DE69938302T2

DE69938302T2 - Neisseria-meningitidis-antigene und zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69938302T2
Application number: DE69938302T
Authority: DE
Inventors: Claire Rockville Fraser; Cesira Galeotti; Guido Grandi; Erin Rockville Hickey; Vega Masignani; Mariarosa Mora; Jeremy Rockville Petersen; Mariagratia Pizza; Rino Rappuoli; Giulio Ratti; Enzo Scalato; Maria Scarselli; Herve Rockville Tettelin; J. Craig Rockville Venter
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; J Craig Venter Institute Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; J Craig Venter Institute Inc
Priority date: 1998-05-01
Filing date: 1999-04-30
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2019-05-01
Also published as: DE69937419D1; EP2261338A2; CN101293920A; JP2013255503A; CN1210305C; WO1999057280A9; EP1944371A2; US20120135024A1; EP2261342A2; EP2261343A3; US9249198B2; ES2294629T3; EP1645631B1; WO1999057280A3; EP2261349A2; US7576176B1; US8524251B2; EP2261357A2; EP2261350A3; EP2261354A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Antigene der Bakterienspecies Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae.
HINTERGRUND
Neisseria meningitidis ist ein nicht-beweglicher Gram-negativer, humanpathogener Diplococcus. Er besiedelt den Kehlkopf und ruft Meningitis sowie gelegentlich, wenn keine Meningitis auftritt, Septikämie hervor. Neisseria meningitidis ist eng mit N. gonorrhoeae verwandt, obgleich ein Merkmal, das Meningococcus klar von Gonococcus unterscheidet, im Vorliegen einer Polysaccaridkapsel besteht, die bei sämtlichen pathogenen Meningococci vorliegt.
N. meningitidis verursacht sowohl endemische als auch epidemische Erkrankungen. In den Vereinigten Staaten beträgt die Infektionsquote 0,6–1 pro 100000 Personen und Jahr und kann im Fall des Ausbruchs der Erkrankung erheblich größer sein (siehe Liebermann et al. (1996), Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neissera meningitidis Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccine in Young Children. JAMA 275 (19): 1499–1503; Schuchat et al. (1997) Bacterial Meningitis in the United States in 1995, N. Engl. J. Med. 337 (14): 970–976). In Entwicklungsländern sind die endemischen Erkrankungsraten erheblich höher, und während Epidemien kann die Infektionsquote 500 Fälle auf 100000 Personen und Jahr betragen. Die Mortalität ist extrem hoch und beträgt 10–20% in den Vereinigten Staaten und ist in Entwicklungsländern erheblich höher. Nach der Einführung des Konjugat-Impfstoffs gegen Haemophilus influenzae ist N. meningitidis die Hauptursache für bakterielle Meningitis bei allen Altersgruppen in den Vereinigten Staaten (Schuchat et al. (1997) s. oben).
Auf der Basis des kapsulären Polysaccharids des Organismus wurden 12 Serogruppen von N. meningitidis identifiziert. Das Pathogen der Gruppe A ist das Pathogen, das bei epidemischen Erkrankungen in Schwarzafrika in den meisten Fällen eine Rolle spielt. Die Pathogene der Serogruppen B und C sind für die überwiegende Mehrzahl der Fälle in den Vereinigten Staaten und in den meisten Industriestaaten verantwortlich. Der Meningococcus-Impfstoff, der gegenwärtig in Gebrauch ist, stellt einen tetravalenten Polysaccharid-Impfstoff dar, der aus den Serogruppen A, C, Y und W135 zusammengesetzt ist. Obgleich dieser Impfstoff bei Jugendlichen und Erwachsenen wirksam ist, ruft er eine nur schwache Immunantwort und eine nur kurze Schutzdauer hervor und kann nicht bei Kindern verwendet werden [siehe zum Beispiel Morbidity and Mortality weekly report, Band 46, Nr. RR-5 (1997)]. Der Grund hierfür liegt darin, dass Polysaccharide T-Zellunabhängige Antigene sind, die eine schwache Immunantwort induzieren, die durch wiederholte Immunisierung nicht geboostert werden kann. Nach dem Erfolg der Impfung gegen H. influenzae wurden Konjugat-Impfstoffe gegen die Serogruppen A und C entwickelt, die sich im letzten Stadium der klinischen Tests befinden (Zollinger, W. D., "New and Improved Vaccines Against Meningococcal Disease" in: New Generation Vaccines, s. oben, Seiten 469–488; Liebermann et al. (1996), s. oben; Costantino et al. (1992) Development and Phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A and C. Vaccine 10: 691–698).
Meningococcus B (menB) bleibt allerdings ein Problem. Dieser Serotyp ist gegenwärtig für ungefähr 50% aller Meningitis-Fälle in den Vereinigten Staaten, Europa und Südamerika verantwortlich. Der Polysaccarid-Ansatz kann hier nicht herangezogen werden, da das kapsuläre Polysaccharid von menB ein Polymer einer α(2–8)-verknüpften N-Acetylneuraminsäure ist, das auch in Sängergewebe vorliegt. Dies führt zu einer Toleranz gegenüber dem Antigen; wenn eine Antwortantwort hervorgerufen werden würde, wäre sie in der Tat gegen den Organismus selbst gerichtet und daher unerwünscht. Zur Vermeidung einer Induktion von Autoimmunität und zur Induktion einer schützenden Immunantwort wurde das kapsuläre Polysaccharid zum Beispiel durch Ersatz der N-Acetyl-Gruppen durch N-Propionyl-Gruppen chemisch modifiziert, wodurch die spezifische Antigenität unverändert blieb (Romero und Outschoorn (1994), Current status of Meningococcal group B vaccine candidates: capsular or non-capsular? Clin. Microbiol. Rev. 7(4): 559–575).
Bei alternativen Ansätzen für menB-Impfstoffe wurden komplexe Gemische von äußeren Membranproteinen (outer membrane Proteins, OMPs) verwendet, die entweder die OMPs allein oder an Porinen angereicherte OMPs enthielten oder bei denen die OMPs der Klasse 4 fehlten, von denen angenommen wird, dass sie Antikörper induzieren, welche die bakterizide Wirksamkeit blockieren. Dieser Ansatz führt zu Impfstoffen, die nicht gut charakterisiert sind. Sie sind in der Lage, gegen den homologen Stamm zu schützen, sind aber nicht breit wirksam bei Vorliegen zahlreicher antigener Varianten der äußeren Membranproteine. Zur Überwindung der Antigen-Variabilität wurden multivalente Impfstoffe konstruiert, die bis zu neun verschiedene Porine enthielten (siehe zum Beispiel Poolman, J. T. (1992), Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis. 4: 13–28). Zusätzliche Proteine zur Verwendung bei Außenmembran-Impfstoffen waren die Proteine opa und opc, jedoch war es mit keinem dieser Ansätze möglich, die Antigen-Variabilität zu überwinden (siehe zum Beispiel Ala'Aldeen und Borriello (1996), The meningococcal transferrin-binding Proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains. Vaccine 14(1): 49–53).
Für die Gene und Proteine von Meningokokken und Gonokokken ist eine gewisse Menge an Sequenzdaten verfügbar (siehe zum Beispiel EP-A-0467714 , WO 96/29412 ), jedoch sind diese in keiner Weise vollständig. Zu weiteren menB-Proteinen können die Proteine gehören, die aufgelistet sind in WO 97/28273 , WO 96/29412 , WO 95/03413 , US 5 439 808 , US 5 879 686 , Rokbi et al. (1997), Infect. Immun. 65: 55–63 und WO 97/13860 .
Die Bereitstellung weiterer Sequenzen könnte die Chance bieten, sezernierte oder oberflächenexponierte Proteine zu identifizieren, die mutmaßliche Targets für das Immunsystem darstellen und bei denen keine antigene Variabilität vorliegt. So könnten zum Beispiel einige der identifizierten Proteine Bestandteile wirksamer Impfstoffe gegen Meningococcus B darstellen, einige könnten Bestandteile von Impfstoffen gegen sämtliche Meningococcus-Serotypen sein, und anderen könnten Bestandteile von Impfstoffen gegen sämtliche pathogenen Neisseriae einschließlich Neisseria meningitidis oder Neisseria gonorrhoeae darstellen. Diese für N. meningitidis oder N. gonorrhoeae spezifischen Sequenzen, die hoch konservativ sind, stellen weitere bevorzugte Sequenzen dar.
Es ist somit Aufgabe der Erfindung, Neisseria-DNA-Sequenzen anzugeben, die Proteine codieren, die antigen oder immunogen sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die Produkte der Proteinexpression und der Reinigung des erwarteten ORF 287, wie er in E. coli kloniert und exprimiert wurde.
2 veranschaulicht das Hydrophilie-Diagramm, den Antigen-Index und die AMPHI-Bereiche der Produkte der Proteinexpression des erwarteten ORF 287, wie er in E. coli kloniert und exprimiert wurde.
3 zeigt einen Sequenzvergleich der Aminosäuresequenzen für ORF 287 für verschiedene Stämme von Neisseria. Die schwarze Schattierung zeigt Bereiche der Homologie, und die graue Schattierung gibt die Konservierung von Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften an. Die Figur zeigt einen hohen Konservierungsgrad bei den verschiedenen Stämmen, was die Brauchbarkeit als Antigen sowohl für Impfstoffe als auch für Diagnostika bestätigt.
DIE ERFINDUNG
Die Erfindung gibt Proteine an, die Aminosäuresequenzen von N. meningitidis und Aminosäuresequenzen von N. gonorrhoeae aufweisen, die in den Beispielen offenbart sind.
Die Erfindung gibt ferner Proteine an, die Sequenzen aufweisen, die zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 homolog sind (d. h., Aminosäuresequenzen mit Sequenzidentität). Der Grad der Homologie (Sequenzidentität) ist vorzugsweise größer als 50% (zum Beispiel 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder mehr). Diese Proteine umfassen Mutanten und Allelvarianten der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2. Typischerweise wird eine Identität von 50% oder mehr zwischen zwei Proteinen als Hinweis auf eine funktionelle Äquivalenz angesehen. Die Identität zwischen Proteinen wird vorzugsweise nach dem Smith-Waterman-Algorithmus zur Homologiesuche ermittelt, der in dem MPSRCH-Programm (Oxford Molecular) implementiert ist, bei dem eine Suche nach affinen Gaps mit den Parametern Gap-Penalty 12, Gap-Extension-Penalty 1 angewandt wird.
Die Erfindung gibt ferner Proteine an, die Fragmente der Aminsäuresequenz SEQ ID NO: 2 enthalten. Die Fragmente umfassen mindestens n aufeinanderfolgende Aminosäuren der Sequenzen, wobei n gleich 7 oder größer ist (zum Beispiel gleich 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 oder darüber). Die Fragmente umfassen vorzugsweise ein Epitop aus der Sequenz.
Die Proteine der Erfindung können selbstverständlich auf verschiedene Weise (zum Beispiel durch rekombinante Expression, Reinigung aus einer Zellkultur, chemische Synthese, etc.) sowie in verschiedenen Formen (zum Beispiel nativ, Fusionen, etc.) hergestellt werden. Sie werden vorzugsweise in im Wesentlichen reiner oder isolierter Form hergestellt (das heißt, im Wesentlichen frei von anderen Proteinen der Wirtszellen von N. meningitidis oder N. gonorrhoeae).
Gemäß einem weiteren Aspekt gibt die Erfindung Antikörper an, die an die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 binden. Diese Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und auf eine beliebige geeignete Weise erzeugt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt gibt die Erfindung Nucleinsäuren an, welche die Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfassen.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung Nucleinsäuren, deren Sequenzidentität mit der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 größer als 50% ist (zum Beispiel 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder darüber). Die Sequenzidentität wird wie oben angegeben ermittelt.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung Nucleinsäure, die mit den hier angegebenen Sequenzen hybridisiert. Die Bedingungen für die Hybridisierung werden im Weiteren angegeben.
Ferner werden Nucleinsäuren angegeben, die Fragmente dieser Sequenzen umfassen. Diese sollten mindestens n aufeinanderfolgende Nucleotide der Nucleinsäurequenz SEQ ID NO: 1 umfassen, wobei n gleich 12 oder größer ist (zum Beispiel 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 oder darüber).
Gemäß einem weiteren Aspekt gibt die Erfindung Nucleinsäure an, die Proteine und Proteinfragmente der Erfindung codiert.
Ferner ist festzustellen, dass die Erfindung Nucleinsäure angibt, die Sequenzen umfasst, die zu den oben beschriebenen komplementär sind (zum Beispiel für Antisense- oder Sondenzwecke).
Die Nucleinsäure gemäß der Erfindung kann selbstverständlich auf zahlreichen Wegen hergestellt werden (zum Beispiel durch teilweise oder vollständige chemische Synthese, aus Genombibliotheken oder cDNA-Bibliotheken, aus dem Organismus selbst, etc.) und kann in verschiedenen Formen vorliegen (zum Beispiel einzelsträngig, doppelsträngig, in Form von Vektoren, in Form von Sonden, etc.).
Der Ausdruck "Nucleinsäure" umfasst ferner DNA und RNA sowie ihre Analoga, wie etwa diejenigen, die modifizierte Hauptketten enthalten, sowie ferner Proteinnucleinsäuren (PNA), etc.
Gemäß einem weiteren Aspekt gibt die Erfindung Vektoren, die Nucleotidsequenzen der Erfindung (zum Beispiel Expressionsvektoren) umfassen, sowie mit solchen Vektoren transformierte Wirtszellen an.
Gemäß einem weiteren Aspekt gibt die Erfindung Zusammensetzungen an, die Proteine, Antikörper und/oder Nucleinsäuren gemäß der Erfindung enthalten. Diese Zusammensetzungen können zum Beispiel als Impfstoffe oder als diagnostische Reagentien oder als immunogene Zusammensetzungen geeignet sein.
Die Erfindung gibt ferner Nucleinsäuren, Proteine oder Antikörper gemäß der Erfindung zur Verwendung als Arzneimittel (zum Beispiel als Impfstoffe) oder als diagnostische Reagentien an. Sie gibt ferner die Verwendung von Nucleinsäuren, Proteinen oder Antikörpern gemäß der Erfindung an zur Herstellung (i) eines Medikaments zur Verhinderung einer Infektion durch Neisseria-Bakterien, (ii) eines diagnostischen Reagens zur Erfassung des Vorliegens von Neisseria-Bakterien oder von gegen Neisseria-Bakterien erzeugten Antikörpern oder (iii) zur Erzeugung von Antikörpern. Bei den Neisseria-Bakterien kann es sich um beliebige Arten oder Stämme davon handeln (zum Beispiel um N. gonorrhoeae), jedoch handelt es sich bevorzugt um N. meningitidis, speziell um Stamm B oder Stamm C.
Gemäß weiteren Aspekten gibt die Erfindung verschiedene Verfahren an.
Es wird ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen der Erfindung angegeben, das den Schritt der Kultivierung einer Wirtszelle gemäß der Erfindung unter Bedingungen umfasst, unter denen Proteinexpression induziert wird.
Es wird ein Verfahren zur Erfassung von Polynucleotiden der Erfindung angegeben, das folgende Schritte aufweist: (a) Inkontaktbringen einer Nucleinsäuresonde gemäß der Erfindung mit einer biologischen Probe unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung von Doppelsträngen und (b) Erfassen der Doppelstränge.
Es wird ein Verfahren zur Erfassung von Proteinen der Erfindung angegeben, das folgende Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen eines Antikörpers gemäß der Erfindung mit einer biologischen Probe unter Bedingungen, die für die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes geeignet sind, und (b) Erfassen der Komplexe.
Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung wird die Erfindung unter Bezug auf die nachstehenden Beispiele, die lediglich der Erläuterung dienen und die vorliegende Erfindung nicht einschränken sollen, wenn nichts anderes angegeben ist, näher erläutert.
Methodik – Zusammenfassung von Standardverfahren und Standardtechniken
Allgemeines
Die vorliegende Erfindung gibt Nucleotidsequenzen und darin codierte Aminosäuresequenzen von Neisseria meningitidis menB an. Mit diesen offenbarten Sequenzen können Nucleinsäuresonden sowie Expressionskassetten und Expressionsvektoren erzeugt werden. Die Expressionsvektoren können zur Erzeugung von Proteinen in Wirtszellen transformiert werden. Die gereinigten oder isolierten Polypeptide (die auch chemisch synthetisiert sein können), können zur Erzeugung von Antikörpern zur Erfassung von menB-Proteinen herangezogen werden. Die Wirtszellen oder Extrakte können ferner für biologische Assays zur Isolierung von Agonisten und Antagonisten verwendet werden. Mit diesen Sequenzen können ferner Untersuchungen zur Identifizierung von offenen Leserahmen und zur Identifizierung von Aminosequenzen durchgeführt werden. Die Proteine können auch in immunogenen Zusammensetzungen, antigenen Zusammensetzungen und als Impfstoff-Komponenten Verwendung finden.
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, wenn nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, der Mikrobiologie, der DNA-Rekombinationstechnik und der Immunologie angewandt, die im Rahmen des fachmännischen Könnens liegen. Solche Techniken sind umfassend in der Literatur erläutert; siehe zum Beispiel Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989); DNA Cloning, Bände I und II (Hrsg. D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (Hrsg. M. J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hrsg. B. D. Hames und S. J. Higgins, 1984); Transcription and Translation (Hrsg. B. D. Hames und S. J. Higgins, 1984); Animal Cell Culture (Hrsg. R. I. Freshney, 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); die Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), insbesondere die Bände 154 und 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Hrsg. J. H. Miller und M. P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Hrsg. Mayer und Walker (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practice, 2. Auflage (Springer-Verlag, N. Y.) sowie Handbook of Experimental Immunology, Bände I–IV (Hrsg. D. M. Weir und C. C. Blackwell, 1986).
In der vorliegenden Patentschrift werden Standardabkürzungen für Nucleotide und Aminosäuren verwendet.
Sämtliche hier zitierten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden hier in vollem Umfang in Bezug genommen.
Expressionssysteme
Die Nucleotidsequenzen von Neisseria menB können in einer Vielzahl unterschiedlicher Expressionssysteme exprimiert werden, zum Beispiel in Expressionssystemen, die zusammen mit Sängerzellen, Pflanzenzellen, Baculoviren, Bakterien und Hefen verwendet werden.
i. Sängersysteme
Säuger-Expressionssysteme sind im Stand der Technik bekannt. Ein Säuger-Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die befähigt ist, Säuger-RNA-Polymerase zu binden und stromabwärts (3') die Transkription einer codierenden Sequenz (zum Beispiel eines Strukturgens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor besitzt eine Transkriptions-Initiationsregion, die sich üblicherweise in der Nähe des 5'-Endes der codierenden Sequenz befindet, und eine TATA-Box, die sich üblicherweise 25–30 Basenpaare (bp) stromaufwärts der Transkriptions-Initiationsstelle befindet. Es wird angenommen, dass die TATA-Box die RNA-Polymerase II so lenkt, dass die RNA-Synthese an der korrekten Stelle beginnt. Ein Säuger-Promotor enthält ferner ein stromaufwärts angeordnetes Promotorelement, das sich üblicherweise innerhalb von 100 bis 200 bp stromaufwärts der TATA- Box befindet. Ein stromaufwärts angeordnetes Promotorelement bestimmt die Rate, mit der die Transkription initiiert wird, und kann in beiden Richtungen wirken (Sambrook et al. (1989), "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage).
Gene von Säuger-Viren werden oft mit hoher Rate exprimiert und weisen ein breites Wirtsspektrum auf; daher ergeben Sequenzen, die Gene von Säuger-Viren codieren, besonders geeignete Promotorsequenzen. Zu den Beispielen hierfür gehören der frühe SV40-Promotor, der Mäuse-Mammatumorvirus-LTR-Promotor, der späte Haupt-Promotor des Adenovirus (Ad MLP) und der Herpes-Simplex-Virus-Promotor. Ferner ergeben von nicht-viralen Genen abgeleitete Sequenzen, wie etwa das murine Metallothionein-Gen, ebenfalls günstige Promotorsequenzen. Die Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein. Je nach dem ausgewählten Promotor können zahlreiche Promotorwirkungen unter Verwendung bekannter Substrate induzierbar sein, wie etwa bei Verwendung des Mäuse-Mammatumor-Virus(MMTV)-Promotors mit dem Glucocorticoid-Response-Element (GRE), das durch Glucocorticoid in auf Hormon ansprechenden transformierten Zellen induziert wird (siehe zum Beispiel das Patent US 5 783 681 ).
Das Vorliegen eines Enhancer-Elements (Enhancer), in Kombination mit den oben beschriebenen Promotor-Elementen, erhöht üblicherweise die Expressionsniveaus. Ein Enhancer ist eine regulatorische DNA-Sequenz, welche die Transkription bis zu 1000-fach zu stimulieren vermag, wenn sie mit homologen oder heterologen Promotoren verknüpft ist, wobei die Synthese an der normalen RNA-Startstelle beginnt. Enhancer sind auch aktiv, wenn sie stromaufwärts oder stromabwärts von der Transkriptions-Initiationsstelle entweder in normaler oder umgekehrter Orientierung oder in einem Abstand von mehr als 1000 Nucleotiden vom Promotor angeordnet sind (Maniatis et al. (1987), Science 236: 1237; Alberts et al. (1989), Molecular Biology of the Cell, 2. Auflage). Enhancer-Elemente, die von Viren abgeleitet sind, können besonders nützlich sein, da sie üblicherweise ein breiteres Wirtsspektrum aufweisen. Zu den Beispielen hierfür gehören der Enhancer für das frühe SV40-Gen (Dijkema et al. (1985), EMBO J. 4: 761) und Enhancer/Promotoren, die abgleitet sind vom langen terminalen Repeat (LTR) des Rous-Sarkom-Virus (Gorman et al. (1982b), Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777) und vom humanen Cytomegalie-Virus (Boshart et al. (1985), Cell 41: 521). Einige Enhancer sind ferner regulierbar und werden erst in Gegenwart eines Induktors wie etwa eines Hormons oder eines Metallions aktiv (Sassone-Corsi und Borelli (1986), Trends Genet. 2: 215; Maniatis et al. (1987), Science 236: 1237).
Ein DNA-Molekül kann in Sängerzellen intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft werden, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins stets ein Methionin ist, das durch das ATG-Startcodon codiert wird. Erwünschtenfalls kann der N-Terminus durch Inkubation mit Bromcyan in vitro vom Protein abgespalten werden.
Alternativ können auch Fremdproteine aus der Zelle in die Wachstumsmedien hinein sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersequenzfragment enthält, das für eine Sekretion des Fremdproteins in Säugerzellen sorgt. Vorzugsweise sind zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdgen Prozessierungsstellen codiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren beinhaltet, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle lenken. Der dreiteilige Adenovirus-Leader ist ein Beispiel für eine Leadersequenz, die zur Sekretion eines Fremdproteins in Säugerzellen führt.
Die Transkriptions-Terminations- und Polyadenylierungssequenzen, die durch Säugerzellen erkannt werden, sind üblicherweise regulatorische Bereiche, die sich 3' vom Translations-Stoppcodon befinden und somit, zusammen mit den Promotorelementen, die codierende Sequenz flankieren. Der 3'-Terminus der reifen mRNA wird durch ortsspezifische posttranslationale Spaltung und Polyadenylierung erzeugt (Birnstiel et al. (1985), Cell 41: 349; Proudfoot und Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA", in: Transcription and splicing (Hrsg. B. D. Hames und D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14: 105). Diese Sequenzen lenken die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA codierte Polypeptid translatiert werden kann. Zu den Beispielen für Transkriptions-Terminator/Polyadenylierungs-Signale gehören Signale, die von SV40 abgeleitet sind (Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells", in: Molecular cloning: A Laboratory Manual).
Üblicherweise werden die oben beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptions-Terminations-Sequenz umfassen, zu Expressionskonstrukten zusammengebaut. In einem Expressionskonstrukt können gewünschtenfalls auch Enhancer, Introns mit funktionellen Splice-Donor-Stellen und Splice-Akzeptor-Stellen sowie Leadersequenzen vorliegen. Die Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon, wie etwa einem extrachromosomalen Element (zum Beispiel in Plasmiden) aufrechterhalten, das die Fähigkeit besitzt, in einem Wirt stabil bestehenzubleiben, zum Beispiel in Säugerzellen oder Bakterien. Zu den Säuger-Replikationssystemen gehören solche, die von Tierviren abgeleitet sind, die zur Replikation transagierende Faktoren erfordern. So replizieren beispielsweise Plasmide, welche die Replikationssysteme von Papova-Viren, wie SV40 (Gluzman (1981), Cell 23: 175) oder Polyoma-Viren enthalten, in Gegenwart des geeigneten viralen T-Antigens unter Erzeugung einer extrem hohen Kopienzahl. Zu weiteren Beispielen für Säuger-Replicons gehören solche, die von Rinder-Papilloma-Virus und von Epstein-Barr-Virus abgeleitet sind. Das Replicon kann ferner zwei Replikationssysteme aufweisen, wodurch es möglich wird, dass es zum Beispiel in Säugerzellen zur Expression und in einem prokaryotischen Wirt zur Klonierung und Amplifizierung gehalten werden kann. Zu den Beispielen für Säuger-Bakterien-Shuttlevektoren gehören pMT2 (Kaufmann et al. (1989), Mol. Cell. Biol. 9: 946) und pHEBO (Shimizu et al. (1986), Mol. Cell. Biol. 6: 1074).
Die angewandte Transformationsprozedur hängt von dem zu transformierenden Wirt ab. Verfahren zur Einführung heterologer Polynucleotide in Säugerzellen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen die Dextran-vermittelte Transfektion, die Calciumphosphat-Fällung, die Polybren-vermittelte Transfektion, die Protoplasten-Fusion, die Elektroporation, die Verkapselung des oder der Polynucleotide in Liposomen und die direkte Mikroinjektion der DNA in Zellkerne.
Säugerzelllinien, die als Wirtszellen zur Expression verfügbar sind, sind im Stand der Technik bekannt; hierzu gehören zahlreiche immortalisierte Zelllinien, die von der American Type Culture Collection (ATTC) erhältlich sind; hierzu gehören, ohne dass damit eine Einschränkung verbunden wäre, Eizellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen (BHK-Zellen), Affennierenzellen (COS-Zellen), humane hepatocelluläre Carcinom-Zellen (zum Beispiel Hep G2) sowie eine Reihe anderer Zelllinien.
ii. Pflanzenzellen-Expressionssysteme
Im Stand der Technik sind zahlreiche genetische Expressionssysteme mit Pflanzenzellkulturen und ganzen Pflanzen bekannt. Zu den Beispiele für genetische Expressionssysteme mit Pflanzenzellen gehören die Systeme, die in Patenten beschrieben sind, zum Beispiel in US 5 693 506 , US 5 659 122 und US 5 608 143 . Weitere Beispiele für genetische Expression in Pflanzenzellkulturen wurden von Zenk, Phytochemistry 30: 3861–3863 (1991), beschrieben. Beschreibungen für Pflanzenprotein-Signalpeptide finden sich zusätzlich zu den oben beschriebenen Literaturangaben in Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209: 33–40 (1987); Chandler et al., Plant Molecular Biology 3: 407–418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731–3738 (1985); Rothstein et al., Gene 55: 353–356 (1987); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15: 2515–2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3: 3–14 (1989); Yu et al., Gene 122: 247–253 (1992). Eine Beschreibung der Regulation der Pflanzengenexpression durch das Phytohormon Gibberellinsäure und durch Gibberellinsäure-induzierte sezernierte Enzyme sind zu finden in R. L. Jone und J. MacMillin, Gibberellins, in: Advanced Plant Physiology, Hrsg. Malcolm B. Wilkins, 1984, Pitman Publishing Limited, London, Seiten 21–52. Druckschriften, in denen weitere metabolisch regulierte Gene beschrieben sind: Sheen, Plant Cell 2: 1027–2038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9: 3447–3452 (1990); Benkel und Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1337–1339 (1987).
Typischerweise wird unter Anwendung von auf diesem Gebiet bekannten Verfahren eine gewünschte Polynucleotidsequenz in eine Expressionskassette eingefügt, die genetische regulatorische Elemente enthält, die zur Wirkung in Pflanzen ausgelegt sind. Die Expressionskassette wird in einen gewünschten Expressionsvektor mit Begleitsequenzen stromaufwärts und stromabwärts von der Expressionskassette, die zur Expression in einem pflanzlischen Wirt geeignet sind, eingeführt. Die Begleitsequenzen stammen von einem Plasmid oder sind viralen Ursprungs und verleihen dem Vektor die Eigenschaften, die notwendig sind, damit die Vektoren DNA von einem ursprünglichen Klonierungswirt, wie etwa Bakterien, in den gewünschten pflanzlichen Wirt einführen können. Das zugrundeliegende bakterielle/pflanzliche Vektorkonstrukt ergibt vorzugsweise einen prokaryotischen Replikationsursprung in einem weiten Bereich von Wirten, einen wählbaren prokaryotischen Marker sowie, für Agraobacterium-Transformationen, T-DNA-Sequenzen für Agrobacterium-vermittelten Transfer in Pflanzenchromosomen. Wenn das heterologe Gen einer Erfassung nicht leicht zugänglich ist, weist das Konstrukt bevorzugt ferner ein wählbares Marker-Gen auf, das sich zur Erfassung eignet, ob eine Pflanzenzelle transformiert wurde. Eine allgemeine Übersicht zu geeigneten Markern, zum Beispiel für Mitglieder der Familie der Gräser, findet sich in Wilmink und Dons, 1993, Plant. Mol. Biol. Reptr. 11(2): 165–185.
Sequenzen, die geeignet sind, eine Integration der heterologen Sequenz in das Pflanzengenom zu erlauben, werden ebenfalls empfohlen. Hierzu können Transposon-Sequenzen und dergleichen zur homologen Rekombination sowie Ti-Sequenzen gehören, die eine zufällige Insertion einer heterologen Expressionskassette in ein Pflanzengenom erlauben. Zu geeigneten prokaryotischen wählbaren Markern gehört die Resistenz gegen Antibiotika wie Ampicillin oder Tetracyclin. Andere DNA-Sequenzen, die zusätzliche Funktionen codieren, können ebenfalls im Vektor vorliegen, wie auf diesem Gebiet bekannt ist.
Die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können zur Expression des interessierenden Proteins oder der interessierenden Proteine in eine Expressionskassette eingebracht werden. Üblicherweise liegt nur eine Expressionskassette vor, wobei jedoch auch zwei oder mehr Expressionskassetten realisierbar sind. Die rekombinante Expressionskassette enthält zusätzlich zu der das heterologe Protein codierenden Sequenz die folgenden Elemente: eine Promotorregion, pflanzliche 5'-nicht-translatierte Sequenzen, ein Initiationscodon je nachdem, ob das Strukturgen mit einem solchen Initiationscodon ausgerüstet ist oder nicht, sowie eine Transkriptions- und Translations-Terminationssequenz. Nur einmal vorkommende Restriktionsenzymstellen am 5'-Ende und am 3'-Ende der Kassette erlauben eine leichte Einführung in einen vorliegenden Vektor.
Eine heterologe codierende Sequenz kann für ein beliebiges Protein vorliegen, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht. Die das interessierende Protein codierende Sequenz codiert ein Signalpeptid, das die Prozessierung und Translokation des Proteins, falls erforderlich, erlaubt, und weist üblicherweise keine Sequenz auf, die zur Bindung des gewünschten Proteins der Erfindung an eine Membran führen würde. Da die Transkriptions-Initiationsregion meistens für ein Gen vorliegt, das während der Keimung exprimiert und transloziert wird, indem das Signalpeptid, das die Translokation ergibt, verwendet wird, kann auch eine Translokation des interessierenden Proteins vorgesehen werden. Auf diese Weise ist eine Translokation des interessierenden Proteins oder der interessierenden Proteine von den Zellen möglich, in denen sie exprimiert werden und von denen sie in effizienter Weise gewonnen werden können. Typischerweise erfolgt die Sekretion in Samen im Aleuron oder in der skutellaren Epithelschicht in das Endosperm des Samens hinein. Obgleich es nicht erforderlich ist, dass das Protein aus den Zellen, in denen das Protein erzeugt wird, sezerniert wird, erleichtert dies die Isolierung und Reinigung des rekombinanten Proteins.
Da die letztendliche Expression des gewünschten Genprodukts in einer eukaryotischen Zelle erfolgt, ist es wünschenswert, zu ermitteln, ob irgendein Teil des klonierten Gens Sequenzen enthält, die durch das Splicosomensystem des Wirtes durch Prozessierung als Introns auftreten. Wenn dies der Fall ist, kann eine stellengerichtete Mutagenese des "Intron"-Bereichs durchgeführt werden, um zu verhindern, dass ein Teil der genetischen Information als falscher Intron-Code verlorengeht, siehe Reed und Maniatis, Cell 41: 95–105, 1985.
Der Vektor kann durch Verwendung von Mikropipetten durch Mikroinjektion direkt in die Pflanzenzellen eingebracht werden, um die rekombinante DNA mechanisch zu übertragen, siehe Crossway, Mol. Gen. Genet. 202: 179–185, 1985. Das genetische Material kann ferner unter Verwendung von Polyethylenglycol in die Pflanzenzelle übertragen werden, siehe Krens et al., Nature 296, 72–74, 1982. Ein weiteres Verfahren zur Einführung von Nucleinsäuresegmenten besteht in der Hochgeschwindigkeitspenetration durch kleine Teilchen mit der Nucleinsäure, die entweder innerhalb der Matrix kleiner Kügelchen oder Partikel oder auf ihrer Oberfläche vorliegt, siehe Klein et al., Nature 327, 70–73, 1987, und Knudsen und Müller, 1991, Planta 185: 330–336, wo das Partikelbombardment von Gersten-Endosperm zur Erzeugung von transgener Gerste beschrieben ist. Ein weiteres Einführungsverfahren besteht in der Fusion von Protoplasten mit anderen Einheiten, entweder mit Minizellen, Zellen, Lysosomen oder anderen fusionierbaren Körpern mit Lipidoberfläche, siehe Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1859–1863, 1982.
Der Vektor kann auch durch Elektroporation in die Pflanzenzellen eingeführt werden (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824, 1985). Bei dieser Technik werden Pflanzenprotoplasten in Gegenwart von Plasmiden, die das Genkonstrukt enthalten, der Elektroporation unterzogen. Elektrische Impulse hoher Feldstärke führen zu einer reversiblen Permeabilisierung von Biomembranen, was die Einführung der Plasmide erlaubt. Die der Elektroporation unterzogenen Pflanzenprotoplasten bilden die Zellwand zurück, teilen sich und bilden Pflanzenkallus.
Sämtliche Pflanzen, aus denen Protoplasten isoliert und zu ganzen regenerierten Pflanzen kultiviert werden können, können durch die vorliegende Erfindung transformiert werden, sodass ganze Pflanzen gewonnen werden, die das übertragene Gen enthalten. Es ist bekannt, dass praktische alle Pflanzen aus kultivierten Zellen oder Geweben regeneriert werden können; hierzu gehören, ohne dass dies einschränkend wäre, sämtliche Hauptarten von Rohrzucker, Zuckerrüben, Baumwolle, Obstbäumen und anderen Bäumen, Leguminosen und Gemüsen. Zu einigen Beispielen für geeignete Pflanzen gehören Arten der Gattungen Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersium, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum und Datura.
Die Mittel zur Regeneration variieren von Pflanzenart zu Pflanzenart, jedoch wird allgemein eine Suspension von transformierten Protoplasten, die Kopien des heterologen Gens enthalten, zunächst erzeugt. Dann bildet sich Kallusgewebe, und Schösslinge können aus dem Kallus induziert und anschließend bewurzelt werden. Alternativ kann die Erzeugung eines Embryos aus der Protoplastensuspension induziert werden. Diese Embryos keimen wie natürliche Embryos und bilden Pflanzen. Die Kulturmedien enthalten allgemein verschiedene Aminosäuren und Hormone, wie Auxin und Cytokinine. Es ist ferner von Vorteil, Glutaminsäure und Prolin dem Medium hinzuzufügen, insbesondere für Pflanzenarten wie Mais und Alfalfa. Schösslinge und Wurzeln entwickeln sich normalerweise gleichzeitig. Eine wirksame Regeneration hängt vom Medium, vom Genotyp und von der Vorgeschichte der Kultur ab. Wenn diese drei Variablen kontrolliert werden, ist die Regeneration dann vollständige reproduzierbar und wiederholbar.
Bei einigen Pflanzenzellkultursystemen kann das gewünschte Protein der Erfindung ausgeschieden werden; alternativ dazu kann das Protein aus der vollständigen Pflanze extrahiert werden. Wenn das gewünschte Protein der Erfindung in das Medium hinein sezerniert wird, kann es daraus gewonnen werden. Alternativ können die Embryonen und embryonenfreie Halbsamen oder andere Pflanzengewebe mechanisch zerstört werden, um ein sezerniertes Protein zwischen den Zellen und Geweben freizusetzen. Das Gemisch kann in einer Pufferlösung suspendiert werden, um lösliche Proteine zu gewinnen. Anschließend werden herkömmliche Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Proteinen angewandt, um das rekombinante Protein zu reinigen. Die Parameter der Zeit, der Temperatur, des pH-Wertes, des Sauerstoffs und der Volumina werden nach Routineverfahren eingestellt, um die Expression und Gewinnung des heterologen Proteins zu optimieren.
iii. Baculovirus-Systeme
Das Polynucleotid, welches das Protein codiert, kann auch in einen geeigneten Insekten-Expressionsvektor eingebracht werden und ist mit den Kontrollelementen innerhalb dieses Vektors operativ verknüpft. Zur Konstruktion des Vektors werden Techniken angewandt, die auf diesem Gebiet bekannt sind. Die Komponenten des Expressionssystems umfassen allgemein einen Transfervektor, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, das sowohl ein Fragment des Baculovirus-Genoms als auch eine geeignete Restriktionsstelle zur Einfügung des zu exprimierenden heterologen Gens oder der zu exprimierenden heterologen Gene enthält, ein Wildtyp-Baculovirus mit einer zu dem Baculovirus-spezifischen Fragment im Transfervektor homologen Sequenz (dies erlaubt die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus-Genom hinein) sowie geeignete Insekten-Wirtszellen und Züchtungsmedien.
Nach dem Einfügen der DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in den Transfervektor werden der Vektor und das virale Wildtyp-Genom durch Transfektion in eine Insekten-Wirtszelle eingebracht, in welcher der Vektor und das virale Genom rekombinieren können. Das verpackte rekombinante Virus wird exprimiert, und rekombinante Plaques werden identifiziert und gereinigt. Materialien und Methoden für Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssysteme sind in Kitform unter anderem von Invitrogen, San Diego, CA, im Handel erhältlich ("MacBac"-Kit). Diese Techniken sind Fachleuten dieses Gebiets allgemein bekannt und umfassend beschrieben in Summers und Smit, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (im Folgenden "Summers und Smith").
Vor der Einführung der DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in das Baculovirus-Genom werden die oben beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, einen Leader (gewünschtenfalls), die interessierende codierende Sequenz und die Transkriptions-Terminations-Sequenz umfassen, üblicherweise zu einem Übertragungs-Zwischenkonstrukt (Transfervektor) zusammengesetzt. Dieses Konstrukt kann ein einziges Gen und operativ verknüpfte regulatorische Elemente, mehrere Gene, von denen jedes seinen eigenen Satz operativ verknüpfter regulatorischer Elemente aufweist, oder mehrere Gene enthalten, die durch den gleichen Satz regulatorischer Elemente reguliert werden. Übertragungs- Zwischenkonstrukte werden oft in einem Replicon, wie etwa einem extrachromosomalen Element (zum Beispiel Plasmide) gehalten, das zu einer stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt, wie etwa einem Bakterium, befähigt ist. Das Replicon besitzt ein Replikationssystem, wodurch es in einem geeigneten Wirt zur Klonierung und Amplifizierung aufrechterhalten werden kann.
Gegenwärtig ist der allgemein am meisten verwendete Transfervektor zur Einführung von Fremdgenen in AcNPV der Transfervektor pAc373. Es wurden ferner auch zahlreiche andere Vektoren konstruiert, die Fachleuten des vorliegenden Gebiets bekannt sind. Hierzu gehört zum Beispiel pVL985 (der das Polyhedrin-Start-Codon von ATG in ATT ändert und der eine BamHI-Klonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts vom ATT einführt, siehe Luckow und Summers, Virology (1989) 17: 31).
Das Plasmid enthält üblicherweise auch das Polyhedrin-Polyadenylierungssignal (Miller et al. (1988), Ann. Rev. Microbiol. 42: 177) und ein prokaryotisches Ampicillin-Resistenz(amp)-Gen sowie einen Replikationsursprung zur Selektion und Propagierung in E. coli.
Baculovirus-Transfervektoren enthalten üblicherweise einen Baculovirus-Promotor. Ein Baculovirus-Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die zur Bindung einer Baculovirus-RNA-Polymerase und zur Initiierung der Transkription einer codierenden Sequenz (zum Beispiel eines Strukturgens) in mRNA stromabwärts (5' nach 3') befähigt ist. Ein Promotor weist eine Transkriptions-Initiationsregion auf, die üblicherweise nahe am 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt. Diese Transkriptions-Initiationsregion enthält üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptions- Initiationsstelle. Ein Baculovirus-Transfervektor kann ferner auch eine zweite, als Enhancer bezeichnete Domäne enthalten, die, falls sie vorliegt, üblicherweise distal zum Strukturgen liegt. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
Strukturgene, die zu späten Zeitpunkten in einem viralen Infektionszyklus in großer Menge transkribiert werden, ergeben besonders geeignete Promotorsequenzen. Zu den Beispielen hierfür gehören Sequenzen, die von dem Gen abgeleitet sind, welches das virale Polyhedrin-Protein codiert, siehe Friesen et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", in: The Molecular Biology of Baculoviruses (Hrsg. Walter Dörfler) und die Veröffentlichungen EP 127 839 und EP 155 476 , sowie das Gen, welches das p10-Protein codiert, siehe Vlak et al. (1988), J. Gen. Virol. 69: 765.
Eine DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte Insektenproteine oder Baculovirus-Proteine abgeleitet werden, etwa dem Baculovirus-Polyhedrin-Gen (Carbonell et al. (1988), Gene 73: 409). Da die Signale für posttranslationale Modifizierungen bei Säugerzellen (wie etwa die Signalpeptidspaltung, die proteolytische Spaltung und die Phosphorylierung) offenbar durch Insektenzellen erkannt werden und es ferner den Anschein hat, dass die zur Sekretion und nukleären Akkumulation erforderlichen Signale ebenfalls zwischen Invertebraten-Zellen und Vertebraten-Zellen konserviert werden, können alternativ auch Leader, die nicht von Insekten stammen, wie etwa solche, die von Genen abgeleitet sind, die humanes α-Interferon codieren (Maeda et al. (1985), Nature 315: 592), humanes Gastrin-freisetzendes Peptid (Lebacq-Verheyden et al. (1988), Molec. Cell. Biol. 8: 3129), humanes IL-2 (Smith et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8404), Maus-IL-3 (Miyajima et al. (1987), Gene 58: 273) sowie humane Glucocerebrosidase (Martin et al. (1988), DNA, 7: 99) verwendet werden, um eine Sekretion in Insekten zu erzielen.
Ein rekombinantes Polypeptid oder Polyprotein kann intrazellulär exprimiert oder, falls es mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen exprimiert wird, sezerniert werden. Eine gute intrazelluläre Expression nicht-fusionierter Fremdproteine erfordert üblicherweise heterologe Gene, die im Idealfall eine kurze Leadersequenz aufweisen, die geeignete Translations-Initiationssignale vor einem ATG-Startsignal enthalten. Gewünschtenfalls kann Methionin am N-Terminus durch Inkubation mit Bromcyan in vitro vom reifen Protein abgespalten werden. Alternativ können rekombinante Polyproteine oder Proteine, die nicht natürlicherweise sezerniert werden, dadurch aus der Insektenzelle sezerniert werden, dass chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersequenzfragment enthält, das eine Sekretion des Fremdproteins in Insekten ergibt. Dieses Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, welche die Translokation des Proteins in das Endoplasmatische Reticulum lenken.
Nach der Einführung der DNA-Sequenz und/oder des Gens, die bzw. das den Expressionsprodukt-Vorläufer des Proteins codiert, wird eine Insekten-Wirtszelle mit der heterologen DNA des Transfervektors und der genomischen DNA des Wildtyp-Baculovirus cotransformiert, üblicherweise durch Cotransfektion. Der Promotor und die Transkriptions-Terminationssequenz des Konstrukts enthalten üblicherweise einen Abschnitt des Baculovirus-Genoms von 2 bis 5 kb. Verfahren zur Einführung einer heterologen DNA an der gewünschten Stelle im Baculovirus-Virus sind auf dem vorliegenden Gebiet bekannt (siehe Summers und Smith, oben; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156, sowie Luckow und Summers (1989)). Als Beispiel kann die Einführung in ein Gen wie etwa das Polyhedrin-Gen durch homologe doppelte Crossover-Rekombination erfolgen; die Einführung kann ferner auch in eine Restriktionsenzymstelle erfolgen, die in dem gewünschten Baculovirus-Gen konstruiert wurde, siehe Miller et al. (1989), Bioessays 4: 91. Die DNA-Sequenz ist, wenn sie anstelle des Polyhedrin-Gens in den Expressionsvektor kloniert wurde, sowohl an 5' als auch 3' durch Polyhedrin-spezifische Sequenzen flankiert und befindet sich stromabwärts des Polyhedrin-Promotors.
Der neu erzeugte Baculovirus-Expressionsvektor wird anschließend in einem infektiösen rekombinanten Baculovirus verpackt. Die homologe Rekombination erfolgt mit geringer Häufigkeit (zwischen etwa 1% und etwa 5%); somit ist die überwiegende Menge des nach Cotransfektion erzeugten Virus noch vom Wildtyp. Daher ist ein Verfahren erforderlich, um rekombinante Viren zu identifizieren. Ein Vorteil des Expressionssystems ist eine visuelle Durchmusterung, die eine Unterscheidung von rekombinanten Viren von anderen erlaubt. Das Polyhedrin-Protein, das durch das native Virus erzeugt wird, wird in den Zellkernen infizierter Zellen zu späten Zeiten nach der viralen Infektion in großen Mengen erzeugt. Angesammeltes Polyhedrin-Protein bildet Okklusionskörper, die auch eingebettete Partikel enthalten. Diese Okklusionskörper, deren Größe bis zu 15 μm beträgt, sind stark lichtbrechend, was ihnen ein hell leuchtendes Aussehen verleiht, das unter dem Lichtmikroskop leicht zu erkennen ist. Zellen, die mit rekombinanten Viren infiziert sind, weisen keine Okklusionskörper auf. Zur Unterscheidung des rekombinanten Virus vom Wildtyp-Virus wird der Transfektionsüberstand als Plaques auf eine Monoschicht von Insektenzellen nach Verfahren ausplattiert, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Die Plaques werden dann unter dem Lichtmikroskop auf das Vorliegen (Hinweis auf Wildtyp-Virus) oder Fehlen (Hinweis auf rekombinantes Virus) von Okklusionskörpern hin untersucht. Gängige Protokolle finden sich in Microbiology, Band 2 (Hrsg. Ausubel et al.), unter 16.8 (Supp. 10, 1990), bei Summers und Smith, siehe oben, und Miller et al. (1989).
Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren wurden für die Einführung in verschiedene Insektenzellen durch Infektion entwickelt. So wurden zum Beispiel rekombinante Baculoviren unter anderem entwickelt für Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni (PCT-Veröffentlichung WO 89/046699 ; Carbonell et al. (1985), J. Virol. 56: 153; Wright (1986), Nature 321: 718; Smith et al. (1983), Mol. Cell. Biol. 3: 2156; siehe auch allgemein Fraser et al. (1989) in Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).
Zellen und Zellkulturmedien sowohl zur direkten als auch zur über Fusionierung erfolgenden Expression von heterologen Polypeptiden in einem Baculovirus-Expressionssystem sind im Handel erhältlich; die Zellkulturtechnologie ist Fachleuten allgemein geläufig; siehe zum Beispiel Summers und Smith, oben.
Die modifizierten Insektenzellen können dann in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden, das eine stabilie Erhaltung des oder der im modifizierten Insektenwirt vorliegenden Plasmide erlaubt. Wenn das Gen für das Expressionsprodukt unter induzierbarer Kontrolle steht, kann der Wirt zu hohen Dichten gezüchtet werden, und die Expression kann induziert werden. Alternativ wird das Produkt, wenn die Expression konstitutiv ist, kontinuierlich in das Medium hinein exprimiert, und das Nährmedium muss kontinuierlich in Zirkulation gehalten werden, wobei das interessierende Produkt entfernt wird und verbrauchte Nährstoffe ergänzt werden. Das Produkt kann durch Techniken wie Chromatographie, zum Beispiel HPLC, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, etc., Elektrophorese, Dichtegradientenzentrifugierung, Lösungsmittelextraktion oder dergleichen gereinigt werden. Soweit nötig, kann das Produkt erforderlichenfalls weiter gereinigt werden, um irgendwelche Insektenproteine, die ebenfalls in das Medium hinein sezerniert werden oder aus der Lyse von Insektenzellen herrühren, im Wesentlichen zu entfernen und so ein Produkt zu erzielen, das im Wesentlichen frei ist von Bruchstücken von Wirtszellen, wie zum Beispiel Proteinen, Lipiden und Polysacchariden.
Zur Erzielung einer Proteinexpression werden rekombinante Wirtszellen, die von den Transformanten abgeleitet sind, unter Bedingungen inkubiert, die eine Expression der das rekombinante Protein codierenden Sequenz erlauben. Diese Bedingungen variieren je nach der ausgewählten Wirtszellen. Die Bedingungen sind jedoch für Durchschnittsfachleute dieses Gebiets auf der Basis des bekannten Fachwissens leicht zu ermitteln.
iv. Bakterielle Systeme
Verfahren zur bakteriellen Expression sind im Stand der Technik bekannt. Ein bakterieller Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die zur Bindung von bakterieller RNA-Polymerase und zur Initiierung der Transkription einer codierenden Sequenz (zum Beispiel eines Strukturgens) in mRNA stromabwärts (3') in der Lage ist. Ein Promotor besitzt eine Transkriptions-Initiationsregion, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz angeordnet ist. Diese Transkriptions-Initiationsregion umfasst üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptions-Initiationsstelle. Ein bakterieller Promotor kann ferner auch eine zweite Domäne aufweisen, die als Operator bezeichnet wird, die eine benachbarte RNA-Polymerase-Bindungsstelle überlappen kann, an der die RNA-Synthese beginnt. Der Operator erlaubt eine negativ regulierte (induzierbare) Transkription, da ein Gen-Repressorprotein den Operator binden und dadurch die Transkription eines speziellen Gens inhibieren kann. Konstitutive Expression kann bei Fehlen von negativen regulatorischen Elementen auftreten, wie etwa eines Operators. Zusätzlich kann eine positive Regulation durch eine Gen-Aktivatorprotein bindende Sequenz erzielt werden, die, falls vorhanden, üblicherweise proximal (5') zur RNA-Polymerase-Bindungssequenz angeordnet ist. Ein Beispiel für ein Gen-Aktivatorprotein ist das Catabolit-Aktivatorprotein (CAP), das dazu beiträgt, die Transkription des Lac-Operons in Escherichia coli (E. coli) zu initiieren (Raibaud et al. (1984), Ann. Rev. Genet. 18: 173). Die regulierte Expression kann daher entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder verstärkt oder abgeschwächt wird.
Sequenzen, die Enzyme von Stoffwechselwegen codieren, ergeben besonders geeignete Promotorsequenzen. Zu den Beispielen hierfür gehören Promotorsequenzen, die von Enzymen abgeleitet sind, die Zucker, wie Galactose, Lactose (lac) (Chang et al. (1977) Nature 198: 1056) und Maltose, metabolisieren. Zu weiteren Beispielen gehören Promotorsequenzen, die von biosynthetischen Enzymen abgeleitet sind, zum Beispiel Tryptophan (trp) (Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731; Patent US 4 738 921 und die Publikationen EP 036 776 und EP 121 775 ). Das β-Lactamase(bla)-Promotorsystem (Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes", in: Interferon. 3 (Hrsg. I. Gresser)), das Promotorsystem PL des Bakteriophagen Lambda (Shimatake et al. (1981), Nature 292: 128) und das Promotorsystem T5 (Patent US 4 689 406 ) liefern ebenfalls nützliche Promotorsequenzen.
Zusätzlich funktionieren auch synthetische Promotoren, die in der Natur nicht vorkommen, als bakterielle Promotoren. So können zum Beispiel Transkriptions-aktivierende Sequenzen eines bakteriellen Promotors oder eines Bakteriophagen-Promotors mit den Operon-Sequenzen eines anderen bakteriellen Promotors oder Bakteriophagen-Promotors verbunden werden, um einen synthetischen Hybridpromotor zu erzeugen (Patent US 4 551 433 ). Zum Beispiel ist der tac-Promotor ein trp-lac-Hybridpromotor, der sowohl trp-Promotorsequenzen als auch lac-Operon-Sequenzen enthält und durch den lac-Repressor reguliert wird (Amann et al. (1983), Gene 25: 167; de Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21). Ferner kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren nicht-bakteriellen Ursprungs enthalten, welche die Fähigkeit besitzen, eine bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Ein natürlich vorkommender Promotor nicht-bakteriellen Ursprungs kann auch mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um hohe Expressionsniveaus einiger Gene in Prokaryonten zu erzielen. Das RNA-Polymerase/Promotor-System des Bakteriophagen T7 ist ein Beispiel für ein gekoppeltes Promotorsystem (Studier et al. (1986), J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1074). Ferner kann ein Hybridpromotor einen Bakteriophagen-Promotor und einen Operatorbereich von E. coli enthalten (Veröffentlichung EP 267 851 ).
Zusätzlich zu einer funktionellen Promotorsequenz ist auch eine wirksame Ribosomen-Bindungsstelle für die Expression von Fremdgenen in Prokaryonten nützlich. In E. coli wird die Ribosomen-Bindungsstelle als Shine-Dalgarno(SD)-Sequenz bezeichnet und umfasst ein Initiationscodon (ATG) und eine Sequenz einer Länge von 3–9 Nucleotiden, die sich in einem Abstand von 3–11 Nucleotiden stromaufwärts des Initiationscodons befindet (Shine et al. (1975), Nature 254: 34). Es wird angenommen, dass die SD-Sequenz die Bindung der mRNA an das Ribosom durch Paaren der Basen zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende der 16S-rRNA von E. coli begünstigt (Steitz et al. (1979), "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", in: Biological Regulation and Development: Gene Expression (Hrsg. R. F. Goldberger)). Zur Expression von eukaryotischen Genen und prokaryotischen Genen mit schwachen Ribosom-Bindungsstellen ist es oftmals erforderlich, den Abstand zwischen der SD-Sequenz und dem ATG des eukaryotischen Gens zu optimieren (Sambrook et al. (1989), "Expression of cloned genes in Escherichia coli", in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft sein, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus immer ein Methionin ist, das durch das ATG-Startcodon codiert wird. Gewünschtenfalls kann das Methionin am N-Terminus durch Inkubation mit Bromcyan in vitro oder durch Inkubation mit einer bakteriellen Peptidase, die N-terminales Methionin abspaltet (Publikation EP 219 237 ), vom Protein abgespalten werden.
Fusionsproteine bilden eine Alternative zur direkten Expression. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Bereich eines endogenen Bakterienproteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, an das 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Bei der Expression liefert dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen. So kann zum Beispiel das ceII-Gen des Bakteriophagen Lambda am 5'-Terminus eines Fremdgens verknüpft und in Bakterien exprimiert werden. Das resultierende Fusionsprotein enthält bevorzugt eine Erkennungsstelle für ein prozessierendes Enzym (Faktor Xa) zur Abspaltung des Bakteriophagen-Proteins vom Fremdgen (Nagai et al. (1984), Nature, 309: 810). Fusionsproteine können auch mit Sequenzen des Gens lacZ (Jia et al. (1987), Gene, 60: 197), des Gens trpE (Allen et al. (1987), J. Biotechnol. 5: 93; Makoff et al. (1989), J. Gen. Microbiol. 135: 11) und des Gens Chey (Veröffentlichung EP 324 647 ) hergestellt werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindung der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder auch nicht. Ein weiteres Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird unter Verwendung der Ubiquitin-Region hergestellt, die bevorzugt eine Erkennungsstelle für ein prozessierendes Enzym enthält (zum Beispiel eine Ubiquitin-spezifische Prozessierungs-Protease), um das Ubiquitin vom Fremdprotein abzuspalten. Durch dieses Verfahren kann natives Fremdprotein isoliert werden (Miller et al. (1989), Bio/Technology 7: 698).
Alternativ können Fremdproteine auch dadurch von der Zelle sezerniert werden, dass chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Signalpeptidsequenz-Fragment enthält, das die Sekretion des Fremdproteins in Bakterien ermöglicht (Patent US 4 336 336 ). Das Signalsequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle lenken. Das Protein wird entweder in das Kulturmedium hinein (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum hinein exprimiert, der sich zwischen der inneren und der äußeren Zellmembran befindet (Gram-negative Bakterien). Vorzugsweise sind Prozessierungsstellen zwischen dem Signalpeptidfragment und dem Fremdgen codiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte bakterielle Proteine abgeleitet werden, wie zum Beispiel aus dem Gen für das äußere Membranprotein (ompA) von E. coli (Masui et al. (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984), EMBO J. 3: 2437) und der Signalsequenz für Alkalische Phosphatase (phoA) von E. coli (Oka et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212). Als weiteres Beispiel kann die Signalsequenz des Alpha-Amylase-Gens von verschiedenen Bacillus-Stämmen zur Sekretion heterologer Proteine aus B. subtilis herangezogen werden (Palva et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; Veröffentlichung EP 244 042 ).
Üblicherweise sind von Bakterien erkannte Transkriptions-Terminationssequenzen regulatorische Bereiche, die 3' vom Translations-Stoppcodon liegen und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA codierte Polypeptid übersetzt werden kann. Transkriptions-Terminationssequenzen enthalten häufig DNA-Sequenzen von etwa 50 Nucleotiden, die befähigt sind, Stamm-Schleifen-Strukturen auszubilden, die zur Termination der Transkription beitragen. Zu den Beispielen hierfür gehören Transkriptions-Terminationssequenzen, die von Genen mit starken Promotoren, wie etwa dem Gen trp von E. coli, wie auch von anderen biosynthetischen Genen abgeleitet sind.
Üblicherweise werden die oben beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Signalsequenz (gewünschtenfalls), eine interessierende codierende Sequenz sowie eine Transkriptions-Terminationssequenz umfassen, zu Expressionskonstrukten vereinigt. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon aufrechterhalten, wie zum Beispiel einem extrachromosomalen Element (zum Beispiel Plasmide), das zu einer stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt, wie zum Beispiel einem Bakterium, befähigt ist. Das Replicon besitzt ein Replikationssystem, aufgrund dessen es in einem prokaryotischen Wirt entweder zur Expression oder zur Klonierung und Amplifizierung aufrechterhalten werden kann. Ein Replicon kann ferner auch ein Plasmid mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl hat allgemein eine Kopienzahl im Bereich von etwa 5 bis etwa 200 und üblicherweise von etwa 10 bis etwa 150. Eine Wirtszelle, die ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl enthält, enthält bevorzugt mindestens 10 und noch bevorzugter mindestens etwa 20 Plasmide. Je nach der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf die Wirtszelle kann ein Vektor mit hoher oder mit niedriger Kopienzahl ausgewählt werden.
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das Bakteriengenom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine zum Bakterienchromosom homologe Sequenz, die eine Integration des Vektors erlaubt. Integrationen scheinen das Ergebnis von Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Bakterienchromosom zu sein. So werden zum Beispiel integrierende Vektoren, die mit DNA von verschiedenen Bacillus-Stämmen konstruiert sind, in das Bacillus-Chromosom integriert (Veröffentlichung EP 127 328 ). Integrierende Vektoren können auch Bakteriophagen- oder Transposon-Sequenzen enthalten.
Üblicherweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion von Bakterienstämmen, die transformiert wurden, zu ermöglichen. Selektierbare Marker können in der bakteriellen Wirtszelle exprimiert werden und können Gene aufweisen, welche die Bakterien gegen Antibiotika wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin resistent machen (Davies et al. (1978), Ann. Rev. Microbiol. 32: 469). Selektierbare Marker können ferner auch biosynthetische Gene umfassen, wie etwa solche des Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Biosynthesewegs.
Alternativ können einige der oben beschriebenen Bestandteile in Transformationsvektoren zusammengebaut werden. Transformationsvektoren enthalten üblicherweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replicon aufrechterhalten oder zu einem integrierenden Vektor entwickelt wird, wie oben beschrieben wurde.
Expressionsvektoren und Transformationsvektoren, entweder als extrachromosomale Replicons oder integrierende Vektoren, wurden zur Transformation zahlreicher Bakterien entwickelt. So wurden zum Beispiel Expressionsvektoren unter anderem für folgende Bakterien entwickelt: Bacillus subtilis (Palva et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; Veröffentlichungen EP 036 259 und EP 063 953 ; PCT-Veröffentlichung WO 84/04541 ), Escherichia coli (Shimatake et al. (1981), Nature 292: 128; Amann et al. (1985), Gene 40: 183; Studier et al. (1986), J. Mol. Biol. 189: 113; Veröffentlichungen EP 036 776 , EP 136 829 und EP 136 907 ), Streptococcus cremoris (Powell et al. (1988), Appl. Environ. Microbiol. 54: 655); Streptococcus lividans (Powell et al. (1988), Appl. Environ. Microbiol. 54: 655), Streptomyces lividans (Patent US 4 745 056 ).
Verfahren zum Einbringen exogener DNA in bakterielle Wirtszellen sind auf dem vorliegenden Gebiet wohl bekannt und umfassen üblicherweise die Transformation von Bakterien durch Behandlung mit CaCl₂ oder anderen Mitteln, wie etwa zweiwertigen Kationen und DMSO. DNA kann ferner auch durch Elektroporation in Bakterienzellen eingebracht werden. Die Transformationsverfahren variieren üblicherweise mit der zu transformierenden Bakterienart (siehe zum Beispiel Verwendung von Bacillus: Masson et al. (1989), FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; Veröffentlichungen EP 036 259 und EP 063 953 ; PCT-Veröffentlichung WO 84/04541 ; Verwendung von Campylobacter. Miller et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 856, und Wang et al. (1990), J. Bacteriol. 172: 949; Verwendung von Escherichia coli: Cohen et al. (1973), Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for tansformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids", in: Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium an Genetic Engineering (Hrsg. H. W. Boyer und S. Nicosia); Mandel et al. (1970), J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988), Biochim. Biophys. Acta, 949: 318; Verwendung von Lactobacillus: Chassy et al. (1987), FEMS Microbiol. Lett. 44: 173; Verwendung von Pseudomonas: Fiedler et al. (1988), Anal. Biochem. 170: 38; Verwendung von Staphylococcus: Augustin et al. (1990), FEMS Microbiol. Lett. 66: 203; Verwendung von Streptococcus: Barany et al. (1980), J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987), "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", in: Streptococcal Genetics (Hrsg. J. Ferretti und R. Curtiss III); Perry et al. (1981), Infect. Immun. 32: 1295; Powell et al. (1988), Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti et al. (1987), Proc. 4th Eur. Cong. Biotechnology 1: 412).
v. Expression in Hefen
Hefe-Expressionssysteme sind Durchschnittsfachleuten ebenfalls bekannt. Ein Hefe-Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die befähigt ist, eine bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einer codierenden Sequenz (zum Beispiel eines Strukturgens) in mRNA in Stromabwärtsrichtung zu initiieren. Ein Promotor besitzt eine Transkriptions-Initiationsregion, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz angeordnet ist. Diese Transkriptions-Initiationsregion enthält üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle (die "TATA-Box") und eine Transkriptions-Initiationsstelle. Ein Hefe-Promotor kann ferner auch eine zweite, als Upstream Activator Sequence (UAS) bezeichnete Domäne enthalten, die sich, falls sie vorliegt, üblicherweise distal zum Strukturgen befindet. Die UAS erlaubt eine regulierte (induzierbare) Expression. Konstitutive Expression erfolgt in Abwesenheit einer UAS. Die regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder verstärkt oder abgeschwächt wird.
Hefe ist ein fermentierender Organismus mit einem aktiven Stoffwechselgeschehen, weshalb Sequenzen, die Enzyme von Stoffwechselwegen codieren, besonders geeignete Promotor-Sequenzen liefern. Zu den Beispielen hierfür gehören Alkoholdehydrogenase (ADH) (Veröffentlichung EP 284 044 ), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglycerat-Mutase und Pyruvatkinase (PyK) (Veröffentlichung EP 329 203 ). Das Hefe-Gen PHO5, das eine saure Phosphatase codiert, liefert ebenfalls nützliche Promotor-Sequenzen (Myanohara et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1).
Darüber hinaus wirken synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, ebenfalls als Hefe-Promotoren. Zum Beispiel können UAS-Sequenzen eines Hefe-Promotors mit der Transkriptions-aktivierenden Region eines anderen Hefe-Promotors verbunden werden, wodurch ein synthetischer Hybrid-Promotor erzeugt wird. Zu den Beispielen für solche Hybrid-Promotoren gehören die regulatorische ADH-Sequenz, die mit der Transkriptions-aktivierenden Region von GAP verbunden ist (Patente US 4 876 197 und US 4 880 734 ). Weitere Beispiele für Hybrid-Promotoren umfassen Promotoren, die aus den regulatorischen Sequenzen der Gene ADH2, GAL4, GAL10 oder PHO5 bestehen, die mit der Transkriptions-aktivierenden Region eines Gens für ein glycolytisches Enzym, wie etwa GAP oder PyK, kombiniert sind (Veröffentlichung EP 164 556 ). Ein Hefe-Promotor kann ferner natürlich vorkommende Promotoren, die nicht aus Hefe stammen, enthalten, welche die Fähigkeit besitzen, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Beispiele für solche Promotoren finden sich, unter anderem, in folgenden Veröffentlichungen: Cohen et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff et al. (1981), Nature 283: 835; Hollenberg et al. (1981), Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 119; Hollenberg et al. (1979), "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae" in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Hrsg. K. N. Timmis und A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980), Gene 11: 163; Panthier et al. (1980), Curr. Genet. 2: 109).
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär in Hefe exprimiert werden. Eine Promotor-Sequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft sein, wobei dann die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins stets ein Methionin ist, das vom ATG-Startcodon codiert wird. Erwünschtenfalls kann das Methionin am N-Terminus durch Inkubation mit Bromcyan in vitro vom Protein abgespalten werden.
Fusionsproteine stellen eine Alternative zu Hefe-Expressionssystemen dar, und zwar in Säuger-, Baculovirus- und Bakterien-Expressionssystemen. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen Hefe-Proteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, mit dem 5'-Ende der heterologen codierenden Sequenz fusioniert. Nach der Expression ergibt dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen. So kann zum Beispiel das Gen der Superoxid-Dismutase (SOD) aus Hefe oder humanen Ursprungs am 5'-Terminus eines Fremdgens verknüpft und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder nicht (siehe zum Beispiel die Veröffentlichung EP 196 056 ). Ein weiteres Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird unter Verwendung der Ubiquitin-Region hergestellt, die bevorzugt eine Erkennungsstelle für ein prozessierendes Enzym aufweist (zum Beispiel eine Ubiquitin-spezifische prozessierende Protease), um das Ubiquitin vom Fremdprotein abzuspalten. Durch dieses Verfahren können daher native Fremdproteine isoliert werden (siehe zum Beispiel WO 88/024066 ).
Alternativ dazu können Fremdproteine auch durch Erzeugung von chimären DNA-Molekülen, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersquenz-Fragment enthält, das die Sekretion des Fremdproteins in Hefe ermöglicht, von der Zelle in die Wachstumsmedien hinein sezerniert werden. Bevorzugt sind Prozessierungsstellen zwischen dem Leader-Fragment und dem Fremdgen codiert, die in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenz-Fragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann aus Genen für sezernierte Hefeproteine abgeleitet werden, zum Beispiel aus dem Gen der Hefe-Invertase (Veröffentlichung EP 012 873 ; Veröffentlichung JP 62-096 086 ) und dem Gen des A-Faktors (Patent US 4 588 684 ). Alternativ gibt es Leader, die nicht aus Hefe stammen, wie etwa einen Interferon-Leader, die ebenfalls eine Sekretion in Hefe ergeben (Veröffentlichung EP 060 057 ).
Eine bevorzugte Klasse von Sekretionsleadern sind solche, die ein Fragment des Alpha-Faktor-Gens von Hefe verwenden, das eine "Prä"-Signalsequenz sowie eine "Pro"-Region enthält. Zu den Arten von Alpha-Faktor-Fragmenten, die verwendet werden können, gehören der Volllängen-Prä-Pro-Alpha-Faktor-Leader (etwa 83 Aminosäurereste) wie auch trunkierte Alpha-Faktor-Leader (üblicherweise etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) (Patente US 4 546 083 und US 4 870 008 ; Veröffentlichung EP 324 274 ). Zu weiteren Leadern, die ein Alpha-Faktor-Leaderfragment verwenden, das eine Sekretion ergibt, gehören hybride Alpha-Faktor-Leader, die mit einer Prä-Sequenz einer ersten Hefe, aber mit einer Pro-Region des Alpha-Faktors einer zweiten Hefe hergestellt sind (siehe zum Beispiel die PCT-Veröffentlichung WO 89/02463 ).
Üblicherweise sind von Hefen erkannte Transkriptions-Terminationssequenzen regulatorische Regionen, die 3' vom Translations-Stoppcodon liegen und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA codierte Polypeptid übersetzt werden kann. Beispiele für eine Transkriptions-Terminationssequenz und andere von Hefe erkannte Terminationssequenzen, wie etwa solche, die glycolytische Enzyme codieren, sind bekannt.
Üblicherweise werden die oben beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, einen Leader (falls gewünscht), die interessierende codierende Sequenz und eine Transkriptions-Terminationssequenz umfassen, zu Expressions-Konstrukten vereinigt. Expressions-Konstrukte werden oft in einem Replicon, wie etwa einem extrachromosomalen Element (zum Beispiel Plasmide) aufrechterhalten, das in einem Wirt, wie einer Hefe oder einem Bakterium, stabil aufrechterhalten werden kann. Das Replicon kann zwei Replikationssysteme aufweisen, wodurch es zum Beispiel in Hefe zur Expression und in einem prokaryotischen Wirt zur Klonierung und Amplifizierung aufrechterhalten werden kann. Zu den Beispielen für solche Hefe-Bakterien-Shuttlevektoren gehören YEp24 (Botstein et al. (1979), Gene 8: 17–24), pCl/1 (Brake et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642–4646) und YRp17 (Stinchcomb et al. (1982), J. Mol. Biol. 158: 157). Ein Replicon kann ferner ein Plasmid mit einer hohen oder einer niedrigen Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl hat allgemein eine Kopienzahl im Bereich von etwa 5 bis etwa 200 und üblicherweise von etwa 10 bis etwa 150. Eine Wirtszelle, die ein Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält, weist bevorzugt mindestens etwa 10 und noch bevorzugter mindestens etwa 20 Plasmide auf. Je nach der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf die Wirtszelle kann entweder ein Vektor mit hoher Kopienzahl oder ein Vektor mit niedriger Kopienzahl ausgewählt werden (siehe zum Beispiel Brake et al. oben).
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das Hefe-Genom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine zu einem Hefe-Chromosom homologe Sequenz, durch die eine Integration des Vektors ermöglicht wird, und enthalten bevorzugt zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Integrationen scheinen aus Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Hefe-Chromosom zu entstehen (Orr-Weaver et al. (1983), Methods in Enzymol., 101: 228–245). Ein integrierender Vektor kann durch Wahl der geeigneten homologen Sequenz zum Einschluss im Vektor zu einem spezifischen Genort in der Hefe gesteuert werden (siehe Orr-Weaver et al., oben). Ein oder mehrere Expressionskonstrukte können integrieren, wodurch möglicherweise die Niveaus an erzeugtem rekombinantem Protein beeinflusst werden (Rine et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6750). Die im Vektor enthaltenen chromosomalen Sequenzen können entweder als singuläres Segment im Vektor vorliegen, was zur Integration des gesamten Vektors führt, oder sie können als zwei Segmente vorliegen, die zu benachbarten Segmenten im Chromosom homolog sind und das Expressionskonstrukt im Vektor flankieren, was zu der stabilen Integration lediglich des Expressionskonstrukts führen kann.
Üblicherweise können extrachromosomale und integrierende Expressions-Konstrukte selektierbare Macker enthalten, um die Selektion von Hefestämmen zu ermöglichen, die transformiert wurden. Selektierbare Marker können biosynthetische Gene umfassen, die in der Hefe als Wirtszelle exprimiert werden können, zum Beispiel ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7 sowie das Resistenzgen G418, die den Hefezellen Resistenz gegen Tunicamycin beziehungsweise G418 verleihen. Darüber hinaus kann ein geeigneter selektierbarer Marker auch der Hefe die Fähigkeit zum Wachstum in Gegenwart toxischer Verbindungen wie etwa Metallen verleihen. So ermöglicht zum Beispiel das Vorliegen von CUP1 der Hefe das Wachstum in Gegenwart von Kupferionen (Butt et al. (1987), Microbiol. Rev. 51: 351).
Alternativ können einige der oben beschriebenen Komponenten zu Transformationsvektoren zusammengesetzt werden. Transformationsvektoren enthalten üblicherweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replicon aufrechterhalten oder zu einem integrierenden Vektor entwickelt wird, wie oben beschrieben wurde.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder als extrachromosomale Replicons oder als integrierende Vektoren, wurden zur Transformation zahlreicher Hefen bereits entwickelt. So wurden zum Beispiel Expressionsvektoren unter anderem für folgende Hefen entwickelt: Candida albicans (Kurtz et al. (1986), Mol. Cell. Biol. 6: 142), Candida maltosa (Kunze et al. (1985), J. Basic Microbiol. 25: 141), Hansenula polymorpha (Gleeson et al. (1986), J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 302); Kluyveromyces fragilis (Das et al. (1984), J. Bacteriol. 158: 1165), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al. (1983), J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg et al. (1990), Bio/Technology 8: 135), Pichia guillerimondii (Kunze et al. (1985), J. Basic Microbiol. 25: 141), Pichia pastoris (Cregg et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Patente US 4 837 148 und US 4 929 555 ), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al. (1983), J. Bacteriol. 153: 163), Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse (1981), Nature 300: 706) und Yarrowia lipolytica (Davidow et al. (1985), Curr. Genet. 10: 380471; Gaillardin et al. (1985), Curr. Genet. 10: 49).
Verfahren zur Einführung von exogener DNA in Hefe-Wirtszellen sind auf dem vorliegenden Gebiet wohl bekannt und umfassen üblicherweise entweder die Transformation von Sphäroplasten oder von mit Alkalikationen behandelten intakten Hefezellen. Die Transformationsverfahren variieren üblicherweise mit der zu transformierenden Hefeart (siehe zum Beispiel Kurtz et al. (1986), Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze et al. (1985), J. Basic Microbiol. 25: 141 [Candida]; Gleeson et al. (1986), J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 302 [Hansenula]; Das et al. (1984), J. Bacteriol. 158: 1165; De Louvencourt et al. (1983), J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg et al. (1990), Bio/Technology 8: 135 [Kluyveromyces]; Cregg et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze et al. (1985), J. Basic Microbiol. 25: 141; die Patente US 4 837 148 und US 4 929 555 [Pichia]; Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al. (1983), J. Bacteriol. 153: 163 [Saccharomyces]; Beach und Nurse (1981), Nature 300: 706 [Schizosaccharomyces]; Davidow et al. (1985), Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin et al. (1985), Curr. Genet. 10: 49 [Yarrowia]).
Definitionen
Eine Zusammensetzung, die X enthält, ist "im Wesentlichen frei von" Y, wenn mindestens 85 Gew.-% der Gesamtmenge X + Y in der Zusammensetzung aus X bestehen. Bevorzugt stellt X mindestens etwa 90 Gew.-% der Gesamtmenge X + Y in der Zusammensetzung dar, noch bevorzugter mindestens etwa 95 Gew.-% oder sogar 99 Gew.-%.
Ein "konserviertes" Aminosäurefragment oder Protein von Neisseria ist ein Aminosäurefragment oder Protein, das in einem bestimmten Neisseria-Protein bei mindestens x% der Neisseria vorliegt. Der Wert von x kann 50% oder mehr, zum Beispiel 66%, 75%, 80%, 90%, 95% oder sogar 100% betragen (das heißt, die Aminosäure wird in dem fraglichen Protein bei sämtlichen Neisseria gefunden). Zur Ermittlung, ob eine Aminosäure in einem bestimmten Neisseria-Protein "konserviert" ist, ist es erforderlich, diesen Aminosäurerest in den Sequenzen des fraglichen Proteins von einer Vielzahl unterschiedlicher Neisseria (einer Referenzpopulation) zu vergleichen. Die Referenzpopulation kann eine Anzahl verschiedener Neisseria-Arten umfassen oder kann eine einzelne Art umfassen. Die Referenzpopulation kann eine Reihe unterschiedlicher Serogruppen einer bestimmten Art oder eine einzige Serogruppe umfassen. Eine bevorzugte Referenzpopulation besteht aus den 5 verbreitetsten Neisseria-Stämmen.
Der Ausdruck "heterolog" bezieht sich auf zwei biologische Bestandteile, die in der Natur nicht zusammen gefunden werden. Die Bestandteile können Wirtszellen, Gene oder regulatorische Bereiche sein, wie etwa Promotoren. Obgleich die heterologen Bestandteile in der Natur nicht zusammen gefunden werden, können sie zusammenwirken, wenn zum Beispiel ein zu einem Gen heterologer Promotor funktionell mit dem Gen verknüpft ist. Ein weiteres Beispiel liegt vor, wenn eine Neisseria-Sequenz zu einer Maus-Wirtszelle heterolog ist.
"Epitop" bedeutet eine antigene Determinante, und ein Epitop kann eine zelluläre und/oder eine humorale Antwort hervorrufen.
Bedingungen für "hohe Stringenz" sind 65°C in 0,1 × SSC 0,5% SDS-Lösung.
Ein "Replikationsursprung" ist eine Polynucleotidsequenz, welche die Replikation von Polynucleotiden initiiert und reguliert, wie etwa ein Expressionsvektor. Der Replikationsursprung verhält sich wie eine autonome Einheit der Polynucleotidreplikation innerhalb einer Zelle, die zur Replikation unter ihrer eigenen Kontrolle befähigt ist. Ein Replikationsursprung kann für einen Vektor erforderlich sein, damit er in einer bestimmten Wirtszelle repliziert. Mit bestimmten Replikationsursprüngen kann ein Expressionsvektor mit einer hohen Kopienzahl in Gegenwart der geeigneten Proteine innerhalb der Zelle reproduziert werden. Beispiele für Ursprünge sind autonom replizierende Sequenzen, die in Hefe wirksam sind, sowie das virale T-Antigen, das in COS-7-Zellen wirksam ist.
Eine "mutierte" Sequenz ist als eine DNA-, RNA- oder Aminosäuresequenz, die sich von der nativen oder einer offenbarten Sequenz unterscheidet, jedoch Homologie dazu besitzt. Je nach der speziellen Sequenz ist der Grad der Homologie (Sequenzidentität) zwischen der nativen oder offenbarten Sequenz und der mutierten Sequenz vorzugsweise größer als 50% (zum Beispiel 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder mehr), wobei die Berechnung wie oben beschrieben erfolgt. Im hier benutzten Sinne ist eine "Allelvariante" eines Nucleinsäuremoleküls oder eines Nucleinsäurebereichs, für den die Nucleinsäuresequenz hier angegeben wird, ein Nucleinsäuremolekül oder ein Nucleinsäurebereich, der an im Wesentlichen der gleichen Stelle im Genom eines anderen oder zweiten Isolats auftritt und der, aufgrund der natürlichen Variation, die zum Beispiel durch Mutation oder Rekombination hervorgerufen wird, eine ähnliche, aber nicht eine identische Nucleinsäuresequenz besitzt. Eine Allelvariante eines codierenden Bereichs codiert typischerweise ein Protein mit ähnlicher Aktivität wie bei dem Protein, das durch das Gen codiert wird, mit dem es verglichen wird. Eine Allelvariante kann auch eine Änderung in den nichttranslatierten 5'- oder 3'-Bereichen des Gens umfassen, zum Beispiel in regulatorischen Kontrollbereichen (siehe zum Beispiel das Patent US 5 753 235 ).
Antikörper
Der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Polypeptid oder eine Gruppe von Polypeptiden, die aus mindestens einer Antikörper-Kombinationsstelle aufgebaut ist. Eine "Antikörper-Kombinationsstelle" ist der dreidimensionale Bindungsraum mit einer Form und Ladungsverteilung der Innenoberfläche, die zu den Eigenschaften eines Epitops eines Antigens komplementär ist, was eine Bindung des Antikörpers mit dem Antigen erlaubt. "Antikörper" umfasst zum Beispiel Vertebraten-Antikörper, Hybrid-Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, veränderte Antikörper, einwertige Antikörper, Fab-Proteine und Eindomänen-Antikörper.
Antikörper gegen die Proteine der Erfindung eignen sich für die Affinitätschromatographie, für Immunoassays und zur Unterscheidung/Identifizierung von Neisseria menB-Proteinen. Gegen die Proteine der vorliegenden Erfindung erzeugte Antikörper binden an antigenen Polypeptiden oder Proteinen oder Proteinfragmenten, die vorliegen und spezifisch mit Stämmen von Neisseria meningitidis menB assoziiert sind. In einigen Fällen können diese Antigene mit speziellen Stämmen assoziiert sein, wie etwa im Fall der Antigene, die für die menB-Stämme spezifisch sind. Die Antikörper der Erfindung können an einer Matrix immobilisiert und in einem Immunoassay oder auf einer Affinitätschromatographiesäule verwendet werden, um die Erfassung und/oder Trennung von Polypeptiden, Proteinen oder Proteinfragmenten oder Zellen, die solche Polypeptide, Proteine oder Proteinfragmente enthalten, zu ermöglichen. Alternativ können solche Polypeptide, Proteine oder Proteinfragmente immobilisiert werden, um Antikörper zu erfassen, die spezifisch daran binden.
Antikörper gegen die Proteine der Erfindung, und zwar sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper, können nach herkömmlichen Verfahren erzeugt werden. Allgemein wird das Protein zunächst dazu verwendet, ein geeignetes Tier zu immunisieren, bevorzugt eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen oder eine Ziege. Kaninchen und Ziegen sind aufgrund des erhältlichen Volumens an Serum und der Verfügbarkeit markierter Anti-Kaninchen- und Anti-Ziege-Antikörper für die Herstellung polyklonaler Seren bevorzugt. Die Immunisierung wird allgemein durch Mischen oder Emulgieren des Proteins in Kochsalzlösung, bevorzugt in einem Adjuvans wie vollständigem Freund-Adjuvans, und parenterales Injizieren des Gemischs oder der Emulsion (allgemein subkutan oder intramuskulär) vorgenommen. Eine Dosis von 50–200 μg/Injektion ist typischerweise ausreichend. Die Immunisierung wird allgemein 2–6 Wochen später mit einer oder mehreren Injektionen des Proteins in Kochsalzlösung, bevorzugt unter Verwendung von unvollständigem Freund-Adjuvans, geboostert. Alternativ können Antikörper durch Immunisierung in vitro unter Anwendung auf diesem Gebiet bekannter Verfahren erzeugt werden, was für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als zur Immunisierung in vivo äquivalent angesehen wird. Polyklonale Antiseren werden durch Aderlass des immunisierten Tiers in einen Glas- oder Kunststoffbehälter, Inkubieren des Bluts während einer Stunde bei 25°C und anschließende Inkubation bei 4°C während 2–18 Stunden erhalten. Das Serum wird durch Zentrifugieren gewonnen (zum Beispiel 1000 g während 10 Minuten). Von Kaninchen können etwa 20–50 ml pro Aderlass erhalten werden.
Monoklonale Antikörper werden unter Anwendung des Standardverfahrens von Kohler und Milstein (Nature (1975), 256: 495–96) oder einer Modifizierung davon hergestellt. Typischerweise wird eine Maus oder eine Ratte wie oben beschrieben immunisiert. Anstelle des Aderlasses bei dem Tier zur Gewinnung des Serums wird allerdings die Milz (und wahlweise verschiedene große Lymphknoten) entfernt und in Einzelzellen dissoziiert. Erforderlichenfalls können die Milzzellen (nach Entfernung nichtspezifischer adhärenter Zellen) durch Aufbringen einer Zellsuspension auf eine Platte oder in Vertiefungen, die mit dem Protein-Antigen beschichtet sind, einem Screening unterzogen werden. B-Zellen, die membrangebundenes Immunglobulin exprimieren, das für das Antigen spezifisch ist, binden an der Platte und werden mit dem Rest der Suspension nicht weggespült. Die resultierenden B-Zellen oder sämtliche dissoziierten Milzzellen werden dann einer Induktion zur Fusionierung mit Myelomzellen zur Erzeugung von Hybridomen unterzogen und in einem selektiven Medium kultiviert (zum Beispiel Hypoxanthin-, Aminopterin-, Thymidin-Medium, "HAT"-Medium). Die daraus hervorgehenden Hybridome werden durch serielle Verdünnung ausplattiert und auf die Produktion von Antikörpern getestet, die spezifisch an das gewünschte immunisierende Antigen binden (und die nicht an nichtverwandte Antigene binden). Die selektierten MAb-sezernierenden Hybridome werden dann in vitro (zum Beispiel in Gewebekulturflaschen oder Hohlfaserreaktoren) oder in vivo (als Ascites in Mäusen) kultiviert.
Wenn es erwünscht ist, können die Antikörper (die polyklonal oder monoklonal sein können), unter Anwendung von herkömmlichen Techniken markiert werden. Zu den geeigneten Markierungen gehören Fluorophore, Chromophore, radioaktive Atome (insbesondere ³²P und ¹²⁵I), Elektronendichtereagentien, Enzyme und Liganden, die spezifische Bindungspartner besitzen. Enzyme werden typischerweise aufgrund ihrer Aktivität erfasst. So wird zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase gewöhnlich aufgrund ihrer Fähigkeit, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) in ein blaues Pigment umzuwandeln, erfasst, was mittels eines Spektrophotometers quantifizierbar ist. Ein "spezifischer Bindungspartner " bezieht sich auf ein Protein, das in der Lage ist, ein Ligandenmolekül mit hoher Spezifität zu binden, wie zum Beispiel im Falle eines Antigens und eines monoklonalen Antikörpers, der dafür spezifisch ist. Zu weiteren spezifischen Bindungspartnern gehören Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A sowie die zahlreichen Rezeptor-Ligand-Paare, die im Stand der Technik bekannt sind. Es versteht sich, dass die obige Beschreibung die verschiedenen Markierungen nicht in verschiedene Klassen einteilen soll, da die gleiche Markierung auf mehrere unterschiedliche Weisen nützlich sein kann. So kann zum Beispiel ¹²⁵I als radioaktive Markierung oder als elektronendichtes Reagens dienen. HRP kann als Enzym oder als Antigen für einen MAb dienen. Außerdem können verschiedene Markierungen für eine gewünschte Wirkung kombiniert werden. So benötigen beispielsweise MAbs und Avidin auch bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung Markierungen: Daher könnte man einen MAb mit Biotin markieren und seine Anwesenheit mit Avidin, das mit ¹²⁵I markiert ist, oder mit einem Anti-Biotin-MAb, der mit HRP markiert ist, erfassen. Andere Abwandlungen und Möglichkeiten sind für Fachleute leicht erkennbar und werden als Äquivalente innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung angesehen.
Antigene, Immunogene, Polypeptide, Proteine oder Proteinfragmente der vorliegenden Erfindung rufen die Bildung von Antikörpern hervor, die spezifische Bindungspartner darstellen. Diese Antigene, Immunogene, Polypeptide, Proteine oder Proteinfragmente der vorliegenden Erfindung umfassen immunogene Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Solche immunogenen Zusammensetzungen können ferner Adjuvantien, Träger oder andere Zusammensetzungen, welche die Antigene, Polypeptide, Proteine oder Proteinfragmente der vorliegenden Erfindung fördern, steigern oder stabilisieren, umfassen oder enthalten. Solche Adjuvantien und Träger sind für Fachleute des vorliegenden Gebiets leicht ersichtlich.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Pharmazeutische Zusammensetzungen können entweder Polypeptide, Antikörper oder Nucleinsäuren der Erfindung umfassen (enthalten). Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Menge der Polypeptide, Antikörper oder Polynucleotide der beanspruchten Erfindung.
Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Menge eines therapeutischen Mittels zur Behandlung, Verbesserung oder Vorbeugung einer gewünschten Krankheit oder eines Krankheitszustands oder zur Erzielung einer erfassbaren therapeutischen oder vorbeugenden Wirkung. Die Wirkung kann zum Beispiel durch chemische Marker oder Antigenniveaus erfasst werden. Zu den therapeutischen Wirkungen gehört auch die Verringerung der physischen Symptome, wie etwa verringerte Körpertemperatur, wenn die Verabreichung an einen Patienten mit Fieber erfolgt. Die genaue wirksame Menge für eine Person hängt von der Größe und dem Gesundheitszustand der Person, der Art und dem Ausmaß der Erkrankung und den Arzneimitteln oder der Kombination von Arzneimitteln, die zur Verabreichung ausgewählt wurden, ab. Es ist daher nicht günstig, eine genaue wirksame Menge im Vorhinein zu spezifizieren. Die wirksame Menge kann allerdings für eine gegebene Situation durch Routineversuche, die im Ermessen des Arztes liegen, bestimmt werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung liegt eine wirksame Dosis der DNA-Konstrukte im Bereich von etwa 0,01 mg/kg bis 50 mg/kg oder im Bereich von 0,05 mg/kg bis etwa 10 mg/kg, bezogen auf das Individuum, dem die DNA-Konstrukte verabreicht werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann auch einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten. Der Ausdruck "pharmazeutisch akzeptabler Träger" bezieht sich auf einen Träger zur Verabreichung eines therapeutischen Mittels, wie etwa Antikörper oder ein Polypeptid, Gene oder andere therapeutische Mittel. Der Ausdruck bezieht sich auf einen beliebigen pharmazeutischen Träger, der selbst keine Produktion von Antikörpern induziert, die für das Individuum, das die Zusammensetzung erhält, schädlich sein könnten, und der ohne übermäßige Toxizität verabreicht werden kann. Geeignete Träger können große, langsam metabolisierte Makromoleküle wie etwa Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, Polyaminosäuren, Aminosäure-Copolymere sowie inaktive Viruspartikel sein. Derartige Träger sind Fachleuten auf dem vorliegenden Gebiet geläufig.
In den Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Salze verwendet werden, zum Beispiel Salze anorganischer Säuren wie die Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate, Sulfate und dergleichen, sowie Salze organischer Säuren wie Acetate, Propionate, Malonate, Benzoate und dergleichen. Eine ausführliche Abhandlung pharmazeutisch akzeptabler Excipientien ist in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J. 1991) verfügbar.
Pharmazeutisch akzeptable Träger in therapeutischen Zusammensetzungen können Flüssigkeiten wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin und Ethanol enthalten. Zusätzlich können in solchen Trägern Hilfssubstanzen, wie Netzmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen und dergleichen, vorliegen. Typischerweise werden die therapeutischen Zusammensetzungen als injizierbare Zusammensetzungen, entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen, hergestellt; ferner können auch feste Formen hergestellt werden, die sich zum Lösen oder Suspendieren in flüssigen Trägern vor der Injektion eignen. Liposomen sind in der Definition eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers eingeschlossen.
Abgabeverfahren
Nach der Formulierung können die Zusammensetzungen der Erfindung dem Subjekt direkt verabreicht werden. Die zu behandelnden Subjekte können Tiere sein; insbesondere können menschliche Subjekte behandelt werden.
Die direkte Verabreichung der Zusammensetzungen erfolgt allgemein durch Injektion, entweder subkutan, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär oder in den Interstitialraum eines Gewebes. Die Zusammensetzungen können ferner auch in eine Wunde verabreicht werden. Zu weiteren Arten der Verabreichung gehören die orale und pulmonale Verabreichung, die Verabreichung in Form von Suppositorien sowie die transdermale und transkutane Verabreichung, Nadeln sowie Gen-Guns oder Hyposprays. Das Dosisregime bei der Behandlung kann in einem Einzeldosenschema oder in einem Mehrfachdosenschema bestehen.
Impfstoffe
Impfstoffe gemäß der Erfindung können entweder prophylaktisch (das heißt, zur Verhinderung einer Infektion vorgesehen) oder therapeutisch (das heißt, zur Behandlung einer Erkrankung nach Infektion vorgesehen) sein.
Derartige Impfstoffe enthalten ein oder mehrere immunisierende Antigene oder ein oder mehrere Immunogene, immunogene Polypeptide, ein oder mehrere Proteine oder Proteinfragmente oder Nucleinsäuren (zum Beispiel Ribonucleinsäure oder Desoxyribonucleinsäure), üblicherweise in Kombination mit "pharmazeutisch akzeptablen Trägern", die beliebige Träger einschließen, die nicht selbst die Produktion von Antikörpern induzieren, die für das Individuum schädlich sind, das die Zusammensetzung erhält. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, Polyaminosäuren, Aminosäure-Copolymere, Lipidaggregate (wie Öltröpfchen oder Liposomen) sowie inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind Fachleuten des vorliegenden Gebiets geläufig. Diese Träger können ferner als immunstimulierende Mittel ("Adjuvantien") wirken. Darüber hinaus kann das Immunogen oder Antigen mit einem bakteriellen Toxoid konjugiert sein, wie zum Beispiel mit einem Diphtherie-, Tetanus-, Cholera- und H. pylori-Toxoid, sowie mit anderen Pathogenen.
Zu bevorzugten Adjuvantien zur Erhöhung der Wirksamkeit der Zusammensetzung gehören, ohne dass hier eine Beschränkung vorläge, folgende Stoffe: (1) Aluminiumsalze (Aluminiumhydroxid-Gel), wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, etc.; (2) Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierungen (mit oder ohne weitere spezielle immunstimulierende Mittel, wie Muramylpeptide (siehe unten) oder Bakterienzellwandbestandteile), wie zum Beispiel (a) MF59 (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/14837 ), das 5% Squalen, 0,5% Tween 80 und 0,5% Span 85 enthält (wahlweise mit Gehalt verschiedener Mengen an MTP-PE (siehe unten), obgleich nicht erforderlich), formuliert zu Submikrometer-Partikeln mit einem Microfluidizer, wie etwa dem Microfluidizer Modell 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, das 10% Squalan, 0,4% Tween 80, 5% Pluronic-geblocktes Polymer L121 und thr-MDP (siehe unten) enthält, entweder mikrofluidisiert zu einer Submikrometer-Emulsion oder gevortext zur Erzeugung einer Emulsion mit größerer Partikelgröße und (c) das Ribi^TM-Adjuvanssystem (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), das 2% Squalen, 0,2% Tween 80 und einen oder mehrere Bakterienzellwandbestandteile aus der Gruppe enthält, die besteht aus Monophosphoryllipid A (MPL), Trehalose-Dimycolat (TDM) und Zellwandgerüst (CWS), bevorzugt MPL + CWS (Detox^TM); (3) Saponin-Adjuvantien, wie Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), die in dieser Form oder in Form von daraus erzeugten Partikeln verwendet werden können, wie ISCOMs (immunstimulierende Komplexe); (4) vollständiges Freund-Adjuvans (CFA) und unvollständiges Freund-Adjuvans (IFA); (5) Cytokine, wie Interleukine (zum Beispiel IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), Interferone (zum Beispiel γ-Interferon), Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (M-CSF), Tumornekrosefaktor (TNF), etc.; (6) detoxifizierte Mutanten eines bakteriellen, ADP-ribosylierenden Toxins, wie ein Choleratoxin (CT), ein Keuchhustentoxin (PT) oder ein hitzelabiles Toxin (LT) von E. coli, insbesondere LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; siehe zum Beispiel WO 93/13302 und WO 92/18265 , sowie (7) weitere Substanzen, die als immunstimulierende Mittel zur Erhöhung der Wirksamkeit der Zusammensetzung wirken. Aluminiumhydroxid-Gel und MF59 sind bevorzugt.
Zu den oben erwähnten Muramylpeptiden gehören, ohne dass hier eine Einschränkung vorläge, N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetylnormuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE), etc.
Die Impfstoffzusammensetzungen, die immunogene Zusammensetzungen umfassen (die zum Beispiel das Antigen, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Adjuvans enthalten können), enthalten typischerweise Verdünnungsmittel, wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol und dergleichen. Zusätzlich können in solchen Trägern Hilfssubstanzen, wie Netzmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen und dergleichen vorliegen. Alternativ können Impfstoffzusammensetzungen, die immunogene Zusammensetzungen umfassen, ein Antigen, ein Polypeptid, ein Protein, ein Proteinfragment oder eine Nucleinsäure in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten.
Noch spezieller enthalten Impfstoffe, die immunogene Zusammensetzungen umfassen, eine immunologisch wirksame Menge der immunogenen Polypeptide sowie beliebige weitere der oben erwähnten Bestandteile, falls erforderlich. Unter einer "immunologisch wirksamen Menge" wird verstanden, dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum entweder in Form einer Einzeldosis oder als Teil einer Dosisreihe zur Behandlung oder zur Vorbeugung wirksam ist. Diese Menge hängt vom Gesundheitszustand und dem körperlichen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (zum Beispiel nichtmenschlicher Primat, Primat, etc.), der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, dem angestrebten Grad des Schutzes, der Formulierung des Impfstoffs, der Einschätzung der medizinischen Situation durch den behandelnden Arzt und anderen relevanten Faktoren ab. Es ist zu erwarten, dass die Menge in einen relativ breiten Bereich fällt, der durch Routineversuche ermittelt werden kann.
Die Impfstoffzusammensetzungen oder immunogenen Zusammensetzungen werden typischerweise als injizierbare Zusammensetzungen hergestellt, und zwar entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen; feste Formen, die zum Lösen oder Suspendieren in flüssigen Trägern vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Präparation kann ferner auch zur Verstärkung der Adjuvanswirkung emulgiert oder in Liposomen verkapselt werden, wie oben zu den pharmazeutisch akzeptablen Trägern erläutert wurde.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden üblicherweise parenteral verabreicht, zum Beispiel durch Injektion, entweder subkutan oder intramuskulär. Zu weiteren Formulierungen, die sich für andere Verabreichungsarten eignen, gehören orale und pulmonale Formulierungen, Suppositorien sowie transdermale und transkutane Anwendungen. Das Dosierungsregime bei der Behandlung kann in einem Einzeldosisschema oder in einem Mehrfachdosisschema bestehen. Der Impfstoff kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.
Als Alternative zu Impfstoffen auf Proteinbasis kann die DNA-Impfung angewandt werden (siehe zum Beispiel Robinson und Torres (1997), Seminars in Immunology 9: 271–283; Donnelly et al. (1997), Ann. Rev. Immunol. 15: 617–648).
Genabgabeträger
Träger zur Gentherapie zur Abgabe von Konstrukten, einschließlich einer codierenden Sequenz eines therapeutischen Mittels der Erfindung, die an den Säuger zur Expression im Säuger abzugeben sind, können entweder lokal oder systemisch verabreicht werden. Bei diesen Konstrukten können virale oder nicht-virale Vektor-Ansätze bei der Modalität in vivo oder ex vivo angewandt werden. Die Expression einer solchen codierenden Sequenz kann unter Verwendung endogener Säuger-Promotoren oder heterologer Promotoren induziert werden. Die Expression der codierenden Sequenz in vivo kann entweder konstitutiv oder reguliert sein.
Die Erfindung umfasst Genabgabeträger, die befähigt sind, die in Betracht gezogenen Nucleinsäuresequenzen zu exprimieren. Der Genabgabeträger ist bevorzugt ein viraler Vektor und noch bevorzugter ein retroviraler, adenoviraler, Adenovirus-assoziierter Virus(AAV)-Vektor, ein Herpes-viraler oder ein Alphavirus-Vektor. Der virale Vektor kann ferner auch ein Astrovirus-, Coronavirus-, Orthomyxovirus-, Papovavirus-, Paramyxovirus-, Parvovirus-, Picornavirus-, Pockenvirus- oder Togavirus-Vektor sein; siehe allgemein Jolly (1994), Cancer Gene Therapy 1: 51–64; Kimura (1994), Human Gene Therapy 5: 845–852; Connelly (1995), Human Gene Therapy 6: 185–193, sowie Kaplitt (1994), Nature Genetics 6: 148–153.
Retrovirale Vektoren sind auf dem vorliegenden Gebiet wohl bekannt; hierzu gehören Retroviren vom Typ B, C und D, xenotrope Retroviren (zum Beispiel NZB-X1, NZB-X2 und NZB9-1, siehe O'Neill (1985), J. Virol. 53: 160), polytrope Retroviren, zum Beispiel MCF und MCF-MLV (siehe Kelly (1983), J. Virol. 45: 291), Spumaviren und Lentiviren, siehe RNA Tumor Viruses, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.
Bereiche des retroviralen Gentherapievektors können von unterschiedlichen Retroviren abgeleitet sein. So können zum Beispiel Retrovektor-LTRs von einem Mäuse-Sarkom-Virus abgeleitet sein, eine tRNA-Bindungsstelle von einem Rous-Sarkom-Virus, ein Packaging-Signal von einem Mäuse-Leukämie-Virus und ein Ursprung einer zweiten Strangsynthese von einem Vogel-Leukämie-Virus.
Diese rekombinanten retroviralen Vektoren können zur Erzeugung transduktionskompetenter retroviraler Vektorpartikel herangezogen werden, indem sie in geeignete Packaging-Zelllinien eingeführt werden (siehe das Patent US 5 591 624 ). Retrovirus-Vektoren können durch Einführung eines chimären Integrase-Enzyms in das retrovirale Partikel zur ortsspezifischen Integration in eine Wirtszellen-DNA konstruiert werden (siehe WO 96/37626 ). Es ist bevorzugt, wenn der rekombinante virale Vektor ein nicht zur Replikation befähigtes rekombinantes Virus ist.
Packaging-Zelllinien, die sich zur Verwendung mit den oben beschriebenen Retrovirus-Vektoren eignen, sind im Stand der Technik wohl bekannt; sie können leicht hergestellt werden, siehe WO 95/30763 und WO 92/05266 , und können zur Erzeugung von produzierenden Zelllinien (die auch als Vektor-Zelllinien oder "VCLs" bezeichnet werden) zur Erzeugung rekombinanter Vektorpartikel herangezogen werden. Die Packaging-Zelllinien werden vorzugsweise aus menschlichen Vorläuferzellen (zum Beispiel HT1080-Zellen) oder Vorläufer-Zelllinien vom Nerz hergestellt, wodurch die Inaktivierung in Humanserum eliminiert wird.
Zu den bevorzugten Retroviren zur Konstruktion der retroviralen Gentherapie-Vektoren gehören das Vogel-Leukämie-Virus, das Rinder-Leukämie-Virus, das Mäuse-Leukämie-Virus, das Mink-Cell Focus-Inducing Virus, das Mäuse-Sarkom-Virus, das Reticululoendotheliose-Virus sowie das Rous-Sarkom-Virus. Zu den besonders bevorzugten Mäuse-Leukämie-Viren gehören 4070A und 1504A (Hartley und Rowe (1976), J. Virol. 19: 19–25), Abelson (ATCC No. VR-999), Friend (ATCC No. VR-245), Graffi, Gross (ATCC No. VR-590), Kirsten, Harvey-Sarkom-Virus und Rauscher (ATCC No. VR-998) sowie das Moloney-Maus-Leukämie-Virus (ATCC No. VR-190). Solche Retroviren können von Hinterlegungsstellen oder Sammlungen wie etwa der American Type Culture Collection ("ATCC") in Rockville, Maryland, bezogen oder aus bekannten Quellen unter Anwendung allgemein verfügbarer Techniken isoliert werden.
Zu den Beispielen für bekannte retrovirale Gentherapie-Vektoren, die bei der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, gehören die Vektoren, die beschrieben sind in den Patentanmeldungen GB 2200651 , EP 0 415 731 , EP 0 345 242 , EP 0 334 301 , WO 89/02468 , WO 89/05349 , WO 89/09271 , WO 90/02806 , WO 90/07936 , WO 94/03622 , WO 93/25698 , WO 93/25234 , WO 93/11230 , WO 93/10218 , WO 91/02805 , WO 91/02825 , WO 95/07994 , US 5 219 740 , US 4 405 712 , US 4 861 719 , US 4 980 289 , US 4 777 127 , US 5 591 624 ; siehe auch Vile (1993), Cancer Res. 53: 3860–3864; Vile (1993), Cancer Res. 53: 962–967; Ram (1993), Cancer Res. 53: 83–88; Takamiya (1992), J. Neurosci. Res. 33: 493–503; Baba (1993), J. Neurosurg. 79: 729–735; Mann (1983), Cell 33: 153; Cane (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6349 sowie Miller (1990), Human Gene Therapy 1.
Humane adenovirale Gentherapie-Vektoren sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und können im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden; siehe zum Beispiel Berkner (1988), Biotechniques 6: 616, und Rosenfeld (1991), Science 252: 431, sowie WO 93/07238 , WO 93/06223 und WO 93/07282 . Zu den Beispielen für bekannte adenovirale Gentherapie-Vektoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können, gehören die Vektoren, die beschrieben sind in den oben aufgeführten Dokumenten sowie in WO 94/12649 , WO 93/03769 , WO 93/19191 , WO 94/28938 , WO 95/11984 , WO 95/00655 , WO 95/27071 , WO 95/29993 , WO 95/34671 , WO 96/05320 , WO 94/08026 , WO 94/11506 , WO 93/06223 , WO 94/24299 , WO 95/14102 , WO 95/24297 , WO 95/02697 , WO 94/28152 , WO 94/24299 , WO 95/09241 , WO 95/25807 , WO 95/05835 , WO 94/18922 und WO 95/09654 . Alternativ kann die Verabreichung einer DNA, die mit einem abgetöteten Adenovirus verknüpft ist, wie in Curiel (1992), Hum. Gene Ther. 3: 147–154, beschrieben ist, angewandt werden. Die Genabgabe-Träger der Erfindung umfassen ferner auch mit Adenovirus-assoziierte Virus(AAV)-Vektoren. Wichtige und bevorzugte Beispiele für solche Vektoren zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind Vektoren auf der Basis von AAV-2, die von Srivastava in WO 93/09239 offenbart sind. Die am meisten bevorzugten AAV-Vektoren enthalten die beiden invertierten AAV-Terminal-Repeats, bei denen die nativen D-Sequenzen durch Ersatz von Nucleotiden in der Weise modifiziert sind, dass mindestens 5 native Nucleotide und bis zu 18 native Nucleotide und vorzugsweise mindestens 10 native Nucleotide bis zu 18 native Nucleotide und am meisten bevorzugt 10 native Nucleotide erhalten sind und die verbleibenden Nucleotide der D-Sequenz deletiert oder durch nicht-native Nucleotide ersetzt sind. Die nativen D-Sequenzen der invertierten AAV-Terminal-Repeats sind Sequenzen von zwei aufeinanderfolgenden Nucleotiden in jedem invertierten AAV-Terminal-Repeat (das heißt, dass sich an jedem Ende eine Sequenz befindet), die an der HP-Bildung nicht beteiligt sind. Das nicht-native Ersatz-Nucleotid kann ein beliebiges Nucleotid sein, das sich von dem Nucleotid unterscheidet, das sich in der nativen D-Sequenz in der gleichen Position befindet. Weitere verwendbare beispielhafte AAV-Vektoren sind pWP-19 und pWN-1; diese beiden Vektoren sind in Nahreini (1993), Gene 124: 257–262, offenbart. Ein weiteres Beispiel für einen solchen AAV-Vektor ist psub201 (siehe Samulski (1987), J. Virol. 61: 3096). Ein weiterer beispielhafter AAV-Vektor ist der Double-D ITR-Vektor. Die Konstruktion des Double-D ITR-Vektors ist in dem Patent US 5 478 745 offenbart. Weitere Vektoren sind offenbart von Carter, Patent US 4 97 368 , und Muzyczka, Patent US 5 139 941 , Chartejee, Patent US 5 474 935 , und Kotin, WO 94/288157 . Ein weiteres Beispiel für einen AAV-Vektor, der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist SSV9AFABTKneo, der den AFP-Enhancer und Albumin-Promotor enthält und die Expression überwiegend in der Leber steuert. Struktur und Aufbau davon sind in Su (1996), Human Gene Therapy 7: 463–470, offenbart. Weitere AAV-Gentherapie-Vektoren sind beschrieben in US 5 354 678 , US 5 173 414 , US 5 139 941 und US 5 252 479 .
Die Gentherapie-Vektoren, die Sequenzen der Erfindung enthalten, umfassen auch Herpes-Vektoren. Wichtige und bevorzugte Beispiele hierfür sind Herpes simplex-Virus-Vektoren, die eine Sequenz enthalten, die ein Thymidinkinase-Polypeptid codieren, wie etwa die Vektoren, die in US 5 288 641 und EP 0 176 170 (Roizman) offenbart sind. Zu weiteren beispielhaften Herpes simplex-Virus-Vektoren gehören HFEM/ICP6-LacZ, der in WO 95/04139 (Wistar Institute) offenbart ist, pHSVlac, der in Geller (1988), Science 241: 1667–1669, sowie in WO 90/09441 und WO 92/07945 beschrieben ist, HSV Us3::pgC-lacZ, der in Fink (1992), Human Gene Therapy 3: 11–19, beschrieben ist, sowie HSV 7134, 2 RH 105 und GAL4, die in EP 0 453 242 (Breakefield) beschrieben sind, ferner die Vektoren, die bei ATCC unter den Hinterlegungsnummern ATCC VR-977 und ATCC VR-260 hinterlegt sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können ferner auch Alphavirus-Gentherapievektoren in Betracht gezogen werden. Bevorzugte Alphavirus-Vektoren sind Sindbis-Virus-Vektoren, ferner Vektoren von Togaviren, Smliki-Forst-Virus (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), Middleberg-Virus (ATCC VR-370), Ross-River-Virus (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), das Virus der venezuelanischen Pferde-Encephalitis (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532) und die Vektoren, die in den Patenten US 5 091 309 und US 5 217 879 sowie in WO 92/10578 beschrieben sind. Ganz besonders sind die Alphavirus-Vektoren verwendbar, die beschrieben sind in der US-Patentanmeldung Serial No. 08/405,627, Anmeldetag 15. März 1995, WO 94/21792 , WO 92/10578 , WO 95/07994 , US 5 091 309 und US 5 217 879 . Derartige Alphaviren können von Hinterlegungsstellen oder Sammlungen wie ATCC in Rockville, Maryland, erhalten werden oder aus bekannten Quellen unter Anwendung allgemein verfügbarer Techniken isoliert werden. Bevorzugt werden Alphavirus-Vektoren mit verringerter Cytotoxizität verwendet (siehe die US-Patentanmeldung Serial No. 08/679640).
DNA-Vektorsysteme wie etwa eukaryotische Schicht-Expressionssysteme eignen sich ebenfalls zur Expression der Nucleinsäuren der Erfindung; siehe WO 95/07994 bezüglich einer detaillierten Beschreibung eukaryotischer Schicht-Expressionssysteme. Die eukaryotischen Schicht-Expressionssysteme der Erfindung leiten sich vorzugsweise von Alphavirus-Vektoren und am meisten bevorzugt von Sindbis-Virus-Vektoren ab.
Zu weiteren viralen Vektoren, die sich zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung eignen, gehören Vektoren, die abgeleitet sind von Poliovirus, zum Beispiel ATCC VR-58, sowie die Vektoren, die beschrieben sind in Evans, Nature 339 (1989) 385, und Sabin (1973), J. Biol. Standardization 1: 115; Rhinoviren, zum Beispiel ATCC VR-1110, sowie die Vektoren, die beschrieben sind in Arnold (1990), J. Cell. Biochem. L401; Pockenviren, wie dem Kanarien-Pocken-Virus oder Vacciniavirus, zum Beispiel ATCC VR-111 und ATCC VR-2010, sowie die Vektoren, die beschrieben sind in Fisher-Hoch (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 317; Flexner (1989), Ann. NY Acad. Sci. 569: 86; Flexner (1990), Vaccine 8: 17; in den Patenten US 4 603 112 und US 4 769 330 und WO 89/01973 ; SV40-Virus, zum Beispiel ATCC VR-305, und die Vektoren, die in Mulligan (1979), Nature 277: 108, und Madzak (1992), J. Gen. Virol. 73: 1533 beschrieben sind; Influenza-Virus, zum Beispiel ATCC VR-797, und rekombinanten Influenza-Viren, die unter Anwendung genetischer Reverstechniken erzeugt sind, wie sie zum Beispiel beschrieben sind in US 5 166 057 und in Enami (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 3802–3805; Enami und Palese (1991), J. Virol. 65: 2711–2713, und Luytjes (1989), Cell 59: 110 (siehe auch McMichael (1983), N. E. J. Med. 309: 13, und Yp (1978), Nature 273: 238 und Nature (1979) 277: 108); menschlichem Immunschwäche-Virus (HIV), das in EP 0 386 882 sowie in Buchschacher (1992), J. Virol. 66: 2731 beschrieben ist; Masernvirus, zum Beispiel ATCC VR-67 und VR-1247, sowie den in EP 0 440 219 beschriebenen Viren; Auravirus, zum Beispiel ATCC VR-368; Bebaru-Virus, zum Beispiel ATCC VR-600 und ATCC VR-1240; Cabassou-Virus, zum Beispiel ATCC VR-922; Chikungunya-Virus, zum Beispiel ATCC VR-64 und ATCC VR-1241; Fort Morgan-Virus, zum Beispiel ATCC VR-924; Getah-Virus, zum Beispiel ATCC VR-369 und ATCC VR-1243; Kyzylagach-Virus, zum Beispiel ATCC VR-927; Mayaro-Virus, zum Beispiel ATCC VR-66; Mucambo-Virus, zum Beispiel ATCC VR-580 und ATCC VR-1244; Ndumu-Virus, zum Beispiel ATCC VR-371; Pixuna-Virus, zum Beispiel ATCC VR-372 und ATCC VR-1245; Tonate-Virus, zum Beispiel ATCC VR-925; Triniti-Virus, zum Beispiel ATCC VR-469; Una-Virus, zum Beispiel ATCC VR-374; Whataroa-Virus, zum Beispiel ATCC VR-926; V-62-33-Virus, zum Beispiel ATCC VR-375; O'Nyong-Virus, Eastern Encephalitis-Virus, zum Beispiel ATCC VR-65 und ATCC VR-1242; Western Encephalitis-Virus, zum Beispiel ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 und ATCC VR-1252, sowie Coronavirus, zum Beispiel ATCC VR-740, sowie den Viren, die in Hamre (1966), Proc. Soc. Biol. Med. 121: 190, beschrieben sind.
Die Abgabe der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Zellen ist nicht auf die oben erwähnten viralen Vektoren beschränkt. Es können auch andere Abgabeverfahren und Abgabemedien angewandet werden, wie zum Beispiel Nucleinsäure-Expressionsvektoren, polykationische kondensierte DNA, die gegebenenfalls mit abgetöteten Adenoviren allein verknüpft sind, siehe zum Beispiel die US-Patentanmeldung Serial No. 08/366 787, Anmeldetag 30. Dezember 1994, und Curiel (1992), Hum. Gene Ther. 3: 147–154, Liganden-verknüpfte DNA, siehe zum Beispiel Wu (1989), J. Biol. Chem. 264: 16985–16987, eukaryotische Zellabgabe-Träger, siehe zum Beispiel die US-Patentanmeldung Serial No. 08/240,030, Anmeldetag 9. Mai 1994, und die US-Patentanmeldung Serial No. 08/404,796, Abscheidung von photopolymerisierten Hydrogelmaterialien, tragbare Gentransferpartikel-Gun, wie zum Beispiel in dem Patent US 5 149 655 beschrieben, ionisierende Strahlung, wie in dem Patent US 5 206 152 und in Wo 92/11033 beschrieben, Kernladungsneutralisation oder Fusion mit Zellmembranen. Weitere Ansätze sind beschrieben in Philip (1994), Mol. Cell. Biol. 14: 2411–2418, sowie in Woffendin (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 1581–1585.
Der Partikel-vermittelte Gentransfer kann ebenfalls angewandt werden, siehe zum Beispiel die US-Patentanmeldung Serial No. 60/023 867. Kurz zusammengefasst kann die Sequenz in herkömmliche Vektoren eingefügt werden, die herkömmliche Kontrollsequenzen zur Expression auf hohem Niveau enthalten, worauf eine Inkubation mit synthetischen Gentransfermolekülen wie etwa polymeren DNA-bindenden Kationen folgt, wie zum Beispiel mit Polylysin, Protamin und Albumin, die an Zell-Targeting-Liganden gebunden sind, wie etwa Asialoorosomucoid, wie beschrieben ist in Wu und Wu (1987), J. Biol. Chem. 262: 4429–4432, Insulin, wie beschrieben ist in Hucked (1990), Biochem. Pharmacol. 40: 253–263, Galactose, wie beschrieben ist in Plank (1992), Bioconjugate Chem. 3: 533–539, Lactose oder Transferrin.
Nackte DNA kann ebenfalls zur Transformation einer Wirtszelle herangezogen werden. Beispielhafte Verfahren zur Einführung nackter DNA sind in WO 90/11092 und US 5 580 859 beschrieben. Die Effizienz der Aufnahme kann durch Verwendung von biologisch abbaubaren Latexkügelchen verbessert werden. DNA-beschichtete Latexkügelchen werden in effizienter Weise nach der Initiierung der Endocytose durch die Kügelchen in die Zellen hineintransportiert. Das Verfahren kann durch Behandlung der Kügelchen zur Erhöhung ihrer Hydophobie und dadurch Erleichterung des Aufbrechens des Endosoms und Freisetzung der DNA in das Cytoplasma weiter verbessert werden.
Liposomen, die als Genabgabeträger wirken können, sind beschrieben in US 5 422 120 , WO 95/13796 , WO 94/23697 , WO 91/14445 und EP 425 968 . Wie in der US-Patentanmeldung Serial No. 60/023 867 beschrieben ist, können bei der nicht-viralen Abgabe die Nucleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid codieren, in herkömmliche Vektoren eingefügt werden, die herkömmliche Kontrollsequenzen für eine Expression auf hohem Niveau enthalten, die dann mit synthetischen Gentransfermolekülen inkubiert werden, wie etwa polymeren DNA-bindenden Kationen wie Polylysin, Protamin und Albumin, die an Zell-Targeting-Liganden gebunden sind, wie etwa Asialoorosomucoid, Insulin, Galactose, Lactose oder Transferrin. Zu weiteren Abgabesystemen gehört die Verwendung von Liposomen zur Verkapselung von DNA, die das Gen unter der Kontrolle einer Vielzahl von gewebespezifischen oder ubiquitär aktiven Promotoren enthält. Zu weiteren für die Verwendung geeigneten nicht-viralen Abgabesysteme gehören mechanische Abgabesysteme, wie etwa der Ansatz, der in Woffendin et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24): 11581–11585, beschrieben ist. Darüber hinaus können die codierende Sequenz und das Expressionsprodukt davon durch Abscheidung von photopolymerisierten Hydrogelmaterialien abgegeben werden. Zu weiteren herkömmlichen Verfahren zur Genabgabe, die zur Abgabe der codierenden Sequenz herangezogen werden können, gehören zum Beispiel die Verwendung einer tragbaren Gentransferpartikel-Gun, wie in US 5 149 655 beschrieben ist, und die Verwendung von ionisierender Strahlung zur Aktivierung des übertragenen Gens, wie in US 5 206 152 und WO 92/11033 beschrieben ist.
Beispielhafte Genabgabeträger auf der Basis von Liposomen und polykationischen Trägern sind die Träger, die beschrieben sind in US 5 422 120 und 4 762 915 , WO 95/13796 , WO 94/23697 , WO 91/1444 , EP 0 524 968 , Stryer, Biochemistry, Seiten 236–240 (1975), W. H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980), Biochem. Biophys. Acta 600: 1; Bayer (1979), Biochem. Biophys. Acta 550: 464; Rivnay (1987), Meth. Enzymol. 149: 119; Wang (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 7851, und Plant (1989), Anal. Biochem. 176: 420.
Eine Polynucleotid-Zusammensetzung kann eine therapeutisch wirksame Menge eines Gentherapieträgers enthalten, wobei dieser wie oben definiert ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung liegt eine wirksame Dosis im Bereich von etwa 0,01 mg/kg bis 50 mg/kg oder 0,05 mg/kg bis etwa 10 mg/kg, bezogen auf die DNA-Konstrukte, bei dem Individuum, dem sie verabreicht werden.
Abgabeverfahren
Nach der Formulierung können die Polynucleotid-Zusammensetzungen der Erfindung wie folgt verabreicht werden: (1) direkte Verabreichung an das Subjekt; (2) Verabreichung ex vivo an Zellen, die von dem Subjekt stammen, oder (3) Verabreichung in. vitro zur Expression rekombinanter Proteine. Die zu behandelnden Subjekte können Säuger oder Vögel sein. Auch menschliche Subjekte können behandelt werden.
Die direkte Verabreichung der Zusammensetzungen erfolgt allgemein durch Injektion, entweder subkutan, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär oder in den Interstitialraum eines Gewebes. Die Zusammensetzungen können ferner auch in einen Tumor oder eine Wunde verabreicht werden. Zu weiteren Arten der Verabreichung gehören die orale und pulmonale Verabreichung, die Verabreichung in Form von Suppositorien sowie transdermale Verabreichungen, Nadeln sowie Gen-Guns oder Hyposprays. Das Dosierungsregime bei der Behandlung kann in einem Einzeldosenschema oder einem Mehrfachdosenschema bestehen.
Verfahren zur Abgabe ex vivo und zur Reimplantation transformierter Zellen in ein Subjekt sind auf dem vorliegenden Gebiet bekannt und beispielsweise in WO 93/14778 beschrieben. Zu den Beispielen für Zellen, die sich für Anwendungen ex vivo eignen, gehören zum Beispiel Stammzellen, insbesondere hämatopoetische Zellen, Lymphzellen, Makrophagen, dendritische Zellen oder Tumorzellen.
Allgemein kann die Abgabe von Nucleinsäuren für Anwendungen sowohl ex vivo als auch in vitro durch folgende Prozeduren vorgenommen werden, zum Beispiel durch Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Fällung, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Verkapselung des Polynucleotids oder der Polynucleotide in Liposomen sowie die direkte Mikroinjektion der DNA in Kerne, wobei alle diese Verfahren auf dem vorliegenden Gebiet bekannt sind.
Pharmazeutische Polynucleotid- und Polypeptid-Zusammensetzungen
Zusätzlich zu den pharmazeutisch akzeptablen Trägern und Salzen, die oben beschrieben wurden, können die folgenden zusätzlichen Mittel zusammen mit Polynucleotid- und/oder Polypeptid-Zusammensetzungen verwendet werden.
A. Polypeptide
Ein Beispiel hierfür sind Polypeptide, zu denen, ohne dass eine entsprechende Einschränkung hierzu vorläge, gehören: Asioloorosomucoid (ASOR), Transferrin, Asialoglycoproteine, Antikörper, Antikörperfragmente, Ferritin, Interleukine, Interferone, Granulocyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Granulocyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF), Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (M-CSF), Stammzellfaktor sowie Erythropoietin. Virale Antigene, wie etwa Hüllproteine, können ebenfalls Verwendung finden, ferner Proteine von anderen invasiven Organismen, wie etwa das 17 Aminosäuren umfassende Peptid des Circumsporozoit-Proteins von Plasmodium falciparum, das als RII bekannt ist.
B. Hormone, Vitamine, etc.
Weitere Gruppen, die eingeschlossen sein können, sind zum Beispiel: Hormone, Steroide, Androgene, Östrogene, Schilddrüsenhormon, Vitamine oder Folsäure.
C. Polyalkylene, Polysaccharide, etc.
Zusammen mit den gewünschten Polynucleotiden oder Polypeptiden kann auch Polyalkylenglycol verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polyalkylenglycol Polyethylenglycol. Zusätzlich können Mono-, Di- oder Polysaccharide enthalten sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts ist das Polysaccharid Dextran oder DEAE-Dextran. Ferner können Chitosan und Poly(lactid-co-glycolid) enthalten sein.
D. Lipide und Liposomen
Das gewünschte Polynucleotid oder Polypeptid kann auch vor der Abgabe an das Subjekt oder davon stammende Zellen in Lipiden verkapselt oder in Liposomen verpackt werden.
Die Lipidverkapselung geschieht allgemein unter Verwendung von Liposomen, die befähigt sind, Nucleinsäure stabil zu binden oder einzuschließen und zurückzuhalten. Das Verhältnis von kondensiertem Polynucleotid oder Polypeptid zu Lipid-Präparation kann variieren, liegt jedoch allgemein im Bereich von etwa 1:1 (mg DNA:Mikromol Lipid), wobei der Lipidgehalt auch höher sein kann. Bezüglich einer Übersicht zur Verwendung von Liposomen als Träger zur Abgabe von Nucleinsäuren siehe Hug und Sleight (1991), Biochem. Biophys. Acta 1097: 1–17; Straubinger (1983), Meth. Enzymol. 101: 512–527.
Zu den Liposomen-Präparationen zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung gehören kationische (positiv geladene), anionische (negativ geladene) sowie neutrale Präparationen. Es war gezeigt worden, dass kationische Liposomen die intrazelluläre Abgabe vermitteln von Plasmid-DNA (Felgner (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7416), mRNA (Malone (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6077–6081) und gereinigten Transkriptionsfaktoren (Debs (1990), J. Biol. Chem. 265: 10189–10192), und zwar in funktioneller Form.
Kationische Liposomen sind leicht erhältlich. So sind zum Beispiel N-[1-(2,3-Dioleyloxy)-propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA)-Liposomen unter der Handelsmarke Lipofectin von GIBCO BRL, Grand Island, NY, erhältlich (siehe auch Felgner, oben). Zu weiteren im Handel erhältlichen Liposomen gehören Transfectace (DDAB/DOPE) und DOTAP/DOPE (Boehringer). Weitere kationische Liposomen können aus leicht erhältlichen Materialien unter Anwendung von auf dem vorliegenden Gebiet wohl bekannten Techniken hergestellt werden, siehe zum Beispiel Szoka (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194–4198, und WO 90/11092 für eine Beschreibung der Synthese von DOTAP (1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)-propan)-Liposomen.
Anionische und neutrale Liposomen sind gleichermaßen leicht erhältlich, etwa von Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), oder können unter Verwendung leicht zugänglicher Materialien leicht hergestellt werden. Zu solchen Materialien gehören, unter anderen, Phosphatidylcholin, Cholesterin, Phosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC), Dioleoylphosphatidylglycerin (DOPG), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE). Diese Materialien können auch mit DOTMA und DOTAP als Ausgangsmaterialien in geeigneten Verhältnissen vermischt werden. Verfahren zur Herstellung von Liposomen unter Verwendung dieser Materialien sind auf dem vorliegenden Gebiet wohl bekannt.
Die Liposomen können multilamellare Vesikel (MLVs), kleine unilamellare Vesikel (SUVs) oder große unilamellare Vesikel (LUVs) darstellen. Die verschiedenen Liposom-Nucleinsäure-Komplexe werden nach auf dem vorliegenden Gebiet bekannten Verfahren hergestellt, siehe zum Beispiel Straubinger (1983), Meth. Immunol. 101: 512–527, Szoka (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194–4198; Papahadjopoulos (1975), Biochim. Biophys. Acta 394: 483; Wilson (1979), Cell 17: 77; Deamer und Bangham (1976), Biochim. Biophys. Acta 443: 629; Ostro (1977), Biochem. Biophys. Res. Commun. 76: 836; Fraley (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348; Enoch und Strittmatter (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 145; Faley (1980), J. Biol. Chem. 255: 10431; Szoka und Papahadjopoulos (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 145, sowie Schaefer-Ridder (1982), Science 215: 166.
E. Lipoproteine
Die abzugebenden Polynucleotide oder Polypeptide können ferner Lipoproteine enthalten. Zu den Beispielen für zu verwendende Lipoproteine gehören Chylomikronen, HDL, IDL, LDL und VLDL. Mutanten, Fragmente oder Fusionen dieser Proteine können ebenfalls verwendet werden. Außerdem können Modifizierungen natürlich vorkommender Lipoproteine verwendet werden, wie etwa acetyliertes LDL. Diese Lipoproteine können Polynucleotide gezielt an Zellen abgeben, die Lipoprotein-Rezeptoren exprimieren. Wenn Lipoproteine zusammen mit dem abzugebenden Polynucleotid enthalten sind, ist vorzugsweise kein weiterer, auf Zellen zielender Ligand in der Zusammensetzung enthalten.
Natürlich vorkommende Lipoproteine umfassen einen Lipidteil und einen Proteinteil. Die Proteinteile sind als Apoproteine bekannt. Bis jetzt wurden die Apoproteine A, B, C und E isoliert und identifiziert. Mindestens zwei davon enthalten verschiedene Proteine, die mit römischen Zahlen bezeichnet werden, AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.
Ein Lipoprotein kann mehr als ein Apoprotein enthalten. So enthalten zum Beispiel natürlich vorkommende Chylomikronen A, B, C und E; mit der Zeit verlieren diese Lipoproteine A und nehmen die Apoproteine C und E auf. VLDL enthält die Apoproteine A, B, C und E, LDL enthält das Apoprotein B, und HDL enthält die Apoproteine A, C und E.
Die Aminosäuren dieser Apoproteine sind bekannt und beispielsweise beschrieben in Breslow (1985), Ann. Rev. Biochem. 54: 699; Law (1986), Adv. Exp. Med. Biol. 151: 162; Chen (1986), J. Biol. Chem. 261: 12918; Kane (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2465, sowie Utermann (1984), Hum. Genet. 65: 232.
Lipoproteine enthalten eine Vielzahl von Lipiden, zu denen Triglyceride, Cholesterin (frei und als Ester) und Phospholipide gehören. Die Zusammensetzung der Lipide variiert bei natürlich vorkommenden Lipoproteinen. So enthalten zum Beispiel Chylomikronen hauptsächlich Triglyceride. Eine detailliertere Beschreibung des Lipidgehalts natürlich vorkommender Lipoproteine ist zum Beispiel in Meth. Enzymol. 128 (1986) zu finden. Die Zusammensetzung der Lipide wird so gewählt, dass sie zur Konformation des Apoproteins für die Rezeptorbindungsaktivität beiträgt. Die Zusammensetzung von Lipiden kann ferner so gewählt werden, dass sie die hydrophobe Wechselwirkung und die Assoziierung mit dem Polynucleotid-Bindungsmolekül erleichtert.
Natürlich vorkommende Lipoproteine können aus Serum beispielsweise durch Ultrazentrifugierung isoliert werden. Solche Verfahren sind beschrieben in Meth. Enzymol. (oben); Pitas (1980), J. Biochem. 255: 5454–5460, und Mahey (1979), J. Clin. Invest. 64: 743–750.
Lipoproteine können ferner auch durch Verfahren in vitro oder durch Rekombinationsverfahren durch Expression der Apoprotein-Gene in einer gewünschten Wirtszelle hergestellt werden; siehe zum Beispiel Atkinson (1986), Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 403, und Radding (1958), Biochim. Biophys. Acta 30; 443.
Lipoproteine können auch von Lieferanten im Handel bezogen werden, zum Beispiel von Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA.
Eine weitere Beschreibung von Lipoproteinen ist zu finden bei Zuckermann et al., PCT-Anmeldung No. US 97/14465.
F. Polykationische Mittel
Polykationische Mittel können, mit oder ohne Lipoprotein, in einer Zusammensetzung mit dem gewünschten Polynucleotid oder Polypeptid, das abzugeben ist, enthalten sein.
Polykationische Mittel weisen typischerweise bei einem physiologisch relevanten pH-Wert nettomäßig eine positive Ladung auf und sind befähigt, die elektrische Ladung von Nucleinsäuren zu neutralisieren, um die Abgabe an einen gewünschten Ort zu erleichtern. Diese Mittel sind sowohl in vitro als auch ex vivo sowie in. vivo anwendbar. Polykationische Mittel können dazu verwendet werden, um Nucleinsäuren intramuskulär, subkutan, etc., an ein lebendes Subjekt abzugeben.
Nachstehend werden Beispiele für als polykationische Mittel geeignete Polypeptide angegeben: Polylysin, Polyarginin, Polyornithin und Protamin. Zu weiteren Beispielen gehören Histone, Protamine, menschliches Serumalbumin, DNA-bindende Proteine, chromosomale Proteine, die keine Histone sind, Hüllproteine von DNA-Viren, wie X174; Transkriptionsfaktoren enthalten ferner Domänen, die DNA binden und daher als Nucleinsäure-Kondensationsmittel geeignet sein können. Kurz zusammengefasst enthalten Transkriptionsfaktoren wie C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP und TFIID basische Domänen, die DNA-Sequenzen binden.
Zu den organischen polykationischen Mitteln gehören Spermin, Spermidin und Putrescin.
Die Abmessungen sowie die physikalischen Eigenschaften eines polykationischen Mittels können aus der obigen Liste extrapoliert werden, um andere polypeptidische polykationische Mittel zu konstruieren oder synthetische polykationische Mittel zu erzeugen.
Synthetische polykationische Mittel
Zu den synthetischen polykationischen Mitteln, die geeignet sind, gehören zum Beispiel DEAE-Dextran und Polybren. Lipofectin^TM und Lipofectamin^TM sind Monomere, die polykationische Komplexe bilden, wenn sie mit Polynucleotiden oder Polypeptiden zusammengebracht werden.
Immundiagnostische Assays
Die Neisseria-Antigene der Erfindung können in Immunoassays verwendet werden, um Antikörperniveaus zu erfassen (oder umgekehrt können Anti-Neisseria-Antikörper zur Erfassung von Antigenniveaus verwendet werden). Immunoassays auf der Basis von wohldefinierten, rekombinanten Antigenen können entwickelt werden, um invasive diagnostische Methoden zu ersetzen. Antikörper gegen Neisseria-Proteine in biologischen Proben, einschließlich zum Beispiel Blut- oder Serumproben, können erfasst werden. Bei der Auslegung der Immunoassays sind zahlreiche Variationen möglich, und eine Vielzahl davon sind im Stand der Technik bekannt. Protokolle für Immunoassays können zum Beispiel auf der Kompetition oder der direkten Reaktion beruhen, oder es kann sich um Assays vom Sandwichtyp handeln. Bei den Protokollen können ferner zum Beispiel feste Träger verwendet werden, oder es kann sich um eine Immunpräzipitation handeln. Bei den meisten Assays werden markierte Antikörper oder Polypeptide verwendet; bei den Markierungen kann es sich zum Beispiel um Fluoreszenzmarkierungen, Chemilumineszenzmarkierungen, radioaktive Markierungen oder um Farbstoffmoleküle handeln. Assays, bei denen die Signale von der Sonde verstärkt werden, sind ebenfalls bekannt; Beispiele hierfür sind Assays, bei denen Biotin und Avidin verwendet werden, sowie Enzym-markierte und Enzym-vermittelte Immunoassays, wie ELISA-Assays.
Zur Immundiagnose geeignete Kits, welche die entsprechenden markierten Reagentien enthalten, werden durch Verpacken der geeigneten Materialien, einschließlich der Zusammensetzungen der Erfindung, in geeigneten Behältern zusammen mit den übrigen Reagentien und Materialien (zum Beispiel geeignete Puffer, Salzlösungen, etc.), die zur Durchführung des Assays erforderlich sind, sowie eines geeigneten Satzes von Assay-Instruktionen hergestellt.
Nucleinsäurehybridisierung
"Hybridisierung" bezieht sich auf die Assoziation von zwei Nucleinsäuresequenzen aneinander durch Wasserstoffbrücken bindung. Typischerweise wird eine Sequenz an einem festen Träger gebunden, während sich die andere Sequenz frei in Lösung befindet. Dann werden die beiden Sequenzen unter Bedingungen, welche die Wasserstoffbrückenbindung begünstigen, miteinander in Kontakt gebracht. Zu den Faktoren, welche diese Bindung beeinflussen, gehören: Art und Volumen des Lösungsmittels, die Reaktionstemperatur, die Hybridisierungsdauer, Bewegen, Mittel zur Blockierung der nichtspezifischen Haftung der Sequenz in der flüssigen Phase am festen Träger (Denhardt's Reagens oder BLOTTO), die Konzentration der Sequenzen, die Verwendung von Verbindungen zur Erhöhung der Assoziationsrate der Sequenzen (Dextransulfat oder Polyethylenglycol) sowie die Stringenz der Waschbedingungen nach der Hybridisierung; siehe Sambrook et al. [oben], Band 2, Kapitel 9, Seiten 9.47 bis 9.57.
"Stringenz" bezieht sich auf die Bedingungen bei einer Hybridisierungsreaktion, welche die Assoziation sehr ähnlicher Sequenzen gegenüber davon verschiedenen Sequenzen begünstigen. So sollte zum Beispiel die Kombination von Temperatur und Salzkonzentration so gewählt werden, dass die Temperatur ungefähr 120 bis 200°C unter der berechneten Temperatur Tm des untersuchten Hybrids liegt. Die Temperatur- und Salzbedingungen können in vielen Fällen in Vorversuchen empirisch bestimmt werden, bei denen Proben von genomischer DNA, die auf Filtern immobilisiert sind, mit der interessierenden Sequenz hybridisiert und dann unter Bedingungen unterschiedlicher Stringenzen gewaschen werden; siehe Sambrook et al. auf Seite 9.50.
Variable, die bei der Durchführung beispielsweise eines Southern Blots in Betracht gezogen werden müssen, sind (1) die Komplexität der zu blottenden DNA und (2) die Homologie zwischen der Sonde und den zu erfassenden Sequenzen. Die Gesamtmenge des zu untersuchenden Fragments oder der zu untersuchenden Fragmente kann um eine Größenordnung von 10 variieren, von 0,1 bis 1 μg für einen Plasmid- oder Phagenverdau bis zu 10^–9 bis 10^–8 g für ein Einzelkopie-Gen in einem hochkomplexen eukaryotischen Genom. Für Polynucleotide geringerer Komplexität können ein wesentlich kürzeres Blotten, kürzere Hybridisierungszeit und kürzere Expositionszeiten, eine kleinere Menge an Ausgangs-Polynucleotiden sowie eine geringere spezifische Aktivität der Sonden angewandt werden. So kann zum Beispiel ein Einzelkopie-Hefegen bei einer Expositionszeit von lediglich 1 Stunde bei Ausgehen von 1 μg Hefe-DNA, 2 Stunden Blotten und 4–8 Stunden Hybridisieren mit einer Sonde von 10⁸ cpm/μg erfasst werden. Für ein Einzelkopie-Säugergen würde ein konservativer Ansatz beginnen mit 10 μg DNA, worauf über Nacht geblottet und über Nacht in Gegenwart von 10% Dextransulfat hybridisiert wird, wobei eine Sonde von mehr als 10⁸ cpm/μg verwendet wird, was zu Expositionszeiten von etwa 24 Stunden führt.
Verschiedene Faktoren können die Schmelztemperatur (Tm) eines DNA-DNA-Hybrids zwischen der Sonde und dem interessierenden Fragment und dementsprechend die geeigneten Bedingungen zur Hybridisierung und zum Waschen beeinflussen. In vielen Fällen ist die Sonde nicht 100%ig homolog zu dem Fragment. Zu weiteren üblicherweise zu berücksichtigenden Variablen gehören die Länge und der gesamte G + C-Gehalt der hybridisierenden Sequenzen sowie die Ionenstärke und der Formamidgehalt des Hybridisierungspuffers. Die Wirkungen all dieser Faktoren können durch eine einzige Gleichung angenähert werden: Tm = 81 + 16,6(log10Ci) + 0,4[%(G + C)] – 0,6(% Formamid) – 600/n – 1,5(% Fehlpaarung),worin Ci die Salzkonzentration (einwertige Ionen) und n die Länge des Hybrids in Basenpaaren (leicht modifiziert gegenüber Meinkoth und Wahl (1984), Anal. Biochem. 138: 267–284) bedeuten.
Bei der Auslegung eines Hybridisierungsexperiments können einige Faktoren, welche die Nucleinsäurehybridisierung beeinflussen, geeigneterweise geändert werden. Die Temperatur der Hybridisierung sowie die Waschvorgänge und die Salzkonzentration während der Waschvorgänge sind am einfachsten einzustellen. Wenn die Temperatur bei der Hybridisierung höher ist (das heißt, die Stringenz), wird das Eintreten einer Hybridisierung zwischen Strängen, die nicht homolog sind, weniger wahrscheinlich, wodurch im Ergebnis der Untergrund abnimmt. Wenn die radioaktiv markierte Sonde zu dem immobilisierten Fragment nicht vollständig homolog ist (was bei Genfamilien und Versuchen zur Interspezies-Hybridisierung häufig der Fall ist), muss die Hybridisierungstemperatur verringert werden, sodass der Untergrund ansteigt. Die Temperatur bei den Waschvorgängen beeinflusst die Intensität der Hybridisierungsbande und das Ausmaß des Untergrunds in gleicher Weise. Die Stringenz der Waschvorgänge wird mit abnehmenden Salzkonzentrationen ebenfalls erhöht.
Allgemein sind geeignete Hybridisierungstemperaturen in Gegenwart von 50% Formamid 42°C für eine Sonde mit 95 bis 100% Homologie mit dem Ziel-Fragment, 37°C für eine Homologie von 90 bis 95% und 32°C für eine Homologie von 85 bis 90%. Für geringere Homologien sollten der Formamidgehalt verringert und die Temperatur entsprechend eingestellt werden, wobei die obige Gleichung angewandt wird. Wenn die Homologie zwischen der Sonde und dem Ziel-Fragment nicht bekannt ist, besteht der einfachste Ansatz darin, mit Hybridisierungs- und Waschbedingungen zu beginnen, die nicht-stringent sind. Wenn nichtspezifische Banden oder ein hoher Untergrund nach der Autoradiographie festgestellt werden, kann das Filter bei hoher Stringenz gewaschen und nochmals exponiert werden. Wenn dieser Ansatz aufgrund der erforderlichen Expositionszeit unpraktisch wird, sollten verschiedene Hybridisierungs- und/oder Wasch-Stringenzen parallel getestet werden.
Nucleinsäuresonden-Assays
Mit Verfahren wie PCR, Branched-DNA-Sondenassays oder Blottingverfahren unter Verwendung von Nucleinsäuresonden gemäß der Erfindung kann das Vorliegen von cDNA oder mRNA ermittelt werden. Eine Sonde "hybridisiert" mit einer Sequenz der Erfindung, wenn sie ein Duplex oder einen doppelsträngigen Komplex zu bilden vermag, der zur Erfassung genügend stabil ist.
Die Nucleinsäuresonden hybridisieren mit den Neisseria-Nucleotidsequenzen der Erfindung (einschließlich Sense- und Antisense-Strängen). Obgleich zahlreiche unterschiedliche Nucleotidsequenzen die Aminosäuresequenz codieren, ist die native Neisseria-Sequenz bevorzugt, da es sich dabei um die aktuelle Sequenz handelt, die in den Zellen vorliegt. mRNA stellt eine codierende Sequenz dar, und deshalb sollte eine Sonde komplementär zu der codierenden Sequenz sein; einzelsträngige cDNA ist komplementär zu mRNA, und daher sollte eine cDNA-Sonde komplementär zur nicht-codierenden Sequenz sein.
Die Sondensequenz muss nicht mit der Neisseria-Sequenz (oder ihrem Komplement) identisch sein – einige Variation in der Sequenz und Länge kann zu einer erhöhten Empfindlichkeit des Assays führen, wenn die Nucleinsäuresonde ein Duplex mit den Zielnucleotiden bilden kann, das erfasst werden kann. Die Nucleinsäuresonde kann ferner zusätzliche Nucleotide enthalten, um das gebildete Duplex zu stabilisieren. Eine zusätzliche Neisseria-Sequenz kann auch als Markierung zur Erfassung des gebildeten Duplex hilfreich sein. So kann zum Beispiel eine nicht-komplementäre Nucleotidsequenz an das 5'-Ende der Sonde angefügt werden, wobei der Rest der Sondensequenz komplementär zu einer Neisseria-Sequenz ist. Alternativ können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen in die Sonde eingestreut werden, sofern die Sondensequenz eine ausreichende Komplementarität mit einer Neisseria-Sequenz besitzt, um damit zu hybridisieren und dadurch ein Duplex zu bilden, das erfasst werden kann.
Die genaue Länge und Sequenz der Sonde hängt von den Hybridisierungsbedingungen, wie der Temperatur, den Salzverhältnissen und dergleichen ab. So enthält beispielsweise für diagnostische Anwendungen die Nucleinsäuresonde je nach der Komplexität der zu analysierenden Sequenz typischerweise mindestens 10–20 Nucleotide, vorzugsweise 15–25 Nucleotide und noch bevorzugter mindestens 30 Nucleotide, obgleich sie auch kürzer als die angegebenen Werte sein kann. Kurze Primer erfordern allgemein niedrigere Temperaturen zur Bildung ausreichend stabiler Hybridkomplexe der Matrize.
Sonden können nach synthetischen Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel nach dem Triester-Verfahren von Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103: 3185] oder nach Urdea et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 7461] oder unter Verwendung im Handel erhältlicher automatischer Oligonucleotid-Synthesizer.
Die chemische Natur der Sonde kann nach Belieben gewählt werden. Für bestimmte Anwendungen sind DNA oder RNA geeignet. Für andere Anwendungen können Modifizierungen eingebracht werden, zum Beispiel Gerüstmodifizierungen, wie etwa Phosphorthioate oder Methylphosphonate, die dazu herangezogen werden können, um die Halbwertszeit in vivo zu erhöhen, die RNA-Affinität zu andern, die Nuclease-Beständigkeit zu erhöhen, etc. [siehe zum Beispiel Agrawal und Iyer (1995), Curr. Opin. Biotechnol. 6: 12–19; Agrawal (1996), TIBTECH 14: 376–387]; Analoga wie etwa Peptidnucleinsäuren können ebenfalls verwendet werden [siehe zum Beispiel Corey (1997), TIBTECH 15: 224–229; Buchhardt et al. (1993), TIBTECH 11: 384–386].
Ein Beispiel für ein Nucleotid-Hybridisierungsassay ist von Urdea et al. in der internationalen Patentanmeldung WO 92/02526 beschrieben [siehe auch das Patent US 5 124 246 ].
Alternativ stellt die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein weiteres, wohlbekanntes Mittel zur Erfassung kleiner Mengen an Zielnucleinsäuren dar. Das Assay ist beschrieben in: Mullis et al., Meth. Enzymol. (1987) 155: 335–350, dem Patent US 4 683 195 und dem Patent US 4 683 202 . Zwei "Primer"-Nucleotide hybridisieren mit den Zielnucleinsäuren und werden verwendet, um die Reaktion zu primern. Die Primer können eine Sequenz aufweisen, die mit der Sequenz des Amplifizierungstargets (oder seinem Komplement) nicht hybridisiert, um die Duplex-Stabilität zu erhöhen oder beispielsweise eine günstige Restriktionsstelle einzuführen. Typischerweise flankiert eine solche Sequenz die gewünschte Neisseria-Sequenz.
Eine thermostabile Polymerase erzeugt Kopien der Zielnucleinsäuren von den Primern unter Verwendung der ursprünglichen Zielnucleinsäuren als Matrize. Nach Erzeugung einer Schwellenmenge an Zielnucleinsäuren durch die Polymerase können diese durch traditionellere Verfahren, wie etwa Southern Blots, erfasst werden. Bei Anwendung des Southern-Blot-Verfahrens hybridisiert die markierte Sonde mit der Neisseria-Sequenz (oder ihrem Komplement).
mRNA oder cDNA können auch durch traditionelle Blotting-Verfahren erfasst werden, die in Sambrook et al. [oben] beschrieben sind. mRNA oder cDNA, die aus mRNA unter Verwendung eines Polymerase-Enzyms erzeugt wurden, können durch Anwendung der Gelelektrophorese gereinigt und aufgetrennt werden. Die Nucleinsäuren auf dem Gel werden dann auf einen festen Träger, wie etwa Nitrocellulose, geblottet. Der feste Träger wird einer markierten Sonde ausgesetzt und dann gewaschen, um nicht hybridisierte Sonde zu entfernen. Danach werden die Duplexe, welche die markierte Sonde enthalten, erfasst. Die Sonde ist typischerweise mit einem radioaktiven Rest markiert.
BEISPIELE
Die Beispiele beschreiben Nucleinsäuresequenzen, die in N. meningitidis und N. gonorrhoeae identifiziert wurden, sowie ihre entsprechenden und mutmaßlichen Translationsprodukte. Nicht alle dieser Nucleinsäuresequenzen sind vollständig, das heißt, sie codieren weniger als das Volllängen-Wildtypprotein.
Die Beispiele liegen allgemein in folgendem Format vor:

• eine Nucleotidsequenz, die in N. meningitidis identifiziert wurde
• das mutmaßliche Translationsprodukt dieser Sequenz von N. meningitidis
• eine Computeranalyse dieses Translationsprodukts auf der Grundlage von Datenbankvergleichen
• eine entsprechende Nucleotidsequenz, die von N. gonorrhoeae identifiziert wurde
• das mutmaßliche Translationsprodukt dieser Sequenz von N. gonorrhoeae
• ein Vergleich der prozentualen Identität zwischen dem Translationsprodukt der Sequenz von N. meningitidis und dem der Sequenz von N. gonorrhoeae
• eine entsprechende Nucleotidsequenz, die von N. meningitidis, Serogruppe A, identifiziert wurde
• das mutmaßliche Translationsprodukt dieser Sequenz von N. meningitidis, Serogruppe A
• ein Vergleich der prozentualen Identität zwischen dem Translationsprodukt der Sequenz von N. meningitidis und dem der Sequenz von N. gonorrhoeae
• eine Beschreibung der Eigenschaften des Proteins, die anzeigt, dass es in geeigneter Weise antigen oder immunogen sein könnte.

Die Sequenzvergleiche wurden bei NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) unter Anwendung der Algorithmen BLAST, BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx und tBLASTx durchgeführt [siehe zum Beispiel auch Altschul et al. (1997), Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of Protein database search programs. Nucleic Acids Research 25: 2289–3402]. Die Suche erfolgte anhand folgender Datenbanken: non-redundant GenBank + EMBL + DDBJ + PDB sequences and non-redundant GenBank CDS translations + PDB + SwissProt + SPupdate + PIR sequences.
Punkte innerhalb von Nucleotidsequenzen stellen Nucleotide dar, die willkürlich eingeführt wurden, um einen Leserahmen beizubehalten. In der gleichen Weise wurden doppelt unterstrichene Nucleotide entfernt. Kleinbuchstaben stellen Unklarheiten dar, die während des Sequenzvergleichs von unabhängigen Sequenzierungsreaktionen entstanden (einige der Nucleotidsequenzen in den Beispielen sind aus einer Kombination der Ergebnisse von zwei oder mehr Experimenten abgeleitet).
Nucleotidsequenzen wurden in allen sechs Leserahmen gescannt, um das Vorliegen hydrophober Domänen vorauszusagen, wobei ein Algorithmus auf der Basis der statistischen Studien von Esposti et al. verwendet wurde [Critical evaluation of the hydropathy of membrane Proteins (1990), Eur. J. Biochem. 190: 207–219]. Diese Domänen stellen potentielle Transmembranbereiche oder hydrophobe Leadersequenzen dar.
Offene Leserahmen wurden aus fragmentierten Nucleotidsequenzen unter Verwendung des Programms ORFFINDER (NCBI) vorhergesagt.
Unterstrichene Aminosäuresequenzen bezeichnen mögliche Transmembrandomänen oder Leadersequenzen in den ORFs, wie durch den PSORT-Algorithmus vorhergesagt (http://www.psort.nibb.ac.jp). Ferner wurden funktionelle Domänen unter Verwendung des Programms NOTIFS (GCG Wisconsin & PROSITE) vorhergesagt.
Für jedes der nachstehenden Beispiele wird auf der Basis des Vorliegens einer mutmaßlichen Leadersequenz und/oder mehrerer mutmaßlicher Transmembrandomänen (einfach unterstrichen) im Gonococcus-Protein vorausgesagt, dass die Proteine von N. meningitidis und N. gonorrhoeae sowie ihre betreffenden Epitope nützliche antigene oder immunogene Zusammensetzungen für Impfstoffe oder Diagnostika sein können.
Die Standardverfahren und Standardprozeduren, die angewandet werden können, um die Erfindung durchzuführen (zum Beispiel zur Verwendung der offenbarten Sequenzen für Impfzwecke oder diagnostische Zwecke) wurden oben zusammengefasst. Diese Zusammenfassung stellt keine Einschränkung der Erfindung dar, sondern gibt lediglich Beispiele an, die herangezogen werden können, was aber nicht zwingend ist.
Zur Expression, zur Reinigung und zur biochemischen Charakterisierung der Proteine der Erfindung wurden insbesondere die nachstehenden Methoden angewandt.
Präparation chromosomaler DNA
Der Stamm 2996 von N. meningitidis wurde in 100 ml GC-Medium bis zur exponentiellen Phase kultiviert, durch Zentrifugierung gewonnen und in 5 ml Puffer (20% (G/V) Saccharose, 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8) resuspendiert. Nach 10 Minuten Inkubation auf Eis wurden die Bakterien. durch Zusatz von 10 ml Lyselösung (50 mM NaCl, 1% Na-Sarkosyl, 50 μg/ml Proteinase K) lysiert, worauf die Suspension 2 Stunden bei 37°C inkubiert wurde. Dann wurden zwei Phenolextraktionen (auf pH 8 äquilibriert) und eine Extraktion mit CHCl₃/Isoamylalkohol (24:1) durchgeführt. Die DNA wurde durch Zusatz von 0,3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol gefällt und durch Zentrifugieren gesammelt. Das Pellet wurde einmal mit 70%igem (V/V) Ethanol gewaschen und in 4,0 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) wieder gelöst. Die DNA-Konzentration wurde durch Messung der optischen Dichte OD bei 260 nm bestimmt.
Oligonucleotiddesign
Synthetische Oligonucleotid-Primer wurden auf der Basis der codierenden Sequenz jedes ORF konstruiert unter Verwendung (a) der Meningococcus B-Sequenz, falls sie verfügbar war, oder (b) der Gonococcus/Meningococcus A-Sequenz unter Anpassung an die bevorzugte Codon-Usage von Meningococcus, wie erforderlich. Eventuelle vorausgesagte Signalpeptide wurden weggelassen, indem die 5'-Primer so ausgelegt wurden, dass die Sequenz unmittelbar stromabwärts von der vorhergesagten Leadersequenz begann.
Bei den meisten ORFs enthielten die 5'-Primer zwei Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme (BamHI-NdeI, BamHI-NheI, EcoRI-NdeI oder EcoRI-NheI), je nach dem Restriktionsmuster des interessierenden Gens. Die 3'-Primer enthielten eine XhoI-Restriktionsstelle oder eine HindIII-Restriktionsstelle (Tabelle 1). Dieses Verfahren wurde aufgestellt, um die Klonierung jedes Amplifizierungsprodukts (entsprechend dem jeweiligen ORF) in zwei unterschiedliche Expressionssysteme zu lenken: pGEX-KG (Verwendung von BamHI-XhoI, BamHI-NindIII, EcoRI-XhoI oder EcoRI-HindIII) und pET21b+ (Verwendung von NdeI-XhoI, NheI-XhoI, NdeI-HindIII oder NheI-HindIII).
Zur Klonierung der ORFs in den pGEX-His-Vektor enthielten die 5'- und 3'-Primer lediglich eine Restriktionsenzymstelle (EcoRI, KpnI oder SalI für die 5'-Primer und PstI, XbaI, SphI oder SalI für die 3'-Primer). Auch hier wurden Restriktionsstellen entsprechend dem speziellen Restriktionsmuster des Gens ausgewählt (Tabelle 1).
Neben den Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme enthielten die Primer Nucleotide, die mit der zu amplifizierenden Sequenz hybridisierten. Die Schmelztemperatur hing von der Anzahl und der Art der hybridisierenden Nucleotide im gesamten Primer ab und wurde für jeden Primer nach folgender Formel ermittelt: Tm = 4(G + C) + 2(A + T) (unter Ausschluss des Endes) Tm = 64,9 + 0,41 (% GC) – 600/N (gesamter Primer)
Die Schmelztemperaturen der ausgewählten Oligonucleotide betrugen üblicherweise 65–70°C für das gesamte Oligonucleotid und 50–55°C für den hybridisierenden Bereich allein.
Tabelle 1 zeigt die für jede Amplifizierung verwendeten Vorwärts- und Rückwärts-Primer. In bestimmten Fällen stimmt die Sequenz des Primers nicht genau mit der Sequenz des vorhergesagten ORF überein. Der Grund hierfür liegt darin, dass bei der anfänglichen Durchführung von Amplifizierungen die vollständigen 5'- und/oder 3'-Sequenzen für einige ORFs von Meningococcus B nicht bekannt waren. Die entsprechenden Sequenzen waren jedoch in Gonococcus oder in Meningococcus A identifiziert worden. Daher wurden, wenn die Sequenz von Meningococcus B unvollständig oder unsicher war, Sequenzen von Gonococcus oder Meningococcus A als Grundlage für die Primerkonstruktion herangezogen. Diese Sequenzen wurden geändert, um die bevorzugte Codon-Usage zu berücksichtigen. Es ist festzuhalten, dass dieser Ansatz nicht länger erforderlich ist, sobald die vollständige Sequenz identifiziert ist.
Oligonucleotide wurden mit einem DNA/RNA-Synthesizer vom Typ Perkin Elmer 394 synthetisiert, von den Säulen in 2,0 ml NH₄OH eluiert und durch 5 Stunden Inkubation bei 56°C von den Schutzgruppen befreit. Die Oligonucleotide wurden durch Zusatz von 0,3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol gefällt. Die Proben wurden zentrifugiert, und die Pellets wurden entweder in 100 μl oder in 1,0 ml Wasser resuspendiert. Die OD₂₆₀ wurde mit einem Spektrophotometer vom Typ Perkin Elmer Lambda Bio Spektrophotometer ermittelt, und die Konzentration wurde auf 2–10 pmol/μl eingestellt.
Amplifizierung
Das Standard-PCR-Protokoll war wie folgt: 50–200 ng genomische DNA wurden als Matrize in Gegenwart von 20–40 μM jedes Oligonucleotid-Primers verwendet; 400–800 μM dNTPs-Lösung, 1 × PCR-Puffer (mit 1,5 mM MgCl₂), 2,5 Einheiten Taq/DNA-Polymerase (unter Verwendung von Perkin Elmer AmpliTaQ, GIBCO Platinum, Pwo DNA-Polymerase oder Tahara Shuzo-Taq-Polymerase). In manchen Fällen wurde die PCR durch Zusatz von 10 μl DMSO oder 50 μl 2 M Betain optimiert.
Nach einem warmen Start (Zugabe der Polymerase während einer einleitenden Inkubation des gesamten Gemisches während 3 Minuten bei 95°C) wurde jede Probe einer zweistufigen Amplifizierung unterzogen. Die ersten 5 Zyklen wurden unter Anwendung der Hybridisierungstemperatur durchgeführt, bei welcher der Restriktionsenzymrest des Primers (siehe oben) ausgeschlossen wurde. Daran schlossen sich 30 Zyklen unter Anwendung der Hybridisierungstemperatur an, die für die Volllängen-Oligonucleotide berechnet worden war. Die Zyklen wurden mit einem Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72°C abgeschlossen.

Die Standardzyklen waren wie folgt:

	Denaturierung	Hybridisierung	Verlängerung
erste 5 Zyklen	30 Sekunden 95°C	30 Sekunden 50–55°C	30–60 Sekunden 72°C
letzte 30 Zyklen	30 Sekunden 95°C	30 Sekunden 65–70°C	30–60 Sekunden 72°C

Die Verlängerungszeiten variierten entsprechend der Länge des zu amplifizierenden ORF. Die Amplifizierungen wurden entweder mit einem Perkin Elmer GeneAmp PCR-System vom Typ 9600 oder vom Typ 2400 durchgeführt. Zur Überprüfung der Ergebnisse wurde 1/10 des Amplifizierungsvolumens auf ein 1–1,5%iges (G/V) Agarosegel aufgebracht, und die Größe jedes amplifizierten Fragments wurde mit einem DNA-Molekulargewichtsmarker verglichen.
Die amplifizierte DNA wurde entweder direkt auf ein 1%iges Agarosegel aufgebracht oder erst mit Ethanol gefällt und in einem Volumen resuspendiert, das für ein Aufbringen auf ein 1,0%iges Agarosegel ausreichend war. Das DNA-Fragment, das der Bande der korrekten Größe entsprach, wurde unter Verwendung des Qiagen Gel Extraction Kits gereinigt, wobei nach dem Protokoll des Herstellers verfahren wurde. Die DNA-Fragmente wurden in einem Volumen von 30 μl oder 50 μl entweder mit H₂O oder mit 10 mM Tris, pH 8,5, eluiert.
Verdau von PCR-Fragmenten
Die gereinigte DNA, die dem amplifizierten Fragment entsprach, wurde mit den geeigneten Restriktionsenzymen einem doppelten Verdau unterzogen, und zwar zur Klonierung in pET-21b+ und Expression des Proteins als C-Terminus-His-tagged-Fusionsprotein, zur Klonierung in pGEX-KG und Expression des Proteins als N-Terminus-GST-Fusionsprotein und zur Klonierung in pGEX-His und Expression des Proteins als N-Terminus-GST-His-tagged-Fusionsprotein.
Jedes gereinigte DNA-Fragment wurde bei 37°C 3 Stunden lang bis über Nacht mit 20 Einheiten des geeigneten Restriktionsenzyms (New England Biolabs) in einem Volumen von 30 oder 40 μl in Gegenwart eines geeigneten Verdaupuffers inkubiert. Die nach dem Verdau erhaltenen Fragmente wurden mit einem QIAquick PCR Purification-Kit (gemäß den Instruktionen des Herstellers) gereinigt und in einem Volumen von 30 μl oder 50 μl entweder mit H₂O oder mit 10 mM Tris, pH 8,5, eluiert. Die DNA-Konzentration wurde durch quantitative Agarose-Gelelektrophorese (1,0% Gel) in Gegenwart eines geeichten Molekulargewichtsmarkers bestimmt.
Verdau der Klonierungsvektoren (pET22B, pGEX-KG, pTRC-His A, pET21b+, pGEX-KG und pGEX-His)
Der Vektor pGEX-His ist ein modifizierter pGEX-2T-Vektor, der stromaufwärts von der Thrombin-Spaltungsstelle einen Bereich aufweist, der sechs Histidinreste codiert, und die mehrfache Klonierungsstelle des Vektors pTRC99 (Pharmacia) enthält. 10 μg Plasmid wurden mit 50 Einheiten jedes Restriktionsenzyms in einem Reaktionsvolumen von 200 μl in Gegenwart eines geeigneten Puffers durch Inkubation über Nacht bei 37°C einem doppelten Verdau unterzogen. Nach Aufbringen des gesamten Verdauprodukts auf ein 1%iges Agarosegel wurde die dem durch Verdau abgebauten Vektor entsprechende Bande aus dem Gel gereinigt, wobei der Qiagen AIAquick Gel Extraction-Kit verwendet wurde, und die DNA wurde in 50 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert. Die DNA-Konzentration wurde durch Messung der OD₂₆₀ der Probe ermittelt und auf 50 μg/μl eingestellt. Für jede Klonierungsprozedur wurde 1 μl Plasmid verwendet.
10 μg Plasmidvektor wurden mit 50 Einheiten jedes Restriktionsenzyms in einem Volumen von 200 μl mit dem geeigneten Puffer über Nacht bei 37°C einem doppelten Verdau unterzogen. Das Abbauprodukt wurde auf ein 1,0%iges Agarosegel aufgegeben, und die dem durch Abbau erhaltenen Vektor entsprechende Bande wurde gereinigt, wobei der Qiagen QIAquick Gel Extraction-Kit verwendet wurde. Die DNA wurde in 50 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert. Die DNA-Konzentration wurde durch Messung der OD_260nm ermittelt; die Konzentration wurde auf 50 μg/μl eingestellt. Für jede Klonierungsprozedur wurde 1 μl Plasmid verwendet.
Klonierung
Bei einigen ORFs wurden die jedem ORF entsprechenden Fragmente, die zuvor einem Verdau unterzogen und gereinigt worden waren, sowohl in pET22b als auch in pGEX-KG ligasiert. In einem Endvolumen von 20 μl und bei einem Molverhältnis Fragment/Vektor von 3:1 wurde die Ligasierung unter Verwendung von 0,5 μl NEB T4 DNA-Ligase (400 Einheiten/μl) in Gegenwart des vom Hersteller gelieferten Puffers durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Bei einigen Experimenten wurde die Ligasierung unter Verwendung des "Rapid Ligation Kit" von Boehringer durchgeführt, wobei nach den Instruktionen des Herstellers verfahren wurde.
Zur Einführung des rekombinanten Plasmids in einen geeigneten Stamm wurden 100 μl E. coli DH5-kompetente Zellen mit der Ligasereaktionslösung 40 Minuten auf Eis und dann 3 Minuten bei 37°C und anschließend nach Zusatz von 800 μl LB-Nährlösung wiederum 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann bei maximaler Geschwindigkeit in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert und in etwa 200 μl des Überstands resuspendiert. Die Suspension wurde dann auf LB-Ampicillin (100 mg/ml) plattiert.
Das Screening der rekombinanten Klone wurde durch Kultivieren von 5 zufällig ausgewählten Kolonien über Nacht bei 37°C entweder in 2 ml (pGEX- oder pTC-Klone) oder in 5 ml (pET-Klone) LB-Nährlösung + 100 μg/ml Ampicillin durchgeführt. Die Zellen wurden dann pelletiert, und die DNA wurde extrahiert, wobei der Qiagen QIAprep Spin Miniprep-Kit verwendet wurde und nach den Instruktionen des Herstellers verfahren wurde; es wurde ein Endvolumen von 30 μl erhalten. 5 μl jedes individuellen Minipreps (etwa 1 g) wurde entweder mit NdeI/XhoI oder mit BamHI/XhoI einem Verdau unterzogen, und das gesamte Abbauprodukt wurde auf ein 1–1,5%iges Agarosegel (je nach der erwarteten Insertgröße) parallel mit dem Molekulargewichtsmarker (1 Kb DNA Ladder, GIBCO) aufgebracht. Die Durchmusterung auf positive Klone erfolgte auf der Basis der korrekten Insertgröße.
Bei anderen ORFs wurden die jedem ORF entsprechenden Fragmente, die zuvor einem Verdau unterzogen und gereinigt worden waren, sowohl in pET21b+ als auch in pGEX-KG ligasiert. Es wurde ein Molverhältnis Fragment/Vektor von 3:1 in einem Endvolumen von 20 μl angewandt, das 0,5 μl T4-DNA-Ligase (400 Einheiten/μl, NEB) und Ligasierungspuffer, der vom Hersteller geliefert wurde, enthielt. Die Reaktion wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Bei einigen Experimenten wurde die Ligasierung unter Verwendung des "Rapid Ligation Kit" von Boehringer vorgenommen, wobei nach dem Protokoll des Herstellers verfahren wurde.
Rekombinantes Plasmid wurde in 100 μl des kompetenten E. coli DH5 oder HB101 durch Inkubieren der Ligase-Reaktionslösung und der Bakterien während 40 Minuten auf Eis und anschließend während 3 Minuten bei 37°C transformiert. Anschließend wurden 800 μl LB-Nährmedium zugegeben, worauf 20 Minuten bei 37°C inkubiert wurde. Die Zellen wurden in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert, in etwa 200 μl des Überstands resuspendiert und auf LB-Ampicillin (100 mg/ml)-Agar ausplattiert.
Das Screening auf rekombinante Klone wurde durch Kultivieren von 5 zufällig gewählten Kolonien über Nacht bei 37°C entweder in 2,0 ml (pGEX-KG-Klone) oder in 5,0 ml (pET-Klone) LB-Nährlösung + 100 μg/ml Ampicillin durchgeführt. Die Zellen wurden pelletiert, und die Plasmid-DNA wurde extrahiert, wobei der Qiagen QIAprep Spin Miniprep-Kit verwendet wurde und nach den Instruktionen des Herstellers verfahren wurde. Ungefähr 1 μg jedes individuellen Minipreps wurde einem Verdau mit den geeigneten Restriktionsenzymen unterzogen, und das Abbauprodukt wurde auf ein 1–1,5%iges Agarosegel (je nach der erwarteten Insertgröße) parallel zu einem Molekulargewichtsmarker (1 kb DNA Ladder, GIBCO) aufgebracht. Positive Klone wurden auf der Basis der Größe des Inserts ausgewählt.
ORFs wurden in PGEX-His durch doppelten Verdau des PCR-Produkts und Ligasierung in einen einem ähnlichen Abbau unterzogenen Vektor kloniert. Nach der Klonierung wurden die rekombinanten Plasmide in den Wirt E. coli W3110 transformiert. Individuelle Klone wurden über Nacht bei 37°C in LB-Nährlösung mit 50 μg/ml Ampicillin kultiviert.
Bestimmte ORFs können unter Verwendung der EcoRI-PstI-Klonierungsstellen oder der EcoRI-SalI- oder SalI-PstI-Klonierungsstellen in den pGEX-His-Vektor kloniert werden. Nach der Klonierung können die rekombinanten Plasmide in den Wirt E. coli W3110 eingeführt werden.
Expression
Jeder in den Expressionsvektor klonierte ORF kann dann in den zur Expression des rekombinanten Proteinprodukts geeigneten Stamm transformiert werden. 1 μl jedes Konstrukts wurde verwendet, um 30 μl E. coli BL21 (Vektor pGEX), E. coli TOP 10 (Vektor pTRC) oder E. coli BL21-DE3 (Vektor pET) zu transformieren, wie oben beschrieben. Im Fall des Vektors pGEX-His wurde zur anfänglichen Klonierung wie auch zur Expression der gleiche E. coli-Stamm (W3110) verwendet. Einzelne rekombinante Kolonien wurden in 2 ml LB + Amp (100 μg/ml) inokuliert, über Nacht bei 37°C inkubiert und dann in 20 ml LB + Amp (100 μg/ml) in 100-ml-Kolben 1:30 verdünnt, wobei sichergestellt wurde, dass die OD₆₀₀ im Bereich von 0,1 bis 0,15 lag. Die Kolben wurden bei 30°C in rotierenden Wasserbad-Schüttlern inkubiert, bis die OD ein zur Induktion der Expression geeignetes exponentielles Wachstum anzeigte (OD 0,4–0,8 für die Vektoren pET und pTRC; OD 0,8–1 für die Vektoren pGEX und pGEX-His). Für die Vektoren pET, pTRC und pGEX-His wurde die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert, während im Fall des pGEX-Systems die Endkonzentration an IPTG 0,2 mM betrug. Nach 3 Stunden Inkubation bei 30°C wurde die Endkonzentration der Probe durch die OD geprüft. Zur Überprüfung der Expression wurde 1 ml jeder Probe entnommen und in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert; das Pellet wurde in PBS resuspendiert; die Analyse erfolgte durch 12% SDS-PAGE mit Coomassie-Blue-Färbung. Die gesamte Probe wurde bei 6000 g zentrifugiert, und das Pellet wurde zur weiteren Verwendung in PBS resuspendiert.
Reinigung von GST-Fusionsproteinen in großem Maßstab
Bei einigen ORFs wurde eine einzelne Kolonie über Nacht bei 37°C auf einer LB + Amp-Agarplatte kultiviert. Die Bakterien wurden in 20 ml flüssige LB + Amp-Kultur in einem Wasserbad-Schüttler inokuliert und über Nacht wachsen gelassen. Die Bakterien wurden in 600 ml frischem Medium 1:30 verdünnt und bei der optimalen Temperatur (20–37°C) bis zu einem Wert OD₅₅₀ von 0,8–1 wachsen gelassen. Die Proteinexpression wurde mit 0,2 mM IPTG und anschließende Inkubation während drei Stunden induziert. Die Kultur wurde bei 4°C bei 8000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Bakterienpellet wurde in 7,5 ml kalter PBS resuspendiert. Die Zellen wurden durch Beschallen auf Eis während 30 Sekunden bei 40 W mit einem Ultraschallgerät vom Typ Branson Sonifier B-15 aufgebrochen, zweimal eingefroren und aufgetaut und wiederum zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und mit 150 μl Glutathion-Sepharose 4B-Harz (Pharmacia) (das zuvor mit PBS gewaschen worden war), gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Probe wurde 5 Minuten bei 4°C unter 700 g zentrifugiert. Das Harz wurde zweimal 10 Minuten mit 10 ml kalter PBS gewaschen, in 1 ml kalter PBS resuspendiert und auf eine Einwegsäule aufgegeben. Das Harz wurde zweimal mit 2 ml kalter PBS gewaschen, bis der Durchfluss einen Wert OD₂₈₀ von 0,02–0,06 erreichte. Das GST-Fusionsprotein wurde durch Zusatz von 700 μl kaltem Glutathion-Elutionspuffer (10 mM reduziertes Glutathion, 50 mM Tris-HCl) eluiert, und die Fraktionen wurden gesammelt, bis der Wert OD₂₈₀ 0,1 betrug. 21 μl jeder Fraktion wurden auf ein 12%iges SDS-Gel aufgegeben, wobei als Standards entweder Biorad-SDS-PAGE-Molekulargewichtsstandards über einen breiten Bereich (M1) (200, 116,25, 97,4, 66,2, 45, 31, 21,5, 14,4, 6,5 kDa) oder Amersham-Rainbow-Marker (M'') (220, 66, 46, 30, 21,5, 14,3 kDa) verwendet wurden. Da das Molekulargewicht (MW) von GST 26 kDa beträgt, muss dieser Wert zu dem MW jedes GST-Fusionsproteins hinzuaddiert werden.
Für weitere ORFs wurde für jeden als GST-Fusion zu reinigenden Klon eine einzelne Kolonie ausgestrichen und über Nacht bei 37°C auf einer LB/Amp (100 μg/ml)-Agarplatte kultiviert. Eine isolierte Kolonie von dieser Platte wurde in 20 ml flüssiges LB/Amp (100 μg/ml)-Medium inokuliert und über Nacht bei 37°C unter Schütteln wachsen gelassen. Die Übernachtkultur wurde 1:30 in 600 ml flüssigem LB/Amp (100 μg/ml)-Medium verdünnt und bei der optimalen Temperatur (20–37°C) wachsen gelassen, bis der Wert der OD_550nm 0,6–0,8 erreichte. Die Expression des rekombinanten Proteins wurde durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,2 mM) induziert, und die Kultur wurde für weitere 3 Stunden inkubiert. Die Bakterien wurden durch 15 min Zentrifugieren unter 8000 g bei 4°C gewonnen.
Das Bakterienpellet wurde in 7,5 ml kalter PBS resuspendiert. Die Zellen wurden durch viermaliges Beschallen auf Eis während 30 s mit 40 W aufgebrochen, wobei ein Branson Sonifier 450 verwendet wurde, und 30 min bei 4°C unter 13 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und mit 150 μl Glutathion-Sepharose 4B-Harz (Pharmacia) gemischt, das zuvor mit PBS äquilibriert worden war, wonach unter vorsichtigem Bewegen während 30 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die absatzweise Präparation wurde 5 min bei 4°C unter 700 g zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen. Das Harz wurde zweimal (absatzweise) 10 min mit 10 ml kalter PBS gewaschen, in 1 ml kalter PBS resuspendiert und auf eine Einwegsäule aufgegeben. Das Harz wurde weiter mit kalter PBS gewaschen, bis der Wert OD_280nm des Durchflusses 0,02–0,01 erreichte. Das GST-Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 700 μl kaltem Glutathion-Elutionspuffer (10 mM reduziertes Glutathion, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) eluiert, und die Fraktionen wurden gesammelt, bis der Wert OD_280nm des Eluats anzeigte, dass das gesamte rekombinante Protein erhalten wurde. Aliquote jeder Elutionsfraktion von 20 μl wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung eines 12%igen Gels analysiert. Die Molekülmasse der gereinigten Proteine wurde ermittelt, wobei entweder der Bio-Rad-Molekulargewichtsstandard mit weitem Bereich (M1) (200, 116, 97,4, 66,2, 45,0, 31,0, 21,5, 14,4, 6,5 kDa) oder der Amersham-Rainbow-Marker (M2) (220, 66,2, 46,0, 30,0, 21,5, 14,3 kDa) verwendet wurde. Die Molekulargewichte der GST-Fusionsproteine stellen eine Kombination des 26 kDa-GST-Proteins mit seinem Fusionspartner dar. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bradford-Assays abgeschätzt.
Reinigung von löslichen His-Fusionsproteinen in großem Maßstab
Für einige ORFs wurde eine einzelne Kolonie über Nacht bei 37°C auf einer LB + Amp-Agarplatte kultiviert. Die Bakterien wurden in 20 ml einer flüssigen LB + Amp-Kultur inokuliert und über Nacht in einem Wasserbad-Schüttler inkubiert. Die Bakterien wurden 1:30 in 600 ml frischem Medium verdünnt und bei der optimalen Temperatur (20–37°C) bis zu einem Wert der OD₅₅₀ von 0,6–0,8 wachsen gelassen. Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert, und die Kultur wurde 3 Stunden weiter inkubiert. Die Kultur wurde bei 4°C und 800 U/min zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen, und das Bakterienpellet wurde in 7,5 ml kaltem 10 mM Imidazolpuffer (300 mM NaCl, 50 mM Phosphatpuffer, 10 mM Imidazol, pH 8) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Beschallen auf Eis während 30 s bei 40 W aufgebrochen, wobei ein Branson Sonifier B-15 verwendet wurde, zweimal eingefroren und aufgetaut und wiederum zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und mit 150 μl Ni²⁺-Harz (Pharmacia) (zuvor gewaschen mit 10 mM Imidazolpuffer) gemischt und bei Raumtemperatur 30 min unter mäßigem Rühren inkubiert. Die Probe wurde 5 min bei 4°C unter 700 g zentrifugiert. Das Harz wurde zweimal mit 10 ml kaltem 10 mM Imidazolpuffer 10 min gewaschen, in 1 ml kaltem 10 mM Imidazolpuffer resuspendiert und auf eine Einwegsäule aufgegeben. Das Harz wurde bei 4°C mit 2 ml kaltem 10 mM Imidazolpuffer gewaschen, bis der Durchfluss einen Wert der OD₂₈₀ von 0,02–0,06 erreichte. Das Harz wurde mit 2 ml kaltem 20 mM Imidazolpuffer (300 mM NaCl, 50 mM Phosphatpuffer, 20 mM Imidazol, pH 8) gewaschen, bis der Durchfluss einen Wert der OD₂₈₀ von 0,02–0,06 erreichte. Das His-Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 700 μl kaltem 250 mM Imidazolpuffer (300 mM, NaCl, 50 mM Phosphatpuffer, 250 mM Imidazol, pH 8) eluiert, und die Fraktionen wurden gesammelt, bis der Wert OD₂₈₀ 0,1 betrug. 21 μl jeder Fraktion wurden auf ein 12%iges SDS-Gel aufgegeben.
Reinigung von unlöslichen His-Fusionsproteinen in großem Maßstab
Eine einzelne Kolonie wurde über Nacht bei 37°C auf einer LB + Amp-Agarplatte kultiviert. Die Bakterien wurden in 20 ml flüssiger LB + Amp-Kultur in einem Wasserbad-Schüttler inokuliert und über Nacht wachsen gelassen. Die Bakterien wurden 1:30 in 600 ml frischem Medium verdünnt und bei der optimalen Temperatur (37°C) bis zu einem Wert der OD₅₅₀ von 0,6–0,8 wachsen gelassen. Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert, und die Kultur wurde 3 h weiter inkubiert. Die Kultur wurde dann bei 4°C und 8000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Bakterienpellet wurde in 7,5 ml Puffer B (8 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,8) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Beschallen auf Eis während 30 s mit 40 W aufgebrochen, wobei ein Branson Sonifier B-15 verwendet wurde, zweimal eingefroren und aufgetaucht und wieder zentrifugiert. Der Überstand wurde bei –20°C aufbewahrt, während die Pellets in 2 ml Guanidinpuffer (6 M Guanidin-Hydrochlorid, 100 mM Phosphatpuffer, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) resuspendiert und in einem Homogenisator 10 Zyklen behandelt wurden. Das Produkt wurde 40 min bei 13000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 150 μl Ni²⁺-Harz (Pharmacia) (zuvor mit Puffer B gewaschen) gemischt und bei Raumtemperatur unter mäßigem Rühren 30 min inkubiert. Die Probe wurde dann 5 min bei 4°C unter 700 g zentrifugiert. Das Harz wurde zweimal mit 10 ml Puffer B 10 min gewaschen, in 1 ml Puffer B suspendiert und auf eine Einwegsäule aufgegeben. Das Harz wurde bei Raumtemperatur mit 2 ml Puffer B gewaschen, bis der Durchfluss einen Wert der OD₂₈₀ von 0,02–0,06 erreichte. Das Harz wurde mit 2 ml Puffer C (8 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,3) gewaschen, bis der Durchfluss einen Wert der OD₂₈₀ von 0,02–0,06 erreichte. Das His-Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 700 μl Elutionspuffer (8 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpuffer, pH 4,5) eluiert, und die Fraktionen wurden gesammelt, bis der Wert der OD₂₈₀ 0,1 betrug. 21 μl jeder Fraktion wurden auf ein 12%iges SDS-Gel aufgegeben.
Reinigung von His-Fusionsproteinen
Für jeden als His-Fusionsprotein zu reinigenden Klon wurde eine einzelne Kolonie ausgestrichen und über Nacht bei 37°C auf einer LB/Amp (100 μg/ml)-Agarplatte kultiviert. Eine isolierte Kolonie von dieser Platte wurde in 20 ml flüssiges LB/Amp (100 μg/ml)-Medium inokuliert und über Nacht bei 37°C unter Schütteln wachsen gelassen. Die Übernachtkultur wurde 1:30 in 600 ml flüssigem LB/Amp (100 μg/ml)-Medium verdünnt und bei der optimalen Temperatur (20–37°C) wachsen gelassen, bis der Wert der OD_550nm 0,6–0,8 erreichte. Die Expression des rekombinanten Proteins wurde durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1,0 mM) induziert, und die Kultur wurde für weitere 3 h inkubiert. Die Bakterien wurden durch 15 min Zentrifugieren bei 4°C unter 8000 g gewonnen.
Das Bakterienpellet wurde resuspendiert in 7,5 ml entweder (i) kaltem Puffer A (300 mM NaCl, 50 mM Phosphatpuffer, 10 mM Imidazol, pH 8,0) für lösliche Proteine oder (ii) Puffer B (8 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,8) für unlösliche Proteine. Die Zellen wurden durch viermaliges Beschallen während 30 s mit 40 W aufgebrochen, wobei ein Branson Sonifier 450 verwendet wurde, und 30 min bei 4°C und 13000 g zentrifugiert. Bei unlöslichen Proteinen wurden die Pellets in 2,0 ml Puffer C (6 m Guanidin-Hydrochlorid, 100 mM Phosphatpuffer, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) resuspendiert und 10 Zyklen mit einem Dounce-Homogenisator behandelt. Die Homogenisate wurden 40 min bei 13000 g zentrifugiert; der Überstand wurde zurückbehalten.
Die Überstände sowohl für die löslichen als auch die unlöslichen Präparationen wurden mit 150 μl Ni²⁺-Harz (zuvor entweder mit Puffer A oder Puffer B, wie gebraucht) gemischt und bei Raumtemperatur unter mäßigem Rühren 30 min inkubiert. Bei dem Harz handelte es sich um Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia), das nach dem Protokoll des Herstellers präpariert worden war. Die absatzweise Präparation wurde 6 min bei 4°C und 700 g zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Harz wurde zweimal (absatzweise) 10 min mit 10 ml Puffer A oder Puffer B gewaschen, in 1,0 ml Puffer A oder Puffer B resuspendiert und auf eine Einwegsäule aufgegeben. Das Harz wurde weiter entweder (i) mit Puffer A bei 4°C oder (ii) mit Puffer B bei Raumtemperatur gewaschen, bis der Wert der OD_280nm des Durchflusses 0,02–0,01 erreichte. Das Harz wurde weiter entweder (i) mit kaltem Puffer C (300 mM NaCl, 50 mM Phosphatpuffer, 20 mM Imidazol, pH 8,0) oder (ii) mit Puffer D (8 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,3) gewaschen, bis der Wert der OD_280nm des Durchflusses 0,02–0,01 erreichte. Das His-Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 600 μl entweder (i) kaltem Elutionspuffer A (300 mM NaCl, 50 mM Phosphatpuffer, 250 mM Imidazol, pH 8,0) oder (ii) von Elutionspuffer B (8 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Phosphatpuffer, pH 4,5) eluiert, und die Fraktionen wurden gesammelt, bis der Wert der OD_280nm anzeigte, dass das gesamte rekombinante Protein erhalten wurde. Aliquote von 20 μl von jeder Elutionsfraktion wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung eines 12%igen Gels analysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bradford-Assays abgeschätzt.
Renaturierung von His-Fusionsproteinen
In den Fällen, in denen eine Denaturierung erforderlich war, um Proteine in Lösung zu bringen, wurde vor der Immunisierung ein Renaturierungsschritt angewandt. Zu den oben erhaltenen denaturierten Fraktionen wurde Glycerin zu einer Endkonzentration von 10% (V/V) zugegeben. Die Proteine wurden mit Dialysepuffer I (10% (V/V) Glycerin, 0,5 M Arginin, 50 mM Phosphatpuffer, 5,0 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 2,0 M Harnstoff, pH 8,8) verdünnt und gegen den gleichen Puffer 12–14 h bei 4°C dialysiert. Eine weitere Dialyse wurde mit Puffer II (10% (V/V) Glycerin, 0,5 M Arginin, 50 mM Phosphatpuffer, 5,0 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, pH 8,8) 12–14 h bei 4°C durchgeführt.
Alternativ wurden 10% Glycerin zu den denaturierten Proteinen zugegeben. Die Proteine wurden dann unter Verwendung von Dialysepuffer I (10% Glycerin, 0,5 M Arginin, 50 mM Phosphatpuffer, 5 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 2 M Harnstoff, pH 8,8) auf 20 μg/ml verdünnt und 12–14 h bei 4°C gegen den gleichen Puffer dialysiert. Das Protein wurde ferner gegen Dialysepuffer II (10% Glycerin, 0,5 M Arginin, 50 mM Phosphatpuffer, 5 mM reduziertes Glutathion, 0,5 mM oxidiertes Glutathion, pH 8,8) 12–14 h bei 4°C dialysiert.
Die Proteinkonzentration wurde nach folgender Formel ermittelt: Protein (mg/ml) = (1,55 + OD280) – (0,76 × OD260).
Reinigung von Proteinen
Zur Analyse der Löslichkeit wurden Pellets, die von 3,0 ml Kulturen erhalten waren, in 500 μl Puffer M1 (PBS, pH 7,2) resuspendiert. Nach Zugabe von 25 μl Lysozym (10 mg/ml) wurden die Bakterien 15 min bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann durch viermaliges Beschallen während 30 s bei 40 W aufgebrochen, wobei ein Branson Sonifier 450 verwendet wurde, und 30 min bei 4°C und 13000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, und das Pellet wurde in Puffer M2 [8 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 20 mM Imidazol und 0,1 M NaH₂PO₄] resuspendiert und 3 bis 4 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand gesammelt, und das Pellet wurde in Puffer M3 [6 M Guanidinium-HCl, 0,5 M NaCl, 20 mM Imidazol und 0,1 M NaH₂PO₄] über Nacht bei 4°C resuspendiert. Die Überstände von allen Schritten wurden durch SDS-PAGE analysiert. Einige Proteine erwiesen sich als in PBS löslich, andere erforderten Harnstoff oder Guanidinium-HCl zur Solubilisierung.
Für Reinigungen in präparativem Maßstab wurden 500 ml Kulturen induziert, und die Fusionsproteine wurden entweder in Puffer M1 oder in Puffer M2 oder in Puffer M3 nach dem oben beschriebenen Verfahren in Lösung gebracht. Die rohen Extrakte wurden auf eine Ni-NTA-Superflow-Säule (Quiagen) aufgegeben, die je nach dem angewandten Solubilisierungspuffer mit Puffer M1, M2 oder M3 äquilibriert worden war. Nichtgebundenes Material wurde durch Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer eluiert. Das rekombinante Fusionsprotein wurde mit dem entsprechenden Puffer, der 500 mM Imidazol enthielt, eluiert und dann gegen den gleichen Puffer ohne Anwesenheit von Imidazol dialysiert.
Immunisierungen von Mäusen
20 μg jedes gereinigten Proteins werden zur intraperitonealen Immunisierung von Mäusen verwendet. Im Fall einiger ORFs wurden Balb-C-Mäuse an den Tagen 1, 21 und 42 mit Al(OH)₃ als Adjuvans immunisiert, und die Immunantwort wurde in am Tag 56 genommenen Proben überwacht. Bei anderen ORFs konnten CD1-Mäuse unter Anwendung des gleichen Protokolls immunisiert werden. Alternativ wurden 20 μg jedes gereinigten Proteins mit Freund-Adjuvans gemischt und zur intraperitonealen Immunisierung von CD1-Mäusen verwendet. Bei vielen dieser Proteine wurde die Immunisierung an den Tagen 1, 21 und 35 vorgenommen, und die Immunantwort wurde in an den Tagen 34 und 49 abgenommenen Proben überwacht. Bei einigen Proteinen wurde die dritte Immunisierung am Tag 28 anstatt am Tag 35 vorgenommen, und die Immunantwort wurde an den Tagen 20 und 42 anstatt an den Tagen 34 und 49 gemessen.
ELISA-Assay (Analyse von Seren)
Der von der Kapsel befreite Stamm MenBM7 wurde auf Chocolate-Agar-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Bakterienkolonien wurden von den Agarplatten unter Verwendung eines sterilen Dacron-Tupfers gesammelt und in 7 ml Mueller-Hinton-Nährmedium (Difco) mit einem Gehalt von 0,25% Glucose inokuliert. Das Bakterienwachstum wurde alle 30 min durch Verfolgen der OD₆₂₀ überwacht. Die Bakterien wurden wachsen gelassen, bis die OD den Wert 0,3–0,4 erreichte. Die Kultur wurde 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Bakterien wurden einmal mit PBS gewaschen, in PBS, die 0,025% Formaldehyd enthielt resuspendiert und 2 h bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4°C unter Rühren inkubiert. 100 μl Bakterienzellen wurden in jede Vertiefung einer Greiner-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit PBT-Waschpuffer (0,1% Tween-20 in PBS) gewaschen. 200 μl Sättigungspuffer (2,7% Polyvinylpyrrolidon 10 in Wasser) wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 2 h bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT gewaschen. In jede Vertiefung wurden 200 μl der verdünnten Seren (Verdünnungspuffer: 1% BSA, 0,1% Tween-20, 0,1% NaN₃ in PBS) gegeben, und die Platten wurden 90 min bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT gewaschen. 100 μl HRP-konjugiertes Kaninchen-Anti-Maus-Serum (Dako), das 1:2000 in Verdünnungspuffer verdünnt war, wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 90 min bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT-Puffer gewaschen. 100 μl Substratpuffer für HRP (25 ml Citratpuffer pH5, 10 mg o-Phenylendiamin und 10 μl H₂O) wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 20 min bei Raumtemperatur belassen. Nach Zugabe von 100 μl H₂SO₄ in jede Vertiefung wurde die OD₄₉₀ verfolgt. Das ELISA-Assay wurde als positiv angesehen, wenn der Wert der OD₄₉₀ das 2,5-Fache der entsprechenden Seren vor der Immunisierung betrug.
Alternativ wurde der entkapselte Stamm MenB M7 auf Chocolate-Agar-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Bakterienkolonien wurden von den Agarplatten unter Verwendung eines sterilen Dacron-Tupfers gesammelt und in Mueller-Hinton-Nährmedium (Difco) mit einem Gehalt von 0,25% Glucose inokuliert. Das Bakterienwachstum wurde alle 30 min durch Verfolgen der OD₆₂₀ überwacht. Die Bakterien wurden wachsen gelassen, bis die OD den Wert 0,3–0,4 erreichte. Die Kultur wurde 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Bakterien wurden einmal mit PBS gewaschen, in PBS resuspendiert, die 0,025% Formaldehyd enthielt und 1 h bei 37°C und dann über Nacht bei 4°C unter Rühren inkubiert. 100 μl Bakterienzellen wurden in jede Vertiefung einer Greiner-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit PBT-Waschpuffer (0,1% Tween-20 in PBS) gewaschen. 200 μl Sättigungspuffer (2,7% Polyvinylpyrrolidon 10 in Wasser) wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 2 h bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT gewaschen. In jede Vertiefung wurden 200 μl der verdünnten Seren (Verdünnungspuffer: 1% BSA, 0,1% Tween-20, 0,1% NaN₃ in PBS) gegeben, und die Platten wurden 90 min bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT gewaschen. 100 μl HRP-konjugiertes Kaninchen-Anti-Maus-Serum (Dako), das 1:2000 in Verdünnungspuffer verdünnt war, wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 2 h bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBT-Puffer gewaschen. 100 μl Substratpuffer für HRP (25 ml Citratpuffer pH5, 10 mg o-Phenylendiamin und 10 μl H₂O₂) wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 20 min bei Raumtemperatur belassen. Nach Zugabe von 100 μl 12,5%iger H₂SO₄ in jede Vertiefung wurde die OD₄₉₀ verfolgt. Die ELISA-Titer wurden willkürlich als Verdünnung der Seren berechnet, die einen OD₄₉₀-Wert von 0,4 über dem Niveau der Seren vor der Immunisierung ergaben. Das ELISA-Assay wurde als positiv angesehen, wenn die Verdünnung der Seren mit OD₄₉₀ von 0,4 höher war als 1:400.
Bakterien-Bindungsassay-Prozedur mit FACScan
Der von der Kapsel befreite Stamm MenB M7 wurde auf Chocolate-Agar-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Bakterienkolonien wurden von den Agarplatten unter Verwendung eines sterilen Dacron-Tupfers gesammelt und in 4 Röhrchen, die jeweils 8 ml Mueller-Hinton-Nährlösung (Difco) mit einem Gehalt von 0,25% Glucose enthielten, inokuliert. Das Bakterienwachstum wurde alle 30 min durch Verfolgen der OD₆₂₀ überwacht. Die Bakterien wurden wachsen gelassen, bis die OD den Wert von 0,35–0,5 erreichte. Die Kultur wurde bei 4000 U/min 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in Blockierpuffer (1% BSA in PBS, 0,4% NaN₃) resuspendiert und 5 min bei 4000 U/min zentrifugiert. Die Zellen wurden in Blockierpuffer resuspendiert, um einen Wert der OD₆₂₀ von 0,07 zu erreichen. 100 μl Bakterienzellen wurden in jede Vertiefung einer Costar-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. 100 μl verdünnte (1:100, 1:200, 1:400) Seren (in Blockierpuffer) wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 2 h bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden 5 min bei 4000 U/min zentrifugiert; der Überstand wurde abgesaugt, und die Zellen wurden durch Zugabe von 200 μl Blockierpuffer pro Vertiefung in jede Vertiefung gewaschen. In jede Vertiefung wurden 100 μl mit R-Phycoerythrin konjugierter Ziege-Anti-Maus-F(ab)₂, 1:100 verdünnt, gegeben, und die Platten wurden 1 h bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden 5 min bei 4000 U/min herunterzentrifugiert und durch Zusatz von Blockierpuffer in einer Menge von 200 μl/Vertiefung gesaschen. Der Überstand wurde abgesaugt, und die Zellen wurden in PBS, 0,25% Formaldehyd, in einer Menge von 200 μl/Vertiefung resuspendiert. Die Proben wurden in FACScan-Röhrchen übertragen und ausgewertet. Die FACScan-Einstellungen (Laserleistung 15 mW) waren wie folgt: FL2 EIN; FSC-H-Schwellenwert: 92; FSC PMT-Spannung: E 01; SSC PMT: 474; Verstärkungen 6,1; FL-s PMT: 586; Kompensationswerte: 0.
OMV-Präparationen
Bakterien wurden über Nacht auf 5 GC-Platten kultiviert, mit einer Schlinge gewonnen und in 10 ml 20 mM Tris-HCl resuspendiert. Die Hitzeinaktivierung wurde während 30 min bei 56°C durchgeführt, und die Bakterien wurden durch 10 min Beschallen (Tastverhältnis 50%, Ausgang 50%) auf Eis aufgebrochen. Nicht aufgebrochene Zellen wurden durch 10 min Zentrifugieren bei 5000 g entfernt, und die gesamte Zellhüllenfraktion wurde durch 75 min Zentrifugieren bei 50000 g bei 4°C gewonnen. Zur Abtrennung der Cytoplasmamembranproteine von den rohen Außenmembranen wurde die gesamte Fraktion in 2% Sarkosyl (Sigma) resuspendiert und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Suspension wurde zur Abtrennung von Aggregaten 10 min bei 10000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde des Weiteren 75 min bei 50000 g ultrazentrifugiert, um die Außenmembranen als Pellet abzutrennen. Die Außenmembranen wurden in 10 mM Tris-HCl, pH 8, resuspendiert, und die Proteinkonzentration wurde mit dem Bio-Rad Protein-Assay gemessen, wobei BSA als Standard verwendet wurde.
Präparation mit ganzen Extrakten
Bakterien wurden über Nacht auf einer GC-Platte kultiviert, mit einer Schlinge gewonnen und in 1 ml 20 mM Tris-HCl resuspendiert. Die Hitzeinaktivierung wurde während 30 min bei 56°C durchgeführt.
Western Blotting
Gereinigte Proteine (500 ng/Spur), Außenmembranvesikel (5 μg) und Gesamtzellextrakte (25 μg), die vom MenB-Stamm 2996 abgeleitet waren, wurden auf ein 12%iges SDS-Polyacrylamid-Gel aufgegeben und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Übertragung erfolgte während 2 h bei 150 mA und 4°C unter Verwendung von Transferpuffer (0,3% Tris-Base, 1,44% Glycin, 20% (V/V) Methanol). Die Membran wurde durch Inkubation bei 4°C über Nacht in Sättigungspuffer (10% entrahmte Milch, 0,1% Triton X100 in PBS) gesättigt. Die Membran wurde zweimal mit Waschpuffer (3% entrahmte Milch, 0,1% Triton X100 in PBS) gewaschen und 2 h bei 37°C mit in Waschpuffer 1:200 verdünntem Mäuseserum inkubiert. Die Membran wurde zweimal gewaschen und 90 min mit 1:2000 verdünntem, mit Meerrettich-Peroxidase markiertem Anti-Maus-Ig inkubiert. Die Membran wurde zweimal mit 0,1% Triton X100 in PBS gewaschen und mit dem Opti-4CN Substrate-Kit (Bio-Rad) entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von Wasser gestoppt.
Assay der bakteriziden Wirkung
Die Stämme MC58 und 2996 wurden auf Chocolate-Agar-Platten über Nacht bei 37°C kultiviert. 5–7 Kolonien wurden gesammelt und zur Inokulation von 7 ml Mueller-Hinton-Nährlösung verwendet. Die Suspension wurde bei 37°C auf einem Nutator inkubiert und wachsen gelassen, bis der Wert der OD₆₂₀ zwischen 0,5 und 0,8 lag. Die Kultur wurde in Form von Aliquoten in sterile 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen gegeben und 20 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wurde einmal in Gey's Puffer (Gibco) gewaschen und im gleichen Puffer bis zu einem Wert der OD₆₂₀ von 0,5 resuspendiert, in Gey's Puffer 1:20000 verdünnt und bei 25°C gelagert.
In jede Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen wurden 50 ml Gey's Puffer/1% BSA gegeben. 25 μl verdünnte (1:100) Mäuseseren (Verdünnungspuffer: Gey's Puffer/0,2% BSA) wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platte wurde bei 4°C inkubiert. 25 μl der zuvor beschriebenen Bakteriensuspension wurden in jede Vertiefung gegeben. 25 μl entweder Hitze-inaktiviertes (30 min im Wasserbad von 56°C) oder normales Kaninchenbaby-Komplement wurden in jede Vertiefung gegeben. Unmittelbar nach der Zugabe des Kaninchenbaby-Komplements wurden 22 μl jeder Probe/Vertiefung auf Mueller-Hinton-Agarplatten ausplattiert (Zeit 0). Die Platte mit 96 Vertiefungen wurde 1 h bei 37°C unter Drehung inkubiert; anschließend wurden 22 μl von jeder Probe/Vertiefung auf Mueller-Hinton-Agarplatten ausplattiert (Zeit 1). Nach Inkubation über Nacht wurden die der Zeit 0 und der Zeit 1 h entsprechenden Kolonien gezählt.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne sie einzuschränken.
BEISPIEL 1
Unter Anwendung der oben beschriebenen Prozeduren wurden die folgenden Oligonucleotid-Primer bei dem Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Assay zur Klonierung der ORFs wie unten angegeben verwendet: Tabelle 1: Zur PCR für Beispiel 2 verwendete Oligonucleotide
Lokalisierung der ORFs
Die nachstehenden DNA-Sequenzen und Aminosäuresequenzen werden durch Überschriften folgender Form identifiziert: [g, m, oder a] [#].[seq oder pep], wobei bedeuten: "g" eine Sequenz von N. gonorrhoeae, "m" eine Sequenz von N. meningitidis B und "a" eine Sequenz von N. meningitidis A; "#" bedeutet die Nummer der Sequenz; "seq" bedeutet eine DNA-Sequenz, und "pep" bedeutet eine Aminosäuresequenz. Die Bezeichnung "g001.seq" bezieht sich zum Beispiel auf eine DNA-Sequenz Nr. 1 von N. gonorrhoeae. Das Vorliegen des Suffixes "–1" an diesen Sequenzen bezeichnet eine zusätzliche Sequenz, die für den gleichen ORF gefunden wurde; somit gelten Daten für einen ORF mit sowohl einer Sequenzbezeichnung ohne Suffix als auch einer Sequenzbezeichnung mit Suffix für beide in dieser Weise bezeichneten Sequenzen. Ferner sind offene Leserahmen als ORF# identifiziert, wobei "#" die Nummer des ORF bedeutet, die der Nummer der Sequenz entspricht, die den ORF codiert; die ORF-Bezeichnungen können ein Suffix ".ng" oder ".a" aufweisen, was anzeigt, dass der ORF einer Sequenz von N. gonorrhoeae beziehungsweise einer Sequenz von N. meningitidis A entspricht. Das Wort "partiell" vor einer Sequenz weist darauf hin, dass die Sequenz ein partieller oder ein vollständiger ORF sein kann. Eine Computeranalyse wurde für die folgenden Vergleiche zwischen Peptidsequenzen "g", "m" und "a" durchgeführt; darin ist das Suffix "pep" impliziert, wenn nicht ausdrücklich angegeben. Wenn ferner ein Konflikt zwischen dem unmittelbar vorhergehenden Text, der beschreibt, welche Sequenzen verglichen werden, und den bezeichneten verglichenen Sequenzen auftritt, gilt die bezeichnete Sequenz, und sie stellt die wahre verglichene Sequenz dar.
ORF: contig:
287
die folgende partielle DNA-Sequenz wurde identifiziert in N. meningitidis <SEQ ID 1>:
Dies entspricht der Aminosäuresequenz <SEQ ID2; ORF 287>:
Die folgende partielle DNA-Sequenz wurde indentifiziert in N. gonorrhoeae <SEQ ID 5>:
Dies entspricht der Aminosäuresequenz <SEQ ID 6; ORF 287 .ng>:
m287/g287 Die ORFs 287 und 287.ng zeigten eine 70,1%ige Identität bei einer Überlappung von 499 Aminosäuren
Die folgende partielle DNA-Sequenz wurde identifiziert in N. meningitidis <SEQ ID 3>:
Dies entspricht der Aminosäuresequenz <SEQ ID 4; ORF 287.a>:
BEISPIEL 2
Expression des ORF 287
Der in Tabelle 1 für ORF 287 beschriebene Primer wurde zur Lokalisierung und zur Klonierung des ORF 287 herangezogen. Das vorausgesagte Gen 287 wurde in den Vektor pGex kloniert und in E. coli exprimiert. Das Produkt der Proteinreinigung wurde durch SDS-PAGE analysiert. In 1, Feld A), ist die Analyse der Reinigung des 287-GST-Fusionsproteins dargestellt. Mäuse wurden mit dem gereinigten 287-GST immunisiert, und die Seren wurden für die FACS-Analyse (Feld B), das Assay zur bakteriziden Wirkung (Feld C) und für das ELISA-Assay (Feld D) verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass 287 ein oberflächenexponiertes Protein ist. Symbole: M1: Molekulargewichtsmarker. Der Pfeil bezeichnet die Position des rekombinanten Protein-Hauptprodukts (A). Diese Experimente bestätigen, dass 287 ein oberflächenexponiertes Protein ist, sowie, dass es sich um ein geeignetes Immunogen handelt. Die Hydrophilie-Diagramme, der Antigenitätsindex und die amphipathischen Regionen von ORF 287 sind in 2 dargestellt. Zur Voraussage mutmaßlicher T-Zell-Epitope wird das Programm AMPHI verwendet (Gao et al., 1989, J. Immunol. 143: 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Human Retroviruses 12: 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol. Suppl. 11: 9). Die Nucleinsäuresequenz von ORF 287 und die dadurch codierte Aminosäuresequenz sind in Beispiel 1 angegeben.
BEISPIEL 3

In Tabelle 4 sind verschiedene Neisseria-Stämme aufgelistet, die verwendet wurden, um die Konservierung der Sequenz des ORF 287 unter den verschiedenen Stämmen zu prüfen. Tabelle 4

Variabilität des Gens 287: Liste der verwendeten Neisseria-Stämme
Identifizierung	Stamm Nummer Gruppe B	Referenz
287_2	BZ198	Seiler et al., 1996
287_9	NGP165	Seiler et al., 1996
287_14	NGH138	Seiler et al., 1996
287_21	MC58	Virji et al., 1992
	Gruppe A
z2491	Z2491	Maiden et al. 1991
	Gonococcus
fa1090	FA1090	Dempsey et al. 1991
Referenzen: Seiler et al., Mol. Microbiol., 1996, 19(4): 841–856, Maiden R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 3140–3145. Virji M. et al., Mol. Microbiol., 1992, 6: 1271–1279 Dempsey J. F. et al., J. Bacteriol., 1991, 173: 5476–5486

Die Aminosäuresequenzen für jeden aufgelisteten Stamm sind wie folgt:
3 zeigt die Ergebnisse des Sequenzvergleichs für jeden dieser Stämme. Die dunkle Schattierung bezeichnet Regionen von Homologie, und die graue Schattierung bezeichnet die Konservierung von Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften. Wie leicht erkennbar ist, liegt bei den verschiedenen Stämmen eine signifikante Konservierung des ORF 287 vor, was seine Brauchbarkeit als Antigen sowohl für Impfstoffe als auch für Diagnostika weiter bestätigt.
BEISPIEL 4
Unter Anwendung der oben beschriebenen Prozeduren wurden die nachstehenden Oligonucleotid-Primer beim Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Assay zur Klonierung der ORFs wie angegeben verwendet: Tabelle 7: Oligonucleotide, die für die PCR zur Amplifizierung vollständiger oder partieller ORFs verwendet wurden
Die folgende partielle DNA-Sequenz wurde identifiziert in N. gonorrhoeae <SEQ ID 5>:
Dies entspricht der Aminosäuresequenz <SEQ ID 6; ORF 287.ng>:
Die folgende partielle DNA-Sequenz wurde identifiziert in N. meningitidis <SEQ ID 1>:
Dies entspricht der Aminosäuresequenz <SEQ ID 2; ORF 287>:
Die Computeranalyse dieser Aminosäuresequenz ergab folgende Ergebnisse: Homologie mit einem erwarteten ORF von N. gonorrhoeae
Die folgende partielle DNA-Sequenz wurde identifiziert in N. meningitidis <SEQ ID 3>:
Dies entspricht der Aminosäuresequenz <SEQ ID 4; ORF 287.a>:
Die vorstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.
IN DER BESCHREIBUNG ZITIERTE DRUCKSCHRIFTEN
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• EP 0467714 A [0007]
• WO 9629412 A [0007] [0007]
• WO 9728273 A [0007]
• WO 9503413 A [0007]
• US 5439808 A [0007]
• US 5879686 A [0007]
• WO 9713860 A [0007]
• US 5783681 A [0040]
• US 5693506 A [0048]
• US 5659122 A [0048]
• US 5608143 A [0048]
• WO 89046699 A [0070]
• US 4738921 A [0075]
• US 4689406 A [0075]
• US 4551433 A [0076]
• EP 219237 A [0078]
• US 4336336 A [0080]
• WO 8404541 A [0087] [0088]
• US 4745056 A [0087]
• EP 036259 A [0087]
• EP 063953 A [0087]
• US 4876197 A [0091]
• US 4880734 A [0091]
• WO 88024066 A [0093]
• US 4588684 A [0095]
• US 4546083 A [0096]
• US 4870008 A [0096]
• WO 8902463 A [0096]
• US 4837148 A [0102] [0103]
• US 4929555 A [0102] [0103]
• US 5753235 A [0110]
• WO 9014837 A [0127]
• WO 9313302 A [0127]
• WO 9219265 A [0127]
• US 5591624 A [0138] [0141]
• WO 9637626 A [0138]
• WO 9530763 A [0139]
• WO 9205266 A [0139]
• GB 2200651 A [0141]
• EP 0415731 A [0141]
• EP 0345242 A [0141]
• EP 0334301 A [0141]
• WO 8902468 A [0141]
• WO 8905349 A [0141]
• WO 8909271 A [0141]
• WO 9002806 A [0141]
• WO 9007936 A [0141]
• WO 9403622 A [0141]
• WO 9325698 A [0141]
• WO 9325234 A [0141]
• WO 9311230 A [0141]
• WO 9310218 A [0141]
• WO 9102805 A [0141]
• WO 9102825 A [0141]
• WO 9507994 A [0141] [0144]
• US 5219740 A [0141]
• US 4405712 A [0141]
• US 4861719 A [0141]
• US 4980289 A [0141]
• US 4777127 A [0141]
• WO 9307283 A [0142]
• WO 9306223 A [0142] [0142]
• WO 9307282 A [0142]
• WO 9412649 A [0142]
• WO 9303769 A [0142]
• WO 9319191 A [0142]
• WO 9428938 A [0142]
• WO 9511984 A [0142]
• WO 9500655 A [0142]
• WO 9527071 A [0142]
• WO 9529993 A [0142]
• WO 9534671 A [0142]
• WO 9605320 A [0142]
• WO 9408026 A [0142]
• WO 9411506 A [0142]
• WO 9424299 A [0142] [0142]
• WO 9514102 A [0142]
• WO 9524297 A [0142]
• WO 9502697 A [0142]
• WO 9428152 A [0142]
• WO 9509241 A [0142]
• WO 9525807 A [0142]
• WO 9505835 A [0142]
• WO 9418922 A [0142]
• WO 9509654 A [0142]
• WO 9309239 A [0142]
• US 5478745 A [0142]
• US 4797368 A [0142]
• US 5139941 A [0142] [0142]
• US 5474935 A [0142]
• WO 94288157 A [0142]
• US 5354678 A [0142]
• US 5173414 A [0142]
• US 5252479 A [0142]
• US 5288641 A [0143]
• EP 0176170 A , Roizman [0143]
• WO 9504139 A [0143]
• WO 9009441 A [0143]
• WO 9207945 A [0143]
• EP 0453242 A [0143]
• US 5091309 A [0144] [0144]
• US 5217879 A [0144] [0144]
• WO 9210578 A [0144] [0144]
• US 08405627 B [0144]
• WO 9421792 A [0144]
• US 679640 A [0144]
• US 4603112 A [0146]
• US 4769330 A [0146]
• WO 8901973 A [0146]
• US 5166057 A [0146]
• EP 0386882 A [0146]
• EP 0440219 A [0146]
• US 08366787 B [0147]
• US 08240030 B [0147]
• US 08404796 B [0147]
• US 5149655 A [0147] [0150]
• US 5206152 A [0147] [0150]
• WO 9211033 A [0147] [0150]
• US 60023867 B [0148]
• WO 9011092 A [0149] [0164]
• US 5580859 A [0149]
• US 5422120 A [0150] [0151]
• WO 9513796 A [0150] [0151]
• WO 9423697 A [0150] [0151]
• WO 9114445 A [0150]
• EP 524968 A [0150]
• US 023867 P [0150]
• US 4762915 A [0151]
• WO 911444 A [0151]
• EP 0524968 A [0151]
• WO 9314778 A [0155]
• US 9714465 W, Zuckermann [0175]
• WO 9202526 A [0196]
• US 5124246 A [0196]
• US 4683195 A [0197]
• US 4683202 A [0197]

In der Beschreibung zitierte Nichtpatentliteratur

• LIEBERMAN et al. Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neisseria meningitidis Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccine in Young Children. JAMA, 1996, vol. 275 (19), 1499–1503 [0003]
• SCHUCHAT et al. Bacterial Meningitis in the United States in 1995. N Engl J Med, 1997, vol. 337 (14), 970–976 [0003]
• Morbidity and Mortality weekly report, 1997, vol. 46 (RR-5 [0004]
• ZOLLINGER WD. New and Improved Vaccines Against Meningococcal Disease. New Generation Vaccines, 469–488 [0004]
• COSTANTINO et al. Development and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A and C. Vaccine, 1992, vol. 10, 691–698 [0004]
• ROMERO; OUTSCHOORN. Current status of Meningococcal group B vaccine candidates: capsular or non-capsular?. Clin Microbiol Rev, 1994, vol. 7 (4), 559–575 [0005]
• POOLMAN JT. Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis., 1992, vol. 4, 13–28 [0006]
• ALA'ALDEEN; BORRIELLO. The meningococcal transferrin-binding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains. Vaccine, 1996, vol. 14 (1), 49–53 [0006]
• ROKBI et al. Infect Immun., 19 September 1997, vol. 65, 55–63 [0007]
• SAMBROOK. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1989 [0035]
• DNA Cloning. 1985, vol. I and ii [0035]
• Oligonucleotide Synthesis. 1984 [0035]
• Nucleic Acid Hybridization. 1984 [0035]
• Transcription and Translation. 1984 [0035]
• Animal Cell Culture. 1986 [0035]
• Immobilized Cells and Enzymes. IRL Press, 1986 [0035]
• B. PERBAL. A Practical Guide to Molecular Cloning. 1984 [0035]
• the Methods in Enzymology series. Academic Press, Inc, vol. 154 & 15 [0035]
• Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells. Cold Spring Harbor Laboratory, 1987 [0035]
• Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology. Academic Press, 1987 [0035]
• SCOPES. Protein Purification: Principles and Practice. Springer-Verlag, 1987 [0035]
• Handbook of Experimental Immunology. 1986, vol. umes [0035]
• MANIATIS et al. Science, 1987, vol. 236, 1237 [0041] [0041]
• ALBERTS et al. Molecular Biology of the Cell. 1989 [0041]
• DIJKEMA et al. EMBO J., 1985, vol. 4, 761 [0041]
• GORMAN et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1982, vol. 79, 6777 [0041]
• BOSHART et al. Cell, 1985, vol. 41, 521 [0041]
• SASSONE-CORSI; BORELLI. Trends Genet., 1986, vol. 2, 215 [0041]
• BIRNSTIEL et al. Cell, 1985, vol. 41, 349 [0044]
• Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. PROUDFOOT; WHITELAW. Transcription and splicing. 1988 [0044]
• PROUDFOOT. Trends Biochem. Sci., 1989, vol. 14, 105, Trends Biochem. Sci. [0044]
• SAMBROOK et al. Expression of cloned genes in cultured mammalian cells. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989 [0044]
• GLUZMAN. Cell, 1981, vol. 23, 175 [0045]
• KAUFMAN et al. Mol. Cell. Biol., 1989, vol. 9, 946 [0045]
• SHIMIZU et al. Mol. Cell. Biol., 1986, vol. 6, 1074 [0045]
• ZENK. Phytochemistry, 1991, vol. 30, 3861–3863 [0048]
• VAULCOMBE et al. Mol. Gen. Genet., 1987, vol. 209, 33–40 [0048]
• CHANDLER et al. Plant Molecular Biology, 1984, vol. 3, 407–418 [0048]
• ROGERS. J. Biol. Chem., 1985, vol. 260, 3731–3738 [0048]
• ROTHSTEIN et al. Gene, 1987, vol. 55, 353–356 [0048]
• WHITTIER et al. Nucleic Acids Research, 1987, vol. 15, 2515–2535 [0048]
• WIRSEL et al. Molecular Microbiology, 1989, vol. 3, 3–14 [0048]
• YU et al. Gene, 1992, vol. 122, 247–253 [0048]
• R. L. JONES; J. MACMILLIN; GIBBERELLINS. Advanced Plant Physiology. Pitman Publishing Limited, 1984, 21–52 [0048]
• SHEEN. Plant Cell, 1990, vol. 2, 1027–1038 [0048]
• MAAS et al. EMBO J., 1990, vol. 9, 3447–3452 [0048]
• BENKEL; HICKEY. Proc. Natl. Acad. Sci., 1987, vol. 84, 1337–1339 [0048]
• WILMINK; DONS. Plant Mol. Biol. Reptr, 1993, vol. 11 ((2)), 165–185 [0049]
• REED; MANIATIS. Cell, 1985, vol. 41, 95–105 [0053]
• CROSSWAY. Mol. Gen. Genet, 1985, vol. 202, 179–185 [0054]
• KRENS et al. Nature, 1982, vol. 296, 72–74 [0054]
• KLEIN et al. Nature, 1987, vol. 327, 70–73 [0054]
• KNUDSEN; MULLER. Planta, 1991, vol. 185, 330–336 [0054]
• FRALEY et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79, 1859–1863 [0054]
• FROMM et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 5824 [0055]
• SUMMERS; SMITH. Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, 1987 [0060]
• LUCKOW; SUMMERS. Virology, 1989, vol. 17, 31 [0062]
• MILLER et al. Ann. Rev. Microbiol., 1988, vol. 42, 177 [0063]
• The Regulation of Baculovirus Gene Expression. FRIESEN et al. The Molecular Biology of Baculoviruses. 1986 [0065]
• VLAK et al. J. Gen. Virol., 1988, vol. 69, 765 [0065]
• MAEDA et al. Nature, 1985, vol. 315, 592 [0066]
• LEBACQ-VERHEYDEN et al. Molec. Cell. Biol., 1988, vol. 8, 3129 [0066]
• SMITH et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 8404 [0066]
• MIYAJIMA et al. Gene, 1987, vol. 58, 273 [0066]
• MARTIN et al. DNA, 1988, vol. 7, 99 [0066]
• SMITH et al. Mol. Cell. Biol., 1983, vol. 3, 2156 [0068] [0070]
• MILLER et al. Bioessays, 1989, vol. 4, 91 [0068]
• Current Protocols in Microbiology. vol. 2 [0069]
• CARBONELL et al. J. Virol., 1985, vol. 56, 153 [0070]
• WRIGHT. Nature, 1986, vol. 321, 718 [0070]
• FRASER et al. In Vitro Cell. Dev. Biol., 1989, vol. 25, 225 [0070]
• RAIBAUD et al. Annu. Rev. Genet., 1984, vol. 18, 173 [0074]
• CHANG et al. Nature, 1977, vol. 198, 1056 [0075]
• GOEDDEL et al. Nuc. Acids Res., 1980, vol. 8, 4057 [0075]
• YELVERTON et al. Nucl. Acids Res., 1981, vol. 9, 731 [0075]
• SHIMATAKE et al. Nature, 1981, vol. 292 [0075]
• AMANN et al. Gene, 1983, vol. 25, 167 [0076]
• DE BOER et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1983, vol. 80, 21 [0076]
• STUDIER et al. J. Mol. Biol., 1986, vol. 189, 113 [0076] [0087]
• TABOR et al. Proc Natl. Acad. Sci., 1985, vol. 82, 1074 [0076]
• SHINE et al. Nature, 1975, vol. 254, 34 [0077]
• Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA. STEITZ et al. Biological Regulation and Development: Gene Expression. 1979 [0077]
• NAGAI et al. Nature, 1984, vol. 309, 810 [0079]
• JIA et al. Gene, 1987, vol. 60, 197 [0079]
• ALLEN et al. J. Biotechnol., 1987, vol. 5, 93 [0079]
• MAKOFF et al. J. Gen. Microbiol., 1989, vol. 135, 11 [0079]
• MILLER et al. Bio/Technology, 1989, vol. 7, 698 [0079]
• GHRAYEB et al. EMBO J., 1984, vol. 3, 2437 [0081]
• OKA et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1985, vol. 82, 7212 [0081]
• PALVA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79, 5582 [0081] [0087] [0088]
• DAVIES et al. Annu. Rev. Microbiol., 1978, vol. 32, 469 [0085]
• SHIMATAKE et al. Nature, 1981, vol. 292, 128 [0087]
• AMANN et al. Gene, 1985, vol. 40, 183 [0087]
• POWELL et al. Appl. Environ. Microbiol., 1988, vol. 54, 655 [0087] [0087] [0088]
• MASSON et al. FEMS Microbiol. Lett., 1989, vol. 60, 273 [0088]
• MILLER et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, vol. 85, 856 [0088]
• WANG et al. J. Bacteriol., 1990, vol. 172, 949 [0088]
• COHEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1973, vol. 69, 2110 [0088]
• DOWER et al. Nucleic Acids Res., 1988, vol. 16, 6127 [0088]
• An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. KUSHNER. Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering. 1978 [0088]
• MANDEL et al. J. Mol. Biol., 1970, vol. 53, 159 [0088]
• TAKETO. Biochim. Biophys. Acta, 1988, vol. 949, 318 [0088]
• CHASSY et al. FEMS Microbiol. Lett., 1987, vol. 44, 173 [0088]
• FIEDLER et al. Anal. Biochem, 1988, vol. 170, 38 [0088]
• AUGUSTIN et al. FEMS Microbiol. Lett., 1990, vol. 66, 203 [0088]
• BARANY et al. J. Bacteriol., 1980, vol. 144, 698 [0088]
• Transformation of Streptococcus lactis by electroporation. HARLANDER. Streptococcal Genetics. 1987 [0088]
• PERRY et al. Infect. Immun., 1981, vol. 32, 1295 [0088]
• SOMKUTI et al. Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology, 1987, vol. 1, 412 [0088]
• MYANOHARA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80, 1 [0090]
• COHEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 1078 [0091]
• HENIKOFF et al. Nature, 1981, vol. 283, 835 [0091]
• HOLLENBERG et al. Curr. Topics Microblol. Immunol., 1981, vol. 96, 119 [0091]
• The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae. HOLLENBERG et al. Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance. 1979 [0091]
• MERCERAU-PUIGALON et al. Gene, 1980, vol. 11, 163 [0091]
• PANTHIER et al. Curr. Genet., 1980, vol. 2, 109 [0091]
• BOTSTEIN et al. Gene, 1979, vol. 8 [0098]
• BRAKE et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1984, vol. 81, 4642–4646 [0098]
• STINCHCOMB et al. J. Mol. Biol., 1982, vol. 158, 157 [0098]
• ORR-WEAVER et al. Methods in Enzymol., 1983, vol. 101, 228–245 [0099]
• RINE et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80, 6750 [0099]
• BUTT et al. Microbiol, Rev., 1987, vol. 51, 351 [0100]
• KURTZ et al. Mol. Cell. Biol., 1986, vol. 6, 142 [0102] [0103]
• KUNZE et al. J. Basic Microbiol., 1985, vol. 25, 141 [0102] [0102] [0103] [0103]
• GLEESON et al. J. Gen. Microbiol., 1986, vol. 132, 3459 [0102] [0103]
• ROGGENKAMP et al. Mol. Gen. Genet., 1986, vol. 202, 302 [0102] [0103]
• DAS et al. J. Bacteriol., 1984, vol. 158, 1165 [0102] [0103]
• DE LOUVENCOURT et al. J. Bacteriol., 1983, vol. 154, 737 [0102]
• VAN DEN BERG et al. Bio/Technology, 1990, vol. 8, 135 [0102] [0103]
• CREGG et al. Mol. Cell. Biol., 1985, vol. 5, 3376 [0102] [0103]
• HINNEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, vol. 75, 1929 [0102] [0103]
• ITO et al. J. Bacteriol., 1983, vol. 153, 163 [0102] [0103]
• BEACH; NURSE. Nature, 1981, vol. 300, 706 [0102] [0103]
• DAVIDOW et al. Curr. Genet., 1985, vol. 10, 380471 [0102]
• GAILLARDIN et al. Curr. Genet., 1985, vol. 10, 49 [0102]
• DE LOUVENCOURT et al. J. Bacteriol., 1983, vol. 154, 1165 [0103]
• DAVIDOW et al. Curr. Genet., 1985, vol. 10, 39 [0103]
• GAILLARDIN et al. Curr. Genet., 1985, vol. 10 [0103]
• KOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, vol. 256, 495–96 [0114]
• ROBINSON; TORRES. Seminars in Immunology, 1997, vol. 9, 271–283 [0133]
• DONNELLY et al. Annu Rev Immunol, 1997, vol. 15, 617–648 [0133]
• JOLLY. Cancer Gene Therapy, 1994, vol. 1, 51–64 [0135]
• KIMURA. Human Gene Therapy, 1994, vol. 5, 845–852 [0135]
• CONNELLY. Human Gene Therapy, 1995, vol. 6, 185–193 [0135]
• KAPLITT. Nature Genetics, 1994, vol. 6, 148–153 [0135]
• O'NEILL. J. Virol., 1985, vol. 53, 160 [0136]
• KELLY. J. Virol., 1983, vol. 45, 291 [0136]
• RNA Tumor Viruses. Cold Spring Harbor Laboratory, 1985 [0136]
• HARTLEY; ROWE. J Virol, 1976, vol. 19, 19–25 [0140]
• VILE. Cancer Res, 1993, vol. 53, 3860–3864 [0141]
• VILE. Cancer Res, 1993, vol. 53, 962–967 [0141]
• RAM. Cancer Res, 1993, vol. 53, 83–88 [0141]
• TAKAMIYA. J Neurosci Res, 1992, vol. 33, 493–503 [0141]
• BABA. J Neurosurg, 1993, vol. 79, 729–735 [0141]
• MANN. Cell, 1983, vol. 33, 153 [0141]
• CANE. Proc Natl Acad Sci, 1984, vol. 81, 6349 [0141]
• MILLER. Human Gene Therapy, 1990 [0141]
• BERKNER. Biotechniques, 1988, vol. 6, 616 [0142]
• ROSENFELD. Science, 1991, vol. 252, 431 [0142]
• CURIEL. Hum. Gene Ther., 1992, vol. 3, 147–154 [0142]
• NAHREINI. Gene, 1993, vol. 124, 257–262 [0142]
• SAMULSKI. J. Virol., 1987, vol. 61, 3096 [0142]
• SU. Human Gene Therapy, 1996, vol. 7, 463–470 [0142]
• GELLER. Science, 1988, vol. 241, 1667–1669 [0143]
• FINK. Human Gene Therapy, 1992, vol. 3, 11–19 [0143]
• EVANS. Nature, 1989, vol. 339, 385 [0146]
• SABIN. J. Biol. Standardization, 1973, vol. 1, 115 [0146]
• ARNOLD. J Cell Biochem, 1990, L401 [0146]
• FISHER-HOCH. Proc Natl Acad Sci, 1989, vol. 86, 317 [0146]
• FLEXNER: Ann NY Acad Sci, 1989, vol. 569, 86 [0146]
• FLEXNER. Vaccine, 1990, vol. 8, 17 [0146]
• MULLIGAN. Nature, 1979, vol. 277, 108 [0146]
• MADZAK. J Gen Virol, 1992, vol. 73, 1533 [0146]
• ENAMI. Proc Natl Acad Sci, 1990, vol. 87, 3802–3805 [0146]
• ENAMI; PALESE. J Virol, 1991, vol. 65, 2711–2713 [0146]
• LUYTJES. Cell, 1989, vol. 59, 110 [0146]
• MCMICHAEL. NEJ Med, 1983, vol. 309, 13 [0146]
• YAP. Nature, 1978, vol. 273, 238 [0146]
• Nature, 1979, vol. 277, 108 [0146]
• HAMRE. Proc Soc Exp Biol Med, 1966, vol. 121, 190 [0146]
• CURIEL. Hum Gene Ther, 1992, vol. 3, 147–154 [0146]
• WU. J Biol Chem, 1989, vol. 264, 16985–16987 [0147]
• PHILIP. Mol Cell Biol, 1994, vol. 14, 2411–2418 [0147]
• WOFFENDIN. Proc Natl Acad Sci, 1994, vol. 91, 1581–1585 [0147]
• WU. J. Biol. Chem., 1987, vol. 262, 4429–4432 [0147]
• HUCKED. Biochem Pharmacol, 1990, vol. 40, 253–263 [0148]
• PLANK. Bioconjugate Chem, 1992, vol. 3, 533–539 [0148]
• WOFFENDIN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, vol. 91 (24), 11581–11585 [0150]
• STRYER Biochemistry. W. H. Freeman, 1975, 236–240 [0151]
• SZOKA. Biochem Biophys Acta, 1980, vol. 600, 1 [0151]
• BAYER. Biochem Biophys Acta, 1979, vol. 550, 464 [0151]
• RIVNAY. Meth Enzymol, 1987, vol. 149, 119 [0151]
• WANG. Proc Natl Acad Sci, 1987, vol. 84, 7851 [0151]
• PLANT. Anal Biochem, 1989, vol. 176, 420 [0151]
• HUG; SLEIGHT. Biochim. Biophys. Acta, 1991, vol. 1097, 1–17 [0162]
• STRAUBINGER. Meth. Enzymol., 1983, vol. 101, 512–527 [0162]
• FELGNER. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84, 7413–7416 [0163]
• MALONE. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, 6077–6081 [0163]
• DEBS. J. Biol. Chem., 1990, vol. 265, 10189–10192 [0163]
• SZOKA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, vol. 75, 4194–4198 [0164] [0166]
• STRAUBINGER. Meth. Immunol., 1983, vol. 101, 512–527 [0166]
• PAPAHADJOPOULOS. Biochim. Biophys. Acta, 1975, vol. 394, 483 [0166]
• WILSON. Cell, 1979, vol. 17, 77 [0166]
• DEAMER; BANGHAM. Biochim. Biophys. Acta, 1976, vol. 443, 629 [0166]
• OSTRO. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1977, vol. 76, 836 [0166]
• FRALEY. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, 3348 [0166]
• ENOCH; STRITTMATTER. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, 145 [0166]
• FRALEY. J. Biol. Chem., 1980, vol. 255, 10431 [0166]
• SZOKA; PAPAHADJOPOULOS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, vol. 75, 145 [0166]
• SCHAEFER-RIDDER. Science, 1982, vol. 215, 166 [0166]
• BRESLOW. Annu Rev. Biochem, 1985, vol. 54, 699 [0170]
• LAW. Adv. Exp Med. Biol., 1986, vol. 151, 162 [0170]
• CHEN. J Biol Chem, 1986, vol. 261, 12918 [0170]
• KANE. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, vol. 77, 2465 [0170]
• UTERMANN. Hum Genet, 1984, vol. 65, 232 [0170]
• Meth. Enzymol., 1986, 128 [0170]
• PITAS. J. Biochem., 1980, vol. 255, 5454–5460 [0172]
• MAHEY. J Clin. Invest, 1979, vol. 64, 743–750 [0172]
• ATKINSON. Annu Rev Biophys Chem, 1986, vol. 15, 403 [0173]
• RADDING. Biochim Biophys Acta, 1958, vol. 30, 443 [0173]
• MEINKOTH; WAHL. Anal. Biochem., 1984, vol. 138, 267–284 [0187]
• MATTEUCCI et al. J. Am. Chem. Soc., 1981, vol. 103, 3185 [0194]
• URDEA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80, 7461 [0194]
• AGRAWAL; IYER. Curr Opin Biotechnol, 1995, vol. 6, 12–19 [0195]
• AGRAWAL. TIBTECH, 1996, vol. 14, 376–387 [0195]
• COREY. TIBTECH, 1997, vol. 15, 224–229 [0195]
• BUCHARDT et al. TIBTECH, 1993, vol. 11, 384–386 [0195]
• MULLIS et al. Meth. Enzymol., 1987, vol. 155, 335–350 [0197]
• ALTSCHUL et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, 1997, vol. 25, 2289–3402 [0202]
• ESPOSTI et al. Critical evaluation of the hydropathy ofmembrane proteins. Eur J Biochem, 1990, vol. 190, 207–219 [0204]
• GAO et al. J. Immunol, 1989, vol. 143, 3007 [0268]
• ROBERTS et al. AIDS Res Human Retroviruses, 1996, vol. 12, 593 [0268]
• QUAKYI et al. Scand J Immunol Suppl, 1992, vol. 11, 9 [0268]
• SEILER A. et al. Mol. Microbiol., 1996, vol. 19 (4), 841–856 [0269]
• MAIDEN R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95, 3140–3145 [0269]
• VIRJI M. et al. Mol. Microbiol., 1992, vol. 6, 1271–1279 [0269]
• DEMPSEY J. F. et al. J. Bacteriol., 1991, vol. 173, 5476–5486 [0269]

Claims

Protein, das umfasst: • die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder • eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2, die größer als 50% ist, oder • ein Fragment der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2, wobei dieses Fragment 7 oder mehr aufeinanderfolgende Aminosäuren der genannten Sequenz umfasst.
Protein nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 größer als 60% ist.
Protein nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 größer als 70% ist.
Protein nach Anspruch 3, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die unter SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist.
Protein nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 größer als 80% ist.
Protein nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 größer als 90% ist.
Protein nach Anspruch 6, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 7 umfasst.
Protein nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 größer als 95% ist.
Protein nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 größer als 99% ist.
Protein nach Anspruch 1, das ein Fragment von mindestens 8 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 1, das ein Fragment von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 1, das ein Fragment von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 1, das ein Fragment von mindestens 14 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 1, das ein Fragment von mindestens 16 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 1, das ein Fragment von mindestens 18 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 1, das ein Fragment von mindestens 20 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 umfasst.
Protein nach Anspruch 16, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die unter SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 7 ausgewählt ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 17, das ein Fusionsprotein ist.
Antikörper, der an die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 bindet.
Antikörper nach Anspruch 19, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Nucleinsäure, die ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 17 codiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 21, welche die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 umfasst.
Nucleinsäure, die ein Fragment der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 umfasst, wobei das Fragment 12 oder mehr aufeinanderfolgende Nucleotide dieser Sequenz aufweist.
Nucleinsäure nach Anspruch 23, wobei das Fragment 15 oder mehr aufeinanderfolgende Nucleotide dieser Sequenz aufweist.
Nucleinsäure nach Anspruch 23, wobei das Fragment 20 oder mehr aufeinanderfolgende Nucleotide dieser Sequenz aufweist.
Nucleinsäure nach Anspruch 23, wobei das Fragment 30 oder mehr aufeinanderfolgende Nucleotide dieser Sequenz aufweist.
Nucleinsäure nach Anspruch 23, wobei das Fragment 40 oder mehr aufeinanderfolgende Nucleotide dieser Sequenz aufweist.
Zusammensetzung, die ein Protein, eine Nucleinsäure oder einen Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 28, bei der es sich um einen Impfstoff oder eine diagnostische Zusammensetzung handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 28 für die Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 18, des Antikörpers nach Anspruch 19 oder Anspruch 20 oder der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 21 bis 27 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung von durch Neisseria-Bakterien verursachten Infektionen.