MXPA03000822A - Vacunas para proteccion de espectro amplio contra enfermedades causadas por neisseria meningitidis. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona generalmente metodos y vacunas para la prevencion de enfermedades causadas por la bacteria Neisseria meningitidis, particularmente cepas del serogrupo B.

Description

VACUNAS PARA PROTECCIÓN DE ESPECTRO AMPLIO CONTRA ENFERMEDADES CAUSADAS POR NEISSERIA MENINGITIDIS REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de ya sea la solicitud provisional de E. U . presentada anteriormente no. de serie 60/221 ,495, presentada el 27 de Julio de 2000, tal solicitud se incorpora en la presente para referencia en su totalidad .

DECLARACIÓN QUE CONSIDERA INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE PATROCI NADA Esta invención se hace con soporte del gobierno bajo garantías no. AI46464 y AI45642 asignadas al National I nstituto of Allergy and I nfectious Disease, y el National I nstituto of Health . El gobierno puede tener ciertos derechos en esta invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a vacunas de espectro amplio para la prevención de enfermedades causadas por Neisseria meningitidis, especialmente serogrupo B.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Neisseria meningitidis es una bacteria gramnegativa que coloniza el tracto respiratorio superior humano y es responsable de brotes epidémicos cíclicos y esporádicos por todo el mundo de, más notablemente, meningitis y sepsis. Las tasas de morbididad y ataque son más elevadas en niños de menos de 2 años de edad. Como otra bacteria gramnegativa, Neisseria meningitidis típicamente posee una membrana citoplásmica, una capa de péptidoglican, una membrana exterior que junto con el polisacárido capsular constituyen la pared bacteriana, y pelos que se proyecta hacia el ambiente exterior.

Estas estructuras de superficie median la infección e ¡nteractúan con el sistema inmune huésped. Por ejemplo, una primer etapa de infección con Neisseria es la adherencia a células objetivo, que se enseña que se media por los pelos y, posiblemente, otras adhesinas tales como Opc. Se ha reportado que los componentes de polisacárido, fosfolípido y proteína de las membrana exterior producen una respuesta inmune. Neisseria meningitidis spp puede dividirse en grupos serológicos, tipos y subtipos en la base de reacciones con anticuerpos policlonales (Frasch , C E. and Chapman , 1 973, J. Infecí. Dis. 127: 149-154) o monoclonales (H ussein , A. , MONOCLONAL ANTIBODI ES AN D N.

MENINGITIDIS. Proefschrift. Utrecth, Nederland, 1988) que ¡nteractúan con diferentes antígenos. El seroagrupamiento se basa en variaciones inmunológicamente detectables en el polisacárido capsular. Aproximadamente 12 serogrupos se conocen : A, B, C, X, Y, Z, 29-E, W- 1 35, H , I , K y L (Ashton , F. E. et al., 1998, J. Clin. Microbio!. 17:722-727; Branham , S. E. 1956, Can. J. Microbiol. 2 : 1 75- 188; Evans, A. C ; 1920, Lab. Bul!. 1245:43-87; Shao-Qing , et al. , 1972, J. e o/. Stand. 9:307-31 5; Slaterus, K.W. , 1 961 , Ant. V. Leeuwenhoek, J. Microbiol. Serol. 29:265-271 ). Actualmente, el serogrupo B ( en B) es responsable por aproximadamente la mitad a 80% de las enfermedades por Neisseria meningitidis invasiva reportadas. La serotipificación se basa en anticuerpos antigénicos definidos por el anticuerpo monoclonal en una proteína de membrana exterior llamada Porin B (PorB). Los anticuerpos que definen aproximadamente 21 serotipos son actualmente conocidos (Sacchi et al., 1998, Clin. Diag. Lab. Immunol. 5:348). La serotipificación se basa en variaciones antigénicas definidas por el anticuerpo en una proteína de membrana exterior llamada Porin A (PorA) . Los anticuerpos que definen aproximadamente 18 serosubtipos son actualmente conocidos. La serosubtipificación es especialmente importante en cepas de Neisseria meningitidis en donde la inmunidad puede ser específica de serosubtipo. Más variabilidad entre proteínas PorA ocurre en dos (ondas I y IV) de ocho ondas expuestas a la superficie, putativas. Las ondas variables I y IV se han designado VR1 y VR2, respectivamente. Ya que existen más variantes de secuencia VR1 y VR2 de PorA que no se han definido por anticuerpos específicos, una nomenclatura alternativa en base al tipo VR de secuencia de aminoácidos deducida de secuenciación de ADN se ha propuesto (Sacchi et al., 2000, J. Infect. Dis. 182: 1 169, ver también el sitio web Multio Locus Sequence Typing). Los llpopolisacáridos también pueden utilizarse como antígenos de tipificación, dando origen a dichos inmunotipos así llamados: L1 , L2, etc. Neisseria meningitidis también puede dividirse en grupos clónales o subgrupos, utilizando varias técnicas que caracterizan directa o indirectamente el genoma bacteriano. Estas técnicas incluyen electroforesis de enzima multilugar (MLEE), en base a variación de movibilidad electroforótica de una enzima, que refleja los polimorfismos subyacentes en un lugar genético particular. Al caracterizar las variantes de un número de tales proteínas, la "distancia" genética entre dos cepas puede inferirse de la proporciones de desigualdades. De manera similar, la clonación entre dos aislados puede inferirse si los dos tienen patrones idénticos de variantes electroforéticas en número de lugares. Más recientemente, la tipificación de secuencia de multilugar (MLST) ha reemplazado a MLEE como el método de elección para caracterizar los microorganismos. Utilizando MLST, la distancia genética entre dos aislados, o clonación se infiere de la proporción de desigualdades en las secuencias de ADN de 11 genes de resguardo en cepas de Neisseria meningitidis (Maiden et a., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:3140). Dada la prevalencia e importancia económica de infecciones por Neisseria meningitidis invasiva, no es sorprendente que se han hecho muchos intentos para desarrollar tratamientos. Aunque estas infecciones pueden tratarse con antibióticos, aproximadamente 10 a 20% de los pacientes tratados mueren, y muchos supervivientes se dejan con secuelas neurológicas permanentes, tales como amputación, pérdida auditiva neurosensorial y parálisis. También, los microorganismos pueden desarrollar resistencia antibiótica. De esta manera, la prevención con vacunas es un modo preferible para contener la difusión de la infección. Debido a que la cápsula de polisacárido es una de las estructuras más exteriores de Neisseria meningitidis patogénica, ha sido un foco principal de los intentos para desarrollar vacunas. Diferentes preparaciones de polisacáridos capsulares se han utilizado para controlar los brotes y epidemias de los serogrupos A, C, Y y W-135, como vacunas mono-, di- , tri- o tetravalentes (Gold et al., 1969- 1970, Bull WHO 45:272-282; Gotschlich et al. , 1969, J. Exp. Meal. 129: 134-136; Hankins, 1 982 , Proc. Soc. Biol. Med. 169: 54-57; Patente de E. U . No. 6, 080,589) . Sin embargo, las vacunas de polisacárido capsular padecen de: deficiente o ninguna respuesta al polisacárido C en niños de menos de 2 años; termolabilidad de polisacárido A; dificultades que consideran la inducción de tolerancia inmunológica después de la vacunación o re-vacunación con polisacárido C (Granoff et al., 1988, J. Infecí. Dis. 160:5028-5030; MacDonald et al., 1 998, JAMA 280: 1685- 1689; MacDonald er al., 2000, JAMA 283: 1826-1827). Para circunvenir estas propiedades inmunológicas, los polisacáridos de los serogrupos A y C se han acoplado covalentemente a vehículos de proteína para hacer vacunas "conjugadas". En contraste a vacunas de polisacárido pleno, estas vacunas conjugadas son altamente inmunogénicas en infantes, en la re-inyección producen incrementos bioestables en concentraciones de anticuerpo anticapsular de suero, y preparar la habilidad para generar respuestas del anticuerpo de memoria a una inyección subsecuente de polisacárido pleno (Campagne et al., Pediat. Infecí. Dis. J. 19: 144- 1 50); Maclennan et al., 2000, JAMA 283: 2795-2801 ) . Las vacunas conjugadas con propiedades similares han sido ligeramente eficaces para prevenir enfermedades invasivas causadas por otras bacterias encapsuladas, tales como Haemophilus influenzae tipo b o Streptoccocus pneumoniae. El polisacárido capsular (PS) de Neissería meningitidis de serogrupo B es un inmunogen deficiente en humanos (Wyle et al., 1972, J. Infect. Dis. 126:514-522; Zollinger, er a/., 1979; J. Clin. Invest. 63:836-834; Jennings et al. , 1981 , J. Immunol. 127: 104- 108) . Los intentos adicionales para mejorar la inmunogenicidad del polisacárido a través de la conjugación a proteína no han sido exitosos (Jennings et al., 1981 , J. Immunol. 127: 1 04- 1 08) . Para aumentar la inmunogenicidad , el polisacárido de cápsula de serogrupo B meningococal (Men B PS) se ha modificado químicamente (grupo N-propionilado se substituye por el grupo N-acetilo de polisacárido B) y se acopla covalentemente a un conjugado de vehículo de proteína (proteína PB N-Pr-MenB) . La vacuna induce en ratones concentraciones elevadas de anticuerpos IgG que son bactericidales y protectores (este concepto se describe y reivindica en la Patente de E. U . No. 4, 727, 136, emitida el 23 de Febrero de 1988 para Jennings et al.,) . Esta vacuna también es inmunogénica en primates sub-humanos, induciendo anticuerpos de suero que activan la bacteriolisis medidada por completo (Fusco et al., 1997, J. Infect. Dis. 175:364-372). En humanos, tales anticuerpos se conocen por conferir protección contra el desarrollo de enfermedad meningococal (Goldschneider et al., 1 969, J. Exp. Med. 129: 1307) . Sin embargo, un subconjunto de los anticuerpos inducidos por esta vacuna tiene actividad auto-anticuerpo a Men B PS sin modificar (es decir, N-acetil-Men B PS) , Granoff et al., 1998, J. Immunol; 160: 5028-5036, que origina serias preocupaciones de seguridad acerca del uso de esta vacuna en humanos. Por lo tanto, los investigadores han pensado los planteamientos alternativos para desarrollar una vacuna eficaz y segura para la prevención de la enfermedad causada por cepas de serogrupo B. Otros grupos se han enfocado en proteínas de superficie como vacunas. Por ejemplo, el componente de proteína principal del pelo, pilin, produce una respuesta inmune; sin embargo, muchas variantes antigónicas existen y continúan desarrollándose, que las vacunas contra la proteína pilosa no han sido altamente eficaces, Ver, Patente de E. U . No. 5,597, 572. En otros ejemplos, las vacunas se han enfocado ha proteína A de superficie Neisserial altamente conservada (NspA) (ver, por ejemplo, Publicación de PCT No. W096/29412). Aunque el gen se conserva altamente y expresa en virtualmente todas las cepas, ambos anticuerpos, policlonal y monoclonal , preparados contra NspA recombinante son bactericidales y/o proporcionan protección , contra solamente aproximadamente 50% de cepas genéticamente diversas (Moe et al., ( 1 999 I nfect. Immun . 67: 5664; Moe et al., Infect. Im mun . 2001 69:3762) . Estas observaciones sugieren que NspA recombinante solo no proporcionará protección adecuada contra un espectro amplio de cepas Neisserial. Aún otros grupos han utilizado preparaciones de membrana para inducir inmunidad. En general, los intentos para producir una vacuna B meningococal en base a las vesículas de membrana exterior utilizaron inmunizaciones repetidas con material preparado de una cepa única o inmunización repetida con una vacuna que contiene antígenos de vesícula de múltiples cepas. Cuando la vacuna contuvo antígenos de vesícula de más de una cepa, las concentraciones del anticuerpo bactericidal resultantes de infantes o niños dieras dos o tres dosis inferiores (Cartwright K et al. , 1 999, Vaccine; 17:2612-261 9; de Kleinjn ED et al. , 2000, Vaccine, 18: 1456- 1466) . En estos estudios, y en un estudio hecho en monos cinomolgus (Rouupe van der Voort ER, 2000, Vaccine, 18: 1334-1 343) existe también evidencia de interferencia inmune entre las respuestas al antígeno diferente. Cuando se utiliza inmunización repetida con vesículas de una cepa única, las concentraciones de anticuerpo más elevadas pero el espectro de reactividad de anticuerpo se limita a solamente unas pocas cepas que tienden a ser serológicamente similares entre sí (Tappero et al. , 1 999, JAMA 281 : 1520; y Rouupe van der Voort ER , 2000, Vaccine, 1 8: 1334- 1343). Nuestros experimentos en modelos animales de laboratorio, que se describen abajo confirmaron esta última observación. Los antisueros de animales de control dan dos inmunizaciones secuenciales de una vacuna de vesícula de membrana exterior preparada en el National Instituto of Public Health, Oslo, Noruega, de una cepa de serogrupo B de Neisseria meningitidis único, H44/76 (B: 15: P 1 .7, 16; "Vacuna Noruega", reaccionadas por citometría de flujo y fueron bactericidas contra solamente las cepas de subgrupo B que como lo fueron del mismo serosubtipo (es decir, P1 .7.16) o cepas que tienen un epítopo similar al epítopo P 1 . 16 (tal como cepas P1 .10-4) . Los humanos son el único receptor conocido de Neisseria meningitidis spp. De acuerdo con lo anterior, las especies de Neisseria han incluido una amplia variedad de estrategias altamente eficaces para evadir el sistema inmune humano. Estas incluyen la expresión de una cápsula de polisacárido que es cruzadamente reactiva con el ácido polisiálico huésped (es decir, serogrupo B) y mutabilidad antigénica elevada para los epítopos no capsulares inmunodominantes, es decir, epítopos de antígenos que están presentes en la superficie en cantidades relativamente grandes, son accesibles a anticuerpos, y producen una respuesta fuerte del anticuerpo. Los esfuerzos anteriores para desarrollar vacunas de espectro amplio se han dificultado por la amplia variedad de estrategias altamente eficaces utilizadas por especies de Neisseria para evadir el sistema inmune humano. Debido a estos antígenos, una respuesta inmune a una cepa dada con frecuencia no conferirá inmunidad eficaz contra otras cepas de Neisseria. La presente invención supera las desventajas de los planteamientos de la técnica anterior a vacunación y produce inmunidad protectora contra un amplio espectro de cepas de Neisseria meningitidis, notablemente (pero no exclusivamente) incluyendo cepas que pertenecen al serogrupo B.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA I NVENCIÓN La presente invención generalmente proporciona métodos y vacunas para la prevención de enfermedades causadas por bacteria Neisseria meningitidis, particularmente cepas de serogrupo B. En una modalidad , el método de la invención comprende: administrar a un mamífero una primer preparación de i) vesículas de membrana exterior (OMV) de una primer Neisseria meningitidis spp. , y ii) microvesículas (MV) liberadas en un medio de cultivo durante el cultivo de un primer Neisseria meningitidis spp. , dicha administración de OMV y/o MV siendo en una cantidad suficiente para preparar y/o producir ¡nmunológicamente una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha primer preparación; administrar al menos una segunda preparación de i) OMVs de una segunda Neisseria meningitidis spp. , y/o ii) MVs liberadas en un medio de cultivo durante el cultivo de un segundo Neisseria meningitidis spp. , dicha administración de OMV y/o V siendo en una cantidad suficiente para preparar y/o producir mmunológicamente una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha segunda preparación; y opcionalmente, pero preferentemente, administrar una tercer preparación de i) OMV de una tercer Neisseria meningitidis spp. , y/o ii) MV que se liberan en un medio de cultivo durante el cultivo de una tercer Neisseria meningitidis spp . , dicha administración de OMV y/o MV siendo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha tercer preparación. La administración de la primer, segunda y (opcionalmente) tercer preparación resulta en la inducción de una respuesta inmune a epítopos presentes en la preparaciones, en donde dicha respuesta confiere inmunidad protectora contra una enfermedad causada por Neisseria meningitidis spp. En modalidades preferidas, la primer, segunda y tercer cepa de Neisseria son genéticamente diversas entre sí, por ejemplo, la primer cepa es genéticamente diversa a la segunda cepa, la tercer cepa, o ambas, la segunda y tercer cepa. En modalidades relacionadas, la administración de las preparaciones es serial . La administración serial de las preparaciones puede conducirse en cualquier orden. Por ejemplo, los siguientes ordenes de administración se encuentran dentro del alcance de la invención (de izquierda a derecha, con la tercer administración siendo opcional) : OMV- OMV-OMV; OMV-OMV-MV; OMV-MV-MV; MV-MV-MV; V-MV-O V; MV-OMV-OMV; OMV-MV-O V; y MV-OMV-MV. Preferentemente, el orden de administración es MV-MV-OMV. En otras modalidades relacionadas, las preparaciones se administran como una mezcla, en donde la administración inicial de la mezcla puede seguirse por una a o más administraciones adicionales de la misma o diferente mezcla para servir como inyecciones de refuerzo. En una modalidad específica, la invención incluye administrar seriaimente microvesículas (MV) que forma burbujas naturalmente durante el crecimiento de Neisseria meningitidis y se liberan en el medio de cultivo (recolectado al separar las células más grandes de las burbujas más pequeñas y después forman en tabletas lar burbujas) y/o vesículas de membrana exterior (OMV, preparada directamente de fracciones de membrana exterior aisladas). OMVs y MVs se prepara de cepas "genéticamente diversas" de Neisseria meningitidis, por ejemplo, cepas que difieren de otra en al menos una de serotipo y serosubtipo, y pueden ser diversas en múltiples lugares genéticos, por ejemplo, difieren en tanto serotipo como serosubtipo, por ejemplo, teniendo diferentes proteínas Porin, PorA y PorB de membrana exterior. Además, las preparaciones de OMV y/o MV pueden darse secuencialmente en al menos dos, preferentemente al menos tres administraciones (por ejemplo, inyecciones) de OMVs o MVs de cepas genéticamente diversas; cuatro, cinco, seis o más administraciones también se contemplan. En otra modalidad específica, la primer Neisseria meningitidis spp. es un miembro de un segundo serosubtipo, tal segundo subserotipo es diferente del subserotiopo de la primer Neissería meningitidis spp, y, cuando se utiliza, la tercer Neissería meningitidis spp. es un miembro de un tercer serosubtipo, tal tercer serosubtipo es diferente del subserotipo de al menos la primer, y preferentemente ambas, primera y segunda, Neissería meningitidis spp. En todavía otra modalidad específica, la primer Neissería meningitidis spp. es un miembro de un primer serotipo y de un primer serosubtipo; la segunda Neissería meningitidis spp. es un miembro de un segundo serotipo y de un segundo serosubtipo, tal segundo serotipo y segundo subserotipo son diferentes del serotipo y subserotipo de la primer Neissería meningitidis spp, y, cuando se utiliza , la tercer Neissería meningitidis spp. es un miembro de u n tercer serotipo y de un tercer serosubtipo, tal tercer serotipo y tercer subserotipo son diferentes del serotipo y subserotipo de al menos la primer, y preferentemente ambas, primer y segunda, Neissería meningitidis spp. En una modalidad específica de la invención , una primer administración es con microvesículas (MVs) preparadas de una cepa de serogrupo C (por ejemplo, RM 1 090 (C:2a: P 1 .5,2 : L3, 7)) . La segunda administración es con MVs preparadas de una segunda cepa (por ejemplo, BZ1 98 (B: NT: P 1 .4)) , y la tercer administración es con vesículas de membrana exterior (OMVs) preparadas de una tercer cepa (por ejemplo, Z1092 (A:4,21 : P1 . 10)) . La inmunización secuencial con vesículas y/o microvesículas preparadas de cepas de Neissería meningitidis genéticamente diversas se refiere de aquí en adelante como la "vacuna CHORI" o "antígeno CHORI". La inmunización con una mezcla de la primer, segunda y tercer preparación de la vacuna CHOR se refiere como "mezcla CHORI". En otros aspectos, la invención comprende una composición que contiene una primer preparación seleccionada del grupo que consiste de vesícula de membrana exterior (OMV), microvesículas (MV), o ambas O V y MV de una primer especie de Neisseria meningitidis, una segunda preparación seleccionada del grupo que consiste de vesícula de membrana exterior (OMV), microvesículas (MV), o ambas, OMV y MV, de una segunda especie de Neisseria meningitidis, en donde la segunda Neisseria meningitidis es genéticamente diversa a la primer especie de Neisseria meningitidis; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En modalidades relacionadas, la composición comprende además una tercer preparación seleccionada del grupo que consiste de vesícula de membrana exterior (OMV), microvesículas (MV), o ambas, OMV y MV de una tercer especie de Neisseria meningitidis, en donde la tercer especie de Neisseria meningitidis es genéticamente diversa de la primer especie de Neisseria meningitidis. En modalidades específicas, la primer preparación de la composición comprende MV, la segunda preparación comprende MV; y la tercer preparación comprende OMV. Preferentemente, la primer y segunda especie de Neisseria meningitidis son genéticamente diversas en que difieren en al menos uno de serotipo o serosubtipo, y, en donde incluidas, la tercer y la primer especie de Neisseria meningitidis son genéticamente diversas en que difieren en al menos uno de serotipo o serosubtipo. En todavía otros aspectos, la invención comprende una composición que contiene al menos un antígeno de Neisseria meningitidis aislado, el antígeno aislado presentándose en la composición en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune en un huésped mamífero, y caracterizándose como una proteína inmunoprecipitada con anti-suero producido después de la vacunación con la vacuna CHORI , y teniendo una masa molecular aparente seleccionada del grupo que consiste de aproximadamente 80 kDa, aproximadamente 59.5 kDa, aproximadamente 40.7 kDa, aproximadamente 39.6 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 27.9 kDa, y 14.5 kDa; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención comprende una composición que contiene al menos un antígeno de Neisseria meningitidis aislado, el antígeno aislado estando presente en la composición en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune en un huésped mamífero, y caracterizándose como una proteína detectada por Western blot con anti-suero producido después de la vacunación de un mamífero con la vacuna CHORI , y teniendo una masa molecular aparente seleccionada del grupo que consiste de aproximadamente 53 kDa a 57 kDa; aproximadamente 46-47 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 20 kDa a 21 kDa; y aproximadamente 18 kDa; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención comprende una composición que contiene al menos un antígeno de Neisseria meningitidis aislado, el antígeno aislado estando presente en la composición en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune en un huésped mamífero, en donde el antígeno es de una proteína que se une específicamente a un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste de 1 D9, 4B1 1 , 9B8 y 14C7 (tales anticuerpos se describen en la presente y depositan con ATCC); y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En modalidades preferidas, las composiciones que tienen antígenos aislados comprenden al menos dos antígenos de Neissería meningitidis aislados. En aspectos relacionados, la invención comprende métodos para producir inmunidad protectora de espectro amplio contra una enfermedad causada por una especie de Neissería meningitidis, dicho método comprendiendo administrar a un mam ífero al menos una de las composiciones que comprenden antígenos aislados como se describe arriba. Preferentemente, las composiciones de antígeno (por ejemplo, preparaciones OMV/MV, preparaciones de proteína aisladas) pueden administrarse a mamíferos, especialmente humanos, que son inmunológicamente inocentes con respecto a Neissería meningitidis (es decir, no se han expuesto a antígenos de Neissería meningitidis, o no se han expuesto a cantidades insuficientes para producir una respuesta inmune protectora). Una modalidad específica de la invención incluye la administración a infantes humanos que son de aproximadamente cinco años o más pequeños, especialmente dos años o más pequeños. En algunas modalidades de la invención, antes de la administración de las composiciones de antígeno de Neiserría meningtidis, los individuos que se han preparado por exposición (a través de la administración o infección natural) a una especie Neisserial diferente a Neisseria meningitidis (o una composición de antígeno preparada de una especie Neisseriaf)- Los antisueros obtenidos de ratones inmunizados como se describe arriba se unen a la superficie celular bacteriana de un grupo de cepas de serogrupo B de Neisseria meningitidis genéticamente diversas, como se determina por la detección citométrica de flujo de inmunofluorescencia indirecta. En un ejemplo, los sueros de ratones inmunizados fueron positivos para once de 12 cepas probadas. Estas 1 1 incluyen 3 cepas meningococales B con proteínas PorA y PorB respectivas que fueron heterólogas a aquellas de las cepas meningococales utilizadas para preparar los inmunogenes utilizados para la vacunación. (A manera de contraste, los antisueros de animales inmunizados con dos inyecciones de la "vacuna OMV Noruega" arriba descrita se reaccionan por citometria de flujo con solamente 5 de 1 1 cepas. Todas las 5 tuvieron proteínas PorA y/o PorB que fueron las mismas o cercanamente relacionadas a aquellas en la vacuna OMV "Noruega") . Los antisueros de animales inmunizados con la "vacuna CHOR I" también produjeron bacteriolisis mediada por complemento en 1 1 de 12 cepas, un buen predictor de una protección contra la enfermedad en humanos (Goldschneider et al., 1 969, J . Exp. ed . 129: 1 307) . El anticuerpo que se une a la superficie de la célula bacteriana, o bacteriolisis mediada por complemento, no se inhibe por la presencia de polisacárido de serogrupo B soluble en exceso, evidencia de que los anticuerpos protectores se dirigen contra antígenos no capsulares. Los antisueros de ratones inmunizados en un segundo ejemplo utilizando la vacuna CHORI son bactericidas contra 14 de 14 cepas probadas incluyendo ocho cepas con serosubtipos que son heterólogos de aquellos utilizados en las preparaciones de vacuna. En un tercer ejemplo, los antisueros preparados de conejillos de Indias inmunizados con la vacuna CHOR I son bactericidas contra 9 de 10 cepas probadas incluyendo 5 cepas con serosubtipos que son heterólogos a aquellos expresados por las cepas de vacuna. Los antisueros a la vacuna CHORI preparados en ratones en el primer ejemplo y en conejillos de I ndias en el tercer ejemplos también son altamente protectores contra bacteremia en las ratas infantes preparadas con bacteria de serogrupo B. El procedimiento de inmunización utilizado en la presente generalmente induce el sistema inmune para converger en antígenos no capsulares que son comunes a las cepas de las cuales se obtienen MVs y OMVs. La vacuna CHOR I produce anticuerpos contra múltiples epítopos de superficie celular incluyendo, PorA, posiblemente PorB, y proteínas conservadas tales como proteína de superficie Neisserial A (NspA) , la proteína clase 4, (proteína modificable por reducción, Rmp) y otros antígenos no capsulares aún sin identificar. En general , las vacunas de la presente invención que emplean inmunización secuencial con material antigónico preparado de diferentes cepas (genéticamente diversas) tienen el potencial para conferir protección contra la mayoría de cepas de serogrupo B de Neisseria meningitidis. Este planteamiento también tiene amplia aplicabilidad para vacunación contra cepas de Neisseria meningitidis representativas de otros serogrupos tales como A, C, Y o W-1 35, y también contra otros miembros del género Neisseria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 resume los resultados de las pruebas de eficacia de la vacuna de la vesícula de membrana exterior meningococal. La figura 2 es una fotografía de un gel de 15% SDS-PAGE de microvesícula (MV), microvesícula extraída con deoxicolato (DOC MV), vesícula de membrana exterior (OMV), y preparaciones de vacuna de vesícula de membrana exterior extraída con deoxicolato (DOC OMV) de cepas meningococales Z1092 (A:4,21:P1.10), BZ198 (B:NT:P.1.4), y RM1090 (C:2a:P1.2), respectivamente. Vía 1, estándares de masa molecular. Vía 2, Z1092 MV. Vía 3, Z1092 DOC MV. Vía 4, Z1092 OMV. Vía 5, Z1092 DOC OMV. Vía 6, BZ198 MV. Vía 7, BZ198 DOC MV. Vía 8, BZ198 OMV. Vía 9, BZ198 DOC OMV. Vía 10, RM1090 MV. Vía 11, RM1090 DOC MV. Vía 12, RM1090 OMV. Vía 13, RM1090 DOC OMV. La Figura 3 es una serie de gráficas que muestran la unión de vacuna anti-CHORI, vacuna anti-Noruega y antisueros de control y mAb para cepas meningococales B encapsuladas vivas MC58 (B:15:P1.7, 16) y S3446 (B:19,14:P1.23,14), como se determina por citometría de flujo de fluorescencia indirecta. Todos los antisueros se prueban en diluciones de 1:20. mAb de control es un mAB de murino específico de la anti-cápsula (Granoff et al., 1998, J. immunol. 160:5028-5036). Los antisueros de control fueron sueros agrupados de ratones inmunizados con proteínas del cultivo sobrenadante de BL21 de la cepa de E. coli o conejillos de Indias inmunizados con el adyuvante, hidróxido de aluminio, sólo. Observe que la cepa MC58 tiene el mismo serotipo y serosubtipo como la cepa utilizada para preparar OMV para la vacuna Noruega. El serotipo y serosubtipo como la cepa utilizada para preparar O V para la vacuna Noruega. El serotipo y serosubtitpo de la cepa S3446 es heteróloga a las cepas utilizadas para preparar ambas vacunas. La Figura 4 presenta datos que consideran la unión de la superficie celular bacteriana de antisueros determinados por citometría de flujo de fluorescencia indirecta. La Figura 5 presenta datos que ilustran la reactividad de antisueros CHORI contra cepas de serogrupo A y C de N. meningitidís. La Figura 6 resume los resultados de un análisis bactericida que prueba los antisueros de vacuna anti-CHORI, anti-rNspA, y vacuna anti-Noruega contra cepa meningococal B 2996. La Figura 7 proporciona datos que muestran la actividad bactericida mediada por complemento de antisueros y anticuerpos. La Figura 8 proporciona datos que muestran la actividad bactericida mediada por complemento de antisueros de ratones inmunizados con las vacunas Indicadas. La Figura 9 proporciona datos que muestran la actividad bactericida de antisueros de conejillos de Indias inmunizados con las vacunas indicadas. La Figura 10 proporciona datos que muestran la protección pasiva en ratas infantes contra la bacteremia de la cepa meningococal B 8047 por antisueros y anticuerpos. La figura 11 proporciona datos que muestran la protección pasiva en ratas infantes contra bacteremia de la cepa meningococal B 8047 por antisueros de conejillos de Indias.

La figura 12 es una fotografía de un gel de plata coloreada de 1 5% SDS-PAGE de proteínas expuestas a superficie precipitadas por antisueros del antígeno anti-CHORI de cepa meningococal B M7. Vía 1 , proteína total de M7. Vía 2 , proteínas precipitadas por antisuero anti-CHORI de murino. Vía 3, proteínas precipitadas por antisueros de control negativo de murino. Los números a la izquierda de la figura indican masa molecular aparente en kDa. La Figura 13 es una fotografía de una Western blot de un gel de 15% SDS-PAGE de proteínas expuestas a superficie precipitadas por antisueros de antígeno anti-CHORI de cepa meningococal B M7 no encapsulada. Vías 1 y 4, proteína total de M7. Vías 2 y 5, proteínas precipitadas por antisueros de antígeno anti-CHOR I de murino. Vías 3 y 6, proteínas precipitadas por antisueros de control negativo de murino. Antisueros de antígeno anti-CHORI se utilizan como el anticuerpo de detección primario en vías 1 a 3 y N 16C13F4 mAb anti-PorA (Rijksinstituut Voor Volksgezondeid en Mileu, Biltoven, Países Bajos) que es específico para serosubtipo P1 .2 se utiliza como el anticuerpo de detección primaria en vías 4 a 5. La Figura 14 proporciona datos que muestran las proteínas accesibles de superficie bacteriana precipitadas por antisueros agrupados de ratones secuencialmente inmunizados con MV de cepa MenC RM 1090, MV de cepa MenB BZ198, y OMV de cepa MenA Z1092. La Figura 14A proporciona ejemplos adicionales de datos que muestran las proteínas accesibles de superficie bacteriana precipitadas por antisueros agrupados de ratones secuencialmente inmunizados con MV de cepa MenC RM1090, MV de cepa MenB BZ198, y OMV de cepa MenA Z 1092. La figura 15 es una fotografía de una Western blot de un gel de 15% SDS-PAGE de preparaciones MV u OMV. Los antisueros de detección primarios son antisueros de vacuna anti-CHOR I/C FA de ratón agrupados en vías 1 a 3, anti-CHORI/AI2(OP03)3 de ratón agrupado en vías 4 y 5, y anti-C HOR I//AI2(OP03)3 de conejillos de Indias en vías 6 a 8. Vías 1 y 6, proteínas MV preparadas de cepa RM 1090. Vías 2 , 7 y 7, proteínas MV preparadas de cepa BZ198. Vías 3, 5 y 8, proteínas OMV preparadas de cepa ?1 0T2. Los números a la izquierda de la figura indican masa molecular aparente en kDa. La Figura 16 proporciona datos que muestran las masas moleculares aparentes de proteínas de las preparaciones de OMV o MV indicadas que son reactivas con antisueros de ratones y conejillos de Indias que se inmunizan secuencialmente con MV de cepa MenC RM 1090 y cepa MenB Bz198, y OMV de cepa MenA Z1092. La Figura 1 7 proporciona datos de ELISA que muestran la absorción de anticuerpos anti-LOS de antisueros agrupados obtenidos de ratones y conejillos de I ndias secuencialmente inmunizados con MV de cepa MenC RM1090 y cepa MenB BZ198, y OMV de cepa MenA Z1090, o tres inyecciones de una mezcla de tres preparaciones de vesícula. La Figura 18 proporciona datos de análisis bactericidas mediado por complemento que muestra que la absorción de anticuerpos anti-LOS de antisueros agrupados obtenidos de ratones y conejillos de I ndias secuencialmente inmunizados con MV de cepa MenC RM 1090 y cepa MenB BZ198 y OMV de cepa MenA Z1092, o tres inyecciones de una mezcla de tres preparaciones de vesícula no cambian la actividad bactericida de los antisueros contra cepas MenB que son homólogas o heterólogas a las cepas de vacuna. La Figura 19 proporciona datos de una ELISA de célula completa que muestra ejemplos de mAbs producidas de ratones secuencialmente inmunizados con MV de cepa MecC RM1090 y cepa MenB BZ198 y OMV de cepa MenA Z1092. Varias mAbs son reactivas con todas las cepas meningococales probadas y otras reaccionan con un subconjunto de cepas limitado. La Figura 20 resume la actividad bactericida mediada por complemento de mAbs preparadas de ratones inmunizados con antígeno anti-CHORI y probadas contra varias cepas MenB. La Figura 21 resume el serotipo meningococal y serosubtipo que define anticuerpos monoclonales disponibles de RIVM. La Figura 22 resume el serogrupo, serotipo, y serosubtipo que define anticuerpos monoclonales disponibles de N I BSC. Antes de que la presente invención y modalidades ejemplificativas específicas de la invención se describan, debe entenderse que esta invención no se limita a modalidades particulares descritas, como tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir solamente modalidades particulares, y no se propone ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones anexas.

Cuando se proporciona un rango de valores, debe entenderse que cada valor que interviene, al décimo de la unidad del límite inferior al menos que el contexto dicte claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior del rango y cualquier otro valor que interviene o establecido en que el rango establecido se comprende dentro de la invención. Los limites, superior e inferior, de estos rangos más pequeños pueden incluirse independientemente en los rangos más pequeños y también pueden comprenderse dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango establecido. Cuando el rango establecido incluye uno o ambos de los límites, los rangos que excluyen cualquiera de ambos de estos límites también se incluyen en la invención. Al menos que se defina de otro modo, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por cualquiera de experiencia ordinaria en la materia a la cual pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en la presente también puede utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora. Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incorporan para referencia para describir y exponer los métodos y/o materiales en conexión con las publicaciones que se citan. Debe observarse que como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un(a)\ "y" y "el(la)" incluyen referencias plurales al menos que el contexto dicte claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un antfgeno" incluye una pluralidad de tales antígenos y referencia a "la vesícula" incluye referencia a una o más vesículas y equivalentes de las mismas conocidas por aquellos expertos en la materia, y así sucesivamente. Las publicaciones tratadas en la presente se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente debe construirse como una admisión de que la presente invención no se titula para preceder tal publicación en virtud de la técnica anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación actuales que pueden necesitarse que se confirmen independientemente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La inmunización de infantes, niños más grandes y adultos con vacunas de vesícula de membrana exterior meningococal (OMV) induce anticuerpos bactericidas de suero, un correlación serológica de protección contra enfermedad (Qoldschneider et al., 1969, J . Exp. Med. 129: 1 307). La eficacia de las vacunas OMV para la prevención de enfermedad meningococal B también se ha demostrado directamente en niños más grandes y adultos en pruebas clínicas prospecto, aleatorizadas, y en estudios de control de caso retrospectivo. Ver, por ejemplo, resultados resumidos en la sección de antecedentes y en la Figura 1 . De esta manera, la efectividad clínica de las vacunas de vesícula de membrana exterior no está en disputa . Tales vacuna son próximas a la licencia para su uso en Noruega en niños más grandes y adultos, y se encuentran en la última etapa de desarrollo clínico para su licencia en otros países Europeos. Una vacuna OMV preparada por el Instituto Finley en Cuba también se encuentra disponible comercialmente y se ha dado a millones de niños en Sudamórica. La respuesta del anticuerpo bactericida de suero a vacunas OMV tiende a ser específica de cepa (Tappero et ai, 1999, JAMA 281 : 1520; y Roupe van der Voort ER, 2000, Vaccine, 18: 1334-1343). PorA es inmunodominante, y la inmunidad inducida es predominantemente específica a las cepas de las cuales las vesículas de membrana se obtienen (Tappero at al., 1999, JAMA 281 : 1520; Martin S at al., 2000, Vaccine, 18:2476-2481 ). Esta limitación se debe principalmente a la variabilidad antigénica de la proteína PorA y es particularmente real en infantes quienes son inmunológicamente inocentes (Tappero et al.) con respecto a la exposición anterior a antígenos neisserial. Por lo tanto, la presente invención incluye producir una respuesta inmune que es ampliamente reactiva con diversas cepas de N. meningitidis que producen la enfermedad. La invención rodea el problema de inmunodominio de dominios antigénicamente variables de PorA en vacunas a base de PorA o vesícula al enfocar la respuesta del anticuerpo en antígenos comunes en las cepas de vacuna. De manera importante, los métodos de la invención producen anticuerpo bactericida de suero, el único serológico probado que correlaciona la protección en humanos (Goldschneider et al., 1969, supra), contra cepas de Naissaria que expresan epítopos de serosubtipo que no se utilizan en las preparaciones de vacuna. Además, el método produce anticuerpo bactericida de suero contra cepas que no se mueren por el anticuerpo a una proteína conservada tal como proteína A de superficie Neisserial , una vacuna meningococal candidato (Martin et al., 2000. J . Biotechnol . 83: 27-31 ; Moe et al., (1999 Infact. I mmun . 67:5664; Moe et al. , Infecí Immun, 2001 69:3762). Sin sujetarse a teoría, la vacuna y régimen de inmunización de la invención proporciona sus ventajas inesperadas en inmunidad protectora de espectro amplio al producir anticuerpos que son específicos tanto para antígenos no conservados como conservados. A. Definiciones El término "inmunidad protectora" significa que una vacuna q programa de inmunización que se administra a un mamífero induce una respuesta inmune que evita, retarda el desarrollo de, o reduce la severidad de una enfermedad que se causa por Neisseria meningitidis, o disminuye o elimina completamente los síntomas de la enfermedad. La frase "una enfermedad causada por una cepa de serogrupo B de Neisseria meningitidis" comprende cualquier síntoma clínico p combinación de síntomas clínicos que están presentes en una infección con un miembro de serogrupo B de Neisseria meningitidis. Estos síntomas incluyen pero no se limitan a: colonización del tracto respiratorio superior (por ejemplo, mucosa de la nasofaringe y amígdalas) por una cepa patogénica de serogrupo B de Neisseria meningitidis, penetración de las bacterias en la mucosa y el lecho vascular submucosal, septicemia, ataque séptico, inflamación , lesiones de la piel hemorrágicas, activación de fibrinolisis y de coagulación sanguínea, disfunción del órgano tal como riñón , pulmón, y falla cardiaca , hemorragia adrenal e infarto muscular, - - derrame capilar, edema isquemia del limbo periférico, síndrome del distrés respiratorio, pericarditis y meningitis. La frase "inmunidad protectora de espectro amplio" significa que una vacuna o programa de inmunización produce "inmunidad protectora" contra al menos uno o más (o contra al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, contra al menos ocho, o al menos contra más de ocho) cepas de Neisseria meningitidis, en donde cada una de las cepas pertenece a un serosubtipo diferente que las cepas utilizadas para preparar la vacuna. La invención contempla específicamente y comprende una vacuna o régimen de vacunación que confiere protección contra una enfermedad causada por un miembro de serogrupo B de Neisseria meningitidis y también contra serogrupos, particularmente serogrupos A, C, Y y W-135. La frase "se une específicamente a un anticuerpo" P "específicamente ¡nmunoreactivo con", cuando se refiere a un antígeno tal como un polisacárido, fosfolípido, proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que se basa en y/o es prueba de la presencia del antígeno en una muestra que también puede incluir una población heterogénea de otras moléculas. De esta manera, bajo condiciones de inmunoanálisis designadas, el anticuerpo específico o anticuerpos se une(n) a un antígeno particular o antígenos en una muestra y no se unen en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo tales condiciones puede requerir un anticuerpo o antisuero que se selecciona por su especificidad para un antígeno o antígenos particulares.

La frase "en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha preparación" significa Que existe una diferencia detectable entre un indicador de respuesta inmune medido antes y después de la administración de una preparación de antfgeno particular. Los indicadores de respuesta inmune incluyen pero no se limitan a: especificidad o concentración de anticuerpo, como se detecta por un análisis tal como un inmunoanálisis enlazado a enzima (ELISA), análisis bactericida, citpmetría de flujo, ¡nmunoprecipitación, inmunodifusión Outcher-Lowny; análisis de detección de unión de, por ejemplo, mancha, Western blot o conjuntos de antígenos; análisis de citotoxicidad , etc. Un "antígeno de superficie" es un antígeno que está presente en una estructura de superficie de Neisseria meningitidis (por ejemplo, la membrana exterior, membrana interior, espacio periplásmico, cápsula, pelos, etc.). La frase "genéticamente diversa" como se utiliza en el contexto de cepas genéticamente diversas de Neisseria meningitidis, se refiere a cepas que difieren entre sí en la secuencia de aminoácidos de al menos uno, y usualmente al menos dos, más usualmente al menos tres polipéptidos, particularmente polipéptidos antigénicos. La diversidad genética de cepas puede realizarse al seleccionar cepas que difieren en al menos uno o más, preferentemente al menos dos o más, de serogrupo, serotipo, o serosubtipo (por ejemplo, dos cepas que difieren en al menos una de las proteínas seleccionadas de membrana exterior, proteínas PorA y PorB, a decir son genéticamente diversas una respecto a la otra) . La diversidad genética también puede definirse por, por ejemplo, tipificación de secuencia de múltiples lugares y/o tipificación de enzima de múltiples lugares (ver, por ejemplo, Maiden et al. , 1 998, Proc. Nati. Acad. Se/'. USA 95:3140; Pizza et al., 2000 Science 287: 1816), efectroforesis de enzima de múltiples lugares, y otros métodos conocidos en la materia. "Serogrupo" como se utiliza en la presente se refiere a la clasificación de Neissería meningitidis en virtud de variaciones inmunológicamente detectables en el polisacárido capsular. Aproximadamente 12 serogrupos son conocidos: A, B, C, X, Y, Z, 29-E, W-135, H , I , K y L. Cualquier serogrupo puede comprender múltiples serotipos y múltiples serosubtipos . "Serotipo" como se utiliza en la presente se refiere a la clasificación de cepas de Neissería meningitidis en base a las diferencias antigénicas definidas por el anticuerpo monoclonal en la proteína de membrana exterior Porin B. Un serotipo único puede encontrarse en múltiples serogrupos y múltiples serosubtipos. "Serosubtipo" como se utiliza en la presente se refiere a la clasificación de cepas de Neissería meningitidis en base a las variaciones antigénicas definidas por el anticuerpo en una proteína de membrana exterior llamada Porin A, o en tipificación VR de secuencias de aminoácidos deducidas de secuenciación de ADN (Sacchi et al., 2000, J. Infecí. Dis. 182: 1 169, ver también el sitio web Multi Locus Sequence Typing) . Más variabilidad entre proteínas PorA ocurre en dos (ondas I y IV) de ocho ondas expuestas a superficie, putativas. Las ondas variables I y IV se han designado VR1 y VR2 , respectivamente. Un serosubtipo único puede encontrarse en múltiples serogrupos y múltiples serotipos. "Enriquecido" significa que un antígeno en una composición de antígeno se manipula por un experimentador o un médico de manera que está presante en al menos una concentración tres veces mayor por peso total, preferentemente al menos una concentración 10 veces mayor, más preferentemente al menos una concentración 100 veces mayor, y más preferentemente al menos una concentración 1 ,000 veces mayor que la concentración de que el antígeno en la cepa de la cual la composición de antígeno se obtiene. De esta manera , si la concentración de un antígeno particular es 1 microgramo por gramo de preparación bacterial total (o de proteína bacterial total), una preparación enriquecida contendría al menos 3 microgramos por gramo de preparación bacteriana total (p de proteína bacteriana total). ??? término "inmunológicamente inocente con respecto a Neisseria meningitidis" denota un individuo (por ejemplo, un mamífero tal como un paciente humano" que nunca se ha expue$tp (a través de infección o administración" a Neisseria meningitidis o a una composición de antígeno derivada de Neisseria meningitidis en cantidades suficientes para producir inmunidad protectora, o si se expone, falla en montar una respuesta inmune protectora. (Un ejemplo de lo último sería un individuo expuesto a una edad demasiado joven cuando las respuestas inmune protectoras no pueden ocurrir. Molages et al., 1994, Infect. Immun. 62:4419-4424), Además es deseable (pero no necesario) que el individuo no se ha expuesto a una especie de Neisseria diferente a Neisseria meningitidis (o una composición de antígeno preparada de una especie Neisserial), particularmente no a una cepa de reacción transversal de especies Neisserial (o al separar las células bacterianas del medio de cultivo (por ejemplo, por filtración o por una centrifugación de baja velocidad que forma en bolitas las células, o lo similar), lisar las células (por ejemplo, por la adición de detergente, ataque osmótico, sonicación, cavitación, o lo similar) y separar una fracción de membrana exterior de moléculas citoplásmicas (por ejemplo, por filtración; o por precipitación diferencial p agregación de membranas exteriores y/0 vesículas de membrana exterior, o por métodos de separación de afinidad utilizando ligandos que reconocen específicamente moléculas de membrana exterior; o por una centrifugación de velocidad elevada que forma en bolitas las membranas exteriores y/o vesículas de membrana exterior, o lo similar); fracciones de membrana exterior pueden utilizarse para producir OMVs. En la producción de MVs u OMVs, puede ser preferible para utilizar cepas que son productores relativamente bajos de endotoxina (lipopolisacárido, LPS) para reducir la necesidad de remover endotoxina de la preparación final antes de utilizarse en humanos. Por ejemplo, OMV y/o MV puede prepararse de mu tan tes de estas cepas de Neisseria en las cuales el lipooligosacárido u otros antígenos que pueden ser indeseables en vacuna (por ejemplo, Rmp) se reduce P elimina. Cuando se desee (por ejemplo, en donde las cepas utilizadas para producir MVs u OMVs se asocian con exotoxina o niveles elevados particulares de endotoxina), las MVs u OMVs se tratan opcionalmente para reducir endotoxina, por ejemplo, para reducir toxicidad después de la administración. La reducción de endotoxina puede realizarse por la extracción con un detergente adecuado (por ejemplo, BR IJ-96, deoxicolato de sodio, lauoilsarcosinato de sodio, Empigen B8, Tritón X- 100, TWEEN 20 (polioxietileno de monolaurato de sorbitan) , TWEEN 80, a una concentración de 0. 1 - 10%, preferentemente 0.5-2%). Cuando se utiliza extracción de detergente, es preferible utilizar un detergente diferente a deoxicolato. La extracción de preparaciones de OMV y MV con deoxicolato resultó en el retiro de algunos antígenos de proteína no capsular (ver Figura 2). Vacunación de animales con preparaciones de QMV Q MV sujetas a extracción de deoxicolato produjo una respuesta inmune que se asocia con concentraciones inferiores de anticuerpos bactericidas en comparación con la vacunación con material extraído sin deoxicolato. Además de MVs u QMVs, los antígenos aislados o combinaciones particulares de antígenos pueden utilizarse para inducir una respuesta inmune protectora. La identidad de los antígenos aislados o combinaciones de antígenos se describen abajo. Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno, así como también cualquier otro componente compatible, según se necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz" se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única 0 como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varia dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratarse, edad, el grupo taxonómico o individuo a tratarse (por ejemplo, primate no humano, primate, etc. ) , la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos , el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración del módico tratante de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un rango relativamente amplio que puede determinarse a través de pruebas de rutina. El tratamiento de dosis puede ser un programa de dosis única P un programa de múltiples dosis (por ejemplo, incluyendo dosis de inyección de refuerzo). La vacuna puede administrarse junto con otro? agentes ¡nmunoreguladores. Las composiciones de antígeno o antígenos individuales a administrarse se proporcionan en una solución farmacéuticamente aceptable tal como una solución acuosa, con frecuencia una solución salina, o que puede proporcionarse en forma de polvo. Las composiciones también pueden incluir un adyuvante. Ejemplos de adyuvantes adecuados conocidos que pueden utilizarse en humanos incluyen, pero no necesariamente se limitan a, alum, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, MF59 (4.3% p/v de escualeno, 0.5% p/v de Tween 80, 0.5% p/v de Span 85), ácido nucleico que contiene CpG (en donde la citosina no se metila), QS21 , MPL, 3DMPL, extractos de Aquilla, ISCO S, mutantes LT/CT, micropartículas poli(D, L-láctido-co-glucolido) (PLG), Quil A, interleuquinas, y lo similar. Para animales experimentales, uno puede utilizar Freund's, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 1 1637, referida como norial DO), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminii-L-alanina-2-(1 '-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, referida como MTP-PE), y RIBI , que contiene tres componentes extraídos de bacterias, lípido A de monofosforilo, dimicolato de trehalosa y estructura de la pared celular (M PL+TDM+CWS) en una emulsión de 2% de escualeno/Tween 80. La efectividad de un adyuvante puede determinarse al medir la cantidad de anticuerpos dirigidos contra el antígeno inmunogénico. Además, los adyuvantes ejemplificativos para aumentar la efectividad de la composición incluyen, pero no se limitan a: ( 1 ) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como péptidos de muramilo (ver abajo) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) M F59™ (WQ 90/14837; Capítulo 10 en Vaccim? design: the subunlt and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995) , que contiene 5% de Escualeno, 0.5% de Tween 80 y 0.5% de Span 85 (opcionalmente conteniendo MTP- P E) formulada en partículas de submicron utilizando un microfluidizador, (b) SA F, que contiena 1 0% de Escualeno, 0.4% de Tween 80, 5% de polímero bloqueado plurónico L121 , y thr-MDP ya sea microfluidizado en una emulsión de submicron p en vórtice para generar una emulsión de tamaño de partícula más larga, y (c) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene 2% de Escualeno, 0.2% de Tween 80, y uno o más componentes de la pared celular bacteriana tal como monofosfolípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y la estructura de la pared celular (CWS), preferentemente M PL + CWS (Qetox™); (2) adyuvantes de saponina, tales como QS21 o Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) puede utilizarse o partículas generadas del mismo tales como ISCOMs (complejos imunoestimuladores) , tales ISCOMS pueden estar exentos de detergente adicional, por ejemplo, WO 00/07621; (3) Adyuvante de Freund Completo (CFA) y Adyuvante de Freund Incompleto (IFA); (4) citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2-, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (WO 99/44636), etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor que estimula la colonia de macrófago (M-CSF), factor de necrosis de tumor (TNF), etc., (5) lípido A de monofosforilo (MPL) o MPL de 3-O-deacilado (3dMPL), por ejemplo, GB-2220221, EP-A-0689454, opcionalmente en la ausencia substancial de alum cuando se utiliza con sacáridos neumococales, por ejemplo, WO 00/56358; (6) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua, por ejemplo, EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-076 231 ; (7) oligonucleótidos que comprenden motivos CpG [Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr opin Mol Ther 2001 3:15-24; Román et al., Nat. 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Immunoi, 1998, 160, 4755-4761; y Yi et al., J Immunoi, 1996, 160, 5898-5906; solicitudes de patente internacional WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/1 881 0, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 y WO 98/52581 ] es decir, que contiene al menos un dinucleótido CG, en donde ( citosina no se metila; (8) un éter de polioxietileno o un óster de polioxietileno, por ejemplo, WO 99/52549; (9) un surfactante de éster de sorbitan de polioxietileno en combinación con un octoxinol (WO 01 /21207) o un surfactante de éster o éter de alquilo de polioxietileno en combinación con al menos un surfactante no iónico adicional tal como octoxinol (WO 01 /21 1 52), (10) una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido CpG) (WO 00/62800) ; (1 1 ) un inmunoestimulador y una partícula de sal metálica, por ejemplo, WO 00/23105; (12) una saponina y una emulsión de aceite en agua, por ejemplo, WQ 99/1 1241 ; (13) una saponina (por ejemplo, QS21 ) + 3Dmpl + I M2 (opcionalmente + un esterol) , por ejemplo, WO 98/57659; (14) otras substancias que actúan como agentes inmunoestimuladores para aumentar la eficacia de la composición . Los péptidos de muramilo incluyendo N-acetil-muramil-L-trepnil-P-isoglutamina (thr-MQP), N-25 acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamuina (nor-MDP) , N-acetilmurami l-L-alanil-D-isoglutarninil-L-alanina-2-(1 '-2'-dipalmitoil-sn-gl¡cero-3-h¡droxifosforiloxi)-etilarnina TP-PE) , etc. Los antfgenos pueden combinarse con excipientes convencionales, tales como grados farmacéuticos de manitol , lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, magnesio, carbonato y lo similar. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiere para aproximar condiciones fisiológicas tales como - -agentes reguladores y ajustadores de pH, agentes ajustadores de toxicidad y lo similar, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y lo similar. La concentración de antígeno en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente en base a volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y lo similar de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente. Las composiciones resultantes pueden encontrarse en la forma de una solución, suspensión, tableta, pildora, cápsula, polvo, gel, crema, loción, pomada, aerosol y lo similar. La concentración de antígenos inmunogónicos de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0.1 %, usualmente en o al menos aproximadamente 2% a tanto como 20% a 50% o más en peso, y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc. , de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. 2. Inmunización Las MVs, OMVs, antígenos aislados, o combinaciones de antígenos de la presente invención se administran oralmente, nasalmente, nasofaringealmente, parenteralmente, entéricamente, gástricamente, tópicamente, transdérmicamente, subcutáneamente, intramuscularmente, en forma de tableta, sólida, en polvo, líquida, aerosol, Ipcalmente p sistémicamente, con o sin excipientes agregados. Los métodos actuales para preparar composiciones parenteralmente administrables se conocerán o serán aparentes para aquellos expertos en la materia y se describen en más detalle en tales publicaciones como Remington's Pharmaceutical Science, 1 5th ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania ( 1980) , La administración de las MVs, OMVs, antígenos aislados, o combinaciones de antígenos puede realizarse serialmente o como una mezcla , como se describe en más detalle abajo. Se reconoce que los polipéptidos y compuestos relacionados descritos arriba, cuando se administran oralmente, deben protegerse de digestión. Esto se realiza típicamente ya sea formar un compuesto con la proteína y la composición para volverlo resistente a hidrólisis enzimática o ácida o al empacar la proteína en un vehículo apropiadamente resistente tal como una liposoma. Medios para proteger proteínas de digestión son conocidos en la materia. Con objeto de aumentar la vida media del suero, las preparaciones antigénicas que se inyectan pueden también encapsulares, introducirse en el lumen de liposomas, prepararse como un coloide, u otras técnicas convencionales pueden emplearse que proporcionan una vida de suero extendida de los péptidos . Una variedad de métodos se encuentran disponibles para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1 980) , Patentes de E. U . Nos. 4,235,871 , 4, 501 ,728 y 4, 837,028. Las preparaciones también pueden proporcionarse en formas de liberación lenta o liberación controlada para la liberación y administración de las preparaciones de antígeno como una mezcla o modo serial . Las composiciones se administran a un animal que se encuentra en riesgo de adquirir una enfermedad Neisserial para prevenir o al menos detener parcialmente el desarrollo de enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para uso terapéutico dependerán, por ejemplo, de la composición del antígeno, la manera de administración, el peso y el estado general de salud del paciente, y el juicio del médico que prescribe. Las dosis únicas o múltiples de las composiciones de antígeno pueden administrarse dependiendo de la dosis y frecuencia requerida y tolerada por el paciente, y vía de administración. En modalidades particulares, las composiciones de antígeno descritas en la presente se administran serialmente. Primero, una dosis terapéuticamente eficaz de una primer composición de antígeno (por ejemplo, MV, OMV, antígeno aislado, o combinaciones de antígenos, con o sin excipientes) preparada de una primer cepa Noisserial se administra a un individuo. La primer composición antigénica se administra generalmente en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune (por ejemplo, activación de células T y/o B). Las cantidades para la inmunización inicial generalmente varían desde aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 1 .0 mg por 70 kilogramos del paciente, más comúnmente desde aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 0.2 mg por 70 kilogramos del paciente. Las dosis de 0.001 hasta aproximadamente 10 mg por paciente por día deben utilizarse, particularmente cuando el antígeno se administra a un sitio apartado y no en la corriente sanguíneo, tal como en una cavidad corporal o en un lumen de un órgano. Substancialmente, dosis más elevadas (por ejemplo, 10 a 1 00 mg o más) son posibles en administración oral, nasal o tópica. Después de la administración de la primer composición de antígeno, una dosis terapéuticamente eficaz de una segunda composición de antígeno (por ejemplo, MV, OMV, antígeno asilado, o combinaciones de antígenos, con o sin excipientes) preparada de una segunda cepa Neisserial se administra a un individuo después de que el individuo se ha preparado inmunológicamente por exposición a la primer composición de antígeno. La inyección de refuerzo puede administrarse días, semanas o meses después de la inmunización inicial, dependiendo de la condición y respuesta del paciente. La existencia de una respuesta inmune a la primer composición de antígeno puede determinarse por métodos conocidos (por ejemplo, al obtener suero del individuo antes y después de la inmunización inicial , y demostrando un cambio en el estado inmune del individuo, por ejemplo, un análisis de inmunoprecipitación , o una ELISA , o un análisis bactericida, o una Western blot, o análisis citométrico de flujo, o lo similar) y/o demostrando que la magnitud de la respuesta inmune a la segunda inyección es más elevada que aquella de los animales de control inmunizados para el primer momento con la composición de materia utilizada para la segunda inyección (por ejemplo, preparación inmunológica). La preparación inmunológica y/o la existencia de una respuesta inmune a la primer composición de antígeno también puede asumirse al esperar un periodo de tiempo después de la primer inmunización que, en base a experiencia previa, es un tiempo suficiente para que una respuesta inmune y/o preparación tenga lugar, por ejemplo, 2 , 4, 6, 1 0 ó 14 semanas. Las dosis de inyección de refuerzo de la segunda composición de antígeno son típicamente desde aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 1 .0 mg de antígeno, dependiendo de la naturaleza del inmunogen y vía de inmunización. En ciertas modalidades preferidas, una dosis terapéuticamente eficaz de una tercer composición de antígeno de una tercer cepa Neisserial se administra a un individuo después de que el individuo se ha preparado y/o montado una respuesta inmune a la segunda composición de antígeno. La tercer inyección de refuerzo puede administrarse días, semanas o meses después de la segunda inmunización, dependiendo de la condición y respuesta del paciente. La existencia de preparación y/o una respuesta inmune a la segunda composición de antígeno puede determinarse por los mismos métodos utilizados para detectar una respuesta inmune a la segunda composición de antígeno. La existencia de preparación y/o una repuesta inmune a la segunda composición de antígeno puede también asumirse al esperar por un periodo de tiempo después de la segunda inmunización que, en base a la experiencia previa, es un tiempo suficiente para que una respuesta inmune y/o preparación tenga lugar, por ejemplo, 2, 4, 6, 10 ó 14 semanas. Las dosis de inyección de refuerzo de la segunda composición de antígeno son típicamente desde aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 1.0 mg de antígeno, dependiendo de la naturaleza del inmunogen y vía de inmunización. La presente invención contempla además el uso de una cuarta, quinta, sexta o más inmunización de inyección de refuerzo, utilizando ya sea una cuarta, quinta o sexta cepa de Neisseria meningitidis o cualquiera de las primeras, segunda, o tercer cepa, u otra cepa que es genéticamente diversa con respecto a al menos una primer, segunda y tercer cepa. Cuando la administración de composiciones antigénicas preparadas de la primer, segunda y (opcionalmente, pero preferentemente) tercer cepa es serial, el orden de administración de la composición puede variarse. Por ejemplo, el orden de administración de OMV y/o MV dentro de estas etapas de administración serial puede variarse. Por ejemplo, los siguientes ordenes de administración se encuentran dentro del alcance de la invención (de izquierda a derecha, con la tercer administración siendo opcional): OMV-O V-OMV; O V-OMV-MV; O V-MV-MV; MV- V-MV; MV- V-OMV; MV-OMV-OMV; OMV-MV-OMV; y MV-OMV-MV. Preferentemente, el orden de administración es MV-MV-OMV. En otras modalidades, la primer, segunda y (opcionalmente) tercer composición de antígeno se administran como una mezcla. En modalidades relacionadas, la primer y segunda composición de antígeno se administran como una mezcla, y la tercer composición de antígeno se administra subsecuentemente. Las mezclas se administran en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune, particularmente una respuesta inmune humoral, en el huésped. Las cantidades para la inmunización de la mezcla generalmente varían desde aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 1 .0 mg por 70 kilogramos del paciente, más comúnmente desde aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 0.2 mg por 70 kilogramos del paciente. Las dosis de 0.001 hasta aproximadamente 10 mg por paciente por día pueden utilizarse, por ejemplo, cuando el antígeno se administra a un sitio apartado y no en la corriente sanguínea, tal como en una cavidad corporal o en un lumen de un órgano. Las dosis substancialmente más elevadas (por ejemplo, 1 0 a 100 mg o más) son posibles en administración oral , nasal o tópica. La administración inicial de la mezcla puede seguirse por inmunización de inyección de refuerzo de la misma o diferente mezcla, con al menos una inyección de refuerzo, más usualmente dos inyecciones de refuerzo, prefiriéndose. En ciertas modalidades preferidas, la primer y segunda cepa Neisseríal, son genéticamente diversas entre sí, por ejemplo, las cepas pertenecen a diferentes serotipos PorB y/o serosubtipos PorA; y también pueden pertenecer opcionalmente a diferentes serogrupos capsulares. Además, la segunda y tercer cepa Neisseríal son genéticamente diversas entre sí, por ejemplo, las cepas pertenecen a diferentes serotipos y/o serosubtipo; también pueden pertenecer opcionalmente a diferentes serogrupos. La tercer cepa Neisseríal preferentemente es genéticamente diversa con respecto a la primer y segunda cepa , pero puede, en algunas modalidades, no ser genéticamente diversa con respecto a la primer cepa. Por ejemplo, el serotipo y/o serosubtipo de la tercer cepa Neisseríal debe ser preferentemente diferente de la primer y segunda cepa pero puede ser la misma que la primer cepa. La presente invención también contempla específicamente que las composiciones de antígeno de otros miembros del género Neisseria pueden administrarse como se describe en la presente para generar inmunidad protectora contra Neisseria meningitidis. Por ejemplo, Neisseria lactamica, un miembro comensal no encapsulado no patogénico del género Neisseria que se encuentra comúnmente en la nasofaringe humana , comprende cepas que tienen muchos antlgenos presentes en N. meningitidis y, por lo tanto, también puede utilizarse para preparar uno de los inmunogenes comprendidos en esta invención. De esta manera, MVs u OMVs de la Neisseria lactamica no patogénica puede utilizarse para preparar o producir una respuesta inmune protectora contra Neisseria meningitidis (o contra otra Neisseria patogénica tal como Neisseria gonorrhea). Esto puede realizarse al administrar inicialmente una composición de antígeno (por ejemplo, MV u OMV) de Neisseria lactamica, seguida al administrar una segunda y opcionalmente una tercer composición de antígeno de Neisseria meningitidis (o Neisseria gonorrhea). La invención contempla específicamente también que las composiciones de antígeno de cepas de Neisseria lactamica se utilicen para la administración inicial, segunda y cualquier subsecuente, en donde cada cepa de lactamica tiene un serotipo y/o serosubtipo diferente que los otros. La invención también contempla que las composiciones de antígeno utilizadas en cualquier etapa en el procedimiento de inmunización pueden obtenerse de una o más cepas de bacterias (especialmente Neisseria lactamica o Neisseria meningitidis) que se forman genéticamente por métodos conocidos (ver, por ejemplo, Pat. de E. U. No. 6,013,267) para expresar uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más moléculas de interés, particularmente moléculas que producen o mejora una respuesta inmune protectora. Los ácidos nucleicos puede, por ejemplo, codificar Porin A, Porin B, NspA, pilin u otras proteínas Neisserial. Otros ácidos nucleicos ejemplificativos incluyen aquellos que codifican proteínas Neisserial inmunoprecipitadas con anti-sueros producidos después de la vacunación con la vacuna CHORI , particularmente aquellas proteínas que tienen masas moleculares aparentes de aproximadamente 80 kDa, aproximadamente 59.5 kDa, aproximadamente 40.7 kDa, aproximadamente 39.6 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 27.9 kDa, y 14.5 kDa, o fragmentos antigónicos de los mismos. Los ácidos nucleicos ejemplificativos, adicionales incluyen aquellos que codifican las proteínas Neisserial detectadas por Western blot con anti-sueros productos después de la vacunación con la vacuna CHOR I , particularmente aquellas proteínas que tienen masas moleculares aparentes de aproximadamente 53 kDa-57 kDa; aproximadamente 46-47 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 20 kDa a 21 kDa; y aproximadamente 18 kDa. Los ácidos nucleicos pueden codificar cualquiera de las proteínas anteriores que se trunca, o altera para incluir o eli minar un sitio de glucosilación , o para incluir o eliminar cualquier epítopo, o para incrementar la expresión de cualquiera de las proteínas anteriores. De particular interés son los fragmentos antigénicos de tales proteínas. Además, las composiciones de antígeno de la invención pueden comprender antígenos adicionales de N. meningitidis tales como aquellos ejemplificados en las publicaciones de PCT Nos. WO 99/24578, WO 99/36544; WO 99/57280, WO 00/22430 y WO 00/66791 , así como también fragmentos antigónicos de tales proteínas. Un aspecto importante de la presente invención es que las composiciones de antígeno utilizadas para preparar e cargar una inmunidad protectora amplia contra Neisseria meningitidis se preparan de cepas de Neisseria que poseen antígenos inmunodominantes variantes (los antígenos principales que se detectan rutinariamente por antisueros de diferentes animales huésped que se han infectado con Neisseria; ejemplos representativos incluyen Porin A , Porin B, pilin , NspA etc.). En los ejemplos descritos en la sección de Ejemplos de abajo, las cepas pueden variar con respecto a ya sea PorA o PorB, como se evidencia por su serotipo o serosubtipo. Las cepas también pueden variar con respecto a la molécula de cápsula , como se refleja por su serogrupo. La clasificación de serosubtipo y serotipo se determina actualmente al detectar cual de un panel de monoclonales conocidos, que se conocen por reconocer moléculas de Porin específicas, se une a una cepa desconocida (Sacchi ef al., 1 998, Clin. Diag. Lab. Immunol. 5:348, ver Tablas 8 y 9 para listas parciales de monoclonales) . Es probable que otros monoclonales se identifiquen. El uso de cualquier serotipo o serosubtipo que puede definirse por cualquier monoclonal nuevo se contempla específicamente por la invención. Además, los serotipos y serosubtipos pueden definirse, no solamente por la interacción con anticuerpos monoclonales, sino que también estructuralmente por la ausencia y/o presencia de residuos de péptido definidos y epítopos de péptido (Sacchi eí al, , 2000, J. Infect. Dis. 182: 1 169) . Los esquemas de clasificación se serosubtipo y serotipo que se basan en características estructurales de las Porinas (conocidas o que pueden descubrirse en una fecha posterior) se comprenden específicamente por la invención . Un propósito y efecto de administración serial de composiciones de antígeno de diferentes cepas es potenciar una respuesta inmune a antígenos y epítopos que son típicamente no inmunodominantes, particularmente epítopos no inmunodominantes que muestran menos variabilidad genética que los epítopos inmunodominantes conocidos. La invención comprende específicamente la administración serial de composiciones de antígeno de cepas Neisserial que difieren con respecto a los antígenos inmunodominantes diferentes a Porinas (por ejemplo, fosfolípidos, polisacáridos, lipopolisacaridos, pilinas, OmpA, Opa, Opc, etc.). Las composiciones de antígeno se administran típicamente a un mamífero que es inmunológicamente inocente con respecto a Neisseria meningitidis. En una modalidad particular, el mamífero es un niño humano aproximadamente de cinco años o más joven, y preferentemente de aproximadamente dos años o más joven, y las composiciones de antígeno se administran en cualquiera o más de los siguientes tiempos: dos semanas, un mes, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 1 1 meses, o un año o 15, 18 ó 21 meses después del nacimiento, o a los 2, 3, 4 ó 5 años de edad. En general, la administración a cualquier mamífero se inicia preferentemente antes de la primer señal de síntomas de enfermedad, o en la primer señal de exposición actual o posible a Neisseria. Cuando los péptidos inmunogénicos particulares que dan origen a inmunidad protectora se identifican como se describe arriba y abajo, estos antígenos pueden administrarse directamente en lugar de MVs u OMVs. Cuando los antígenos identificados son péptidos, el ADN que codifica uno o más de los péptidos de la invención también pueden administrarse al paciente. Este planteamiento se describe, por ejemplo, en Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990) , así como también las Patentes de E. U. Nos. 5,580,859 y 5,589,466. 3. Detección de antígenos inmunogénicos Las fracciones subcelulares tales como MVs y OMVs contienen muchos antígenos que pueden dar origen a una respuesta inmune (ver, por ejemplo, Figura 2 que representa un gel electroforótico de varias tales fracciones) . Sin embargo, no cada antígeno en una preparación puede producir ya sea una respuesta humoral o inmunidad protectora contra una enfermedad causada por una Neisseria meningitidis spp. De esta manera, la presente invención también se refiere a antígenos individuales y/o combinaciones de antígenos que inducen inmunidad protectora. Otro objetivo es utilizar los antígenos identificados para formular las composiciones de antígeno que pueden utilizarse para producir inmunidad protectora contra una enfermedad por Neisseria. Los antisueros o mAbs se obtienen o producen de mamíferos que se inducen por los métodos de la presente invención para exhibir inmunidad protectora contra un enfermedad causada por una Neisseria meningitidis spp. Los antisueros o mAbs se utilizan para detectar sus antígenos Neisseria correspondientes, y estos antígenos identificados y aislados en base a sus propiedades fisicoquímicas (clase de molécula: péptido, ácido nucleico, etc. ; masa molecular, carga, composición química, etc) o secuencia de aminoácidos. Los antígenos aislados (o porciones inmunológicamente eficaces de los mismos) pueden administrarse entonces a mamíferos, solos y/o en combinación) para valorar el grado al cual inducen inmunidad protectora. La presente invención contempla específicamente administrar serialmente antígenos aislados de una cepa o diferentes cepas de Neisseria, o administrar tales antígenos en una mezcla que comprende uno o más, usualmente dos o más , más usualmente res o más, aún más usualmente cuatro a seis o más antígenos. Los antígenos Neisserial ejemplificativos adecuados para su administración como se describe pueden incluir, pero no necesariamente limitarse a aquellas proteínas inmunoprecipitadas con anti-sueros producidos después de la vacunación con la vacuna CHORI , particularmente aquellas proteínas que tienen masas moleculares aparentes de aproximadamente 80 kDa , aproximadamente 59.5 kDa, aproximadamente 40.7 kDa, aproximadamente 39.6 kDa , aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 27.9 kDa, y 14.5 kDa , o fragmentos antigónicos de los mismos. Los antígenos administrados pueden incluir al menos uno de estos antígenos, o pueden incluir una combinación de estos antígenos (por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o más) . Antígenos Neisseríal ejemplificativos, adicionales adecuados para su administración como se describe pueden incluir, pero no necesariamente limitarse a aquellas proteínas detectadas por Western blot con anti-sueros producidos después de la vacunación con la vacuna CHOR I , particularmente aquellas proteínas que tienen masas moleculares aparentes de aproximadamente 53 kDa-57 kDa ; aproximadamente 46-47 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 20 kDa a 21 kDa; y aproximadamente 18 kDa, o fragmentos antigónicos de los mismos. Los antígenos administrados pueden incluir al menos uno de estos antígenos, o pueden incluir una combinación de estos antígenos (por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o más). Debe observarse que las referencias hechas a masas moleculares de proteínas se refieren a masa molecular aparente como se determina por SDS-PAGE bajo las condiciones descritas. Debe ser fácilmente aparente para el experto en la materia en la consideración de la presente especificación que estas masas moleculares aparentes pueden variar para la misma proteína entre dos diferentes experimentos (por ejemplo, utilizando diferentes geles o diferentes preparaciones, cuando se aislan de dos cepas diferentes (por ejemplo, debido a polimorfismos entre cepas debido a substituciones de aminoácidos, eliminaciones y/o inserciones, modificaciones post-translacionales, y lo similar)) y además que diferentes proteínas pueden parecer tener la misma masa molecular aparente. Los antígenos que producen inmunidad protectora se detectan por métodos conocidos: por ejemplo, inmunoanálisis, inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad, Western blots, etc. Ejemplos de tales métodos se describen abajo. (a) Detección de Antígenos por Inmunoanálisis Una variedad de formatos de inmunoanálisis se utilizan para caracterizar antisueros y anticuerpos específicamente inmunoreactivos con un antígeno particular o composición antigénica, y también para medir la intensidad de una respuesta inmune a un antígeno particular o composición antigénica. La primer etapa es producir generalmente antisuero o una preparación de anticuerpo que se une al antígeno o composición antigénica. (1 ) Producción de Antisueros Inmunes y Anticuerpos Monoclonales o Policlonales Específicos Los métodos para producir anticuerpos monoclonales y policlonales utilizados en estos análisis se conocen por aquellos de experiencia en la materia. Ver, por ejemplo, Coligan (1 991 ), CU RRENT PROTOCOLS IN IMM UNOLOGY, Wiley/Greene , NY; y Harlow and Lañe ( 1989), ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, NY; Stites ef al., (eds.) 1997 MEDICAL I MMU NOLOGY 9th ed. McG raw-H ill Professional Publishing, Nueva York, NY, y referencias citadas en la presente; Goding (1986), MONOCLONAL ANTI BODI ES: PRI NC I PLES AN D PRACTICE (2d ed. ) Academic Press, Nueva York, NY; y Kohler and Milstein ( 1975), Natura, 256: 495-497. Por ejemplo, con objeto de producir antisueros para utilizarse en un inmunoanálisis, una composición que contiene antígenos de Naissaría maningitidis spp, se da sola o mezclada con un adyuvante y se inyecta en un animal de elección (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, puerco, cabra, vaca, caballo, pollo, etc. ) de acuerdo a cualquier procedimiento descrito en la presente. La respuesta inmune del animal a la preparación de inmunogen se monitorea al tomar sangrados prueba y determinar la concentración de reactividad de alícuotas serialmente diluidas de suero a alícuotas serialmente diluidas de la composición antigénica . Los antisueros policlonales con una concentración de 1 0 o mayor se seleccionan y prueba para su reactividad transversal contra controles no inmunogénicos, utilizando un inmunoanálisis de unión competitivo. Los anticuerpos policlonales o monoclolanes y antisueros usualmente se unirán con una constante de disociación (KD) de al menos aproximadamente 0.1 m M , más usualmente al menos aproximadamente 1 µ?, preferentemente al - S menos aproximadamente 0.1 µ o mejor, y más preferentemente, .01 µ? o mejor. (2) Anticuerpos monoclonales En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de varios huéspedes mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. La descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se encuentra en , por ejemplo, Stites ef al. , Supra, y las referencias citadas en la presente; Harlo and Lañe, Supra; Goding Supra. , y Kohler and Milstein . Supra. Resumido brevemente, este método procede al inyectar a un animal con una preparación inmunogénica. El animal se sacrifica entonces y las células se toman de su bazo, que se fusiona con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. La población de hibridomas se selecciona entonces para aislar los clones individuales, cada uno de los cuales secreta una especie de anticuerpo única al inmunogen . De esta manera , las especies de anticuerpo individuales son los productos de células B únicas clonadas e inmortalizadas del animal inmune generados en respuesta a un sitio específico reconocido en la substancia inmunogénica. Los métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con Virus Eipstein Barr, oncógenos, o retrovirus, u otros métodos conocidos en la materia . Las colonias que se originan de células inmortalizadas únicas se seleccionan para la producción de anticuerpos de la afinidad y especificidad deseada para el antígeno, y producción de los anticuerpos monoclonales producidos por tales células se aumenta por varias técnicas, incluyendo inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado (preferentemente mamífero). Otras técnicas adecuadas incluyen la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fago o vectores similares (ver, por ejemplo, Huse et al., (1998) Science 246:1275-1281; Ward et al., (1989) Nature 341:544-546; y Vaughan et al., (1996) Nature Biotechnology 14:309-314). (3) Inmunoanálisls Una vez que un suero inmune o un anticuerpo monoclonal que reconoce uno o más antígenos Neisseríal se obtiene, puede utilizarse para realizar inmunoanálisis. Para un resumen de procedimientos de inmunoanálisis e inmunológicos en general, ver D. Stites and A. Terr, (eds.), Supra. Además, los inmunoanálisis de la presente invención pueden realizarse de cualquiera de las varias configuraciones, que se revisan extensivamente en ENZYME IMMUNOASSAY, E.T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Ratón, Florida (1980); "Practico and Theory of Enzyme Immunoassays," P. Tijssen, en LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Elseiver Science Publishers B.V. Amsterdam (1985); y Harlow and Lañe, supra, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. Por ejemplo, los inmunoanálisis ELISA de fase sólida se utilizan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales especialmente inmunoreactivos con un antígeno. Ver Harlow and Lañe, Supra. Los antisueros agrupados y/o imunoabsorbidos (o anticuerpos monoclonales) también se utilizan en un ¡nmunoanalisis de unión directo o competitivo. El último compara la unión de una segunda composición de antígeno (por ejemplo, MVs, O Vs, antígenos aislados o composiciones de anttgeno de una cepa Neissería diferente conocida o desconocida) a aquella de la composición de antígeno de referencia utilizada para producir inmunidad protectora. Con objeto de hacer esta comparación en el análisis competitivo, las dos preparaciones de antígeno se analizan cada una en un amplio rango de concentraciones y se determina la cantidad de cada molécula requerida para inhibir 50% de la unión de los antisueros a la preparación de antígeno de referencia inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida es menor a 10 veces la cantidad del péptido de referencia utilizada para hacer el anticuerpo, entonces la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado para la preparación de antígeno de referencia. (b) Western Blots El análisis Western Blot generalmente comprende separar productos por electroforesis de gel en la base de peso molecular, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylón, o filtro de nylón derivado) e incubar la muestra con anticuerpos de marcado que se unen específicamente a la proteína de analito. Los anticuerpos de marcado se unen específicamente a analito en el soporte sólido. Estos anticuerpos se marcan directamente, o alternativamente se detectan subsecuentemente utilizando agentes de marcado tales como anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de anti-ratón de oveja marcados en donde el anticuerpo para un analito es un anticuerpo de murino) que se une específicamente al anticuerpo de marcado. (4) Purificación de Antígenos Inmunogénicos Los antígenos pueden aislarse (separarse de una o más moléculas con la cual el antígeno se asocia ¡n vivo) y purificarse (un antígeno purificado, por ejemplo, una proteína, preferentemente muestra esencialmente una banda única en un gel electroforético para cada subunidad disociable del antígeno) y utilizarse para producir inmunidad protectora. Los antígenos individuales, especialmente proteínas y fragmentos de péptidos de los mismos, pueden purificarse por cualquiera de una variedad de técnicas conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía líquida de desempeño elevado de fase inversa (HPLC), intercambio de ión o cromatografía de inmunoafinidad, separación por tamaño, o electroforesis (ver generalmente, Scopes, R. Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Por ejemplo, los antígenos de Neisseria meningitidis spp. se obtienen al utilizar antisueros de espectro amplio para generar preparaciones ricas en antígeno. Los antígenos aislados también pueden prepararse al inmunoprecipitar una fracción obtenida de Neisseria meningitidis spp. Los antígenos también pueden aislarse al conjugar antisueros inmunes o anticuerpos monoclonales a una columna y desempeñar cromatografía de afinidad. La fuente de los antígenos pueden ser un lisato de célula total obtenido por métodos conocidos, por ejemplo, por sonicación, o alternativamente por exposición a un detergente iónico o no iónico, o la fuente puede ser MVs u O Vs de una cepa Neisseria!. 5. Antfgenos de Péptido Además, una vez que la identidad de los antfgenos de proteína y/o epítopos de péptido específicos se establece, las preparaciones de antígeno de Neissería meningitidis spp, adecuadas para inducir inmunidad protectora en la presente invención pueden generare al sintetizar póptidos mediante técnicas convencionales, e inyectar preparaciones de péptido sintéticas en un mamífero. Las técnicas para síntesis de péptido se conocen bien en la materia. Ver, por ejemplo, Stewart and Young , Solid Phase Peptide Synthesis (Rockford, I I I . , Pierce), 2d Ed . (1984) and Kent, 1 988, Annu. Rev. Biochem. 57:957. Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos codifican el polilpéptido particular pueden clonarse y expresarse para proporcionar el péptido. Las técnicas estándar pueden utilizare para obtener y seleccionar bibliotecas de ácidos nucleicos para identificar secuencias que codifican las secuencias deseadas (ver Sambrook ef al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), o ácidos nucleicos que codifican póptidos deseados pueden sintetizarse por métodos conocidos. Las proteínas de fusión (aquellas que consisten de todas o parte de las secuencias de aminoácidos de dos o más proteínas9 pueden producirse recombinantemente. Además, utilizando técnicas de mutagenesis in vivo, las proteínas sin relacionar pueden mutarse para comprender las secuencias apropiadas. Se entenderá que los antígenos inmunogénicos de la presente invención pueden modificarse para proporcionar una variedad de atributos deseados, por ejemplo, características farmacológicas mejoradas, mientras se incrementa o al menos retiene substancialmente toda la actividad biológica del péptido sin modificar. Por ejemplo, los péptidos pueden modificarse al extender, reducir la secuencia de aminoácidos del péptido. Las substituciones con diferentes aminoácidos o imitaciones de aminoácidos también pueden hacerse. Los péptidos empleados en la invención sujeto no necesitan ser idénticos a aquellos descritos en la sección de Ejemplos abajo (por ejemplo, con respecto a peso molecular), siempre que los péptidos sujetos sean capaces de inducir una respuesta inmune contra la molécula de antígeno deseada. De esta manera, un experto reconocerá que un número de substituciones conservadoras (descritas en más detalle abajo) puede hacerse sin afectar substancialmente la actividad del péptido. Las substituciones del aminoácido único, eliminaciones o inserciones pueden utilizarse para determinar que residuos son relativamente insensibles a modificación. Las substituciones se hacen preferentemente con porciones relativamente neutrales, pequeñas tales como Ala, Gly, Pro o residuos similares. El efecto de substituciones de aminoácido único también puede probarse utilizando D-aminoácidos. Los números y tipos de residuos que se substituyen o agregan dependen del espacio necesario entre los puntos de contacto esenciales y ciertos atributos funcionales que se enseñan (por ejemplo, hidrofobicidad contra hidrof ilicidad) . La inmunogenicidad incrementada también puede lograrse por tales substituciones, en comparación con el péptido de origen. En cualquier caso, tales substituciones podrían emplear residuos de aminoácidos u otros fragmentos moleculares elegidos para evitar, por ejemplo, interferencia de carga y estérica que puede interrumpir la unión. La substitución de aminoácidos, sin embargo, no necesita limitarse a aquellos que ocurren naturalmente en las proteínas, tales como L-a-aminoácidos, o sus D-isómeros. Los péptidos pueden substituirse con una variedad de porciones tales como imitaciones de aminoácido bien conocidas por aquellos de experiencia en la materia. (Ver, por ejemplo, Pat. de E. U. No. 6,030,619). Los residuos individuales de los polipéptidos antigénicos inmunogénicos pueden incorporarse en el péptido por una unión de péptido o imitación de unión de péptido. Una imitación de unión de péptido de la invención incluye modificaciones de la estructura de péptido bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Tales modificaciones incluyen modificaciones del nitrógeno de amida, el a-carbono, carbonilo de amida, reemplazo completo de la unión de amida, extensiones, eliminaciones o degradaciones de la estructura. Ver, generalmente, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Protains, Vol. VII (Weinstein ed. , 1983). Varias modificaciones de la estructura del péptido se conocen. Estas incluyen ?[??2??], fCSNHz], [N HCO], ?[????2] y ?[(?) o (Z) CH=CH]. La nomenclatura utilizada arriba sigue aquella sugerida por Spatola, arriba. En este contexto, ? indica la ausencia de una unión de amida. La estructura que reemplaza el grupo amida se especifica dentro de los corchetes. Las imitaciones de aminoácido también pueden incorporarse en los péptidos. Una "imitación de aminoácido" como se utiliza aquí es una porción diferente a un aminoácido que ocurre naturalmente que sirve conformacional como funcionalmente como un substituto para un aminoácido en un polipéptido de la presente invención. Tal porción sirve como un substituto para un residuo de aminoácido si no interfiere con la habilidad del péptido para producir una respuesta inmune contra el antígeno apropiado. Las imitaciones de aminoácido pueden incluir aminoácidos sin proteína, tales como ß-?-5-aminoácidos, ß-?-d-iminoácldos (tal como ácido piperidina-4-carboxílico), así como también muchos derivados de L-a-aminoácidos. Un número de imitaciones de aminoácido adecuadas se conocen por los expertos; incluyen ciclohexilalanina, ácido 3-ciclohexilpropiónico, alanina L-adamantilo, ácido adamantilacético y lo similar. Las imitaciones de péptido adecuadas para los póptidos de la presente invención se tratan por Morgan and Gainor, (1989) Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-2526. Como se observa arriba, los péptidos empleados en la invención sujeto no necesitan ser idénticos, pero puede ser substancialmente idénticos, a la secuencia correspondiente del antígeno objetivo. Por lo tanto, los péptidos pueden estar sujetos a varios cambios, tales como inserciones, eliminaciones, y substituciones, ya sea conservadoras o no conservadoras, en donde tales cambios pueden proporcionar ciertas ventajas en su uso. Los polipéptidos de la invención pueden modificarse en un número de maneras siempre que comprendan una secuencia substancialmente idéntica (como se define abajo) a una secuencia en la región objetivo del antígeno. La alineación y comparación de las secuencias de aminoácidos relativamente cortas (menores a aproximadamente 30 residuos) es típicamente recta. La comparación de secuencias más largas puede requerir más métodos sofisticados para lograr una alineación óptima de dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede conducirse por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1981 ) Adv. Appl. Math. 2:482, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, por la búsqueda para el método de similitud de Pearson and Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 85:2444, por implementaciones computarizadas de estos algortimos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wl) o por inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, que resulta en el porcentaje más elevado de similitud de secuencia sobre la ventana de comparación) generada por los diversos métodos. Los términos "idéntico" o por ciento de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos o aminoácidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos, cuando se compara y alinea para máxima correspondencia, como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o inspección visual. Preferentemente, la identidad substancial existe sobre una región de las secuencias que es al menos aproximadamente 50 residuos en longitud, más preferentemente sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y más preferentemente las secuencias son substancialmente idénticas sobre al menos aproximadamente 150 residuos. En una modalidad más preferida, las secuencias son substancialmente idénticas sobre la longitud completa de las regiones de codificación. Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual las secuencias de prueba se comparan. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de referencia y prueba, se introducen en una computadora, se diseñan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba relativo a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa diseñados. La alineación óptima de secuencias para su comparación puede conducirse, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. ath. 2:482 (1981 ), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch 48:443 (1970), por la búsqueda para el método de similitud de Pearson and Lipman Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algortimos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wl) o por inspección visual (ver generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una ventura de articulación entre Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. , (Complemento 1995) (Ausubel). Ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschuel et al., (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, respectivamente. El Software para realizar análisis BLAST se encuentra públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/). Este algoritmo incluye identificar primero pares de secuencia con puntuación elevada (HSPs) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia interrogante, que ya sea se ajusta o satisface alguna puntuación T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de bases de datos. T se refiere al umbral de puntuación de la palabra en proximidad (Altschul et al., supra). Estos aciertos de la palabra en proximidad inicial actúan como simientes para iniciar las búsquedas para encontrar HSPs más largos que la contienen . Los aciertos de la palabra se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como la puntuación de alineación acumulativa pueda incrementarse. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos de acoplamiento; siempre > 0) y N (puntuación de penalidad para residuos sin acoplamiento; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de la palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae por la cantidad X desde su valor máximo logrado; la puntuación acumulativa va a cero o por debajo de cero, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST (para secuencias de nucleótidos) utiliza como fallas una longitud de palabra (W) de 1 1 , una expectación (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambos filamentos. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como fallas una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 89: 10915 (1989)). Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual un acoplamiento entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos podría ocurrir por suerte. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.1 , más preferentemente menor que aproximadamente 0.01 y más preferentemente menor que aproximadamente 0.001.

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son substancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe abajo. De esta manera, un polipéptido típicamente es substancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente por substituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son substancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridizan entre sí bajo condiciones severas, como se describe abajo. Preferentemente, las posiciones de residuo que no son idénticas difieren por substituciones de aminoácidos conservadoras. Las substituciones de aminoácidos conservadoras se refieren al intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es erina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es aparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticos es fenilalanina, tirosina, y triptofan; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de substitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina. fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina- glutamina. Los polipóptidos comprendidos por la invención típicamente comprenden al menos aproximadamente 10 residuos y más preferentemente al menos aproximadamente 15 residuos, preferentemente de un dominio del antígeno que se expone al sistema inmune. En ciertas modalidades, los póptidos no excederán aproximadamente 50 residuos y típicamente no excederán aproximadamente 30 residuos. Los péptidos imunogénicos se limitan conformacionalmente. Los medios para lograr esto se conocen bien en la material (ver, por ejemplo, Hruby and Bonner en Methods in Molecular Biology, Volumen 35 Peptide Synthesis Protocols, Pennington and Dunn eds (Humana Pres, Totowa, NJ 1994). Un medio preferido para preparar péptidos conformacionalmente limitados se a través de ciclización. Cualquier método comúnmente utilizado para producir oligopéptidos ciclízados puede utilizarse para producir los péptidos de la invención. Por ejemplo, en ciertas modalidades los péptidos incluirán residuos de cisteína en ambos términos, que permiten la producción de péptidos cíclicos a través de enlaces de disulfuro. El tratamiento de tal péptido con un agente oxidante tal como oxígeno, yodo o agente similar producirá un péptido cíclico que puede purificarse además utilizando método cromatográfico u otros de purificación química. La construcción de póptidos cíclicos también puede realizarse a través de enlaces de tioéter. Por ejemplo, los péptidos N-bromoacetil-derivados pueden reaccionarse con residuos que contienen sulfhidrilo, tales como cisteína. La ciclización ocurre por la reacción del sulfohidrilo libre de cisteína en el péptido con el grupo bromoacetilo para formar un enlace de tioéter (Robey et al., Anal. Biochem 177:373-7 (1989) y Patente de E.U. No. 5,066,716). Otros métodos para construir péptidos cíclicos se conocen por aquellos expertos en la materia. Estos incluyen ciclizaciones de cadena lateral-cadena lateral, cadena lateral-cadena principal y cadena principal-cadena principal. Además, los enlazadores pueden utilizarse para unir los términos, amino y carboxilo, de un péptido. En enlazador es capaz de formar uniones covalentes tanto al término amino como carboxilo. Los enlazadores adecuados se conocen bien por aquellos expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, enlazadores de carbono de cadena recta o ramificada, enlazadores de carbono heterocíclicos, o enlazadores de péptido. Los enlazadores pueden unirse a los aminoácidos de termino amino y carboxilo a través de sus grupos laterales (por ejemplo, a través de un enlace de disulfuro a cisteína) o a través de grupos carboxilo y amino de carbono alfa de los aminoácidos terminales. Para una discusión general de métodos adecuados para ciclización, ver Hruby and Bonner in Methods in Molecular Biology, Volumen 35 Peptide Synthesis Protocols, Pennington and Dunn eds (Humana Pres, Totowa, NJ 1994). Por ejemplo, las ciclizaciones pueden incluir la formación de análogos carba y tioéteres (Lebl et al., in Peptides 1986 Proceedings of the 19th European Peptide Symposium pp. 341 -344; Robey et al., Anal. Biochem. 177:373-7 (1989) y la Patente de E. U . No. 5,066,716), bis-tioóteres (Mosberg et al., JACS 107:2986-2987 (1985)), azopéptidos (Siemion et al., Mol. Ce//. Biochem. 34: (1991 )), y otras estructuras cíclicas, tales como estructuras de puente (Charpentier, . , et al., J. Med. Chem. 32(6): 1 184-1 190 (1989), Thaisrivongs, S. , et al., J. Med. Chem. 34(4): 127(1991 ) y Ozeki, E. , et al., Int. J. Peptide Protein Res. 34: 1 1 1 (1989)). La ciclización de posiciones estructura a estructura también puede utilizarse. El puente es un tipo especial de ciclización en el cual los sitios distantes en un péptido se unen utilizando fragmentos o moléculas de puente separados. Las moléculas de puente pueden incluir, por ejemplo, moléculas de anhídrido succínico (Charpentier, B., et al., supra) y fragmentos de carboximetileno (Thaisrivongs, S. , et al., supra). El puente por metales también puede utilizarse (Ozeki, E. , et al., supra). En algunas modalidades, los péptidos incluyen dos o más residuos de cisteína. Las cisternas pueden substituirse o agregarse dentro del péptido o en cualquier término. La posición de las cisteínas no es crítica siempre que los enlaces de disulfuro puedan formarse entre ellas lo que permite la producción de péptidos cíclicos. Por ejemplo, el tratamiento de tal péptido con un agente oxidante tal como oxígeno, yodo o agente similar producirá un péptido cíclico que puede purificarse además utilizando método cromatográfico u otros métodos de purificación química. Las modalidades adicionales incluyen péptidos que contienen secuencias antigénicas de secuencias de proteína que se han incorporado independientemente en péptidos de doblez (Regan & DeGrado, 1988, Science 241 :976; Mutter, 1988, TIBS 13:260; Kamtekar et al., 1993, Science 262: 1680; Sieber & Moe, 1996, Biochemistry 35: 181 ; Butcher & Moe, 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 1 135, FitzGerald et al., 1998 Biochemistry 273:9951 ). Los péptidos independientemente de doblez pueden ocurrir naturalmente o ser de diseño nuevo. Los péptidos capaces de producir inmunidad protectora similar a aquella de la vacuna CHORI pueden también obtenerse al utilizar anticuerpos monoclonales producidos por inmunización con antígeno CHORI o lo similar para seleccionar imitaciones moleculares de bibliotecas de péptido de despliegue de fago u otras bibliotecas de combinación tales como moléculas pequeñas o ácidos nucleicos. Además de utilizar los péptidos, los anticuerpos originados contra péptidos de la invención pueden utilizarse para inhibir respuestas inflamatorias. Los anticuerpos pueden originarse para los péptidos de la presente invención utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Los anticuerpos anti-idiotlpicos también pueden generarse. La siguiente descripción se presenta como un resumen general de las técnicas disponibles, sin embargo, un experto en la materia reconocerá que muchas variaciones en los siguientes métodos se conocen. Frecuentemente, los péptidos y anticuerpos de la invención se marcarán mediante unión, ya sea covalente o no covalentemente, una substancia que proporciona una señal detectable. Una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación se conocen y se reportan extensivamente tanto en literatura científica como de patente. Las marcas adecuadas incluyen radionucleótidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminescentes, partículas magnéticas y lo similar. Las patentes que enseñan el uso de tales marcas incluyen Patentes de E. U . Nos. 3,81 7, 837, 3, 850,752 , 3, 939,950 , 3,966,345 , 4,277,437 , 4,275, 149 y 4,366,241. También, las inmunoglobulinas recombinantes pueden producirse. Ver Cabilly, Patente de E. U. No. 4,816,567; y Queen et al., (1989) Proc Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033. 6. Inmunidad Pasiva Los anticuerpos inmunoprotectores que reconocen epítopos de Neissería también pueden administrarse a un organismo (por ejemplo, un paciente humano) para inducir inmunidad pasiva contra una enfermedad Neisserial, ya sea para prevenir que la infección o enfermedad ocurra, o como una terapia para mejorar el resultado clínico en pacientes con enfermedad establecida (por ejemplo, tasa de complicación reducida tal como ataque, tasa de mortalidad reducida, o morbididad reducida, tal como sordera). Los anticuerpos administrados a un organismo diferente a las especies en las cuales se origina con frecuencia son inmunogénicos. De esta manera, por ejemplo, los anticuerpos de porcino o murino administrados a un humano con frecuencia inducen una respuesta inmunológica contra el anticuerpo. Las propiedades inmunogénicas del anticuerpo se reducen al alterar las porciones, o todo, el anticuerpo en secuencias característicamente humanas produciendo así anticuerpos quiméricos o humanos, respectivamente. Los anticuerpos quiméricos son moléculas de inmunoglobulina que comprenden una porción humana y no humana. Más específicamente, la región de combinación del antígeno (o región variable) de un anticuerpo quimérico humanizado se deriva de una fuente no humana (por ejemplo, murino), y la región constante del anticuerpo quimérico (que confiere función de efecto biológico a la inmunoglobulina) se deriva de una fuente humana. El anticuerpo quimérico debe tener la especificidad de unión de antígeno de la molécula de anticuerpo no humano y la función de efecto conferida por la molécula de anticuerpo humano . Un número grande de métodos para generar anticuerpos quiméricos se conocen bien por aquellos expertos en la materia (ver, por ejemplo, Patentes de E. U . Nos. 5,502, 167, 5, 500, 362 , 5,491 ,088, 5,482,856, 5,472,693, 5, 354, 847, 5,292, 867, 5,231 , 026, 5,204,244, 5,202 ,238, 5, 169,939, 5,081 ,235, 5,075,431 y 4, 975,369). Un planteamiento alternativo es la generación de anticuerpos humanizados al enlazar las regiones CDR de anticuerpos no humanos a regiones constantes humanas mediante técnicas de ADN recombinante. Ver Queen et al. , (1989) Proc Nati Acad. Sci. USA 86: 1 0029- 1 0033 (1989) y WO 90/07861 . En una modalidad preferida, el vector de ADN recombinante se utilizar para transfectar una estirpe que produce un anticuerpo contra un póptido de la invención. El nuevo vector de ADN recombinante contiene un "gen de reemplazo" para reemplazar todo o una porción del gel que codifica la región constante de inmunoglobulina en la estirpe (por ejemplo, un gen de reemplazo puede codificar toda o una porción de una región constate de una inmunoglobulina humana, una clase de inmunoglobulina específica) , y una "secuencia objetivo" que permite la recombinación homóloga objetivo con secuencias de inmunoglobulina dentro de la célula que produce el anticuerpo. En otra modalidad, un vector de ADN recombinante se utiliza para transfectar una estirpe que produce un anticuerpo que tiene una función de efecto deseado (por ejemplo, una región constante de una inmunoglobulina humana), en tal caso, el gen de reemplazo contenido en el vector recombinante puede codificar toda o una porción de una región de un anticuerpo y la secuencia objetivo contenida en el vector recombinante permite la recombinación homóloga y la modificación del gen objetivo dentro de la célula que produce el anticuerpo. En cualquier modalidad, cuando solamente una porción de la región constante o variable se reemplaza, el anticuerpo quimérico resultante puede definir el mismo antígeno y/o tener la misma función de efecto aún sin alterar o mejorar de manera que el anticuerpo quimérico puede demostrar una mayor especificidad de antígeno, mayor constante de unión de afinidad, función de efecto aumentada, o secreción aumentada y producción por la estirpe que produce el anticuerpo transfectado, etc. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos completamente humanos. Los anticuerpos humanos consisten completamente de secuencias de polipéptido característicamente humanas. Los anticuerpos humanos de esta invención pueden producirse por una amplia variedad de métodos (ver, por ejemplo, Larrick et al., Patente de E. U. No. 5,001 ,065). En una modalidad, los anticuerpos humanos de la presente invención se producen inicialmente en células trioma (descendientes de tres células, dos humanas y una de ratón). Los genes que codifican los anticuerpos se clonan entonces y expresan en otras células, particularmente células mamíferos no humanas. El planteamiento general para producir anticuerpos humanos por tecnología de trioma se ha descrito por Ostberg et al., (1983), Hybridoma 2: 361 -367, Ostberg, Patente de E . U . No. 4,634,664 y Engelman et al. , Patente de E. U . No. 4,634,666. Se ha encontrado que las triomas producen anticuerpo más establemente que los hibridomas ordinarios hechos de células humanas. Los métodos para producir y formular anticuerpos adecuados para su administración a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) se conocen bien en la materia . Por ejemplo, los anticuerpos pueden proporcionarse en una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo y un excipiente farmacéutico (por ejemplo, salina) . La composición farmacéutica puede incluir opcionalmente otros aditivos (por ejemplo, reguladores, estabilizadores, conservadores y lo similar) . Una cantidad eficaz de anticuerpo es generalmente una cantidad eficaz para proporcionar protección contra síntomas o enfermedad Neisserial por un periodo deseado, por ejemplo, un periodo de al menos aproximadamente 2 días a 1 0 días o 1 mes a 2 meses) . 7. Análisis de Diagnóstico Los antígenos o anticuerpos de la invención también pueden utilizarse para propósitos de diagnóstico. Por ejemplo, los péptidos pueden utilizarse para seleccionar sueros inmunes y pre-inmunes para asegurar que la vacunación ha sido eficaz. Los anticuerpos también pueden utilizarse en inmunoanálisis para detectar la presencia de moléculas de antígeno particulares asociadas con enfermedad Neisserial.

EJEMPLOS Debe entenderse que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son para propósitos ilustrativos solamente y que las diversas modificaciones o cambios en vista de los mismos se sugerirán a personas expertas en la materia y se incluirán dentro del espíritu y resumen de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas aquí se incorporan en la presente para referencia en su totalidad para todos los propósitos. A. Preparaciones de Membrana Las cepas para la preparación de OMVs y Vs se seleccionan en la base de serogrupo, serotipo y serosubtipo. Las cepas a utilizarse en la preparación de MVs se seleccionan para niveles relativamente elevados de burbujeo y expresión de NspA (ver Moe et al. , (1999 Infect. Immun. 67: 5664) . Las cepas ejemplificativas utilizadas en la preparación de OMVs y MVs se han depositado con la American Type Culture Collection (ATCC, ver abajo) . Las cepas que producen niveles elevados de burbujas, tales cepas son particularmente útiles en la producción de MV, pueden seleccionarse o se conocen en la materia (ver, por ejemplo, WO 01 /34642). La cepa meningococal congelada a -80°C en -2% de leche descremada acuosa (p/v) se subcutliva en una placa de agar de chocolate comercial (Remel, Laztakas, KS). Después de crecimiento durante la noche a 37"C en 4% de CO2, varias colonias se seleccionan para inocular ~7 mi de caldo Mueller-H inton estéril a un ODe2onm de 0.1 . El cultivo se incuba a 37°C, 4% de C02 con sacudida hasta que el ODe20nm alcance 0.6-0.8 (dos a tres horas). Dos a tres cultivos iniciales de 7 mi se utilizan entonces para inocular 500 mi de caldo Mueller- H inton . El cultivo más grande se desarrolló a un ODe2onm de 0.9-1 .0 a 37'C con agitación - -vigorosa. Se agrega fenol al cultivo a una concentración final de 0.5% (p/v) y la mezcla se deja a 4°C durante la noche para inactivar las bacterias. Las células se forman en bolitas mediante centrifugación (1 1 ,000 x g) por 30 min. a 4°C. Las bolitas celulares se congelan a -20°C hasta que se utilizan para la preparación de vesículas de membrana de proteína de membrana exterior (OMV). Las microvesículas (MV) se recolectan del sobrenadante de cultivo celular tratado con fenol al agregar sulfato de amonio sólido (390 g/l de concentración final) lentamente con agitación. Después de que sulfato de amonio se agrega y disuelve completamente, la mezcla se deja a 4°C durante la noche. MVs precipitadas se recolectan entonces mediante centrifugación a 1 1 ,000 x g por 30 min. La bolita de MV precipitada se resuspende en 0.04 volumen de PBS y se centrifuga de nuevo a 16,000 x g por 15 min a 4°C. La bolita se descarta y las MVs, que permanecen en el sobrenadante, se recolectan por centrifugación a 100,000 x g por 2 hrs a 4°C. La bolita final se resuspende en 0.01 volumen (es decir, 5 mi por 500 mi de cultivo) de agua (preparación de vacuna "MV"). Alternativamente, la bolita se resuspende en 0.1 M de Tris«HCI, pH 8.6, que contiene 10 mM de EDTA y 0.5% (p/v) de deoxicolato de sodio (~ 3ml/500 mi de cultivo celular). Después de agitar (30 min), la mezcla se centrifuga (125,000 x g, 2 hrs, 4°C). El sobrenadante se descarta y la bolita resuspende en 1 mi de 3% de sucrosa (preparación de vacuna "DOC MV"). La concentración de proteína de las preparaciones MV y DOC MV se determina por análisis BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, I L). Las suspensiones MV y DOC MV se congelan entonces en hielo seco y almacenan a -20°C hasta que se utilizan para inmunización. Vesículas de membrana exteriores (OMV) se preparan por el método de Zollinger et al., (1979 J. Clin, tnvest. 63:836-848). La bolita celular congelada se resuspende en 10 mi de 0.05 M de regulador Tris«HCI, pH 7.4 que contiene 0. 15 M de NaCI y 0.01 M de EDTA, se calienta entonces a 56°C por 30 min, seguido por enfriamiento en hielo. La suspensión celular se sónica entonces en hielo con varias explosiones de 15 segundos utilizando sonificador de microsonda (Branson, Danbury, CT) . Los residuos celulares se remueven mediante centrifugación a 16,000 x g por 15 min, y las vesículas de membrana exteriores (OMVs) en el sobrenadante se obtienen mediante ultracentrifugación a 1 00, 000 x g por 2 hrs a 4"C. La bolita OMV se resuspende en 2 mi de agua (preparación de vacuna OMV") . Alternativamente, la bolita de célula congelada se resuspende en 0.1 M Tris» HCl , pH 8.6, que contiene 10 mM de EDTA y 0.5% (p/v) de deoxicolato de sodio. Después de agitar por 30 min, a temperatura ambiente, la mezcla se centrifuga (20,000 x g, 30 min, 4°C). El sobrenadante se retiene y la bolita se reextrae y centrifuga de nuevo con un tercer volumen del mismo regulador. Los sobrenadantes de ambas extracciones se combinan y centrifugan (125,000 x g, 2 hrs, 4°C). El sobrenadante y la bolita se resuspende en 5 mi de 3% de sucrosa (preparación de vacuna "DOC OMV"). Las preparaciones de vacuna OMV y DOC OMV se congelan en hielo seco, y almacenan a -20eC hasta que se utilizan para inmunización . La concentración de proteína de las preparaciones OMV y DOC OMV se determina por BCA (Pierce Chemical Co, Rockford , I L) . 8. Programa de Inmunización Las preparaciones MV u OMV se diluyen en PBS y ya sea se mezclan con un volumen igual de adyuvante de Freund completo (CFA; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) o hidróxido de aluminio (Alhydrogel 1 .3% de Superfos Biosector, Frederikssund, Dinamarca), o fosfato de aluminio (Alhydroghei que se ha incubado con regulador PBS por al menos 3 hrs). En algunas preparaciones de vacuna, los nucleótidos CpG (5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'(SEQ ID NO: 1 ) Chiron Corp. , Emeryville, CA) se agregan a la mezcla de fosfato de aluminio/antígeno a una concentración final de 100 µg/ml como un segundo adyuvante. Los ratones se inmunizan por vía IP (CFA) o SC (fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio) con 100 µ? que contienen entre 5 a 25 microgramos de proteína total de la MV preparada de la cepa meningococal RM1090. En intervalos de 3 a 4 semanas dos dosis de inyección de refuerzo subsecuentes (5-25 microgramos/ratón) se dan con ya sea adyuvante de Freund incompleto (IFA), o hidróxido de aluminio, o fosfato de aluminio (preparado como se describe arriba) por las vías IP o SC, respectivamente, o primeras MVs preparadas de cepa meningococal BZ198 y después OMVs preparadas de cepa meningococal Z1092. La inmunización secuencial con tres diferentes cepas meningococales, que son genéticamente diferentes con respecto a su serogrupo, serotipo, y serosubtipo y otros antígenos, constituye lo que de aquí en adelante se designará "vacuna CHORI". En un segundo experimento, otro grupo de ratones se inmunizan con vacuna CHORI como se describe arria excepto que oligonucleótidos CpG no se utilizan como un segundo adyuvante y el experimento incluyó ratones a los que se les da la vacuna CHORI combinada con adyuvante de hidróxido de aluminio y ratones a los que se les dan tres inyecciones de una mezcla de MV/OMV descrita arriba junto con fosfato de aluminio. En un tercer experimento, a los grupos de conejillos de Indias se les dan ya sea inmunizaciones secuenciales con antígenos de vacuna CHOR I o tres inyecciones de una mezcla de antígenos de vacuna CHORI combinados con fosfato de aluminio. C. SDS-PAGE y Western blots Las preparaciones de proteína se analizan utilizando 1 5% SDS-PAGE como se describe por Laemmii (1970 Nature 227:680-685) que emplean un aparato de electroforesis Mini-Protean II (BioRad, Richmond, CA). Las muestras se suspenden en regulador de muestra SDS (0.06 M Tris. HCI, pH 6.8, 1 0% (v/v) glicerol , 2% (p/v) SDS, 5% (v/v) 2-mercaptoetanol , 10 microgramos/ml bromofenol azul) y opcionalmente se calientan a 100°C por 1 min, antes de cargarse directamente en el gel. La figura 2 muestra un gel de 15% SDS-PAH E coloreado con Coomassie de las proteínas presentes en la MV de cepa Z1092 (vía 2) o preparaciones OMV de cepa Z1 092 (vía 4) , o las preparaciones respectivas después de haber extraído con 0.5% (p/v) de deoxicolato de sodio (es decir DOC MV [vía 3] y DOC OMV [vía 5]) como se describe por Fredricksen et al. , (1991 , NIPH Ann. 14:67-79). Las cuatro preparaciones correspondientes hechas de cepas meningococales BZ198 y RM 1090 (se muestras en las vías 6 a 13, respectivamente) . Cinco proteínas, PorA, PorB, Rmp, Opa, y Opc, se conocen por constituir las proteínas de membrana exterior Neisseria meningitidis. Todas las preparaciones parecen contener las proteínas de membrana exterior principales PorA y PorB (-39-42 kDa) y las proteínas de opacidad, Opa y Opc (-28-31 kDa), aunque la masa aparente de las proteínas particulares y cantidades relativas fueron diferentes en cada preparación. La proteína menos distinta que contiene una masa aparente de -31-34 kDa en las preparaciones DOC OMV puede ser la proteína modificable de reducción (Rmp). Además de las proteínas de membrana exterior principales, cada preparación MV y OMV contiene varias otras proteínas en cantidades menores. En general, las proteínas menores son más variables entre las cepas y entre MV en comparación con las preparaciones OMV. D. Unión de anticuerpo a la superficie celular La unión de anticuerpos a la superficie de bacteria viva se determina por citometría de flujo de fluorescencia indirecta (Granoff et al., 1998, J. Immunol. 160:5028-5036). Las células bacterianas crecen fase mid-log en caldo Mueller-Hinton, recolectan por centrifugación, y resuspenden en regulador de bloqueo (PBS que contiene 1% (p/v) de albúmina de suero de bovino (BSA) y 0.4% (p/v) de azida de sodio) a una densidad de ~10e células por mi. Las diluciones de prueba o antisuero de control (típicamente 1:20, 1:200, 1:2000) se agregan entonces y dejan unir a las células, que se mantienen en hielo por 2 hrs. Después de dos enjuagues con regulador de bloqueo, las células se incuban con IgG de anti-ratón de cabra (H+L) de fragmento conjugado F(ab')2 con FITC (Jackson Immune Research, West Grove, PA) por 1 hr. Las células se enjuagan dos veces con regulador de bloque después se reaccionan con 0.25% de formaldehído en regulador PBS antes de analizar las células bacterianas por citometría de flujo. Los anticuerpos de control positivo incluyeron anticuerpos monoclonales de serosubtipificación o serotipificación específica de meningococal (M N2C3B, M N 16C1 3F4, Rijksinstituut Voor Volksgezondeid en Mileu, Biltoven , Países Bajos)y SEAM 12 , un anticuerpo monoclonal anti-polisacárido que es específico para cepas de serogrupo B encapsuladas (Granoff et al., 1998, J. Immunol. 160:5028) . El control negativo consistió de un anticuerpo monoclonal IgG de ratón (VIG 10) de especificidad relevante y sueros policlonales de ratones inmunizados con proteínas de membrana de E. coli. Los anticuerpos utilizados para definir el serogrupo , serotipo y serosubtipo se proporcionan en las Figuras 20 y 21 . La figura 3 muestra los resultados de un experimento típico que examina la unión del anticuerpo a dos cepas de prueba: MC58 y S3446. Ambas cepas expresan proteína PorA y PorB que son heterólogas con la proteína s de porina respectiva de las tres cepas utilizadas para preparar la vacuna C HORI . Los antisueros de ratones inmunizados con antígeno CHOR I muestran un incremento en intensidad de fluorescencia con ambas cepas cuando los antisueros se prueban en diluciones de 1 :20 a 1 :200. En contraste, los antisueros policlonales preparados para proteínas precipitadas de sobrenadante de cultivo de E. coli muestran solamente fluorescencia antecedente de baja intensidad (1 :20 dilución), y se consideran negativos. Los antisueros de conejillos de I ndias inmunizados con la vacuna Noruega, preparada de OMV de cepa 4H H/76 (P 1 .7.16) , fueron positivos contra la cepa MC58 con un serosubtipo PorA homólogo (P1.7, 16) pero fueron negativos cuando se probo en 1 :20 dilución contra cepa S3446 con un serosubtipo heterólogo (P1 .22.14). Como se resume en la Figura 4, de las 12 cepas de serogrupo B de N. meningitidis probadas por citometría de flujo, 1 1 (92%), incluyendo 6 cepas con serosubtipos PorA heterólogos, y 3 cepas teniendo tanto serosubtipos como serotipos heterólogos, fueron positivas para toda la unión de superficie celular por antisuero de antígeno anti-CHORI . Una cepa negativa no expresa PorA, que sugiere que algunos de los anticuerpos de vacuna anti-CHORI se une a PorA o a proteínas cuya expresión puede regularse junto con expresión PorA. Además de las 1 1 cepas meningococales B, los antisueros de vacuna anti-CHORI fueron positivos también en este análisis cuando se prueba con cepas meningococales de serogrupo A (Z1073) y C (60E) (Figura 5). E. Actividad del anticuerpo bactericida dependiente de complemento El análisis bactericida se adapta del método previamente descrito por Mandrell et al. , (1995 J. Infect. Dis. 172: 1279-1289). Descubriendo que una vacuna produce anticuerpos bactericidas contra Neisseria meningitidis se acepta en el campo como predicción del efecto protector de la vacuna en humanos Goldschneider et al., 1969, J. Exp. Med. 129: 1307; Borrow et al., 2001 Infect Immun. 69: 1568). Después del crecimiento durante la noche en ágar de chocolate, varias colonias se inoculan en caldo Mueller-Hinton (Aeíonm inicial de -0.1 ) y el organismo de prueba se desarrolla por aproximadamente 2 hrs a un Asaonm de -0.6. Después de enjuagar la bacteria dos veces en regulador de Gey que contiene 1 % BSA (p/v), aproximadamente 300 a 400 unidades que forman la colonia (CFUs) se agregan a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción final de 60 microlitros contuvo 20% (v/v) de complemento, y diluciones de 2 veces seriales de suero total o anticuerpos monoclonales de control en regulador de Grey. La fuente de complemento fue suero humano de un adulto saludable sin anticuerpo anticupsular detectable a polisacárido de grupo B cuando se prueba por ELISA (Granoff et al., 1998, J. Immunol. 160:5028-5036), y no actividad bactericida intrínseca detectable contra la cepa de prueba a una concentración final de 20 o 40%. En experimentos preliminares con un panel de suero de prueba, esta fuente de complemento da concentraciones bactericidas comparables como aquellas obtenidas con suero agamaglobulinémico como la fuente complemento. Las concentraciones bactericidas de suero se definen como la dilución de suero (o concentración de anticuerpo) que resulta en un 50% de reducción en CFUs por mi después de 60 min, incubación de bacterias en la mezcla de reacción, en comparación con CFU de control por mi en tiempo 0. Típicamente, las bacterias incubadas con el anticuerpo de control negativo y complemento mostraron un incremento de 150 a 200% en CFU/mL durante los 60 min de incubación. La Figura 6 muestra datos de un experimento típico con cepa meningococal B 2996 probada con un mAb capsular anti-meningococal B (SEAM 12, Granoff et al., 1998, J. Immunol. 160:5028-5036), antisueros de control de conejillo de Indias y ratón, NspA anti-recombinante de ratón y antisueros de antígeno anti-CHORI , y antisueros de vacuna anti-Noruega de conejillo de Indias. La Figura 7 resume los resultados de medición de actividad bactericida mediada por complemento de los antisueros de antígeno anti-CHORI a cada cepa meningococal B probada. Todas las 12 cepas se mueren por complemento junto con concentraciones similares de un mAb anti-capsular de control positivo (SEA 12 ; subtipo lgG2a (Granoff et al. , 1 998, J. Immunol. 160: 5028-5036) . De manera similar, todas las 1 1 cepas fueron positivas para antisueros anti-CH ORI que se unen por el análisis de flujo fueron susceptibles a bacteriolisis mediada por complemento inducida por el anticuerpo (a una 1 : 10 dilución o más elevada, cada una mostró más de 50% de muerte, en comparación con CFU/ml presente en el tiempo 0). También, las cepas A y C meningococales heterólogas que fueron positivas cuando se prueban en el análisis de flujo también fueron positivas en el análisis bactericida (Figura 5). De nuevo, solamente la cepa M 136, que no expresa PorA, y fue negativa para unión de anticuerpo en el análisis de flujo, fue resistente a la muerte en el análisis bactericida. En contraste, los anticuerpos producidos por ya sea la vacuna Noruega o rIMspA, ambos de los cuales son candidatos de vacuna meningococal B que actualmente se prueban en humanos, fueron capaces de activar la bacteriolisis mediada por complemento con solamente un número limitado del conjunto genéticamente diverso de cepas. Como con el análisis de flujo, los antisueros de vacuna anti-NspA y los antisueros de vacuna anti-Noruega son bactericidas contra solamente un número limitado de las cepas. La Figura 8 resume los resultados de probar la actividad bactericida mediada por complemento de antisueros anti-CHOR I preparados en un segundo experimento en ratones. Los datos se muestran para antisueros preparados con vacuna CHORI dada con CFA o fosfato de aluminio (sin CpG). Los resultados se muestran para las 14 cepas meningococales B probadas en este experimento (8 con serosubtipos heterólogos a aquellos de las cepas de vacuna). Los resultados se muestran para una cepa Men B adicional en la cual el gen que codifica NspA se ha inactivado (BZ198ANspA) . Todas las 1 5 cepas se matan por antisueros anti-CHOR I ( 14/15 con vacuna CHORI dada con CFA; y 13/15 con vacuna C HORI dada con fosfato de aluminio; para las cepas heterólogas, 6/7 y 5/7, respectivamente). En contraste, solamente 1 de 1 5 cepas se matan por antisueros de animales de control dan 3 inyecciones de MV de E. coli. Estos resultados de un segundo experimento en ratones confirman los resultados anteriores obtenidos con la vacuna CHORI en el experimento 1 . Además, los datos indican que el segundo adyuvante, oligonucleótidos CpG, que no se utiliza en el segundo experimento, no se necesita por la vacuna CHORI para producir ampliamente anticuerpo reactivo. Un grupo de ratones en el segundo experimento recibió tres inyecciones, cada uno consistiendo de una mezcla de la misma MV, MV y OMV utilizadas en la inmunización secuencial . Los antisueros resultantes son bactericidas contra 12 de las 15 cepas (4 de 7 de las cepas heterólogas) . La inmunización con la mezcla de antfgenos produjo actividad bactericida más amplia que la esperada pero las concentraciones medidas contra algunas cepas tienden a ser mucho más baja que aquellas obtenidas en animales a los que se les da la inmunización de vacuna CHOR I secuencial (por ejemplo, CU385 y 1000, concentraciones de 1 : 128 y 1 : 128 después de la vacuna CHOR I/fosfato de aluminio vs. concentraciones de < 1 :4 y 1 :6 en antisueros preparados contra tres inyecciones de los antígenos mezclados/fosfato de aluminio) .. En un tercer experimento, los grupos de conejillos de I ndias se inmunizan con vacuna CHORI dada con fosfato de aluminio (sin CpG) , o hidróxido de aluminio (sin CpG). Los resultados se muestran en la Figura T para 9 cepas meningococales B probadas (5 con serosubtipos heterólogos a aquellos de las cepas de vacuna), y para una cepa MenB adicional en la cual el gen que codifica NspA se ha inactivado (BZ198ANspA). 9 de las 10 cepas se matan por antisueros anti-CHORI vs. 0 de 10 cepas muertas por antisueros de animales de control a los que se les dan 3 inyecciones de MV de E. coli. De esta manera, la vacuna CHORI produce respuestas de anticuerpo bactericida en base a amplio en conejillos de I ndias, un segundo modelo animal que puede ser más predecible de respuestas de anticuerpo protector en humanos que en ratones. F. Protección pasiva del animal U n criticismo de análisis bactericidas es que prueba la actividad de anticuerpos contra bacterias crecidas en caldo, y que las bacterias crecidas in vivo pueden tener propiedades diferentes. Por lo tanto, la habilidad del antisuero anti-CHORI de ratón para conferir protección pasiva contra bacteremia grupo B N. meningitidis se prueba en ratas infantes probados con I P, utilizando un moldeo aceptado y método adaptado de Saukkonen et al., (J. Infect. Dis. , 1988, 158:209-212) , que se considera en el campo como siendo predecible de resultados en humanos. La cepa 8047 meningococal B, que fue positiva por el análisis citométrica de flujo para epítopos accesibles de superficie de antígeno C HO I y susceptibles a actividad bactericida del antígeno anti-CHORI , se selecciona para este estudio. Los cachorros infantes (6 a 7 días de edad) de seis carnadas de ratas Wistar multiplicadas por raza (Charles River, Hollister, CA) se redistribuyen aleatoriamente a las madres en crianza. Los grupos de cinco a seis animales se preparan con I P con 100 µ? de aproximadamente 5 x 103 CFU de la cepa 8047 de grupo B. La cepa utilizada se ha pasado tres veces en ratas infantes. La bacteria aislada de cultivos sangu íneos después del tercer paso se desarrolló tres veces agar de chocolate durante la noche y se almacenó congelada a -70°C en frascos que contienen leche descremada estéril. El día del experimento, las bacterias se desarrollaron, lavaron y resuspendieron en regulador PBS que contiene 1 % BSA como se describe arriba para el análisis bactericida. A los animales se les da antisueros o anticuerpos diluidos en PBS que contiene 1 % BSA por inyección IP 2 hrs. antes de la preparación bacteriana. Dieciocho horas después de la preparación bacteriana, los especímenes sanguíneos se obtienen al perforar el corazón con una jeringa y aguja que contiene una a dos gotas de 25 Unidades/ml de heparina sin conservador (Fujisawa USA, Deerfield , I L). Al ícuotas de 1 , 10 y 100 microlitros de sangre se colocan en agar de chocolate. CFU por mi de sangre se determina después de incubación durante la noche de las placas a 37°C en 5% de C02. La Figura 1 0 resume los resultados de cultivos bacterianos cuantitativos realizados en especímenes sanguíneos obtenidos 1 8 hrs después de preparación . U na dosis de 1 0 microgramos por rata del anticuerpo anticapsular de control positivo, SEAM 3, es completamente protector contra la cepa como lo fue los antisueros anti-CHORI de ratón en una dilución de 1 :20). En contraste, los antisueros de vacuna antiNoruega de conejillo de Indias (1 :20) y los dos sueros de control (antisueros de ratón preparados a proteínas E. coli o antisueros de conejillo de Indias de animales inmunizados con alum sola) no fueron capaces de proteger contra bacteremia causada por cepa 8047. En un segundo experimento de protección pasiva utilizando el procedimiento arriba descrito, los antisueros de vacuna anti-CMORI preparados en conejillos de India también muestran proteger ratas infantes de bacteremia meningococal B después de preparación IP (Figura 1 1 ). La protección se observa en animales tratados con antisueros preparados para vacuna administrada con fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio, y fue superior a la protección observada en animales de control tratados con 20 µ? de un anticuerpo monoclonal anticapsular de murino (SEAM 3). G. Inmunoprecípitación de antígenos de superficie reconocidos por anticuerpos de antígeno anti-CHORI El método utilizado para inmunoprecípitación de antígenos accesibles de superficie se basa en aquellos descritos por Hansen et el., (1981 Infect. Immun. 33: 950-953) y Gulig et al., (1982 Infecí. Immun. 37:82-88). En nuestros estudios, el método se utiliza con ya sea células sin marcar, o con células en las cuales las proteínas de superficie se han radioyodinado. Las células se desarrollan en caldo Mueller-Hinton (~7 mi) a un OD de 0.6 y recolectaron mediante centrifugación a 5000 x g a 4°C. La bolita celular se lava dos veces en PBS frío que contiene 1 % BSA o, para el análisis de radioinmunoprecipitación, PBS solo. Las células a yodinarse se transfieren a un tubo de vidrio. Un nanomole de Kl y 1 mC¡ de Na12Bl (Amersham) se agregan a la suspensión celular. La radioyonización se inicia por la adición de 0.03% de H202 (50 µ?) y lactoperoxidasa (Sigma, St. Louis, MO) en agua (50 µ? de una solución de 1 mg/ml). Las mismas cantidades de H202 y lactoperoxidasa se agregan en intervalos de 4 min. por 12 min. La reacción se termina después de 16 min al agregar la mezcla de reacción a PBI frío (20 mi) (es decir Nal substituido para NaCI en PBS). Las células se recolectan por centrifugación (5,000 x g, 10 min, 4°C), lavaron 2 veces con PBS, después se utilizaron inmediatamente. Las células se resuspenden en PBS (2 mi) que contiene 1 % BSA. Los antisueros se agregan a alícuotas de 0.5 mi de suspensión celular. La mezcla se incuba con sacudida por 90 min. a 4°C. Las células se recolectan entonces por centrifugación (1 min. de giro en microfuga), lavan dos veces con PBS/1 % BSA y resuspenden en 1 mi de regulador de solubilización (50 mM de regulador Tris, pH 7.8, que contiene 150 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, 1 % de Tritón X- 100, 0.2% de deoxicolato de sodio, y 0. 1 % de sulfato de dodecilo de sodio. Después de la incubación por 60 min. a 37eC, el material insoluble se remueve por centrifugación (45,000 x g por 60 min. a 20°C). Los sobrenadantes se transfieren entonces a tubos que contienen 3-4 miligramos de perlas de Sepharose de proteína A (Sigma) pre-equilibradas con 50 µ? de PBS. Las muestras se incuban durante la noche a 4°C con sacudida. Las perlas se lavan cinco veces con regulador de solubilización. Las proteínas unidas se liberan de las perlas al agregar 75 µ? de regulador muestra de SDS y calienta a 100"C por 1 min . Después de remover el sobrenadante, 1 µ? de 2-mercapto etanol se agrega a cada muestra y después se calienta de nuevo a 100°C por 1 min. Las muestras se pasan entonces en un gel de 15% SDS-PAGE y se colorearon utilizando color plata (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Para Western blots, el gel se equilibra con regulador (48 mM Tris« HCI, 39 m M glicina, pH 9.0, 20% (v/v) metanol) y las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad) utilizando una célula de transferencia electroforética Trans-Blot™ (Bio- Rad) semi-seco. Las membranas de nitrocelulosa se bloquean con 2% (p/v) leche descremada en PBS que contiene 0.2% (p/v) azida de sodio. Los antisueros se diluyen en el mismo regulador de bloqueo que contiene 0.1 % Tween-20. El anticuerpo unido se detecta utilizando IgG anti-ratpon de conejo, anticuerpo policlonal de conjugado ?,?-alcalina (Zymed, South San Francisco, CA) diluido en PBS que contiene 1 % (p/v) BSA, 1 % (p/v) Tween-20 y 0.2% (p/v) azida de sodio y substrato Sigma Fast™ BC I P/N BT (Sigma). La Figura 12 es un gel SDS coloreado con plata que demuestra las proteínas de superficie celular precipitadas con los antisueros anti-CHORI (Vía 2) de M7, un mutante no encapsulado de cepa de serogrupo B, NMB (Stephens et al. , 1991 , Infecí. Immun. 59. 4097-4107) , seis proteínas teniendo masas aparentes de 59.5, 40.7, 39.6, 33, 27.9 y 14.5 kDa se precipitan por los antisueros preparados para el antígeno CHORI (Vía 2) pero no por antisueros de proteína anti-E. coli de control (Vía 3). Los mismos resultados se obtienen cuando los antisueros de antígeno anti-CHORI se utilizan para precipitar proteínas de superficie de la cepa origen encapsulada, NMB (datos no mostrados). Excepto para 59.5 y 27.9 kDa de proteínas Ig de cadena ligera y pesada (ver abajo) , las mismas proteínas de superficie detectadas por coloración de plata se observan también en células marcadas con 125l (datos no mostrados) . De observarse, no hubo lipooligosacárido (LOS) , que se detectaría por coloración de plata, que se precipita por los antisueros de antígeno anti-CHOR I . Los experimentos adicionales, descritos abajo, se diseñan para determinar si la unión de superficie observada y actividad biológica protectora de antisueros de vacuna anti-CHOR I se debe a anticuerpos anti-LOS. La Figura 1 3 muestra una Western blot de las mismas muestras como se resuelve en el gel SDS en la Figura 12. Las muestras en las vías 1 a 3 se detectan por antisueros de vacuna anti-CHOR I. Las muestras en las vías 4 a 6 se detectan por mAb específica de anti-PorA P 1 .2. Las proteínas que tienen masas aparentes de 5T.5 y 27.9 kDa en la Figura 13, (Vías 2, 3, 5 y 6) corresponden a cadenas, pesada y ligera, de anticuerpo, respectivamente, a medida que se detectan con anticuerpo secundario de conjugado de fosfatasa alcalina Ig anti-ratón de conejo. La proteína de 40.7 kDa precipitada por los antisueros de antígeno anti-CHORI (Figura 12 , Vía 2) fue reactiva con el anticuerpo específico anti-PorA P1 .2 en la Western (Figura 13, Vía 5) y , por lo tanto, es PorA P1 .2. Como se espera, PorA P1 .2 también se detecta en la proteína total de M7 (Figura 13, Vía 4). Los antisueros de vacuna anti-CHORI detectaron solamente la proteína de 33 kDa (Vía 2) y no PorA. De esta manera, los antisueros preparados al antígeno C HORI reaccionan tanto con protefna de 33 kDa desnaturalizada y nativa pero solamente las formas nativas de las proteínas de 40.7, 39.6 y 14.5 kDa presentes en la superficie celular de la cepa M7 (Figura 12 , vía 2). Los experimentos de inmunoprecipitación similares se realizan en las preparaciones de MV y OMV util izadas para inmunización y siete cepas de serogrupo B encapsuladas, genéticamente diversas. Los resultados se resumen en la Figura 14. Cuando los resultados se comparan, es aparente que la inmunización secuencial con vesículas de membrana de tres cepas meningococales genéticamente diversas produce anticuerpos que reconocen una variedad de antígenos. Algunos de los antígenos que se reconocen son los mismos en todas las cepas; otras son cepas específicas o comunes a subconjuntos de cepas. Por ejemplo, las proteínas que tienen masas aparentes de 37-41 kDa se precipitan de las cepas BZ198 y NMV pero no de cualquiera de otras cepas. De manera similar, las proteínas que tienen una masa aparente de 25.7 kDa se precipitan de cepas NG3/88 y S3446 pero de cualquier otra cepa. Sin embargo, existe una proteína de superficie que tiene una masa aparente de 32 a 33 kDa que se reconoce por antisueros de antígeno anti-CHORI en todos los ejemplos excepto para la cepa M 136, que fue negativa tanto en análisis bactericida como flujo. La proteína de 32 a 33 kDa puede ser un antígeno conservado. Los experimentos adicionales se realizan en cepas de serogrupo B encapsuladas. CU385, BZ198 y 1 000 utilizan células en las cuales las proteínas de superficie se han radioyodinado (Figura 14A) y precipitado con antisueros inmunes de diferentes grupos de ratones dando la vacuna CHORI . Además de las proteínas arriba descritas, en este segundo conjunto de experimentos, las proteínas con masas moleculares aparentes entre 1 0 y 14.5 kDa, y 80 kDa se precipitan de cepas CU385 y BZ198. Tres proteínas con kDa aparente de 26, 41 y 45 se precipitan de la cepa 1000. Es importante observar que no todos los antígenos reconocidos por los antisueros de ratones inmunizados con antígeno CHORI se inmunoprecipitan de las células bacterianas. También existen anticuerpos en los antisueros para algunos antígenos (por ejemplo, la proteína NspA) que se muestra que están presentes por una ELISA o Western blot, pero no se inmunoprecipitan en este experimento. La falla para detectar estos otros antígenos puede resultar del hecho de que el complejo de anticuerpo/antígeno debe ser estable en la presencia de detergentes (Tritón X- 100, deoxicolato, y sulfato de laurilo) a detectarse. H. Detección de proteínas reactivas en preparaciones de MV y OMV de vacuna CHORI con anticuerpos de vacuna anti-CHORI producidos en ratones y conejillos de Indias. La Figura 15 muestra una Western blot de MVs de cepas RM 1090 (C:2a: P 1 .5,2:63, 7) , y BZ198 (B: NT: P1 .4) y OMV de cepa Z1092 (A:4: P 1 .10) . Los antisueros de ratones inmunizados con vacuna CHORI combinados con CFA , o a los que se les da adyuvante de fosfato de aluminio, o de conejillos de Indias inmunizados con vacuna CHORI junto con adyuvante de fosfato de aluminio, se utilizan como el anticuerpo de detección primario. La blot muestra que la vacuna CHORI produce anticuerpos que son reactivos con varias proteínas que tiene masa molecular aparente similar en cada una de las preparaciones de OMV o MV independientes de las especies animales o adyuvante utilizado en la vacuna. Las masas moleculares aparentes de todas las proteínas en las preparaciones de MV u OMV que son reactivas con anticuerpos producidos por inmunización con vacuna CHORI se resumen en la Figura 16. I. Detección de actividad del anticuerpo anti-LOS Uno de los determinantes antigénicos en la superficie del meningococci que se ha observado que produce anticuerpos bactericidas es lipooligosacárido (LOS). Con objeto de determinar si los anticuerpos anti-LOS se producen por la vacuna CHORI , una columna de afinidad LOS se prepara y utiliza para absorber los anticuerpos anti-LOS en los antisueros de vacuna anti-CHORI utilizando los métodos descritos por Shenep et al., (1982, J. Infect. Dis. 145: 181 -190) con las siguientes modificaciones. LOS se prepara de cada cepa de vacuna por el método de Appicella ?? al., (Bacterial Pathogenesis (1997) V. L. Clark and P. M. Bavoil eds. Academic Press, San Diego, CA), y se conjuga con BSA como sigue. LOS (1 mg) se combina con BSA (2 mg) en 100 mM regulador MES, pH 5.0. EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida HCI; 100 µ? de una solución de 10 mg/ml en agua) se agrega con agitación seguida por la incubación a temperatura ambiente por 2 hrs. Una mezcla igual de los tres conjugados LOS-BSA (conjugado de 1 mg de LOS-BSA por mi de gel hidratado) se acopla a perlas de agarosa activadas por CNBr (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) en regulador de carbonato de sodio (0.1 M, pH 8.0) durante la noche a temperatura ambiente.

Después del retiro de anticuerpos anti-LOS al pasar la vacuna anti-CHORI y antisueros de antígeno mezclados anti-CHORI a través de la columna de afinidad LOS, los antisueros se concentran a su volumen original por ultrafiltración y prueba por la presencia de anticuerpo anti-LOS por ELISA y actividad bactericida mediada por complemento contra dos cepas MenB (BZ198 y S3032). Como se resume en la Figura 17, la presencia de anticuerpo anti-LOS se reduce grandemente o elimina por absorción con la columna de afinidad del conjugado LOS-BSA. Como se muestra en la Figura 18, hubo poca o nada de diferencia en las concentraciones bactericidas entre los sueros absorbidos y no absorbidos de ratones o conejillos de Indias inmunizados con vacuna CHORI que indica que el anticuerpo anti-LOS no contribuye significativamente a la actividad bactericida contra ya sea una cepa de vacuna (BZ198) o cepa S3032, que tiene PorA y PorB que son heterólogas a las cepas utilizadas para preparar la vacuna. Existe un mayor efecto en las concentraciones bactericidas de antisuero preparadas de ratones y conejillos de Indias inmunizados con vacuna CHORI mezclada que indica una contribución más significativa de anticuerpos anti-LOS a la concentración bactericida en estos antisueros. J. Preparación de anticuerpos monoclonales Los ratones CD1 hembra (Charles River, Hollister, Calif) se vacunan secuencialmente con MV preparada de cepa meningococal RM1090 (C:2a:P1 .5,2), BZ198 (B: NT:7,4) y OMV de cepa Z1092 (A:4,21 : P1 .10). A los ratones se les dan tres inyecciones de 100 microlitros, cada una separada por tres semanas, que contienen 5 microgramos de proteína. Las primeras dos dosis se dan subcutáneamente junto con fosfato de aluminio (0.5% pes/vol) y la dosis final se da subcutáneamente sin adyuvante y administra intraperitonealmente (i . p.). Tres días después, los animales se sacrifican y sus células de bazo se fusionan con células de mieloma (P3X63-AG8.653) en una proporción de 1 célula de bazo a 1 .74 célula de mieloma. Después de dos semanas de incubación en medio HAT selectivo, los sobrenadantes de hibridoma se selecciona para actividad de unión de anticuerpo por ELISA de célula completa utilizando cepas MenB ecanpsuladas 1000 y CU3885 como el antígeno objetivo. El método descrito por Abdillahi and Poolman, (Mlcrob Pathog , 1988 4:27-32) se utiliza para el análisis ELISA de célula completa. Los hibridomas que secretan el anticuerpo que fue reactivo con tanto cepas 1000 como CU385 y en una ELISA de célula completa y fue positivo para su unión por citometría de flujo se clona al limitar la dilución y después se expande y congela para uso subsecuente en cultivo de tejido. Los anticuerpos de ocho estirpes se caracterizan en detalle. Las subclases de los anticuerpos monoclonales se determinan utilizando una ELISA de captura de anticuerpo y anticuerpo policlonal conjugado de fosfatasa alcalina específico para cada una de las subclases de IgG de ratón , IgM, IgA, cadenas ligeras ? y ? (Southern Biotechnology Associates, I nc. Birmingham, Ala.) . Los anticuerpos monoclonales producidos por los clones de hibridoma se recolectan de medio de cultivo de tejido por precipitación de sulfato de amonio (55% p/vol). La concentración de mAb purificada se determina por ELISA de captura utilizando estándares Ig como se recomienda por el fabricante (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham , Ala.) . K. Reactividad de mAbs de antígeno antl-CHORI con cepas MenB d iversas. La habilidad de mAbs preparadas de ratones inmunizados con antígeno anti-CHORI (administrado con CFA o fosfato de aluminio) para unirse a cepas MenB diversas se determina por ELISA de célula completa (Abdillahi and Poolman, icrob Pathog, 1988 4:27-32) . Los resultados se resumen en la Figura 19. Ninguno de los anticuerpos policlonales reacciona con LOS preparados de las cepas de inmunización . Los mAbs 1 D9 y 14C7 son reactivos con antígenos en todas o casi todas las cepas meningococales probados pero no con ninguna cepa no neisserial . MAb 14C7 es específico para la proteína NspA de superficie Neisserial altamente conservada ya que es reactiva con rNspA expresada en E. cali. Este mAb también es reactivo con cepas 8047 y BZ1 98 pero no es reactivo con las cepas correspondientes en las cuales el gen NspA se ha inactívado. En contraste a los anticuerpos ampliamente reactivos, los antígenos reconocidos por los mAbs 4B 1 1 y 9B6 se limitan a ciertas cepas. Observe que MAb 4B1 1 es reactivo con la cepa 8047 pero no con el mutante 8047 correspondiente en el cual el gen NspA se ha inactivado. Sin embargo, mAb 4B 1 no se une a rNspA expresado en vesículas E. coli, y también no se une a cepa BZ198, que se conoce que sobreexpresa naturalmente (ver Moe et al., 1999 Infect. I mmun. 67:5664; Moe et al., I nfect I mmun. 2001 69:3762) . Por lo tanto, mAb 4B1 1 puede reconocer un epítopo NspA que es específico para la cepa 8047, o un epítopo u otra proteína de membrana que no está presente en la cepa BZ198 pero está presente y asociada con la expresión NspA en la cepa 8047. Tomados juntos, los resultados con los diferentes mAbs muestran que la vacuna de antígeno anti-CHORI produce anticuerpos contra tanto proteínas altamente conservadas como no conservadas. L. Actividad bactericida de mAbs de antígeno anti-CHORI con cepas MenB diversas La actividad bactericida mediada por complemento de mAbs preparados de ratones inmunizados con antígeno anti-CHORI, y probados contra cepas enV se resume en la Figura 20. El anticuerpo monoclonal 1 D9, que reacciona por ELISA con todas las cepas de N. meningitidis probadas, no fue bactericida. El anticuerpo 14C7 monoclonal, que parece reconocer NspA, fue bactericida o bacterioestático contra todas las cepas probadas excepto BZ198ANspA (un derivado de NspA). La actividad del anticuerpo monoclonal 14C7 fue superior a aquella del anticuerpo monoclonal de control AL12 (producido en ratones inmunizados con NspA recombinante (ver Moe et al., Infect. Immun. 2001 69:3762). Esta observación sugiere que la inmunización con la vacuna CHORI proporciona un medio superior para producir anticuerpos anti-NspA en comparación con la inmunización con una vacuna en base a NspA recombinante. El anticuerpo monoclonal 4B1 1 (un anticuerpo Ig ) fue bactericida contra cepas 1000 y CU385. Observe que el anticuerpo monoclonal 4B1 1 no reacciona con estas mismas cepas por ELISA de célula completa a la concentración más elevada probada (ver Figura 19). El análisis bactericida mide la actividad del anticuerpo funcional utilizando bacterias vivas mientras que la ELISA de célula bacterial mide el anticuerpo que se une a bacterias muertas por calor, que en estas cepas pueden tener desnaturalizado el objetivo antigónico de mAb 4B1 1 . DEPÓSITOS Un depósito de cultivos biológicamente puros de los materiales en la tabla de abajo se hace con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manasas, VA 201 10-2209, bajo las provisiones del Tratado de Budapest, en o antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. El número de acceso indicado se asigna después de la prueba de viabilidad exitosa, y los honorarios de requisito se pagan. El acceso a dichos cultivos será disponible durante la suspensión de la solicitud de patente a una determina por el Comisionado a nombrarse bajo 37 C. F. R. §1 .14 y 35 U.S.C. §122. Toda la restricción en la disponibilidad de dichos cultivos al público se removerá irrevocablemente en la garantía de una patente en base a la solicitud. Además, los depósitos designados se mantendrán por un periodo de treinta (30) años desde la fecha de depósito, o por cinco (5) años después de la última solicitud de depósito; o por la vida exigible de la Patente de E. U. cualquiera que sea su duración. Si un cultivo se vuelve no viable o se destruye de manera inadvertida, o, en el caso de cepas que contienen plásmido, se pierde su plásmido, se reemplazará con un cultivo viable de la misma descripción taxonómica. Estos depósitos se proporcionan meramente como una conveniencia para aquellos de experiencia en la materia, y no son una admisión que requiere un depósito. Puede requerirse licencia para hacer, utilizar o vender los materiales depositados, y tal licencia no se garantiza en la presente. El depósito de abajo se recibe por ATCC en o antes de la fecha de presentación de la presente solicitud.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para producir inmunidad protectora de espectro amplio contra Neisseria meningitidis, dicho método comprendiendo las etapas de: administrar a un mamífero una primer preparación de microvesícuias (MVs) de una primer especie de Neisseria meningitidis que es un miembro de un primer serotipo y de un primer serosubtipo, en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha primer preparación; y administrar a dicho mamífero una segunda preparación de MVs de una segunda especie de Neisseria meningitidis que es un miembro de un segundo serotipo y de un segundo serosubtipo, en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha segunda preparación ; en donde el serotipo o serosubtipo de cada una de la primer, segunda y tercer especie de Neisseria meningitidis es diferente, y en donde la administración de la primer, segunda y tercer preparación es suficiente para producir una respuesta inmune en dicho mamífero, en donde dicha respuesta inmune confiere inmunidad protectora contra una enfermedad causada por más de una cepa de especies de Neisseria meningitidis. 2. El método según la reivindicación 1 , el método comprendiendo además: administrar a dicho mam ífero una tercer preparación de vesículas de membrana exterior (OMV), MVs, o ambas, OMVs y MVs, de una tercer especie de Neisseria meningitidis que es un miembro de un tercer serotipo y un tercer serosubtipo, en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha tercer preparación. 3. El método según la reivindicación 2, caracterizado porque la primer, segunda y tercer preparación se administran serialmente. 4. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque las preparaciones se administran de manera que la primer preparación se administra primero, la segunda preparación se administra después, y la tercer administración se administra al último. 5. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la primer, segunda y tercer preparación se administran como una mezcla. 6. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la tercer preparación comprende Vs. 7. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la inmunidad protectora conferida es contra una enfermedad en al menos cuatro cepas de especie de Neisseria meningitidis. 8. El método según la reivindicación 7, caracterizado porque la inmunidad protectora conferida es contra una enfermedad causada por más de una cepa de especie de Neisseria meningitidis de serogrupo B. 9. Un método para producir inmunidad protectora de espectro amplio contra una enfermedad causada por un miembro de serogrupo B de Neisseria meningitidis, dicho método comprendiendo las etapas de: administrar a un mamífero una primer preparación de microvesículas (MVs) de una primer especie de Neisseria meningitidis que es un miembro de un primer serosubtipo, en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha primer preparación; administrar a dicho mamífero una segunda preparación de MVs de una segunda especie de Neisseria meningitidis que es un miembro de un segundo serosubtipo, en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha segunda preparación; en donde el serosubtipo de cada una de la primer y segunda especie de Neisseria meningitidis es diferente, y en donde la administración de la primer y segunda preparación es suficiente para producir una respuesta inmune en dicho mamífero, en donde dicha respuesta inmune confiere inmunidad protectora contra una enfermedad causada por al menos cuatro cepas de especies de Neisseria meningitidis. 10. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque el método comprende además administrar a dicho mamífero una tercer preparación de una tercer especie de Neisseria meningitidis que es un miembro de un tercer serosubtipo, la tercer preparación comprendiendo vesículas de membrana exterior (OMV), MVs, o ambas, OMVs y MVS, dicha administración siendo una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha tercer preparación, en donde el serosubtipo de la primer y tercer especie es diferente. 1 1 . El método según la reivindicación 10, caracterizado porque el serosubtipo de la primer, segunda y tercer especie es diferente. 12. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque la primer y segunda preparación se administran como una mezcla. 1 3. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque la primer y segunda preparación se administran serialmente. 14. Un método para producir inmunidad protectora de espectro amplio contra una enfermedad causada por una especie de Neisseria meningitidis, dicho método comprendiendo las etapas de: administrar a un mamífero una primer preparación de una primer especie de Neisseria meningitidis, la primer preparación comprendiendo las vesículas de membrana exterior (OMV) , microvesículas (MV), o ambas, OMV y MV, dicha administración de la primer preparación siendo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha primer preparación ; administrar a un mamífero una segunda preparación de una segunda especie de Neisseria meningitidis que es genéticamente diversa a la primer especie de Neisseria meningitidis, la segunda preparación comprendiendo las vesículas de membrana exterior (OMV) , microvesículas (MV), o ambas, OMV y MV, dicha administración de la segunda preparación siendo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha segunda preparación; en donde la administración de la primer y segunda preparación produce una respuesta inmune en dicho mamífero, en donde dicha respuesta inmune confiere inmunidad protectora contra una enfermedad causada por más de una cepa de especie de Neisseria meningitidis. 15. El método según la reivindicación 14, caracterizado porque comprende la etapa adicional de administrar a dicho mamífero una tercer preparación de vesículas de membrana exterior de una tercer especie de Neisseria meningitidis, tal tercer especie que es genéticamente diversa a al menos la primer especie de Neisseria meningitidis, dicha administración siendo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epftopos presentes en dicha tercer preparación. 16. Un método para producir inmunidad protectora de espectro amplio contra una enfermedad causada por una especie de Neisseria meningitidis, dicho método comprendiendo las etapas de: administrar a un mamífero una primer preparación de antígeno de una primer especie de Neisseria meningitidis, dicha administración de la primer preparación siendo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha primer preparación; administrar al mamífero una segunda preparación de antígeno de una segunda especie de Neisseria meningitidis que es genéticamente diversa a la primer especie de Neisseria meningitidis, dicha administración de la segunda preparación siendo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha segunda preparación; en donde la administración de la primer y segunda preparación produce una respuesta inmune en dicho mamífero, en donde dicha respuesta inmune confiere inmunidad protectora contra una enfermedad causada por más de una cepa de especie de Neisseria meningitidis. 17. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque el método comprende además administrar al mam ífero una tercer preparación de antígeno de una tercer especie de Neisseria menlngitidis que es genéticamente diversa a al menos la primer especie de Neisseria meningitidis, dicha administración de la tercer preparación siendo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha segunda preparación. 18. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque la primer y segunda preparación de antígeno se administran serialmente. 19. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque la primer y segunda preparación de antígeno se administran como una mezcla. 20. El método según las reivindicaciones 1 , 9, 14 ó 16, caracterizado porque las preparaciones de OMV y MV se administran junto con excipientes farmacéuticamente aceptables. 21 . El método según las reivindicaciones 1 , 9, 14 ó 16, caracterizado porque los excipientes comprenden un adyuvante. 22. El método según las reivindicaciones 1 , 9. 14 ó 16, caracterizado porque el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, alum o MF59. 23. El método según las reivindicaciones 1 , 9, 14 ó 16, caracterizado porque la administración es por inyección. 24. El método según las reivindicaciones 1 , 9, 14 ó 16, caracterizado porque la administración es por administración oral o por aerosol . 25. El método según las reivindicaciones 1 , 9, 14 ó 16, ca ra eteriza do porque el mamífero es un humano . 26. El método según la reivindicación 25, caracterizado porque el humano es ¡nmunológicamente inocente con respecto a Neisseria meningitidis. 27. El método según la reivindicación 25, caracterizado porque el humano es un niño humano de menos de cinco años de edad. 28. Un método para identificar un epftopo antigénico que produce inmunidad protectora de espectro amplio contra una enfermedad causada por especie de Neisseria meningitidis, dicho método comprendiendo las etapas de: administrar a un mamífero una primer preparación de vesículas de membrana exterior (OMV), microvesículas (MV) , o ambas, OMV y MV de una primer especie de Neisseria meningitidis. Dicha administración siendo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha primer preparación; administrar a dicho mamífero al menos una segunda preparación de vesículas de membrana exterior (OMV), m icrovesículas (MV), o ambas, OMV y MV de una segunda especie de Neisseria meningitidis, en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha segunda preparación, en donde la segunda Neisseria meningitidis spp es genéticamente diversa a la primer Neisseria meningitidis spp, y en donde dicha administración de la primer y segunda preparación es suficiente para producir una respuesta inmune a al menos un epítopo presente en dicha primer y segunda preparación, y en donde dicha respuesta confiere inmunidad protectora contra una - loe -enfermedad causada por especie de Neisseria meningitidis; e identificar al menos un epítopo que produce inmunidad protectora de espectro amplio contra una enfermedad causada por especie de Neisseria meningitidis. 29. Una composición que comprende: una primer preparación seleccionada del grupo que consiste de vesícula de membrana exterior (OMV), microvesículas (MV), o ambas, O V y MV de una primera da una primer especie de Neisseria meningitidis, y una segunda preparación seleccionada del grupo que consiste de vesícula de membrana exterior (OMV), microvesículas (MV), o ambas, OMV y MV de una segunda especie de Neisseria meningitidis, en donde la segunda Neisseria meningitidis spp es genéticamente diversa a la primer especie de Neisseria meningitidis; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 30. La composición según la reivindicación 29, que comprende además: una tercer preparación seleccionada del grupo que consiste de vesícula de membrana exterior (OMV) , microvesículas (MV) , o ambas, OMV y MV de una tercer especie de Neisseria meningitidis, en donde la tercer especie de Neisseria meningitidis es genéticamente diversa a la primer especie de Neisseria meningitidis. 31 . La composición según la reivindicación 30, caracterizada porque: la primer preparación comprende MV; la segunda preparación comprende V; y la tercer preparación comprende OMV. 32. La composición según la reivindicación 29, caracterizada porque la primer y segunda especie de Neisseria meningitidis son genéticamente diversas en que difieren en al menos uno de serotipo o serosubtipo. 33. La composición según la reivindicación 31 , caracterizada porque la primer y tercer especie de Neisseria meningitidis son genéticamente diversas en que difieren en al menos uno de serotipo o serosubtipo. 34. Una composición que comprende: al menos un antígeno de Neisseria meningitidis aislado, el antígeno aislado estando presente en la composición en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune en un huésped mamífero, y caracterizándose como una proteína inmunoprecipitada con anti-sueros producidos después de la vacunación de un mamífero con la composición de la reivindicación 31 , y teniendo una masa molecular aparente seleccionada del grupo que consiste de aproximadamente 80 kDa, aproximadamente 59.5 kDa, aproximadamente 40.7 kDa, aproximadamente 39.6 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 27.9 kDa y 14.5 kDa; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 35. Una composición que comprende: al menos un antígeno de Neisseria meningitidis aislado, el antígeno aislado estando presente en la composición en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune en un huésped mamífero, y caracterizada como una proteína detectada por Western blot con antisueros producidos después de la vacunación de un mamífero con la composición de la reivindicación 31 , y que tiene una masa molecular aparente seleccionada del grupo que consiste de aproximadamente 53 kDa a 57 kDa; aproximadamente 46-47 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 20 kDa a 21 kDa, y aproximadamente 18 kDa; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 36. Una composición que comprende: al menos un antígeno de Neisseria meningitidis aislado, el antígeno aislado estando presente en la composición en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune en un huésped mamífero, en donde el antígeno es de una proteína que se une específicamente a un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste de I D9 (No. de Acceso ATCC xx), 4B 1 1 (No. de Acceso ATCC xx) , 9B8 (No. de Acceso ATCC xx) y 14C7 (No. de Acceso ATCC xx); y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 37. La composición según la reivindicación 34, 35 ó 36, caracterizada porque la composición comprende al menos dos antígenos de Neisseria meningitidis aislados. 38. Una composición que comprende antígenos de Neisseria meningitidis aislados, caracterizada porque dichos antígenos se identifican por el método de la reivindicación 28. 39. Un método para producir inmunidad protectora de espectro amplio contra una enfermedad causada por una especie de Neissería meningitidis, dicho método comprendiendo administrar a un mamífero la composición da la reivindicación 34, 35, 36 ó 38. RESU MEN La presente invención proporciona generalmente métodos y vacunas para la prevención de enfermedades causadas por la bacteria Neisseria meningitidis, particularmente cepas del serogrupo B.