ES2294629T3 - Antigenos de neisseria y composiciones. - Google Patents
Antigenos de neisseria y composiciones. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2294629T3 ES2294629T3 ES05077865T ES05077865T ES2294629T3 ES 2294629 T3 ES2294629 T3 ES 2294629T3 ES 05077865 T ES05077865 T ES 05077865T ES 05077865 T ES05077865 T ES 05077865T ES 2294629 T3 ES2294629 T3 ES 2294629T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- seq
- fragment
- sequence
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 61
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 33
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 273
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 174
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 73
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 49
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 33
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 107
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 72
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 38
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 26
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 16
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 137
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 127
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 78
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 47
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 46
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 43
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 39
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 39
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 37
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 37
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 36
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 35
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 31
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 30
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 26
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 24
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 24
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 24
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 24
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 23
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 21
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 20
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 20
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 19
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 19
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 18
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 17
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 16
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 15
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 12
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 12
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 101150095079 menB gene Proteins 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 8
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 8
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 8
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 8
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 8
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 7
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 7
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 7
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 LEU2 Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 6
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 6
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 5
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 4
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 4
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 4
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 4
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 4
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 239000007977 PBT buffer Substances 0.000 description 4
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 4
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 4
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 3
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 3
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- RSMRWWHFJMENJH-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC RSMRWWHFJMENJH-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 244000024469 Cucumis prophetarum Species 0.000 description 2
- 235000010071 Cucumis prophetarum Nutrition 0.000 description 2
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208296 Datura Species 0.000 description 2
- 102100020743 Dipeptidase 1 Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 2
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTPGJEROJZHISI-UHFFFAOYSA-N Pleniradin-acetat Natural products C1=C(C)C2C(OC(=O)C)CC(C)(O)C2CC2C(=C)C(=O)OC21 UTPGJEROJZHISI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 2
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- 241000220259 Raphanus Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010084541 asialoorosomucoid Proteins 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229940124731 meningococcal vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 1
- YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N (4R)-4-[[(2S,3R)-2-[acetyl-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-4-[(1R)-1-carboxyethoxy]-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid Chemical compound C(C)(=O)N([C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](CCC(=O)O)C(N)=O)C1[C@H](N)[C@@H](O[C@@H](C(=O)O)C)[C@H](O)[C@H](O1)CO YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101710115267 ATP synthase protein MI25 Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000179819 Aechmea magdalenae Species 0.000 description 1
- 235000001291 Aechmea magdalenae Nutrition 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 241000207875 Antirrhinum Species 0.000 description 1
- 102000018655 Apolipoproteins C Human genes 0.000 description 1
- 108010027070 Apolipoproteins C Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241001106067 Atropa Species 0.000 description 1
- 241000178568 Aura virus Species 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000608319 Bebaru virus Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000209200 Bromus Species 0.000 description 1
- 102100034808 CCAAT/enhancer-binding protein alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000232908 Cabassous Species 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100408682 Caenorhabditis elegans pmt-2 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 201000009182 Chikungunya Diseases 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 241000723343 Cichorium Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102100038385 Coiled-coil domain-containing protein R3HCC1L Human genes 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000208175 Daucus Species 0.000 description 1
- 240000001879 Digitalis lutea Species 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010014611 Encephalitis venezuelan equine Diseases 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000231322 Fort Morgan virus Species 0.000 description 1
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000208152 Geranium Species 0.000 description 1
- 241000608297 Getah virus Species 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000945515 Homo sapiens CCAAT/enhancer-binding protein alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000743767 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein R3HCC1L Proteins 0.000 description 1
- 101001002317 Homo sapiens Gastrin Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 101001033034 Homo sapiens UDP-N-acetylglucosamine-dolichyl-phosphate N-acetylglucosaminephosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical class Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208278 Hyoscyamus Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046315 IDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 241000274177 Juniperus sabina Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208204 Linum Species 0.000 description 1
- 102000011965 Lipoprotein Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010061306 Lipoprotein Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010033266 Lipoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 102000057248 Lipoprotein(a) Human genes 0.000 description 1
- 241000121629 Majorana Species 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000608292 Mayaro virus Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- WPNJAUFVNXKLIM-UHFFFAOYSA-N Moxonidine Chemical compound COC1=NC(C)=NC(Cl)=C1NC1=NCCN1 WPNJAUFVNXKLIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000868135 Mucambo virus Species 0.000 description 1
- 101001033276 Mus musculus Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 108700015872 N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 241001162910 Nemesia <spider> Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 102000006570 Non-Histone Chromosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008964 Non-Histone Chromosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700020497 Nucleopolyhedrovirus polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241000219830 Onobrychis Species 0.000 description 1
- 102100035593 POU domain, class 2, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710084414 POU domain, class 2, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100035591 POU domain, class 2, transcription factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710084411 POU domain, class 2, transcription factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000209117 Panicum Species 0.000 description 1
- 235000006443 Panicum miliaceum subsp. miliaceum Nutrition 0.000 description 1
- 235000009037 Panicum miliaceum subsp. ruderale Nutrition 0.000 description 1
- 241000208181 Pelargonium Species 0.000 description 1
- 241000209046 Pennisetum Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241000868134 Pixuna virus Species 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical class CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100029796 Protein S100-A10 Human genes 0.000 description 1
- 101710110950 Protein S100-A10 Proteins 0.000 description 1
- 102100027584 Protein c-Fos Human genes 0.000 description 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000218206 Ranunculus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000712909 Reticuloendotheliosis virus Species 0.000 description 1
- 241000710942 Ross River virus Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241001106018 Salpiglossis Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 241000780602 Senecio Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 1
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 description 1
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000868137 Tonate virus Species 0.000 description 1
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 description 1
- 102100022972 Transcription factor AP-2-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710189834 Transcription factor AP-2-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000010912 Transferrin-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010062476 Transferrin-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000255985 Trichoplusia Species 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 241001312519 Trigonella Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038413 UDP-N-acetylglucosamine-dolichyl-phosphate N-acetylglucosaminephosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000002687 Venezuelan Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 201000009145 Venezuelan equine encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000219977 Vigna Species 0.000 description 1
- 241000231320 Whataroa virus Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 108010022164 acetyl-LDL Proteins 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 1
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 244000309743 astrovirus Species 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 208000004668 avian leukosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 150000001558 benzoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M didecyl(dimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCC UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001424 field-emission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000009403 interspecific hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002690 malonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 235000005739 manihot Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 208000037941 meningococcal disease Diseases 0.000 description 1
- 229940035102 meningococcal group b vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000004942 nuclear accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 238000000819 phase cycle Methods 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- 101150035767 trp gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016264 ubiquitin-Nalpha-protein hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Una proteína que comprende: * la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 2: * una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 2 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria; * una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 8 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 2; * la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 4; * una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria; * una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 10 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 4; * la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 6; * una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 6 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria; * una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 10 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 6, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 6.
Description
Antígenos de Neisseria y composiciones.
Esta invención se refiere a antígenos de las
especies bacterianas: Neisseria meningitidis y Neisseria
gonorrhoeae.
Neisseria meningitidis es un diplococo
gram negativo inmóvil patógeno del ser humano. Coloniza la faringe,
causando meningitis y ocasionalmente septicemia en ausencia de
meningitis. Está estrechamente relacionado con N.
gonorrhoeae, aunque una característica que diferencia claramente
los meningococos de gonococos es la presencia de una cápsula de
polisacáridos que está presente en todos los meningococos
patógenos.
N. meningitidis causa enfermedad endémica
y epidémica. En los Estados Unidos el índice de infección es de
0,6-1 por cada 100.000 personas al año, y puede ser
mucho mayor durante los brotes (véase Lieberman y col., (1996)
Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neisseria
meningitidis Oligosaccharide-Protein Conjugate
Vaccine in Young Children. JAMA 275(19):
1499-1503; Schuchat y col., (1997) Bacterial
Meningitis in the United States in 1995. N Engl J Med
337(14): 970-976). En los países en vías de
desarrollo, los índices de enfermedad endémica son mucho mayores y
durante los casos de epidemia los índices pueden alcanzar hasta 500
casos por cada 100.000 personas al año. La mortalidad es
extremadamente alta, del 10-20% en los Estados
Unidos y mucho mayor en los países en vías de desarrollo. Después
de la presentación de la vacuna conjugada contra Haemophilus
influenzae, N. meningitidis es la causa principal de
meningitis bacteriana en todas las edades en los Estados Unidos
(Schuchat y col (1997) anteriormente).
Según el polisacárido capsular del organismo se
han identificado 12 serogrupos de N. meningitidis. El grupo
A es el patógeno implicado más a menudo en la enfermedad epidémica
en el África Subsahariana. Los serogrupos B y C son responsables de
la amplia mayoría de casos en los Estados Unidos y en la mayoría de
los países en vías de desarrollo. Los serogrupos W135 e Y son
responsables del resto de casos de los Estados Unidos y de los
países en vías de desarrollo. La vacuna contra meningococos usada
actualmente es una vacuna de polisacárido tetravalente constituida
por serogrupos A, C, Y y W135. Aunque es eficaz en adolescentes y en
adultos, induce una mala respuesta inmune y una corta duración de
la protección y no puede usarse en lactantes [por ejemplo,
Morbidity and Mortality weekly report, Vol. 46, Nº
RR-5 (1997)]. Esto es debido a que los polisacáridos
son antígenos independientes de las células T que inducen una
respuesta inmune débil que no puede reforzarse mediante la
inmunización repetida. Después del éxito de la vacunación contra
H. influenzae, se han desarrollado vacunas conjugadas contra
serogrupos A y C y están en la etapa final del ensayo clínico
(Zollinger WD "New and Improved Vaccines Against Meningococcal
Disease". En: New Generation Vaccines, anteriormente, págs.
469-488; Lieberman y col (1996) anteriormente;
Costantino y col (1992) Development
and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A and C. Vaccine 10: 691-698).
and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A and C. Vaccine 10: 691-698).
Sin embargo, el meningococo B (menB) sigue
siendo un problema. Este serotipo es responsable actualmente de
aproximadamente el 50% de todas las meningitis en los Estados
Unidos, Europa, y Sudamérica. El enfoque de polisacáridos no puede
usarse debido a que el polisacárido capsular de menB es un polímero
de ácido N-acetil neuramínico con enlace
a(2-8) que también está presente en el tejido
de los mamíferos. Esto produce tolerancia al antígeno; de hecho, si
se provocara una respuesta inmune, seria
auto-inmune, y por lo tanto no deseable. Para
evitar la inducción de auto-inmunidad y para inducir
una respuesta inmune protectora, se ha modificado el polisacárido
capsular sustituyendo los grupos N-acetilo con
grupos N-propionilo, dejando inalterada la
antigenicidad especifica (Romero & Outschoom (1994) Current
status of Meningococcal group B vaccine candidates: capsular or
non-capsular? Clin Microbiol Rev 7(4):
559-575).
Los enfoques alternaturales para vacunas contra
menB han usado mezclas complejas de proteínas de la membrana
externa (OMP), que contenían o las OMP en solitario u OMP
enriquecidas con porinas o con una deleción en las OMP de clase 4
que se cree inducen anticuerpos que bloquean la actividad
bactericida. Este enfoque produce vacunas que no están bien
caracterizadas. Éstas son capaces de proteger contra la cepa
homóloga, pero no son eficaces a gran escala, ya que existen muchas
variantes antigénicas de las proteínas de la membrana externa. Para
superar la variabilidad antigénica, se han construido vacunas
multivalentes que contienen hasta nueve porinas diferentes (por
ejemplo, Poolman JT (1992) Development of a meningococcal vaccine.
Infect. Agents Dis, 4: 13-28). Las proteínas
adicionales a usar en vacunas de la membrana externa son las
proteínas opa y opc, pero ninguno de estos enfoques ha sido capaz
de superar la variabilidad antigénica (por ejemplo, Ala'Aldeen
& Borriello (1996) The meningococcal
transferrin-binding proteins 1 and 2 are both
surface exponed and generate bactericidal antibodies capable of
killing nomologous and heterologous strains. Vaccine 14(1):
49-53).
Para los genes y proteínas de los gonococos y
meningococos están disponibles una cierta cantidad de datos de
secuencia (por ejemplo EP-A-0467714,
WO 96/29412), pero estos son incompletos. Dempsey y col. (1995) J
Bacterial 177: 6390-400, describieron un mapa físico
del cromosoma de una cepa del serogrupo A de N. meningitidis
y Moxon (1997) Lancet 350: 1240-44, informaron de
que las secuencias genómicas de diversos patógenos, incluyendo
N. meningitidis, se están determinando. El suministro de
otras secuencias podría proporcionar una oportunidad para
identificar proteínas secretadas o expuestas en la superficie que se
suponen son dianas para el sistema inmune y que no sean variables
antigénicamente. Por ejemplo, algunas de las proteínas identificadas
podrían ser componentes de vacunas eficaces contra meningococos B y
algunas podrían ser componentes de vacunas contra todos los
serotipos de meningococos y otras podrían ser componentes de vacunas
contra todos las especies de Neisseria patogénicas
incluyendo Neisseria meningitidis o Neisseria
gonorrhoeae. Estas secuencias específicas para N.
meningitidis o N. gonorrhoeae que se conservan mejor, son
secuencias preferidas.
Por lo tanto es un objetivo de la invención
proporcionar secuencias de ADN de Neisseria que codifiquen proteínas
que sean antigénicas o inmunogénicas.
La invención proporciona proteínas que
comprenden las secuencias de aminoácidos de N. meningitidis y
las secuencias de aminoácidos de N. gonorrhoeae descritas en
los ejemplos.
También proporciona proteínas que comprenden
secuencias homólogas (es decir, aquellas que tienen identidad de
secuencias) con las secuencias de aminoácidos de N.
meningitidis descritas en los ejemplos y que son eficaces para
la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria.
Dependiendo de la secuencia particular, el grado de homología
(identidad de secuencia) es preferentemente mayor de 50% (por
ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más). Estas proteínas
incluyen mutantes y variantes alélicas de las secuencias descritas
en los ejemplos. Normalmente, se considera que 50% de identidad o
más entre dos proteínas es una indicación de equivalencia
funcional. La identidad entre proteínas se determina preferentemente
mediante el algoritmo de búsqueda de homología de
Smith-Waterman como está implementado en el programa
MPSRCH (Oxford Molecular) usando una búsqueda de huecos afines con
parámetros: penalización de hueco 12, penalización de extensión del
hueco 1.
La invención también proporciona proteínas que
comprenden fragmentos de las secuencias de aminoácidos de N.
meningitidis y de las secuencias de aminoácidos de N.
gonorrhoeae descritas en los ejemplos. Los fragmentos deben
comprender al menos n aminoácidos consecutivos de las secuencias y,
dependiendo de la secuencia en particular, n es 8 o más (por
ejemplo, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más). Los fragmentos comprenden un
epítopo de la secuencia.
Las proteínas de la invención pueden prepararse,
por supuesto, por diversos medios (por ejemplo, expresión
recombinante, purificación a partir de cultivo celular, síntesis
química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo, natural,
fusiones, etc.). Éstas se preparan preferentemente en forma
sustancialmente pura o aislada (es decir, sustancialmente libres de
otras proteínas celulares del huésped de N. meningitidis o
N. gonorrhoeae).
De acuerdo con otro aspecto, la invención
proporciona anticuerpos que se unen a estas secuencias de
aminoácidos. Estos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden
producirse mediante cualquier medio adecuado.
De acuerdo con otro aspecto, la invención
proporciona ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de
nucleótidos de N. meningitidis y las secuencias de
nucleótidos de N. gonorrhoeae descritas en los ejemplos.
De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan
ácidos nucleicos que tienen una identidad de secuencia de más de
50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con las
secuencias de ácido nucleico de este documento. La identidad de
secuencia se determina como se ha descrito anteriormente.
También se proporcionan ácidos nucleicos que
comprenden fragmentos de estas secuencias. Estos deben comprender
al menos n nucleótidos consecutivos de las secuencias de N.
meningitidis o de las secuencias de N. gonorrhoeae y,
dependiendo de la secuencia en particular, n es 12 o más (por
ejemplo, 20, 25, 30, 35, 40 o más). De acuerdo con otro aspecto, la
invención proporciona ácidos nucleicos que codifican las proteínas y
los fragmentos de proteínas de la invención.
Debe entenderse también que la invención
proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias
complementarias a las descritas anteriormente (por ejemplo, para
fines de sondeo antisentido).
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención
pueden prepararse, por supuesto, de diversas maneras (por ejemplo,
mediante síntesis química, en todo o en parte, a partir de
bibliotecas genómicas o de ADNc, a partir del propio organismo,
etc.) y pueden tener diversas formas (por ejemplo, de cadena
sencilla, de doble cadena, vectores, sondas, etc.).
Además, la expresión "ácido nucleico"
incluye ADN y ARN y también sus análogos, tales como los que
contienen estructuras modificadas, y también ácidos péptido
nucleicos (APN) etc.
De acuerdo con otro aspecto, la invención
proporciona vectores que comprenden nucleótidos de la invención
(por ejemplo, vectores de expresión) y células huésped transformadas
con dichos vectores.
De acuerdo con otro aspecto, la invención
proporciona composiciones que comprenden proteínas, anticuerpos y/o
ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Estas composiciones
pueden ser adecuadas como vacunas, por ejemplo, o como reactivos de
diagnóstico o como composiciones inmunogénicas.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención también proporciona un ácido
nucleico, proteína o anticuerpo de acuerdo con la invención para su
uso como medicamentos (por ejemplo, como vacunas) o como reactivos
de diagnóstico. La invención también proporciona el uso de un ácido
nucleico, proteína o anticuerpo de acuerdo con la invención en la
fabricación de (I) un medicamento para prevenir la infección debida
a bacterias de Neisseria (ii) un reactivo de diagnóstico para
detectar la presencia de bacterias de Neisseria o de anticuerpos
generados contra bacterias de Neisseria o (iii) para generar
anticuerpos. Dichas bacterias de Neisseria pueden ser de cualquier
especie o cepa (tales como N. gonorrhoeae) pero son
preferentemente N. meningitidis, especialmente del serogrupo
B o el serogrupo C.
Un procedimiento para tratar a un paciente,
puede implicar administrar al paciente una cantidad
farmacéuticamente eficaz de un ácido nucleico, proteína y/o
anticuerpo de acuerdo con la invención.
Se proporciona un procedimiento para producir
proteínas de la invención, que comprende la etapa de cultivar una
célula huésped de acuerdo con la invención en condiciones que
inducen la expresión de proteínas.
Se adjunta un resumen de técnicas y
procedimientos convencionales que pueden emplearse para poner en
practica la invención (por ejemplo, para utilizar las secuencias
descritas para fines de vacunación o de diagnóstico) como un
Apéndice de la solicitud. Este resumen proporciona ejemplos que
pueden usarse.
Habiendo descrito de forma general la invención,
ésta se entenderá más fácilmente en referencia a los siguientes
ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración.
Esta invención proporciona secuencias de
nucleótidos de menB de Neisseria meningitidis, secuencias de
aminoácidos codificadas en su interior. Con estas secuencias
descritas, pueden producirse ensayos de sondas de ácidos nucleicos
y casetes y vectores de expresión. Los vectores de expresión pueden
transformarse en células huésped para producir proteínas. Los
polipéptidos purificados o aislados (que también pueden sintetizarse
químicamente) pueden usarse para producir anticuerpos para detectar
proteínas de menB. Además, las células huésped o sus extractos
pueden utilizarse para ensayos biológicos para aislar agonistas o
antagonistas. Además, con estas secuencias puede buscarse la
identificación de marcos de lectura abierta e identificar secuencias
de aminoácidos. Las proteínas también pueden usarse en
composiciones inmunogénicas, composiciones antigénicas y como
componentes de vacuna.
La puesta en práctica de la presente invención
empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas
convencionales de biología molecular, microbiología, ADN
recombinante e inmunología, que están dentro del alcance de la
técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la
bibliografía, por ejemplo, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory
Manual, segunda edición (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N.
Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984);
Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.
1984); Transcription and Traslation (B.D. Hames & S.J. Higgins
eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986);
Immobilized Cells and Enzimes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A
Practical Guide to Molecular Cloning (1984); The Methods in
Enzymology series (Academic Press, Inc), especialmente volumen 154
& 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y
M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and
Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular
Biology (Academic Press, London); Scopes (1987) Protein
Purification: Principles and Practice, Segunda edición
(Springer-Verlag, N.Y.), y Handbook of Experimental
Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir and C.C.
Blackwell eds 1986).
En esta memoria descriptiva se usan abreviaturas
convencionales para los nucleótidos y los aminoácidos.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes
de patentes mencionadas en este documento se incorporan en su
totalidad por referencia.
Las secuencias de nucleótidos de menB de
Neisseria pueden expresarse en diversos sistemas de expresión
diferentes; por ejemplo los utilizados con células de mamífero,
células vegetales, baculovirus, bacterias y levaduras.
En la técnica se conocen sistemas de expresión
en mamíferos. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de ADN
capaz de unir la ARN polimerasa de mamíferos e iniciar la
trascripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por
ejemplo un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región
de inicio de la trascripción, que se sitúa normalmente en posición
proximal al extremo 5' de la secuencia codificante y una caja TATA,
normalmente situada 25-30 pares de bases (pb)
cadena arriba del sitio de inicio de la trascripción. Se cree que la
caja TATA dirige la ARN polimerasa II para que comience la síntesis
de ARN en el sitio correcto. Un promotor de mamífero también
contendrá un elemento promotor cadena arriba, situado normalmente en
100 o 200 pb cadena arriba de la caja TATA. Un elemento promotor
cadena arriba determina el índice con el que se inicia la
trascripción y puede actual en cualquier orientación (Sambrook y
col (1989) "Expression of Clone Genes in Mammalian Cells" In
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed.).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los genes virales de mamífero se expresan a
menudo en gran cantidad y tienen un amplio intervalo de huéspedes;
por lo tanto las secuencias que codifican genes virales de mamífero
proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los
ejemplos incluyen el promotor temprano SV40, el promotor LTR del
virus de tumor mamario de ratón, el promotor tardío principal de
adenovirus (Ad MLP), y el promotor del virus herpes simplex. Además,
las secuencias obtenidas de genes no virales, tales como el gen de
metalotioneína de ratón, también proporcionan secuencias promotoras
útiles. La expresión puede ser constitutiva o regulada (inducible).
Dependiendo del promotor seleccionado, muchos promotores pueden
inducirse usando sustratos conocidos, tales como usando el virus de
tumor mamario de ratón (MMTV) con el elemento sensible a
glucocorticoides (GRE) que se induce mediante glucocorticoides en
células transformadas sensibles a hormonas (véase por ejemplo, la
patente de Estados Unidos 5.783.681).
La presencia de un elemento potenciador
(potenciador), combinado con los elementos promotores descritos
anteriormente, normalmente aumentará los niveles de expresión. Un
potenciador es una secuencia de ADN reguladora que puede estimular
la trascripción hasta 1.000 veces cuando se une a promotores
homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis en el sitio de
inicio del ARN normal. Los potenciadores también son activos cuando
se sitúan cadena arriba o cadena abajo del sitio de inicio de la
trascripción, en orientación normal o invertida o a una distancia
de más de 1.000 nucleótidos del promotor (Maniatis y col. (1987)
Science 236: 1237; Alberts y col. (1989) Molecular Biology of the
Cell, 2ª ed.). Los elementos potenciadores obtenidos a partir de
virus pueden ser particularmente útiles, debido a que normalmente
tienen un intervalo de huéspedes más amplio. Los ejemplos incluyen
el potenciador del gen temprano de SV40 (Dijkema y col. (1985) EMBO
J. 4: 761) y los potenciadores/promotores obtenidos de la
repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous
(Gorman y col. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777) y del
citomegalovirus humano (Boshart y col. (1985) Cell 41: 521). Además,
algunos potenciadores son regulables y se vuelven activos solamente
en presencia de un inductor, tal como una hormona o un ión metálico
(Sassone-Corsi y Borelli (1986) Trends Genet. 2:
215; Maniatis y col. (1987) Science 236: 1237).
Una molécula de ADN puede expresarse de forma
intracelular en células de mamífero. Una secuencia promotora puede
unirse directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer
aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante será siempre
una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se
desea, el extremo N puede escindirse de la proteína mediante
incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Como alternatural, las proteínas extrañas
también pueden secretarse a partir de la célula al medio de cultivo
creando moléculas de ADN quiméricas que codifiquen una proteína de
fusión constituida por un fragmento de secuencia líder que
posibilita la secreción de la proteína extraña en células de
mamífero. Preferentemente, existen sitios de procesamiento
codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que pueden
escindirse in vivo o in vitro. El fragmento de
secuencia líder codifica normalmente un péptido señal constituido
por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a
partir de la célula. El líder tripartito de adenovirus es un
ejemplo de una secuencia líder que posibilita la secreción de una
proteína extraña en células de mamífero.
Normalmente, las secuencias de terminación de la
trascripción y de poliadenilación reconocidas por las células de
mamífero son regiones reguladoras situadas en posición 3' con
respecto al codón de terminación de la producción y por lo tanto,
junto con los elementos promotores flanquean a la secuencia
codificante. El extremo 3' del ARNm maduro se forma mediante
escisión y poliadenilación postrascripcional y específica de sitio
(Bimstiel y col. (1985) Cell 41: 349; Proudfoot y Whitelaw (1988)
``Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. En
Transcription and splicing (ed. B.D. Hames y D.M. Glover); Proudfoot
(1989) Trends Biochem. Sci. 14: 105). Estas secuencias dirigen la
trascripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido
codificado por el ADN. Los ejemplos de señales de terminación de la
trascripción/poliadenilación incluyen los obtenidos de SV40
(Sambrook y col. (1989) "Expression of cloned genes in cultured
mammalian cells." En Molecular Cloning: A Laboratory
Manual).
Normalmente, los componentes descritos
anteriormente, que comprenden un promotor, secuencia de
poliadenilación y secuencia de terminación de la trascripción se
colocan conjuntamente en construcciones de expresión. También
pueden incluirse si se desea, en una construcción de expresión,
potenciadores, intrones con sitios donadores y aceptores de corte y
empalme funcionales y secuencias líderes. Las construcciones de
expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un
elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz del
mantenimiento estable en un huésped, tal como células de mamífero o
bacterias. Los sistemas de replicación en mamíferos incluyen los
obtenidos a partir de virus animales, que requieren factores que
actúen en dirección trans para replicarse. Por ejemplo, los
plásmidos que contienen el sistema de replicación de papovavirus,
tales como SV40 (Gluzman (1981) Cell 23: 175) o poliomavirus, se
replican a un número de copias extremadamente alto en presencia del
antígeno T viral apropiado. Los ejemplos adicionales de replicones
de mamífero incluyen los obtenidos de papilomavirus bovino y del
virus Epstein-Barr. Además, el replicón puede tener
dos sistemas de replicación, lo que le permite mantenerse, por
ejemplo, en células de mamífero para su expresión y en un huésped
procariota para clonación y amplificación.
Los ejemplos de dichos vectores lanzadera
mamífero-bacteria incluyen pMT2 (Kaufman y col.
(1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946) y pHEBO (SHimizu y col. (1986) Mol.
Cell. Biol. 6: 1074).
El procedimiento de transformación utilizado
depende del huésped a transformar. Los procedimientos para la
introducción de los polinucleótidos heterólogos en las células de
mamífero se conocen en la técnica e incluyen transfección mediada
por dextrano, precipitación por fosfato de calcio, transfección
mediada por polibreno, fusión de protoplastos, encapsulación de los
polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en
los núcleos.
Las líneas celulares de mamífero disponibles
como huéspedes para la expresión se conocen en la técnica e incluyen
muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American
Type Culture Collection (ATCC, Colección Americana de Cultivos
Tipo), incluyendo aunque sin limitación, células de ovario de
hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de
hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma
hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y varias líneas
celulares diferentes.
Existen muchos sistemas de expresión genética en
cultivo de células vegetales y en plantas completas conocidos en la
técnica. Los sistemas de expresión genética en células vegetales
ejemplares incluyen los que se describen en patentes tales como:
U.S. 5.693.506; U.S. 5.659.122; y U.S. 5.608.143. Ejemplos
adicionales de expresión genética en cultivo de células vegetales
se han descrito por Zenk, Phytochemistry 30:
3861-3863 (1991). Además pueden encontrarse
descripciones de péptidos señal de proteínas vegetales además de en
la bibliografía descrita anteriormente en Vaulcombe y col. Mol.
Gen. Genet. 209: 33-40 (1987); Chandler y col.,
Plant Molecular Biology 3: 407-418 (1984); Rogers,
J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985); Rothstein y
col., Gene 55: 353-356 (1987); Whittier y col.,
Nucleic Acids Research 15: 2515-2535 (1987); Wirsel
y col., Molecular Microbiology 3: 3-14 (1989); Yu y
col., Gene 122: 247-253 (1992). Una descripción de
la regulación de expresión de genes vegetales mediante la
fitohormona ácido giberélico y las enzimas secretadas inducidas por
el ácido giberélico puede encontrarse en los documentos de R.L.
Jones y J. MacMillin, Gibberellins: en: Advanced Plant Physiology.
Malcolm B. Winkins, ed., 1984 Pitman Publiching Limited, London
págs. 21-52. Bibliografía que describe otros genes
regulados metabólicamente: Seen, Plant Cell, 2:
1027-1038 (1990); Maas y col., EMBO J. 9:
3447-3452 (1990); Benkel y Hickey, Proc. Natl.
Acad. Sci. 84: 1337-1339 (1987).
Normalmente, usando técnicas conocidas en la
técnica, se inserta una secuencia de polinucleótidos deseada en una
casete de expresión que comprende elementos reguladores genéticos
diseñados para el funcionamiento en plantas. La casete de expresión
se inserta en un vector de expresión deseado con secuencias
acompañantes cadena arriba y cadena debajo de la casete de
expresión adecuada para la expresión en un huésped vegetal. La
secuencias acompañantes serán de origen viral o de un plásmido y
proporcionan las características necesarias para el vector para
permitirle trasladar el ADN de un huésped de clonación original, tal
como una bacteria, al huésped vegetal deseado. La construcción
vector-bacteria/planta básica proporcionará
preferentemente un amplio intervalo de huéspedes, un origen de
replicación procariota; un marcador seleccionable procariota y,
para transformaciones en Agrobacterium, secuencias de ADN T para la
transferencia mediada por Agrobacterium a cromosomas vegetales.
Cuando el gen heterólogo no puede detectarse fácilmente, la
construcción tendrá preferentemente un gen marcador seleccionable
adecuado para determinar si una célula vegetal se ha transformado.
Una revisión general de los marcadores adecuados, por ejemplo para
los miembros de la familia de las gramíneas, se encuentra en el
documento Wilmink y Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11 (2):
165-185.
También se recomiendan las secuencias adecuadas
para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el
genoma de la planta. Estas pueden incluir secuencias del transposón
y similares para recombinación homóloga así como secuencias Ti que
permiten la inserción aleatoria de una casete de expresión
heteróloga en un genoma vegetal. Los marcadores seleccionables
procariotas adecuados incluyen de resistencia a antibióticos tales
como ampicilina o tetraciclina. También pueden estar presentes en el
vector, otras secuencias de ADN que codifican funciones
adicionales, como se conocen en la técnica.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención pueden incluirse en una casete de expresión para la
expresión de las proteínas de interés. Normalmente, solamente habrá
una casete de expresión, aunque pueden proporcionarse dos o más. La
casete de expresión recombinante contendrá, además de la secuencia
que codifica la proteína heteróloga, los siguientes elementos, una
región promotora, secuencias sin traducir 5' vegetales, un codón de
inicio dependiendo de si el gen estructural viene o no equipado con
uno, y una secuencia de terminación de la trascripción y de la
traducción. Los sitios de restricción enzimática únicos en los
extremos 5' y 3' de la casete permiten la fácil inserción en un
vector pre-existente.
Una secuencia codificante heteróloga puede ser
para cualquier proteína relacionada con la presente invención. La
secuencia que codifica la proteína de interés codificará un péptido
señal que permitirá el procesamiento y la translocación de la
proteína, según sea apropiado, y carecerá normalmente de cualquier
secuencia que pudiera dar como resultado la unión de la proteína
deseada de la invención a una membrana. Ya que, para la mayoría, la
región de inicio de la trascripción será la de un gen que se expresa
y se transloca durante la germinación, empleando el péptido señal
que posibilita la translocación, también puede posibilitarse la
translocación de la proteína de interés. De este modo, las
proteínas de interés se translocarán a partir de las células en las
que se expresan y pueden recogerse de forma eficaz. La secreción
típica en las semillas es a través de la aleurona o del epitelio
del escutelo al endospermo de la semilla. Aunque no es necesario que
la proteína se secrete a partir de las células en las que se
produce, esto facilita el aislamiento y la purificación de la
proteína recombinante.
Puesto que la expresión definitiva del producto
génico deseado se realizará en una célula eucariota es deseable
determinar si cualquier porción del gen clonado contiene secuencias
que se procesarán como intrones por la maquinaria de corte y
empalme del huésped, si esto fuera así, puede realizarse mutagénesis
dirigida de la región "intrón" para evitar la perdida de una
porción del mensaje genético en forma de falso código intrón, Reed
y Maniatis, Cell 41: 95-105, 1985.
El vector puede microinyectarse directamente en
células vegetales mediante el uso de micropipetas para transferir
mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genet, 202:
179-185, 1985. El material genético también puede
transferirse a la célula vegetal usando polietilenglicol, Krens y
col., Nature, 296, 72-74, 1982. Otro procedimiento
de introducción de segmentos de ácido nucleico es la penetración
balística a alta velocidad mediante pequeñas partículas con el
ácido nucleico dentro de la matriz de pequeñas perlas o partículas o
en la superficie, Klein y col., Nature, 327, 70-73,
1987 y Knudsen y Muller, 1991, Planta, 185: 330-336,
muestran el bombardeo de partículas del endospermo de cebada para
crear cebada transgénica. Otro procedimiento de introducción sería
la fusión de protoplastos con otras entidades, minicélulas, células,
lisosomas u otros cuerpos con superficie lipídica que puede
fundirse, Fraley, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,
1859-1863, 1982.
El vector también puede introducirse en las
células vegetales mediante electroporación (Fromm y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824, 1985). En esta técnica, los
protoplastos vegetales se electroporan en presencia de plásmidos
que contienen la construcción génica. Los impulsos eléctricos de
alto potencial iónico permeabilizan de forma reversible las
membranas biológicas permitiendo la introducción de los plásmidos.
Los protoplastos vegetales electroporados vuelven a formar la pared
celular, se dividen y forman callos vegetales.
Todas las plantas a partir de las que pueden
aislarse y cultivarse protoplastos para proporcionar plantas
regeneradas completas pueden transformarse mediante la presente
invención de modo que se recuperen plantas completas que contienen
el gen transferido. Se sabe que prácticamente todas las plantas
pueden regenerarse a partir de células o tejidos cultivados,
incluyendo aunque sin limitación las especies de caña de azúcar,
remolacha de azúcar, algodón, fruta y otros árboles, legumbres y
verduras. Algunas plantas adecuadas incluyen por ejemplo las
especies de los géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis,
Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot,
Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapsis, Atropa, Capsicum,
Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia,
Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus,
Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum,
Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia,
Glycine, Lollum, Zea, Triticum, Sorghum, y Datura.
Los medios de regeneración varían entre especie
y especie vegetales, pero generalmente se proporciona en primer
lugar una suspensión de protoplastos transformados que contienen
copias del gen heterólogo. Se forma tejido calloso y pueden
inducirse brotes a partir de los callos, que posteriormente pueden
sembrarse. Como alternatural, puede inducirse la formación de
embriones a partir de la suspensión de protoplastos. Estos embriones
germinan como los embriones naturales para formar plantas. Los
medios de cultivo contendrán generalmente diversos aminoácidos y
hormonas, tales como auxina y citocininas. También es ventajoso
añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para
especies tales como maíz y alfalfa. Los brotes y las raíces se
desarrollan normalmente de forma simultánea. La regeneración eficaz
dependerá del medio, del genotipo, y del historial del cultivo. Si
se controlan estas tres variables, entonces la regeneración es
totalmente reproducible y repetible.
En algunos sistemas de cultivo de células
vegetales, la proteína deseada de la invención puede excretarse o,
como alternatural, la proteína puede extraerse a partir de la planta
completa. En los casos en los que la proteína de la invención se
secreta al medio, ésta puede recogerse. Como alternatural, los
embriones y las semillas sin embrión u otro tejido vegetal, pueden
extraerse mecánicamente para liberar cualquier proteína secretada
entre las células y los tejidos. La mezcla puede suspenderse en una
solución tampón para recuperar las proteínas solubles. Después se
utilizarán procedimientos convencionales de aislamiento y
purificación de proteínas para purificar la proteína recombinante.
Los parámetros de tiempo, temperatura, pH, oxígeno y volumen se
ajustarán mediante procedimientos rutinarios para optimizar la
expresión y la recuperación de la proteína heteróloga.
El polinucleótido que codifica la proteína
también puede insertarse en un vector de expresión en insectos
adecuado, y se une de forma operativa a los elementos de control
dentro de este vector. La construcción de vectores emplea técnicas
que se conocen en la técnica. Generalmente, los componentes del
sistema de expresión incluyen un vector de transferencia,
normalmente un plásmido bacteriano, que contiene un fragmento del
genoma de baculovirus y un sitio de restricción adecuado para la
inserción del gen o genes heterólogos a expresar; un baculovirus de
tipo natural con una secuencia homóloga al fragmento específico de
baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la
recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma del
baculovirus); y células huésped de insecto y medios de cultivo
apropiados.
Después de insertar la secuencia de ADN que
codifica la proteína en el vector de transferencia, el vector y el
genoma viral de tipo natural se transfieren a una célula huésped de
insecto en la que se permite que el vector y el genoma viral
recombinen. El virus recombinante encapsulado se expresa y se
identifican y se purifican placas recombinantes. Los materiales y
los procedimientos para sistemas de expresión de baculovirus/células
de insecto están disponibles en el mercado en forma de kit de entre
otros, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac"). Estas técnicas las
conocen en general los expertos en la materia y se describen
completamente en el documento de Summers y Smith, Texas
Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555 (1987) (en lo
sucesivo en este documento "Summers y Smith").
Antes de la inserción de la secuencia de ADN que
codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes
descritos anteriormente, que comprenden un promotor, una secuencia
líder (si se desea), la secuencia codificante de interés y la
secuencia determinación de la transcripción, se ensamblan
normalmente en una construcción de translocación intermedia (vector
de transferencia). Esta construcción puede contener un único gen y
elementos reguladores unidos de forma operativa; múltiples genes,
cada uno con su propio conjunto de elementos reguladores unidos de
forma operativa; o múltiples genes, regulados por el mismo conjunto
de elementos reguladores. Las construcciones de translocación
intermedias se mantienen a menudo en un replicón, tal como un
elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de
mantenerse de forma estable en un huésped tal como una bacteria. El
replicón tendrá un sistema de replicación, que le permitirá
mantenerse en un huésped adecuado para la clonación y la
amplificación.
Actualmente, el vector de transferencia usado
más comúnmente para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373.
También se han diseñado muchos otros vectores, conocidos por los
expertos en la materia. Estos incluyen, por ejemplo pVL985 (que
altera el codón de inicio polihedrina de ATG a ATT, y que introduce
un sitio de clonación BamHI 32 pares de bases cadena abajo del ATT;
véase Luckow y Summers, Virology (1989), 17: 31.
El plásmido normalmente también contiene la
señal de poliadenilación de polihedrina (Miller y col., (1988) Ann.
Rev. Microbiol., 42: 177) y un gen de resistencia a ampicilina
procariota (amp) y un origen de replicación para la
selección y propagación en E. coli.
Los vectores de transferencia de baculovirus
contienen normalmente un promotor de baculovirus. Un promotor de
baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN
polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción cadena abajo
(5' a 3') de una secuencia codificante (por ejemplo gen estructural)
en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la
transcripción que se sitúa normalmente en posición proximal con
respecto al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de
inicio de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión a
ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un vector
de transferencia de baculovirus también puede contener un segundo
dominio llamado potenciador que, si está presente, está normalmente
en posición distal con respecto al gen estructural. La expresión
puede ser regulada o constitutiva.
Los genes estructurales, que normalmente se
transcriben en un ciclo de infección vírica, proporcionan secuencias
promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias
obtenidas a partir del gen que codifica una proteína de poliedro
viral, Friesen y col., (1996) "The Regulation of Baculovirus Gene
Expression" en: ``The Molecular Biology of Baculoviruses (ed.
Walter Doerfler): Publicación EPO Nº 127 839 y 155 476; y el gen
que codifica la proteína p10, Vlak y co., (1988), J. Gen. Virol. 69:
765.
El ADN que codifica secuencias señal adecuadas
puede obtenerse de genes para proteínas de insecto o de baculovirus
secretadas, tales como el gen de la polihedrina de baculovirus
(Carbonell y col. (1988) Gene, 73: 409). Como alternatural, como
las señales para las modificaciones
post-traduccionales de células de mamífero (tales
como la escisión de un péptido señal, escisión proteolítica, y
fosforilación) parecen ser reconocidas por las células de insecto,
y las señales necesarias para la secreción y la acumulación nuclear
también parecen conservarse entre células de invertebrados y
células de vertebrados, también pueden usarse para proporcionar
secreción en insectos, líderes de origen no de insecto, tales como
los obtenidos de los genes que codifican
interferón-\alpha (alfa) humano, Maeda y col.,
(1986), Nature 315: 592; péptido de liberación de gastrina humana,
Lebacq-Verheyden y col., (1988), Molec. Cell. Biol.
8: 3129; IL-2 humana, Smith y col., (1985) Proc.
Nat'l Acad. Sci. USA, 82: 8404; IL-3 de ratón,
(Miyajima y col., (1987) Gene 58: 273; y glucocerebrosidasa humana;
Martin y col., (1988) DNA, 7: 99.
Un polipéptido o poliproteína recombinante puede
expresarse de forma intracelular o, si se expresa con las
secuencias reguladoras apropiadas, puede secretarse. La expresión
intracelular adecuada de proteínas extrañas sin fusionar
normalmente requiere gene heterólogos que idealmente tienen una
secuencia líder corta que contiene señales de inicio de la
traducción adecuadas precediendo a una señal de inicio ATG. Si se
desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína
madura mediante incubación in vitro con bromuro de
cianógeno.
Como alternatural, las poliproteínas o proteínas
recombinantes que no se secretan de forma natural pueden secretarse
a partir de la célula de insecto creando moléculas de ADN quiméricas
que codifican una proteína de fusión constituida por un fragmento
de secuencia líder que posibilita la secreción de las proteínas
extrañas en insectos. El fragmento de secuencia líder codifica
normalmente un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos
que dirigen la translocación de la proteína al retículo
endoplasmático. Después de la inserción de la secuencia de ADN y/o
del gen que codifica el precursor del producto de expresión de la
proteína, una célula huésped de insecto se
co-transforma con el ADN heterólogo del vector de
transferencia y el ADN genómico del baculovirus de tipo natural,
normalmente mediante co-transfección. El promotor y
la secuencia de terminación de la transcripción de la construcción
estarán constituidos normalmente por una sección de
2-5 kb del genoma del baculovirus. Los
procedimientos para introducir ADN heterólogo en el sitio deseado en
el baculovirus se conocen en la técnica. (Véase Summers y Smith
anteriormente; Ju y col., (1987; Smith y col., Mol. Cell. Biol.
(1983), 3: 2156: y Luckow y Summers (1989)). Por ejemplo, la
inserción puede ser en un gen tal como el gen de polihedrina,
mediante recombinación homóloga de doble entrecruzamiento; la
inserción también puede realizarse en un sitio de restricción
enzimática introducido en el gen de baculovirus deseado. Miller y
col., (1989), Bioessays, 4: 91. La secuencia de ADN, cuando se
clona en lugar del gen de polihedrina en el vector de expresión,
está flanqueada tanto en 5' como en 3' por secuencias específicas de
polihedrina y se coloca cadena abajo del promotor de
polihedrina.
El vector de expresión de baculovirus recién
formado se introduce posteriormente en un baculovirus recombinante
infeccioso. La recombinación homóloga se produce a baja frecuencia
(entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%); por lo tanto, la
mayor parte del virus producido después de la
co-transfección sigue siendo virus de tipo natural.
Por lo tanto, es necesario un procedimiento para identificar virus
recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es una
selección visual que permite distinguir virus recombinantes. La
proteína polihedrina, que es producida por el virus natural, se
produce a niveles muy altos en los núcleos de las células infectadas
en las etapas tardías después de la infección vírica. La proteína
polihedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que también
contienen partículas incluidas. Estos cuerpos de oclusión, tienen
gran capacidad de refracción, lo que les proporciona una apariencia
brillante que se visualiza fácilmente en el microscopio óptico. Las
células infectadas con virus recombinante carecen de cuerpos de
oclusión. Para distinguir los virus recombinante de los virus de
tipo natural, se coloca el sobrenadante de transfección en placas en
una monocapa de células de insecto mediante técnicas conocidas por
los expertos en la materia. Concretamente, las placas se exploran
en el microscopio óptico para detectar la presencia (indicativa de
virus de tipo natural) o ausencia (indicativa de virus
recombinantes) de cuerpos de oclusión. Current Protocols in
Microbiology Vol. 2 (Ausubel y col., eds) a 16.8 (Supp. 10, 1990),
Summers y Smith, anteriormente, Miller y col., (1989).
Se han desarrollado vectores de expresión en
baculovirus recombinantes para la infección de varias células de
insecto. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes
para entre otros Aedes aegypti, Autographa californica,
Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y
Trichoplusia nl (publicación PCT Nº WO 89/046699; Carbonell
y col., (1985) J. Virol. 56: 153, Wright (1986) Nature 321: 718;
Smith y col., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156: y véase generalmente,
Fraser y col. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).
Las células y los medios de cultivo celular
están disponibles en el mercado para la expresión directa y de
fusión de polipéptidos heterólogos en un sistema de expresión de
baculovirus; la tecnología del cultivo celular es conocida
generalmente por los expertos en la materia. Véase por ejemplo
Summers y Smith anteriormente.
Las células de insecto modificadas pueden
cultivarse en un medio nutriente adecuado, lo que permite el
mantenimiento estable del(los) plásmido(s)
presente(s) en el huésped insecto modificado. Cuando el gen
producido por la expresión está bajo un control inducible, el
huésped puede crecer hasta una alta densidad y puede inducirse la
expresión. Como alternatural, cuando la expresión es constitutiva,
el producto se expresará de forma continua en el medio y el medio
nutriente debe circular de forma continua, mientras se retira el
producto de interés y se aumentan los nutrientes agotados. El
producto puede purificarse mediante técnicas tales como
cromatografía, por ejemplo HPLC, cromatografía de afinidad,
cromatografía de intercambio iónico, etc., electroforesis;
centrifugado por gradiente de densidad; extracción del disolvente o
similares. Según sea apropiado, el producto puede purificarse
adicionalmente para eliminar sustancialmente cualquier proteína de
insecto que pudiera secretarse al medio o pudiera resultar de la
lisis de células de insectos, para proporcionar un producto que esté
al menos sustancialmente libre de restos del huésped, por ejemplo,
proteínas, lípidos y polisacáridos.
Para obtener la expresión de las proteínas, se
incuban las células huésped recombinantes obtenidas de los
transformantes en condiciones que permiten la expresión de la
secuencia que codifica la proteína recombinante. Estas condiciones
variarán dependiendo de la célula huésped seleccionada. Sin embargo,
las condiciones pueden determinarlas fácilmente los expertos en la
materia, de acuerdo con lo que se conocen en la técnica.
En la técnica se conocen métodos de expresión
bacteriana. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN
capaz de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la
transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por
ejemplo gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de
inicio de la transcripción que se sitúa normalmente en posición
proximal con respecto al extremo 5' de la secuencia codificante.
Esta región de inicio de la transcripción normalmente incluye un
sitio de unión a la ARNm polimerasa y un sitio de inicio de la
transcripción. Un promotor bacteriano también tendrá un segundo
dominio llamado operador, que puede solaparse con un sitio de unión
de ARN polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de ARN.
El operador permite la transcripción regulada negativamente
(inducible), ya que una proteína represora del gen puede unirse al
operador y por lo tanto inhibir la transcripción de un gen
específico. La expresión constitutiva puede producirse en presencia
de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además,
puede conseguirse la regulación positiva mediante una secuencia de
unión a la proteína activadora del gen, que, si está presente, está
normalmente en posición proximal (5') con respecto a la secuencia de
unión a la ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora
del gen es la proteína activadora del catabolito (CAP), que ayuda al
inicio de la transcripción del operón lac en Escherichia
coli (E. coli) (Raibaud y col., (1984) Annu. Rev. Genet.
18: 173). Por lo tanto la expresión regulada puede ser positiva o
negativa, potenciando o reduciendo de este modo la
transcripción.
Las secuencias que codifican enzimas de rutas
metabólicas proporcionan secuencias promotoras particularmente
útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras obtenidas de
enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa
(lac), (Chang y col., (1977) Nature 198: 1056) y maltosa. Los
ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras obtenidas de
enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) (Goeddel y
col., (1980) Nuc. Acids Res 8: 4057; Yelverton y col., (1981) Nucl.
Acids Res. 9: 731, Patente de Estados Unidos 4.738.921; Publicación
EPO Nº 036 776 y 121 775). El sistema promotor de
beta-lactamasa (bla) (Weissmann (1981) "The
cloning of interferon and other mistakes" En Interferon 3 (ed. I.
Gresser)), y los sistemas promotores de bacteriófago lambda PL
(Shimatake y col., (1981) Nature 292: 128) y T5 (Patente de Estados
Unidos 4.689.406) también proporcionan secuencias promotoras
útiles.
Además, los promotores sintéticos que no se
encuentran en la naturaleza también funcionan como promotores
bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la
transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago pueden
unirse con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o
bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético (Patente de
Estados Unidos 4.551.433). Por ejemplo, el promotor tac es un
promotor trp-lac híbrido constituido por el
promotor trp y las secuencias del operón lac que está
regulado por el represor lac (Amann y col., (1983) Gene 25:
167; de Boer y col, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21). Además,
un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural de
origen no bacteriano que tengan la capacidad de unirse a la ARN
polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor de
origen natural de origen no bacteriano puede acoplarse también con
una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de
expresión de algunos genes en procariotas. El sistema de ARN
polimerasa/promotor del bacteriófago T7 es un ejemplo de un sistema
promotor acoplado (Studier y col., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113,
Tabor y col., (1985) Proc Natl Acad. Sci. 82: 1074). Además, un
promotor híbrido puede estar constituido también por un promotor
bacteriófago y una región operadora de E. coli (publicación
EPO Nº 267 851).
Además de la secuencia promotora en
funcionamiento, un sitio de unión al ribosoma eficaz también es útil
para la expresión de genes extraños en procariotas. En E.
coli, el sitio de unión al ribosoma se denomina la secuencia
Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio
(ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud
situada 3-11 nucleótidos cadena arriba del codón de
inicio (Shine y col., (1975) Nature 254: 34). Se piensa que la
secuencia SD promueve la unión del ARNm al ribosoma emparejando
bases entre la secuencia SD y el extremo 3' del ARNr 16S de E.
coli (Steitz y col., (1979) ``Genetic signals and nucleotide
sequences in Messenger RNA" En Biological Regulation and
Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)). Para expresar
genes eucariotas y genes procariotas con un sitio de unión débil al
ribosoma, a menudo es necesario optimizar la distancia entre la
secuencia SD y el ATG del gen eucariota (Sambrook y col., (1989)
"Expression of cloned genes in Escherichia coli. En
Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
Una molécula de ADN puede expresarse de forma
intracelular. Una secuencia promotora puede unirse de forma directa
con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el
extremo N será siempre una metionina, que está codificada por el
codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede
escindirse de la proteína mediante incubación in vitro con
bromuro de cianógeno o mediante incubación in vitro o in
vivo con una peptidasa N terminal de metionina bacteriana
(Publicación EPO Nº 219 237).
Las proteínas de fusión proporcionan una
alternatural a la expresión directa. Normalmente, una secuencia de
ADN que codifica la porción N terminal de una proteína bacteriana
endógena, u otra proteína estable, se fusiona con el extremo 5' de
secuencias codificantes heterólogas. Después de la expresión, esta
construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de
aminoácidos. Por ejemplo, el gen de la célula del bacteriófago
lambda puede unirse en el extremo 5' de un gen extraño y puede
expresarse en bacterias. La proteína de fusión resultante conserva
preferentemente un sitio para una enzima de procesamiento (factor
Xa) para escindir la proteína del bacteriófago del gen extraño
(Nagai y col. (1984) Nature 309: 810). Las proteínas de fusión
también pueden prepararse con secuencias de los genes lacZ
(Jia y col. (1987) Gene 60: 197), trpE (Allen y col., (1987)
J. Biotechnol. 5: 93: Makoff y col., (1989) J. Gen. Microbiol. 135:
11) y Chey (Publicación EPO Nº 324 647). Las secuencias de ADN en
la unión de las dos secuencias de aminoácidos pueden codificar o no
un sitio escindible. Otro ejemplo es una proteína de fusión a
ubiquitina. Dicha proteína de fusión se prepara con la región de
ubiquitina que conserva preferentemente un sitio para una enzima de
procesamiento (por ejemplo, una proteasa de procesamiento
específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína
extraña. A través de este procedimiento, puede aislarse una
proteína extraña natural (Miller y col. (1989) BiolTechnology 7:
698).
Como alternatural, también pueden secretarse de
la célula proteínas extrañas creando moléculas de ADN quiméricas
que codifiquen una proteína de fusión constituida por un fragmento
de secuencia de péptido señal que posibilita la secreción de la
proteína extraña en bacterias (Patente de Estados Unidos 4.336.336).
El fragmento de secuencia señal normalmente codifica un péptido
señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la
secreción de la proteína a partir de la célula. La proteína se
secreta en el medio de cultivo (bacterias gram positivas) o el
espacio periplasmático situado entre la membrana interna y externa
de la célula (bacterias gram negativas). Preferentemente existen
sitios de procesamiento, que puede escindirse in vivo o in
vitro codificados entre el fragmento de péptido señal y el gen
extraño.
El ADN que codifica secuencias de señal
adecuadas puede obtenerse de genes para proteínas bacterianas
secretadas, tales como el gen de la proteína de la membrana externa
de E. coli (ompA) (Masui y col., (1983), en
Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb y col. (1984)
EMBO J. 3: 2437) y la secuencia señal de fosfatasa alcalina de
E. coli (phoA) (Oka y col. (1985) Proc. Natl. Acad.
Sic. 82: 7212). Como ejemplo adicional, puede usarse la secuencia
señal del gen de alfa-amilasa de diversas cepas de
Bacillus para secretar proteína heterólogas de B. subtilis
(Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582;
publicación EPO Nº 244 042).
Normalmente, las secuencias de terminación de la
transcripción reconocidas por las bacterias son regiones
reguladoras situadas en posición 3' con respecto al codón de
terminación de la traducción y por lo tanto junto con el promotor
flanquean a la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la
transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido
codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la
transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN de
aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras en
bucle que ayudan a terminar la transcripción. Los ejemplos incluyen
secuencias de terminación de la transcripción obtenidas de genes
con promotores fuertes, tales como el gen trp en E.
coli así como otros genes biosintéticos.
Normalmente, los componentes descritos
anteriormente, que comprenden un promotor, secuencia señal (si se
desea) secuencia codificante de interés y secuencia de terminación
de la transcripción, se colocan de forma conjunta en construcciones
de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo
en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo
plásmido) capaz de mantenerse de forma estable en un huésped, tal
como bacterias. Este replicón tendrá un sistema de replicación, que
le permite por lo tanto mantenerse en un huésped procariota para
expresión o para clonación y amplificación. Además, un replicón
puede ser un plásmido de un alto o bajo número de copias. Un
plásmido de elevado número de copias tendrá generalmente un número
de copias que varía entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 y
normalmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un
huésped que contiene un plásmido de elevado número de copias
contendrá preferentemente al menos aproximadamente 10 y más
preferentemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede
seleccionarse un vector de alto o bajo número de copias,
dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña sobre el
huésped.
Como alternatural, las construcciones de
expresión pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector
de integración. Los vectores de integración contienen normalmente al
menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite
que el vector se integre. La integración parece ser el resultado de
recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma
bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos
con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de
Bacillus (publicación EPO Nº 127 328). Los vectores de integración
también pueden estar constituidos por secuencias de bacteriófagos o
del transposón.
Normalmente, las construcciones
extracromosómicas y de integración de la expresión pueden contener
marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas
bacterianas que se hayan transformado. Los marcadores seleccionables
pueden expresarse en el huésped bacteriano y pueden incluir genes
que hacen a las bacterias resistentes a fármacos tales como
ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y
tetraciclina (Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469).
Los marcadores seleccionables también pueden incluir genes
biosintéticos, tales como los de las rutas de histidina, triptófano
y leucina.
Como alternatural, algunos de los componentes
descritos anteriormente pueden colocarse conjuntamente en vectores
de transformación. Los vectores de transformación están constituidos
normalmente por un marcador seleccionable que se mantiene en un
replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se ha
descrito anteriormente.
Los vectores de expresión y transformación, ya
sean replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han
desarrollado para la transformación en muchas bacterias. Por
ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para entre
otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis (Palva y
col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582: publicación EPO Nº
036 259 y 063 953; Publicación PCT Nº WO 84/04541), Escherichia
coli (Shimatake y col., (1981) Nature 292: 128; Amman y col.,
(1985) Gene 40: 183: Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113;
Publicación EPO Nº 036 776, 135 829 y 136 907), Streptococus
cremoris (Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:
655); Streptococcus lividans (Powell y col., (1988) Appl.
Environ. Microbiol. 54: 655), Streptomyces lividans (Patente
de Estados Unidos Nº 4.745.056).
Los procedimientos para introducir ADN exógeno
en huéspedes bacterianos se conocen bien en la técnica, e incluyen
normalmente la transformación de una bacteria tratada con CaCl_{2}
u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. También
puede introducirse ADN en células bacterianas mediante
electroporación. Los procedimientos de transformación varían
normalmente con las especies bacterianas a transformar. (Véase por
ejemplo uso de Bacillus: Masson y col. (1989) FEMS
Microbiol. Lett. 60: 273, Palva y col., (1982) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79: 5582; Publicación EPO Nº 036 259 y 063 953;
Publicación PCT Nº WO 84/04541; uso de Campylobacter, Miller
y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856, y Wang y col. (1990)
J. Bacteriol. 172: 949; uso de Escherichia coli: Cohen y
col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110: Dower y col. (1988)
Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method
for transformation of Escherichia coli with
ColE1-derived plasmids. En Genetic Engineering:
Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering
(eds. H.W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col., (1970) J. Mol. Biol.
53: 159: Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318, uso de
Lactobacillus: Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:
173, uso de Pseudomonas: Fiedler y col., (1988) Anal.
Biochem 170: 38, uso de Staphylococcus: Augustin y col.
(1990) FEMs Microbiol. Lett. 66: 203; uso de Streptococcus:
Barany y col. (1980) J. Bacteriol, 144: 698; Harlander (1987)
"Transformation of Streptococcus lactis by
electroporation, en Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R.
Curtiss III); Perry y col., (1981) Infect. Immun. 32: 1295; Powell
y col., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti y col.,
(1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412.
Los sistemas de expresión en levaduras también
son conocidos por los expertos en la materia. Un promotor de
levadura es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN
polimerasa de levadura e iniciar la transcripción cadena abajo (3')
de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARNm.
Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que se
sitúa normalmente en posición proximal con respecto al extremo 5'
de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la
transcripción normalmente incluye un sitio de unión a la ARNm
polimerasa (la "caja TATA") y un sitio de inicio de
transcripción. Un promotor de levadura también puede contener un
segundo dominio denominado secuencia activadora cadena arriba (UAS),
que, si está presente, está normalmente en posición distal con
respecto al gen estructural. La UAS permite la expresión regulada
(inducible). La expresión constitutiva se produce en ausencia de una
UAS. La expresión regulada puede ser positiva o negativa,
potenciando o reduciendo de este modo la transcripción.
La levadura es un organismo fermentador con una
ruta metabólica activa, por lo tanto las secuencias que codifican
enzimas en la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras
particularmente útiles. Los ejemplos incluyen alcohol
deshidrogenasa (ADH) (Publicación EPO Nº 284 044), enolasa,
glucoquinasa, glucosa-6-fosfato
isomerasa,
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa,
(GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa,
3-fosfoglicerato mutasa y piruvato quinasa (PyK)
(Publicación EPO Nº 329 203). El gen PHO5 de levadura, que
codifica fosfatasa ácida, también proporciona secuencias promotoras
útiles (Myanohara y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
1).
Además, los promotores sintéticos que no se
producen en la naturaleza también funcionan como promotores de
levaduras. Por ejemplo, las secuencias UAS de un promotor de
levadura pueden unirse con la región de activación de la
transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor
híbrido sintético. Los ejemplos de dichos promotores híbridos
incluyen la secuencia reguladora ADH unida a la región de activación
de la transcripción GAP (Patentes de Estados Unidos Nº 4.876.197 y
4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen
promotores que están constituidos por las secuencias reguladoras de
los genes ADH2, GAL4, GAL10, o PHO5, combinadas con
la región de activación del a transcripción de un gen de la enzima
glicolítica tal como GAP o PyK (Publicación EPO Nº 164 556).
Además, un promotor de levadura puede incluir promotores de origen
natural de origen no de levadura que tengan la capacidad de unirse
a la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Los
ejemplos de dichos promotores incluyen entre otros (Cohen y col.
(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff y col. (1981)
Nature 283: 835: Hollenberg y col. (1981) Curr. Topics Microbiol.
Immunol. 96: 119; Hollenberg y col. (1979) "The Expression of
Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces
cerevisiae," en Plasmids of Medical, Environmental and
Comercial Importante (eds. K.N. Timmis y A. Puhler);
Mercerau-Puigalon y col. (1980) Gene 11: 163;
Panthier y col. (1980) Curr. Genet. 2: 109).
Una molécula de ADN puede expresarse de forma
intracelular en una levadura. Una secuencia promotora puede unirse
de forma directa con la molécula de ADN, en cuyo caso, el primer
aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante será siempre
una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se
desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína
mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Las proteínas de fusión proporcionan una
alternatural para los sistemas de expresión en levadura, así como
en sistemas de expresión en mamíferos, vegetales, en baculovirus y
bacterianos. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la
porción N terminal de una proteína de levadura endógena, u otra
proteína estable, se fusiona con el extremo 5' de las secuencias
codificante heterólogas. Después de la expresión, esta construcción
proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por
ejemplo, la levadura del gen de la superóxido dismutasa humana
(SOD), puede unirse en el extremo 5' de un gen extraño y expresarse
en levadura. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias
de aminoácidos puede codificar o no un sitio escindible. Véase por
ejemplo, Publicación EPO Nº 196056. Otro ejemplo es una proteína de
fusión a ubiquitina. Dicha proteína de fusión se prepara con la
región de ubiquitina que preferentemente conserva un sitio para una
enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento
específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína
extraña. Por lo tanto a través de este procedimiento, puede
aislarse una proteína extraña natural (por ejemplo WO
88/024066).
Como alternatural, también pueden secretarse
proteínas extrañas a partir de la célula a los medios de cultivo
creando moléculas de ADN quiméricas que codifiquen una proteína de
fusión constituida por un fragmento de secuencia líder que
posibilita la secreción en levaduras de la proteína extraña.
Preferentemente, existen sitios de procesamiento codificados entre
el fragmento líder y el gen extraño que pueden escindirse in
vivo o in vitro. El fragmento de secuencia líder
normalmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos
hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la
célula.
El ADN que codifica péptidos señal adecuados
puede obtenerse de genes para proteínas de levaduras secretadas,
tales como el gen de la invertasa de levadura (Publicación EPO Nº
012 873; Publicación JPO Nº 62: 096.086) y el gen del factor A
(Patente de Estados Unidos Nº 4.588.684). Como alternatural, existen
líderes de origen no de levadura, tal como un líder de interferón,
que también posibilitan la secreción en levaduras (Publicación EPO
Nº 060 057).
Una clase preferida de líderes de secreción son
los que emplean un fragmento del gen del factor alfa de levadura,
que contiene una secuencia señal "pre" y una región "pro".
Los tipos de fragmentos de factor alfa que pueden emplearse
incluyen el líder de factor alfa pre-pro de longitud
completa (de aproximadamente 83 restos de aminoácidos) así como
líderes de factor alfa truncados (normalmente de aproximadamente 25
a aproximadamente 50 restos de aminoácidos) (Patente de Estados
Unidos Nº 4.546.083 y 4.870.008; Publicación EPO Nº 324 274). Los
líderes adicionales que emplean un fragmento líder de factor alfa
que posibilita la secreción incluyen líderes de factor alfa
híbridos preparados con una presecuencia de una primera levadura,
pero una región pro de un factor alfa de una segunda levadura
(véase por ejemplo Publicación PCT Nº WO 89/02463).
Normalmente, las secuencias de terminación de la
transcripción reconocidas por una levadura son secuencias
reguladoras situadas en posición 3' con respecto al codón de
terminación de la traducción, y por lo tanto junto con el promotor
flanquean a la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la
transcripción de un ARNm que puede traducirse al polipéptido
codificado por el ADN. Los ejemplos de secuencia de terminación de
la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por
la levadura, tales como las que codifican enzimas glicolíticas.
Normalmente, los componentes descritos
anteriormente, comprenden un promotor, líder (si se desea),
secuencia codificante de interés y una secuencia de terminación de
la transcripción y se colocan conjuntamente en construcciones de
expresión. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en
un replicón tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo,
plásmidos) capaz de mantenerse de forma estable en un huésped, tal
como una levadura o una bacteria. El replicón puede tener dos
sistemas de replicación, que le permiten por lo tanto mantenerse,
por ejemplo, en levaduras para la expresión y en un huésped
procariota para clonación y amplificación. Los ejemplos de dichos
vectores lanzadera de levadura-bacteria incluyen
Yep24 (Botstein y col. (1979) Gene 8: 17-24), pCI/1
(Brake y col. (1984) Proc Natl. Acad. Sci. USA 81:
4642-4646) e YRp17 (Stinchcomb y col. (1982) J. Mol.
Biol. 158: 157). Además, una replicón puede ser un plásmido de un
alto o un bajo número de copias. Un plásmido de elevado número de
copias tendrá generalmente un número de copias que varía entre
aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y normalmente entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un
plásmido de elevado número de copias preferentemente tendrá al
menos aproximadamente 10 y más preferentemente al menos
aproximadamente 20. La introducción de un vector de alto o de bajo
número de copias puede seleccionarse, dependiendo del efecto del
vector y de la proteína extraña sobre el huésped. Véase por ejemplo,
Brake y col., anteriormente.
Como alternatural, las construcciones de
expresión pueden integrarse en el genoma de la levadura con un
vector de integración. Los vectores de integración normalmente
contienen al menos una secuencia homóloga a un cromosoma de
levadura que permite que el vector se integre, y preferentemente
contienen dos secuencias homólogas que flanquean a la construcción
de expresión. Las integraciones parecen ser el resultado de
recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma de
levadura (Orr-Weaver y col. (1983) Methods in
Enzymol. 101: 228-245). Un vector de integración
puede dirigirse a un locus específico en la levadura seleccionando
la secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector.
Véase Orr-Weaver y col., anteriormente. Una o más
construcciones de expresión pueden integrarse, afectando
posiblemente a los niveles de la proteína recombinante producida
(Rine y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750). Las
secuencias cromosómicas incluidas en el vector pueden producirse
como un único segmento en el vector, que da como resultado la
integración de todo el vector, o como dos segmentos homólogos a
segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean a la
construcción de expresión en el vector, lo que puede provocar la
integración estable de solamente la construcción de expresión.
Normalmente, las construcciones de expresión
extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores
seleccionables para permitir la selección de cepas de levadura que
se haya transformado. Los marcadores seleccionables pueden incluir
genes biosintéticos que pueden expresarse en el huésped de levadura,
tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 y ALG7 y el gen de
resistencia a G418, que confiere resistencia en células de levadura
a tunicamicina y G418, respectivamente. Además, un marcador
seleccionable adecuado puede proporcionar también a la levadura la
capacidad de crecer en presencia de compuestos tóxicos, tales como
metales. Por ejemplo, a presencia de CUP1 permite a la
levadura crecer en presencia de iones de cobre (Butt y col. (1987)
Microbiol. Rev. 51: 351).
Como alternatural, algunos de los componentes
descritos anteriormente, pueden colocarse conjuntamente en vectores
de transformación. Los vectores de transformación normalmente están
constituidos por un marcador seleccionable que se mantiene en un
replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se ha
descrito anteriormente.
Los vectores de expresión y transformación,
replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han
desarrollado para la transformación en muchas levaduras. Por
ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión y procedimientos
para introducir ADN exógeno en huéspedes de levadura para, entre
otros, las siguientes levaduras; Candida albicans (Kurtz, y
col. (1986); Mol. Cell. Biol. 6: 142), Candida maltosa (Kunze
y col. (1985) J. Basic Microbiol.25: 141); Hansenula
polymorpha (Gleeson, y col., (1986), J. Gen. Microbiol. 132:
3459; Roggenkamp y col., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302),
Kluyveromyces fragilis (Das, y col. (1984) J. Bacteriol.
158: 1165); Kluyveromyces lactis (De Louvencourt y col.
(1983), J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg y col. (1990),
Bio/Technology 8: 135); Pichia guillerimondii (Kunze y col.,
(1985) J. Basic Microbiol. 25: 141); Pichia pastoris (Cregg,
y col (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Patentes de Estados Unidos
Nº 4.837.148 y 4.929.555); Saccharomyces cerevisiae (Hinnen
y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito y col,
(1983) J. Bacteriol. 153: 163); Schizosaccharomyces
pombe (Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706); y Yarrowia
lipolytica (Davidow, y col., (1985) Curr. Genet. 10: 380471
Gaillardin, y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49).
Los procedimientos para introducir ADN exógeno
en los huéspedes de levadura se conocen bien en la técnica, y
normalmente incluyen la transformación de esferoplastos o de células
de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Los
procedimientos de transformación varían normalmente con las especies
de levadura a transformar. Véase por ejemplo, [Kurtz y col. (1986)
Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol.25:
141 Candida]; [Gleeson, y col., (1986), J. Gen. Microbiol. 132:
3459; Roggenkamp y col., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302;
Hansenula]; [Das, y col. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165; De
Louvencourt y col. (1983), J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg y
col. (1990), Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg, y col
(1985), Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze y col. (1985); J. Basic
Microbiol. 25: 141; Patentes de Estados Unidos Nº 4.837.148 y
4.929.555 Pichia]; [Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75: 1929; Ito y col, (1983) J. Bacteriol. 153: 163 Saccharomyces];
[Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces];
[Davidow, y col., (1985) Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin, y col.
(1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].
Una composición que contiene X está
sustancialmente libre de Y cuando al menos 85% en peso del total X+Y
en la composición es X. Preferentemente, X comprende al menos
aproximadamente 90% en peso del total de X+Y en la composición, más
preferentemente al menos aproximadamente 95% o incluso 99% en
peso.
Un fragmento de aminoácido o proteína de
Neisseria "conservado" es uno que está presente en una
proteína de Neisseria particular en al menos x% de
Neisseria. El valor de x puede ser 50% o más, por ejemplo,
66%, 75%, 80%, 90%, 95% o incluso 100% (es decir, el aminoácido se
encuentra en la proteína en cuestión en toda la Neisseria).
Para determinar si un aminoácido está "conservado" en una
proteína de Neisseria particular, es necesario comparar este
resto de aminoácido en las secuencias de la proteína en cuestión de
una pluralidad de Neisseria diferentes (una población de
referencia). La población de referencia puede incluir varias
especies de Neisseria diferentes o puede incluir una única
especie. La población de referencia puede incluir varios serogrupos
diferentes de una especie en particular o un único serogrupo. Una
población de referencia preferida está constituida por las 5
Neisseria más comunes.
El término "heterólogos" se refiere a dos
componentes biológicos que no se encuentran juntos en la naturaleza.
Los componentes pueden ser células huésped, genes o regiones
reguladoras, tales como promotores. Aunque los componentes
heterólogos no se encuentran juntos de forma natural, pueden
funcionar de forma conjunta, como cuando un promotor heterólogo a
un gen se une de forma operativa al gen. Otro ejemplo es cuando una
secuencia de Neisseria es heteróloga para una célula huésped
de ratón.
Un "origen de replicación" es una secuencia
de polinucleótidos que inicia y regula la replicación de
polinucleótidos, tal como un vector de expresión. El origen de
replicación se comporta como una unidad autónoma de replicación de
polinucleótidos en una célula, capaz de replicarse bajo su propio
control. Puede ser necesario un origen de replicación para que un
vector se replique en una célula huésped particular. Con ciertos
orígenes de replicación, un vector de expresión puede reproducirse
a un elevado número de copias en presencia de las proteínas
apropiadas dentro de la célula. Los ejemplos de orígenes son
secuencias de replicación autónoma, que son eficaces en levaduras;
y el antígeno T viral, eficaz en células COS-7.
Una secuencia "mutante" se define como un
ADN, ARN o secuencia de aminoácidos que es diferente de, pero que
tiene una homología con, la secuencia natural o descrita.
Dependiendo de la secuencia particular, el grado de homología
(identidad de secuencia) entre la secuencia natural o descrita y la
secuencia mutante es preferentemente mayor de 50% (por ejemplo,
60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) lo que se calcula como se ha
descrito anteriormente. Como se usa en este documento, una
"variante alélica" de una molécula de ácido nucleico, o de una
región, para la que se proporciona en este documento la secuencia
de ácido nucleico, es una molécula de ácido nucleico, o una región,
que se produce en esencialmente el mismo locus en el genoma de otro
o de un segundo aislado y que, debido a la variación natural
causada por ejemplo, por mutación o recombinación, tiene una
secuencia de ácido nucleico similar pero no idéntica. Una variante
alélica de región codificante codifica normalmente una proteína que
tiene una actividad similar a la de la proteína codificada por el
gen con el que se está comparando. Una variante alélica también
puede comprender una alteración en las regiones 5' o 3' no
traducidas del gen, tal como en regiones de control reguladoras
(véase por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.753.235).
Como se usa en este documento, el término
"anticuerpo" se refiere a un polipéptido o a un grupo de
polipéptidos constituido por al menos un sitio de combinación de
anticuerpos. Un "sitio de combinación de anticuerpos" es el
espacio de unión tridimensional con una forma de superficie interna
y una distribución de cargas complementarias a las características
de un epítopo o un antígeno, lo que permite una unión del anticuerpo
con el antígeno. "Anticuerpo", incluye por ejemplo,
anticuerpos de vertebrados, anticuerpos híbridos, anticuerpos
quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos alterados,
anticuerpos univalentes, proteínas Fab y anticuerpos de dominio
único.
Los anticuerpos contra las proteínas de la
invención son útiles para cromatografía de afinidad, inmunoensayos
y distinción/identificación de proteínas de menB de
Neisseria. Los anticuerpos producidos contra las proteínas
de la presente invención se unen a polipéptidos o a proteínas o a
fragmentos de proteínas antigénicos que están presentes y se
asocian específicamente con cepas de menB de Neisseria
meningitidis. En algunos casos, estos antígenos pueden
asociarse con cepas específicas, tales como los antígenos
específicos para las cepas de menB. Los anticuerpos de la invención
pueden inmovilizarse con una matriz y utilizarse en un inmunoensayo
o en una columna de cromatografía de afinidad, para permitir la
detección y/o separación de polipéptidos, proteínas o fragmentos de
proteínas o células que comprenden dichos polipéptidos, proteínas o
fragmentos de proteínas. Como alternatural, dichos polipéptidos,
proteínas o fragmentos de proteínas pueden inmovilizarse para
detectar anticuerpos que se unen específicamente a ellos.
Los anticuerpos para las proteínas de la
invención, policlonales y monoclonales, pueden prepararse mediante
procedimientos convencionales. En general, la proteína se usa en
primer lugar para inmunizar un animal adecuado, preferentemente, un
ratón, rata, conejo o cabra. Se prefieren conejos y cabras para la
preparación de sueros policlonales debido al volumen de suero
obtenible y a la disponibilidad de anticuerpos anticonejo y
anticabra marcados. La inmunización se realiza generalmente
mezclando o emulsionando la proteína en solución salina,
preferentemente con un adyuvante tal como el adyuvante completo de
Freund e inyectando la mezcla o emulsión por vía parenteral
(generalmente por vía subcutánea o intramuscular). Normalmente es
suficiente una dosis de 50-200 \mug/inyección. La
inmunización se refuerza generalmente 2-6 semanas
después con una o más inyecciones de la proteína en solución
salina, preferentemente usando adyuvante incompleto de Freund. Puede
generarse alternaturalmente anticuerpos mediante inmunización in
vitro usando procedimientos conocidos en la técnica lo que,
para los fines de esta invención, se considera equivalente a la
inmunización in vivo. Los antisuero policlonales se obtienen
extrayendo sangre de animales inmunizados en un recipiente de vidrio
o de plástico, incubando la sangre a 25ºC durante 1 hora, seguido
de incubación a 4ºC durante 2-18 horas. El suero se
recupera mediante centrifugado (por ejemplo, a 1000 g durante 10
minutos). Pueden obtenerse de aproximadamente 20-50
ml por extracción de sangre a partir de conejos.
Los anticuerpos monoclonales se preparan usando
el procedimiento convencional de Kohler y Milstein (Nature (1975)
256: 495-96), o una modificación del mismo.
Normalmente, se inmuniza un ratón o una rata como se ha descrito
anteriormente. Sin embargo, en lugar de extraer sangre del animal
para extraer el suero, se extirpa el bazo (y opcionalmente varios
nódulos linfáticos grandes) y se disocian en células únicas. Si se
desea, las células del bazo pueden seleccionarse (después de la
retirada de células adherentes no específicas) aplicando una
suspensión celular a una placa o a un pocillo recubierto con el
antígeno de la proteína. Las células B que expresan inmunoglobulina
unida a la membrana específica para el antígeno se unen a la placa y
no se eliminan mediante el aclarado con el resto de la suspensión.
Las células B resultantes, o todas las células del bazo disociadas,
se inducen después para que se fusionen con células de mieloma para
formar hibridomas y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo,
medio hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Los
hibridomas resultantes se colocan en placas mediante dilución
limitante, y se ensaya la producción de anticuerpos que se unen
específicamente al antígeno inmunizante (y que no se unen a
antígenos no relacionados). Los hibridomas que secretan MAB
seleccionados se cultivan después in vitro (por ejemplo en
frascos de cultivo tisular o en reactores de fibra hueca) o in
vivo (como ascitis en ratones).
Si se desea, los anticuerpos (policlonales o
monoclonales) pueden marcarse usando técnicas convencionales. Las
marcas adecuadas incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos
radioactivos (particularmente ^{32}P y ^{125}I), reactivos
densos a electrones, enzimas y ligandos que tienen compañeros de
unión específicos. Las enzimas se detectan normalmente mediante su
actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano rusticano se detecta
normalmente mediante su capacidad para convertir
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento
azul, cuantificable con un espectrofotómetro. "Compañero de unión
de específica" se refiere a una proteína capaz de unirse a una
molécula ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el caso
de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para éste.
Otros compañeros de unión específica incluyen biotina y avidina o
estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas de
receptor-ligando conocidas en la técnica. Debe
entenderse que la descripción anterior no pretende categorizar las
diversas marcas en diferentes clases, ya que la misma marca puede
servir en diferentes modos. Por ejemplo, ^{125}I puede servir como
una marca radioactiva o como un reactivo denso a electrones. HRP
puede servir como enzima o como antígeno para un MAb. Además, pueden
combinarse diversas marcas para el efecto deseado. Por ejemplo, los
MAb y avidina también requieren marcas en la práctica de esta
invención: por lo tanto, puede marcarse un MAb con biotina y
detectar su presencia con avidina marcada con ^{125}I o con un
MAb anti-biotina marcado con HRP. Otras
permutaciones y posibilidades serán fácilmente evidentes para los
expertos en la materia, y se consideran equivalentes dentro del
alcance de la presente invención.
Los antígenos, inmunógenos, polipéptidos,
proteínas o fragmentos de proteína de la presente invención provocan
la formación de anticuerpos compañeros de unión específica. Estos
antígenos, inmunógenos, polipéptidos, proteínas o fragmentos de
proteínas de la presente invención comprenden composiciones
inmunogénicas de la presente invención. Dichas composiciones
inmunogénicas pueden comprender o incluir además adyuvantes,
vehículos u otras composiciones que promueven o potencian o
estabilizan los antígenos, polipéptidos, proteínas o fragmentos de
proteínas de la presente invención. Dichos adyuvantes y vehículos
serán muy evidentes para los expertos en la materia.
Las composiciones farmacéuticas pueden
comprender (incluir) polipéptidos, anticuerpos o ácidos nucleicos de
la invención. Las composiciones farmacéuticas comprenderán una
cantidad terapéuticamente eficaz de polipéptidos, anticuerpos, o
polinucleótidos de la presente invención.
La expresión "cantidad terapéuticamente
eficaz", como se usa en este documento, se refiere a una cantidad
del agente terapéutico para tratar, mejorar o prevenir una
enfermedad o afección deseada, o para mostrar un efecto terapéutico
o preventivo detectable. El efecto puede detectarse mediante, por
ejemplo, niveles de marcadores químicos o antígenos. Los efectos
terapéuticos también incluyen reducción de los síntomas físicos,
tales como temperatura corporal disminuida, cuando se administran a
un paciente que está febril. La cantidad eficaz exacta para un
sujeto dependerá del tamaño y el estado de salud del sujeto, de la
naturaleza y el alcance de la afección y de los agentes
terapéuticos o combinación de agentes terapéuticos seleccionados
para administración. Por lo tanto, no es útil especificar una
cantidad eficaz exacta por adelantado. Sin embargo, la cantidad
eficaz para una situación dada puede determinarse mediante
experimentación rutinaria y está dentro del juicio del médico.
Para los fines de la presente invención, una
dosis eficaz estará entre aproximadamente 0,01 mg/kg a 50 mg/kg o
entre 0,05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de las construcciones de
ADN en el individuo al que se administran.
Una composición farmacéutica también puede
contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión
"vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo
para la administración de un agente terapéutico, tal como
anticuerpos o un polipéptido, genes y otros agentes terapéuticos. La
expresión se refiere a cualquier vehículo farmacéutico que no
induce por sí solo la producción de anticuerpos perjudiciales para
el individuo que recibe la composición y que puede administrarse
sin toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser
macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como
proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos
poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos
y partículas de virus inactivos. Dichos vehículos los conocen bien
los expertos en la materia.
Pueden usarse en estos sales farmacéuticamente
aceptables, por ejemplo, sales de ácido minerales tales como
clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, y similares; y las
sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos,
malonatos, benzoatos y similares. Una discusión exhaustiva de los
excipientes farmacéuticamente aceptable está disponible en el
documento Remington Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J.
1991).
Los vehículos farmacéuticamente aceptables en
las composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como
agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, en dichos
vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como
agentes humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras del pH,
y similares. Normalmente, las composiciones terapéuticas se
preparan en forma de inyectables, en soluciones o en suspensiones
liquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para
solución en o suspensión en vehículos líquidos antes de la
inyección. Los liposomas se incluyen dentro de la definición de un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una vez formuladas, las composiciones de la
invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos
a tratar pueden ser animales; en particular, pueden tratarse sujetos
humanos.
El suministro directo de las composiciones se
realizará generalmente mediante inyección, por vía subcutánea, por
vía intraperitoneal, por vía intravenosa o por vía intramuscular o
se suministrarán en el espacio intersticial de un tejido. Las
composiciones también pueden administrarse en una lesión. Otros
modos de administración incluyen administración oral y pulmonar,
supositorios y aplicaciones transdérmicas y transcutáneas, agujas y
pistolas génicas o inyectores tipo hypospray. El tratamiento y la
dosificación pueden ser en un programa de dosis única o un programa
de dosis múltiples.
Las vacunas de acuerdo con la invención pueden
ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o
terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de la
infección).
Dichas vacunas comprenden antígeno(s) o
inmunógeno(s) inmunizadores, polipéptidos, proteína(s)
o fragmentos de proteínas o ácidos nucleicos (por ejemplo, ácido
ribonucleico o ácido desoxirribonucleico) inmunogénicos,
normalmente en combinación con "vehículos farmacéuticamente
aceptables" que incluyen cualquier vehículo que no induce por sí
mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que
recibe la composición. Los vehículos adecuados son normalmente
macromoléculas grandes de metabolización lenta tales como proteínas,
polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos,
aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados
lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas) y partículas de
virus inactivados. Dichos vehículos los conocen bien los expertos
en la materia. Además, estos vehículos pueden funcionar como agentes
inmunoestimuladores ("adyuvantes"). Además, el inmunógeno o
antígeno puede conjugarse con un toxoide bacteriano, tal como un
toxoide de difteria, tétanos, cólera, H. pylori, etc.
patógenos.
Los adyuvantes preferidos para potenciar la
eficacia de la composición incluyen, aunque sin limitación: (1)
sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio,
fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones
de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes
inmunoestimuladores específicos tales como péptidos de muramilo
(véase a continuación) o componentes de la pared celular
bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59 (publicación PCT Nº WO
90/14837), que contienen escualeno a 5%, Tween 80 a 0,5% y Span 85
a 0,5% (que contienen opcionalmente diversas cantidades de
MTP-PE (véase a continuación), aunque no se
requiere) formuladas en partículas submicrométricas usando un
microfluidizador tal como el microfluidizador modelo 110Y
(Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene escualeno a 10%,
Tween 80 a 0,4%; polímero L121 bloqueado con pluronic a 5% y
thr-MDP (véase a continuación) microfluidizado en
una emulsión submicrométrica o agitado en vórtice para generar una
emulsión de tamaño de partícula mayor y (c) el sistema adyuvante
Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene
escualeno a 2%, Tween 80 a 0,2% y uno o más componentes de la pared
celular bacteriana del grupo constituido por monofosforilípido A
(MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared
celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox^{TM}); (3) pueden
usarse adyuvantes de saponina, tales como Stimulon^{TM}
(Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a
partir de los mismos tales como ISCOM (complejos
inmunoestimuladores); (4) Adyuvante Completo de Freund (CFA) y
Adyuvante Incompleto de Freund (IFA); (5) citocinas, tales como
interleucinas (por ejemplo, IL-1,
IL-2, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-12,
etc.), interferones (por ejemplo interferón gamma), factor
estimulador de la colonia de macrófagos (M-CSF),
factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; y (6) otras sustancias que
actúan como agentes inmunoestimuladores para potenciar la eficacia
de la composición. Se prefieren alumbre y MF59.
Como se ha mencionado anteriormente, los
péptidos de muramilo incluyen aunque sin limitación,
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
(thr-MDP),
N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina
(nor-MDP),
N-acetilmuramil-N-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina
(MTP-PE), etc.
Las composiciones de vacuna que comprenden
composiciones inmunogénicas (por ejemplo, que pueden incluir el
antígeno, vehículo farmacéuticamente aceptable y un adyuvante)
contendrán normalmente diluyentes, tales como agua, solución
salina, glicerol, etanol, etc. Además, pueden estar presentes en
dichos vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes
humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras del pH y
similares. Como alternatural, las composiciones de vacuna que
comprenden composiciones inmunogénicas pueden comprender un
antígeno, polipéptido, proteína, fragmento de proteína o ácido
nucleico en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Más específicamente, las vacunas que comprenden
composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad
inmunológicamente eficaz de los polipéptidos inmunogénicos, así
como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente,
según sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz" se
entiende que la administración de esta cantidad a un individuo, en
una única dosis o como parte de una serie, es eficaz para el
tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo del
estado de salud y de la condición física del individuo a tratar, del
grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no
humano, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmune del
individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección
deseado, de la formulación de la vacuna, de la evaluación del
médico que trata al paciente o de la situación médica y de otros
factores pertinentes. Se espera que la cantidad esté dentro de un
intervalo relativamente amplio que pueda determinarse a través de
ensayos rutinarios.
Normalmente, las composiciones de vacuna o
composiciones inmunogénicas se preparan como inyectables, en forma
de soluciones o suspensiones liquidas; pueden prepararse formas
sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos
líquidos antes de la inyección. La preparación también puede
emulsionarse o encapsularse en liposomas para un efecto adyuvante
potenciado, como se ha descrito anteriormente en vehículos
farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones inmunogénicas se administran
convencionalmente por vía parenteral por ejemplo, mediante
inyección, por vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones
adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen
formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones
transdérmicas y transcutáneas. El tratamiento de la dosificación
puede ser un programa de dosis única y un programa de dosis
múltiples. La vacuna puede administrarse junto con otros agentes
inmunorreguladores.
Como alternatural a las vacunas basadas en
proteínas, puede emplearse la vacunación con ADN (por ejemplo,
Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:
271-283; Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15:
617-648).
Los vehículos de terapia génica para el
suministro de construcciones, incluyendo una secuencia codificante
de un agente terapéutico de la invención, a suministrar al mamífero
para la expresión en el mamífero, pueden administrarse de forma
local o sistémica. Estas construcciones pueden utilizar enfoques de
vector viral o no viral en modalidad in vivo o ex
vivo. La expresión de dicha secuencia codificante puede
inducirse usando promotores de mamífero endógenos o heterólogos. La
expresión de la secuencia codificante in vivo puede ser
constitutiva o regulada.
La invención incluye vehículos de suministro de
genes capaces de expresar las secuencias de ácido nucleico
contempladas. El vehículo de suministro de genes es preferentemente
un vector viral y más preferentemente, un vector retroviral,
adenoviral, viral adenoasociado (AAV), herpes viral o de alfavirus.
El vector viral también puede ser un vector viral de astrovirus,
coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus,
picornavirus, poxvirus o togavirus. Véase en general, Jolly (1994)
Cancer Gene Therapy 1: 51-64; Kimura (1994) Human
Gene Therapy 5: 845-852; Connelly (1995) Human Gene
Therapy 6: 185-193; y Kaplitt (1994) Nature Genetics
6: 148-153.
Los vectores retrovirales se conocen bien en la
técnica, incluyendo retrovirus de tipo B, C y D, retrovirus
xenotrópicos (por ejemplo, NZB-X1,
NZB-X2 y NZB9-1 (véase O'Neill
(1985) J. Virol, 53: 160) retrovirus politrópicos por ejemplo, MCF
y MCF-MLV (véase Nelly (1983) J. Virol. 45: 291),
espumavirus y lentivirus. Véase el documento RNA Tumor Viruses,
Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.
Las porciones del vector de terapia génica
retroviral pueden suministrarse a partir de diferentes retrovirus.
Por ejemplo, pueden obtenerse LTR de retrovectores de un Virus de
Sarcoma de Ratón, un sitio de unión a ARNt de un Virus de Sarcoma
de Rous, una señal de envasado de un Virus de Leucemia de Ratón y un
origen de la síntesis de una segunda cadena de un Virus de Leucosis
Aviar.
Estos vectores retrovirales recombinantes pueden
usarse para generar partículas de vector retroviral competentes
para la transducción introduciéndolos en líneas celulares de
envasado apropiadas (véase la patente de EE.UU. 5.591.624). Los
vectores de retrovirus pueden reconstruirse para integración
especifica de sitio en ADN de la célula huésped mediante
incorporación de una enzima integrasa quimérica en la partícula
retroviral (véase el documento WO 96/37626). Es preferible que el
vector viral recombinante sea un virus recombinante de replicación
defectuosa.
Las líneas celulares de envasado adecuadas para
su uso con los vectores de retrovirus descritos anteriormente se
conocen bien en la técnica, se preparan fácilmente (véase los
documentos WO 95/30763 y WO 92/05266), y pueden usarse para crear
líneas celulares productoras (también llamadas líneas celulares de
vector o "VCL") para la producción de partículas de vectores
recombinantes. Preferentemente, las líneas celulares de envasado se
preparan a partir de células parentales humanas (por ejemplo células
HT1080) o líneas celulares parentales de visón, lo que elimina la
inactivación en suero humano.
Los retrovirus preferidos para la construcción
de vectores de terapia génica retrovirales incluyen Virus de la
Leucosis Aviar, Virus de la Leucemia Bovina, Virus de la Leucemia de
Ratón, Virus que Induce Focos en Células de Visón, Virus del
Sarcoma de Ratón, Virus de Reticuloendoteliosis y Virus del Sarcoma
de Rous. Los Virus de Leucemia de Ratón particularmente preferidos
incluyen 4070A y 1504A (Hartley y Rowe (1976) J. Virol. 19:
19-25), Abelson (ATCC Nº VR-999),
Friend (ATCC Nº VR-245), Graffi, Gross (ATCC Nº
VR-590), Kirsten, Virus del Sarcoma de Harvey y
Rauscher (ATCC Nº VR-998) y Virus de la Leucemia de
Ratón de Moloney (ATCC Nº VR-190). Dichos
retrovirus pueden obtenerse de depósitos o colecciones tales como la
American Type Culture Collection ("ATCC") en Rockville,
Maryland o aislarse a partir de fuentes conocidas usando técnicas
disponibles comúnmente.
Los vectores de terapia génica retroviral
conocidos ejemplares que pueden emplearse en esta invención incluyen
los que se describen en las solicitudes de patente GB 2200651, EP
0415731, EP 0345242, EP 0334301, WO 89/02468; WO 89/05349, WO
89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO
93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, WO 91/02825, WO
95/07994, US 5.219.740, US 4.405.712, US 4.861.719, US 4.980.289, US
4.777.127, US 5.591.624. Véase también el documento Vile (1993)
Cancer Res 53: 3860-3864; Vile (1993) Cancer Res
53: 962-967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993)
83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:
493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79:
729-735; Mann (1983) Cell 33: 153; Cane (1984) Proc
Natl Acad Sci 81: 6349; y Miller (1990) Human Gene Therapy 1.
Los vectores de terapia génica de adenovirus
humanos también se conocen en la técnica y pueden emplearse en esta
invención. Véase, por ejemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6: 616 y
Rosenfeld (1991) Science 252: 431, y WO 93/07283, WO 93/06223, y WO
93/07282. Los vectores de terapia génica de adenovirus conocidos
ejemplares y que pueden emplearse en esta invención incluyen los
que se describen en los documentos mencionados anteriormente y en
WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984, WO
95/00655, WO 95/27071, WO 95/29993, WO 95/34671, WO 96/05320, WO
94/08026, WO 94/11506, WO 93/06229, WO 94/24299, WO 95/14102, WO
95/24297, WO 95/02697, WO 94/28152, WO 94/25299, WO 95/09241, WO
95/25807, WO 95/05835, WO 94/18922 y WO 95/09654. Como
alternatural, puede emplearse la administración de ADN unido a
adenovirus inactivados como se describe en el documento Curiel
(1992) Hum. Gene Ther. 3: 147-154. Los vehículos de
suministro de genes de la invención también incluyen vectores de
virus asociados a adenovirus (AAV). Ejemplos principales y
preferidos de dichos vectores para su uso en esta invención son los
vectores basados en AAV-2 descritos en el documento
Srivastava, WO 93/09239. Los vectores AAV más preferidos,
comprenden las dos repeticiones terminales invertidas de AAV en las
que las secuencias D naturales se modifican mediante sustitución de
nucleótidos, de modo que al menos 5 nucleótidos naturales y hasta
18 nucleótidos naturales, preferentemente al menos 10 nucleótidos
naturales y hasta 18 nucleótidos naturales, más preferentemente 10
nucleótidos naturales se conservan y el resto de nucleótidos de la
secuencia D se delecionan o se sustituyen con nucleótidos no
naturales. Las secuencias D naturales de las repeticiones
terminales invertidas de AAV son secuencias de 20 nucleótidos
consecutivos en cada repetición terminal invertida de AAV (es
decir, solamente existe una secuencia en cada extremo) que no están
implicadas en la formación de HP. El nucleótido de sustitución no
natural puede ser cualquier nucleótido diferente del nucleótido que
se encuentra en la secuencia D natural en la misma posición. Otros
vectores de AAV ejemplares que pueden emplearse son
pWP-19, pWN-1 ambos descritos en
Nahreini (1993) Gene 124: 257-262. Otro ejemplo de
dicho vector de AAV es psub201 (véase Samulski (1987) J. Virol. 61:
3096). Otro vector de AAV ejemplar es el vector IRT
Doble-D. La construcción del vector ITR Doble D se
describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.478.745. Otros
vectores más son los que se describen en la patente de Estados
Unidos Nº 4.797.368 de Carter y en la patente de Estados Unidos
5.139.941 de Muzyczka, en la patente de Estados Unidos 5.474.935 de
Chartejee y en el documento WO94/282157 de Kotin. Otro ejemplo
adicional de un vector de AAV que puede emplearse en esta invención
es SSV9AFABTKneo, que contiene el potenciador AFP y el promotor de
albúmina y dirige la expresión de forma predominante en el hígado.
Su estructura y su construcción se describen en el documento Su
(1996) Human Gene Therapy 7: 463-470. En los
documentos 5.354.678, US 5.173.414, US 5.139.941 y US 5.252.479 se
describen vectores de terapia génica de AAV adicionales.
Los vectores de terapia génica que comprenden
secuencias de la invención también incluyen vectores de herpes. Los
ejemplos principales y preferidos son vectores del virus herpes
simplex que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de
timidina quinasa tal como los descritos en los documentos US
5.288.641 y EP0176170 (Roizman). Vectores ejemplares de virus
herpes simplex adicionales incluyen HFEM/lCP6-LacZ
descrito en el documento WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac
descrito en el documento Geller (1988) Science 241:
1667-1669 y en el documento WO90/09441 y en
WO92/07945, HSV Us3::pgC-lacZ descrito en el
documento Fink (1992) Human Gene Therapy 3: 11-19 y
HSV 7134, 2 RH 105 y GAL4 descritos en el documento EP 0453242
(Breakefield), y los depositados en la ATCC con los número de
acceso ATCC VR-977 y ATCC
VR-260.
También se contemplan vectores de terapia génica
de virus alfa que pueden emplearse en esta invención. Los vectores
de virus alfa preferidos son los vectores de los virus Sindbis.
Togavirus, virus Semliki Forest (ATCC VR-67, ATCC
VR-1247), virus Middleberg (ATCC
VR-370), virus Ross River (ATCC
VR-373; ATCC VR-1246), virus de la
encefalitis equina venezolana (ATCC VR923; ATCC
VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC
VR-532), y los descritos en las patentes de Estados
Unidos 5.091.309, 5.217.879, y en el documento WO92/10578. Más
particularmente, pueden emplearse los vectores de virus alfa
descritos en el documento US Nº de serie 08/405.627, presentado el
15 de marzo de 1995, WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, US 5.091309
y US 5.217.879. Dichos virus alfa pueden obtenerse a partir de
depósitos o de colecciones tales como la ATCC de Rockville, Maryland
o aislarse a partir de fuentes conocidas usando técnicas
disponibles comúnmente. Preferentemente, se usan vectores de virus
alfa con toxicidad reducida (véase USSN 08/679640).
\newpage
Los sistemas de vectores de ADN tales como
sistemas de expresión en capas eucariotas también son útiles para
expresar los ácidos nucleicos de la invención. Véase el documento
WO95/07994 para una descripción detallada de los sistemas de
expresión en capas eucariotas. Preferentemente, los sistemas de
expresión en capas eucariotas de la invención se obtienen de
vectores de virus alfa y más preferentemente de vectores virales de
Sindbis.
Otros vectores virales adecuados para su uso en
la presente invención incluyen los obtenidos de poliovirus, por
ejemplo ATCC VR-58 y los que se describen en el
documento Evans, Nature 339 (1989) 385 y Sabin (1973) J. Biol.
Standardization 1: 115; rinovirus, por ejemplo ATCC
VR-1110 y los que se describen en el documento
Arnold (1990) J Cell Blochem L401; poxvirus tales como poxvirus de
canario o virus vaccinia, por ejemplo ATCC VR-111 y
ATCC VR-2010 y los que se describen en el documento
Fisher-Hoch (1989) Proc. Natl Acad Sci 86: 317;
Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569: 86, Flexner (1990) Vaccine 8:
17; en US 4.603.112 y US 4.769.330 y en el documento WO89/01973;
virus SV40, por ejemplo ATCC VR-305 y los que se
describen en los documentos Mulligan (1979) Nature 277: 108 y
Madzak (1992) J Gen Virol 73: 1533; virus de la gripe, por ejemplo
ATCC VR-797 y virus de la gripe recombinantes
preparados empleando técnicas genéticas inversas como se describe en
el documento US 5.166.057 y en Enami (1990) Proc Natl Acad Sci 87:
3802-3805; Enami y Palese (1991) J Virol 65:
2711-2713 y Luytjes (1989) Cell 59: 110, (véase
McMichael (1983) NEJ Med 309: 13, y Yap (1978) Nature 273: 238 y
Nature (1979) 277: 108); virus de la inmunodeficiencia humana como
se describe en el documento EP-0386882 y en
Buchschacher (1992) J. Virol. 66: 2731, virus del sarampión, por
ejemplo ATCC VR-67 y VR-1247 y los
que se describen en EP-0440219; virus Aura, por
ejemplo ATCC VR-368; virus Bebaru, por ejemplo ATCC
VR-600 y ATCC VR-1240; virus
Cabassou, por ejemplo ATCC VR-922; virus
Chikungunya, por ejemplo ATCC VR-64 y ATCC
VR-1241; virus Fort Morgan, por ejemplo ATCC
VR-924; virus Getah, por ejemplo ATCC
VR-369 y ATCC VR-1243; virus
Kyzylagach, por ejemplo ATCC VR-927; virus Mayaro,
por ejemplo ATCC VR-66; virus Mucambo, por ejemplo
ATCC VR-580 y ATCC VR-1244; virus
Ndumu, por ejemplo ATCC VR-371; virus Pixuna, por
ejemplo ATCC VR-372 y ATCC VR-1245;
virus Tonate, por ejemplo ATCC VR-925; virus
Triniti, por ejemplo ATCC VR-469; virus Una, por
ejemplo ATCC VR-374; virus Whataroa, por ejemplo
ATCC VR-926; virus
Y-62-33, por ejemplo ATCC
VR-375; virus O'Nyong, virus de la encefalitis
oriental, por ejemplo ATCC VR-65 y ATCC
VR-1242; virus de la encefalitis occidental, por
ejemplo ATCC VR-70, ATCC VR-1251,
ATCC VR-622 y ATCC VR-1252; y
coronavirus, por ejemplo ATCC VR-740 y los que se
describen en el documento Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121:
190.
El suministro de las composiciones de esta
invención a células no se limita a los vectores virales mencionados
anteriormente. Pueden emplearse otros procedimientos y medios de
suministro tales como, por ejemplo vectores de expresión de ácidos
nucleicos, ADN condensado policatiónico unido o sin unir a
adenovirus inactivados en solitario, por ejemplo US Nº de serie
08/366.787, presentada el 30 de diciembre de 1994 y Curiel (1992)
Hum Gene Ther 3: 147-154. ADN unido a ligando, por
ejemplo véase el documento Wu (1989) J Biol Chem 264:
16985-16987, células vehículo para el suministro de
células eucariotas, por ejemplo véase US Nº de serie 08/240.030,
presentada el 9 de mayo de 1994, y US Nº de serie 08/404.796,
depósito de materiales de hidrogel fotopolimerizado, pistolas de
partículas de transferencia génica de manejo manual, como se
describe en la patente de Estados Unidos 5.149.655, radiación
ionizante como se describe en los documentos US5.206.152 y
WO92/11033, neutralización de carga nucleica o fusión con membranas
celulares. Los enfoques adicionales se describen en el documento
Philip (1994) Mol Cell Biol 14: 2411-2418 y en
Woffendin (1994) Proc Natl Acad Sci 91:
1581-1585.
Puede emplearse transferencia génica mediada por
partículas, por ejemplo véase US Nº de serie 60/023.867. En
resumen, la secuencia puede insertarse en vectores convencionales
que contienen secuencias de control convencionales para un alto
nivel de expresión y después incubarse con moléculas de
transferencia génica sintética tales como cationes de unión a ADN
polimérico tales como polilisina, protamina, y albúmina, unidos a
ligandos dirigidos a células tales como asialoorosomucoide, como se
describe en el documento Wu & Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:
4429-4432, insulina como se describe en el documento
Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40: 253-263,
galactosa como se describe en el documento Pland (1992)
Bioconjugate Chem 3: 533-539, lactosa o
transferrina.
También puede emplearse ADN desnudo para
transformar una célula huésped. Los procedimientos de introducción
de ADN desnudo ejemplares se describen en el documento WO 90/11092 y
en US 5.580.859. La eficacia de la captación puede mejorarse usando
perlas de látex biodegradables. Las perlas de látex recubiertas de
ADN se transportan eficazmente a las células después del inicio de
la endocitosis por las perlas. El procedimiento puede mejorarse
adicionalmente mediante el tratamiento de las perlas para aumentar
la hidrofobicidad y facilitar de este modo la alteración del
endosoma y la liberación del ADN al citoplasma.
Los liposomas que pueden actuar como vehículos
de suministro de genes se describen en los documentos U.S.
5.422.120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 y
EP-524.968. Como se describe en el documento USSN.
60/023.867, sobre el suministro no viral, las secuencias de ácido
nucleico que codifican un polipéptido pueden insertarse en vectores
convencionales que contienen secuencias de control convencionales
para un alto nivel de expresión y después pueden incubarse con
moléculas de transferencia de genes sintéticas tales como cationes
de unión a ADN polimérico, tales como polilisina, protamina y
albúmina, unidos a ligandos que se dirigen a células tales como
asialoorosomucoide, insulina, galactosa, lactosa o transferrina.
Otros sistemas de suministro incluyen el uso de liposomas para
encapsular ADN que comprende el gen bajo el control de diversos
promotores específicos de tejido o activos de forma ubicua. Otros
suministros no virales adecuados para su uso incluyen sistemas de
suministro mecánico, tales como el enfoque descrito en el documento
Woffendin y col (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):
11581-11585. Además, la secuencia codificante y el
producto de la expresión de ésta puede suministrarse a través del
depósito de materiales de hidrogel fotopolimerizados. Otros
procedimientos convencionales para el suministro de genes que
pueden usarse para suministrar la secuencia codificante incluyen,
por ejemplo, el uso de una pistola de partículas de transferencia de
genes de uso manual, como se describe en el documento U.S.
5.149.655; el uso de radiación ionizante para activar un gen
transferido, como se describe en los documentos U.S. 5.206.152 y
WO92/11033.
Los vehículos ejemplares de suministro de genes
policatiónicos y de liposomas son los descritos en el documento US
5.422.120 y 4.762.915; en los documentos WO95/13796; WO94/23697 y
WO91/14445; en el documento EP-0524968; y en
Stryer, Biochemistry, páginas 236-240 (1975) W.H.
Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600: 1;
Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550: 464; Rivnay (1987) Meth
Enzymol 149: 119; Wang (1987) Proc Natl Acad Sci 84: 7851; Plant
(1989) Anal Biochem 176: 420.
Una composición de polinucleótidos puede
comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un vehículo de
terapia génica, como se ha definido la expresión anteriormente. Para
los fines de la presente invención, una dosis eficaz estará entre
aproximadamente 0,01 mg/kg y 50 mg/kg o entre 0,05 mg/kg y
aproximadamente 10 mg/kg de las construcciones de ADN en el
individuo al que se administran.
Una vez formuladas, las composiciones de
polinucleótidos de la invención pueden administrarse (1)
directamente al sujeto; (2) pueden suministrarse ex vivo, a
células obtenidas del sujeto, o (3) in vitro para la
expresión de proteínas recombinantes. Los sujetos a tratar pueden
ser mamíferos o aves. También pueden tratarse sujetos humanos.
El suministro directo de las composiciones se
conseguirá generalmente mediante inyección, por vía subcutánea,
intraperitoneal, intravenosa o intramuscular o se suministrarán en
el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también
pueden administrarse a un tumor o lesión. Otros modos de
administración incluyen administración oral y pulmonar,
supositorios y aplicaciones transdérmicas, agujas y pistolas génicas
o inyectores de tipo hypospray. El tratamiento de la dosificación
puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis
múltiples.
Los procedimientos para el suministro ex
vivo y la reimplantación de células transformadas en un sujeto
se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en el documento
WO93/14778. Los ejemplos de células útiles en aplicaciones ex
vivo incluyen, por ejemplo, células madres, particularmente
hematopoyéticas, células linfáticas, macrófagos, células
dendríticas o células tumorales.
Generalmente, el suministro de ácidos nucleicos
para aplicaciones ex vivo e in vitro puede realizarse
mediante los siguientes procedimientos, por ejemplo, transfección
mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio,
transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos,
electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas
y microinyección directa de ADN en los núcleos, como se conoce en la
técnica.
Además de los vehículos y sales
farmacéuticamente aceptables descritos anteriormente, pueden usarse
los siguientes agentes adicionales con composiciones de
polinucleótidos y/o polipéptidos.
Un ejemplo son polipéptidos que incluyen, sin
limitación: asioloorosomucoide (ASOR); transferrina;
asialoglicoproteínas; anticuerpos; fragmentos de anticuerpo;
ferritina; interleucinas; interferones, factor estimulador de las
colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF),
factor estimulador de las colonias de granulocitos
(G-CSF), factor estimulador de colonias de
macrofagos (M-CSF), factor de células madre y
eritropoyetina. También pueden usarse antígenos virales, tales como
proteínas de la envuelta. También, proteínas de otros organismos
invasores, tales como el péptido de 17 aminoácidos de la proteína
del circumsporozoito de plasmodium falciparum conocida como
RII.
Otros grupos que pueden incluirse son, por
ejemplo: hormonas, esteroides, andrógenos, estrógenos, hormona
tiroidea o vitaminas, ácido fólico.
También puede incluirse polialquilenglicol con
los polinucleótidos o polipéptidos deseados. En una realización
preferida, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Además, pueden
incluirse mono-, di- o polisacáridos. En una realización preferida
de este aspecto, el polisacárido es dextrano o
DEAE-dextrano. También, quitosano y
poli(lacturo-co-glicólido).
El polinucleótido o polipéptido deseado también
puede encapsularse en lípidos o envasarse en liposomas antes del
suministro al sujeto o a células obtenidas del mismo.
La encapsulación en lípidos se realiza
generalmente usando liposomas que son capaces de unirse o atrapar de
forma estable y conservar el ácido nucleico. La proporción de
polinucleótido o polipéptido condensado para la preparación de
lípidos puede variar pero generalmente será de aproximadamente 1:1
(mg de ADN:micromoles de lípido) o más de lípido. Para una revisión
del uso de liposomas como vehículos para el suministro de ácidos
nucleicos, véase el docu-
mento Hug y Sleight (1991) Biochim, Biophys. Acta 1097: 1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101: 512-527.
mento Hug y Sleight (1991) Biochim, Biophys. Acta 1097: 1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101: 512-527.
Las preparaciones de liposomas para su uso en la
presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas
positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras. Los
liposomas catiónicos han demostrado mediar en el suministro
intracelular de ADN de plásmidos (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84: 7413-7416); ARNm (Malone (1989) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86: 6077-6081); y factores de
transcripción purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:
10189-10192), de forma funcional.
Los liposomas catiónicos están fácilmente
disponibles. Por ejemplo están disponibles liposomas de
N[1-2-3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio
(DOTMA) con la marca comercial Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand
Island, NY. (Véase también Felgner anteriormente). Otros liposomas
disponibles en el mercado incluyen transfectace (DDAB/DOPE) y
DOTA/DOPE (Boerhinger). Otros liposomas catiónicos pueden
prepararse a partir de materiales fácilmente disponibles usando
técnicas bien conocidas en la técnica. Véase por ejemplo los
documentos Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:
4194-4198; WO90/11092 para una descripción de la
síntesis de liposomas de DOTAP
(1,2-bis(oleiloxi)-3-(trimetilamonio)propano).
Análogamente, los liposomas aniónicos y neutros
están fácilmente disponibles, tales como de Avanti Polar Lipids
(Birmingham, AL) o pueden prepararse fácilmente usando materiales
fácilmente disponibles. Dichos materiales incluyen
fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina,
dioleilfosfatidilcolina (DOPC), dioleilfosfatidilglicerol (DOPG),
dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales
también pueden mezclarse con los materiales de partida DOTMA y
DOTAP en proporciones apropiadas. Los procedimientos para preparar
liposomas usando estos materiales se conocen bien en la
técnica.
Los liposomas pueden comprender vesículas
multilaminares (MLV), pequeñas vesículas unilamelares (SUV) o
grandes vesículas unilaminares (LUV). Los diversos complejos de
liposoma-ácido nucleico se preparan usando procedimientos conocidos
en la técnica. Véanse por ejemplo los documentos Straubinger (1983)
Meth. Immunol. 101: 512-527; Szoka (1978) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194-4198; Papahadjopoulos
(1975) Biochim. Biophys. Acta 394: 483; Wilson (1979) Cell 17: 77);
Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443: 629; Ostro
(1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76: 836; Fraley (1979) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348); Enoch & Stritmatter (1979)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 145; Fraley (1980) J. Biol. Chem.
(1980) 255: 10431; Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 75: 145; y Schaefer-Ridder (1982)
Science 215: 166.
Además, pueden incluirse lipoproteínas con el
polinucleótido o polipéptido a suministrar. Los ejemplos de
lipoproteínas a utilizar incluyen: quilomicrones, HDL, IDL, LDL y
VLDL. También pueden usarse mutantes, fragmentos o fusiones de
estas proteínas. También pueden usarse modificaciones de
lipoproteínas de origen natural, tales como LDL acetilada. Estas
lipoproteínas pueden dirigir el suministro de polinucleótidos a
células que expresan receptores de lipoproteínas. Preferentemente,
si se incluyen lipoproteínas con el polinucleótido a suministrar,
no se incluye ningún otro ligando de dirección en la
composición.
Las lipoproteínas de origen natural comprenden
un lípido y una porción proteica. La porción proteica se conoce
como apoproteína. Actualmente, se han aislado e identificado las
apoproteínas A, B, C, D y E. Al menos dos de éstas contienen varias
proteínas, denominadas mediante números romanos AI, AII, AIV; CI,
CII, CIII.
La lipoproteína A puede comprender más de una
apoproteína. Por ejemplo, los quilomicrones de origen natural están
constituidos por A, B, C y E, a lo largo del tiempo estas
lipoproteínas pierden A y adquieren apoproteínas C y E. VLDL
comprende A, B, C y E, LDL comprende la apoproteína B y HDL
comprende las apoproteínas A, C y E.
Los aminoácidos de estas apoproteínas se conocen
y se describen por ejemplo en los documentos Breslow (1985) Annu
Rev. Biochem 54: 699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151: 162; Chen
(1986) J Biol Chem 261: 12918; Kane (1980) Proc Natl Acad Sci USA
77: 2465; y Utermann (1984) Hum Genet 65: 232.
Las lipoproteínas contienen diversos lípidos
incluyendo triglicéridos, colesterol (libre y en forma de ésteres)
y fosfolípidos. La composición de los lípidos varía en las proteínas
de origen natural. Por ejemplo, los quilomicrones comprenden
principalmente triglicéridos. Una descripción más detallada del
contenido de lípidos de las lipoproteínas de origen natural puede
encontrarse por ejemplo, en el documento Meth. Enzymol. 128 (1986).
La composición de los lípidos se selecciona para que ayuden a la
conformación de la apoproteína para la actividad de unión al
receptor. La composición de lípidos también puede seleccionarse para
facilitar la interacción hidrófoba y la asociación con la molécula
de unión al polinucleótido.
Las lipoproteínas de origen natural pueden
aislarse a partir del suero mediante ultracentrifugado, por ejemplo.
Dichos procedimientos se describen en los documentos Meth
Enzymol (anteriormente); Pitas (1980) J. Biochem. 255:
5454-5460 y Mahey (1979) J Clin. Invest 64:
743-750.
Las lipoproteínas también pueden producirse
mediante procedimientos in vitro o recombinantes mediante la
expresión de los genes de la apoproteína en una célula huésped
deseada. Véase por ejemplo, el documento Atkinson (1986) Annu Rev
Biophys Chem 15: 403 y Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30:
443.
Las lipoproteínas también pueden adquirirse de
proveedores comerciales, tales como Biomedical Technologies, Inc.,
Stoughton, Massachusetts, USA.
Una descripción adicional de las lipoproteínas
puede encontrarse en el documento Zuckermann y col., aplicación PCT
Nº US97/14465.
Los agentes policatiónicos pueden incluirse, con
o sin lipoproteína, en una composición con el polinucleótido o
polipéptido a administrar deseado.
Los agentes policatiónicos, muestran normalmente
una carga neta positiva a un pH pertinente fisiológico y son
capaces de neutralizar la carga eléctrica de ácidos nucleicos para
facilitar el suministro a una ubicación deseada. Estos agentes
tienen aplicaciones in vitro, ex vivo e in vivo. Los
agentes policatiónicos pueden usarse para suministrar ácidos
nucleicos a un sujeto vivo por vía intramuscular, por vía
subcutánea, etc.
Los siguientes son ejemplos de polipéptidos
útiles como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina,
poliornitina, y protamina. Otros ejemplos incluyen histonas,
protaminas, albúmina de suero humano, proteínas de unión al ADN,
proteínas cromosómicas no histona, proteínas de la envuelta a partir
de virus de ADN tales como (X174, los factores transcripcionales
también contienen dominios que se unen al ADN y por lo tanto pueden
ser útiles como agentes de condensación de ácidos nucleicos. En
resumen, los factores transcripcionales tales como C/CEBP,
c-jun, c-fos, AP-1,
AP-2, AP-3, CPF,
Prot-1, Sp-1, Oct-1,
Oct-2, CREP y TFIID contienen dominios básicos que
se unen a secuencias de ADN.
Los agentes policatiónicos orgánicos incluyen:
espermina, espermidina y putrescina.
Las dimensiones y las propiedades físicas de un
agente policatiónico pueden extrapolarse a partir de la lista
anterior para construir otros agentes policatiónicos de
polipéptidos, para producir agentes policatiónicos sintéticos.
Los agentes policatiónicos sintéticos que son
útiles incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano,
polibreno, lipofectin®, y lipofectAMINE® que son monómeros que
forman complejos policatiónicos cuando se combinan con
polinucleótidos o polipéptidos.
Los antígenos de Neisseria de la invención
pueden usarse en inmunoensayos para detectar niveles de anticuerpo
(o, por el contrario, pueden usarse anticuerpos anti Neisseria para
detectar niveles de antígeno). Los inmunoensayos basados en
antígenos recombinantes bien definidos pueden desarrollarse para
sustituir procedimientos de diagnóstico invasivos. Los anticuerpos
para proteínas de Neisseria con muestras biológicas, incluyen, por
ejemplo, muestras de sangre o de suero donde pueden detectarse. El
diseño de los inmunoensayos está sometido a una gran cantidad de
variación y se conocen diversos inmunoensayos en la técnica. Los
protocolos para el inmunoensayo pueden basarse, por ejemplo, en
competición, reacción directa, o en ensayos de tipo sándwich. Los
protocolos también pueden usar, por ejemplo, soportes sólidos o
pueden realizarse mediante inmunoprecipitación. La mayoría de los
ensayos implican el uso de un anticuerpo o polipéptido marcado. Las
marcas pueden ser, por ejemplo, fluorescentes, quimioluminiscentes,
radioactivas o moléculas de tinte. Los ensayos que amplifican las
señales a partir de la sonda también se conocen. Los ejemplos de
estos son ensayos que utilizan biotina y avidina e inmunoensayos
marcados con enzimas, tales como ensayos ELISA.
Se construyen kits adecuados para
inmunodiagnóstico y que contienen los reactivos marcados apropiados
envasando los materiales apropiados, incluyendo las composiciones
de la invención, en recipientes adecuados, junto con los reactivos
y materiales restantes (por ejemplo, tampones adecuados, soluciones
salinas, etc.) necesarios para la realización del ensayo, así como
un conjunto adecuado de instrucciones para el ensayo.
"Hibridación", se refiere a la asociación
de dos secuencias de ácidos nucleicos entre sí mediante puentes de
hidrógeno. Normalmente, una secuencia se fijará un soporte sólido y
la otra estará libre en solución. Después, las dos secuencias se
pondrán en contacto entre sí en condiciones que favorecen la
formación de puentes de hidrógeno. Los factores que afectan a esta
formación de puentes incluyen: el tipo y el volumen del disolvente,
la temperatura de la reacción; el tiempo de hibridación; la
agitación; agentes para bloquear la unión no específica de la
secuencia de fase líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o
BLOTTO); concentración de las secuencias; uso de compuestos para
aumentar el índice de asociación de la secuencia (sulfato de
dextrano o polietilenglicol); y la rigurosidad de las condiciones
de lavado después de la hibridación; véase el documento Sambrook y
col. [anteriormente] Volumen 2, capítulo 9, páginas 9.47 a
9.57.
"Rigurosidad" se refiere a condiciones en
una reacción de hibridación que favorecen la asociación de
secuencias muy similares por encima de la de secuencias que son
diferentes. Por ejemplo, la combinación de temperatura y
concentración de sales debe seleccionarse de modo que esté
aproximadamente 120 a 200º C por debajo de la Tm calculada para el
híbrido estudiado. La temperatura y las condiciones de las sales
pueden determinarse a menudo de forma empírica en experimentos
previos en los que muestras del ADN genómico inmovilizadas en
filtros se hibridan con la secuencia de interés y después se lavan
en condiciones de diferentes rigurosidades. Véase el documento
Sambrook y col. en la página 9.50.
Las variables a considerar cuando se realiza,
por ejemplo, una inmunotransferencia de Southern son (1) la
complejidad del ADN que se inmunotransfiere y (2) la homología entre
la sonda y las secuencias detectadas. La cantidad total de los
fragmentos a estudiar puede variar en una magnitud de 10, entre 0,1
y 10 \mug para un plásmido o fago digerido a 10^{-9} y
10^{-8} g a partir de una única copia del gen en un genoma
eucariota muy complejo. Para polinucleótidos de menor complejidad,
pueden usarse tiempos de inmunotransferencia, de hibridación y de
exposición sustancialmente más cortos, una menor cantidad de
polinucleótidos de partida y una actividad específica menor de las
sondas. Por ejemplo, un gen de levadura, de copia única puede
detectarse con un tiempo de exposición de solamente una hora
empezando con 1 \mug de ADN de levadura, inmunotransfiriendo
durante dos horas e hibridando durante 4-8 horas con
una sonda de 10^{8} cpm/\mug. Para un gen de mamífero de copia
única, un enfoque conservativo debería comenzar con 10 \mug de
ADN, inmunotransferencia durante toda la noche e hibridación
durante toda la noche en presencia de sulfato de dextrano a 10%
usando una sonda de más de 10^{8} cpm/\mug, dando como
resultado un tiempo de exposición de aproximadamente 24 horas.
Varios factores pueden afectar a la temperatura
de fusión (Tm) de un híbrido de ADN-ADN entre la
sonda y el fragmento de interés y como consecuencia, las
condiciones apropiadas para la hibridación y el lavado. En muchos
casos la sonda no es homologa al 100% con el fragmento. Otras
variables que se encuentran comúnmente incluyen la longitud y el
contenido de G+C total de las secuencias de hibridación y la fuerza
iónica y el contenido de formamida del tampón de hibridación. Los
efectos de estos factores pueden relacionarse aproximadamente
mediante una única ecuación:
Tm = 81 +
16,6(log_{10}Ci) + 0,4[%(G + C)]-0,6(% de
formamida) - 600/n-1,5(% de emparejamiento
erróneo).
donde Ci es la concentración de
sales (iones monovalentes) y n es la longitud del híbrido en pares
de bases (modificada ligeramente de Meinkoth & Wahi (1984)
Anal. Biochem. 138:
267-284).
En el diseño de un experimento de hibridación,
pueden alterarse convenientemente algunos factores que afectan a la
hibridación del ácido nucleico. La temperatura de la hibridación y
de los lavados y la concentración de sales durante el lavado son
las variables más sencillas de ajustar. A medida que la temperatura
de la hibridación aumenta (es decir, aumenta la rigurosidad), es
menos probable que ocurra la hibridación entre cadenas que no son
homólogas y como resultado, el fondo disminuye. Si la sonda
radiomarcada no es completamente homóloga con el fragmento
inmovilizado (como es frecuentemente el caso en familias de genes y
en experimentos de hibridación interespecíficos), debe reducirse la
temperatura de hibridación y el fondo aumentará. La temperatura de
los lavados afecta a la intensidad de la banda de hibridación y al
grado de fondo de forma similar. La rigurosidad de los lavados
también aumenta disminuyendo la concentración de sales.
En general, las temperaturas de hibridación
adecuadas en presencia de formamida a 50% son 42ºC para una sonda
que es de 95 a 100% homóloga con el fragmento diana, 37ºC para 90% a
95% de homología y 32ºC para 85 a 90% de homología. Para homologías
inferiores, debe rebajarse el contenido de formamida y la
temperatura debe ajustarse adecuadamente, usando la ecuación
anterior. Si la homología entre la sonda y el fragmento diana no se
conoce, el enfoque más sencillo es comenzar con condiciones de
hibridación y de lavado que no sean rigurosas. Si se observan
bandas no específicas o un alto fondo después de la
autorradiografía, el filtro puede lavarse con rigurosidad alta y
volverse a exponer. Si el tiempo necesario para la exposición hace
que este enfoque sea poco práctico, deben ensayarse en paralelo
varias rigurosidades de hibridación y/o de lavado.
Procedimientos tales como PCR, ensayos de sonda
de ADN ramificado, o técnicas de inmunotransferencia utilizando
sondas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden
determinar la presencia de ADNc o ARNm. Se dice que una sonda
"hibrida" con una secuencia de la invención si puede formar un
dúplex o un complejo de doble cadena, que sea lo suficientemente
estable para detectarse.
Las sondas de ácido nucleico hibridarán con las
secuencias de nucleótidos de Neisseria de la invención (incluyendo
cadena sentido y antisentido). Aunque muchas secuencias de
nucleótidos diferentes codificarán las secuencias de aminoácidos,
se prefiere la secuencia de Neisseria natural ya que es la verdadera
secuencia presente en las células. El ARNm representa una secuencia
codificante y de este modo una sonda debe ser complementaria con la
secuencia codificante. El ADNc de cadena sencilla es complementario
al ARNm, y por tanto una sonda de ADNc debe ser complementaria con
la secuencia no codificante.
No es necesario que la secuencia de la sonda sea
idéntica a la secuencia de Neisseria (o que lo sea completamente),
algunas variaciones en la secuencia y en la longitud pueden conducir
a una sensibilidad del ensayo aumentada si la sonda del ácido
nucleico puede formar un dúplex con nucleótidos diana, que puede ser
detectado. Además, la sonda de ácido nucleico puede incluir
nucleótidos adicionales para estabilizar el dúplex formado. Una
secuencia de Neisseria adicional también puede ser útil como marca
para detectar el dúplex formado. Por ejemplo, puede unirse una
secuencia de nucleótidos no complementaria en el extremo 5' de la
sonda, siendo el resto de la sonda complementario a la secuencia de
Neisseria. Como alternatural, pueden introducirse en la sonda bases
no complementarias o secuencias más largas, siempre que la secuencia
de la sonda tenga la suficiente complementariedad con la secuencia
de Neisseria para hibridar con ella y formar de este modo un dúplex
que pueda detectarse.
La longitud y secuencia exacta de la sonda
dependerán de las condiciones de hibridación, tales como
temperatura, condiciones salinas y similares. Por ejemplo, para
aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la
secuencia del analito, la sonda de ácido nucleico contiene
normalmente al menos 10-20 nucleótidos,
preferentemente 15-25 y más preferentemente al
menos 30 nucleótidos, aunque puede ser más corta. Los cebadores
cortos requieren generalmente temperaturas más bajas para formar
complejos híbridos suficientemente estables con la plantilla.
Pueden producirse sondas mediante procedimientos
sintéticos, tales como el procedimiento del triéster de Matteucci y
col. [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103: 3185], o de acuerdo con Urdea y
col. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 7461] o usando
sintetizadores automatizados de oligonucleótidos disponibles en el
mercado.
La naturaleza química de la sonda puede
seleccionarse de acuerdo con las preferencias. Para algunas
aplicaciones, son apropiados ADN o ARN. Para otras aplicaciones,
pueden incorporarse modificaciones por ejemplo, modificaciones en
la estructura, tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, que
pueden usarse para aumentar la semivida in vivo, alterar la
afinidad por ARN, aumentar la resistencia a nucleasa, etc. [por
ejemplo véase el documento Agrawal & Iyer (1995) Curr Opin
Biotenchnol 6: 12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:
376-387]; también pueden usarse análogos tales como
ácidos péptidonucleicos [por ejemplo véase el documento Corey (1997)
TIBIECH 15: 224-229, Buchardt y col. (1993) TIBTECH
11: 384-386].
Un ejemplo de un ensayo de hibridación de
nucleótidos se describe por Urdea y col en la solicitud de patente
internacional WO92/02526 [véase también patente de Estados Unidos
5.124.246].
Como alternatural, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es otro procedimiento bien conocido para detectar
pequeñas cantidades de ácido nucleico diana. El ensayo se describe
en el documento: Mullis y col [Meth. Enzymol. (1987) 155:
335-350]; patente de Estados Unidos 4.683.195; y
patente de Estados Unidos 4.683.202. Dos nucleótidos
"cebadores" hibridan con los ácidos nucleicos diana y se usan
para iniciar la reacción. Los cebadores pueden comprende una
secuencia que no hibrida con la secuencia de la diana de
amplificación (o con su complemento) para ayudar a la estabilidad
del dúplex o, por ejemplo, para incorporar un sitio de restricción
adecuado. Normalmente, dicha secuencia flanqueará a la secuencia de
Neisseria deseada.
Una polimerasa termoestable crea copias de
ácidos nucleico diana a partir de los cebadores usando los ácidos
nucleicos diana como plantilla. Después de que se haya generado una
cantidad umbral de ácidos nucleicos diana mediante la polimerasa,
pueden detectarse mediante procedimientos más convencionales, tales
como inmunotransferencias de Southern. Cuando se usa el
procedimiento de inmunotransferencia de Southern, la sonda marcada
hibridará con la secuencia de Neisseria (o con su complemento).
También pueden detectarse ARNm o ADNc mediante
técnicas de inmunotransferencia tradicionales, descritas en el
documento Sambrook y col [anteriormente]. El ARNm o el ADNc generado
a partir de ARNm usando una enzima polimerasa, pueden purificarse y
separarse usando electroforesis en gel. Los ácidos nucleicos en el
gel se inmunotransfieren después a un soporte sólido, tal como
nitrocelulosa. El soporte sólido se expone a una sonda marcada y
después se lava para eliminar la sonda sin hibridar. A continuación,
se detectan los dúplex que contienen la sonda marcada. Normalmente,
la sonda se marca con un resto radioactivo.
Los ejemplos describen secuencias de ácidos
nucleicos que se han identificado en N. meningitidis, y N.
gono- rrhoeae junto con sus supuestos y respectivos
productos de traducción. Los ejemplos incluyen:
- \bullet
- una secuencia de nucleótidos que se ha identificado en N. meningitidis.
- \bullet
- el supuesto producto de traducción de dicha secuencia de N. meningitidis.
- \bullet
- una secuencia de nucleótidos correspondiente identificada en N. gonorrhoeae.
- \bullet
- el supuesto producto de traducción de dicha secuencia de N. gonorrhoeae.
- \bullet
- una comparación del porcentaje de identidad entre el producto de traducción de la secuencia de N. meningitidis y el de la secuencia de N. gonorrhoeae.
Las comparaciones de secuencia se realizaron en
NCBI (http://www.ncbi.nim.nih.gov) usando los algoritmos BLAST,
BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx, y tBLASTx [por ejemplo
véase el documento Altschul y col. (1997) Gapped BLAST y
PSI-BLAST: a new generation or protein database
search programs. Nucleic Acids Research 25:
2289-3402]. Las búsquedas se realizaron en las
siguientes bases de datos: secuencias no redundantes
GenBank+EMBL+DDBJ+PDB y secuencias no redundantes y GenBank CDS
translations+PBD+SwissProt+SPPupdate
+PIR.
+PIR.
Las letras minúsculas representan ambigüedades
que surgen durante el alineamiento de reacciones de secuenciación
independiente (algunas de las secuencias de nucleótidos en los
ejemplos se obtienen a partir de la combinación de los resultados
de dos o más experimentos).
Las secuencias de nucleótidos se exploraron en
los seis marcos de lectura para predecir la presencia de dominios
hidrófobos usando un algoritmo basado en los estudios estadísticos
de Esposti y col. [Critical evaluation of the hydropathy of
membrane proteins (1990) Eur J Biochem 190:
207-219]. Estos dominios representan potenciales
regiones transmembrana o secuencias líderes hidrófobas.
Los marcos de lectura abierta se predijeron a
partir de secuencias de nucleótidos fragmentadas usando el programa
ORFFINDER (NCBI).
Las secuencias de aminoácidos subrayadas indican
posibles dominios transmembrana o secuencias líderes en los ORF, de
acuerdo con lo predicho con el algoritmo PSORT
(http://www.psort.nibb.ac.jp). Los dominios funcionales también se
predijeron usando el programa MOTIFS (GCG Wisconsin &
PROSITE).
En base a la presencia de una supuesta secuencia
líder y/o varios supuestos dominios transmembrana (subrayados con
una única línea) en la proteína de gonococos, se predice que las
proteínas de N. meningitidis y N. gonorrhoeae y sus
respectivos epítopos podrían ser antígenos útiles o composiciones
inmunogénicas para vacunas o diagnósticos.
Las técnicas y procedimientos convencionales que
pueden emplearse para realizar la invención (por ejemplo, para
utilizar las secuencias descritas para vacunación o diagnóstico) se
han resumido anteriormente. Este resumen no es una limitación de la
invención, sino que proporciona ejemplos que pueden usarse, pero que
no son necesarios.
En particular, se usaron los siguientes
procedimientos para expresar, purificar y caracterizar
bioquímicamente a las proteínas de la invención.
Se cultivó la cepa 2996 de N.
meningitidis hasta una fase exponencial en 100 ml de medio GC,
se recogió mediante centrifugado y se resuspendió en 5 ml de tampón
(sacarosa a 20%, Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM,
ajustado a pH 8,0). Después de 10 minutos de incubación en hielo,
las bacterias se lisaron añadiendo 10 ml de solución de lisis (NaCl
50 mM, Na-Sarkosyl a 1%, 50 mg/ml de proteinasa K) y
la suspensión se incubó a 37ºC durante 2 horas. Se realizaron 2
extracciones de fenol (equilibrado a pH 8) y una extracción con
ChCl_{3}/alcohol isoamílico (24:1). El ADN se precipitó mediante
la adición de acetato sódico 0,3 M y 2 volúmenes de etanol y se
recogió mediante centrifugado. El sedimento se lavó una vez con
etanol a 70% y se redisolvió en 4 ml de tampón
(Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). La concentración
de ADN se midió leyendo la DO a 260 nm.
Se diseñaron cebadores de oligonucleótidos
sintéticos en base a la secuencia codificante de cada ORF, usando
(a) la secuencia de meningococos B cuando estaba disponible o (b) la
secuencia de gonococos/meningococos A adaptada para el uso
preferente del codón de los meningococos. Se omitieron los péptidos
señal predichos, sustrayendo la secuencia cebador de amplificador
del extremo 5' inmediatamente cadena abajo a partir de la secuencia
líder predicha.
Para la mayoría de los ORF, los cebadores 5'
incluían 2 sitios de reconocimiento de enzimas de restricción
(BamHI-NdeI, BamHI-NheI, o
EcoRI-NheI, dependiendo del patrón de restricción del
gen); los cebadores 3' incluyeron un sitio de restricción
XhoI. Se estableció este procedimiento para dirigir la
clonación de cada producto de amplificación (correspondiente a cada
ORF) en dos sistemas de expresión diferentes:
pGEX-KG (usando BamHI-XhoI o
EcoRI-XhoI), y pET21 b+ (usando
NdeI-XhoI o NheI-Xhol).
Para algunos ORF se realizaron dos
amplificaciones diferentes para clonar cada ORF en los dos sistemas
de expresión. Se usaron dos cebadores 5' para cada ORF; se usó el
mismo cebador XhoI 3' que anteriormente:
Otros ORF pueden clonarse en el vector de
expresión pTRC y expresarse como una fusión His-tag
amino-terminal. El péptido señal predicho puede
incluirse en el producto final. Se incorporaron sitios de
restricción NheI-BamHI usando cebadores:
Además de contener las secuencias de
reconocimiento de enzimas de restricción, los cebadores incluían
nucleótidos que hibridaban con la secuencias a amplificar. El
número de nucleótidos que hibridaban dependía de la temperatura de
fusión de todo el cebador, y se determinaba para cada cebador usando
las formulas:
La temperatura media de fusión de los
oligonucleótidos seleccionados era de 65-70ºC para
el oligonucleótido completo y de 50-55ºC para la
región de hibridación en solitario.
Los oligonucleótidos se sintetizaron mediante un
sintetizador Perkin Elmer 394 DNA/RNA Synthesizer, se eluyeron de
las columnas en 2 ml de NH_{4}-OH, y se
desprotegieron mediante 5 horas de incubación a 56ºC. Los
oligonucleótidos precipitaron mediante adición de acetato de sodio
0,3 M y 2 volúmenes de etanol. Después se centrifugaron las
muestras y los sedimentos se resuspendieron en 100 \mul o un 1 ml
de agua. Se determinó la DO_{260} usando un espectrofotómetro
Perkin Elmer Lambda Bio y la concentración se determinó y se ajustó
a 2-10 pmol/\mul.
Cuando se realizaron las amplificaciones
iniciales, no podía conocerse la secuencia completa 5' y/o 3' para
algunos ORF de meningococos, aunque se habían identificado las
secuencias correspondientes en gonococos. Para la amplificación,
pudieron usarse por lo tanto las secuencias de gonococos como base
para el primer diseño, alteradas para tener en cuenta la
preferencia de codones. En particular, pueden cambiarse los
siguientes codones: ATA \rightarrow ATT; TCG \rightarrow TCT;
CAG \rightarrow CAA; AAG \rightarrow AAA; GAG \rightarrow
GAA; CGA y CGG \rightarrow CGC; GGG \rightarrow GGC.
El protocolo de PCR convencional era de la
siguiente manera: se usaron 50-200 ng de ADN
genómico como plantilla en presencia de 20-40
\muM de cada oligonucleótido, una solución de dNTP
400-800 \muM, 1 volumen de tampón de PCR
(incluyendo MgCl_{2} 1,5 mM), 2,5 unidades de Taql ADN polimerasa
(usando Perkin Elmer AmpliTaQ, GIBCO Platinum, Pwo DNA polymerase,
or Tahara Shuzo Taq polymerase).
En algunos casos, la PCR se optimizaba mediante
la adición de 10 \mul de DMSO o 50 \mul de betaína 2 M.
Después de un inicio con calor (añadiendo la
polimerasa durante una incubación preliminar de 3 minutos de la
mezcla completa a 95ºC), cada muestra experimentó una amplificación
de dos etapas: los 5 primeros ciclos se realizaron usando como
temperatura de hibridación uno de los oligonucleótidos excluyendo
las colas de las enzimas de restricción, seguido de 30 ciclos
realizados de acuerdo con la temperatura de hibridación de los
oligonucleótidos de longitud completa. Los ciclos venían seguidos de
una etapa de extensión de 10 minutos a 72ºC.
Los ciclos convencionales fueron de la siguiente
manera:
El tiempo de elongación varió de acuerdo con la
longitud del ORF a amplificar.
Las amplificaciones se realizaron usando un
sistema 9600 o 2400 Perkin Elmer GeneAmp PCR. Para comprobar los
resultados, se introdujo 1/10 del volumen de amplificación en un gel
de agarosa a 1-1,5% y se comparó el tamaño de cada
fragmento amplificado con un marcador de peso molecular de ADN.
El ADN amplificado se introdujo directamente en
un gel de agarosa al 1% o se precipitó en primer lugar con etanol y
se resuspendió en un volumen adecuado para introducirlo en un gel de
agarosa a 1%. El fragmento de ADN correspondiente a la banda de
tamaño correcto se eluyó después y se purificó a partir del gel,
usando el kit Qiagen Gel Extraction Kit, siguiendo las
instrucciones del fabricante. El volumen final del fragmento de ADN
era de 30 \mul o 50 \mul de agua o Tris 10 mM, pH 8,5.
El ADN purificado correspondiente al fragmento
amplificado se dividió en dos alícuotas y se digirió por partida
doble con: (a) NdeI/XhoI o NheI/XhoI
para clonarlo en pET-21 b+ y para la expresión
adicional de la proteína como una fusión His-Tag
C-terminal; (b) BamHI/XhoI o
EcoRI/XhoI para clonarlo en pGEX-KG y
la expresión adicional de la proteína como una fusión del extremo N
de GST.
Para algunos ORF, puede colocarse
NheI/BamHI para clonación en un vector
pTRC-HisA y expresión adicional de la proteína como
una fusión His-tag N Terminal.
Cada fragmento de ADN purificado se incubó (37ºC
durante de 3 horas a una noche) con 20 unidades de cada enzima de
restricción (New England Biolabs) en un volumen final de 30 ó 40
\mul en presencia del tampón apropiado. El producto de digestión
se purificó después usado el kit de purificación QIAguick PCR,
siguiendo las instrucciones del fabricante y se eluyó en un volumen
final de 30 (o 50) \mul de agua o Tris-HCl 10 mM,
pH 8,5. La concentración final de ADN se determinó mediante
electroforesis en gel de agarosa a 1% en presencia del marcador de
peso molecular titulado.
Se digirieron por partida doble 10 \mug de
plásmido con 50 unidades de cada enzima de restricción en 200
\mul de volumen de reacción en presencia del tampón apropiado
mediante incubación durante toda la noche a 37ºC. Después de
introducir toda la digestión en un gel de agarosa a 1%, se purificó
la banda correspondiente al vector digerido a partir del gel usando
el kit Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit y el ADN se eluyó en 50
\mul de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. La concentración
de ADN se evaluó midiendo la DO_{260} de la muestra y se ajusto a
50 g/ml. Se usó 1 \mul de plásmido para cada procedimiento de
clonación.
Los fragmentos correspondientes a cada ORF,
digeridos previamente y purificados, se ligaron en pET22b y
pGEX-KG. En un volumen final de 20 \mul, una
proporción molar de 3:1 fragmento/vector se ligó usando 0,5 \mul
de T4 ADN ligasa NEB (400 unidades/\mul), en presencia del tampón
suministrado por el fabricante. La reacción se incubó a temperatura
ambiente durante 3 horas. En algunos experimentos, el ligamiento se
realizó usando el kit "Rapid Ligation Kit" de Boheringer,
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para introducir el plásmido recombinante en una
cepa adecuada, se incubaron 100 \mul de células competentes DH5
de E. coli con la solución de reacción de la ligasa durante
40 minutos en hielo, después a 37ºC durante 3 minutos y después,
tras añadir 800 \mul de caldo LB, de nuevo a 37ºC durante 20
minutos. Después se centrifugaron las células a una velocidad
máxima en una microcentrífuga Eppendorf y se resuspendieron a
aproximadamente 200 \mul del sobrenadante. Después se colocó en
placas la suspensión en ampicilina LB (100 mg/ml).
La selección de los clones recombinantes se
realizó cultivando 5 colonias seleccionadas al azar durante toda la
noche a 37ºC en 2 ml (clones pGEX o pTC) o 5 ml (clones pET) en
caldo LB + 100 \mug/ml de ampicilina. Después las células se
sedimentaron y el ADN se extrajo usando el kit Qiagen QIAprep Spin
Miniprep Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante, hasta un
volumen final de 30 \mul, se digirieron 5 \mul de cada
minipreparación individual (aproximadamente 1 g) con
NdeI/XhoI o BamHI/XhoI y toda la
digestión se introdujo en un gel de agarosa a
1-1,5% (dependiendo del tamaño esperado para el
inserto), en paralelo con el marcador de peso molecular (ADN Ladder
de 1 kb, GIBCO). La selección de los clones positivos se realizó de
acuerdo con el tamaño correcto del inserto.
Algunos ORF pueden clonarse en el vector
pGEX-HIS usando sitios de clonación
EcoRI-PstI, o EcoRI-SalI o
SalI-PstI. Después de la clonación, los plásmidos
recombinantes pueden introducirse en el huésped W3110 de E.
coli.
Cada ORF clonado en el vector de expresión puede
transformarse después en la cepa adecuada para la expresión del
producto de proteína recombinante. Se usó 1 \mul de cada
construcción para transformar 30 \mul de BL21 de E. coli
(vector pGEX), TOP 10 de E. coli (vector pTRC) o
LB21-DE3 (pET) como se ha descrito anteriormente.
En el caso del vector pGEX-His, se usó la misma cepa
de E. coli (W3110) para la clonación inicial y la expresión.
Se inocularon colonias recombinantes sencillas en 2 ml de LB+Amp
(100 \mug/ml), se incubaron a 37ºC durante toda la noche, después
se diluyeron a 1:30 en 20 ml de LB+Amp (100 \mug/ml) en matraces
de 100 ml, asegurándonos de que la DO_{600} variaba entre 0,1 y
0,15. Los matraces se incubaron a 30ºC en baños de agua con
agitación orbital, hasta que la DO indicaba un crecimiento
exponencial adecuado para la inducción de la expresión (DO de
0,4-0,8 para vectores pET y pTRC; DO
0,8-1 para vectores pGEX y
pGEX-His). Para los vectores pET, pTRC y
pGEX-His, la expresión de la proteína se indujo
mediante adición de IPTG 1 mM, mientras que en el caso del sistema
de pGEX, la concentración final de IPTG era de 0,2 mM. Después de 3
horas de incubación a 30ºC, se comprobó la concentración final de
la muestra mediante DO. Para comprobar la expresión, se extrajo 1
ml de cada muestra, se centrifugó en una microcentrífuga, el
sedimento se resuspendió en PBS y se analizó mediante
SDS-PAGE a 12% con tinción de azul de Coomassie.
Toda la muestra se centrifugó a 6.000 g y el sedimento se
resuspendió en PBS para uso adicional.
Se cultivó una única colonia durante toda la
noche a 37ºC en una placa de agar LB+Amp. Las bacterias se
inocularon en 20 ml de cultivo líquido LB+Amp en un baño de agua
con agitación y se cultivaron durante toda la noche. Las bacterias
se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio recién preparado y se les
dejó crecer a la temperatura óptima (20-37ºC) hasta
una DO_{550} de 0,8-1. Se indujo la expresión de
las proteínas con IPTG 0,2 mM seguido de 3 horas de incubación. El
cultivo se centrifugó a 8000 rpm a 4ºC. El sobrenadante se descartó
y el sedimento bacteriano se resuspendió en 7,5 ml de PBS frío. Las
células se rompieron mediante sonicación en hielo durante 30
segundos a 40 W usando un sonicador Branson B-15, se
congelaron y se descongelaron dos veces y se centrifugaron de
nuevo. El sobrenadante se recogió y se mezcló con 150 \mul de
resina Glutatione-Sepharose 4B (Pharmacia)
(previamente lavada con PBS) y se incubaron a temperatura ambiente
durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5
minutos a 4ºC. La resina se lavó dos veces con 10 ml de PBS frío
durante 10 minutos, se resuspendió en 1 ml de PBS frío y se
introdujo en una columna desechable. La resina se lavó dos veces con
2 ml de PBS frío hasta que el flujo a su través alcanzaba una
DO_{280} de 0,02-0,06. La proteína de fusión GST
se eluyó mediante la adición de 700 \mul de tampón de elución de
glutatión frío 10 mM reducido con glutatión,
Tris-HCl 50 mM) y se recogieron las fracciones hasta
que la DO_{280} era de 0,1. Se introdujeron 21 \mul de cada
fracción en un gel SDS a 12% usando el patrón de amplio espectro de
peso molecular de SDS-PAGE de Biorad (M1) (200,
116,25, 97,4, 66,2, 45, 31, 21,5, 14,4, 6,5 kDa) o el marcador
Amersham Rainbow Marker (M'') (200, 66, 46, 30, 21,5, 14,3 kDa)
como patrones. Como el PM de GST es de 26 kDa, este valor debe
añadirse al PM de cada proteína de fusión GST.
Una única colonia se cultivó durante toda la
noche a 37ºC en una placa de agar LB + Amp. Las bacterias se
inocularon en 20 ml de cultivo líquido LB + Amp y se incubaron
durante toda la noche en un baño de agua con agitación. Las
bacterias se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio recién preparado y
se dejaron crecer a la temperatura óptima (20-37ºC)
a una DO_{550} de 0,6-0,8. La expresión de las
proteínas se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM y el cultivo
se incubó adicionalmente durante tres horas. El cultivo se
centrifugó a 8000 rpm a 4ºC, el sobrenadante se descartó y el
sedimento bacteriano se resuspendió en 7,5 ml de tampón de imidazol
10 mM frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 10 mM, pH
8). Las células se rompieron mediante sonicación en hielo durante
30 segundos a 40 W usando un sonicador Branson B-15,
se congelaron y se descongelaron dos veces y se centrifugaron de
nuevo. El sobrenadante se recogió y se mezcló con 150 \mul de
resina Ni^{2+} (Pharmacia) (previamente lavada con tampón imidazol
10 mM) y se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave
durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5
minutos a 4ºC. La resina se lavó dos veces con 10 ml de tampón de
imidazol 10 mM frío durante 10 minutos, se resuspendió en 1 ml de
tampón de imidazol 10 mM frío y se introdujo en una columna
desechable. La resina se lavó a 4ºC con 2 ml de tampón de imidazol
10 mM frío hasta que el flujo a su través alcanzaba una DO_{280}
de 0,02-0,06. La resina se lavó con 2 ml de tampón
de imidazol 20 mM frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol
20 mM, pH 8) hasta que el flujo a su través alcanzó la DO_{280}
de 0,02-0,06. La proteína de fusión His se eluyó
mediante la adición de 700 \mul de tampón de imidazol 250 mM frío
(NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 250 mM, pH 8) y se
recogieron las fracciones hasta que la DO_{280} era de 0,1. Se
introdujeron 21 \mul de cada fracción en un gel SDS a 12%.
Una única colonia se cultivó durante toda la
noche a 37ºC en una placa de agar LB + Amp. Las bacterias se
inocularon en 20 ml de cultivo líquido LB + Amp en un baño de agua
con agitación y se cultivaron durante toda la noche. Las bacterias
se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio recién preparado y se dejaron
crecer a la temperatura óptima (37ºC) a una DO_{550} de
0,6-0,8.
La expresión de las proteínas se indujo mediante
la adición de IPTG 1 mM y el cultivo se incubó adicionalmente
durante 3 horas. El cultivo se centrifugó a 8000 rpm a 4ºC. El
sobrenadante se descartó y el sedimento bacteriano se resuspendió
en 7,5 ml de tampón de B (urea 8 M, Tris-HCl 10 mM,
tampón fosfato 10 mM, pH 8,8). Las células se rompieron mediante
sonicación en hielo durante 30 segundos a 40 W usando un sonicador
Branson B-15, se congelaron y se descongelaron dos
veces y se centrifugaron de nuevo. El sobrenadante se almacenó a
-20ºC, mientras que el sedimento se resuspendió en 2 ml de tampón
de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, tampón fosfato 100 mM,
Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) y se trataron en un
homogeneizador durante 10 ciclos. El producto se centrifugó a
13.000 rpm durante 40 minutos. El sobrenadante se mezcló con 150
\mul de resina Ni^{2+} (Pharmacia) (previamente lavada con
tampón B) y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave
durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5
minutos a 4ºC. La resina se lavó dos veces con 10 ml de tampón B
durante 10 minutos, se resuspendió en 1 ml de tampón B y se cargó en
una columna desechable. La resina se lavó a temperatura ambiente
con 2 ml de tampón B hasta que el flujo a su través alcanzaba una
DO_{280} de 0,02-0,06. La resina se lavó con 2 ml
de tampón C (urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, tampón
fosfato 100 mM, pH 6,3) hasta que el flujo a su través alcanzó la
DO_{280} de 0,02-0,06. La proteína de fusión His
se eluyó mediante la adición de 700 \mul de tampón de elución
(urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH
4,5) y se recogieron las fracciones hasta que la DO_{280} era de
0,1. Se introdujeron 21 \mul de cada fracción en un gel SDS a
12%.
Se añadió glicerol al 10% a las proteínas
desnaturalizadas. Después se diluyeron las proteínas a 20 \mug/ml
usando tampón de diálisis I (glicerol a 10%, arginina 0,5 M, tampón
fosfato 50 mM, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0,5 mM,
urea 2 M, pH 8,8) y se dializó frente al mismo tampón a 4ºC durante
12-14 horas. La proteína se dializó adicionalmente
frente al tampón de diálisis II (glicerol a 10%, arginina 0,5 M,
tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado
0,5 mM, pH 8,8) durante 12-14 horas a 4ºC. La
concentración de proteína se evaluó usando la fórmula:
Se usaron 20 \mug de cada proteína purificada
para inmunizar ratones por vía intraperitoneal. En el caso de
algunos ORF, se inmunizaron ratones Balb-C con
Al(OH)_{3} como adyuvante en los días 1, 21 y 42, y
la respuesta inmune se controló en muestras tomadas el día 56. Para
otros ORF, los ratones CD1 podían inmunizarse usando el mismo
protocolo. Para los ORF 25 y 40, se inmunizaron ratones CD1 usando
adyuvante de Freund, y se usó el mismo protocolo de inmunización,
excepto que la respuesta inmune se medía el día 42, en lugar del
56. Análogamente, para otros ORF, se inmunizaron ratones CD1 con
adyuvante de Freund, pero la respuesta inmune se midió el día
49.
La cepa M7 de MenB encapsulado se colocó en
placas de agar chocolate y se incubó durante toda la noche a 37ºC.
Se recogieron colonias bacterianas a partir de las placas de agar
usando un hisopo de dracon estéril y se inocularon en 7 ml de caldo
Mueller-Hinton (Difco) que contenía glucosa a 0,25%.
El crecimiento bacteriano se controló cada 30 minutos siguiendo la
DO_{620}. Se dejó crecer a las bacterias hasta que la DO alcanzaba
el valor de 0,3-0,4. El cultivo se centrifugó
durante 10 minutos a 10.000 rpm. El sobrenadante se descartó y las
bacterias se lavaron una vez con PBS, se resuspendieron en PBS que
contenía formaldehído a 0,025% y se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente y después durante toda la noche a 4ºC con
agitación. Se añadieron 100 \mul de células bacterianas a cada
pocillo de una placa Greiner de 96 pocillos y se incubaron durante
toda la noche a 4ºC. Después se lavaron los pocillos tres veces con
tampón de lavado PBT (Tween 20 a 0,1% en PBS). Se añadieron 200
\mul de tampón de saturación (polivinilpirrolidona a 2,7% en agua)
a cada pocillo y las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Se
lavaron los pocillos tres veces con PBT. Se añadieron 200 \mul de
suero diluido (tampón de dilución: BSA a 1%, Tween 20 a 0,1%,
NaN_{3} a 0,1% en PBS) a cada pocillo y las placas se incubaron
durante 90 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron tres veces con PBT.
Se añadieron 100 \mul de suero anti-ratón de
conejo conjugado con HRP (Dako) diluido a 1:2000 en tampón de
dilución a cada pocillo y las placas se incubaron durante 90 minutos
a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón PBT. Se
añadieron 100 \mul de tampón sustrato para HRP (25 ml de tampón
citrato pH 5, 10 mg de O-fenildiamina y 10 \mul
de H_{2}O) a cada pocillo y las placas se dejaron a temperatura
ambiente durante 20 minutos. Se añadieron 100 \mul de
H_{2}SO_{4} a cada pocillo y se siguió la DO_{490}. El ensayo
ELISA se consideró positivo cuando la DO_{490} era 2,5 veces la de
los sueros pre-inmunes respectivos.
La cepa M7 de MenB encapsulados se colocó en
placas de agar chocolate y se incubó durante toda la noche a 37ºC.
Se recogieron colonias bacterianas a partir de las placas de agar
usando un hisopo de dracon estéril y se inocularon en 4 tubos que
contenían 8 ml cada uno de caldo Mueller-Hinton
(Difco) que contenía glucosa a 0,25%. El crecimiento bacteriano se
controló cada 30 minutos siguiendo la DO_{620}. Se dejó crecer a
las bacterias hasta que la DO alcanzaba el valor de
0,35-0,5. El cultivo se centrifugó durante 10
minutos a 4.000 rpm. El sobrenadante se descartó y el sedimento se
resuspendió en tampón de bloqueo (BSA a 1%, NaN_{3} a 0,4%) y se
centrifugó durante 5 minutos a 4.000 rpm. Las células se
resuspendieron en tampón de bloqueo para alcanzar DO_{620} de
0,07. Se añadieron 10 \mul de células bacterianas a cada pocillo
de una placa Costar de 96 pocillos. Se añadieron 100 \mul de
sueros diluidos (1:200) (en tampón de bloqueo) a cada pocillo y las
placas se incubaron durante 2 horas a 4ºC. Las células se
centrifugaron durante 5 minutos a 4.000 rpm, se aspiro el
sobrenadante y las células se lavaron mediante la adición de 200
\mul/pocillo de tampón de bloqueo en cada pocillo. Se añadieron
100 \mul de F(ab)_{2} conjugado con
R-ficoeritrina de cabra anti-ratón,
diluido a 1:100, a cada pocillo y las placas se incubaron durante
una hora a 4ºC. Las células se sedimentaron mediante centrifugado a
4.000 rpm durante 5 minutos y se lavaron mediante adición de 200
\mul/pocillo de tampón de bloqueo. El sobrenadante se aspiró y
las células se resuspendieron en 200 \mul/pocillo de PBS,
formaldehído a 0,25%. Las muestras se transfirieron a tubos FACScan
y se leyeron. Las condiciones para el ajuste del FASCan eran: FL1
activado, FL2 y FL3 desactivado; umbral de FSC-H 92;
voltaje de FSC PMT: E 02; SSC PMT: 474; aumentos de amplitud 7,1;
FL-2 PMT: 539. Valores de compensación: 0.
Se cultivaron bacterias durante toda la noche en
5 placas GC, se recogieron con un asa de siembra y se resuspendieron
en 10 ml de Tris-HCl 20 mM. Se realizó inactivación
con calor a 56ºC durante 30 minutos y las bacterias se rompieron
mediante sonicación durante 10 minutos en hielo (50% de ciclo de
trabajo, 50% de rendimiento). Las células sin romper se eliminaron
mediante centrifugado a 5000 g durante 10 minutos y la fracción de
la envuelta celular total se recuperó mediante centrifugado a
50.000 g a 4ºC durante 75 minutos. Para extraer las proteínas de la
membrana citoplasmática de las membranas externas en bruto, toda la
fracción se resuspendió en Sarkosyl a 2% (Sigma) y se incubaron a
temperatura ambiente durante 20 minutos. La suspensión se centrifugó
a 10.000 g durante 10 minutos para eliminar los agregados y el
sobrenadante se ultracentrifugó a 50.000 g durante 75 minutos para
sedimentar las membranas externas. Las membranas externas se
resuspendieron en Tris-HCl 10 mM, pH 8 y la
concentración de proteínas se midió mediante el ensayo
Bio-Rad Protein, usando BSA como patrón.
Se cultivaron las bacterias durante toda la
noche en una placa GC, se recogieron con un asa de siembra y se
resuspendieron en 1 ml de Tris-HCl 20 mM. Se realizó
inactivación con calor a 56ºC durante 30 minutos.
Se introdujeron proteínas purificadas (500
ng/pista), vesículas de membrana externa (5 \mug) y de extractos
de células totales (25 \mug) obtenidos de la cepa de MenB 2996 en
SDS-PAGE a 15% y se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa. La transferencia se realizó durante 2 horas a 150 mA
a 4ºC, en tampón de transferencia (Tris básico a 0,3%, glicina a
1,44% y metanol a 20%). La membrana se saturaba mediante incubación
durante toda la noche a 4ºC en tampón de saturación (leche
desnatada a 10%, Tritón X100 a 0,1% en PBS). La membrana se lavó
dos veces con tampón de lavado (leche desnatada a 0,3%, Tritón X100
a 0,1% en PBS) y se incubó durante 2 horas a 37ºC en sueros de
ratón diluidos en tampón de lavado 1:200. La membrana se lavó dos
veces y se incubó durante 90 minutos en una dilución 1:2000 de Ig
anti-ratón marcada con peroxidasa de rábano
rusticano. La membrana se lavó dos veces con Tritón X100 a 0,1% en
PBS y se desarrollo con el kit Opti-4CN Substrate
Kit (Bio-Rad). La reacción se interrumpió añadiendo
agua.
La cepa MC58 se cultivó durante toda la noche a
37ºC en placas de agar chocolate. Se recogieron 5-7
colonias y se usaron para inocular 7 ml de caldo
Mueller-Hinton. La suspensión se incubó a 37ºC en un
mezclador nutator y se dejó crecer hasta que la DO_{620} estaba
entre 0,5-0,8. El cultivo se dividió en alícuotas en
tubos Eppendorf estériles de 1,5 ml y se centrifugó durante 20
minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga. El sedimento se
lavó una vez en tampón de Gey (Gibco) y se resuspendió en el mismo
tampón a una DO_{620} de 0,5, se diluyó a 1:20000 en tampón de
Gey y se almacenó a 25ºC.
Se añadieron 50 \mul de tampón Gey/BSA a 1% a
cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Se
añadieron 25 \mul de sueros de ratón diluidos (1:100) (tampón de
dilución: tampón de Gey/BSA a 0,2%) y la placa se incubó a 4ºC. Se
añadieron 25 \mul de la suspensión bacteriana descrita
anteriormente a cada pocillo. Se añadieron 25 \mul de complemento
de cría de conejo inactivado con calor (56ºC durante 30 minutos) o
normal a cada pocillo. Inmediatamente después de la adición del
complemento de cría de conejo, se colocaron 22 \mul de cada
muestra/pocillo en placas de agar Mueller-Hinton
(tiempo 0). La placa de 96 pocillos se incubó durante 1 hora a 37ºC
con rotación y después se colocaron 22 \mul de cada
muestra/pocillo en placas de agar Mueller-Hinton
(tiempo 1). Después de una incubación durante toda la noche se
contaron las colonias correspondientes a tiempo 0 y a tiempo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando los procedimientos descritos
anteriormente, se identificó la siguiente secuencia de ADN parcial
en N. gonorrhoeae <ID SEC Nº 1>:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esto corresponde a la secuencia de aminoácidos
<ID SEC Nº 2; ORF 741.ng>
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia de ADN
parcial en N. meningitidis <ID SEC Nº 3>:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esto corresponde a la secuencia de aminoácidos
<ID SEC Nº 4; ORF 741>:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
m741/g741 61,4% de identidad en un solapamiento
de 280 aa
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia de ADN
parcial en N. meningitidis <ID SEC Nº 5>:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esto corresponde a la secuencia de aminoácidos
<ID SEC Nº 6; ORF 741.a>:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a741/m741 95,6% de identidad en un solapamiento
de 274 aa
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> CHIRON CORPORATION
\hskip1cmTHE INSTITUTE FOR GENOMIC RESEARCH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTÍGENOS DE NEISSERIA Y
COMPOSICIONES
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P042614EP
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US19980083758P
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
01-05-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US19980094869P
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
31-07-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US19980098994P
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
02-09-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US19980099062P
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
02-09-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US19980103749P
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
09-10-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US19980103794P
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
09-10-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US19980103796P
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
09-10-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US19990121528P
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
25-02-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP99922752.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-04-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<170> SeqWin99, versión 1.02
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 840
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 274
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 274
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccc atatg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccg ctagc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggaattct agctagc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgctcgag
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattccat atggccatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatcc
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcagctag ccatatg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatcc
\hfill8
Claims (39)
1. Una proteína que comprende:
- \bullet
- la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 2:
- \bullet
- una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 2 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria;
- \bullet
- una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 8 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 2;
- \bullet
- la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 4;
- \bullet
- una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria;
- \bullet
- una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 10 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 4;
- \bullet
- la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 6;
- \bullet
- una secuencia de aminoácidos que tiene 50% o más de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 6 y que es eficaz para la prevención de enfermedades debidas a bacterias de Neisseria;
- \bullet
- una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de 10 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 6, en la que dicho fragmento comprende un epítopo de la ID SEC Nº 6.
2. La proteína de la reivindicación 1, que tiene
más de 60% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.
3. La proteína de la reivindicación 2, que tiene
más de 70% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.
4. La proteína de la reivindicación 3, que tiene
más de 80% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.
5. La proteína de la reivindicación 4, que tiene
más de 90% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.
6. La proteína de la reivindicación 5, que tiene
más de 95% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.
7. La proteína de la reivindicación 6, que tiene
más de 99% de identidad de secuencia con la ID SEC Nº 4.
8. La proteína de la reivindicación 1, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 12 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4.
9. La proteína de la reivindicación 8, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 14 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4.
10. La proteína de la reivindicación 9, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 16 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4.
11. La proteína de la reivindicación 10, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 18 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4.
12. La proteína de la reivindicación 11, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 20 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 4.
13. La proteína de la reivindicación 1, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 10 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.
14. La proteína de la reivindicación 13, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 12 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.
15. La proteína de la reivindicación 14, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 14 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.
16. La proteína de la reivindicación 15, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 16 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.
17. La proteína de la reivindicación 16, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 18 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.
18. La proteína de la reivindicación 17, que
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento
de 20 o más aminoácidos consecutivos de la ID SEC Nº 2.
19. La proteína de cualquier reivindicación
precedente, siendo la proteína un antígeno de Neisseria.
20. Un anticuerpo que se une de forma específica
a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
constituido por ID SEC Nº 2, ID SEC Nº 4 e ID SEC Nº 6.
21. El anticuerpo de la reivindicación 20, que
es un anticuerpo monoclonal.
22. Una molécula de ácido nucleico que codifica
una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 19.
a 19.
23. Una molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 22, que comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada entre el grupo constituido por ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 3
e ID SEC Nº 5.
24. Una molécula de ácido nucleico que codifica
una proteína eficaz para la prevención de una enfermedad debida a
bacterias de Neisseria y que comprende (i) un fragmento de 12 o más
nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 1 que codifica un epítopo
de la ID SEC Nº 2; (ii) un fragmento de 20 o más nucleótidos
consecutivos de la ID SEC Nº 3 que codifica un epítopo de la ID SEC
Nº 4; o (iii) un fragmento de 20 o más nucleótidos consecutivos de
la ID SEC Nº 5 que codifica un epítopo de la ID SEC Nº 6.
25. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 24, que comprende un fragmento de 25 o más
nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 3.
26. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 25, que comprende un fragmento de 30 o más
nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 3.
27. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 26, que comprende un fragmento de 35 o más
nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 3.
28 La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 27, que comprende un fragmento de 40 o más
nucleótidos consecutivos de la ID SEC Nº 3.
29. Una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos complementaria a una molécula de ácido
nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28.
30. Una composición que comprende una proteína,
una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo según cualquier
reivindicación precedente.
31. Una composición según la reivindicación 30
que es una composición inmunogénica.
32. Una composición según la reivindicación 30
que es una composición de vacuna o una composición de
diagnóstico.
33. Una composición según la reivindicación 30
para su uso como producto farmacéutico.
34. El uso de una proteína según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 19, una molécula de ácido nucleico
según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29 o un anticuerpo
según la reivindicación 20 ó 21, en la fabricación de un
medicamento para la prevención de infección debida a bacterias de
Neisseria.
35. El uso de la reivindicación 34, en el que el
medicamento es para la prevención de infección debida a N.
meningitidis.
36. El uso de la reivindicación 35, en el que el
medicamento es para la prevención de infección debida a N.
meningitidis B.
37. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 33, o el uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 34 a 36, en donde las composiciones o el
medicamento incluyen un adyuvante.
38. Un vector que comprende la secuencia de
nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de
las reivindicaciones 22 a 29.
39. Una célula huésped transformada con el
vector de la reivindicación 38.
40. Un procedimiento para producir la proteína
de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende la
etapa de cultivar una célula huésped según la reivindicación 39 en
condiciones que inducen la expresión de proteínas.
Applications Claiming Priority (17)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8375898P | 1998-05-01 | 1998-05-01 | |
US83758P | 1998-05-01 | ||
US9486998P | 1998-07-31 | 1998-07-31 | |
US94869P | 1998-07-31 | ||
US9906298P | 1998-09-02 | 1998-09-02 | |
US9899498P | 1998-09-02 | 1998-09-02 | |
US98994P | 1998-09-02 | ||
US99062P | 1998-09-02 | ||
US10379698P | 1998-10-09 | 1998-10-09 | |
US10374998P | 1998-10-09 | 1998-10-09 | |
US10379498P | 1998-10-09 | 1998-10-09 | |
US103794P | 1998-10-09 | ||
US103796P | 1998-10-09 | ||
US103749P | 1998-10-09 | ||
US12152899P | 1999-02-25 | 1999-02-25 | |
US121528P | 1999-02-25 | ||
PCT/US1999/009346 WO1999057280A2 (en) | 1998-05-01 | 1999-04-30 | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2294629T3 true ES2294629T3 (es) | 2008-04-01 |
Family
ID=27574612
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES08003373.1T Expired - Lifetime ES2537575T3 (es) | 1998-05-01 | 1999-04-30 | Antígenos y composiciones de neisseria meningitidis |
ES05077865T Expired - Lifetime ES2294629T3 (es) | 1998-05-01 | 1999-04-30 | Antigenos de neisseria y composiciones. |
ES99922752T Expired - Lifetime ES2304065T3 (es) | 1998-05-01 | 1999-04-30 | Antigenos y composiciones de neisseria meningitidis. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES08003373.1T Expired - Lifetime ES2537575T3 (es) | 1998-05-01 | 1999-04-30 | Antígenos y composiciones de neisseria meningitidis |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES99922752T Expired - Lifetime ES2304065T3 (es) | 1998-05-01 | 1999-04-30 | Antigenos y composiciones de neisseria meningitidis. |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (9) | US7576176B1 (es) |
EP (23) | EP2261350A3 (es) |
JP (9) | JP5102414B2 (es) |
CN (3) | CN101293920B (es) |
AT (2) | ATE388230T1 (es) |
AU (1) | AU761780B2 (es) |
BR (1) | BR9910089A (es) |
CA (2) | CA2650642A1 (es) |
CY (2) | CY1109649T1 (es) |
DE (2) | DE69937419T2 (es) |
DK (2) | DK1645631T3 (es) |
ES (3) | ES2537575T3 (es) |
HK (1) | HK1090382A1 (es) |
MX (4) | MX343752B (es) |
NZ (4) | NZ508366A (es) |
PT (3) | PT1944371E (es) |
WO (1) | WO1999057280A2 (es) |
Families Citing this family (198)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU1463097A (en) | 1996-01-04 | 1997-08-01 | Rican Limited | Helicobacter pylori bacterioferritin |
EP2298900A1 (en) | 1996-09-17 | 2011-03-23 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Compositions and methods for treating intracellular diseases |
US6914131B1 (en) | 1998-10-09 | 2005-07-05 | Chiron S.R.L. | Neisserial antigens |
CA2308606A1 (en) * | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Chiron S.P.A. | Neisserial antigens |
US20070026021A1 (en) * | 1998-05-01 | 2007-02-01 | Chiron S.R.I. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
CN101293920B (zh) * | 1998-05-01 | 2012-07-18 | 诺华疫苗和诊断公司 | 脑膜炎奈瑟球菌抗原和组合物 |
US6756493B1 (en) | 1998-09-01 | 2004-06-29 | Antex Biologics, Inc. | Nucleic acid sequence and uses thereof |
US6693186B2 (en) | 1998-09-01 | 2004-02-17 | Antex Biologics Inc | Neisseria meningitidis polypeptide, nucleic acid sequence and uses thereof |
US6610306B2 (en) | 1998-10-22 | 2003-08-26 | The University Of Montana | OMP85 protein of neisseria meningitidis, compositions containing the same and methods of use thereof |
ATE527360T1 (de) | 1998-12-08 | 2011-10-15 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Neue verbindungen abgeleitet von neisseria meningitidis |
WO2000042192A1 (en) * | 1999-01-15 | 2000-07-20 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Neisseria meningitidis polypeptide basb052 |
US6797273B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-09-28 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Neisseria meningitidis antigen |
CN1375006A (zh) | 1999-01-22 | 2002-10-16 | 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 | 新型化合物 |
AU2292800A (en) * | 1999-01-22 | 2000-08-07 | Smithkline Beecham Biologicals (Sa) | Neisseria meningitidis antigenic polypeptides, corresponding polynucleotides andprotective antibodies |
GB9902084D0 (en) * | 1999-01-29 | 1999-03-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB9902937D0 (en) * | 1999-02-10 | 1999-03-31 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
ES2228454T3 (es) | 1999-02-26 | 2005-04-16 | Chiron S.R.L. | Mejora de la actividad bacteriana de antigenos de neisseria con oligonucleotidos que contienen motivos cg. |
EP2270169A3 (en) * | 1999-03-12 | 2011-06-15 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Neisseria meningitidis antigenic polypeptides, corresponding polynucleotides and protective antibodies |
AU2004240199B2 (en) * | 1999-04-30 | 2007-05-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Conserved Neisserial antigens |
NZ530640A (en) | 1999-04-30 | 2006-06-30 | Chiron S | Conserved neisserial antigens |
AU2013200678B2 (en) * | 1999-05-19 | 2014-08-21 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Combination Neisserial compositions |
CA2929348A1 (en) | 1999-05-19 | 2000-11-30 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Combination neisserial compositions |
GB9911683D0 (en) * | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
AU2013203304B2 (en) * | 1999-05-19 | 2014-10-09 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Combination Neisserial compositions |
GB9918319D0 (en) | 1999-08-03 | 1999-10-06 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
AU2003270970B2 (en) * | 1999-08-03 | 2005-05-26 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine composition |
AU784203B2 (en) | 1999-10-29 | 2006-02-23 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Neisserial antigenic peptides |
GB9928196D0 (en) | 1999-11-29 | 2000-01-26 | Chiron Spa | Combinations of B, C and other antigens |
AU1875301A (en) | 1999-11-29 | 2001-06-04 | Chiron S.P.A. | 85kda neisserial antigen |
RU2279889C2 (ru) | 2000-01-17 | 2006-07-20 | Чирон С.Р.Л. | ВАКЦИНА ВЕЗИКУЛ НАРУЖНЫХ МЕМБРАН (OMV), СОДЕРЖАЩАЯ БЕЛКИ НАРУЖНОЙ МЕБРАНЫ N.Meningitidis СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ГРУППЫ В |
PL216780B1 (pl) | 2000-01-25 | 2014-05-30 | Univ Queensland Of Santa Lucia | Wyizolowane białka zawierające konserwatywne obszary antygenu powierzchniowego NhhA z Neisseria meningitidis, białka fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego, wyizolowany kwas nukleinowy, konstrukt ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej, sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis oraz sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta oraz zastosowanie wyizolowanego białka, białka fuzyjnego i konstruktu ekspresyjnego |
ES2391153T3 (es) | 2000-02-28 | 2012-11-22 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Expresión heteróloga de proteínas de Neisseria |
EP1322328B1 (en) | 2000-07-27 | 2014-08-20 | Children's Hospital & Research Center at Oakland | Vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis |
US7939087B2 (en) | 2000-10-27 | 2011-05-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Nucleic acids and proteins from Streptococcus groups A & B |
US7261901B2 (en) | 2001-01-31 | 2007-08-28 | University Of Iowa Research Foundation | Vaccine and compositions for the prevention and treatment of neisserial infections |
WO2002060936A2 (en) * | 2001-01-31 | 2002-08-08 | University Of Iowa Research Foundation | Vaccine and compositions for the prevention and treatment of neisserial infections |
GB0103171D0 (en) | 2001-02-08 | 2001-03-28 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
US7534444B2 (en) * | 2001-04-17 | 2009-05-19 | Novattis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Molecular mimetics of meningococcal B epitopes which elicit functionally active antibodies |
WO2002099035A2 (en) | 2001-05-31 | 2002-12-12 | Chiron Corporation | Chimeric alphavirus replicon particles |
GB0115176D0 (en) | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
GB0118249D0 (en) | 2001-07-26 | 2001-09-19 | Chiron Spa | Histidine vaccines |
DK2248822T3 (en) | 2001-07-27 | 2017-02-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | MENINGOCOKKER ADHESIONS |
GB0121591D0 (en) * | 2001-09-06 | 2001-10-24 | Chiron Spa | Hybrid and tandem expression of neisserial proteins |
AU2012202488B2 (en) * | 2001-09-06 | 2014-01-16 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Hybrid and tandem expression of Neisserial proteins |
CN100354297C (zh) * | 2001-10-03 | 2007-12-12 | 希龙公司 | 辅助的脑膜炎球菌组合物 |
AR045702A1 (es) | 2001-10-03 | 2005-11-09 | Chiron Corp | Composiciones de adyuvantes. |
US7838015B2 (en) * | 2001-10-03 | 2010-11-23 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Adjuvanted meningococcus compositions |
MX339524B (es) * | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
JP4413617B2 (ja) | 2001-12-12 | 2010-02-10 | カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | Chlamydiatrachomatisに対する免疫化 |
EP2572707A3 (en) | 2002-02-20 | 2013-11-06 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules |
EP1961427A3 (en) | 2002-08-02 | 2009-11-04 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Neisserial vaccine compositions comprising a combination of antigens |
GB0220194D0 (en) | 2002-08-30 | 2002-10-09 | Chiron Spa | Improved vesicles |
US7785608B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
DE60335477D1 (de) * | 2002-10-11 | 2011-02-03 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Polypeptidimpstoffe zum breiten schutz gegen hypervirulente meningokokken-linien |
US7927858B2 (en) | 2002-11-01 | 2011-04-19 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Drying process |
US7807802B2 (en) | 2002-11-12 | 2010-10-05 | Abbott Lab | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae |
AU2003288660A1 (en) | 2002-11-15 | 2004-06-15 | Chiron Srl | Unexpected surface proteins in neisseria meningitidis |
GB0227346D0 (en) | 2002-11-22 | 2002-12-31 | Chiron Spa | 741 |
US8034378B2 (en) | 2002-12-27 | 2011-10-11 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc | Immunogenic compositions containing phospholipid |
EP2172213B1 (en) | 2003-01-30 | 2013-04-03 | Novartis AG | Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups |
CA2520124A1 (en) | 2003-03-28 | 2004-10-14 | Chiron Corporation | Use of benzazole compounds for immunopotentiation |
GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
WO2004094596A2 (en) * | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Wyeth Holdings Corporation | Novel immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
US7731967B2 (en) | 2003-04-30 | 2010-06-08 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Compositions for inducing immune responses |
CN1798548B (zh) | 2003-06-02 | 2010-05-05 | 诺华疫苗和诊断公司 | 基于含吸附类毒素和含多糖抗原微粒体的免疫原性组合物 |
US7851433B2 (en) | 2003-08-13 | 2010-12-14 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Method of purifying TFPI and TFPI analogs |
GB0323103D0 (en) | 2003-10-02 | 2003-11-05 | Chiron Srl | De-acetylated saccharides |
PL1961426T3 (pl) | 2003-10-02 | 2012-03-30 | Gsk Vaccines S R L | Skojarzone szczepionki przeciwko zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych |
CU23236A1 (es) * | 2003-12-03 | 2007-09-26 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | PROTEINA NMB0928 Y SU USO EN FORMULACIONES FARMACéUTICAS P |
CU23237A1 (es) * | 2003-12-03 | 2007-09-26 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | PROTEINA NMB1125 Y SU USO EN FORMULACIONES FARMACéUTICAS |
GB0408977D0 (en) * | 2004-04-22 | 2004-05-26 | Chiron Srl | Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins |
CA2571710A1 (en) | 2004-06-24 | 2006-11-02 | Nicholas Valiante | Small molecule immunopotentiators and assays for their detection |
DE602004013752D1 (de) * | 2004-06-29 | 2008-06-26 | Ct For Disease Control Dept Of | Oberflächenprotein aus Neisserien |
CA2575548A1 (en) | 2004-07-29 | 2006-07-27 | John L. Telford | Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae |
GB0419408D0 (en) * | 2004-09-01 | 2004-10-06 | Chiron Srl | 741 chimeric polypeptides |
GB0419918D0 (en) * | 2004-09-08 | 2004-10-13 | Imp College Innovations Ltd | Vaccine |
JP4993750B2 (ja) | 2005-01-27 | 2012-08-08 | チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド | 髄膜炎菌に起因する疾患に対する広域防御のための、gna1870を基にした小胞ワクチン |
GB0502095D0 (en) | 2005-02-01 | 2005-03-09 | Chiron Srl | Conjugation of streptococcal capsular saccharides |
GB0502096D0 (en) | 2005-02-01 | 2005-03-09 | Chiron Srl | Purification of streptococcal capsular polysaccharide |
SI2351772T1 (sl) | 2005-02-18 | 2016-11-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Proteini in nukleinske kisline iz Escherichia coli povezane z meningitisom/sepso |
ES2385045T3 (es) | 2005-02-18 | 2012-07-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Inmunógenos de Escherichia coli uropatogénica |
GB0505996D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Fermentation process |
EP1723964A1 (en) * | 2005-05-20 | 2006-11-22 | Institut Pasteur | Use of penicillin-binding proteins or polynucleotides or antibodies thereof for preventing or treating bacterial infections |
EP2357000A1 (en) | 2005-10-18 | 2011-08-17 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles |
ES2514316T3 (es) | 2005-11-22 | 2014-10-28 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Partículas similares a virus (VLPs) de Norovirus y Sapovirus |
GB0524066D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Chiron Srl | 741 ii |
EP1962902A2 (en) * | 2005-12-06 | 2008-09-03 | Universita Degli Studi di Padova | Methods and compositions relating to adhesins as adjuvants |
EP2368569A3 (en) | 2006-01-18 | 2012-05-02 | University Of Chicago | Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins |
EP2357184B1 (en) | 2006-03-23 | 2015-02-25 | Novartis AG | Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators |
CU23572A1 (es) * | 2006-03-31 | 2010-09-30 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Composición farmacéutica que comprende la proteína nmb0938 |
AU2016204760A1 (en) * | 2006-04-26 | 2016-07-28 | Wyeth Llc | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
AU2014268186C1 (en) * | 2006-04-26 | 2017-12-07 | Wyeth Llc | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
WO2007144316A2 (en) | 2006-06-12 | 2007-12-21 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccine |
BRPI0713904A2 (pt) | 2006-06-29 | 2013-06-25 | Novartis Ag | polipeptÍdeos a partir de neisseria meningitidis |
AU2007285484B2 (en) | 2006-08-16 | 2013-05-02 | Novartis Ag | Immunogens from uropathogenic Escherichia coli |
AR064642A1 (es) * | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
GB0700562D0 (en) | 2007-01-11 | 2007-02-21 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Modified Saccharides |
GB0713880D0 (en) | 2007-07-17 | 2007-08-29 | Novartis Ag | Conjugate purification |
BRPI0816689B1 (pt) | 2007-09-12 | 2021-08-24 | Novartis Ag | Composição de vacina, kit e método para a confecção de uma composição de vacina para a prevenção ou tratamento de infecção por streptococcus pyogenes |
EP2200642B1 (en) | 2007-10-19 | 2012-04-18 | Novartis AG | Meningococcal vaccine formulations |
US7833776B2 (en) * | 2007-12-12 | 2010-11-16 | National Health Research Institutes | Lipidating sequences and use thereof for producing lipidated proteins in E. coli |
US8815253B2 (en) | 2007-12-07 | 2014-08-26 | Novartis Ag | Compositions for inducing immune responses |
US8426163B2 (en) | 2007-12-07 | 2013-04-23 | National Health Research Institutes | Production of lipidated proteins in E. coli |
US8466259B2 (en) | 2007-12-07 | 2013-06-18 | National Health Research Institutes | Adjuvants |
CA2709927C (en) | 2007-12-21 | 2017-05-16 | Novartis Ag | Mutant forms of streptolysin o |
AU2009215364B2 (en) * | 2008-02-21 | 2014-09-18 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Meningococcal fHBP polypeptides |
MY150481A (en) | 2008-03-03 | 2014-01-30 | Irm Llc | Compounds and compositions as tlr activity modulators |
ES2557282T3 (es) | 2008-03-10 | 2016-01-25 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Proteínas quiméricas de unión al factor H (fHBP) que contienen un dominio B heterólogo, y métodos de uso |
US20100035234A1 (en) * | 2008-05-19 | 2010-02-11 | Novartis Ag | Vaccine assays |
CA2726512A1 (en) * | 2008-06-09 | 2009-12-17 | Novartis Ag | Antibodies against neisserial factor h binding protein |
GB0810742D0 (en) * | 2008-06-12 | 2008-07-16 | Univ Nottingham | Enzyme |
CA2733943A1 (en) | 2008-09-03 | 2010-03-11 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Peptides presenting an epitope of an a domain of factor h binding protein and methods of use |
GB0816447D0 (en) * | 2008-09-08 | 2008-10-15 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
JP5689064B2 (ja) | 2008-10-27 | 2015-03-25 | ノバルティス アーゲー | 精製方法 |
EP2367568A2 (en) | 2008-12-17 | 2011-09-28 | Novartis AG | Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor |
EP2384120B1 (en) | 2009-01-05 | 2019-12-11 | Epitogenesis Inc. | Adjuvant compositions and methods of use |
EP2385842A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-11-16 | Novartis AG | Cna_b domain antigens in vaccines against gram positive bacteria |
CA2756522C (en) | 2009-03-24 | 2018-06-26 | Novartis Ag | Adjuvanting meningococcal factor h binding protein |
WO2010109324A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Novartis Ag | Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates |
AU2010242905B2 (en) | 2009-04-30 | 2014-10-23 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Chimeric factor H binding proteins (fHbp) and methods of use |
ITMI20090946A1 (it) | 2009-05-28 | 2010-11-29 | Novartis Ag | Espressione di proteine ricombinanti |
US8287880B2 (en) | 2009-06-02 | 2012-10-16 | National Health Research Institutes | Lipidated vaccine against dengue virus infection |
US9517263B2 (en) | 2009-06-10 | 2016-12-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Benzonaphthyridine-containing vaccines |
WO2011008400A2 (en) | 2009-06-16 | 2011-01-20 | Novartis Ag | High-throughput complement-mediated antibody-dependent and opsonic bactericidal assays |
US8658176B2 (en) | 2009-06-22 | 2014-02-25 | National Health Research Institutes | Lipidated tumor-associated antigens and immunotherapeutic compositions |
CA2772103A1 (en) | 2009-08-27 | 2011-03-03 | Novartis Ag | Adjuvant comprising aluminium, oligonucleotide and polycation |
AU2010288240B2 (en) | 2009-08-27 | 2014-03-27 | Novartis Ag | Hybrid polypeptides including meningococcal fHBP sequences |
WO2011026111A1 (en) | 2009-08-31 | 2011-03-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Oral delivery of a vaccine to the large intestine to induce mucosal immunity |
TWI445708B (zh) | 2009-09-02 | 2014-07-21 | Irm Llc | 作為tlr活性調節劑之化合物及組合物 |
ES2443952T3 (es) | 2009-09-02 | 2014-02-21 | Novartis Ag | Composiciones inmunógenas que incluyen moduladores de la actividad de TLR |
BR112012009014B8 (pt) | 2009-09-30 | 2022-10-04 | Novartis Ag | Processo para preparar conjugado de polissacarídeo capsular de s. aureus tipo 5 ou tipo 8 e molécula de transporte crm197, conjugado e composição imunogênica |
CN102724988B (zh) | 2009-09-30 | 2014-09-10 | 诺华股份有限公司 | 脑膜炎球菌fHBP多肽的表达 |
JP5960055B2 (ja) | 2009-10-27 | 2016-08-02 | ノバルティス アーゲー | 改変髄膜炎菌fHBPポリペプチド |
RS56000B1 (sr) | 2009-10-30 | 2017-09-29 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Prečišćavanje stafilokokus aureus tip 5 i tip 8 kapsuliranih saharida |
WO2011057148A1 (en) | 2009-11-05 | 2011-05-12 | Irm Llc | Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators |
SG181712A1 (en) | 2009-12-15 | 2012-07-30 | Novartis Ag | Homogeneous suspension of immunopotentiating compounds and uses thereof |
BR112012022800A2 (pt) | 2010-03-11 | 2018-05-15 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | composição imunogênica ou vacina, cepa bacteriana gram-negativa geneticamente engenheirada, métodos para o tratamento ou prevenção de infecção ou doença, para produzir uma composição imunogênica ou uma vacina, e para preparar uma imunoglobulina, preparação da imunoglobulina, e, preparação farmacêutica |
CA2793510A1 (en) | 2010-03-18 | 2012-02-16 | Novartis Ag | Adjuvanted vaccines for serogroup b meningococcus |
CA2792938C (en) | 2010-03-23 | 2018-07-31 | Irm Llc | Compounds (cystein based lipopeptides) and compositions as tlr2 agonists used for treating infections, inflammations, respiratory diseases etc. |
WO2011126863A1 (en) | 2010-03-30 | 2011-10-13 | Children's Hospital & Research Center Oakland | Factor h binding proteins (fhbp) with altered properties and methods of use thereof |
EP2556377B1 (en) | 2010-04-08 | 2017-07-12 | University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education | B-cell antigen presenting cell assay |
KR20130121699A (ko) | 2010-05-28 | 2013-11-06 | 테트리스 온라인, 인코포레이티드 | 상호작용 혼성 비동기 컴퓨터 게임 기반구조 |
AU2011268507B2 (en) | 2010-06-25 | 2014-08-14 | Novartis Ag | Combinations of meningococcal factor H binding proteins |
EP3246044B2 (en) | 2010-08-23 | 2024-04-10 | Wyeth LLC | Stable formulations of neisseria meningitidis rlp2086 antigens |
GB201014967D0 (en) * | 2010-09-09 | 2010-10-20 | Univ Southampton | Composition |
AU2011300418B2 (en) | 2010-09-10 | 2016-05-12 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Meningococcus overexpressing NadA and/or NHBA and outer membrane vesicles derived therefrom |
US20120070457A1 (en) * | 2010-09-10 | 2012-03-22 | J. Craig Venter Institute, Inc. | Polypeptides from neisseria meningitidis |
ES2864635T3 (es) | 2010-09-10 | 2021-10-14 | Wyeth Llc | Variantes no lipidadas de antígenos ORF2086 de Neisseria meningitidis |
GB201101665D0 (en) | 2011-01-31 | 2011-03-16 | Novartis Ag | Immunogenic compositions |
TW201221642A (en) | 2010-11-15 | 2012-06-01 | Nat Health Research Institutes | Method of producing lipidated polypeptides |
TWI507413B (zh) | 2010-11-15 | 2015-11-11 | Nat Health Research Institutes | 脂質化多抗原表位疫苗 |
US20130315959A1 (en) | 2010-12-24 | 2013-11-28 | Novartis Ag | Compounds |
PL2491788T3 (pl) | 2011-02-25 | 2016-07-29 | Kraft Foods R & D Inc | Wyrób spożywczy z formowanym korpusem |
JP6191082B2 (ja) | 2011-03-02 | 2017-09-06 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | より低用量の抗原および/またはアジュバントを有する混合ワクチン |
US20150147356A1 (en) | 2011-05-12 | 2015-05-28 | Alan Kimura | Antipyretics to enhance tolerability of vesicle-based vaccines |
BR112013032410A2 (pt) | 2011-06-24 | 2017-01-17 | Epitogenesis Inc | composições farmacêuticas compreendendo uma combinação de veículos, vitaminas, taninos e flavonoides de seleção como imunomoduladores específicos de antígeno |
JP2014529407A (ja) | 2011-08-31 | 2014-11-13 | チルドレンズホスピタル アンド リサーチ センター オークランド | ナイセリアにおいて抗原の発現を促進するための操作された配列および使用方法 |
WO2013068949A1 (en) | 2011-11-07 | 2013-05-16 | Novartis Ag | Carrier molecule comprising a spr0096 and a spr2021 antigen |
EP2797624A1 (en) | 2011-12-29 | 2014-11-05 | Novartis AG | Adjuvanted combinations of meningococcal factor h binding proteins |
RU2014135522A (ru) | 2012-02-02 | 2016-03-27 | Новартис Аг | Промоторы для увеличенной экспрессии белка у менингококка |
JP2015517089A (ja) | 2012-03-08 | 2015-06-18 | ノバルティス アーゲー | タンパク質ベースの髄膜炎菌ワクチンのためのインビトロ有効性アッセイ |
US20150125486A1 (en) | 2012-03-08 | 2015-05-07 | Novartis Ag | Adjuvanted formulations of pediatric antigens |
MY167723A (en) | 2012-03-09 | 2018-09-21 | Pfizer | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
US10376573B2 (en) | 2012-06-14 | 2019-08-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccines for serogroup X meningococcus |
JP2015524418A (ja) | 2012-07-27 | 2015-08-24 | アンスティテュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 血管内皮細胞への髄膜炎菌の線毛媒介接着の受容体としてのcd147 |
AU2013311702A1 (en) | 2012-09-06 | 2015-02-19 | Novartis Ag | Combination vaccines with serogroup B meningococcus and D/T/P |
ES2848048T3 (es) | 2012-10-03 | 2021-08-05 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Composiciones inmunogénicas |
WO2014078656A1 (en) * | 2012-11-16 | 2014-05-22 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Gonorrheal mtre peptides and vaccines |
CN105188747A (zh) | 2013-02-01 | 2015-12-23 | 葛兰素史密斯克莱生物公司 | 包含toll样受体激动剂的免疫组合物的皮内递送 |
ES2685894T3 (es) | 2013-03-08 | 2018-10-15 | Pfizer Inc. | Polipéptidos de fusión inmunogénicos |
CN105431167A (zh) | 2013-08-02 | 2016-03-23 | 奥克兰儿童医院及研究中心 | 非天然发生因子h结合蛋白(fhbp)及其使用方法 |
WO2015033251A2 (en) | 2013-09-08 | 2015-03-12 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
CA2940447C (en) | 2014-02-28 | 2023-07-11 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modified meningococcal fhbp polypeptides |
CA3212723A1 (en) | 2014-07-23 | 2016-01-28 | Peter T. Beernink | Factor h binding protein variants and methods of use thereof |
KR20190049940A (ko) | 2015-02-19 | 2019-05-09 | 화이자 인코포레이티드 | 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법 |
EP3838918B1 (en) * | 2015-05-18 | 2022-08-31 | BiOMVis Srl | Immunogenic compositions containing bacterial outer membrane vesicles and therapeutic uses thereof |
JP7005504B2 (ja) | 2016-02-22 | 2022-01-21 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー | 生体分子の固定化方法 |
US11612664B2 (en) | 2016-04-05 | 2023-03-28 | Gsk Vaccines S.R.L. | Immunogenic compositions |
EP3263695A1 (en) | 2016-06-29 | 2018-01-03 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Immunogenic compositions |
US20180064801A1 (en) | 2016-09-02 | 2018-03-08 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccines for neisseria gonorrhoeae |
AU2018215585B2 (en) | 2017-01-31 | 2022-03-17 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
EP3655031A1 (en) | 2017-07-21 | 2020-05-27 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Neisseria meningitidis immunogenic compositions |
US11116830B2 (en) | 2017-12-18 | 2021-09-14 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Bacterial polysaccharide-conjugated carrier proteins and use thereof |
BR112020016314A2 (pt) | 2018-02-12 | 2020-12-15 | Inimmune Corporation | Compostos ou um sais farmaceuticamente aceitáveis, composição farmacêutica, kit, e, métodos para elicitar, intensificar ou modificar uma resposta imunológica, para tratar, prevenir ou reduzir a suscetibilidade a câncer, para tratar, prevenir ou reduzir a suscetibilidade a uma doença infecciosa, para tratar, prevenir ou reduzir a suscetibilidade a uma alergia, para tratar, prevenir ou reduzir a suscetibilidade a uma afecção autoimune, para tratar, prevenir ou reduzir a suscetibilidade em um sujeito à infecção bacteriana, viral, priônica, autoimunidade, câncer ou alergia, para tratar, prevenir ou reduzir a suscetibilidade à autoimunidade, alergia, reperfusão de isquemia ou sepse, para tratar, prevenir ou reduzir a gravidade de ataques epiléticos e para tratar, prevenir ou reduzir a suscetibilidade a doenças oculares como degeneração macular, hipertensão ocular e infecção ocular |
CN108950056B (zh) * | 2018-08-30 | 2021-08-20 | 安徽农业大学 | 与小麦种子休眠/穗发芽抗性相关的caps标记及其检测方法 |
WO2020086408A1 (en) | 2018-10-26 | 2020-04-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | A high-yield perfusion-based transient gene expression bioprocess |
GB2583070B (en) | 2019-03-20 | 2023-09-13 | Schlumberger Technology Bv | Viscosification of aqueous solutions |
EP3941451A4 (en) * | 2019-03-21 | 2022-12-14 | Fonterra Co-Operative Group Limited | POLAR LIPID COMPOSITIONS TO MAINTAIN OR INCREASE MOBILITY AND VITALITY |
EP4007600A4 (en) * | 2019-08-01 | 2023-08-23 | Trustees of Tufts College | VACCINE COMPOSITIONS AND ANTIGEN SELECTION METHODS |
US11865981B2 (en) * | 2020-05-05 | 2024-01-09 | Thor Tech, Inc. | Wire loom support |
CA3198876A1 (en) | 2020-11-04 | 2022-05-12 | Eligo Bioscience | Cutibacterium acnes recombinant phages, method of production and uses thereof |
CN113773366B (zh) * | 2021-07-27 | 2023-06-16 | 四川丽妍工坊生物科技有限公司 | 一种抗炎多肽bmp14及其制备方法和应用 |
GB202115077D0 (en) | 2021-10-21 | 2021-12-08 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Assay |
GB202208093D0 (en) | 2022-06-01 | 2022-07-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic composition |
GB202208089D0 (en) | 2022-06-01 | 2022-07-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic composition |
Family Cites Families (222)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2386796A (en) | 1942-08-05 | 1945-10-16 | Bond Crown & Cork Co | Extruding device |
DE2855719A1 (de) | 1978-12-22 | 1980-07-10 | Siemens Ag | Zahnaerztliche handstueckanordnung |
US4336336A (en) | 1979-01-12 | 1982-06-22 | President And Fellows Of Harvard College | Fused gene and method of making and using same |
AU545912B2 (en) | 1980-03-10 | 1985-08-08 | Cetus Corporation | Cloned heterologous jive products in bacillies |
ZA811368B (en) | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
NZ199722A (en) | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
BR8202422A (pt) | 1981-04-29 | 1983-04-12 | Biogen Nv | Vetor de clonacao de bacillus processo para sua construcao molecula de dna recombinante processo para sua construcao e processo para a producao de um polipeptidio |
US4551433A (en) | 1981-05-18 | 1985-11-05 | Genentech, Inc. | Microbial hybrid promoters |
US4405712A (en) | 1981-07-01 | 1983-09-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | LTR-Vectors |
US4769330A (en) | 1981-12-24 | 1988-09-06 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus and methods for making and using the same |
US4603112A (en) | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
US4876197A (en) | 1983-02-22 | 1989-10-24 | Chiron Corporation | Eukaryotic regulatable transcription |
CA1341116C (en) | 1983-02-22 | 2000-10-17 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein |
JPS59166086A (ja) | 1983-03-09 | 1984-09-19 | Teruhiko Beppu | 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法 |
US4546083A (en) | 1983-04-22 | 1985-10-08 | Stolle Research & Development Corporation | Method and device for cell culture growth |
US4588684A (en) | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
JPS59205983A (ja) | 1983-04-28 | 1984-11-21 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法 |
US4663280A (en) | 1983-05-19 | 1987-05-05 | Public Health Research Institute Of The City Of New York | Expression and secretion vectors and method of constructing vectors |
IE58011B1 (en) | 1983-05-27 | 1993-06-16 | Texas A & M Univ Sys | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
US4689406A (en) | 1983-08-10 | 1987-08-25 | Amgen | Enhancement of microbial expression of polypeptides |
US4870008A (en) | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
JPS6054685A (ja) | 1983-09-02 | 1985-03-29 | Suntory Ltd | 改良発現ベクタ−およびその利用 |
EP0136907A3 (en) | 1983-10-03 | 1986-12-30 | Genentech, Inc. | A xenogeneic expression control system, a method of using it, expression vectors containing it, cells transformed thereby and heterologous proteins produced therefrom |
WO1995013796A1 (en) | 1993-11-16 | 1995-05-26 | Depotech Corporation | Vesicles with controlled release of actives |
ZA848495B (en) | 1984-01-31 | 1985-09-25 | Idaho Res Found | Production of polypeptides in insect cells |
US4880734A (en) | 1984-05-11 | 1989-11-14 | Chiron Corporation | Eukaryotic regulatable transcription |
EP0164556B1 (en) | 1984-05-11 | 1994-03-02 | Chiron Corporation | Enhanced yeast transcription employing hybrid promoter region constructs |
US5288641A (en) | 1984-06-04 | 1994-02-22 | Arch Development Corporation | Herpes Simplex virus as a vector |
CA1282721C (en) | 1984-06-04 | 1991-04-09 | Bernard Roizman | Herpes simplex virus as a vector |
US4738921A (en) | 1984-09-27 | 1988-04-19 | Eli Lilly And Company | Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products |
US4745056A (en) | 1984-10-23 | 1988-05-17 | Biotechnica International, Inc. | Streptomyces secretion vector |
US4837148A (en) | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
US4762915A (en) | 1985-01-18 | 1988-08-09 | Liposome Technology, Inc. | Protein-liposome conjugates |
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
CA1260858A (en) | 1985-03-28 | 1989-09-26 | Lawrence S. Cousens | Expression using fused genes providing for protein product |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4865974A (en) | 1985-09-20 | 1989-09-12 | Cetus Corporation | Bacterial methionine N-terminal peptidase |
US4777127A (en) | 1985-09-30 | 1988-10-11 | Labsystems Oy | Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus |
JPS6296086A (ja) | 1985-10-21 | 1987-05-02 | Agency Of Ind Science & Technol | 複合プラスミド |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
US5091309A (en) | 1986-01-16 | 1992-02-25 | Washington University | Sindbis virus vectors |
US4861719A (en) | 1986-04-25 | 1989-08-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | DNA constructs for retrovirus packaging cell lines |
DE3750378T2 (de) | 1986-05-02 | 1995-01-19 | Gist Brocades Nv | Sekretionssignal-Selektionsvektoren für extrazelluläre Proteinsynthese in Bazillen. |
US5554372A (en) | 1986-09-22 | 1996-09-10 | Emory University | Methods and vaccines comprising surface-active copolymers |
WO1988002406A2 (en) | 1986-10-02 | 1988-04-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods of regulating metabolic stability of proteins |
EP0273116A3 (en) | 1986-10-09 | 1990-05-02 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Gonococcal and meningococcal polypeptides, vaccines and diagnostics |
US5514581A (en) * | 1986-11-04 | 1996-05-07 | Protein Polymer Technologies, Inc. | Functional recombinantly prepared synthetic protein polymer |
JPS63123383A (ja) | 1986-11-11 | 1988-05-27 | Mitsubishi Kasei Corp | ハイブリツドプロモ−タ−、発現調節dna配列および発現ベクタ− |
GB8702816D0 (en) | 1987-02-07 | 1987-03-11 | Al Sumidaie A M K | Obtaining retrovirus-containing fraction |
US5219740A (en) | 1987-02-13 | 1993-06-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy |
JP2795850B2 (ja) | 1987-03-23 | 1998-09-10 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | 酵母発現ベクター |
US4980289A (en) | 1987-04-27 | 1990-12-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Promoter deficient retroviral vector |
WO1989001973A2 (en) | 1987-09-02 | 1989-03-09 | Applied Biotechnology, Inc. | Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens |
DK463887D0 (da) | 1987-09-07 | 1987-09-07 | Novo Industri As | Gaerleader |
EP0378576B1 (en) | 1987-09-11 | 1995-01-18 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Transduced fibroblasts and uses therefor |
US5124246A (en) | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
US4929555A (en) | 1987-10-19 | 1990-05-29 | Phillips Petroleum Company | Pichia transformation |
CN1049686C (zh) | 1987-11-18 | 2000-02-23 | 希龙股份有限公司 | 非a和非b肝炎病毒的诊断及疫苗 |
JPH01144977A (ja) * | 1987-11-30 | 1989-06-07 | Agency Of Ind Science & Technol | 新規組換えプラスミドpTPGIF2 |
WO1989005349A1 (en) | 1987-12-09 | 1989-06-15 | The Australian National University | Method of combating viral infections |
CA1340772C (en) | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
US4973551A (en) | 1988-01-15 | 1990-11-27 | Merck & Co., Inc. | Vector for the expression of fusion proteins and protein immunogens |
US5591624A (en) | 1988-03-21 | 1997-01-07 | Chiron Viagene, Inc. | Retroviral packaging cell lines |
US5662896A (en) | 1988-03-21 | 1997-09-02 | Chiron Viagene, Inc. | Compositions and methods for cancer immunotherapy |
CN1038306A (zh) | 1988-03-21 | 1989-12-27 | 维吉恩公司 | 重组反转录病毒 |
US5206152A (en) | 1988-04-08 | 1993-04-27 | Arch Development Corporation | Cloning and expression of early growth regulatory protein genes |
US5422120A (en) | 1988-05-30 | 1995-06-06 | Depotech Corporation | Heterovesicular liposomes |
AP129A (en) | 1988-06-03 | 1991-04-17 | Smithkline Biologicals S A | Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells |
JP3082204B2 (ja) | 1988-09-01 | 2000-08-28 | ホワイトヘッド・インスティチュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | 両栄養性および環境栄養性宿主域を持つ組換え体レトロウイルス |
AU640118B2 (en) | 1988-12-19 | 1993-08-19 | De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur | Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine |
NL8803111A (nl) | 1988-12-19 | 1990-07-16 | Nederlanden Staat | Multivalent meningococcen klasse i buitenmembraaneiwit vaccin. |
US5217879A (en) | 1989-01-12 | 1993-06-08 | Washington University | Infectious Sindbis virus vectors |
JP2752788B2 (ja) | 1989-01-23 | 1998-05-18 | カイロン コーポレイション | 感染および過剰増殖障害の為の組換え療法 |
WO1990009441A1 (en) | 1989-02-01 | 1990-08-23 | The General Hospital Corporation | Herpes simplex virus type i expression vector |
JP3140757B2 (ja) | 1989-02-06 | 2001-03-05 | デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート | パッケージング欠陥hivプロウイルス、細胞系及びその使用 |
KR920701453A (ko) | 1989-03-17 | 1992-08-11 | 미리엄 디. 멕코나헤이 | 유전자발현의 외부조절 |
DE69034078T2 (de) | 1989-03-21 | 2004-04-01 | Vical, Inc., San Diego | Expression von exogenen Polynukleotidsequenzen in Wirbeltieren |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
HU212924B (en) | 1989-05-25 | 1996-12-30 | Chiron Corp | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
NL9021328A (nl) | 1989-08-15 | 1992-06-01 | Pasminco Australia Ltd | Werkwijze en inrichting voor de absorptie van zinkdamp in gesmolten lood. |
EP0845537A1 (en) | 1989-08-18 | 1998-06-03 | Chiron Corporation | Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells |
US5585362A (en) | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
US5166057A (en) | 1989-08-28 | 1992-11-24 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand rna virus expression-systems |
GB8919607D0 (en) | 1989-08-30 | 1989-10-11 | Wellcome Found | Novel entities for cancer therapy |
AU7007491A (en) | 1990-02-02 | 1991-08-08 | Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern | Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses |
ZA911974B (en) | 1990-03-21 | 1994-08-22 | Res Dev Foundation | Heterovesicular liposomes |
CA2039921A1 (en) | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Xandra O. Breakefield | Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication |
AU7906691A (en) | 1990-05-23 | 1991-12-10 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
US5149655A (en) | 1990-06-21 | 1992-09-22 | Agracetus, Inc. | Apparatus for genetic transformation |
CU22302A1 (es) * | 1990-09-07 | 1995-01-31 | Cigb | Secuencia nucleotidica codificante para una proteina de la membrana externa de neisseria meningitidis y uso de dicha proteina en preparados vacunales |
EP0467714A1 (en) | 1990-07-19 | 1992-01-22 | Merck & Co. Inc. | The class II protein of the outer membrane of neisseria meningitidis |
AU8412991A (en) | 1990-07-27 | 1992-03-02 | Chiron Corporation | Large comb-type branched polynucleotides |
ATE253114T1 (de) * | 1990-08-23 | 2003-11-15 | Univ North Carolina | Transferrin bindende proteine aus neisseria- gonorrhoeae und neisseria-meningitidis |
JPH06500923A (ja) | 1990-09-21 | 1994-01-27 | カイロン コーポレイション | パッケージング細胞 |
WO1992007945A1 (en) | 1990-10-30 | 1992-05-14 | Dana Farber Cancer Institute | Cell type specific alteration of levels of gene products in neural cells |
US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
SE9003978D0 (sv) | 1990-12-13 | 1990-12-13 | Henrik Garoff | Dna expressionssystem baserade paa ett virus replikon |
ATE190354T1 (de) | 1990-12-20 | 2000-03-15 | Arch Dev Corp The University O | Kontrolle der genexpression durch ionisierende strahlung |
AU1411492A (en) * | 1991-01-31 | 1992-09-07 | Washington University | Polypeptides and polynucleotides useful for the diagnosis and treatment of pathogenic neisseria |
EP0575553B1 (en) | 1991-03-14 | 1998-12-16 | Imclone Systems, Inc. | Recombinant hybrid porin epitopes |
IL101715A (en) | 1991-05-02 | 2005-06-19 | Amgen Inc | Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs |
JPH0515375A (ja) * | 1991-07-11 | 1993-01-26 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒト内因子をコードするdna配列 |
ATE237694T1 (de) | 1991-08-20 | 2003-05-15 | Us Gov Health & Human Serv | Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt |
FR2681786A1 (fr) | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires. |
NZ244306A (en) | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
IL103059A0 (en) | 1991-09-30 | 1993-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
WO1993010218A1 (en) | 1991-11-14 | 1993-05-27 | The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Vectors including foreign genes and negative selective markers |
GB9125623D0 (en) | 1991-12-02 | 1992-01-29 | Dynal As | Cell modification |
WO1993013302A1 (de) | 1991-12-23 | 1993-07-08 | Michael Zoche | Motor mit einer vorrichtung zur entölung |
EP0625049A4 (en) | 1992-01-23 | 1995-07-12 | Vical Inc | EX VIVO GENTRANSFER. |
WO1993015115A1 (en) * | 1992-01-24 | 1993-08-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | E. coli dna polymerase iii holoenzyme and subunits |
FR2688514A1 (fr) | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
EP0650370A4 (en) | 1992-06-08 | 1995-11-22 | Univ California | METHODS AND COMPOSITIONS TARGETED ON SPECIFIC TISSUES. |
EP0644946A4 (en) | 1992-06-10 | 1997-03-12 | Us Health | VECTOR PARTICLES RESISTANT TO HUMAN SERUM INACTIVATION. |
WO1993025685A1 (en) * | 1992-06-12 | 1993-12-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Cloning and characterization of the cell death genes ced-3 and ced-4 |
FR2692592B1 (fr) | 1992-06-19 | 1995-03-31 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de Neisseria meningitidis et procédés les exprimant. |
GB2269175A (en) | 1992-07-31 | 1994-02-02 | Imperial College | Retroviral vectors |
GB9216851D0 (en) | 1992-08-07 | 1992-09-23 | Univ Manitoba | Dna sequences of rat probasin gene |
AU692423B2 (en) | 1992-09-25 | 1998-06-11 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain |
WO1994008013A1 (en) * | 1992-10-07 | 1994-04-14 | State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of The Oregon Health Sciences University | Pilin variants and uses thereof |
ATE307212T1 (de) | 1992-11-18 | 2005-11-15 | Arch Dev Corp | Adenovirus-gelenkter gen-transfer zum herz-und glatten vaskulären muskel |
EP0905253A3 (en) | 1992-12-03 | 2000-11-02 | Genzyme Corporation | Adenoviral vector deleted of all E4-ORF except ORF6 |
US5478745A (en) | 1992-12-04 | 1995-12-26 | University Of Pittsburgh | Recombinant viral vector system |
US5348358A (en) | 1993-02-22 | 1994-09-20 | Selick David A | Contact lens insertion tool |
DE4311651A1 (de) | 1993-04-08 | 1994-10-13 | Boehringer Ingelheim Int | Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen |
JP3545403B2 (ja) | 1993-04-22 | 2004-07-21 | スカイファルマ インコーポレイテッド | 医薬化合物を被包しているシクロデキストリンリポソーム及びその使用法 |
DK0624376T3 (da) | 1993-05-13 | 2000-07-24 | American Cyanamid Co | Fremstilling og anvendelse af LOS-udtømte ydre membranproteiner af gram-negative cocci |
WO1994028157A1 (en) | 1993-05-26 | 1994-12-08 | The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Fusion proteins containing adeno-associated virus rep protein and bacterial protein |
FR2705686B1 (fr) | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
US6479055B1 (en) * | 1993-06-07 | 2002-11-12 | Trimeris, Inc. | Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission |
JP3532566B2 (ja) | 1993-06-24 | 2004-05-31 | エル. グラハム,フランク | 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター |
JP4190028B2 (ja) | 1993-07-13 | 2008-12-03 | アベンテイス・フアルマ・ソシエテ・アノニム | 欠陥組換えアデノウイルスベクター及び遺伝子治療での使用 |
US5439808A (en) | 1993-07-23 | 1995-08-08 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
WO1995004139A1 (en) | 1993-07-27 | 1995-02-09 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Modified dna virus vectors and uses therefor |
US5631236A (en) | 1993-08-26 | 1997-05-20 | Baylor College Of Medicine | Gene therapy for solid tumors, using a DNA sequence encoding HSV-Tk or VZV-Tk |
US5362865A (en) | 1993-09-02 | 1994-11-08 | Monsanto Company | Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences |
DE69430369T2 (de) | 1993-09-15 | 2002-10-17 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Rekombinanter alphavirus vektor |
FR2710536B1 (fr) | 1993-09-29 | 1995-12-22 | Transgene Sa | Usage anti-cancéreux d'un vecteur viral comportant un gène modulateur de la réponse immunitaire et/ou inflammatoire. |
EP0723460A4 (en) | 1993-10-01 | 1998-09-30 | Us Health | GENE THERAPY FOR THE NERVOUS SYSTEM |
ATE314482T1 (de) | 1993-10-25 | 2006-01-15 | Canji Inc | Rekombinante adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung |
US5693506A (en) | 1993-11-16 | 1997-12-02 | The Regents Of The University Of California | Process for protein production in plants |
FR2712603B1 (fr) | 1993-11-18 | 1996-02-09 | Centre Nat Rech Scient | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
US5550213A (en) * | 1993-12-27 | 1996-08-27 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Inhibitors of urokinase plasminogen activator |
JPH07241786A (ja) | 1994-03-08 | 1995-09-19 | Fanuc Ltd | 産業用ロボットの制御装置 |
US6780406B1 (en) | 1994-03-21 | 2004-08-24 | The Regents Of The University Of Michigan | Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation administering a thymidine kinase gene |
US7252989B1 (en) | 1994-04-04 | 2007-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus supervector system |
ATE173634T1 (de) | 1994-04-20 | 1998-12-15 | Us Army | Impfstoff gegen gram-negative bakterielle infektionen |
JPH10507061A (ja) | 1994-04-28 | 1998-07-14 | ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | アデノウイルス中にパッケージされたプラスミドdnaを用いる遺伝子送達ベクターおよびパッケージング細胞株 |
EP0772689B1 (en) | 1994-05-09 | 2007-12-19 | Oxford Biomedica (UK) Limited | Retroviral vectors having a reduced recombination rate |
FR2720408B1 (fr) | 1994-05-31 | 1996-08-14 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Fragments Tbp2 de Neisseria meningitidis. |
CA2192442C (en) | 1994-06-10 | 2007-09-25 | Imre Kovesdi | Complementary adenoviral vector systems and cell lines |
FR2722210B1 (fr) | 1994-07-08 | 1996-08-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouvelles streptogramines et procede de preparation de streptogramines par mutasynthese |
FR2723588B1 (fr) | 1994-08-12 | 1996-09-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Adenovirus comprenant un gene codant pour la glutathion peroxydase |
IL117483A (en) | 1995-03-17 | 2008-03-20 | Bernard Brodeur | MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K. |
US6265567B1 (en) * | 1995-04-07 | 2001-07-24 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Isolated FrpB nucleic acid molecule |
AU5552396A (en) | 1995-04-21 | 1996-11-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleotide sequence of the haemophilus influenzae rd genome, fragments thereof, and uses thereof |
AU5741996A (en) | 1995-05-22 | 1996-12-11 | Chiron Corporation | Position-specific integration of vector constructs into eukaryotic genomes mediated by a chimeric integrase protein |
WO1996040893A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Astra Aktiebolag | Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics |
FR2739624B1 (fr) | 1995-10-10 | 1997-12-05 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Nouvelle sous-unite tbp2 de neisseria meningitidis |
US6737248B2 (en) * | 1996-01-05 | 2004-05-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Staphylococcus aureus polynucleotides and sequences |
US6172192B1 (en) * | 1996-01-26 | 2001-01-09 | Innogenetics N.V. | Toxoplasma gondii antigen Tg20 |
KR19990082265A (ko) | 1996-02-01 | 1999-11-25 | 다니엘 제이. 압둔-나비 | 효모중에서 b군 나이세리아 멘인기티디스 외막(mb3)단백질을 발현시키는 방법 및 백신 |
US5753235A (en) | 1996-02-15 | 1998-05-19 | Heska Corporation | Recombinant canine herpesviruses |
CZ297698A3 (cs) * | 1996-03-29 | 1999-02-17 | Astra Aktiebolag | Sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence vztahující se k Helicobacter pylori a její vakcinační kompozice |
WO1997042966A1 (en) * | 1996-05-10 | 1997-11-20 | Xoma Corporation | Therapeutic uses of bpi protein products for human meningococcemia |
US6096529A (en) * | 1996-06-10 | 2000-08-01 | National Research Council Of Canada | Recombinant α-2,3-sialyltransferases and their uses |
FR2751000B1 (fr) * | 1996-07-12 | 1998-10-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques |
EP0818465A1 (en) | 1996-07-12 | 1998-01-14 | Institute of Molecular Biotechnology (IMB) Department of Genome Analysis | Genomic sequence of Rhizobium sp. NGR234 symbiotic plasmid |
WO1998017805A2 (en) * | 1996-10-24 | 1998-04-30 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, c/o Centers for Disease Control and Prevention, Technology Transfer Office | Invasion associated genes from neisseria meningitidis serogroup b |
EP0948625B1 (en) * | 1996-12-20 | 2011-01-26 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Uspa1 and uspa2 antigens of moraxella catarrhalis |
US5763589A (en) * | 1997-01-09 | 1998-06-09 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human membrane protein |
US6914131B1 (en) | 1998-10-09 | 2005-07-05 | Chiron S.R.L. | Neisserial antigens |
CA2308606A1 (en) * | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Chiron S.P.A. | Neisserial antigens |
GB9726398D0 (en) | 1997-12-12 | 1998-02-11 | Isis Innovation | Polypeptide and coding sequences |
DE69941567D1 (de) | 1998-01-14 | 2009-12-03 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Antigene aus neisseria meningitidis |
CN101293920B (zh) | 1998-05-01 | 2012-07-18 | 诺华疫苗和诊断公司 | 脑膜炎奈瑟球菌抗原和组合物 |
US20070026021A1 (en) | 1998-05-01 | 2007-02-01 | Chiron S.R.I. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
EP1144998A3 (en) | 1998-10-09 | 2002-08-07 | Chiron Corporation | Neisseria genomic sequences and methods of their use |
US6214566B1 (en) * | 1998-11-16 | 2001-04-10 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Method for detecting anti-squalene antibodies |
ATE527360T1 (de) * | 1998-12-08 | 2011-10-15 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Neue verbindungen abgeleitet von neisseria meningitidis |
GB9902084D0 (en) * | 1999-01-29 | 1999-03-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
EP2270169A3 (en) * | 1999-03-12 | 2011-06-15 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Neisseria meningitidis antigenic polypeptides, corresponding polynucleotides and protective antibodies |
WO2000066791A1 (en) | 1999-04-30 | 2000-11-09 | Chiron Corporation | Neisseria genomic sequences and methods of their use |
NZ530640A (en) * | 1999-04-30 | 2006-06-30 | Chiron S | Conserved neisserial antigens |
CA2929348A1 (en) | 1999-05-19 | 2000-11-30 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Combination neisserial compositions |
AU784203B2 (en) | 1999-10-29 | 2006-02-23 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Neisserial antigenic peptides |
RU2279889C2 (ru) | 2000-01-17 | 2006-07-20 | Чирон С.Р.Л. | ВАКЦИНА ВЕЗИКУЛ НАРУЖНЫХ МЕМБРАН (OMV), СОДЕРЖАЩАЯ БЕЛКИ НАРУЖНОЙ МЕБРАНЫ N.Meningitidis СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ГРУППЫ В |
PL216780B1 (pl) | 2000-01-25 | 2014-05-30 | Univ Queensland Of Santa Lucia | Wyizolowane białka zawierające konserwatywne obszary antygenu powierzchniowego NhhA z Neisseria meningitidis, białka fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego, wyizolowany kwas nukleinowy, konstrukt ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej, sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis oraz sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta oraz zastosowanie wyizolowanego białka, białka fuzyjnego i konstruktu ekspresyjnego |
ES2391153T3 (es) | 2000-02-28 | 2012-11-22 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Expresión heteróloga de proteínas de Neisseria |
WO2001085932A2 (en) | 2000-05-10 | 2001-11-15 | Aventis Pasteur Limited | Immunogenic polypeptides encoded by mage minigenes and uses thereof |
WO2003009869A1 (en) | 2001-07-26 | 2003-02-06 | Chiron Srl. | Vaccines comprising aluminium adjuvants and histidine |
GB0118249D0 (en) | 2001-07-26 | 2001-09-19 | Chiron Spa | Histidine vaccines |
DK2248822T3 (en) | 2001-07-27 | 2017-02-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | MENINGOCOKKER ADHESIONS |
GB0121591D0 (en) | 2001-09-06 | 2001-10-24 | Chiron Spa | Hybrid and tandem expression of neisserial proteins |
MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
EP1961427A3 (en) | 2002-08-02 | 2009-11-04 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Neisserial vaccine compositions comprising a combination of antigens |
US7785608B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
DE60335477D1 (de) | 2002-10-11 | 2011-02-03 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Polypeptidimpstoffe zum breiten schutz gegen hypervirulente meningokokken-linien |
GB0227346D0 (en) | 2002-11-22 | 2002-12-31 | Chiron Spa | 741 |
CA2512917A1 (en) | 2003-01-15 | 2004-08-05 | Wyeth Holdings Corporation | Methods for increasing neisseria protein expression |
EP2172213B1 (en) | 2003-01-30 | 2013-04-03 | Novartis AG | Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups |
WO2004094596A2 (en) | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Wyeth Holdings Corporation | Novel immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
PL1961426T3 (pl) | 2003-10-02 | 2012-03-30 | Gsk Vaccines S R L | Skojarzone szczepionki przeciwko zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych |
GB0409748D0 (en) | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Chiron Srl | Lactoferrin cleavage |
GB0419408D0 (en) | 2004-09-01 | 2004-10-06 | Chiron Srl | 741 chimeric polypeptides |
JP4993750B2 (ja) | 2005-01-27 | 2012-08-08 | チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド | 髄膜炎菌に起因する疾患に対する広域防御のための、gna1870を基にした小胞ワクチン |
GB0524066D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Chiron Srl | 741 ii |
TW200806315A (en) | 2006-04-26 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
BRPI0713904A2 (pt) * | 2006-06-29 | 2013-06-25 | Novartis Ag | polipeptÍdeos a partir de neisseria meningitidis |
AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
US20100150912A1 (en) | 2007-04-11 | 2010-06-17 | Novartis Ag | Blocking interaction between pathogen factors and factor h to inhibit hemorrhagic syndromes |
AU2008259423A1 (en) | 2007-06-04 | 2008-12-11 | Novartis Ag | Formulation of meningitis vaccines |
AU2009215364B2 (en) | 2008-02-21 | 2014-09-18 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Meningococcal fHBP polypeptides |
ES2557282T3 (es) | 2008-03-10 | 2016-01-25 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Proteínas quiméricas de unión al factor H (fHBP) que contienen un dominio B heterólogo, y métodos de uso |
CA2733943A1 (en) | 2008-09-03 | 2010-03-11 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Peptides presenting an epitope of an a domain of factor h binding protein and methods of use |
IT1394288B1 (it) | 2008-09-12 | 2012-06-06 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunogeni di proteine che legano il fattore h. |
GB0819633D0 (en) | 2008-10-25 | 2008-12-03 | Isis Innovation | Composition |
WO2010065473A2 (en) | 2008-12-01 | 2010-06-10 | Applied Materials, Inc. | Gas distribution blocker apparatus |
CA2756522C (en) | 2009-03-24 | 2018-06-26 | Novartis Ag | Adjuvanting meningococcal factor h binding protein |
AU2011300418B2 (en) | 2010-09-10 | 2016-05-12 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Meningococcus overexpressing NadA and/or NHBA and outer membrane vesicles derived therefrom |
-
1999
- 1999-04-30 CN CN2008100817214A patent/CN101293920B/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-30 CN CNB998081450A patent/CN1210305C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-30 US US09/674,546 patent/US7576176B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-30 NZ NZ508366A patent/NZ508366A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-04-30 EP EP10178535A patent/EP2261350A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 EP EP10179752A patent/EP2261357A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 EP EP10178517A patent/EP2261342A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 EP EP10178543A patent/EP2261354A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 EP EP99922752A patent/EP1093517B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 EP EP10178537A patent/EP2261351A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 PT PT80033731T patent/PT1944371E/pt unknown
- 1999-04-30 EP EP08003373.1A patent/EP1944371B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 EP EP10178542A patent/EP2261353A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 EP EP10178503A patent/EP2261338A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 NZ NZ527182A patent/NZ527182A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-04-30 NZ NZ541361A patent/NZ541361A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-04-30 EP EP05077865A patent/EP1645631B1/en not_active Revoked
- 1999-04-30 EP EP10178521A patent/EP2261344A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 EP EP10178510.3A patent/EP2261339B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 DE DE69937419T patent/DE69937419T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 AU AU39677/99A patent/AU761780B2/en not_active Ceased
- 1999-04-30 WO PCT/US1999/009346 patent/WO1999057280A2/en active IP Right Grant
- 1999-04-30 EP EP10178530A patent/EP2261347A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 DE DE69938302T patent/DE69938302T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 NZ NZ532665A patent/NZ532665A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-04-30 PT PT05077865T patent/PT1645631E/pt unknown
- 1999-04-30 EP EP10178532A patent/EP2261348A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 EP EP10178533A patent/EP2261349A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 ES ES08003373.1T patent/ES2537575T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 JP JP2000547235A patent/JP5102414B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-30 MX MX2014014862A patent/MX343752B/es unknown
- 1999-04-30 AT AT99922752T patent/ATE388230T1/de active
- 1999-04-30 MX MX2013012066A patent/MX339406B/es unknown
- 1999-04-30 CA CA002650642A patent/CA2650642A1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 DK DK05077865T patent/DK1645631T3/da active
- 1999-04-30 PT PT99922752T patent/PT1093517E/pt unknown
- 1999-04-30 EP EP10178529A patent/EP2261346A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 EP EP10178520A patent/EP2261343A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 ES ES05077865T patent/ES2294629T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 EP EP10178516A patent/EP2261341A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 MX MXPA00010722A patent/MXPA00010722A/es not_active IP Right Cessation
- 1999-04-30 EP EP10178538A patent/EP2261352A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 BR BR9910089-4A patent/BR9910089A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-04-30 EP EP10178522A patent/EP2261345A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 AT AT05077865T patent/ATE376591T1/de active
- 1999-04-30 CN CNB2005100728077A patent/CN100379757C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-30 EP EP10178545A patent/EP2261355A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 EP EP10179068A patent/EP2261356A3/en not_active Withdrawn
- 1999-04-30 CA CA2330838A patent/CA2330838C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 DK DK99922752T patent/DK1093517T3/da active
- 1999-04-30 EP EP10178513.7A patent/EP2261340B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 MX MX2013011115A patent/MX343744B/es unknown
- 1999-04-30 ES ES99922752T patent/ES2304065T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-10-03 HK HK06110923A patent/HK1090382A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-01-11 US US12/013,047 patent/US7988979B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-17 CY CY20081100066T patent/CY1109649T1/el unknown
- 2008-05-30 CY CY20081100564T patent/CY1108083T1/el unknown
-
2009
- 2009-05-25 JP JP2009125889A patent/JP2009183306A/ja not_active Withdrawn
-
2010
- 2010-02-16 JP JP2010031866A patent/JP2010166916A/ja not_active Withdrawn
-
2011
- 2011-03-23 US US13/070,448 patent/US9139621B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-01-26 US US13/359,471 patent/US8524251B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-01-26 US US13/359,459 patent/US20120156236A1/en not_active Abandoned
- 2012-01-26 US US13/359,442 patent/US9249196B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-06-21 JP JP2012140208A patent/JP2012191946A/ja not_active Withdrawn
- 2012-06-21 JP JP2012140207A patent/JP2012191945A/ja active Pending
-
2013
- 2013-07-30 JP JP2013157835A patent/JP6025675B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2013-07-30 JP JP2013157834A patent/JP6025674B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-08-01 US US14/450,075 patent/US9266929B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2014-08-01 US US14/450,082 patent/US9249198B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-07-21 US US14/804,756 patent/US20160030545A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-08-05 JP JP2016154472A patent/JP2016222709A/ja not_active Withdrawn
- 2016-09-30 JP JP2016192774A patent/JP2017012195A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2294629T3 (es) | Antigenos de neisseria y composiciones. | |
ES2333071T3 (es) | Antigenos de neisseria meningitidis. | |
ES2323845T3 (es) | Secuencias genomicas de neisseria y procedimientos de uso. | |
ES2522667T3 (es) | Antígenos Neisseriales conservados | |
EP1559795A2 (en) | Neisseria genomic sequences and methods of their use | |
US20070026021A1 (en) | Neisseria meningitidis antigens and compositions | |
AU2012203235B2 (en) | Neisseria meningitidis antigens and compositions | |
AU2006202355B2 (en) | Neisseria meningitidis antigens and compositions |