導体、アゾンウィルス、レトロウィルス由来の ＤＮＡ配列およびプラスミドとファージＤＮＡの結合体由来のベクターが挙げら れる。。 それ以外の真核生物の発現ベクターが当技術分野では公知である（例えば、Ｐ、 　Ｊ、５ｏｕｔｈｅｒｎおよびＰ、Ｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　 Ｇｅｎｅｔ、１．　３２７−３４１（１９８２）　；　Ｓ、Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ら、　Ｍｏｌ、　Ｃａ１１．　Ｂｉｏｌ、　１．　８４５−８６４（１９８１） 　；　Ｒ，Ｊ、　ＫａｕｆｍａｎｎｋよびＰ、　Ａ、　５ｈａｒｐ、”Ａ＋＋＋ ｐｌｊｆｉｃａｔｉｏｎ　Ａｎｄ已ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃ ｅｓ　Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａ　Ｍｏｃｌｕｌａｒ　Ｄｉｈ ｙｄｒｏｆｏ撃≠狽■ Ｒ＋Ｊｕｃｔａｓｅ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ　Ｇｅｎｅ、　”　 Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、１５９．６０１−６２１（１９８２）；Ｒ，Ｊ、に ａｕｆｍａｎｎおよびＰ、　Ａ、　５ｈａｒｐ、　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉ ｏｌ、１５９゜６０１−６４４　（１９８２）　；Ｓ、１．　５ｃａｈｉｌｌ　 ら、”Ｂｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＡｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ 　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｏｆ　Ａ　）Ｉｕｍａｎ　ｌｎ＋ｍｕｎｅ　Ｉｎｔ ｅｒｆｅｒｏｎ　cＮＡ　Ｇｅｎｅ　Ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　０ｖａｒｙ　Ｃｅ１ｌｓ、”Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．　４６５４−４６５９　（１９８３） 　；Ｇ、　ｔｌｒｌａｕｂおよびり、　Ａ、　Ｃｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、＾ｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７、４２１６−４２２０．　（１９８０）　参照）　。 有用な発現宿主としては十分公知である原核および真核細胞が挙げられる。 いくつかの適当な原核宿主としては、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　５Ｇ−９３６、■ 山　ＨＢ−１０１、Ｌ肛其Ｗ３１１０、Ｌ憇其　Ｘ１７７６、Ｌ製其Ｘ２２８２ 、Ｂ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ、およびＢ、ｃｏｌｉ　ＭＲＣＩ等の［！、ｃｏｌｉ、 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ等のＢａｃｉｌ ｌｕｓ、およびＳｔｒａｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。適当な真核細胞として は、酵母およびその他の菌類、昆虫やＣＯ８細胞やＣＨＯ細胞等の動物細胞、並 びに組織培養ヒト細胞および植物細胞が挙げられる。 本発明に有用な発現ベクターは、発現さるべきＤＮＡ配列またはフラグメントに 結合する少なくとも一つの発現制御配列を含有する。調節配合は、クローン化さ れたＤＮＡ配列の発現を制御・調節するためにベクターに挿入される。有用な発 現制御配列の例としては、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージ λの大部分のオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコート蛋白質の制御領 域、３−フォスフォグリセリン酸キナーゼのプロモーター等の酵母の解糖プロモ ーター、Ｐｂｏ２等の酵母の酸性フォスファターゼのプロモーター、酵母のα− 交接因子、およびＳＶ４０の初期または後期プロモーター等のポリオーマ、アデ ノウィルス、レトロウィルス、およびサルウィルス等由来のプロモーター、およ び原核または真核細胞およびそれらのウィルスまたはそれらを組み合わせたもの の遺伝子の発現を制御するとして知られているその他の配列が挙げられる。 組み換えポリペプチドは、当技術分野で公知の方法により精製される。適当な方 法が、Ｆ、＾、　Ｏ，Ｍａｒｓｔｏｎ、　”丁ｈｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 　ｏｆ　１３ｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄ■■ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、”ｉｎ　ＯＮ Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ、Ｅｄ、、Ｖｏ戟B ＩＩＩ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍ１ｔａｄ、　Ｂｎｇｌａｎｄ　（１９８ ７）に記載されている。 本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡも、当技術分野 で公知の方法により個々のアミノ酸残基およびヌクレオチドから各々化学的に合 成してもよい。ポリペプチド合成の適当な方法は５ｔｕａｒｔ′Ｊ６よびＹｏｕ ｎｇによる’５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐ巳ｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、 　”第２版、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４ ）に記載されている。ＤＮＡ合成の適当な方法はＣａｒｕｔｈｅｒｓ溶血素群毒 素の一つのアミノ酸配列とは異なるが実質的に相同するアミノ酸配列を有するセ グメントからなるポリペプチドは、予想外に、哺乳動物をＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉ ｔｉｄｉｓによる感染性疾病から保護するのに有用な抗原である。該哺乳動物と は、典型的にはヒトである。 有効に用いるためには、抗原は免疫される哺乳動物に対して非毒性である。抗原 が毒性である場合、当技術分野で公知の方法により非毒性にしてもよい。そのよ うな方法としては、例えば、抗原性があり非毒性の完全なポリペプチドのフラグ メントを調製すること、あるいは毒性を破壊する抗原性に影響を与えないキャリ ヤ分子に毒素を結合させる等により、ポリペプチドを非毒性にすることが挙げら れる。キャリヤ分子は、典型的にはそれ以外のポリペプチドである。 好ましくは、抗原のアミノ酸配列はＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに見出され るポリペプチドに存在するものである。ポリペプチド、または哺乳動物を免疫す るのに有用な非毒性で抗原性のあるフラグメントは、上述のようなＮ、　ｍｅｎ ｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの単離、組み換えＤＮＡ技術による製造、または化学合 成等の当技術分野で公知の方法により作られてもよい。 フラグメントの長さは、フラグメントが抗原性かつ非毒性であるかぎり、制限は ない。したがって、フラグメントはエピトープを決定するのに十分なアミノ酸残 基を含有していなければならない。公知の抗原性ポリペプチドから抗原性フラ（ １９８９）に記載されている。 フラグメントが、エピトープは決定するが短すぎて抗原性でない場合には、キャ リヤ分子に接合してもよい。いくつかの適当なキャリヤ分子としては、キーホー ル・リンベット（にｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンおよびウシ血清 アルブミンが挙げられる。接合は当技術分野で公知の方法によって行ってもよい 。そのような一つの方法はフラグメントのシスティン残基をキャリヤ分子上のシ スティン残基と結合させるものである。 本発明はさらに、Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対する哺乳動物（ヒト を含む）免疫用ワクチン組成物を包含するものである。ワクチン組成物は適当な キャリヤ中の上記のような免疫原性抗原を含む。適当なキャリヤとしては、水、 リン酸緩衝化塩溶液、およびエマルジョン等の標準的薬物として許容可能ないか なるキヤ、リヤも含まれる。 ワクチンには、アジュバント、例えばムラミルペプチド、およびインターフェロ ン、インターロイキン−１およびインターロイキン−６等のリンホカインが挙げ られる。抗原は、当技術分野で公知であるように、酸化アルミニウム粒子のよう な適当な粒子に吸着していてもよいし、あるいはリポソームに保持されていてな 場合、上記のワクチン組成物を哺乳動物に投与することにより、ヒトを含む宿主 哺乳動物を免疫する方法をも包含するものである。ワクチンは哺乳動物に対して 非毒性な形態の免疫厳正ポリペプチドを含む。ポリペプチドは一連の溶血素群毒 素のアミノ酸配列と相同性のあるアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列は、好ま しくはＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在し、通常はＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉ ｔｉｄｉｓの外層腹に見出される。しかし、抗体は本発明のポリペプチドおよび その他の細菌風由来の溶血素群毒素と交叉反応するので、ワクチン組成物中の抗 原はそれらの他の属のアミノ酸配列、例えばＢ、ｃｏｌｉまたはＢ、　ｐｅｒｔ ｕｓｓｉｓ等由来のものからなるものであってよい。 ワクチンは当技術分野で公知の方法により哺乳動物に投与される。そのような方 法には、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与が挙げられる。 抗体 本発明は、発明のポリペプチドに対して生じる抗体を提供するものである。ポリ ペプチドはエピトープを決定し、さらに溶血素群毒素の一つのアミノ酸配列と実 質的に相同するアミノ酸配列からなる。抗体は好ましくは、Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇ ｉｔｉｄｉｓに存在し、かつ他の細菌風の溶血素群毒素とは異なるアミノ酸配列 からなるポリペプチドに対して産生される。 抗体は好ましくはモノクローナルである。モノクローナル抗体は当技術分野で公 知の方法により製造されてもよい。これらの方法としては、Ｋｏｈｌｅｒおよび （１９８９）に記載された組み換えＤＮＡ法が挙げられる。 Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染による疾病に悩まされているヒトを含む哺 乳動物を、溶血素群毒素の一つに特異的な抗体を投与することにより治原するこ ともできる。いかなる属の細菌溶血素群毒素の一つに対して生じる抗体も適当で あるが、体が好ましい。 治療上の目的には、本発明の抗原性ポリペプチドが中和抗体を産生ずることが必 要である。中和抗体とは、細菌細胞の生育を著しく阻害あるいは死滅させる、お よび／またはポリペプチドの毒素機能をインビトロまたはインビボで著しく中和 する抗体である。阻害または中和が疾病に感染した哺乳動物の症状をなくす、あ るいは弱めるのに十分効果的な場合、細菌の生育が著しく阻害されるか、また哺 乳動物（ヒトを含む）免疫用ワクチンとして有用な抗イデイオタイプの抗体の調 製に用いてもよい。抗イデイオタイプの抗体は当技術分野で公知の方法により調 製される。 核酸分子 本発明は、本発明記載のいかるなポリペプチドをコードする単離された核酸分子 をも包含するものである。核酸分子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。 核酸分子の有用性は、以下で説明するように、Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 検出用プローブとして用いることができること、あるいは上記で説明したような 本発明のポリペプチドを製造できることにある。核酸分子は当技術分野で公知の 方法により調製ら単離すること、または公知の操作法によりＤＮＡを合成するこ とが挙げられる。 であるポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする遺伝子を認識 するプローブを用いることを包含する。もし試料中にＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ ｄｉｓが存在すれば、プローブがそれを認識する。 プローブは抗体であってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体は 上記のように調製してもよい。 ポリペプチドを抗体で検出する方法は公知である。例えば、ポリペプチドは面相 の支持体上で固定されていてもよい。ポリペプチドの固定化は、ポリペプチドに 特異的な固定化−次抗体を介して行ってもよい。固定化−次抗体はポリペプチド を含有していると思われる試料と共にインキュベートされる。もしポリペプチド が存在すれば、−次抗体と結合する。 二次抗体もまたポリペプチドに特異的であるが、これは固定化ポリペプチドに結 合する。二次抗体は当技術分野で公知である方法により標識されてもよい。非固 定化物質は洗い出され、固定された標識が存在すればポリペプチドが存在するこ とになる。このイムノアッセイ法およびその他のイムノアッセイ法がＤａｖｉｄ ら゛　により米国特許第４．３７６、１１０号（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ 、、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ］１ｆｏｒｎｉａに譲渡された）に記載されて いる。 プローブはまた、Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在する溶血素群毒素の一 つをコードするＲＮＡまたはＤＮＡ分子を認識する核酸分子であってもよい。核 酸分子プローブが試料中の特異的な核酸分子を認識するか否かを決定する方法は 当技術分野で公知である。一般的に、試料中に存在すると思われる核酸配列に相 補性な標識化プローブを調製する。目標とする核酸分子とハイブリダイズしたプ ローブの存在により、核酸分子の存在が示される。適当な方法が５ｃｈｎｅｉｃ ｌｅｒらによる米国特許第４．８８２．２６９号（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　ｌ１ｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙに譲渡された。）およびＳｅｇｅｖによるＰＣＴ出願出願　９ ０１０１０６９号に記載されている。５ｃｈｎｅｉｄｅｒらの特許およびＳｅｇ ｅｖの出願は共にＩｍＣＩｏｎｅ　Ｓｙｓｔａｍｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ　Ｃ１ｔｙの認可を受けている。 上記のプローブは当技術分野で公知の方法により標識される。抗体を標識する方 法は、例えば、）ｌｕｎｔｅｒおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄによるＮａｔｕｒｅ上 ４４，９４５（１９６２）、＃よびＤａｖｉｄらによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　上３．１０１４−１０２１（１９７４）に記載されている。抗体を標識する それ以外の方法が米国特許第３、９４０．４７５号および同第３．６４５．０９ ０号に記載されている。オリゴヌクレオチドプローブを標識する方法は、例えば 、ＬｅａｒｙらによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９ ８３）８０°４０４５　；　ＲｅｎｚおよびＫｕｒｚによるＮｕｃｌ、　Ａｃ１ ｄｑＨＲｅｓ。 （１９８４）１２：３４３５；ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＧｕ＋＋＋ｐｏｒｔ によるＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。 （１９８３）１１：６１６７：Ｓｍ１ｔｈらによるＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、（１９８５）　：１３：２３９９；およびＭｅｉｎｋｏｔｈおよＵＷａｈ ｌによる＾ｎａｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８４）１３８：２６７に記載され ている。 標識は放射性であってもよい。有用な放射性ａａのいくつかの例としては、３２ ｐ、　＋２５　■、１５１Ｌおよび３Ｈが挙げられる。放射性標識を用いること が英国特許第２．０３４．３２３号、米国特許第４．３５８．５３５号および同 第４．３０２．２０４号に記載されている。 非放射性、ｌｌｉ＆のいくつかの例としては、酵素、発色団、電子顕微鏡観察法 により検出可能な原子および分子、および磁気特性により検出可能な金属イオン が挙げられる。 いくつかの有用な酵素標識には、基質に検出可能な変化を与える酵素が挙げられ る。いくつかの有用な酵素およびそれらの基質としては、例えば、西洋ワサビの ペルオキシダーゼ（ピロガロールおよびＯ−フェニレンジアミン）、β−ガラク トシダーゼ（フルオレセインβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）、およびアルカリ性 フォスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート／ ニトロブルーテトラゾリン）が挙げられる。酵素標識を用いることは、英国特許 第２．０１９．４０４号、欧州特許第６３．８７９号、およびＲｏｔｍａｎによ るＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、、４７．１９８１−１９９１　（１９６１）が挙げられる。　−有用な 発色団としては、例えば、染料以外に、蛍光性、化学発光性、および生物発光性 の分子が挙げられる。本発明で有用ないくつかの発色団としては、例えばフルオ レセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、ウンベリフェロン 、ルミノールが挙げられる。 ｓｍは、当技術分野で十分公知ないかなる方法により抗体またはヌクレオチドプ ローブに接合されていてもよい。標識は官能基を介してプローブに直接結合させ てもよい。プローブはそのような官能基を含有しているか、または含有するよう にできる。適当な官能基のいくつかの例としては、例えば、アミノ、カルボキシ ル、スルフヒドリル、マレイミド、インシアナート、イソチオシアナートが挙げ られる。 標識もまた、上記の方法によりプローブに結合したリガンド、およびリガンドが 標識に結合するためのりセブターによってプローブと接合されていてもよい。 いかなる公知のりガンドーリセブター結合も適当である。ヒ゛オチンーアヒ゛ジ ン結合が好ましい。 本発明のポリペプチドは、試料中のＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに特異的な 抗体の存在の検出に用いられてもよい。その方法は、溶血素群毒素の一つと実質 的１ご相同するアミノ酸配列を有するセグメントを含有するポリペプチドの調製 からなる。ポ１ノペブテドは上記のようにして調製してもよい。好ましく１よ、 ポリペプチド′１′！Ｋｅｎｎｅｔｈにより記載されている（Ｋｅｎｎｅｔｈら 、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ 、　Ｎ、　Ｙ、、３７６頁（１９８１）の“Ｂｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ａｎ ｔｉｂｏｄｙ　Ａｓ５ａｙ　ｗｉｔｈＣｅｌｌｓ　Ａｔｔａｃｈｅｄ　ｔｏ　Ｐ ｏ１ｙｖｉｎｙｌ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　Ｐｌａｔｅｓ”）　ｊ！！準的ＥＬ　Ｉ 　ＳＡプロトコ−ベートした後、プレートは例えば１０％標準ヤギ血清等の適当 なブロッキング剤でブロフクされる。患者の血清等の試料を添加し、終点決定の ための力価測定を行う。陽性および陰性の対照試料を同時に加えて、未知ｆＪ試 料１こ存在する抗体量を定量する。インキユベートに続いて、適当な酵素１こ接 合したヤギ抗ヒトＩｇで試料をプローブ化する。試料中の抗ポリペプチド′抗体 の存在１よ酵素の存在により示される。 本発明のポリペプチドに対して生じる抗体はＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを 認識し、試料中の髄膜炎菌細胞を淋菌細胞と識別することができる。例えＩｆ、 Ａ４．８４モノクローナル抗体は鉄抑制髄膜炎菌細胞により発現されるポリペプ チドを認識することができる。しかし、Ａ４．８４は鉄抑制Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒ ｈｏｅａｅ中の蛋白質を認識しなシへ〇抗体は上記のような公知の方法により標 識化してもよし）。鉄抑制髄膜炎菌細胞を鉄抑制淋菌細胞と識別するためのアッ セイは、標準プロットやＥＬＩＳＡフォーマット等の公知のフォーマットに従っ て行う。 実施例 実施例１．Ａ４．８５ＭＡｂの単離 細菌の外層膜を以下のようにしてＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ ｓ　Ｆ　ＡＭ　２０株の鉄抑制培養から調製する。ＦＡＭ２０をケレックス・デ ファインド（ｃｈｅｌｅｘｅｄ　ｄｅｆｉｎｅｄ）培地（ＣＤＭ、　Ｗｅｓｔら 、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　上６９．３４１４（１９８７））に接種 する。この培地は、細菌内に貯蔵されている鉄がなくなるまでしか生育できない ようになっている。この間に、飲料用性によって調節される一組の蛋白質が発現 するようになる。細菌を採取し、外層膜をＤｙｅｒらによるＩｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｃｌ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　５６．　９７７　（１９８８）に記載されている ようにして調製する。 ３〜５匹のメスのＢＡＬＢ／ｃのマウスを、筋肉内（ｉｍ）または腹腔内（ｌρ ）経路のいづれかにより鉄抑制ＦＡＭ２０外層膜で免疫する。ｉｍ経路を用いる 場合、０日間に１１００ｕの抗原（八ｇ）を完全フロイントアジ二バントに乳化 して二つの異なる部位に注射し、続いてここで不完全フロインドアジユバントに 乳化したＡｇで２週間後にブースター注射を行う。Ｉｐ経路では、０．７．１４ および２８８日間１１００ｕのＡｇで免疫する。血清抗体レベルをめるために、 血清抗体レベルは、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングのいずれかによ り最後のブースターを注射した後３日チェックされる。マウスは融合する前にそ れぞれ連続した３日間に最後のブースター１２を注射する。融合する日にマウス を頚部脱臼により層殺し、膵臓を無菌的に取出す。膵細胞は２本の曲がった１９ ゲージ針を用いて嚢から細胞を細片化して抽出する。抽出された細胞は再懸濁し て単一細胞の懸濁液にする。 マウスのミエローマ細胞であるＳＦ３．０−ＡＧ１４　（Ａ、ＴＣＣＣＲＬ１５ ８１）　を、　Ｄｕｌｂａｃｃｏ’　ｓ　Ｍｏｄ　ｉｆ　ｉｅｄ　Ｂａｇｌｅ’ 　ｓ　Ｍｅｄｉｕｍｕ／Ｈａｍ’　ｓ　Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に１５％ ウシ胎児血清（ＦＣ３）を添加した培地で生育させ、これを融合相手として用い る。膵細胞：ミエローマ細胞を１０：１の比率で混合し、５〇−容遠心管内で共 にペレットにする。上清を吸い取り、残った乾燥ペレットに１ｆｆＬ１！の５０ ％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　（３７℃に余熱したもの）を加える。細 胞をそっと再懸濁し、室温で２分間放置した後、血清を添加しないＤＭＥＭ／Ｆ ｌ　２を１−加え、さらに細胞をそっと再懸濁する。そして、細胞をさらに希釈 し、２分間隔で２．４．８、および１６ｄのＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えて再懸濁す る。そして細胞をベレットにして、上清を吸い取る。１５％のＰＣ３を追添した ２ｄのＤＭＥＭ／Ｆ１２を注意深Ｘ加えてベレットが再懸濁しないようにし、そ の後３７℃で１時間インキュベートする。 １時間のインキュベートが終了したら、懸濁液を希釈して最終濃度をＩ×１０６ 細胞／ｄにする。この懸濁液を組織培養フラスコに注ぎ、−夜インキユベートす る。翌日、２ＸＨＡＴ　（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）成分を 追添した同量の培養培地を、９６ウエルのプレートに、１ｘｌＯＪｊｌ細胞／ウ エルで２００　ｕｌｌ／ウェルとなるように入れる。その細胞は、融合後４〜５ 日毎に培地の半分をウェルから吸い取り、新規のＩＸＨＡＴ培地を添加すること により栄養補給される。ウェルは１０〜１４日後に生育が記録され、生育してい るウェルは、培養上清をＥＩｊＳＡまたはウェスタンブロッティングのいずれか でスクリーニングすることにより、分泌された抗体の存在がテストされる。アッ セイに陽性であると判明したウェルは、生育させるため、ＨＴ添加物（アミノプ テリンは含有せず）を含む培養培地中の２４ウ工ル培養皿に広げられ、再テスト される。再テストで陽性と判明したものは、さらに大きい組織培養槽に広げられ 、それから制限希釈培養法により２度クローン化される。 単一のマウスの胛細胞から発生した細胞系（Ａ４．８５）がＳ離された。Ａ４． ８５は、合成が細菌生育培地中の鉄の存在によりその各合成が抑制されるいくつ かの蛋白質遣（質量が７０キロダルトン〜数百キロダルトン）とＦＡＭ２０外層 膜のウェスタン・プロット上で反応するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生ず る。 実施例２Ａ、染色体のクローンのｊｌｌＬ離Ａ、ライブラリーの作成 Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ｆ　ＡＭ　２０株の染色体Ｄ ＮＡのライブラリーは、バクテリオファージベクターλ−ｇｔｌｌにおいて、以 下のようにして作成される。 ＦＡＭ２０株染色体ＤＮＡは標準法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）により単 離される。 ＤＮＡは超音波処理によりおよそ３００〜１０００ｂｐのフラグメント長に切断 ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで切り出され、各分子の末端にＥｃｏＲＩ制 ｇ　ｔ　１　１　ＤＮＡ　（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ　：　＾　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、bｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｏｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８Q）　） と連結される。連結したＤＮＡは、λパッケージング抽出物（Ｐｒｏｒｎｅｇａ 　Ｃｏｒｐ、。 Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて、業者の指示に従ってλフア ージ頭部にパッケージされる。 Ｂ、ライブラリースクリーニングおよびＤＮＡのＪｌ離Ａｔ８５ＭＡｂでｇ識さ れるエピトープを発現するクローンを検出するために、上記で作成されたライブ ラリーをＡ４．８５ＭＡｂでスクリーンする。λ−ｇｔ１１発現ライブラリーか らの５００．０００の組み換えプラークが、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）の 方法によりスクリーンされる。Ａ４．８５ＭＡｂと反応する精製クローンは、反 応性プラークを再ブレーティングおよびスクリーニングを２度行うことによりｓ ｎされる。Ｍ製λクローン（Ａ４．８５）からの髄膜炎菌挿入ＤＮＡは、ポリメ ラーゼチェーンリアクンヨン（ＰＣＲ）技術によりＰｅｒｋｉｎ−Ｂ１ｍｅｒ／ −Ｃｅｔｕｓのキットを用いて増幅される。ＰＣＲ増幅ＤＮＡは、配列している ベクター５４６７　（１９８７））によりシークエナーゼキット（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ。 ＣＡ）を用いて決定されるＤＮＡ配列にクローン化される。 クローン化された髄膜炎菌ＤＮＡは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ （Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ　ｉｓ。 ＩＮ）キットを用いてランダムプライムド（ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉＩ［１ｅｄ） 法により３２Ｐで標識され、λ４．８５にクローン化されたＤＮＡに隣接するＦ ＡＭ２０染色体のＤＮＡ制限フラグメントを同定するためにサザンハイプリダイ ゼーション　（Ｍａｎｉａｔｉｓら。 １９８２）に用いられる。およそ５６０および１６００ｂｐの染色体の５ａｕ３ Ａ　Ｉフラグメントは、クローン化髄膜炎菌ＤＮＡにハイブリッドする。 ＦＡＭ２０　ＤＮＡは５ａｕ３Ａ　Ｉで切断され、準備されたアガロースゲル上 で断片化される。二つのサイズのフラグメント、すなわち４００〜７００ｂｐの ものと１４００〜１８００ｂｐのものが単離される。 ５６０ｂｐの５ａｕ３Ａ　Ｉフラグメントは、ＦＡＭ２０−３ａｕ３Δ　■フラ グメントの４００〜７００ｂｐのフラクションをＢａｍＨＩ−切断プラスミドｐ ＢＲ３２２と連結することによりクローン化される（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９ ８２）。 所望する５６０ｂｐのフラグメントのクローンは、ｓ２Ｐｐｍ化λ４．８５挿入 ＤＮＡを有する組み換えプラスミドを含有するａＷｉコロニーのハイブリダイゼ ーションにより同定される（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。ＤＮＡプローブ とハイブリッドした純粋なコロニーのプラスミドＤＮＡ　（ｐＵＮＣＨ２０１） を調製し、二本鎖配列化に用いるためにｉｓされたシークナーゼを用いてその配 列を決定する（Ｉｆ：ｒａｆｔら、　８ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６．　５４ ４　（１９８８）　）ａクローン化フラグメントがＦＡＭ２０ゲノムにそのまま の状態で存在するフラグメントの典型であることを！ｉｌｉ認するために、サザ ンハイブリダイゼーションが用いられる。 １６００ｂｐのフラグメントをクローン化するために、ＦＡＭ２０−５ａｕ３Ａ 　Ｉフラグメントの１４００〜１８００ｂｐのフラクションの末端をフレノウ（ Ｋｌｅｎｏｗ）酵素およびＤＮＡヌクレオチドとの反応により平滑にする。合成 ターゼ処理λＺＡＰ　ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　 ＣＡ）と連結させる。 連結したＤＮＡは、バッカジーン（Ｐａｃｋａｇｅｎｅ）　λパッケージング抽 出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてλ頭部にパッケージされる。１４００〜１８０ ０ｂｐのＦＡＭ２０−３ａｕ３Ａ　ｒフラグメントのライブラリーは”Ｐｐｍ化 オリゴヌクレオチド（ＳＡＴＩ）でスクリーンされ、λ４．８５挿入部の一端で ＤＮＡ配列と一８ｔ　るよう合成サレる（５’　ＧＣＣＡＴＴＧＣＣＡ［’ＴＧ ＴＡＧＡＴＡ　３’　）　、　Ｓ　Ａ　Ｔ　１　オリゴヌクレオチドとハイブリ ッドしているλＺＡＰプラークは上記のようにして精製される。λＺＡＰクロー ン（λＺＡＰ　２０２）の内側部はヘルパーバクテリオファージの添加により“ 切り出される“。その切り出しにより、クローン化１ｉａｒ炎菌挿入部を含有す る多複写プラスミド（ｐＵＮＣＨ２０２）が得られる。クローン化フラグメント がＦＡＭ２０ゲノムにそのままの状態で存在するフラグメントの典型であること を確認するには、サザンハイブリダイゼーションを用いる。クローン化ＤＮＡフ ラグメントの配列は、上記のような二本鎖に配列することにより決定される。 ｐＵＮｃＨ２０１、ｐＵＮｃＨ２０２、及びλ４．８５挿入邪の隣接配列により 、クローン化ＤＮＡ全体を含有するオープンリーディングフレームの存在が判明 する。遺伝子の開始点も末端もクローン化ＤＮＡには存在しない。第１図にその ＤＮＡ配列を示す。オーブンリーディングフレームにより予示されるアミノ酸配 列は８３５個のアミノ酸（９１ｋ　Ｄ）を含有する。その配列を第２図に示す。 ＦＡＳＴＡ配列比較検索（上記参照）により決定されたように、ＤＮＡも、この 領域から予測されるポリペプチド配列も、細菌毒素の溶血素群と高度に類似する 。例えば、第り図に示したＤＮＡ配列は８．　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＣｙａ遺伝 子（アデニル酸シクラーゼ）と５４％；Ｂ、ｃｏｌｉのｈ　Ｉ　ｙＡ、ｈ　Ｉｙ ＢＳｈ　ｌｙｃ、およびｈｌｙＤＪ伝子（溶血素）と６０％；　Ｅ、　ｃｏｌｉ のｈ　ｌｙＡ、ｈ　］　ｙＢおよびｈ＋ｙｃ遺伝子（溶血素）と６５％；　Ａ、 　ａｃｔｉｎｏｍｙｃａｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓのロイコトキノン遺伝子と５６ ％：　Ａ、ｐｌａｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの溶血素遺伝子と５６％；　Ｐ、 　ｈａｅｍｏｌｙｔ　ｉｃａす。 このＤＮＡ配列から予示されるアミノ酸配列は、ロイコトキシン七２−５％〜２ ８％：溶血素と２２％〜２８％；およびアデニル酸シクラーゼと３０％の同一性 を示す。 髄膜炎１１ＦＡＭ２０株には、本発明ポリペプチドをコードするＤＮＡのコピー が少なくとも二つ含まれる。このことは、染色体ＤＮＡを、切断頻度の低いＢｇ 　Ｉ　Ｉ　Ｌ　Ｓｐａ　Ｌ　Ｎｈｅ　Ｉ、およびＮｈｅＩとＳｐｅ　Ｉを組み合 わせたもので消化することにより証明することができる。パルスフィールド勾配 電気泳動により分離される消化されたＤＮＡのサザンブロッツは、厳しい条件下 、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子配列のフラグメントを含有する遺伝 子プローブとハイブリッドする二つの主要なバンドを示す。 本発明の鉄調節ポリペプチドをコードする遺伝子の残部は、ｐＵＮＣＨ２０１お よびｐＵＮＣＨ２０２を単離するための上記の方法と類似した方法で単離される 。すでにクローン化された領域の端に隣接する、あるいはその完全な領域を含有 するＤＮＡ制限フラグメントは、予め決定されたＤＮＡ配列由来のオリコ゛ヌク レオチドのプローブを用いたサザンハイプリダイゼーションにより同定される。 これらの７ラグメントは、ｐＵＮＣＨ２０１およびｐＵＮＣＨ２０２のクローン 化で上記したようにしてプラスミドあるいはバクテリオファージ−ベクターのい ずれかにクローン化される。新たにクローン化されたフラグメントのＤＮＡ配列 は上記のようにして決定され、遺伝子のいずれかの末端に到達した時判明する。 遺伝子が単一のＤＮＡフラグメントで単離される場合、この遺伝子によりコード される蛋白質がＡ４８．５ＭＡｂと反応することを確認するためのインヒ゛トロ のアッセイで発現する。その遺伝子が単一のＤＮＡフラグメントで完全にクロー ン化されない場合は、完全な遺伝子を得るために標準的な分子生物学的技術によ り再構築される（Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　ａ土、９０８４（１９８７））。 例えば、本発明のポリペプチドをコードしている構造遺伝子の二つのコピーのう ちの一つからのＤＮＡフラグメントがアガロースゲルで精製され、クローン化お よび配列された。第３図はそのＤＮＡ配列を示すものであり、遺伝子５′末端で 完結する。第３図において下線を引いた部分は−３５および一１０領域を有する 典型的なプロモーター、リボゾーム結合部位、ＡＴＧ開始部位、および−共通す るファーボックス（ｆｏｒ　ｂｏｘ）であり、グラム陰性鉄調節プロモーターに おＬ）で典型的に見られるものである。 実ｍ例２Ｂ、ウェスタンプロットおよび分子量髄膜炎菌ＦＡＭ２０株から得られ る完全なポリペプチドは、ウェスタンプロット分析により２３０〜２５０ｋＤの 分子量を示す。ウェスタンプロ帰は以下のようにして行ってもよい。すなわち： 鉄飢餓処理したＦＡＭ２０の全細胞を、ＷｅｓｔおよびＳｐａｒｌｉｎｇによる Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９．　３４１４−３４２１　（１９Ｂ？）の方法１こ 従って調製する。 細胞を水冷ディビス（Ｄａｖｉｓ）最小培地Ａ（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍａｄ、　Ｒａｓ、、３：５（１９５０））中で洗浄し、すぐ に水中で冷却し、０℃、２０．０ＯＯｐｓｉでフレンチ・プレッシャー・セル（ Ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｃｅｌｌ）内で破裂させる。得られた混合物 を１０分間、２０．０ＯＯＧで遠心分離し、沸騰させたＳＤＳに溶解したベレッ トを得る。溶解した膜蛋白質は、ラエム！Ｊ　（Ｌａｅ田１ｉ）緩衝液中で標準 的な７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されるが、そのことはＬａｅｍｌによ るＮａｔｕｒｅ　２２７゜６８０−６８５　（１９７０）に記載されていた。蛋 白質は移動して（１６時間。 ８０ｕＡ）オプティバインド（Ｏｐｔｉｂｉｎｄ）　二）　０セルロース膜Ｃ５ ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌ　］のものが利用できる）上に移る。その 膜を、５％ＢＳＡのＴＢＳ（２０ｒｎＭ　）リス、５００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ ７，５）で１時間ブロックし、ＴＢＳで５分間すすぎ；５％ＢＳＡ中でモノクロ ーナル抗体Ａ４８．５（上記参照）を１＝２に希釈して１時間インキニベー）Ｌ ；ＴＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分間、２度洗浄し；５％ＢＳＡで 希釈された二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリ性フォスファターゼ接合）中 で１時間インキュベートしくＢｉｏＲａｃ１社！！（希釈率＝　１　：　３００ ０）またはＳｉｇｍａ社製（希釈率＝　１　：　１０００）が使用可能である） 　；　Ｔ　Ｂ　Ｓ　／Ｔｗｅｅｎで５分間、３度洗浄し；再度ＴＢＳで５分間洗 浄し：１０ｍ１’の炭酸緩衝液（ｐＨ９，８）（０，ＬＭ　ＮａＨＣ口ｓ　：　 １１１１Ｍ　ＭｇＣｊ’　ａ）中に４５ｕｉ＝トロブルーテトラゾリン（Ｓｉｙ ｐａ社製（７５ｍｇ／ｍｆ）が使用できる＞、３５ｕｊ！　５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドリルフォスフエイト、ｐ−）ルニジン塩（５０ωｇ／ｍｌ’） を含有するアルカリフォスファターゼ基質で展開する。 実施例３．試料中の抗体のアッセイ 蛋白質内のポリペプチドに対する抗体の存在をスクリーンするために、標準ＥＬ ＩＳＡプロトコールが用いられる。要約すれば、９６ウエルのマイクロタイター プレートを、高ｐＨ（９，６）炭酸緩衝液で、抗原を５０〜１１０００ｎ／ウエ ルの濃度に換えて被覆する。プレートを９℃で一昼夜インキコベートし、１０％ 標準ヤギ血清で３７℃で１時間ブロックする。患者の血清を添加し、終点を決定 するために力価を測定する。対照試料の陽性および陰性血清を同時に添加し、未 知の試料中に存在する目的の抗体量を定量する。３７℃で２〜３時間インキュベ ートした後、試料を西洋ワサビのパーオキシダーゼに接合するヤギー抗ヒト■ｇ でプローブ化する。ＴＭＢを用いて陽性の試料を特徴する請求の範囲の発明は、 本明細書および容易に利用可能の引用文献や出発物質により実施可能である。さ らに、本発明の実施および使用を簡便にするために、以下の細胞系を１９９０年 ７月１２日に＾ｍａｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎ。 Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託している。 髄膜炎菌細胞系ＦΔＭ１８（承認番号５５０７１）髄膜炎菌細胞系ＦＡＭ２０（ 承認番号５５０７２）ハイブリドーマ細胞系Ａ４．８５（承認番号ＨＢ１０５０ ４）さらに、以下の有用なプロトコールおよび情報を含むパンフレア）が本明細 書のファイルヒストリーにおいて利用できる。 ”Ｐｒａｄｉｇｅｓｔａｄ　Ｌａｍｂｄａ　Ｚａｐ／Ｅｃｏ　ＲＩ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　にｉｔ　Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ、”Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０ ．　１９８７）；“Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌｕｓ”　（ｆｏｒ　ｐａｃｋａｇｉ ｎｇ　ｒａｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｌａｍｂｄａ　ｐｈａｇｅ）、Ｓｔｒａｔａ■ ≠獅■B Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ（Ａｐｒｉｌ　２５．１９８８）； および’ｐｉｃｏＢｌｕｅ　ＩＬＩｌｍｕｎｏｓｃｒａｅｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　Ｉ ｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ、　’Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＝AＬａ Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　（Ｍａｙ　１９．１９８９）。 第１図　：　ＤＮＡ部分配列 ３１１１　Ｇ６Ｃτ＾τＧＣ＾ＧＣ丁丁丁ＧＧ（ＣＧλ　入丁丁Ｇ６人丁丁Ｃλ 　入＾Ｃ（ＡＣＧ入Ｃ入　入Ｃ入丁Ｃ入丁Ｃλ＾暮０１　丁τｃｃへ入ＣＴＧＧ 　ＧＧＣλξノー〜（入Ｔ　ＣＧＣＣλ入丁ｃｃｃ　＾（ＴフτＣ入＾ＣＣＧλ 丁丁ＧＧ＾ｃｅｃ番５１　入＾ＡＣＧＧζ丁入＾　丁Ｇ入＾ＧＧＴ＾ττ　Ｇ（ 入Ｃ丁ＧλＣＡｃｃ人Ｔｃｃｃ入＾ＧＴ　λＧＣ＾Ｃ入−Ｃ了Ａう０１　へ＾入 入ＡＧ入入ＣＧ　Ｃ了丁丁入Ｇ丁τ丁ＣＣＣ丁１丁ＣＴＣ＾丁　入＾＾ＧＣフ入 λ＾Ｇ　ＣＡＧＣ：了＾丁７Ｃ＾ｔ！１１　ＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＧＣ ＡＴ丁Ｇ　ＣＣＧ？Ｇζ丁丁Ｇ＾　１ｃｃｃ丁λＣ入ＣＧ　ＧＧＧＣＡＧＧＡＴ Ｔ＋００１　ＣＣ入Ｇζ＾Ｃ＾ＣＴＣ丁＾了丁λＣλＴＧ　入ｃｃｃ入＾Ｇ入入 Ｇ　入ｃｃｃｃｃ丁τ入＾　丁入ｉｃｃ丁Ｃλ入へ１０５１　Ｇ）ＭＣＣＡＡＣ Ｇ　Ａ？ＡＣ入Ｔ）、ＣＧ＾　ｃｃ入τＣ了ｃｃｃｃ　九人＾＾＾Ｃ入丁Ｃ丁　 入ｃｃ入＾＾λｃｃ丁Ｌ１ｏＩ　Ｇ丁フＧＴＴＣＣ入＾＾ＣＣＣＧ丁ＴフＣ

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも５０アミノ酸残基を有するセグメントを含み、該セグメントのア ミノ酸配列がＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｇに存在し、かつ該アミノ酸配列が溶 血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異なるが、実質的には相同ず る、単離された抗原性ポリペプチド、または該ポリベプチドの抗原性フラグメン ト。 ２．セグメントが少なくとも１００アミノ酸残基を有する、請求の範囲第１項記 載のポリペプチド。 ３．セグメントが少なくとも２００アミノ酸残基を有する、請求の範囲第１項記 載のポリペプチド。 ４．実質的に純粋な形態である、請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ５．抗原性アミノ酸配列が免疫性である、請求の範囲第１項記載のポリペプチド 。 ６．ポリペプチドのアミノ酸配列が第２図に示される配列を含む、請求の範囲第 １項記載のポリペプチド。 ７．ポリペプチドに対する抗体が、その他の細菌属由来である溶血素群毒素の少 なくとも一つと交叉反応する、請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ８．その他の細菌の属がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐａｓｔ ｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＢｏ ｒｄｅｔｅｌｌａを含む、請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ９．その他の溶血素群毒素がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のα−溶血素 ；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ 由来のロイコトキシン；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ由来の ロイコトキシン；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のアデニル酸シ クラーゼ；およびＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｅｓ由来のアデニル酸シクラ ーゼを含む、請求の範囲第７項記載のポリペプチド。 １０．その他の溶血素群毒素がＥ．ｃｏｌｉ由来のα−溶血素である、請求の範 囲第７項記載のポリベプチド。 １１．（ａ）少なくとも５０アミノ酸残基を有するセグメントを含み、該セグメ ントの該アミノ酸配列が溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異 なるが、実質的には相同する、単離された抗原性ポリペプチド、またはそのよう なポリペプチドの抗原性フラグメントを調製すること；および（ｂ）該ポリペプ チドまたは核フラグメントを哺乳動物に対して非毒性にすること の工程を含むＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの感染から哺乳動物を保護するのに 有用な抗原の製造方法。 １２．アミノ酸配列がＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに見出されるポリペプチド に存在する、請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３．哺乳動物がヒトである、請求の範囲第１１項に記載の方法。 １４．（ａ）少なくとも５０アミノ酸残基を有するセグメントを含み、該セグメ ントの該アミノ酸配列が溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異 なるが、実質的には相同する、単離された抗原性ポリペプチド、またはそのよう なポリペプチドの抗原性フラグメントを調製すること；（ｂ）該ポリペプチドを 哺乳動物に対して非毒性にすること；および（ｃ）該非毒性ポリペプチドを薬物 上許容可能なキャリヤと結合させることの工程を含む、哺乳動物をＮ．ｍｅｎｉ ｎｇｉｔｉｄｉｓの感染から保護するのに有用なワクチン組成物の製造方法。 １５．ポリヘブチドがＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離されたものである 、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６．該哺乳動物がヒトである、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １７．（ａ）哺乳動物に非毒性であり、少なくとも５０アミノ酸残基を有するセ グメントを含み、該アミノ酸配列が溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸 配列とは異なるが、実質的には相同する免疫原性ポリペプチド、またはそのよう なポリペプチドの抗原性フラグメント、 （ｈ）薬物的に許容可能なキャリヤ を含有する、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して哺乳動物を免疫するこ とが可能なワクチン組成物。 １８．ポリペプチドがＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在する、請求の範囲第 １７項に記載のワクチン組成物。 １９．ポリペプチドがＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外層膜に存在する、請求 の範囲第１７項に記載のワクチン組成物。 ２０．哺乳動物がヒトである、請求の範囲第１７項に記載の方法。 ２１．哺乳動物をＮ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ感染から保護する必要がある場合 に、ポリペプチドが少なくとも５０アミノ酸残基を有するセグメントを含み、該 セグメントのアミノ酸配列が実質的に溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ 酸配列と相同する、哺乳動物の非毒性な形態の免疫原性ポリペプチド、またはそ のようなポリペプチドの抗原性フラグメントを含有するワクチン組成物を哺乳動 物に投与することを含む、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して哺乳動物 を免疫する方法。 ２２．アミノ酸配列がＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在する、請求の範囲第 ２１項に記載の方法。 ２３．アミノ酸配列がＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外層膜に存在する、請求 の範囲第２１項に記載の方法。 ２４．哺乳動物がヒトである、請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２５．少なくとも５０アミノ酸残基を有するセグメントを含み、該セグメントの アミノ酸配列がＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在し、該セグメントのアミノ 酸配列が溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異なるが、実質的 に相同するポリペプチド、またはそのようなポリベプチドの抗原性フラグメント に対して産生されるモノクローナル抗体。 ２６．少なくとも５０アミノ酸残基を有するセグメントを含み、該セグメントの 該アミノ酸配列がＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在し、該アミノ酸配列が溶 血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配列とは異なるが、実質的に相同する ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの抗原性フラグメントをコードす る、単離さた核酸分子。 ２７．（ａ）少なくとも５０アミノ酸残基を有するセグメントを含み、該セグメ ントの該アミノ酸配列が実質的に溶血素群毒素の一つのセグメントのアミノ酸配 列と相同する、単離された抗原性ポリペプチド、またはそのようなポリペプチド の抗原性フラグメントを調製すること；および（ｂ）該ポリペプチドが試料中の 抗体を認識するかどうかを決定することの工程を含む、試料中のＮ．ｍｅｎｉｎ ｇｔｉｄｉｓに特異的な抗体の存在を検出する方法。 ２８．ポリペプチドがＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在するアミノ酸配列か らなる、請求の範囲第２７項に記載の方法。 ２９Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在するアミノ酸配列を有し、該アミノ酸 配列が９アミノ酸の溶血素共通配列の少なくとも３つの繰り返しを含み、該溶血 素共通配列が位置１にあるＬ； 位置３にあるＧ； 位置４にあるＧ； 位置６にあるＧ； 位置７にあるＮ； 位置８にあるＤ；および 位置２、５および９にあるｘ （ｘはいずれかの単一のアミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含むセ グメントを含有する単離されたポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの 抗原性フラグメント。 ３０．セグメントが少なくとも１００アミノ酸残基を有する、請求の範囲第２９ 項記載のポリペプチド。 ３１．セグメントが少なくとも２００アミノ酸残基を有する、請求の範囲第２９ 項記載のポリベブチド。 ３２．実質的に純粋な形態である、請求の範囲第２９項記載のポリペプチド。 ３３．抗原性アミノ酸配列が免疫原性である、請求の範囲第２９項記載のポリベ ブチド。 ３４．その他の溶血素群毒素の少なくとも一つと交叉反応するポリペプチドに対 する抗体がその他の細菌属由来である、請求の範囲第２９項記載のポリペプチド 。 ３５．その他の細菌属がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐａｓｔ ｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｏｒ ｄｅｔｅｌｌａである、請求の範囲第２９項記載のポリペプチド。 ３６．その他の溶血素群毒素がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のα−溶血 素；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｔｍｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ 由来のロイコトキシン；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ由来の ロイコトキノン；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のアデニル酸シ クラーゼ；およびＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｅｓ由来のアデニル酸シクラ ーゼを含む、請求の範囲第３４項記載のポリペプチド。 ３７．その他の溶血素群毒素がＥ．ｃｏｌｉ由来のα−溶血素を含む、請求の範 囲第３４項記載のポリベプチド。 ３８．（ａ）９個のアミノ酸の溶血素共通配列の少なくとも３つの繰り返しを含 み、該溶血素共通配列が 位置１にあるＬ； 位置３にあるＧ； 位置４にあるＧ； 位置６にあるＧ； 位置７にあるＮ； 位置８にあるＤ；および 位置２、５および９にあるｘ （ｘはいずれかの単一アミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含むアミ ノ酸配列を有するセグメントを含む、単離されたポリペプチド；またはそのよう なポリペプチドの抗原性フラグメントを調製すること；および （ｂ）該ポリベブチドまたはフラグメントを哺乳動物に対して非毒性にすること の工程を含む、哺乳動物をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染から保護するのに 有用な抗原の製造方法。 ３９．アミノ酸配列がＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに見出されるポリヘブチト に存在する、請求の範囲第３８項に記載の方法。 ４０．（ａ）９個のアミノ酸の溶血素共通配列の少なくとも３つの繰り返しを含 み、該溶血素共通配列が 位置１にあるＬ； 位置３にあるＧ； 位置４にあるＧ； 位置６にあるＧ； 位置７にあるＮ； 位置８にあるＤ；および 位置２、５および９にあるｘ （ｘはいずれかの単一アミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含むアミ ノ酸配列を有するセグメントを含む、単離されたポリペプチド、またはそのよう なポリベプチドの抗原性フラグメントを調製すること； （ｂ）該ポリペプチドまたはフラグメントを哺乳動物に対して非毒性にすること ；および （ｃ）該非毒性ポリペプチドを薬物的に許容可能なキャリャと結合させることの 工程を含む、哺乳動物をＮ．ｍｅｉｎｉｎｇｉｄｉｓ感染から保護するのに有用 なワクチン組成物の製造方法。 ４１．ポリペプチドがＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離されたものである 、請求の範囲第４０項記載の方法。 ４２．（ａ）９個のアミノ酸の溶血素共通配列の少なくとも３つの繰り返しを含 み、該溶血素共通配列が 位置１にあるＬ； 位置３にあるＧ； 位置４にあるＧ； 位置６にあるＧ； 位置７にあるＮ； 位置８にあるＤ；および 位置２、５および９にあるｘ （Ｘはいずれかの単一アミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含むアミ ノ酸配列を有するセグメントを含み、単離されたポリペプチド、またはそれらの 免疫原性のあるフラグメント；および（ｂ）薬物的に許容可能なキャリャ を含有する、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して哺乳動物を免疫するワ クチン組成物。 ４３．ポリヘプチトがＮ．ｍｅｍｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在する、請求の範囲第 ４２項に記載のワクチン組成物。 ４４．ポリペプチドがＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外層膜に存在する、請求 の範囲第４２項に記載のワクチン組成物。 ４５．哺乳動物がヒトである、請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４６．哺乳動物をＮ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ感染から保護する必要がある場合 に、９個のアミノ酸の溶血素共通配列の少なくとも３つの繰り返しを含み、該溶 血素共通配列が： 位置１にあるＬ； 位置３にあるＧ； 位置４にあるＧ； 位置６にあるＧ； 位置７にあるＮ； 位置８にあるＤ；および 位置２、５および９にあるｘ （ｘはいずれかの単一アミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含むアミ ノ酸配列を有するセグメントを含む、単離された免疫原性ポリペプチド、または それらの免疫原性フラグメントを含有するワクチン組成物を哺乳動物に投与する ことを含む、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して哺乳動物を免疫する方 法。 ４７．アミノ酸配列がＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在する、請求の範囲第 ４６項に記載の方法。 ４８．アミノ酸配列がＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外層膜に存在する、請求 の範囲第４６項に記載の方法。 ４９．哺乳動物がヒトである、請求の範囲第４６項に記載の方法。 ５０．Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在するアミノ酸配列を有するセグメン トを含み、該アミノ酸配列が９個のアミノ酸の溶血素共通配列のうち少なくとも ３つの繰り返しを含み、該溶血素共通配列が： 位置１にあるＬ； 位置３にあるＧ； 位置４にあるＧ； 位置６にあるＧ； 位置７にあるＮ； 位置８にあるＤ；および 位置２、５および９にあるｘ （ｘはいずれかの単一アミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含む単離 されたポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの抗原性フラグメントに対 して産生されるモノクローナル抗体。 ５１．（ａ）溶血素群毒素の一つであるポリペプチドまたはそれらの抗原性フラ グメントに特異的な抗体を調製すること；および（ｂ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ ｄｉｓに感染した哺乳動物に該抗体を投与することの工程を含む、Ｎ．ｍｅｎｉ ｎｇｉｔｉｄｉｓ感染により引き起こされる疾患に苦しむ哺乳動物を治療する方 法。 ５２．哺乳動物がヒトである、請求の範囲第５１項に記載の方法。 ５３．抗体が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在するアミノ酸配列を有する セグメントを含むポリペプチドに対して産生される、請求の範囲第５１項に記載 の方法。 ５４．抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第５１項に記載の方法。 ５５．Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在するアミノ酸配列を有するセグメン トを含み、該アミノ酸配列が９個のアミノ酸の溶血素共通配列の少なくとも３つ の繰り返しを含み、該溶血素共通配列が 位置１にあるＬ； 位置３にあるＧ； 位置４にあるＧ； 位置６にあるＧ； 位置７にあるＮ； 位置８にあるＤ；および 位置２、５および９にあるｘ （ｘはいずれかの単一アミノ酸残基を示す。）のうち、少なくとも４つを含む単 離されたポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの抗原性フラグメントを コードする、単離された核酸分子。 ５６．（ａ）溶血素群毒素の一つであるポリペプチドもしくはそれらのフラグメ ントまたは、該ポリペプチドもしくはフラグメントをコードする核酸分子を認識 するプローブを調製すること；および （ｂ）該プローブが試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを認識するかどうか を確認することの工程を含む、試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を 検出する方法。 ５７．プローブが抗体である、請求の範囲第５６項に記載の方法。 ５８．抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第５６項に記載の方法。 ５９．プローブが核酸分子である、請求の範囲第５６項に記載の方法。 ６０．溶血素群毒素の一つであるポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードす る核酸分子が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在する、請求の範囲第５６項 に記載の方法６１．（ａ）９個のアミノ酸の溶血素共通配列の少なくとも３つの 繰り返しを含み、該溶血素共通配列が 位置１にあるＬ； 位置３にあるＧ； 位置４にあるＧ； 位置６にあるＧ； 位置７にあるＮ； 位置８にあるＤ；および 位置２、５および９にあるｘ （ｘはいずれかの単一アミノ酸残基を示す。）のうち少なくとも４つを含むアミ ノ酸配列を有するセグメントを含む、単離された抗原性ポリペプチド、またはそ のようなポリペプチドの免疫原性フラグメントを調製すること；および （ｂ）該ポリペプチドが試料中の抗体を認識するかどうかを確認することの工程 を含む、試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに特異的な抗体の存在を検出す る方法。 ６２．ポリペプチドがＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在するアミノ酸配列を 含む、請求の範囲第６１項記載の方法。