JP5275982B2 - ワクチン - Google Patents
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Description
−LOS内部コアの修飾(decoration)は、免疫型の殺菌性エピトープの確定に重要である、
−L2 LOSをヘプトースIIに結合したGlcNAc残基においてO−アセチル化修飾する酵素が見いだされ、それをコードする遺伝子がOac1である、
−O−アセチル化されているL3免疫型LOSが見出され(以前に報告されていない)、これはL3株に広範囲に存在すると考えられる、
−従来のL3 LOSに対する抗体はO−アセチル化L3株を死滅させることができるが、この殺菌は従来のL3株に対してそれほど有効ではない。
従って、本発明の一態様においては、そのヘプトースII残基に結合したGlcNac残基においてO−アセチル化されているナイセリア株由来のL3 LOSを含む免疫原性組成物を提供する。ナイセリア株は、天然にそのようなLOSを産生するもの(例えばNZ124株)であってもよいし、又は機能的oac1遺伝子の挿入によって作出されたもの(以下参照)であってもよい。本発明の目的のため、L3V免疫型は、L2免疫型とより免疫学的に類似しているため、L3株の分類ではない。
R2=PEAであり、
R3=Hであり、
R4=OAcであり、
R5=H、PEA、又はGlyである〕。
R2=PEA又はGlcであり、
R3=PEAであり、
R4=H又はOAcであり、
R5=H、PEA、又はGlyである〕
を含んでもよい。
R1=ヘキソース−ヘキソース−であり、
R2=H又はPEAであり、
R3=PEAであり、
R4=OAcであり、
R5=H又はGlyである〕
を含んでもよい。
R2=Hであり、
R3=PEAであり、
R4=OAcであり、
R5=Glyである〕
を含んでもよい。
R2=PEAであり、
R3=Hであり、
R4=Hであり、
R5=H、PEA、又はGlyである。〕
を含むことができる。
本明細書中に記載される刊行物及び特許、又は特許出願の主題又はそこに開示される情報は、参照により本明細書に組み入れる。
ヒトスフィンゴ糖脂質に存在するラクト−N−ネオテトラオースオリゴ糖基(Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glcβ1−、図1)と類似した構造が存在することから、L3又はL2 LOSに対して生起された抗体の安全性が問われてきている。多くの人々が残存量のL3 LOSを含むデオキシコレート抽出小胞ワクチンで安全にワクチン接種されてきているが(G. Bjuneら, Lancet(1991), 338, 1093-1096、GVG. Sierraら, NIPH ann(1991), 14, 195-210)、LOSが本明細書に記載されるように抗原として保持される場合、LOS糖鎖構造の末端部分の欠失が、ヒト組織の表面に提示される構造との抗LOS免疫応答の交差反応の阻止において有利であることが、本発明者らによって発見された。好ましい実施形態において、lgtB遺伝子の不活性化が末端ガラクトース残基及びシアル酸が欠損した中間体LOS構造を生じる(図1及び2を参照、突然変異はL2及びL3及びL4 LOSに4GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glcβ1−構造を残存させる)。そのような中間体は、L3及び/又はL2(及び/又はL4)LOS株において獲得され得る。別の及びあまり好ましくないLOSの(短い)バージョンは、lgtE遺伝子のスイッチオフによって得ることができる。さらに別の及びあまり好ましくない型のLOSは、lgtA遺伝子のスイッチオフによって得ることができる。そのようなlgtA−突然変異を選択する場合、非免疫原性L1免疫型の形成を阻止するためにlgtC発現をスイッチオフすることがまた好ましい。
本発明の上記の精製LOS又はブレブ免疫原性組成物はまた、それらが由来する細菌性産生株における特定の遺伝子の発現の下方制御によって、毒性をより少なくすることができる。そのような無毒化は、天然のOMVによる鼻腔内免疫には不必要であるだろうが(J.J Drabickら, Vaccine(2000), 18, 160-172)、非経口ワクチン接種における無毒化には有用であろう。好ましくは、本発明の精製LOS又はブレブ免疫原性組成物は、リピドA生合成に関与する遺伝子(特にリピドAへの第2アシル鎖(secondary acyl chain)の付加に関与する遺伝子)の突然変異/改変/不活性化により(特にmsbB及び/又はhtrB遺伝子由来の機能的遺伝子産物の発現の下方制御により、好ましくは遺伝子のスイッチオフにより、最も好ましくは遺伝子のプロモーター及び/又はオープンリーディングフレームの全体又は一部の欠失により)、ナイセリア産生株を遺伝的に操作することによって無毒化される。あるいはまた(又はさらに)、精製LOS又はブレブ免疫原性組成物は、以下の遺伝子:pmrA、pmrB、pmrE及びpmrFのうちの1つ以上の遺伝子が(より強力なプロモーターの導入、又は遺伝子のさらなるコピーの組み込みによって)上方制御されるように遺伝的に改変されたナイセリア株から得ることができる。あるいはまた(又はさらに)、精製LOS又はブレブ免疫原性組成物は、ポリミキシンBの機能的等価物である非毒性ペプチド[リピドAに対して高いアフィニティの有する分子]を組成物に添加することにより無毒化され得る(以下参照、すなわち、本発明の1以上のLOSが、LOSの毒性を低減させるために好適なリピドA結合ペプチド、例えばSAEP2又はSAEPIIと複合体化されている)。
本発明のさらなる態様は、本発明のナイセリア株から単離されるLOS調製物(特に上述した任意のもの)である。好ましくは、単離されたLOS(又はLOS含有ブレブ)は、L2又はL3免疫型であり、好ましくは本発明の免疫原性組成物は本発明のL2及びL3 LOS(又はブレブ)調製物を両方含む。
LOS(特に本発明のLOS)がブレブ製剤中に存在する場合、LOSは好ましくは、ブレブ調製物上にも存在する1又はそれ以上の外膜タンパク質(例えば髄膜炎菌におけるPorA又はPorB)へのLOSのコンジュゲーションを可能にする方法により、in situにおいてコンジュゲートされる。従って、本発明のさらなる態様は、その外膜中に、LOSとコンジュゲートされた外膜タンパク質が組み込まれるグラム陰性細菌株由来のブレブ調製物(本発明の1以上のブレブ調製物)である。LOSはコンジュゲートのためにブレブ調製物に添加してもよいが、LOSはブレブ調製物の表面に天然に存在することが好ましい。
本発明の外膜小胞(OMV又はブレブ)は、多くの公知の技術により単離することができる(Fredriksenら, NIPH Annals(1991), 14, 67-79、Zollingerら, J. Clin Invest(1979), 63, 836-848、Saundersら, Infect Immun(1999), 67, 113-119、J.J. Drabickら, Vaccine(1999), 18, 160-172)。これらは2つの主要な群に分類される。すなわち、デオキシコレート(約0.5%)を使用して髄膜炎菌からブレブを抽出する技術と、低レベルのデオキシコレート(DOC)を使用するか又は全くデオキシコレートを使用しない技術である。DOCを使用しない方法では、ブレブはOMV中に高レベルのLOSを維持するという興味深い特徴を有する。このことはLOSが防御抗原であるワクチンにおいて有利である。DOC抽出ブレブと比較して、DOCを使用しない方法により得られるOMV中のL3抗原(Ag)の濃度は約10倍高い。界面活性剤を用いない(好ましくはDOCを用いない)ブレブ調製法は、この理由により本発明の方法の目的にとって好ましいが、低レベルの界面活性剤(好ましくはDOC)を含むバッファーでの抽出もまた、ブレブ内で強固に相互作用するLOSの大半を残す一方、より毒性があり緩く保持されたLOSを除去するステップであるという点で有利であり得る。典型的には、0〜0.5%、好ましくは0.02〜0.4%、0.04〜3%又は0.06〜2%界面活性剤(好ましくはDOC)がブレブ抽出に使用され、より好ましくは0.08〜0.15%、最も好ましくはおよそ又は正確に0.1%を用いて、最適な量のLOSをブレブ中に安定に存在させて得る。LOSが1以上の上記の方法により無毒化されている場合には、DOCを用いない(又は低DOC〜0.3%DOC若しくはそれ以下の)抽出法が特に好ましい。
本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される賦形剤の添加によってワクチン組成物として容易に製剤化することができる。
本発明の免疫原性組成物は、適切なアジュバントとともに製剤化することで本発明のワクチン組成物を作製することができる。
本発明の上記のブレブ組成物は、それらが由来するナイセリア株(淋菌及び好ましくは髄膜炎菌、最も好ましくは髄膜炎菌Bを含む)が、ゲノム中への遺伝子のさらなるコピーを挿入することにより、又は既存の遺伝子の上流により強力なプロモーターを導入することにより、又は非改変株と比較して1.2、1.5、2、3、5若しくは10倍を超える抗原レベルを生じるよう改変された株を誘導することが可能なWO01/09350号に記載のあらゆる他の方法により、上方制御された1又はそれ以上の下記遺伝子(防御抗原をコードする遺伝子)を有する場合、本発明のワクチンにおける有効性がさらに改良され得る。すなわち、NspA(WO96/29412号)、Hsf又はその末端切断物(WO99/31132号及びWO01/55182号、NhhAとしても知られる)、Hap(PCT/EP99/02766号)、OMP85(WO00/23595号)、PilQ(PCT/EP99/03603号)、PldA(PCT/EP99/06718号)、FrpB(WO96/31618号)、TbpA(WO92/03467号、米国特許第5912336号、WO93/06861号及びEP586266)、TbpB(WO93/06861号及びEP586266)、NadA(Comanducciら J. Exp. Med. 2002 195:1445-1454、NMB 1994)、FrpA/FrpC、又は5以上の反復配列を含むこれらの抗原間に共通の部分(WO92/01460号;Thompsonら,(1993) J. Bacteriol. 175:811-818; Thompsonら,(1993) Infect. Immun. 61:2906-2911)、LbpA、LbpB(PCT/EP98/05117号)、FhaB(WO98/02547号、配列番号38(ヌクレオチド3083〜9025))、HasR(PCT/EP99/05989号)、lipo02(PCT/EP99/08315号)、Tbp2(WO99/57280号;NMB0460)、MltA(WO99/57280号;NMB0033)、TspA(WO00/03003号)、TspB(WO00/03003号)、ctrA(PCT/EP00/00135号)、MafA(NMB0652)、MafB(NMB0643)、Omp26(NMB0181)、アドヘシンX(NMB0315)、アドヘシンY(NMB0995)、アドヘシンZ(NMB1119)及びOstA(NMB0280)である。NMB配列の例は、www.neisseria.orgのデータベースで見出すことができる。本明細書でHsfについて言及する場合、この用語はあらゆる場合においてHsf末端切断物(特にWO01/55182号に開示されたもの)と置換可能である。
本発明者らは、ブレブに関わる上記組成物及びワクチンが、(同一の利点を有する)ゴースト又は死菌全細胞調製物及びワクチンに関する方法にまで容易に拡張できることを意図している。グラム陰性細菌株からゴースト調製物(完全なエンベロープを有する空の細胞)を製造する方法は当技術分野で周知である(例えばWO92/01791号を参照)。全細胞を殺滅して、ワクチンに使用するための不活性化細胞調製物を作製する方法もまた周知である。従って、本明細書を通して記載されるブレブを含む組成物及びワクチンは、等価物である本発明のゴースト及び死菌全細胞調製物を含む同じ組成物又はワクチンにも当てはまることを意図している。
血清殺菌アッセイは、本発明の免疫原性組成物中で組み合わせた場合に抗原間の相乗作用的な関係を評価するための好ましい方法である。
以下の実施例は、特に詳細に記載しない限りは当業者にとって周知でありルーチンである標準的な技術を用いて実施される。本実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
要約
・MS−MS分析から、NZ124(L3)株の内部コアLOSのN−アセチル−グルコサミン(GlcNAc)はO−アセチル化されていることがわかっている。H44/76株及びM687株、並びにH44/76株由来のL3 lgtB(−)株及びL3 1st(−)ワクチン株(それぞれ、B1854=TrL3及びB1948=L7)についてはそうではない。
・NZ124株は、H44/76株及びM687株と比較して、抗体媒介性補体殺菌に対する抵抗性が高いわけではない。
・露出が乏しい表面エピトープと殺菌抗体との接触性は、NZ124株及びH44/76株で類似しているようである。
・4つの動物種を用いた5つの動物モデルにおいて、どんな製剤を用いても、抗TrL3及び抗L7ブレブ血清は、H44/76株及びM687株と比較して、NZ124株の死滅を媒介する効果が低かった。
・これらの結果は、内部コアLOSのGlcNAcのアセチル化が、抗「非アセチル化LOS」抗体により媒介される死滅の効力を低減する可能性があることを示唆している。
MS/MS分析に基づき、髄膜炎菌のL3 LOSの2つの異なる構造を説明する。これら2つの構造は、内部コアのGlcNAc上にアセチル基が存在するかしないかによって区別される(図2A)。文献には、この追加アセチル基なしでL3構造が記載されている。
・この株は本来、抗体及び補体が媒介する殺菌に対して、H44/76株及びM687株より抵抗性が高い可能性がある;
・この株では、LOSエピトープは殺菌抗体との接触性が低い可能性がある;
・内部コアLOSのアセチル化は、抗「非アセチル化」LOS抗体が媒介する殺菌の効力にマイナスの影響を与える可能性がある。
NZ124株は、抗体媒介性殺菌に対し、より抵抗性なのか?
この疑問に答えるために、本発明者らは、様々なPorA+ブレブワクチンで免疫したマウス由来の血清をSBAにおいて分析した。抗血清を相同及び異種PorA株に対しSBAで試験した。表1に示す結果は、2つの実験から得られたものである。
特に、NspAループは、例えば、PorAのVR1及びVR2ループと比較して、比較的小さいことから、莢膜の大きさがNspA表面エピトープと抗体との接触性を制限する可能性があることが以前から示唆されてきた。実際、莢膜の大きさと、抗NspA血清が補体媒介性殺菌を誘導する能力との間には関係が証明されている(Moeら、1999 I&I 167:5664-75)。
マウス、ウサギ、モルモット、仔ラット及び成体ラットを、porA KOブレブで免疫した。実験の大部分は、ペンタ−アセチル化(penta-acylated)リピドA LOSを産生する株から取得したブレブ(msbB突然変異、B1853、B1854及びB1948ブレブ)を用いて行ったが、少数の実験では、ヘキサ−アセチル化(hexa-acylated)LOS含有ブレブ(B1820ブレブ)を用いて実施した。アルミニウム塩(Al(OH)3若しくはAlPO4)を用いて、又は用いずに(非吸収製剤)、またCpGを用いて、様々な製剤を試験した。H44/76株、M687株及びNZ124株に対する仔ウサギ補体を用いて、抗ブレブ血清をSBAにおいて試験した。
TrL3又はL7ブレブでマウスを免疫すると、H44/76株及びM687株の死滅を媒介する高レベルの殺菌抗体が誘発された。マウス血清を用いて測定したSBA力価は、H44/76株及びM687株に対するものと比較してNZ124株に対して3〜20倍低かったことから、上記抗体は、NZ124株に対しては殺菌力が低い。
α鎖の糖組成に加えて、ヘプトースIIの「修飾(decoration)」は、LOS免疫原性に影響を与えるようである。PEAの数及び位置、3位におけるグルコースの存在、7位におけるグリシンの存在、並びにGlcNAcのO−アセチル化が、交差防御の重要な決定因子であるようだ。
ヘプトースIIの7位にグリシンを付加する酵素は不明である。
GlcNAcにO−アセチルを付加する酵素は、本試験の時点まで不明であった。
・翻訳されたナイセリアゲノム(ナイセリア・ゴノローエ(N.gonorrhoeae)、髄膜炎菌MenB MC58、MenC FAM18及びMenA Z2491)上のOafAタンパク質(サルモネラ由来;ヘモフィルスO−アセチラーゼHi0391+Hi0392と相同)を用いたBLAST研究後、ナイセリアにoac1(MC58遺伝子NMB0285に代表される)とoac2(MC58遺伝子NMB1836に代表される)と称される2つの遺伝子ファミリーが見出され、oac2よりoac1ファミリーの方がOafAに近縁であった。
・両遺伝子ともにフレーム変動性である:すなわち、ORFにポリG区間(stretch)が存在する。
・MC58(非O−アセチル化LOS)において、oac1遺伝子(NMB0285)はフレーム外(out of phase)であるが、oac2(NMB1836)はフレーム内(in phase)である。
・試験した各株について、oac1及びoac2に対応するPCR産物を取得した。
・ポリG区間による機能性を調べるためにポリG区間を配列決定した。
・NMB0285遺伝子の機能性と、MS−MSによるO−アセチル基の検出との間に完全な相関がある(16/16)。
・NMB1836遺伝子の機能性と、MS−MSにより得られたデータとの間には相関がない(7/16)。
・ナイセリアにおけるO−アセチル化遺伝子はNMB0285であるという強力な証拠を得た。
1136-GGG GGA TAT TGA A-1149 Z2491(NMA2202)
NZ124、すなわち、O−アセチル化され(活性コンホメーションのoac1による)、H44/76(非アセチル化)由来のブレブにより誘導された血清に対してより抵抗性が高いL3株において、等価のNMB0285遺伝子(oac1)をノックアウトした。質量分光分析によりO−アセチラーゼ遺伝子の不活性化が初めて確認されたため、KO突然変異株をSBA分析に用いて、ワクチン交差防御におけるLOS O−アセチル化の関与をさらに詳しく調べることにする。
・O−アセチル化遺伝子の5’及び3’フランキング領域に対応するNZ124組換え5’及び3’領域を含むNMB0285 KOプラスミドを構築した(pMG−T−easyベクター)。NMB0285遺伝子の代わりにKanRマーカーを導入した。このプラスミドはpRIT 15574と称する。
・NZ124のoac1 KO株を構築した(これに由来するLOSは脱O−アセチル化されている)ところ、oac1はNmenのLOS O−アセチラーゼであることがさらに示された。
H44/76株由来のブレブはL3免疫型(非アセチル化)である。該ブレブは、L3 O−アセチル化株(例えば、NZ124、BZ10)に対する殺菌抗体を誘導する能力が低減しているため、機能的O−アセチル化遺伝子(oac1)をH44/76由来のブレブ産生株に再導入することが提案される。
・NZ124遺伝子(O−アセチル化オン株)によるH44/76のNMB0285遺伝子の置換(遺伝子オフ)。
・NZ124プロモーター及び上流調節配列を含有させた(NZ124オープンリーディングフレーム及びNZ124の448bp上流を挿入した)。
・挿入は、センス配向のエリスロマイシン耐性遺伝子を用いて行なった。
・ワクチン異種防御効力に関するブレブL3 LOS O−アセチル化の重要性を試験した(前述の方法で改変したH44/76ブレブによるNZ124の殺菌改善があったか否かを観察するため)。このL3ブレブとO−アセチル化L2株760676由来のブレブの組合せも試験することにより、異種殺菌抗体産生について調べることにする。
・前記のように実施したところ、質量分光測定により、改変H44/76株から得られたLOSがHepIIにおいてO−アセチル化されていることがわかった。
要約
・特異的なポリクローナル抗体を用いた免疫拡散法(オクタロニー法)により、6725株及びC11株の免疫型を決定した。MS/MS分析により内部コアLOS組成を決定した。PCR及び配列決定により、LOS内部コア修飾に関与する酵素をコードする遺伝子を分析した。
・MS/MS分析によれば、6275株はHepIIに2個のPEA残基を有する。この株はL3株として免疫型決定されたが、通常のL3株には(HepIIの3位に)1個のPEAしかない。
・MS/MSにより、C11株の内部コアLOSの2つの異なる組成が観察された。一方の集団はHepIIに1個のPEA残基を含むのに対し、他方の集団は2個のPEA残基を含む。この株は、抗L2血清と非常に弱い反応を有するL3株として免疫型決定した。
髄膜炎菌LOSの内部コアLOS組成は、これまでの記載より複雑であると思われる。近年まで、内部コアLOSは、HepIIにPEAを含まないか、又は3若しくは6(7)位に1個だけPEA残基を含むと提唱されていた。しかし、近年、3位及び6(又は7)位に2個のPEAを含む新規の内部コアLOSが記載された。この新しいLOS構造は、これまでL3として免疫型決定された株由来のものと記載されていることから、この新規のLOS構造は、L3変異体にちなんで「L3v」と名付けられた。
1.MS/MS分析による内部コア組成
MS/MS分析(図4参照)により、以下のことが明らかになった:
・両方の株において、α鎖LOSは、末端シアル酸基を有するL2及びL3について記載された典型的LNnT四糖である。
・6275株の内部コアLOSは、ほぼ確実に3位及び6(7)位に2つのPEA残基を有するが、NMR分析により確認する必要がある。
・C11株は、2つの異なる内部コア:
−1個のPEAを含む(HepIIでのその位置は明確にされていないが、HepIIのグリシンに対し弱いシグナルが認められることから、7位のPEAは排除される)第1集団と、
−2個のPEAを含む(このHepIIでもグリシンが検出されたため、ほぼ確実に3位及び6位に含む)第2集団
から構成されていた。
・いずれの株についても、HepIIにグルコースは検出されない。
一連の特異的抗血清を用いて、免疫型決定を実施した。L3及びL2抗血清以外の抗血清(L1、L4、L5…)で得られた結果は、6275株及びC11株に関して陰性であったため、L3抗血清及びL2抗血清を用いて得られた結果のみを以下に記載する。これらの実験では、GSK Bioで現在用いられている6275株及びC11株(GSK6275−1&2、及びGSK C11)を、アムステルダム大学で20年以上フリーザー内に保存された類似株(Zol 6275株及びRIV C11株)と比較した。
3位にPEAを付加する酵素が同定されており、これは、lpt3遺伝子によりコードされる。HepIIの3位のPEAは、超毒性髄膜炎菌株の70%に検出され、Wright及びその共同研究者らは、分析した株の86%においてPCRによりlpt3遺伝子を検出した。この遺伝子は、フレーム変動により調節されず、様々な血清群C及びA株において部分的に欠失していることがわかった。3位へのPEAの付加は、同じ位置でのグルコースの付加と競合していると仮定されている。関与する酵素は、lgtG遺伝子によりコードされ(WO94/015099号参照)、ORF内のポリG区域でのフレーム変動により調節される。Moxon研究所の仮定は、lgtGのORFが存在し、かつフレーム内であれば、機能的酵素が産生され、3位にグルコースが付加されるため、この位置にPEAは付加されないというものである。
・lpt3遺伝子の完全コピーの存在を評価しながら(PCR)、lgtG遺伝子の機能性についての研究を続行した(PCRによる存在、ORF内のポリC区間の配列)
・lpt6遺伝子の存在をPCRにより評価した。遺伝子の完全コピーが存在すれば、この株が6位にPEAを有するLOSを含むことが推定される。
次の表は、多様な方法を用いた様々な髄膜炎菌株の特性決定を要約したものである。
内部コアLOS組成の多様性は、これまで記載されているより複雑である。初めに、HepIIに1個のPEA基を含まない又は含む(3位又は6/7位のいずれか)株が記載されたが、近年、2個のPEA基を含む株が記載された。このような株は、例えば、血清群Bの6275株及び血清群CのC11株である。
・デスフェラールの存在下で、B1854、B1948、B1971、B1984及びB1987ブレブを培養物から作製した。
・B1900ブレブは、デスフェラールを用いずに、培養物から作製した。
動物実験の手順:
30匹のマウスの群を筋内経路(IM)によって3回、0、21及び28日目にOMV(約15〜20%の無毒化LOSを含む)で免疫した。毎回の接種材料は、5μg(タンパク質含量)の非吸着OMVからなるものであった。OMVは、莢膜多糖及びPorAが下方制御され、LOSが無毒化される(msbB突然変異)ように操作した髄膜炎菌(Nmen)株から作製した。産生株(前記表を参照)は、遺伝子改変された野生型H44/76株(この場合、これらはL7 LOS又はTrL3 LOSのいずれかを発現した)あるいは遺伝子改変された野生型760676株(この場合、これらは、シアル化された若しくはシアル化されていないL2 LOS、又はTrL2 LOSを発現した)のいずれかに由来するものであった。前述した培養条件下で増殖させた株からブレブを単離した。42日目に、一連の髄膜炎菌株(表1参照)を用いた血清殺菌アッセイ(SBA)による分析のために血液サンプルを採取した。プールした血液サンプル又は個々の血清(1群につき10〜30の血清)のいずれかについてSBAを実施した。
37℃+5%CO2にて、MH+1%Polyvitex+1%ウマ血清ペトリ皿上で髄膜炎菌株を一晩培養した。これらを振盪しながら、37℃で50μMのデスフェラール(鉄キレート剤)を添加した液体TSB培地において470nmでのODが0.5に達するまで3時間継代培養した。血清サンプルを56℃で40分かけて不活性化し、次にPBS−グルコース0.1%で1/10又は1/50希釈した後、平底マイクロプレートにおいて25μlの容量で2倍希釈(8希釈)した。細菌をPBS−グルコース0.1%で希釈することにより、5300CFU/mlを達成し、この希釈物18.8μlを血清希釈物に添加した。また、ウサギ補体(6.2μl)も各ウェルに添加した。振盪しながら37℃で75分インキュベートした後、50μlのMH+0.9%寒天をウェルに添加し、約30分後に50μlのPBS+0.9%寒天を添加した。37℃+CO2で、マイクロプレートを一晩インキュベートした。CFUを計数し、死滅の割合(%)を計算した。SBA力価は、50%の死滅をもたらす希釈度とする。
37℃+5%CO2にて、BHI+1%ウマ血清ペトリ皿上で髄膜炎菌株を一晩培養した。これらを、37℃+5%CO2で、BHI+1%ウマ血清を用いて4時間継代培養した。血清サンプルを56℃で40分かけて不活性化し、次にPBS−グルコース0.1%で1/10希釈した後、平底マイクロプレートにおいて25μlの容量で2倍希釈(8希釈)した。細菌をPBS−グルコース0.1%で希釈することにより、6400CFU/mlを達成し、この希釈物12.5μlを血清希釈物に添加した。また、ウサギ補体(12.5μl)も各ウェルに添加した。振盪しながら37℃で75分インキュベートした後、50μlのTSB+0.9%寒天をウェルに添加し、約30分後に50μlのPBS+0.9%寒天を添加した。35℃又は37℃+CO2で、マイクロプレートを一晩インキュベートした。CFUを計数し、死滅の割合(%)を計算した。SBA力価は、50%の死滅をもたらす希釈度とする。
・L3=HepII(ほぼ確実に3位)に1個のPEAを有し、内部コアGlcNAcに別のアセチルはない。
・“L3”=HepII(ほぼ確実に3位)に1個のPEAを有し、内部コアGlcNAcに1個の別のアセチルを有する。
・L2=HepII(ほぼ確実に6位)に1個のPEAを有し、内部コアGlcNAcに1個の別のアセチルを有する。
・変異体=HepII(ほぼ確実に3位及び6位)に2個のPEAを有し、内部コアGlcNAcに1個の別のアセチルを有する;しかし、W3193株においてはHepIIにOacは一切存在しないことに留意されたい。
・L10及びL11=構造は決定されていない。
・L3、“L3”、L2及び変異体は、LNnT四糖(シアル化又は非シアル化)を含む。
以下の表1に要約した結果及び図5から、以下のことがわかる:
・L2由来のブレブは、NmenB L2株に対する殺菌抗体を誘導するが、NmenB L3株(M97250687を除く)に対するものは誘導しない。これに対し、L3由来のブレブは、NmenB L3及び“L3”株に対して、また、血清群Aの3125株(L10)及び血清群YのM01.0240539株(表ではM01.539)に対して防御応答を誘導するが、L2株に対しては誘導しない。質量分光法による3125のL10 LOSの構造を図6に示す。
・加えて、L2由来のブレブは、変異型LOSを保有する株(NmenB 6275株及びNmenC C11株)に対して防御を誘導し、また、血清群C(C19)、血清群Y(S1975)、血清群A(F8238、L11)及び血清群W−135(S4383株及び3193株)由来の他の株に対しても誘導する。
・非末端切断型L2 LOSは、lgtB突然変異体(=TrL2)より優れた「交差防御」を誘導する。これは、L3由来のブレブ(TrL3=L7)については、そうではない。
・非シアル化L2ブレブは、シアル化L2ブレブと類似レベルの殺菌抗体を誘導する(少なくとも6275株に対して)。
・SBAにおいて対象とした(ターゲティング)株によれば、二価ワクチンについて妨害が観察されたり、されなかったりするが、これは、試験した株のすべてに対して最も優れた効力(SBA力価)を確実にするためには、二価製剤/組成物の微調整が必要であることを示している。
・内部コアの修飾は、交差反応性殺菌抗体の誘導に大きな影響を与える。
・非血清群B株及び6275株に対し、L2由来のブレブ(末端シアル酸を含む又は含まないL2、及びTrL2)により付与される交差防御は、モルモット、ウサギ及び仔ラットにおいても観察される。
・一般に、L2由来のブレブは、M97250687(表ではM687)を除いて、L3株の補体死滅を媒介することができる有意なレベルの殺菌抗体を誘導することができない(仔ラット及びウサギ血清を用いたH44/76株に関するデータは、陰性血清について測定した活性のバックグランドにより、信頼性に欠けるため、反復しなければならない)。
・モルモットでは、TrL2ブレブは、L2 lst−ブレブ及びL2ブレブより高レベルの殺菌抗体を誘導するようであるが、仔ラット、マウス及びウサギでは、L2≧L2 lst−≧TrL2の順位が観察される。
・これらの結果から、殺菌抗体の誘導を誘発するためにL2 LOSのシアル化は必要ではないこと、また、TrL2ブレブ(lgtB突然変異)も、殺菌抗体の産生を誘発することができる(TrL3 LOSと同様に)ことがわかる。
方法
動物実験の手順:
−30匹のマウスの群を筋内経路(IM)によって3回、0、21及び28日目に、二価OMV製剤(約15〜20%の無毒化LOSを含む、L3由来のOMV+L2由来のOMV)で免疫した。毎回の接種材料は、0.8μg+0.8μg(LOS含量)の非吸着OMVからなるものであった。OMVは、莢膜多糖及びPorAが下方制御され、LOSが無毒化される(msbB突然変異)ように操作した髄膜炎菌(Nmen)株から作製した。産生株は、遺伝子改変された野生型H44/76株(L3)又は遺伝子改変された野生型760676株(L2)のいずれかに由来するものであった(遺伝子改変及び培養条件を記載する以下の表を参照)。42日目に、血清群A、B、C、W135(W)及びY由来の一連の22種の髄膜炎菌株を用いた血清殺菌アッセイ(SBA)による分析のために血液サンプルを採取した。プールした血液サンプルについてSBAを実施した。血清は実験20060425及び20060426から得たものである。
デスフェラールを用いて実施した培養物からB1854及びB1948 OMVを作製した。
37℃+5%CO2にて、髄膜炎菌株をペトリ皿上で一晩培養した。次に、37℃+5%CO2にて、デスフェラール(鉄キレート剤)を含む又は含まないペトリ皿上で、上記株を4時間継代培養した。血清サンプルを56℃で40分かけて不活性化し、次にPBS−グルコース0.1%で1/10又は1/50希釈した後、平底マイクロプレートにおいて25μlの容量で2倍希釈した。次に、細菌(PBS−グルコース0.1%で希釈することにより、1ウェル当たり約100〜150CFU/mlを達成する)と、仔ウサギ補体(マイクロウェル中の最終濃度:12.5%v/v)との混合物25μlを血清希釈物に添加した。振盪しながら37℃で75分インキュベートした後、2層の寒天(0.9%)をウェルに添加した。35℃又は37℃+CO2で、マイクロプレートを一晩インキュベートした後、CFUを計数し、死滅の割合(%)を計算した。SBA力価は、50%の死滅をもたらす希釈度とする。
・L3=HepII(ほぼ確実に3位)に1個のPEAを有し、内部コアGlcNAcに別のアセチルはない。
・“L3”=HepII(ほぼ確実に3位)に1個のPEAを有し、内部コアGlcNAcに1個の別のアセチルを有する。
・L2=HepII(ほぼ確実に6位)に1個のPEAを有し、内部コアGlcNAcに1個の別のアセチルを有する。
・変異体=HepII(ほぼ確実に3位及び6位)に2個のPEAを有し、一般に内部コアGlcNAcに1個の別のアセチルを有する。
・L10及びL11=構造は完全には決定されていない。
・L3、“L3”、L2及び変異体は、LNnT四糖(シアル化、又は非シアル化)を含む。
殺菌力価の4倍増加(対照動物由来のプール血清サンプル、又は比較物としてのワクチン前血清サンプルを用いた)に基づき、得られた結果(次の表を参照)から以下のことがわかる:
・L7+NSL2 OMV又はTrL3+TrL2 OMVのいずれかを含む非吸着二価製剤は、血清群A、B、C、W及びYに属する髄膜炎菌株に対する交差防御を付与することができる。
・この交差防御は、マウスだけではなく、仔ラット、モルモット及びウサギでも観察される。
・しかし、上記製剤は、L4 LOS免疫型を発現する株に対しては防御応答を誘発することができない。これらの実験において、血清はL10株に対して殺菌性ではない。
・L3又は“L3”又は変異体又はL2 LOSを発現する株のほとんどは、マウス、仔ラット及びモルモット血清により死滅する。これらの株に対し、交差防御の割合(%)は90%近い。
・交差防御は、ウサギにおいて、より低いようである。
L3及びL2髄膜炎菌株由来のOMNをベースとする二価ワクチンは、L3又は“L3”又は変異体(L3v)又はL2 LOSのいずれかを発現する髄膜炎菌株に対する防御を付与することができる。この防御は所与の血清群に制限されるわけではない。
方法
動物実験の手順:
−30匹のマウスの群を筋内(IM)経路によって3回、0、21及び28日目にOMV(約15〜20%の無毒化LOSを含む)で免疫した。毎回の接種材料は、0.8μg(LOS含量)の非吸着OMVからなるものであった。OMVは、莢膜多糖及びPorAが下方制御され、LOSが無毒化される(msbB突然変異)ように操作した髄膜炎菌株から作製した。産生株は、遺伝子改変された野生型H44/76株に由来するものであった(遺伝子改変及び培養条件を記載する以下の表を参照)。42日目に、髄膜炎菌株を用いた血清殺菌アッセイ(SBA)による分析のために血液サンプルを採取した。個々の血清についてSBAを実施した。血清は実験20060634から得たものである。
37℃+5%CO2にて、髄膜炎菌株(OAc−であるH44/76及びM97250687と、OAc+であるNZ124)をペトリ皿上で一晩培養した。次に、37℃+5%CO2にて、デスフェラール(鉄キレート剤)を含むペトリ皿上で、上記株を4時間継代培養した。血清サンプルを56℃で40分かけて不活性化し、次にPBS−グルコース0.1%で1/10又は1/50希釈した後、平底マイクロプレートにおいて25μlの容量で2倍希釈した。次に、細菌(PBS−グルコース0.1%で希釈することにより、1ウェル当たり約100〜150CFU/mlを達成する)と、仔ウサギ補体(マイクロウェル中の最終濃度:12.5%v/v)との混合物25μlを血清希釈物に添加した。振盪しながら37℃で75分インキュベートした後、2層の寒天(0.9%)をウェルに添加した。35℃又は37℃+CO2で、マイクロプレートを一晩インキュベートした。CFUを計数した後、死滅の割合(%)を計算した。SBA力価は、50%の死滅をもたらす希釈度とする。
マウスの場合、L7 OAc+OMVはL7 OAc−OMVより免疫原性が高い(以下の表を参照)。確かに、L7 OAc+OMVで免疫したマウス由来の血清は、L7 OAc−OMVで免疫したマウス由来の血清より高い補体媒介殺菌活性を示す。これは、OAc−及びOAc+野生型株に対して観察される。しかし、有意な差異はOAc−株(H44/76及びM97205687)に対してしか観察されない。
内部コアGlcNAcのO−アセチル化は、マウスにおいてOMVの免疫原性(SBA力価)を増強するが、モルモットではそうではないことが証明された。
Claims (16)
- ナイセリア株由来のL2 LOS、場合により髄膜炎菌A株、B株、C株、W135株又はY株から単離されたもの、をさらに含む、請求項1記載の免疫原性組成物。
- ナイセリア株由来のL10 LOS、場合により髄膜炎菌A株、B株、C株、W135株又はY株から単離されたもの、をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- ナイセリア株由来のL4 LOS、場合により髄膜炎菌A株、B株、C株、W135株又はY株から単離されたもの、をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- L3 LOSが髄膜炎菌A株、B株、C株、W135株又はY株から単離されたものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2及びL3 LOS、L2及びL10 LOS、L3及びL10 LOS、L4及びL2 LOS、L4及びL3 LOS、L4及びL10 LOS、L2及びL3及びL10 LOS、L2及びL3及びL4 LOS、L2及びL4及びL10 LOS、L3及びL4及びL10 LOS、又はL2及びL3及びL10及びL4 LOSが、タンパク質キャリアとコンジュゲートされている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2及びL3 LOS、L2及びL10 LOS、L3及びL10 LOS、L4及びL2 LOS、L4及びL3 LOS、L4及びL10 LOS、L2及びL3及びL10 LOS、L2及びL3及びL4 LOS、L2及びL4及びL10 LOS、L3及びL4及びL10 LOS、又はL2及びL3及びL10及びL4 LOSが、無毒化リピドA部分を有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2及びL3 LOS、L2及びL10 LOS、L3及びL10 LOS、L4及びL2 LOS、L4及びL3 LOS、L4及びL10 LOS、L2及びL3及びL10 LOS、L2及びL3及びL4 LOS、L2及びL4及びL10 LOS、L3及びL4及びL10 LOS、又はL2及びL3及びL10及びL4 LOSが、免疫原性組成物中に精製LOS調製物として存在する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2及びL3 LOS、L2及びL10 LOS、L3及びL10 LOS、L4及びL2 LOS、L4及びL3 LOS、L4及びL10 LOS、L2及びL3及びL10 LOS、L2及びL3及びL4 LOS、L2及びL4及びL10 LOS、L3及びL4及びL10 LOS、又はL2及びL3及びL10及びL4 LOSが、免疫原性組成物中にリポソーム調製物として存在する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- L2 LOS、L3 LOS、L10 LOS、L4 LOS、L2及びL3 LOS、L2及びL10 LOS、L3及びL10 LOS、L4及びL2 LOS、L4及びL3 LOS、L4及びL10 LOS、L2及びL3及びL10 LOS、L2及びL3及びL4 LOS、L2及びL4及びL10 LOS、L3及びL4及びL10 LOS、又はL2及びL3及びL10及びL4 LOSが、免疫原性組成物中にブレブ調製物として存在する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の免疫原性組成物の有効量と、髄膜炎菌血清群A、髄膜炎菌血清群C、髄膜炎菌血清群W−135、髄膜炎菌血清群Y、及びインフルエンザ菌b型の株に由来する、1以上のコンジュゲートした莢膜多糖又はオリゴ糖と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含むワクチン組成物。
- 髄膜炎菌血清群A、B、C、W135及びYから選択される1以上によって引き起こされる疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、請求項1〜11のいずれか1項に記載の免疫原性組成物又は請求項12記載のワクチンの使用。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の免疫原性組成物又は請求項12記載のワクチンの製造方法であって、L3 LOSを単離するステップ、場合によりそれを必要に応じて単離されたL2及び/又はL10及び/又はL4 LOSと組み合わせるステップ、並びに薬学的に許容される賦形剤と共にL3 LOSを製剤化するステップを含む方法。
- 髄膜炎菌免疫型L3疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、請求項1〜11のいずれか1項に記載の免疫原性組成物又は請求項12記載のワクチンの使用。
- 髄膜炎菌免疫型L3疾患が、そのヘプトースII残基に結合したGlcNac残基においてO−アセチル化されているLOS、そのヘプトースII残基に結合したGlcNac残基においてO−アセチル化されていないLOS、又はそのヘプトースII残基に結合したGlcNac残基において部分的にO−アセチル化されておりかつ部分的にO−アセチル化されていないLOS、のいずれかのLOSを有する株によって引き起こされる、請求項15記載の使用。
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