JP6025675B2 - 髄膜炎菌抗原および組成物 - Google Patents
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Description
れ、そしてその全体において参考として援用される:60/083,758(1998年
5月1日出願);60/094,869(1998年7月31日出願);60/098,
994(1998年9月2日出願);60/099,062(1998年9月2日出願)
;60/103,749(1998年10月9日出願);60/103,794(199
8年10月9日出願);60/103,796(1998年10月9日出願);および6
0/121,528(1999年2月25日出願)。
ria gonorrhoeae由来の抗原に関する。
Neisseria meningitidisは、非運動性のグラム陰性双球菌ヒト
病原体である。これは、咽頭にコロニー形成をし、髄膜炎(および、時折、髄膜炎のない
敗血症)を引き起こす。これは、N.gonorrhoeaに密接に関連しているが、髄
膜炎菌が淋病菌と明らかに異なる1つの特徴は、全ての病原性髄膜炎菌に存在する多糖類
性被膜の存在である。
いて、発病率は1年間に100,000人中0.6〜1人の割合であり、そして大発生に
よりずっと大きくなり得る(Liebermanら(1996)Safety and
Immunogenicity of a Serogroups A/C Neiss
eria meningitidis Oligosaccharide−Protei
n Conjugate Vaccine in Young Children.JA
MA 275(19):1499−1503;Schuchatら(1997)Bact
erial Meningitis in the United States in
1995,N Engl J Med 377(14):970−976)。発展途上
国では、風土病の割合は、よりずっと大きくそして伝染病発生率は1年間あたり100,
000人あたり500件に達し得る。死亡率は極めて高く、米国では10〜20%、そし
て発展途上国においてはよりずっと高い。Haemophilus influenza
eに対する共役ワクチンの導入の結果、N.meningitidisは、米国において
全ての年齢における細菌性髄膜炎の主な原因である(Schuchat(1997)前出
)。
ている。A群はサハラアフリカ周縁での伝染病において最も頻繁に関与している病原体で
ある。血清型B群および血清型C群は、米国および大部分の先進国における症例の大部分
の原因である。血清型W135およびYは、米国および先進国における症例の残りの原因
である。現在使用される髄膜炎ワクチンは、血清型A、C、Y、およびW135で構成さ
れる4価の多糖類ワクチンである。これは、青年および成人には効果があるが、弱い免疫
応答および短い保護持続期間を誘導し、そして乳児には使用され得ない(例えば、Mor
bidity and Mortality weekly report,46巻,N
o.PR−5(1997))。これは、多糖類が、繰り返し免疫処置により増強され得な
い弱い免疫応答を誘導するT細胞独立性抗原であるからである。H.influenza
に対するワクチン接種の成功に続き、血清型Aおよび血清型Cに対する共役ワクチンが開
発されており、そして臨床試験の最終段階である(Zollinger WD「New
and Improved Vaccines Against Meningococ
cal Disease」New Generation Vaccines,上記,4
69−488頁;Liebermanら(1996)上記;Costantinoら(1
992)Development and phease I clinical te
sting of a conjugate vaccine against men
ingococus AおよびC.Vaccine 10:691−698)。
、欧州、および南アメリカにおける全髄膜炎のおおよそ50%の原因である。この多糖類
アプローチは使用され得ない。なぜならばmenB被膜多糖類は、哺乳動物組織にもまた
存在するα(2−8)−連結N−アセチルノイラミン酸のポリマーであるからである。こ
れは抗原に対する寛容性を生ずる;実際、免疫応答が惹起された場合、それは抗−自己で
あり、それ故、所望されない。自己免疫の誘導を回避しそして保護的免疫応答を誘導する
ために、この被膜性多糖類は、例えば、N−アセチル基をN−プロピオニル基と置換して
化学的に改変されるが、特異的抗原性は不変のままである(RomeroおよびOuts
choorn(1994)Current Status of Meningococ
cal group B vaccine candidates:capsular
or non−capsular? Clin Microbiol Rev 7(4)
:559−575)。
合物(OMPのみを含むかまたはポーリンに富むOMPのいずれかを含む)を使用するか
、または細菌活性をブロックする抗体を誘導すると考えられるクラス4OMPを欠失した
。このアプローチは、十分に特徴付けられていないワクチンを産生する。それらワクチン
は、相同な菌株に対して保護し得えるが、外膜タンパク質の多くの抗原性改変体が多く存
在する場合、全体として効果がない。抗原変異性を克服するために、9つまでの異なるポ
ーリンを含む多価ワクチンが構築されている(例えば、Poolman JT(1992
)Development of a meningococcal vaccine.
Infect.Agents Dis.4:13−28)。外膜ワクチンで使用されるさ
らなるタンパク質は、opaおよびopcタンパク質であるが、これらのアプローチは抗
原変異性を克服し得ない(例えば、Ala’AldeenおよびBorriello(1
996)The meningococcal tranferrin−binding
proteins 1 and 2 are both surface expos
ed and generate bactericidal antibodies
capable of killing homologous and hetero
logous strains.Vaccine 14(1):49−53)。
EP−A−0467714,WO96/29412)について利用可能であるが、これは
決して完全ではない。他のmenBタンパク質としては、WO97/28273、WO9
6/29412、WO95/03413、US5,439,808、およびUS5,87
9,686に列挙されるものが挙げられ得る。
とのない分泌タンパク質または表面露出タンパク質を同定するための機会を提供し得た。
例えば、同定されたタンパク質のいくつかは、髄膜炎菌Bに対して効果のあるワクチンの
成分であり、いくつかは全ての髄膜炎菌血清型に対するワクチンの成分であり、そして他
は全ての病原性Neisseriae(Neisseria meningitidis
またはNesseria gonorrhoeaeを含む)に対するワクチンの成分であ
り得た。より高度に保存されるN.meningitidisまたはN.gonorrh
oeaeに特異的なsoれらの配列は、さらに好ましい配列である。
従って、本発明の目的は、抗原性または免疫原性のタンパク質をコードするナイセリア
DNA配列を提供することである。
本発明は、本実施例で開示されたN.meningitidisアミノ酸配列およびN
.gonorrhoeaeアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1) 配列番号2790からのアミノ酸配列のフラグメントを含むタンパク質であ
って、ここで該フラグメントが、該配列からの少なくとも7アミノ酸を含む、タンパク質
。
(項目2) 配列番号2〜配列番号3020の偶数の配列番号からなる群より選択される
アミノ酸配列を含む、タンパク質。
(項目3) 項目1に記載のタンパク質に対して50%以上の相同性を有する、タンパク
質。
(項目4) 配列番号2〜配列番号3020の偶数の配列番号からなる群より選択される
アミノ酸配列のフラグメントを含むタンパク質であって、ここで該フラグメントが、該配
列からの14以上の連続するアミノ酸を含む、タンパク質。
(項目5) 項目1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質に特異的に結合する、抗体。
(項目6) 項目1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする、核酸分子。
(項目7) 配列番号1〜配列番号3019の奇数の配列番号からなる群より選択される
ヌクレオチド配列を含む、項目5に記載の核酸分子。
(項目8) 配列番号1〜配列番号3019の奇数の配列番号からなる群より選択される
ヌクレオチド配列のフラグメントを含む核酸分子であって、ここで該フラグメントが、該
配列からの40以上の連続するヌクレオチドを含む、核酸分子。
(項目9) 項目6に記載の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
(項目10) 項目7に記載の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
(項目11) 項目8に記載の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
(項目12) 項目1〜12のいずれかに記載のタンパク質、核酸、または抗体を含む、
組成物。
(項目13) ワクチン組成物または診断用組成物である、項目12に記載の組成物。
(項目14) 医薬品として使用するための、項目12に記載の組成物。
(項目15) 髄膜炎菌に起因する感染の処置または予防のための医薬の製造における、
項目12に記載の組成物の、使用。
(項目16) 項目1に記載のタンパク質を含む組成物であって、該組成物が免疫原性で
ある、組成物。
(項目17) 項目2に記載のタンパク質を含む組成物であって、該組成物が免疫原性で
ある、組成物。
(項目18) 項目3に記載のタンパク質を含む組成物であって、該組成物が免疫原性で
ある、組成物。
な(すなわち、配列同一性を有する)配列を含むタンパク質を提供する。この特定の配列
に依存して、相同性の程度(配列同一性)は、好ましくは50%よりも大きい(例えば、
60%、70%、80%、90%、95%、99%以上)。これらのタンパク質は、本実
施例で開示される配列の変異体および対立遺伝子改変体を含む。代表的には、2つのタン
パク質の間の50%以上の同一性は、機能的に等価であることの表示であると考えられる
。タンパク質間の同一性は、好ましくは、パラメーター(gap penalty 12
,gap extention penalty 1)でのaffine gap検索を
使用して、MPSRCHプログラム(Oxford Molecular)において実行
されるようなSmith−Waterman相同性検索アルゴリズムによって決定される
。
よびN.gonorrhoeaeアミノ酸配列のフラグメントを含むタンパク質を提供す
る。このフラグメントは、その配列由来の少なくともn個の連続したアミノ酸を含むべき
であり、そしてその特定の配列に依存して、nは7以上(例えば8、10、12、14、
16、18、20以上)である。好ましくはこのフラグメントは、その配列に由来するエ
ピトープを含む。
の精製、化学合成など)によって、および種々の型で(例えば、天然型、融合型など)調
製され得る。これらは、好ましくは実質的に純粋または単離された型で調製される(すな
わち、他のN.meningitidisまたはN.gonorrhoeae宿主細胞タ
ンパク質を実質的に含まない)。
れらは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして任意の適切な手段により
産生され得る。
sヌクレオチド配列およびN.gonorrhoeaeヌクレオチド配列を含む核酸を提
供する。
えば、60%、70%、80%、90%、95%、99%またはそれ以上)配列同一性を
有する核酸を含む。配列同一性は、上記に議論されるように決定される。
核酸を含む。ハイブリダイゼーションの条件は、本明細書中に示される。
ngitidis配列またはN.gonorrhoeae配列由来の少なくともn個の連
続するヌクレオチドを含有すべきであり、そして特定の配列に依存して、nは10または
それ以上(例えば、12、14、15、18、20、25、30、35、40またはそれ
以上)である。
をコードする核酸を提供する。
されるべきである(例えば、アンチセンスの目的またはプロービングの目的のために)。
全体的に、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから、生物自体からなど)で
調製され得、そして種々の型(例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど)をと
り得る。
改変された骨格を含むDNAおよびRNA)もまた、そしてタンパク質核酸(PNA)な
どもまた含む。
、発現ベクター)およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
を含む組成物を提供する。これらの組成物は、例えば、ワクチンとして、または診断用試
薬として、または免疫原性組成物として適切であり得る。
するための、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体を提供する。また、以下の製造
における、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体の使用を提供する:(i)ナイセ
リア細菌に起因する感染の処置または予防のための医薬品;(ii)ナイセリア細菌また
はナイセリア細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断用試薬;あるいは
(iii)抗体を惹起し得る試薬。上記のナイセリア細菌は任意の種または株(例えば、
N.gonorrhoeae)であり得るが、好ましくは、N.meningitidi
s(特に、B株またはC株)である。
を患者に投与する工程を包含する、患者の処置の方法を提供する。
ク質または核酸は、化学的手段を使用して、一部または全体が合成されるプロセスが提供
される。
プローブを、二重鎖を形成するハイブリダイズの条件下で生物学的サンプルと接触させる
工程;および(b)上記の二重鎖を検出する工程を包含する、プロセスが提供される。
抗体−抗原複合体の形成に適した条件下で生物学的サンプルと接触させる工程;および(
b)上記の複合体を検出する工程を包含する、プロセスが提供される。
ここで、本発明を一般的に記載してきたが、同じことが、例示目的で提供され、そして
明記しない限り、本発明を限定することを意図されない、以下の実施例を参照することに
よって、より容易に理解され得る。
(一般)
本発明は、Neisseria meningitidis menBヌクレオチド配
列、そこにコードされるアミノ酸配列を提供する。これらの開示される配列を用いて、核
酸プローブアッセイ、ならびに発現カセットおよび発現ベクターが産生され得る。発現ベ
クターは、タンパク質を産生するために宿主細胞内に形質転換され得る。精製された、ま
たは単離されたポリペプチド(これもまた、化学的に合成され得る)は、menBタンパ
ク質を検出するための抗体を産生するために使用され得る。また、宿主細胞または抽出物
は、アゴニストまたはアンタゴニストを単離するための生物学的アッセイに利用され得る
。さらに、これらの配列を用いて、オープンリーディングフレームを同定して、そしてア
ミノ酸配列を同定するために検索し得る。タンパク質はまた、免疫原性組成物、抗原性組
成物中で、およびワクチン成分として利用され得る。
免疫学の慣習的な技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技
術は以下の文献で十分説明されている(例えば、Sambrook Molecular
Cloning:A Laboratory Manual 第2版(1989);D
NA Cloning,第I巻および第II巻(D.N Glover編 1985);
Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編 1984
);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hamesおよ
びS.J.Higgins編 1984);Transcription and Tr
anslation(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編 1984)
;Animal Cell Culture(R.I.Freshney編 1986)
;Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press
,1986);B.Perbal,A Practical Guide to Mol
ecular Cloning(1984);the Methods in Enzy
mologyシリーズ(Academic Press,Inc.),特に154巻およ
び155巻;Gene Transfer Vector for Mammalian
Cells(J.H.MillerおよびM.P.Calos編1987,Cold
Spring Harbor Laboratory);MayerおよびWalker
,編(1987),Immunochemical Methods in Cell
and Molecular Biology(Academic Press,Lon
don);Scopes,(1987)Protein Purification:P
rinciples and Practice,第2版(Springer−Verl
ag,N.Y.)、およびHandbook of Experimental Imm
unology,第I巻−第IV巻(D.M.WeirおよびC.C.Blackwel
l編 1986)。
。
援用される。
Neisseria menBヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系;例えば、哺
乳動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母と共に使用される発現系に
おいて発現され得る。
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物R
NAポリメラーゼを結合し、コード配列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへの下流(3
’)転写を開始し得る任意のDNA配列である。プロモーターは、転写開始領域(これは
コード配列の5’末端の近位に通常位置する)およびTATAボックス(転写開始部位の
25〜30塩基対(bp)上流に通常位置する)を有する。TATAボックスは、その正
しい部位においてRNAポリメラーゼIIにRNA合成を開始させるよう指示すると考え
られている。哺乳動物プロモーターはまた、TATAボックスの100〜200bp上流
以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは
、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る速度を決定する(Samb
rookら(1989)「Expression of Cloned Genes i
n Mammalian Cells」 Molecular Cloning:A L
aboratory Manual、第2版)。
従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提
供する。例は、SV40初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスLTRプロモーター、
アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、および単純疱疹ウイルスプロモ
ーターを含む。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に
由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成性であるかまた
は調節される(誘導可能)かのいずれかであり得る。選択されるプロモーターに依存して
、多くのプロモーターは、公知の基質を使用して誘導可能であり得る(例えば、マウス乳
腺癌ウイルス(MMTV)プロモーターのグルココルチコイド応答性エレメント(GRE
)との使用(このプロモーターは、ホルモン応答性形質転換細胞においてグルココルチコ
イドにより誘導される))。例えば、米国特許第5,783,681号を参照のこと。
エンハンサー)の存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサーは、同種プロモー
ターまたは異種プロモーターに連結される場合、転写を1000倍まで刺激し得る調節D
NA配列であり、合成は、通常のRNA開始部位で開始する。エンハンサーはまた、それ
らが、通常方向もしくは逆の(flipped)方向のいずれかで転写開始部位より上流
または下流に、もしくはプロモーターから1000ヌクレオチドを超える距離で位置され
る場合、活性である(Maniatisら(1987) Science 236:12
37;Albertsら(1989)Molecular Biology of th
e Cell,第2版)。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらは通常、よ
り広い宿主範囲を有するため、特に有用であり得る。例は、SV40初期遺伝子エンハン
サー(Dijkemaら(1985)EMBO J.4:761)およびラウス肉腫ウイ
ルスの長末端反復(LTR)に由来するエンハンサー/プロモーター(Gormanら(
1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.79:6777)およびヒトサイ
トメガウイルスに由来するエンハンサー/プロモーター(Boshartら(1985)
Cell 41:521)を包含する。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であ
り、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になる(Sa
ssone−CorsiおよびBorelli(1986)Trends Genet.
2:215;Maniatisら(1987)Science 236:1237)。
換えタンパク質のN末端における最初のアミノ酸が常にATG開始コドンによりコードさ
れるメチオニンである場合、DNA分子と直接連結され得る。所望される場合、N末端は
、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る
。
するリーダー配列フラグメントで構成される融合タンパク質をコードするキメラDNA分
子を作製することにより、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまた
はインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リーダーフラグメントおよび外来遺伝子
との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、
細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸で構成される単一のペプチドをコ
ードする。アデノウイルス3分割(tripartite)リーダーは、哺乳動物細胞に
おける外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
訳終止コドンの3’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共
に、コード配列に隣接する。成熟mRNAの3’末端は、部位特異的転写後切断およびポ
リアデニル化により形成される(Birnstielら.(1985)Cell 41:
349;ProudfootおよびWhitelaw(1988)「Terminati
on and 3’end processing of eukaryotic RN
A.」Transcription and splicing(B.D.Hamesお
よびD.M.Glover編);Proudfoot(1989)Trends Bio
chem.Sci.14:105)。これらの配列は、mRNAの転写を方向づけ、その
mRNAは、そのDNAにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネータ
ー/ポリアデニル化シグナルの例としては、SV40由来のシグナルが挙げられる(Sa
mbrookら(1989)「Expression of cloned genes
in cultured mammalian cells.」Molecular
Cloning:A Laboratory
Manual)。
要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライスドナー部位
およびアクセプター部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される
場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のよ
うな宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント(例えば、プラスミド)のような、
レプリコン内で維持される。哺乳動物複製系としては、複製にトランス作用性の因子を必
要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、SV40(Gluzmam
(1981)Cell 23:175)、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウ
イルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのT抗原の存在下で極めて高いコピ
ー数で複製する。哺乳動物レプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルスお
よびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコ
ンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用の哺乳動物細胞内で、ならびにク
ローニングおよび増幅用の原核生物の宿主内で、そのレプリコンは維持することが可能で
ある。このような哺乳類−細菌シャトルベクターの例としては、pMT2(Kaufma
nら、(1989)Mol.Cell.Biol.9:946)およびpHEBO(Sh
imizuら、(1986)Mol.Cell.Biol.6:1074)が挙げられる
。
ドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキスト
ラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェク
ション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオ
チドの封入、およびDNAの核内への直接微量注入が挙げられる。
胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、乳仔ハムス
ター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep
G2)および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、American
Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの不
死化細胞株が含まれる。
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物遺伝子発現系が存在する。例示的な
植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第5,693,506号;米国特許第5,65
9,122号;および米国特許第5,608,143号のような特許文献に記載されるも
のが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Zenk,Phyt
ochemistry 30:3861−3863(1991)に記載されている。植物
タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加えて、以下の文献において
も見出され得る;Vaulcombeら,Mol.Gen.Genet.209:33−
40(1987);Chandlerら,Plant Molecular Biolo
gy 3:407−418(1984);Rogers,J.Biol.Chem.26
0:3731−3738(1985);Rothsteinら,Gene 55:353
−356(1987);Whittierら,Nucleic Acids Resea
rch 15:2515−2535(1987);Wirselら,Molecular
Microbiology 3:3−14(1989);Yuら,Gene 122:
247−253(1992)。植物ホルモンであるジベレリン酸、およびジベレリン酸に
より誘導される分泌酵素による植物遺伝子発現の調節の記載は、R.L.Jonesおよ
びJ.MacMillin,Gibberellins:Advanced Plant
Physiology,Malcolm B.Wilkins編,1984 Pitm
an Publishing Limited,London,21−52頁に見出され
得る。他の代謝調節遺伝子が記載される参考文献;Sheen,Plant Cell,
2:1027−1038(1990);Maasら,EMBO J.9:3447−34
52(1990);BenkelおよびHickey,Proc.Natl.Acad.
Sci.84:1337−1339(1987)。
内で操作するために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセット中に挿入する。
その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコン
パニオン配列を有する望ましい発現ベクター中に挿入される。そのコンパニオン配列は、
プラスミド起源またはウイルス起源でのものあり、そしてそのベクターが、細菌のような
本来のクローニング宿主から所望の植物宿主へDNAが移動することを可能にするために
必要とされる特徴をベクターに提供する。基本的な細菌/植物ベクター構築物は、好まし
くは、広範な宿主範囲の原核生物の複製起点;原核生物の選択マーカー;および、Agr
obacteriumの形質転換についてAgrobacterium媒介転位のための
T DNA配列、を植物染色体に提供する。異種遺伝子が検出に容易に反応しない場合は
、好ましくは、その構築物はまた、植物細胞が形質転換されたか否かの決定に適した選択
マーカー遺伝子も有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科のメンバー
については、WilminkおよびDons,1993,Plant Mol.Biol
.Reptr,11(2):165−185に見出される。
これらは、植物ゲノム内へ異種発現カセットのランダム挿入を可能にする相同組換えのた
めのトランスポゾン配列など、およびTi配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカー
としては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げら
れる。当該分野で公知であるように、さらなる機能をコードする他のDNA配列もまた、
そのベクター中に存在し得る。
る。2つ以上の発現カセットも可能であるが、通常は一つのみの発現カセットである。組
換え発現カセットは、異種タンパク質のコード配列に加えて、以下のエレメントを含む;
プロモーター領域、植物5’非翻訳配列、開始コドン(構造遺伝子が開始コドンを備えて
いるか否かに依存する)、ならびに転写配列および翻訳終結配列。そのカセットの5’末
端および3’末端の独特な制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にす
る。
目的のタンパクをコードする配列は、適切に、そのタンパク質のプロセッシングおよび輸
送を可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の
膜への結合を生じ得る任意の配列を欠く。転写開始領域は、大部分は、発芽中に発現およ
び輸送される遺伝子のためのものであるから、輸送を規定するシグナルペプチドを使用す
ることにより、それはまた、目的のタンパク質の輸送を提供し得る。この方法で、目的の
タンパク質は、それらが発現される細胞から輸送され、そして効率的に回収され得る。代
表的には、種子における分泌は、種子の胚乳へ、アリューロン層または胚盤上皮層を通過
する。タンパク質が産生された細胞から分泌される必要がない一方で、これは組換えタン
パク質の単離および精製を容易にする。
任意の部分が、イントロンのように宿主のスプライセオソーム(splicosome)
機構によってプロセシングされる配列を含むか否かを決定することが望ましい。そのよう
な場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、偽イントロンコード(false
intron code)として遺伝的情報の一部を欠失することを防ぐように実施さ
れ得る(ReedおよびManiatis、Cell 41:95−105(1985)
)。
よって、植物細胞内に直接的に微量注入され得る。Crossway、Mol.Gen.
Genet,202:179−185、1985。遺伝物質はまた、ポリエチレングリコ
ールを用いて植物細胞内に転移され得る(Krensら、Nature、296、72−
74、1982)。核酸部分の導入の別の方法は、小さいビーズまたは微粒子のいずれか
のマトリックスの内部に、あるいは表面に核酸を有する小さな微粒子による高速バリステ
ィック(ballistic)穿通法である(Kleinら,Nature,327,7
0−73,1987ならびにKnudsenおよびMuller,1991,Plant
a,185:330−336は、大麦胚乳の粒子の照射(bombardment)によ
りトランスジェニック大麦を作製することを示している)。さらに別の導入方法は、他の
物体、いずれかのミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の易融な脂肪表面体とのプロト
プラストの融合である(Fraleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,79,1859−1863,1982)。
mら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824,1985)。
この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在下でエ
レクトロポレートされる。高い電界の強さの電気衝撃により、生体膜を可逆的に通過でき
るようにして、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレートされた植物プロトプ
ラストは細胞壁を再形成し、分裂して、そして植物カルス形成する。
、本発明により形質転換され得、転移された遺伝子を保持する完全な植物が再生される。
実際に、全ての植物は、培養細胞あるいは組織(さとうきび、甜菜、綿、果実および他の
樹木、マメ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない)から再生
され得る。いくつかの適した植物としては、例えば、以下の属由来の種が挙げられる;F
ragaria,Lotus,Medicago,Onobrychis,Trifol
ium,Trigonella,Vigna,Citrus,Linum,Gerani
um,Manihot,Daucus,Arabidopsis,Brassica,R
aphanus,Sinapis,Atropa,Capsicum,Datura,H
yoscyamus,Lycopersion,Nicotiana,Solanum,
Petunia,Digitalis,Majorana,Cichorium,Hel
ianthus,Lactuca,Bromus,Asparagus,Antirrh
inum,Hererocallis,Nemesia,Pelargonium,Pa
nicum,Pennisetum,Ranunculus,Senecio,Salp
iglossis,Cucumis,Browaalia,Glycine,Loliu
m,Zea,Triticum,Sorghum,およびDatura。
形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織が形成され、そ
してシュートがカルスから誘導され、続いて発根される。あるいは、胚形成がプロトプラ
スト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。
培養培地は、一般に、種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのよう
なホルモンを含有する。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加することは、特に
、コーンおよびアルファルファのような種にとって有用である。シュートおよび根は、通
常、同時に発生する。効果的な再生は、培地、遺伝子型、および培養遍歴に依存する。こ
れらの3つの変数が制御されるならば、再生は十分に再現性がありそして繰り返し可能で
ある。
はこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内に分
泌される場合、これを回収し得る。あるいは、胚および胚を有さない不完全な種子または
他の植物組織を機械的に破壊して、細胞と組織と間の任意の分泌タンパク質を放出させ得
る。その混合物を緩衝液に懸濁して、可溶性タンパク質を回収し得る。次いで、慣用的な
タンパク質の単離方法および精製方法を使用して、組換えタンパク質を精製する。時間、
温度、pH、酸素、および容量のパラメーターを慣用的な方法により調整して、異種タン
パク質の適切な発現および回収を最適化する。
タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫の発現ベクター内に挿入
され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの
構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として、以
下のものが挙げられる:バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種
遺伝子の挿入のための簡便な制限部位の両方を有する転移ベクター(通常は細菌プラスミ
ド);転移ベクター内のバキュロウイルス特異的フラグメントに対して配列相同性を有す
る野生型バキュロウイルス(これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組
換えを可能にする);ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。
野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでベクターとウイル
スゲノムを組換え可能にする。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして
組換えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系の材料
および方法は、特に、Invitrogen、San Diego CAからキット形態
(「MaxBac」キット)で市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり
、そしてSummersおよびSmith、Texas Agricultural E
xperiment Station Bulletin No.1555(1987)
(以下、「Summers and Smith」)に十分に記載されている。
ーター配列、リーダー配列(所望される場合は)、目的のコード配列、および転写終結配
列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物(転移ベクター)に構築する。この構
築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント;作動可能に連結され
た調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子;あるいは同じ調節エレメント
のセットにより調節される複数の遺伝子、を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細
菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント(例えば、プラスミド)のよ
うな、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それは
クローニングおよび増幅に適切な宿主内で維持され得る。
は、pAc373である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計される。これら
には、例えば、pVL985(ポリへドリンの開始コドンをATGからATTに変化させ
、そしてそのATTから32塩基対下流に、BamHIクローニング部位を導入する;L
uckowおよびSummers,Virology(1989)17:31を参照のこ
と)が挙げられる。
、(1988)Ann.Rev.Microbiol.,42:177)、および原核生
物のアンピシリン耐性(amp)遺伝子、およびE.coliでの選択および増殖のため
の複製起点を有する。
ュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスRNAポリメラーゼを結合し、そしてコ
ード配列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへの下流(5’から3’)方向の転写を開始
し得る任意のDNA配列である。プロモーターは、通常、コード配列の5’末端に近接し
て存在する転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、RNAポリメラーゼ
結合部位および転写開始点を含む。バキュロウイルス転移ベクターはまた、エンハンサー
と呼ばれる第二のドメインを有し得、存在する場合には、通常、構造遺伝子に対して遠位
にある。発現は調節的または構成的のいずれかであり得る。
配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子(Frie
senら、(1986)「The Regulation of Baculoviru
s Gene Expression,」:The Molecular Biolog
y of Baculoviruses(Walter Doerfler編);EPO
公開第127839号および同第155476号;およびp10タンパク質をコードする
遺伝子(Vlakら,(1988),J.Gen.Virol.69:765)由来の配
列が挙げられる。
ュロウイルスポリへドリン遺伝子(Carbonellら,(1998)Gene,73
:409)のようなバキュロウイルスタンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、哺乳
動物細胞の翻訳後修飾(シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、およびリン酸化の
ような)のシグナルは、昆虫細胞に認識されるようであり、ならびに分泌および核蓄積に
必要なシグナルはまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されているようであ
るため、ヒトインターフェロンα(Maedaら(1985)Nature 315:5
92);ヒトガストリン放出ペプチド(Lebacq−Verheydenら(1988
)Molec.Cell.Biol.8:3129);ヒトIL−2(Smithら(1
985)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA、82:8404);マウス
IL−3(Miyajimaら(1987)Gene 58:273);およびヒトグル
コセレブロシダーゼ(Martinら(1988)DNA、7:99)をコードする遺伝
子に由来のような、非昆虫起源のリーダーもまた使用して、昆虫での分泌を提供し得る。
適切な調節配列と共に発現される場合には、分泌され得る。非融合の外来タンパク質の優
れた細胞内発現には通常、ATG開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む
短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、N末端の
メチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質か
ら切断され得る。
虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントを含む、融合タンパ
ク質をコードするキメラDNA分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。
リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内への輸送を指向する疎水性アミ
ノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。
、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種DNAおよび野生型バキュロウイルスのゲノムD
NAを同時形質転換(通常は、同時トランスフェクションによって)する。構築物のプロ
モーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの2〜5kbの区域を含む
。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種DNAを導入する方法は、当該分野で
公知である(SummersおよびSmith、前出;Juら(1987);Smith
ら,Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156;ならびにLuckowお
よびSummers(1989)を参照のこと)。例えば、その挿入は、相同二重交差組
換え(homologous double crossover recombina
tion)により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内であり得る;挿入はまた、所望
のバキュロウイルス遺伝子に設計された制限酵素部位内であり得る。Millerら、(
1989)、Bioessays 4;91。発現ベクター内のポリへドリン遺伝子の代
わりにクローン化される場合のDNA配列は、ポリへドリン特異的配列に5’および3’
の両側で隣接され、そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置される。
イルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる(約1%〜約5%の間)
;それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されるウイルスの大半は、なお野生型ウ
イルスである。従って、組換えウイルスを同定するための方法が必要である。その発現系
の利点は、組換えウイルスを区別させ得る可視的スクリーニングである。天然のウイルス
により産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染された
細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉
塞体を形成し、それはまた包埋された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大15μmの大
きさで、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で可視化される。組
換えウイルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスを区
別するために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単
層にプラーク形成させた。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で、閉塞体の存在(野生
型ウイルスを示す)または非存在(組換えウイルスを示す)についてスクリーニングする
。「Current Protocols in Microbiology」、第2巻
(Ausubelら編)16.8(増補10、1990);SummersおよびSmi
th、前出;Millerら(1989)。
。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された:Aed
es aegypti、Autographa californica、Bombyx
mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera
frugiperda、およびTrichoplusia ni(PCT公開番号WO
89/046699;Carbonellら,(1985)J.Virol.56:15
3;Wright(1986)Nature 321:718;Smithら,(198
3)Mol.Cell.Biol.3:2156;および一般には、Fraserら,(
1989)In Vitro Cell.Dev.Biol.25:225を参照のこと
)。
接発現および融合発現の両方のために市販される;細胞培養技術は、一般に当業者に公知
である。例えば、前出のSummersおよびSmithを参照のこと。
を可能にする適切な栄養培地で増殖し得る。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある
場合、宿主は高密度で増殖され得、そして発現は誘導され得る。あるいは、発現が構成的
である場合、その産物は培地中に連続的に発現され、そして栄養培地を連続的に循環させ
る一方で、目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を増大させる必要がある。その産物
は、クロマトグラフィー(例えば、HPLC、アフィニティークロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィーなど);電気泳動;密度勾配遠心;溶媒抽出などのような技術
により精製され得る。適切には、必要ならば、その産物をさらに精製して、培地中にも分
泌されたか、または昆虫細胞の溶解から生じる任意の昆虫タンパク質を実質的に除去し、
宿主細片(例えば、タンパク質、脂質および多糖類)を少なくとも実質的に含まない産物
を供給する。
パク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条
件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知の
条件に基づいて、当業者に容易に確かめられる。
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のRNAポリ
メラーゼに結合し得、そしてコード配列(例えば、構造遺伝子)の下流方向(3’方向)
へのmRNAへの転写を開始し得る任意のDNA配列である。プロモーターは、通常、コ
ード配列の5’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、
通常、RNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはま
た、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し、これはRNA合成が始まる近接のR
NAポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク
質が、オペレーターに結合し、そのため特定の遺伝子の転写を阻害し得るような、負の調
節された(誘導性の)転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節
エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパ
ク質結合配列により達成され得、その配列は、存在する場合には通常、RNAポリメラー
ゼ結合配列の(5’)側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例としては
、カタボライト活性化タンパク質(CAP)があり、それはEscherichia c
oli(E.coli)におけるlacオペロンの転写の開始を補助する(Raibau
dら(1984)Annu.Rev.Genet.18:173)。従って、調節される
発現は、正または負のいずれかであり、それによって転写を増強するかまたは低下し得る
。
ては、ガラクトース、ラクトース(lac)(Changら.(1997)Nature
198:1056)、およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列
が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン(trp)(Goeddelら(1
980)Nuc.Acids Res.8:4057;Yelvertonら(1981
)Nucl.Acids Res.9:731;米国特許第4,738,921号;EP
O公開番号036 776および121 775)のような生合成酵素由来のプロモータ
ー配列が挙げられる。β−ラクタマーゼ(bla)プロモーター系(Weissmann
(1981)「The cloning of interferon and oth
er mistakes.」Interferon 3(I.Gresser編))、バ
クテリオファージλPL(Shimatakeら(1981)Nature 292:1
28)およびT5(米国特許第4,689,406号)プロモーター系もまた有用なプロ
モーター配列を提供する。
る。例えば、ある細菌あるいはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別
の細菌あるいはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合し得、合成ハイブ
リッドプロモーターを作製する(米国特許第4,551,433号)。例えば、tacプ
ロモーターは、trpプロモーター配列およびlacリプレッサーにより調節されるla
cオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドtrp−lacプロモーターである
(Amannら(1983)Gene 25:167;de Boerら(1983)P
roc.Natl.Acad.Sci.80:21)。さらに、細菌のプロモーターは、
細菌のRNAポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能力を有する非細菌起源の
天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはま
た、原核生物内でいくつかの遺伝子の高いレベルでの発現を生じるために、適合性のある
RNAポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージT7
RNAポリメラーゼ/プロモーター系は、連結したプロモーター系の例である(Stu
dierら(1986)J.Mol.Biol.189:113;Taborら(198
5)Proc Natl.Acad.Sci.82:1074)。さらに、ハイブリッド
プロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびE.coliオペレーター
領域から構成され得る(EPO公開番号267 851)。
ける外来遺伝子の発現に有用である。E.coliにおいて、リボソーム結合部位は、シ
ャイン−ダルガルノ(SD)配列と呼ばれ、そして開始コドン(ATG)および開始コド
ンの3〜11ヌクレオチド上流に位置する長さ3〜9ヌクレオチドの配列を含む(Shi
neら(1975)Nature 254:34)。SD配列は、SD配列とE.col
iの16S rRNAの3’末端との間の塩基対形成によりリボソームへのmRNAの結
合を促進すると考えられている(Steitzら(1979)「Genetic sig
nals and
nucleotide sequences in messenger RNA.」
Biological Regulation and Development:Ge
ne Expression(R.F.Goldberger編))。弱いリボソーム結
合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現のためには、SD配列と真核
生物遺伝子のATGとの間の距離を最適化することが、しばしば必要とされる(Samb
rookら(1989)「Expression of cloned genes i
n Escherichia coli.」Molecular Cloning:A
Laboratory Manual)。
と連結され得、この場合、N末端の最初のアミノ酸は、常に、ATG開始コドンによりコ
ードされるメチオニンである。所望される場合、N末端のメチオニンは、臭化シアンとの
インビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチオニンN末端ペプチダーゼとのイン
ビボまたはインビトロのインキュベーションのいずれかによりタンパク質から切断され得
る(EPO公開番号219 237)。
パク質、あるいは他の安定なタンパク質のN末端部分をコードするDNA配列は、異種の
コード配列の5’末端と融合される。発現の際に、この構築物は、2つのアミノ酸配列の
融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の5’末端と
連結し得、そして細菌において発現され得る。生じた融合タンパク質は、好ましくは、外
来遺伝子由来のバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロセシング酵素(Xa
因子)用の部位を保持する(Nagaiら(1984)Nature 309:810)
。融合タンパク質はまた、lacZ(Jiaら(1987)Gene 60:197)、
trpE(Allenら(1987)J.Biotechnol.5:93;Makof
fら(1989)J.Gen.Microbiol.135:11)、およびChey(
EPO公開番号324 647)遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。2つのアミノ
酸配列の接合部でのDNA配列は、切断部位をコードしてもよいし、あるいはコードしな
くてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は
、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素(例え
ば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ)用の部位を保持するユビキチン領域と
共に作製され得る。この方法を通して、天然の外来タンパク質は分離され得る(Mill
erら(1989)Bio/Technology 7:698)。
ナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラDN
A分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国特許第4,336,336
号)。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎
水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培
地(グラム陽性細菌)、または細胞の内膜と外膜との間に位置するペリプラズム腔(グラ
ム陰性細菌)のいずれかへ分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれ
かで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされ
るプロセシング部位がある。
pA)(Masuiら(1983)、Experimetal Manipulatio
n of Gene Expression;Ghrayebら、(1984)EMBO
J.3:2437)およびE.coliアルカリホスファターゼシグナル配列(pho
A)(Okaら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82:7212)
のような、分泌性細菌タンパク質についての遺伝子に由来し得る。さらなる例として、種
々のBacillus株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、B.subti
lis由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る(Palvaら(1982)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:5582;EPO公開番号244
042)。
節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの
配列は、そのDNAによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得るmRNAの転写
を指向する。転写終結配列は、しばしば、転写の終結を補助するステムループ構造を形成
し得る、約50ヌクレオチドのDNA配列を含む。例としては、強力なプロモーターを有
する遺伝子(例えば、E.coliのtrp遺伝子および他の生合成遺伝子)由来の転写
終結配列が挙げられる。
列、および転写終結配列を含む)は、組み立てられて発現構築物となる。発現構築物は、
しばしば、宿主(例えば細菌)において安定に保持し得る染色体外エレメント(例えばプ
ラスミド)のような、レプリコンに維持される。このレプリコンは複製系を有し、従って
、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコンが原核生物宿主に
おいて保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまた
は低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約5〜
約200、そして通常約10〜約150の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミ
ドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約10個、そしてより好ましくは少なくとも約2
0個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選
択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。
。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌の染色体と相同
な少なくとも1つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なDNAと細菌の染
色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のBacillus株からのD
NAによって構築される組み込みベクターは、Bacillus染色体に組み込まれる(
EPO公開番号 127 328)。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまた
はトランスポゾン配列から構成され得る。
転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主において発現され得
、そして細菌が薬物(例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン
、カナマイシン(ネオマイシン)、およびテトラサイクリン)に耐性になるようにする遺
伝子を含み得る(Daviesら(1978)Annu.Rev.Microbiol.
32:469)。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの
生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、または組み
込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー(market)から構成され
得る。
いずれか)は、多くの細菌へ形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは
、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた:Bacillus subtilis
(Palvaら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:5
582;EPO公開番号036 259および063 953;PCT公開番号 WO8
4/04541)、Escherichia coli(Shimatakeら(198
1)Nature 292:128;Amannら(1985)Gene 40:183
;Studierら(1986)J.MOl.Biol.189:113;EPO公開番
号036
776号、同第136 829号、同第136 907号)、Streptococc
us cremoris(Powellら(1988)Appl.Environ.Mi
crobiol.54:655);Streptococcus lividans(P
owellら(1988)Appl.Environ.Microbiol.54:65
5)、Streptomyces lividans(米国特許第4,745,056号
)。
Cl2または他の因子(例えば、二価陽イオンおよびDMSO)のいずれかで処理された
細菌の形質転換を含む。DNAはまた、エレクトロポレーションにより細菌細胞に導入さ
れ得る。形質転換の手順は、通常、形質転換されるべき細菌の種で変化する。(例えば、
以下を参照のこと:Bacillusの使用:Massonら(1989)FEMS M
icrobiol.Lett.60:273;Palvaら(1982)Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 79:5582;EPO公開番号036 259号お
よび同第063 953号;PCT公開番号WO84/04541;Campyloba
cterの使用:Millerら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.
85:856;およびWangら(1990)J.Bacteriol.172:949
;Escherichia coli:Cohenら(1973)Proc.Natl.
Acad.Sci.69:2110;Dowerら(1988)Nucleic Aci
ds Res.16:6127;Kushner(1978)「An improved
method for transfsormation of Escherich
ia coli with ColE1−derived plasmids」Gene
tic Enginerring:Proceedings of Internati
onal Symposium on Genetic Engineering(H.
W.BoyerおよびS.Nicosia編);Mandelら(1970)J.Mol
.Biol.53:159;Taketo(1988)Biochim.Biophys
.Acta 949:318;Lactobacillusの使用:Chassyら(1
987)FEMS Microbiol.Lett.44:173;Pseudomon
asの使用:Fiedlrら(1988)Anal.Biochem 170:38;S
taphylococcusの使用:Augustinら(1990)FEMS Mic
robiol.Lett.66:203;Streptococcusの使用:Bara
nyら(1980)J.Bacteriol.144:698;Harlander(1
987)「Transformation of Streptococcus lac
tis by electroporation」:Streptococcal Ge
netics(J.FerrettiおよびR.CurtissIII編);Perry
ら(1981)Infect.Immun.32:1295;Powellら(1988
)Appl.Environ.Microbiol.54:655;Somkutiら(
1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1:4
12。
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラー
ゼに結合可能であり、そしてコード配列(例えば、構造遺伝子)からmRNAへの下流の
(3’側の)転写を開始し得る、任意のDNA配列である。プロモーターは、通常、コー
ド配列の5’末端の近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、
RNAポリメラーゼ結合部位(「TATAボックス」)および転写開始部位を含む。酵母
プロモーターはまた、上流アクチベーター配列(UAS)と呼ばれる第2のドメインを有
し得、これは、もし存在するならば、通常、構造遺伝子とは遠位である。このUASは、
調節される(誘導できる)発現を可能にする。構成的発現は、UASの非存在下で生じる
。調節される発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させるか
または減少させるかのいずれかであり得る。
をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げ
られる:アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)(EPO公開第284 044号)、エ
ノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド
−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPまたはGAPDH)、ヘキソキナーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ(PyK
)(EPO公開第329 203号)。酸性ホスファターゼをコードする酵母PHO5遺
伝子はまた、有用なプロモーター配列を提供する(Myanoharaら(1983)P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 80:1)。
る。例えば、ある1つの酵母プロモーターのUAS配列は、別の酵母プロモーターの転写
活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハイ
ブリッドプロモーターの例は、GAP転写活性化領域と連結されるADH調節配列(米国
特許第4,876,197号および同第4,880,734号)を含む。ハイブリッドプ
ロモーターの他の例は、ADH2、GAL4、GAL10、またはPHO5遺伝子のいず
れかの調節配列からなり、GAPまたはPyK(EPO公開第164 556号)のよう
な解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に結合されているプロモーターを含む。さらに、酵母
プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する
、天然に存在する非酵母起源のプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例と
しては、とりわけ、以下が挙げられる:(Cohenら、(1980)Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 77:1078;Henikoffら(1981)Na
ture 283:835;Hollenbergら(1981)Curr.Topic
s Microbiol.Immunol.96:119;Hollenbergら(1
979)「The Expression of Bacterial Antibio
tic Resistance Gene in the Yeast Sacchar
omyces cervisiae」、Plasmids of Medical,En
vironmental and Commercial Importance(K.
N.TimmisおよびA.Puhler編);Mercerau−Puigalonら
(1980)Gene 11:163;Panthierら(1980)Curr.Ge
net.2:109;)。
子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のN末端にある最初のアミノ酸は常に
ATG開始コドンによってコードされるメチオニンである。もし所望ならば、N末端のメ
チオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、タンパク質から切
断され得る。
および細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質、または
他の安定なタンパク質のN末端部分をコードするDNA配列は、異種コード配列の5’末
端に融合される。発現において、この構築物は、2つのアミノ酸配列の融合物を提供する
。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)遺伝子は、外来遺
伝子の5’末端に連結され得、そして酵母において発現され得る。2つのアミノ酸配列の
連結部にあるDNA配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例
えば、EPO公開番号196 056号を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク
質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロ
セシング酵素(例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ)のための部位を好
ましくは保持する、ユビキチン領域を伴って作製される。従って、この方法を通じて、ネ
イティブな外来タンパク質は、単離され得る(例えば、WO88/024066)。
ーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、キメラDNA分子
を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまた
はインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコ
ードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、細胞からのタン
パク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドを、通常コー
ドする。
であり得、その遺伝子は例えば、酵母インベルターゼ遺伝子(EPO公開番号012 8
73;JPO公開番号62:096,086)およびA因子遺伝子(米国特許第4,58
8,684号)である。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分
泌も提供する、非酵母起源のリーダーが存在する(EPO公開番号第060 057号)
。
ーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。用いられ得
るこの型のα因子フラグメントは、完全長の、プレ−プロα因子リーダー(約83アミノ
酸残基)および短縮されたα因子リーダー(通常約25〜約50アミノ酸残基)を含む(
米国特許第4,546,083号および同第4,870,008号;EPO公開番号第3
24 274号)。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリー
ダーは、第1の酵母のプレ配列を有するが、第2の酵母α因子からのプロ領域を有しない
で作製される、ハイブリッドα因子リーダーを含む(例えば、PCT公開番号WO89/
02463を参照のこと)。
であり、そして従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、そ
のDNAにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る、mRNAの転写を指向する。転
写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする
転写終結配列である。
および転写終結配列を含む)は、組み立てられて発現構築物になる。発現構築物は、宿主
(例えば、酵母または細菌)において安定に保持され得る染色体外エレメント(例えば、
プラスミド)のような、レプリコンにおいてしばしば保持される。このレプリコンは、2
つの複製系を有し得、従って、このことが、例えば、酵母において発現のために、ならび
に原核生物宿主においてクローニングおよび増幅のために保持されることを可能にする。
このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる:YEp24(
Botsteinら(1979)Gene 8:17〜24)、pCl/1(Brake
ら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4642〜46
46)、およびYRp17(Stinchcombら(1982)J.Mol.Biol
.158:157)。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プ
ラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約5〜約200、そし
て通常約10〜約150の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は
、好ましくは少なくとも約10個、そしてより好ましくは少なくとも約20個を有する。
高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に
対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。例えば、Brakeら、前出を
参照のこと。
。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同
な少なくとも1つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する2つの相同配
列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なDNAと酵母の染色体との間の組換えか
ら生じるようである(Orr−Weaverら(1983)Methods in En
zymol.101:228〜245)。組み込みベクターは、そのベクター中に含有す
るために適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座を指向さ
れ得る。Orr−Weaverら、前出を参照のこと。1つ以上の発現構築物が組み込ま
れ得、おそらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る(Rineら(1
983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:6750)。ベクター
に含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント(ベクター全体の組み込みを
生じる)、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築
物に隣接する2つのセグメント(発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る)のいず
れかとして生じ得る。
転換された酵母株の選択を可能にする。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る
生合成遺伝子を含み得、それは例えば、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1、およ
びALG7、ならびにG418耐性遺伝子であり、それぞれ、酵母細胞がツニカマイシン
およびG418に耐性になるようにする。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のよ
うな毒性化合物の存在下において増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、CUP1
の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする(Buttら(
1987)Microbiol.Rev.51:351)。
。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、または
組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マーカーから構成される。
のいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、酵母宿主
に外来DNAを導入する発現ベクターおよび方法は、とりわけ、以下の酵母のために開発
されてきた:Candida albicans(Kurtzら(1986)Mol.C
ell.Biol.6:142)、Candida maltosa(Kunzeら(1
985)J.Basic Microbiol.25:141);Hansenula
polymorpha(Gleesonら(1986)J.Gen.Microbiol
.132:3459;Roggenkampら(1986)Mol.Gen.Genet
.202:302)、Kluyveromyces fragilis(Dasら(19
84)J.Bacteriol.158:1165)、Kluyveromyces l
actis(De Louvencourtら(1983)J.Bacteriol.1
54:737;Van den Bergら(1990)Bio/Technology
8:135)、Pichia guillerimondii(Kunzeら(198
5)J.Basic Microbiol.25:141)、Pichia pasto
ris(Creggら(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376;米国特
許第4,837,148号および同第4,929,555号)、Saccharomyc
es cerevisiae(Hinnenら(1978)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 75:1929;Itoら(1983)J.Bacteriol.
153:163);Schizosaccharomyces pombe(Beach
およびNurse(1981)Nature 300:706)、およびYarrowi
a lipolytica(Davidowら(1985)Curr.Genet.10
:380471;Gaillardinら(1985)Curr.Genet.10:4
9)。
スフェロプラストの、またはアルカリ陽イオンで処置された無傷の酵母細胞のいずれかの
形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する。
例えば以下を参照のこと:(Kurtzら(1986)Mol.Cell.Biol.6
:142;Kunzeら(1985)J.Basic Microbiol.25:14
1;Candida);(Gleesonら(1986)J.Gen.Microbio
l.132:3459;Roggenkampら(1986)Mol.Gen.Gene
t.202:302;Hansenula);[Dasら(1984)J.Bacter
iol.158:1165;De Louvencourtら(1983)J.Bact
eriol.154:1165;Van den Bergら(1990)Bio/Te
chnology 8:135;Kluyveromyces];[Creggら(19
85)Mol.Cell.Biol.5:3376;Kunzeら(1985)J.Ba
sic Microbiol.25:141;米国特許第4,837,148号および同
第4,929,555号;Pichia];[Hinnenら(1978)Proc.N
atl.Acad.Sci.USA
75:1929;Itoら(1983)J.Bacteriol.153:163 S
accharomyces];[BeachおよびNurse(1981)Nature
300:706;Schizosaccharomyces];[Davidowら(
1985)Curr.Genet.10:39;Gaillardinら(1985)C
urr.Genet.10:49;Yarrowia]。
Xを含む組成物は、組成物中の全X+Yの少なくとも85重量%がXであるとき、Yを
「実質的に含まない」。好ましくは、Xは、組成物中の全X+Yの少なくとも約90重量
%を、さらに好ましくは少なくとも約95重量%または99重量%さえをも含む。
くともx%のNeisseriaで、特定のナイセリアのタンパク質中に存在するもので
ある。このxの値は、50%以上(例えば、66%、75%、80%、90%、95%ま
たは100%でさえ(すなわち、アミノ酸は、全てのNeisseriaにおいて該当す
るタンパク質中に見出される))であり得る。アミノ酸が、特定のナイセリアのタンパク
質において「保存されて」いるか否かを決定するために、複数の異なるNeisseri
a(参照集団)由来の該当するタンパク質の配列中のアミノ酸残基を比較する必要がある
。この参照集団は、多数の異なるNeisseria種を含み得るか、または単一種を含
み得る。この参照集団は、特定の種の多数の異なる血清型または単一の血清型を含み得る
。好ましい参照集団は、5つの最も一般的なNeisseria株からなる。
宿主細胞、遺伝子、または調節領域(例えば、プロモーター)であり得る。異種成分は天
然では共に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に
連結される場合、それらは共に機能し得る。別の例は、ナイセリア配列がマウス宿主細胞
に対して異種であることである。
答を誘発し得る。
ある。
するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律
性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特
定の宿主細胞において複製するために必要であり得る。特定の複製起点を有せば、発現ベ
クターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例
は、酵母において有効な自律性複製配列;およびCOS−7細胞で有効であるウイルスT
抗原である。
配列、RNA配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の配列に依存して、天然の
配列または開示された配列と変異配列との間の相同性(配列同一性)の程度は、上記のよ
うに算出して、好ましくは50%より大きい(例えば、60%、70%、80%、90%
、95%、99%またはそれ以上)。本明細書中で使用される場合、本明細書で核酸配列
が提供される核酸分子、または領域の「対立遺伝子改変体」は、別のもしくは2番目の単
離体のゲノム中の同じ遺伝子座で本質的に生ずる核酸分子または領域であり、そしてこれ
は、例えば、変異または組換えにより生ずる天然変化に起因して、類似するが、しかし同
一でない核酸配列を有する。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される
遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコー
ドする。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の5’または3’非翻訳領域(例えば、調節制
御領域)での変化を含み得る(例えば、米国特許第5,753,235号を参照のこと)
。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも1つの抗体結合部位から
構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」は、内部表面形
状および抗原のエピトープの特徴に相補的な電荷分布を有する、3次元結合空間であり、
これが、抗体と抗原の結合を可能にする。「抗体」は、例えば、脊椎動物抗体、ハイブリ
ッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、変化された抗体、一価抗体、Fabタンパク質、お
よび単一ドメイン抗体を含む。
びNeisseriaのmenBタンパク質の識別/同定に有用である。
本発明のタンパク質に対して惹起された抗体は、Neisseria meningit
idis menBの株に存在および特異的に関連する抗原性のポリペプチドまたはタン
パク質もしくはタンパク質フラグメントに結合する。いくつかの例では、これらの抗原は
、特定の株(例えば、これらの抗原はmenB株に特異的である)に関連し得る。本発明
の抗体は、マトリックスに固定され得、そして免疫アッセイまたは親和性カラムクロマト
グラフィーカラムに利用され得、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質フラグメ
ント、あるいはこのようなポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質フラグメントを
含む細胞の検出および/または分離を可能にする。あるいは、このようなポリペプチド、
タンパク質、またはタンパク質フラグメントは、それらに特異的に結合し得る抗体を検出
するために固定され得る。
従来の方法によって調製され得る。一般に、タンパク質は、最初に、適切な動物、好まし
くはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使用される。ウサギおよびヤ
ギは、得られ得る血清の容量、および標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の入手可
能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。免疫は、一般的に、タン
パク質を生理食塩水(好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント)に
混合または乳化し、そしてその混合物または乳化物を非経口的に(一般的に皮下、または
筋肉内に)注射することによって行われる。50〜200μg/注射の用量が、代表的に
充分である。免疫は、一般的に、2〜6週後に生理食塩水を使用する(好ましくはフロイ
ント不完全アジュバント)のタンパク質の1回以上の注射でブーストされる。あるいは、
当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって抗体を産生し得、これは
、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に等しいと考えられる。ポリクローナル抗血清
は、免疫された動物からガラスまたはプラスチック製容器へ採血し、その血液を25℃で
1時間インキュベートし、その後4℃で2〜18時間インキュベートすることによって得
られる。この血清は、遠心分離(例えば1,000g、10分間)によって回収される。
ウサギから、採血につき約20〜50mlが得られ得る。
5)256:495〜96)の標準的方法、またはその改変版を使用して調製される。代
表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するた
めに動物から採血するよりも、脾臓(および必要に応じていくつかの大きなリンパ節)が
取り出され、そして単細胞へ解離される。もし所望ならば、脾臓細胞は、(非特異的付着
細胞の回収後)細胞懸濁液をタンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェル
へアプライすることによって、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫
グロブリンを発現するB細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液によって、
洗い落とされない。生じるB細胞、または全ての解離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞
と融合するように誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地(例えばヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「HAT」)において培養される。生じるハイ
ブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫する抗原に対して特異
的に結合する(かつ関連しない抗原に結合しない)抗体の産生についてアッセイされる。
選択されるMAb分泌ハイブリドーマは、次にインビトロ(例えば、組織培養瓶または中
空繊維リアクター中で)、またはインビボ(マウスにおける腹水として)のいずれかで培
養される。
従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げられる:発蛍光団、
発色団、放射性原子(特に32Pおよび125I)、電子密度試薬、酵素、および特異的結合
パートナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、その活性によって検出される。例えば
、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン
(TMB)を青い色素(分光光度計を用いて定量可能)へ変換するその能力によって、検
出される。「特異的結合パートナー」とは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタン
パク質をいい、例えば抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合である。他の
特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、IgGお
よびプロテインA、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター−リガンド対を含
む。同じ標識がいくつかの異なる様式で働き得るので、以上の記載が、種々の標識を別個
のクラスへ分類することを意味しないことは、理解されるべきである。例えば、125Iは
、放射性標識として、または電子密度試薬として働き得る。HRPは、酵素として、また
はMAbについての抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために、種々の標識を組
合せ得る。例えば、MAbおよびアビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要と
する。従って、MAbをビオチンで標識して、そして125Iで標識したアビジン、または
HRPで標識した抗ビオチンMAbで、その存在を検出し得る。他の置換および可能性は
、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内に等しいと考えられる。
、特定の結合パートナー抗体の形成を誘発する。本発明のこれらの抗原、免疫原、ポリペ
プチド、タンパク質、またはタンパク質フラグメントは、本発明の免疫原性組成物を含む
。このような免疫原性組成物は、本発明の抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質、ま
たはタンパク質フラグメントを、促進または増強もしくは安定化するアジュバント、キャ
リア、または他の組成物をさらに含み得る(comprise or include)
。このようなアジュバントおよびキャリアは、当業者に容易に理解され得る。
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この
薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレ
オチドのいずれかを含む。
置、改善、または予防するための治療薬剤の量、または、検出可能な治療効果または予防
効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、キメラマーカーまたは抗原
レベルによって検出され得る。治療効果はまた、熱病の患者に与えた場合に、体温低下の
ような、身体の症状における減少を含む。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大き
さおよび健康、状態の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療または治療
の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。
しかし、所定状況のための有効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の
判断内である。
A構築物の約0.01mg/kg〜50mg/kgまたは0.05mg/kg〜約10m
g/kgである。
能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬剤のような、
治療薬剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害
な抗体の産生をそれ自体誘導しない、任意の薬学的キャリアをいい、そして、過度の毒性
を伴わずに投与され得る。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコ
ール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のように、大き
く、緩徐に代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩;および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香
酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Re
mington’s Pharmaceutical
Sciences(Mack Pub.Co.、N.J.1991)にて利用可能であ
る。
およびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質
などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は
、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質として調製される;注射前に液体ビ
ヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、
薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。
一旦処方されると、本発明の組成物は、その被験体へ直接投与され得る。処置される被
験体は、動物であり得;特に、ヒト被験体が処置され得る。
いずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間質空間へ送達される。この
組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与、および肺投与、坐剤
、および経皮(transdermal)適用ならびに経皮(transcutaneo
us)適用、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー(hypospray)が含まれ
る。投薬処置は、単回用量スケジュール、または多数回用量スケジュールであり得る。
本発明に従うワクチンは、予防的(すなわち、感染を予防するため)または治療(すな
わち、感染後の疾患を処置するため)のいずれかであり得る。
はタンパク質フラグメント、または核酸(例えば、リボ核酸またはデオキシリボ核酸)を
、通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、このキャリア自体は、その組成物
を受ける個体に有害である抗体の産生を誘発しない任意のキャリアを含む。適切なキャリ
アは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子(例えば、タンパク質、ポリサッカ
リド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝
集物(例えば、油小滴またはリポソーム)、および不活性ウイルス粒子である。このよう
なキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤(「アジ
ュバント」)として機能し得る。さらに、この免疫原または抗原は、細菌毒素(例えば、
ジフテリア、破傷風、コレラ、H.pyloriなどの病原由来の毒素)と結合体化され
得る。
「明礬」)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど
);(2)水中油型乳濁液濁処方物(他の特定の免疫刺激薬剤(例えば、ムラミルペプチ
ド(以下を参照のこと)または細菌細胞壁成分)を伴うか伴わない)を包含するが、それ
らに限定されず、例えば、以下:(a)5%スクアレン、0.5% Tween 80、
および0.5% Span85(必要に応じて、種々の量のMTP−PE(以下を参照の
こと)を含有するが、必要ではない)を含み、モデル110Y微小流体化器(Micro
fluidics、Newton、MA)のような微小流体化器を用いてμ未満の粒子へ
と処方されたMF59(PCT出願WO90/14837);(b)μ未満のエマルジョ
ンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを
生成したかのいずれかである、10%スクアレン、0.4%Tween80、5%プルロ
ニックブロックポリマーL121、およびthr−MDP(以下を参照のこと)を含有す
るSAF、ならびに(c)2%スクアレン、0.2%Tween80、およびモノホスホ
リピドA(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS
)好ましくはMPLおよびCWS(DetoxTM)からなる群由来の1つ以上の細菌細胞
壁成分を含むRibiTMアジュバント系(RAS)、(Ribi Immunochem
、Hamilton、MT);(3)サポニンアジュバント(例えば、Stimulon
TM)(Cambridge Bioscience、Worcester、MA)を使用
し得るか、またはそれから粒子(例えば、ISCOM(免疫刺激性複合体)を生成し得る
;(4)完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(
IFA);(5)サイトカイン(例えば、インターロイキン(例えば、IL−1、IL−
2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12など)、インターフェロン(
例えば、γインターフェロン)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍
壊死因子(TNF)など;(6)コレラ毒素(CT)、百日咳毒素(PT)、またはE.
coli熱不安定性毒素(LT)(詳細には、LT−K63、LT−R72、CT−S1
09、PT−K9/G129)のような細菌ADP−リボース化毒素の無毒化変異体;例
えば、WO93/13302およびWO92/19265を参照のこと;および(7)そ
の組成物の効力を強化するための免疫刺激因子として作用する他の物質を包含するがそれ
らに限定されない。ミョウバンおよびMF59が好ましい。
ル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニ
ル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D
−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセ
ロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)などを包含する
がそれらに限定されない。
含み得る)を含むワクチン組成物は、代表的に、希釈剤(例えば、水、生理食塩水、グリ
セロール、エタノールなど)を含有する。さらに、補助物質(例えば、湿潤剤または乳化
剤、pH緩衝物質など)が、このようなビヒクルに存在し得る。あるいは、免疫原組成物
を含むワクチン組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に、抗原、ポリペプチド、タン
パク質、タンパク質フラグメント、または核酸を含み得る。
プチド、ならびに、必要な場合、任意の他の上記の成分を含む。「免疫学的に有効な量」
とは、単回用量または一連の一部のいずれかでの個体へのその量の投与が、処置または予
防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、
処置される個体の分類上のグループ(例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など)、抗体を
合成するための個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医療状況
の処置医の判断、および他の関連因子に依存して変化する。この量は、慣用的な治験を通
して決定され得る比較的広範な範囲に入ることが予想される。
として、注射可能なように調製され;注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物と
して適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリ
アの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたは
リポソーム中にカプセル化され得る。
の注射による)に投与される。他の投与様式に適切なさらなる処方物は、経口処方物およ
び肺処方物、坐剤、および経皮(transdermalおよびtranscutane
ous)適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュール
であり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤とともに投与され得る。
、RobinsonおよびTorres(1997)Seminars
in Immunology 9:271−283;Donnellyら(1997)
Annu Rev Immunol 15:617−648)。
本発明の治療剤のコード配列を含む、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送
達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所または全身的のいずれかで投
与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクター
アプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利用し得る。このようなコード配列の
発現は、内在性哺乳動物プロモーターまたは外来性プロモーターを用いて誘導され得る。
このコード配列のインビボでの発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。
達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウ
イルスベクター、またはαウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、アス
トロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、パポ
バウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナ
ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る
。一般的には、Jolly(1994)Cancer Gene Therapy 1:
51−64;Kimura(1994)Human Gene Therapy 5:8
45−852;Connelly(1995)Human Gene Therapy
6:185−193;およびKaplitt(1994)Nature
Genetics 6:148−153を参照のこと。
のレトロウイルス、異種栄養性ウイルス(例えば、NZB−X1、NZB−X2およびN
ZB9−1(O’Neill(1985)J.Virol.53:160を参照のこと)
多向性レトロウイルス(例えば、MCFおよびMCF−MLV(Kelly(1983)
J.Virol.45:291を参照のこと)、スプマウイルスおよびレンチウイルスが
含まれる。RNA Tumor Viruses、第2版、Cold Spring H
arbor Laboratory、1985を参照のこと。
えば、レトロウイルスLTRは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、tRNA結合部位はラ
ウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し
得、そして第二の鎖合成の起源はトリ白血病ウイルスに由来し得る。
れらを導入することによって形質導入受容性レトロウイルスベクター粒子を生成し得る(
米国特許第5,591,624号を参照のこと)。レトロウイルスベクターは、レトロウ
イルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによって宿主細胞DNAへの部位特異
的組込みについて構築され得る(WO96/37626号を参照のこと)。この組換えウ
イルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。
は、当該分野で周知であり、容易に調製され(WO95/30763号およびWO92/
05266号を参照のこと)、そしてこれを使用して、組換えベクター粒子の生産のため
のプロデューサー細胞株(これは、ベクター細胞株または「VCL」とも称される)を作
製し得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞(例えば、HT10
80細胞)またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を除去
する。
血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成
ウイルス(Mink−Cell Focus−Inducing Virus)、マウス
肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスを含む。特に好ましいマ
ウス白血病ウイルスは、4070Aおよび1504A(HartleyおよびRowe(
1976)J.Virol.19:19−25)、Abelson(ATCC番号VR−
999)、Friend(ATCC番号VR−245)、Graffi、Gross(A
TCC番号VR−590)、Kirsten、Harvey肉腫ウイルスおよびRaus
cher(ATCC番号VR−998)およびモロニーマウス白血病ウイルス(ATCC
番号VR−190)を含む。このようなレトロウイルスは、寄託機関または収集機関(例
えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション(「ATCC」)、Rockville
、Maryland)から入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供
給源から単離され得る。
出願GB2200651、EP0415731、EP0345242、EP033430
1、WO89/02468;WO89/05349、WO89/09271.WO90/
02806、WO90/07936、WO94/03622、WO93/25698、W
O93/25234、WO93/11230、WO93/10218、WO91/028
05、WO91/02825、WO95/07994、米国特許第5,219,740号
、同4,405,712号、同4,861,719号、同4,980,289号、同4,
777,127号、同5,591,624号に記載されるものを含む。Vile(199
3)Cancer Res 53:3860−3864;Vile(1993)Canc
er Res.53:962−967;Ram(1993)Cancer Res 53
(1993)83−88;Takamiya(1992)J Neurosci Res
33:493−503;Baba(1993)J Neurosurg 79:729
−735;Mann(1983)Cell 33:153;Cane(1984)Pro
c Natl Acad Sci 81;6349;およびMiller(1990)H
uman Gene Therapy 1もまた参照のこと。
おいて使用可能である。例えば、Berkner(1988)Biotechnique
s 6:616およびRosenfeld(1991)Science 252:431
;ならびにWO93/07283、WO93/06223、およびWO93/07282
を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベク
ターは、上記に参照される文書およびWO94/12649、WO93/03769、W
O93/19191、WO94/28938、WO95/11984、WO95/006
55、WO95/27071、WO95/29993、WO95/34671、WO96
/05320、WO94/08026、WO94/11506、WO93/06223、
WO94/24299、WO95/14102、WO95/24297、WO95/02
697、WO94/28152、WO94/24299、WO95/09241,WO9
5/25807、WO95/05835、WO94/18922およびWO95/096
54において記載されるものを含む。あるいは、Curiel(1992)Hum.Ge
ne Ther.3:147−154に記載されるような殺傷したアデノウイルスに連結
したDNAの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス
随伴ウイルス(AAV)ベクターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクタ
ーの主要なおよび好ましい例は、Srivastava WO93/09239に開示さ
れるAAV−2ベースのベクターである。最も好ましいAAVベクターは、2つのAAV
逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブD配列は、ヌクレオチドの置換によって改変
され、その結果、少なくとも5つのネイティブなヌクレオチドおよび18までのネイティ
ブヌクレオチド、好ましくは少なくとも10のネイティブヌクレオチドから18までのネ
イティブヌクレオチド、最も好ましくは10のネイティブヌクレオチドが維持され、そし
てD配列の残りのヌクレオチドが欠失またはネイティブでないヌクレオチドで置換されて
いる。AAV逆方向末端反復のネイティブなD配列は、各AAV逆方向末端反復において
(すなわち、各末端に1つの配列が存在する)20の連続するヌクレオチドの配列であっ
て、これは、HP形成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオチドは、同じ位置で
のネイティブなD配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。
他の使用可能な例示的なAAVベクターは、pWP−19、pWN−1であり、これらは
両方ともNahreini(1993)Gene 124:257−262に開示される
。このようなAAVベクターの別の例は、psub201(Samulski(1987
)J.Virol.61:3096を参照のこと)である。別の例示的なAAVベクター
は、Double−D ITRベクターである。Double−D ITRベクターの構
築は、米国特許第5,478,745号に開示される。なお他のベクターは、Carte
rの米国特許第4,797,368号およびMuzyczkaの米国特許第5,139,
941号、Chartejeeの米国特許第5,474,935号ならびにKotinの
WO94/288157に開示されるものである。本発明において使用可能なAAVベク
ターのなおさらなる例は、SSV9AFABTKneoであり、これは、AFPエンハン
サーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優性に発現を指向する。
その構造および構築は、Su(1996)Human Gene Therapy 7:
463−470に開示される。さらなるAAV遺伝子治療ベクターは、米国特許第5,3
54,678号、同5,173,414号、同5,139,941号、および同5,25
2,479号に開示される。
要なおよび好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘ
ルペスウイルスベクター(例えば、米国特許第5,288,641号、およびEP017
6170(Roizman)に開示されるもの)である。さらなる例示的な単純ヘルペス
ウイルスベクターは、WO95/04139(Wistar Institute)に開
示されるHFEM/ICP6−LacZ、Geller(1988)Science 2
41:1667−1669ならびにWO90/09441およびWO92/07945に
記載されるpHSVlac、Fink(1992)Human Gene Therap
y 3:11−19に記載されるHSV Us3::pgC−lacZ、ならびにEP0
453242(Breakefield)に記載されるHSV 7134、2RH 10
5およびGAL4、ならびにATCCに受託番号ATCC VR−977およびATCC
VR−260として寄託されたものを含む。
いαウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。トガウイルス、セムリキ
森林ウイルス(ATCC VR−67;ATCC VR−1247)、Middlebe
rgウイルス(ATCC VR−370)、ロスリバーウイルス(ATCC VR−37
3;ATCC VR−1246)、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス(ATCC VR−
923;ATCC VR−1250;ATCC VR−1249;ATCC VR−53
2)および米国特許第5,0091,309号、同5,217,879号、およびWO9
2/10578に記載されるもの。より詳細には、米国特許出願第08/405,627
号(1995年3月15日出願)、WO94/21792号、WO92/10578号、
WO95/07994号、米国特許第5,091,309号、および米国特許第5,21
7,879号に記載されるαウイルスベクターが使用可能である。このようなαウイルス
は、ATCC、Rockville、Marylandのような寄託機関または収集機関
から入手し得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得
る。好ましくは、細胞傷害性を減少させたαウイルスベクターを使用する(米国特許出願
番号08/679640号を参照のこと)。
である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはWO95/07994を参照のこと
。好ましくは、本発明の真核生物層状発現系はαウイルスベクターに由来し、そして最も
好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。
る:ポリオウイルス(例えば、ATCC VR−58およびEvans、Nature
339(1989)385およびSabin(1973)J.Biol.Standar
dization 1:115に記載されるもの);リノウイルス(例えば、ATCC
VR−1110およびArnold(1990)J Cell Biochem L40
1に記載されるもの);ポックスウイルス(例えば、カナリアポックスルウイルスまたは
ワクシニアウイルス(例えば、ATCC VR−111およびATCC VR−2010
ならびにFisher−Hoch(1989)Proc Natl Acad Sci
86:317;Flexner(1989)Ann NY Acad Sci 569:
86、Flexner(1990)Vaccine 8:17;米国特許第4,603,
112号および同4,769,330号ならびにWO89/01973号に記載されるも
の);SV40ウイルス(例えば、ATCC VR−305およびMulligan(1
979)Nature 277:108およびMadzak(1992)J Gen V
irol 73:1533に記載されるもの);インフルエンザウイルス(例えば、AT
CC VR−797および米国特許第5,166,057号およびEnami(1990
)Proc Natl Acad Sci 87:3802−3805;Enamiおよ
びPalese(1991)J Virol 65:2711−2713およびLuyt
jes(1989)Cell 59:110(McMichael(1983)NEJ
Med 309:13ならびにYap(1978)Nature 273:238および
Nature(1979)277:108もまた参照のこと)に記載されるような逆遺伝
子技術を使用して作製した組換えインフルエンザウイルス);EP−0386882およ
びBuchschacher(1992)J.Virol.66:2731に記載される
ようなヒト免疫不全ウイルス;麻疹ウイルス(例えば、ATCC VR−67およびVR
−1247ならびにEP−0440219に記載されるもの);アウラ(Aura)ウイ
ルス(例えば、ATCC VR−368);ベバル(Bebaru)ウイルス(例えば、
ATCC VR−600およびATCC VR−1240);カバス(Cabassou
)ウイルス(例えば、ATCC VR−922);チクングニヤウイルス(例えば、AT
CC VR−64およびATCC VR−1241);フォートモーガン(Fort M
organ)ウイルス(例えば、ATCC VR−924);ゲタウイルス(例えば、A
TCC VR−369およびATCC VR−1243);キジラガハ(Kyzylag
ach)ウイルス(例えば、ATCC VR−927);マヤロウイルス(例えば、AT
CC VR−66);ムカン(Mucambo)ウイルス(例えば、ATCC VR−5
80およびATCC VR−1244);ヌヅム(Ndumu)ウイルス(例えば、AT
CC VR−371);ピクスナ(Pixuna)ウイルス(例えば、ATCC VR−
372およびATCC VR−1245);トナテ(Tonate)ウイルス(例えば、
ATCC
VR−925);トリニティ(Trinity)ウイルス(例えば、ATCC
VR−469);ユナ(Una)ウイルス(例えば、ATCC VR−374);ワタ
ロア(Whataroa)ウイルス(例えば、ATCC VR−926);Y−62−3
3ウイルス(例えば、ATCC VR−375);オニョンニョンウイルス、東部脳脊髄
炎ウイルス(例えば、ATCC VR−65およびATCC VR−1242);西部脳
脊髄炎ウイルス(例えば、ATCC VR−70、ATCC VR−1251、ATCC
VR−622およびATCC VR−1252);ならびにコロナウイルス(例えば、
ATCC VR−740)およびHamre(1966)Proc Soc Exp B
iol Med 121:190に記載のもの。
他の送達方法および媒体が使用され得る(例えば、核酸発現ベクター、殺傷したアデノウ
イルスに連結したポリカチオン性縮合DNAかまたは連結してないポリカチオン性縮合D
NA単独(例えば、米国特許出願番号08/366,787(1994年12月30日出
願)およびCuriel(1992)Hum
Gene Ther 3:147−154を参照のこと)、リガンド連結DNA(例え
ば、Wu(1989)J Biol Chem 264:16985−16987を参照
のこと)、真核生物細胞送達ビヒクル細胞(例えば、米国特許出願番号08/240,0
30(1994年5月9日出願)および米国特許出願番号08/404,796を参照の
こと)、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃(米国特許第5,14
9,655号に記載されるような)、米国特許第5,206,152およびWO92/1
1033に記載されるような電離放射線、核電荷中和または細胞膜との融合)。さらなる
アプローチは、Philip(1994)Mol Cell Biol 14:2411
−2418およびWoffendin(1994)Proc Natl Acad Sc
i 91:1581−1585に記載される。
参照のこと)。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベ
クターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド(例えば、アシアロオロソムコイド(Wu
およびWu(1987)J.Biol.Chem.262:4429−4432に記載さ
れるような)、Hucked(1990)Biochem Pharmacol 40:
253−263に記載されるようなインスリン、Plank(1992)Bioconj
ugate Chem 3:533−539に記載されるようなガラクトース、ラクトー
スまたはトランスフェリン)に連結された合成遺伝子移入分子(例えば、ポリリジン、プ
ロタミンおよびアルブミン、のような重合DNA結合カチオン)とともにインキュベート
され得る。
導入方法は、WO90/11092および米国特許第5,580,859号に記載される
。取り込み効率は、生分解性のラテックスビーズを用いて改良され得る。DNAコートラ
テックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸送さ
れる。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高め、それによってエンドソームの破壊お
よび細胞質へのDNAの放出を容易にすることによってさらに改良され得る。
、WO95/13796、WO94/23697、WO91/14445、およびEP5
24,968に記載される。米国特許出願60/023,867に記載されるように、非
ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための
従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド(例え
ば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフ
ェリン)に連結された、重合性DNA結合カチオン(例えば、ポリリジン、プロタミン、
およびアルブミン)のような合成遺伝子移入分子とともにインキュベートされ得る。他の
送達系は、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含む
DNAをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な非ウイル
ス送達は、機械的送達系(例えば、Woffendinら(1994)Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 91(24):11581−11585に記載されるア
プローチを含む。さらに、コード配列およびそのようなものの発現産物は、光重合化ヒド
ロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達について使用され得る、遺伝
子送達のための他の従来の方法は、例えば、手動の遺伝子移入粒子銃(米国特許第5,1
49,655号に記載されるような);移入された遺伝子を活性化するための電離放射線
の使用(米国特許第5,206,152号およびWO92/11033に記載されるよう
な)を含む。
2,120号および同4,762,915号;WO95/13796;WO94/236
97;およびWO91/14445;EP−0524968;およびStryer、Bi
ochemistry、236−240頁(1975)、W.H.Freeman、Sa
n Francisco;Szoka(1980)Biochem Biophys A
cta 600:1;Bayer(1979) Biochem Biophys Ac
ta 550:464;Rivnay(1987)Meth Enzymol 149:
119;Wang(1987)Proc Natl Acad Sci 84:7851
;Plant(1989)Anal Biochem 176:420に記載されるもの
である。
されるとおりである)を含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体
において、約0.01mg/kg〜50mg/kgまたは0.05mg/kg〜約10m
g/kgのDNA構築物である。
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、(1)被験体に直接);(2
)エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて;または(3)組換えタンパク質の発現の
ためにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得
る。ヒト被験体もまた処置され得る。
は組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。この組成物はまた、
腫瘍または病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与または肺投与、坐剤、および
経皮適用、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。投薬治療は、単回用量スケ
ジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。
知であり、そして例えばWO93/14778に記載されている。エキソビボ適用に有用
である細胞の例は、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹
状細胞または腫瘍細胞を含む。
手順:例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブ
レン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチ
ドのリポソーム内へのカプセル化、およびDNAの核への直接の微量注入(これらはすべ
て当該分野で周知である)で達成され得る。
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポ
リヌクレオチド組成物および/またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。
1つの例は、限定することなく以下を包含するポリペプチドである:アシアロオロソム
コイド(ASOR);トランスフェリン;アシアロ糖タンパク質;抗体;抗体フラグメン
ト;フェリチン;インターロイキン;インターフェロン;顆粒球マクロファージコロニー
刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、マクロファージコ
ロニー刺激因子(M−CSF)、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原(例
えば、エンベロープタンパク質)もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタ
ンパク質(例えば、RIIとして知られるPlasmodium falciparum
の環境スポロゾイト(circumsporozoite)タンパク質由来の17アミノ
酸ペプチド)。
包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン
、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとと
もに含有され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチ
レングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリド
が含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキス
トランまたはDEAEデキストランである。また、キトサンおよびポリ(乳酸−コ−グリ
コリド)である。
所望のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞
への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージング
され得る。
し得るリポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドまたは縮合ポリペプチドの
脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約1:1(mgDNA:マイクロモル
脂質)であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてのリ
ポソーム使用の概説については、HugおよびSleight(1991)Biochi
m.Biophys.Acta.1097:1−17;Straubinger(198
3)Meth.Enzymol.101:512−527を参照のこと。
ン性(負に荷電した)および中性の調製物を包含する。カチオン性リポソームは、機能的
な形態で、プラスミドDNA(Felgner(1987)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 84:7413−7416);mRNA(Malone(1989
)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6077−6081;および
精製した転写因子(Debs(1990)J.Biol.Chem.265:10189
−10192)の細胞内送達を媒介することが示されている。
オキシ)プロピル]−N,N,N−トリエチルアンモニウム(DOTMA)リポソームは
、GIBCO BRL、Grand Island、NYから商標リポフェクチン(Li
pofectin)の下で入手可能である(Felgner前出もまた参照のこと)。他
の市販されているリポソームは、トランスフェクテース(transfectace)(
DDAB/DOPE)およびDOTAP/DOPE(Boerhinger)を含む。他
のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用する容易に利用可能な物質から
調製され得る。例えば、DOTAP(1,2−ビス(オレイルオキシ)−3−(トリメチ
ルアンモニオ)プロパン)リポソームの合成の記載について、Szoka(1978)P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 75:4194−4198;WO90/
11092を参照のこと。
ipids(Birmingham,AL)から容易に入手可能であるか、または容易に
入手可能な物質を使用して容易に調製され得る。このような物質には、とりわけ、ホスフ
ァチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホス
ファチジルコリン(DOPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)
、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)が含まれる。これらの物質
はまた、適切な比率のDOTMAおよびDOTAPの出発物質と混合される。これらの物
質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
または大きな単一膜のベシクル(LUV)を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は
当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Straubinger(19
83)Meth.Immunol.101:512−527;Szoka(1978)P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 75:4194−4198;Papah
adjopoulos(1975)Biochim.Biophys.Acta 394
:483;Wilson(1979)Cell 17:77;DeamerおよびBan
gham(1976)Biochim.Biophys.Acta 443:629;O
stro(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.76:
836;Fraley(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
6:3348;EnochおよびStrittmatter(1979)Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 76:145;Fraley(1980)J.Bio
l.Chem.(1980)255:10431;SzokaおよびPapahadjo
poulos(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:14
5;ならびにSchaefer−Ridder(1982)Science 215:1
66を参照のこと。
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドとともに
含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例は、キロミクロン、HDL、IDL、LDL
、およびVLDLを含む。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物も
また、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体(例えば、アセチル
化されたLDL)が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプタ
ーを発現する細胞へのポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパ
ク質が、送達されるポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはその
組成物中には含まれない。
部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質A、B、C、D、お
よびEが単離および同定されている。これらの少なくとも2つはいくつかのタンパク質を
含み、ローマ数字、AI、AII、AIV;CI、CII、CIIIによって命名されて
いる。
するキロミクロンは、A、B、C、およびEからなり、そして時間がたてばこれらのリポ
タンパク質はAを欠失し、そしてCおよびEアポタンパク質を獲得する。VLDLは、A
、B、C、およびEアポタンパク質を含み、LDLはアポタンパク質Bを含み;そしてH
DLは、アポタンパク質A、C、およびEを含む。
985)Annu Rev.Biochem 54:699;Law(1986)Adv
.Exp Med.Biol.151:162;Chen(1986)J Biol C
hem 261:12918;Kane(1980)Proc Natl Acad S
ci USA 77:2465;およびUtermann(1984)Hum Gene
t 65:232に記載されている。
リン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質
において変化する。例えば、キロミクロンは、主としてトリグリセリドを含む。天然に存
在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Meth.Enzym
ol.128(1986)に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性に
ついてアポタンパク質の立体構造において補助するために選択される。脂質の組成はまた
、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され
得る。
。そのような方法は、Meth.Enzymol.(前出);Pitas(1980)J
.Biochem.255:5454−5460およびMahey(1979)J Cl
in.Invest 64:743−750に記載される。
発現による組換え方法によって産生され得る。例えば、Atkinson(1986)A
nnu Rev Biophys Chem 15:403およびRadding(19
58)Biochim Biophys Acta 30:443を参照のこと。
.,Stoughton,Massachusetts,USAのような商業的な供給者
から購入され得る。
465に見い出され得る。
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを有す
る組成物中に、リポタンパク質を伴って、またはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。
、そして所望の位置への送達を容易にするための核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤
は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボ適用のいずれもを有する。ポリカチオン性
薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用
され得る。
リアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例は、ヒストン、プロタミン、
ヒト血清アルブミン、DNA結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、DNAウイ
ルス由来のコートタンパク質(例えば、X174)を含む。転写因子もまた、DNAに結
合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写
因子(例えば、C/CEBP、c−jun、c−fos、AP−1、AP−2、AP−3
、CPF、Prot−1、Sp−1、Oct−1、Oct−2、CREP、およびTFI
ID)は、DNA配列に結合する塩基性ドメインを含む。
rescine)を含む。
他のポリペプチドのポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬
剤が産生され得る。
有用な合成ポリカチオン性薬剤は、例えば、DEAE−デキストラン、ポリブレンを含
む。LipofectinTM、およびlipofectAMINETMは、ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドと組み合わせた場合に、ポリカチオン性複合体を形成するモノマー
である。
本発明のNeisserial抗原は、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイに
おいて使用され得る(または、逆に抗Neisserial抗体は、抗原レベルを検出す
るために使用され得る)。充分に規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイは、侵襲
性の診断方法と置き換えるために開発され得る。生物学的サンプル(例えば、血液サンプ
ルまたは血清サンプルを含む)内のNeisserialタンパク質に対する抗体が検出
され得る。このイムノアッセイの設計は、多くのバリエーションの対象であり、そして種
々のこれらは当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッ
セイ、または直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコ
ルはまた、例えば、固体支持体を使用し得るか、または免疫沈降によってなされ得る。ほ
とんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含む;その標識は、例
えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブから
のシグナルを増幅するアッセイもまた公知である;これらの例は、ビオチンおよびアビジ
ンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ(例えば、EL
ISAアッセイ)である。
セイの実行に必要とされる残りの試薬および物質(例えば、適切な緩衝液、塩溶液など)
ならびに適切なアッセイの説明書のセットと共に、本発明の組成物を含む適切な物質をパ
ッケージすることによって構築される。
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による2つの核酸配列の互いの会合をいう
。代表的には、1つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離してい
る。次いで、2つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影
響を与える因子は以下を含む:溶媒のタイプおよび容量;反応温度;ハイブリダイゼーシ
ョンの時間;撹拌;液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤(
Denhardt’s試薬またはBLOTTO);配列の濃度;配列の会合の速度を増大
させる化合物(硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール)の使用;およびハイブ
リダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Sambrookら(前出)第2
巻、第9章、9.47〜9.57頁を参照のこと。
ハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算
されたTmより約120〜200℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべき
である。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムDNAのサンプルが
目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される
、予備的な実験において経験的に決定され得る。Sambrookら、9.50頁を参照
のこと。
複雑さ、および(2)プローブと検出される配列との間の相同性である。研究されるフラ
グメント全量は、プラスミドまたはファージ消化物については0.1〜1μg、非常に複
雑な真核生物ゲノム中の単一コピーについては10-9〜10-8gまで、10倍変化し得る
。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハ
イブリダイゼーション、および曝露回数、より少量の出発ポリヌクレオチド、ならびによ
り低い非活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、1μgの
酵母DNAで開始し、2時間ブロットし、そして4〜8時間108cpm/μgのプロー
ブを用いてハイブリダイズして、わずか1時間の曝露時間を用いて検出され得る。単一コ
ピーの哺乳動物遺伝子について、保存性のアプローチは、10μgのDNAで開始し、一
晩ブロットし、そして108cpm/μgより多いプローブを用いて10%硫酸デキスト
ランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約24時間の曝露時間を生じる。
ドの融解温度(Tm)、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄につ
いての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはフラグメント
に対して100%相同なわけではない。他の共通して直面する変化には、長さ、およびハ
イブリダイズする配列の全G+C含量、ならびにイオン強度およびハイブリダイゼーショ
ン緩衝液のホルムアミド含量が含まれる。これらのすべての因子の効果は、一つの式によ
って近似され得る:
Tm=81+16.6(log10Ci)+0.4[%(G+C)]−0.6(%ホル
ムアミド)−600/n−1.5(%ミスマッチ)。
ここでCiは塩濃度(一価イオン)であり、そしてnは塩基対内のハイブリッドの長さで
ある(MeinkothおよびWahl(1984)Anal.Biochem.138
:267−284からわずかに改変した)。
えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度な
らびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度(す
なわち、ストリンジェンシー)が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリ
ダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少す
る。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合(遺伝
子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように
)、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが
増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイゼーションバンドの強度、および
バックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減
少とともに増大する。
的フラグメントに95%〜100%相同であるプローブについて42℃、90%〜95%
の相同性では37℃、そして85%〜90%の相同性については32℃である。より低い
相同性については、上記の式を用いて、適宜にホルムアミド含量が低くされ、そして温度
が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合
、最も単純なアプローチは、ストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件およ
び洗浄条件の両方で開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドま
たは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄
され得、そして再び露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的
にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄ストリンジェンシー
が並行して試験されるべきである。
本発明に従う核酸プローブを利用する、PCR、分枝DNAプローブアッセイ、または
ブロッティング技術のような方法は、cDNAまたはmRNAの存在を決定し得る。プロ
ーブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合体を形成し得る場合に、本
発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
ンチセンス鎖の両方を含む)にハイブリダイズする。多くの異なるヌクレオチド配列がア
ミノ酸配列をコードするが、ネイティブなNeisserial配列は、細胞に存在する
実際の配列であるので、好ましい。mRNAは、コード配列を表し、従ってプローブはコ
ード配列に相補的であるべきであり、一本鎖cDNAはmRNAに相補的であり、従って
cDNAプローブは非コード配列に相補的であるべきである。
。核酸プローブが標的ヌクレオチドと検出され得る二重鎖を形成し得る場合、配列および
長さのいくらかの変動は、アッセイの感受性の増加をもたらし得る。また、核酸プローブ
は、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌクレオチドを含み得る。さらなるN
eisseria配列もまた、形成された二重鎖を検出するための標識としての一助とな
り得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、そのプローブの5’末端に付着され得、
ここでそのプローブ配列の残りはNeisseria配列に相補的である。あるいは、プ
ローブ配列が、それとハイブリダイズし、そしてそれによって検出され得る二重鎖を形成
するためにNeisseria配列との十分な相補性を有する場合、非相補的塩基または
より長い配列が、プローブ中に分散され得る。
条件など)に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列の複雑さに依存し
て、核酸プローブは、代表的には、少なくとも10〜20ヌクレオチド、好ましくは15
〜25、そしてより好ましくは少なくとも30ヌクレオチドを含むが、これよりも短くも
あり得る。短いプライマーは、一般的には、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を
形成するのにより低い温度を必要とする。
.Chem.Soc.(1981)103:3185))、またはUrdeaら(Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:7461)に従って、また
は市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、産生され得る。
AまたはRNAが適切である。他の適用については、改変(例えば、ホスホロチオエート
またはメチルホスホネートのようなバックボーンの改変)が組み込まれ得、インビボの半
減期を増大させ、RNA親和性を変化させ、ヌクレアーゼ耐性を増大させるためなどに使
用され得(例えば、AgrawalおよびIyer(1995)Curr Opin B
iotechnol 6:12−19;Agrawal(1996)TIBTECH 1
4:376−387を参照のこと);ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る
(例えば、Corey(1997)TIBTECH 15 224−229;Bucha
rdtら(1993)TIBTECH 11:384−386を参照のこと)。
WO92/02526によって記載される(米国特許第5,124,246号もまた参
照のこと)。
手段である。そのアッセイは、Mullisら(Meth.Enzymol.(1987
)155:335−350);米国特許第4,683,195号および同第4,683,
202号に記載されている。2つの「プライマー」ヌクレオチドは、標的核酸とハイブリ
ダイズし、そして反応を開始するために使用される。このプライマーは、二重鎖の安定性
を補助するために、または、例えば、都合のよい制限部位を組み込むために、増幅標的(
またはその相補物)の配列にハイブリダイズしない配列を含み得る。代表的には、このよ
うな配列は、所望のNeisseria配列に隣接する。
ら標的核酸のコピーを作製する。閾値量の標的核酸がポリメラーゼによって産生された後
、それらはより従来的な方法(例えば、サザンブロット)によって検出され得る。サザン
ブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、Neisseria配列(またはそ
の相補物)にハイブリダイズする。
なブロッティング技術によって検出され得る。mRNA、またはmRNAからポリメラー
ゼ酵素を使用して生成されたcDNAは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離され得
る。次いで、ゲル上のこの核酸は、ニトロセルロースのような固体支持体上にブロットさ
れる。この固体支持体は、標識されたプローブに曝露され、次いですべてのハイブリダイ
ズしていないプローブを洗浄して除去する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する
。代表的には、そのプローブは、放射活性部分で標識される。
本実施例は、N.meningitidisで同定された核酸配列を、推定の翻訳産物
と共に記載し、そしてまたN.gonorrhoeaeで同定された核酸配列を、推定の
翻訳産物と共に記載する。すべての核酸配列が完全なわけではなく、すなわち、それらは
、全長の野生型タンパク質より短い配列をコードする。
・N.meningitidisにおいて同定されたヌクレオチド配列
・このN.meningitidis配列の推定の翻訳産物
・データベースの比較に基づくこの翻訳産物のコンピューター分析
・N.gonorrhoeaeから同定される、対応するヌクレオチド配
・このN.gonorrhoeae配列の推定の翻訳産物
・N.meningitidis配列の翻訳産物とN.gonorrhoeae配列の
翻訳産物との間の同一性のパーセンテージの比較
・N.meningitidisのA株から同定された、対応するヌクレオチド配列
・このN.meningitidis A株の配列の推定の翻訳産物
・N.meningitidis配列の翻訳産物とN.gonorrhoeae配列の
翻訳産物との間の同一性のパーセンテージの比較
・適切に抗原性または免疫原性であり得ることを示すタンパク質の特徴の記載。
n、BLASTx、およびtBLASTxのアルゴリズム(例えば、Altschulら
(1997)Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new g
eneration of protein database search pro
grams.Nucleic Acids Resaerch 25:2289−340
2もまた参照のこと)を使用して、NCBI(http://www.ncbi.nlm
.nih.gov)で行った。検索を、以下のデータベースに対して行った:縮重しない
GenBank+EMBL+DDBJ+PDB配列および縮重しないGenBank C
DS 翻訳物+PDB+SwissProt+SPupdate+PIR配列。
って導入されたヌクレオチドを示す。同様に、二重下線を付したヌクレオチドを取り除い
た。小文字は、独立した配列決定反応のアラインメントの間に生じたあいまいさを示す(
本実施例におけるヌクレオチド配列のいくつかは2つ以上の実験の結果を合わせて得られ
る)。
(Critical evaluation of the hydropathy o
f membrane proteins(1990)Eur
J Biochem 190:207−219)の統計学的な研究に基づくアルゴリズ
ムを用いて、疎水性ドメインの存在を予測した。これらのドメインは、潜在的な膜貫通領
域または疎水性リーダー配列を表す。
して、フラグメント化されたヌクレオチド配列から予測した。
ort.nibb.ac.jp)によって予測される、ORF中の潜在的な膜貫通ドメイ
ンまたはリーダー配列を示す。機能的なドメインもまた、MOTIFSプログラム(GC
G WisconsinおよびPROSITE)を使用して予測した。
いくらかの推定の膜貫通ドメイン(一本下線)の存在に基づいて、N.meningit
idisおよびN.gonorrhoeaeからのタンパク質およびそれらのそれぞれの
エピトープは、ワクチンまたは診断剤のために有用な抗原または免疫原性組成物であり得
ることが予測される。
配列を使用するために)使用され得る標準的な施術および手順が、上記に要約された。こ
の要旨は、本発明に対する限定ではなく、むしろ、使用され得るが必要ではない例を与え
る。
徴付けを行った。
N.meningitidis株2996を、100mlのGC培地中で対数増殖期ま
で増殖させ、遠心分離によって収集し、そして5ml緩衝液(20%(w/v)スクロー
ス、50mM Tris−HCl、50mM EDTA、pH8)に再懸濁した。氷上で
10分間のインキュベーション後、その細菌を、10mlの溶解溶液(50mM NaC
l、1% Na−サルコシル、50μg/ml プロテイナーゼK)の添加によって溶解
し、そしてその懸濁液を37℃で2時間インキュベートした。2回のフェノール抽出(p
H8に平衡化)および1回のCHCl3/イソアミルアルコール(24:1)抽出を行っ
た。DNAを、0.3M 酢酸ナトリウムおよび2容量のエタノールの添加によって沈殿
させ、そして遠心分離によって収集した。ペレットを、70%(v/v)エタノールで1
回洗浄し、そして4.0ml TE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM ED
TA、pH8)に再溶解した。DNA濃度を、260nmにおけるODを読みとることに
よって測定した。
合成オリゴヌクレオチドプライマーを、(a)利用可能な場合にはmeningoco
ccus B配列、または(b)gonococcus/meningococcus
A配列を使用して、必要に応じて、meningococcusの好ましいコドン使用法
に適合させて、各々のORFのコード配列に基づいて設計した。予測されるリーダー配列
のすぐ下流の配列に対して、5’プライマーを設計することによって、いかなる予測され
るシグナルペプチドをも除外した。
、2つの制限酵素部位(BamHI−NdeI、BamHI−NheI、EcoRI−N
deIまたはEcoRI−NheI)を含んだ。3’プライマーは、XhoI制限部位ま
たはHindIII制限部位を含んだ(表1)。この手順を、各々の増幅産物(各々のO
RFに一致する)のクローニングを2つの異なる発現系:pGEX−KG(BamHI−
XhoI、BamHI−HindIII、EcoRI−XhoIまたはEcoRI−Hi
ndIIIを使用する)、およびpET21b+(NdeI−XhoI、NheI−Xh
oI、NdeI−HindIIIまたはNheI−HindIIIを使用する)に指向さ
せるように確立した。
3’プライマーは、ただ1つの制限酵素部位(5’プライマーについてEcoRI、Kp
nIまたはSalIおよび3’プライマーについてPstI、XbaI、SphIまたは
SalI)を含んだ。また、制限部位を、遺伝子の特定の制限パターンに従って選択した
(表1)。
イズするヌクレオチドを含んだ。融解温度は、プライマー全体においてハイブリダイズす
るヌクレオチドの数および型に依存し、そして各々のプライマーについて、以下の式を使
用して決定した:
Tm=4(G+C)+2(A+T) (テイルを除外)
Tm=64.9+0.41(%GC)−600/N (プライマー全体)
選択したオリゴヌクレオチドの融解温度は、オリゴ全体について通常65〜70℃であ
り、そしてハイブリダイズする領域単独では50〜55℃であった。
合において、プライマーの配列は、予測されるORFの配列に正確には一致しない。これ
は、初期の増幅を行った時、いくつかのmeningococcas B ORFについ
て、完全な5’および/または3’配列は、公知ではなかったからである。しかし、対応
する配列は、GonococcusまたはMeningoccus Aにおいて同定され
ていた。従って、Meningoccus B配列が不完全または不確かであった場合、
Gonococcus配列またはMeningococcus A配列を、プライマー設
計のための基礎として使用した。これらの配列を、コドンの優先性を考慮して変更した。
一旦完全な配列が同定されると、このアプローチがもはや必要でないことが理解され得る
。
チドを合成し、2.0mlのNH4OH中でカラムから溶出し、そして56℃での5時間
のインキュベーションにより脱保護した。このオリゴを0.3M 酢酸ナトリウムおよび
2容量のエタノールの添加によって沈殿させた。このサンプルを遠心分離し、そしてその
ペレットを100μlまたは1.0mlいずれかの水に再懸濁した。OD260を、Per
kin Elmer Lambda
Bio分光光度計を使用して決定し、濃度を2〜10pmol/μlに調整した。
標準PCRプロトコールは、以下のとおりであった:50〜200ngのゲノムDNA
を、20〜40μMの各オリゴヌクレオチドプライマー、400〜800μMのdNTP
溶液、1×PCR緩衝液(1.5mM MgCl2を含む)、2.5単位のTaqI D
NAポリメラーゼ(Perkin−Elmer AmpliTaQ、GIBCO Pla
tinum、Pwo DNAポリメラーゼ、またはTakara Shuzo Taqポ
リメラーゼを使用する)の存在下でテンプレートとして使用した。いくつかの場合におい
て、PCRを10μlのDMSOまたは50μlの2Mベタインの添加によって最適化(
otpimse)した。
メラーゼを添加する)の後に、各サンプルに二工程増幅を行った:最初の5サイクルを、
プライマーの制限酵素のテールを除くハイブリダイゼーション温度を使用して行った(上
記を参照のこと)。これに続いて、次に全長オリゴについて算出されたハイブリダイゼー
ション温度を用いて30サイクルを行った。このサイクルは、72℃での10分間の伸長
によって完了した。標準サイクルは、以下のとおりであった:
2400のいずれかのPerkin Elmer GeneAmp PCRシステムを使
用して行った。結果を確認するために、増幅容量の1/10を、1〜1.5%(w/v)
アガロースゲルにロードし、そして各増幅フラグメントのサイズをDNA分子量マーカー
と比較した。
殿をして、1.0%アガロースゲルにロードするために適切な容量中に再懸濁したかのい
ずれかであった。正確なサイズのバンドに対応するDNAフラグメントを、Qiagen
Gel Extraction Kitを使用して、製造業者のプロトコルに従って精
製した。DNAフラグメントを、H2Oまたは10mM Tris、pH8.5のいずれ
かで、30μlまたは50μlの容量で溶出させた。
増幅フラグメントに対応する精製DNAを、以下のために適切な制限酵素を用いて2重
に消化した:pET−21b+へのクローニング、およびC末端Hisタグ化融合物とし
てのタンパク質の発現、pGEX−KGへのクローニング、およびN末端GST融合物と
してのタンパク質の発現、ならびにpGEX−Hisへのクローニング、およびN末端G
ST−Hisタグ化融合物としてのタンパク質の発現。
消化緩衝液の存在下で適切な制限酵素(New England Biolabs)20
単位を用いて、37℃で3時間から一晩、インキュベートした。消化フラグメントをQI
Aquick PCR精製キットを(製造業者の指示に従って)使用して精製し、そして
、H2Oまたは10mM Tris(pH8.5)のいずれかの30μlまたは50μl
の容量中で溶出した。DNA濃度を、適定された分子量マーカーの存在下での定量的アガ
ロースゲル電気泳動(1.0%ゲル)によって決定した。
T21b+、pGEX−KGおよびpGEX−His)の消化)
ベクターpGEX−Hisは、トロンビン切断部位の上流に6つのヒスチジン残基をコ
ードする領域を保有し、ベクターpTRC99(Pharmacia)のマルチプルクロ
ーニング部位を含む、改変されたpGEX−2Tベクターである。10μgのプラスミド
を、適切な緩衝液の存在下で、200μlの反応容量中で、50単位の各制限酵素を用い
て、37℃での一晩のインキュベーションで2重に消化した。消化物全体を1%アガロー
スゲルにロードした後に、消化したベクターに対応するバンドを、Qiagen QIA
quick Gel Extraction Kitを使用してゲルから精製し、そして
そのDNAを50μlの10mM Tris−HCl(pH8.5)中に溶出した。DN
A濃度を、サンプルのOD260を測定することにより評価し、そして50μg/μlに調
整した。1μlのプラスミドを、各クローニング手順に使用した。
各制限酵素を用いて、37℃での一晩のインキュベーションで2重に消化した。消化物を
1.0%アガロースゲルにロードし、そしてQiagen QIAquick Gel
Extraction Kitを使用して精製した消化したベクターに対応するバンドを
、50μlの10mM Tris−HCl(pH8.5)中に溶出させた。DNA濃度を
、OD260を測定することにより評価し、そして濃度を50μg/μlに調整した。1μ
lのプラスミドを、各クローニング手順に使用した。
いくつかのORFについて、予め消化して精製した各ORFに対応するフラグメントを
、pET22bおよびpGEX−KGの両方に連結した。最終容量20μl中で、モル比
3:1のフラグメント/ベクターを、0.5μlのNEB T4 DNAリガーゼ(40
0単位/μl)を使用して、製造業者から供給された緩衝液の存在下で連結した。この反
応物を、室温で3時間インキュベートした。いくつかの実験において、連結を、Bohe
ringerの「Rapid Ligation Kit」を使用して、製造業者の指示
に従って行った。
ンピテント細胞を、リガーゼ反応溶液とともに、40分間氷上でインキュベートし、次に
、37℃で3分間インキュベートし、次に、800μlのLBブロスを添加した後、再度
37℃で20分間インキュベートした。次に細胞を、Eppendorfの微量遠心機に
おいて最大速度で遠心分離し、そして約200μlの上清に再懸濁した。次に、その懸濁
物をLBアンピシリン(100mg/ml)上にプレーティングした。
/mlのアンピシリンを加えた2ml(pGEXまたはpTCクローン)または5ml(
pETクローン)のLBブロスのいずれかにおいて37℃で一晩増殖させて行った。次に
、細胞をペレットにして、Qiagen QIAprep Spin Miniprep
Kitを使用して、製造業者の指示に従って、DNAを最終容量30μlに抽出した。
各々個々のミニプレップ(約1g)の5μlを、NdeI/XhoIまたはBamHI/
XhoIのいずれかを用いて消化し、そして全消化物を、1〜1.5%アガロースゲル(
予想されるインサートサイズに依存する)に、分子量マーカー(1Kb DNA Lad
der、GIBCO)と並行してロードした。陽性クローンのスクリーニングを、正確な
インサートサイズに基づいて行った。
、pET21b+およびpGEX−KGの両方の中に連結した。3:1のモル比のフラグ
メント/ベクターを、0.5μlのT4 DNAリガーゼ(400単位/μl、NEB)
および製造業者によって供給される連結緩衝液を含む20μlの最終容量において用いた
。反応を、室温にて3時間行った。いくつかの実験では、Boheringerの「Ra
pid Ligation Kit」および製造業者のプロトコルを用いて連結を行った
。
01中に、連結反応溶液および細菌を氷上で40分間インキュベートし、次いで37℃に
て3分間インキュベートすることによって、形質転換した。これに続いて、800μlの
LBブロスを添加し、そして37℃にて20分間インキュベーションした。細胞を、Ep
pendorfの微量遠心機において最大速度で遠心分離し、約200μlの上清に再懸
濁し、そしてLBアンピシリン(100mg/ml)寒天上にプレーティングした。
/mlのアンピシリンを加えた2.0ml(pGEX−KGクローン)または5.0ml
(pETクローン)のLBブロスのいずれかにおいて37℃で一晩増殖させて行った。細
胞をペレットにし、そしてQiagen QIAprep Spin Miniprep
Kitを使用して、製造業者の指示に従って、プラスミドDNAを抽出した。約1μg
の各々個々のミニプレップを、適切な制限酵素を用いて消化し、そして消化物を、1〜1
.5%アガロースゲル(予想されるインサートサイズに依存する)に、分子量マーカー(
1kb DNA Ladder、GIBCO)と並行してロードした。陽性クローンを、
インサートのサイズに基づいて選択した。
とによって、PGEX−His中にクローニングした。クローニングの後、組換えプラス
ミドを、E.coli宿主W3110中に形質転換した。個々のクローンを、個々のクロ
ーンを50μg/mlアンピシリンを含むLBブロス中で37℃で、一晩で増殖させた。
I、またはSalI−PstIを用いてpGEX−HISベクター中にクローニングし得
る。クローニングの後、組換えプラスミドを、E.coli宿主W3110に導入し得る
。
次いで、発現ベクター中にクローニングされた各ORFを、組換えタンパク質産物の発
現に適切な株中に形質転換し得る。各構築物の1μlを使用して、30μlのE.col
i BL21(pGEXベクター)、E.coli TOP10(pTRCベクター)ま
たはE.coli BL21−DE3(pETベクター)を、上記のように形質転換した
。pGEX−Hisベクターの場合、同一のE.coli株(W3110)を初期のクロ
ーニングおよび発現のために使用した。単一の組換えコロニーを、Amp(100μg/
ml)を加えた2mlのLBに接種し、37℃で一晩でインキュベートし、次に、100
mlのフラスコ中でAmp(100μg/ml)を加えた20mlのLB中に1:30で
希釈し、OD600の範囲が0.1と0.15との間であることを確実にした。このフラス
コを、ODが発現の誘導に適切な指数増殖を示すまで(pETおよびpTRCベクターに
ついて、0.4〜0.8 OD;pGEXおよびpGEX−Hisベクターについて0.
8〜1 OD)、回転型水浴振とう機中で30℃でインキュベートした。pET、pTR
CおよびpGEX−Hisベクターについて、タンパク質の発現を1mM IPTGの添
加によって誘導し、一方、pGEX系の場合、IPTGの最終濃度は、0.2mMであっ
た。30℃での3時間のインキュベーションの後、サンプルの最終濃度を、ODによって
確認した。発現を確認するために、1mlの各サンプルを取り出し、微量遠心機で遠心分
離し、ペレットをPBS中で再懸濁し、そしてクマシーブルー染色を用いる12% SD
S−PAGEによって分析した。サンプル全体を6000gで遠心分離し、そしてペレッ
トをさらなる使用のためにPBS中に再懸濁した。
いくつかのORFについて、単一のコロニーを、Ampを加えたLB寒天プレート上で
37℃で一晩で増殖させた。細菌を、水浴振とう機中のアンピシリンを加えた20mlの
LB液体培養物中に接種し、そして一晩増殖させた。細菌を、600mlの新鮮な培地中
に1:30に希釈し、最適な温度(20〜37℃)でOD550が0.8〜1になるまで増
殖させた。タンパク質の発現を0.2mMのIPTGを用いて誘導し、続いて、3時間イ
ンキュベートした。培養物を8000rpmで4℃で遠心分離した。上清を捨て、そして
細菌のペレットを7.5mlの冷PBS中に懸濁した。この細胞を、Branson s
onifier B−15を使用して、氷上で、30秒間、40Wで超音波処理すること
により破砕し、2回凍結融解し、そして再度遠心分離した。この上清を回収し、150μ
lのグルタチオン−Sepharose 4B樹脂(Pharmacia)(前もってP
BSで洗浄)と混合し、そして室温で30分間インキュベートした。このサンプルを70
0gで5分間4℃で遠心分離した。この樹脂を10mlの冷PBSを用いて、10分間、
2回洗浄し、1mlの冷PBSに再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹
脂を素通り画分が0.02〜0.06のOD280に到達するまで2mlの冷PBSで2回
洗浄した。GST融合タンパク質を、700μlの冷グルタチオン溶出緩衝液(10mM
還元型グルタチオン、50mM Tris−HCl)の添加によって溶出し、そして画
分をOD280が0.1になるまで回収した。各画分の21μlを、Biorad SDS
−PAGE Molecular weight standard broad ra
nge(M1)(200、116.25、97.4、66.2、45、31、21.5、
14.4、6.5kDa)またはAmersham Rainbow Marker(M
”)(220、66、46、30、21.5、14.3kDa)のいずれかを標準として
使用して、12% SDSゲル上にロードした。GSTの分子量が26kDaであるので
、この値を各GST融合タンパク質の分子量に添加しなければならない。
コロニーを画線し、そしてLB/Amp(100μg/ml)寒天プレート上で37℃に
て一晩増殖させた。このプレートからの単離されたコロニーを、20mlのLB/Amp
(100μg/ml)液体培地中に接種し、そして振盪しながら一晩増殖させた。一晩の
培養物を、600mlのLB/Amp(100μg/ml)液体培地中に1:30に希釈
し、そして最適な温度(20〜37℃)でOD550が0.6〜0.8になるまで増殖させ
た。組換えタンパク質の発現をIPTG(最終濃度0.2mM)の添加によって誘導し、
そして培養物をさらに3時間インキュベートした。細菌を、4℃にて8000×gにて1
5分間遠心分離することによって収集した。
onifier 450を使用して、氷上で、30秒間、40Wで4回超音波処理するこ
とにより破砕し、そして13000×gにて30分間、4℃にて遠心分離した。この上清
を回収し、150μlのグルタチオン−Sepharose 4B樹脂(Pharmac
ia)(前もってPBSで平衡化)と混合し、そして穏やかに攪拌しながら室温で30分
間インキュベートした。バッチ様式の調製物を、700×gにて5分間、4℃にて遠心分
離し、そして上清を捨てた。この樹脂を10mlの冷PBSを用いて、10分間、2回洗
浄し(バッチ様式で)、1mlの冷PBSに再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードし
た。この樹脂を素通り画分が0.02〜0.01のOD280nmに到達するまで冷PBSで
洗浄し続けた。GST融合タンパク質を、700μlの冷グルタチオン溶出緩衝液(10
mM 還元型グルタチオン、50mM Tris−HCl、pH8.0)の添加によって
溶出し、そして画分を、溶出物のOD280nmによって全ての組換えタンパク質が得られた
ことが示されるまで回収した。各溶出画分の20μlのアリコートを、12%ゲルを用い
てSDS−PAGEによって分析した。精製タンパク質の分子量を、Bio−Rad b
road range molecular weight standard(M1)
(200、116、97.4、66.2、45.0、31.0、21.5、14.4、6
.5kDa)またはAmersham Rainbow Marker(M2)(220
、66.2、46.0、30.0、21.5、14.3kDa)のいずれかを使用して決
定した。GST融合タンパク質の分子量は、26kDa GSTタンパク質とその融合パ
ートナーとの組合せである。タンパク質濃度を、Bradfordアッセイを用いて評価
した。
いくつかのORFについて、単一のコロニーをLB+Ampアガープレート上で37℃
で一晩増殖させた。細菌を、20mlのLB+Amp液体培養物中に接種し、水浴振とう
機中で一晩インキュベートした。細菌を、600mlの新鮮な培地中に1:30に希釈し
、最適な温度(20〜37℃)でOD550が0.6〜0.8になるまで増殖させた。タン
パク質の発現を1mMのIPTGの添加によって誘導し、そして、培養物をさらに3時間
インキュベートした。培養物を8000rpmで4℃で遠心分離した。上清を捨て、そし
て細菌のペレットを7.5mlの冷10mMイミダゾール緩衝液(300mM NaCl
、50mM リン酸緩衝液、10mM イミダゾール、pH8)中に再懸濁した。この細
胞を、Branson sonifier B−15を使用し、氷上で、30秒間、40
Wで超音波処理によって破砕し、2回凍結融解して、そして再度遠心分離した。上清を収
集し、150μlのNi2+樹脂(Pharmacia)(10mMイミダゾール緩衝液で
予め洗浄する)と混合し、30分間、穏やかな撹拌をしながら、室温でインキュベートし
た。このサンプルを700gで5分間4℃で遠心分離した。この樹脂を10mlの冷10
mMイミダゾール緩衝液を用いて10分間、2回洗浄し、1mlの冷10mMイミダゾー
ル緩衝液に再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を、2mlの冷10
mMイミダゾール緩衝液を用いて4℃で、素通り画分が0.02〜0.06のO.D280
に達するまで洗浄した。この樹脂を、2mlの冷20mMイミダゾール緩衝液(300m
M NaCl、50mM リン酸緩衝液、20mM イミダゾール、pH8)で素通り画
分が0.02〜0.06のO.D280に達するまで洗浄した。このHis融合タンパク質
を、700μlの冷250mMイミダゾール緩衝液(300mM NaCl、50mM
リン酸緩衝液、250mM イミダゾール、pH8)の添加によって溶出し、O.D280
が0.1になるまで、画分を収集した。21μlの各画分を、12%SDSゲルにロード
した。
単一のコロニーをLB+Ampアガープレート上で37℃で一晩で増殖させた。細菌を
、水浴振とう機中の20mlのLB+Amp液体培養物中に接種し、そして一晩増殖させ
た。細菌を、600mlの新鮮な培地中に1:30に希釈し、最適な温度(37℃)でO
.D550が0.6〜0.8になるまで増殖させた。タンパク質の発現を1mM IPTG
の添加によって誘導し、そして、培養物をさらに3時間インキュベートした。培養物を8
000rpmで4℃で遠心分離した。上清を捨て、そして細菌のペレットを7.5mlの
緩衝液B(尿素8M、10mM Tris−HCl、100mM リン酸緩衝液、pH8
.8)中に再懸濁した。この細胞を、Branson sonifier B−15を使
用し、氷上で、30秒間、40Wでの超音波処理により破砕し、2回凍結融解して、そし
て再度遠心分離した。上清を−20℃に保存し、一方、ペレットを2mlのグアニジン緩
衝液(6M 塩酸グアニジン、100mM リン酸緩衝液、10mM Tris―HCl
、pH7.5)に再懸濁し、そしてホモジナイザー中で10サイクル処理した。この産物
を13000rpmで40分間遠心分離した。上清を150μlのNi2+−樹脂(Pha
rmacia)(緩衝液Bで予め洗浄する)と混合し、そして30分間穏やかな撹拌をし
ながら、室温でインキュベートした。このサンプルを700gで5分間4℃で遠心分離し
た。この樹脂を10mlの緩衝液Bを用いて10分間、2回洗浄し、1mlの緩衝液B中
に再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を、2mlの緩衝液Bを用い
て室温で、素通り画分が0.02〜0.06のOD280に達するまで洗浄した。この樹脂
を、2mlの緩衝液C(尿素8M、10mM Tris−HCl、100mM リン酸緩
衝液、pH6.3)で、素通り画分が0.02〜0.06のO.D280に達するまで洗浄
した。このHis融合タンパク質を、700μlの溶出緩衝液(尿素8M、10mM T
ris−HCl、100mM リン酸緩衝液、pH4.5)の添加によって溶出し、そし
てOD280が0.1になるまで、画分を回収した。21μlの各画分を、12%SDSゲ
ルにロードした。
His融合物として精製されるべき各クローンについて、単一のコロニーをストリーク
し、そしてLB/Amp(100μg/ml)アガープレート上で37℃にて一晩増殖さ
せた。このプレートから単離されたコロニーを、20mlのLB/Amp(100μg/
ml)液体培地中に接種し、攪拌しながら37℃で一晩増殖させた。この一晩の培養物を
、600mlのLB/Amp(100μg/ml)液体培地中に1:30で希釈し、そし
てOD550nmが0.6〜0.8に達するまで最適な温度(20〜37℃)で増殖させた。
組換えタンパク質の発現をIPTGの添加(最終濃度1.0mM)によって誘導し、そし
て培養物をさらに3時間インキュベートした。細菌を8000×gで15分間4℃で遠心
分離することによって回収した。
aCl、50mM リン酸緩衝液、10mM イミダゾール、pH8.0)、または(i
i)不溶性タンパク質については、緩衝液B(8M尿素、10mM Tris−HCl、
100mM リン酸緩衝液、pH8.8)のいずれか7.5ml中に再懸濁した。細胞を
、Branson sonifier 450を40Wで使用し、氷上で、30秒間づつ
4回超音波処理することによって破砕し、そして13000×gで30分間、4℃で遠心
分離した。不溶性タンパク質については、ペレットを2.0mlの緩衝液C(6M 塩酸
グアニジン、100mM リン酸緩衝液、10mM Tris―HCl、pH7.5)に
再懸濁し、そしてDounceホモジナイザー中で10サイクル処理した。このホモジネ
ートを13000×gで40分間遠心分離し、そしてこの上清を保持した。
うに、緩衝液Aまたは緩衝液Bのいずれかで予め平衡化する)と混合し、30分間、穏や
かに撹拌しながら、室温でインキュベートした。この樹脂は、製造業者のプロトコルに従
って調製された、Chelating Sepharose Fast Flow(Ph
armacia)であった。このバッチ様式の(batch wise)調製物を700
×gで5分間4℃で遠心分離し、そしてこの上清を捨てた。この樹脂を10mlの緩衝液
AまたはBを用いて10分間、2回洗浄(バッチ様式)で、1.0mlの緩衝液Aまたは
B中に再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を、(i)緩衝液Aを用
いて4℃で、または(ii)緩衝液Bを用いて室温でのいずれかで、素通り画分のOD28
0nmが0.02〜0.01に達するまで洗浄し続けた。この樹脂を、(i)冷緩衝液C(
300mM NaCl、50mM リン酸緩衝液、20mM イミダゾール、pH8)、
または(ii)緩衝液D(8M尿素、10mM Tris−HCl、100mM リン酸
緩衝液、pH6.3)のいずれかで、素通り画分のOD280nmが0.02〜0.01に達
するまでさらに洗浄した。このHis融合タンパク質を、700μlの(i)冷溶出緩衝
液A(300mM NaCl、50mM リン酸緩衝液、250mM イミダゾール、p
H8)、または(ii)溶出緩衝液B(8M尿素、10mM Tris−HCl、100
mM リン酸緩衝液、pH4.5)のいずれかの添加によって溶出し、そしてO.D280n
mが全ての組換えタンパク質が得られたことを示すまで、画分を収集した。各溶出画分の
20μlのアリコートを、12%ゲルを使用してSDS−PAGEによって分析した。タ
ンパク質濃度をBradfordアッセイを使用して評価した。
タンパク質を可溶化するために変性が必要とされる場合、免疫の前に再生の工程を用い
た。グリセロールを、上記で得られた変性した画分に添加し、10%(v/v)の最終濃
度を得た。このタンパク質を透析緩衝液I(10%(v/v)グリセロール、0.5M
アルギニン、50mM リン酸緩衝液、5.0mM 還元型グルタチオン、0.5mM
酸化型グルタチオン、2.0M 尿素、pH8.8)を使用して200μg/mlになる
まで希釈し、そして同じ緩衝液に対して、4℃で12〜14時間透析した。さらなる透析
を、透析緩衝液II(10%(v/v)グリセロール、0.5M アルギニン、50mM
リン酸緩衝液、5.0mM 還元型グルタチオン、0.5mM 酸化型グルタチオン、
pH8.8)を用いて4℃で12〜14時間実行した。
透析緩衝液I(10%グリセロール、0.5M アルギニン、50mM
リン酸緩衝液、5mM 還元型グルタチオン、0.5mM 酸化型グルタチオン、2M
尿素、pH8.8)を使用して20μg/mlになるまで希釈し、同じ緩衝液に対して
、4℃で12〜14時間透析した。このタンパク質をさらに透析緩衝液II(10%グリ
セロール、0.5M アルギニン、50mM リン酸緩衝液、5mM 還元型グルタチオ
ン、0.5mM 酸化型グルタチオン、pH8.8)に対して4℃で12〜14時間透析
した。
タンパク質(mg/ml)=(1.55×OD280)−(0.76×OD260)。
可溶性を分析するために、3.0mlの培養物から得られたペレットを、500μlの
緩衝液M1(PBS pH7.2)中に再懸濁した。25μlのリゾチーム(10mg/
ml)を添加し、そしてこの細菌を15分間4℃でインキュベートした。細胞を、Bra
nson sonifier 450を40Wで使用して30秒間4回氷上で超音波破砕
することにより破壊し、そして13000×gで30分間4℃にて遠心分離した。この上
清を収集し、そしてこのペレットを、緩衝液M2(8M尿素、0.5M NaCl、20
mMイミダゾールおよび0.1M NaH2PO4)中に再懸濁し、そして4℃で3〜4時
間インキュベートした。遠心分離後、この上清を収集し、そしてこのペレットを、緩衝液
M3(6MグアニジニウムHCl、0.5M NaCl、20mM イミダゾールおよび
0.1M NaH2PO4)中に4℃にて一晩再懸濁した。全ての工程からの上清を、SD
S−PAGEにより分析した。いくつかのタンパク質は、PBS中で可溶性であることが
見出され、他のタンパク質は、可溶化のために尿素またはグアニジウムHClを必要とし
た。
を、上記の手順を使用して、緩衝液M1、M2またはM3のいずれかにおいて可溶化した
。粗抽出物を、用いた可溶化緩衝液に依存して、緩衝液M1、M2またはM3を用いて平
衡化したNi−NTAスーパーフローカラム(Quiagen)上にロードした。非結合
物質を、カラムを同一の緩衝液で洗浄することにより溶出した。500mMのイミダゾー
ルを含有する対応する緩衝液を用いて、組換え融合タンパク質を溶出し、次いでイミダゾ
ールの非存在下で同じ緩衝液に対して透析した。
20μgの各精製タンパク質を使用して、マウスの腹腔内で免疫した。いくつかのOR
Fの場合、Balb−Cマウスを、Al(OH)3をアジュバントとして用いて、1、2
1および42日目に免疫し、そして56日目に採取したサンプルにおける免疫応答をモニ
ターした。他のORFについては、CD1マウスを、同じプロトコルを用いて免疫し得た
。ORF25および40については、CD1マウスを、フロイントアジュバントを用いて
免疫し、そして免疫応答を56日目ではなく42日目に測定したことを除いて、同じ免疫
プロトコルを使用した。同様に、なお他のORFについては、CD1マウスをフロイント
アジュバントを用いて免疫したが、免疫応答を49日目に測定した。あるいは、20μg
の各精製タンパク質をフロイントアジュバントと混合し、そしてCD1マウスに腹腔内で
免疫するために使用した。多くのタンパク質については、この免疫化を、1、21および
35日目に実行し、そして免疫応答を、34および49日目に採取されたサンプルにおい
てモニターした。いくつかのタンパク質については、第3の免疫化を、35日目ではなく
28日目に実行し、この免疫応答を、34および49日目ではなく、20および42日目
に測定した。
無莢膜のMenB M7株を、チョコレートアガープレート上にプレートし、そして3
7℃で一晩インキュベートした。細菌のコロニーをアガープレートから滅菌ドラコン(d
racon)スワブを使用して収集し、そして0.25%グルコースを含有する7mlの
Mueller−Hintonブロス(Difco)中に接種した。細菌の増殖を30分
毎に、OD620を追跡することによりモニターした。細菌をODが0.3〜0.4の値に
達するまで増殖させた。培養物を10分間10000rpmで遠心分離した。上清を捨て
、そして細菌をPBSで1回洗浄し、0.025%のホルムアルデヒドを含有するPBS
中に再懸濁し、そして室温で2時間インキュベートし、次いで4℃で一晩で攪拌しながら
インキュベートした。100μlの細菌細胞を、96ウェルGreinerプレートの各
ウェルに添加し、そして4℃で一晩でインキュベートした。次いでそのウェルをPBT洗
浄緩衝液(PBS中の0.1% Tween−20)を用いて3回洗浄した。200μl
の飽和緩衝液(水中の2.7%のポリビニルピロリドン 10)を各ウェルに添加し、そ
してプレートを37℃で2時間インキュベートした。ウェルをPBTで3回洗浄した。2
00μlの希釈血清(希釈緩衝液:PBS中に1% BSA、0.1% Tween−2
0、0.1% NaN3)を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを37℃で90分間
インキュベートした。ウェルをPBTで3回洗浄した。希釈緩衝液中に1:2000に希
釈した100μlのHRP−結合体化ウサギ抗マウス(Dako)血清を、各ウェルに添
加し、そしてこのプレートを37℃で90分間インキュベートした。ウェルを、PBT緩
衝液で3回洗浄した。100μlのHRPに対する基質緩衝液(25mlのクエン酸緩衝
液、pH5、10mgのO−フェニルジアミンおよび10μlのH2O2)を各ウェルに添
加し、そしてこのプレートを室温で20分間放置した。100μlのH2SO4を各ウェル
に添加し、そしてOD490を追跡した。OD490がそれぞれの免疫前血清の2.5倍である
場合、ELISAが陽性であるとみなした。
、そして37℃で一晩インキュベートした。細菌のコロニーをアガープレートから滅菌ド
ラコンスワブを使用して収集し、そして0.25%グルコースを含有する7mlのMue
ller−Hintonブロス(Difco)中に接種した。細菌の増殖を30分毎に、
OD620を追跡することによりモニターした。細菌をODが0.3〜0.4の値に達する
まで増殖させた。培養物を10分間10000rpmで遠心分離した。上清を捨て、そし
て細菌をPBSで1回洗浄し、0.025%のホルムアルデヒドを含有するPBS中に再
懸濁し、そして37℃で1時間インキュベートし、次いで4℃で一晩で攪拌しながらイン
キュベートした。100μlの細菌細胞を、96ウェルGreinerプレートの各ウェ
ルに添加し、そして4℃で一晩でインキュベートした。次いでこのウェルをPBT洗浄緩
衝液(PBS中の0.1% Tween−20)を用いて3回洗浄した。200μlの飽
和緩衝液(水中の2.7%のポリビニルピロリドン 10)を各ウェルに添加し、そして
プレートを37℃で2時間インキュベートした。ウェルをPBTで3回洗浄した。200
μlの希釈血清(希釈緩衝液:PBS中に1% BSA、0.1% Tween−20、
0.1% NaN3)を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを37℃で2時間インキ
ュベートした。ウェルをPBTで3回洗浄した。希釈緩衝液中に1:2000に希釈した
100μlのHRP−結合体化ウサギ抗マウス(Dako)血清を、各ウェルに添加し、
そしてこのプレートを37℃で90分間インキュベートした。ウェルを、PBT緩衝液で
3回洗浄した。100μlのHRPに対する基質緩衝液(25mlのクエン酸緩衝液、p
H5、10mgのO−フェニルジアミンおよび10μlのH2O2)を各ウェルに添加し、
そしてこのプレートを室温で20分間放置した。100μlの12.5% H2SO4を各
ウェルに添加し、そしてOD490を追跡した。ELISA力価を、免疫前血清レベルを超
える0.4のOD490値を与える血清の希釈として任意(abitrarely)算定し
た。0.4のOD490での血清の希釈が1:400を超える場合、ELISAを陽性であ
るとみなした。
無莢膜MenB M7株をチョコレートアガープレートにプレートし、37℃でオーバ
ーナイトでインキュベートした。細菌のコロニーをアガープレートから滅菌ドラコン(d
racon)スワブを使用して回収し、各々0.25%グルコースを含有する8mlのM
ueller−Hintonブロス(Difco)を含む4本のチューブに中に接種した
。細菌の増殖を30分毎に、OD620を追跡することによりモニターした。細菌を、OD
が0.35〜0.5の値に達するまで増殖させた。培養物を10分間4000rpmで遠
心分離した。上清を捨て、ペレットをブロッキング緩衝液(PBS中1% BSA、0.
4% NaN3)中に再懸濁し、5分間4000rpmで遠心分離した。細胞をOD620が
0.07に達するようにブロッキング緩衝液に再懸濁した。100μlの細菌細胞を、C
oster96ウェルプレートの各ウェルに添加した。100μlの希釈(1:100、
1:200、1:400)血清(ブロッキング緩衝液中)を各ウェルに添加し、そしてそ
のプレートを4℃で2時間インキュベートした。細胞を5分間4000rpmで遠心分離
し、その上清を吸引し、各ウェルに200μl/ウェルのブロッキング緩衝液を添加する
ことにより、細胞を洗浄した。100μlのR−フィコエリトリン結合体化F(ab)2
ヤギ抗マウス(1:100希釈)を各ウェルに添加し、そしてプレートを1時間4℃でイ
ンキュベートした。細胞を、4000rpm5分間の遠心分離によって遠心沈殿し、20
0μl/ウェルのブロッキング緩衝液を添加することにより、洗浄した。その上清を吸引
し、そして細胞を200μl/ウェルのPBS、0.25%のホルムアルデヒドに再懸濁
した。そのサンプルをFACScanチューブに移して、読み取った。FACScan(
Laser Power 15mW)設定の状態は、以下のとおりである:FL2 オン
、FSC−H閾値:92;FSC PMT電圧:E 01;SSC PMT:474;増
幅利得 6.1:FL−2 PMT:586;補償値:0。
細菌を5GCプレート上でオーバーナイトで増殖させ、ループを用いて収穫し、そして
10mlの20mM Tris−HClに再懸濁した。56℃、30分の熱不活化を行い
、そして細菌を10分間氷上で超音波処理することにより破壊した(50% 衝撃係数、
50% 出力)。未破壊細胞を5000g、10分間の遠心分離によって除去し、そして
全細胞エンベロープ画分を50000g、4℃、75分間の遠心分離によって回収した。
細胞質膜タンパク質を粗外膜から抽出するために、全画分を2%サルコシル(Sigma
)中に再懸濁し、そして室温で20分間インキュベートした。この懸濁液を、10000
gで10分間遠心し、凝集物を除去し、そしてこの上清をさらに50000gで75分間
、超遠心分離して、外膜をペレット化した。この外膜を、10mM Tris−HCl(
pH8)に再懸濁し、そしてそのタンパク質濃度をBio−Rad Proteinアッ
セイによって、BSAを標準として測定した。
細菌をGCプレート上でオーバーナイトで増殖させ、ループを用いて収穫し、そして1
mlの20mM Tris−HClに再懸濁した。56℃、30分の熱不活化を行った。
MenB株2996由来の精製タンパク質(500ng/レーン)、外膜ベシクル(5
μg)および全細胞抽出物(25μg)を、12%SDS−PAGE上にロードし、ニト
ロセルロース膜上に転写した。この転写を、2時間、150mA、4℃、転写緩衝液(0
.3% Tris Base、1.44% グリシン、20%(v/v)メタノール)を
使用して行った。この膜を飽和緩衝液(PBS中の10% スキムミルク、0.1% T
riton X100)中での4℃のオーバーナイトのインキュベートにより飽和させた
。この膜を洗浄緩衝液(PBS中の3% スキムミルク、0.1% Triton X1
00)を用いて2回洗浄し、洗浄緩衝液中に1:200に希釈したマウス血清とともに、
2時間37℃でインキュベートした。この膜を2回洗浄し、1:2000希釈の西洋わさ
びペルオキシダーゼ標識化抗マウスIgとともに90分間インキュベートした。この膜を
PBS中の0.1% Triton X100を用いて2回洗浄し、Opti−4CN基
質キット(Bio−Rad)を用いて、発色させた。この反応を水を添加して停止した。
MC58株および2966株をチョコレートアガープレート上で、37℃でオーバーナ
イトで増殖させた。5〜7のコロニーを回収し、そして7mlのMueller−Hin
tonブロスに接種するために使用した。この懸濁液を、旋回装置上で37℃でインキュ
ベートし、OD620が0.5〜0.8の間になるまで増殖させた。この培養物を滅菌1.
5mlエッペンドルフチューブに分取し、微量遠心機中で最大速度で20分間遠心分離し
た。このペレットをGey緩衝液(Gibco)中で1回洗浄し、そして同一の緩衝液中
でOD620が0.5になるように再懸濁し、Gey緩衝液中に1:20000に希釈し、
25℃で保存した。
加した。25μlの希釈(1:100)マウス血清(希釈緩衝液:Gey緩衝液/0.2
% BSA)を各ウェルに添加し、そのプレートを4℃でインキュベートした。上記記載
の細菌懸濁液の25μlを各ウェルに添加した。熱非働化(56℃水浴中に30分)また
は正常乳仔ウサギ補体のいずれかの25μlを各ウェルに添加した。乳仔ウサギ補体の添
加の直後に、1ウェルあたり22μlの各サンプルをMueller−Hintonアガ
ープレート上にプレートした(時間0)。この96ウェルプレートを、1時間37℃で回
転しながらインキュベートし、次に、1ウェルあたり22μlの各サンプルをMuell
er−Hintonアガープレート上にプレートした(時間1)。オーバーナイトのイン
キュベートの後、時間0および時間1に対応するコロニーを計数した。
ORF4遺伝子および919遺伝子は、種々のNeisseria株(株の表を参照の
こと)から抽出された染色体DNA上でPCRによって増幅された。PCRプライマーと
して使用された以下のオリゴヌクレオチドは、遺伝子の上流および下流領域において設計
された。
1サイクル 94℃、2分間
30サイクル 94℃、30秒間
約54℃または約60℃(プライマーのTmに従って)、30秒間
72℃、40秒間
1サイクル 72℃、7分間。
列決定された:
(実施例2〜10のPCRに使用されるオリゴヌクレオチド)
上記の手順を用いて、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、示されるようなORF
をクローニングするために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイにおいて利用した
:
以下のDNAおよびアミノ酸配列は、以下の形式のタイトルによって同定される:[g
、m、またはa][#].[seqまたはpep]。ここで「g」は、N.gonorr
hoeae由来の配列を意味し、「m」は、N.meningitidis B由来の配
列を意味し、そして「a」は、N.meningitidis A由来の配列を意味する
;「#」は、配列番号を意味する;「seq」はDNA配列を意味し、そして「pep」
はアミノ酸配列を意味する。例えば、「g001.seq」は、N.gonorroho
eae DNA配列、番号1をいう。これらの配列への添字「−1」の存在は、同じOR
Fについて見出されたさらなる配列を示し、従って、添字を有さない配列の指定および添
字を有する配列の指定の両方を有するORFについてのデータが、このような指定された
配列の両方に適用する。さらに、オープンリーディングフレームは、ORF#として同定
され、ここで「#」はORFの番号を意味し、これはORFをコードする配列の番号に対
応し、そしてORFの指定は「.ng」または「.a」の添字を付けられ得、このことは
、そのORFがそれぞれ、N.gonorrhoeae配列またはN.meningit
idis A配列に対応することを意味する。配列の前の語「部分的」は、その配列が部
分ORFであるかまたは完全ORFであり得ることを示す。コンピューター分析が、「g
」、「m」、および「a」ペプチド配列の間を理解する比較のために行われた;そしてそ
の中で添字「pep」は、はっきりと言及されていない場合に暗示される。さらに、すぐ
前に先行するテキストと、どの配列が比較されるかの記載との間に矛盾がある場合、そし
て指定された配列が比較された場合、指定された配列は、実際の比較される配列を制御し
、そして実際の比較される配列である。
ORF: コンティーグ:
279 gnm4.seq
以下の部分的DNA配列は、N.meningitidisにおいて同定された(配列
番号3039):
号3041):
ng)と152アミノ酸重複にわたって89.5%の同一性を示す。
番号3043):
以下の部分的DNA配列は、N.meningitidisにおいて同定された(配列
番号3045):
号3047):
g)と200アミノ酸重複にわたって、87.5%の同一性を示す。
番号3049):
かにした(配列番号3051):
53):
055):
番号3057):
号3059):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号3061):
かにした(配列番号3063):
65):
067):
番号3069):
号3071):
ng)と441アミノ酸重複にわたって95.9%の同一性を示す:
番号3073):
98.6%の同一性を示した。
番号3075):
号3077):
g)と366アミノ酸重複にわたって73.5%の同一性を示す:
番号3079):
にした(配列番号3081):
083):
番号3085):
号3087):
g)と475アミノ酸重複にわたって91.7%の同一性を示す:
番号3089):
かにした(配列番号3091):
93):
095):
ノ酸重複において97.8%の同一性を示した。
番号3097):
号3099):
g)と177アミノ酸重複にわたって96.0%の同一性を示す:
番号3101):
9.4%の同一性を示した。
番号3103):
号3105):
て70.1%の同一性を示した。
番号3107):
番号3109):
号3111):
)と320アミノ酸重複にわたって98.8%の同一性を示す:
番号3113):
(ORF 919の発現)
表1中に記載されるORF 919についてのプライマーを使用して、ORF 919
を位置付けそしてクローン化した。推定遺伝子919をpETベクター中にクローン化し
、そしてE.coli中で発現させた。このタンパク質発現および精製産物を、SDS−
PAGEにより分析した。パネルA)は、919−His融合タンパク質精製分析を示す
。マウスを精製された919−Hisで免疫し、そして血清をウェスタンブロット(パネ
ルB)、FACS分析(パネルC)、殺菌アッセイ(パネルD)、およびELISAアッ
セイ(パネルE)に使用した。記号:M1、分子量マーカー;PP、精製タンパク質、T
P、N.meningitidis総タンパク質抽出物;OMV、N.meningit
idis外膜小胞調製物。矢印は、主な組換えタンパク質産物(A)およびN.meni
ngitidis免疫反応性バンド(B)の位置を示す。これらの実験は、919は、表
面露出タンパク質であり、有用な免疫源であることを確かめる。ORF 919の親水性
プロット、抗原性指数、および両親媒性領域を図10に提供する。AMPHIプログラム
を使用して、推定T細胞エピトープを予測する(Gaoら、1989、J.Immuno
l 143:3007;Robertsら、1996、AIDS Res Human
Retroviruses 12:593;Quakyiら、1992、Scand J
Immunol Suppl 11:9)。ORF 919の核酸配列およびそれによ
ってコードされるアミノ酸配列を実施例1に提供する。
(実施例3)
(ORF 279の発現)
表1中に記載されるORF 279についてのプライマーを使用して、ORF 279
を位置付けそしてクローン化した。推定遺伝子279をpGexベクター中にクローン化
し、そしてE.coli中で発現させた。このタンパク質発現および精製産物を、SDS
−PAGEにより分析した。パネルA)は、279−GST精製分析を示す。マウスを精
製された279−GSTで免疫し、そして血清をウェスタンブロット分析(パネルB)、
FACS分析(パネルC)、殺菌アッセイ(パネルD)、およびELISAアッセイ(パ
ネルE)に使用した。記号:M1、分子量マーカー;TP、N.meningitidi
s総タンパク質抽出物;OMV、N.meningitidis外膜小胞調製物。矢印は
、主な組換えタンパク質産物(A)およびN.meningitidis免疫反応性バン
ド(B)の位置を示す。これらの実験は、279は、表面露出タンパク質であり、有用な
免疫源であることを確かめる。ORF 279の親水性プロット、抗原性指数、および両
親媒性領域を図11に提供する。AMPHIプログラムを使用して、推定T細胞エピトー
プを予測する(Gaoら、1989、J.Immunol 143:3007;Robe
rtsら、1996、AIDS Res Human Retroviruses 12
:593;Quakyiら、1992、Scand J Immunol Suppl
11:9)。ORF 279の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を
実施例1に提供する。
(実施例4)
(ORF 576および576−1の発現)
表1中に記載されるORF 576についてのプライマーを使用して、ORF 576
を位置付けそしてクローン化した。推定遺伝子576をpGexベクター中にクローン化
し、そしてE.coli中で発現させた。このタンパク質精製産物を、SDS−PAGE
により分析した。パネルA)は、576−GST融合タンパク質精製分析を示す。マウス
を精製された576−GSTで免疫し、そして血清をウェスタンブロット(パネルB)、
FACS分析(パネルC)、殺菌アッセイ(パネルD)、およびELISAアッセイ(パ
ネルE)に使用した。記号:M1、分子量マーカー;TP、N.meningitidi
s総タンパク質抽出物;OMV、N.meningitidis外膜小胞調製物。矢印は
、主な組換えタンパク質産物(A)およびN.meningitidis免疫反応性バン
ド(B)の位置を示す。これらの実験は、ORF 576は、表面露出タンパク質であり
、有用な免疫源であることを確かめる。ORF 576の親水性プロット、抗原性指数、
および両親媒性領域を図12に提供する。AMPHIプログラムを使用して、推定T細胞
エピトープを予測する(Gaoら、1989、J.Immunol 143:3007;
Robertsら、1996、AIDS Res Human Retroviruse
s 12:593;Quakyiら、1992、Scand J Immunol Su
ppl 11:9)。ORF 576の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ
酸配列を実施例1に提供する。
(実施例5)
(ORF 519および519−1の発現)
表1中に記載されるORF 519についてのプライマーを使用して、ORF 519
を位置付けそしてクローン化した。推定遺伝子519をpETベクター中にクローン化し
、そしてE.coli中で発現させた。このタンパク質精製産物を、SDS−PAGEに
より分析した。パネルA)は、519−His融合タンパク質精製分析を示す。マウスを
精製された519−Hisで免疫し、そして血清をウェスタンブロット(パネルB)、F
ACS分析(パネルC)、殺菌アッセイ(パネルD)、およびELISAアッセイ(パネ
ルE)に使用した。記号:M1、分子量マーカー;TP、N.meningitidis
総タンパク質抽出物;OMV、N.meningitidis外膜小胞調製物。矢印は、
主な組換えタンパク質産物(A)およびN.meningitidis免疫反応性バンド
(B)の位置を示す。これらの実験は、519は、表面露出タンパク質であり、有用な免
疫源であることを確かめる。ORF 519の親水性プロット、抗原性指数、および両親
媒性領域を図13に提供する。AMPHIプログラムを使用して、推定T細胞エピトープ
を予測する(Gaoら、1989、J.Immunol 143:3007;Rober
tsら、1996、AIDS Res Human Retroviruses 12:
593;Quakyiら、1992、Scand J Immunol Suppl 1
1:9)。ORF 519の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を実
施例1に提供する。
(実施例6)
(ORF 121および121−1の発現)
表1中に記載されるORF 121についてのプライマーを使用して、ORF 121
を位置付けそしてクローン化した。推定遺伝子121をpETベクター中にクローン化し
、そしてE.coli中で発現させた。このタンパク質精製産物を、SDS−PAGEに
より分析した。パネルA)は、121−His融合タンパク質精製分析を示す。マウスを
精製された121−Hisで免疫し、そして血清をウェスタンブロット分析(パネルB)
、FACS分析(パネルC)、殺菌アッセイ(パネルD)、およびELISAアッセイ(
パネルE)に使用した。結果は、121が表面露出タンパク質であることを示す。記号:
M1、分子量マーカー;TP、N.meningitidis総タンパク質抽出物;OM
V、N.meningitidis外膜小胞調製物。矢印は、主な組換えタンパク質産物
(A)およびN.meningitidis免疫反応性バンド(B)の位置を示す。これ
らの実験は、121は、表面露出タンパク質であり、有用な免疫源であることを確かめる
。ORF 121の親水性プロット、抗原性指数、および両親媒性領域を図14に提供す
る。AMPHIプログラムを使用して、推定T細胞エピトープを予測する(Gaoら、1
989、J.Immunol 143:3007;Robertsら、1996、AID
S Res Human Retroviruses 12:593;Quakyiら、
1992、Scand J Immunol Suppl 11:9)。ORF 121
の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を実施例1に提供する。
(実施例7)
(ORF 128および128−1の発現)
表1中に記載されるORF 128についてのプライマーを使用して、ORF 128
を位置付けそしてクローン化した。推定遺伝子128をpETベクター中にクローン化し
、そしてE.coli中で発現させた。このタンパク質精製産物を、SDS−PAGEに
より分析した。パネルA)は、128−His精製分析を示す。マウスを精製された12
8−Hisで免疫し、そして血清をウェスタンブロット分析(パネルB)、FACS分析
(パネルC)、殺菌アッセイ(パネルD)、およびELISAアッセイ(パネルE)に使
用した。結果は、128が表面露出タンパク質であることを示す。記号:M1、分子量マ
ーカー;TP、N.meningitidis総タンパク質抽出物;OMV、N.men
ingitidis外膜小胞調製物。矢印は、主な組換えタンパク質産物(A)およびN
.meningitidis免疫反応性バンド(B)の位置を示す。これらの実験は、1
28は、表面露出タンパク質であり、有用な免疫源であることを確かめる。ORF 12
8の親水性プロット、抗原性指数、および両親媒性領域を図15に提供する。AMPHI
プログラムを使用して、推定T細胞エピトープを予測する(Gaoら、1989、J.I
mmunol 143:3007;Robertsら、1996、AIDS Res H
uman Retroviruses 12:593;Quakyiら、1992、Sc
and J Immunol Suppl 11:9)。ORF 128の核酸配列およ
びそれによってコードされるアミノ酸配列を実施例1に提供する。
(実施例8)
(ORF 206の発現)
表1中に記載されるORF 206についてのプライマーを使用して、ORF 206
を位置付けそしてクローン化した。推定遺伝子206をpETベクター中にクローン化し
、そしてE.coli中で発現させた。このタンパク質精製産物を、SDS−PAGEに
より分析した。パネルA)は、206−His精製分析を示す。マウスを精製された20
6−Hisで免疫し、そして血清をウェスタンブロット分析(パネルB)に使用した。髄
膜炎菌由来のタンパク質抽出物における免疫反応性バンドが、17kDaの代わりに38
kDaであることは、価値ある知見である(パネルA)。この抗体染色の性質の情報を得
るために、本発明者らは、His−tagを含まずかつ推定リーダーペプチドを含むE.
coliにおいてORF 206を発現させた。この206タンパク質のネイティブな形
態を発現しているE.coli由来の、総タンパク質抽出物についてのウェスタンブロッ
ト分析は、髄膜炎菌において観察されるように、38kDaの位置に反応性バンドを示し
た。本発明者らは、パネルB)における38kDaバンドは特異的であり、そして抗20
6抗体は多量体タンパク質複合体を認識するようであると結論する。パネルCはFACS
分析を示し、パネルDは殺菌アッセイを示し、そしてパネルEはELISAアッセイを示
す。結果は、206が表面露出タンパク質であることを示す。記号:M1、分子量マーカ
ー;TP、N.meningitidis総タンパク質抽出物;OMV、N.menin
gitidis外膜小胞調製物。矢印は、主な組換えタンパク質産物(A)およびN.m
eningitidis免疫反応性バンド(B)の位置を示す。これらの実験は、206
は、表面露出タンパク質であり、有用な免疫源であることを確かめる。ORF 519の
親水性プロット、抗原性指数、および両親媒性領域を図16に提供する。AMPHIプロ
グラムを使用して、推定T細胞エピトープを予測する(Gaoら、1989、J.Imm
unol 143:3007;Robertsら、1996、AIDS Res Hum
an Retroviruses 12:593;Quakyiら、1992、Scan
d J Immunol Suppl 11:9)。ORF 206の核酸配列およびそ
れによってコードされるアミノ酸配列を実施例1に提供する。
(実施例9)
(ORF 287の発現)
表1中に記載されるORF 287についてのプライマーを使用して、ORF 287
を位置付けそしてクローン化した。推定遺伝子287をpGexベクター中にクローン化
し、そしてE.coli中で発現させた。タンパク質精製産物を、SDS−PAGEによ
り分析した。パネルA)は、287−GST融合タンパク質精製分析を示す。マウスを精
製された287−GSTで免疫し、そして血清をFACS分析(パネルB)、殺菌アッセ
イ(パネルC)、およびELISAアッセイ(パネルD)に使用した。結果は、287が
表面露出タンパク質であることを示す。記号:M1、分子量マーカー。矢印は、主な組換
えタンパク質産物(A)の位置を示す。これらの実験は、287は、表面露出タンパク質
であり、有用な免疫源であることを確かめる。ORF 287の親水性プロット、抗原性
指数、および両親媒性領域を図17に提供する。AMPHIプログラムを使用して、推定
T細胞エピトープを予測する(Gaoら、1989、J.Immunol 143:30
07;Robertsら、1996、AIDS Res Human Retrovir
uses 12:593;Quakyiら、1992、Scand J Immunol
Suppl 11:9)。ORF 287の核酸配列およびそれによってコードされる
アミノ酸配列を実施例1に提供する。
(実施例10)
(ORF 406の発現)
表1中に記載されるORF 406についてのプライマーを使用して、ORF 406
を位置付けそしてクローン化した。推定遺伝子406をpETベクター中にクローン化し
、そしてE.coli中で発現させた。このタンパク質精製産物を、SDS−PAGEに
より分析した。パネルA)は、406−His融合タンパク質精製分析を示す。マウスを
精製された406−Hisで免疫し、そして血清をウェスタンブロット分析(パネルB)
、FACS分析(パネルC)、殺菌アッセイ(パネルD)、およびELISAアッセイ(
パネルE)に使用した。結果は、406が表面露出タンパク質であることを示す。記号:
M1、分子量マーカー;TP、N.meningitidis総タンパク質抽出物;OM
V、N.meningitidis外膜小胞調製物。矢印は、主な組換えタンパク質産物
(A)およびN.meningitidis免疫反応性バンド(B)の位置を示す。これ
らの実験は、406は、表面露出タンパク質であり、有用な免疫源であることを確かめる
。ORF 406の親水性プロット、抗原性指数、および両親媒性領域を図18に提供す
る。AMPHIプログラムを使用して、推定T細胞エピトープを予測する(Gaoら、1
989、J.Immunol 143:3007;Robertsら、1996、AID
S Res Human Retroviruses 12:593;Quakyiら、
1992、Scand J Immunol Suppl 11:9)。ORF 406
の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を実施例1に提供する。
(実施例11)
表2は、異なる株間でのORF 225の配列保存を評価するために使用した、いくつ
かのNeisseria株を列挙する。
て灰色の影は類似した特徴を有するアミノ酸の保存を示す。容易に識別可能である場合、
ORF 225の種々の株間で有意な保存が存在し、このことはさらに、ワクチンおよび
診断の両方のための抗原としての有用性を確認する。
(実施例12)
表3は、異なる株間でのORF 235の配列保存を評価するために使用した、いくつ
かのNeisseria株を列挙する。
て灰色の影は類似した特徴を有するアミノ酸の保存を示す。容易に識別可能である場合、
ORF 235の種々の株間で有意な保存が存在し、このことはさらに、ワクチンおよび
診断の両方のための抗原としての有用性を確認する。
(実施例13)
表4は、異なる株間でのORF 287の配列保存を評価するために使用した、いくつ
かのNeisseria株を列挙する。
て灰色の影は類似した特徴を有するアミノ酸の保存を示す。容易に識別可能である場合、
ORF 287の種々の株間で有意な保存が存在し、このことはさらに、ワクチンおよび
診断の両方のための抗原としての有用性を確認する。
(実施例14)
表5は、異なる株間でのORF 519の配列保存を評価するために使用した、いくつ
かのNeisseria株を列挙する。
て灰色の影は類似した特徴を有するアミノ酸の保存を示す。容易に識別可能である場合、
ORF 519の種々の株間で有意な保存が存在し、このことはさらに、ワクチンおよび
診断の両方のための抗原としての有用性を確認する。
(実施例15)
表6は、異なる株間でのORF 919の配列保存を評価するために使用した、いくつ
かのNeisseria株を列挙する。
て灰色の影は類似した特徴を有するアミノ酸の保存を示す。容易に識別可能である場合、
ORF 919の種々の株間で有意な保存が存在し、このことはさらに、ワクチンおよび
診断の両方のための抗原としての有用性を確認する。
(実施例16)
上記の手順により、以下のオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応(P
CR)アッセイにおいて使用して、示されるようにORFをクローン化した:
表7:完全ORFまたは部分的ORFを増幅するために、PCRに使用されたオリゴヌ
クレオチド
以下の部分的DNA配列は、N.gonorrhoeaeにおいて同定された(配列番
号1):
番号3):
番号5):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF 001は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 001.
ng)と131アミノ酸重複にわたって、89.3%の同一性を示す。
号7):
番号9):
番号11):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF 003は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 003.
ng)と219アミノ酸重複にわたって、88.6%の同一性を示す。
号13):
番号15):
番号17):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF004は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF004.ng)
との258アミノ酸重複にわたって93.4%の同一性を示す:
9):
21):
23):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF005は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF005.ng)
との366アミノ酸重複にわたって77.0%の同一性を示す:
5):
27):
29):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF006は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF006.ng)
との153アミノ酸重複にわたって95.4%の同一性を示す:
1):
33):
35):
7):
39):
41):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF007は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF007.ng)
との113アミノ酸重複にわたって86.7%の同一性を示す:
3):
45):
47):
9):
51):
53):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF008は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF008.ng)
との164アミノ酸重複にわたって92.7%の同一性を示す:
5):
57):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF009は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF009.ng)
との86アミノ酸重複にわたって97.7%の同一性を示す:
59):
1):
63):
65):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF010は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF010.ng)
との231アミノ酸重複にわたって98.7%の同一性を示す:
7):
69):
71):
3):
75):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF011は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF011.ng)
との165アミノ酸重複にわたって95.8%の同一性を示す:
7):
79):
81):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF012は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF012.ng)
との218アミノ酸重複にわたって58.7%の同一性を示す:
83):
85):
7):
89):
91):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF013は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF013.ng)
との101アミノ酸重複にわたって73.3%の同一性を示す:
3):
95):
97):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF015は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF015.ng)
との91アミノ酸重複にわたって94.5%の同一性を示す:
9):
101):
103):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF018は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF018.ng)
との103アミノ酸重複にわたって84.5%の同一性を示す:
05):
107):
109):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF019は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF019.ng)
との89アミノ酸重複にわたって95.5%の同一性を示す:
11):
113):
115):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF023は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF023.ng)
との113アミノ酸重複にわたって97.3%の同一性を示す:
17):
119):
111):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF025は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF025.ng)
との353アミノ酸重複にわたって75.6%の同一性を示す:
13):
115):
117):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF031は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF031.ng)
との85アミノ酸重複にわたって60.0%の同一性を示す:
19):
111):
113):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF032は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF032.ng)
との176アミノ酸重複にわたって86.4%の同一性を示す:
15):
117):
119):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF033は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF033.ng)
との509アミノ酸重複にわたって98.4%の同一性を示す:
21):
123):
125):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF034は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF034.ng)
との257アミノ酸重複にわたって96.5%の同一性を示す:
27):
129):
131):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF036は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF036.ng)
との271アミノ酸重複にわたって74.9%の同一性を示す:
133):
35):
137):
139):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF038は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF038.ng)
との213アミノ酸重複にわたって98.1%の同一性を示す:
41):
143):
145):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF039は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF039.ng)
との171アミノ酸重複にわたって60.8%の同一性を示す:
47):
149):
151):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF040は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF040.ng)
との436アミノ酸重複にわたって88.3%の同一性を示す:
53):
155):
157):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF041は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF041.ng)
との154アミノ酸重複にわたって96.8%の同一性を示す:
59):
161):
163):
65):
167):
169):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF042は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF042.ng)
との201アミノ酸重複にわたって93.0%の同一性を示す:
171):
173):
75):
177):
(N.meningitidis menA由来の推定ORFと、menBとの相同性)
ORF043は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF043.a)と
の128アミノ酸重複にわたって89.8%の同一性を示す:
179):
81):
183):
185):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF044は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF044.ng)
との89アミノ酸重複にわたって86.5%の同一性を示す:
87):
189):
191):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF046は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF046.ng)
との185アミノ酸重複にわたって97.3%の同一性を示す:
93):
195):
197):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF047は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF047.ng)
との312アミノ酸重複にわたって96.2%の同一性を示す:
99):
201):
203):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF048は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF048.ng)
との150アミノ酸重複にわたって96.4%の同一性を示す:
05):
207):
209):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF049は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF049.ng)
との139アミノ酸重複にわたって86.3%の同一性を示す:
11):
213):
215):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF050は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF050.ng)
との127アミノ酸重複にわたって98.4%の同一性を示す:
17):
219):
221):
23):
225):
227):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF052は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF052.ng)
との119アミノ酸重複にわたって95.8%の同一性を示す:
29):
231):
233):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF073は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF073.ng)
との131アミノ酸重複にわたって87.0%の同一性を示す:
35):
237):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF075は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF075.ng)
との137アミノ酸重複にわたって65.7%の同一性を示す:
239):
41):
243):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF080は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF080.ng)
との242アミノ酸重複にわたって97.9%の同一性を示す:
245):
47):
249):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF081は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF081.ng)
との455アミノ酸重複にわたって94.1%の同一性を示す:
251):
号253):
番号255):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF082は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF082.ng)
と247アミノ酸重複にわたって92.7%の同一性を示す:
番号257):
号259):
番号261):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF084は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF084.ng)
と231アミノ酸重複にわたって90.5%の同一性を示す:
番号263):
号265):
番号267):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF085は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF085.ng)
と94アミノ酸重複にわたって94.7%の同一性を示す:
番号269):
号271):
番号273):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF086は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF086.ng)
と396アミノ酸重複にわたって96.7%の同一性を示す:
番号275):
号277):
番号279):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF087は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF087.ng)
と355アミノ酸重複にわたって83.9%の同一性を示す:
番号281):
号283):
番号285):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF088は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF0888.ng
)と205アミノ酸重複にわたって91.7%の同一性を示す:
番号287):
号289):
番号291):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF089は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF089.ng)
と149アミノ酸重複にわたって88.6%の同一性を示す:
番号293):
号295):
番号297):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF090は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF090.ng)
と118アミノ酸重複にわたって83.9%の同一性を示す:
番号299):
番号2):
号303):
番号305):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF091は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF091.ng)
と101アミノ酸重複にわたって84.2%の同一性を示す:
番号307):
号309):
番号311):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF092は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF092.ng)
と506アミノ酸重複にわたって96.6%の同一性を示す:
番号313):
号315):
番号317):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF093は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF093.ng)
と276アミノ酸重複にわたって96.7%の同一性を示す:
番号319):
号321):
番号323):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF094は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF094.ng)
と103アミノ酸重複にわたって95.1%の同一性を示す:
番号325):
号327):
番号329):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF095は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF095.ng)
と124アミノ酸重複にわたって97.6%の同一性を示す:
番号331):
号333):
番号335):
番号337):
号339):
番号341):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF097は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF097.ng)
と436アミノ酸重複にわたって96.3%の同一性を示す:
番号343):
号345):
番号347):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF098は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF098.ng)
と125アミノ酸重複にわたって89.6%の同一性を示す:
番号349):
号351):
番号353):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF099は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF099.ng)
と639アミノ酸重複にわたって96.2%の同一性を示す:
番号355):
号357):
番号359):
番号361):
号363):
番号365):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF0105は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF105.ng
)と289アミノ酸重複にわたって79.9%の同一性を示す:
番号367):
号369):
番号371):
番号373):
号375):
番号377):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF107は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF107.ng)
と170アミノ酸重複にわたって89.4%の同一性を示す:
番号379):
号381):
番号383):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF108は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF108.ng)
と173アミノ酸重複にわたって89.6%の同一性を示す:
番号385):
号387):
番号389):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF109は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF109.ng)
と126アミノ酸重複にわたって92.9%の同一性を示す:
番号391):
号393):
番号395):
と97アミノ酸重複にわたって88.7%の同一性を示す:
番号397):
号399):
番号401):
番号403):
号405):
番号407):
号409):
号411):
番号413):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF117は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF117.ng)
と490アミノ酸重複にわたって97.6%の同一性を示す:
番号415):
号417):
番号419):
番号421):
号423):
番号425):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF118は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF118.ng)
と125アミノ酸重複にわたって92.8%の同一性を示す:
番号427):
号429):
番号431):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF120は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF120.ng)
と223アミノ酸重複にわたって97.3%の同一性を示す:
番号433):
号435):
番号437):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF121は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF121.ng)
と336アミノ酸重複にわたって73.5%の同一性を示す:
番号439):
番号441):
番号443):
号445):
番号447):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF122は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF122.ng)
と246アミノ酸重複にわたって47.2%の同一性を示す:
番号449):
号451):
番号453):
番号455):
号457):
以下の部分的なDNA配列は、N.meningitidisにおいて同定された(配列
番号459):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF125は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF125.ng)
と343アミノ酸重複にわたって92.1%の同一性を示す:
番号461):
号463):
番号465):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF126は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF126.ng)
と269アミノ酸重複にわたって95.9%の同一性を示す:
番号467):
号469):
番号471):
番号473):
号475):
番号477):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF127は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF127.ng)
と290アミノ酸重複にわたって97.9%の同一性を示す:
番号479):
号481):
番号483):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF128は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF128.ng)と
475アミノ酸の重複にわたって91.7%の同一性を示す:
番号485):
号487):
:
番号489):
番号491):
号493):
番号495):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF129は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF129.ng
)と110アミノ酸の重複にわたって79.1%の同一性を示す:
番号497):
号499):
番号501):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF130は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF130.ng
)と206アミノ酸の重複にわたって98.1%の同一性を示す:
番号503):
号505):
番号507):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF132は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF132.ng
)と38アミノ酸の重複にわたって89.5%の同一性を示す:
番号509):
号511):
番号513):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF134は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF134.ng
)と531アミノ酸の重複にわたって98.7%の同一性を示す:
番号515):
号517):
番号519):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF135は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF135.ng
)と294アミノ酸の重複にわたって97.6%の同一性を示す:
番号521):
号523):
番号525):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF136は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF136.ng
)と209アミノ酸の重複にわたって85.6%の同一性を示す:
番号527):
号529):
番号531):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF137は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF137.ng
)と283アミノ酸の重複にわたって95.4%の同一性を示す:
番号533):
号535):
番号537):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF138は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF138.ng
)と298アミノ酸の重複にわたって98.0%の同一性を示す:
番号539):
号541):
番号543):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF138は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF138.ng
)と179アミノ酸の重複にわたって92.2%の同一性を示す:
番号545):
号547):
番号549):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF140は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF140.ng
)と454アミノ酸の重複にわたって94.5%の同一性を示す:
番号551):
号553):
番号555):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF141は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF141.ng
)と558アミノ酸の重複にわたって97.5%の同一性を示す:
番号557):
号559):
番号561):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF142は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF142.ng
)と158アミノ酸の重複にわたって93.7%の同一性を示す:
番号563):
号565):
番号567):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号569):
号571):
番号573):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号575):
号577):
番号579):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号581):
号583):
番号585):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号587):
号589):
番号591):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号593):
号595):
番号597):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF149は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF149.ng
)と339アミノ酸の重複にわたって95.9%の同一性を示す:
番号599):
号601):
:
番号603):
番号605):
号607):
番号609):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF150は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF150.ng
)と369アミノ酸の重複にわたって91.3%の同一性を示す:
番号611):
号613):
番号615):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF151は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF151.ng
)と603アミノ酸の重複にわたって99.2%の同一性を示す:
番号617):
号619):
番号621):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF152は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF152.ng
)と218アミノ酸の重複にわたって95.4%の同一性を示す:
番号623):
号625):
番号627):
番号629):
号631):
番号633):
番号635):
号637):
番号639):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF155は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF155.ng
)と513アミノ酸の重複にわたって97.9%の同一性を示す:
番号641):
号643):
番号645):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号647):
号649):
番号651):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号653):
号655):
番号657):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号659):
号661):
番号663):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号665):
号667):
番号669):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
番号671):
号673):
675):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
号677):
679):
681):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORF)
m164/gp164
432アミノ酸重複中で98.6%の同一性
号683):
685):
号687):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
号689):
691):
る:
693):
号695):
:
97):
号699):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFと相同性)
ORF204は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 204.ng
)と250アミノ酸にわたって82.0%の同一性を示す:
号701):
03):
号705):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF205は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 205.ng
)と181アミノ酸にわたって88.4%の同一性を示す:
号707):
709):
る:
711):
号713):
:
15):
号717):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF206は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 206.ng
)と177アミノ酸にわたって96.0%の同一性を示す:
号719):
21):
号723):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF209は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 209.ng
)と253アミノ酸にわたって88.5%の同一性を示す:
号725):
727):
729):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF211は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 211.ng
)と174アミノ酸にわたって89.1%の同一性を示す:
号731):
33):
号735):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF212は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 212.ng
)と421アミノ酸にわたって92.9%の同一性を示す:
号737):
739):
741):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)ORF214は、N.go
norrhoeae由来の推定ORF(ORF214.ng)と152アミノ酸にわたっ
て80.3%の同一性を示す:
号743):
745):
る:
号747):
号749):
:
51):
753):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF215は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF215.ng)
と173アミノ酸にわたって96.0%の同一性を示す:
号755):
757):
759):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF216は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF216.ng)
と147アミノ酸にわたって91.8%の同一性を示す:
号761):
763):
号765):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF217は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF217.ng)
と226アミノ酸重複にわたって80.5%の同一性を示す:
号767):
69):
号771):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF218は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF218.ng)
と218アミノ酸にわたって87.2%の同一性を示す:
773):
775):
号777):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFと相同性)
ORF219は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 219.ng
)と213アミノ酸にわたって86.9%の同一性を示す:
号779):
81):
号783):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF221は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 221.ng
)と170アミノ酸にわたって87.6%の同一性を示す:
号785):
787):
789):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF223は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF223.ng)
と119アミノ酸にわたって80.7%の同一性を示す:
号791):
93):
号795):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF225は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 22.5.n
g)と248アミノ酸重複にわたって83.5%の同一性を示す:
号797):
99):
る:
号801):
号803):
:
805):
号807):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF226は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 226.ng
)と121アミノ酸重複にわたって94.2%の同一性を示す:
号809):
11):
号813):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF227は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 227.ng
)と66アミノ酸にわたって95.5%の同一性を示す:
号815):
号817):
以下の部分的なDNA配列は、N.meningitidis中で同定された(配列番
号819):
821):
号823):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF229は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF229.ng)
と169アミノ酸にわたって80.5%の同一性を示す:
号825):
827):
号829):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF221は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 230.ng
)と386アミノ酸にわたって95.9%の同一性を示す:
号831):
833):
る:
835):
号837):
:
39):
号841):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF231は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 231.ng
)と73アミノ酸重複にわたって98.6%の同一性を示す:
号843):
45):
る:
号847):
号849):
:
851):
号853):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF232は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 232.ng
)と290アミノ酸重複にわたって94.1%の同一性を示す:
号855):
57):
号859):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF233は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 233.ng
)と152アミノ酸にわたって93.4%の同一性を示す:
号861):
863):
号865):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF234は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF234.ng)
と54アミノ酸にわたって94.4%の同一性を示す:
867):
号869):
号871)
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFと相同性)
ORF235は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 235.ng
)と215アミノ酸にわたって96.7%の同一性を示す:
873):
875):
号877):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF236は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF236.ng)
と258アミノ酸にわたって82.9%の同一性を示す:
号879):
81):
号883):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF237は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 237.ng
)と382アミノ酸重複にわたって86.1%の同一性を示す:
号885):
87):
号889):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF238は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 238.ng
)と401アミノ酸重複にわたって86.0%の同一性を示す:
号891):
93):
号895):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF239は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 239.ng
)と255アミノ酸にわたって93.7%の同一性を示す:
号897):
899):
号901):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF240は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF240.ng)
と220アミノ酸にわたって94.5%の同一性を示す:
号903):
905):
号907):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF241は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 241.ng
)と177アミノ酸にわたって91.5%の同一性を示す:
号909):
911):
る:
913):
号915):
:
17):
号919):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF242は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF 242.ng
)と289アミノ酸重複にわたって90.3%の同一性を示す:
921):
23):
925):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF243は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF243.ng
)との110アミノ酸にわたる重複において92.7%の同一性を示す:
927):
29):
931):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF244は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF244.ng
)との277アミノ酸にわたる重複において86.3%の同一性を示す:
933):
35):
:
937):
939):
41):
943):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF246は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF246.ng
)との150アミノ酸にわたる重複において80.0%の同一性を示す:
945):
47):
949):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF247は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF247.ng
)との238アミノ酸にわたる重複において69.3%の同一性を示す:
951):
53):
:
955):
957):
59):
961):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF248は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF248.ng
)との185アミノ酸にわたる重複において81.1%の同一性を示す:
963):
965):
67):
969):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF249は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF249.ng
)との203アミノ酸にわたる重複において81.3%の同一性を示す:
971):
973):
75):
977):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF250は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF250.ng
)との111アミノ酸にわたる重複において91.0%の同一性を示す:
979):
81):
983):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF251は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF251.ng
)との243アミノ酸にわたる重複において85.2%の同一性を示す:
985):
87):
989):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF253は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF253.ng
)との397アミノ酸にわたる重複において94.7%の同一性を示す:
991):
93):
995):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF254は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF254.ng
)との167アミノ酸にわたる重複において97.6%の同一性を示す:
997):
99):
1001):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF255は、由来の推定ORF(ORF255.ng)との188アミノ酸にわた
る重複において88.8%の同一性を示す:
1003):
005):
1007):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF256は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF256.n
g)と239のアミノ酸にわたる重複において92.9%の同一性を示す:
1009):
011):
る:
1013):
1015):
:
017):
1019):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF257は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF257.ng
)と125のアミノ酸にわたる重複において88.0%の同一性を示す:
1021):
023):
1025):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF258は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF258.ng
)と386のアミノ酸にわたる重複において90.9%の同一性を示す:
1027):
029):
1031):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF259は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF259.ng
)と212のアミノ酸にわたる重複において94.3%の同一性を示す:
1033):
035):
る:
1037):
1039):
:
041):
1043):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF260は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF260.ng
)と171のアミノ酸にわたる重複において89.5%の同一性を示す:
1045):
047):
1049):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF261は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF261.ng
)と237のアミノ酸にわたる重複において79.7%の同一性を示す:
1051):
053):
1055):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF263は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF263.ng
)と77のアミノ酸にわたる重複において85.7%の同一性を示す:
1057):
059):
1061):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF264は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF264.ng
)と239のアミノ酸にわたる重複において91.6%の同一性を示す:
1063):
1065):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF265は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF265.ng
)と123のアミノ酸にわたる重複において88.6%の同一性を示す:
1067):
069):
1071):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF266は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF266.ng
)と114のアミノ酸にわたる重複において92.1%の同一性を示す:
1073):
075):
1077):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF267は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF267.ng
)と127のアミノ酸にわたる重複において82.7%の同一性を示す:
1079):
081):
1083):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF268は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF268.ng
)と150のアミノ酸にわたる重複において86.0%の同一性を示す:
1085):
1087):
1089):
:
091):
1093):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF269は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF269.ng
)と121のアミノ酸にわたる重複において87.6%の同一性を示す:
1095):
097):
1099):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF270は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF270.ng
)と140のアミノ酸にわたる重複において96.4%の同一性を示す:
1101):
103):
1105):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF271は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF271.ng
)と189のアミノ酸にわたる重複において95.2%の同一性を示す:
1107):
109):
1111):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF272は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF272.ng
)と370のアミノ酸にわたる重複において97.6%の同一性を示す:
1113):
115):
1117):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF273は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF273.ng
)と171のアミノ酸にわたる重複において86.0%の同一性を示す:
1119):
121):
1123):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF274は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF274.ng
)と163のアミノ酸にわたる重複において97.5%の同一性を示す:
1125):
127):
1129):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF276は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF276.ng
)と278のアミノ酸にわたる重複において96.8%の同一性を示す:
1131):
133):
1135):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF277は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF277.ng
)と221のアミノ酸にわたる重複において90.0%の同一性を示す:
1137):
139):
1141):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF278は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF278.ng
)と170のアミノ酸にわたる重複において95.9%の同一性を示す:
1143):
145):
1147):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF279は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF279.n
g)と152のアミノ酸にわたる重複において89.5%の同一性を示す:
1149):
ORF279についての表1に記載されるプライマーを使用して、そしてORF279
を位置付けしクローニングした。ORF279を、上記のように、pETベクターおよび
pGexベクターにクローニングし、そしてE.coliにおける発現させた。タンパク
質発現産物および精製物を、SDS−PAGEにより分析した。図2Aは、アフィニティ
ー精製の結果を示し、そして図2Bは、E.coliにおける発現を示す。精製したHi
s融合タンパク質を使用して、マウスを免疫化し、その血清をELISA(陽性結果)、
FACS分析(図2C)、ウエスタンブロット(図2D)のために使用した。これらの実
験は、ORF279が、表面露出タンパク質であり、有用な免疫原であることを確証する
。ORF279の親水性プロット、抗原インデックス、および両親媒性領域を図6に提供
する。推定T細胞エピトープを推測するために、AMPHIプログラムを使用する(Ga
oら、1989、J.Immunol 143:3007;Robertsら、1996
,AIDS Res Human Retrovirues 12:593;Quaky
iら、1992,Scand J Immunol Suppl 11:9)。ORF2
79の核酸配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、本明細書中に提供する。
以下の部分的DNA配列は、N.gonorrhoeae中で同定された(配列番号1
151):
1153):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF280は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF280.ng
)と308のアミノ酸にわたる重複において93.8%の同一性を示す:
1155):
157):
1159):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF281は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF281.ng
)と263のアミノ酸にわたる重複において93.5%の同一性を示す:
1161):
163):
1165):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF282は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF282.ng
)と217のアミノ酸にわたる重複において98.6%の同一性を示す:
1167):
169):
1171):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
1173):
175):
1177):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
1179):
181):
1183):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
1185):
187):
1189):
1191):
193):
1195):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
1197):
199):
1201):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
1203):
205):
)に対応する:
1207):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
1209):
211):
1213):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
1215):
217):
1219):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
1221):
223):
1225):
1227):
229):
1231):
1233):
235):
1237):
1239):
241):
1243):
1245):
247):
1249):
1251):
253):
1255):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF302は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF302.ng
)との533アミノ酸の重複にわたって、94.0%の同一性を示す:
1257):
259):
1261):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF305は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF305.ng
)との243アミノ酸の重複にわたって、96.7%の同一性を示す:
1263):
265):
1267):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF306は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF306.ng
)との253アミノ酸の重複にわたって、88.9%の同一性を示す:
1269):
271):
1273):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF307は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF307.ng
)との38アミノ酸の重複にわたって、97.4%の同一性を示す:
1275):
277):
1279):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF308は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF308.ng
)との231アミノ酸の重複にわたって、96.5%の同一性を示す:
1281):
283):
1285):
1287):
289):
1291):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF311は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF311.ng
)との455アミノ酸の重複にわたって、78.5%の同一性を示す:
1293):
295):
1297):
1299):
301):
1303):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF312は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF312.ng
)との451アミノ酸の重複にわたって、95.6%の同一性を示す:
1305):
307):
1309):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF313は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF313.ng
)との173アミノ酸の重複にわたって、90.2%の同一性を示す:
1311):
313):
1315):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF401は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF401.ng
)との203アミノ酸の重複にわたって、100.0%の同一性を示す:
1317):
319):
1321):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF402は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF402.ng
)との497アミノ酸の重複にわたって、97.0%の同一性を示す:
1323):
325):
1327):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF406は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF406.a)
との320アミノ酸の重複にわたって、98.8%の同一性を示す:
1329):
331):
1333):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF501は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF501.ng
)との558アミノ酸の重複にわたって、86.2%の同一性を示す:
1335):
337):
1339):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF502は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF502.ng
)との168アミノ酸の重複にわたって、95.8%の同一性を示す:
1341):
343):
1345):
1347):
349):
1351):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF503は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF503.ng
)との68アミノ酸の重複にわたって、91.2%の同一性を示す:
号1353:
355):
1357):
1359):
361):
1363):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF504は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF504.ng
)との425アミノ酸の重複にわたって、96.7%の同一性を示す:
1365):
367):
1369):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF505は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF505.ng
)との287アミノ酸の重複にわたって、93.7%の同一性を示す:
1371):
1373):
375):
1377):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF506は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF506.ng
)との520アミノ酸の重複にわたって、89.2%の同一性を示す:
1379):
381>:
1383>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 507は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 50
7.ng)との185アミノ酸重複に対して87.0%同一性を示す:
1385>:
387>:
1389>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 508は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 50
8.ng)との167アミノ酸重複に対して86.8%同一性を示す:
1391>:
393>:
1395>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 509は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 50
9.ng)との575アミノ酸重複に対して87.8%同一性を示す:
1397>:
399>:
1401>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 510は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 51
0.ng)との132アミノ酸重複に対して96.2%同一性を示す:
1403>:
405>:
1407>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 512は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 51
2.ng)との122アミノ酸重複に対して93.4%同一性を示す:
1409>:
411>:
1413>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 513は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 51
3)との191アミノ酸重複に対して99.5%同一性を示す:
1415>:
417>:
1419>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 515は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 51
5.ng)との304アミノ酸重複に対して85.9%同一性を示す:
1421>:
423>:
:
1425>:
1427>:
429>:
1431>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 516は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 51
6.ng)との231アミノ酸重複に対して90.0%同一性を示す:
1433>:
435>:
1437>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 517は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 50
8.ng)との164アミノ酸重複に対して92.7%同一性を示す:
1439>:
441>:
1443>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 518は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 51
8.ng)との135アミノ酸重複に対して74.1%同一性を示す:
1445>:
447>:
1449>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 519は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 51
9.ng)との200アミノ酸重複に対して87.5%同一性を示す:
1451>:
453>:
:
1455>:
1457>:
表1に記載されるORF519についてのプライマーを使用して、ORF 519を位
置決定およびクローニングした。ORF 519を、上記のようにpETベクターおよび
pGexベクターにクローニングし、そしてE.coli中で発現させた。タンパク質発
現産物および精製物を、SDS−PAGEにより分析した。図4Aは、アフィニティー精
製の結果を示し、そして図4Bは、E.coliにおける発現を示す。精製したNis融
合タンパク質を使用してマウスを免疫し、その血清をELISA(陽性の結果)、FAC
S分析(図4C)、ウェスタンブロット(図1E)、および殺菌アッセイ(図4D)に使
用した。これらの実験により、519が表面に露出されたタンパク質であること、および
これが有用な免疫原であることが確認される。ORF 519の親水性プロット、抗原性
指標、および両親媒性領域を、図8に提供する。AMPHIプログラムを使用して、推定
T細胞エピトープを推測する(Gaoら、1989、J.Immunol 143:30
07;Robertsら、1996、AIDS Res Human Retrovir
us 12:593;Quakyiら、1992、Scand J Immunol S
uppl 11:9)。ORF 519核酸配列およびこれによりコードされるアミノ酸
配列は、本明細書中に提供されるものである。
以下の部分DNA配列は、N.gonorrhoeaeにおいて同定された<配列番号
1459>:
1461>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 520は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 52
0.ng)との197アミノ酸重複に対して87.3%同一性を示す:
1463>:
465>:
:
1467>:
1469>:
471>:
1473>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 521は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 52
1.ng)との171アミノ酸重複に対して90.6%同一性を示す:
1475>:
477>:
1479>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 522は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 52
2.ng)との144アミノ酸重複に対して91.0%同一性を示す:
1481>:
483>:
1485>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 523は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 52
3.ng)との126アミノ酸重複に対して91.3%同一性を示す:
1487>:
489>:
1491>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 525は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 52
5.ng)との186アミノ酸重複に対して94.1%同一性を示す:
1493>:
495>:
:
1497>:
:
1499>:
501>:
1503>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 527は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 52
7.ng)との150アミノ酸重複に対して90.0%同一性を示す:
1505>:
507>:
1509>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 528は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 52
8.ng)との121アミノ酸重複に対して89.3%同一性を示す:
1511>:
513>:
:
1515>:
1517>:
1519>:
1521>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 529は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 52
9.ng)との115アミノ酸重複に対して83.5%同一性を示す:
1523>:
525>:
1527>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 530は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 53
0.ng)との98アミノ酸重複に対して88.8%同一性を示す:
1529>:
531>:
1533>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 531は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 53
1.ng)との162アミノ酸重複に対して94.4%同一性を示す:
1535>:
537>:
1539>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 532は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 53
2.ng)との93アミノ酸重複に対して91.4%同一性を示す:
1541>:
543>:
1545>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 535は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 53
5.ng)との262アミノ酸重複に対して80.9%同一性を示す:
1547>:
549>:
1551>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 537は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 53
7.ng)との164アミノ酸重複に対して95.7%同一性を示す:
1553>:
555>:
1557>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 538は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 53
8.ng)との392アミノ酸重複に対して92.1%同一性を示す:
1559>:
561>:
1563>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 539は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 53
9.ng)との345アミノ酸重複に対して89%同一性を示す:
1565>:
567>:
1569>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 540は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 54
0.ng)との112アミノ酸重複に対して85.7%同一性を示す:
1571>:
573>:
1575>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 542は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 54
2.ng)との111アミノ酸重複に対して93.7%同一性を示す:
1577>:
579>:
1581>:
ORF 543は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 54
3.ng)との379アミノ酸重複に対して84.2%同一性を示す:
1583>:
585>:
1587>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 544は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 54
4.ng)との162アミノ酸重複に対して90.7%同一性を示す:
1589>:
591>:
1593>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 547は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 54
7.ng)との142アミノ酸重複に対して97.2%同一性を示す:
1595>:
597>:
1599>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 548は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 54
8.ng)との217アミノ酸重複に対して95.9%同一性を示す:
1601>:
603>:
1605>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 550は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 55
0.ng)とのアミノ酸重複に対して%同一性を示す:
1607>:
609>:
1611>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 552は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 55
2.ng)との174アミノ酸重複に対して97.1%同一性を示す:
1613>:
1615>:
1617>:
619>:
1621>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 553は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 55
3.ng)との185アミノ酸重複に対して65.5%同一性を示す:
1623>:
625>:
1627>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 554は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 55
4.ng)との389アミノ酸重複に対して96.1%同一性を示す:
1629>:
631>:
1633>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 556は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 55
6.ng)との139アミノ酸重複に対して100.0%同一性を示す:
1635>:
637>:
1639>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 557は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 55
7.ng)との159アミノ酸重複に対して94.3%同一性を示す:
1641>:
643>:
1645>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 558は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 55
8.ng)との106アミノ酸重複に対して92.5%同一性を示す:
1647>:
649>:
1651>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
ORF 560は、N.gonorrhoeae由来の予想されるORF(ORF 56
0.ng)との246アミノ酸重複に対して97.2%同一性を示す:
1653>:
1655>:
(N.gonorrhoeae由来の予想されるORFとの相同性)
1657>:
1659):
号1661):
(N.gonorrhoeaeからの推定ORFとの相同性)
号1663):
1665):
号1667):
(N.gonorrhoeaeからの推定ORFとの相同性)
ORF563は、N.gonorrhoeaeからの推定ORF(ORF563.ng
)との2316aa重複部分にわたって79.1%の相同性を示す。
号1669):
(fhaとの相同性)
1671):
号1673):
(N.gonorrhoeaeからの推定ORFとの相同性)
号1675):
1677):
号1679):
(N.gonorrhoeaeからの推定ORFとの相同性)
号1681):
1683):
号1685):
(N.gonorrhoeaeからの推定ORFとの相同性)
号1687):
1689):
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
ORF576についての表1に記載されるプライマーを使用して、ORF576を位置
付けし、そしてクローニングした。ORF576を、上記のように、pETベクターおよ
びpGexベクターにクローニングし、そしてE.coliにおいて発現させた。タンパ
ク質発現産物および精製物を、SDS−PAGEにより分析した。図3Aは、アフィニテ
ィー精製の結果を示し、そして図3Bは、E.coliにおける発現を示す。精製したH
is融合タンパク質を使用して、マウスを免疫化し、その血清をELISA(陽性結果)
、FACS分析(図3C)、ウエスタンブロット(図3D)のために使用した。これらの
実験は、ORF576が、表面露出タンパク質であり、有用な免疫原であることを確証す
る。ORF576の親水性プロット、抗原インデックス、および両親媒性領域を図7に提
供する。推定T細胞エピトープを推測するために、AMPHIプログラムを使用する(G
aoら、1989、J.Immunol 143:3007;Robertsら、199
6,AIDS Res Human Retrovirues 12:593;Quak
yiら、1992,Scand J Immunol Suppl 11:9)。ORF
576の核酸配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、実施例1に提供する。
以下の部分DNA配列を、N.gonorrhoeae(配列番号1749)において
同定した:
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
同定した:
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
同定した:
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
同定した:
て同定した:
て同定した:
同定した:
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
同定した:
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
同定した:
て同定した:
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
て同定した:
1871):
:
号1873):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
号1875):
1877):
号1879):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF597は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF597)との
389アミノ酸にわたる重複で96.1%の同一性を示す:
号1881):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF597は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF597)と
の389アミノ酸にわたる重複で98.5%の同一性を示す:
1883):
号1885):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF601は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF601.ng
)との205アミノ酸にわたる重複で94.1%の同一性を示す:
号1887):
1889):
号1891):
号1893):
1895):
号1897):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF603は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF603.ng
)との450アミノ酸にわたる重複で91.6%の同一性を示す:
号1899):
1901):
号1903):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF604は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF604.ng
)との169アミノ酸にわたる重複で83.4%の同一性を示す:
号1905):
1907):
号1909):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF605は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF605.ng
)との513アミノ酸にわたる重複で97.9%の同一性を示す:
号1911):
1913):
号1915):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF606は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF606.ng
)との225アミノ酸にわたる重複で100.0%の同一性を示す:
号1917):
1919):
号1921):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF607は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF607.ng
)との459アミノ酸にわたる重複で94.8%の同一性を示す:
号1923):
1925):
号1927):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF608は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF608.ng
)との188アミノ酸にわたる重複で95.2%の同一性を示す:
号1929):
1931):
号1933):
号1935):
1937):
号1939):
号1941):
1943):
号1945):
号1947):
1949):
号1951):
号1953):
1955):
号1957):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
号1959):
1961):
号1963):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
号1965):
1967):
号1969):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
号1971):
1973):
号1975):
号1977):
1979):
号1981):
号1983):
1985):
号1987):
号1989):
1991):
号1993):
号1995):
1997):
号1999):
号2001):
号2003):
2004):
号2006):
2009):
号2011):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
号2013):
2015):
号2017):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
号2019):
2021):
号2023):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
号2025):
2027):
号2029):
号2031):
2033):
号2035):
号2037):
2039):
号2041):
号2043):
2045):
る:
号2047):
号2049):
:
2051):
号2053):
号2055):
2057):
号2059):
号2061):
2063):
号2065):
(N.meningitidis menAとmenB由来の推定ORFとの相同性)
ORF643は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF643.a)
との136アミノ酸にわたる重複で94.9%の同一性を示す:
号2067):
2069):
号2071):
号2073):
2075):
号2077):
号2079):
2081):
号2083):
号2085):
2087):
号2089):
号2091):
2093):
号2095):
号2097):
2099):
号2101):
号2103):
2105):
号2107):
号2109):
2111):
る:
号2113):
号2115):
:
号2117):
:
番号2119):
番号2121):
号2123):
:
番号2125):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2127):
号2129):
:
番号2131):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2133):
号2135):
:
番号2137):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2139):
号2141):
:
列番号2143):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2145):
号2147):
:
番号2149):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2151):
号2153):
:
番号2155):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2157):
号2159):
:
番号2161):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2163):
号2165):
g):
番号2167):
番号2169):
):
号2171):
:
番号2173):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2175):
号2177):
:
番号2179):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2181):
号2183):
:
番号2185):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2187):
号2189):
:
番号2191):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2193):
号2195):
:
番号2197):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2199):
号2201):
:
番号2203):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2205):
号2207):
:
番号2209):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2211):
号2213):
:
番号2215):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2217):
号2219):
:
番号2221):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2223):
号2225):
:
番号2227):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2229):
号2231):
:
番号2233):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2235):
号2237):
:
番号2239):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
番号2241):
号2243):
番号2245):
N.meningitidis menA由来の推定ORFと、N.meningit
idis menB由来の推定ORFとの相同性
ORF681は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF681.a)
と、261アミノ酸の重複にわたって94.6%の同一性を示す。
番号2247):
号2249):
番号2251):
N.meningitidis menA由来の推定ORFと、N.meningit
idis menB由来の推定ORFとの相同性
ORF682は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF682.a)
と、134アミノ酸の重複にわたって88.1%の同一性を示す。
番号2253):
号2255):
番号2257):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF683は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF683)と、
146アミノ酸の重複にわたって99.3%の同一性を示す。
番号2259):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF683は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF683)と
、146アミノ酸の重複にわたって97.9%の同一性を示す。
号2261):
番号2263):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF684は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF684)と、
172アミノ酸の重複にわたって97.7%の同一性を示す。
番号2265):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF684は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF684)と
、172アミノ酸の重複にわたって99.4%の同一性を示す。
号2267):
番号2269):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF685は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF685)と、
356アミノ酸の重複にわたって94.4%の同一性を示す。
番号2271):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF685は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF685)と
、355アミノ酸の重複にわたって98.9%の同一性を示す。
号2273):
番号2275):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF686は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF686)と、
131アミノ酸の重複にわたって95.4%の同一性を示す。
番号2277):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF686は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF686)と
、131アミノ酸の重複にわたって96.2%の同一性を示す。
号2279):
番号2281):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF687は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF687)と、
234アミノ酸の重複にわたって97.0%の同一性を示す。
番号2283):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF687は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF687)と
、232アミノ酸の重複にわたって98.7%の同一性を示す。
号2285):
番号2287):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF688は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF688)と、
138アミノ酸の重複にわたって90.6%の同一性を示す。
番号2289):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF688は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF688)と
、138アミノ酸の重複にわたって93.5%の同一性を示す。
号2291):
番号2293):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF689は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF689)と、
408アミノ酸の重複にわたって88.0%の同一性を示す。
番号2295):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF689は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF689)と
、459アミノ酸の重複にわたって99.1%の同一性を示す。
号2297):
番号2299):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF690は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF690)と、
408アミノ酸の重複にわたって89.3%の同一性を示す。
番号2301):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF690は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF690)と
、280アミノ酸の重複にわたって93.9%の同一性を示す。
号2303):
番号2305):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF691は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF691)と、
144アミノ酸の重複にわたって97.2%の同一性を示す。
番号2307):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF691は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF691)と
、144アミノ酸の重複にわたって97.2%の同一性を示す。
号2309):
番号2311):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF692は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF692)と、
338アミノ酸の重複にわたって91.1%の同一性を示す。
番号2313):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF692は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF692)と
、336アミノ酸の重複にわたって98.8%の同一性を示す。
号2315):
番号2317):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF694は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF694)と、
372アミノ酸の重複にわたって86.8%の同一性を示す。
番号2319):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF694は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF694)と
、385アミノ酸の重複にわたって100%の同一性を示す。
号2321):
番号2323):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF694は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF695)と、
305アミノ酸の重複にわたって90.8%の同一性を示す。
番号2325):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF695は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF695)と
、308アミノ酸の重複にわたって88.3%の同一性を示す。
番号2327):
番号2329):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF696は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF696.a
)と、120アミノ酸の重複にわたって100.0%の同一性を示す。
号2331):
番号2333):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFと、menBとの相同性
ORF700は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF700)と、
300アミノ酸の重複にわたって94.7%の同一性を示す。
番号2335):
号2337):
番号2339):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFと、menBとの相同性
ORF701は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF701.ng
)と、128アミノ酸の重複にわたって92.2%の同一性を示す。
番号2341):
号2343):
番号2345):
)と、124アミノ酸の重複にわたって91.9%の同一性を示す。
番号2347):
号2349):
番号2351):
)と、288アミノ酸の重複にわたって98.3%の同一性を示す。
番号2353):
番号2355):
号2357):
番号2359):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF705は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF705)と、
238アミノ酸の重複にわたって95.0%の同一性を示す。
番号2361):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF705は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF705)と
、238アミノ酸の重複にわたって100.0%の同一性を示す。
号2363):
:
番号2365):
番号2367):
番号2369):
番号2371):
73):
375):
377):
63):
381):
383):
385):
387):
389):
391):
393):
395):
397):
399):
401):
03):
405):
07):
409):
411):
412.a):
13):
415):
417):
419):
421):
423):
425):
427):
429):
431):
433):
435):
437):
439):
441):
る、以下の部分DNA配列を同定した(配列番号2443):
445):
447):
449):
451):
453):
455):
57):
8;ORF728):
459):
N.meningitidis menA with menB由来の推定ORFとの相
同性
ORF728は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF728.a)と
の377アミノ酸の重複にわたって、96.3%の同一性を示す:
461):
63):
465):
N.meningitidis menA with menB由来の推定ORFとの相
同性
ORF729は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF729.a)と
の467アミノ酸の重複にわたって、95.7%の同一性を示す:
467):
69):
471):
473):
75):
477):
479):
81):
483):
N.meningitidis menA with menB由来の推定ORFとの相
同性
ORF732は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF732.a)
と491アミノ酸の重複にわたって、98.2%の同一性を示す:
485):
87):
489):
N.meningitidis menA with menB由来の推定ORFとの相
同性
ORF733は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF733.a)と
の123アミノ酸の重複にわたって、94.3%の同一性を示す:
491):
93):
495):
497):
499):
501):
03):
505):
N.meningitidis menA with menB由来の推定ORFとの相
同性
ORF736は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF736.ng)
との258アミノ酸の重複にわたって、97.7%の同一性を示す:
507):
09):
511):
N.meningitidis menA with menB由来の推定ORFとの相
同性
ORF737は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF737.a)と
の108アミノ酸の重複にわたって、95.4%の同一性を示す:
513):
15):
517):
N.meningitidis menA with menB由来の推定ORFとの相
同性
ORF738は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF738.a)と
の604アミノ酸の重複にわたって、95.0%の同一性を示す:
519):
21):
523):
N.meningitidis menA with menB由来の推定ORFとの相
同性
ORF739は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF739.a)と
の197アミノ酸の重複にわたって、86.3%の同一性を示す:
525):
27):
529):
531):
33):
535):
537):
539):
541):
543):
545):
547):
549):
51):
553):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF746は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF746)との3
46アミノ酸の重複にわたって、89.9%の同一性を示す:
555):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF746は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF746)との
332アミノ酸の重複にわたって、99.7%の同一性を示す:
557):
559):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF747は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF746)との
102アミノ酸の重複にわたって、97.1%の同一性を示す:
61):
563):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF748は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF748)との4
21アミノ酸の重複にわたって、95.0%の同一性を示す:
565):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF748は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF748)との
421アミノ酸の重複にわたって、99.0%の同一性を示す:
67):
569);
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF749は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF749)との3
88アミノ酸の重複にわたって、96.1%の同一性を示す:
571):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF749は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF749)との
388アミノ酸の重複にわたって、99.7%の同一性を示す:
73):
575):
N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性
ORF750は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF750)との3
22アミノ酸の重複にわたって、93.8%の同一性を示す:
577):
N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性
ORF750は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF750)との3
21アミノ酸の重複にわたって、98.8%の同一性を示す:
579):
581):
583):
585):
587):
589):
591):
593):
595):
597):
599):
601):
03):
605):
607):
2609):
2611):
2613):
2615):
2617):
2619):
2621):
2623):
2625):
N.meningitidis由来の予測されるORFとの相同性
ORF765は、N.meningitidis由来のORF(ORF765)と309
アミノ酸のオーバーラップにわたって、96.18%の同一性を示す:
627):
2629):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF767は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF767)と214ア
ミノ酸のオーバーラップにわたって、95.8%の同一性を示す:
2631):
N.meningitidis由来の予測されるORFとの相同性
ORF767は、N.meningitidis由来のORF(ORF767)と214
アミノ酸のオーバーラップにわたって、96.7%の同一性を示す:
633):
2635):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF768は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF768)と119ア
ミノ酸のオーバーラップにわたって、96.6%の同一性を示す:
2637):
N.meningitidis由来の予測されるORFとの相同性
ORF768は、N.meningitidis由来のORF(ORF768)と119
アミノ酸のオーバーラップにわたって、99.2%の同一性を示す:
639):
2641):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF769は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF769)と429ア
ミノ酸のオーバーラップにわたって、95.1%の同一性を示す:
2643):
N.meningitidis由来の予測されるORFとの相同性
ORF769は、N.meningitidis由来のORF(ORF769)と490
アミノ酸のオーバーラップにわたって、99.8%の同一性を示す:
645):
2647):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF770は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF770)と186ア
ミノ酸のオーバーラップにわたって、93.5%の同一性を示す:
2649):
N.meningitidis由来の予測されるORFとの相同性
ORF770は、N.meningitidis由来のORF(ORF770)と186
アミノ酸のオーバーラップにわたって、99.5%の同一性を示す:
651):
2653):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF771は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF771)と704ア
ミノ酸のオーバーラップにわたって、90.3%の同一性を示す:
2655):
N.meningitidis由来の予測されるORFとの相同性
ORF771は、N.meningitidis由来のORF(ORF771)と704
アミノ酸のオーバーラップにわたって、98.9%の同一性を示す:
657):
2659):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF772は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF772)と298ア
ミノ酸のオーバーラップにわたって、85.2%の同一性を示す:
2661):
N.meningitidis由来の予測されるORFとの相同性
ORF772は、N.meningitidis由来のORF(ORF772)と298
アミノ酸のオーバーラップにわたって、95.6%の同一性を示す:
2663):
665):
2667):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF774は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF774)と237ア
ミノ酸のオーバーラップにわたって、92.8%の同一性を示す:
2669):
N.meningitidis由来の予測されるORFとの相同性
ORF774は、N.meningitidis由来のORF(ORF774)と238
アミノ酸のオーバーラップにわたって、89.5%の同一性を示す:
2671):
2673):
N.meningitidis由来の予測されるORFとの相同性
ORF790は、N.meningitidis由来のORF(ORF790)と342
アミノ酸のオーバーラップにわたって、98.2%の同一性を示す:
675):
2677):
2679):
681):
2683):
2685):
687):
2689):
2691):
693):
2695):
2697):
699):
2701):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF900は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF900)と386ア
ミノ酸のオーバーラップにわたって、87.0%の同一性を示す:
2703):
2705):
2707):
709):
2711):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF902は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF902.ng)と3
45アミノ酸のオーバーラップにわたって、80.9%の同一性を示す:
2713):
715):
2717):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF903は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF903.ng)と5
19アミノ酸のオーバーラップにわたって、48.9%の同一性を示す:
2719):
721):
2723):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF904は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF904.ng)と4
36アミノ酸のオーバーラップにわたって、90.4%の同一性を示す:
2725):
2727):
729):
2731):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF907は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF907.ng)と1
26アミノ酸のオーバーラップにわたって、92.9%の同一性を示す:
2733):
735):
2737):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF908は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF908.ng)と1
66アミノ酸のオーバーラップにわたって、93.4%の同一性を示す:
2739):
741):
743):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF909は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF909.ng)と9
0アミノ酸のオーバーラップにわたって、53.3%の同一性を示す:
2745):
2747):
2749):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF910は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF910.ng)と9
4アミノ酸のオーバーラップにわたって、96.8%の同一性を示す:
2751):
753):
2755):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF911は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF911.ng)と1
64アミノ酸のオーバーラップにわたって、99.4%の同一性を示す:
2757):
759):
号2761):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF912は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF912.ng)と1
96アミノ酸のオーバーラップにわたって、91.8%の同一性を示す:
2763):
765):
2767):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF913は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF913.ng)と2
77アミノ酸のオーバーラップにわたって、94.9%の同一性を示す:
2769):
771):
2773):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF914は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF914.ng)と2
44アミノ酸のオーバーラップにわたって、96.7%の同一性を示す:
2775):
777):
2779):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF915は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF915.ng)と1
64アミノ酸のオーバーラップにわたって、97.0%の同一性を示す:
2781):
783):
2785):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF917は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF917.ng)と3
76アミノ酸のオーバーラップにわたって、97.6%の同一性を示す:
2787):
789):
2791):
2793):
実施例1に記載されたORF919についてのプライマーを使用して、ORFを位置付
けし、そしてクローニングした。この配列は、図1#において提供されるように、精製さ
れ、そしてE.coli中で発現された。ORF919の親水性プロット、抗原性指数、
および両親媒性領域を、図5#中に提供する。AMPHIプログラムは、推定のT細胞エ
ピトープを予測するために使用されている(Gaoら(1989)J.Immunol.
143:3007;Robertsら(1996)AIDS Res Human Re
troviruses 12:593;Quakyiら(1992)Scand J I
mmunol 補遺 11:9)。ORF919の核酸配列は、提示C#において提供さ
れる。
以下の部分的DNA配列は、N.gonorrhoeae中で同定された(配列番号2
795):
2797):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF920は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF920.ng)と2
07アミノ酸のオーバーラップにわたって、91.3%の同一性を示す:
2799):
801):
2803):
2805):
807):
2809):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF921は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF921.ng)と1
62アミノ酸のオーバーラップにわたって、95.7%の同一性を示す:
2811):
813):
2815):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF922は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF922.ng)と3
69アミノ酸のオーバーラップにわたって、95.9%の同一性を示す:
2817):
819):
2821):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF923は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF923.ng)と1
57アミノ酸のオーバーラップにわたって、68.8%の同一性を示す:
2823):
825):
2827):
N.gonorrhoeae由来の予測されるORFとの相同性
ORF925は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF925.ng)と5
0アミノ酸のオーバーラップにわたって、94.0%の同一性を示す:
829):
2831):
2833):
835):
2837):
839):
2841):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF927は、N.gonorrhoeae由来のORF(ORF927.ng)と
243アミノ酸重複にわたって94.2%の同一性を示す:
2843):
845):
2847):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF929は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF929.ng
)と487アミノ酸重複にわたって98.8%の同一性を示す:
2849):
2851):
853):
2855):
857):
2859):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF931は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF931.ng
)と185アミノ酸重複にわたって91.9%の同一性を示す:
2861):
2863):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF932は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF932.ng
)と アミノ酸重複にわたって %の同一性を示す:
以下の部分的DNA配列は、N.meningitidis中で同定された(配列番号
2865):
2867):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF934は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF934.ng
)と205アミノ酸重複にわたって91.7%の同一性を示す:
2869):
2871):
2873):
875):
2877):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF936は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF936.ng
)と128アミノ酸重複にわたって93.8%の同一性を示す:
2879):
881):
2883):
2885):
887):
2889):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF937は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF937.ng
)と289アミノ酸重複にわたって86.9%の同一性を示す:
2891):
2893):
2895):
897):
2899):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF950は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF950)と1
12アミノ酸重複にわたって86.6%の同一性を示す:
2901):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF950は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF950)と
102アミノ酸重複にわたって100.0%の同一性を示す:
903):
2905):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF951は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF951)と6
16アミノ酸重複にわたって88.6%の同一性を示す:
2907):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF951は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF951)と6
14アミノ酸重複にわたって96.4%の同一性を示す:
909):
2911):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF952は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF952)と2
01アミノ酸重複にわたって92.5%の同一性を示す:
2913):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF952は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF952)と
218アミノ酸重複にわたって97.7%の同一性を示す:
915):
2917):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF953は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF953)と1
87アミノ酸重複にわたって93.0%の同一性を示す:
2919):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF953は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF953)と
187アミノ酸重複にわたって97.3%の同一性を示す:
2921):
923):
2925):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF957は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF957)と3
31アミノ酸重複にわたって95.2%の同一性を示す:
2927):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF957は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF957)と
377アミノ酸重複にわたって96.3%の同一性を示す:
929):
2931):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF958は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF958)と8
02アミノ酸重複にわたって89.3%の同一性を示す:
2933):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF957は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF957)と
377アミノ酸重複にわたって96.3%の同一性を示す:
935):
2937):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF959は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF959)と1
08アミノ酸重複にわたって95.4%の同一性を示す:
2939):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF959は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF959)と
108アミノ酸重複にわたって94.4%の同一性を示す:
2941):
2943):
2945):
2947):
949):
2951):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF973は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF973.ng
)と274アミノ酸重複にわたって95.6%の同一性を示す:
2953):
955):
2957):
2959):
961):
2963):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
2965):
967):
2969):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
2971):
973):
2975):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
2977):
979):
2981):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
2983):
985):
2987):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
2989):
2991):
2993):
995):
2997):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF992は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF992)と2
33アミノ酸重複にわたって96.1%の同一性を示す:
2999):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF992は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF992)と
233アミノ酸重複にわたって100.0%の同一性を示す:
001):
3003):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF993は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF993)と2
48アミノ酸重複にわたって93.1%の同一性を示す:
3005):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF993は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF993)と
248アミノ酸重複にわたって97.6%の同一性を示す:
007):
3009):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF996は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF996)と2
07アミノ酸重複にわたって98.1%の同一性を示す:
3011):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF996は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF996)と
207アミノ酸重複にわたって100.0%の同一性を示す:
013):
3015):
(N.gonorrhoeae由来の推定ORFとの相同性)
ORF997は、N.gonorrhoeae由来の推定ORF(ORF997)と3
51アミノ酸重複にわたって96.0%の同一性を示す:
3017):
(N.meningitidis由来の推定ORFとの相同性)
ORF997は、N.meningitidis由来の推定ORF(ORF997)と
437アミノ酸重複にわたって98.2%の同一性を示す:
3019):
ない。
Claims (4)
- 配列番号2536、および配列番号2538からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
- 配列番号2536または配列番号2538のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、タンパク質であって、該タンパク質はナイセリア細菌に対する殺菌活性を有する血清を生じ得る、タンパク質。
- 配列番号2536または配列番号2538のアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、タンパク質であって、該タンパク質はナイセリア細菌に対する殺菌活性を有する血清を生じ得る、タンパク質。
- 配列番号2536または配列番号2538のアミノ酸配列に対して99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、タンパク質であって、該タンパク質はナイセリア細菌に対する殺菌活性を有する血清を生じ得る、タンパク質。
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