DE69937419T2

DE69937419T2 - Neisseria Meningitidis Antigene und Zusammenstellungen

Info

Publication number: DE69937419T2
Application number: DE69937419T
Authority: DE
Inventors: Claire Rockville Fraser; Cesira Chiron Srl Galeotti; Guido Chiron Srl Grandi; Erin Rockville Hickey; Vega Chiron SRL Masignani; Mariarosa Chiron SRL Mora; Jeremy Rockville Petersen; Mariagrazia Chiron SRL Pizza; Rino Chiron SRL Rappuoli; Giulio Chiron Srl Ratti; Enzo Chiron SRL Scalato; Maria Chiron SRL Scarselli; Herve Rockville Tettelin; J. Craig Rockville Venter
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; Institute for Genomic Research
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; J Craig Venter Institute Inc
Priority date: 1998-05-01
Filing date: 1999-04-30
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2019-05-01
Also published as: EP2261338A3; DE69938302T2; HK1090382A1; DK1645631T3; EP2261339B1; NZ527182A; AU761780B2; EP2261348A3; CN101293920A; WO1999057280A9; EP2261354A3; EP2261356A3; JP2012191945A; CA2330838C; JP6025674B2; ATE388230T1; EP2261350A2; US20120164166A1; CN101293920B; EP2261340A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Antigene der Bakterienarten: Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae.
HINTERGRUND
Neisseria meningitidis ist ein nicht bewegliches Gram-negatives Diplococcus-Pathogen des Menschen. Es besiedelt den Rachenraum, verursacht Meningitis und gelegentlich Septikämie ohne Meningitis. Es ist eng mit N. gonorrhoeae verwandt, obgleich eine Eigenschaft, die Meningococcus deutlich von Gonococcus unterscheidet, das Vorhandensein einer Polysaccharid-Kapsel ist, die bei allen pathogenen Meningokokken vorliegt.
N. meningitidis verursacht sowohl endemische als auch epidemische Krankheit. In den Vereinigten Staaten beträgt die Befallsrate 0,6–1 pro 100.000 Personen pro Jahr, und sie kann während der Ausbrüche wesentlich höher sein (vgl. Lieberman et al. (1996) Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neisseria meningitidis Oligosaccharide Protein Conjugate Vaccine in Young Children. JAMA 275(19):1499–1503; Schuchat et al., (1997) Bakterial Meningitis in the United States in 1995. N. Engl. J. Med. 337(14):970–976). In Entwicklungsländern sind die endemischen Krankheitsraten wesentlich höher, und während Epedemien kann die Häufigkeitsrate 500 Fälle pro 100.000 Personen pro Jahr erreichen. Die Sterblichkeit ist extrem hoch, 10–20% in den Vereinigten Staaten und wesentlich höher in Entwicklungsländern. Nach Einführung des Konjugat-Impfstoffes gegen Haemophilus influenzae ist N. meningitidis in den Vereinigten Staaten der größte Verursacher bakterieller Meningitis in allen Altersstufen (Schuchat et al., (1997), vorstehend).
Basierend auf dem Kapsel-Polysaccharid des Organismus sind 12 Serogruppen von N. meningitidis identifiziert worden. Gruppe A ist das Pathogen, das am häufigsten an der epidemischen Krankheit in der afrikanischen Sub-Sahara-Region beteiligt ist. Die Serogruppen B und C sind für eine große Mehrheit der Fälle in den Vereinigten Staaten und in den meisten entwickelten Ländern verantwortlich. Für die übrigen Fälle in den Vereinigten Staaten und den entwickelten Ländern sind die Serogruppen W135 und Y verantwortlich. Der zur Zeit verwendete Impfstoff gegen Meningokokken ist ein tetravalenter Polysaccharid-Impfstoff, der aus den Serogruppen A, C, Y und W135 zusammengesetzt ist. Obgleich er bei Jugendlichen und Erwachsenen wirksam ist, ruft er nur eine geringe Immunantwort und einen kurzen Schutzzeitraum hervor und kann nicht bei Kindern verwendet werden [z. B. Morbidity and Mortality weekly report, Bd. 46, Nr. RR-5 (1997)]. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass Polysaccharide von T-Zellen unabhängige Antigene sind, welche eine schwache Immunantwort hervorrufen, die durch wiederholte Immunisierung nicht verstärkt werden kann. Nach dem Erfolg der Impfung gegen H. influenzae sind Konjugat-Impfstoffe gegen die Serogruppen A und C entwickelt worden und befinden sich im Endstadium der klinischen Erprobung (Zollinger WD „New and Improved Vaccines Against Meningococcal Disease". In: New Generation Vaccines, vorstehend, S. 469–488; Lieberman et al., (1996), vorstehend; Costantino et al., (1992) Development and Phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A und C. Vaccine 10:691–698).
Meningococcus B (menB) bleibt jedoch ein Problem. Dieser Serotyp ist zur Zeit für etwa 50% aller Meningitis-Erkrankungen in den Vereinigten Staaten, Europa und Südamerika verantwortlich. Der Polysaccharid-Ansatz kann nicht verwendet werden, weil das menB-Polysaccharid der Kapsel ein Polymer von α(2-8)-verbundenen N-Acetylneuraminsäure ist, die auch im Gewebe von Säugern vorkommt. Dies hat Toleranz gegenüber dem Antigen zur Folge; tatsächlich würde eine hervorgerufene Immunantwort gegen sich selbst gerichtet sein und daher unerwünscht. Um das Hervorrufen einer Autoimmunität zu vermeiden und eine schützende Immunantwort zu induzieren, ist das Polysaccharid der Kapsel zum Beispiel chemisch verändert worden, indem die N-Acetyl-Gruppen durch N-Propionyl-Gruppen ersetzt worden sind, welche die spezifische Antigenität unverändert lassen (Romero & Outschoom (1994) Current Status of Meningococcal group B vaccine candidates: capsular or noncapsular? Clin. Microbiol. Rev. 7(4):559–575).
In alternativen Ansätzen für menB-Impfstoffe sind komplexe Gemische von äußeren Membranproteinen (OMPs) verwendet worden, die entweder die OMPs allein oder in Porinen angereicherte OMPs enthielten oder bei denen die OMPs der Klasse 4 deletiert worden sind, von denen man annimmt, dass sie Antikörper induzieren, die die bakterizide Aktivität blockieren. Dieser Ansatz erzeugt Impfstoffe, die nicht gut charakterisiert sind. Sie sind in der Lage, gegen den homologen Stamm zu schützen, sind aber im Großen und Ganzen nicht wirksam, wenn zahlreiche antigene Varianten der äußeren Membranproteine vorliegen. Um die antigene Variabilität zu überwinden, sind multivalente Impfstoffe entwickelt worden, die bis zu neun verschiedene Porine enthalten (z. B. Poolman JT, (1992) Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis. 4:13–28). Zusätzliche Proteine, die in den Impfstoffen mit äußeren Membranen verwendet worden sind, waren die opa- und opc-Proteine, keiner dieser Ansätze war jedoch in der Lage, die antigene Variabilität zu überwinden (z. B. Ala'Aldeen & Borriello, (1996) The meningococcal transferrin-binding Proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains. Vaccine 14(1):49–53).
Für Gene und Proteine von Meningokokken und Gonokokken ist eine gewisse Menge an Sequenzdaten verfügbar (z. B. EP-A-0467714 , WO96/29412 ), sie sind jedoch in keiner Weise vollständig. Dempsey et al., (1995), J. Bacteriol. 177:6390–400, offenbarten eine physikalische Karte für das Chromosom eines N. meningitidis-Stammes der Serogruppe A, und Moxon (1997), Lancet 350:1240–44, berichtete, dass die Genom-Sequenzen verschiedener Pathogene, einschließlich N. meningitidis, bestimmt werden. Die Bereitstellung weiterer Sequenzen könnte eine Möglichkeit liefern, sekretierte oder an der Oberfläche exponierte Proteine zu identifizieren, die die vermutlichen Ziele für das Immunsystem sind und keine antigene Variabilität aufweisen. Einige der identifizierten Proteine könnten zum Beispiel Bestandteile von wirksamen Impfstoffen gegen Meningococcus B, einige könnten Bestandteile von Impfstoffen gegen alle meningokokkalen Serotypen sein, und andere könnten Bestandteile von Impfstoffen gegen alle pathogenen Neisseriae, einschließlich Neisseria meningitidis oder Neisseria gonorrhoeae, sein. Jene für N. meningitidis oder N. gonorrhoeae spezifischen Sequenzen, die in höherem Maße konserviert sind, sind weitere bevorzugte Sequenzen.
Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, DNA-Sequenzen von Neisseria zu liefern, die Proteine codieren, welche antigene oder immunogene Wirkung aufweisen.
DIE ERFINDUNG
Die Erfindung liefert Proteine, die die Aminosäuresequenzen von N. meningitidis und die Aminosäuresequenzen von N. gonorrhoeae umfassen, die in den Beispielen offenbart werden.
Sie liefert auch Proteine, die Sequenz-Homologa (d. h jene, die Sequenz-Identität aufweisen) zu den Aminosäuresequenzen von N. meningitidis, die in den Beispielen offenbart werden, umfassen, und die Schutz vor Krankheit durch Neisseria-Bakterien bewirken. In Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz ist der Grad an Homologie (Sequenz-Identität) bevorzugt höher als 50% (z. B. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder höher). Diese Proteine umschließen mutierte und allele Varianten der in den Beispielen offenbarten Sequenzen. Typischerweise wird 50%ige oder höhere Identität zwischen zwei Proteinen als ein Anzeichen für funktionale Äquivalenz angesehen. Identität zwischen Proteinen wird bevorzugt durch den Such-Algorithmus nach Homologien von Smith-Waterman bestimmt, wie in dem MPSRCH-Programm (Oxford Molecular) verwendet, wobei eine Suche nach affinen Lücken mit den Parametern: Lückenstrafe 12, Lücken-Extensionsstrafe 1 verwendet wird.
Die Erfindung liefert darüber hinaus Proteine, umfassend Fragmente der Aminosäuresequenzen von N. meningitidis und der Aminosäuresequenzen von N. gonorrhoeae, die in den Beispielen offenbart werden. Die Fragmente sollten mindestens n aufeinanderfolgende Aminosäuren aus den Sequenzen umfassen und n ist in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz 8 oder größer (z. B. 10, 12, 14, 16, 18, 20 oder größer). Die Fragmente umfassen ein Epitop aus der Sequenz.
Die Proteine der Erfindung können natürlich mit verschiedenen Mitteln (z. B. rekombinanter Expression, Reinigung aus Zellkultur, chemischer Synthese etc.) und auf verschiedene Weisen (z. B. nativ, Fusionen etc.) hergestellt werden. Sie werden bevorzugt in im Wesentlichen reiner oder isolierter Form hergestellt (d. h. im Wesentlichen frei von anderen Wirtszell-Proteinen von N. meningitidis und N. gonorrhoeae).
Im Einklang mit einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung Antikörper, die an diese Aminosäuresequenzen binden. Diese können polyclonal oder monoclonal sein und können auf jede geeignete Weise hergestellt werden.
Im Einklang mit einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung Nucleinsäuren, die die Nucleotidsequenzen von N. meningitidis und die Nukleotidsequenzen von N. gonorrhoeae umfassen und die in den Beispielen offenbart werden.
Im Einklang mit einem weiteren Aspekt werden Nucleinsäuren geliefert, die eine Sequenz-Identität von mehr als 50% (z. B. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder mehr) zu den hierin gegebenen Sequenzen aufweisen. Sequenz-Identität wird, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Nucleinsäure, die Fragmente dieser Sequenzen umfasst, wird ebenfalls geliefert. Diese sollten n aufeinanderfolgende Nucleotide aus den Sequenzen von N. meningitidis oder den Sequenzen von N. gonorrhoeae umfassen, und n ist in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz 12 oder größer (z. B. 20, 25, 30, 35, 40 oder größer).
Im Einklang mit einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung Nucleinsäure, die Proteine und Proteinfragmente der Erfindung codiert.
Es sollte auch beachtet werden, dass die Erfindung Nucleinsäure liefert, die Sequenzen umfasst, welche komplementär zu jenen vorstehend beschriebenen sind (z. B. für Antisense- oder Sonden-Zwecke).
Nucleinsäure im Einklang mit der Erfindung kann natürlich auf viele Weisen hergestellt werden (z. B. durch chemische Synthese, teilweise oder im Ganzen, aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken, aus dem Organismus selbst usw.) und kann verschiedene Formen haben (z. B. einsträngig, doppelsträngig, Vektoren, Sonden usw.).
Zusätzlich umschließt der Ausdruck "Nucleinsäure" DNA und RNA und auch ihre Analoga wie etwa jene, die modifizierte Rückgrate enthalten, und auch Protein-Nukleinsäuren (PNA) usw.
Im Einklang mit einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung Vektoren, die Nucleotidsequenzen der Erfindung umfassen (z. B. Expressionsvektoren), und Wirtszellen, die mit solchen Vektoren transformiert worden sind.
Im Einklang mit einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung Zusammensetzungen, die Protein, Antikörper und/oder Nucleinsäure im Einklang mit der Erfindung umfassen. Diese Zusammensetzungen können zum Beispiel als Impfstoffe oder als diagnostische Reagenzien oder als immunogene Zusammensetzungen geeignet sein.
Die Erfindung liefert auch Nucleinsäure, Protein oder Antikörper im Einklang mit der Erfindung zur Verwendung als Arzneimittel (z. B. als Impfstoffe) oder als diagnostische Reagenzien. Sie liefert auch die Verwendung von Nucleinsäure, Protein oder Antikörper im Einklang mit der Erfindung für die Herstellung (i) eines Arzneimittels zur Verhinderung einer Infektion durch Neisseria-Bakterien, (ii) eines diagnostischen Reagenzes für den Nachweis der Anwesenheit von Neisseria-Bakterien oder von Antikörpern, die gegen Neisseria-Bakterien gebildet worden sind, oder (iii) zur Bildung von Antikörpern. Die genannten Neisseria-Bakterien können jeder beliebigen Art oder jedem beliebigen Stamm angehören (wie etwa N. gonorrhoeae), sind aber bevorzugt N. meningitidis, besonders Serogrupppe B oder Serogruppe C.
Ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten kann die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an Nucleinsäure, Protein und/oder Antikörper im Einklang mit der Erfindung an den Patienten umfassen.
Ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen der Erfindung wird geliefert, welches den Schritt der Kultivierung einer Wirtszelle im Einklang mit der Erfindung unter Bedingungen umfasst, die die Expression des Proteins induzieren.
Eine Zusammenfassung der Standardtechniken und -Verfahren, die verwendet werden können, um die Erfindung durchzuführen (z. B. um die offenbarten Sequenzen zur Impfung oder für diagnostische Zwecke zu verwenden), ist als Anhang an die Beschreibung angefügt. In der Zusammenfassung werden Beispiele gegeben, die verwendet werden können.
Nach dieser allgemeinen Beschreibung der Erfindung wird diese durch die Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele, die zur Erläuterung dienen sollen, besser verstanden werden.
Methodologie – Zusammenfassung von Standardverfahren und -Techniken
Allgemein
Diese Erfindung liefert Nucleotidsequenzen von Neisseria meningitidis menB und Aminosäuresequenzen, die dadurch codiert sind. Mit diesen offenbarten Sequenzen können Tests mit Nucleinsäure-Sonden und Expressionskassetten und Vektoren hergestellt werden. Die Expressionsvektoren können in Wirtszellen transformiert werden, um Proteine zu produzieren. Die gereinigten oder isolierten Polypeptide (die auch chemisch synthetisiert werden können) können verwendet werden, um Antikörper herzustellen, mit denen menB-Proteine nachgewiesen werden können. Auch die Wirtszellen oder Extrakte können für biologische Untersuchungen verwendet werden, um Agonisten oder Antagonisten zu isolieren. Zusätzlich kann man mit diesen Sequenzen Durchmusterungen durchführen, um offene Leserahmen zu identifizieren und um Aminosäuresequenzen zu identifizieren. Die Proteine können auch in immunogenen Zusammensetzungen, antigenen Zusammensetzungen und als Bestandteile von Impfstoffen verwendet werden.
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung wird, soweit nicht anders angezeigt, herkömmliche Techniken aus Molekularbiologie, Mikrobiologie, Verfahren mit rekombinanter DNA und herkömmliche Techniken aus Immunologie verwenden, die zum Fachwissen der jeweiligen Gebiete gehören. Solche Techniken werden in der Literatur umfassend erklärt, z. B. Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Zweite Auflage (1989); DNA Cloning, Band I und ii (D. N. Glover, Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg., 1984); Transcription und Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, Hrsg., 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); die Serie Methods in Enzymology (Academic Press. Inc.), besonders die Bände 154 & 155; Gene Transfer Vektors for Mammalian Cells (J. H. Miller und M. P. Calos, Hrsg., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer und Walker, Hrsg. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purificafion: Principles and Practice, Zweite Auflage (Springer-Verlag, N. Y.), und Handbook of Experimental Immunology, Bände I–IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell, Hrsg., 1986).
In dieser Beschreibung werden Standard-Abkürzungen für Nucleotide und Aminosäuren verwendet.
Alle Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, die hierin zitiert werden, sind vollständig durch Bezugnahme eingeschlossen.
Expressionssysteme
Die Nucleotidsequenzen von Neisseria-menB können mit einer Reihe von verschiedenen Expressionssystemen exprimiert werden; zum Beispiel jenen, die bei Säugerzellen, Pflanzenzellen, Bakuloviren, Bakterien und Hefe verwendet werden.
i. Säuger-Systeme
Säuger-Expressionssysteme sind auf dem Fachgebiet bekannt. Ein Säuger-Promotor ist jede beliebige DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Säuger-RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärts gerichtete (3') Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. eines Struktur-Gens) in mRNA einzuleiten. Ein Promotor wird eine Region zur Einleitung der Transkription, die gewöhnlich proximal des 5'-Endes der Codierungssequenz liegt, und eine TATA-Box, die gewöhnlich 25–30 Basenpaare (bp) stromaufwärts der Stelle zur Einleitung der Transkription liegt, besitzen. Die TATA-Box soll die RNA-Polymerase II steuern, so dass sie die RNA-Synthese an der korrekten Stelle beginnt. Ein Säuger-Promotor wird auch ein stromaufwärts gelegenes Promotor-Element enthalten, das gewöhnlich innerhalb von 100 bis 200 bp stromaufwärts der TATA-Box liegt. Ein stromaufwärts gelegenes Promotor-Element bestimmt die Rate, mit der die Transkription eingeleitet wird, und kann in jeder Richtung agieren (Sambrook et al. (1989) 'Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells.' In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl.).
Säuger-Virus-Gene werden oft mit hohen Raten exprimiert und haben einen weiten Bereich an Wirtszellen; daher liefern Sequenzen, die Säuger-Virus-Gene codieren, besonders nützliche Promotor-Sequenzen. Beispiele schließen den frühen SV40-Promotor, den LTR-Promotor des Brusttumor-Virus der Maus, den späten Adenovirus-Hauptpromotor (Ad MLP) und den Promotor des Herpes simplex-Virus ein. Zusätzlich liefern auch Sequenzen, die von nicht-viralen Genen stammen, wie etwa vom murinen Metallothionein-Gen, nützliche Promotor-Sequenzen. Die Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) erfolgen. In Abhängigkeit von dem ausgewählten Promotor können viele Promotoren unter Verwendung bekannter Substrate induzierbar sein, wie etwa die Verwendung des Promotors des Brusttumor-Virus der Maus (MMTV) mit dem auf Glucocorticoid ansprechenden Element (GRE), welches durch Glucocorticoid in transformierten Zellen, die auf das Hormon ansprechen, induziert wird (vgl. zum Beispiel US-Patent Nr. 5,783,681 ).
Die Anwesenheit eines Enhancer-Elementes (Enhancer), kombiniert mit den vorstehend beschriebenen Promotor-Elementen, wird die Expressionsspiegel gewöhnlich erhöhen. Ein Enhancer ist eine regulierende DNA-Sequenz, die die Transkription bis auf das 1000-fache stimulieren kann, wenn sie mit homologen oder heterologen Promotoren verbunden ist, wobei die Synthese an der normalen RNA-Startstelle beginnt. Enhancer sind auch aktiv, wenn sie stromaufwärts oder stromabwärts der Stelle zur Einleitung der Transkription entweder in normaler oder umgekehrter Richtung oder in einer Entfernung von mehr als 1000 Nucleotiden vom Promotor liegen (Maniatis et al., (1987) Science 30 236:1237; Alberts et al., (1989) Molecular Biology of the Cell, 2. Aufl.). Enhancer-Elemente, die von Viren stammen, können besonders nützlich sein, weil sie gewöhnlich einen weiteren Bereich an Wirten haben. Beispiele umschließen den frühen SV40-Gen-Enhancer (Dijkema et al., (1985) EMBO J. 4:761) und die Enhancer/Promotoren, die von der langen terminalen Wiederholungssequenz (LTR) des Rous-Sarkom-Virus (Gorman et al., (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777) und vom Cytomegalievirus des Menschen (Boshart et al., (1985) Cell 41:521) stammen. Zusätzlich sind einige Enhancer regulierbar und werden nur in Anwesenheit eines induzierenden Agens wie etwa eines Hormons oder Metall-Ions aktiv (Sassone-Corsi und Borelli, (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al., (1987) Science 236:1237).
Ein DNA-Molekül kann in Säugerzellen intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotor-Sequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden sein, in diesem Fall wird die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins stets ein Methionin sein, das durch das ATG-Startcodon codiert ist. Falls gewünscht, kann der N-Terminus durch in-vitro-Inkubation mit Cyanogenbromid vom Protein abgespalten werden.
Alternativ können auch fremde Proteine von der Zelle in das Kulturmedium sekretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leader-Sequenz-Fragment umfasst, welches die Sekretion des fremden Proteins in Säugerzellen ermöglicht. Bevorzugt werden Prozessierungsstellen zwischen dem Leader-Fragment und dem fremden Gen codiert, das entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leader-Sequenz-Fragment codiert gewöhnlich ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren umfasst, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Die dreiteilige Leader-Sequenz des Adenovirus ist ein Beispiel für eine Leader-Sequenz, die die Sekretion eines fremden Proteins in Säugerzellen bewirkt.
Gewöhnlich sind die Sequenzen zur Beendung der Transkription und zur Polyadenylierung, die von Säugerzellen erkannt werden, regulierende Regionen, die 3'-wärts des Translations-Stoppcodons liegen und daher die codierende Sequenz zusammen mit den Promotor-Elementen flankieren. Der 3'-Terminus der reifen mRNA wird durch stellenspezifische posttranskriptionale Spaltung und Polyadenylierung gebildet (Bimstiel et al., (1985) Cell 41:349; Proudfoot und Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and splicing (Hrsg. B. D. Hames und D. M. Glover); Proudfoot, (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105). Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid, das durch die DNA codiert wird, translatiert werden kann. Beispiele für Terminations-/Polyadenylierungssignale für die Transkription umschließen jene, die von SV40 stammen (Sambrook et al., (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
Gewöhnlich werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und eine Sequenz zur Beendung der Transkription umschließen, in Expressionskonstruktionen zusammengefügt. Enhancer, Introns mit funktionalen Spleiß-Donor- und -Akzeptor-Stellen und Leader-Sequenzen können ebenfalls in ein Expressionskonstruktion eingeschlossen werden, falls gewünscht. Expressionskonstruktionen werden oft in einem Replikon aufrechterhalten, wie etwa einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmiden), das zu einem stabilen Verbleib in einer Wirtszelle wie etwa Säugerzellen oder Bakterien in der Lage ist. Säuger-Replikationssysteme umschließen jene, die von tierischen Viren stammen und die trans agierende Faktoren benötigen, um sich zu replizieren. Zum Beispiel replizieren sich Plasmide, die die Replikationssysteme von Papova-Viren enthalten, wie etwa SV40 (Gluzman, (1981) Cell 23:175) oder das Polyom-Virus, in Anwesenheit des geeigneten viralen T-Antigens auf eine extrem hohe Anzahl der Kopien. Zusätzlich umschließen Beispiele für Säuger-Replikons jene, die vom Papillom-Virus des Rindes und vom Epstein-Barr-Virus abstammen. Zusätzlich kann das Replikon zwei Replikationssysteme besitzen, wodurch ermöglicht wird, dass es zum Beispiel zur Expression in Säugerzellen und zur Clonierung und Amplifizierung in einem prokaryontischen Wirtsorganismus gehalten wird. Beispiele für solche Säuger-Bakterien-Pendelvektoren umschließen pMT2 (Kaufman et al., (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946) und pHEBO (Shimizu et al., (1986), Mol. Cell. Biol. 6:1074).
Das verwendete Transformationsverfahren ist von dem Wirtsorganismus abhängig, der transformiert werden soll. Verfahren zur Einführung von heterologen Polynucleotiden in Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt und umschließen Dextran-vermittelte Transfizierung, Calciumphosphat-Fällung, Polybren-vermittelte Transfizierung, Protoplastenfusion, Elektroporation, Einschluss von Polynucleotid(en) in Liposomen und direkte Mikroinjektion der DNA in die Kerne.
Säuger-Zelllinen, die als Wirtszellen zur Expression verwendet werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt und umschließen viele immortalisierte Zelllinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) zur Verfügung gestellt werden, einschließlich, aber nicht hierauf beschränkt, Quarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), HeLa-Zellen, Nierenzellen von Baby-Hamstern (BHK), Nierenzellen von Affen (COS), Karzinomzellen aus Lebergewebe des Menschen (z. B. Hep G2) und einer Reihe anderer Zelllinien.
ii. Expressionssysteme mit Pflanzenzellen
Es gibt viele auf dem Fachgebiet bekannte genetische Expressionssysteme mit Pflanzenzellkulturen und ganzen Pflanzen. Beispielhafte genetische Expressionssysteme mit Pflanzenzellen umschließen solche, die in Patenten beschrieben worden sind, wie etwa US-Patent Nr. 5,693,506 ; US-Patent Nr. 5,659,122 ; und US-Patent Nr. 5,608,143 . Zusätzliche Beispiele für genetische Expression in Planzenzellkultur sind von Zenk, Phytochemistry 30:3861–3863 (1991), beschrieben worden. Beschreibungen von pflanzlichen Protein-Signalpeptiden können zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Literaturangaben bei Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33–40 (1987); Chandler et al., Plant Molecular Biology 3:407–418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731–3738 (1985); Rothstein et al., Gene 55:353–356 (1987); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515–2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3–14 (1989); Yu et al., Gene 122:247–253 (1992) gefunden werden. Eine Beschreibung der Regulierung von pflanzlicher Gen-Expression durch das Phytohormon Gibberellinsäure und sekretierte Enzyme, die durch Gibberellinsäure induziert werden, kann bei R. L. Jones und J. MacMillin, Gibberellins: in: Advanced Plant Physiology, Malcolm B. Wilkins, Hrsg., 198 4, Pitman Publishing Limited, London, S. 21–52 gefunden werden. Literaturangaben, die andere durch den Stoffwechsel regulierte Gene beschreiben, sind: Sheen, Plant Cell, 2:1027,–1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447–3452 (1990); Benkel und Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1337–1339 (1987).
Typischerweise wird eine gewünschte Polynucleotidsequenz unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken in eine Expressionskassette inseriert, welche genetische Regulationselemente umschließt, die für ihre Funktion in Pflanzen entworfen worden sind. Die Expressionskassette wird zusammen mit begleitenden Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts der Expressionskassette, die für Expression in einem pflanzlichen Wirtsorganismus geeignet sind, in einen gewünschten Expressionsvektor inseriert. Die begleitenden Sequenzen werden plasmidischen oder viralen Ursprungs sein und weisen die notwendigen Vektor-Eigenschaften auf, um den Vektoren zu ermöglichen, DNA von einem ursprünglichen Wirtsorganismus zur Clonierung wie etwa Bakterien auf den gewünschten pflanzlichen Wirtsorganismus zu übertragen. Die grundlegende bakteriell-pflanzliche Vektorkonstruktion wird bevorzugt einen prokaryontischen Replikationsursprung mit einem breiten Wirtsbereich, eine prokaryontische selektierbare Markierung und, für die Transformationen von Agrobakterium, T-DNA-Sequenzen für eine durch Agrobakterium vermittelte Übertragung auf Pflanzenchromosomen verwenden. Wo das heterologe Gen einem Nachweis nicht direkt zugänglich ist, wird die Konstruktion bevorzugt auch ein selektierbares Markierungsgen haben, das zur Bestimmung, ob eine Pflanzenzelle transformiert worden ist, geeignet ist. Eine allgemeine Übersicht über geeignete Markierungen, zum Beispiel für Mitglieder aus der Familie der Gräser, kann man bei Wilmink und Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr. 11(2):165–185, finden.
Sequenzen, die für eine Zulassung der Integration der heterologen Sequenz in das pflanzliche Genom geeignet sind, werden ebenfalls empfohlen. Diese können für die homologe Rekombination sowohl Transposon-Sequenzen und dergleichen als auch Ti-Sequenzen, die Insertion einer heterologen Expressionskassette in ein pflanzliches Genom nach dem Zufallsprinzip erlauben, einschließen. Geeignete prokaryontische selektierbare Markierungen umschließen Resistenz gegenüber Antibiotika wie etwa Ampicillin oder Tetracyclin. Andere DNA-Sequenzen, die weitere Funktionen codieren, können ebenfalls in dem Vektor vorliegen, was auf dem Fachgebiet bekannt ist.
Die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können für die Expression der interessierenden Proteine (des interessierenden Proteins) in eine Expressionskassette eingeschlossen sein. Gewöhnlich wird nur eine Expressionskassette vorliegen, obwohl zwei oder mehr vorstellbar sind. Die rekombinante Expressionskassette wird zusätzlich zu der das heterologe Protein codierenden Sequenz die nachstehenden Elemente enthalten: eine Promotor-Region, pflanzliche, nicht translatierte 5'-Sequenzen, Startcodon in Abhängigkeit davon, ob das Strukturgen bereits hiermit ausgestattet ist oder nicht, und eine Sequenz zur Beendung der Transkription und der Translation. Unverwechselbare Stellen für Restriktionsenzyme an den 5'- und 3'-Enden der Kassette gestatten leichte Insertion in einen bereits bestehenden Vektor.
Eine heterologe Codierungssequenz kann für jedes beliebige Protein im Einklang mit der vorliegenden Erfindung erstellt werden. Die Sequenz, die das interessierende Protein codiert, wird ein Signalpeptid codieren, welches die Prozessierung und Translokation des Proteins, falls angemessen, gestattet, und ihr wird gewöhnlich jede Sequenz fehlen, die eine Bindung des gewünschten Proteins der Erfindung an eine Membran zur Folge haben könnte. Da in den meisten Fällen die Transkriptions-Startregion für ein Gen sein wird, welches während der Keimungsphase exprimiert und transloziert wird, kann man durch Verwendung des Signalpeptides, welches die Translokation bewirkt, auch die Translokation des interessierenden Proteins bewirken. Auf diese Weise wird das interessierende Protein (die interessierenden Proteine) aus den Zellen, in denen es exprimiert wird, transloziert werden und kann wirksam geerntet werden. Typische Sekretion bei Samen erfolgt über die Aleuron- oder Scutellarepithel-Schicht hinweg in das Endosperm des Samens. Obgleich es nicht notwendig ist, dass das Protein von den Zellen, in denen es produziert wird, sekretiert wird, erleichtert dies jedoch die Isolierung und Reinigung des rekombinanten Proteins.
Da die endgültige Expression des gewünschten Genproduktes in einer eukaryontischen Zelle stattfinden wird, ist es wünschenswert zu bestimmen, ob ein beliebiger Abschnitt des clonierten Gens Sequenzen enthält, die von der Spleißosom-Maschinerie des Wirtsorganismus als Introns ausgeschnitten werden. Falls dem so ist, kann eine stellengerichtete Mutagenese der "Intron"-Region durchgeführt werden, um den Verlust eines Abschnittes der genetischen Botschaft als einen falschen Intron-Code zu verhindern, Reed und Maniatis, Cell 41:95–105, 1985.
Der Vektor kann durch die Verwendung von Mikropipetten zur mechanischen Übertragung der rekombinanten DNA direkt in Pflanzenzellen mikroinjiziert werden, Crossway, Mol. Gen. Genet, 202:179–185, 1985. Das genetische Material kann auch unter Verwendung von Polyethylenglykol in die Pflanzenzelle übertragen werden, Krens, et al., Nature, 296, 72–74, 1982. Ein anderes Verfahren zur Einführung von Nucleinsäure-Segmenten ist die ballistische Hochgeschwindigkeits-Penetration kleiner Partikel, wobei sich die Nucleinsäure entweder innerhalb der Matrix kleiner Perlen oder Partikel oder auf deren Oberfläche befindet, Klein, et al., Nature, 327, 70–73, 1987 und Knudsen und Muller, 1991, Planta, 185:330–336, die Partikel-Bombardierung von Endosperm der Gerste lehren, um transgene Gerste zu erzeugen. Noch ein anderes Verfahren zur Einführung wäre die Fusion von Protoplasten mit anderen Einheiten, entweder Minizellen, Zellen, Lysosomen oder anderen fusionierbaren Körpern mit Lipid-Oberfläche, Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859–1863, 1982.
Der Vektor kann auch durch Elektroporation in die Pflanzenzellen eingeführt werden (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985). Bei dieser Technik werden pflanzliche Protoplasten in Anwesenheit von Plasmiden, die die Gen-Konstruktion enthalten, einer Elektroporation unterzogen. Elektrische Impulse mit hoher Feldstärke permeabilisieren Biomembranen reversibel, was die Einführung der Plasmide gestattet. Pflanzliche Protoplasten, bei denen eine Elektroporation durchgeführt wurde, bauen die Zellwand neu auf, teilen sich und bilden einen Pflanzen-Kallus.
Alle Pflanzen, von denen Protoplasten isoliert und kultiviert werden können, um ganze, regenerierte Pflanzen zu erzeugen, können durch die vorliegende Erfindung transformiert werden, so dass ganze Pflanzen wiedergewonnen werden, die das übertragene Gen enthalten. Es ist bekannt, dass praktisch alle Pflanzen aus kultivierten Zellen oder Geweben regeneriert werden können, einschließlich, aber nicht hierauf beschränkt, aller wichtigeren Zuckerrohr-Arten, Zuckerrrübe, Baumwolle, Obst- und andere Bäume, Hülsenfrüchte und Gemüse. Einige geeignete Pflanzen umschließen zum Beispiel Arten der Gattungen Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunie, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum und Datura.
Die Verfahren für die Regenerierung sind von Pflanzenart zu Pflanzenart verschieden, allgemein wird aber zuerst eine Suspension aus transformierten Protoplasten, die Kopien des heterologen Gens enthalten, hergestellt. Kallusgewebe wird gebildet, und es können Schösslinge aus dem Kallus induziert und anschließend bewurzelt werden. Alternativ kann eine Embryobildung aus der Protoplasten-Suspension induziert werden. Diese Embryos keimen wie natürliche Embryos, um Pflanzen zu bilden. Die Kulturmedien werden allgemein verschiedene Aminosäuren und Hormone wie etwa Auxin und Cytokinine enthalten. Es ist auch von Vorteil, dem Kulturmedium Glutaminsäure und Prolin zuzugeben, besonders bei solchen Arten wie Mais und Luzerne. Schösslinge und Wurzeln entwickeln sich normalerweise gleichzeitig. Wirksame Regeneration wird von dem Kulturmedium, dem Genotyp und der Vorgeschichte der Kultur abhängen. Wenn diese drei Variablen gesteuert werden, ist die Regeneration vollständig reproduzierbar und wiederholbar.
In einigen pflanzlichen Zellkultursystemen kann das gewünschte Protein der Erfindung exkretiert werden, oder alternativ kann das Protein aus der gesamten Pflanze extrahiert werden. Wenn das gewünschte Protein der Erfindung in das Kulturmedium sekretiert wird, kann es gesammelt werden. Alternativ können die Embryonen und embryolosen Halbsamen oder anderes Pflanzengewebe mechanisch aufgebrochen werden, um sekretiertes Protein zwischen Zellen und Geweben freizusetzen. Das Gemisch kann in einer Pufferlösung suspendiert werden, um lösliche Proteine rückzugewinnen. Es werden dann herkömmliche Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Protein verwendet, um das rekombinante Protein zu reinigen. Die Parameter Zeit, Temperatur, pH-Wert, Sauerstoff und Volumen werden durch Routine-Verfahren eingestellt, um Expression und Gewinnung von heterologem Protein zu optimieren.
iii. Baculovirus-Systeme
Das Polynucleotid, das das Protein codiert, kann auch in einen geeigneten Expressionsvektor eines Insektes inseriert werden und ist mit den Kontrollelementen innerhalb dieses Vektors funktionell verbunden. Für die Konstruktion des Vektors werden auf dem Fachgebiet bekannte Techniken verwendet. Allgemein umschließen die Bestandteile des Expressionssystems einen Transfervektor, gewöhnlich ein bakterielles Plasmid, welches sowohl ein Fragment des Baculovirus-Genoms als auch eine gebräuchliche Restriktionsstelle für die Insertion des heterologen Gens oder der heterologen Gene, die exprimiert werden sollen, enthält; ein Baculovirus des Wildtyps mit einer Sequenz, die zu dem für das Baculovirus spezifischen Fragment in dem Transfervektor homolog ist (dies gestattet die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus-Genom hinein); und geeignete insektenstämmige Wirtszellen und Kulturmedium für das Wachstum.
Nach der Insertion der DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in den Transfervektor werden der Vektor und das virale Wildtyp-Genom in eine insektenstämmige Wirtszelle transfiziert, in der dem Vektor und dem viralen Genom gestattet wird, zu rekombinieren. Das verpackte rekombinante Virus wird exprimiert, und rekombinante Plaques werden identifiziert und gereinigt. Materialien und Verfahren für Baculovirus/Insektenzell-Expressionssysteme sind in Kit-Form käuflich zu erwerben, unter anderem von Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac"-Kit). Diese Techniken sind Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt und werden von Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (nachstehend "Summers und Smith") vollständig beschrieben.
Vor der Insertion der DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in das Baculovirus-Genom werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Leader-Sequenz (falls gewünscht), die interessierende codierende Sequenz und eine Sequenz zur Beendung der Transkription umfassen, gewöhnlich in einer intermediären Konstruktion zur Übertragung (Transfervektor) vereint. Diese Konstruktion kann ein einzelnes Gen und funktionell verbundene Regulationselemente; mehrere Gene, jedes mit seinem eigenen Satz an funktionell verbundenen Regulationselementen; oder mehrere Gene, die durch den selben Satz an Regulationselementen reguliert werden, enthalten. Intermediäre Konstruktionen zur Übertragung werden oft in einem Replikon wie etwa einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmiden) gehalten, das zu einem stabilen Verbleib in einem Wirtsorganismus wie etwa einem Bakterium in der Lage ist. Das Replikon wird ein Replikationssystem besitzen, durch das ihm ermöglicht wird, zur Clonierung und Amplifizierung in einem geeigneten Wirtsorganismus bestehen zu bleiben.
Der am meisten allgemein verwendete Transfervektor zur Einführung fremder Gene in AcNPV ist zur Zeit pAc373. Viele andere Vektoren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, sind ebenfalls entworfen worden. Diese umschließen zum Beispiel pVL985 (welches das Polyhedrin-Startcodon von ATG nach ATT ändert und welches eine BamHI-Clonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts des ATT einführt; vgl. Luckow und Summers, Virology (1989) 17:31).
Das Plasmid enthält gewöhnlich auch das Polyhedrin-Polyadenylierungssignal (Miller et al., (1988) Ann. Rev. Microbiol, 42:177) und ein prokaryontisches Gen für Ampicillin-Resistenz (amp) und einen Replikationsursprung für Selektion und Vermehrung in E. coli.
Baculovirus-Transfervektoren enthalten gewöhnlich einen Baculovirus-Promotor. Ein Baculovirus-Promotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine Baculovirus-RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärts gerichtete (5' zu 3') Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA einzuleiten. Ein Promotor wird eine Region zur Einleitung der Transkription besitzen, die gewöhnlich proximal des 5'-Endes der codierenden Sequenz liegt. Diese Region zur Einleitung der Transkription umschließt gewöhnlich eine Bindungsstelle für RNA-Polymerase und eine Stelle zur Einleitung der Transkription. Ein Baculovirus-Transfervektor kann auch eine zweite Domäne, Enhancer genannt, besitzen, die, falls vorhanden, gewöhnlich distral des Strukturgens liegt. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv erfolgen.
Strukturgene, die in einem viralen Infektionszyklus zu späten Zeitpunkten im Überfluss transkribiert werden, liefern besonders nützliche Promotor-Sequenzen. Beispiele umschließen Sequenzen, die von dem Gen, das das virale Polyhedrin-Protein codiert, Friesen et al., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression: in: The Molecular Biology of Baculoviruses (Hrsg. Walter Doerfler); EPO Publ. Nr. 127 839 und 155 476 ; und dem Gen stammen, welches das p10-Protein codiert, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sekretierte Insekten- oder Baculovirus-Proteine wie etwa dem Baculovirus-Polyhedrin-Gen erhalten werden (Carbonell et al., (1988) Gene 73:409). Da die Signale für posttranslationale Modifikationen bei Säugerzellen (wie etwa Signalpeptid-Spaltung, proteolytische Spaltung und Phosphorylierung) von Insektenzellen erkannt zu werden scheinen und die Signale die für Sekretion und Akkumulation im Kern benötigt werden, anscheinend ebenfalls zwischen den Zellen von Wirbellosen und den Zellen von Wirbeltieren konserviert sind, können alternativ ebenfalls Leader-Sequenzen verwendet werden, die nicht insektenstämmigen Ursprungs sind, wie jene, die von Genen stammen, die (alpha) α-Interferon des Menschen, Maeda et al., (1985) Nature 315:592; Gastrin freisetzendes Peptid des Menschen, Lebacq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 des Menschen, Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404; IL-3 der Maus, (Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; und Glucocerebrosidase des Menschen, Martin et al. (1988) DNA, 7:99, codieren, um Sekretion bei Insekten zu bewirken.
Ein rekombinantes Polypeptid oder Polyprotein kann intrazellulär exprimiert oder es kann, falls es mit den richtigen Regulationssequenzen exprimiert wird, sekretiert werden. Eine gute intrazelluläre Expression von nicht fusionierten fremden Proteinen erfordert gewöhnlich heterologe Gene, die idealerweise eine kurze Leader-Sequenz besitzen, welche geeignete Signale für die Einleitung der Translation enthalten, die einem ATG-Startsignal vorausgehen. Falls gewünscht, kann Methionin am N-Terminus durch in vitro-Inkubation mit Cyanogenbromid vom reifen Protein abgespalten werden.
Alternativ können rekombinante Polyproteine oder Proteine, die nicht natürlicherweise sekretiert werden, von der Insektenzelle sekretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, welches ein Fragment einer Leader-Sequenz umfasst, das die Sekretion des fremden Proteins in Insekten bewirkt. Das Fragment der Leader-Sequenz codiert gewöhnlich ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren umfasst, die die Translokation des Proteins in das endoplasmatische Retikulum steuert.
Nach Insertion der DNA-Sequenz und/oder des Gens, das den Vorläufer des Expressionsproduktes des Proteins codiert, wird eine insektenstämmige Wirtszelle mit der heterologen DNA des Transfervektors und der genomischen DNA des Wildtyp-Baculovirus kotransformiert – gewöhnlich durch Kotransfizierung. Der Promotor und die Sequenz für die Beendung der Transkription der Konstruktion wird gewöhnlich einen 2–5 kb großen Abschnitt des Baculovirus-Genoms umfassen. Verfahren zur Einführung von heterologer DNA an der gewünschten Stelle im Baculovirus sind auf dem Fachgebiet bekannt. (Vgl. Summers und Smith, vorstehend; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; und Luckow und Summers (1989)). Zum Beispiel kann die Insertion in ein Gen wie etwa das Polyhedrin-Gen durch doppelte homologe Crossover-Rekombination erfolgen; die Insertion kann auch in eine Stelle für ein Restriktionsenzym erfolgen, welche in das gewünschte Baculovirus-Gen eingefügt worden ist. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. Wenn die DNA-Sequenz an die Stelle des Polyhedrin-Gens in dem Expressionsvektor cloniert wird, wird sie sowohl von den für Polyhedrin spezifischen 5'- als auch 3'-Sequenzen flankiert und wird stromabwärts des Polyhedrin-Promotors positioniert.
Der neu gebildete Baculovirus-Expressionsvektor wird anschließend in ein infektiöses rekombinantes Baculovirus verpackt. Homologe Rekombination tritt in geringer Häufigkeit auf (zwischen etwa 1% und etwa 5%); auf diese Weise ist die Mehrheit des nach der Kotransfizierung produzierten Virus immer noch das Wildtyp-Virus. Daher ist ein Verfahren zur Identifizierung rekombinanter Viren erforderlich. Ein Vorteil des Expressionssystems besteht in der visuellen Durchmusterung, die gestattet, rekombinante Viren zu unterscheiden. Das Polyhedrin-Protein, das von dem ursprünglichen Virus produziert wird, wird in sehr hohen Spiegeln in den Zellkernen infizierter Zellen zu späten Zeitpunkten nach der viralen Infektion produziert. Akkumuliertes Polyhedrin-Protein bildet Einschlusskörper, die zusätzlich eingebettete Partikel enthalten. Diese Einschlusskörper mit einer Größe von bis zu 15 μm sind hoch refraktil, was ihnen eine hellglänzende Erscheinung verleiht, die leicht unter dem Lichtmikroskop erkannt werden kann. Zellen, die mit rekombinanten Viren infiziert sind, fehlen solche Einschlusskörper. Um das rekombinante Virus vom Wildtyp-Virus zu unterscheiden, wird der Überstand der Transfizierung unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, auf eine einzellige Schicht an Insektenzellen aufgebracht, um Plaques zu bilden. Diese Plaques werden unter dem Lichtmikroskop auf die Anwesenheit (kennzeichnend für das Wildtyp-Virus) oder das Fehlen (kennzeichnend für das rekombinante Virus) von Einschlusskörpern durchmustert. Current Protocols in Microbiology, Bd. 2 (Ausubel et al., Hrsg.) unter 16,8 (Erg. 10, 1990); Summers und Smith, vorstehend; Miller et al. (1989).
Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren sind für die Infektion verschiedener Insektenzellen entwickelt worden. Rekombinante Baculoviren sind unter anderem entwickelt worden für: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni (PCT-Veröffentl. Nr. WO 89/046699 ; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; und vgl. allgemein Fraser, et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).
Zellen und Zellkulturmedien können sowohl für die direkte als auch die Fusionsexpression von heterologen Polypeptiden in einem Baculovirus-Expressionssystem käuflich erworben werden; die Zellkultur-Technik ist Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt. Vgl. z. B. Summers und Smith, vorstehend.
Die modifizierten Insektenzellen können dann in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, das den stabilen Verbleib des Plasmids oder der Plasmide, die in der modifizierten insektenstämmigen Wirtszelle vorliegen, gestattet. Wenn das Gen für das Expressionsprodukt unter induzierbarer Kontrolle steht, kann die Wirtszelle auf eine hohe Dichte gezüchtet und die Expression induziert werden. Alternativ, wenn die Expression konstitutiv ist, wird das Produkt kontinuierlich in das Kulturmedium exprimiert, und das Nährmedium muss kontinuierlich zirkuliert werden, während das interessierende Produkt entnommen wird und verbrauchte Nährstoffe ergänzt werden. Das Produkt kann durch Verfahren wie Chromatographie, z. B. HPLC, Affinitätschromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie usw., Elektrophorese, Dichtegradienten-Zentrifugation, Lösungsmittel-Extraktion oder dergleichen gereinigt werden. Ggf. kann das Produkt darüber hinaus, wie angegeben, gereinigt werden, um so im Wesentlichen alle vom Insekt stammenden Proteine, die ebenfalls in das Kulturmedium sekretiert werden oder aus der Lyse der Insektenzellen stammen, zu entfernen, um ein Produkt zu liefern, welches wenigstens im Wesentlichen frei von Resten der Wirtszelle, z. B. Proteinen, Lipiden und Polysacchariden, ist.
Um Protein-Expression zu erreichen, werden rekombinante Wirtszellen, die von den Transformanten abstammen, unter Bedingungen inkubiert, die die Expression der Sequenz gestatten, die das rekombinante Protein codiert. Diese Bedingungen werden in Abhängigkeit von der ausgewählten Wirtszelle variieren. Die Bedingungen können jedoch von Fachleuten auf dem Gebiet, basierend auf dem Wissensstand des Fachgebietes, leicht festgelegt werden.
iv. Bakterielle Systeme
Bakterielle Expressionstechniken sind auf dem Fachgebiet bekannt. Ein bakterieller Promotor ist jede beliebige DNA-Sequenz, die in der Lage ist, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärts stattfindende (3'-)Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA einzuleiten. Ein Promotor wird eine Region zur Einleitung der Transkription besitzen, die gewöhnlich proximal des 5'-Endes der codierenden Sequenz liegt. Die Region zur Einleitung der Transkription umschließt gewöhnlich eine Bindungsstelle für RNA-Polymerase und eine Stelle zur Einleitung der Transkription. Ein bakterieller Promotor kann auch einen zweite, Operator genannte Domäne besitzen, welche eine benachbarte Bindungsstelle für RNA-Polymerase, an der die RNA-Synthese beginnt, überlappt. Der Operator gestattet negativ regulierte (induzierbare) Transkription, da ein Gen-Repressorprotein den Operator binden kann und damit die Transkription eines spezifischen Gens verhindern kann. Konstitutive Expression kann beim Fehlen von negativen Regulationselementen wie etwa des Operators auftreten. Zusätzlich kann eine positive Regulation durch eine ein Gen-Aktivatorprotein bindende Sequenz erreicht werden, welche, wenn vorhanden, gewöhnlich proximal (5') der Bindungssequenz für RNA-Polymerase liegt. Ein Beispiel für ein Gen-Aktivatorprotein ist das katabolische Aktivatorprotein (CAP), das hilft, die Transkription des lac-Operon bei Escherichia coli (E. coli) einzuleiten (Raibaud et al., (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173). Regulierte Expression kann daher entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder verstärkt oder reduziert wird.
Sequenzen, die Enzyme metabolischer Stoffwechselwege codieren, liefern besonders nützliche Promotor-Sequenzen. Beispiele schließen Promotor-Sequenzen ein, die von Zucker abbauenden Enzymen stammen, wie etwa Galactose, Lactose (lac) (Chang et al., (1977) Nature 198:1056) und Maltose. Zusätzliche Beispiele umschließen Promotor-Sequenzen, die von biosynthetischen Enzymen stammen, wie etwa Tryptophan (trp) (Goeddel et al., (1980) Nucl. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al., (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; US-Patent Nr. 4,738,921 ; EPO-Veröffentl. Nr. 036 776 und 121 775 ). Das beta-Lactamase (bla)-Promotor-System (Weissmann (1981) "The cloning of interferon und other mistakes." In Interferon 3 (Hrsg. I. Gresser)), Promotor-Systeme des Bakteriophagen Lambda PL (Shimatake et al., (1981) Nature 292:128) und T5 ( US-Patent Nr. 4,689,406 ) liefern gleichfalls nützliche Promotor-Sequenzen.
Zusätzlich dienen synthetische Promotoren, die in der Natur nicht vorkommen, ebenfalls als bakterielle Promotoren. Zum Beispiel können die Sequenzen zur Aktivierung der Transkription des ersten bakteriellen oder Bakteriophagen-Promotors mit den Operon-Sequenzen eines zweiten bakteriellen oder Bakteriophagen-Promotors verbunden werden, wodurch ein synthetischer Hybrid-Promotor erzeugt wird ( US-Patent Nr. 4,551,433 ). Zum Beispiel ist der tac-Promotor ein Hybrid-trp-lac-Promotor, der sowohl den trp-Promotor als auch lac-Operon-Sequenzen umschließt und welcher durch den lac-Repressor reguliert wird (Amann et al., (1983) Gene 25:167; de Boer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21). Darüber hinaus kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren nicht bakteriellen Ursprungs einschließen, welche die Fähigkeit besitzen, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einzuleiten. Ein natürlich vorkommender Promotor nicht bakteriellen Ursprungs kann auch mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um hohe Expressionsspiegel für einige Gene in Prokaryonten zu erzeugen. Das Bakteriophage T7-RNA-Polymerase/Promotor-System ist ein Beispiel für ein gekoppeltes Promotor-System (Studier et al., (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074). Zusätzlich kann ein Hybrid-Promotor auch einen Promotor eines Bakteriophagen und eine Operator-Region von E. coli umfassen ( EPO-Veröffentl. Nr. 267 851 ).
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotor-Sequenz ist eine wirksame Bindungsstelle für ein Ribosom ebenfalls für die Expression von fremden Genen in Prokaryonten von Nutzen. In E. coli wird die Bindungsstelle für ein Ribosom die Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz genannt und umschließt ein Startcodon (ATG) und eine Sequenz mit einer Länge von 3–9 Nucleotiden, die 3–11 Nucleotide stromaufwärts des Startcodons liegt (Shine et al., (1975) Nature 254:34). Es wird angenommen, dass die SD-Sequenz die Bindung von mRNA an das Ribosom durch die Paarung von Basen zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende der 16S-rRNA von E. coli unterstützt (Steitz et al., (1979) "Genetic signals and nucleotide Sequenzen in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Hrsg. R. F. Goldberger)). Um eukaryontische Gene und prokaryontische Gene mit einer schwachen Bindungsstelle für das Ribosom zu exprimieren, ist es oft notwendig, den Abstand zwischen der SD-Sequenz und dem ATG des eukaryontischen Gens zu optimieren (Sambrook et al., (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotor-Sequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden werden, in diesem Fall wird die erste Aminosäure am N-Terminus immer ein Methionin sein, das durch das ATG-Startcodon codiert wird. Falls gewünscht kann Methionin am N-Terminus durch in vitro-Inkubation mit Cyanogenbromid oder durch entweder in vivo- oder in vitro-Inkubation mit einer bakteriellen für das N-terminale Methionin spezifischen Peptidase von dem Protein abgespalten werden ( EPO-Veröffentl. Nr. 219 237 ).
Fusionsproteine liefern eine Alternative zur Steuerung der Expression. Gewöhnlich wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Abschnitt eines endogenen Bakterienproteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, an das 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Bei der Expression wird diese Konstruktion eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen liefern. Zum Beispiel kann das Zellgen des lambda-Bakteriophagen an das 5'-Ende eines fremden Gens gebunden und in Bakterien exprimiert werden. Das entstandene Fusionsprotein behält bevorzugt eine Stelle für ein prozessierendes Enzym (Faktor Xa), um das Bakteriophagen-Protein von dem fremden Gen abzuspalten (Nagai et al., (1984) Nature 309:810). Fusionsproteine können auch mit Sequenzen der lacZ- (Jia et al., (1987) Gene 60:197), trpE- (Allen et al., (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al., (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11) und Chey-Gene ( EPO-Veröffentl. Nr. 324 647 ) hergestellt werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder nicht. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin-Region hergestellt, die bevorzugt eine Stelle für ein prozessierendes Enzym behält (z. B. die für Ubiquitin spezifische Prozessierungsprotease), um das Ubiquitin von dem fremden Protein abzuspalten. Durch dieses Verfahren kann natürliches fremdes Protein isoliert werden (Miller et al., (1989) Bio Technology 7:698).
Alternativ können fremde Proteine auch von der Zelle sekretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Signalpeptid-Sequenz-Fragment umfasst, welches die Sekretion des fremden Protein in Bakterien unterstützt ( US-Patent Nr. 4,336,336 ). Das Signalsequenz-Fragment codiert gewöhnlich ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren umfasst, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Das Protein wird entweder in das Wachstums-Kulturmedium (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, der zwischen der inneren und der äußeren Zellmembran liegt (Gram-negative Bakterien), sekretiert. Bevorzugt gibt es Stellen zur Prozessierung, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können und zwischen dem Signalpeptid-Fragment und dem fremden Gen codiert werden.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sekretierte bakterielle Proteine stammen, wie etwa dem Gen für das äußere Membranprotein von E. coli (ompA) (Masui et al., (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al., (1984) EMBO J. 3:2437) und der Signalsequenz für alkalische Phosphatase von E. coli (PhoA) (Oka et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212). Als ein zusätzliches Beispiel kann die Signalsequenz des Gens für alpha-Amylase von verschiedenen Bacillus-Stämmen verwendet werden, um heterologe Proteine von B. subtilis zu sekretieren (Palva et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EPO-Veröffentl. Nr. 244 042 ).
Gewöhnlich sind die Sequenzen zur Beendung der Transkription, die von Bakterien erkannt werden, regulatorische Regionen, die 3'-wärts des Translations-Stoppcodons liegen und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid, das von der DNA codiert wird, translatiert werden kann. Sequenzen zur Beendung der Transkription umschließen häufig DNA-Sequenzen mit etwa 50 Nucleotiden, die in der Lage sind, Stamm-Schleifen-Strukturen zu bilden, die die Beendung der Transkription unterstützen. Beispiele umschließen Sequenzen zur Beendung der Transkription, die von Genen mit starken Promotoren stammen, wie etwa dem trp-Gen von E. coli als auch anderen biosynthetischen Genen.
Gewöhnlich werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Signalsequenz (falls gewünscht), die interessierende Codierungssequenz und die Sequenz zur Beendung der Transkription umfassen, zusammen in Expressionskonstruktionen vereint. Die Expressionskonstruktionen werden oft in einem Replikon wie etwa einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmiden) gehalten, die zu einem stabilen Verbleib in einem Wirtsorganismus wie etwa Bakterien in der Lage sind. Das Replikon wird ein Replikationssystem besitzen, wodurch ihm ermöglicht wird, in einem prokaryontischen Wirtsorganismus entweder zur Expression oder zur Clonierung und Amplifizierung bestehen zu bleiben. Zusätzlich kann ein Replikon ein Plasmid entweder mit einer hohen oder einer geringen Anzahl von Kopien sein. Ein Plasmid mit einer hohen Anzahl von Kopien wird allgemein eine Anzahl an Kopien zwischen etwa 5 bis etwa 200 und gewöhnlich etwa 10 bis etwa 150 besitzen. Ein Wirtsorganismus, der ein Plasmid mit einer hohen Anzahl an Kopien enthält, wird bevorzugt mindestens 10 und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide enthalten. In Abhängigkeit von der Wirkung des Vektors und des fremden Proteins in dem Wirtsorganismus kann ein Vektor mit entweder hoher oder geringer Anzahl an Kopien ausgewählt werden.
Alternativ können die Expressionskonstruktionen mit einem integrierenden Vektor in das bakterielle Genom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten mindestens eine Sequenz, die zu dem bakteriellen Chromosom, das die Integration des Vektors gestattet, homolog ist. Die Integrationen scheinen aus Rekombinationen zwischen der homologen DNA in dem Vektor und dem bakteriellen Chromosom zu resultieren. Zum Beispiel integrieren sich integrierende Vektoren, die mit DNA von verschiedenen Bacillus-Stämmen konstruiert worden sind, in das Bacillus-Chromosom ( EPO-Veröffentl. Nr. 127 328 ). Integrierende Vektoren können auch Bakteriophagen- oder Transposon-Sequenzen umfassen.
Gewöhnlich können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstruktionen selektierbare Markierungen enthalten, um die Selektion auf bakterielle Stämme, die transformiert worden sind, zu gestatten. Selektierbare Markierungen können in dem bakteriellen Wirtsorganismus exprimiert werden und können Gene einschließen, die die Bakterien resistent gegen Wirkstoffe wie etwa Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin machen (Davies et al., (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469). Selektierbare Markierungen können auch biosynthetische Gene einschließen, wie etwa jene aus den Stoffwechselwegen für die Biosynthese von Histidin, Tryptophan und Leucin.
Alternativ können einige der vorstehend beschriebenen Bestandteile in Transformationsvektoren zusammengefasst werden. Transformationsvektoren umfassen gewöhnlich eine selektierbare Markierung, die entweder in einem Replikon gehalten oder in einen integrierenden Vektor entwickelt wird, wie vorstehend beschrieben.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replikons oder integrierende Vektoren, sind für die Transformation zahlreicher Bakterien entwickelt worden. Zum Beispiel sind Expressionsvektoren unter anderem für die nachstehenden Bakterien entwickelt worden: Bacillus subtilis (Palva et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EPO-Veröffentl. Nr. 036 259 und 063 953 ; PCT-Veröffentl. Nr. WO 84/04541 ), Escherichia coli (Shimatake et al., (1981) Nature 292:128; Amann et al., (1985) Gene 40:183; Studier et al., (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EPO-Veröffentl. Nr. 036 776 , 136 829 und 136 907 ), Streptococcus cremoris (Powell et al., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655); Streptococcus lividans (Powell et al., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655), Streptomyces lividans ( US-Patent Nr. 4,745,056 ).
Verfahren zur Einführung von exogener DNA in bakterielle Wirtszellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umschließen gewöhnlich entweder die Transformation von Bakterien, die mit CaCl₂ oder anderen Agenzien wie etwa divalenten Kationen und DMSO behandelt worden sind. DNA kann auch durch Elektroporation in Bakterienzellen eingeführt werden. Die Transformationsverfahren variieren gewöhnlich mit der Bakterienart, die transformiert werden soll. (Vgl. z. B. für die Verwendung von Bacillus: Masson et al., (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60..273; Palva et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EPO-Veröffentl. Nr. 036 259 und 063 953 ; PCT-Veröffentl. Nr. WO 84/04541 ; für die Verwendung von Campylobacter: Miller et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; und Wang et al., (1990) J. Bakteriol. 172:949; für die Verwendung von Escherichia coli: Cohen et al., (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids." In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium an Genetic Engineering (Hrsg. H. W. Boyer und S. Nicosia); Mandel et al., (1970) J. Mol. 53:159; Taketo (1988) Biochem. Biophys. Acta 949:318; für die Verwendung von Lactobacillus: Chassy et al., (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173; für die Verwendung von Pseudomonas: Fiedler et al., (1988) Anal. Biochem. 170:38; für die Verwendung von Staphylococcus: Augustin et al., (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203; für die Verwendung von Streptococcus: Barany et al., (1980) J. Bakteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", in: Streptococcal Genetics (Hrsg. J. Ferretti und R. Curtiss III); Perry et al., (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et al., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al., (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412.
v. Expression in Hefe
Auch Hefe-Expressionssysteme sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Ein Hefe-Promotor ist jede beliebige DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die flussabwärts stattfindende (3') Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA einzuleiten. Ein Promotor wird eine Region zur Einleitung der Transkription besitzen, die gewöhnlich proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz platziert ist. Diese Region zur Einleitung der Transkription umschließt gewöhnlich eine Bindungsstelle für RNA-Polymerase (die "TATA-Box") und eine Stelle zur Einleitung der Transkription. Ein Hefe-Promotor kann auch eine zweite, stromaufwärts liegende Aktivator-Sequenz (UAS) genannte Domäne besitzen, die, falls vorhanden, gewöhnlich distal des Strukturgens liegt. Die UAS gestattet regulierte (induzierbare) Expression. Konstitutive Expression tritt bei Abwesenheit einer UAS ein. Regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder verstärkt oder reduziert wird.
Hefe ist ein fermentierender Organismus mit einem aktiven Stoffwechselweg, daher liefern Sequenzen, die Enzyme des Stoffwechselwege codieren, besonders nützliche Promotor-Sequenzen. Beispiele umschließen Alkoholdehydrogenase (ADH) ( EPO-Veröffentl. Nr. 284 044 ), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-Phosphat-Isomerase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglycerat-Mutase und Pyruvatkinase (PyK) ( EPO-Veröffentl. Nr. 329 203 ). Das Gen PHO5 der Hefe, das die saure Phosphatase codiert, liefert ebenfalls nützliche Promotor-Sequenzen (Myanohara et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1).
Zusätzlich dienen auch synthetische Promotoren, die in der Natur nicht vorkommen, als Promotoren in Hefe. Zum Beispiel können UAS-Sequenzen eines Hefe-Promotors mit der Region zur Aktivierung der Transkription eines anderen Hefe-Promotors verbunden werden, wodurch ein synthetischer Hybrid-Promotor erzeugt wird. Beispiele solcher Hybrid-Promotoren umschließen die ADH-Regulatorsequenz verbunden mit der Region zur Aktivierung der GAP-Transkription ( US-Patent Nr. 4,876,197 und 4,880,734 ). Andere Beispiele für Hybrid-Promotoren umschließen Promotoren, die aus den Regulatorsequenzen entweder des ADH2-, GAL4-, GAL10-, oder des PHO5-Gens, kombiniert mit der Region zur Aktivierung der Transkription eines Gens für ein glycolytisches Enzym wie etwa GAP oder PyK, zusammengesetzt sind ( EPO-Veröffentl. Nr. 164 556 ). Darüber hinaus kann ein Hefe-Promotor natürlich vorkommende Promotoren mit nicht hefestämmigem Ursprung einschließen, die die Fähigkeit besitzen, RNA-Polymerase der Hefe zu binden und die Transkription einzuleiten. Beispiele für solche Promotoren umschließen unter anderem (Cohen et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff et al., (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al., (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al., (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Hrsg. K. N. Timmis und A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al., (1980) Gene 11:163; Panthier et al., (1980) Curr. Genet. 2:109).
Ein DNA-Molekül kann in Hefe intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotor-Sequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden werden; in diesem Fall wird die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein, das durch das ATG-Startcodon codiert wird. Falls gewünscht, kann das Methionin am N-Terminus durch in vitro-Inkubation mit Cyanogenbromid abgespalten werden.
Fusionsproteine liefern eine Alternative für Hefe-Expressionssysteme, sowohl in säugerstämmigen, pflanzlichen-, Baculovirus- und bakteriellen Expressionssystemen. Gewöhnlich wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Abschnitt eines endogenen Hefe-Proteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, an das 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Bei der Expression wird diese Konstruktion eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen liefern. Zum Beispiel kann das Superoxid-Dismutase (SOD)-Gen der Hefe oder des Menschen mit dem 5'-Ende eines fremden Gens verbunden und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann eine Spaltstelle codieren oder nicht. Vgl. z. B. EPO-Veröffentl. Nr. 196056 . Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin-Region hergestellt, die bevorzugt eine Stelle für ein prozessierendes Enzym beibehält (z. B. die für Ubiquitin spezifische prozessierende Protease), um das Ubiquitin von dem fremden Protein abzuspalten. Durch dieses Verfahren kann daher natives fremdes Protein isoliert werden (z. B. WO88/024066 ).
Alternativ können fremde Proteine auch von der Zelle in das Kulturmedium sektretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, welches ein Fragment einer Leader-Sequenz umfasst, das die Sekretion des fremden Proteins in Hefe sicherstellt. Bevorzugt werden Prozessierungsstellen zwischen dem Leader-Fragment und dem fremden Gen codiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Fragment der Leader-Sequenz codiert gewöhnlich ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren umfasst, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sekretierte Hefe-Proteine erhalten werden, wie etwa dem Hefe-Invertase-Gen ( EPO-Veröffentl. Nr. 012 873 ; JPO-Veröffentl. WO62:096,086 ) und dem A-Faktor-Gen ( US-Patent Nr. 4,588,684 ). Alternativ gibt es Leader-Sequenzen nicht hefestämmigen Ursprungs wie etwa eine Interferon-Leader-Sequenz, die ebenfalls die Sekretion in Hefe sicherstellen ( EPO-Veröffentl. Nr. 060 057 ).
Eine bevorzugte Klasse der Leader-Sequenzen zur Sekretion sind jene, die ein Fragment des alpha-Faktor-Gens verwenden, welches sowohl eine "prä-"Signalsequenz als auch eine "pro-"Region enthält. Die Typen der alpha-Faktor-Fragmente, die verwendet werden können, umschließen sowohl die prä-pro-alpha-Faktor-Leader-Sequenz in voller Länge (etwa 83 Aminosäurereste) als auch verkürzte alpha-Faktor-Leader-Sequenzen (gewöhnlich etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) ( US-Patente Nr. 4,546,083 und 4,870,008 ; EPO-Veröffentl. Nr. 324 274 ). Zusätzliche Leader-Sequenzen, die ein Fragment der alpha-Faktor-Leader-Sequenz verwenden, welches die Sekretion sicherstellt, umschließen Hybrid-alpha-Faktor-Leader-Sequenzen, die aus einer prä-Sequenz eines ersten Hefe-, aber einer pro-Region eines zweiten Hefe-alpha-Faktors hergestellt worden sind. (Vgl. z. B. PCT-Veröffentl. Nr. WO 89/02463 .)
Gewöhnlich sind die Sequenzen zur Beendung der Transkription, die von Hefe erkannt werden, regulatorische Regionen, die 3'-wärts des Translations-Stoppcodons liegen und auf diese Weise zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid, das von der DNA codiert wird, translatiert werden kann. Beispiele für eine Sequenz zur Beendung der Transkription und andere von Hefe erkannte Sequenzen zur Beendung sind z. B. jene, die glycolytische Enzyme codieren.
Gewöhnlich werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Leader-Sequenz (falls gewünscht), eine interessierende codierende Sequenz und eine Sequenz zur Beendung der Transkription umfassen, in Expressionskonstruktionen zusammengefasst. Die Expressionskonstruktionen werden oft in einem Replikon wie etwa einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmiden) gehalten, die zu stabilem Verbleib in einem Wirtsorganismus wie etwa Hefe oder Bakterien in der Lage sind. Das Replikon kann zwei Replikationssysteme besitzen, wodurch ermöglicht wird, dass es zum Beispiel in Hefe zur Expression und in einem prokaryontischen Wirtsorganismus zur Clonierung und Amplifizierung aufrechterhalten wird. Beispiele für solche Hefe-Bakterien-Pendelvektoren umschließen YEp24 (Botstein et al., (1979) Gene 8:17–24), pCI/1 (Brake et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642–4646) und YRp17 (Stinchcomb et al., (1982) J. Mol. Biol. 158:157). Zusätzlich kann ein Replikon ein Plasmid mit entweder einer hohen oder einer geringen Anzahl an Kopien sein. Ein Plasmid mit einer hohen Anzahl an Kopien wird allgemein eine Anzahl an Kopien besitzen, die von etwa 5 bis etwa 200 reicht und gewöhnlich etwa 10 bis etwa 150 Kopien umfasst. Ein Wirtsorganismus, der ein Plasmid mit einer hohen Anzahl an Kopien enthält, wird bevorzugt mindestens etwa 10 und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Kopien besitzen. In Abhängigkeit von der Wirkung des Vektors und des fremden Proteins auf den Wirtsorganismus kann zwischen einem Vektor mit hoher oder geringer Anzahl an Kopien gewählt werden. Vgl. Brake et al., vorstehend.
Alternativ können die Expressionskonstruktionen mit einem integrierenden Vektor in das Genom der Hefe integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten gewöhnlich mindestens eine Sequenz, die homolog zu einem Hefe-Chromosom ist und die dem Vektor die Integration gestattet, und bevorzugt zwei homologe Sequenzen, die die Expressionskonstruktion flankieren. Integrationen scheinen aus Rekombinationen zwischen homologer DNA in dem Vektor und dem Chromosom der Hefe zu resultieren (Orr-Weaver et al., (1983) Methods in Enzymol. 101:228–245). Ein integrierender Vektor kann auf eine spezifische Stelle in der Hefe gerichtet werden, indem die geeignete homologe Sequenz für einen Einschluss in den Vektor ausgewählt wird. Vgl. Orr-Weaver et al., vorstehend. Eine oder mehrere Expressionskonstruktionen können integriert werden, die möglicherweise die Spiegel an rekombinantem Protein, das produziert wird, beeinflussen (Rine et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750). Die chromosomalen Sequenzen, die im Vektor eingeschlossen sind, können entweder als ein einzelnes Segment in dem Vektor auftreten, was zu der Integration des gesamten Vektors führt, oder als zwei Segmente, die homolog zu benachbarten Segmenten in dem Chromosom sind und die Expressionskonstruktion in dem Vektor flankieren, was zu der stabilen Integration der Expressionskonstruktion allein führen kann.
Gewöhnlich können extrachromosomale und sich integrierende Expressionskonstruktionen selektierbare Markierungen enthalten, die die Selektion von Hefestämmen ermöglichen, die transformiert worden sind. Selektierbare Markierungen können biosynthetische Gene einschließen, die in der hefestämmigen Wirtszelle exprimiert werden können, wie etwa ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, und das G418-Resistenz-Gen, welches die Resistenz gegenüber Tunicamycin beziehungsweise G418 auf Hefezellen überträgt. Zusätzlich kann eine geeignete selektierbare Markierung auch Hefe liefern, die die Fähigkeit besitzt, in Anwesenheit toxischer Bestandteile wie etwa Metall zu wachsen. Zum Beispiel gestattet die Anwesenheit von CUP1 der Hefe, in der Anwesenheit von Kupferionen zu wachsen (Butt et al., (1987) Microbiol. Rev. 51:351).
Alternativ können einige der vorstehend beschriebenen Bestandteile in Transformationsvektoren zusammengefasst werden. Transformationsvektoren umfassen gewöhnlich eine selektierbare Markierung, die entweder in einem Replikon aufrechterhalten wird oder in einen sich integrierenden Vektor entwickelt ist, wie vorstehend beschrieben.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder als extrachromosomales Replikon oder als sich integrierende Vektoren, sind für die Transformation zahlreicher Hefen entwickelt worden. Zum Beispiel sind Expressionsvektoren und Verfahren zur Einführung von exogener DNA in hefestämmige Wirtsorganismen unter anderem für die nachstehenden Hefen entwickelt worden: Candida albicans (Kurtz, et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142); Candida maltosa (Kunze, et al., (1985) J. Basic Microbiol. 25:141); Hansenula polymorpha (Gleeson, et al., (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302); Kluyveromyces fragilis (Das, et al., (1984) J. Bacteriol. 158:1165); Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al., (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al., (1990) Bio/Technology 8:135); Pichia guillerimondii (Kunze et al., (1985) J. Basic Microbiol. 25:141); Pichia pastoris (Cregg, et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; US-Patente Nr. 4,837,148 und 4,929,555 ); Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al., (1983) J. Bakteriol. 153:163); Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, (1981) Nature 300:706); und Yarrowia lipolytica (Davidow, et. al., (1985) Curr. Genet. 10:38047, Gaillardin, et al., (1985) Curr. Genet. 10:49).
Verfahren zur Einführung exogener DNA in hefestämmige Wirtszellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umschließen gewöhnlich entweder die Transformierung von Spheroplasten oder von intakten Hefezellen, die mit Alkali-Kationen behandelt sind. Die Transformierungsverfahren variieren gewöhnlich mit den Hefearten, die transformiert werden sollen. Vgl. z. B. [Kurtz et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al., (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al., (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al., (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al., (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al., (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al., (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; US-Patente Nr. 4,837,148 und 4,929,555 ; Pichia]; [Hinnen et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75; 1929; Ito et al., (1983) J. Bacteriol. 153:163 Saccharomyces); [Beach und Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow et al., (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al., (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia].
Definitionen
Eine Zusammensetzung, die X enthält, ist "im Wesentlichen frei von" Y, wenn mindestens 85 Gewichts-% des gesamten X + Y in der Zusammensetzung X darstellt. Bevorzugt umfasst X mindestens etwa 90 Gewichts-% des gesamten X + Y in der Zusammensetzung, mehr bevorzugt mindestens etwa 95 Gewichts-% oder sogar 99 Gewichts-%.
Ein "konserviertes" Aminosäure-Fragment oder Protein von Neisseria ist eines, das in einem bestimmten Protein von Neisseria in mindestens x % von Neisseria vorliegt. Der Wert für x kann 50% oder mehr betragen, z. B. 66%, 75%, 80%, 90%, 95% oder sogar 100% (d. h. die Aminosäure wird in dem fraglichen Protein in allen Neisseria gefunden). Um zu bestimmen, ob eine Aminosäure in einem bestimmten Neisseria-Protein "konserviert" ist, ist es notwendig, diesen Aminosäurerest in den Sequenzen des fraglichen Proteins mit einer Mehrheit unterschiedlicher Neisseria (einer Referenzpopulation) zu vergleichen. Die Referenzpopulation kann eine Anzahl an verschiedenen Neisseria-Arten einschließen oder kann eine einzelne Art einschließen. Die Referenzpopulation kann eine Anzahl an verschiedenen Serogrupen einer bestimmten Art oder eine einzelne Serogruppe einschließen. Eine bevorzugte Referenzpopulation umfasst die 5 häufigsten Neisseria.
Der Ausdruck "heterolog" betrifft zwei biologische Bestandteile, die in der Natur nicht zusammen angetroffen werden. Die Bestandteile können Wirtszellen, Gene oder Regulator-Regionen wie etwa Promotoren sein. Obgleich die heterologen Bestandteile in der Natur nicht zusammen angetroffen werden, können sie miteinander funktionieren, z. B. wenn ein Promotor, der heterolog zu einem Gen ist, funktionell mit dem Gen verbunden ist. Ein anderes Beispiel ist, wenn eine Neisseria-Sequenz heterolog zu einer mausstämmigen Wirtszelle ist.
Ein "Replikationsursprung" ist eine Polynucleotidsequenz, die die Replikation von Polynucleotiden wie etwa eines Expressionsvektors einleitet und reguliert. Der Replikationsursprung verhält sich wie eine eigenständige Einheit der Polynucleotid-Replikation innerhalb einer Zelle und ist zu Replikation unter seiner eigenen Kontrolle in der Lage. Ein Replikationsursprung kann für einen Vektor benötigt werden, damit er sich in einer bestimmten Wirtszelle repliziert. Mit bestimmten Replikationsursprüngen kann ein Expressionsvektor in Anwesenheit der geeigneten Proteine innerhalb der Zelle mit einer hohen Anzahl an Kopien reproduziert werden. Beispiele für Replikationsursprünge sind die sich selbständig replizierenden Sequenzen, die in Hefe wirksam sind; und das virale T-Antigen, das in COS-7-Zellen wirksam ist.
Eine "mutierte" Sequenz ist als eine DNA-, RNA- oder Aminosäuresequenz definiert, die sich von der natürlichen oder offenbarten Sequenz unterscheidet, aber homolog zu ihr ist. In Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz ist der Grad an Homologie (Sequenz-Identität) zwischen der natürlichen oder offenbarten Sequenz und der mutierten Sequenz bevorzugt größer als 50% (z. B. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder größer), was, wie vorstehend beschrieben, berechnet wird. Der hierin verwendete Begriff einer "allelen Variante" eines Nucleinsäuremoleküls oder einer Region, für die hierin eine Nucleinsäuresequenz gegeben ist, ist ein Nucleinsäuremolekül oder eine Region, die im Wesentlichen an der selben Stelle in dem Genom eines anderen oder zweiten Isolats auftritt und die auf Grund von natürlicher Variation durch zum Beispiel Mutation oder Rekombination eine ähnliche, aber nicht identische Nucleinsäuresequenz aufweist. Eine allele Variante einer codierenden Region codiert typischerweise ein Protein, welches ähnliche Aktivität zu der des Proteins aufweist, das durch jenes Gen codiert wird, mit dem sie verglichen wird. Eine allele Variante kann auch eine Änderung in den nicht translatierten 5'- oder 3'-Regionen des Gens umfassen, wie etwa in regulatorischen Kontrollregionen. (Vgl. zum Beispiel US-Patent Nr. 5,753,235 ).
Antikörper
Der hierin verwendete Begriff "Antikörper betrifft ein Polypeptid oder eine Gruppe von Polypeptiden, die aus mindestens einer Antikörper kombinierenden Stelle aufgebaut sind. Eine "Antikörper kombinierende Stelle" ist der dreidimensionale Bindungsraum mit einer inneren Oberflächenform und Ladungsverteilung, die komplementär zu den Eigenschaften eines Epitops eines Antigens sind und eine Bindung des Antikörpers mit dem Antigen gestatten. "Antikörper" umschließt zum Beispiel Antikörper von Wirbeltieren, Hybrid-Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, veränderte Antikörper, univalente Antikörper, Fab-Proteine und Antikörper mit einer einzelnen Domäne.
Antikörper gegen die Proteine der Erfindung sind für die Affinitätschromatographie, einen Immuntest und zur Unterscheidung/Identifizierung von menB-Proteinen von Neisseria nützlich. Antikörper, die gegen die Proteine der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, binden an antigene Polypeptide oder Proteine oder Proteinfragmente, die anwesend sind und spezifisch mit menB-Stämmen von Neisseria meningitidis verbunden sind. In einigen Fällen können diese Antigene mit spezifischen Stämmen verbunden sein, wie etwa jene Antigene, die spezifisch für die menB-Stämme sind. Die Antikörper der Erfindung können an einer Matrix immobilisiert und in einem Immuntest oder in einer Säule für eine Affinitätschromatographie verwendet werden, um den Nachweis und/oder die Trennung von Polypeptiden, Proteinen oder Proteinfragmenten oder Zellen, die solche Polypeptide, Proteine oder Proteinfragmente umfassen, zu gestatten. Alternativ können solche Polypeptide, Proteine oder Proteinfragmente immobilisiert werden, um Antikörper nachzuweisen, die in der Lage sind, spezifisch hieran zu binden.
Antikörper gegen Proteine der Erfindung, sowohl polyclonale als auch monoclonale, können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. Allgemein wird das Protein zunächst verwendet, um ein geeignetes Tier, bevorzugt eine Maus, Ratte, ein Kaninchen oder eine Ziege, zu immunisieren. Kaninchen und Ziegen werden auf Grund des erhaltbaren Volumen an Serum und der Verfügbarkeit von markierten anti-Kaninchen- und anti-Ziege-Antikörper für die Herstellung von polyclonalen Seren bevorzugt. Die Immunisierung wird allgemein duch Vermischen oder Emulgieren des Proteins in Kochsalzlösung, bevorzugt in einem Adjuvans wie etwa vollständigem Freundschen Adjuvans und parenterales Injizieren des Gemisches oder der Emulsion (allgemein subkutan oder intramuskulär) durchgeführt. Typischerweise ist eine Dosis von 50–200 μg/Injektion ausreichend. Die Immunisierung wird allgemein 2–6 Wochen später mit einer oder mehreren Injektionen des Proteins in Kochsalzlösung bevorzugt unter Verwendung von unvollständigem Freundschem Adjuvans aufgefrischt. Man kann alternativ Antikörper durch in vitro-Immunisierung unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erzeugen, die für die Zwecke dieser Erfindung als gleichwertig zur in vivo-Immunisierung angesehen wird. Polyclonale Antiseren werden durch Blutabnahme von dem immunisierten Tier in ein Glas- oder Plastikgefäß, Inkubieren des Blutes bei 25°C über eine Stunde und anschließender Inkubation bei 4°C über 2–18 Stunden erreicht. Das Serum wird durch Zentrifugation (z. B. 1.000 g über 10 Minuten) gewonnen. Etwa 20–50 ml pro Abnahme können von Kaninchen gewonnen werden.
Monoclonale Antikörper werden unter Verwendung des Standardverfahrens von Köhler & Milstein (Nature (1975) 256:495–96) oder einer Modifizierung hiervon hergestellt. Typischerweise wird eine Maus oder Ratte immunisiert, wie vorstehend beschrieben. Anstatt dem Tier Blut abzunehmen, um Serum zu entnehmen, wird jedoch die Milz (und optional mehrere große Lymphknoten) entnommen und in einzelne Zellen dissoziiert. Falls gewünscht, können die Milzzellen durchmustert werden (nach Entfernung von adhärenten nicht spezifischen Zellen), indem eine Zellsuspension auf eine Platte oder eine Vertiefung aufgebracht wird, die mit dem Protein-Antigen überzogen ist. B-Zellen, die an die Membran gebundenes Immunglobulin, das für das Antigen spezifisch ist, exprimieren, binden an die Platte und werden nicht mit dem Rest der Suspension abgespült. Resultierende B-Zellen oder alle dissoziierten Milzzellen werden dann angeregt, mit Myelomzellen zu fusionieren, um Hybridome zu bilden, und in einem selektiven Kulturmedium (z. B. Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin-Kulturmedium, "HAT") kultiviert. Die entstandenen Hybridome werden durch limitierende Verdünnung plattiert und auf die Produktion von Antikörper, die spezifisch das immunisierende Antigen binden (und die nicht an nicht-verwandte Antigene binden), untersucht. Die selektierten, MAb sekretierenden Hybridome werden dann entweder in vitro (z. B. in Gewebekultur-Flaschen oder Hohlfaser-Reaktoren) oder in vivo (wie Ascites bei Mäusen) kultiviert.
Falls gewünscht, können die Antikörper (polyclonale oder monoclonale) unter Verwendung herkömmlicher Techniken markiert werden. Geeignete Markierungen umschließen Fluorophore, Chromophore, radioaktive Atome (besonders ³²P und ¹²⁵I), elektronendichte Reagenzien, Enzyme und Liganden, die spezifische Bindungspartner haben. Enzyme werden typischerweise durch ihre Aktivität nachgewiesen. Zum Beispiel wird Meerrettich-Peroxidase gewöhnlich durch ihre Fähigkeit nachgewiesen, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) in ein blaues Pigment umzuwandeln, das mit einem Spektrophotometer quantifizierbar ist. Der Ausdruck "spezifischer Bindungspartner" betrifft ein Protein, das in der Lage ist, ein Ligand-Molekül mit hoher Spezifität zu binden, wie zum Beispiel in dem Fall eines Antigens und eines monoclonalen Antikörpers, der hierfür spezifisch ist. Andere spezifische Bindungspartner umschließen Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, und die zahlreichen Rezeptor-Ligand-Paare, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Es sollte deutlich sein, dass die vorstehende Beschreibung nicht dazu dienen soll, die verschiedenen Markierungen bestimmten Klassen zuzuordnen, da die selbe Markierung auf mehrere unterschiedliche Arten verwendet werden kann. Zum Beispiel kann ¹²⁵I als eine radioaktive Markierung oder als ein elektronendichtes Reagenz dienen. HRP kann als Enzym oder als Antigen für einen mAK dienen. Darüber hinaus kann man verschiedene Markierungen für eine gewünschte Wirkung kombinieren. Zum Beispiel erfordern bei der Ausführung dieser Erfindung mAK und Avidin ebenfalls Markierungen: auf diese Weise könnte man einen mAK mit Biotin markieren und seine Anwesenheit mit Avidin, das mit ¹²⁵I markiert ist, oder mit einem anti-Biotin-mAK, der mit HRP markiert ist, nachweisen. Andere Permutationen und Möglichkeiten werden sich Fachleuten auf dem Gebiet leicht erschließen, und sie werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung als gleichwertig angesehen.
Antigene, Immunogene, Polypeptide, Proteine oder Proteinfragmente der vorliegenden Erfindung rufen die Bildung von spezifischen Bindungspartner-Antikörpern hervor. Diese Antigene, Immunogene, Polypeptide, Proteine oder Proteinfragmente der vorliegenden Erfindung umfassen immunogene Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Solche immunogenen Zusammensetzungen können darüber hinaus Adjuvantien, Trägerstoffe oder andere Zusammensetzungen umfassen oder einschließen, welche die Antigene, Polypeptide, Proteine oder Proteinfragmente der vorliegenden Erfindung unterstützen oder verstärken oder stabilisieren. Solche Adjuvantien und Trägerstoffe werden sich Fachleuten auf dem Gebiet leicht erschließen.
Arzneimittel
Arzneimittel können entweder Polypeptide, Antikörper, oder Nucleinsäuren der Erfindung umfassen (einschließen). Die Arzneimittel werden eine therapeutisch wirksame Menge an entweder Polypeptiden, Antikörpern oder Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung umfassen.
Der hierin verwendete Ausdruck „therapeutisch wirksame Menge" betrifft eine Menge eines therapeutischen Agens zur Behandlung, Linderung oder Verhinderung einer bestimmten Krankheit oder eines bestimmten Zustandes oder um eine nachweisbare therapeutische oder präventive Wirkung zu zeigen. Die Wirkung kann zum Beispiel durch chemische Markierungen oder Antigen-Spiegel nachgewiesen werden. Therapeutische Wirkungen umschließen auch die Reduktion physischer Symptome wie etwa gesunkener Körpertemperatur nach Verabreichung an einen fiebrigen Patienten. Die genaue wirksame Menge für einen Patienten wird von der Größe und dem Gesundheitszustand des Patienten, der Art und des Ausmaßes des Zustandes und der therapeutischen Mittel oder Kombination an therapeutischen Mitteln, die zur Verabreichung ausgewählt wurden, abhängig sein. Es ist daher nicht sinnvoll, eine genaue wirksame Menge im Voraus festzulegen. Die wirksame Menge für eine gegebene Situation kann jedoch durch Routineuntersuchungen bestimmt werden und liegt im Ermessen des Arztes.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine wirksame Dosis von etwa 0,01 mg/kg bis 50 mg/kg oder von 0,05 mg/kg bis etwa 10 mg/kg der DNA-Konstruktionen für das Individum, dem sie verabreicht wird, ausreichen.
Arzneimittel kann auch einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff enthalten. Der Ausdruck „pharmazeutisch verträglicher Trägerstoff" betrifft einen Trägerstoff zur Verabreichung eines therapeutischen Agens wie etwa Antikörpern oder eines Polypeptids, Genen und anderen therapeutischen Agenzien. Der Ausdruck betrifft jeden beliebigen pharmazeutischen Trägerstoff, der nicht selbst die Produktion von Antikörpern anregt, die dem Individuum, welches die Zusammensetzung erhält, Schaden zufügen, und der ohne ungebührliche Toxizität verabreicht werden kann. Geeignete Trägerstoffe können große Makromoleküle sein, die langsam im Körper abgebaut werden, wie etwa Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Kopolymere und inaktive Viruspartikel. Solche Trägerstoffe sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt.
Pharmazeutisch verträgliche Salze können hierin verwendet werden, zum Beispiel Mineralsäure-Salze wie etwa Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate, Sulfate und dergleichen; und die Salze von organischen Säuren, wie Acetate, Propionate, Malonate, Benzoate und dergleichen. Eine umfassende Diskussion von pharmazeutisch verträglichen Exzipien ist in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J. 1991) verfügbar.
Pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe in Arzneimitteln können Flüssigkeiten wie etwa Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin und Ethanol enthalten. Zusätzlich können Hilfssubstanzen wie etwa benetzende oder emulgierende Agenzien, pH-Wert puffernde Substanzen und dergleichen in solchen Trägerstoffen vorliegen. Typischerweise werden die Arzneimittel als Injektionslösungen hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, die zur Lösung in oder Suspension in flüssigen Trägerstoffen vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Liposomen sind in die Definition für einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff eingeschlossen.
Abgabeverfahren
Sobald die Zusammensetzungen der Erfindung formuliert worden sind, können sie dem Individuum direkt verabreicht werden. Die zu behandelnden Individuen können Tiere sein; besonders menschliche Patienten können behandelt werden.
Direkte Verabreichung der Zusammensetzungen wird allgemein durch Injektion erreicht, entweder subkutan, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär, oder sie wird in den interstitiellen Raum eines Gewebes verabreicht. Die Zusammensetzungen können auch in eine Verletzung hinein verabreicht werden. Andere Verabreichungswege umschließen orale Verabreichung und pulmonale Verabreichung, Suppositorien und transdermale und transkutane Verabreichungen, Nadeln und Gen-Schussvorrichtungen oder Hyposprays. Die Dosierung kann über einen Behandlungsplan mit einer Einzeldosis oder mit Mehrfachdosen erfolgen.
Impfstoffe
Impfstoffe im Einklang mit der Erfindung könne entweder prophylaktisch (d. h. zur Verhinderung einer Infektion) oder therapeutisch (d. h. zur Behandlung einer Krankheit nach der Infektion) wirken.
Solche Impfstoffe umfassen immunisierende Antigen(e) oder Immunogen(e), immunogenes Polypeptid, Protein(e) oder Proteinfragmente oder Nucleinsäuren (z. B. Ribonucleinsäure oder Desoxyribonucleinsäure), gewöhnlich in Verbindung mit „pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen", die jeden beliebigen Trägerstoff einschließen, der nicht selbst die Produktion von Antikörpern anregt, die dem Individuum, welches die Zusammensetzung erhält, Schaden zufügen. Geeignete Trägerstoffe sind typischerweise große Makromoleküle, die langsam im Körper abgebaut werden, wie etwa Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Kopolymere, Lipid-Aggregate (wie etwa Öltröpfchen oder Liposomen) und inaktive Viruspartikel. Solche Trägerstoffe sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Zusätzlich können diese Trägerstoffe als immunstimulierende Agenzien („Adjuvantien") wirken. Darüber hinaus kann das Immunogen oder Antigen an ein bakterielles Toxin konjugiert sein, wie etwa ein Toxoid der Diphtherie-, Tetanus-, Cholera-, H. pylori-Pathogene und dergleichen.
Bevorzugte Adjuvantien zur Verstärkung der Wirksamkeit der Zusammensetzung umschließen, sind aber nicht hierauf beschränkt: (1) Aluminiumsalze (Alaun) wie etwa Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminumsulfat etc; (2) Formulierungen von Öl-in-Wasser-Emulsion (mit anderen spezifischen immunstimulierenden Agenzien wie etwa Muramylpeptiden (vgl. nachstehend) oder Bestandteilen der Bakterienwand oder ohne sie) wie etwa zum Beispiel (a) MF59 (PCT-Veröffentl. Nr. WO 90/14837 ), das 5% Squalen, 0,5% Tween 80 und 0,5% Span 85 enthält (optional verschiedene Mengen an MTP-PE (vgl. nachstehend) enthaltend, jedoch nicht erforderlich), formuliert in Submikron-Partikel unter Verwendung eines Mikroverflüssigers wie etwa des Mikroverflüssigers Modell 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, das 10% Squalan, 0,4% Tween 80, 5% pluronisch blockiertes Polymer L121 und thr-MDP enthält (vgl. nachstehend), entweder in einer Submikron-Emulsion mikroverflüssigt oder einer Vortex-Behandlung unterzogen, um eine Emulsion mit größeren Partikeln zu erzeugen, und (c) RibiTM-Adjuvanssystem (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), das 2 Squalen, 0,2% Tween 80 und eine oder mehrere Bestandteile der Bakterienzellwand aus der aus Monophosphorylipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM) und dem Zellwandskelett (CWS) bestehenden Gruppe enthält, bevorzugt MPL + CWS (Detox^TM); (3) Saponin-Adjuvantien wie etwa Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) oder Partikel, die hieraus erzeugt werden, wie etwa ISCOMs (immunstimulierende Komplexe) können verwendet werden; (4) vollständiges Freundsches Adjuvans (CFA) und unvollständiges Freundsches Adjuvant (IFA); (5) Cytokine wie etwa Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 etc.), Interferone (z. B. gamma-Interferon), Makrophagenkolonie stimulierender Faktor (M-CSF), Tumornekrosefaktor (TNF) etc; und (6) andere Substanzen, die als immunstimulierende Agenzien wirken, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu verstärken. Alaun und MF59 sind bevorzugt.
Wie vorstehend genannt, umschließen Muramylpeptide, sind aber nicht hierauf beschränkt, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutam in (thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE) etc.
Die Impfstoffzusammensetzungen, die immunogene Zusammensetzungen enthalten, (z. B. die das Antigen, den pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff und das Adjuvans einschließen können) werden typischerweise Verdünnungsmittel wie etwa Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol etc. enthalten. Zusätzlich können unterstützende Substanzen wie etwa benetzende und emulgierende Agenzien, pH-Wert puffernde Substanzen und dergleichen in solchen Trägerstoffen vorliegen. Alterntiv können Impfstoffzusammensetzungen, die immunogene Zusammensetzungen umfassen, ein Antigen, Polypeptid, Protein, Proteinfragment oder eine Nucleinsäure in einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff umfassen.
Genauer umfassen Impfstoffe, die immunogene Zusammensetzungen umfassen, sowohl eine immunologisch wirksame Menge der immunogenen Polypeptide als auch jeden beliebigen anderen der vorstehend genannten Bestandteile, falls notwendig. „Immunologisch wirksame Menge" bedeutet, dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum, entweder in einer Einzeldosis oder als Teil einer Reihe von Verabreichungen, bei Behandlung oder Prävention wirksam ist. Dies Menge variiert mit der Gesundheit und dem physischen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z. B. nicht menschlicher Primat, Primat etc.), der Leistungsfähigkeit des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren, dem Grad des gewünschten Schutzes, der Formulierung des Impfstoffes, der Einschätzung der medizinischen Situation durch den behandelnden Arzt und anderen relevanten Faktoren. Es wird erwartet, dass die Menge in einem relativ breiten Bereich liegt, der durch Routineuntersuchungen bestimmt werden kann.
Typischerweise werden die Impfstoffzusammensetzungen oder immunogenen Zusammensetzungen als injizierbare Substanzen hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, die zur Lösung in oder Suspension in flüssigen Trägerstoffen vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Das Präparat kann auch für eine verstärkte Adjuvanswirkung emulgiert oder in Liposomen eingeschlossen sein, wie vorstehend für die pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffe diskutiert worden ist.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden gewöhnlich parenteral verabreicht, z. B. durch Injektion, entweder subkutan oder intramukulär. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Verabreichungsweisen geeignet sind, umschließen Formulierungen für orale Verabreichung und pulmonale Verabreichung, Suppositorien und transdermale und transkutane Anwendungen. Die Dosierung kann über einen Einzeldosen-Behandlungsplan oder über einen Behandlngsplan mit mehrenen Dosen erfolgen. Der Impfstoff kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Agenzien verabreicht werden.
Als eine Alternative zu Impfstoffen, die auf Protein beruhen, kann eine DNA-Impfung durchgeführt werden (z. B. Robinson & Torres, (1997) Seminars in Immunology 9:271–283; Donnelly et et. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:617–648).
Trägerstoffe zur Genabgabe
Trägerstoffe in der Gentherapie zur Abgabe von Konstruktionen, einschließlich einer codierenden Sequenz eines therapeutischen Mittels der Erfindung, die an den Säuger zur Expression in dem Säuger abgegeben werden sollen, können entweder lokal oder systemisch verabreicht werden. Diese Konstruktionen können virale oder nicht virale Vektor-Ansätze in in vivo- oder ex vivo-Modalität verwenden. Die Expression einer solchen codierenden Sequenz kann unter Verwendung von endogenen säugerstämmigen oder heterologen Promotoren induziert werden. Die Expression der codierenden Sequenz in vivo kann entweder konstitutiv oder reguliert erfolgen.
Die Erfindung umschließt Trägerstoffe zur Genabgabe, die in der Lage sind, die betrachteten Nucleinsäuresequenzen zu exprimieren. Das Trägersystem zur Genabgabe ist bevorzugt ein viraler Vektor und mehr bevorzugt ein retroviraler, adenoviraler, adeno-assoziierter viraler (MV), Herpesvirus- oder Alphavirus-Vektor. Der virale Vektor kann auch ein viraler Vektor sein, der vom Astrovirus, Coronavirus, Orthomyxovirus, Papovavirus, Paramyxovirus, Parvovirus, Picomavirus, Pockenvirus oder Togavirus stammt. Vgl. allgemein Jolly, (1994) Cancer Gene Therapy 1:51–64; Kimura, (1994) Human Gene Therapy 5:845–852; Connelly, (1995) Human Gene Therapy 6:185–193; und Kaplitt, (1994) Nature Genetics 6:148–153.
Retrovirale Vektoren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, einschließlich der Retroviren vom Typ B, C und D, xenotroper Retroviren (zum Beispiel NZB-X1, NZB-X2 und NZB9-1 (vgl. O'Neill, (1985) J. Virol. 53:160), polytroper Retroviren, z. B. MCF und MCF-MLV (vgl. Kelly, (1983) J. Virol. 45:291), Spumaviren und Lentiviren. Vgl. RNA Tumor Viruses, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.
Abschnitte des retroviralen Gentherapie-Vektors können von verschiedenen Retroviren stammen. Zum Beispiel können Retrovektor-LTRs von einem murinen Sarkom-Virus, einer tRNA bindenden Stelle eines Rous-Sarkom-Virus, einem Verpackungssignal von einem murinen Leukämie-Virus und einem Ursprung für die Synthese des zweiten Stranges von einem Vogel-Leukose-Virus stammen.
Diese rekombinanten retroviralen Vektoren können verwendet werden, um transduktionskompetente retrovirale Vektor-Partikel zu erzeugen, indem sie in geeignete Verpackungszelllinien eingeführt werden (vgl. US-Patent Nr. 5,591,624 ). Retrovirus-Vektoren können für eine stellenspezifische Integration in Wirtszell-DNA konstruiert werden, indem ein chimäres Integrase-Enzym in den retroviralen Partikel inkorporiert wird (vgl. WO96/37626 ). Es ist bevorzugt, dass der rekombinante virale Vektor ein replikationsdefekes rekombinantes Virus ist.
Verpackungszelllinien, die für die Verwendung mit den vorstehend beschriebenen Retrovirus-Vektoren geeignet sind, sind auf dem Fachgebeit gut bekannt, können leicht hergestellt werden (vgl. WO95/30763 und WO92/05266 ) und können verwendet werden, um Produzentenzelllinen (auch Vektor-Zellinien oder „VCLs" genannt) zur Produktion von rekombinanten Vektor-Partikeln zu erzeugen. Bevorzugt werden die Verpackungszelllinien aus menschlichen Elternzellen (z. B. HT1080- Zellen) oder aus vom Mink stammenden Elternzellen hergestellt, was die Inaktivierung in menschlichem Serum ausschließt.
Bevorzugte Retroviren für die Konstruktion von retroviralen Vektoren für die Gentherapie umschließen das Vogel-Leukose-Virus, Rinder-Leukämie-Virus, murine Leukämie-Virus, Mink-Zell-Focus-Induzierende Virus, murine Sarkom-Virus, Retikuloendotheliose-Virus und Rous-Sarkom-Virus. Besonders bevorzugte murine Leukämie-Viren umschließen 4070A und 1504A (Hartley und Rowe, (1976) J. Virol. 19:19–25), Abelson (ATCC-Nr. VR-999), Friend (ATCC-Nr. VR-245), Graffi, Gross (ATCC-Nr. VR-590), Kirsten, Harvey-Sarkom-Virus und Rauscher (ATCC-Nr. VR-998) und das murine Moloney-Leukämie-Virus (ATCC-Nr. VR-190). Solche Retroviren können aus Hinterlegungsstellen oder Sammlungen wie etwa der American Type Culture Collection ("ATCC") in Rockville, Maryland bezogen oder aus bekannten Quellen unter Verwendung allgemein zugänglicher Techniken isoliert werden.
Exemplarische, bekannte retrovirale Vektoren für die Gentherapie, die in dieser Erfindung verwendet werden können, umschließen jene, die in den nachstehenden Patentanmeldungen beschrieben werden: GB2200651 , EP0415731 , EP0345242 , EP0334301 , WO89/02468 ; WO89/05349 , WO89/09271 , WO90/02806 , WO90/07936 , WO94/03622 , WO93/25698 , WO93/25234 , WO93/11230 , WO93/10218 , WO91/02805 , WO91/02825 , WO95/07994 , US 5,219,740 , US 4,405,712 , US 4,861,719 , US 4,980,289 , US 4,777,127 , US 5,591,624 . Vgl. auch Vile, (1993) Cancer Res. 53:3860–3864; Vile, (1993) Cancer Res. 53:962–967; Ram, (1993) Cancer Res. 53 (1993) 83–88; Takamiya, (1992) J. Neurosci. Res. 33:493–503; Baba, (1993) J. Neurosurg. 79:729–735; Mann, (1983) Cell 33:153; Cane, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6349; und Miller, (1990) Human Gene Therapy 1.
Menschliche adenovirale Vektoren zur Gentherapie sind ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt und können in dieser Erfindung eingesetzt werden. Vgl. zum Beispiel Berkner, (1988) Biotechniques 6:616 und Rosenfeld, (1991) Science 252:431, und WO93/07283 , WO93/06223 und WO93/07282 . Exemplarische, bekannte adenovirale Vektoren für die Gentherapie, die in dieser Erfindung verwendet werden können, umschließen jene, die in den vorstehend zitierten Dokumenten und in WO94/12649 , WO93/03769 , WO93/19191 , WO94/28938 , WO95/11984 , WO95/00655 , WO95/27071 ; WO95/29993 , WO95/34671 , WO96/05320 , WO94/08026 , WO94/11506 , WO93/06223 , WO94/24299 , WO95/14102 , WO95/24297 , WO95/02697 , WO94/28152 , WO94/24299 , WO95/09241 , WO95/25807 , WO95/05835 , WO94/18922 und WO95/09654 beschrieben worden sind. Alternativ kann die Verabreichung von DNA, gebunden an abgetötetes Adenovirus, wie von Curiel, (1992) Hum. Gene Ther. 3:147–154 beschrieben, verwendet werden. Die Trägerstoffe zur Genabgabe der Erfindung umschließen auch Adenovirus-assoziiertes Virus-(AAV)-Vektoren. Führende und bevorzugte Beispiele für solche Vektoren zur Verwendung in dieser Erfindung sind die auf AAV-2 basierenden Vektoren, offenbart von Srivastava, WO93/09239 . Die am meisten bevorzugten AAV-Vektoren umfassen die beiden invertierten terminalen AAV-Wiederholungssequenzen, in denen die natürlichen D-Sequenzen durch Substitution von Nucleotiden modifiziert worden sind, so dass mindestens 5 natürliche Nucleotide und bis zu 18 natürliche Nucleotide, bevorzugt mindestens 10 natürliche Nukleotide und bis zu 18 natürliche Nucleotide, am meisten bevorzugt 10 natürliche Nukleotide beibehalten werden und die restlichen Nucleotide der D-Sequenz deletiert oder durch nicht natürliche Nucleotide ersetzt sind. Die natürlichen D-Sequenzen der invertierten terminalen AAV-Wiederholungssequenzen sind Sequenzen von 20 aufeinanderfolgenden Nucleotiden in jeder invertierten terminalen AAV-Wiederholungssequenz (d. h., es befindet sich eine Sequenz an jedem Ende), die nicht an der HP-Bildung beteiligt sind. Das nicht natürliche Ersatz-Nucleotid kann jedes Nucleotid sein, das nicht in der natürlichen D-Sequenz in der gleichen Position vorkommt. Andere verwendbare, beispielhafte AAV-Vektoren sind pWP-19, pWN-1, die beide von Nahreini, (1993) Gene 124:257–262, offenbart werden. Ein anderes Beispiel für einen solchen AAV-Vektor ist psub201 (vgl. Samulski, (1987) J. Virol. 61:3096). Ein anderer beispielhafter AAV-Vektor ist der Doppel-D-ITR-Vektor. Die Konstruktion des Doppel-D-ITR-Vektors wird im US-Patent Nr. 5,478,745 offenbart. Noch andere Vektoren sind jene, die von Carter, US-Patent Nr. 4,797,368 und Muzyczka, US-Patent Nr. 5,139,941 , Chartejee, US-Patent 5,474,935 , und Kotin WO94/288157 offenbart worden sind. Noch ein weiteres Beispiel für einen AAV-Vektor, der in dieser Erfindung verwendet werden kann, ist SSV9AFABTKneo, welcher den AFP-Enhancer und Albumin-Promotor enthält und die Expression überwiegend in der Leber steuert. Seine Struktur und Konstruktion werden von Su, (1996) Human Gene Therapy 7:463–470 offenbart. Zusätzliche AAV-Vektoren für die Gentherapie werden in den Patenten US 5,354,678 , US 5,173,414 , US 5,139,941 , und US 5,252,479 beschrieben.
Die Vektoren für die Gentherapie, die Sequenzen der Erfindung umfassen, umschließen auch Herpes-Vektoren. Führende und bevorzugte Beispiele sind Vektoren des Herpes simplex-Virus, die eine Sequenz enthalten, die ein Thymidinkinase-Polypeptid codiert, wie etwa jene, die in den Patenten US 5,288,641 und EP0176170 (Roizman) offenbart worden sind. Zusätzliche beispielhafte Vektoren des Herpes simplex-Virus umschließen HFEM/ICP6-LacZ, offenbart in WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac, beschrieben von Geller, (1988) Science 241:1667–1669 und in WO90/09441 und WO92/07945 , HSV Us3::pgC-lacZ, beschrieben von Fink, (1992) Human Gene Therapy 3:11–19, und HSV 7134, 2 RH 105 und GAL4, beschrieben in EP0453242 (Breakefield), und jene, die bei der ATCC als Zugangsnummern ATCC VR-977 und ATCC VR-260 hinterlegt worden sind.
Ebenfalls in Betracht gezogen werden Alphavirus-Vektoren für die Gentherapie, die in dieser Erfindung verwendet werden können. Bevorzugte Alphavirus-Vektoren sind die Vektoren der Sindbis-Viren, Togaviren, Semliki-Forest-Virus (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), Middleberg-Virus (ATCC VR-370), Ross-River-Virus (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), Venezuelischer Pferde-Enzephalitis-Virus (ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532), und jene, die in den US-Patenten Nr. 5,091,309 , 5,217,879 und WO92/10578 beschrieben werden. Insbesondere sind jene Alphavirus-Vektoren, die in den US-Seriennr. 08/405,627, eingereicht am 15. März 1995, WO94/21792 , WO92/10578 , WO95/07994 , US 5,091,309 und US 5,217,879 beschrieben werden, verwendbar. Solche alpha-Viren können aus Hinterlegungsstellen oder Sammlungen wie etwa der ATCC in Rockville, Maryland, bezogen oder aus bekannten Quellen unter Verwendung von allgemein verfügbaren Techniken isoliert werden. Bevorzugt werden Alphavirus-Vektoren mit reduzierter Cytotoxizität verwendet (vgl. USSN 08/679640).
DNA-Vektorsysteme wie etwa eukaryontisch geschichtete („eukaryotic layered") Expressionssysteme sind ebenfalls für das Exprimieren der Nucleinsäuren der Erfindung von Nutzen. Vgl. WO95/07994 für eine genaue Beschreibung von eukaryontisch geschichteten Expressionssystemen. Bevorzugt stammen die eukaryontisch geschichteten Expressionssysteme der Erfindung von Alphavirus-Vektoren und am meisten bevorzugt von Sindbis-Virus-Vektoren.
Andere virale Vektoren, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umschließen jene, die von nachstehenden Viren stammen: Poliovirus, zum Beispiel ATCC VR-58, und jene, die von Evans, Nature 339 (1989) 385 und Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115, beschrieben werden; Rhinovirus, zum Beispiel ATCC VR-1110 und jene, die von Arnold, (1990) J. Cell. Biochem. 1401 beschrieben werden; Pockenviren wie etwa das kanarische Pockenvirus oder Vaccinia-Virus, zum Beispiel ATCC VR-111 und ATCC VR-2010 und jene, die von Fisher-Hoch, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:317; Flexner, (1989) Ann. NY Acad. Sci. 569:86, Flexner, (1990) Vaccine 8:17; in US-Patent Nr. 4,603,112 und US-Patent Nr. 4,769,330 und WO89/01973 beschrieben werden; SV40-Virus, zum Beispiel ATCC VR-305 und jene, die von Mulligan, (1979) Nature 277:108 und Madzak, (1992) J. Gen. Virol. 73:1533 beschreiben werden; Influenza-Virus, zum Beispiel ATCC VR-797 und rekombinante Influenza-Viren, die durch Verwendung reverser Gentechniken hergestellt worden sind, wie in US-Patent Nr. 5,166,057 und von Enami, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3802–3805; Enami & Palese (1991) J. Virol. 65:2711–2713 und Luytjes, (1989) Cell 59:110 beschrieben worden sind (vgl. auch McMichael, (1983) NEJ. Med. 309:13 und Yap, (1978) Nature 273:238 und Nature (1979) 277:108); Immunschwäche-Virus des Menschen, wie in EP-0386882 und von Buchschacher, (1992) J. Virol. 66:2731 beschrieben; Masernvirus, zum Beispiel ATCC VR-67 und VR-1247 und jene, die in EP-0440219 beschrieben werden; Aura-Virus, zum Beispiel ATCC VR-368; Bebaru-Virus, zum Beispiel ATCC VR-600 und ATCC VR-1240; Cabassou-Virus, zum Beispiel ATCC VR-922; Chikungunya-Virus, zum Beispiel ATCC VR-64 und ATCC VR-1241; Fort-Morgan-Virus, zum Beispiel ATCC VR-924; Getah-Virus, zum Beispiel ATCC VR-369 und ATCC VR-1243; Kyzylagach-Virus, zum Beispiel ATCC VR-927; Mayaro-Virus, zum Beispiel ATCC VR-66; Mucambo-Virus, zum Beispiel ATCC VR-580 und ATCC VR-1244; Ndumu-Virus, zum Beispiel ATCC VR-371; Pixuna-Virus, zum Beispiel ATCC VR-372 und ATCC VR-1245; Tonate-Virus, zum Beispiel ATCC VR-925; Triniti-Virus, zum Beispiel ATCC VR-469; Una-Virus, zum Beispiel ATCC VR-374; Whataroa-Virus, zum Beispiel ATCC VR-926; Y-62-33-Virus, zum Beispiel ATCC VR-375; O'Nyong-Virus, Östliches Enzephalitis-Virus, zum Beispiel ATCC VR-65 und ATCC VR-1242; Westliches Enzephalitis-Virus, zum Beispiel ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 und ATCC VR-1252; und Coronavirus, zum Beispiel ATCC VR-740 und jene, die von Hamre, (1966) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 121:190 beschrieben werden.
Die Abgabe der Zusammensetzungen dieser Erfindung in Zellen ist nicht auf die vorstehend genannten viralen Vektoren beschränkt. Andere Verfahren und Medien zur Abgabe können verwendet werden, wie zum Beispiel Nucleinsäure Expressionsvektoren, polykationische kondensierte DNA, nur verbunden oder nicht verbunden mit einem abgetöteten Adenovirus, vgl. zum Beispiel US-Seriennr. 08/366,787, eingereicht am 30. Dezember 1994 und Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147–154, über Liganden verbundene DNA, vgl. zum Beispiel Wu, (1989) J. Biol. Chem. 264:16985–16987, eukaryontische Trägerzellen zur Abgabe, vgl. zum Beispiel US-Seriennr. 08/240,030, eingereicht am 9. Mai 1994, und US-Seriennr. 08/404,796, Hinterlegung von photopolymerisierten Hydrogel-Materialien, handgehaltene Gentransfer-Partikelpistole, wie in US-Patent Nr. 5,149,655 beschrieben, ionisierende Strahlung, wie in US-Patent Nr. 5,206,152 und in WO92/11033 beschrieben, Neutralisierung der Nucleinsäureladung oder Fusion mit Zellmembranen. Zusätzliche Ansätze werden von Philip, (1994) Mol. Cell. Biol. 14:2411–2418 und von Woffendin, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581–1585, beschrieben.
Durch Partikel vermittelter Gentransfer kann verwendet werden, vgl. zum Beispiel US-Seriennr. 60/023,867. Seit Kurzem kann die Sequenz in herkömmliche Vektoren, die herkömmliche Kontrollsequenzen zur Expression in hohen Spiegeln enthalten, inseriert und dann mit synthetischen Gentransfer-Molekülen inkubiert werden, wie etwa mit polymeren DNA-bindenden Kationen wie Polylysin, Protamin und Albumin, die an Zellen anzielende Liganden gebunden werden, wie etwa Asialorosomucoid, wie von Wu & Wu, (1987) J. Biol. Chem. 262:4429–4432 beschrieben, Insulin, wie von Hucked, (1990) Biochem. Pharmacol. 40:253–263 beschrieben, Galactose, wie von Plank, (1992) Bioconjugate Chem. 3:533–539 beschrieben, Lactose oder Transferrin.
Nackte DNA kann ebenfalls verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transformieren. Beispielhafte Einführungsverfahren für nackte DNA werden in WO 90/11092 und US-Patent Nr. 5,580,859 beschrieben. Die Wirksamkeit der Aufnahme kann durch die Verwendung von biologisch abbaubaren Latex-Perlen verbessert werden. Mit DNA überzogene Latex-Perlen werden nach Einleitung der Endocytose durch die Perlen mit hoher Wirksamkeit in die Zellen transportiert. Die Verfahren können darüber hinaus verbessert werden, indem die Perlen behandelt werden, um die Hydrophobie zu erhöhern und damit den Aufbruch des Endosoms zu erleichtern und die DNA in das Cytoplasma freizusetzen.
Liposomen, die als Gen-Abgabesysteme verwendet werden können, werden in US 5,422,120 , WO95/13796 , WO94/23697 , WO91/14445 und EP-524,968 beschrieben. Wie in USSN. 60/023,867 beschrieben, können bei nicht viraler Abgabe die Nucleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid codieren, in herkömmliche Vektoren, die herkömmliche Kontrollsequenzen zur Expression in hohen Spiegeln enthalten, inseriert werden, und dann mit synthetischen Molekülen zum Gentransfer inkubiert werden, etwa mit polymeren DNA-bindenden Kationen wie Polylysin, Protamin und Albumin, die an Zellen anzielende Liganden wie etwa Asialorosomucoid, Insulin, Galactose, Lactose oder Transferrin gebunden sind. Andere Abgabesysteme umschließen die Verwendung von Liposomen, um DNA, die das Gen unter der Kontrolle einer Reihe von gewebespezifischen oder ubiquitär aktiven Promotoren umfasst, einzukapseln. Weitere nicht virale Abgabe, die für die Verwendung geeignet ist, umschließt mechanische Abgabesysteme wie etwa der Ansatz, der von Woffendin et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):11581–11585, beschrieben wird. Darüber hinaus kann die codierende Sequenz und das Produkt ihrer Expression durch die Ablagerung von photopolymerisierten Hydrogel-Materialien abgegeben werden. Andere herkömmliche Verfahren zur Gen-Abgabe, die zur Abgabe der codierenden Sequenz verwendet werden können, umschließen zum Beispiel die Verwendung von handgehaltenen Gentransfer-Partikelpistolen, wie in US-Patent Nr. 5,149,655 beschrieben; die Verwendung von ionisierender Strahlung zur Aktivierung des transferrierten Gens, wie in den Patenten US 5,206,152 und WO92/11033 beschrieben.
Beispielhafte Liposom- und polykationische Gen-Abgabesysteme sind jene, die in den US-Patenten US 5,422120 und 4,762,915 ; in WO95/13796 ; WO94/23697 ; und WO91/14445 ; in EP-0524968 ; und von Stryer, Biochemistry, Seiten 236–240 (1975) W. H. Freeman, San Francisco; Szoka, (1980) Biochem. Biophys. Acta 600:1; Bayer, (1979) Biochem. Biophys. Acta 550:464; Rivnay, (1987) Meth. Enzymol. 149:119; Wang, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7851; Plant, (1989) Anal. Biochem. 176:420 beschrieben werden.
Eine Polynucleotid-Zusammensetzung kann die therapeutisch wirksame Menge eines Trägerstoffes für Gentherapie im Rahmen der vorstehenden Definition umfassen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine wirksame Dosis zwischen etwa 0,01 mg/kg bis 50 mg/kg oder 0,05 mg/kg bis etwa 10 mg/kg der DNA-Konstruktionen in dem Individuum, dem sie verabreicht wird, betragen.
Abgabeverfahren
Sobald sie formuliert sind, können die Polynucleotid-Zusammensetzungen der Erfindung verabreicht werden: (1) dem Individuum direkt; (2) als ex vivo-Abgabe an Zellen, die von dem Individuum stammen; oder (3) in vitro zur Expression von rekombinanten Proteinen. Die zu behandelnden Individuen können Säuger oder Vögel sein. Auch Menschen können behandelt werden.
Direkte Abgabe der Zusammensetzungen wird allgemein durch Injektion erfolgen, entweder subkutan, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär, oder sie wird in den interstitiellen Raum eines Gewebes abgegeben. Die Zusammensetzungen können auch in einen Tumor oder eine Verletzung verabreicht werden. Andere Verabreichungswege umschließen orale Verabreichung und pulmonale Verabreichung, Suppositorien und transdermale Anwendungen, Nadeln und Gen-Pistolen oder Hyposprays. Die Dosierung kann nach einem Behandlungsplan mit einer Einzeldosis oder einem Behandlungsplan mit mehrfachen Dosen erfolgen.
Verfahren für die ex vivo-Abgabe und Reimplantation von transformierten Zellen in ein Individuum sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden z. B. in WO93/14778 beschrieben. Beispiele für Zellen, die für die ex vivo-Anwendungen nützlich sind, umschließen zum Beispiel Stammzellen, besonders hämatopoetische, Lymphzellen, Makrophagen, dendritische Zellen oder Tumorzellen.
Allgemein kann die Abgabe von Nucleinsäuren sowohl für ex vivo- als auch für in vitro-Anwendungen mit den nachstehenden Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel der durch Dextran vermittelten Transfizierung, Calciumphosphat-Fällung, durch Polybren vermittelte Transfizierung, Protoplastenfusion, Elektroporation, Einkapselung des Polynucleotids/der Polynucleotide in Liposomen und direkte Mikroinjektion der DNA in die Kerne; alle Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Polynucleotid- und Polypeptid-Arzneimittel
Zusätzlich zu den pharmazeutisch verträglichen, vorstehend beschriebenen Trägerstoffen und Salzen können die nachstehenden zusätzlichen Agenzien mit Polynucleotid- und/oder Polypeptid-Zusammensetzungen verwendet werden.
A. Polypeptide
Ein Beispiel sind Polypeptide, die, ohne Beschräunkung, einschließen: Asiolorosomucoid (ASOR); Transferrin; Asialglycoproteine; Antikörper; Antikörper-Fragmente; Ferritin; Interleukine; Interferone, Granulocyten-Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF), Granulozytenkolonie stimulierenden Faktor (G-CSF), Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (M-CSF), Stammzellfaktor und Erythropoietin. Virale Antigene wie etwa Hüllproteine können ebenfalls verwendet werden. Auch Proteine von anderen invasiven Organismen wie etwa das 17 Aminosäuren umfassende Peptid des Circumsporozoit-Proteins von Plasmodium falciparum, bekannt als RII, können verwendet werden.
B. Hormone, Vitamine etc.
Andere Gruppen, die eingeschlossen werden können, sind zum Beispiel: Hormone, Steroide, Androgene, Östrogene, Thyroidhormon oder Vitamine, Folsäure.
C. Polyalkylene, Polysaccharide etc.
Auch Polyalkylenglykol kann mit den gewünschten Polynucleotiden oder Polypeptiden eingeschlossen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Polyalkylenglykol ein Polyethlylenglycol. Zusätzlich können Mono-, Di- oder Polysaccaride eingeschlossen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts ist das Polysaccharid Dextran oder DEAE-Dextran. Auch Chitosan und Poly(lactid-co-glycolid).
D. Lipide und Liposomen
Das gewünschte Polynucleotid oder Polypeptid kann auch in Lipide eingeschlossen werden oder vor der Abgabe an das Individuum oder an Zellen, die von diesem abstammen, in Liposomen verpackt werden.
Der Einschluss in ein Lipid wird allgemein erreicht, indem Liposomen verwendet werden, die in der Lage sind, Nucleinsäure stabil zu binden oder einzufangen und zurückzuhalten. Das Verhältnis von kondensiertem Polynucleotid oder Polypeptid zum Lipidpräparat kann variieren, wird aber allgemein etwa 1:1 (mg DNA:Mikromol Lipid) betragen oder einen höheren Lipidanteil haben. Für einen Überblick über die Verwendung von Liposomen als Träger zur Abgabe von Nucleinsäuren vgl. Hug und Sleight, (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097:1–17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512–527.
Liposomenpräparate zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umschließen kationische (positive geladene), anionische (negative geladene) und neutrale Präparate. Es ist gezeigt worden, dass kationische Liposomen die intrazelluläre Abgabe von Plasmid-DNA (Felgner, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413–7416); mRNA (Melone, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077–6081); und gereinigten Transkriptionsfaktoren (Debs, (1990) J. Biol. Chem. 265:10189–10192) in funktionaler Form vermitteln.
Kationische Liposomen sind direkt verfügbar. Zum Beispiel sind N[1-2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA)-Liposomen unter der Handelsmarke Lipofectin von GIBCO BRL, Grand Island, NY erhältlich. (Vgl. auch Felgner, vorstehend). Andere käuflich zu erwerbende Liposomen umschließen Transfectace (DDAB/DOPE) und DOTAP/DOPE (Boehringer). Andere kationische Liposomen können aus direkt verfügbaren Materialien unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten Techniken hergestellt werden. Vgl. z. B. Szoka, (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194–4198; WO90/11092 für eine Beschreibung der Synthese von DOTAP (1,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propan)-Liposomen.
In ähnlicher Weise sind anionische und neutrale Liposomen direkt verfügbar, wie etwa von Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), oder können leicht unter Verwendung von direkt verfügbaren Materialien hergestellt werden. Solche Materialien umschließen unter anderem Phosphatidylcholin, Cholesterin, Phosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC), Dioleoylphosphatidylglycerin (DOPG), Dioleoylphoshatidylethanolamin (DOPE). Diese Materialien können auch mit den DOTMA- und DOTAP-Startmaterialien in geeigneten Verhältnissen vermischt werden. Verfahren zur Herstellung von Liposomen unter Verwendung dieser Materialien sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die Liposomen können multilamellare Vesikel (MLVs), kleine unilamellare Vesikel (SUVs) oder große unilamellare Vesikel (LUVs) umfassen. Die verschiedenen Liposom-Nucleinsäure-Komplexe werden unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt. Vgl. z. B. Straubinger, (1983) Meth. Immunol. 101:512–527; Szoka, (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194–4198; Papahadjopoulos, (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson, (1979) Cell 17:77); Deamer & Bangham, (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro, (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraley, (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348); Enoch & Strittmatter, (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:145; Fraley, (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka & Papahadjopoulos, (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145; und Schaefer-Ridder, (1982) Science 215:166.
E. Lipoproteine
Zusätzlich können Lipoproteine mit dem abzugebenden Polynucleotid oder Polypeptid eingeschlossen werden. Beispiele für Lipoproteine, die verwendet werden können, umschließen: Chylomikrone, HDL, IDL, LDL und VLDL. Mutanten, Fragmente oder Fusionen dieser Proteine können ebenfalls verwendet werden. Auch Modifikationen von natürlich auftretenden Lipoproteinen können verwendet werden, wie etwa acetyliertes LDL. Diese Lipoproteine können die Abgabe von Polynucleotiden auf Zellen richten, die Lipoprotein-Rezeptoren expimieren. Wenn Lipoproteine das abzugebende Polynucleotid einschließen, ist bevorzugt kein anderer zielgerichteter Ligand in die Zusammensetzung eingeschlossen.
Natürlich auftretende Lipoproteine umfassen ein Lipid und einen Protein-Abschnitt. Die Protein-Abschnitte sind als Apoproteine bekannt. Zur Zeit sind die Apoproteine A, B, C, D, und E isoliert und identifiziert worden. Mindestens zwei von diesen enthalten mehrere Proteine, die mit den römischen Ziffern AI, AII, AIV; CI, CII, CIII bezeichnet werden.
Ein Lipoprotein kan mehr als ein Apoprotein umfassen. Zum Beispiel umfasst das natürlich vorkommende Chylomikron A, B, C und E, mit der Zeit verlieren diese Lipoproteine A und gewinnen die Apoproteine C und E. VLDL umfasst die Apoproteine A, B, C, und E, LDL umfasst das Apoprotein B; und HDL umfasst die Apoproteine A, C und E.
Die Aminosäuren dieser Apoproteine sind bekannt und werden zum Beispiel von Breslow, (1985) Annu. Rev. Biochem. 54:699; Law, (1986) Adv. Exp. Med. Biol. 151:162; Chen, (1986) J. Biol. Chem. 261:12918; Kane, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2465; und Utermann, (1984) Hum. Genet. 65:232 beschrieben.
Lipoproteine enthalten eine Vielzahl von Lipiden, einschließlich Triglyceride, Cholesterin (freies und Ester) und Phospholipide. Die Zusammensetzung der Lipide variiert in natürlich auftretenden Lipoproteinen. Zum Beispiel umfassen Chylomikrone überwiegend Triglyceride. Eine genauere Beschreibung des Lipidgehaltes von natürlich auftretenden Lipoproteinen kann zum Beispiel in Meth. Enzymol. 128 (1986) gefunden werden. Die Zusammensetzung der Lipide wird so ausgewählt, dass sie an der Konformation des Apoproteins für die Rezeptor bindende Aktivität teilhaben. Die Zusammensetzung von Lipiden kann auch in der Weise gewählt werden, dass hydrophobe Wechselwirkung und Assoziation mit dem Polynucleotid bindenden Molekül erleichtert wird.
Natürlich auftretende Lipoproteine können zum Beispiel durch Ultrazentrifugation aus dem Serum isoliert werden. Solche Verfahren werden in Meth. Enzymol. (vorstehend); Pitas, (1980) J. Biochem. 255:5454–5460 und Mahey, (1979) J. Clin. Invest. 64:743–750 beschrieben.
Lipoproteine können auch in vitro oder mit rekombinanten Verfahren durch Expression der Apoprotein-Gene in einer gewünschten Wirtszelle hergestellt werden. Vgl. zum Beispiel Atkinson, (1986) Annu. Rev. Biophys. Chem. 15:403 und Radding, (1958) Biochim. Biophys. Acta 30: 443.
Lipoproteine können auch käuflich erworben werden, etwa von Biomedical Techniologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA.
Eine weiterführende Beschreibung von Lipoproteinen kann bei Zuckermann et al., PCT-Anmeldung Nr. US97/14465 gefunden werden.
F. Polykationische Agenzien
Polykationische Agenzien können, mit oder ohne Lipoprotein, in eine Zusammensetzung mit dem gewünschten Polynucleotid oder Polypeptid zur Abgabe eingeschlossen sein.
Polykationische Agenzien weisen typischerweise eine positive Netto-Ladung bei physiologisch relevantem pH-Wert auf und sind in der Lage, die elektrische Ladung von Nucleinsäuren zu neutralisieren, um die Abgabe an einen gewünschten Ort zu erleichtern. Für diese Agenzien gibt es sowohl in vitro-, ex vivo- als auch in vivo- Anwendungen. Polykationische Agenzien können verwendet werden, um Nucleinsäuren intramuskulär, subkutan etc. an ein lebendes Individuum abzugeben.
Die nachstehenden Verbindungen sind Beispiele für nützliche Polypeptide als polykationische Agenzien: Polylysin, Polyarginin, Polyornithin und Protamin. Andere Beispiele umschließen Histone, Protamine, menschliches Serumalbumin, DNA bindende Proteine, chromosomale nicht-Histon-Proteine, Mantelproteine von DNA-Viren wie etwa (X174, Transkriptionsfaktoren enthalten auch Domänen, die DNA binden, und können daher als Nucleinsäure kondensierende Agenzien nützlich sein. In Kürze, Transkriptionsfaktoren wie etwa C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP und TFIID enthalten basische Domänen, die DNA-Sequenzen binden.
Organische polykationische Agenzien umschließen: Spermin, Spermidin und Purtrescin.
Die Dimensionen und physikalischen Eigenschaften eines polykationischen Agens können aus der vorstehenden Liste extrapoliert werden, um andere polykationische Polypeptid-Agenzien zu konstruieren oder um synthetische polykationische Agenzien herzustellen.
Synthetische polykationische Agenzien
Synthetische polykationische Agenzien, die nützlich sind, umschließen zum Beispiel DEAE-Dextran, Polybren. Lipofectin und Lipofectamine sind Monomere, die polykationische Komplexe bilden, wenn sie mit Polynucleotiden oder Polypeptiden kombiniert werden.
Immundiagnostische Untersuchungen
Neisseria-Antigene der Erfindung können in Immuntests verwendet werden, um Antikörper-Spiegel nachzuweisen (oder anders herum, anti-Neisseria-Antikörper können verwendet werden, um Antigen-Spiegel nachzuweisen). Immuntests, die auf genau definierten rekombinanten Antigenen beruhen, können entwickelt werden, um invasive diagnostische Verfahren zu ersetzen. Antikörper gegen Neisseria-Proteine in biologischen Proben, einschließlich zum Beispiel Blut- oder Serumproben, können nachgewiesen werden. Der Aufbau solcher Immuntests ist Gegenstand großer Variationen, und eine Vielzahl von ihnen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Protokolle für den Immuntest können zum Beispiel auf Kompetition oder direkter Reaktion oder auf Tests nach dem Sandwich-Typ beruhen. Protokolle können auch zum Beispiel feste Unterlagen verwenden oder können eine Immunfällung sein. Die meisten Untersuchungen schließen die Verwendung eines markierten Antikörpers oder Polypeptids ein; die Markierungen können zum Beispiel fluoreszierende, chemilumineszierende, radioaktive oder Farbstoff-Moleküle sein. Untersuchungen, die die Signale einer Sonde amplifizieren, sind ebenfalls bekannt; Beispiele hierfür sind Untersuchungen, die Biotin und Avidin und mit Enzym markierte und enzymvermittelte Immuntests, wie etwa ELISA-Tests, verwenden.
Kits, die für immundiagnostische Zwecke geeignet sind und die benötigten markierten Reagenzien enthalten, werden hergestellt, indem die benötigten Materialien, einschließlich der Zusammensetzungen der Erfindung, in geeigneten Behältnissen zusammen mit den übrigen Reagenzien und Materialien (zum Beispiel geeigneten Pufferlösungen, Salzlösungen etc.), die für die Durchführung des Tests erforderlich sind, sowie einer geeigneten Bedienungsanleitung zur Durchführung des Tests verpackt werden.
Nucleinsäure-Hybridisierung
"Hybridisierung" betrifft die Anlagerung von zwei Nucleinsäuresequenzen aneinander durch Wasserstoffbrückenbindung. Typischerweise wird eine Sequenz auf einer festen Unterlage fixiert werden, und die andere wird sich frei in Lösung befinden. Dann werden die beiden Sequenzen unter Bedingungen, die Wasserstoffbrückenbindung begünstigen, miteinander in Kontakt gebracht werden. Faktoren, die diese Bindung beeinflussen, umschließen: Art und Volumen des Lösungsmittels; Reaktionstemperatur; Zeit für die Hybridisierung; Bewegung; Agenzien zur Blockierung der nicht spezifischen Anlagerung der Sequenz aus der flüssigen Phase an die feste Unterlage (Denhardt-Reagenz oder BLOTTO); Konzentration der Sequenzen; Verwendung von Verbindungen zur Steigerung der Zusammenlagerungsrate der Sequenzen (Dextransulfat oder Polyethylenglykol); und die Stringenz der Waschbedingungen im Anschluss an die Hybridisierung. Vgl. Sambrook et al., [vorstehend] Band 2, Kapitel 9, Seiten 9.47 bis 9.57.
"Stringenz" betrifft die Bedingungen in einer Hybridisierungsreaktion, die die Zusamenlagerung von sehr ähnlichen Sequenzen gegenüber Sequenzen, die sich unterscheiden, bevorzugen. Zum Beispiel sollte diejenige Kombination von Temperatur und Salzkonzentration gewählt werden, die etwa 120 bis 200°C unter der berechneten Tm des zu untersuchenden Hybrids liegt. Die Bedingungen für Temperatur und Salzgehalt können oft empirisch in vorausgehenden Experimenten bestimmt werden, in denen Proben genomischer DNA, die an Filter immobilisiert sind, an die interessierende Sequenz hybridisiert werden und dann unter Bedingungen mit verschiedenen Stringenzen gewaschen werden. Vgl. Sambrook et al., Seite 9.50.
Variablen, die beachtet werden müssen, wenn zum Beispiel ein Southern-Blot durchgeführt werden soll, sind (1) die Komplexität der im Blot verwendeten DNA und (2) die Homologie zwischen der Sonde und den nachzuweisenden Sequenzen. Die Gesamtmenge der(des) zu untersuchenden Fragment(es) kann um eine Größenordnung 10, von 0,1 bis 1 μg für einen Plasmid- oder Phagenaufschluss bis zu 10^–9 bis 10^–8 g für ein Gen in Einzelkopie in einem hochkomplexen eukaryontischen Genom variieren. Für Polynucleotide mit geringerer Komplexität können wesentlich kürzere Blotting-, Hybridisierungs- und Expositionszeiten, eine geringere Menge an Start-Polynucleotiden und eine geringere spezifische Aktivität der Sonden verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Hefe-Gen in Einzelkopie mit einer Expositionszeit von nur 1 Stunde, mit 1 μg Hefe-DNA-Startsubstanz, Blotting über zwei Stunden und Hybridisierung über 4–8 Stunden mit einer Sonde mit 108 ZpM/μg nachgewiesen werden. Für ein Säuger-Gen in Einzelkopie würde ein konservativer Ansatz mit 10 μg DNA starten, wobei Blotten über Nacht und Hybridisierung über Nacht in Anwesenheit von 10% Dextransulfat unter Verwendung einer Sonde von mehr als 10⁸ ZpM/μg erfolgt, was zu einer Expositionszeit von ~24 Stunden führt.
Zahlreiche Faktoren können die Schmelztemperatur (Tm) eines DNA-DNA-Hybrids zwischen der Sonde und dem interessierenden Fragment beeinflussen, und folglich die geeigneten Bedingungen für Hybridisierung und Waschvorgang. In vielen Fällen ist die Sonde nicht zu 100% homolog mit dem Fragment. Andere gewöhnlich in Betracht gezogene Variablen umschließen die Länge und den Gesamtgehalt an G + C der hybridisierenden Sequenzen und die Ionenstärke und den Gehalt an Formamid in der Hybridisierungspufferlösung. Die Wirkungen all dieser Faktoren können mit einer einzigen Gleichung abgeschätzt werden: Tm = 81 + 16,6(log10Ci) + 0,4[%(G + C)] – 0,6(%Formamid) – 600/n – 1,5(%Fehlpaarung),worin Ci die Salzkonzentration (monovalente Ionen) ist und n ist die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist (leicht modifiziert nach Meinkoth & Wahl, (1984) Anal. Biochem. 138:267–284).
Bei dem Aufbau eines Hybridisierungsexperimentes können einige Faktoren, die die Hybridisierung von Nucleinsäuren beeinflussen, geeignet verändert werden. Die Temperatur der Hybridisierung und die Waschvorgänge und die Salzkonzentration während der Waschvorgänge sind am einfachsten anzupassen. Mit steigender Temperatur der Hybridisierung (d. h. Stringenz) wird es weniger wahrscheinlich, dass Hybridisierung zwischen Strängen auftritt, die nicht homolog sind, und als ein Ergebnis nimmt der Hintergrund ab. Wenn die radioaktiv markierte Sonde nicht vollständig homolog zu dem immobilisierten Fragment ist (was im Fall der Genfamilien- und Interspezies-Hybridisierungsexperimente häufig vorkommt), muss die Hybridisierungstemperatur gesenkt werden, und der Hintergrund nimmt zu. Die Temperatur der Waschgänge beeinflusst die Intensität der hybridisierenden Bande und den Grad des Hintergrundes in ähnlicher Weise. Die Stringenz der Waschgänge wird auch durch abnehmende Salzkonzentrationen erhöht.
Allgemein betragen gewöhnliche Hybridisierungstemperaturen in Anwesenheit von 50% Formamid 42°C für eine Sonde, die 95% bis 100% homolog zu dem Zielfragment ist, 37°C für 90% bis 95% Homologie und 32°C für 85% bis 90% Homologie. Für geringere Homologien sollte der Gehalt an Formamid verringert und die Temperatur entsprechend, unter Verwendung der vorstehenden Gleichung, angepasst werden. Wenn der Grad an Homologie zwischen der Sonde und dem Zielfragment nicht bekannt ist, ist der einfachste Ansatz, sowohl mit Hybridisierungs- als auch mit Waschbedingungen zu beginnen, die nicht stringent sind. Wenn nicht spezifische Banden oder starker Hintergrund nach der Autoradiographie beobachtet werden, kann der Filter unter hoher Stringenz gewaschen und erneut exponiert werden. Wenn die für die Exposition erforderliche Zeit diesen Ansatz unpraktisch macht, sollten mehrere Stringenzen für die Hybridisierungs- und/oder Waschvorgänge parallel getestet werden.
Untersuchungen mit Nucleinsäure-Sonden
Mit Verfahren wie etwa PCR, Untersuchungen mit verzweigten DNA-Sonden oder Blot-Techniken, bei denen Nucleinsäure-Sonden im Einklang mit der Erfindung verwendet werden, kann die Anwesenheit von cDNA oder mRNA bestimmt werden. Es gilt, dass eine Sonde mit einer Sequenz der Erfindung „hybridisiert", wenn sie einen Duplex- oder doppelsträngigen Komplex bilden kann, der stabil genug ist, dass er nachgewiesen werden kann.
Die Nucleinsäure-Sonden werden mit den Nucleotid-Sequenzen von Neisseria der Erfindung hybridisieren (einschließlich sowohl der Sense- als auch der Antisense-Stränge). Obgleich viele verschiedene Nucleotidsequenzen die Aminosäuresequenz codieren werden, wird die natürlich vorkommende Sequenz von Neisseria bevorzugt, weil sie die aktuell in den Zellen vorliegende Sequenz ist. Die mRNA repräsentiert eine codierende Sequenz, und daher sollte eine Sonde komplementär zu der codierenden Sequenz sein; einsträngige cDNA ist komplementär zu der mRNA, und daher sollte eine cDNA-Sonde komplementär zu der nicht codierenden Sequenz sein.
Die Sondensequenz muss nicht mit der Sequenz von Neisseria (oder ihrem Komplement) identisch sein – einige Variationen in Sequenz und Länge können zu erhöhter Test-Sensitivität führen, wenn die Nucleinsäure-Sonde einen Duplex-Komplex mit Ziel-Nucleotiden bilden kann, der nachgewiesen werden kann. Die Nucleinsäure-Sonde kann auch zusätzliche Nucleotide zur Stabilisierung des gebildeten Duplex-Komplexes anschließen. Eine zusätzliche Sequenz von Neisseria kann auch als eine Markierung hilfreich sein, um den gebildeten Duplex-Komplex nachzuweisen. Zum Beispiel kann eine nicht komplementäre Nucleotidsequenz an das 5'-Ende der Sonde angehängt werden, wobei der Rest der Sondensequenz komplementär zu einer Neisseria-Sequenz ist. Alternativ können nicht komplementäre Basen oder längere Sequenzen in die Sonde eingestreut sein, vorausgesetzt, dass die Sondensequenz eine ausreichende Komplementarität zu der Neisseria-Sequenz aufweist, um mit ihr zu hybridisieren und dadurch einen Duplex-Komplex zu bilden, der nachgewiesen werden kann.
Die exakte Länge und Sequenz der Sonde wird von den Hybridisierungsbedingungen wie etwa Temperatur, Salz-Bedingungen und dergleichen abhängen. Zum Beispiel umfasst die Nucleinsäure-Sonde für diagnostische Anwendungen in Abhängigkeit von der Komplexität der zu analysierenden Sequenz typischerweise mindestens 10–20 Nucleotide, bevorzugt 15–25 und mehr bevorzugt mindestens 30 Nucleotide, obgleich sie auch kürzer sein kann. Kurze Primer erfordern allgemein kühlere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridkomplexe mit der Matrize zu bilden.
Die Sonden können durch synthetische Verfahren wie etwa das Triester-Verfahren von Matteucci et al., [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185] oder nach Urdea et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:7461] oder unter Verwendung von käuflich zu erwerbenden automatisierten Apparaten zur Oligonucleotid-Synthese hergestellt werden.
Die chemische Natur der Sonde kann nach jeweiliger Bevorzugung ausgewählt werden. Für bestimmte Anwendungen ist DNA oder RNA geeignet. Für andere Anwendungen können Modifikationen eingeschlossen werden, z. B. können Modifikationen am Rückgrat wie etwa Phosphorthioate oder Methylphosphonate verwendet werden, um die in vivo-Halbwertszeit zu erhöhen, RNA-Affinität zu ändern, Resistenz gegenüber Nuclease zu erhöhen etc. [vgl. z. B. Agrawal & Iyer (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:12–19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:376–387]; Analoga wie etwa Peptid-Nucleinsäuren können ebenfalls verwendet werden [vgl. z. B. Corey (1997) TIBTECH 15:224–229; Buchardt et al., (1993) TIBTECH 11:384–386].
Ein Beispiel für eine Nucleotid-Hybridisierungsuntersuchung wird von Urdea et al. in der internationalen Patentanmeldung WO92/02526 beschrieben [vgl. auch US-Patent246).
Alternativ ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein anderes gut bekanntes Mittel zum Nachweis von kleinen Mengen an Ziel-Nucleinsäuren. Die Untersuchung wird beschrieben in: Mullis et al., [Meth. Enzymol. (1987) 155: 335–350]; US-Patent Nr. 4,683,195 ; und US-Patent Nr. 4,683,202 . Zwei "Primer-"Nucleotide hybridisieren mit der Ziel-Nucleinsäure und werden zum Starten der Reaktion verwendet. Die Primer können eine Sequenz umfassen, die nicht mit der Zielsequenz der Amplifizierung (oder ihrem Komplement) hybridisieren, um die Stabilität des Duplex-Komplexes zu unterstützen oder um zum Beispiel eine gebräuchliche Restriktionsstelle einzuschließen. Typischerweise wird eine solche Sequenz die gewünschte Sequenz von Neisseria flankieren.
Eine thermostabile Polymerase erzeugt unter Verwendung der originalen Ziel-Nucleinsäuren als eine Matrize von den Primern Kopien der Ziel-Nucleinsäuren. Nachdem einen Schwellenmenge an Ziel-Nucleinsäuren von der Polymerase erzeugt worden ist, können diese durch traditionellere Verfahren wie etwa Southern-Blots nachgewiesen werden. Wenn das Southern-Blot-Verfahren verwendet wird, wird die markierte Sonde mit der Sequenz von Neisseria (oder ihrem Komplement) hybridisieren.
Auch mRNA oder cDNA können durch traditionelle Blot-Techniken nachgewiesen werden, die von Sambrook et al., [vorstehend] beschrieben werden. mRNA oder cDNA, die unter Verwendung eines Polymerase-Enzyms aus mRNA erzeugt worden ist, kann unter Verwendung von Gel-Elektrophorese gereinigt und abgetrennt werden. Die Nucleinsäuren auf dem Gel werden dann auf eine feste Unterlage wie etwa Nitrocellulose übertragen. Die feste Unterlage wird einer markierten Sonde ausgesetzt und dann gewaschen, um nicht hybridisiertes Sondenmaterial zu entfernen. Als nächstes werden die Duplex-Komplexe, die die markierte Sonde enthalten, nachgewiesen. Typischerweise wird die Sonde mit einer radioaktiven Einheit markiert.
BEISPIELE
Die Beispiele beschreiben Nucleinsäuresequenzen, die in N. meningitidis und N. gonorrhoeae identifiziert worden sind, zusammen mit ihren entsprechenden und putativen Translationsprodukten. Die Beispiele umschließen:

• eine Nucleotidsequenz, die in N. meningitidis identifiziert worden ist
• das mutmaßliche Translationsprodukt der genannten Sequenz von N. meningitidis
• eine zugehörige Nucleotidsequenz, die in N. gonorrhoeae identifiziert worden ist
• das mutmaßliche Translationprodukt der genannten Sequenz von N. gonorrhoeae
• einen Vergleich des Prozentsatzes an Identität zwischen dem Translationsprodukt der Sequenz von N. meningitidis und der Sequenz von N. gonorrhoeae

Die Sequenzvergleiche wurden am NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) unter Verwendung der Algorithmen BLAST, BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx & tBLASTx durchgeführt [vgl. auch Altschul et al., (1937) Gapped BLAST und PSI-BLAST: a new generation of Protein database search programs. Nucleic Acids Research 25:2289–3402]. Durchmusterungen wurden gegenüber den nachfolgenden Datenbanken durchgeführt: nicht redundante Sequenzen aus GenBank + EMBL + DDBJ + PDB und nicht redundante Sequenzen aus GenBank CDS-Translationen + PDB + SwissProt + SPupdate + PIR.
Klein geschriebene Buchstaben bedeuten Zweideutigkeiten, die während der Abgleichung von voneinander unabhängigen Sequenzierungsreaktionen auftraten (einige der Nucleotidsequenzen in den Beispielen stammen aus der Kombination der Ergebnisse aus zwei oder mehr Experimenten).
Die Nucleotidsequenzen wurden in allen sechs Leserahmen gescannt, um die Anwesenheit von hydrophoben Domänen unter Verwendung eines Algorithmus vorauszusagen, der auf den statistischen Untersuchungen von Esposti et al., [Critical evaluation of the hydropathy of membrane Proteins (1990), Eur. J. Biochem. 190:207–219) beruht. Diese Domänen repräsentieren potentielle Transmembran-Regionen oder hydrophobe Leader-Sequenzen.
Offene Leserahmen wurden unter Verwendung des Programmes ORFFINDER (NCBI) aus fragmentierten Nucleotidsequenzen verhergesagt.
Unterstrichene Aminosäuresequenzen zeigen mögliche Transmembran-Domänen oder Leader-Sequenzen in den ORFs an, wie durch den PSORT-Algorithmus (http://www.psort.nibb.ac.jp) vorhergesagt wird. Funktionale Domänen wurden unter Verwendung des MOTIFS-Programmes (GCG Wisconsin & PROSITE) ebenfalls vorhergesagt.
Beruhend auf der Anwesenheit einer mutmaßlichen Leader-Sequenz und/oder von mehreren mutmaßlichen Transmembran-Domänen (einfach unterstrichen) in dem Gonokokken-Protein wird vorausgesagt, dass die Proteine von N. meningitidis und N. gonorrhoeae und ihre entsprechenden Epitope nützliche Antigene oder immunogene Verbindungen für Impfstoffe oder diagnostische Mittel sein könnten.
Die Standardtechniken und -Verfahren, die verwendet werden können, um die Erfindung durchzuführen (z. B. die Verwendung der offenbarten Sequenzen in Impfstoffen oder zu diagnostischen Zwecken) wurden vorstehend zusammengefasst. Diese Zusammenfassung ist keine Begrenzung der Erfindung, sondern gibt stattdessen Beispiele, die verwendet werden können, die aber nicht erforderlich sind.
Im Einzelnen wurden die nachstehenden Verfahren verwendet, um die Proteine der Erfindung zu exprimieren, zu reinigen und biochemisch zu charakterisieren.
Präparation von chromosomaler DNA
Stamm 2996 von N. meningitidis wurde bis zur exponentiellen Phase in 100 ml GC-Kulturmedium gezüchtet, durch Zentrifugation geerntet und in 5 ml Pufferlösung (20% Saccharose, 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, auf pH-Wert 8,0 eingestellt) resuspendiert. Nach 10-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Bakterien durch Zugabe von 10 ml Lysierungslösung (50 mM NaCl, 1% Na-Sarkosyl, 50 μg/ml Proteinase K) lysiert, und die Suspension wurde bei 37°C über 2 Stunden inkubiert. Zwei Phenol-Extraktionen (auf pH-Wert 8 äquilibriert) und eine ChCl₃/Isoamylalkohol (24:1)-Extraktion wurden durchgeführt. DNA wurde durch Zugabe von 0,3 M Natriumacetat und 2 Volumeneinheiten Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Der Niederschlag wurde einmal mit 70% Ethanol gewaschen und in 4 ml Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8) wieder gelöst. Die DNA-Konzentration wurde durch Ablesen der CD bei 260 nm gemessen.
Oligonucleotid-Entwurf
Synthetische Oligonucleotid-Primer wurden auf der Basis der codierenden Sequenz jedes ORF entworfen, indem (a) die Meningococcus B-Sequenz, wenn verfügbar, oder (b) die Gonococcus/Meningococcus A-Sequenz, angepasst an die von Meningococcus bevorzugte Codon-Verwendung, verwendet wurden. Alle erwarteten Signalpeptide wurden entfernt, indem die Primer-Sequenz zur Amplifizierung des 5'-Endes unmittelbar stromabwärts von der erwarteten Leader-Sequenz abgeleitet wurde.
Bei den meisten ORFs schlossen die 5'-Primer zwei Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme ein (BamHI-NdeI, BamHI-NheI oder EcoRI-NheI, in Abhängigkeit von dem Restriktionsmuster des Gens); die 3'-Primer schlossen eine XhoI-Restriktionsstelle ein. Dieses Verfahren wurde eingesetzt, um die Clonierung jedes einzelnen Amplifikationsproduktes (in Bezug zu jedem einzelnen ORF) in zwei verschiedenen Expressionssystemen zu steuern: pGEX-KG (unter Verwendung von entweder BamHI-XhoI oder EcoRI-XhoI) und pET21b+ (unter Verwendung von entweder NdeI-XhoI oder NheI-XhoI).
Für einige ORFs wurden zwei verschiedene Amplifizierungen durchgeführt, um jeden ORF in den beiden Expressionssystemen zu clonieren. Zwei verschiedene 5'-Primer wurden für jeden ORF verwendet; derselbe 3'-XhoI-Primer wurde wie zuvor verwendet:
Andere ORFs können in den Expressionsvektor pTRC cloniert und als ein His-Marker-Fusionsprodukt am Amino-Terminus exprimiert werden. Das erwartete Signalpeptid kann in dem Endprodukt eingeschlossen sein. Die NheI-BamHI-Restriktionsstellen wurden unter Verwendung der nachstehenden Primer eingeschlossen:
Neben den Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme umschlossen die Primer Nucleotide, die mit der zu amplifizierenden Sequenz hybridisierten. Die Anzahl der hybridisierenden Nucleotide war von der Schmelztemperatur des gesamten Primers abhängig und wurde für jeden Primer unter Verwendung der nachstehenden Formel bestimmt: Tm = 4(G + C) + 2(A + T) (Schwanz ausgeschlossen) Tm = 64,9 + 0,41 (% GC) – 600/N (vollständiger Primer)
Die mittlere Schmelztemperatur der ausgewählten Oligos betrug 65–70°C für das vollständige Oligo und 50–55°C für die hybridisierende Region allein.
Die Oligos wurden durch ein 394-DNA/RNA-Synthesegerät von Perkin-Elmer synthetisiert, in 2 ml NH₄-OH von den Säulen eluiert, und die Schutzgruppen wurden durch Inkubation bei 56°C über 5 Stunden entfernt. Die Oligos wurden durch Zugabe von 0,3 M Na-Acetat und 2 Volumeneinheiten Ethanol ausgefällt. Die Proben wurden dann zentrifugiert und die Niederschläge in entweder 100 μl oder 1 ml Wasser resuspendiert. Die OD₂₆₀ wurde unter Verwendung eines Lambda-Bio-Spektrophotometers von Perkin Elmer bestimmt, und die Konzentration wurde bestimmt und auf 2–10 pMol/μl eingestellt.
Wenn die ersten Amplifizierungen durchgeführt werden, kann es sein, dass die vollständige 5'- und/oder 3'-Sequenz für einige ORFs von Meningokokken nicht bekannt ist, obgleich es sein kann, dass die entsprechenden Sequenzen für Gonococcus identifiziert worden sind. Für die Amplifizierung könnten daher die Sequenzen von Gonococcus als die Basis für den Entwurf von Primern in veränderter Form, um der Codon-Präferenz Rechnung zu tragen, verwendet werden. Im Einzelnen können die nachfolgenden Codons ausgetauscht werden: ATA → ATT; TCG → TCT; CAG → CAA; AAG → AAA; GAG → GAA; CGA und CGG → CGC; GGG → GGC.
Amplifizierung
Das Standard-PCR-Protokoll war wie folgt: 50–200 ng genomische DNA wurden als eine Matrize in Anwesenheit von 20–40 μM jedes Oligos, 400–800 μM dNTP-Lösung, 1 × PCR-Pufferlösung (einschließlich 1,5 mM MgCl₂), 2,5 Einheiten TaqI-DNA-Polymerase (Verwendung von Perkin-Elmer-AmpliTaQ, GIBCO Platinum, Pwo-DNA-Polymerase oder Takara Shuzo-Taq-Polymerase) verwendet.
In einigen Fällen wurde die PCR durch die Zugabe von 10 μl DMSO oder 50 μl 2M Betain optimiert.
Nach einem heißen Start (Zugabe der Polymerase während einer vorausgehenden Inkubation des gesamten Gemisches über 3 Minuten bei 95°C) durchlief jede Probe eine Doppelschritt-Amplifizierung: die ersten 5 Zyklen wurden durchgeführt, indem als die Hybridisierungstemperatur diejenige der Oligos ohne den Schwanz der Restriktionsenzyme verwendet wurde, gefolgt von 30 Zyklen, die im Einklang mit der Hybridisierungstemperatur der Oligos in ganzer Länge durchgeführt wurden. Auf die Zyklen folgte ein abschließender Extensionsschritt über 10 Minuten bei 72°C.

Die Standardzyklen waren wie folgt:

	Denaturierung	Hybridisierung	Elongation
Erste 5 Zyklen	30 Sekunden, 95°C	30 Sekunden, 50–55°C	30–60 Sekunden, 72°C
Letzte 30 Zyklen	30 Sekunden, 95°C	30 Sekunden, 65–70°C	30–60 Sekunden, 72°C

Die Elongationszeit variierte im Einklang mit der Länge des zu amplifizierenden ORF.
Die Amplifizierungen wurden alle unter Verwendung entweder eines 9600- oder eines 2400-GeneAmp-PCR-Systems von Perkin-Elmer durchgeführt. Um die Ergebnisse zu überprüfen, wurden 1/10 des Amplifizierungsvolumen auf ein 1–1,5%-Agarosegel gegeben, und die Größe von jedem amplifizierten Fragment wurde mit einer DNA-Molekulargewichtsmarkierung verglichen.
Die amplifizierte DNA wurde entweder direkt auf ein 1%-Agarosegel gegeben oder zunächst mit Ethanol ausgefällt und in einem geeigneten Volumen resuspendiert, um dann auf ein 1%-Agarosegel gegeben zu werden. Das DNA-Fragment, das der Bande mit der richtigen Größe entsprach, wurde dann unter Verwendung des Gel Extraktion Kit von Qiagen unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers eluiert und aus dem Gel gereinigt. Das Endvolumen des DNA-Fragmentes betrug 30 μl oder 50 μl entweder Wasser oder 10 mM Tris, pH-Wert 8,5.
Spaltung von PCR-Fragmenten
Die dem amplifizierten Fragment entsprechende gereinigte DNA wurde in 2 Aliquots aufgeteilt und zweimal gespalten mit: (a) NdeI/XhoI oder NheI/XhoI für die Clonierung in pET-21b+ und weitere Expression des Proteins als ein C-Terminus-His-Marker-Fusionsprodukt; (b) BamHI/XhoI oder EcoRI/XhoI für die Clonierung in pGEX-KG und weitere Expression des Proteins als ein GST-N-Terminus-Fusionsprodukt.
Für einige ORFs kann NheI/BamHI für die Clonierung in den Vektor pTRC-HisA eingebracht werden, und weitere Expression des Proteins erfolgt als N-Terminus-His-Marker-Fusionsprodukt.
Jedes gereinigte DNA-Fragment wurde mit 20 Einheiten jedes Restriktionsenzyms (New England Biolabs) in einem Endvolumen von entweder 30 oder 40 μl in Anwesenheit der geeigneten Pufferlösung inkubiert (37°C über 3 Stunden bis über Nacht). Das Spaltprodukt wurde dann unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungskit unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers gereinigt und in einem Endvolumen von 30 (oder 50) μl entweder Wasser oder 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,5, eluiert. Die endgültige DNA-Konzentration wurde durch 1%-Agarosegel-Elektrophorese in Anwesenheit einer titrierten Molekulargewichtsmarkierung bestimmt.
Spaltung der Clonierungsvektoren (pET22B, pGEX-KG und pTRC-His A)
10 μg Plasmid wurde mit 50 Einheiten von jedem Restriktionsenzym in 200 μl Reakionsvolumen in Anwesenheit einer geeigneten Pufferlösung durch Inkubation über Nacht bei 37°C doppelt gespalten. Nach Auftragen des gesamten Spaltproduktes auf ein 1%-Agarosegel wurde die Bande, die dem gespaltenen Vektor entsprach, unter Verwendung des QIAquick-Gel Extraktion Kit von Qiagen aus dem Gel gereinigt, und die DNA wurde in 50 μl 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,5, eluiert. Die DNA-Konzentration wurde durch Messen der OD₂₆₀ der Probe bestimmt und auf 50 μg/μl eingestellt. 1 μl des Plasmids wurde für jeden Clonierungsvorgang verwendet.
Clonierung
Die dem jeweiligen ORF entsprechenden Fragmente, zuvor gespalten und gereinigt wurden, sowohl in pET22b als auch pGEX-KG ligiert. In einem Endvolumen von 20 μl wurde ein molares Verhältnis von 3:1 von Fragment/Vektor unter Verwendung von 0,5 μl NEB-T4-DNA-Ligase (400 Einheiten/μl) in Anwesenheit der vom Hersteller gelieferten Pufferlösung ligiert. Das Reaktionsgemisch wurde bei Zimertemperatur über 3 Stunden inkubiert. In einigen Experimenten wurde die Ligierung unter Verwendung des „Rapid Ligation Kit" von Boehringer nach Anweisung des Herstellers durchgeführt.
Um das rekombinante Plasmid in einen geeigneten Stamm einzuführen, wurden 100 μl kompetente E. coli DH5-Zellen mit der Ligase-Reaktionslösung über 40 Minuten auf Eis, dann bei 37°C über 3 Minuten, dann nach Zugabe von 800 μl LB-Brühe wiederum bei 37°C über 20 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann mit höchster Geschwindigkeit in einer Eppendorf-Mikrofuge zentrifugiert und in etwa 200 μl des Überstandes resuspendiert. Die Suspension wurde dann auf LB-Ampicillin (100 mg/ml) ausgestrichen.
Die Durchmusterung der rekombinanten Clone wurde durchgeführt, indem 5 nach dem Zufallsprinzip ausgewählte Kolonien über Nacht bei 37°C entweder in 2 ml (pGEX- oder pTC-Clone) oder in 5 ml (pET-Clone) LB-Brühe + 100 μg/ml Ampicillin gezüchtet wurden. Die Zellen wurden dann ausgefällt und die DNA wurde unter Verwendung des QIAprep-Spin Miniprep Kit von Qiagen nach Anweisungen des Herstellers auf ein Endvolumen von 30 μl extrahiert. 5 μl von jeder einzelnen Minipräp (etwa 1 g) wurden entweder mit NdeI/XhoI oder BamHI/XhoI gespalten, und das gesamte Spaltprodukt wurde zusammen mit der Molekulargewichtsmarkierung (1Kb-DNA-Leiter, GIBCO) auf ein 1–1,5%-Agarosegel (in Abhängigkeit von der erwarteten Größe der Insertion) aufgetragen. Die Durchmusterung auf die positiven Clone wurde auf der Basis der korrekten Insertionsgröße durchgeführt.
Clonierung
Bestimmte ORFs können in den Vektor pGEX-HIS cloniert werden, indem die EcoRI-PstI-Clonierungsstellen oder EcoRI-SalI oder SalI-PstI verwendet werden. Nach der Clonierung können die rekombinanten Plasmide in die E. coli W3110-Wirtszelle eingeführt werden.
Expression
Jeder ORF, der in den Expressionsvektor cloniert worden ist, kann dann in den Stamm transformiert werden, der für die Expression des rekombinanten Proteinproduktes geeignet ist. 1 μl wurde von jedem Konstrukt verwendet, um 30 μl E. coli BL21 (Vektor pGEX), E. coli TOP 10 (Vektor pTRC) oder E. coli BL21-DE3 (Vektor pET) zu transformieren, wie vorstehend beschrieben. Im Fall des Vektors pGEX-His wurde derselbe E.coli-Stamm (W3110) für anfängliche Clonierung und Expression verwendet. Einzelne rekombinante Kolonien wurden in 2 ml LB + Amp (100 μg/ml) geimpft, bei 37°C über Nacht inkubiert, dann in 20 ml LB + Amp (100 μg/ml) in 100 ml-Kolben auf 1:30 verdünnt, wobei sichergestellt wurde, dass die OD₆₀₀ zwischen 0,1 und 0,15 lag. Die Kolben wurden bei 30°C in rotierenden Wasserbad-Schwenkern inkubiert, bis die CD exponentielles Wachstum anzeigte, das für die Einleitung der Expression geeignet war (0,4–0,8 OD für die Vektoren pET und pTRC; 0,8–1 CD für die Vektoren pGEX und pGEX-His). Bei den Vektoren pET, pTRC und pGEX-His wurde die Protein-Expression durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert, während die Endkonzentration an IPTG im Fall des pGEX-Systems 0,2 mM betrug. Nach Inkubation über 3 Stunden bei 30°C wurde die Endkonzentration der Probe durch die CD überprüft. Um die Expression zu überprüfen, wurde 1 ml aus jeder Probe entnommen, in einer Mikrofuge zentrifugiert, der Niederschlag in PBS resuspendiert und durch 12%-SDS-PAGE mit Coomassie- Blau-Färbung analysiert. Die gesamte Probe wurde mit 6000 g zentrifugiert und der Niederschlag für weiteren Gebrauch in PBS resuspendiert.
Reinigung von GST-Fusionsproteinen in großem Maßstab
Eine einzelne Kolonie wurde über Nacht bei 37°C in einer LB + Amp-Agar-Schale gezüchtet. Die Bakterien wurden in 20 ml LB + Amp-Flüssigkultur in einem Wasserbad-Schwenker geimpft und über Nacht kultiviert. Die Bakterien wurden 1:30 in 600 ml frisches Kulturmedium verdünnt, und man ließ sie bei einer optimalen Temperatur (20–37°C) bis zu einer OD₅₅₀ von 0,8–1 wachsen. Die Proteinexpression wurde mit 0,2 mM IPTG mit anschließender Inkubation über drei Stunden induziert. Die Kultur wurde mit 8000 UpM bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und der Bakterien-Niederschlag wurde in 7,5 ml kalter PBS resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall-Behandlung auf Eis über 30 sec mit 40 W unter Verwendung eines B-15-Ultraschallgerätes von Branson aufgebrochen, zweimal tiefgefroren und aufgetaut und wiederum zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und mit 150 μl Glutation-Sepharose 4B-Harz (Pharmacia) (zuvor mit PBS gewaschen) vermischt und bei Zimmertemperatur über 30 Minuten inkubiert. Die Probe wurde mit 700 g über 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Harz wurde zweimal über 10 Minuten mit 10 ml kalter PBS gewaschen, in 1 ml kalter PBS resuspendiert und auf eine handelsübliche Säule aufgetragen. Das Harz wurde zweimal mit 2 ml kalter PBS gewaschen, bis der Durchfluss eine OD₂₈₀ von 0,02–0,06 erreicht hatte. Das GST-Fusionsprotein wurde durch die Zugabe von 700 μl kalter Glutathion-Elutionspufferlösung (10 mM reduziertes Glutathion, 50 mM Tris-HCl) eluiert, und die Fraktionen wurden gesammelt, bis die OD₂₈₀ 0,1 betrug. 21 μl von jeder Fraktion wurden auf ein 12%-SDS-Gel aufgetragen, wobei entweder der Molekulargewichtsstandard für die SDS-PAGE-Untersuchung von Biorad mit breitem Bereich (M1) (200, 116,25, 97,4, 66,2, 45, 31, 21,5, 14,4, 6,5 kDa) oder die Rainbow-Markierung von Amersham (M'') (220, 66, 46, 30, 21,5, 14,3 kDa) als Standards verwendet wurden. Da das MG von GST 26 kDa beträgt, muss dieser Wert zum MG von jedem GST-Fusionsprotein hinzu addiert werden.
Reinigung von löslichen His-Fusionsproteinen in großem Maßstab
Eine einzelne Kolonie wurde über Nacht bei 37°C in einer LB + Amp-Agarschale kultiviert. Die Bakterien wurden in 20 ml einer LB + Amp-Flüssigkultur geimpft und über Nacht in einem Wasserbad-Schwenker inkubiert. Die Bakterien wurden im Verhältnis 1:30 in 600 ml frischem Kulturmedium verdünnt, und man ließ sie bei optimaler Temperatur (20–37°C) bis zu einer OD₅₅₀ von 0,6–0,8 wachsen. Die Protein-Expression wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert, und die Kultur wurde über drei Stunden weiter inkubiert. Die Kultur wurde mit 8000 UpM bei 4°C zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, und der bakterielle Niederschlag wurde in 7,5 ml kalter 10 mM Imidazol-Pufferlösung (300 mM NaCl, 50 mM Phosphatpufferlösung, 10 mM Imidazol, pH-Wert 8) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall-Behandlung auf Eis über 30 sec bei 40 W unter Verwendung eines B-15-Ultraschallgerätes von Branson aufgebrochen, zweimal tiefgefroren und aufgetaut und wiederum zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und mit 150 μl Ni²⁺-Harz (Pharmacia) (zuvor mit 10 mM Imidazolpufferlösung gewaschen) vermischt und bei Zimmertemperatur unter sanftem Rühren über 30 Minuten inkubiert. Die Probe wurde mit 700 g über 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Harz wurde zweimal mit 10 ml kalter 10 mM Imidazol-Pufferlösung über 10 Minuten gewaschen, in 1 ml kalter 10 mM Imidazol-Pufferlösung resuspendiert und auf eine handelsübliche Säule aufgetragen. Das Harz wurde bei 4°C mit 2 ml kalter 10 mM Imidazol-Pufferlösung gewaschen, bis die Durchflusslösung die OD₂₈₀ von 0,02–0,06 erreicht hatte. Das Harz wurde mit 2 ml kalter 20 mM Imidazol-Pufferlösung (300 mM NaCl, 50 mM Phosphat-Pufferlösung, 20 mM Imidazol, pH-Wert 8) gewaschen, bis die Durchflusslösung die OD₂₈₀ von 0,02–0,06 erreicht hatte. Das His-Fusionsprotein wurde durch die Zugabe von 700 μl kalter 250 mM Imidazol-Pufferlösung (300 mM NaCl, 50 mM Phosphat-Pufferlösung, 250 mM Imidazol, pH-Wert 8) eluiert, und die Fraktionen wurden gesammelt, bis die OD₂₈₀ 0,1 betrug. 21 μl von jeder Fraktion wurden auf ein 12% SDS-Gel aufgetragen.
Reinigung von unlöslichen His-Fusionsproteinen in großem Maßstab
Eine einzelne Kolonie wurde über Nacht bei 37°C in einer LB + Amp-Agarschale kultiviert. Die Bakterien wurden in 20 ml einer LB + Amp-Flüssigkultur in einem Wasserbad-Schwenker geimpft und über Nacht kultiviert. Die Bakterien wurden im Verhältnis 1:30 in 600 ml frischem Kulturmedium verdünnt, und man ließ sie bei optimaler Temperatur (37°C) bis zur OD₅₅₀ von 0,6–0,8 wachsen. Die Protein-Expression wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert, und die Kultur wurde über drei Stunden weiter inkubiert. Die Kultur wurde mit 8000 UpM bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und der bakterielle Niederschlag wurde in 7,5 ml Pufferlösung B (Harnstoff 8 M, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpufferlösung, pH-Wert 8,8) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall-Behandlung auf Eis über 30 sec bei 40 W unter Verwendung eines B-15-Ultraschallgerätes von Branson aufgebrochen, zweimal tiefgefroren und aufgetaut und wiederum zentrifugiert. Der Überstand wurde bei –20°C gelagert, während die Niederschläge in 2 ml Guanidin-Pufferlösung (6 M Guanidin-Hydrochlorid, 100 mM Phosphatpufferlösung, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5) resuspendiert wurden und über 10 Zyklen in einem Homogenisator behandelt wurden. Das Produkt wurde mit 13.000 UpM über 40 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 150 μl Ni²⁺-Harz (Pharmacia) (zuvor mit Pufferlösung B gewaschen) vermischt und bei Zimmertemperatur unter sanfter Bewegung über 30 Minuten inkubiert. Die Probe wurde mit 700 g über 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Harz wurde zweimal mit 10 ml Pufferlösung B über 10 Minuten gewaschen, in 1 ml Pufferlösung B resuspendiert und auf eine Wegwerfsäule aufgetragen. Das Harz wurde bei Zimmertemperatur mit 2 ml Pufferlösung B gewaschen, bis die Durchflusslösung die OD₂₈₀ von 0,02–0,06 erreicht hatte. Das Harz wurde mit 2 ml Pufferlösung C (Harnstoff 8 M, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpufferlösung, pH-Wert 6,3) gewaschen, bis die Durchflusslösung die OD₂₈₀ von 0,02–0,06 erreicht hatte. Das His-Fusionsprotein wurde durch die Zugabe von 700 μl Elutionspufferlösung (Harnstoff 8 M, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpufferlösung, pH-Wert 4,5) eluiert, und die Fraktionen wurden gesammelt, bis die OD₂₈₀ 0,1 betrug. 21 μl von jeder Fraktion wurden auf ein 12% SDS-Gel aufgetragen.
Renaturierung von His-Fusionsproteinen
10% Glycerin wurde zu den denaturierten Proteinen zugegeben. Die Proteine wurden dann unter Verwendung von Dialyse-Pufferlösung I (10% Glycerin, 0,5 M Arginin, 50 mM Posphatpufferlösung, 5 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 2 M Harnstoff, pH 8,8) auf 20 μg/ml verdünnt und gegen dieselbe Pufferlösung bei 4°C über 12–14 Stunden dialysiert. Das Protein wurde darüber hinaus gegen Dialysepufferlösung II (10% Glycerin, 0,5 M Arginin, 50 mM Phosphatpufferlösung, 5 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, pH-Wert 8,8) über 12–14 Stunden bei 4°C dialysiert. Die Proteinkonzentration wurde nach der nachstehenden Formel berechnet: Protein (mg/ml) = (1,55 × OD280) – (0,76 × OD260)
Immunisierungen von Mäusen
20 μg von jedem gereinigten Protein werden verwendet, um Mäuse intraperitoneal zu immunisieren. In dem Fall einiger ORFs wurden Balb-C-Mäuse mit Al(OH)₃ als Adjuvans an den Tagen 1, 21 und 42 immunisiert, und die Immunantwort wurde in Proben beobachtet, die am Tag 56 genommen wurden. Für andere ORFs konnten CD1-Mäuse nach dem gleichen Protokoll immunisiert werden. Für die ORFs 25 und 40 wurden CD1-Mäuse unter Verwendung von Freundschem Adjuvans immunisiert, und das gleiche Immunisierungsprotokoll, mit der Änderung, dass die Immunantwort am Tag 42 anstatt 56 gemessen wurde, wurde verwendet. In ähnlicher Weise wurden für noch andere ORFs CD1-Mäuse mit Freundschem Adjuvans immunisiert, aber die Immunantwort wurde am Tag 49 gemessen.
ELISA-Test (Serumanalysen)
Der unverkapselte Stamm MenB M7 wurde auf Schokoladenagarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Bakterielle Kolonien wurden mit einem sterilen Dracon-Tupfer von den Agarplatten gesammelt und in 7 ml Mueller-Hinton-Brühe (Difco), die 0,25% Glucose enthielt, überimpft. Das bakterielle Wachstum wurde alle 30 Minuten durch Verfolgen der OD₆₂₀ beobachtet. Man ließ die Bakterien wachsen, bis die OD den Wert 0,3–0,4 erreicht hatte. Die Kultur wurde über 10 Minuten mit 10.000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Bakterien wurden einmal mit PBS gewaschen, in PBS, das 0,025% Formaldehyd enthielt, resuspendiert und über 2 Stunden bei Zimmertemperatur und dann über Nacht bei 4°C unter Rühren inkubiert. 100 μl Bakterienzellen wurden in jede Vertiefung einer Greiner-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit PBT-Waschpufferlösung (0,1% Tween-20 in PBS) gewaschen. 200 μl Sättigungspufferlösung (2,7% Polyvinylpyrrolidon 10 in Wasser) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden über 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT gewaschen. 200 μl verdünnte Seren (Verdünnungspufferlösung: 1% BSA, 0,1% Tween-20, 0,1% NaN₃ in PBS) wurden in jede Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden über 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT gewaschen. 100 μl HRP-konjugiertes anti-Maus (Dako)-Serum vom Kaninchen, 1:2000 in Verdünnungspufferlösung verdünnt, wurden in jede Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden über 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT-Pufferlösung gewaschen. 100 μl Substratpufferlösung für HRP (25 ml Citratpufferlösung, pH-Wert 5, 10 mg O-Phenyldiamin und 10 μl H₂O) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden bei Zimmertemperatur über 20 Minuten stehengelassen. 100 μl H₂SO₄ wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, und die OD₄₉₀ wurde verfolgt. Der ELISA-Test wurde als positiv angesehen, wenn die OD₄₉₀ das 2,5-fache der entsprechenden Präimmun-Seren betrug.
Verfahren des FACScan-Bakterien-Bindungstests
Der unverkapselte Stamm MenB M7 wurde auf Schokoladenagarplatten aufgetragen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Bakterielle Kolonien wurden mit einem sterilen Dracon-Tupfer von den Agarplatten gesammelt und in vier Röhrchen, die je 8 ml Mueller-Hinton-Brühe (Difco) enthielten, die 0,25% Glucose enthielt, überimpft. Das bakterielle Wachstum wurde alle 30 Minuten durch Verfolgen der OD₆₂₀ beobachtet. Man ließ die Bakterien wachsen, bis die OD den Wert 0,35–0,5 erreicht hatte. Die Kultur wurde über 10 Minuten mit 4000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag wurde in Blockierungspufferlösung (1% BSA, 0,4% NaN₃) resuspendiert und über 5 Minuten mit 4000 UpM zentrifugiert. Die Zellen wurden in Blockierungspufferlösung resuspendiert, um eine OD₆₂₀ von 0,07 zu erreichen. 100 μl Bakterienzellen wurden zu jeder Vertiefung einer Costar-Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben. 100 μl verdünnte (1:200) Seren (in Blockierungspufferlösung) wurden jeder Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden über 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden über 5 Minuten mit 4000 UpM zentrifugiert, der Überstand wurde abgesaugt, und die Zellen wurden durch die Zugabe von 200 μl Blockierungspufferlösung/Vertiefung zu jeder Vertiefung gewaschen. 100 μl R-Phycoerythrin-konjugiertes anti-Maus-F(ab)₂ der Ziege, 1:100 verdünnt, wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden über 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation mit 4000 UpM über 5 Minuten abgesetzt und durch Zugabe von 200 μl Blockierungspufferlösung/Vertiefung gewaschen. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen wurden in 200 μl PBS, 0,25% Formaldehyd/Vertiefung resuspendiert. Die Proben wurden in FACScan-Röhrchen übertragen und gemessen. Die Bedingung für die FACScan-Einstellung waren: FL1 an, FL2 und FL3 aus; FSC-H-Schwelle:92; FSC-PMT-Spannung: E 02; SSC-PMT: 474; Amp. Gains 7,1; FL-2 PMT: 539. Kompensationswerte: 0.
OMV-Präparationen
Bakterien wurden über Nacht auf 5 GC-Platten gezüchtet, mit einer Schlinge geerntet und in 10 ml 20 mM Tris-HCl resuspendiert. Die Hitzeinaktivierung wurde bei 56°C über 30 Minuten durchgeführt, und die Bakterien wurden durch Ultraschall über 10' auf Eis aufgebrochen (50% Pflichtzyklus, 50% Leistung). Nicht aufgebrochene Zellen wurden durch Zentrifugation mit 5000 g über 10 Minuten entfernt, und die gesamte Fraktion der Zellhüllen wurde durch Zentrifugation mit 50.000 g bei 4°C über 75 Minuten gewonnen. Um cytoplasmatische Membranproteine aus den äußeren Rohmembranen zu extrahieren, wurde die gesamte Fraktion in 2% Sarkosyl (Sigma) resuspendiert und bei Zimmertemperatur über 20 Minuten inkubiert. Die Suspension wurde mit 10.000 g über 10 Minuten zentrifugiert, um Aggregate zu entfernen, und der Überstand wurde darüber hinaus mit 50.000 g über 75 Minuten ultrazentrifugiert, um die äußeren Membranen auszufällen. Die äußeren Membranen wurden in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, resuspendiert, und die Proteinkonzentration wurde durch den Bio-Rad-Proteintest unter Verwendung von BSA als ein Standard gemessen.
Präparation der Gesamtextrakte
Bakterien wurden über Nacht auf einer GC-Platte gezüchtet, mit einer Schlinge geerntet und in 1 ml 20 mM Tris-HCl resuspendiert. Die Hitzeinaktivierung wurde bei 56°C über 30 Minuten durchgeführt.
Western-Blot-Verfahren
Gereinigte Proteine (500 ng/Spur), äußere Membranvesikel (5 μg) und Gesamtzellextrakte (25 μg), die vom MenB-Stamm 2996 stammten, wurden einer 15% SDS-PAGE unterzogen und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Übertragung wurde über 2 Stunden mit 150 mA bei 4°C in Transferpufferlösung (0,3% Tris-Base, 1,44% Glycin, 20% Methanol) vorgenommen. Die Membran wurde durch Inkubation über Nacht bei 4°C in Sättigungspufferlösung (10% Magermilch, 0,1% Triton X100 in PBS) gesättigt. Die Membran wurde zweimal mit Waschpufferlösung (3% Magermilch, 0,1% Triton X100 in PBS) gewaschen und über 2 Stunden bei 37°C mit Maus-Seren, die 1:200 in Waschpufferlösung verdünnt waren, inkubiert. Die Membran wurde zweimal gewaschen und über 90 Minuten mit einem mit Meerrettich-Peroxidase markierten, im Verhältnis 1:2000 verdünnten anti-Maus-Ig inkubiert. Die Membran wurde zweimal mit 0,1% Triton X100 in PBS gewaschen und mit dem Opti-4CN-Substrat-Kit (Bio-Rad) entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasser gestoppt.
Untersuchung auf Keimtötung
Der Stamm MC5B wurde über Nacht bei 37°C auf Schokoladenagar-Platten gezüchtet. 5–7 Kolonien wurden gesammelt und verwendet, um 7 ml Mueller-Hinton-Brühe zu beimpfen. Die Suspension wurde bei 37°C auf einem Nutator inkubiert, und man ließ sie wachsen, bis die OD₆₂₀ zwischen 0,5–0,8 lag. Die Kultur wurde in Aliquots in sterile 1,5 ml-Eppendorfröhrchen aufgeteilt und über 20 Minuten mit Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrofuge zentrifugiert. Der Niederschlag wurde einmal in Gey-Pufferlösung (Gibco) gewaschen und in derselben Pufferlösung auf eine OD₆₂₀ von 0,5 resuspendiert, im Verhältnis 1:20.000 in Gey-Pufferlösung verdünnt und bei 25°C gelagert.
50 μl Gey-Pufferlösung/1% BSA wurden in jede Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben. 25 μl verdünnte (1:100) Maus-Seren (Verdünnungspufferlösung: Gey-Pufferlösung/0,2% BSA) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platte wurde bei 4°C inkubiert. 25 μl der vorstehend beschriebenen Bakteriensuspension wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. 25 μl von entweder hitzeinaktiviertem (56°C-Wasserbad über 30 Minuten) oder normalem Baby-Kaninchen-Komplement wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Unmittelbar nach der Zugabe des Baby-Kaninchen-Komplements wurden 22 μl von jeder Probe/Vertiefung auf Mueller-Hinton-Agarplatten ausplattiert (Zeitpunkt 0). Die Platte mit 96 Vertiefungen wurde über 1 Stunde bei 37°C unter Rotation inkubiert, und dann wurden 22 μl von jeder Probe/Vertiefung auf Mueller-Hinton-Agarplatten ausplattiert (Zeitpunkt 1). Nach Inkubation über Nacht wurden die Kolonien, die dem Zeitpunkt 0 und Zeitpunkt 1 h entsprachen, gezählt.
Sequenzen
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren wurde der nachstehende Abschnitt der DNA-Sequenz von N. gonorrhoeae identifiziert <SEQ ID NO: 1>:
Dies entspricht der Aminosäuresequenz <SEQ ID NO: 2; ORF 741.ng>:
Der nachstehende Abschnitt einer DNA-Teilsequenz wurde in N. meningitidis identifiziert <SEQ ID NO: 3>:
Dies entspricht der Aminosäuresequenz <SEQ ID NO: 4; ORF 741>:
Der nachstehende Abschnitt der DNA-Sequenz wurde in N. meningitidis identifiziert <SEQ ID NO: 5>:
Dies entspricht der Aminosäuresequenz <SEQ ID NO: 6; ORF 741.a>:
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein umfassend: • die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2; • eine Aminosäuresequenz, welche eine 50%ige oder höhere Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 2 hat und welche wirksam ist zur Vorbeugung einer Krankheit, die auf Neisseria-Bakterien zurückzuführen ist; • eine Aminosäuresequenz, umfassend ein Fragment von 8 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 2, wobei das Fragment ein Epitop aus SEQ ID NO: 2 umfasst; • die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4; • eine Aminosäuresequenz, welche eine 50%ige oder höhere Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 4 hat und welche wirksam ist zur Vorbeugung einer Krankheit, die auf Neisseria-Bakterien zurückzuführen ist; • eine Aminosäuresequenz, umfassend ein Fragment von 10 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 4, wobei das Fragment ein Epitop aus SEQ ID NO: 4 umfasst; • die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6; • eine Aminosäuresequenz, welche eine 50%ige oder höhere Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 6 hat und welche wirksam ist zur Vorbeugung einer Krankheit, die auf Neisseria-Bakterien zurückzuführen ist; • eine Aminosäuresequenz, umfassend ein Fragment von 10 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 6, wobei das Fragment ein Epitop aus SEQ ID NO: 6 umfasst.
Protein nach Anspruch 1, welches eine Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 4 aufweist, die höher als 60% ist.
Protein nach Anspruch 2, welches eine Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 4 aufweist, die höher als 70% ist.
Protein nach Anspruch 3, welches eine Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 4 aufweist, die höher als 80% ist.
Protein nach Anspruch 4, welches eine Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 4 aufweist, die höher als 90% ist.
Protein nach Anspruch 5, welches eine Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 4 aufweist, die höher als 95% ist.
Protein nach Anspruch 6, welches eine Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 4 aufweist, die höher als 99% ist.
Protein nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 12 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 4 umfasst.
Protein nach Anspruch 8, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 14 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 4 umfasst.
Protein nach Anspruch 9, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 16 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 4 umfasst.
Protein nach Anspruch 10, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 18 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 4 umfasst.
Protein nach Anspruch 11, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 20 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 4 umfasst.
Protein nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 10 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 13, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 12 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 14, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 14 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 15, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 16 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 16, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 18 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 17, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment von 20 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren aus SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach einem der vorherigen Ansprüchen, wobei das Protein ein Neisseria-Antigen ist.
Antikörper, welcher spezifisch an eine Aminosäuresequenz bindet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6.
Antikörper nach Anspruch 20, welcher ein monoclonaler Antikörper ist.
Nucleinsäuremolekül, welches ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 19 codiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 22, umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5.
Nucleinsäuremolekül, welches ein Protein codiert, das wirksam ist für die Vorbeugung von Krankheiten, welche auf Neisseria Bakterien zurückzuführen sind, umfassend (i) ein Fragment von 12 oder mehr zusammenhängenden Nucleotiden aus SEQ ID NO: 1, welche ein Epitop aus SEQ ID NO: 2 codieren; (ii) ein Fragment von 20 oder mehr zusammenhängenden Nucleotiden aus SEQ ID NO: 3, welche ein Epitop aus SEQ ID NO: 4 codieren; oder (iii) ein Fragment von 20 oder mehr zusammenhängenden Nucleotiden aus SEQ ID NO: 5, welche ein Epitop aus SEQ ID NO: 6 codieren.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 24, umfassend ein Fragment von 25 oder mehr zusammenhängenden Nucleotiden aus SEQ ID NO: 3.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 25, umfassend ein Fragment von 30 oder mehr zusammenhängenden Nucleotiden aus SEQ ID NO: 3.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 26, umfassend ein Fragment von 35 oder mehr zusammenhängenden Nucleotiden aus SEQ ID NO: 3.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 27, umfassend ein Fragment von 40 oder mehr zusammenhängenden Nucleotiden aus SEQ ID NO: 3.
Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche komplementär zu einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 22 bis 28 ist.
Zusammensetzung, umfassend ein Protein, ein Nucleinsäuremolekül oder einen Antikörper nach einem der vorherigen Ansprüche.
Zusammensetzung nach Anspruch 30, welche eine immunogene Zusammensetzung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 30, welche eine Impfstoffzusammensetzung oder eine diagnostische Zusammensetzung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 30 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 19, eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 22 bis 29 oder eines Antikörpers nach Anspruch 20 oder 21 für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung einer Infektion, welche durch Neisseria-Bakterien verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei das Medikament zur Vorbeugung einer Infektion, welche durch N. meningitidis hervorgerufen wird, dient.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das Medikament zur Vorbeugung einer Infektion, welche durch N. meningitidis B hervorgerufen wird, dient.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 33 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 36, wobei die Zusammensetzung oder das Medikament ein Adjuvans beinhaltet.
Vektor, umfassend die Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 22 bis 29.
Wirtszelle, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 38.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 19, umfassend den Schritt der Anzucht einer Wirtszelle nach Anspruch 39 unter Bedingungen, welche die Proteinexpressionen induzieren.