ES2294629T3 - Antigenos de neisseria y composiciones. - Google Patents

Abstract

Una proteína que comprende: * la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 2: * una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 2 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria; * una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 8 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 2; * la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 4; * una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria; * una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 10 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 4; * la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 6; * una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 6 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria; * una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 10 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 6, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 6.

Description

Antígenos de Neisseria y composiciones.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a antígenos de las especies bacterianas: Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae.

Antecedentes

Neisseria meningitidis es un diplococo gram negativo inmóvil patógeno del ser humano. Coloniza la faringe, causando meningitis y ocasionalmente septicemia en ausencia de meningitis. Está estrechamente relacionado con N. gonorrhoeae, aunque una característica que diferencia claramente los meningococos de gonococos es la presencia de una cápsula de polisacáridos que está presente en todos los meningococos patógenos.

N. meningitidis causa enfermedad endémica y epidémica. En los Estados Unidos el índice de infección es de 0,6-1 por cada 100.000 personas al año, y puede ser mucho mayor durante los brotes (véase Lieberman y col., (1996) Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neisseria meningitidis Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccine in Young Children. JAMA 275(19): 1499-1503; Schuchat y col., (1997) Bacterial Meningitis in the United States in 1995. N Engl J Med 337(14): 970-976). En los países en vías de desarrollo, los índices de enfermedad endémica son mucho mayores y durante los casos de epidemia los índices pueden alcanzar hasta 500 casos por cada 100.000 personas al año. La mortalidad es extremadamente alta, del 10-20% en los Estados Unidos y mucho mayor en los países en vías de desarrollo. Después de la presentación de la vacuna conjugada contra Haemophilus influenzae, N. meningitidis es la causa principal de meningitis bacteriana en todas las edades en los Estados Unidos (Schuchat y col (1997) anteriormente).

Según el polisacárido capsular del organismo se han identificado 12 serogrupos de N. meningitidis. El grupo A es el patógeno implicado más a menudo en la enfermedad epidémica en el África Subsahariana. Los serogrupos B y C son responsables de la amplia mayoría de casos en los Estados Unidos y en la mayoría de los países en vías de desarrollo. Los serogrupos W135 e Y son responsables del resto de casos de los Estados Unidos y de los países en vías de desarrollo. La vacuna contra meningococos usada actualmente es una vacuna de polisacárido tetravalente constituida por serogrupos A, C, Y y W135. Aunque es eficaz en adolescentes y en adultos, induce una mala respuesta inmune y una corta duración de la protección y no puede usarse en lactantes [por ejemplo, Morbidity and Mortality weekly report, Vol. 46, Nº RR-5 (1997)]. Esto es debido a que los polisacáridos son antígenos independientes de las células T que inducen una respuesta inmune débil que no puede reforzarse mediante la inmunización repetida. Después del éxito de la vacunación contra H. influenzae, se han desarrollado vacunas conjugadas contra serogrupos A y C y están en la etapa final del ensayo clínico (Zollinger WD "New and Improved Vaccines Against Meningococcal Disease". En: New Generation Vaccines, anteriormente, págs. 469-488; Lieberman y col (1996) anteriormente; Costantino y col (1992) Development
and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A and C. Vaccine 10: 691-698).

Sin embargo, el meningococo B (menB) sigue siendo un problema. Este serotipo es responsable actualmente de aproximadamente el 50% de todas las meningitis en los Estados Unidos, Europa, y Sudamérica. El enfoque de polisacáridos no puede usarse debido a que el polisacárido capsular de menB es un polímero de ácido N-acetil neuramínico con enlace a(2-8) que también está presente en el tejido de los mamíferos. Esto produce tolerancia al antígeno; de hecho, si se provocara una respuesta inmune, seria auto-inmune, y por lo tanto no deseable. Para evitar la inducción de auto-inmunidad y para inducir una respuesta inmune protectora, se ha modificado el polisacárido capsular sustituyendo los grupos N-acetilo con grupos N-propionilo, dejando inalterada la antigenicidad especifica (Romero & Outschoom (1994) Current status of Meningococcal group B vaccine candidates: capsular or non-capsular? Clin Microbiol Rev 7(4): 559-575).

Los enfoques alternaturales para vacunas contra menB han usado mezclas complejas de proteínas de la membrana externa (OMP), que contenían o las OMP en solitario u OMP enriquecidas con porinas o con una deleción en las OMP de clase 4 que se cree inducen anticuerpos que bloquean la actividad bactericida. Este enfoque produce vacunas que no están bien caracterizadas. Éstas son capaces de proteger contra la cepa homóloga, pero no son eficaces a gran escala, ya que existen muchas variantes antigénicas de las proteínas de la membrana externa. Para superar la variabilidad antigénica, se han construido vacunas multivalentes que contienen hasta nueve porinas diferentes (por ejemplo, Poolman JT (1992) Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis, 4: 13-28). Las proteínas adicionales a usar en vacunas de la membrana externa son las proteínas opa y opc, pero ninguno de estos enfoques ha sido capaz de superar la variabilidad antigénica (por ejemplo, Ala'Aldeen & Borriello (1996) The meningococcal transferrin-binding proteins 1 and 2 are both surface exponed and generate bactericidal antibodies capable of killing nomologous and heterologous strains. Vaccine 14(1): 49-53).

Para los genes y proteínas de los gonococos y meningococos están disponibles una cierta cantidad de datos de secuencia (por ejemplo EP-A-0467714, WO 96/29412), pero estos son incompletos. Dempsey y col. (1995) J Bacterial 177: 6390-400, describieron un mapa físico del cromosoma de una cepa del serogrupo A de N. meningitidis y Moxon (1997) Lancet 350: 1240-44, informaron de que las secuencias genómicas de diversos patógenos, incluyendo N. meningitidis, se están determinando. El suministro de otras secuencias podría proporcionar una oportunidad para identificar proteínas secretadas o expuestas en la superficie que se suponen son dianas para el sistema inmune y que no sean variables antigénicamente. Por ejemplo, algunas de las proteínas identificadas podrían ser componentes de vacunas eficaces contra meningococos B y algunas podrían ser componentes de vacunas contra todos los serotipos de meningococos y otras podrían ser componentes de vacunas contra todos las especies de Neisseria patogénicas incluyendo Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae. Estas secuencias específicas para N. meningitidis o N. gonorrhoeae que se conservan mejor, son secuencias preferidas.

Por lo tanto es un objetivo de la invención proporcionar secuencias de ADN de Neisseria que codifiquen proteínas que sean antigénicas o inmunogénicas.

La invención

La invención proporciona proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos de N. meningitidis y las secuencias de aminoácidos de N. gonorrhoeae descritas en los ejemplos.

También proporciona proteínas que comprenden secuencias homólogas (es decir, aquellas que tienen identidad de secuencias) con las secuencias de aminoácidos de N. meningitidis descritas en los ejemplos y que son eficaces para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria. Dependiendo de la secuencia particular, el grado de homología (identidad de secuencia) es preferentemente mayor de 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más). Estas proteínas incluyen mutantes y variantes alélicas de las secuencias descritas en los ejemplos. Normalmente, se considera que 50% de identidad o más entre dos proteínas es una indicación de equivalencia funcional. La identidad entre proteínas se determina preferentemente mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como está implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) usando una búsqueda de huecos afines con parámetros: penalización de hueco 12, penalización de extensión del hueco 1.

La invención también proporciona proteínas que comprenden fragmentos de las secuencias de aminoácidos de N. meningitidis y de las secuencias de aminoácidos de N. gonorrhoeae descritas en los ejemplos. Los fragmentos deben comprender al menos n aminoácidos consecutivos de las secuencias y, dependiendo de la secuencia en particular, n es 8 o más (por ejemplo, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más). Los fragmentos comprenden un epítopo de la secuencia.

Las proteínas de la invención pueden prepararse, por supuesto, por diversos medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación a partir de cultivo celular, síntesis química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo, natural, fusiones, etc.). Éstas se preparan preferentemente en forma sustancialmente pura o aislada (es decir, sustancialmente libres de otras proteínas celulares del huésped de N. meningitidis o N. gonorrhoeae).

De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que se unen a estas secuencias de aminoácidos. Estos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden producirse mediante cualquier medio adecuado.

De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de nucleótidos de N. meningitidis y las secuencias de nucleótidos de N. gonorrhoeae descritas en los ejemplos.

De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan ácidos nucleicos que tienen una identidad de secuencia de más de 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con las secuencias de ácido nucleico de este documento. La identidad de secuencia se determina como se ha descrito anteriormente.

También se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden fragmentos de estas secuencias. Estos deben comprender al menos n nucleótidos consecutivos de las secuencias de N. meningitidis o de las secuencias de N. gonorrhoeae y, dependiendo de la secuencia en particular, n es 12 o más (por ejemplo, 20, 25, 30, 35, 40 o más). De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican las proteínas y los fragmentos de proteínas de la invención.

Debe entenderse también que la invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias complementarias a las descritas anteriormente (por ejemplo, para fines de sondeo antisentido).

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden prepararse, por supuesto, de diversas maneras (por ejemplo, mediante síntesis química, en todo o en parte, a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, a partir del propio organismo, etc.) y pueden tener diversas formas (por ejemplo, de cadena sencilla, de doble cadena, vectores, sondas, etc.).

Además, la expresión "ácido nucleico" incluye ADN y ARN y también sus análogos, tales como los que contienen estructuras modificadas, y también ácidos péptido nucleicos (APN) etc.

De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona vectores que comprenden nucleótidos de la invención (por ejemplo, vectores de expresión) y células huésped transformadas con dichos vectores.

De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden proteínas, anticuerpos y/o ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Estas composiciones pueden ser adecuadas como vacunas, por ejemplo, o como reactivos de diagnóstico o como composiciones inmunogénicas.

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La invención también proporciona un ácido nucleico, proteína o anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso como medicamentos (por ejemplo, como vacunas) o como reactivos de diagnóstico. La invención también proporciona el uso de un ácido nucleico, proteína o anticuerpo de acuerdo con la invención en la fabricación de (I) un medicamento para prevenir la infección debida a bacterias de Neisseria (ii) un reactivo de diagnóstico para detectar la presencia de bacterias de Neisseria o de anticuerpos generados contra bacterias de Neisseria o (iii) para generar anticuerpos. Dichas bacterias de Neisseria pueden ser de cualquier especie o cepa (tales como N. gonorrhoeae) pero son preferentemente N. meningitidis, especialmente del serogrupo B o el serogrupo C.

Un procedimiento para tratar a un paciente, puede implicar administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente eficaz de un ácido nucleico, proteína y/o anticuerpo de acuerdo con la invención.

Se proporciona un procedimiento para producir proteínas de la invención, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped de acuerdo con la invención en condiciones que inducen la expresión de proteínas.

Se adjunta un resumen de técnicas y procedimientos convencionales que pueden emplearse para poner en practica la invención (por ejemplo, para utilizar las secuencias descritas para fines de vacunación o de diagnóstico) como un Apéndice de la solicitud. Este resumen proporciona ejemplos que pueden usarse.

Habiendo descrito de forma general la invención, ésta se entenderá más fácilmente en referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración.

Metodología - Resumen de procedimientos y técnicas convencionales General

Esta invención proporciona secuencias de nucleótidos de menB de Neisseria meningitidis, secuencias de aminoácidos codificadas en su interior. Con estas secuencias descritas, pueden producirse ensayos de sondas de ácidos nucleicos y casetes y vectores de expresión. Los vectores de expresión pueden transformarse en células huésped para producir proteínas. Los polipéptidos purificados o aislados (que también pueden sintetizarse químicamente) pueden usarse para producir anticuerpos para detectar proteínas de menB. Además, las células huésped o sus extractos pueden utilizarse para ensayos biológicos para aislar agonistas o antagonistas. Además, con estas secuencias puede buscarse la identificación de marcos de lectura abierta e identificar secuencias de aminoácidos. Las proteínas también pueden usarse en composiciones inmunogénicas, composiciones antigénicas y como componentes de vacuna.

La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro del alcance de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, por ejemplo, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, segunda edición (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Traslation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzimes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); The Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc), especialmente volumen 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Segunda edición (Springer-Verlag, N.Y.), y Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds 1986).

En esta memoria descriptiva se usan abreviaturas convencionales para los nucleótidos y los aminoácidos.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en este documento se incorporan en su totalidad por referencia.

Sistemas de Expresión

Las secuencias de nucleótidos de menB de Neisseria pueden expresarse en diversos sistemas de expresión diferentes; por ejemplo los utilizados con células de mamífero, células vegetales, baculovirus, bacterias y levaduras.

i. Sistemas de Mamíferos

En la técnica se conocen sistemas de expresión en mamíferos. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de ADN capaz de unir la ARN polimerasa de mamíferos e iniciar la trascripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por ejemplo un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la trascripción, que se sitúa normalmente en posición proximal al extremo 5' de la secuencia codificante y una caja TATA, normalmente situada 25-30 pares de bases (pb) cadena arriba del sitio de inicio de la trascripción. Se cree que la caja TATA dirige la ARN polimerasa II para que comience la síntesis de ARN en el sitio correcto. Un promotor de mamífero también contendrá un elemento promotor cadena arriba, situado normalmente en 100 o 200 pb cadena arriba de la caja TATA. Un elemento promotor cadena arriba determina el índice con el que se inicia la trascripción y puede actual en cualquier orientación (Sambrook y col (1989) "Expression of Clone Genes in Mammalian Cells" In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed.).

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Los genes virales de mamífero se expresan a menudo en gran cantidad y tienen un amplio intervalo de huéspedes; por lo tanto las secuencias que codifican genes virales de mamífero proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen el promotor temprano SV40, el promotor LTR del virus de tumor mamario de ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP), y el promotor del virus herpes simplex. Además, las secuencias obtenidas de genes no virales, tales como el gen de metalotioneína de ratón, también proporcionan secuencias promotoras útiles. La expresión puede ser constitutiva o regulada (inducible). Dependiendo del promotor seleccionado, muchos promotores pueden inducirse usando sustratos conocidos, tales como usando el virus de tumor mamario de ratón (MMTV) con el elemento sensible a glucocorticoides (GRE) que se induce mediante glucocorticoides en células transformadas sensibles a hormonas (véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.783.681).

La presencia de un elemento potenciador (potenciador), combinado con los elementos promotores descritos anteriormente, normalmente aumentará los niveles de expresión. Un potenciador es una secuencia de ADN reguladora que puede estimular la trascripción hasta 1.000 veces cuando se une a promotores homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis en el sitio de inicio del ARN normal. Los potenciadores también son activos cuando se sitúan cadena arriba o cadena abajo del sitio de inicio de la trascripción, en orientación normal o invertida o a una distancia de más de 1.000 nucleótidos del promotor (Maniatis y col. (1987) Science 236: 1237; Alberts y col. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2ª ed.). Los elementos potenciadores obtenidos a partir de virus pueden ser particularmente útiles, debido a que normalmente tienen un intervalo de huéspedes más amplio. Los ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano de SV40 (Dijkema y col. (1985) EMBO J. 4: 761) y los potenciadores/promotores obtenidos de la repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Gorman y col. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777) y del citomegalovirus humano (Boshart y col. (1985) Cell 41: 521). Además, algunos potenciadores son regulables y se vuelven activos solamente en presencia de un inductor, tal como una hormona o un ión metálico (Sassone-Corsi y Borelli (1986) Trends Genet. 2: 215; Maniatis y col. (1987) Science 236: 1237).

Una molécula de ADN puede expresarse de forma intracelular en células de mamífero. Una secuencia promotora puede unirse directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, el extremo N puede escindirse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Como alternatural, las proteínas extrañas también pueden secretarse a partir de la célula al medio de cultivo creando moléculas de ADN quiméricas que codifiquen una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia líder que posibilita la secreción de la proteína extraña en células de mamífero. Preferentemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que pueden escindirse in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia líder codifica normalmente un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula. El líder tripartito de adenovirus es un ejemplo de una secuencia líder que posibilita la secreción de una proteína extraña en células de mamífero.

Normalmente, las secuencias de terminación de la trascripción y de poliadenilación reconocidas por las células de mamífero son regiones reguladoras situadas en posición 3' con respecto al codón de terminación de la producción y por lo tanto, junto con los elementos promotores flanquean a la secuencia codificante. El extremo 3' del ARNm maduro se forma mediante escisión y poliadenilación postrascripcional y específica de sitio (Bimstiel y col. (1985) Cell 41: 349; Proudfoot y Whitelaw (1988) ``Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. En Transcription and splicing (ed. B.D. Hames y D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14: 105). Estas secuencias dirigen la trascripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de señales de terminación de la trascripción/poliadenilación incluyen los obtenidos de SV40 (Sambrook y col. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

Normalmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, secuencia de poliadenilación y secuencia de terminación de la trascripción se colocan conjuntamente en construcciones de expresión. También pueden incluirse si se desea, en una construcción de expresión, potenciadores, intrones con sitios donadores y aceptores de corte y empalme funcionales y secuencias líderes. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz del mantenimiento estable en un huésped, tal como células de mamífero o bacterias. Los sistemas de replicación en mamíferos incluyen los obtenidos a partir de virus animales, que requieren factores que actúen en dirección trans para replicarse. Por ejemplo, los plásmidos que contienen el sistema de replicación de papovavirus, tales como SV40 (Gluzman (1981) Cell 23: 175) o poliomavirus, se replican a un número de copias extremadamente alto en presencia del antígeno T viral apropiado. Los ejemplos adicionales de replicones de mamífero incluyen los obtenidos de papilomavirus bovino y del virus Epstein-Barr. Además, el replicón puede tener dos sistemas de replicación, lo que le permite mantenerse, por ejemplo, en células de mamífero para su expresión y en un huésped procariota para clonación y amplificación.

Los ejemplos de dichos vectores lanzadera mamífero-bacteria incluyen pMT2 (Kaufman y col. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946) y pHEBO (SHimizu y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074).

El procedimiento de transformación utilizado depende del huésped a transformar. Los procedimientos para la introducción de los polinucleótidos heterólogos en las células de mamífero se conocen en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación por fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC, Colección Americana de Cultivos Tipo), incluyendo aunque sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y varias líneas celulares diferentes.

ii. Sistemas de Expresión de Células Vegetales

Existen muchos sistemas de expresión genética en cultivo de células vegetales y en plantas completas conocidos en la técnica. Los sistemas de expresión genética en células vegetales ejemplares incluyen los que se describen en patentes tales como: U.S. 5.693.506; U.S. 5.659.122; y U.S. 5.608.143. Ejemplos adicionales de expresión genética en cultivo de células vegetales se han descrito por Zenk, Phytochemistry 30: 3861-3863 (1991). Además pueden encontrarse descripciones de péptidos señal de proteínas vegetales además de en la bibliografía descrita anteriormente en Vaulcombe y col. Mol. Gen. Genet. 209: 33-40 (1987); Chandler y col., Plant Molecular Biology 3: 407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985); Rothstein y col., Gene 55: 353-356 (1987); Whittier y col., Nucleic Acids Research 15: 2515-2535 (1987); Wirsel y col., Molecular Microbiology 3: 3-14 (1989); Yu y col., Gene 122: 247-253 (1992). Una descripción de la regulación de expresión de genes vegetales mediante la fitohormona ácido giberélico y las enzimas secretadas inducidas por el ácido giberélico puede encontrarse en los documentos de R.L. Jones y J. MacMillin, Gibberellins: en: Advanced Plant Physiology. Malcolm B. Winkins, ed., 1984 Pitman Publiching Limited, London págs. 21-52. Bibliografía que describe otros genes regulados metabólicamente: Seen, Plant Cell, 2: 1027-1038 (1990); Maas y col., EMBO J. 9: 3447-3452 (1990); Benkel y Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1337-1339 (1987).

Normalmente, usando técnicas conocidas en la técnica, se inserta una secuencia de polinucleótidos deseada en una casete de expresión que comprende elementos reguladores genéticos diseñados para el funcionamiento en plantas. La casete de expresión se inserta en un vector de expresión deseado con secuencias acompañantes cadena arriba y cadena debajo de la casete de expresión adecuada para la expresión en un huésped vegetal. La secuencias acompañantes serán de origen viral o de un plásmido y proporcionan las características necesarias para el vector para permitirle trasladar el ADN de un huésped de clonación original, tal como una bacteria, al huésped vegetal deseado. La construcción vector-bacteria/planta básica proporcionará preferentemente un amplio intervalo de huéspedes, un origen de replicación procariota; un marcador seleccionable procariota y, para transformaciones en Agrobacterium, secuencias de ADN T para la transferencia mediada por Agrobacterium a cromosomas vegetales. Cuando el gen heterólogo no puede detectarse fácilmente, la construcción tendrá preferentemente un gen marcador seleccionable adecuado para determinar si una célula vegetal se ha transformado. Una revisión general de los marcadores adecuados, por ejemplo para los miembros de la familia de las gramíneas, se encuentra en el documento Wilmink y Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11 (2): 165-185.

También se recomiendan las secuencias adecuadas para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la planta. Estas pueden incluir secuencias del transposón y similares para recombinación homóloga así como secuencias Ti que permiten la inserción aleatoria de una casete de expresión heteróloga en un genoma vegetal. Los marcadores seleccionables procariotas adecuados incluyen de resistencia a antibióticos tales como ampicilina o tetraciclina. También pueden estar presentes en el vector, otras secuencias de ADN que codifican funciones adicionales, como se conocen en la técnica.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden incluirse en una casete de expresión para la expresión de las proteínas de interés. Normalmente, solamente habrá una casete de expresión, aunque pueden proporcionarse dos o más. La casete de expresión recombinante contendrá, además de la secuencia que codifica la proteína heteróloga, los siguientes elementos, una región promotora, secuencias sin traducir 5' vegetales, un codón de inicio dependiendo de si el gen estructural viene o no equipado con uno, y una secuencia de terminación de la trascripción y de la traducción. Los sitios de restricción enzimática únicos en los extremos 5' y 3' de la casete permiten la fácil inserción en un vector pre-existente.

Una secuencia codificante heteróloga puede ser para cualquier proteína relacionada con la presente invención. La secuencia que codifica la proteína de interés codificará un péptido señal que permitirá el procesamiento y la translocación de la proteína, según sea apropiado, y carecerá normalmente de cualquier secuencia que pudiera dar como resultado la unión de la proteína deseada de la invención a una membrana. Ya que, para la mayoría, la región de inicio de la trascripción será la de un gen que se expresa y se transloca durante la germinación, empleando el péptido señal que posibilita la translocación, también puede posibilitarse la translocación de la proteína de interés. De este modo, las proteínas de interés se translocarán a partir de las células en las que se expresan y pueden recogerse de forma eficaz. La secreción típica en las semillas es a través de la aleurona o del epitelio del escutelo al endospermo de la semilla. Aunque no es necesario que la proteína se secrete a partir de las células en las que se produce, esto facilita el aislamiento y la purificación de la proteína recombinante.

Puesto que la expresión definitiva del producto génico deseado se realizará en una célula eucariota es deseable determinar si cualquier porción del gen clonado contiene secuencias que se procesarán como intrones por la maquinaria de corte y empalme del huésped, si esto fuera así, puede realizarse mutagénesis dirigida de la región "intrón" para evitar la perdida de una porción del mensaje genético en forma de falso código intrón, Reed y Maniatis, Cell 41: 95-105, 1985.

El vector puede microinyectarse directamente en células vegetales mediante el uso de micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genet, 202: 179-185, 1985. El material genético también puede transferirse a la célula vegetal usando polietilenglicol, Krens y col., Nature, 296, 72-74, 1982. Otro procedimiento de introducción de segmentos de ácido nucleico es la penetración balística a alta velocidad mediante pequeñas partículas con el ácido nucleico dentro de la matriz de pequeñas perlas o partículas o en la superficie, Klein y col., Nature, 327, 70-73, 1987 y Knudsen y Muller, 1991, Planta, 185: 330-336, muestran el bombardeo de partículas del endospermo de cebada para crear cebada transgénica. Otro procedimiento de introducción sería la fusión de protoplastos con otras entidades, minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos con superficie lipídica que puede fundirse, Fraley, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863, 1982.

El vector también puede introducirse en las células vegetales mediante electroporación (Fromm y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824, 1985). En esta técnica, los protoplastos vegetales se electroporan en presencia de plásmidos que contienen la construcción génica. Los impulsos eléctricos de alto potencial iónico permeabilizan de forma reversible las membranas biológicas permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos vegetales electroporados vuelven a formar la pared celular, se dividen y forman callos vegetales.

Todas las plantas a partir de las que pueden aislarse y cultivarse protoplastos para proporcionar plantas regeneradas completas pueden transformarse mediante la presente invención de modo que se recuperen plantas completas que contienen el gen transferido. Se sabe que prácticamente todas las plantas pueden regenerarse a partir de células o tejidos cultivados, incluyendo aunque sin limitación las especies de caña de azúcar, remolacha de azúcar, algodón, fruta y otros árboles, legumbres y verduras. Algunas plantas adecuadas incluyen por ejemplo las especies de los géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapsis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lollum, Zea, Triticum, Sorghum, y Datura.

Los medios de regeneración varían entre especie y especie vegetales, pero generalmente se proporciona en primer lugar una suspensión de protoplastos transformados que contienen copias del gen heterólogo. Se forma tejido calloso y pueden inducirse brotes a partir de los callos, que posteriormente pueden sembrarse. Como alternatural, puede inducirse la formación de embriones a partir de la suspensión de protoplastos. Estos embriones germinan como los embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo contendrán generalmente diversos aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citocininas. También es ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y alfalfa. Los brotes y las raíces se desarrollan normalmente de forma simultánea. La regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo, y del historial del cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces la regeneración es totalmente reproducible y repetible.

En algunos sistemas de cultivo de células vegetales, la proteína deseada de la invención puede excretarse o, como alternatural, la proteína puede extraerse a partir de la planta completa. En los casos en los que la proteína de la invención se secreta al medio, ésta puede recogerse. Como alternatural, los embriones y las semillas sin embrión u otro tejido vegetal, pueden extraerse mecánicamente para liberar cualquier proteína secretada entre las células y los tejidos. La mezcla puede suspenderse en una solución tampón para recuperar las proteínas solubles. Después se utilizarán procedimientos convencionales de aislamiento y purificación de proteínas para purificar la proteína recombinante. Los parámetros de tiempo, temperatura, pH, oxígeno y volumen se ajustarán mediante procedimientos rutinarios para optimizar la expresión y la recuperación de la proteína heteróloga.

iii. Sistemas de Baculovirus

El polinucleótido que codifica la proteína también puede insertarse en un vector de expresión en insectos adecuado, y se une de forma operativa a los elementos de control dentro de este vector. La construcción de vectores emplea técnicas que se conocen en la técnica. Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, normalmente un plásmido bacteriano, que contiene un fragmento del genoma de baculovirus y un sitio de restricción adecuado para la inserción del gen o genes heterólogos a expresar; un baculovirus de tipo natural con una secuencia homóloga al fragmento específico de baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma del baculovirus); y células huésped de insecto y medios de cultivo apropiados.

Después de insertar la secuencia de ADN que codifica la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo natural se transfieren a una célula huésped de insecto en la que se permite que el vector y el genoma viral recombinen. El virus recombinante encapsulado se expresa y se identifican y se purifican placas recombinantes. Los materiales y los procedimientos para sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto están disponibles en el mercado en forma de kit de entre otros, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac"). Estas técnicas las conocen en general los expertos en la materia y se describen completamente en el documento de Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555 (1987) (en lo sucesivo en este documento "Summers y Smith").

Antes de la inserción de la secuencia de ADN que codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, una secuencia líder (si se desea), la secuencia codificante de interés y la secuencia determinación de la transcripción, se ensamblan normalmente en una construcción de translocación intermedia (vector de transferencia). Esta construcción puede contener un único gen y elementos reguladores unidos de forma operativa; múltiples genes, cada uno con su propio conjunto de elementos reguladores unidos de forma operativa; o múltiples genes, regulados por el mismo conjunto de elementos reguladores. Las construcciones de translocación intermedias se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de mantenerse de forma estable en un huésped tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, que le permitirá mantenerse en un huésped adecuado para la clonación y la amplificación.

Actualmente, el vector de transferencia usado más comúnmente para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. También se han diseñado muchos otros vectores, conocidos por los expertos en la materia. Estos incluyen, por ejemplo pVL985 (que altera el codón de inicio polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación BamHI 32 pares de bases cadena abajo del ATT; véase Luckow y Summers, Virology (1989), 17: 31.

El plásmido normalmente también contiene la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller y col., (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42: 177) y un gen de resistencia a ampicilina procariota (amp) y un origen de replicación para la selección y propagación en E. coli.

Los vectores de transferencia de baculovirus contienen normalmente un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción cadena abajo (5' a 3') de una secuencia codificante (por ejemplo gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que se sitúa normalmente en posición proximal con respecto al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus también puede contener un segundo dominio llamado potenciador que, si está presente, está normalmente en posición distal con respecto al gen estructural. La expresión puede ser regulada o constitutiva.

Los genes estructurales, que normalmente se transcriben en un ciclo de infección vírica, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias obtenidas a partir del gen que codifica una proteína de poliedro viral, Friesen y col., (1996) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression" en: ``The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler): Publicación EPO Nº 127 839 y 155 476; y el gen que codifica la proteína p10, Vlak y co., (1988), J. Gen. Virol. 69: 765.

El ADN que codifica secuencias señal adecuadas puede obtenerse de genes para proteínas de insecto o de baculovirus secretadas, tales como el gen de la polihedrina de baculovirus (Carbonell y col. (1988) Gene, 73: 409). Como alternatural, como las señales para las modificaciones post-traduccionales de células de mamífero (tales como la escisión de un péptido señal, escisión proteolítica, y fosforilación) parecen ser reconocidas por las células de insecto, y las señales necesarias para la secreción y la acumulación nuclear también parecen conservarse entre células de invertebrados y células de vertebrados, también pueden usarse para proporcionar secreción en insectos, líderes de origen no de insecto, tales como los obtenidos de los genes que codifican interferón-\alpha (alfa) humano, Maeda y col., (1986), Nature 315: 592; péptido de liberación de gastrina humana, Lebacq-Verheyden y col., (1988), Molec. Cell. Biol. 8: 3129; IL-2 humana, Smith y col., (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82: 8404; IL-3 de ratón, (Miyajima y col., (1987) Gene 58: 273; y glucocerebrosidasa humana; Martin y col., (1988) DNA, 7: 99.

Un polipéptido o poliproteína recombinante puede expresarse de forma intracelular o, si se expresa con las secuencias reguladoras apropiadas, puede secretarse. La expresión intracelular adecuada de proteínas extrañas sin fusionar normalmente requiere gene heterólogos que idealmente tienen una secuencia líder corta que contiene señales de inicio de la traducción adecuadas precediendo a una señal de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína madura mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Como alternatural, las poliproteínas o proteínas recombinantes que no se secretan de forma natural pueden secretarse a partir de la célula de insecto creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia líder que posibilita la secreción de las proteínas extrañas en insectos. El fragmento de secuencia líder codifica normalmente un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la translocación de la proteína al retículo endoplasmático. Después de la inserción de la secuencia de ADN y/o del gen que codifica el precursor del producto de expresión de la proteína, una célula huésped de insecto se co-transforma con el ADN heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico del baculovirus de tipo natural, normalmente mediante co-transfección. El promotor y la secuencia de terminación de la transcripción de la construcción estarán constituidos normalmente por una sección de 2-5 kb del genoma del baculovirus. Los procedimientos para introducir ADN heterólogo en el sitio deseado en el baculovirus se conocen en la técnica. (Véase Summers y Smith anteriormente; Ju y col., (1987; Smith y col., Mol. Cell. Biol. (1983), 3: 2156: y Luckow y Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de polihedrina, mediante recombinación homóloga de doble entrecruzamiento; la inserción también puede realizarse en un sitio de restricción enzimática introducido en el gen de baculovirus deseado. Miller y col., (1989), Bioessays, 4: 91. La secuencia de ADN, cuando se clona en lugar del gen de polihedrina en el vector de expresión, está flanqueada tanto en 5' como en 3' por secuencias específicas de polihedrina y se coloca cadena abajo del promotor de polihedrina.

El vector de expresión de baculovirus recién formado se introduce posteriormente en un baculovirus recombinante infeccioso. La recombinación homóloga se produce a baja frecuencia (entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%); por lo tanto, la mayor parte del virus producido después de la co-transfección sigue siendo virus de tipo natural. Por lo tanto, es necesario un procedimiento para identificar virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es una selección visual que permite distinguir virus recombinantes. La proteína polihedrina, que es producida por el virus natural, se produce a niveles muy altos en los núcleos de las células infectadas en las etapas tardías después de la infección vírica. La proteína polihedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que también contienen partículas incluidas. Estos cuerpos de oclusión, tienen gran capacidad de refracción, lo que les proporciona una apariencia brillante que se visualiza fácilmente en el microscopio óptico. Las células infectadas con virus recombinante carecen de cuerpos de oclusión. Para distinguir los virus recombinante de los virus de tipo natural, se coloca el sobrenadante de transfección en placas en una monocapa de células de insecto mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Concretamente, las placas se exploran en el microscopio óptico para detectar la presencia (indicativa de virus de tipo natural) o ausencia (indicativa de virus recombinantes) de cuerpos de oclusión. Current Protocols in Microbiology Vol. 2 (Ausubel y col., eds) a 16.8 (Supp. 10, 1990), Summers y Smith, anteriormente, Miller y col., (1989).

Se han desarrollado vectores de expresión en baculovirus recombinantes para la infección de varias células de insecto. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para entre otros Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia nl (publicación PCT Nº WO 89/046699; Carbonell y col., (1985) J. Virol. 56: 153, Wright (1986) Nature 321: 718; Smith y col., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156: y véase generalmente, Fraser y col. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).

Las células y los medios de cultivo celular están disponibles en el mercado para la expresión directa y de fusión de polipéptidos heterólogos en un sistema de expresión de baculovirus; la tecnología del cultivo celular es conocida generalmente por los expertos en la materia. Véase por ejemplo Summers y Smith anteriormente.

Las células de insecto modificadas pueden cultivarse en un medio nutriente adecuado, lo que permite el mantenimiento estable del(los) plásmido(s) presente(s) en el huésped insecto modificado. Cuando el gen producido por la expresión está bajo un control inducible, el huésped puede crecer hasta una alta densidad y puede inducirse la expresión. Como alternatural, cuando la expresión es constitutiva, el producto se expresará de forma continua en el medio y el medio nutriente debe circular de forma continua, mientras se retira el producto de interés y se aumentan los nutrientes agotados. El producto puede purificarse mediante técnicas tales como cromatografía, por ejemplo HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc., electroforesis; centrifugado por gradiente de densidad; extracción del disolvente o similares. Según sea apropiado, el producto puede purificarse adicionalmente para eliminar sustancialmente cualquier proteína de insecto que pudiera secretarse al medio o pudiera resultar de la lisis de células de insectos, para proporcionar un producto que esté al menos sustancialmente libre de restos del huésped, por ejemplo, proteínas, lípidos y polisacáridos.

Para obtener la expresión de las proteínas, se incuban las células huésped recombinantes obtenidas de los transformantes en condiciones que permiten la expresión de la secuencia que codifica la proteína recombinante. Estas condiciones variarán dependiendo de la célula huésped seleccionada. Sin embargo, las condiciones pueden determinarlas fácilmente los expertos en la materia, de acuerdo con lo que se conocen en la técnica.

iv. Sistemas Bacterianos

En la técnica se conocen métodos de expresión bacteriana. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por ejemplo gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que se sitúa normalmente en posición proximal con respecto al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión a la ARNm polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano también tendrá un segundo dominio llamado operador, que puede solaparse con un sitio de unión de ARN polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción regulada negativamente (inducible), ya que una proteína represora del gen puede unirse al operador y por lo tanto inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede producirse en presencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, puede conseguirse la regulación positiva mediante una secuencia de unión a la proteína activadora del gen, que, si está presente, está normalmente en posición proximal (5') con respecto a la secuencia de unión a la ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora del gen es la proteína activadora del catabolito (CAP), que ayuda al inicio de la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) (Raibaud y col., (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173). Por lo tanto la expresión regulada puede ser positiva o negativa, potenciando o reduciendo de este modo la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de rutas metabólicas proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras obtenidas de enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac), (Chang y col., (1977) Nature 198: 1056) y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras obtenidas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) (Goeddel y col., (1980) Nuc. Acids Res 8: 4057; Yelverton y col., (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731, Patente de Estados Unidos 4.738.921; Publicación EPO Nº 036 776 y 121 775). El sistema promotor de beta-lactamasa (bla) (Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes" En Interferon 3 (ed. I. Gresser)), y los sistemas promotores de bacteriófago lambda PL (Shimatake y col., (1981) Nature 292: 128) y T5 (Patente de Estados Unidos 4.689.406) también proporcionan secuencias promotoras útiles.

Además, los promotores sintéticos que no se encuentran en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago pueden unirse con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético (Patente de Estados Unidos 4.551.433). Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido constituido por el promotor trp y las secuencias del operón lac que está regulado por el represor lac (Amann y col., (1983) Gene 25: 167; de Boer y col, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21). Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural de origen no bacteriano que tengan la capacidad de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor de origen natural de origen no bacteriano puede acoplarse también con una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema de ARN polimerasa/promotor del bacteriófago T7 es un ejemplo de un sistema promotor acoplado (Studier y col., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113, Tabor y col., (1985) Proc Natl Acad. Sci. 82: 1074). Además, un promotor híbrido puede estar constituido también por un promotor bacteriófago y una región operadora de E. coli (publicación EPO Nº 267 851).

Además de la secuencia promotora en funcionamiento, un sitio de unión al ribosoma eficaz también es útil para la expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli, el sitio de unión al ribosoma se denomina la secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud situada 3-11 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio (Shine y col., (1975) Nature 254: 34). Se piensa que la secuencia SD promueve la unión del ARNm al ribosoma emparejando bases entre la secuencia SD y el extremo 3' del ARNr 16S de E. coli (Steitz y col., (1979) ``Genetic signals and nucleotide sequences in Messenger RNA" En Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)). Para expresar genes eucariotas y genes procariotas con un sitio de unión débil al ribosoma, a menudo es necesario optimizar la distancia entre la secuencia SD y el ATG del gen eucariota (Sambrook y col., (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli. En Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

Una molécula de ADN puede expresarse de forma intracelular. Una secuencia promotora puede unirse de forma directa con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vitro o in vivo con una peptidasa N terminal de metionina bacteriana (Publicación EPO Nº 219 237).

Las proteínas de fusión proporcionan una alternatural a la expresión directa. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se fusiona con el extremo 5' de secuencias codificantes heterólogas. Después de la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de la célula del bacteriófago lambda puede unirse en el extremo 5' de un gen extraño y puede expresarse en bacterias. La proteína de fusión resultante conserva preferentemente un sitio para una enzima de procesamiento (factor Xa) para escindir la proteína del bacteriófago del gen extraño (Nagai y col. (1984) Nature 309: 810). Las proteínas de fusión también pueden prepararse con secuencias de los genes lacZ (Jia y col. (1987) Gene 60: 197), trpE (Allen y col., (1987) J. Biotechnol. 5: 93: Makoff y col., (1989) J. Gen. Microbiol. 135: 11) y Chey (Publicación EPO Nº 324 647). Las secuencias de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos pueden codificar o no un sitio escindible. Otro ejemplo es una proteína de fusión a ubiquitina. Dicha proteína de fusión se prepara con la región de ubiquitina que conserva preferentemente un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, una proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. A través de este procedimiento, puede aislarse una proteína extraña natural (Miller y col. (1989) BiolTechnology 7: 698).

Como alternatural, también pueden secretarse de la célula proteínas extrañas creando moléculas de ADN quiméricas que codifiquen una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia de péptido señal que posibilita la secreción de la proteína extraña en bacterias (Patente de Estados Unidos 4.336.336). El fragmento de secuencia señal normalmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula. La proteína se secreta en el medio de cultivo (bacterias gram positivas) o el espacio periplasmático situado entre la membrana interna y externa de la célula (bacterias gram negativas). Preferentemente existen sitios de procesamiento, que puede escindirse in vivo o in vitro codificados entre el fragmento de péptido señal y el gen extraño.

El ADN que codifica secuencias de señal adecuadas puede obtenerse de genes para proteínas bacterianas secretadas, tales como el gen de la proteína de la membrana externa de E. coli (ompA) (Masui y col., (1983), en Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb y col. (1984) EMBO J. 3: 2437) y la secuencia señal de fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) (Oka y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sic. 82: 7212). Como ejemplo adicional, puede usarse la secuencia señal del gen de alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus para secretar proteína heterólogas de B. subtilis (Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; publicación EPO Nº 244 042).

Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras situadas en posición 3' con respecto al codón de terminación de la traducción y por lo tanto junto con el promotor flanquean a la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras en bucle que ayudan a terminar la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción obtenidas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos.

Normalmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, secuencia señal (si se desea) secuencia codificante de interés y secuencia de terminación de la transcripción, se colocan de forma conjunta en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo plásmido) capaz de mantenerse de forma estable en un huésped, tal como bacterias. Este replicón tendrá un sistema de replicación, que le permite por lo tanto mantenerse en un huésped procariota para expresión o para clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido de un alto o bajo número de copias. Un plásmido de elevado número de copias tendrá generalmente un número de copias que varía entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 y normalmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de elevado número de copias contendrá preferentemente al menos aproximadamente 10 y más preferentemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede seleccionarse un vector de alto o bajo número de copias, dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña sobre el huésped.

Como alternatural, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración contienen normalmente al menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. La integración parece ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (publicación EPO Nº 127 328). Los vectores de integración también pueden estar constituidos por secuencias de bacteriófagos o del transposón.

Normalmente, las construcciones extracromosómicas y de integración de la expresión pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que se hayan transformado. Los marcadores seleccionables pueden expresarse en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que hacen a las bacterias resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina (Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469). Los marcadores seleccionables también pueden incluir genes biosintéticos, tales como los de las rutas de histidina, triptófano y leucina.

Como alternatural, algunos de los componentes descritos anteriormente pueden colocarse conjuntamente en vectores de transformación. Los vectores de transformación están constituidos normalmente por un marcador seleccionable que se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se ha descrito anteriormente.

Los vectores de expresión y transformación, ya sean replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para la transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para entre otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis (Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582: publicación EPO Nº 036 259 y 063 953; Publicación PCT Nº WO 84/04541), Escherichia coli (Shimatake y col., (1981) Nature 292: 128; Amman y col., (1985) Gene 40: 183: Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Publicación EPO Nº 036 776, 135 829 y 136 907), Streptococus cremoris (Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655); Streptococcus lividans (Powell y col., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655), Streptomyces lividans (Patente de Estados Unidos Nº 4.745.056).

Los procedimientos para introducir ADN exógeno en huéspedes bacterianos se conocen bien en la técnica, e incluyen normalmente la transformación de una bacteria tratada con CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. También puede introducirse ADN en células bacterianas mediante electroporación. Los procedimientos de transformación varían normalmente con las especies bacterianas a transformar. (Véase por ejemplo uso de Bacillus: Masson y col. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273, Palva y col., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; Publicación EPO Nº 036 259 y 063 953; Publicación PCT Nº WO 84/04541; uso de Campylobacter, Miller y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856, y Wang y col. (1990) J. Bacteriol. 172: 949; uso de Escherichia coli: Cohen y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110: Dower y col. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. En Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col., (1970) J. Mol. Biol. 53: 159: Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318, uso de Lactobacillus: Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44: 173, uso de Pseudomonas: Fiedler y col., (1988) Anal. Biochem 170: 38, uso de Staphylococcus: Augustin y col. (1990) FEMs Microbiol. Lett. 66: 203; uso de Streptococcus: Barany y col. (1980) J. Bacteriol, 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, en Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry y col., (1981) Infect. Immun. 32: 1295; Powell y col., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti y col., (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412.

v. Expresión en levaduras

Los sistemas de expresión en levaduras también son conocidos por los expertos en la materia. Un promotor de levadura es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que se sitúa normalmente en posición proximal con respecto al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión a la ARNm polimerasa (la "caja TATA") y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor de levadura también puede contener un segundo dominio denominado secuencia activadora cadena arriba (UAS), que, si está presente, está normalmente en posición distal con respecto al gen estructural. La UAS permite la expresión regulada (inducible). La expresión constitutiva se produce en ausencia de una UAS. La expresión regulada puede ser positiva o negativa, potenciando o reduciendo de este modo la transcripción.

La levadura es un organismo fermentador con una ruta metabólica activa, por lo tanto las secuencias que codifican enzimas en la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen alcohol deshidrogenasa (ADH) (Publicación EPO Nº 284 044), enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, (GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfoglicerato mutasa y piruvato quinasa (PyK) (Publicación EPO Nº 329 203). El gen PHO5 de levadura, que codifica fosfatasa ácida, también proporciona secuencias promotoras útiles (Myanohara y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1).

Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también funcionan como promotores de levaduras. Por ejemplo, las secuencias UAS de un promotor de levadura pueden unirse con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de dichos promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora ADH unida a la región de activación de la transcripción GAP (Patentes de Estados Unidos Nº 4.876.197 y 4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que están constituidos por las secuencias reguladoras de los genes ADH2, GAL4, GAL10, o PHO5, combinadas con la región de activación del a transcripción de un gen de la enzima glicolítica tal como GAP o PyK (Publicación EPO Nº 164 556). Además, un promotor de levadura puede incluir promotores de origen natural de origen no de levadura que tengan la capacidad de unirse a la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Los ejemplos de dichos promotores incluyen entre otros (Cohen y col. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff y col. (1981) Nature 283: 835: Hollenberg y col. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 119; Hollenberg y col. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," en Plasmids of Medical, Environmental and Comercial Importante (eds. K.N. Timmis y A. Puhler); Mercerau-Puigalon y col. (1980) Gene 11: 163; Panthier y col. (1980) Curr. Genet. 2: 109).

Una molécula de ADN puede expresarse de forma intracelular en una levadura. Una secuencia promotora puede unirse de forma directa con la molécula de ADN, en cuyo caso, el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Las proteínas de fusión proporcionan una alternatural para los sistemas de expresión en levadura, así como en sistemas de expresión en mamíferos, vegetales, en baculovirus y bacterianos. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N terminal de una proteína de levadura endógena, u otra proteína estable, se fusiona con el extremo 5' de las secuencias codificante heterólogas. Después de la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, la levadura del gen de la superóxido dismutasa humana (SOD), puede unirse en el extremo 5' de un gen extraño y expresarse en levadura. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede codificar o no un sitio escindible. Véase por ejemplo, Publicación EPO Nº 196056. Otro ejemplo es una proteína de fusión a ubiquitina. Dicha proteína de fusión se prepara con la región de ubiquitina que preferentemente conserva un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. Por lo tanto a través de este procedimiento, puede aislarse una proteína extraña natural (por ejemplo WO 88/024066).

Como alternatural, también pueden secretarse proteínas extrañas a partir de la célula a los medios de cultivo creando moléculas de ADN quiméricas que codifiquen una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia líder que posibilita la secreción en levaduras de la proteína extraña. Preferentemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que pueden escindirse in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia líder normalmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula.

El ADN que codifica péptidos señal adecuados puede obtenerse de genes para proteínas de levaduras secretadas, tales como el gen de la invertasa de levadura (Publicación EPO Nº 012 873; Publicación JPO Nº 62: 096.086) y el gen del factor A (Patente de Estados Unidos Nº 4.588.684). Como alternatural, existen líderes de origen no de levadura, tal como un líder de interferón, que también posibilitan la secreción en levaduras (Publicación EPO Nº 060 057).

Una clase preferida de líderes de secreción son los que emplean un fragmento del gen del factor alfa de levadura, que contiene una secuencia señal "pre" y una región "pro". Los tipos de fragmentos de factor alfa que pueden emplearse incluyen el líder de factor alfa pre-pro de longitud completa (de aproximadamente 83 restos de aminoácidos) así como líderes de factor alfa truncados (normalmente de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 restos de aminoácidos) (Patente de Estados Unidos Nº 4.546.083 y 4.870.008; Publicación EPO Nº 324 274). Los líderes adicionales que emplean un fragmento líder de factor alfa que posibilita la secreción incluyen líderes de factor alfa híbridos preparados con una presecuencia de una primera levadura, pero una región pro de un factor alfa de una segunda levadura (véase por ejemplo Publicación PCT Nº WO 89/02463).

Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por una levadura son secuencias reguladoras situadas en posición 3' con respecto al codón de terminación de la traducción, y por lo tanto junto con el promotor flanquean a la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse al polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de secuencia de terminación de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por la levadura, tales como las que codifican enzimas glicolíticas.

Normalmente, los componentes descritos anteriormente, comprenden un promotor, líder (si se desea), secuencia codificante de interés y una secuencia de terminación de la transcripción y se colocan conjuntamente en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de mantenerse de forma estable en un huésped, tal como una levadura o una bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, que le permiten por lo tanto mantenerse, por ejemplo, en levaduras para la expresión y en un huésped procariota para clonación y amplificación. Los ejemplos de dichos vectores lanzadera de levadura-bacteria incluyen Yep24 (Botstein y col. (1979) Gene 8: 17-24), pCI/1 (Brake y col. (1984) Proc Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642-4646) e YRp17 (Stinchcomb y col. (1982) J. Mol. Biol. 158: 157). Además, una replicón puede ser un plásmido de un alto o un bajo número de copias. Un plásmido de elevado número de copias tendrá generalmente un número de copias que varía entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y normalmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de elevado número de copias preferentemente tendrá al menos aproximadamente 10 y más preferentemente al menos aproximadamente 20. La introducción de un vector de alto o de bajo número de copias puede seleccionarse, dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña sobre el huésped. Véase por ejemplo, Brake y col., anteriormente.

Como alternatural, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma de la levadura con un vector de integración. Los vectores de integración normalmente contienen al menos una secuencia homóloga a un cromosoma de levadura que permite que el vector se integre, y preferentemente contienen dos secuencias homólogas que flanquean a la construcción de expresión. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma de levadura (Orr-Weaver y col. (1983) Methods in Enzymol. 101: 228-245). Un vector de integración puede dirigirse a un locus específico en la levadura seleccionando la secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector. Véase Orr-Weaver y col., anteriormente. Una o más construcciones de expresión pueden integrarse, afectando posiblemente a los niveles de la proteína recombinante producida (Rine y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750). Las secuencias cromosómicas incluidas en el vector pueden producirse como un único segmento en el vector, que da como resultado la integración de todo el vector, o como dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean a la construcción de expresión en el vector, lo que puede provocar la integración estable de solamente la construcción de expresión.

Normalmente, las construcciones de expresión extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas de levadura que se haya transformado. Los marcadores seleccionables pueden incluir genes biosintéticos que pueden expresarse en el huésped de levadura, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 y ALG7 y el gen de resistencia a G418, que confiere resistencia en células de levadura a tunicamicina y G418, respectivamente. Además, un marcador seleccionable adecuado puede proporcionar también a la levadura la capacidad de crecer en presencia de compuestos tóxicos, tales como metales. Por ejemplo, a presencia de CUP1 permite a la levadura crecer en presencia de iones de cobre (Butt y col. (1987) Microbiol. Rev. 51: 351).

Como alternatural, algunos de los componentes descritos anteriormente, pueden colocarse conjuntamente en vectores de transformación. Los vectores de transformación normalmente están constituidos por un marcador seleccionable que se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se ha descrito anteriormente.

Los vectores de expresión y transformación, replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para la transformación en muchas levaduras. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión y procedimientos para introducir ADN exógeno en huéspedes de levadura para, entre otros, las siguientes levaduras; Candida albicans (Kurtz, y col. (1986); Mol. Cell. Biol. 6: 142), Candida maltosa (Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol.25: 141); Hansenula polymorpha (Gleeson, y col., (1986), J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302), Kluyveromyces fragilis (Das, y col. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165); Kluyveromyces lactis (De Louvencourt y col. (1983), J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg y col. (1990), Bio/Technology 8: 135); Pichia guillerimondii (Kunze y col., (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141); Pichia pastoris (Cregg, y col (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Patentes de Estados Unidos Nº 4.837.148 y 4.929.555); Saccharomyces cerevisiae (Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito y col, (1983) J. Bacteriol. 153: 163); Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706); y Yarrowia lipolytica (Davidow, y col., (1985) Curr. Genet. 10: 380471 Gaillardin, y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49).

Los procedimientos para introducir ADN exógeno en los huéspedes de levadura se conocen bien en la técnica, y normalmente incluyen la transformación de esferoplastos o de células de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación varían normalmente con las especies de levadura a transformar. Véase por ejemplo, [Kurtz y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol.25: 141 Candida]; [Gleeson, y col., (1986), J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302; Hansenula]; [Das, y col. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165; De Louvencourt y col. (1983), J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg y col. (1990), Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg, y col (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze y col. (1985); J. Basic Microbiol. 25: 141; Patentes de Estados Unidos Nº 4.837.148 y 4.929.555 Pichia]; [Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito y col, (1983) J. Bacteriol. 153: 163 Saccharomyces]; [Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces]; [Davidow, y col., (1985) Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin, y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].

Definiciones

Una composición que contiene X está sustancialmente libre de Y cuando al menos 85% en peso del total X+Y en la composición es X. Preferentemente, X comprende al menos aproximadamente 90% en peso del total de X+Y en la composición, más preferentemente al menos aproximadamente 95% o incluso 99% en peso.

Un fragmento de aminoácido o proteína de Neisseria "conservado" es uno que está presente en una proteína de Neisseria particular en al menos x% de Neisseria. El valor de x puede ser 50% o más, por ejemplo, 66%, 75%, 80%, 90%, 95% o incluso 100% (es decir, el aminoácido se encuentra en la proteína en cuestión en toda la Neisseria). Para determinar si un aminoácido está "conservado" en una proteína de Neisseria particular, es necesario comparar este resto de aminoácido en las secuencias de la proteína en cuestión de una pluralidad de Neisseria diferentes (una población de referencia). La población de referencia puede incluir varias especies de Neisseria diferentes o puede incluir una única especie. La población de referencia puede incluir varios serogrupos diferentes de una especie en particular o un único serogrupo. Una población de referencia preferida está constituida por las 5 Neisseria más comunes.

El término "heterólogos" se refiere a dos componentes biológicos que no se encuentran juntos en la naturaleza. Los componentes pueden ser células huésped, genes o regiones reguladoras, tales como promotores. Aunque los componentes heterólogos no se encuentran juntos de forma natural, pueden funcionar de forma conjunta, como cuando un promotor heterólogo a un gen se une de forma operativa al gen. Otro ejemplo es cuando una secuencia de Neisseria es heteróloga para una célula huésped de ratón.

Un "origen de replicación" es una secuencia de polinucleótidos que inicia y regula la replicación de polinucleótidos, tal como un vector de expresión. El origen de replicación se comporta como una unidad autónoma de replicación de polinucleótidos en una célula, capaz de replicarse bajo su propio control. Puede ser necesario un origen de replicación para que un vector se replique en una célula huésped particular. Con ciertos orígenes de replicación, un vector de expresión puede reproducirse a un elevado número de copias en presencia de las proteínas apropiadas dentro de la célula. Los ejemplos de orígenes son secuencias de replicación autónoma, que son eficaces en levaduras; y el antígeno T viral, eficaz en células COS-7.

Una secuencia "mutante" se define como un ADN, ARN o secuencia de aminoácidos que es diferente de, pero que tiene una homología con, la secuencia natural o descrita. Dependiendo de la secuencia particular, el grado de homología (identidad de secuencia) entre la secuencia natural o descrita y la secuencia mutante es preferentemente mayor de 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) lo que se calcula como se ha descrito anteriormente. Como se usa en este documento, una "variante alélica" de una molécula de ácido nucleico, o de una región, para la que se proporciona en este documento la secuencia de ácido nucleico, es una molécula de ácido nucleico, o una región, que se produce en esencialmente el mismo locus en el genoma de otro o de un segundo aislado y que, debido a la variación natural causada por ejemplo, por mutación o recombinación, tiene una secuencia de ácido nucleico similar pero no idéntica. Una variante alélica de región codificante codifica normalmente una proteína que tiene una actividad similar a la de la proteína codificada por el gen con el que se está comparando. Una variante alélica también puede comprender una alteración en las regiones 5' o 3' no traducidas del gen, tal como en regiones de control reguladoras (véase por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.753.235).

Anticuerpos

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o a un grupo de polipéptidos constituido por al menos un sitio de combinación de anticuerpos. Un "sitio de combinación de anticuerpos" es el espacio de unión tridimensional con una forma de superficie interna y una distribución de cargas complementarias a las características de un epítopo o un antígeno, lo que permite una unión del anticuerpo con el antígeno. "Anticuerpo", incluye por ejemplo, anticuerpos de vertebrados, anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos alterados, anticuerpos univalentes, proteínas Fab y anticuerpos de dominio único.

Los anticuerpos contra las proteínas de la invención son útiles para cromatografía de afinidad, inmunoensayos y distinción/identificación de proteínas de menB de Neisseria. Los anticuerpos producidos contra las proteínas de la presente invención se unen a polipéptidos o a proteínas o a fragmentos de proteínas antigénicos que están presentes y se asocian específicamente con cepas de menB de Neisseria meningitidis. En algunos casos, estos antígenos pueden asociarse con cepas específicas, tales como los antígenos específicos para las cepas de menB. Los anticuerpos de la invención pueden inmovilizarse con una matriz y utilizarse en un inmunoensayo o en una columna de cromatografía de afinidad, para permitir la detección y/o separación de polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas o células que comprenden dichos polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas. Como alternatural, dichos polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas pueden inmovilizarse para detectar anticuerpos que se unen específicamente a ellos.

Los anticuerpos para las proteínas de la invención, policlonales y monoclonales, pueden prepararse mediante procedimientos convencionales. En general, la proteína se usa en primer lugar para inmunizar un animal adecuado, preferentemente, un ratón, rata, conejo o cabra. Se prefieren conejos y cabras para la preparación de sueros policlonales debido al volumen de suero obtenible y a la disponibilidad de anticuerpos anticonejo y anticabra marcados. La inmunización se realiza generalmente mezclando o emulsionando la proteína en solución salina, preferentemente con un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund e inyectando la mezcla o emulsión por vía parenteral (generalmente por vía subcutánea o intramuscular). Normalmente es suficiente una dosis de 50-200 \mug/inyección. La inmunización se refuerza generalmente 2-6 semanas después con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, preferentemente usando adyuvante incompleto de Freund. Puede generarse alternaturalmente anticuerpos mediante inmunización in vitro usando procedimientos conocidos en la técnica lo que, para los fines de esta invención, se considera equivalente a la inmunización in vivo. Los antisuero policlonales se obtienen extrayendo sangre de animales inmunizados en un recipiente de vidrio o de plástico, incubando la sangre a 25ºC durante 1 hora, seguido de incubación a 4ºC durante 2-18 horas. El suero se recupera mediante centrifugado (por ejemplo, a 1000 g durante 10 minutos). Pueden obtenerse de aproximadamente 20-50 ml por extracción de sangre a partir de conejos.

Los anticuerpos monoclonales se preparan usando el procedimiento convencional de Kohler y Milstein (Nature (1975) 256: 495-96), o una modificación del mismo. Normalmente, se inmuniza un ratón o una rata como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en lugar de extraer sangre del animal para extraer el suero, se extirpa el bazo (y opcionalmente varios nódulos linfáticos grandes) y se disocian en células únicas. Si se desea, las células del bazo pueden seleccionarse (después de la retirada de células adherentes no específicas) aplicando una suspensión celular a una placa o a un pocillo recubierto con el antígeno de la proteína. Las células B que expresan inmunoglobulina unida a la membrana específica para el antígeno se unen a la placa y no se eliminan mediante el aclarado con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todas las células del bazo disociadas, se inducen después para que se fusionen con células de mieloma para formar hibridomas y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Los hibridomas resultantes se colocan en placas mediante dilución limitante, y se ensaya la producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno inmunizante (y que no se unen a antígenos no relacionados). Los hibridomas que secretan MAB seleccionados se cultivan después in vitro (por ejemplo en frascos de cultivo tisular o en reactores de fibra hueca) o in vivo (como ascitis en ratones).

Si se desea, los anticuerpos (policlonales o monoclonales) pueden marcarse usando técnicas convencionales. Las marcas adecuadas incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radioactivos (particularmente ^{32}P y ^{125}I), reactivos densos a electrones, enzimas y ligandos que tienen compañeros de unión específicos. Las enzimas se detectan normalmente mediante su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano rusticano se detecta normalmente mediante su capacidad para convertir 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. "Compañero de unión de específica" se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para éste. Otros compañeros de unión específica incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas de receptor-ligando conocidas en la técnica. Debe entenderse que la descripción anterior no pretende categorizar las diversas marcas en diferentes clases, ya que la misma marca puede servir en diferentes modos. Por ejemplo, ^{125}I puede servir como una marca radioactiva o como un reactivo denso a electrones. HRP puede servir como enzima o como antígeno para un MAb. Además, pueden combinarse diversas marcas para el efecto deseado. Por ejemplo, los MAb y avidina también requieren marcas en la práctica de esta invención: por lo tanto, puede marcarse un MAb con biotina y detectar su presencia con avidina marcada con ^{125}I o con un MAb anti-biotina marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia, y se consideran equivalentes dentro del alcance de la presente invención.

Los antígenos, inmunógenos, polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteína de la presente invención provocan la formación de anticuerpos compañeros de unión específica. Estos antígenos, inmunógenos, polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas de la presente invención comprenden composiciones inmunogénicas de la presente invención. Dichas composiciones inmunogénicas pueden comprender o incluir además adyuvantes, vehículos u otras composiciones que promueven o potencian o estabilizan los antígenos, polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas de la presente invención. Dichos adyuvantes y vehículos serán muy evidentes para los expertos en la materia.

Composiciones Farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender (incluir) polipéptidos, anticuerpos o ácidos nucleicos de la invención. Las composiciones farmacéuticas comprenderán una cantidad terapéuticamente eficaz de polipéptidos, anticuerpos, o polinucleótidos de la presente invención.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en este documento, se refiere a una cantidad del agente terapéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección deseada, o para mostrar un efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto puede detectarse mediante, por ejemplo, niveles de marcadores químicos o antígenos. Los efectos terapéuticos también incluyen reducción de los síntomas físicos, tales como temperatura corporal disminuida, cuando se administran a un paciente que está febril. La cantidad eficaz exacta para un sujeto dependerá del tamaño y el estado de salud del sujeto, de la naturaleza y el alcance de la afección y de los agentes terapéuticos o combinación de agentes terapéuticos seleccionados para administración. Por lo tanto, no es útil especificar una cantidad eficaz exacta por adelantado. Sin embargo, la cantidad eficaz para una situación dada puede determinarse mediante experimentación rutinaria y está dentro del juicio del médico.

Para los fines de la presente invención, una dosis eficaz estará entre aproximadamente 0,01 mg/kg a 50 mg/kg o entre 0,05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de las construcciones de ADN en el individuo al que se administran.

Una composición farmacéutica también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo para la administración de un agente terapéutico, tal como anticuerpos o un polipéptido, genes y otros agentes terapéuticos. La expresión se refiere a cualquier vehículo farmacéutico que no induce por sí solo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y que puede administrarse sin toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos. Dichos vehículos los conocen bien los expertos en la materia.

Pueden usarse en estos sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácido minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión exhaustiva de los excipientes farmacéuticamente aceptable está disponible en el documento Remington Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J. 1991).

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, en dichos vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras del pH, y similares. Normalmente, las composiciones terapéuticas se preparan en forma de inyectables, en soluciones o en suspensiones liquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. Los liposomas se incluyen dentro de la definición de un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Procedimientos de Suministro

Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales; en particular, pueden tratarse sujetos humanos.

El suministro directo de las composiciones se realizará generalmente mediante inyección, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o por vía intramuscular o se suministrarán en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse en una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmicas y transcutáneas, agujas y pistolas génicas o inyectores tipo hypospray. El tratamiento y la dosificación pueden ser en un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples.

Vacunas

Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de la infección).

Dichas vacunas comprenden antígeno(s) o inmunógeno(s) inmunizadores, polipéptidos, proteína(s) o fragmentos de proteínas o ácidos nucleicos (por ejemplo, ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico) inmunogénicos, normalmente en combinación con "vehículos farmacéuticamente aceptables" que incluyen cualquier vehículo que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son normalmente macromoléculas grandes de metabolización lenta tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas) y partículas de virus inactivados. Dichos vehículos los conocen bien los expertos en la materia. Además, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores ("adyuvantes"). Además, el inmunógeno o antígeno puede conjugarse con un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de difteria, tétanos, cólera, H. pylori, etc. patógenos.

Los adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia de la composición incluyen, aunque sin limitación: (1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como péptidos de muramilo (véase a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59 (publicación PCT Nº WO 90/14837), que contienen escualeno a 5%, Tween 80 a 0,5% y Span 85 a 0,5% (que contienen opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE (véase a continuación), aunque no se requiere) formuladas en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene escualeno a 10%, Tween 80 a 0,4%; polímero L121 bloqueado con pluronic a 5% y thr-MDP (véase a continuación) microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado en vórtice para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor y (c) el sistema adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno a 2%, Tween 80 a 0,2% y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo constituido por monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox^{TM}); (3) pueden usarse adyuvantes de saponina, tales como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores); (4) Adyuvante Completo de Freund (CFA) y Adyuvante Incompleto de Freund (IFA); (5) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferón gamma), factor estimulador de la colonia de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; y (6) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores para potenciar la eficacia de la composición. Se prefieren alumbre y MF59.

Como se ha mencionado anteriormente, los péptidos de muramilo incluyen aunque sin limitación, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-N-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Las composiciones de vacuna que comprenden composiciones inmunogénicas (por ejemplo, que pueden incluir el antígeno, vehículo farmacéuticamente aceptable y un adyuvante) contendrán normalmente diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras del pH y similares. Como alternatural, las composiciones de vacuna que comprenden composiciones inmunogénicas pueden comprender un antígeno, polipéptido, proteína, fragmento de proteína o ácido nucleico en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Más específicamente, las vacunas que comprenden composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de los polipéptidos inmunogénicos, así como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente, según sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz" se entiende que la administración de esta cantidad a un individuo, en una única dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo del estado de salud y de la condición física del individuo a tratar, del grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección deseado, de la formulación de la vacuna, de la evaluación del médico que trata al paciente o de la situación médica y de otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad esté dentro de un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse a través de ensayos rutinarios.

Normalmente, las composiciones de vacuna o composiciones inmunogénicas se preparan como inyectables, en forma de soluciones o suspensiones liquidas; pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para un efecto adyuvante potenciado, como se ha descrito anteriormente en vehículos farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones inmunogénicas se administran convencionalmente por vía parenteral por ejemplo, mediante inyección, por vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas y transcutáneas. El tratamiento de la dosificación puede ser un programa de dosis única y un programa de dosis múltiples. La vacuna puede administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores.

Como alternatural a las vacunas basadas en proteínas, puede emplearse la vacunación con ADN (por ejemplo, Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9: 271-283; Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15: 617-648).

Vehículos para el Suministro de Genes

Los vehículos de terapia génica para el suministro de construcciones, incluyendo una secuencia codificante de un agente terapéutico de la invención, a suministrar al mamífero para la expresión en el mamífero, pueden administrarse de forma local o sistémica. Estas construcciones pueden utilizar enfoques de vector viral o no viral en modalidad in vivo o ex vivo. La expresión de dicha secuencia codificante puede inducirse usando promotores de mamífero endógenos o heterólogos. La expresión de la secuencia codificante in vivo puede ser constitutiva o regulada.

La invención incluye vehículos de suministro de genes capaces de expresar las secuencias de ácido nucleico contempladas. El vehículo de suministro de genes es preferentemente un vector viral y más preferentemente, un vector retroviral, adenoviral, viral adenoasociado (AAV), herpes viral o de alfavirus. El vector viral también puede ser un vector viral de astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus o togavirus. Véase en general, Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1: 51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5: 845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6: 185-193; y Kaplitt (1994) Nature Genetics 6: 148-153.

Los vectores retrovirales se conocen bien en la técnica, incluyendo retrovirus de tipo B, C y D, retrovirus xenotrópicos (por ejemplo, NZB-X1, NZB-X2 y NZB9-1 (véase O'Neill (1985) J. Virol, 53: 160) retrovirus politrópicos por ejemplo, MCF y MCF-MLV (véase Nelly (1983) J. Virol. 45: 291), espumavirus y lentivirus. Véase el documento RNA Tumor Viruses, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Las porciones del vector de terapia génica retroviral pueden suministrarse a partir de diferentes retrovirus. Por ejemplo, pueden obtenerse LTR de retrovectores de un Virus de Sarcoma de Ratón, un sitio de unión a ARNt de un Virus de Sarcoma de Rous, una señal de envasado de un Virus de Leucemia de Ratón y un origen de la síntesis de una segunda cadena de un Virus de Leucosis Aviar.

Estos vectores retrovirales recombinantes pueden usarse para generar partículas de vector retroviral competentes para la transducción introduciéndolos en líneas celulares de envasado apropiadas (véase la patente de EE.UU. 5.591.624). Los vectores de retrovirus pueden reconstruirse para integración especifica de sitio en ADN de la célula huésped mediante incorporación de una enzima integrasa quimérica en la partícula retroviral (véase el documento WO 96/37626). Es preferible que el vector viral recombinante sea un virus recombinante de replicación defectuosa.

Las líneas celulares de envasado adecuadas para su uso con los vectores de retrovirus descritos anteriormente se conocen bien en la técnica, se preparan fácilmente (véase los documentos WO 95/30763 y WO 92/05266), y pueden usarse para crear líneas celulares productoras (también llamadas líneas celulares de vector o "VCL") para la producción de partículas de vectores recombinantes. Preferentemente, las líneas celulares de envasado se preparan a partir de células parentales humanas (por ejemplo células HT1080) o líneas celulares parentales de visón, lo que elimina la inactivación en suero humano.

Los retrovirus preferidos para la construcción de vectores de terapia génica retrovirales incluyen Virus de la Leucosis Aviar, Virus de la Leucemia Bovina, Virus de la Leucemia de Ratón, Virus que Induce Focos en Células de Visón, Virus del Sarcoma de Ratón, Virus de Reticuloendoteliosis y Virus del Sarcoma de Rous. Los Virus de Leucemia de Ratón particularmente preferidos incluyen 4070A y 1504A (Hartley y Rowe (1976) J. Virol. 19: 19-25), Abelson (ATCC Nº VR-999), Friend (ATCC Nº VR-245), Graffi, Gross (ATCC Nº VR-590), Kirsten, Virus del Sarcoma de Harvey y Rauscher (ATCC Nº VR-998) y Virus de la Leucemia de Ratón de Moloney (ATCC Nº VR-190). Dichos retrovirus pueden obtenerse de depósitos o colecciones tales como la American Type Culture Collection ("ATCC") en Rockville, Maryland o aislarse a partir de fuentes conocidas usando técnicas disponibles comúnmente.

Los vectores de terapia génica retroviral conocidos ejemplares que pueden emplearse en esta invención incluyen los que se describen en las solicitudes de patente GB 2200651, EP 0415731, EP 0345242, EP 0334301, WO 89/02468; WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, WO 91/02825, WO 95/07994, US 5.219.740, US 4.405.712, US 4.861.719, US 4.980.289, US 4.777.127, US 5.591.624. Véase también el documento Vile (1993) Cancer Res 53: 3860-3864; Vile (1993) Cancer Res 53: 962-967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33: 493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79: 729-735; Mann (1983) Cell 33: 153; Cane (1984) Proc Natl Acad Sci 81: 6349; y Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Los vectores de terapia génica de adenovirus humanos también se conocen en la técnica y pueden emplearse en esta invención. Véase, por ejemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6: 616 y Rosenfeld (1991) Science 252: 431, y WO 93/07283, WO 93/06223, y WO 93/07282. Los vectores de terapia génica de adenovirus conocidos ejemplares y que pueden emplearse en esta invención incluyen los que se describen en los documentos mencionados anteriormente y en WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984, WO 95/00655, WO 95/27071, WO 95/29993, WO 95/34671, WO 96/05320, WO 94/08026, WO 94/11506, WO 93/06229, WO 94/24299, WO 95/14102, WO 95/24297, WO 95/02697, WO 94/28152, WO 94/25299, WO 95/09241, WO 95/25807, WO 95/05835, WO 94/18922 y WO 95/09654. Como alternatural, puede emplearse la administración de ADN unido a adenovirus inactivados como se describe en el documento Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3: 147-154. Los vehículos de suministro de genes de la invención también incluyen vectores de virus asociados a adenovirus (AAV). Ejemplos principales y preferidos de dichos vectores para su uso en esta invención son los vectores basados en AAV-2 descritos en el documento Srivastava, WO 93/09239. Los vectores AAV más preferidos, comprenden las dos repeticiones terminales invertidas de AAV en las que las secuencias D naturales se modifican mediante sustitución de nucleótidos, de modo que al menos 5 nucleótidos naturales y hasta 18 nucleótidos naturales, preferentemente al menos 10 nucleótidos naturales y hasta 18 nucleótidos naturales, más preferentemente 10 nucleótidos naturales se conservan y el resto de nucleótidos de la secuencia D se delecionan o se sustituyen con nucleótidos no naturales. Las secuencias D naturales de las repeticiones terminales invertidas de AAV son secuencias de 20 nucleótidos consecutivos en cada repetición terminal invertida de AAV (es decir, solamente existe una secuencia en cada extremo) que no están implicadas en la formación de HP. El nucleótido de sustitución no natural puede ser cualquier nucleótido diferente del nucleótido que se encuentra en la secuencia D natural en la misma posición. Otros vectores de AAV ejemplares que pueden emplearse son pWP-19, pWN-1 ambos descritos en Nahreini (1993) Gene 124: 257-262. Otro ejemplo de dicho vector de AAV es psub201 (véase Samulski (1987) J. Virol. 61: 3096). Otro vector de AAV ejemplar es el vector IRT Doble-D. La construcción del vector ITR Doble D se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.478.745. Otros vectores más son los que se describen en la patente de Estados Unidos Nº 4.797.368 de Carter y en la patente de Estados Unidos 5.139.941 de Muzyczka, en la patente de Estados Unidos 5.474.935 de Chartejee y en el documento WO94/282157 de Kotin. Otro ejemplo adicional de un vector de AAV que puede emplearse en esta invención es SSV9AFABTKneo, que contiene el potenciador AFP y el promotor de albúmina y dirige la expresión de forma predominante en el hígado. Su estructura y su construcción se describen en el documento Su (1996) Human Gene Therapy 7: 463-470. En los documentos 5.354.678, US 5.173.414, US 5.139.941 y US 5.252.479 se describen vectores de terapia génica de AAV adicionales.

Los vectores de terapia génica que comprenden secuencias de la invención también incluyen vectores de herpes. Los ejemplos principales y preferidos son vectores del virus herpes simplex que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de timidina quinasa tal como los descritos en los documentos US 5.288.641 y EP0176170 (Roizman). Vectores ejemplares de virus herpes simplex adicionales incluyen HFEM/lCP6-LacZ descrito en el documento WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac descrito en el documento Geller (1988) Science 241: 1667-1669 y en el documento WO90/09441 y en WO92/07945, HSV Us3::pgC-lacZ descrito en el documento Fink (1992) Human Gene Therapy 3: 11-19 y HSV 7134, 2 RH 105 y GAL4 descritos en el documento EP 0453242 (Breakefield), y los depositados en la ATCC con los número de acceso ATCC VR-977 y ATCC VR-260.

También se contemplan vectores de terapia génica de virus alfa que pueden emplearse en esta invención. Los vectores de virus alfa preferidos son los vectores de los virus Sindbis. Togavirus, virus Semliki Forest (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), virus Middleberg (ATCC VR-370), virus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532), y los descritos en las patentes de Estados Unidos 5.091.309, 5.217.879, y en el documento WO92/10578. Más particularmente, pueden emplearse los vectores de virus alfa descritos en el documento US Nº de serie 08/405.627, presentado el 15 de marzo de 1995, WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, US 5.091309 y US 5.217.879. Dichos virus alfa pueden obtenerse a partir de depósitos o de colecciones tales como la ATCC de Rockville, Maryland o aislarse a partir de fuentes conocidas usando técnicas disponibles comúnmente. Preferentemente, se usan vectores de virus alfa con toxicidad reducida (véase USSN 08/679640).

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Los sistemas de vectores de ADN tales como sistemas de expresión en capas eucariotas también son útiles para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Véase el documento WO95/07994 para una descripción detallada de los sistemas de expresión en capas eucariotas. Preferentemente, los sistemas de expresión en capas eucariotas de la invención se obtienen de vectores de virus alfa y más preferentemente de vectores virales de Sindbis.

Otros vectores virales adecuados para su uso en la presente invención incluyen los obtenidos de poliovirus, por ejemplo ATCC VR-58 y los que se describen en el documento Evans, Nature 339 (1989) 385 y Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1: 115; rinovirus, por ejemplo ATCC VR-1110 y los que se describen en el documento Arnold (1990) J Cell Blochem L401; poxvirus tales como poxvirus de canario o virus vaccinia, por ejemplo ATCC VR-111 y ATCC VR-2010 y los que se describen en el documento Fisher-Hoch (1989) Proc. Natl Acad Sci 86: 317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569: 86, Flexner (1990) Vaccine 8: 17; en US 4.603.112 y US 4.769.330 y en el documento WO89/01973; virus SV40, por ejemplo ATCC VR-305 y los que se describen en los documentos Mulligan (1979) Nature 277: 108 y Madzak (1992) J Gen Virol 73: 1533; virus de la gripe, por ejemplo ATCC VR-797 y virus de la gripe recombinantes preparados empleando técnicas genéticas inversas como se describe en el documento US 5.166.057 y en Enami (1990) Proc Natl Acad Sci 87: 3802-3805; Enami y Palese (1991) J Virol 65: 2711-2713 y Luytjes (1989) Cell 59: 110, (véase McMichael (1983) NEJ Med 309: 13, y Yap (1978) Nature 273: 238 y Nature (1979) 277: 108); virus de la inmunodeficiencia humana como se describe en el documento EP-0386882 y en Buchschacher (1992) J. Virol. 66: 2731, virus del sarampión, por ejemplo ATCC VR-67 y VR-1247 y los que se describen en EP-0440219; virus Aura, por ejemplo ATCC VR-368; virus Bebaru, por ejemplo ATCC VR-600 y ATCC VR-1240; virus Cabassou, por ejemplo ATCC VR-922; virus Chikungunya, por ejemplo ATCC VR-64 y ATCC VR-1241; virus Fort Morgan, por ejemplo ATCC VR-924; virus Getah, por ejemplo ATCC VR-369 y ATCC VR-1243; virus Kyzylagach, por ejemplo ATCC VR-927; virus Mayaro, por ejemplo ATCC VR-66; virus Mucambo, por ejemplo ATCC VR-580 y ATCC VR-1244; virus Ndumu, por ejemplo ATCC VR-371; virus Pixuna, por ejemplo ATCC VR-372 y ATCC VR-1245; virus Tonate, por ejemplo ATCC VR-925; virus Triniti, por ejemplo ATCC VR-469; virus Una, por ejemplo ATCC VR-374; virus Whataroa, por ejemplo ATCC VR-926; virus Y-62-33, por ejemplo ATCC VR-375; virus O'Nyong, virus de la encefalitis oriental, por ejemplo ATCC VR-65 y ATCC VR-1242; virus de la encefalitis occidental, por ejemplo ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 y ATCC VR-1252; y coronavirus, por ejemplo ATCC VR-740 y los que se describen en el documento Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121: 190.

El suministro de las composiciones de esta invención a células no se limita a los vectores virales mencionados anteriormente. Pueden emplearse otros procedimientos y medios de suministro tales como, por ejemplo vectores de expresión de ácidos nucleicos, ADN condensado policatiónico unido o sin unir a adenovirus inactivados en solitario, por ejemplo US Nº de serie 08/366.787, presentada el 30 de diciembre de 1994 y Curiel (1992) Hum Gene Ther 3: 147-154. ADN unido a ligando, por ejemplo véase el documento Wu (1989) J Biol Chem 264: 16985-16987, células vehículo para el suministro de células eucariotas, por ejemplo véase US Nº de serie 08/240.030, presentada el 9 de mayo de 1994, y US Nº de serie 08/404.796, depósito de materiales de hidrogel fotopolimerizado, pistolas de partículas de transferencia génica de manejo manual, como se describe en la patente de Estados Unidos 5.149.655, radiación ionizante como se describe en los documentos US5.206.152 y WO92/11033, neutralización de carga nucleica o fusión con membranas celulares. Los enfoques adicionales se describen en el documento Philip (1994) Mol Cell Biol 14: 2411-2418 y en Woffendin (1994) Proc Natl Acad Sci 91: 1581-1585.

Puede emplearse transferencia génica mediada por partículas, por ejemplo véase US Nº de serie 60/023.867. En resumen, la secuencia puede insertarse en vectores convencionales que contienen secuencias de control convencionales para un alto nivel de expresión y después incubarse con moléculas de transferencia génica sintética tales como cationes de unión a ADN polimérico tales como polilisina, protamina, y albúmina, unidos a ligandos dirigidos a células tales como asialoorosomucoide, como se describe en el documento Wu & Wu (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432, insulina como se describe en el documento Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40: 253-263, galactosa como se describe en el documento Pland (1992) Bioconjugate Chem 3: 533-539, lactosa o transferrina.

También puede emplearse ADN desnudo para transformar una célula huésped. Los procedimientos de introducción de ADN desnudo ejemplares se describen en el documento WO 90/11092 y en US 5.580.859. La eficacia de la captación puede mejorarse usando perlas de látex biodegradables. Las perlas de látex recubiertas de ADN se transportan eficazmente a las células después del inicio de la endocitosis por las perlas. El procedimiento puede mejorarse adicionalmente mediante el tratamiento de las perlas para aumentar la hidrofobicidad y facilitar de este modo la alteración del endosoma y la liberación del ADN al citoplasma.

Los liposomas que pueden actuar como vehículos de suministro de genes se describen en los documentos U.S. 5.422.120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 y EP-524.968. Como se describe en el documento USSN. 60/023.867, sobre el suministro no viral, las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido pueden insertarse en vectores convencionales que contienen secuencias de control convencionales para un alto nivel de expresión y después pueden incubarse con moléculas de transferencia de genes sintéticas tales como cationes de unión a ADN polimérico, tales como polilisina, protamina y albúmina, unidos a ligandos que se dirigen a células tales como asialoorosomucoide, insulina, galactosa, lactosa o transferrina. Otros sistemas de suministro incluyen el uso de liposomas para encapsular ADN que comprende el gen bajo el control de diversos promotores específicos de tejido o activos de forma ubicua. Otros suministros no virales adecuados para su uso incluyen sistemas de suministro mecánico, tales como el enfoque descrito en el documento Woffendin y col (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24): 11581-11585. Además, la secuencia codificante y el producto de la expresión de ésta puede suministrarse a través del depósito de materiales de hidrogel fotopolimerizados. Otros procedimientos convencionales para el suministro de genes que pueden usarse para suministrar la secuencia codificante incluyen, por ejemplo, el uso de una pistola de partículas de transferencia de genes de uso manual, como se describe en el documento U.S. 5.149.655; el uso de radiación ionizante para activar un gen transferido, como se describe en los documentos U.S. 5.206.152 y WO92/11033.

Los vehículos ejemplares de suministro de genes policatiónicos y de liposomas son los descritos en el documento US 5.422.120 y 4.762.915; en los documentos WO95/13796; WO94/23697 y WO91/14445; en el documento EP-0524968; y en Stryer, Biochemistry, páginas 236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600: 1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550: 464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149: 119; Wang (1987) Proc Natl Acad Sci 84: 7851; Plant (1989) Anal Biochem 176: 420.

Una composición de polinucleótidos puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un vehículo de terapia génica, como se ha definido la expresión anteriormente. Para los fines de la presente invención, una dosis eficaz estará entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 50 mg/kg o entre 0,05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de las construcciones de ADN en el individuo al que se administran.

Procedimientos de Suministro

Una vez formuladas, las composiciones de polinucleótidos de la invención pueden administrarse (1) directamente al sujeto; (2) pueden suministrarse ex vivo, a células obtenidas del sujeto, o (3) in vitro para la expresión de proteínas recombinantes. Los sujetos a tratar pueden ser mamíferos o aves. También pueden tratarse sujetos humanos.

El suministro directo de las composiciones se conseguirá generalmente mediante inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular o se suministrarán en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse a un tumor o lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmicas, agujas y pistolas génicas o inyectores de tipo hypospray. El tratamiento de la dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples.

Los procedimientos para el suministro ex vivo y la reimplantación de células transformadas en un sujeto se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en el documento WO93/14778. Los ejemplos de células útiles en aplicaciones ex vivo incluyen, por ejemplo, células madres, particularmente hematopoyéticas, células linfáticas, macrófagos, células dendríticas o células tumorales.

Generalmente, el suministro de ácidos nucleicos para aplicaciones ex vivo e in vitro puede realizarse mediante los siguientes procedimientos, por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa de ADN en los núcleos, como se conoce en la técnica.

Composiciones farmacéuticas de polinucleótidos y polipéptidos

Además de los vehículos y sales farmacéuticamente aceptables descritos anteriormente, pueden usarse los siguientes agentes adicionales con composiciones de polinucleótidos y/o polipéptidos.

A. Polipéptidos

Un ejemplo son polipéptidos que incluyen, sin limitación: asioloorosomucoide (ASOR); transferrina; asialoglicoproteínas; anticuerpos; fragmentos de anticuerpo; ferritina; interleucinas; interferones, factor estimulador de las colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), factor estimulador de las colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de macrofagos (M-CSF), factor de células madre y eritropoyetina. También pueden usarse antígenos virales, tales como proteínas de la envuelta. También, proteínas de otros organismos invasores, tales como el péptido de 17 aminoácidos de la proteína del circumsporozoito de plasmodium falciparum conocida como RII.

B. Hormonas, Vitaminas, etc.

Otros grupos que pueden incluirse son, por ejemplo: hormonas, esteroides, andrógenos, estrógenos, hormona tiroidea o vitaminas, ácido fólico.

C. Polialquilenos, Polisacáridos, etc.

También puede incluirse polialquilenglicol con los polinucleótidos o polipéptidos deseados. En una realización preferida, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Además, pueden incluirse mono-, di- o polisacáridos. En una realización preferida de este aspecto, el polisacárido es dextrano o DEAE-dextrano. También, quitosano y poli(lacturo-co-glicólido).

D. Lípidos y liposomas

El polinucleótido o polipéptido deseado también puede encapsularse en lípidos o envasarse en liposomas antes del suministro al sujeto o a células obtenidas del mismo.

La encapsulación en lípidos se realiza generalmente usando liposomas que son capaces de unirse o atrapar de forma estable y conservar el ácido nucleico. La proporción de polinucleótido o polipéptido condensado para la preparación de lípidos puede variar pero generalmente será de aproximadamente 1:1 (mg de ADN:micromoles de lípido) o más de lípido. Para una revisión del uso de liposomas como vehículos para el suministro de ácidos nucleicos, véase el docu-
mento Hug y Sleight (1991) Biochim, Biophys. Acta 1097: 1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101: 512-527.

Las preparaciones de liposomas para su uso en la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras. Los liposomas catiónicos han demostrado mediar en el suministro intracelular de ADN de plásmidos (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7416); ARNm (Malone (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6077-6081); y factores de transcripción purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265: 10189-10192), de forma funcional.

Los liposomas catiónicos están fácilmente disponibles. Por ejemplo están disponibles liposomas de N[1-2-3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA) con la marca comercial Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, NY. (Véase también Felgner anteriormente). Otros liposomas disponibles en el mercado incluyen transfectace (DDAB/DOPE) y DOTA/DOPE (Boerhinger). Otros liposomas catiónicos pueden prepararse a partir de materiales fácilmente disponibles usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase por ejemplo los documentos Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194-4198; WO90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas de DOTAP (1,2-bis(oleiloxi)-3-(trimetilamonio)propano).

Análogamente, los liposomas aniónicos y neutros están fácilmente disponibles, tales como de Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) o pueden prepararse fácilmente usando materiales fácilmente disponibles. Dichos materiales incluyen fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina, dioleilfosfatidilcolina (DOPC), dioleilfosfatidilglicerol (DOPG), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales también pueden mezclarse con los materiales de partida DOTMA y DOTAP en proporciones apropiadas. Los procedimientos para preparar liposomas usando estos materiales se conocen bien en la técnica.

Los liposomas pueden comprender vesículas multilaminares (MLV), pequeñas vesículas unilamelares (SUV) o grandes vesículas unilaminares (LUV). Los diversos complejos de liposoma-ácido nucleico se preparan usando procedimientos conocidos en la técnica. Véanse por ejemplo los documentos Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101: 512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394: 483; Wilson (1979) Cell 17: 77); Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443: 629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76: 836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348); Enoch & Stritmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255: 10431; Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 145; y Schaefer-Ridder (1982) Science 215: 166.

E. Lipoproteínas

Además, pueden incluirse lipoproteínas con el polinucleótido o polipéptido a suministrar. Los ejemplos de lipoproteínas a utilizar incluyen: quilomicrones, HDL, IDL, LDL y VLDL. También pueden usarse mutantes, fragmentos o fusiones de estas proteínas. También pueden usarse modificaciones de lipoproteínas de origen natural, tales como LDL acetilada. Estas lipoproteínas pueden dirigir el suministro de polinucleótidos a células que expresan receptores de lipoproteínas. Preferentemente, si se incluyen lipoproteínas con el polinucleótido a suministrar, no se incluye ningún otro ligando de dirección en la composición.

Las lipoproteínas de origen natural comprenden un lípido y una porción proteica. La porción proteica se conoce como apoproteína. Actualmente, se han aislado e identificado las apoproteínas A, B, C, D y E. Al menos dos de éstas contienen varias proteínas, denominadas mediante números romanos AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.

La lipoproteína A puede comprender más de una apoproteína. Por ejemplo, los quilomicrones de origen natural están constituidos por A, B, C y E, a lo largo del tiempo estas lipoproteínas pierden A y adquieren apoproteínas C y E. VLDL comprende A, B, C y E, LDL comprende la apoproteína B y HDL comprende las apoproteínas A, C y E.

Los aminoácidos de estas apoproteínas se conocen y se describen por ejemplo en los documentos Breslow (1985) Annu Rev. Biochem 54: 699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151: 162; Chen (1986) J Biol Chem 261: 12918; Kane (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 2465; y Utermann (1984) Hum Genet 65: 232.

Las lipoproteínas contienen diversos lípidos incluyendo triglicéridos, colesterol (libre y en forma de ésteres) y fosfolípidos. La composición de los lípidos varía en las proteínas de origen natural. Por ejemplo, los quilomicrones comprenden principalmente triglicéridos. Una descripción más detallada del contenido de lípidos de las lipoproteínas de origen natural puede encontrarse por ejemplo, en el documento Meth. Enzymol. 128 (1986). La composición de los lípidos se selecciona para que ayuden a la conformación de la apoproteína para la actividad de unión al receptor. La composición de lípidos también puede seleccionarse para facilitar la interacción hidrófoba y la asociación con la molécula de unión al polinucleótido.

Las lipoproteínas de origen natural pueden aislarse a partir del suero mediante ultracentrifugado, por ejemplo. Dichos procedimientos se describen en los documentos Meth Enzymol (anteriormente); Pitas (1980) J. Biochem. 255: 5454-5460 y Mahey (1979) J Clin. Invest 64: 743-750.

Las lipoproteínas también pueden producirse mediante procedimientos in vitro o recombinantes mediante la expresión de los genes de la apoproteína en una célula huésped deseada. Véase por ejemplo, el documento Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15: 403 y Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30: 443.

Las lipoproteínas también pueden adquirirse de proveedores comerciales, tales como Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA.

Una descripción adicional de las lipoproteínas puede encontrarse en el documento Zuckermann y col., aplicación PCT Nº US97/14465.

F. Agentes policatiónicos

Los agentes policatiónicos pueden incluirse, con o sin lipoproteína, en una composición con el polinucleótido o polipéptido a administrar deseado.

Los agentes policatiónicos, muestran normalmente una carga neta positiva a un pH pertinente fisiológico y son capaces de neutralizar la carga eléctrica de ácidos nucleicos para facilitar el suministro a una ubicación deseada. Estos agentes tienen aplicaciones in vitro, ex vivo e in vivo. Los agentes policatiónicos pueden usarse para suministrar ácidos nucleicos a un sujeto vivo por vía intramuscular, por vía subcutánea, etc.

Los siguientes son ejemplos de polipéptidos útiles como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina, poliornitina, y protamina. Otros ejemplos incluyen histonas, protaminas, albúmina de suero humano, proteínas de unión al ADN, proteínas cromosómicas no histona, proteínas de la envuelta a partir de virus de ADN tales como (X174, los factores transcripcionales también contienen dominios que se unen al ADN y por lo tanto pueden ser útiles como agentes de condensación de ácidos nucleicos. En resumen, los factores transcripcionales tales como C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP y TFIID contienen dominios básicos que se unen a secuencias de ADN.

Los agentes policatiónicos orgánicos incluyen: espermina, espermidina y putrescina.

Las dimensiones y las propiedades físicas de un agente policatiónico pueden extrapolarse a partir de la lista anterior para construir otros agentes policatiónicos de polipéptidos, para producir agentes policatiónicos sintéticos.

Agentes policatiónicos sintéticos

Los agentes policatiónicos sintéticos que son útiles incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno, lipofectin®, y lipofectAMINE® que son monómeros que forman complejos policatiónicos cuando se combinan con polinucleótidos o polipéptidos.

Ensayos de Inmunodiagnóstico

Los antígenos de Neisseria de la invención pueden usarse en inmunoensayos para detectar niveles de anticuerpo (o, por el contrario, pueden usarse anticuerpos anti Neisseria para detectar niveles de antígeno). Los inmunoensayos basados en antígenos recombinantes bien definidos pueden desarrollarse para sustituir procedimientos de diagnóstico invasivos. Los anticuerpos para proteínas de Neisseria con muestras biológicas, incluyen, por ejemplo, muestras de sangre o de suero donde pueden detectarse. El diseño de los inmunoensayos está sometido a una gran cantidad de variación y se conocen diversos inmunoensayos en la técnica. Los protocolos para el inmunoensayo pueden basarse, por ejemplo, en competición, reacción directa, o en ensayos de tipo sándwich. Los protocolos también pueden usar, por ejemplo, soportes sólidos o pueden realizarse mediante inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos implican el uso de un anticuerpo o polipéptido marcado. Las marcas pueden ser, por ejemplo, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o moléculas de tinte. Los ensayos que amplifican las señales a partir de la sonda también se conocen. Los ejemplos de estos son ensayos que utilizan biotina y avidina e inmunoensayos marcados con enzimas, tales como ensayos ELISA.

Se construyen kits adecuados para inmunodiagnóstico y que contienen los reactivos marcados apropiados envasando los materiales apropiados, incluyendo las composiciones de la invención, en recipientes adecuados, junto con los reactivos y materiales restantes (por ejemplo, tampones adecuados, soluciones salinas, etc.) necesarios para la realización del ensayo, así como un conjunto adecuado de instrucciones para el ensayo.

Hibridación de Ácidos Nucleicos

"Hibridación", se refiere a la asociación de dos secuencias de ácidos nucleicos entre sí mediante puentes de hidrógeno. Normalmente, una secuencia se fijará un soporte sólido y la otra estará libre en solución. Después, las dos secuencias se pondrán en contacto entre sí en condiciones que favorecen la formación de puentes de hidrógeno. Los factores que afectan a esta formación de puentes incluyen: el tipo y el volumen del disolvente, la temperatura de la reacción; el tiempo de hibridación; la agitación; agentes para bloquear la unión no específica de la secuencia de fase líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO); concentración de las secuencias; uso de compuestos para aumentar el índice de asociación de la secuencia (sulfato de dextrano o polietilenglicol); y la rigurosidad de las condiciones de lavado después de la hibridación; véase el documento Sambrook y col. [anteriormente] Volumen 2, capítulo 9, páginas 9.47 a 9.57.

"Rigurosidad" se refiere a condiciones en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de secuencias muy similares por encima de la de secuencias que son diferentes. Por ejemplo, la combinación de temperatura y concentración de sales debe seleccionarse de modo que esté aproximadamente 120 a 200º C por debajo de la Tm calculada para el híbrido estudiado. La temperatura y las condiciones de las sales pueden determinarse a menudo de forma empírica en experimentos previos en los que muestras del ADN genómico inmovilizadas en filtros se hibridan con la secuencia de interés y después se lavan en condiciones de diferentes rigurosidades. Véase el documento Sambrook y col. en la página 9.50.

Las variables a considerar cuando se realiza, por ejemplo, una inmunotransferencia de Southern son (1) la complejidad del ADN que se inmunotransfiere y (2) la homología entre la sonda y las secuencias detectadas. La cantidad total de los fragmentos a estudiar puede variar en una magnitud de 10, entre 0,1 y 10 \mug para un plásmido o fago digerido a 10^{-9} y 10^{-8} g a partir de una única copia del gen en un genoma eucariota muy complejo. Para polinucleótidos de menor complejidad, pueden usarse tiempos de inmunotransferencia, de hibridación y de exposición sustancialmente más cortos, una menor cantidad de polinucleótidos de partida y una actividad específica menor de las sondas. Por ejemplo, un gen de levadura, de copia única puede detectarse con un tiempo de exposición de solamente una hora empezando con 1 \mug de ADN de levadura, inmunotransfiriendo durante dos horas e hibridando durante 4-8 horas con una sonda de 10^{8} cpm/\mug. Para un gen de mamífero de copia única, un enfoque conservativo debería comenzar con 10 \mug de ADN, inmunotransferencia durante toda la noche e hibridación durante toda la noche en presencia de sulfato de dextrano a 10% usando una sonda de más de 10^{8} cpm/\mug, dando como resultado un tiempo de exposición de aproximadamente 24 horas.

Varios factores pueden afectar a la temperatura de fusión (Tm) de un híbrido de ADN-ADN entre la sonda y el fragmento de interés y como consecuencia, las condiciones apropiadas para la hibridación y el lavado. En muchos casos la sonda no es homologa al 100% con el fragmento. Otras variables que se encuentran comúnmente incluyen la longitud y el contenido de G+C total de las secuencias de hibridación y la fuerza iónica y el contenido de formamida del tampón de hibridación. Los efectos de estos factores pueden relacionarse aproximadamente mediante una única ecuación:

Tm = 81 + 16,6(log_{10}Ci) + 0,4[%(G + C)]-0,6(% de formamida) - 600/n-1,5(% de emparejamiento erróneo).

donde Ci es la concentración de sales (iones monovalentes) y n es la longitud del híbrido en pares de bases (modificada ligeramente de Meinkoth & Wahi (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284).

En el diseño de un experimento de hibridación, pueden alterarse convenientemente algunos factores que afectan a la hibridación del ácido nucleico. La temperatura de la hibridación y de los lavados y la concentración de sales durante el lavado son las variables más sencillas de ajustar. A medida que la temperatura de la hibridación aumenta (es decir, aumenta la rigurosidad), es menos probable que ocurra la hibridación entre cadenas que no son homólogas y como resultado, el fondo disminuye. Si la sonda radiomarcada no es completamente homóloga con el fragmento inmovilizado (como es frecuentemente el caso en familias de genes y en experimentos de hibridación interespecíficos), debe reducirse la temperatura de hibridación y el fondo aumentará. La temperatura de los lavados afecta a la intensidad de la banda de hibridación y al grado de fondo de forma similar. La rigurosidad de los lavados también aumenta disminuyendo la concentración de sales.

En general, las temperaturas de hibridación adecuadas en presencia de formamida a 50% son 42ºC para una sonda que es de 95 a 100% homóloga con el fragmento diana, 37ºC para 90% a 95% de homología y 32ºC para 85 a 90% de homología. Para homologías inferiores, debe rebajarse el contenido de formamida y la temperatura debe ajustarse adecuadamente, usando la ecuación anterior. Si la homología entre la sonda y el fragmento diana no se conoce, el enfoque más sencillo es comenzar con condiciones de hibridación y de lavado que no sean rigurosas. Si se observan bandas no específicas o un alto fondo después de la autorradiografía, el filtro puede lavarse con rigurosidad alta y volverse a exponer. Si el tiempo necesario para la exposición hace que este enfoque sea poco práctico, deben ensayarse en paralelo varias rigurosidades de hibridación y/o de lavado.

Ensayos de Sonda de Ácido Nucleico

Procedimientos tales como PCR, ensayos de sonda de ADN ramificado, o técnicas de inmunotransferencia utilizando sondas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden determinar la presencia de ADNc o ARNm. Se dice que una sonda "hibrida" con una secuencia de la invención si puede formar un dúplex o un complejo de doble cadena, que sea lo suficientemente estable para detectarse.

Las sondas de ácido nucleico hibridarán con las secuencias de nucleótidos de Neisseria de la invención (incluyendo cadena sentido y antisentido). Aunque muchas secuencias de nucleótidos diferentes codificarán las secuencias de aminoácidos, se prefiere la secuencia de Neisseria natural ya que es la verdadera secuencia presente en las células. El ARNm representa una secuencia codificante y de este modo una sonda debe ser complementaria con la secuencia codificante. El ADNc de cadena sencilla es complementario al ARNm, y por tanto una sonda de ADNc debe ser complementaria con la secuencia no codificante.

No es necesario que la secuencia de la sonda sea idéntica a la secuencia de Neisseria (o que lo sea completamente), algunas variaciones en la secuencia y en la longitud pueden conducir a una sensibilidad del ensayo aumentada si la sonda del ácido nucleico puede formar un dúplex con nucleótidos diana, que puede ser detectado. Además, la sonda de ácido nucleico puede incluir nucleótidos adicionales para estabilizar el dúplex formado. Una secuencia de Neisseria adicional también puede ser útil como marca para detectar el dúplex formado. Por ejemplo, puede unirse una secuencia de nucleótidos no complementaria en el extremo 5' de la sonda, siendo el resto de la sonda complementario a la secuencia de Neisseria. Como alternatural, pueden introducirse en la sonda bases no complementarias o secuencias más largas, siempre que la secuencia de la sonda tenga la suficiente complementariedad con la secuencia de Neisseria para hibridar con ella y formar de este modo un dúplex que pueda detectarse.

La longitud y secuencia exacta de la sonda dependerán de las condiciones de hibridación, tales como temperatura, condiciones salinas y similares. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia del analito, la sonda de ácido nucleico contiene normalmente al menos 10-20 nucleótidos, preferentemente 15-25 y más preferentemente al menos 30 nucleótidos, aunque puede ser más corta. Los cebadores cortos requieren generalmente temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con la plantilla.

Pueden producirse sondas mediante procedimientos sintéticos, tales como el procedimiento del triéster de Matteucci y col. [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103: 3185], o de acuerdo con Urdea y col. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 7461] o usando sintetizadores automatizados de oligonucleótidos disponibles en el mercado.

La naturaleza química de la sonda puede seleccionarse de acuerdo con las preferencias. Para algunas aplicaciones, son apropiados ADN o ARN. Para otras aplicaciones, pueden incorporarse modificaciones por ejemplo, modificaciones en la estructura, tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, que pueden usarse para aumentar la semivida in vivo, alterar la afinidad por ARN, aumentar la resistencia a nucleasa, etc. [por ejemplo véase el documento Agrawal & Iyer (1995) Curr Opin Biotenchnol 6: 12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14: 376-387]; también pueden usarse análogos tales como ácidos péptidonucleicos [por ejemplo véase el documento Corey (1997) TIBIECH 15: 224-229, Buchardt y col. (1993) TIBTECH 11: 384-386].

Un ejemplo de un ensayo de hibridación de nucleótidos se describe por Urdea y col en la solicitud de patente internacional WO92/02526 [véase también patente de Estados Unidos 5.124.246].

Como alternatural, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es otro procedimiento bien conocido para detectar pequeñas cantidades de ácido nucleico diana. El ensayo se describe en el documento: Mullis y col [Meth. Enzymol. (1987) 155: 335-350]; patente de Estados Unidos 4.683.195; y patente de Estados Unidos 4.683.202. Dos nucleótidos "cebadores" hibridan con los ácidos nucleicos diana y se usan para iniciar la reacción. Los cebadores pueden comprende una secuencia que no hibrida con la secuencia de la diana de amplificación (o con su complemento) para ayudar a la estabilidad del dúplex o, por ejemplo, para incorporar un sitio de restricción adecuado. Normalmente, dicha secuencia flanqueará a la secuencia de Neisseria deseada.

Una polimerasa termoestable crea copias de ácidos nucleico diana a partir de los cebadores usando los ácidos nucleicos diana como plantilla. Después de que se haya generado una cantidad umbral de ácidos nucleicos diana mediante la polimerasa, pueden detectarse mediante procedimientos más convencionales, tales como inmunotransferencias de Southern. Cuando se usa el procedimiento de inmunotransferencia de Southern, la sonda marcada hibridará con la secuencia de Neisseria (o con su complemento).

También pueden detectarse ARNm o ADNc mediante técnicas de inmunotransferencia tradicionales, descritas en el documento Sambrook y col [anteriormente]. El ARNm o el ADNc generado a partir de ARNm usando una enzima polimerasa, pueden purificarse y separarse usando electroforesis en gel. Los ácidos nucleicos en el gel se inmunotransfieren después a un soporte sólido, tal como nitrocelulosa. El soporte sólido se expone a una sonda marcada y después se lava para eliminar la sonda sin hibridar. A continuación, se detectan los dúplex que contienen la sonda marcada. Normalmente, la sonda se marca con un resto radioactivo.

Ejemplos

Los ejemplos describen secuencias de ácidos nucleicos que se han identificado en N. meningitidis, y N. gono- rrhoeae junto con sus supuestos y respectivos productos de traducción. Los ejemplos incluyen:

\bullet

una secuencia de nucleótidos que se ha identificado en N. meningitidis.

\bullet

el supuesto producto de traducción de dicha secuencia de N. meningitidis.

\bullet

una secuencia de nucleótidos correspondiente identificada en N. gonorrhoeae.

\bullet

el supuesto producto de traducción de dicha secuencia de N. gonorrhoeae.

\bullet

una comparación del porcentaje de identidad entre el producto de traducción de la secuencia de N. meningitidis y el de la secuencia de N. gonorrhoeae.

Las comparaciones de secuencia se realizaron en NCBI (http://www.ncbi.nim.nih.gov) usando los algoritmos BLAST, BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx, y tBLASTx [por ejemplo véase el documento Altschul y col. (1997) Gapped BLAST y PSI-BLAST: a new generation or protein database search programs. Nucleic Acids Research 25: 2289-3402]. Las búsquedas se realizaron en las siguientes bases de datos: secuencias no redundantes GenBank+EMBL+DDBJ+PDB y secuencias no redundantes y GenBank CDS translations+PBD+SwissProt+SPPupdate
+PIR.

Las letras minúsculas representan ambigüedades que surgen durante el alineamiento de reacciones de secuenciación independiente (algunas de las secuencias de nucleótidos en los ejemplos se obtienen a partir de la combinación de los resultados de dos o más experimentos).

Las secuencias de nucleótidos se exploraron en los seis marcos de lectura para predecir la presencia de dominios hidrófobos usando un algoritmo basado en los estudios estadísticos de Esposti y col. [Critical evaluation of the hydropathy of membrane proteins (1990) Eur J Biochem 190: 207-219]. Estos dominios representan potenciales regiones transmembrana o secuencias líderes hidrófobas.

Los marcos de lectura abierta se predijeron a partir de secuencias de nucleótidos fragmentadas usando el programa ORFFINDER (NCBI).

Las secuencias de aminoácidos subrayadas indican posibles dominios transmembrana o secuencias líderes en los ORF, de acuerdo con lo predicho con el algoritmo PSORT (http://www.psort.nibb.ac.jp). Los dominios funcionales también se predijeron usando el programa MOTIFS (GCG Wisconsin & PROSITE).

En base a la presencia de una supuesta secuencia líder y/o varios supuestos dominios transmembrana (subrayados con una única línea) en la proteína de gonococos, se predice que las proteínas de N. meningitidis y N. gonorrhoeae y sus respectivos epítopos podrían ser antígenos útiles o composiciones inmunogénicas para vacunas o diagnósticos.

Las técnicas y procedimientos convencionales que pueden emplearse para realizar la invención (por ejemplo, para utilizar las secuencias descritas para vacunación o diagnóstico) se han resumido anteriormente. Este resumen no es una limitación de la invención, sino que proporciona ejemplos que pueden usarse, pero que no son necesarios.

En particular, se usaron los siguientes procedimientos para expresar, purificar y caracterizar bioquímicamente a las proteínas de la invención.

Preparación de ADN Cromosómico

Se cultivó la cepa 2996 de N. meningitidis hasta una fase exponencial en 100 ml de medio GC, se recogió mediante centrifugado y se resuspendió en 5 ml de tampón (sacarosa a 20%, Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM, ajustado a pH 8,0). Después de 10 minutos de incubación en hielo, las bacterias se lisaron añadiendo 10 ml de solución de lisis (NaCl 50 mM, Na-Sarkosyl a 1%, 50 mg/ml de proteinasa K) y la suspensión se incubó a 37ºC durante 2 horas. Se realizaron 2 extracciones de fenol (equilibrado a pH 8) y una extracción con ChCl_{3}/alcohol isoamílico (24:1). El ADN se precipitó mediante la adición de acetato sódico 0,3 M y 2 volúmenes de etanol y se recogió mediante centrifugado. El sedimento se lavó una vez con etanol a 70% y se redisolvió en 4 ml de tampón (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). La concentración de ADN se midió leyendo la DO a 260 nm.

Diseño de oligonucleótidos

Se diseñaron cebadores de oligonucleótidos sintéticos en base a la secuencia codificante de cada ORF, usando (a) la secuencia de meningococos B cuando estaba disponible o (b) la secuencia de gonococos/meningococos A adaptada para el uso preferente del codón de los meningococos. Se omitieron los péptidos señal predichos, sustrayendo la secuencia cebador de amplificador del extremo 5' inmediatamente cadena abajo a partir de la secuencia líder predicha.

Para la mayoría de los ORF, los cebadores 5' incluían 2 sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (BamHI-NdeI, BamHI-NheI, o EcoRI-NheI, dependiendo del patrón de restricción del gen); los cebadores 3' incluyeron un sitio de restricción XhoI. Se estableció este procedimiento para dirigir la clonación de cada producto de amplificación (correspondiente a cada ORF) en dos sistemas de expresión diferentes: pGEX-KG (usando BamHI-XhoI o EcoRI-XhoI), y pET21 b+ (usando NdeI-XhoI o NheI-Xhol).

100

Para algunos ORF se realizaron dos amplificaciones diferentes para clonar cada ORF en los dos sistemas de expresión. Se usaron dos cebadores 5' para cada ORF; se usó el mismo cebador XhoI 3' que anteriormente:

101

Otros ORF pueden clonarse en el vector de expresión pTRC y expresarse como una fusión His-tag amino-terminal. El péptido señal predicho puede incluirse en el producto final. Se incorporaron sitios de restricción NheI-BamHI usando cebadores:

102

Además de contener las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción, los cebadores incluían nucleótidos que hibridaban con la secuencias a amplificar. El número de nucleótidos que hibridaban dependía de la temperatura de fusión de todo el cebador, y se determinaba para cada cebador usando las formulas:

103

La temperatura media de fusión de los oligonucleótidos seleccionados era de 65-70ºC para el oligonucleótido completo y de 50-55ºC para la región de hibridación en solitario.

Los oligonucleótidos se sintetizaron mediante un sintetizador Perkin Elmer 394 DNA/RNA Synthesizer, se eluyeron de las columnas en 2 ml de NH_{4}-OH, y se desprotegieron mediante 5 horas de incubación a 56ºC. Los oligonucleótidos precipitaron mediante adición de acetato de sodio 0,3 M y 2 volúmenes de etanol. Después se centrifugaron las muestras y los sedimentos se resuspendieron en 100 \mul o un 1 ml de agua. Se determinó la DO_{260} usando un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda Bio y la concentración se determinó y se ajustó a 2-10 pmol/\mul.

Cuando se realizaron las amplificaciones iniciales, no podía conocerse la secuencia completa 5' y/o 3' para algunos ORF de meningococos, aunque se habían identificado las secuencias correspondientes en gonococos. Para la amplificación, pudieron usarse por lo tanto las secuencias de gonococos como base para el primer diseño, alteradas para tener en cuenta la preferencia de codones. En particular, pueden cambiarse los siguientes codones: ATA \rightarrow ATT; TCG \rightarrow TCT; CAG \rightarrow CAA; AAG \rightarrow AAA; GAG \rightarrow GAA; CGA y CGG \rightarrow CGC; GGG \rightarrow GGC.

Amplificación

El protocolo de PCR convencional era de la siguiente manera: se usaron 50-200 ng de ADN genómico como plantilla en presencia de 20-40 \muM de cada oligonucleótido, una solución de dNTP 400-800 \muM, 1 volumen de tampón de PCR (incluyendo MgCl_{2} 1,5 mM), 2,5 unidades de Taql ADN polimerasa (usando Perkin Elmer AmpliTaQ, GIBCO Platinum, Pwo DNA polymerase, or Tahara Shuzo Taq polymerase).

En algunos casos, la PCR se optimizaba mediante la adición de 10 \mul de DMSO o 50 \mul de betaína 2 M.

Después de un inicio con calor (añadiendo la polimerasa durante una incubación preliminar de 3 minutos de la mezcla completa a 95ºC), cada muestra experimentó una amplificación de dos etapas: los 5 primeros ciclos se realizaron usando como temperatura de hibridación uno de los oligonucleótidos excluyendo las colas de las enzimas de restricción, seguido de 30 ciclos realizados de acuerdo con la temperatura de hibridación de los oligonucleótidos de longitud completa. Los ciclos venían seguidos de una etapa de extensión de 10 minutos a 72ºC.

Los ciclos convencionales fueron de la siguiente manera:

1

El tiempo de elongación varió de acuerdo con la longitud del ORF a amplificar.

Las amplificaciones se realizaron usando un sistema 9600 o 2400 Perkin Elmer GeneAmp PCR. Para comprobar los resultados, se introdujo 1/10 del volumen de amplificación en un gel de agarosa a 1-1,5% y se comparó el tamaño de cada fragmento amplificado con un marcador de peso molecular de ADN.

El ADN amplificado se introdujo directamente en un gel de agarosa al 1% o se precipitó en primer lugar con etanol y se resuspendió en un volumen adecuado para introducirlo en un gel de agarosa a 1%. El fragmento de ADN correspondiente a la banda de tamaño correcto se eluyó después y se purificó a partir del gel, usando el kit Qiagen Gel Extraction Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. El volumen final del fragmento de ADN era de 30 \mul o 50 \mul de agua o Tris 10 mM, pH 8,5.

Digestión de los fragmentos de PCR

El ADN purificado correspondiente al fragmento amplificado se dividió en dos alícuotas y se digirió por partida doble con: (a) NdeI/XhoI o NheI/XhoI para clonarlo en pET-21 b+ y para la expresión adicional de la proteína como una fusión His-Tag C-terminal; (b) BamHI/XhoI o EcoRI/XhoI para clonarlo en pGEX-KG y la expresión adicional de la proteína como una fusión del extremo N de GST.

Para algunos ORF, puede colocarse NheI/BamHI para clonación en un vector pTRC-HisA y expresión adicional de la proteína como una fusión His-tag N Terminal.

Cada fragmento de ADN purificado se incubó (37ºC durante de 3 horas a una noche) con 20 unidades de cada enzima de restricción (New England Biolabs) en un volumen final de 30 ó 40 \mul en presencia del tampón apropiado. El producto de digestión se purificó después usado el kit de purificación QIAguick PCR, siguiendo las instrucciones del fabricante y se eluyó en un volumen final de 30 (o 50) \mul de agua o Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. La concentración final de ADN se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa a 1% en presencia del marcador de peso molecular titulado.

Digestión de los vectores de clonación (pET22B, pGEX-KG y pTRC-His A)

Se digirieron por partida doble 10 \mug de plásmido con 50 unidades de cada enzima de restricción en 200 \mul de volumen de reacción en presencia del tampón apropiado mediante incubación durante toda la noche a 37ºC. Después de introducir toda la digestión en un gel de agarosa a 1%, se purificó la banda correspondiente al vector digerido a partir del gel usando el kit Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit y el ADN se eluyó en 50 \mul de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. La concentración de ADN se evaluó midiendo la DO_{260} de la muestra y se ajusto a 50 g/ml. Se usó 1 \mul de plásmido para cada procedimiento de clonación.

Clonación

Los fragmentos correspondientes a cada ORF, digeridos previamente y purificados, se ligaron en pET22b y pGEX-KG. En un volumen final de 20 \mul, una proporción molar de 3:1 fragmento/vector se ligó usando 0,5 \mul de T4 ADN ligasa NEB (400 unidades/\mul), en presencia del tampón suministrado por el fabricante. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas. En algunos experimentos, el ligamiento se realizó usando el kit "Rapid Ligation Kit" de Boheringer, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para introducir el plásmido recombinante en una cepa adecuada, se incubaron 100 \mul de células competentes DH5 de E. coli con la solución de reacción de la ligasa durante 40 minutos en hielo, después a 37ºC durante 3 minutos y después, tras añadir 800 \mul de caldo LB, de nuevo a 37ºC durante 20 minutos. Después se centrifugaron las células a una velocidad máxima en una microcentrífuga Eppendorf y se resuspendieron a aproximadamente 200 \mul del sobrenadante. Después se colocó en placas la suspensión en ampicilina LB (100 mg/ml).

La selección de los clones recombinantes se realizó cultivando 5 colonias seleccionadas al azar durante toda la noche a 37ºC en 2 ml (clones pGEX o pTC) o 5 ml (clones pET) en caldo LB + 100 \mug/ml de ampicilina. Después las células se sedimentaron y el ADN se extrajo usando el kit Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante, hasta un volumen final de 30 \mul, se digirieron 5 \mul de cada minipreparación individual (aproximadamente 1 g) con NdeI/XhoI o BamHI/XhoI y toda la digestión se introdujo en un gel de agarosa a 1-1,5% (dependiendo del tamaño esperado para el inserto), en paralelo con el marcador de peso molecular (ADN Ladder de 1 kb, GIBCO). La selección de los clones positivos se realizó de acuerdo con el tamaño correcto del inserto.

Clonación

Algunos ORF pueden clonarse en el vector pGEX-HIS usando sitios de clonación EcoRI-PstI, o EcoRI-SalI o SalI-PstI. Después de la clonación, los plásmidos recombinantes pueden introducirse en el huésped W3110 de E. coli.

Expresión

Cada ORF clonado en el vector de expresión puede transformarse después en la cepa adecuada para la expresión del producto de proteína recombinante. Se usó 1 \mul de cada construcción para transformar 30 \mul de BL21 de E. coli (vector pGEX), TOP 10 de E. coli (vector pTRC) o LB21-DE3 (pET) como se ha descrito anteriormente. En el caso del vector pGEX-His, se usó la misma cepa de E. coli (W3110) para la clonación inicial y la expresión. Se inocularon colonias recombinantes sencillas en 2 ml de LB+Amp (100 \mug/ml), se incubaron a 37ºC durante toda la noche, después se diluyeron a 1:30 en 20 ml de LB+Amp (100 \mug/ml) en matraces de 100 ml, asegurándonos de que la DO_{600} variaba entre 0,1 y 0,15. Los matraces se incubaron a 30ºC en baños de agua con agitación orbital, hasta que la DO indicaba un crecimiento exponencial adecuado para la inducción de la expresión (DO de 0,4-0,8 para vectores pET y pTRC; DO 0,8-1 para vectores pGEX y pGEX-His). Para los vectores pET, pTRC y pGEX-His, la expresión de la proteína se indujo mediante adición de IPTG 1 mM, mientras que en el caso del sistema de pGEX, la concentración final de IPTG era de 0,2 mM. Después de 3 horas de incubación a 30ºC, se comprobó la concentración final de la muestra mediante DO. Para comprobar la expresión, se extrajo 1 ml de cada muestra, se centrifugó en una microcentrífuga, el sedimento se resuspendió en PBS y se analizó mediante SDS-PAGE a 12% con tinción de azul de Coomassie. Toda la muestra se centrifugó a 6.000 g y el sedimento se resuspendió en PBS para uso adicional.

Purificación a gran escala de proteínas de fusión GST

Se cultivó una única colonia durante toda la noche a 37ºC en una placa de agar LB+Amp. Las bacterias se inocularon en 20 ml de cultivo líquido LB+Amp en un baño de agua con agitación y se cultivaron durante toda la noche. Las bacterias se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio recién preparado y se les dejó crecer a la temperatura óptima (20-37ºC) hasta una DO_{550} de 0,8-1. Se indujo la expresión de las proteínas con IPTG 0,2 mM seguido de 3 horas de incubación. El cultivo se centrifugó a 8000 rpm a 4ºC. El sobrenadante se descartó y el sedimento bacteriano se resuspendió en 7,5 ml de PBS frío. Las células se rompieron mediante sonicación en hielo durante 30 segundos a 40 W usando un sonicador Branson B-15, se congelaron y se descongelaron dos veces y se centrifugaron de nuevo. El sobrenadante se recogió y se mezcló con 150 \mul de resina Glutatione-Sepharose 4B (Pharmacia) (previamente lavada con PBS) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5 minutos a 4ºC. La resina se lavó dos veces con 10 ml de PBS frío durante 10 minutos, se resuspendió en 1 ml de PBS frío y se introdujo en una columna desechable. La resina se lavó dos veces con 2 ml de PBS frío hasta que el flujo a su través alcanzaba una DO_{280} de 0,02-0,06. La proteína de fusión GST se eluyó mediante la adición de 700 \mul de tampón de elución de glutatión frío 10 mM reducido con glutatión, Tris-HCl 50 mM) y se recogieron las fracciones hasta que la DO_{280} era de 0,1. Se introdujeron 21 \mul de cada fracción en un gel SDS a 12% usando el patrón de amplio espectro de peso molecular de SDS-PAGE de Biorad (M1) (200, 116,25, 97,4, 66,2, 45, 31, 21,5, 14,4, 6,5 kDa) o el marcador Amersham Rainbow Marker (M'') (200, 66, 46, 30, 21,5, 14,3 kDa) como patrones. Como el PM de GST es de 26 kDa, este valor debe añadirse al PM de cada proteína de fusión GST.

Purificación a gran escala de proteínas solubles de fusión His

Una única colonia se cultivó durante toda la noche a 37ºC en una placa de agar LB + Amp. Las bacterias se inocularon en 20 ml de cultivo líquido LB + Amp y se incubaron durante toda la noche en un baño de agua con agitación. Las bacterias se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio recién preparado y se dejaron crecer a la temperatura óptima (20-37ºC) a una DO_{550} de 0,6-0,8. La expresión de las proteínas se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM y el cultivo se incubó adicionalmente durante tres horas. El cultivo se centrifugó a 8000 rpm a 4ºC, el sobrenadante se descartó y el sedimento bacteriano se resuspendió en 7,5 ml de tampón de imidazol 10 mM frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 10 mM, pH 8). Las células se rompieron mediante sonicación en hielo durante 30 segundos a 40 W usando un sonicador Branson B-15, se congelaron y se descongelaron dos veces y se centrifugaron de nuevo. El sobrenadante se recogió y se mezcló con 150 \mul de resina Ni^{2+} (Pharmacia) (previamente lavada con tampón imidazol 10 mM) y se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5 minutos a 4ºC. La resina se lavó dos veces con 10 ml de tampón de imidazol 10 mM frío durante 10 minutos, se resuspendió en 1 ml de tampón de imidazol 10 mM frío y se introdujo en una columna desechable. La resina se lavó a 4ºC con 2 ml de tampón de imidazol 10 mM frío hasta que el flujo a su través alcanzaba una DO_{280} de 0,02-0,06. La resina se lavó con 2 ml de tampón de imidazol 20 mM frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 20 mM, pH 8) hasta que el flujo a su través alcanzó la DO_{280} de 0,02-0,06. La proteína de fusión His se eluyó mediante la adición de 700 \mul de tampón de imidazol 250 mM frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 250 mM, pH 8) y se recogieron las fracciones hasta que la DO_{280} era de 0,1. Se introdujeron 21 \mul de cada fracción en un gel SDS a 12%.

Purificación a gran escala de proteínas insolubles de fusión His

Una única colonia se cultivó durante toda la noche a 37ºC en una placa de agar LB + Amp. Las bacterias se inocularon en 20 ml de cultivo líquido LB + Amp en un baño de agua con agitación y se cultivaron durante toda la noche. Las bacterias se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio recién preparado y se dejaron crecer a la temperatura óptima (37ºC) a una DO_{550} de 0,6-0,8.

La expresión de las proteínas se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM y el cultivo se incubó adicionalmente durante 3 horas. El cultivo se centrifugó a 8000 rpm a 4ºC. El sobrenadante se descartó y el sedimento bacteriano se resuspendió en 7,5 ml de tampón de B (urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 10 mM, pH 8,8). Las células se rompieron mediante sonicación en hielo durante 30 segundos a 40 W usando un sonicador Branson B-15, se congelaron y se descongelaron dos veces y se centrifugaron de nuevo. El sobrenadante se almacenó a -20ºC, mientras que el sedimento se resuspendió en 2 ml de tampón de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, tampón fosfato 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) y se trataron en un homogeneizador durante 10 ciclos. El producto se centrifugó a 13.000 rpm durante 40 minutos. El sobrenadante se mezcló con 150 \mul de resina Ni^{2+} (Pharmacia) (previamente lavada con tampón B) y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5 minutos a 4ºC. La resina se lavó dos veces con 10 ml de tampón B durante 10 minutos, se resuspendió en 1 ml de tampón B y se cargó en una columna desechable. La resina se lavó a temperatura ambiente con 2 ml de tampón B hasta que el flujo a su través alcanzaba una DO_{280} de 0,02-0,06. La resina se lavó con 2 ml de tampón C (urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 6,3) hasta que el flujo a su través alcanzó la DO_{280} de 0,02-0,06. La proteína de fusión His se eluyó mediante la adición de 700 \mul de tampón de elución (urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 4,5) y se recogieron las fracciones hasta que la DO_{280} era de 0,1. Se introdujeron 21 \mul de cada fracción en un gel SDS a 12%.

Renaturalización de proteínas de fusión His

Se añadió glicerol al 10% a las proteínas desnaturalizadas. Después se diluyeron las proteínas a 20 \mug/ml usando tampón de diálisis I (glicerol a 10%, arginina 0,5 M, tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0,5 mM, urea 2 M, pH 8,8) y se dializó frente al mismo tampón a 4ºC durante 12-14 horas. La proteína se dializó adicionalmente frente al tampón de diálisis II (glicerol a 10%, arginina 0,5 M, tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0,5 mM, pH 8,8) durante 12-14 horas a 4ºC. La concentración de proteína se evaluó usando la fórmula:

104

Inmunizaciones de ratones

Se usaron 20 \mug de cada proteína purificada para inmunizar ratones por vía intraperitoneal. En el caso de algunos ORF, se inmunizaron ratones Balb-C con Al(OH)_{3} como adyuvante en los días 1, 21 y 42, y la respuesta inmune se controló en muestras tomadas el día 56. Para otros ORF, los ratones CD1 podían inmunizarse usando el mismo protocolo. Para los ORF 25 y 40, se inmunizaron ratones CD1 usando adyuvante de Freund, y se usó el mismo protocolo de inmunización, excepto que la respuesta inmune se medía el día 42, en lugar del 56. Análogamente, para otros ORF, se inmunizaron ratones CD1 con adyuvante de Freund, pero la respuesta inmune se midió el día 49.

Ensayo ELISA (análisis de los sueros)

La cepa M7 de MenB encapsulado se colocó en placas de agar chocolate y se incubó durante toda la noche a 37ºC. Se recogieron colonias bacterianas a partir de las placas de agar usando un hisopo de dracon estéril y se inocularon en 7 ml de caldo Mueller-Hinton (Difco) que contenía glucosa a 0,25%. El crecimiento bacteriano se controló cada 30 minutos siguiendo la DO_{620}. Se dejó crecer a las bacterias hasta que la DO alcanzaba el valor de 0,3-0,4. El cultivo se centrifugó durante 10 minutos a 10.000 rpm. El sobrenadante se descartó y las bacterias se lavaron una vez con PBS, se resuspendieron en PBS que contenía formaldehído a 0,025% y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y después durante toda la noche a 4ºC con agitación. Se añadieron 100 \mul de células bacterianas a cada pocillo de una placa Greiner de 96 pocillos y se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Después se lavaron los pocillos tres veces con tampón de lavado PBT (Tween 20 a 0,1% en PBS). Se añadieron 200 \mul de tampón de saturación (polivinilpirrolidona a 2,7% en agua) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Se lavaron los pocillos tres veces con PBT. Se añadieron 200 \mul de suero diluido (tampón de dilución: BSA a 1%, Tween 20 a 0,1%, NaN_{3} a 0,1% en PBS) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron tres veces con PBT. Se añadieron 100 \mul de suero anti-ratón de conejo conjugado con HRP (Dako) diluido a 1:2000 en tampón de dilución a cada pocillo y las placas se incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón PBT. Se añadieron 100 \mul de tampón sustrato para HRP (25 ml de tampón citrato pH 5, 10 mg de O-fenildiamina y 10 \mul de H_{2}O) a cada pocillo y las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron 100 \mul de H_{2}SO_{4} a cada pocillo y se siguió la DO_{490}. El ensayo ELISA se consideró positivo cuando la DO_{490} era 2,5 veces la de los sueros pre-inmunes respectivos.

Procedimiento de ensayo de Unión de Bacterias FACScan

La cepa M7 de MenB encapsulados se colocó en placas de agar chocolate y se incubó durante toda la noche a 37ºC. Se recogieron colonias bacterianas a partir de las placas de agar usando un hisopo de dracon estéril y se inocularon en 4 tubos que contenían 8 ml cada uno de caldo Mueller-Hinton (Difco) que contenía glucosa a 0,25%. El crecimiento bacteriano se controló cada 30 minutos siguiendo la DO_{620}. Se dejó crecer a las bacterias hasta que la DO alcanzaba el valor de 0,35-0,5. El cultivo se centrifugó durante 10 minutos a 4.000 rpm. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en tampón de bloqueo (BSA a 1%, NaN_{3} a 0,4%) y se centrifugó durante 5 minutos a 4.000 rpm. Las células se resuspendieron en tampón de bloqueo para alcanzar DO_{620} de 0,07. Se añadieron 10 \mul de células bacterianas a cada pocillo de una placa Costar de 96 pocillos. Se añadieron 100 \mul de sueros diluidos (1:200) (en tampón de bloqueo) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 2 horas a 4ºC. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 4.000 rpm, se aspiro el sobrenadante y las células se lavaron mediante la adición de 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo en cada pocillo. Se añadieron 100 \mul de F(ab)_{2} conjugado con R-ficoeritrina de cabra anti-ratón, diluido a 1:100, a cada pocillo y las placas se incubaron durante una hora a 4ºC. Las células se sedimentaron mediante centrifugado a 4.000 rpm durante 5 minutos y se lavaron mediante adición de 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 200 \mul/pocillo de PBS, formaldehído a 0,25%. Las muestras se transfirieron a tubos FACScan y se leyeron. Las condiciones para el ajuste del FASCan eran: FL1 activado, FL2 y FL3 desactivado; umbral de FSC-H 92; voltaje de FSC PMT: E 02; SSC PMT: 474; aumentos de amplitud 7,1; FL-2 PMT: 539. Valores de compensación: 0.

Preparaciones de OMV

Se cultivaron bacterias durante toda la noche en 5 placas GC, se recogieron con un asa de siembra y se resuspendieron en 10 ml de Tris-HCl 20 mM. Se realizó inactivación con calor a 56ºC durante 30 minutos y las bacterias se rompieron mediante sonicación durante 10 minutos en hielo (50% de ciclo de trabajo, 50% de rendimiento). Las células sin romper se eliminaron mediante centrifugado a 5000 g durante 10 minutos y la fracción de la envuelta celular total se recuperó mediante centrifugado a 50.000 g a 4ºC durante 75 minutos. Para extraer las proteínas de la membrana citoplasmática de las membranas externas en bruto, toda la fracción se resuspendió en Sarkosyl a 2% (Sigma) y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. La suspensión se centrifugó a 10.000 g durante 10 minutos para eliminar los agregados y el sobrenadante se ultracentrifugó a 50.000 g durante 75 minutos para sedimentar las membranas externas. Las membranas externas se resuspendieron en Tris-HCl 10 mM, pH 8 y la concentración de proteínas se midió mediante el ensayo Bio-Rad Protein, usando BSA como patrón.

Preparación de Extractos Totales

Se cultivaron las bacterias durante toda la noche en una placa GC, se recogieron con un asa de siembra y se resuspendieron en 1 ml de Tris-HCl 20 mM. Se realizó inactivación con calor a 56ºC durante 30 minutos.

Inmunotransferencia de Western

Se introdujeron proteínas purificadas (500 ng/pista), vesículas de membrana externa (5 \mug) y de extractos de células totales (25 \mug) obtenidos de la cepa de MenB 2996 en SDS-PAGE a 15% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se realizó durante 2 horas a 150 mA a 4ºC, en tampón de transferencia (Tris básico a 0,3%, glicina a 1,44% y metanol a 20%). La membrana se saturaba mediante incubación durante toda la noche a 4ºC en tampón de saturación (leche desnatada a 10%, Tritón X100 a 0,1% en PBS). La membrana se lavó dos veces con tampón de lavado (leche desnatada a 0,3%, Tritón X100 a 0,1% en PBS) y se incubó durante 2 horas a 37ºC en sueros de ratón diluidos en tampón de lavado 1:200. La membrana se lavó dos veces y se incubó durante 90 minutos en una dilución 1:2000 de Ig anti-ratón marcada con peroxidasa de rábano rusticano. La membrana se lavó dos veces con Tritón X100 a 0,1% en PBS y se desarrollo con el kit Opti-4CN Substrate Kit (Bio-Rad). La reacción se interrumpió añadiendo agua.

Ensayo bactericida

La cepa MC58 se cultivó durante toda la noche a 37ºC en placas de agar chocolate. Se recogieron 5-7 colonias y se usaron para inocular 7 ml de caldo Mueller-Hinton. La suspensión se incubó a 37ºC en un mezclador nutator y se dejó crecer hasta que la DO_{620} estaba entre 0,5-0,8. El cultivo se dividió en alícuotas en tubos Eppendorf estériles de 1,5 ml y se centrifugó durante 20 minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga. El sedimento se lavó una vez en tampón de Gey (Gibco) y se resuspendió en el mismo tampón a una DO_{620} de 0,5, se diluyó a 1:20000 en tampón de Gey y se almacenó a 25ºC.

Se añadieron 50 \mul de tampón Gey/BSA a 1% a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Se añadieron 25 \mul de sueros de ratón diluidos (1:100) (tampón de dilución: tampón de Gey/BSA a 0,2%) y la placa se incubó a 4ºC. Se añadieron 25 \mul de la suspensión bacteriana descrita anteriormente a cada pocillo. Se añadieron 25 \mul de complemento de cría de conejo inactivado con calor (56ºC durante 30 minutos) o normal a cada pocillo. Inmediatamente después de la adición del complemento de cría de conejo, se colocaron 22 \mul de cada muestra/pocillo en placas de agar Mueller-Hinton (tiempo 0). La placa de 96 pocillos se incubó durante 1 hora a 37ºC con rotación y después se colocaron 22 \mul de cada muestra/pocillo en placas de agar Mueller-Hinton (tiempo 1). Después de una incubación durante toda la noche se contaron las colonias correspondientes a tiempo 0 y a tiempo 1.

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Secuencias

Usando los procedimientos descritos anteriormente, se identificó la siguiente secuencia de ADN parcial en N. gonorrhoeae <ID SEC Nº 1>:

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2

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Esto corresponde a la secuencia de aminoácidos <ID SEC Nº 2; ORF 741.ng>

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3

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Se identificó la siguiente secuencia de ADN parcial en N. meningitidis <ID SEC Nº 3>:

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4

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Esto corresponde a la secuencia de aminoácidos <ID SEC Nº 4; ORF 741>:

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5

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m741/g741 61,4% de identidad en un solapamiento de 280 aa

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6

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Se identificó la siguiente secuencia de ADN parcial en N. meningitidis <ID SEC Nº 5>:

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7

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Esto corresponde a la secuencia de aminoácidos <ID SEC Nº 6; ORF 741.a>:

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8

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a741/m741 95,6% de identidad en un solapamiento de 274 aa

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9

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<110> CHIRON CORPORATION

\hskip1cm

THE INSTITUTE FOR GENOMIC RESEARCH

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<120> ANTÍGENOS DE NEISSERIA Y COMPOSICIONES

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<130> P042614EP

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<150> US19980083758P

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<151> 01-05-1998

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<150> US19980094869P

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<151> 31-07-1998

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US19980098994P

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<151> 02-09-1998

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<150> US19980099062P

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 02-09-1998

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<150> US19980103749P

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<151> 09-10-1998

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<150> US19980103794P

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<151> 09-10-1998

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<150> US19980103796P

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<151> 09-10-1998

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<150> US19990121528P

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<151> 25-02-1999

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<150> EP99922752.2

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<151> 30-04-1999

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 14

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<170> SeqWin99, versión 1.02

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<210> 1

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<211> 840

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<212> ADN

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<213> Neisseria gonorrhoeae

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<400> 1

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10

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<210> 2

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<211> 279

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<212> PRT

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<213> Neisseria gonorrhoeae

\newpage

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<400> 2

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 825

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria meningitidis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria meningitidis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

13

130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 825

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria meningitidis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria meningitidis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatccc atatg

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatccg ctagc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaattct agctagc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgctcgag

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaattccat atggccatgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatcc

\hfill

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcagctag ccatatg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatcc

\hfill

8

Claims (39)

1. Una proteína que comprende:

\bullet

la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 2:

\bullet

una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 2 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria;

\bullet

una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 8 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 2;

\bullet

la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 4;

\bullet

una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria;

\bullet

una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 10 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 4;

\bullet

la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 6;

\bullet

una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 6 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria;

\bullet

una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 10 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 6, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 6.

2. La proteína de la reivindicación 1, que tiene más de 60% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.

3. La proteína de la reivindicación 2, que tiene más de 70% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.

4. La proteína de la reivindicación 3, que tiene más de 80% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.

5. La proteína de la reivindicación 4, que tiene más de 90% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.

6. La proteína de la reivindicación 5, que tiene más de 95% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.

7. La proteína de la reivindicación 6, que tiene más de 99% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.

8. La proteína de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 12 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4.

9. La proteína de la reivindicación 8, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 14 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4.

10. La proteína de la reivindicación 9, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 16 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4.

11. La proteína de la reivindicación 10, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 18 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4.

12. La proteína de la reivindicación 11, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 20 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4.

13. La proteína de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 10 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.

14. La proteína de la reivindicación 13, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 12 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.

15. La proteína de la reivindicación 14, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 14 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.

16. La proteína de la reivindicación 15, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 16 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.

17. La proteína de la reivindicación 16, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 18 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.

18. La proteína de la reivindicación 17, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 20 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.

19. La proteína de cualquier reivindicación precedente, siendo la proteína un antígeno de Neisseria.

20. Un anticuerpo que se une de forma específica a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por ID SEC Nº 2, ID SEC Nº 4 e ID SEC Nº 6.

21. El anticuerpo de la reivindicación 20, que es un anticuerpo monoclonal.

22. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 19.

23. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 22, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3 e ID SEC Nº 5.

24. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína eficaz para la prevención de una enfermedad debida a bacterias de Neisseria y que comprende (i) un fragmento de 12 o más nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 1 que codifica un epítopo de la ID SEC Nº 2; (ii) un fragmento de 20 o más nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 3 que codifica un epítopo de la ID SEC Nº 4; o (iii) un fragmento de 20 o más nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 5 que codifica un epítopo de la ID SEC Nº 6.

25. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 24, que comprende un fragmento de 25 o más nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 3.

26. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 25, que comprende un fragmento de 30 o más nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 3.

27. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 26, que comprende un fragmento de 35 o más nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 3.

28 La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27, que comprende un fragmento de 40 o más nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 3.

29. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28.

30. Una composición que comprende una proteína, una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo según cualquier reivindicación precedente.

31. Una composición según la reivindicación 30 que es una composición inmunogénica.

32. Una composición según la reivindicación 30 que es una composición de vacuna o una composición de diagnóstico.

33. Una composición según la reivindicación 30 para su uso como producto farmacéutico.

34. El uso de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29 o un anticuerpo según la reivindicación 20 ó 21, en la fabricación de un medicamento para la prevención de infección debida a bacterias de Neisseria.

35. El uso de la reivindicación 34, en el que el medicamento es para la prevención de infección debida a N. meningitidis.

36. El uso de la reivindicación 35, en el que el medicamento es para la prevención de infección debida a N. meningitidis B.

37. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, en donde las composiciones o el medicamento incluyen un adyuvante.

38. Un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29.

39. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 38.

40. Un procedimiento para producir la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped según la reivindicación 39 en condiciones que inducen la expresión de proteínas.