CN1074422C - 制备含有hcv表位的分离多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

制备一种分离多肽的方法，该分离多肽包含由HCV基因组编码的作为HCV功能基团的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列，所述HCV基因组包含至少24个连续核苷酸的多核苷酸，该多核苷酸序列与如下序列的任一链互补：(i)储存于CCTCCNo.M88125、或CCTCCNo.M88126、或CCTCCNo.M88127、或CCTCCNo.M88128、或CCTCCNo.M88129的HCVcDNA，或(ii)如图47所示核苷酸序列，所述方法包括提供氨基酸和聚合所述氨基酸以产生多肽。

Description

制备含有HCV表位的分离多肽的方法
本申请是发明专利申请CN88107988.X的分案申请。
本发明涉及一种用于控制非A和非B肝炎病毒(NANBV)感染蔓延的物质和方法、更具体地说，它涉及一些针对非A和非B(NANB)肝炎，亦即肝炎C病毒的病原体的诊断性DNA片段、诊断性蛋白、诊断性抗体、以及保护性抗原和抗体。
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非A和非B肝炎(NANBH)是一种传染性疾病或疾病族，这类疾病被认为是由病毒引起的，并可与其他类型的与病毒相关的肝脏疾病相区别，后者包括由已知的肝炎病毒即肝炎A病毒(HAV)、肝炎B病毒(HBV)、和δ肝炎病毒(HDV)引起的疾病，以及由巨细胞病毒(CMV)或EB病毒(EBV)引起的肝炎。NANBH首先是在输血后的个体中发现的。从人传播给黑猩猩，以及在黑猩猩中的连续传代证明，NANBH系由可传播的传染性病毒所致。但是，依然未能鉴别出引起NANBH的传染性病毒，而且亦不知道引起该疾病的病毒数。
流行病学的资料表明，可能存在三种NANBH：水传播的流行型；与血或针刺相关的类型；以及散发(已成习惯的群居)型。但是可引起NANBH的病毒数仍不清楚。
通过排除其他病毒标记的方法已初步完成了NANBH的临床诊断和鉴别。用于检测推想的NANBV抗原和抗体的方法有琼脂一凝胶扩散、反向免疫电泳、免疫荧光显微镜检查、免疫电子显微镜检查、放射免疫测定和酶联免疫吸收试验。然而，这些测定方法用于NANBN的诊断均无足够的灵敏度、特效性和重现性。
至此，对与NANBH病毒有关的抗原抗体系统的特征或特性既不清楚，又缺乏一致的看法。这至少部分是由于：(1)HBV DNA结合到肝细胞的基因组中；以及(2)在个体中用NANBV先于HBV感染或两者合并感染；和(3)与HBV有关的可溶性和颗粒性抗原的已知的复杂性。另外，既有可能NANBH被误诊，也有可能NANBH是由一种以上的传染性病毒引起的。而且，尚不清楚在感染NANBH的病人血清中，血清测定是检测什么。有人假设，琼脂凝胶扩散和反向免疫电泳测定系检测自体免疫应答或有时在血清试样之间发生的非特异性蛋白相互作用，这种作用并不代表特异的NANBV抗原-抗体反应。免疫荧光法、酶联免疫吸收试验和放射免疫测定似乎是检测低水平的类风湿因子状物质，这种物质通常出现在患有其他肝病和非肝病患者的血清中，以及在患有NANBH患者的血清中。所测得的某些反应性可以代表抗宿主-决定的细胞质抗原的抗体。
有一些可供选择的NANBV[例如可参见下列作者的综述：Prince(1983),Feinstone and Hoofnagle(1984),and Ore-rby(1985,1986,1987)，以及Iwarson(1987)的文章]。然而，尚无资料证明这些可供选择者中的某一个代表着NANBH的病原体。
需要有灵敏和特效的方法来筛选和鉴别NANBV载体，以及被NANBV污染的血或血制品是至关重要的。输血后的病人中约有10％发生输血后的肝炎(PTH)，而其中NANBH占高达90％的比例。这一疾病的主要问题是向慢性肝损伤的不断发展(25-55％)。
预防NANBH通过血液和血制品，或通过接近的个体接触进行传染，以及对病人的护理均需要有可靠的诊断和预测手段，来检测与NANBV相关的核酸、抗原和抗体。此外，还需要有有效的疫苗和免疫治疗的治疗剂来预防和/或治疗此种疾病。
本发明涉及一种新发现的NANBH病原体，肝炎C病毒(HCV)的分离和特性鉴别。更具体地说，本发明提供了部分HCV基因组的互补DNA(cDNA)复制体族。这些cDNA复制体通过某种技术进行分离，该技术包括一个新颖的步骤，即从NANBH病人的血清所感染的组织中的颗粒体所产生的cDNA库中筛选表达产物，以检测从迄今为止未分离和未鉴别的病毒体的基因组和所选克隆的基因组中衍生得到的新合成的抗原，它产生仅与感染个体(与非感染个体相比)的血清发生免疫反应的产物。
利用以HCV cDNA得到的探针，以及在HCV cDNA内所得的顺序信息对HCV基因组性质的研究表明，HCV是黄热病病毒或类似黄热病的病毒。
部分从HCV中得到的cDNA顺序可用作探针，以检测试样中病毒的存在与否，并分离该病毒天然存在的变异体。这些cDNA也使得编码在HCV基因组中的HCV抗原的多肽顺序可供利用，并可产生多肽，后者可用作诊断检验的标准或试剂，和/或作为疫苗的组分。直接抗包含在这些多肽顺序中的HCV表位的多克隆和单克隆抗体也可作为治疗剂而用于诊断检验中，用于筛选抗病毒体，以及用于分离产生这些cDNA的NANBV体。此外，利用从这些cDNA中所得的探针，可以分离和定序HCV基因组的其他部分，由此产生可用于诊断和/或处理(包括预防和治疗)NANBH的其他探针和多肽。
因此，有关于多核苷酸，本发明的某些方面是：纯化的HCV多核苷酸，重组HCV多核苷酸，含有从HCV基因组或从HCVcDNA衍生得到的顺序的重组多核苷酸，编码HCV表位的重组多核苷酸，含有上述任何重组多核苷酸的重组载体，以及用这些载体中任一个转化的宿主细胞。
本发明的另一方面是：(1)重组表达系统，它含有从HCV基因组或HCV cDNA衍生得到的DNA的开放读码(ORF)，其中ORF可操纵地连接到与所需宿主可相容的控制顺序中；(2)用重组表达系统转化的细胞；和(3)由转化细胞产生的多肽。
本发明的再一方面是：纯化HCV；从纯化HCV所得的多肽制剂；纯化HCV多肽；以及纯化多肽，后者含有在免疫学上可看作与HCV中所含的表位相同的表位。
本发明的又一方面是：重组HCV多肽；含有从HCV基因组或从HCV cDNA中衍生所得顺序的重组多肽；含有HCV表位的重组多肽；以及由HCV多肽组成的融合多肽。
本发明的又一方面是一种直接抗HCV表位的单克隆抗体和直接抗HCV表位的多克隆抗体的纯化制剂。
本发明的又一方面是一种对HCV感染致免疫的颗粒，后者包括一个具有氨基酸顺序的非HCV多肽和一个HCV表位，当所说的氨基酸顺序在真核宿主中产生时，则该顺序能形成一种颗粒。
本发明的又一方面是一种对于HCV的多核苷酸探针。
本发明涉及药盒(kit)的方面为：分析由HCV衍化的多核苷酸的样品，包括含有来源于HCV的8个或更多的核苷酸的多核苷酸探针，在合适的容器中对包括针对于HCV抗原的抗体的用于测试HCV抗原存在的分析样品进行检测。在合适的容器，对包括含有一种存在于HCV抗原上的表位的多肽的针对HCV抗原的抗体的存在进行分析的分析样品进行检测。
本发明的其他方面还有：附着于固体底物的多肽包括一个HCV表位；及附着于固态底物的HCV表位的抗体。
本发明还包括：一种产生含有HCV表位的多肽的方法，包括：在允许该多肽表达的条件下，对用含有一个编码包括HCV表位的多肽的顺序的表达载体进行转化的宿主细胞进行培养；以及用此方法产生的含有HCV表位的多肽。
本发明也包括另一种方法，用以检测样品中的HCV核酸，包括：在探针和样品中的HCV核酸之间形成多核苷酸复合体的条件下，用HCV多核苷酸的探针对核酸进行处理；并且检测含有探针的多核苷酸复合体。
本发明还采用免疫测试法。涉及一种检测HCV抗原的免疫测试法，包括：在抗原-抗体复合物形成所允许的条件下，将怀疑含有HCV抗原的样品与针对于欲检测的HCV抗原的探针抗体一起培养；并对含有探针抗体的抗原抗体复合物进行检测。一种用于检测针对于HCV抗原的抗体的免疫测试法包括：在抗体-抗原形成复合物所允许的条件下，将怀疑含有抗-HCV抗体的样品与含有HCV表位的探针多肽一起培养；并且对含有探针抗原的抗体-抗原复合物进行检测。
本发明还涉及用于治疗HCV感染的疫苗，包括一个含有HCV表位的致免疫的肽，或为HCV的灭活制剂，或HCV的减毒的制剂。
本发明另一方面还涉及一种用HCV感染的组织培养生长细胞。
本发明还包括一种产生抗HCV的抗体的方法，包括：将含有在数量上足以引起免疫响应的分离的致免疫多肽施用于个体。
本发明另外还包括一种将衍化自未确定的感染原的基因组的cDNA分离的方法，包括：(a)提供用含有被感染剂感染的组织中分离的核酸得到的cDNA基因库的表达载体转化的宿主细胞，随后在cDNA编码的多肽得以表达所允许的条件下使该宿主细胞生长；(b)将该cDNA的表达产物与含有被该感染剂感染的个体的驱体组成部分的抗体，在允许免疫反应的条件上下进行相互作用，并对相互作用而产生的抗体-抗原复合物进行检测；(c)使表达在步骤(b)中形成抗体-抗原复合物的多肽的宿主细胞在允许作为个体克隆的细胞生长的条件下生长，并分离这些克隆；(d)在允许在cDNA内编码的多肽表达的条件下，使得自(c)的克隆的细胞生长，随后将表达产物与含有不同于步骤(a)的个体(该个体被用感染剂，或为未经感染剂感染的对照个体)的驱体组成部分的抗体进行作用，接着对作为作用结果而形成的抗体-抗原复合物进行检测；(e)使表位与抗体(该抗体含有被感染的，以及怀疑正被感染的个体的驱体组成部分，但不包括那些对照个体的组分)形成抗体-抗原复合物的多肽的细胞，在允许个体克隆生长的条件下，使之生长，并分离这些克隆；以及(f)从(e)的宿主克隆细胞中分离cDNA。
附图简要说明：
图1表示插入在克隆5-1-1中的HCV cDNA的双链核苷酸顺序，以及编码在其内的多肽的推测氨基酸顺序。
图2表示在克隆5-1-1,81,1-2和91中重叠HCV cDNA顺序的同源性。
图3表示从重叠克隆81,1-2和91中所得的HCV cDNA的复合顺序，以及其内编码的氨基酸顺序。
图4表示插入在克隆81中的HCV cDNA的双链核苷酸顺序，以及编码在其内的多肽的推测氨基酸顺序。
图5表示在克隆36中的HCV cDNA顺序，重叠克隆81的NANBV cDNA的区段，以及编码在克隆36内的多肽顺序。
图6表示在克隆36和81中HCV cDNA的组合ORF，以及在其内编码的多肽。
图7表示在克隆32内的HCV cDNA顺序，重叠克隆81的区段；以及在其内编码的多肽。
图8表示在克隆35内的HCV cDNA顺序，重叠克隆36的区段，以及在其内编码的多肽。
图9表示在克隆35,36,81和32内的HCV cDNA的组合ORF，以及在其内编码的多肽。
图10表示在克隆37b中的HCV cDNA顺序，重叠克隆35的区段，以及在其内编码的多肽。
图11表示在克隆33b中的HCV cDNA顺序，重叠克隆32的区段，以及在其内编码的多肽。
图12表示在克隆40b中的HCV cDNA顺序，重叠克隆37b的区段，以及在其内编码的多肽。
图13表示在克隆25c中的HCV cDNA顺序，重叠克33b的区段，以及在其内编码的多肽。
图14表示核苷酸顺序和编码在ORF中的多肽，ORF延伸通过克隆40b,37b,35,36,81,32,33b和25c中的HCV cDNA。
图15表示在克隆33c中的HCV cDNA顺序，重叠克隆40b和33c的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图16表示在克隆8h中的HCV cDNA顺序，重叠克隆33c的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图17表示在克隆7e中的HCV cDNA顺序，重叠克隆8h的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图18表示在克隆14c中的HCV cDNA顺序，重叠克隆25c的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图19表示在克隆8f中的HCV cDNA顺序，重叠克隆14c的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图20表示在克隆33f中的HCV cDNA顺序，重叠克隆8f的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图21表示在克隆33g中的HCV cDNA顺序，重叠克隆33f的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图22表示在克隆7f内的HCV cDNA顺序，重叠克隆7e内顺序的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图23表示在克隆11b内的HCV cDNA顺序，重叠克隆7f内顺序的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图24表示在克隆14i内的HCV cDNA顺序，重叠克隆11b内顺序的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图25表示在克隆39c内的HCV cDNA顺序，重叠克隆33g内顺序的区段，以及在其内编码的氨基酸。
图26表示在克隆7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f和33g中从排列的cDNA中所得的复合HCV cDNA顺序，图中也表示了编码在所得的顺序内延伸的ORF中的多肽的氨基酸顺序。
图27表示克隆12f中的HCV互补DNA顺序，重叠克隆14i的片段和编码在其内的氨基酸。
图28表示在克隆35f中的HCV cDNA顺序，重叠克39c的片段，以及编码在其内的氨基酸。
图29表示在克隆19g内的HCV cDNA顺序，重叠克隆35f的片段和在其内被编码的氨基酸。
图30表示克隆26g的顺序，重叠克隆19g的片段，在其内被编码的氨基酸。
图31表示克隆15e的顺序，重叠克隆26g的片段，以及在其内被编码的氨基酸。
图32表示在复式cDNA中的顺序，通过使5′至3′方向的克隆12f至15e排列而衍生得到，它也可表示在连续ORF中被编码的氨基酸。
图33表示用BB-NANB,HAV和HBV感染的黑猩猩的血清的融合蛋白质SOD-NANB5-1-1′的Western印迹的照片。
图34表示用NANBV,HAV,HBV感染的人体的血清和对照人体血清的融合蛋白质SOD-NANB5-1-1′的Western印迹的照片。
图35是一个显示载体pAB24主要特征的图。
图36表示融合多肽C100-3羧基末端的推测氨基酸顺序，以及编码它的核苷酸顺序。
图37A是用考马斯蓝着色的聚丙烯酰胺凝胶的照片，可以鉴别在酵母中表达的C100-3。
图37b表示用NANBV感染的人体血清所进行的C100-3的Western印迹。
图38表示以克隆81的BB-NANBV cDNA为探针，从受BB-NANBV感染的黑猩猩的肝中分离得到的RNA的Northern印迹的放射自显影照片。
图39表示用RNaseA或DNase1处理，并以克隆81的BB-NANBV cDNA为探针的NANBV核酸的自显影照片。
图40表示从含有抗NANB5-1-1′的感染血清中所取山的NANBV颗粒内提取的，以来自克隆81的经32P标记的NANBV cDNA探查的核酸放射自显影照片。
图41表示含有分离得到的NANBV核酸的滤子的放射自显影照片，以从克隆81中的NANBV cDNA所得的经32P标记的正链和负链DNA为探针进行了探查。
图42表示在HCV cDNA中被编码的多肽和来自登革热病毒的NS蛋白质之间的同源性。
图43表示由ELISA筛选所确定的，在随机样水中HCV感染分布的组织图。
图44表示在ELISA测定中使用两种构型的免疫球蛋白-酶接合物，在随机样本中11CV感染分布的组织图。
图45表示在一种引物混合物内的顺序，来自黄热病病毒的NsI的一段保守顺序。
图46所示为克隆kq-1中的HCV cDNA顺序、重叠图26中的cDNA的部分以及其中编码的氨基酸。
图47所示为由使克隆kq-1通过15e以5′至3′方向排列得到的复合cDNA中的顺序；它还表示以连续ORF中编码的氨基酸。
实施本发明的方式Ⅰ定义
“肝炎C病毒”已被该领域的工作人员专用于迄今为止未知的NANBH病原体。因此，本发明所用的“肝炎C病毒”(HCV)系指引起NANBH的病原体，而以前被称作为NANBV和/或BB-NANBV。HCV、NANBV和BB-NANBV这些词在文内是通用的。作为该词的引伸，由HCV引起的，以前称为NANB肝炎(NANBH)的疾病也称为肝炎C。NANBH和肝炎C这二个词在文内可以通用。
本文所用的“HCV”一词系指能引起NANBH的病毒类和减毒菌株，或从其内衍生得到的缺陷性干涉颗粒。如下文所示，HCV病毒组包括RNA。业已知道，含有RNA的病毒具有较高的自发突变率，亦即(据报道)每一核苷酸为10-3-10-4的量级(Fields &Knipe,1986)。因此，在下文所述的HCV物种内有多种菌株。本文所述的组合物或方法可使各种有关的菌株进行繁殖、鉴别、检测和分离。而且，它们也可使对付各种菌株的诊断剂和疫苗的制备成为可能，并用于供药理应用的抗病毒剂(可抑制HCV的复制)的筛选方法。
尽管是从一种HCV菌株中衍生得到的(以下称为CDC/HCVI)，但本文所提供的资料足以使病毒分类学家能鉴别属于该种类的其他菌株。如文内所述，我们已发现HCV是一种黄热疫病毒或黄热病状病毒。黄热病病毒颗粒的形态学和组成是已知的，并在Brihton(1986年)中进行了讨论。通常，就形态学而论，黄热病病毒含有一个被类脂双层膜包围的中心核壳体。病毒颗粒是球状的，直径约为40-50nm。它们核心的直径约为25-30nm。沿着病毒颗粒被膜的外表面是长约5-10nm的突出物，并带有直径约为2nm的未端结。
HCV编码一种在免疫学上可视作与HCV基因组中的表位相同的表位，而本文所述的cDNA是从该HCV基因组中衍生得到，最好该表位是在本文所述的cDNA内被编码。若与其他已知的黄热病病毒相比，该表位是HCV所独有的。表位的单一性可由其与HCV的免疫反应性和与其他黄热病病毒种没有免疫反应性来确定。确定免疫反应性的方法在该技术领域内是公知的，例如放射免疫测定，Elisa测定和血液反应，文内提供了供测定用的几种合适技术试样。
除如上所述外，下述参数单独或组合在一起，可用于鉴别HCV菌株。由于HCV菌株是进化相关的，估计基因组的在核苷酸级的全部同源性约为40％或更大，较好的是约60％或更大，更好的是约80％或更大，另外，有至少约为13个核苷酸的对应的连接顺序。在推测的HCV菌株基因组顺序和CDC/CHIHCV cDNA顺序之间的一致性可由该技术领域已知的技术确定。例如可通过推测HCV的多核苷酸的顺序信息与本文所述的HCV cDNA顺序的直接比较来确定。另外，也可由下述方法确定，即在同源区(例如在S消化之前所用的)之间形成稳定复体的条件下杂交多核苷酸，然后用单链的指定核酸酶消化，最后测定消化后片段的大小。
由于HCV菌株的进化关系，推测的HCV菌株可根据它们的多肽级的同源性而视为相同。通常，HCV菌株在多肽级约大于40％同源性，较好的是约大于60％的同源性，更好的是约大于80％同源性。确定氨基酸顺序同源性的等级在该技术领域中是公知的。例如，氨基酸顺序可通过测定和与本文所提供的顺序相比较而确定。例如，推测HCV的基因组物质的核苷酸顺序也可被测定(一般是经由cDNA中间体)；在其内被编码的氨基酸顺序可被确定，相应的区被进行比较。本文所引用的从一种指定顺序，例如HCV cDNA，特别是从图1-32中所列举的那些，或来自HCV基因组的顺序所“衍生得到的”多核苷酸，是指这样一种多核苷酸顺序，它包括一个至少约有6-8个核苷酸的顺序，较好的是至少约有8个核苷酸，更好的是至少约有10-12个核苷酸，而最好是至少约有15-20个核苷酸，它相当于，亦即与指定核苷酸顺序的区域同源或互补。最好，衍生出多核苷酸的该区域的顺序与HCV基因组独有的顺序同源或互补。某一顺序是否是HCV基因组独有的，可由该技术领域内熟练人员所知的技术确定。例如，可将该顺序与数据库(例如Genebank)中的顺序进行比较，以确定其是否存在于未感染的宿主或其他有机体中。也可将该顺序与其他病毒体(包括已知能引起肝炎的病毒体，例如HAV、HBV和HDV)的已知顺序，以及Flavivilidae的其他成员的顺序相比较。所得顺序与其他顺序的对应或非对应性也可在合适的严格条件下进行杂交而确定。确定核酸顺序互补性的杂交技术在该领域是公知的，并将在下文进行讨论〔例如也可参见Maniatis et al(1982)〕。此外，由杂交形成的复合多核苷酸的失配可由已知技术确定，这包括诸如用SI之类的核酸酶消化，后者专门消化复合多核苷酸中的单链区。可产生典型DNA顺序的区域包括(但不限于)诸如非转录区和/或非转译区，以及编码特定表位的区域。
所得到的多核苷酸不一定是通过物理方法从所示的核苷酸顺序获得，也可以任何方式产生，包括诸如化学合成或者DNA复制，反转录或转录，后三种是基于产生多核苷酸的区域所提供的碱基顺序。另外，与指定顺序相应的区域的连接可按该技术领域内公知的方式修饰，以使之与预定的应用一致。
同样，从指定的核酸顺序(例如图1-33中所示的顺序或从HCV基因组)衍生得到的多肽或氨基酸顺序系指多肽的氨基酸顺序与编码在该顺序中的多肽的氨基酸顺序或其部分顺序相同，其中所述的部分至少由3-5个氨基酸组成，较佳的是至少由8-10个氨基酸组成，而更佳的是至少由11-15个氨基酸组成，或者其在免疫学上可与编码在该顺序中的多肽相同。
重组或衍生所得的多肽不一定是从指定的核酸顺序(例如图1-32中的顺序)或HCV基因组中转译而来，它可以任何方式产生，例如包括化学合成、重组体表达系统的表达、或从突变HCV中分离。
本文所用的“重组多核苷酸”一词系指从基因组、cDNA、半合成或合成来源的多肽苷酸，根据其来源和处理方式，(1)它不是与全部或部分的在天然或库中的形式上与其有关的多核苷酸相关；和/或(2)它与一种多核苷酸相连，而不是在天然情况下相连的那种。
本文所用的“多核苷酸”一词系指任何长度的核苷酸(核苷酸或脱氧核苷酸)的多聚体。该名词仅指分子的初级结构。由此它既包括双链和单链的RNA，又包括双链和单链的DNA。它也包括如用甲基化作用和/或封端修饰的多核苷酸，以及未修饰形式的多肽苷酸。
本文所用的“HCV含有与cDNA相应的顺序”的词句系指HCV含有这样一种多核苷酸顺序，它与所指定的DNA同源或互补，而与cDNA同源或互补的程度约为50％或更大，较好的是至少约为70％，而更好的是至少约90％。相应的顺序至少约为70个核苷酸长度，较为可取的是至少约为80个核苷酸长度，而更为可取的是至少约为90个核苷酸。在HCV顺序的cDNA之间的对应性可由该技术领域已知的技术确定，例如包括将该顺序内容与所述的cDNA进行直接比较，或者杂交和用单链核酸酶消化，然后测定消化片段的大小。
“纯化的病毒多核苷酸”系指HCV基因组或其片段，它基本上没有与病毒多核苷酸天然相关的多肽，亦即它含有50％以下的所述多肽，较好的是含有30％以下的多肽，更好的是含有10％以下的多肽。从病毒颗粒中纯化病毒多核苷酸的技术在该技术领域内是公知的，这包括诸如用促溶剂使颗粒破裂；用离子交换层析法，亲合层析法和密度沉降法来分离多核苷酸和多肽。
“纯化的病毒多肽”一词系指基本上无细胞组分(病毒多肽与细胞组分是天然相关的HCV多肽或其片段，亦即它含有50％以下的细胞组分，较好的是含有30％以下的细胞组分，更好的是含有10％以下的细胞组分。纯化病毒多肽的技术在该技术领域内是公知的，并将在下文讨论。
“重组宿主细胞”，“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”，以及其他表示微生物或作为单细胞实体培养的多肽真核细胞系的这类术语系指可以是，或业已用作重组载体或其他转化DNA的受体的细胞，它们包括已被转染的原始细胞的后代。应该明白，由于偶然或有意义的突变，单亲代细胞的后代在形态学或基因组或总DNA组分上不一定与原始亲代完全相同。亲代细胞的后代与其亲代非常相似，以致可用相关的性质进行定性，如存在编码所需要的肽的核苷酸顺序，这类亲代细胞的后代被包括在本定义所指的后代范围内，也即上述术语所指。
“复制子”是指任何遗传因子，如质粒、染色体、病毒，它相当于细胞内的多核苷酸复制的自主单元，即能够在其自身控制下进行复制。
“载体”是一种复制子，其内连接另一个多核苷酸，可使所连接的片段复制和/或表达。
“控制顺序”系指这样一种多核苷酸顺序，它们对实现与之相连接的编码顺序的表达是必须的。这类控制顺序根据宿主生物而异，在原核生物中，这种控制顺序一般包括启动子，核糖体结合位点和终止子；而在真核生物中，这种控制顺序一般包括启动子，终止子，有时还包括强化子。“控制顺序”一词系指至少包括表达必需的全部组分，也可包括其他的组分，这些组分的存在是有利的，如前导顺序。
“操纵连接”系指所述的组分处于一种并列关系，以致可使它们实施原有的功能。“操纵连接”到编码顺序上的控制顺序就是以这样一种方式连接，从致编码顺序的表达是在与控制顺序相容的条件下实现的。
“开放编码”(ORF)是一段编码多肽的多核苷酸顺序，这一区域可以代表一部分密码顺序或全部密码顺序。
“密码顺序”是一种多核苷酸顺序，当置于适当的调节顺序控制之下时，它转录成mRNA和/或转译成多肽。密码顺序的边界是由5’末端的转译起始密码子和3’末端的转译终止密码子所确定。密码顺序可包括(但并不限于)mRNA,cDNA和重组多核苷酸顺序。
“在免疫学上可视作等同的”系指亦存在于指定的多肽(通常为HCV蛋白)冲，并为其所特有的表位和多肽。免疫等同性可由抗体结合和/或在结合中的竞争所确定，这类技术对于该领域内具有普通技艺的人来说是已知的，并将在下文阐述。表位的单一性也可用下述方法确定，即通过计算机对已知数据库(例如Genebank)进行检索，找出编码表位的多核苷酸顺序，以及与其他已知蛋白比较氨基酸顺序。
本文所用的“表位”系指多肽的抗原决定簇，一个表位可包括在表位所特有的一个空间构型内的三个氨基酸，通常一个表位至少由5个这样的氨基酸组成，更为普通的是至少由8-10个这类氨基酸组成。确定氨基酸空间构型的方法是该技术领域公知的，包括诸如X射线结晶学和二维核磁共振法。
当抗体对包含在多肽内的特定表位的识别后，与多肽结合时，多肽对抗体是有“免疫学反应性”的。免疫学反应性可由抗体结合(更具体地说由抗体结合动力学)和/或用已知多肽作为竞争子在结合中的竞争来确定，该已知多肽含有一个直接抗抗体的表位。用于确定一种多肽是否与抗体的免疫学反应性的技术是该技术领域所已知的。
本文所用的“含有HCV表位的免疫”一词包括天然存在的HCV多肽及其片段，以及由其他方法(包括化学合成或多肽在重组有机体中的表达)制备的多肽。
“多肽”一词系指氨基酸分子链，而不是指产物的特定长度，因此，肽、寡肽和蛋白质均包括在多肽的定义内。该词也不是指多肽表达后的修饰，例如糖基化、乙酰化和磷酸化等。
本文所用的“转化”一词系指一个外源多核苷酸插入宿主细胞，而与用于插入的方法，例如直接吸收、转导或f-交配等无关。外源多核苷酸可以作为非整合载体，例如质粒，也可被整合到宿主基因组中。
本文所用的“处理”系指预防和治疗。
本文所用的“个体”系指脊椎动物，特别是哺乳动物类的成员，并包括(但不限于)家畜、运动娱乐用的动物、灵长类以及人类。
本文所用的核苷酸“正链”包含编码多肽的顺序。而“负链”含有与“正链”互补的顺序。
本文所用的病毒的“正链基因组”是指其中的基因组(无论是RNA还是DNA)是单链的，它编码病毒多肽。正链RNA病毒的例子包括披盖病毒(Togaviridae)冠状病毒、(Coronaviridae)、逆转录病毒(Retrviridae)、微小RNA病毒(Picornaviridae)和杯状病毒(Caliciviridae)。以前分为披盖病毒类的黄热病病毒也包括在内(参见Fields & Knipe(1986)〕。
本文所用的“含有抗体的驱体组成部分”系指个体躯体中的一个部分，它是有关抗体的来源。含有抗体的驱体组成部分在该技术领域中是已知的，包括(但不限于)诸如血浆，血清，脑脊髓液，淋巴液，及呼吸道、肠道和生殖泌尿道的表面部分，泪液、唾液、乳汁、白血球和骨髓瘤。
本文所用的“纯化HCV”系指这样一种HCV制剂，它业已从病毒通常与之相关的细胞组成物中分离出来，并与可能存在于感染织组中其他类型的病毒分离。分离病毒的技术是该技术领域的熟练人员所知的，包括诸如离心分离和亲和色谱分离法，制备净化HCV的方法将在下文讨论。Ⅱ．本发明的描述
除非另行说明，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学常规技术，这些都在该领域的技术范围内。这类技术在下述列举的的文献中进行了充分描述：即Maniatis,Fitsch & Sambrook,MOLECULAR CLONING；ALABORATORY MANUAL(1982)；DNA CLONING,VOLUMES ⅠAND Ⅱ(D.N Glover ed.1985)；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS(M.J.Gait ed,1984)；Nucleic ACIDHYBRIDIZATION (B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；TRANSCRIPTION AND TRANSLATION(B.D.Hames &S.J.Higgins eds.1984)；ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney ed.1986)；IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES(IRL Press,1986)；B.Perbal,A PRACTICAL GUIDE TOMOLECULAR CLONING(1984)；the series,METHODS INENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.)；GENE TRANSFERVECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(J.H.Miller AND M.P.Calos eds.1987,Coid spring Harbor Laboratory),Methobs in Enzymology Vol.154 and Vol.155(Wuand Grossman,and Wu,eds.,respectively),Mayerand Walker,eds.(1987),IMMUNOCHEMICAL METHODS INCELL AND MOLECULAR BIOLOGY(Academic Press,London),Scopes,(1987),PROTEIN PURIFICAION:PRINCIPLES AND PRACTICE,Second Edition(Springer-Verlag,N.Y.),and HANDBOOK OF EXPERIMENTALIMMUNOLOGY,VOLUMES Ⅰ-Ⅳ(D.M.Welr and C.C.Blackwell eds 1986).
在上下文内提到的所有专利、专利申请书及出版物在此处列出，以供参考。
通过供给一族接近同源的核苷酸顺序，而这些核苷酸顺序是从存在于受HCV感染的黑猩猩的血浆内的核苷酸顺序所衍生得到的cDNA库内分离出的，这样就使本发明有效的材料和方法的实现成为可能。由于这族核苷酸既不能与未感染的人，亦不能与未感染的黑猩猩的基因组DNA杂交，而这族顺序的核苷酸仅存在于被HCV感染的黑猩猩的肝或血浆中，仅因为该顺序并不存在于Genebank中，因此，上述的核苷酸顺序族不是来源于人类或黑猩猩的。此外，此族顺序并未显示出与HBV基因组内所含有的顺序具有显著的同源性。
包含在克隆5-1-1中的该族内一个成员的顺序具有一个连续的开放读码(ORF)，后者编码一个约有50个氨基酸的多肽。被HCV感染的人体的血清含有与该多肽相结合的抗体，而未受感染的人体的血清不含有与该多肽相结合的抗体。最后，鉴于未受感染的黑猩猩的血清中不含有抗该多肽的抗体，这种抗体是在急性NANBH感染后，在黑猩猩中诱发产生的。而且，抗这种多肽的抗体不会在受HCV和HBV感染的黑猩猩和人体中检出。根据这些判据，该顺序是一种病毒的cDNA，其中所说的病毒诱发NANBH，或与NANBH相关，而该DNA顺序示于图1。如下文所述，在克隆5-1-1中的cDNA顺序与其他分离所得的cDNA顺序的不同之处在于它含有28个额外的碱基对。
cDNA族中其他被确定的成员的复合体示于图3，这些其他成员系用与克隆5-1-1中的一个cDNA片段相同的合成顺序作为探针而分离出的。cDNA族中的一个成员系用克隆81中的cDNA衍生得到的合成顺序分离的，并示于图5，该顺序与克隆81的顺序的复合体示于图6。cDNA族的其他成员，包括在克隆12f,14i,11b,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,33g,39c,35f,19g,26g和15c存在的顺序将在Ⅳ.A节中描述。在这些克隆中的cDNA的复合体将在Ⅳ.A.18节中描述，见图32。复合的cDNA表明，它含有一个连续ORF，由此编码多聚蛋白。这一描述是与下文讨论的建议相一致的，该建议意指HCV是一种黄热病病毒，或者是类似的黄热病病毒。
示于图1-32的cDNA族的可获性，便有可能组建DNA探针和多肽，这二种物质可用于诊断因HCV感染而引起的NANBH，并检查所献的血和血制品，以及输血者是否受到感染。例如，从这些顺序中可以合成约为8-10个或更多数目核苷酸的DNA寡聚体，后者可用作杂交探针，以检测在诸如怀疑带有病毒的对象的血清中是否存在病毒基因组，或用于检查所献血中是否存在病毒。cDNA顺序也使设计和生产HCV特定的多肽成为可能，后者可用作诊断剂，以诊断在NANBH期间发生的抗体存在与否。抗cDNA中衍生得到的纯化多肽的抗体也可用于检测被感染的个体和血中的病毒抗原。
对这类cDNA顺序的了解也使之能设计和生产多肽，后者可被用作抗HCV的疫苗，也可用于生产抗体，而所说抗体又可用于疾病的预防和/或治疗被HCV感染的个体。
而且，cDNA顺序族使HCV基因组的进一步特征记述成为可能。从这些顺序中衍生得到的多核苷酸探针可被用于探查cDNA库中是否存在另外的重叠cDNA顺序，后者又可被用来得到更多的重叠顺序。除了该基因组被截断，而且分割的片段缺少共同的顺序外，此种技术可用来获得整个基因组的顺序。然而，若基因组是截断的，则通过重复本文所述的用于分离cDNA克隆的λ-gt11血清筛选法，或者从纯化HCV颗粒分离基因组，可得到基因组的其他片段。
互补DNA顺序和由这些顺序衍生得到的多肽，以及抗这些多肽的抗体也可用于分离和鉴别BB-NANBV体。例如，抗包含在多肽(该多肽系从cDNA中衍生得到)中的HCV表位的抗体可被用在基于亲合色谱技术的方法中，以分离出病毒。另外，上述抗体可被用来鉴别由其他方法分离出的病毒颗粒。然后，对分离出的病毒颗粒内的病毒抗原和基因组物质可作进一步定性。
从HCV基因组的进一步定序，以及从HCV抗原的进一步定性和基因组的定性所得到的信息可使更多的探针、多肽和抗体的设计和合成成为可能，而所述的探针、多肽和抗体可用于诊断、预防和治疗由HCV引起的NANBH，以及用于筛选受到感染的血和血制品。
鉴于HCV的探针(包括抗原和抗体在内)和来自于基因组的多核苷酸(互补DNA族系从该基因组中衍生得到)的可以获得，由此推动了组织培养系统的发展，而后者在阐明HCV的生物学方面有极其重要的应用价值。而这又导致基于抗病毒化合物的新处理领域的发展，而这种抗病毒化合物能优先抑制HCV的复制和感染。
用于鉴别和分离NANBH的病原体的方法是新颖的，该法可用于鉴别和/或分离至今尚未进行特征鉴定的病原体，后者含有一个基因组，并与各种疾病有关，包括由病毒、类病毒、细菌、真菌和寄生虫。在这一方法中，cDNA库系以存在于受感染的个体中的感染组织内的核酸所产生的。所述的库在某一载体中构建，该库可使在cDNA中编码的多肽进行表达。宿主细胞克隆含有一个表达病原体中多肽的免疫反应片段的载体，该克隆通过用来自另一个体(事先用推测的病原体进行感染)的含有抗体的驱体组成部分来对上述库的表达产物进行免疫检查而选出的。免疫探查技术的步骤包括使含有cDNA之载体的表达产物与二级感染个体中驱体组成部分抗体相互作用，然后检测表达产物和二级感染个体的抗体之间是否形成抗体-抗原复合体。分离出的克隆的免疫学上的进一步筛选是通过将其表达产物分别与用推测的病原体感染的其他个体的含有抗体的驱体组织，以及未受推测病原体感染的对照个体的组织相互作用，并用未感染的个体的抗体检测是否形成抗原-抗体复合体，分离出对多肽编码的含有载体的cDNA，其中所述的多肽与受感染的个体和被怀疑是受到病原体感染的个体中的抗体发生免疫反应，但不与对照个体发生此反应。用于组建cDNA库的感染个体和用于免疫探查的感染个体不必是相同的物种。
由此种方法分离得到的cDNA和它们的表达产物，以及抗该表达产物的抗体可用于对病原体的特性鉴定和/或获得病原体。正如下文更为详细所描述的，该法已成功也用于分离从HCV基因组衍生得到的一族cDNA。Ⅱ.A互补DNA顺序的制备
来自慢性HCV感染的，并含有高效价病毒，即至少为106黑猩猩感染剂量/毫升(CID/毫升)的黑猩猩的汇集血清被用于分离病毒颗粒，从这些颗粒中分离出的核酸用作组建病毒基因组的cDNA库的模板。用于分离推测的HCV颗粒和在λ-gt11中组建cDNA库的方法将在Ⅳ.A.1节中进行讨论。λ-gt11是这样一载体，它已专门演变成将插入cDNA表达为具有β-半乳糖苷酶的融合多肽；并用由特定抗原而形成的特异性抗血清来筛选大量重组体噬菌体。为200个碱基对的cDNA的一群cDNA中产生的λ-gt11cDNA库进行筛选以寻找编码的表位，后者能专与先前患有NANB肝炎的患者所取出的血清结合(参见Huynh,T.V.et al.,1985)。在大约10个噬菌体中筛选，对得到的5个阳性噬菌体进行鉴别、提纯后，检验其是否具有与已用HCV体感染过的各种人和黑猩猩的血清结合的专一性。其中一个噬菌体5-1-1结合了被检验的8份人类血清中的5份。鉴于7名正常供血者的血清未显示出这种结合，所以此种结合似乎对从前被NANB肝炎感染过的患者中取出的血清具有选择性。
对重组噬菌体5-1-1中的cDNA顺序进行测定，并将该顺序示于图1。由该克隆cDNA编码的多肽示于核苷酸顺序上面，该多肽是在与融合多肽的N末端的β-半乳糖苷酶部分相同的转译码内。因此，该转译ORF专是编码被NANB肝炎感染患者的血清专一性识别的表位。
在重组噬菌体5-1-1中的cDNA的可获得性使含有病毒基因组的cDNA的另外区段和/或可替换的区段的其他克隆的分离成为可能。以上描述的λ-gt11 cDNA库用从克隆5-1-1 cDNA顺序所衍生得到的合成多核苷酸进行探查。探查结果产生了三种其他的克隆，分别被定名为81,1-2和91，并对包含在这些克隆内的cDNA定序(参见Ⅳ.A.3和Ⅳ.A.4节)。4个独立克隆之间的同源性示于图2，图中同源性用垂直线表示。在克隆5-1-1,81和91中特有的核苷酸顺序由小写字母表示。
在克隆5-1-1,81,1-2和91中重组噬菌体内存在的克隆cDNA是高度同源的，仅在二个区域不同。首先，在克隆1-2中的67号核苷酸是胸腺嘧啶核苷，而其他三个克隆在该位置为胞嘧啶核苷。然而，这种替代并不改变所编码的氨基酸的性质。
这些克隆之间的第二个差异是克隆5-1-1在其5′末端含有28个碱基对，而后者并不存在其他的克隆中。这额外的顺序可以是5′末端的克隆的人工产物，后者通常在cDNA法的产物中可观察到。
从克隆81的HCV cDNA内的5′区和3′区中衍生得到的合成顺序被用于从λ-gt11 NANBV cDNA库中探查和分离cDNA,该库覆盖克隆81 cDNA(参见Ⅳ.A.5节)。所产生的在克隆36和克隆32内的cDNA顺序分别示于图5和图7。
同样，基于克隆36的5′区的合成多核苷酸被用于从覆盖克隆36cDNA的λ-gt11 NANBV cDNA库中探查和分离cDNA(参见IV.A.8节)。含有与合成的多核苷酸探针杂交的重组噬菌体的cDNA的纯化克隆被称为克隆35，包含在该克隆中的NANBV cDNA顺序示于图8，
使用分离重叠cDNA顺序的技术，已得到含有另外的上游，下游HCV cDNA顺序的克隆。在以下Ⅳ.A节中对其他克隆的分离作了描述。
对分离到的克隆内编码的HCV cDNA的核苷酸顺序所进行的分析表明，复合cDNA含有一个长而连续的ORF。图26表示来自这些克隆的复合cDNA顺序，及其编码的推测的HCV多肽。
对于修补cDNA顺序的方法的描述是历来最感兴趣的事。本文提供所产生的顺序(及它们的补体)，顺序或其任何部分可用合成法或用合成法与部分顺序的修补相结合而制备得到，其中所述的部分顺序修补系采用本文所述的同样方法进行。
从HCV cDNA文库和从噬菌体5-1-1,81,1-2和91中复制得到的λ-gt11菌株已根据中国专利法的规定，保藏在中国典型培养物中心(CCTCC)，并已获得下列登记号：
    克隆名称     CCTCC保藏
    保藏号     保藏日
    λ-gt11噬菌体5-1-1     M88125     1988.11.5
    λ-gt11噬菌体81     M88126     1988.11.5
    λ-gt11噬菌体91     M99127     1988.11.5
    λ-gt11噬菌体1-2     M99128     1988.11.5
    gt11-HCVcDNA文库     M99129     1988.11.5
一俟本申请被许可和公布为美国专利后，对于得到这些保藏物的所有限制都将最终地取消，在本专利申请未决期间，按37CFR1.14和35USC1.22条款的规定而授予权利的局长所批准的人才能使用上述指明的保藏物。而且，所指明的保藏物将从保藏日期维持30年，或最后请求保藏后的5年，或者美国专利可实施的期限，总之由以上较长的一种期限而定。这些保藏物和上述提到的其他保藏物仅用于提供方便，而并不要求实施根据此处所述的本发明。在保藏物中的HCVcDNA顺序在文内一并列出，以供参改。
如上所述，对基因组进行“搜索”(walking of genome)，将重叠的cDNA顺序自HCVλ-gt-11库中分离出来，从而提供一种相应于完整的HCV基因组的cDNA的方法。然而，根据本文所提供的资料，分离这些cDNA的其他方法对于该技术领域的熟练人员来说是显而易见的。其中某些方法在以下Ⅳ.A节中进行了描述。Ⅱ.B病毒多肽和片段的制备
cDNA顺序(或者是用以下将讨论的，在图1-26中cDNA顺序分离出的任一个)，及在图1-26中的互补DNA顺序的可获性使得编码在各链中的多肽的抗原活性区的表达载体的组建成为可能。这些抗原活性区可以从外壳或被膜抗原，或者从核心抗原中衍生得到，包括诸如多核苷酸结合蛋白质、多核苷酸聚合酶，以及复制和/或组装病毒颗粒所需的其他病毒蛋白质。编码所需多肽的片段可用常规的限制性内切消化或合成法从cDNA克隆中衍生得到，并被连接到载体中，后者举例来说可含有诸如β-半乳糖苷酶或超氧化物岐化酶(SOD)(最好是SOD)之类的融合顺序的部分。用于产生含有SOD融合顺序的多肽的方法和载体在欧洲专利局公布号0196056的专利文献(1986年10月1日公布)中进行了描述。对SOD和HCV多肽的融合多肽，亦即NANBs-1-1′,NANB81＇和C100-3(它们在HCVcDNA的复合体中被编码)进行编码的载体将分别在Ⅳ.B.1,Ⅳ.B.2和Ⅳ.B.4节中进行描述。在各有义链内含有开放读码的HCV cDNA的任何所需部分能以重组多肽(如成熟或融合蛋白质)的形式获得，另外，在cDNA内编码的多肽可通过化学合成来提供。
对所需的多肽(无论其是融合型还是成熟型，也无论其是否含有可使之分泌的信号顺序)编码的DNA可被连接到适合任何合适宿主的表达载体中。真核体和原核体宿主体系目前被用于形成重组多肽，一些其他的常用控制体系和宿主细胞系的概况给出在下面Ⅲ.A节中。然后将多肽从破碎细胞或从培养基中分离出来，接着再对其提纯至预定的应用所需的程度。提纯可以采用该技术领域已知的技术进行，例如盐分级分离、在离子交换树脂上的色谱分离、亲合色谱法、离心分离等。例如可参见有关酶学方法中提纯蛋白质用的各种方法。这类多肽可作诊断剂、或者导致中和抗体的多肽可被配制成疫苗。所产生的抗这些多肽的抗体也可用作诊断剂，或用于被动免疫疗法。此外，如以下Ⅱ.J节所详述的，抗这些多肽的抗体可用于分离和鉴别HCV颗粒。
HCV抗原也可从HCV病毒粒子中分离得到。病毒粒子可在组织培养物内的HCV感染细胞中或感染的宿主中生长。Ⅱ.C抗原多肽的制备和与载体的接合
多肽的抗原区一般是比较小的，典型的长度是8至10个氨基酸，或更短。少至5个氨基酸的片段可以表示一个抗原区。这些区段可对应于HCV抗原区、因此，以HCV的cDNA为基础，编码HCV多肽的短片段的DNA可以重组体方式表达为融合蛋白或分离多肽。另外，短的氨基酸顺序可以方便地用化学合成方法得到。若合成多肽处于正确的构象，以提供正确的表位，但它太小，以致不具有免疫原性，则可将该多肽连接到合适的载体中。
一些获得这类连结的技术在该技术领域内是已知的，这包括用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基硫)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环已烷-1-羧酸酯(SMCC)(购自Pierce Company,Rockfold,Illinois)生长二硫键(若多肽无硫氢基，则可通过加入半胱氨酸残基而提供)。这些试剂在它们之间形成了一个二硫键，在一个蛋白质上半胱氨酸残基形成一个肽，以及一个通过一个赖氨酸上的ε氨基或在另一个中的其他游离氨基的酰胺键。二硫化物/酰胺生成剂的各种品种均是已知的(例如可参见Immun.Rev.(1982)62:185)。其他的双功能偶合剂系形成硫醚，而不是二硫键。这类硫醚生成剂中有许多是市场上可买到的，包括6-顺丁烯二酰亚胺酸、2-溴乙酸、2-碘乙酸、4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸等的活性酯。羧酸基可通过与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸或其钠盐相结合而活化。以上列举的并不意味是完整的，显然也可使用上述化合物的变化形式。
可以使用任何载体，只要其本身不会诱发对宿主有害的抗体的产生。合适的载体一般是大型的，代谢缓慢的大分子，如蛋白质，诸如胶乳功能化琼脂糖(latex functionalized sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素、纤维素珠之类的多糖，诸如多聚谷氨酸、多聚赖氨酸之类的多聚氨基酸，氨基酸共聚物和失活的病毒颗粒(例如可参见。D节)。特别有效的蛋白质基质是血清白蛋白、钥孔_血蓝素、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白、破伤风类毒素，以及该技术领域中熟练人员所熟知的其他蛋白质。Ⅱ.D含有HCV表位的杂种颗粒免疫原的制备
HCV表位的致免疫性可以通过下述在哺乳动物或酵母体系中进行制备而增强，其中所述的哺乳动物或酵母体系是与形成颗粒的蛋白质(例如与肝炎B表面抗原相关的)融合或组合其中NANBV表位直接与生成颗粒的蛋白质编码顺序相连结的构成物产生对于HCV表位致免疫的杂种。另外，所制备的全部载体包括HBV特有的表位在内，如前S肽，均有不同程度的致免疫性。从形成颗粒的蛋白质，包括HCV顺序在内所组建的颗粒对于HCV和HBV是致免疫的。
业已证明，肝炎表面抗原(HBsAg)在S.Cerevisiae(Valen-zuela et al.,1982)以及(例如)在哺乳动物细胞(Valenzuela,P etal.,1984)中被形成和组合成颗粒。这类颗粒的生成已被证明能增强单体亚单位的致免疫性。组合物也可包括HBsAg的免疫显性表位，后者由前S区的55个氨基酸组成(Neurath et al.,1984)。可在酵母中表达的前S-HBsAg颗粒的组合物业已在1986年3月15日公布的欧洲专利174,444中进行了揭示。包括对于酵母表达的不同的病毒顺序的杂种，业已在1986年3月26日公布的欧洲专利175,261中进行了揭示。以上两篇专利申请均被转让给本文的受让人，此处引用仅供参改。这类组合物也可使用SV40-二氢叶酸还原酶载体(Michelle et al.,1984)，在诸如中国仓鼠卵巢细胞之类的哺乳动物细胞中被表达。
此外，形成颗粒的蛋白质编码顺序的一部分可用编码HCV表位的密码子替换。在这种替换中，不需要在酵母或哺乳动物中作为引起单体聚集而形成致免疫颗粒的媒介物的区域可被删除，由此消除了其他的HBV抗原位点与HCV表位的竞争。Ⅱ.E疫苗的制备
从HCVcDNA中衍生得到的一种或一种以上的致免疫多肽，以及从图1-32中的cDNA，或者从疫苗所对应的HCV基因组均可制备疫苗。所观察到的存在于HCV及黄热病毒之间的同源性涉及可能是作为疫苗最为有效的多肽的信息，同时也提供了涉及编码它们的基因组的区域方面的信息。关于黄热病毒基因组的一级结构在《Rice》(1986)等上曾作过讨论。据信，黄热病毒基因组RNA为唯一的病毒专一性mRNA种，并转译为三个病毒结构蛋白，即C、M及E，同时也产生两个大的非结构蛋白，NV4及NV5，及一组复杂的较小的非结构蛋白。已经搞清黄热病毒的主要中和表位存在于E(外壳)蛋白(Roehrig(1986))上。依据与黄热病毒的同源性可以预计相应的HCVE基因及多肽编码区域。因而，疫苗可以包括含HCVE表位的重组体多肽。这些重组体可以在细菌、酵母、或哺乳动物细胞中表达，或者亦可分离自病毒制剂。人们还期望另外的结构蛋白同样含有可引起保护性抗-HCV抗体的表位。因此，在HCV疫苗中含有E、C及M的表位的多肽可能也被单独或联合应用。
除上述之外，还发现用NS1(非结构蛋白1)进行的免疫作用，可导致抗黄热病(Schlesinger等人)(1986)。尽管该免疫作用不能产生中和抗体，但这一点是确实无疑的。由于这种蛋白看似高度密集于黄热病毒中，看来HCV NS1也同样具有抗HCV感染的保护作用。此外，还发现非结构蛋白可能也具有抗病毒致病性的保护作用，尽管它们并不产生中和抗体。
鉴于上述事实，抗HCV的多价疫苗可以包括一种或多种结构蛋白，及/或一种或多种非结构蛋白。这些疫苗可以包括，例如，重组体HCV多肽及/或自病毒粒子分离的多肽。另外，也许还可在疫苗中利用灭活的HCV；灭活过程可以利用病毒胞解物或其它的本技术所了解的方法使黄热病毒灭活，例如，用有机溶剂或去垢剂，或福尔马林进行处理。此外，疫苗也可从减毒的HCV株来制备。减毒的HCV株的制备叙述在下。
已知黄热病毒中的一些蛋白含有高度密集的区域，因而，可期望在HCV及其它黄热病毒之间进行免疫交叉反应。也许在黄热病毒及HCV之间共有的表位，可产生抗一种或多种由这些致病原引起的疾病的保护性抗体。由此，依据这一知识也许可以设计出多种目的的疫苗。
含有致免疫的多肽作为活性组分的疫苗的制备方法对该技术领域内的熟练人员是公知的。通常，是将这类疫苗制备成溶液或悬浮液状态的可注射剂，也可将其制备成适用于在注射前溶解于或悬浮在液体中的固态形式。这类制剂也可以成乳化状，或者蛋白质被封裹在脂质体中。活性的致免疫组分常与药学上可接受的，并与活性组分相容的赋形剂相混合。合适的赋形剂可列举出水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，或它们的组合物。此外，根据需要，疫苗中可含有少量辅助物质，如可湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，和/或能增强疫苗功效的佐剂。可能有效的佐剂例子包括(但不限于)氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称作为正MDP)、H-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)和RIBI，后者含有从细菌中提取的三种组分，即一磷酰基类脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL＇TDM＇CWS)，并都置于2％的角鲨烯/Tween 80的乳化液中。佐剂的功效可以通过测定施用了疫苗(该疫苗也含有各种佐剂)中此种多肽后所产生的直接抗含有HCV抗原顺序的致免疫多肽的抗体的量来确定。
疫苗通常是通过注射(例如皮下注射或肌内注射)的方式，非肠道施用的。适合于其他施用方式的另外制剂包括栓剂，和(在某些情况下)口服制剂。对于栓剂来说，常规的粘结剂和载体可包括聚(亚烷基)二醇或三甘油醇，这类栓剂可以由活性组分的含量为0.5％-10％，最好为1％-2％的混合物制成。口服制剂包括这类通常所用的赋形剂，如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、钠糖精、纤维素和碳酸镁等。这些组合物可以是溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放的制剂或粉剂形式，并含有10％-95％的活性组分，最好是含有25％-70％的活性组分。
蛋白质可被配制成中性或盐的形式的疫苗。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基所形成的)，系与盐酸或磷酸之类的无机酸，或与诸如乙酸、草酸、酒石酸和马来酸之类的有机酸所形成的。Ⅱ.F疫苗的剂量和施用
疫苗可以按与剂量处方相符合的方式施用，其施用的量应达到预防和/或治疗的效用。根据被处理的对象，对象的免疫系统的能力，以及所需保护的程度，所施用的疫苗量一般是每一次剂量为5微克至250微克抗原的范围内。所需施用的活性组分的精确量可根据医师的判断而定，可以因每一对象而异。
疫苗可以按单一剂量的安排方式给予，或者最好是以多次剂量安排的方式给予。多次剂量的安排是这样的，其中接种的主要过程可以是用1-10次的单独剂量，然后在需要维持和/或增强疫苗应答的其后的时间间隔中给于其他的剂量，例如对于第二次剂量在1-4月，根据需要，其后的剂量是在几个月后给予。剂量制度至少部分地也将由个体的需要而决定，并取决于医师的判断。
此外，含有致免疫HCV抗原的疫苗可以与其他免疫调节剂，如免疫球蛋白结合施用。Ⅱ.G抗HCV表位的抗体的制备
按上述方法制备得到的致免疫多肽被用于产生多克隆和单克隆的抗体。若需要多克隆抗体，可将选出的哺乳动物(例如鼠、兔子、山羊、马等)用带有HCV表位的致免疫多肽进行免疫。收集免疫动物的血清，并按已知方法处理。若含有抗HCV表位的多克隆抗体的血清中存在抗其他抗原的抗体，则可用免疫亲合层析法对该多克隆抗体进行提纯。用于产生和处理多克隆抗血清的技术对该技术领域是公知的(例如可参见Mayer和Walker.1987)。
另外，多克隆抗体可从以前已被HCV感染过的哺乳动物中分离得到。在V.E节中描述了一个提纯感染个体的血清中的抗HCV表位的抗体的例子，它是基于亲合层析法，并使用了SOD的融合多肽和在cDNA克隆5-1-1内编码的多肽。
直接抗HCV表位的单克隆抗体也可以由该技术领域的熟练人员方便地制备。用杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是熟知的。永久性产生抗体的细胞系可由细胞融合产生，也可由其他技术产生，如用致瘤的DNA直接转化B淋巴细胞，或用EB病毒进行转染(例如可参见M.Schreier et al.,(1980)；Hammerling et al.,(1981)；Kennett et al.,(1980)；see also,U.S.Patent Nos.4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,466,917；4,472,500；4,491,632 and 4,493,890)。可对所产生的一些抗HCV表位的单克隆抗体检查它们的各种性质，如同型、表位亲和力等。
直接抗HCV表位的单克隆抗体和多克隆抗体在诊断方面特别有用，而中性抗体在被动免疫治疗方面是有用的。单克隆抗体特别可用于增高抗个体基因型的抗体。
抗个体基因型的抗体是免疫球蛋白，后者携带需要防护的传染体抗原的“内像”(例如可参见Nisonoff,A.,et al.,1981和Dreesman et al.,1985)。
增强抗个体基因型抗体的技术在该技术领域中是已知的(例如可参见Grzych,1985,Mac Namara et al.,1984和Uytdehaag etal,1985)。这类抗个体基因型抗体也可用于治疗NANBH，以及用于解释HCV抗原的致免疫区。Ⅱ.H．用于诊断的寡核苷酸探针和药盒
将包括图1-32中的那部分cDNAs在内的分离出来的HCVcDNAs的已知部分作为基础，通过切除或合成的手段，可以制备接近8个或更多个核苷酸的寡聚物，它们与HCV基因组杂交，可用于识别病毒试剂，鉴别病毒基因组的其他特性以及检测在致病个体中的病毒。用于检测HCV多核苷酸(天然的或衍生的)的探针需要一定的长度以便于能够通过杂交而检测特异的病毒顺序。6-8个核苷酸是能工作的长度，10-12个核苷酸的顺序是较佳的，而约20个核苷酸的顺序则是最佳的。这些顺序最好从缺少异源性的区域中衍生出来。这些探针可以采用包括寡核苷酸自动合成方法在内的常规方法来制备。有用的探针包括诸如克隆5-1-1和这里所揭示的其他克隆，以及下面所提出的用于探查cDNA的各种寡聚物。与HCV基因组的任何特异部分相互补都可以。当用作为探针时，完全互补是最好的，尽管随着片段的长度增加并不必需完全互补。
当将这种探针用于诊断时，如果需要的话，欲分析的生物样品，如血液或血清要进行处理以提取包含于其中的核酸。从样品中得到的核酸要进行凝胶电泳或其他分离大小的技术处理；或者核酸样品也可以进行点印迹而无需分离大小。然后将探针“打上”标记。合适的标记和对探针进行标记的方法是该技术领域中已知的，例如，通过切口转移或激酶掺入的放射性标记物，生物素、荧光探针和化学发光探针。然后，在相应的严密的杂交条件下，用标记的探针处理从样品中提取出来的核酸。
可以将探针制成与HCV基因组完全互补。因此，为了避免假象出现，通常十分严格的条件是所需要的。但是，如果探针与缺少异源性的病毒基因组是互补的，则只能使用十分严格的条件。杂交的严格程度是通过杂交和洗涤过程中的许多因素，包括温度、离子强度、时间长短和甲酰胺的浓度来确定的。这些因素业已概述过了，如Mania-tis T．(1982)。
通常，人们估计在受感染的个体的血清中，HCV基因组顺序将以相对较低的水平存在，即以约102-103顺序/ml的浓度存在。在杂交分析中，该水平可能需要使用放大技术。这种技术是该技术领域中已知的。例如，EnZo生物化学公司的“生物桥”(“Bio-Bridge”)系统使用末端脱氧核苷酸转移酶给DNA探针加上未经修饰的3′-多聚胸苷尾巴。将有多聚胸苷尾巴的探针先与靶核苷酸顺序杂交，然后再与生物素修饰的多聚腺苷杂交。第84103520号PCT申请和EPA124221描述了DNA杂交分析，其中：(1)将被测物与单链DNA探针退火，该探针与一段酶标记寡核苷酸互补，(2)将所得到的有尾的复合体与酶标记的寡核苷酸杂交。EPA204510描述了DNA杂交分析，其中被测DNA与有尾的(如多聚胸苷尾巴)的探针相接触，一条具有与探针的尾巴相杂交的顺序(如多腺苷酸顺序)的放大链，该链可与多个标记的链结合。特别需要的技术首先包括将在血清中的靶HCV顺序放大约10,000倍，即约放大到每毫升106个顺序。这些可以通过Saiki等(1986)的技术来完成。然后，可采用在美国共同申请(Attorney Docket No.2300-0171,1987年10月15日提出，转让给这里的受让者，由此以列入参考文献中)中所描述的杂交分析来测定放大的顺序。该杂交分析可检测每毫升106水平的顺序，它采用可与单链被测核苷酸结合，或也可与多个标记的单链寡核苷酸结合的核酸聚合物。合适的溶液相夹层分析可以与标记的多核苷酸探针一起使用，制备探针的方法已在EPO225,807(1987.6.16公开)中描述了(它已转让给这里的受让者，它在这里被列为参考)。
探针可以包装到诊断药盒内。诊断药盒包括被标记或者未被标记的探针DNA，而标记用的成份可能包含于药盒中。药盒也可包含其它适合于包装的试剂和特定的杂交方法所需要的材料，例如：对照和进行试验的指导书。Ⅱ.I．免疫分析和诊断药盒
能够与含有HCV抗体的血清进行免疫反应的多肽，如在第Ⅳ.A．章节中描述的克隆以及它们的其它组合克隆中衍生或编码的那些(见第Ⅳ.A．章节)，及在这些多肽中抗HCV特定的表位的抗体(例如，可见第Ⅳ.E．章节)在免疫分析中可用于测定生物样品(如血液或血清)中HCV抗体的存在或病毒和/或病毒抗原的存在。免疫分析设计受大量各种因素影响，这些因素中许多是该技术领域中已知的。例如，免疫分析可使用一个病毒抗原，如第Ⅳ.A章节中描述的含有HCV cDNA的任何克隆中衍生出来的多肽，或从这些克隆的cDNAs中衍生的cDNAs组合物中得到的多肽，或可从产生这些克隆中cDNAs的HCV基因组中所得到的多肽；或者，免疫分析也可以使用从上述来源中衍生的病毒抗原的混合物。例如，它可使用一个直接抗病毒表位的单克隆抗体，直接抗一个病毒抗原的单克隆抗体的组合物，直接抗不同病毒抗原的单克隆抗体、直接抗相同病毒抗原的多克隆抗体或直接抗不同病原抗体的多克隆抗体。例如，试验方法基于竞争、或直接反应，或夹层型分析。而试验方法也可使用，如固体载体，或免疫沉淀。大多数分析都需要使用标记的抗体和多肽；标记可以是，例如：荧光的、化学发光的、放射性的或染料分子。放大得自探针的信号的分析也是已知的；例如采用生物素和抗生物素蛋白的分析，以及酶标和介导性的免疫分析，如ELISA分析。
HCV的黄病毒模型使人们可以预言病毒颗粒结构蛋白的诊断表位。C、pre-M、M和E结构域均可能包含可用于检测病毒抗原，尤其是用于诊断的有意义的生物势的表位。相似地，非结构蛋白质的结构域可能含有重要的诊断表位(例如，编码假定的聚合酶的NBS；和编码假定的互补结合的抗原的NSI)。包括这些特异结构域的表位的重组多肽或病毒多肽可能可用于在受感染的血供体和受感染的病人中检测病毒抗体。
此外，在免疫分析中，直接抗E和/或M蛋白质的抗体可用于检测在带有引起NANBH的HCV的病人体中和在受感染的血供体中的病毒抗原。更进一步地，这些抗体对于急性期供体和病人的检测是极有用的。
适用于免疫诊断和含有合适的标记试剂的药盒包括有关的材料，如：置于一个合适的容器中的含有HCV表位的本发明的多肽或直接抗HCV表位的抗体，及保留的试剂和进行分析所需的材料，以及一份实验指导书。Ⅱ.J．用来自病毒基因组的cDNA衍生的探针对HCV基因组、病毒颗粒和病毒抗原的进一步定性
包括如图1-22中所示的，在Ⅳ.A章节中描述的克隆中的HCVcDNA顺序的信息可用于进一步地了解HCV基因组的顺序，及识别和分离HCV病毒的信息，以便于进一步了解它的一些特性，包括基因组的性质、病毒颗粒的结构和所组成抗原的性质。换句话说，该信息可以导致其它的多核苷酸探针、来自HCV基因组的多肽和直接抗HCV表位的抗体，该抗体可用于由HCV引起的NANBH的诊断和治疗。
在上述的克隆中的cDNA顺序的信息对于用于分离来自HCV基因组尚未确定的区域中其它cDNA顺序的探针的设计是有用的，在Ⅳ.A．章节中描述的克隆中的cDNA是从该HCV基因组中衍生出来的。例如，在图1,3,6,9,14和22中所显示的从靠近HCV cDNA顺序的族的5′-末端或3′末端的区衍生出来的含有约8或更多个核苷酸、较佳为20个或更多个核苷酸的标记的探针可用于从HCVcDNAs库中分离互相重叠的cDNA顺序。该顺序含有与上述克隆中的cDNA互相重叠的顺序，但是也含有基因组的其它区域，上述克隆中的cDNA不是从这些区域中产生的，该顺序可用于合成用于识别其它互相重叠片段的探针，这些片段与Ⅳ.A章节中所描述的克隆不一定互相重叠。除非HCV基因组被截断，且产生的片段缺乏共同的顺序，利用分离从病毒基因组中衍生出来的互相重叠的cDNA的技术来测定整个病毒基因组顺序是可能的。但是，尽管这是不可能的，但如果基因组是缺乏共同顺序的片段的基因组，则基因组的顺序可以通过血清学地筛选λ-gtll HCV cDNA库而检测，如将Ⅳ.A章节中描述的克隆的分离和测序的技术用于分离克隆5-1-1，测分离到的cDNA顺序和采用分离的cDNAs来分离互相重叠的片段。换句话说，基因片断的特征可以是从由纯化的HCV微粒分离出来的病毒基因组中得到的。用于纯化HCV病毒颗粒和在纯化过程中检测它们的方法在本文的下面进行了描述。用于从病毒颗粒中分离多核苷酸基因组的方法是现有技术中已知的，可以采纳的一种方法显示于实例Ⅳ.A.1中。然后，将分离的基因片段克隆和测序。因此，根据这里所提供的信息，克隆和测定HCV基因组顺序而不考虑它们的性质是可能的。
用于构造cDNA库的方法是现有技术中已知的，并在上面讨论了；用λ-gt11构造HCV cDNA库的方法将在下面的Ⅳ．A章节中讨论。但是，用核酸探针筛选时用的cDNA库也可以用已有技术中已知的其它载体，如λ-gt10[Huynh等(1985)来构造。通过从图1-32的cDNAs衍生出来的探针和从这些cDNAs衍生的多核苷酸合成的探针来检测的HCV衍生的cDNA可以通过用合适的限制酶(一个或多个)消化分离的多核苷酸而从克隆中分离出来并测序。例如，可参见Ⅳ.A.3和Ⅳ.A.4两个章节，它们描述了用于分离和测定与克隆5-1-1的HCV cDNA互相重叠的HCV cDNA的顺序的技术，而Ⅳ.A.5-Ⅳ.A.7中则描述了与克隆81中的HCVcDNA互相重叠的HCV cDNA的分离和测序，Ⅳ.A.8和Ⅳ.A.9章节中描述了与克隆81互相重叠的另一克隆(克隆36)的分离和测序。
从这些互相重叠的HCV cDNAs中衍生的顺序信息可用于测定病毒基因组中的同源性和异源性区域，它可表示出基因组中不同菌株和/或缺陷颗粒的群体的存在。它也可以用于设计杂交探针，以采用在Ⅱ.G章节中所描述的技术来测定在生物样品中，和在HCV分离过程中(后面将讨论)的HCV或HCV抗原或HCV核酸。更进一步地，互相重叠的cDNAs可用于建立表达从HCV基因组衍生的多肽的载体，所述HCV基因组也编码在克隆5-1-1,36,81,91，和1-2以及在Ⅳ.A章节中所描述的其它克隆中编码的多肽。建立含有HCV表位的这些多肽的技术，和直接抗HCV表位抗体的技术以及它们的使用均相似于对于从包含于前面和后面讨论的克隆5-1-1,32,35,36,1-2,81,91中的NANBV cDNA顺序衍生的多肽的描述。
克隆5-1-1,32,35,36,81,91,1-2和Ⅳ.A章节中所描述的其他克隆中的cDNA顺序族编码了含有对于HCV专一的表位的抗原；即，在用HAV或HBV感染的个体中，以及没有被HCV感染的个体中不存在直接抗这些抗原的抗体(见Ⅳ.B章节中所显示的血清数据。更进一步地，将这些cDNAs的顺序信息与HAV、HBV、HDV的顺序以及基因“银行”中的基因顺序的比较指示出在这些cDNAs和这些来源的多核苷酸顺序之间存在最小的同源性。因此，可直接抗在这些克隆的cDNAs中编码的抗原的抗体可用于识别从感染的个体中分离出来的BB-NANBV颗粒。此外，它们也可用于分离NANBH病毒。
通过任何已有技术中已知的方法，例如：以识别大小为依据的技术(如沉积或除去的方法)，或以密度法为依据的技术(如密度梯度超离心法)，或采用作用剂(如聚乙二醇)的沉淀法，或借助各种材料，如阴离子或阳离子交换材料和可借助疏水性而进行连接的材料以及亲和性的层析柱的色谱法，HCV颗粒可以从BB-NANBV感染的个体的血清中或从细胞培养物中分离出来。在分离过程中，HCV的存在可以通过抽提出的基因组的杂交分析而检测。采用从上面所描述的HCV cDNAs所衍生的探针，或通过使用直接抗在图1-32中所显示的cDNA顺序的族中所编码的HCV抗原、或也使用直接抗在上面所描述的互相重叠的HCV cDNA顺序中编码的HCV抗原的抗体作为探针的免疫分析而测定。抗体可以是单克隆的，也可以是多克隆的，在用于免疫分析前先纯化抗体可能是需要的。在Ⅳ.E章节中描述了直接抗克隆5-1-1中编码的抗原的多克隆抗体的纯化过程；对于直接抗其他HCV抗原的抗体可以采用相似的纯化过程。
将直接抗在图1-32中所显示的cDNAs族中编码的HCV抗原、以及在互相重叠的HCV cDNAs中编码的抗原的抗体固定于固相载体上，则它们可用于通过免疫亲和色谱法分离HCV。免疫亲和色谱法的技术是已有技术中已知的，包括将抗体固定于固相载体上以使它们保留它们的免疫选择活性的技术；也可以是这些技术，即：将抗体吸附于载体上(例如，参考Kurstak“Enzyme immunodiagnosis”,31-37)，以及将抗体共价连接到载体上。总的说来，这些技术与所用的在Ⅱ.C章节中描述的抗原共价连接至固相载体上的技术相似；但是，空间基团可能包含于双官能偶合剂中，这样，抗体的抗原结合位点保持易结合状态。
在纯化过程中，HCV的存在可以通过采用从图1-32中所显示的HCV cDNA顺序族或从前述的互相重叠的HCV cDNA顺序中衍生的多核苷酸作为探针的核酸杂交而检测或证实。在这种情况下，在能引起病毒颗粒分裂的条件下处理组分，例如，在螯合剂存在下用界面活性剂处理，且病毒核酸的存在采用Ⅱ.H．章节中所描述的杂交技术测定。分离了的颗粒是诱导HCV的成分进一步的证实可以通过用分离了的病毒颗粒感染黑猩猩，然后测定是否由感染而引起NANBV症状而获得。
然后，可进一步表示纯化制备得的病毒颗粒的特征。基因组的核酸已经进行了纯化。根据它对于核糖核酸酶敏感，而对于DNA酶不敏感，即显示了病毒是由RNA基因组组成的。见后面的实例Ⅳ.C.2.。采用现有技术中已知的技术，例如，通过电子显微镜进行肉眼观察，或在密度梯度中移动和沉积特性可以确定它是线状和环状或非环状。根据所控制的HCV基因组可以与HCVcDNAs的负链杂交，可以看到HCV可能包含RNA基因组正链(见Ⅳ.H.1章节)。这种技术在例如，《酶法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)中业已进行了描述。此外，纯化的核酸可以通过已知的技术(包括反转录等)进行克隆和测序，因为基因组材料是RNA。例如，可参考Ma-niatis(1982)和Glover(1985)。利用从病毒颗粒中衍生的核酸，测定整个基因组顺序是可能的，而不管它是不是片段的。
检查通过39c(见图26)而得到的组合克隆14i的连续ORF中编码的多肽的同源性，显示出HCV多肽含有与黄病毒蛋白保守区的相应蛋白质同源的区域。它的一个实例在Ⅳ.H.3章节中进行了描述。该发现具有很多重要的结果。第一，将该事实与表明HCV包含大小约为10,000个核苷酸的正链基因组的结果相联系，表明它与HCV是一种黄病毒或类黄病毒的设想是一致的。一般说来，黄病毒的病毒体和它们的基因组具有相对一致的结构和组织，它们是已知的。见Rice等，(1988)和B rinton,M.A.(1988)。因此，编码多肽C,pre-M/M和E的结构基因可能固定于克隆14i的基因组上游的5′末端。更进一步地，可以通过与其他黄病毒的比较，而预先确定编码这些蛋白质的顺序的精确的位置。
在克隆14i中上游顺序的分离可以通过这里所给出的信息中的几种方法来达到，这对于该技术领域的普通技术人员来说是明显的。例如，基因组“移动”(Walking)技术可用于分离5′到克隆14i中，但与该克隆互相重叠的那些顺序；这样依次导致了其他顺序的分离。该技术将在下面的Ⅳ.A章节中进一步论证。例如，人们也已知道黄病毒具有保守的表位和保守的核酸顺序区域。含有保守的顺序的多核苷酸可以用作为结合HCV基因组的探针，这样，就使其可以分离。此外，采用聚合酶链反应技术，这些保守的顺序与从图22所显示的HCV cDNAs衍生的顺序一起，可用于设计在放大克隆14i的上游基因组顺序的系统中有用的引物。它的一个实例将在下面描述。
HCV的结构可以被测定，且它的组分可以分离。例如，其形态和大小可以用，例如电子显微镜来检测。特异病毒多肽抗原(如外壳或外膜抗原)或内抗原(如核酸结合蛋白质)、核心抗原和多核苷酸聚合酶的识别和位置也可以测定，例如，测定抗原是否以主要或次要病毒组分存在，以及采用直接抗分离的cDNAs中编码的特定抗原的抗体作为探针。该信息可用于设计疫苗，例如，较佳地是将一外抗原包含于疫苗制剂中。多价疫苗可以含有，如从编码结构蛋白质的基因组衍生的多肽，如E以及得自基因组的其它部分的多肽，如非结构的或结构的多肽。Ⅱ.K．用于HCV复制的细胞培养系统和动物模型系统
HCV是一种黄病毒或类黄病毒的设想也提供了使HCV生长的方法的信息。术语“类黄病毒”意指该病毒与已知的黄病毒的保守区具有很大的同源性，且其主要的基因组是单个ORF。培养黄病毒的方法是该技术领域的技术人员共知的(例如，可参考(Brinton等人的综述(1986)。通常，培养HCV的合适细胞或细胞系可以包括已知的能支持黄病毒复制的那些，如下面的那些：猴肾细胞系(如MK,uFRO)；猪肾细胞系(如PS)；幼仓鼠肾细胞系(如BHK)；鼠类巨噬细胞系(如P388 D1、MK1、Mml)；人体巨噬细胞系(如u-937)；人体外周血液白细胞；人体粘连单细胞；肝细胞或肝细胞系(如HuH7,HepG2)；胚胎或胚胎细胞(如鸡胚成纤维细胞)；或从无脊椎动物，较佳是从昆虫中得到的细胞系(如果蝇细胞系)，或较佳地是从节肢动物得到的细胞系，如蚊子细胞系(如A.Albopictus,Aedex孢子虫； Cutex tritaeniorhynchus)或蜱细胞系(如RME-14革蜱parumapertus)。
培养先前所述的肝细胞，然后用HCV感染它是可能的；或者，肝细胞培养物从受感染个体(如人或黑猩猩)的肝中取得。后者是通过体外传代并在体内感染的细胞的一个例子。此外，各种传统的方法可用于从肝细胞培养物中获得细胞系。例如，先前的肝培养物(在肝细胞群加营养前和后的)可溶融到各种细胞中以维持稳定性。例如，培养物也可以被转化的病毒感染，或用转化的基因转染以建立永久的或半永久的细胞系。此外，如在肝培养物中的细胞可溶融到所建立的细胞系(如HepG2)中。用于细胞溶融的方法是该技术领域已知的，例如，使用溶融试剂，如聚乙二醇，Sendai病毒和E-B病毒(非洲淋巴细胞瘤病毒)。
如上所述的，HCV是一种黄病毒或类黄病毒。因此，通过该技术领域已知的用黄病毒感染细胞的技术进行细胞系的HCV感染是可能的。例如，它们包括，在病毒可进入细胞的条件下，用病毒制剂培养细胞。此外，通过用分离的病毒多核苷酸转染细胞来获得病毒制剂也是可能的。业已知道，披盖病毒和黄病毒RNAs对于各种脊椎动物细胞系(Pfefferkorn和Shapiro(1974))，和蚊子细胞系(Peleg(1969))是有感染性的。用RNA复合物、正链RNAs和DNAs(包括cDNAs)来转染组织培养细胞是该技术领域中已知的，例如，可包括使用电处理(electroporaion)；用DEAE-Dextran或磷酸钙沉淀的技术。通过在体外转录与完全基因组相应的HCVcDNA可以获得丰富的HCVcDNA源。用该物质或用克隆的HCVcDNA转染会引起病毒复制和体外病毒繁殖。
除培养的细胞以外，动物模型系统可以用于病毒复制；动物系统中的黄病毒是该技术领域的普通技术人员共知的(例如，可参考Monath的综述(1986))。这样，HCV复制不仅发生于黑猩猩中，而且还可发生于其他动物，如土拨鼠和幼鼠中。Ⅱ.L．抗HCV的抗病毒试剂的筛选
细胞培养物和动物模型系统对于HCV的有效性使人们能够筛选可抑制HCV复制的抗病毒试剂，尤其是可筛选这些试剂，这些试剂在抑制病毒复制时，可优先地允许细胞生长和繁殖。这些筛选方法是该技术领域的普通技术人员周知的。通常，采用各种浓度的抗病毒试剂来试验它们在支持病毒复制的细胞培养系统中防止病毒复制和以后在动物模型系统中抑制感染或病毒繁殖(和低水平毒素)的效果。
这里所提供的用于检测HCV抗原和HCV多核苷酸的方法和组成可用于筛选抗病毒试剂，其中也提供了可选择的，可能比细胞空斑试验分析更灵敏的手段，以检测病毒复制中试剂的效果。例如，这里所描述的HCV-多核苷酸探针可用于定在细胞培养物中所产生的病毒核酸的量。例如，这可以通过将感染的细胞核酸与标记的HCV-多核苷酸探针杂交或竞争杂交而进行。例如，使用这里所描述的免疫分析法，抗HCV抗体也可以用于在细胞培养物中的HCV抗原的定性和定量，此外，因为竞争分析时，在受感染的细胞培养物中HCV抗原的定量是需要的，所以，这里所描述的在HCV cDNAs中编码的多肽在这些竞争分析中是有用的。通常，从HCV cDNA中得到的重组HCV多肽被标记，因为在细胞培养系统中产生抗原，对于这个标记的多肽与HCV多肽的结合的抑制进行了监控。更进一步地，当HCV在细胞系中复制而不引起细胞死亡时，这些技术是尤其有用的。Ⅱ.M．HCV的弱毒菌株的制备
除了上述的以外，采用组织培养系统和/或动物模型系统，就有可能分离HCV的弱毒菌株。这些菌株适用于疫苗或病毒抗原的分离。多次传代后，在细胞培养物和/或动物模型中弱毒的菌株是可以分离的。采用现有技术中已知的方法可以进行在受感染的细胞或个体中的弱毒菌株的测定，例如，可以包括作为探针的HCV中编码的一个或多个表位的抗体的使用或作为探针的含有至少约8个核苷酸的HCV顺序的多核苷酸的使用。或者，另外的情况为，弱毒菌株可以采用这里所提供的HCV的基因组信息和重组技术而构造。通常，人们希望缺失基因组中编码与致病因子相关，而又允许病毒复制的多肽区域。此外，基因组结构应可以表达能够使HCV的抗体失效的表位。然后，改造过的基因组可用于转化允许病毒复制的细胞，且细胞在病毒可复制的条件下生长。弱毒HCV菌株不仅可用于疫苗，而且也可以作为病毒抗原的商业制品的来源，因为这些病毒的生产对于病毒生产和/或病毒产品生产中的雇员来说，不需要很严格的保护措施。Ⅲ．通常的方法
从病毒中抽提基因组、制备和探查cDNA库、测克隆的顺序、构造表达载体、转化细胞、进行诸如放射免疫分析和ELISA分析的免疫分析、使细胞在培养物中生长等一般技术是现有技术中已知的，实验室手册详细地描述了这些技术。但是，作为一般的指导，下面提出了一些可有效地用于这些过程的方法和可用于进行这些过程的材料。Ⅲ.A．宿主和表达控制顺序
当与所指定的宿主相容的合适的控制顺序被使用时，原核和真核宿主细胞均可用于表达所需要的编码顺序。原核宿主中，大肠杆菌是最常使用的。原核细胞的表达控制顺序包括启动子，较佳地是还含有操纵基因部分和核糖体结合位点。与原核宿主相容的转移载体通常是从诸如pBR322一种含有载有氨苄青霉素和四环素抗性的操纵子的质粒中衍生出来的，和含有提供抗生素抗性标记的顺序的各种pUC载体。这些标记可用于筛选时获得成功的转化体。通常所使用的原核控制顺序包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等人，(1977))。色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，(1980))和λ-衍生PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shinatake等人(1981))和从trp和lac UV5启动子的顺序中衍生的杂合tac启动子(De Boer等人(1983))。前面的系统与大肠杆菌是十分相容的；如果需要的话，其他原核宿主，如具有相应的控制顺序的芽孢杆菌或假单孢菌的菌株也可以使用。
真核宿主包括在培养系统中的酵母和哺乳动物的细胞。啤酒酵母和卡氏酵母是最常用的酵母宿主，也是合适的真菌宿主。酵母相容载体携带标记，通过提供原营养给营养缺陷型突变株或给野生型菌株提供抗重金属抗性，所述的标记就可以选择成功的转化体。酵母相容载体可以采用2微米的复制起点(Broach等人(1983)),CEN3和ARS1的结合体或可保证复制的其他手段，如会引起将合适的片段插入宿主细胞基因组的顺序。酵母载体的控制顺序是现有技术中已知的，它包括合成糖酵解酶的启动子(Hess等人(1968)；Holland等人(1978))，其中包括了磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitznen(1980))。还可能包含终止子，如从烯醇化酶基因中衍生的终止子(Holland(1980))。尤其有用的控制系统是包含3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)启动子或乙醇脱氢酶(ADH)可调节的启动子、也是从GAPDH衍生出来的终止子。如果需要分泌，则还可包含来自酵母α因子的前导顺序。此外，可操纵连接的转录调节区和转录启动区可以不是野生型中天然的相关状态。这些系统已在EPO120,551(1984年10月3日公开)；EPO116,201(1984年8月22日公开)；和EPO164,556(1985年12月18日公开)中详细描述了，它们均转让给了本受让者(发明人)，这里均列为参考。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是现有技术中已知的，它包括可从美国典型培养物中心(ATCC)中得到的很多永存的细胞系，其中包括He La细胞、中国大田鼠卵巢(CHO)细胞系、幼鼠肾(BHK)细胞和许多其他的细胞系。与哺乳动物细胞适应的启动子也是现有技术中已知的，包括病毒启动子，如猿猴病毒40(SV40)(Fiers(1978))、罗氏肉瘤病毒(RSV)、腺病毒(ADV)和牛乳头状瘤病毒(BPV)的启动子。哺乳动物细胞还需要终止顺序和多聚腺苷酸附加顺序；可增强表达的增强子顺序也可包含在内，和能导致基因放大的顺序也是需要的。这些顺序均是现有技术中已知的。适于在哺乳动物细胞中复制的载体包括病毒复制子或能保证将相应的编码NANBV表位的顺序整合进宿主基因组中的顺序。Ⅲ.B．转化
转化是采用任何已知的方法将多核苷酸引入宿主细胞，包括，如将多核苷酸包装入病毒，通过直接摄入多核苷酸的方法用该病毒转导宿主细胞。所用的转化过程取决于欲转化的宿主。例如，用含有BB-NANBV顺序的λ-gtll转化大肠杆菌宿主细胞将在下面的实例中讨论。通过直接摄入的细菌转化通常采用氯化钙和氯化铷的处理方法(Cohen(1972)； Maniatis(1982))。直接摄入的酵母转化可采用Hinnen等(1978)的方法而进行。直接摄入的哺乳动物的转化可以采用Graham和Van der Eb(1978)的磷酸钙沉淀法或各种已知的修饰法来进行。Ⅲ.C.载体构造
载体构造采用现有技术中已知的技术。采用一合适的限制酶，通常在这些商业可购得的酶的制造商指定的条件下进行专一位点的DNA裂解。通常，1个单位的酶于20微升缓冲液中，在37℃培养1-2小时，可切开约1微克质粒或DNA顺序。用限制性内切酶保温后，蛋白质通过用苯酸/氯仿抽提而去除，DNA用乙醇沉淀而复得。根据《酶学》(Enzymology)(1980)65:499-560中所揭示的一般的方法，裂解后的片段可采用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳技术而得以分离。
在合适的脱氧核苷三磷酸(dNTPs)存在于混合物中的情况下，采用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(Klenow)可以使裂解片段的粘性末端变为钝化末端。也可用S1核酸酶处理，结果导致任何的单链DNA部分水解。
连接是在标准的缓冲液和温度条件下，采用T4DNA连接酶和ATP而进行的；粘性末端的连接比钝化末端的连接需要更少的ATP和更少的连接酶。当载体片段被用作连接混合物的部分时，通常用细菌碱性磷酸酶(BAP)或牛小肠碱性磷酸酶处理载体片段以除去5′-磷酸，这样就防止了载体的再连接。另外，不要的片段的限制性酶解可用于阻止再连接。
将连接混合物转化到合适的克隆宿主，如大肠杆菌中，并通过抗生素抗性而选择成功的转化体和筛选出正确的构造。Ⅲ.D．需要的DNA顺序的构造
采用Warner(1984)所描述的自动寡核苷酸合成器可以制备合成的寡核苷酸。如果需要，可采用32P-ATP存在下的多核苷酸激酶，在反应的标准条件下处理而将合成链“打上”32P的标记。
包括从cDNA库中分离出来的DNA顺序在内的DNA顺序可以采用已知的技术而修饰，如在Zoller(1982)中所描述的定点诱变法。简单地说，将欲修饰的DNA包装到噬菌体内作为一个单链顺序，将采用与欲修饰的DNA部分互补的具有所需要的修饰顺序的合成寡核苷酸作为引物，在DNA聚合酶的作用下将其转化为双链DNA。将所得到的双链DNA转化到维持噬菌体的宿主细菌中。将含有噬菌体的每一条链的复制产物转化后的细菌培养物涂布于琼脂上以获得噬菌斑。理论上来说，50％的新的噬菌斑含有具有突变顺序的噬菌体，而50％则保留原来的顺序。在杂交可进行的温度和条件下，噬菌斑的复制体与标记的合成探针杂交，与校正的链，而不是与未修饰的顺序进行。杂交鉴定的顺序被重新得到和克隆。Ⅲ.E．采用探针杂交
DNA库可以用Grunstein和Hogness(1975)的方法进行探查。简单地说，在该方法中，将欲探查的DNA固定于硝酸纤维素滤纸上，变性后用含有0-50％甲酰胺、0.75M NaCl、75mM柠檬酸钠、0.02％(Wt/V)每一种牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll、50mM磷酸钠(PH6.5)、0.1％十二烷基磺酸钠(SDS)和100微克/ml载体变性DNA的缓冲液进行预杂交。在缓冲液中甲酰胺的浓度及预杂交和随后的杂交步骤的时间和温度都要根据需要的严度而定。不需要很严格的条件的寡聚物探针通常使用低百分含量的甲酰胺、较低的温度和较长的杂交时间。而含有大于30或40个核苷酸(如从cDNA或基因组顺序中衍生的核苷酸)的探针通常使用较高的温度，如约40-42℃，和较高百分含量的甲酰胺，如50％。预杂交后，将5′-32P-标记的寡核苷酸探针加入缓冲液，滤纸在该混合物中，于杂交条件下培养。洗涤后，将处理后的滤纸进行放射自显影以显示杂交探针的位置；在原始琼脂板上相应位置上的DNA被用作为所需DNA的源。Ⅲ.F．结构和顺序的验证
对于常规的载体构造来说，连接混合物被转化到大肠杆菌菌株HB101或其他合适的宿主中，选择成功的转化体通过抗生素抗性或其他标记。然后，根据Clewell等人(1969)的方法从转化体中制备质粒，然后通常进行氯霉素扩增(Clewell(1972))。通常用限制性内切酶分析和/或测序分析分离到的DNA。测序可以通过由Sanger等人(1977)以及Messing等人(1981)进一步描述的双脱氧方法而进行，也可采用Maxam等人(1980)的方法。根据Barr等人(1986)的方法，使用T-deazoguanosine可以克服有时在GC富集区所观察到的条带堆集问题。Ⅲ.G．酶联免疫吸附分析
酶联免疫吸附分析可用于测定抗原或抗体的浓度。该方法是凭借酶和抗原或抗体的结合，利用结合酶的活性作为定量的标志。为了测定抗体，可将已知的抗原固定于固相(例如，小平板或塑料杯)中，用试验血清稀释液进行保温，洗涤后，用酶标记的抗免疫球蛋白保温，再洗涤。适用于标记的酶是现有技术已知的，例如，它们包括辣根过氧化物酶。与固相结合的酶的活性通过加入专一性底物，比色测定所形成的产物或底物的消耗。酶的结合活性是抗体结合量的直接函数。
为了测定抗原，可将已知的特异抗体固定于固相中，加入含有抗原的试验材料，保温后洗涤固相，并加入第二种酶标记的抗体。洗涤后，加入底物，与抗原浓度相关的酶活性用比色法来估计。Ⅳ．实例
下面将对本发明的实例进行描述，它们只是为了说明本发明，而非将本发明局限于此范围内。从本描述中，在权项的范围内的多个具体例对于该领域的普通技术人员来说将是很明显的。所提出的过程，如在Ⅳ.A．中所提出的，如果需要的话，可以重复，但是不必须根据本发明提供的信息而构造所需要的核苷酸顺序的技术也是可行的。在大肠杆菌中的表达进行了举例说明，但是，其他系统也是可用的，如在Ⅲ.A．中提出了更完全的系统。从基因组中衍生的附加的表位也可以制备，并用于产生下面提出的抗体。Ⅳ.A．HCV cDNA的制备、分离和测顺序Ⅳ.A.1.HCV cDNA的制备
初始的NANB病毒是从患有慢性NANBH的黑猩猩血浆液中取得的。该黑猩猩已进行了从其他患有慢性NANBH的黑猩猩的血的感染实验，而所述的NANBH是通过在从人体汇集血清中一批污染了HCV的因子8浓缩液感染而得到的。通过将很多含有高水平的丙氨酸氨基转移酶活性的单个血浆样品混合而制备黑猩猩的血浆库；该活性从由于HCV感染而损伤的肝脏中产生。因为1ml 10-6倍稀释的该混合血清可以通过静脉注射在其他黑猩猩中引起NANBH，它的CID至少为106/ml，即它具有高感染性的病毒效价。
高效价血浆混合液的cDNA库是这样产生的。首先，将病毒颗粒从血浆中分离出来；用含有50mM Tris-HCl,pH8.0、1mMEDTA、100mM NaCl的310ml溶液来稀释90ml原液。在15,000×g,20℃下离心20分钟而将碎片去掉。然后，将所得到的上清液中的病毒颗粒用Beckman SW28转子，28,000rpm下，于20℃离心5小时而制成沉淀。为了释放出病毒基因组，可以将沉淀悬浮于含有1％十二烷基磺酸钠(SDS)、10mM EDTA、10mM Tris-HCl,pH7.5,或并含有2mg/ml蛋白酶K的15ml溶液中，然后在45℃培养90分钟使颗粒裂解。加入0.8微克MS2细菌噬菌体作为载体，用苯酚∶氯仿为1∶1的混合物(苯酚用0.5MTris-HCl,pH7.5、0.1％(V/V)β-巯基乙醇、0.1％(w/v)羟基喹诺酮进行饱和)抽提四次，然后再用氯仿抽提二次而将核酸分离出来。水相用1-丁醇浓缩，然后用2.5倍体积的无水乙醇进行沉淀，在-20℃过夜。核酸用Beckman SW41转子，于40,000rpm，40℃下离心90分钟而得到，并溶解于已用0.05％(v/v)焦碳酸二乙酯处理并高压灭菌过的水中。
用17.5mM CH3Hg OH将上述过程中所得到的核酸(＜2微克)变性；采用Huynh(1985)中所描述的方法利用该变性核酸作为模板而合成cDNA，并将其克隆至噬菌体λ-gt11的EcoRⅠ位点，除了在用反转录酶合成第一条cDNA链(Taylor等人(1976)的过程中，用随机引物来代替寡胸苷12-18。所得到的双链cDNAs在琼脂糖CL-4B柱中根据大小而进行分离；将洗脱下来的大小约400、300、200和100个碱基对分别装入cDNA容器1,2,3和4。从容器3的cDNA中可产生λ-gt11 cDNA库。
从容器3的cDNA库产生的λ-gt11 cDNA库进行表位的筛选，该表位能够专一地与从先行进行NANBH试验过的病人中取得的血清相结合。采用Huynh等人(1985)的方法，除了结合的人体抗体是用已具有125I放射标记的羊抗人Ig抗血清来测定，约有10个噬菌体用病人血清筛选出来了。5个阳性噬菌体被鉴定和纯化。然后，将该5个阳性噬菌体进行专一性结合试验，即将其与从取自先行用NANBH病毒感染的8个不同的成人的血清相结合，采用与上述相同的方法。四个噬菌体所编码的多肽只能与一个成人的血清有免疫反应，即该成人血清是用于初步筛选噬菌体库的。第5个噬菌体(5-1-1)编码的多肽可与8个试验血清中的5个有免疫反应。而且，该多肽不能与取自7个正常血液供者的血清进行免疫反应。因此，很明显，克隆5-1-1所编码的多肽能被取自NANB病人的血清专一地免疫地识别。Ⅳ.A.2．在重组噬菌体5-1-1中HCV cDNA的顺序和在该顺序内编码的多肽的顺序
在重组噬菌体5-1-1中的cDNA采用Sanger等人(1977)的方法测序。实质上，cDNA用EcoRⅠ切出，用凝胶电泳进行大小分离。将EcoRⅠ限制片断再克隆进M13,mp18和mp19(Messing(1983)载体中，采用Sanger等人(1977)的脱氧链终止法进行测序。所得到的顺序列于表1中。
图1中编码的多肽，它是在HCV cDNA中编码的，其与与之相融合的β-半乳糖苷酶N末端部分具有相同的转译框架。如Ⅳ.A章节中所示的，5-1-1的转译“开放读码”(ORF)编码能被受NANBH感染的病人和黑猩猩的血清专一识别的表位。Ⅳ.A.3．与克隆5-1-1的cDNA互相重叠的HCV cDNA的分离
通过用根据从克隆5-1-1中的HCV cDNA的顺序合成的多核苷酸，筛选如Ⅳ.A.1章节中所描述的方法建立的相同的λ-gt11库而获得与克隆5-1-1的cDNA互相重叠的HCV cDNA，如图1中所示的。用于筛选的多核苷酸顺序是：
5′-TCC CTT GCT CGA TGT ACGGTA AGT GCT GAG AGC ACT CTTCCA TCT CAT CGA ACT CTC GGTAGA GGA CTT CCC TGT CAG GT-3′.用该探针，采用Huynh(1985)中所描述的方法，筛选λ-gt11库。50000个克隆中约有1个与该探针杂交。含有与合成的探针杂交的cDNAs的3个克隆分别命名为81,1-2和91。Ⅳ.A.4．与克隆5-1-1中的cDNA互相重叠的HCVcDNAs的核酸顺序
在克隆81、1-2和91中的三个cDNAs的核酸顺序基本上以Ⅳ.A.2章节中描述的方法而测定。与噬菌体5-1-1的HCVcDNA顺序有关的这些克隆的顺序显示于图2中，它显示了编码需检测的HCV表位的链，其中核酸顺序中的同源性是通过顺序之间的垂直线而指示出来的。
克隆的HCV cDNAs的顺序在互相重叠区是高度同源的(见图2)。但是，在两个区中存在差异。克隆1-2中核苷酸67是胸苷，而其他三个克隆则在该位置上是胞苷。但是，应该看到，当C或T占据该位置时可以编码同样的氨基酸。
第二个不同是克隆5-1-1含有28个在其他三个克隆中所没有的碱基对。这些碱基对位于克隆5-1-1的cDNA顺序的起点上，并通过小写字母而指示出来。根据放射免疫分析的数据(将在下面的Ⅳ.D．章节中讨论)，HCV表位在这28个碱基对的区域中编码是可能的。
克隆81、1-2和91缺乏5-1-1的28个碱基对可能意味着在这些克隆中的cDNA是从缺失的HCV基因组中衍生的；或者，28个碱基对区可能是克隆5-1-1的末端人工产物。
在克隆81和91的核苷酸顺序中的小写字母的顺序简单地指出了尚未在其他cDNAs中发现的这些顺序，因为这些区的互相重叠的cDNAs迄今未被分离到。
从克隆5-1-1、81、1-2和91中的互相重叠的cDNAs中衍生的复合的HCV cDNA顺序显示于图3中。但是，在该图中，克隆5-1-1所独具的28个碱基对被省去了。该图也显示了在复合的HCVcDNA的ORF中编码的多肽的顺序。Ⅳ.A.5．与克隆81的cDNA互相重叠的HCV cDNAs的分离
与克隆81的cDNA互相重叠的HCV cDNA部分及其上游顺序的分离是这样进行的。采用与克隆81的5′末端顺序同源的合成多核苷酸探针杂交而筛选在Ⅳ.A.1中所描述的方法而建立的λ-gt11库。克隆81的顺序呈现于图4中。用于筛选的合成多核苷酸的顺序为：
5′CTG TCA GGT ATG ATT GCCGGC TTC CCG GAC 3′.所用的方法基本上按照Huynh(1985)所描述的，除了“库”的滤纸要在严格的条件下洗涤2次，即洗涤是在5×SSC、0.1％SDS中，于55℃下每次洗涤30分钟。50,000个克隆中约1个与探针杂交。将含有与该顺序杂交的cDNA的阳性重组噬菌体分离和纯化。该噬菌体现命名为克隆36。
与克隆81中的cDNA的羧酸末端顺序互相重叠的下游cDNA顺序采用与分离上游cDNA顺序相似的方法而分离，除了所制备的合成寡核苷酸探针是与克隆81的3′末端顺序同源的。用于筛选的合成多核苷酸的顺序为：
5′TTT GGC TAG TGG TTA GTGGGC TGG TGA CAG 3′.含有与这个顺序后部杂交的cDNA的阳性重组噬菌体被分离和纯化，并被命名为克隆32。Ⅳ.A.6．克隆36中的HCVcDNA的核苷酸顺序
克隆36中的cDNA的核苷酸顺序基本上采用Ⅳ.A.2章节中描述的方法测定。该cDNA的双链顺序、与克隆81的HCV cDNA互相重叠区域和通过ORF编码的多肽均显示于图5中。
克隆36的ORF与克隆81中编码的HCV抗原具有相同的转译框架。因此，在组合时，克隆36和81的ORFs可编码多肽，该多肽为大HCV抗原部分。该假定的HCV多肽的顺序和编码它的双链DNA顺序(它是从克隆36和81和HCV cDNAs的组合的ORFs中衍生的)均显示于图6中。Ⅳ.A.7．克隆32中HCV cDNA的核苷酸顺序
克隆32中cDNA的核苷酸顺序基本上以与Ⅳ.A.2中描述的测定克隆5-1-1顺序的相似的方法而进行测定。顺序的数据表明，克隆32重组噬菌体中cDNA是从两个不同来源中衍生的。该cDNA的一个片段是由从HCV基因组衍生的418个核苷酸所组成；另一个片段则由从细菌噬菌体MS2基因组中衍生的172个核苷酸所组成，后者在制备λ-gt11血浆cDNA库时被作为载体。
与HCV基因组的顺序相应的克隆32中cDNA的顺序显示于图7中。图中也表明了与克隆81的顺序互相重叠的顺序区以及由该ORF编码的多肽。该顺序包含一个连续的ORF，该ORF与由克隆81编码的HCV抗原具有相同的转译框架。Ⅳ.A.8.与克隆36的cDNA互相重叠的HCV cDNA的分离
与克隆36的cDNA互相重叠的HCV cDNA部分及其上游顺序的分离采用Ⅳ.A.5章节中描述的，分离与克隆81cDNA互相重叠的顺序的方法而进行，除了合成的多核苷酸是根据克隆36的5′区。用于筛选的合成多核苷酸的顺序是：
5′AAG CCA CCG TGT GCG CTAGGG CTCA AGC CC3′.50,000个克隆中约1个与探针杂交。含有与该顺序杂交的cDNA的重组噬菌体的分离和纯化的克隆被命名为克隆35。Ⅳ.A.9.克隆35中HCV cDNA的核苷酸顺序
克隆35中cDNA的核苷酸顺序基本上以Ⅳ.A.2章节中描述的方法进行测定。该顺序、与克隆36中cDNA的顺序互相重叠的部分和这里假定的编码的多肽，均显示于图8中。
很明显，克隆35含有一单个的、连续的ORF,该0RF用与由克隆36、克隆81和克隆32编码多肽时相同的转译框架来编码多肽。图9显示了延伸到克隆35、36、81和32的长的连续的ORF顺序，和假定的由其编码的多肽。该组合顺序已采用从相同的λ-gt11 cDNA库中衍生的其他独立的cDNA克隆而加以证实了。Ⅳ.A.10．与克隆35的cDNA互相重叠的HCV cDNA的分离
与克隆35的cDNA互相重叠的HCV cDNA部分及其上游顺序的分离以Ⅳ.A.8中所描述的，分离与克隆36cDNA互相重叠的顺序相同的方法进行，除了根据克隆35的5′区合成多核苷酸。用于筛选合成的多核苷酸的顺序为：
5′CAG GAT GCT GTC TCC CGCACT CAA CGT 3′50,000个克隆中约有1个与探针杂交。含有与该顺序杂交的cDNA的重组噬菌体的分离和纯化后的克隆被命名为克隆37b。Ⅳ.A.11.克隆37b中HCV的核苷酸顺序
在克隆37b中cDNA的核苷酸顺序基本上以Ⅳ.A.2中描述的方法测定。该顺序及其与克隆35中cDNA的顺序互相重叠的部分及其编码的假定多肽均显示于图10中。
克隆35的5′末端核苷酸是T(胸苷)，因而在克隆37b中相应的核苷酸是A(腺苷)。已测定了在分离克隆37b的过程中分离到的其余三个独立的克隆中的cDNAs的顺序(如Ⅳ.A.10章节中描述的)。这些克隆的cDNAs的该位置上也是A(腺苷)。因此，克隆35中的5′末端T(胸苷)可能是克隆过程中的人工产物。业已知道，人工产物常常出现在cDNA分子的5′末端。
很明显，克隆37b含有一个可编码多肽的连续的ORF，该多肽是在经过互相重叠的克隆35、36、81和32延伸的ORF中所编码的多肽的延续。Ⅳ.A.12．与克隆32中的cDNA互相重叠的HCV cDNA的分离
克隆32的HCV cDNA下游顺序的分离是这样进行的。首先，采用以克隆32中的HCV cDNA的核苷酸顺序为基础的合成杂交探针分离克隆cla。方法基本按照Ⅳ.A.5章节中所描述的，除了合成探针的顺序是：
5′AGT GCA GTG GAT GAA CCGGCT GAT AGC CTT 3′.利用克隆cla的核苷酸顺序，可合成别的合成核苷酸，它具有下列顺序：
5′TCC TGA GGC GAC TGC ACCAGT GGA TAA GCT 3′.用克隆cla衍生的顺序作为探针筛选λ-gt11库，结果在50,000阳性菌落中约产生1个探针。与该探针杂交的分离和纯化后的克隆被命名为克隆33b。Ⅳ.A.13．克隆33b中的HCV cDNA的核苷酸顺序
克隆33b中cDNA的核苷酸顺序基本上以Ⅳ.A.2章节中描述的方法进行测定。该顺序、及其与克隆32中的cDNA的顺序互相重叠的部分和所编码的假定的多肽均显示于图11中。
很明显，克隆33b含有一个连续的ORF，它是在互相重叠的克隆37b、35、36、81和32中的ORFs的延续。在克隆33b中编码的多肽与在这些互相重叠的克隆的延伸的ORF中编码的多肽具有相同的转译框架。Ⅳ.A.14．与克隆37b的cDNA以及与克隆33b的cDNA互相重叠的HCV cDNAs的分离
为了分离与克隆37b和克隆33b的cDNA互相重叠的HCVcDNAs，根据这些克隆中的cDNAs顺序合成的寡核苷酸探针被用于筛选λ-gt11库，采用与Ⅳ.A.3章节中所描述的方法基本相同的方法进行。所用探针为：
5′CAG GAT GCT GTC TCC CGCACT CAA CGT C 3′和
5′TCC TGA GGC GAC TGC ACCAGT GGA TAA GCT 3′它们用于测定含有分别与克隆37b和33b的顺序重叠的HCVcDNA顺序的菌落。用每一个探针，50,000个菌落中约1个被检测到。含有与克隆37b的cDNA互相重叠及其上游的cDNA的克隆被命名为克隆40b。含有与克隆33b的cDNA互相重叠及其下游的cDNA的克隆被命名为克隆25C。Ⅳ.A.15．在克隆40b和克隆25C中的HCV cDNA的核苷酸顺序
在克隆40b和克隆25c中的cDNAs的核苷酸顺序基本按Ⅳ.A.2章节中所描述的方法测定。克隆40b和25c的顺序、及其与克隆37b和33b的cDNAs互相重叠的部分，以及所编码的假定的多肽均显示于图12(克隆40b)和图13(克隆25c)中。
克隆40b的5′-末端核苷酸是G(胞苷)。但是，已测定了在分离克隆40的过程中分离到的5个其他独立克隆中得到的cDNAs顺序，如Ⅳ.A.14章节中所描述的。这些克隆中的cDNA在相应的位置上含有T(胸苷)。因此，G可看成为克隆的人工产物(见Ⅳ.A.11章节中的讨论)。
克隆25c的5′-末端是ACT，但在克隆cla中该区的顺序(未显示)和克隆33b中该区的顺序是TCA。该不同也可以看成为克隆的人工产物，正如克隆5-1-1中的28个多余的5′-末端核苷酸。
很明显，克隆40b和25c均含有一个ORF，它是在先前已测定了顺序的克隆中连续的ORF的延续。在克隆40b、37b、35、36、81、32、33b和25c中延伸的ORF的核苷酸顺序，及其所编码的假定多肽的氨基酸顺序均显示于图14中。在图中，潜在的人工产物已从顺序中省去了，代之的多重互相重叠的克隆的非5′-末端区的相应的顺序被显示出来了。Ⅳ A.16．由克隆36、81和32中的cDNAs制备一种HCV cDNA复合物
复合HCV cDNA，即C100是如下构建的。首先，以EcoRⅠ切断克隆36、81和32中的cDNAs。把每个克隆的cDNA EcoRⅠ片段单独克隆到载体pGEM3-蓝(Promega Biotec)的EcoRⅠ位点。所得的含有克隆36、81和32中的cDNAs的重组载体分别被称为pGEM3-蓝/36、pGEM3-蓝/81和pGEM3-蓝/32。用NaeⅠ和NarⅠ消化pGEM3-蓝/81适当定向的重组体，并纯化大片段(∽2850bp)，与来自pGEM3-蓝/36的NaeⅠ/NarⅠ纯化限制片段(∽570bp)连结。这个来自克隆36和81的复合cDNAs用于产生另一种pGEM3-蓝载体，它含有包含在这些克隆中的重叠cDNA内的连续HCV ORF。然后，用PVuⅡ和EcoRⅠ消化这种新质粒，形成一个大约680bp的片段，接着与分离适当定向的pGEM3-蓝/32质粒的PVuI Ⅰ/EcoRⅠ小片段(580bp)连接。来自克隆36、81和32的复合cDNA连接在线性化的载体pSODcf1的EcoRⅠ上，这将在Ⅳ.B.1．节中叙述，它用于在细菌中表达克隆5-1-1。选择含有复合HCV cDNA(C100)的∽1270bp EcoRⅠ片段的重组体，以EcoRⅠ切断取自质粒的cDNA，并且纯化。Ⅳ.A.17．克隆14i、11b、7f、7e、8h、33c、14c、8f、33f、33g和39c中HCV cDNAs的分离和核苷酸顺序
采用Ⅳ.A.1．节中所述的从HCV cDNAs入gt11库中分离重叠cDNA片段的技术分离克隆14i、11b、7f、7e、8h、33c、14c、8f、33f、33g和39c的HCV cDNAs。所用的技术大体上如Ⅳ.A.3.节中所述，除了所用的探针是根据最后分离的克隆的核苷酸顺序设计的，此克隆来自复合HCV顺序的5′至3′未端。与以下所述的探针杂交的克隆频率每例大约为1/50,000。
克隆14i、7f、7e、8h、33c、14c、8f、33f、33g和39c中的HCV cDNAs核苷酸顺序基本上由Ⅳ.A.2节中所述来测定，除了自这些噬菌体中切断cDNA被从克隆5-1-1中分离cDNA代替之外。
应用基于克隆40b中的核苷酸顺序的杂交探针分离克隆33c。图12所示为克隆40b的核苷酸顺序。用于分离33c的探针的核苷酸顺序为：
5′ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACAATT ACC ACT 3′
图15所示为克隆33C中HCV cDNA顺序以及与克隆40b中HCV cDNA重叠的顺序，它还表明其中编码的氨基酸。
应用基于克隆33C中的核苷酸顺序的探针分离克隆8h。该探针的核苷酸顺序为：
5′AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C3′
图16所示为克隆8h中HCV cDNA顺序和与克隆33C中的重叠的顺序以及其中编码的氨基酸。
应用基于克隆8h中的核苷酸顺序的探针分离克隆7e。该探针的核苷酸顺序为：
5′TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACGAGG CAC 3＇
图17所示为克隆7e中的HCVcDNA顺序和与克隆8h中的重叠的顺序以及其中编码的氨基酸。
用基于克隆25c中的核苷酸顺序的探针分离克隆14C。图13所示为克隆25C的顺序。分离克隆14C的探针的顺序为：
5′ACC TTC CCC ATT AAT GCC TAC ACC ACG GGC 3′
图18所示为克隆14C中的HCV cDNA顺序和其与克隆25C中的重叠的顺序以及其中编码的氨基酸。
用基于克隆14C中的核苷酸顺序的探针分离克隆8f。该探针的核苷酸顺序为：
5′TCC ATC TCT CAA GGC AAC TTG CGC CGC TAA 3′
图19所示为克隆8f中的HCV cDNA顺序和其与克隆14C中的重叠的顺序以及其中编码的氨基酸。
用基于克隆8f中的核苷酸顺序的探针分离克隆33f。该探针的核苷酸顺序为：
5′TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC CTC CAA AGT  3′
图20所示为克隆33f中的HCV cDNA顺序和其与克隆8f中的重叠的顺序以及其中编码的氨基酸。
用基于克隆33f中的核苷酸顺序的探针分离克隆33g。该探针的核苷酸顺序为：
5′GCG ACA ATA CGA CAA CAT CCT CTG AGC CCG 3′
图21所示为克隆33g中的HCV cDNA顺序和其与克隆33f中的重叠的顺序以及其中编码的氨基酸。
用基于克隆7e中的核苷酸顺序的探针分离克隆7f。该探针的核苷酸顺序为：
5′CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3′
图23所示为克隆11b中的HCV cDNA顺序和其与克隆7f中的重叠的顺序以及其中编码的氨基酸。
用基于克隆11b中的核苷酸顺序的探针分离克隆14i。该探针的核苷酸顺序为：
5′CTC TGT CAC CAT ATT ACA AGC GCT ATA TCA 3′
图24所示为克隆14i中的HCV cDNA顺序和其与克隆11b中的重叠的顺序以及其中编码的氨基酸。
用基于克隆33g中的核苷酸顺序的探针分离克隆39C。该探针的核苷酸顺序为：
5′CTC GTT GCT ACG TCA CCA CAA TTT GGT GTA 3′
图25所示为克隆39C中的HCV cDNA顺序和其与克隆33g中的重叠的顺序以及其中编码的氨基酸。Ⅳ.A.18.来自含HCV cDNA的分离克隆的复合HCV cDNA顺序
上述的分离克隆中的HCV cDNA顺序已被连结形成复合HCV cDNA顺序。从5′至3′方向排列好的分离克隆是14i、7f、7e、8h、33c、40b、37b、35、36、81、32、33b、25c、14c、8f、33f、33g以及39c。图26所示为来自分离克隆的复合HCV cDNA顺序以及其中编码的氨基酸。
在建立该复合顺序中，业已考虑到以下顺序的异质性。克隆33C含有一个800bp的HCV cDNA，它与克隆40b和37c中的cDNAs重叠。在克隆33c以及5种其他重叠克隆中，核苷酸#789为G。然而，在克隆37b(参见Ⅳ.A.11节)中，相应的核苷酸为A。这种顺序的差异使其中编码的氨基酸中形成一种明显的异质性，它对G或A来说分别为CYS或TYR。这种异质性对蛋白质折叠可能具有重要的分岐。故而，图26已表明了这种顺序异质性，也表示了该复合HCV cDNA。
克隆8h中HCV cDNA中的核苷酸残基#2为T。然而，如下所述，克隆7e中的相应残基为A；此外，在3种其他分离重叠克隆中也发现这个位置上为A。故而，克隆8h中的T残基可以代表一种克隆假象。因此，在图26中，这个位置中的残基被指定为A。
克隆8fHCV cDNA中的3′一末端核苷酸为G。但是，克隆33f和2种其他重叠克隆中的相应残基为T。因此，在图26中，这个位置上的残基被指定为T。
克隆33fHCV cDNA中的3′一末端顺序为TTGC。但是，克隆33g和2种其他重叠克隆中的相应顺序为ATTC。因此，在图26中，相应的区域以ATTC表示。
克隆33g HCV cDNA中的核苷酸残基#4为T。但是，在克隆33f和2种其他重叠克隆中，相应残基为A。因此，在图26中，相应的残基被指定为A。
克隆14i的3′一末端为AA，而克隆11b以及3种其他克隆中的相应二核苷酸为TA。因此，图26中绘成TA残基。
以上讨论了其他顺序异质性的消除。
对复合HCV cDNA的检验表明它含有一个大的ORF。这就表明病毒基因组被转译成伴随转译或者随后转译处理的一个大的多肽。Ⅳ.A.19．克隆12f、35f、19g、26g和15e中HCV cDNA
s的核苷酸顺序的分离
基本上用Ⅳ.A.17．节中所述的方法分离克隆12f、35f、19g、26g、和15e中的HCV cDNAs，除了探针如下所述之外。在每种情况下，与探针杂交的克隆频率约为1/50,000。基本上如Ⅳ.A.2．节中所述，测定这些克隆中HCV cDNAs的核苷酸顺序，除了以来自所指一些克隆的cDNA代替由克隆5-1-1-中分离的cDNA之外。基于克隆14i中核苷酸的顺序，用一种杂交探针完成克隆12f的分离，它含有图26中HCV cDNA的cDNA上游。该探针的核苷酸顺序为：
5′TGC TTC TCC ATG ATG CTA CTC ATA TCC CAA 3′
图27中所示为克隆12f的HCV cDNA顺序、其与克隆14i中的顺序重叠部分以及其中编码的氨基酸。
基于克隆39c中核苷酸的顺序，用一种杂交探针完成克隆35f的分离，它含有图26中HCV cDNA的cDNA下游。该探针的核苷酸顺序为：
5′AGC AGC GGC GTC AAA AGT GAA GGC TAA CTT 3′
图28中所示为克隆35f顺序、其与克隆39c中的顺序重叠部分以及其中编码的氨基酸。
基于克隆35f的3′顺序，用一种杂交探针完成克隆19g的分离。该探针的核苷酸顺序为：
5′TTC TCG TAT GAT ACC CGC TGC TTT GAC TCC 3′
图29所示为克隆19g的HCV cDNA顺序、其与克隆35f中的顺序重叠部分以及其中编码的氨基酸。
基于克隆19g的3′顺序，用一种杂交探针完成克隆26g的分离。该探针的核苷酸顺序为
5′TGT GTG GCG ACG ACT TAG TCG TTA TCT GTG 3′
图30所示为克隆26g的HCV cDNA顺序、其与克隆19g中的顺序重叠部分以及其中编码的氨基酸。
基于克隆26g的3′顺序，用一种杂交探针分离克隆15e。该探针的核苷酸顺序为：
5′CAC ACT CCA GTC AAT TCC TGG CTA GGC AAC 3′
图31所示为克隆15e的HCV cDNA顺序、其与克隆26g中的顺序重叠部分以及其中编码的氨基酸。
本节中所述的一些克隆业已按Ⅱ.A．节中所述的条款和条件在ATCC保藏，登记号如下：
λ-gt11    ATCC编号 保藏日期
克隆12f    40514    1988年11月10日
克隆35f    40511    1988年11月10日
克隆15e    40513    1988年11月10日
克隆kq-1   40512    1988年11月10日
在一些分离的克隆中的HCV cDNA顺序被连结形成复合HCV cDNA顺序。在5′至3′方向上被连结的一些分离克隆是12f、14i、7f、7e、8h、33c、40b、37b、35、36、81、32、33b、25c、14c、8f、33f、33g、39c、35f、19g、26g、以及15e。图32所示为来自一些分离克隆的复合HCV cDNA顺序以及其中编码的氨基酸。Ⅳ.A.20．分离克隆12f中的HCV cDNA顺序的cDNA顺序
上游的可供选择的方法
基于来自克隆12f中的HCV cDNA的图32中的大多数5′HCV顺序，合成逆转录酶的小合成寡核苷酸引物并且用于结合到相应于上游顺序的引物逆转录的HCV基因组RNA中的顺序。引物顺序是与公知克隆125的5′末端顺序近端的，但是要下游到足以允许引物的探针顺序上游的设计。采用引发和克隆的公知的标准方法。用引发位点的顺序上游筛选所得的cDNA库(如从克隆12f中的说明的顺序中减去)。从NANBH黑猩猩或者从NANBH人的类似样本中的质粒或者肝样本中获得HCV基因组RNA。Ⅳ.A.21．利用后接使顺序与HCV基因组的5′未端区分离的可
供选择的方法
为了分离HCV RNA基因组的未端5′未端顺序，用Oligo c后接逆转录第一循环的cDNA产物，它具有两倍模板RNA。这通过培养在CTP存在下具有未端转移酶完成。利用Oligo c作为一种逆转录酶反应的引物完成cDNA合成的第二循环，其中获得cDNA第一条链的补体。基因组HCV RNA的来源如Ⅳ.A.20节中所述。以末端转移酶后接以及逆转录酶反应的方法如Maniatis等人(1982)中所述。然后，cDNA产物被克隆、筛选以及排顺序。Ⅳ.A.22．利用后接使顺序与HCV基因组的3′末端区分离的可供选
择的方法
本方法是基于前面所用的克隆黄热病毒RNA的cDNAs。在本方法中，RNA经状态变性去除3′未端上第二构建，然后用rATP作为底物，以polyA多聚酶后接。再用Oligo dT作为引物，由逆转录酶催化polyA后接的RNA的逆转录。合成cDNA的第二条链，cDNA产物被克隆、筛选以及排顺序。Ⅳ.A.23．建立含有较大cDNA插入体的λ-gt11 HCVcDNA库
用于建立和筛选λ-gt11库的方法基本上如Ⅳ.A.1．节中所述，除了该库由自Sepharose CL-4B柱中洗脱的较大尺寸cDNAs的汇集体形成之外。Ⅳ.A.24．用合成低聚物作为引物建立HCVcDNA库
由来自Ⅳ.A.1．节中所述的感染黑猩猩质粒库的RNA以及由来自该感染动物的肝的polyARNA部分制备新的HCVcDNA库。基本上如Gubler和Hoffman(1983)所述构建cDNA，除了第一cDNA链合成用的引物是两种基于上述的HCV基因组的合成低聚物之外。基于克隆11b和7e的顺序的引物分别为：
5′CTG GCT TGA AGA ATC 3′
和
5′AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC 3′
把所得cDNAs克隆到入噬菌体载体中，再用其他不同的合成低聚物筛选，该低聚物顺序基于图32中所示的HCV顺序。Ⅳ.B．编码在HCVcDNA内的多肽的表达和作为HCV诱导抗原的表达产物的识别Ⅳ.B.1．编码在克隆5-1-1中的多肽的表达
编码在克隆5-1-1中的HCV多肽(参见上述Ⅳ.A.2．节)在过氧化物岐化酶(SOD)的作用下表达为融合多肽。这一过程是通过把克隆5-1-1 cDNA插入体再克隆到如下所述的表达载体pSODcf〕〔Steimer等人(1986年〕，中完成的。
首先，用BamHⅠ和EcoRⅠ处理自pSODcfl中分离的DNA,再把以下接头连到经限制性酶切的线性DNA上：
5′GAT CCT GGA ATT CTG ATA A 3′
3′GA  CCT TAA GAC TAT TTT AA 5′克隆以后，分离含有插入体的质粒。
用EcoRⅠ酶切含有插入体的质粒，以EcoRⅠ切断克隆5-1-1中的HCV cDNA插入体，再连到经EcoRⅠ酶切的线性质粒DNA上。DNA混合物被用来转化E.Coli菌株D1210[Sadler等人(1980)]。图1显示了在正确的ORF表达方向中的5-1-1 cDNA重组子，此重组子可被限制性酶谱和核苷酸顺序识别。
通过使细菌在IPTG存在下生长，来自一种克隆的重组体细菌可被诱导表达SOD-NANB5-1-1多肽。Ⅳ.B.2．克隆81中编码的多肽的表达
克隆81中的HCV cDNA表达SOD-NANB81融合多肽。编码这种融合多肽的载体的制备方法与形成编码SOD-NANB5-1-1的载体的方法相似，除了HCV cDNA的来源是克隆81之外，它的分离如Ⅳ.A.3．节中所述，而测定cDNA顺序如Ⅳ.A.4．节中所述。图4所示为克隆81中的HCV cDNA的核苷酸顺序以及其中编码的多肽的推测氨基酸顺序。
以EcoRⅠ切断克隆81中插入的HCV cDNA，并连到含有接头(参见Ⅳ.B.1)并用EcoRⅠ处理后线性化的pSODcf1上。DNA混合物被用来转化E.Coli菌株D1210。图4显示了在正确的ORF表达方向中的克隆81HCV cDNA重组子，此重组子可被限制性酶谱和核苷酸顺序识别。
通过使细菌在IPTG存下下生长，来自一种克隆的重组体细菌可被诱导表达SOD-NANB81多肽。Ⅳ.B.3.编码在克隆5-1-1内的多肽作为HCV和NANBH相关
的抗原的识别
通过证明用NANBH感染的黑猩猩和人的血清与融合多肽、SOD-NANB5-1-1有免疫反应，可以识别编码在克隆5-1-1的HCV cDNA内的多肽为一种NANBH相关抗原SOD-NANB5-1-1是由在其N-末端上的过氧化物岐化酶和C-末端的结构内5-1-1抗原组成，这一过程由如下的“Western”印迹(“Western”blotting)[Towbin等人(1979)]来完成。
通过在IPTG存在下生长，用编码Ⅳ.B.1．节中所述的SOD-NANB5-1-1多肽的表达载体转化的细菌重组菌株被诱导表达融合多肽。根据Laemmli(1970)法，在SDS存在下总的细菌溶菌液在聚丙烯酰胺凝胶上电泳。把分离的多肽转移在硝酸纤维滤纸上[Tow-bin等人(1979)]。然后，把滤纸切成薄条带，每一条带单独地与不同的黑猩猩和人的血清培养。如Ⅳ.A.1．节中所述，再与125I-标记的羊抗人Ig培养检测结合的抗体。
图33所示为用于Western印迹的黑猩猩血清的特性以及在放射性自显影条带的照片上所示的结果。在急性NANBH(Hutchinson菌株)感染(1-16道)、肝炎A感染(17-24道和26-33道)以及肝炎B感染(34-44道)期间，在不同的时间从黑猩猩采集血清与含有多肽的硝酸纤维条带一起培养。25和45道表示阴性对照，其中免疫印迹(immunoblots)是用在λ-gt11 cDNA库的原始筛选中用以识别重组克隆5-1-1(参见Ⅳ.A.1)的病人血清进行培养。
下表列出了对图33所示Western印迹的说明。
    黑猩猩    样品数据(天)                 ALT(血清中丙氨酸氨基行数    号码    感染类型(0=人工接种天数)       转移酶)的水平mu/ml1         1          NANB             0                    92         1          NAHB             76                   713         1          NANB             118                  194         1          NANB             154                  N/A5         2          NANB             0                    56         2          NANB             21                   527         2          HANB             73                   138         2          NANB             138                  N/A9         3          NANB             0                    810        3          HANB             43                   20511        3          NANB             53                   1412        3          NANB             159                  613        4          NANB             -3                   1114        4          NANB             55                   13215        4          NANB             83                   N/A16        4          NANB             140                  N/A17        5          NAV              0                    418        5          HAV              25                   4719        5          HAV              40                   1820        5          HAV              268                  521        6          HAV              -8                   N/A22        6          HAV              15                   10623        6          HAV              41                   1024        6          HAV              129                  N/A26        7          HAV              0                    727        7          HAV              22                   8328        7          HAV              115                  529        7          HAV              139                  N/A30        8          HAV              0                    1531        8          HAV              26                   13032        8          HAV              74                   833        8          HAV              205                  534        9          HBV              -290                 N/A35        9          HBV              379                  936        9          HBV              435                  637        10         HBV              0                    838        10         HBV              111-118(库)          96-156(库)39        10         HBV              205                  940        10         HBV              240                  1341        11         HBV              0                    1142        11         HBV              20-56(1库)           8-100(库)43        11         HBV              169                  944        11         HBV              223                  10
在图23中对照道25和45中的可见带反映3抗体与SOD融合多肽的NANB5-1-1部分的结合。这些抗体并不显示仅仅与SOD结合，因为在这些样本中的阴性对照也包括在内，而且表现为迁移速度比SOD-NANB5-1-1融合多肽快得多的带。
图33的1-16道表示4只黑猩猩的血清样本中的抗体的结合；该血清采自NANBH感染之前以及接着的急性感染期中。由图可见，与SOD-NANB5-1-1多肽发生免疫反应的抗体不在感染HCV之前感染的早期急性阶段的血清样本中，4只动物都在急性后期或者紧接急性期阶段诱发针对这种多肽的循环抗体。
在3号和4号黑猩猩中，在免疫印迹中所观察到的附加带是由于背景与宿主细菌蛋白质结合的缘故。
与用以NANBH感染的黑猩猩的血清获得的结果相反，在以HAV感染的4只黑猩猩或者以HBV感染的3只黑猩猩中并未观察到抗融合多肽的NANB5-1-1部分的抗体的形成。在这些样本中唯一的结合是背景与宿主细菌蛋白质的结合，这也出现在HCV感染的样本中。
图34所示为用于Western印迹的人血清的特性以及在放射性自显影条带的照片上所示的结果。在NANBH感染(1-21道)，HAV感染(33-40道)以及HBV感染(41-49道)期间，在不同的时间从人体采集的血清，与含有多肽的硝酸纤维素条带一起培养。25和50道表示阳性对照，其中免疫印迹是用在上述的λ-gt11库的原始筛选中所用的病人血清进行培养。22-24道和26-32道表示“无感染”对照，其中的血清来自“正常”的供血者。
下表列出了对图34所示Western印迹的说明。行数    病人号码    诊断    ALT水平(mu/ml)1       11          NANB        13542       11          NANB        313       21          NANB        144       21          NANB        795       21          NANB        266       31          NANB        787       31          NANB        878       31          NANB        259       41          NANB        6010      41          NANB        1311      51          NANB        29812      51          NANB        10113      61          NANB        47414      61          NANB        31815      71          NANB        2016      71          NANB        1631 7     81          NANB        4418      81          NANB        5019      9            NANB        N/A20      10           NANB        N/A21      11           NANB        N/A22      12           正常        N/A23      13           正常        N/A24      14           正常        N/A26   30174           正常        N/A27   30105           正常        N/A28   30072           正常        N/A29   30026           正常        N/A30   30146           正常        N/A31   30250           正常        N/A32   30071           正常        N/A33      15           急性HAV     N/A34      16           急性HAV     N/A35      17           急性HAV     N/A36      18           急性HAV     N/A37   48088           急性HAV     N/A38   47288           急性HAV     N/A39   47050           急性HAV     N/A40   46997           急性HAV     N/A41      19     恢复健康的HBV     N/A42      20     (抗-HBSag+ve；    N/A43      21     抗-HBCag+ve)      N/A44      22     (抗-HBSag+ve；    N/A45      23     抗-HBCag+ve)      N/A46      24     (抗-HBSag+ve；    N/A47      25     抗-HBCag+ve)      N/A48      26     (抗-HBSag+ve；    N/A49      27     抗-HBSag+ve)      N/A
1对这些病人中得到的血清样品进行分析
如图34所示，来自九位NANBH病人的血清，包括用于筛选λ-gt11库的血清，含有抗融合多肽的NANB5-1-1部分的抗体。三位患NANBH病人的血清不含这些抗体。在这些病人中以后有可能形成抗NANB5-1-1抗体也有可能，那些血清无反应的个体，是具有不同的NANBV致病体，因而不发生免疫反应。
图34还表明，许多感染HAV和HBV的病人的血清并不含有抗NANB5-1-1抗体，而且这些抗体也不在取自“正常”对照组的血清中。虽然一个HAV病人(36道)似乎含有抗NAN B5-1-1抗体，但是这可能是由于这位病人以前曾感染过HCV，因为NANBH的发病率是很高的而且往往无症状。
血清学研究指出，克隆5-1-1中的cDNA编码可被感染BB-NANBV的病人和动物的血清特异性识别的一些表位。此外，cDNA似乎并非从灵长类动物基因组中得到。一种由克隆5-1-1或者由克隆81构成的杂交探针，在独特的单拷贝基因可被检测的情况下，与来自未感染个体的对照人和黑猩猩基因组DNA的“Southern”印迹(“Southern”blots)不杂交。这些探针与对照牛基因组DNA的Southern印迹也不杂交。Ⅳ.B.4在克隆36、81和32中的HCVcDNAs复合体中编码的多肽
的表达
编码在延伸穿过克隆36、81和32的ORF中的HCV多肽在具有SOD时表达为一个融合多肽。这一过程的完成是把复合cDNA、C100插入含有人体过氧化物岐化酶基因的表达盒中，再把该表达盒插入酵母表达载体中，在酵母中表达多肽。
表达盒包含从克隆36、81和32中得到复合C100、cDNA，它是把∽1270bpEcoRⅠ片段插入载体pS3-56(也称之PS356)的EcoRⅠ位点，获得质粒pS3-56C100而构成的。C100的构建如上Ⅳ.A.16节中所述。
载体pS3-56是pBR322衍生物，它含有一个表达盒，该表达盒由人过氧化物岐化酶基因上游的ADHL/GAPDH杂交酵母启动子下游的GAPDH转录终止子组成。Cousens等人(1987)已描述了一种相似的盒，它含有这些控制因子和过氧化物岐化酶基因。其中受托者一般占有的共同待批1986年10月1日公开的欧洲专利申请EPO196,056,然而，pS3-56中的盒与Cousens等人(1987)的盒的不同之处在于缺少异种胰岛素原基因和免疫球蛋白接点，以及接在过氧化物岐化酶的gln154后面是含有EcoRⅠ位点的转接顺序。转接顺序如下：
5′-AAT TTG GGA ATT CCA TAA TGA G-3′AC CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT
当含有该盒的载体表达时，EcoRⅠ位点使插入的异种顺序产生多肽，后者通过含有氨基酸顺序
-asn-leu-gly-ile-arg-的一个寡肽接头，而与过氧化物岐化酶融合。
pS356的一样本业已在1988年4月29日按照布达佩斯条约的条款保藏在美国典型培养物收集中心(ATCC)，地址：12301Park-lawn Dr.,Rockville,Margland 20853,USA，登记号为67683。有关该保藏物的可用性和使用以及保藏物的保存条款和条件均与Ⅱ.A.节中对含有NANBV-CDNAs的菌株所规定的相同。该保藏物仅为方便，由说明书看来，并不要求实施本发明。因此，保藏物在本文中仅供参考。
含有正确方向插入的C100 cDNA的重组子被分离后，用BamHⅠ切断来自pS3-56C100的含有C100cDNA的表达盒，再分离和纯化含有该盒的∽3400bp片段。然后，把该片段插入酵母载体pAB24的BamHⅠ位点中。
图35中显示了质粒pAB24的重要特征，它是一种酵母穿梭载体，它含有完整的2微米复制顺序〔Broach(1981)〕和pBR322顺序。它还含有来自质粒YEp24〔Botstein等人(1979)〕酵母URA3基因以及来自质粒pcl/1的酵母LEU2d基因，欧洲专利局公开第116,201号。质粒pAB24是通过用EcoRⅠ消化YEp24以及再消化载体去除部分2微米顺序来构建的。所得质粒YEp24ΔRⅠ通过用ClaⅠ消化并用业已用ClaⅠ线性化的完整的2微米质连结线性化。然后，所得的质粒pCBou用XbaⅠ消化以及凝胶上分离8605bp载体片段。这种分离的XbaⅠ片段与含有由pC1/1中分离的LEU基因的4460bp XbaⅠ片段连接；LEU2d基因的取向与URA3基因的方向相同。表达插入是pBR322顺序的唯一BamHⅠ位点，这样，中断细菌抗四环素基因。
把含有SOD-C100表达盒pAB24C100-3的重组质粒转化酵母菌株JSC308以及转化其他的酵母菌株。如Hinnen等人(1978)所述，使细胞进行转化并接种在ura-选择性培养板上。把单个菌落接种在leu-选择性培养基中，生长到饱和。通过在含有1％葡糖的YEP中生长，诱发培养物表达SOD-C100多肽(被称之C100-3)。
菌株JSC308具有在ADRⅠ位上整合的基因型MAT,leu2,ura3(del)DM15(GAP/ADR1)。在JSC308中，阳性激活剂基因产物ADR1的过度表达会导致过大去阻遏作用(相对于ADR1野生型对照)以及在通过ADH2UAS调节系统合成蛋白质时这种表达的异种蛋白质的收获率相当高。酵母菌株JSC308的构建在与本文同时提交的共同待批的美国专利申请(申请号还不知，代理文档号2300-0229)中说明，因此，仅供参考。JSC308的一样本已于1988年5月5日按布达佩斯条xqy条件保藏在ATCC，登记号为20879。有关保藏物的可用性和使用以及保藏物的保存条款和条件均与ⅡA节中对含有HCV cDNAs菌株所规定的相同。
编码在pAB24 C100-3中的完整的C100-3融合多肽应当含有在氨基未端上的154种人的SOD的氨基酸、以及来自含有EcoRⅠ位点的合成的转接体的5种氨基酸残基、来自C100 cDNA的363种氨基酸残基，以及来自连接克隆32中HCV cDNA顺序的MS2核苷酸顺序的5种羧基未端氨基酸(参见Ⅳ.A.7.节)。图36中所示为以SOD的倒数第二位Ala残基开始的这种多肽的羧基未端的推测氨基酸顺序；它还表明了这部分多肽编码的核苷酸顺序。Ⅳ.B.5.在C100内编码的多肽作为NANBH相关的抗原的识别
以大小表示由酵母菌株JSC308中的质粒pAB24C100-3表达的C100-3融合多肽的特征，并通过其与具有慢性NANBH病人的血清的免疫学反应性把在C100内编码的多肽的看作是NANBH相关抗原。
对如Ⅳ.B.4.节中所述表达的C100-3多肽分析如下。用pAB24或者pAB24C100-3转化酵母JSC308细胞，并且诱导其表达编码多肽的异种质粒在1ml培养物(OD650nm ～20)中，被诱导的酵母细胞以每分钟10,000转离心1分钟，使之沉淀，再使其与2体积溶液和1体积玻璃珠(直径为0.2毫微米)强力地旋转而溶解。该溶液含有50mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA,1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)以及1微克/毫升pepstatin。溶菌液中包括C100-3多肽的不溶性物质用离心(每分钟10,000转，5分钟)收集，然后煮沸5分钟使其溶解在Laemmli SD S试样缓冲液中(参见Laemmli(1970)]。按照Laemmli(1970)方法，在SDS存在下与0.3毫升诱导的酵母培养物等量的多肽在10％聚丙稀酰胺凝胺上电泳。在该凝胶上同时电泳标准蛋白质。用考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)使含有表达的多肽的凝胶染色，或者如Ⅳ.B.2.节中所述，用采自慢性NANBH的病人的血清作“Western”印迹，以测定从pAB24和pAB24 C100-3表达的多肽的免疫学反应性。
图37所示为其结果。图37A中，用考马斯亮蓝使多肽染色。1道(pAB24)、2道和3道所示分别为来自用pAB24转化的JSC308的不溶性多肽和来自用pAB24C100-3转化的JSC的两个不同菌落的不溶性多肽。2道和3道与1道的比较表明，来自用pAB24C100-3转化的JSC308的一种多肽相应的分子量为∽54,000道尔顿(dalton)的诱导表达，在以pAB24转化的JSC308中不诱导。箭头表示所说的多肽。
图37B所示为用pAB24(1道)或者用pAB24C100-3(2道)转化的JSC308中表达的不溶性多肽的Western印迹的结果。
由pAB24表达的多肽并不与NANBH病人的血清起免疫反应。然而，如箭头所示，用pAB24C100-3转化的JSC308所表达的分子量为∽54,000道尔顿的多肽，与NANBH病人的血清起免疫反应。2道中的其他免疫反应性多肽可能是这个∽54,000道尔顿多肽的降解和(或)聚合的产物。Ⅳ.B.6.融合多肽C100-3的纯化
通过抽取表达多肽的宿主酵母细胞不溶性部分的分级提取来纯化在N-未端上有SOD和在C-未端上有结构内C100 HCV-多肽的融合多肽C100-3。
如Ⅲ.B.4.节中所述，用pAB24C100-3转化的酵母菌珠JSC308可以表达融合多肽C100-3。然后，通过均化作用使酵母细胞溶解，在pH12.0下，提取溶菌液中的不溶性物质，再在含有SDS的缓冲液中，使保留在不溶部分中的C100-3溶解。
酵母溶菌液基本上按照Nagahuma等人的方法(1984)制备。制备酵母细胞悬液，即把33％(v/v)细胞悬浮在含有20m MTris-HCl,pH8.0,1mM二硫苏糖醇以及1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)的溶液(缓冲液A)中。使悬浮液(15毫升)与等体积的玻璃珠(直径0.45-0.50毫米)混合，把混合物放在Super Mixer(Lab Line Instruments,Inc.)上以最高速度旋转8分钟。分离匀浆和玻璃珠，然后，用与一开始装入细胞相同体积的缓冲液A洗涤玻璃珠三次。把洗液和匀浆液合并之后，在4℃以7,000×g使匀浆离心15分钟，沉淀物再悬浮于相当于二倍的开始装入细胞的体积的缓冲液A中,7,000×g离心15分钟使之再沉淀，从而获得溶菌液中的不溶物质。这种洗涤工序重复三次。
在pH12.0下，提取溶菌液中的不溶物质。使沉淀悬浮在含有0.5MNaCl、1mM EDTA的缓冲液中，悬液体积等于开始装入的细胞时体积的1.8倍。添加0.2体积0.4M pH12.0的磷酸钠缓冲液调节悬浮液的pH值。混合之后，悬液在4℃以7,000×g离心15分钟，去除上清。重复提取二次。提取的沉淀通过使其悬浮在0.5MNaCl、1mM EDTA中，用相当于二倍的开始装入细胞的体积的悬液洗涤，接着在4℃以7,000×g离心15分钟。
通过用SDS处理，使在提取的沉淀中的C100-3多肽溶解。沉淀悬浮在相当于开始装入细胞体积的0.9倍的缓冲液A中，再添加0.1体积2％SDS。悬液混合之后，在4℃以7,000×g离心15分钟。所得沉淀用SDS提取三次以上。汇集所得的含有C100-3的上清。
本过程从酵母匀浆的不溶部分得到10倍以上纯化的C100-3，多肽的收获率大于50％。
按照Laemmli(1970)法用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析融合多肽的纯化制剂。据此分析，多肽的纯度大于80％，分子量大约54,000道尔顿。Ⅳ.C．与HCV cDNA杂交的感染个体中RNA的识别Ⅳ.C.1．与HCV cDNA杂交的患NANBH的黑猩猩肝中RN
A的识别
如下已证明，患NANBH的黑猩猩的肝内有一种RNA，通过Northern印迹显示它能与克隆81内HCV cDNA杂交。
采用Maniatis等人(1982)所述的从哺乳动物细胞内分离总RNA以及分成poly A+和poly A两部分的方法，从得到高滴度血浆的黑猩猩活体解剖肝中分离RNA(参见Ⅳ.A.1．节)。这些RNA在甲醛/琼脂糖凝胶(1％w/v)上电泳并被转移到硝酸纤维纸上[Maniatis等人(1982)]。硝酸纤维纸与来自克隆81的放射性标记的HCV cDNA杂交(参见图4插入的核苷酸顺序)。为了制备放射性标记探针，用DNA多聚酶Ⅰ通过切口转移，以32P标记自克隆81中分离的HCV cDNA插入子[Maniatis等人(1982)]。在一种含有10％(w/v)硫酸葡聚糖、50％(w/v)去离甲酰胺、750mM NaCl、75mM柠檬酸钠、20mMNa2HPO4(pH6.5)、0.1％SDS、0.02％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)、0.02％(w/v)Ficoll-400、0.02％(w/v)聚乙稀吡咯烷酮、100微克/毫升用声处理和变性剪切的鲑精DNA以及106CPM/ml切口转移cDNA探针的溶液中在42℃杂交18小时。
图38所示为被探滤纸的放射自显影。1道含有32P标记的限制断片标记物。2-4道含有如下黑猩猩肝RNA:2道含有30微克总RNA；3道含有30微克polyA-RNA；4道含有20微克polyA+RNA。如图32所示，患NANBH的黑猩猩的肝含有一种与polyA+RNA分子有关的异种种群，它可与HCV cDNA探针杂交，其大小似乎由大约5000核苷酸到大约11,000核苷酸组成。这种与HCV cDNA杂交的RNA可能代表病毒基因组和(或)病毒基因组的特殊转录本。
以下的Ⅳ.C.2．节中所述的试验与HCV含有RNA基因组的假设是一致的。Ⅳ.C.2．受感染个体的血清中含RNA的HCV的识别
如Ⅳ.A.1节中所述，从高滴度NANBH黑猩猩血浆中分离的颗粒提取核酸。把分离的核酸的等分试样(相当于1毫升原始血浆)重悬在20微升50mM Hepes(pH7.5)、1mm EDTA以及16微克/毫升酵母可溶性RNA的溶液中。煮沸5分钟后立即冷冻使样本变性，用RNA酶A[5微升含0.1mg/ml RNA酶A25mMEDTA、40mM Hepes(pH7.5)]或DNA酶Ⅰ[5微升含1单位DNA酶、10mMMgCl、25mM Hepes(pH7.5)中含有1单位DNA酶Ⅰ]处理；对照样本在无酶下孵育。孵育后加入230微升含有2微克/毫升酵母可溶性RNA的冰冻2XSSC，样本在硝酸纤维纸上过滤。滤物与来自克隆81的cDNA探针杂交，该探针以缺口转移法用32P标记。图39所示为滤物的放射性自显影。在用DNA酶处理的和对照样本中(分别为2道和1道)检测到杂交信号，但在用RNA酶处理的样本(3道)中没有检测到。由于用RNA酶A处理破坏了从微粒中分离的核酸，而DNA酶Ⅰ处理并无影响，此充分证明了HCV基因组由RNA组成。Ⅳ．C.3.从患NANBH黑猩猩的肝和血浆样品中的HCV核酸顺序得到的被放大的HCV核酸顺序的检测
应用大体上由Saiki等人(1986)所述的多聚酶链反应(PCR)技术，放大存在于患NANBH黑猩猩的肝和血浆以及对照黑猩猩中的HCV核酸。从克隆81或者克隆36和37的HCV cDNA顺序得到引物寡核苷酸。通过凝胶电泳和Southem印迹，用两引物之间，但并不包括两引物的区间内的顺序的合适的cDNA寡聚物作为探针，探测放大顺序。
从患NANBH的三只黑猩猩的活体解剖肝中和从二只对照黑猩猩中分离含有受放大系统检验的HCV顺序的RNA样本。RNA部分的分离按Ⅳ.C.1．节中所述的硫氰酸胍过程。
还从患NANBH的二只黑猩猩的血浆中、从一只对照黑猩猩中以及对照黑猩猩的血浆库中分离受放大系统1检验的RNA样本。一只受感染的黑猩猩有106或大于106的CID/ml，另一受感染的黑猩猩有105大于105的CID/ml，
按如下从血浆中提取核酸。用一种含有10微克/毫升多聚腺苷酸的TENB/蛋白酶K/SDS溶液[0.05M Tris-HCl(pH8.0)、0.001M EDTA、0.1M NaCl、1mg/ml蛋白酶K以及0.5％ SDS]，把0.1毫升或者0.01毫升血浆稀释到最终体积为1.0毫升，再在37℃下培养60分钟。在这种蛋白酶K消化之后，用TE[10.0mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]饱和酚提取，使所得的血浆部分去蛋白。离心分离酚相，用含0.1％SDS的TENB重提取。汇集每次提取的所得水相，再用等体积的酚/氯仿/异戊醇[1∶1(99∶2)]提取二次，然后用等体积氯仿/异戊醇(99∶1)混合物提取二次。接着，离心分离，水相被加至最终浓度为0.2M醋酸钠中，加入二倍体积乙醇使核酸沉浣。在以38K速度旋转的SW41转子中，4℃超离心60分钟收集沉淀的核酸。
除了上述之外，按Chomcyzski和Sacchi(1987)法，用50微克polyA载体提取高滴度黑猩猩血浆或是汇集起来的对照血浆。这一过程使用一种酸性硫氰酸胍提取液。在Eppendorf小管中,4℃10,000转/分离心10分钟回收RNA。
在两种情况下，在cDNA以PCR反应合成之前，通过结合和从S和SElutip-R柱中洗脱进一步纯化用蛋白酶K/SDS/酚方法从血浆中提取的核酸。以下过程按制备者的指导进行。
如上所述所制备的，从核酸(总的核酸或者RNA)中得到用作PCR反应模板的cDNA。乙醇沉淀后使沉淀的核酸干燥，重悬在经DEPC处理的蒸馏水中。在65℃下加温10分钟，使核酸中二级结构破坏，并立即在冰上冷却样本。用1-3微克来自肝的，或者从10-100微升血浆中提取的核酸(或RNA)的总黑猩猩RNA合成cDNA。合成使用反转录酶，而且按照由制备者BRL规定的议定书，在25微升反应液中反应。如下所述，cDNA合成的引物是也在PCR反应中所用的引物。cDNA合成的所有反应混合物含有23单位RNA酶抑制剂-RNASIN(Fisher/Promega)。cDNA合成后，用水稀释反应混合物，煮沸10分钟，在冰上快速冷却。
PCR反应基本上按照制备者的指导(Cetus-Perkin-Elmer)进行，除了添加1微克RNA酶A之外。反应的最终体积为100微升。PCR反应按37℃、72℃和94℃的规则完成35个周期。
从克隆81、克隆36或者克隆37b中的HCV cDNA顺序得到合成cDNA和PCR反应的引物。(图4、5和10分别表示克隆81、36和37b的HCV cDNA顺序。)从克隆81中得到的两种16-mer引物的顺序为：
5′CAA TCA TAC CTG ACA G 3′
和
5′GAT AAC CTC TGC CTG A 3′
从克隆36中得到的引物的顺序为：
5′GCA TGT CAT GAT GTA T 3＇
从克隆37b中得到的引物的顺序为：
5 ACA ATA CGT GTG TCA C 3′在PCR反应中，引物对由来自克隆81的两种16-mer，或者由来自克隆36的16-mer和来自克隆37b的16-mer组成。
采用碱性凝胶电泳，分离PCR反应产物，再进行Southern印迹，以及用来自与引物不重叠的一段HCV cDNA的32P标记内部寡核苷酸探针分析PCR反应产物。用酚/氯仿提取PCR反应混合物，再用盐和乙醇从水相中沉淀出核酸。离心收集沉淀的核酸，再溶解在蒸馏水中。等分试样在1.8％碱性琼脂糖凝胶上电泳。在该凝胶使60、108和161核苷酸长度的单链DNA与分子量标记物共同电泳。电泳之后，使凝胶中的DNAs转移到Biorad Zeta探针纸上。预杂交、杂交和洗涤条件均按制备者(Biorad)的规定。
用于杂交检测放大的HCV cDNA顺序的探针如下。当PCR引物对来自克隆81时，该探针为一个108-mer，其顺序与处在两个引物间的顺序相对应。当PRC引物对来自克隆36和37b时，该探针是来自克隆35的缺口转译HCV cDNA插入子。这些引物是来自克隆37b插入子的155-170核苷酸和来自克隆36插入子的208-268核苷酸。克隆35中的HCV cDNA插入子的3′末端与克隆36中的插入子的1-186核苷酸重叠；而克隆35插入子的5′末端与克隆37b中插入子207-269核苷酸重叠。(比较图5、8和10)这样，克隆35中的cDNA插入子跨越了部分产生引物的克隆36和37b间的顺序，它可被用作一种放大顺序的探针，此顺序包括这些引物。
对肝样本中RNA的分析是按照上述过程，运用了几组引物和探针来进行的。患NANBH的三只黑猩猩的肝中的RNA对预期大小(161和586核苷酸分别为81和36及37b的)的放大顺序产生阳性杂交结果，而对照黑猩猩则产生阴性杂交结果。试验重复三次均得到相同的结果。
血浆中核酸和RNA的分析也是按照上述过程，运用了来自克隆81的引物和探针来进行的。血浆取自患NANBH的二只黑猩猩、一只对照黑猩猩，以集对照黑猩腥的血浆库。两种NANBH血浆均含有在PCR放大试验中呈阳性结果的核酸/RNA，而两种对照血浆均呈阴性结果。这些结果已被多次重复得到。Ⅳ.D.检测受感染个体血清中HCV抗体的放射免疫试验
按TSU和Herzenberg(1980)法，研制了检测抗HCV抗原的抗体的固相放射免疫试验。用含有HCV表位的纯化多肽包被微量滴定板(Immulon2,Renovawell条带)。用可能含有抗HCV表位抗体的人的血清样本或者适当的对照组血清样本与包被的板共同培养。在培养过程中，如有抗体，则免疫性地结合在固相抗原上。去除未结合的物质、洗涤微量滴定板之后，通过用125I标记的羊抗人免疫球蛋白培养检测人抗体-NANBV抗原复合物。用吸收去除未结合的标记抗体，洗涤该板。测定每井的放射性；井中结合的人抗HCV抗体的量与放射性成比例的。Ⅳ.D.1．融合多肽SOD-NANB5-1-1的纯化
如Ⅳ.B.1.节中所述的在重组体细胞中表达的融合多肽SOD-NANB5-1-1通过用尿素对细胞提取物作分级提取，随后在阴、阳离子交换柱上层析，从重组E.Coli中进行纯化。具体如下：
把1升培养物中的Thawed细胞重悬在含有0.01M Tris-HCl(pH8.0)的10毫升20％(W/V)蔗糖中，再加入0.4毫升0.5MEDTA(pH8.0)。在0℃下放置5分钟后，混合物4,000×g离心10分钟。把所得的沉淀物悬浮在含有0.05M Tris-HCl(pH8.0)、1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)和1微克/毫升pepstatin A的10毫升25％(W/V)蔗糖中，接着添加0.5毫升溶菌酶(10毫克/毫升)，在0℃下培养10分钟。在0.05M Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA中加10毫升1％(V/V)Triton X-100之后，混合物在0℃继续培养10分钟偶而摇动。在无菌的20号皮下注射针中培养6次以搅匀所得的粘性溶液，再以13,000×g离心25分钟。把沉淀物悬浮在5毫升0.01M Tris-HCl(pH8.0)中，以4,000×g离心10分钟。把含有SOD-NANB5-1-1融合蛋白的沉淀溶在有0.02MTris-HCl(pH8.0)、1mM二硫苏糖醇的5毫升6M尿素中(缓冲液A)，并且装入用缓冲液A平衡的Q-琼脂糖快速流动柱。在缓冲液A中用0.0-0.3M NaCl的线性梯度洗脱多肽。洗脱后，在SDS存在下用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析这些部分，以测定其SOD-NANB5-1-1的含量。把含有这种多肽的一些部分汇集起来，并使其在含有0.02M磷酸钠缓冲液(pH6.0)、1mM二硫苏醇的6M尿素(缓冲液B)中透析。把透析后的样本装入用缓冲液B平衡的S-琼脂糖速流动柱，再在缓冲液B中用0.0-0.3M NaCl线性梯度洗脱。在SOD-NANB5-1-1存在下，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分折这些部分，把适合的部分汇集起来。
在SDS存在下，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SOD-NANB5-1-1多肽的最终制剂。基于这种分析，该制备的纯度大于80％。Ⅳ.D.2融合多肽SOD-NANB81的纯化
通过用尿素使细胞提取物分级提取，然后采用分离融合多肽SOD-NANB5-1-1中所述的过程(参见Ⅳ.D.1．节)在阴、阳离子交换柱上层析，从重组E.Coli.中纯化如Ⅳ.B.2.节中所述的在重组细菌中表达的融合多肽SOD-NANB81。
在SDS存在下，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SOD-NANB81多肽的最终剂。基于这种分析，该制剂的纯度大于50％。Ⅳ.D.3.用固相放射免疫试验检测抗HCV表位的抗体
用放射免疫试验(RIA)分析32名被确诊的NANBH病人的血清样本，检测抗存在于融合多肽SOD-NANB5-1-1和SOD-NANB81中的BB-NANBV表位的抗体。
用Ⅳ.D.1．节和Ⅳ.D.2．节分别纯化的SOD-NANB5-1-1和SOD-NANB81包被微量滴定板。试验如下进行。
在0.125 M硼酸钠缓冲液(pH8.3)、0.075M NaCl(BBC)中含有0.1-0.5微克SOD-NAMB5-1-1或者SOD-NANB81，将此溶液的100微升等分试样加入到微量滴定板的每个并中(Dynatech Immulon 2,Removawell条带)。在湿盒内、4℃下，使该板培养过夜，之后去除蛋白质溶液，用含有0.02％Triton X-100的BBS(BBST)洗涤井三次。为了防止非特异性结合，每井用在BBS中添加100微升5毫克/毫升BSA溶液的牛血清白蛋白(BSA)包被，接着在室温下培养1小时；培养后弃去BSA溶液。使包被在井上的多肽与血清反应，该血清中加有100微升在0.01M磷酸钠缓冲液(pH7.2)、0.15M NaCl(PBS)及含10mg/ml BSA的溶液中以1∶100稀释的血清样本，有血清的井在37℃下培养1小时。培养之后，吸去血清样本，用BBST洗涤井五次。通过把125I-标记的F′(ab)2羊抗人Ig G连在包被的井上，测定结合在融合多肽上的抗-NAN5-1-1和抗-NANB81。将100微升标记探针的等分试样(比活性5-20微居里/微克)加入到每个井中，在37℃下使该板培养1小时，接着吸去多余探针，用BBST洗涤5次。在7放射线的计数器上计数，测定每个井中结合的放射活性量。
表1所示为患NANBH个体中抗-NANB5-1-1和抗-NANB81的检测结果。
                 表1NANB、HAV和HBV肝炎病人血清中抗-5-1-1和抗-81的检测病人参考                            S/N数及编号   诊断             抗-5-1-1     抗-811.281     慢性NANB,IVD2   0.77         4.20
       慢性NANB,IVD     1.14         5.14
       慢性NANB,IVD     2.11         4.052.291  AVH3,NANB,散发的  1.09         1.05
       慢性NANB         33.89        11.39
       慢性NANB         36.22        13.673.301     AVH,NANB,IVD     1.90         1.54
       慢性NANB,IVD     34.17        30.28
       慢性NANB,IVD     32.45        30.844.31       慢性NANB,PT4    16.09        8.055.321     晚期AVH NANB,IVD 0.69         0.94
       晚期AVH NANB,IVD 0.73         0.686.331     AVH,NANB,IVD     1.66         1.96
       AVH,NANB,IVD     1.53         0.567.341     慢性NANB,PT      34.40        7.55
       慢性NANB,PT      45.55        13.11
       慢性NANB,PT      41.58        13.45
       慢性NANB,PT      44.20        15.488.351     AVHN ANB,IVD     31.92        31.95
       新近“痊愈”             6.87         4.45
       NANB,AVH9.36       Late AVH NANB PT 11.84        5.7910.37      AVH NANB,IVD     6.52         1.3311.38      晚期AVH NANB,PT  39.44        39.1812.39      慢性NANB,PT      42.22        37.5413.40      AVH,NANB,PT      1.35         1.1714.41      慢性 NANB7 PT    0.35         0.28病人参考                             S/N数及编号    诊断                抗-5-1-1   抗-8115.42       AVH,NANB,IVD        6.25        2.3416.43       慢性 NANB,Pr        0.74        0.6117.44       AVH,NANB,PT         5.40        1.8318.45       慢性,NANB,PT        0.52        0.3219.46       AVH,NANB            23.35       4.4520.47       AVH,Type A          1.60        1.3521.48       AVH,Typr A          1.30        0.6622.49       AVH,Type A          1.44        0.7423.50       最近分辨 AVH,       0.48        0.56
        Type A2451        AVH,Type A          0.68        0.64
        最近分辨AVH,Type A  0.80        0.6525.52       最近分辨    AVH,    1.38        1.04
        Type A
        最近分辨    AHV,    0.80        0.65
        Type A26.53       AVH Type A          1.85        1.16
        最近分辨    AVH,    1.02        0.88
        Type A27.54       AVH,Type A          1.35        0.7428.55       晚期AVH,HBV         0.58        0.5529.56       慢性tic HBV         0.84        1.0630.57       晚期AVH,HBV         3.20        1.6031.58       慢性  HBV           0.47        0.4632.591     AVH,HBV             0.73        0.60
        痊愈AVH,HBV         0.43        0.4433.601     AVH,HBV             1.06        0.92
        痊愈AVH,HBV         0.75        0.68病人参考                              S/N编号      诊断                  抗-5-1-1    抗-8134.611   AVH,HBV               1.66         0.61
      痊愈AVH,HBV           0.63         0.3635.621   AVH,HBV               1.02         0.73
      痊愈AVH,HBV           0.41         0.4216.631   AVH,HBV               1.24         1.31
      痊愈AVH,HBV           1.55         0.4517.641   AVH,HBV               0.82         0.79
      痊愈AVH,HBV           0.53         0.3738.651   AVH,HBV               0.95         0.92
      痊愈AVH,HBV           0.70         0.5039.661   AVH,HBV               1.03         0.68
      痊愈AVH,HBV           1.71         1.391．取自这些病人的有效的顺序血清试样2．IVD=静脉内给药者3．AVH=急性病毒肝炎4．PT=转输后
由表1可见，就抗存在于SOD-NANB5-1-1和SOD-NANB81中的HCV表位的抗体而论，取自被诊断为患NANBH的病人的32份血清中的19份是阳性的。
然而，阳性的血清样本并不等于与SOD-NANB5-1-1和SOD-NANB81有免疫学反应。1号病人的血清样本对SOD-NANB81是阳性的，但是对SOD-NANB5-1-1就不是阳性的。10号、15号和17号病人的血清样本对SOD-NANB5-1-1是阳性的，但是对SOD-NANB81却不是。3号、8号、11号和12号病人的血清样本同等地与两种融合多肽反应，而2号、4号、7号和9号病人的血清样本与SOD-NANB5-1-1反应比与SOD-NANB81反应高2-3倍。据这些结果，表明NANB5-1-1和NANB81至少可能含有三种不同的表位；也就是说，可能每种多肽至少含有一个唯一的表位，而二个多肽至少可以共有一个表位。Ⅳ.D.4针对N ANBH的固相RIA的特异性
针对NANBH的固相RIA的特异性是通过分析感染HAV或HBV的病人的血清及对照个体的血清来测试的。这种运用部分纯化的SOD-NANB5-1-1和SOD-NANB81的分析基本按Ⅳ.D.3中所描述的方法进行，除了血清是来自已经确诊的带有HAV或HBV的病人，或者是来自血库供血者的。表1所列为感染HAV或HBV的病人的血清的分析结果。用感染HAV的病人的11份血清样品及感染HBV的病人的20份血清样品测试RIA，如表1所示，这些血清没有一个与含有BB-NANBV表位的融合多肽产生阳性免疫反应。采用NANB5-1-1抗原的RIA被用来测定对照组血清的免疫活性。从正常供血者中得到的230个血清样品中，只有2个在RIA中产生阳性反应(数据未显示)。这可能是该两位供血者的血清样品事先已接触过HCV。Ⅳ．D.5在NANB H感染过程中NANB5-1-1的活性
在2位病人和4只黑猩猩感染NANBH的过程中，抗NANB5-1-1抗体的存在用如Ⅳ.D.3中描述的RIA进行测定。另外，该RIA被用来测定黑猩猩在感染HAV和HBV的过程中抗NANB5-1-1抗体的存在与否。
列于表2的结果显示，对于黑猩猩和人体，抗NANB5-1-1抗体可在NANBH感染急性阶段的初期被检测出来。在感染HAV或HBV的黑猩猩的血清样品中都未检测到抗NANB5-1-1抗体。因此，抗NANB5-1-1抗体可作为个体接触HCV的一个标记。
                        2用5-1-1抗原的肝炎病人和黑猩猩的连续
                清样品的血清转化病人/黑猩猩         样品日期(天数)              抗-5-1-1
                (0=接种日)       肝炎病毒   (S/N)         ALT
                                                         (mu/ml)病人29              T8               NANB       1.09          1180
                T+180                       33.89         425
                T+208                       36.22         --病人30              T                NANB       1.90          1830
                T+307                       34.17         290
                T+799                       32.45         276黑猩猩1             0                NANB       0.87          9
                76                          0.93          71
                118                         23.67         19
                154                         32.41         --黑猩猩2             0                NANB       1.00          5
                21                          1.08          52
                73                          4.64          13
                138                         25.01         --黑猩猩3             0                NANB       1.08          8
                43                          1.44          205
                53                          1.82          14
                159                         11.87         6黑猩猩4             -3               NANB       1.12          11
                55                          1.25          132
                83                          6.60          --
                240                         17.51         --黑猩猩5             0                HAV        1.50          4
                25                          2.39          147
                40                          1.92          18
                268                         1.53          5黑猩猩6             -8               HAV        0.85          --
                15                          --            106
                41                          0.81          10
                129                         1.33          --黑猩猩7             0                HAV        1.17          7
                22                          1.60          83
                115                         1.55          5
                139                         1.60          --黑猩猩8             0                HAV        0.77          15
                26                          1.98          130
                74                          1.77          8
                205                         1.27          5黑猩猩9             -290             HBV        1.74          --
                379                         3.29          3
                435                         2.77          6黑猩猩10            0                HBV        2.35          8
                111-118备用                 2.74          95-155(备用
                205                         2.05          9
                240                         1.78          13黑猩猩11            0                HBV        1.82          11
                28-56备用                   1.26          8-100(备用
                169                         --            9
                223                         0.52          10T=初始取样日Ⅳ.E 抗NANB5-1-1的多克隆血清抗体的纯化
在SOD-NANB5-1-1多肽与NANBH病人的血清样品中的抗体发生特异性免疫反应活性的基础上，发展一个纯化与NANB5-1-1中的表位发生免疫反应的血清抗体的方法。该方法运用了亲和层析法。将纯化的SOD-NANB5-1-1多肽(见Ⅳ.D.1)附着在不溶性载体上，这种附着使固定化多肽保留了其对NANB5-1-1的抗体的亲和性。血清样品中的抗体被吸收到带基质的多肽中。在清洗去除非特定结合物和未结合的物质后，通过改变pH值以及/或者用Chaotropic剂试(比如尿素)，结合的抗体就被从结合的SOD-HCV多肽中释放出来。
含有SOD-NANB5-1-1的硝酸纤维素膜按下法制备，将0.2微米孔径的2.1cm Sartorius硝酸纤维素膜用BBS洗涤3次，每次3分钟。在室温时将纯化制剂在BBS中培养2小时，或者在4℃下培养过夜，SOD-NANB5-1-1被连到膜上。去除含有未结合抗原的溶液，滤液用BBS洗涤三次，每次3分钟。通过与5mg/ml BSA溶液培养30分钟，用BSA结合膜上剩余活性位点。再用BBS洗涤5次和用蒸馏水洗涤3次洗去过量的BSA。然后将含有病毒抗原和BSA的膜用0.05M甘氨酰盐酸，pH2.5,0.10MNaCl(GlyHCl)处理15分钟，再用PBS洗3次，每次3分钟。
将含有NANBH病人血清的融合多肽的膜培养2小时，以分离多克隆抗NANB5-1-1抗体。在培养后，用BBS洗涤滤液5次，再用蒸馏水洗涤2次。GlyHCl洗脱5次，每次3分钟，将结合的抗体从各滤液中洗脱出来。把每次洗脱液收集在含有2.0MTrisHCl,pH8.0的试管中，再将洗脱液的pH值调节到pH=8.0。亲和层析后，抗NANB5-1-1抗体的回收率近似50％。
含有结合的病毒抗原的硝酸纤维素膜可使用多次而结合力不会有明显的降低。为了重复使用该膜，在抗体被洗脱之后将膜用BBS洗涤3次，每次3分钟。然后，将其保存在4℃的BBS中。Ⅳ.F利用纯化的人体多克隆抗HCV抗体从感染血浆中获得HCV颗粒；以获得颗粒中的核酸与HCV cDNA杂交Ⅳ.F.1利用人体多克隆抗HCV抗体从感染血浆中获得HCV颗粒
将存在于患NANBH的黑猩猩的感染血浆中的蛋白质-核酸混合物用结合在聚苯乙烯珠上的纯化的人体多克隆抗HCV抗体进行分离。
用编码在克隆5-1-1中的SOD-HCV多肽将多克隆抗NANB5-1-1抗体从患NANBH的病人血清中提纯出来，该纯化方法已在Ⅳ.E中描述过。
通过各自用1毫升抗体在室温下孵育过夜，(1微克/毫升抗体在硼酸盐缓冲液中，pH 8.5)将纯化的抗NANB5-1-1抗体结合到聚苯乙烯珠上(1/4”的直径，光洁的，精细塑料球公司，Chicago,Illinois)。培养过夜后，将球珠用TBST[50mM Tris HCl,pH8.0,150mM NaCl,0.05％(V/V)Tween 20]清洗一次，然后用含有10mg/ml BSA的磷酸盐缓冲盐(PBS)清洗。
对此球珠的制备除了用总人体免疫球蛋白代替纯化的抗NANB5-1-1抗体外，其他的以相同的方式进行。
用结合到球珠上的抗NANB5-1-1抗体，从感染NANBH的黑猩猩血浆中获得HCV是如下完成的，所用的患NANBH的黑猩猩血浆是如Ⅳ.A.1中描连的。将1ml的感染NANBV的黑猩猩血浆与5个用抗NANB5-1-1抗体包被的，或用对照的免疫球蛋白包被的球珠在37℃下培养3小时。该球珠用TBST洗3次。Ⅳ.F.2获得的颗粒中的核酸与NANBV-cDNA的杂交
从用抗NANB5-1-1抗体获得的颗粒中释放出来的核酸组分被用来与来自克隆81的HCV cDNA杂交。
HCV颗粒是从感染NANBH的黑猩猩血浆中获得的，如Ⅳ.F.1中所述。为了从颗粒中释放核酸，在37℃下用每球珠0.2毫升的含有蛋白酶k(mg/ml),10mM Tris HCl,pH7.5,10mMEOTA,0.25％(w/v)SDS,10微克/毫升可溶性酵母RNA的溶液与经洗涤的球珠培养60分钟，移去上清液。用苯酚和氯仿抽提上清液，用乙醇在-20℃沉淀核酸过夜。离心收集核酸沉淀液，干燥，再溶于50m M Hepes,pH7.5。将双份的从用抗NANB5-1-1抗体包被的球珠和用含有总人体免疫球蛋白包被的对照球珠中得到的样品可溶性核酸在硝酸纤维素滤纸上过滤。将滤纸与32P标记的，用纯化的克隆81中的HCV cDNA片段制成的切口转移探针杂交。该探针的制备方法及杂交方法如ⅢC.1.描述的。
如图34所示为含有核酸的探针滤液的放射自显影图。该核酸来自用含有抗NANB5-1-1抗体的球珠获得的颗粒。用抗NANB5-1-1抗体得到的抽提液(A1,A2)可得到相对于对照抗体抽提液(A3,A4)和对照酵母RNA(B1,B2)的清晰的杂交信号。包括1pg,5pg和10pg的纯化的克隆81 cDNA片段在内的标准分别列于C1-3中。
这些结果揭示了用抗NANB5-1-1抗体从NANBH血浆中获得的颗粒包含了核酸，该核酸与克隆81中的HCV cDNA杂交，因此进一步证明了这些克隆中的cDNAs是来自于NANBH的病原体。Ⅳ.G．C100-3与纯化的抗NANB5-1-1抗体的免疫反应性
C100-3融合多肽与抗原NANB5-1-1抗体的免疫反应性是用放射免疫测定法进行测定的，在该方法中，结合在固相上的抗原被纯化的抗NANB5-1-1抗体攻击，用125I-标记的羊抗人抗体可检测抗原-抗体复合物。将C100-3多肽的免疫反应性与SOD-NAN5-1-1抗原的进行了比较。
融合多肽C100-3的合成和纯化是分别按照Ⅳ.B.5和Ⅳ.B.6中描述的方法进行的。融合多肽SOD-NANB5-1-1的合成和纯化是分别按照Ⅳ.B.1和Ⅳ.D.1中描述的方法进行的。纯化的抗NANB5-1-1抗体的获得如Ⅳ.E.中所描述的。
将一百微升含有不同量的纯化的C100-3抗原，并含0.125M硼化钠缓冲液，pH8.3,0.075M NaCl(BBS)的溶液加到微量滴定板的各个井中(Dynatech 1mmnlon 2 Removawell Strips)。将该板置于4℃的湿盒内培养过夜，之后，移去蛋白质溶液，用含有0.02％Triton X-100的BBS(BBST)洗涤3次，为了防止非特定的结合，用BSA包被井，即在BBS中加入100微升5mg/ml的BSA溶液，在室温培养1个小时之后，将过量的BSA溶液除去。包被井中的多肽与纯化的抗NANB5-1-1抗体(以每井1微克抗体)反应，样品在37℃下培养1小时。培养后，吸去多余的溶液，再用BBST洗涤井5次。结合在融合多肽上的抗NANB5-1-1的测定是通过将125I标记的F′(ab)2羊抗人Ig G键接到包被井上进行的。将100微升标记探针(比活5-20微居里/微克)加到各井中，测定板在37℃下培养1小时，吸去多余的探针，并用BBST洗涤5次。各井中结合的放射活性量用检测7-射线的计数器计数。
C100-3与纯化的抗NANB5-1-1抗体的免疫反应性同NANB5-1-1与纯化的抗体的相比的结果列于表3。
                         表3
用放射免疫测定法得到的C100-3及NANB5-1-1的免疫反应性
        RIA(cpm/测定法)
AG(ng)400    320    240    160    60    0
NANB5-1-1   7332 6732 4954 4050 3051 57
C100-3       7450 6985 5920 5593 4096 67
表3中的结果显示，抗NANB5-1-1识别在C100-3多肽的C100部分中的表位，因此，NANB5-1-1与C100具有一个共同的表位。此结果提出，编码NANBH表位的cDNA顺序既存在于克隆5-1-1中又存在于克隆81中。Ⅳ.HCV的特性Ⅳ.H.1HCV基因组线状的特性
考虑到HCV基因组的线状(Strandetness),HCV基因组的定性是通过分离在用抗NANB5-1-1抗体包被的聚苯乙烯球珠上获得颗粒的核酸部分，并测定分离的核酸是否与HCV cDNA的正链和/或负链杂交来进行的。
颗粒是来自感染HCV的黑猩猩血浆如Ⅳ.F.1中所描述的，采用包被免疫纯化的抗NANB5-1-1抗体的聚苯乙烯球珠。用Ⅳ.F.2中描述的方法释放颗粒中的核酸组分。将相当于3mls高滴度血浆的已分离的基因组核酸印迹到硝酸纤维素滤纸上。作为对照，来自克隆81的变性HCV cDNA也印迹到相同的滤纸上。用32P标记的从HCV cDNAs克隆的单股DNA的正链或负链混合物来探测该滤纸，该cDNAs是从克隆40b,81，和25c切下的。
单链探针是通过用EcoRⅠ切下克隆81,40b,和25c的HCVcDNAs，并且在M13载体，mp18及mp19中克隆cDNA片段而得到的[Messing(1983)]。将M13克隆定序以测定它们是否包含来自HCV cDNAs的DNA的正链或负链。定序是按Sanger等的双脱氧链终止法进行的(1977)。
一套含有从获得的颗粒中分离出来的HCV基因组的重复的滤纸中的每张滤纸与来自HCV cDNAs的正链或负链探针杂交。图41显示了用来自克隆81,40b和25c的探针混合物检测NANBV基因组所得的放射自显影结果。该混合物是用来提高杂交试验的灵敏度。在名单Ⅰ中，样品与正链探针混合物杂交，在名单Ⅱ中，样品与负链探针混合物杂交而被检测。免疫印迹法的名单中样品的组成被列于表4
         表4
通道   A              B
1      HCV基因组      *
2      ----           *
3      *              cDNA81
4      ----           cDNA81*是指未描述的样品。
如图35的结果所示，只有负链DNA探针与分离的HCV基因组杂交。将该结果与基因组对RNA酶而不是DNA酶敏感(见Ⅳ.C.2)的结果综合起来看，表明NANBV基因组是正链RNA。
这些数据，以及其他有关假定的NANBV(s)的物理化学性质的实验数据，与HCV可能是黄热病病毒酶的一种的假设是一致的。然而，HCV代表了一类新病毒体的可能性依然存在。Ⅳ.H.2获得的颗粒的顺序检测，当用PCR放大时，此颗粒可与来自克隆81的HCV cDNA杂交。
捕获的颗粒中的RNA如Ⅳ.H.1中所述的得到，与来自克隆81的HCV cDNA杂交的顺序的分析是利用如Ⅳ.C.3所述的PCR放大过程进行的，除了杂交探针是来自克隆81 cDNA顺序的激酶寡聚核苷酸。其结果显示，放大的顺序与产生HCV cDNA探针的克隆81杂交。Ⅳ.H.3登革热黄热病病毒(MNWWVD1)的非结构型蛋白质和克隆14i至39c的联合ORF编码的HCV多肽之间的同源性
克隆14i至39c的联合HCV cDNAs包含一个连续ORF，如图26所示。比较了其编码的多肽与登革热黄热病病毒(MNWVD1)中非结构型多肽的区域的顺序的同源性。这一分析使用了Dayhoff蛋白质数据库，并用计算机来完成。结果显示在图42中，其中符号(∶)表示一个真正的同源，符号(·)表示顺序中的一个保守性置换；破折号表示顺序中一个空间，以达到最高同源。如图中所示，编码在HCV cDNA中的顺序与登革热病毒的非结构型多肽之间有着显著的同源性。除了图42中所示的同源性外，编码在靠近cDNA3′一末端的区域的多肽片段经分析也包含了与登革热聚合酶顺序同源的顺序。重要的是，发现被认为对RNA依赖性RNA聚合酶必需的典型Gly-Asp-Asp(GDD)顺序被包含在HCV cDNA编码的多肽中，其位置与在登革热2号病毒中的一致(末给出数据)。Ⅳ.H.4 HCV-DNA在感染组织中是不可测的
两种类型的研究所提供的结果指出，HCV-DNA在患NANBH个体的组织中是不可测的。这些结果连同在Ⅳ.C和Ⅳ.H.1及Ⅳ.H.2中所述的提供了一种迹象，即HCV不是含有病毒的DNA，其复制物也不含有cDNA。Ⅳ.H.4.a Southern印迹过程
为了测定感染NANBH的黑猩猩肝是否含有可检测的HCV-DNA(或HCV-cDNA)，从这个来源分离出来的DNA的限制性内切酶片段是可作Southern印迹的，该印迹用32P-标记HCVcDNA探查。结果显示出标记的HCVcDNA未杂交至来自感染的黑猩猩肝的印迹DNA，也未杂交至来自正常黑猩猩肝的对照印迹DNA。相比较，在阳性对照中，β-干扰素基因的标记探针紧固地杂交至限制酶消化的人体胎盘DNA的Southern印迹。这些体系被设计成检测用标记探针不能测得的基因复制的信号。
DNAs是从两个患NANBH黑猩猩的肝中分离出来的。对照DNAs是从未感染的黑猩猩肝以及人体胎盘中分离出来的。抽提DNA的方法基本按照Maniatis等的(1982)，DNA样品是在分离过程中用RNA酶处理的。
按生产厂家的指导将各个DNA样品用EcoRⅠ,MboⅠ或HincⅡ(12微克)处理。将消化的DNAs在1％中性琼脂糖凝胶上进行电泳，在硝酸纤维素上作Southern印迹，印迹材料与合适的切口转移探针cDNA(3×106cpm/ml的杂交混合)杂交。来自感染的黑猩猩肝和正常肝的DNA与来自克隆36加81的32P-标记的HCV DNA杂交；人体胎盘与来自β-干扰素基因的32P-标记的DNA杂交。杂交后，在严格的条件下洗涤印迹物，比如，在65℃，用含有0.1×SSC,0.1％SDS的溶液洗涤。
β-干扰素基因的制备如Houghton等所述的(1981)。Ⅳ.H.4.b运用PCR技术的放大
为了确定HCV-DNA是否能在患NANBH的黑猩猩的肝中检测到，将DNA从组织中分离出来，并进行使用从克隆81的HCVcDNA衍生而来的引物和探针聚核苷酸的PCR放大检测技术。阴性对照物是从未感染的HepG2组织培养细胞中分离出来的和从推测未感染的人体胎盘中分离出来的DNA样品。阳性对照物是阴性对照物中加入克降81的已知相对较小量(250分子)的HCVcDNA插入物的样品。
另外，为了证实从同样患NANBH的的黑猩猩肝中分离出来的RNA断片包含互补于HCV-cDNA探针的顺序，PCR放大检测体系也就被用在分离的RNA样品上。
在该研究中，DNAs是用Ⅳ.H.4.a中所述的方法分离的，RNAs是基本按Chirgwin等所述的(1981)提取的。
DNA样品从2个感染的黑猩猩肝，未感染的HepG2细胞，以及人体胎盘中分离出来的。按照生产厂家的指导，各种DNA各取1微克用Hind Ⅲ进行消化。基本上按Ⅳ.C.3中所述将消化的样品进行PCR放大并检测放大的HCV cDNA，除了反转录步骤被略去。PCR引物和探针是来自克隆81的HCV cDNA，在Ⅳ.C.3中已有描述。在放大之前，对于阳性对照物，通过加入250摩尔从克隆81分离而来的HCV cDNA插入物来使各个DNA的1微克样品增效。
为了确定HCV顺序是否在从患NANBH的黑猩猩肝分离出来的RNA中存在，将含有0.4微克的总RNA的样品进行基本如Ⅳ.C.3中所述的放大过程，除了反转录酶从某些作为阴性对照的样品中略去了。PCR引物和探针是来自克隆81的HCV cDNA，如前所述。
结果显示出互补于HCV cDNA探针的放大顺序在来自感染的黑猩猩肝的DNAs中不能检测到，也不能从阴性对照物中检测到。相反，当样品(包括来自感染的黑猩猩肝的DNA)是在放大前用HCV cDNA增效的，在所有阳性对照物中检测出克隆81顺序。此外，在RNA的研究中，放大的克隆81的HCV cDNA顺序只在使用反转录酶时才检测到，由此足以推断，其结果不是因为DNA的传染造成。
这些结果表明，患NANBH黑猩猩的肝细胞不含或含有测不出程度的HCV DNA。基于增效研究，如果存在HCV DNA的话，它处于远远低每个肝细胞0.06拷贝的程度。相反，来自相同肝样品的总RNA中的HCV顺序很容易用PCR技术检测到。Ⅳ.I．以HCV C100-3作为测试抗原，用于HCV感染的ELISA测定法
所有的样品用HCV C100-3 ELISA测定。这个测定法利用HCV C100-3抗原(其合成和纯化如Ⅳ.B.5中所描述的)及一个鼠单克隆抗人Ig G的辣根过氧化酶(HRP)结合物。
用HCV C100-3抗原包被的板按下述方法制备。先配制一种含有包被缓冲剂(50mM硼酸钠，pH9.0)21毫升/板，BSA(25微克/毫升)C100-3(2.50微克/毫升的溶液再加到RemoveawellImmlon I板(Dynatech公司提供)中。混合5分钟后，将溶液以每井0.2ml加到板上，盖好，于37℃培养2个小时，之后吸去溶液。用400微升的洗涤缓冲液(100mM磷酸钠，pH7.4,140mM氯化钠，0.1％(w/v)酪朊，1％(w/v)Triton X-110,0.01％(w/v)硫柳汞)洗井一次。弃去洗涤液后，每井加入200微升的包被后溶液(10mM磷酸钠，pH7.2,150mM氯化钠，0.1％(w/v)酪朊和2mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)，将板轻轻盖上以防蒸发，并于室温下放置30分钟。然后吸去溶液，低压冻干过夜，无自加热。制备好的板可以在2-8℃下在密封的铝袋中贮存。
为了完成ELISA测定，将20微升血清样品或对照样品加到含有200微升样品稀释液(100mM磷酸钠，pH7.4,500mM氯化钠，1mM EOTA,0.1％(w/v)酪朊，0.015(w/v)硫柳汞，1％(w/v)Triton X-100,100微升/毫升酵母抽提液)的井中。密封该板，于37℃培养2小时，吸去溶液，用400微升洗涤液(含有0.05％Tween20的磷酸缓冲盐(PBS)洗涤井。洗涤过的井用200微升包含在Ortho结合稀释液(10mM磷酸钠，pH7.2,150mM氯化钠，50％(v/v)胎牛血清，1％(v/v)热处理过的马血清，1mMK3Fe(CN)60,0.05％(w/v)Tween 20,0.02％(w/v)硫柳汞)中的鼠抗人体Ig G-HRP结合物处理。该处理于37℃下进行1小时，吸去溶液，用洗涤缓冲液洗涤井，之后也用同法吸去洗涤液，为测量酶结合物的结合量，加入200微升底物溶液(每5ml展开液10mgo-苯二胺二氯化氢)展开液包含50mM用磷酸调节至pH5.1的柠檬酸钠，和0.6微升/毫升的30％H2O2。含有底物溶液的板于室温在暗处培养30分钟，加入50微升/毫升4N硫酸终止反应，测定ODs。
下面提供的实例显示以HCV C100-3为抗原的微量滴定板ELISA具有高度特异性，证据为反应初始速率约为1％，随机的供血者的重复反应速率约5％的迹象所示。该测试法既能检测感染后期急性阶段及疾病慢性阶段的免疫应答。另外，该测试法能检测某些在NANBH替代试验中显示阴性的样品，这些样品来自患有NANBH历史的病人，或来自与NANBH传播有牵连的供血者。
在下述例子中，使用了下列缩写：
ALI              丙氨酸氨基转移酶
Anti-HBc         抗HBc的抗体
Anti-H Bs Ag     抗H Bs Ag的抗体
H Bc             肝炎B核心抗原
H Bs Ag          肝炎B表面抗原
Ig G             免疫球蛋白G
Ig M             免疫球蛋白M
Iu/L             国际单位/升
NA               不可测得
NT               未测过
N                样品大小
Nep              阴性
OD               光密度
Pos              阳性
S/CO     信号临界
SD       标准偏差
X        平均或中值
WNL      在正常范围之内Ⅳ.I.1随机供血者群体中的HCV感染
来自随机供血者的一组1,056个样品(新鲜血清)是从加利福尼亚州旧金山Irwin Memorial血库得到的。这些样品的测试结果归总在显示OD值分布的矩形图中(图37)。如图37所示，4个样品的读数＞3,1个样品的读数在1到3之间，5个样品的读数在0.4到1之间，其余的1,046个样品读数＜0.4，其中90％以上的样品的值＜0.1。
反应活性随机样品的结果列于表5，用一个等于平均值加5标准偏差的切断值，1,056(0.95％)个样品中的10个样品具初始反应活性，其中，5个样品(0.47％)在用ELISA对其进行第二次测试时重现反应活性。表5还显示出对各个重现反应活性的样品的AIT和Anti-H Bd状态。特别有趣的是所有5个重复反应活性的样品在二个NANBH置换试验中均显阴性，而在HCVE LISA中显阳性。
                       表5反应活性随机样品的结果
            N=1051
            X=0.049*
            SD=±0.074
切断： X+5SD=0.419(0.400+阴性对照)
        Initial
     初始反应活性∶重复反应活性                Anti
样品      OD            OD          ALT**    HBc***
                                    (IU/L)     (OD)4227      0.462         0.084       NA         NA6292      0.569         0.294       NA         NA6188      0.699         0.326       NA         NA6157      0.735         0.187       NA         NA6277      0.883         0.152       NA         NA639 7     1.567         1.392       30.14      1.4336019      ＞3.000       ＞3.000     46.48      1.0576651      ＞3.000       ＞3.000     48.53      1.3436669      ＞3.000       ＞3.000     60.53      1.1654003      ＞3.000       3.000       WNL****   阴性
      10/1056=0.95％   5/1056=0.47％
*样品的读数＞1,5的未包括在平均值和SD的计算之中
**ALT≥68IU/L是在正常范围以上
***Anti-HBc《0.535(竞争性试验)被认为阳性
****WML：在正常范围之内Ⅳ.I.2黑猩猩血清样品
以HCV C100-3ELISA测试了来自11只黑猩猩的血样品。这些黑猩猩中的4个由于一批污染的因子Ⅷ(假定为Hutchinson株)而感染NANBH，试验按在疾病控制中心与Daniel Bradley博士合作时规定的程序进行，4个感染HAV的黑猩猩，3个感染HBV的黑猩猩为对照，在感染后的不同时间取得血清样品。
归总在表6的结果证明了被NANBH的Hutchinson株感染的所有黑猩猩中的抗体血清转化。感染后急性阶段(其特征为ALT明显上升又随即回复到正常后)，抗HCVC100-3的抗体可以在4/4NANBH感染的黑猩猩的血清中检测到。这些样品先前已经给出过，如在Ⅳ.B.3中所述的，用Western分析法，和RIA时显示阳性。相反，感染HCV或HBV的对照黑猩猩，在ELISA中没有一个显示出反应性。
                        表6黑猩猩血清样品
                                           ALT
       OD      5/CO    接种日    取血日   (IU/L)    注入物负对比     0.001正对比     1.507
  切断 0.401黑猩猩1   -0.007  0.00    05/24/84  05/24/84  9         NAH8
       0.003   0.01              08/07/87  71
       ＞3.000 ＞7.78            09/18/84  19
       ＞3.000 ＞7.78            10/27/84  ---黑猩猩2   ---     ---     06/07/84  ---       ---       NANB
       -0.003  0.00              05/31/84  5
       -0.005  0.00              06/28/87  52
       0.975   2.36              08/20/87  13
       ＞3.000 ＞7.78            10/24/87   ---黑猩猩3   0.005   0.01    03/17/85  03/14/85    8       NANB
       0.017   0.07              04/26/85    205
       0.006   0.01              05/06/85    14
       1.010   2.52              08/20/85    6黑猩猩4   -0.006  0.00    03/11/85  03/11/85    11      NANB
       0.003   0.01              05/09/85    132
       0.523   1.31              06/06/85    ---
       1.571   3.93              08/01/85    ---黑猩猩5   -0.006  0.00    11/21/80  11/21/80    4       HAV
       0.001   0.00              12/16/80    147
       0.003   0.01              12/30/80    18
       0.006   0.01           07/29-08/21/81 5黒猩猩6   ---     ---     05/25/82  ---         ---     HAV
       -0.005  0.00              05/17/82    ---
       0.001   0.00              06/10/82    100
       -0.004  0.00              07/06/82    10
       0.290   0.72              10/01/82    ---黑猩猩7   -0.008  0.00    05/25/82  05/25/82    7       HAV
       -0.004  0.00              06/17/82    83
       -0.006  0.00              09/15/82    5
       0.005   0.01              10/09/82    ---
                     表6(续)黑猩猩血清样品(Cont′d)
                                                  ALT
       OD        S/CO    接种日      取血日      (Iu/L)  注入物黑猩猩8   -0.007    0.00    11/21/80    11/21/80    15      HAV
       0.000     0.00                12/16/80    130
       0.004     0.01                02/03/81    8
       0.000     0.00             06/03-06/10/81 4.5黑猩猩9   ---       ---     07/24/80    ---         ---     HBV
       0.019     0.05             08/22-10/10/79 ---
       ---       ---                 03/11/81    57
       0.015     0.04             07/01-08/05/81 9
       0.008     0.02                10/01/81    6黑猩猩10   ---       ---     05/12/82    ---         ---     HBV
       0.011     0.03             07/21-05/12/82 9
       0.015     0.01             09/01-09/08/82 126
       0.008     0.02                12/02/82    9
       0.010     0.02                01/06/83    13黑猩猩11  ---       ---     05/12/82    ---         ---     HBV
       0.000     0.00             01/06-05/12/82 11
       ---       ---                 06/23/82    100
       0.003     0.00             06/09-07/07/82 ---
       -0.003    0.00                10/28/82    9
       -0.003    0.00                12/20/82    10Ⅳ.I.3名单1：来自慢性人体NANBH携带者的已被
          证实的感染性血清
一份编了号的名单包括22个独立样品，每个样品为二份，总数为44个样品。这些样品来自被证实的慢性人体NANBH携带者感染性血清，有关联的供血者的感染性血性，及急性期NANBH病人的感染性血清。另外，这些样品还来自高度纯种的阴性对照及其他疾病对照。这个名单由马里兰，贝塞斯达，国立卫生研究院，健康和医疗部的H·Alter博士提供。这个名单是Alter博士几年前建立的，并被Alfer博士用作为令人满意的假设NANBH测量法的名单。(参考引证了Alfer的文章)。
整个名单用ELISA测定法测定二次，并把结果送到Alfer博士那里评定。评定的结果如表7所示。尽管表中只报道了双份名单中的一组，在双份样品中二组得到了相同的结果。
如表7所示，6份在一个黑猩猩中被证实的感染性血清是强阳性。来自一例急性NANBH的第7份感染性血清在该ELISA测定中是非反应性的。正常ALT水平的和在黑猩猩研究中结果不明确的一个相关供血者的样品在测量中是非反应性的。来自一个急性NANBH病人的三个其他系列样品也是非反应性的。从至少捐血10次而不与肝炎有牵连的供血者而得到的所有来自高度纯种的阴性对照的样品，在ELISA测定中是非反应性的。最后，测试样品中的四个样品在由别人发展的假定NANBH测定法中已被认为是阳性的，但是这些测定法是不可信的。用HCV ELISA测量法，这四个样品的结果是阴性。
                         表7H.ALTER的名单1：名单                            第一次结果          第二次结果1)由黑猩猩传染的被证实了的感染A．慢性NANB：后-Tx
  JF                              +                   +
  EB                              +                   +
  PG                              +                   +B．带升高了的ALT的有关连的供血者
  BC                              +                   +
  JJ                              +                   +
  BB                              +                   +C．急性NANB：后-Tx
  WH                              -                   -2)由黑猩猩传染不明确的感染带正常ALT的有关连的供血者A．带正常ALT的有关连的供血者
  CC                              -                   -3)急性NANB：后-TxJL 1周                              -                   -JL 2周                              -                   -JL 3周                              -                   -4)对照疾病A．初期胆汁性肝硬变
  EK                              -                   -B．恢复中的酒精性肝炎
  11B                             -                   -5)纯种阴性对照DH                                  -                   -DC                                  -                   -LV                                  -                   -HL                                  -                   -AH                                  -                   -6)潜在NANB“抗原”JS-80-01T-0(IsllloA)                -                   -AsTERIX(TREPO)                      -                   -ZURTZ(ARNOLO)                       -                   -BECASSOINE(TREPO)                   -                   -Ⅳ.I.4.名单2：供血者/受血者NANBH
编号的名单中包括10个与NANBH有关的明确的供血者-受血者输血病例，总共有188个样品。每例包括了一些或全部的输给受血者的供血者的样品，及来自受血者的系列样品(在输血后的3,6及12个月抽出的)。还包括在输血前的受血者的原血样。编码名单由NIH的H.Alter博士提供，结果也送给他进行评定。
归总于表8的结果显示出ELISA测量法检测到10例与输血有关的NANBH中9例的抗体血清转化。例4的样品(未检测到血清转化)在ELISA测量法中始终反应很弱，10个受血体样品中的2个在输血后3个月时是反应性的；6个月时，8个受血体样品是反应性的；在12个月时，除了例4之外，所有的样品是反应性的。另外，10例中的7例发现至少有一个抗体阳性供血者，例10有二个阳性供血者。在例10中也发现受血体的原血样对HCV抗体是阳性的，该受血体的1个月的血下降到反应性水平的临界线，而其4个和10个月的血上升至阳性。一般地，S/CO为0.4时被认为是阳性的。因此，这种情形可能表示HCV病人的前期感染。
所有反应性(即阳性)样品的ALT和HBc状况汇总在表9。从表中可见，1/8供血者的样品对代用的标记是阴性的，在HCV抗体ELISA中是反应性的。另一方面，受血体样品(直到输血后12个月)要么有升高的ALT，要么有阳性抗HBc，或者两者都有。
                                  表8供血者/受血者NANB名单H.ALTER的供血者NANB名单
                       受血者                             后-Tx
例     供血者          原血样           3个月的           6个月的           12个月的
    OD       S/CO    OD       S/CO    OD     S/CO      OD        S/CO    OD         S/CO1． ---      ---     .032     0.07    .112   0.26      ＞3.000   ＞6.96  ＞3.000    ＞6.962． ---      ---     .059     0.14    .050   0.12      1.681     3.90    ＞3.000    ＞6.963． .403     0.94    .049     0.11    .057   0.13      ＞3.000   ＞6.96  ＞3.000    ＞6.964． ---      ---     .065     0.15    .073   0.17      .067      0.16    .217       0.505． ＞3.000  ＞6.96  .034     0.08    .096   0.22      ＞3.000   ＞6.96  ＞3.000    ＞6.966． ＞3.000  ＞6.96  .056     0.13    1.475  3.44      ＞3.000   ＞6.96  ＞3.000    ＞6.967． ＞3.000  ＞6.96  .034     0.08    .056   0.13      ＞3.000   ＞6.96  ＞3.000    ＞6.968． ＞3.000  ＞6.96  .061     0.14    .078   0.18      2.262     5.28    ＞3.000    ＞6.96
9． ＞3.000  ＞6.96  .080     0.19    .127   0.30      .055      0.13    ＞3.000    ＞6.96
10．＞3.000  ＞6.96  ＞3.000  ＞6.96  .317   0.79      ＞3.000** ＞6.96  ＞3.000***＞6.96
    ＞3.000  ＞6.96*表示1个月的**表示4个月的，***表示10个月的
                表9H.ALTER名单1中反应和性样品的ALT和HBC状况
                  抗-
   样品           ALT*          HBc**供血者实例3                 常              阴性实例5                 升高            阳性实例6                 升高            阳性实例7                 不可测得        阴性实例8                 正常            阳性实例9                 升高            不可测实例10                正常            阳性实例10                正常            阳性
 受血者实例1         6个月   升高            阳性
 12个月   升高    未测得实例2         6个月   升高            阴性
 12个月   升高    未测得实例3         6个月   正常            未测得***
 12个月   升高    未测得***实例5         6个月   升高            未测得
 12个月   升高    未测得实例6         3个月   升高            阳性
 6个月    升高    阴性
 12个月   升高    未测得实例7         6个月   升高            阴性
 12个月   升高    未测得实例8         6个月   正常            阳性
 12个月   升高    未测得实例9         12个月  升高            未测得实例10        4个月   升高            未测得
10个月    升高    未测得
*ALT≥45IU/L为上述正常限度
**抗HBc≤50％(竞争测量法)被认为阳性
***原血和3个月样品对HBc为阴性Ⅳ.I.5高危险组样品中的HCV感染的测定
用ELISA检测高危险组样品，以确定对HCV C100-3的反应性。这些样品从Kansas市，Community Blood Bank的Gary Tegtmeier博士那里得到。结果汇总在表10。
如表中所显示的，具有最高反应性的样品是从血友病得到的(76％)。另外，带升高的ALT和抗HBc阳性的病人样品的反应性为51％，该值与这组的NANBH流行和临床数据估计值一致。抗HCV抗体的发生率在下列情况下也是高的，如在只带升高的ALT的供血者血液中，或只对乙型肝炎核心抗体阳性的供血者血液中，或当与随机态愿供血者相比，除高ALT或抗核心抗体外，没有其它变化的供血者中。
                      表10NANB高危险组件样品
                                  分布
组                    N        N         OD         反应性百分率升高有ALT的               35       3         ＞3.000    11.4％
                  1   0.728抗HBC的                   24       5         ＞3.000    20.8％升高的ALT，抗HBC的        33       12        ＞3.000    51.5％
                  1   2.768
                  1   2.324
                  1   0.939
                  1   0.951
                  1   0.906排斥的供血者的            25       5         ＞3.000    20.0％有肝炎历史的供血者的      150      19        ＞3.000    14.7％
                  1   0.837
                  1   0.714
                  1   0.469血友病的                  50       31        ＞3.000    76.0％
                  1   2.568
                  1   2.483
                  1   2.000
                  1   1.979
                  1   1.495
                  1   1.209
                  1   0.819Ⅳ.I.6在HCV C100-3ELISA中用抗IgG或IgM的单克隆抗体，或多克隆抗体作为二级抗体的比较研究
对用抗IgG单克隆结合物的ELISA测定法的灵敏度与用抗IgM单克隆结合物的比较，或以据报道是特异性重链和轻链的多克隆抗血清代替上述两者的比较，进行了以下研究。Ⅳ.I.6.a来自血清转化的系列样品
利用酶结合物的或用多克隆抗血清的HCV C100-3ELISA试验研究了3例NANB血清转化的系列样品，该酶结合物为只与抗IgG单克隆结合的，或为结合进抗IgM单克隆的。样品由纽约纽约市，纽约血液中心的Cladd Stevens博士提供。样品的资料列在表11中。
利用抗IgG单克隆抗体-酶结合物得到的结果列于表12中。其数据显示，最初检测到的强的反应性分别在例1,2和3的样品1-4,2-8和3-5中。
用联合的抗Ig单克隆结合物及抗IgM结合物所得结果列于表13。测试3个不同比例的抗IgG与抗IgM,抗IgG的1∶10,000稀释液保持不变。测试的抗IgM单克隆结合物的稀释液为1∶30,000、1∶60,000和1∶120,000。其数据表明，与仅用抗IgG的研究相一致，在样品1-4,2-8和3-5中检测到初始强反应性。
用抗IgG单克隆结合物(1∶10,000稀释)，或Tago多克隆结合物(1∶80000稀释)，或Jackson多克隆结合物(1∶80,000稀释)的ELISA所得到的结果列于表14中。从其数据可看出，用这三种构型在样品1-4,2-8和3-5中检测到初期强反应性；Tago多克隆抗体产生最小信号。
上述结果表明，所有三种构型在疾病急性期(以ALT升高为指标)后的相同时间检测出反应性样品。而且，结果意示着用抗IgG单克隆酶结合物的HCV C100-3ELISA的灵敏度相当于或高于用其他酶结合物的测试构型所得的。
                     表11CLADD9STEVENS名单上的样品的情况
         日期         HBsAg    抗-HBs抗-HBs  ALT      胆红素实例11-1         8/5/81        1.0      91.7       12.9     40.0      -1.01-2         9/2/81        1.0      123.0      15.1     274.0     1.41-3         10/7/81       1.0      64.0       23.8     261.0     0.91-4         11/19/81      1.0      67.3       33.8     75.0      0.91-5         12/15/81      1.0      30.5       27.6     71.0      1.0实例22-1         10/19/81      1.0      1.0        116.2    17.0      -1.02-2         11/17/81      1.0      0.8        89.5     46.0      1.12-3         12/02/81      1.0      1.2        78.3     63.0      1.42-4         12/14/81      1.0      0.9        90.6     152.0     1.42-5         12/23/81      1.0      0.8        93.6     624.0     1.72 -6        1/20/82       1.0      0.8        92.9     66.0      1.52-7         2/15/82       1.0      0.8        86.7     70.0      1.32-8         3/17/82       1.0      0.9        69.8     24.0      -1.02 -9        4/21/82       1.0      0.9        67.1     53.0      1.52-10        5/19/82       1.0      0.5        74.8     95.0      1.62-11        6/14/82       1.0      0.8        82.9     37.0      -1.0实例33-1         4/7/81        1.0      1.2        88.4     13.0      -1.03-2         5/12/81       1.0      1.1        126.2    236.0     0.43-3         5/30/81       1.0      0.7        99.9     471.0     0.23 -4        6/9/81        1.0      1.2        110.8    315.0     0.43-5         7/6/81        1.0      1.1        89.9     273.0     0.43-6         8/10/81       1.0      1.0        118.2    158.0     0.43-7         9/8/81        1.0      1.0        112.3     84.0     0.33-8         10/14/81      1.0      0.9        102.5    180.0     0.53-9         11/11/81      1.0      1.0        84.6     154.0     0.3
                    表 12用抗IgG单克隆结合物得到的ELISA结果样品        日期            ALT     OD     S/CO阴性对照                            .076切断                                .476PC(1∶128)                          1.390实例#11-1        08/05/81        40.0     .178     .371-2        09/02/81        274.0    .154     .321-3        10/07/81        261.0    .129     .271-4        11/19/81        75.0     .937     1.971-5        12/15/81        71.0     ＞3.000  ＞6.30实例#22-1        10/19/81        17.0     .058     0.122-2        11/17/81        46.0     .050     0.112-3        12/02/81        63.0     .047     0.102-4        12/14/81        152.0    .059     0.122-5        12/23/81        624.0    .070     0.152-6        01/20/82        66.0     .051     0.112-7        02/15/82        70.0     .139     0.292-8        03/17/82        24.0     1.867    3.922-9        04/21/82        53.0     ＞3.000  ＞6.302-10       05/19/82        95.0     ＞3.000  ＞6.302-11       06/14/82        37.0     ＞3.000  ＞6.30实例#33-1        04/07/81        13.0     .090     .193-2        05/12/81        236.0    .064     .133-3        05/30/81        471.0    .079     .173-4        06/09/81        315.0    .211     .443-5        07/06/81        273.0    1.707    3.593-6        08/10/81        158.0    ＞3.000  ＞6.303-7        09/08/81        84.0     ＞3.000  ＞6.303-8        10/14/81        180.0    ＞3.000  ＞6.303-9        11/11/81        154.0    ＞3.000  ＞6.30
                      表13用抗IgG和抗IgM单克隆结合物所得的ELISA结果
                                            NANB ELISAs
                                单克隆        单克隆       单克隆
                            IGG 1∶10K    IGG 1∶10K    IGG 1∶10K
                            IGM 1∶30K    IGH 1∶60K    IGM 1∶120K样品      日期
                 ALT     OD      S/CO    OD   S/CO     OD    S/CONEG CoNIRoL                  .100                .080        .079CuTofFPC(1∶128)                   1.083               1.328       1.197实例#11-1      08/05/81     40     .173                .162        .0701-2      09/02/81     274    .194                .141        .0791-3      10/07/81     261    .162                .129        .0631-4      11/19/81     75     .812                .85         .7091-5      12/15/81     71     ＞3.00              ＞3.00      ＞3.00实例#22-1      10/19/81     17     .442                .045        .0852-2      11/17/81     46     .102                .029        .0302-3      12/02/81     63     .059                .036        .0272-4      12/14/81     152    .065                .041        .0252-5      12/23/81     624    .082                .033        .0322-6      01/20/82     66     .102                .042        .0272-7      02/15/82     70     .188                .068        .0962-8      03/17/82     24     1.728               1.668       1.5412-9      04/21/82     53     ＞3.00              2.443       ＞3.002-10     05/19/82     95     ＞3.00              ＞3.00      ＞3.002-11     06/14/82     37     ＞3.00              ＞3.00      ＞3.00实例#33-1      04/07/81     13     .193                .076        .0493-2      05/12/81     236    .201                .051        .0383-3      05/30/81     471    .132                .067        .0523-4      06/09/81     315    .175                .155        .1403-5      07/06/81     273    1.335               1.238       1.2603-6      08/10/81     158    ＞3.00              ＞3.00      ＞3.003-7      09/08/81     84     ＞3.00              ＞3.00      ＞3.003-8      10/14/81     180    ＞3.00              ＞3.00      ＞3.003-9      11/11/81     154    ＞3.00              ＞3.00      ＞3.00
                      表14用多克隆结合物得到的ELISA结果
                                 NANB ELISAs
                              单克隆            TAGO             JACKSON
                              1∶10K            1∶80K           1∶80K样品          日期      ALT       OD    S/CO        OD    S/CO        OD       S/CO
                             .076              .045              .154阴性对照切断                     .476              .545              .654PC(1∶128)                       1.390             .727              2.154实例#11-1         08/05/81     40      .178    .37       .067    .12       .153      .231-2         09/02/81     274     .154    .32       .097    .18       .225      .341-3         10/07/81     261     .129    .27       .026    .05       .167      .261-4         11/19/81     75      .937    1.97      .324    .60       .793      1.211-5         12/15/81     71      ＞3.00  ＞6.30    1.778   3.27      ＞3.00    ＞4.59实例#22-1         10/19/81     17      .058    .12       .023    .04       .052      .082-2         11/17/81     46      .050    .11       .018    .03       .058      .092-3         12/02/81     63      .047    .10       .020    .04       .060      .092-4         12/14/81     152     .059    .12       .025    .05       .054      .082-5         12/23/81     624     .070    .15       .026    .05       .074      .112-6         01/20/82     66      .051    .11       .018    .03       .058      .092-7         02/15/82     70      .139    .29       .037    .07       .146      .222-8         03/17/82     24      1.867   3.92      .355    .65       1.429     2.192-9         04/21/82     53      ＞3.00  ＞6.30    .748    1.37      ＞3.00    ＞4.592-10        05/19/82     95      ＞3.00  ＞6.30    1.025   1.88      ＞3.00    ＞4.592-11        06/14/82     37      ＞3.00  ＞6.30    .917    1.68      ＞3.00    ＞4.59实例#33-1         04/07/81     13      .090    .19       .049    .09       .138      .213-2         05/12/81     236     .064    .13       .040    .07       .094      .143-3         05/30/81     471     .079    .17       .045    .08       .144      .223-4         06/09/81     315     .211    .44       .085    .16       .275      .423-5         07/06/81     273     1.707   3.59      .272    .50       1.773     2.713-6         08/10/81     158     ＞3.00  ＞6.30    1.347   2.47      ＞3.00    ＞4.593-7         09/08/81     84      ＞3.00  ＞6.30    2.294   4.21      ＞3.00    ＞4.593-8         10/14/81     180     ＞3.00  ＞6.30    ＞3.00  ＞5.50    ＞3.00    ＞4.593-9         11/11/81     154     ＞3.00  ＞6.30    ＞3.00  ＞5.50    ＞3.00    ＞4.59Ⅳ.I.6.b随机供血者的样品
将来自随机供血者血液的样品用HCV C100-3ELISA筛选HCV感染，其中抗体酶结合物是抗IgG单克隆结合物或一个多克隆结合物。对多克隆结合物和单克隆结合物，筛选的样品总数分别为1077和1056。筛选结果汇总在表15中，样品的分布显示在图44的短形图中。
平均数和标准偏差的计算排除了那些给出超过1.5信号的样品，即1073 OD值用作使用多克隆结合物的计算，1051用作使用抗IgG单克隆结合物的计算。如表15所示，当使用多克隆结合物时，平均数从0.0493移至0.0931，标准偏差从0.074增加至0.0933。而且，结果还显示，如果用X+5SD的标准来定义测量法的临界，ELISA中的多克隆-酶结合构型就要求一个较高的临界值。这意味着与单克隆体系相比试验的特异性降低了。另外，如图44中描绘的矩形图，在随机供血者血液用抗IgG单克隆结合物的ELISA测量法筛选中与用商品化的多克隆标记的测量法中的相比时，阴性和阳性分布的结果发生了较大的分离。
             表15测试隆机供血者血样二个ELISA构型的比较结合物     多克隆      抗IgG单克隆
       (Jackson)样品数       1073        1051平均数(x)    0.0931      0.04926标准编差 (SD)0.0933      0.074275SD          0.4666      0.3714临界(5SD+x)  0.5596      0.4206Ⅳ.J来自不同地理位置的NANBH病人中HCV血清转化的检测
用基本如Ⅳ.D所述的RIA法筛选来自因ALT水平升高而被凝有NANBH的血清及来自HAV和HBV测试时为阴性的血清，除了HCV C100-3抗原被用作为微滴定板中的筛选抗原。如表16中所列的结果表明，RIA检查出高百分率的阳性样品。
               表16
在不同国家的NANBH病人中抗-C100-3的血清转化频率国家              荷兰   意大利    日本检查数            5      36        26阳性数            3      29        19阳性百分数(％)    60     80        73Ⅳ.K患群体获得性(“Community Acquired”)NANBH的病人中的HCV血清转化的检测
从100个患NANBH的病人得到的血清由疾病控制中心的M.Alter博士和哈佛大学的J.Dienstag博士提供，对于这些病人无明显的传染途径(比如输血、用药，性乱交等这些被认为的危险因素)。除了HCV C100-3抗原被用作为附着在微滴定板上的筛选抗原，这些样品是用基本如Ⅳ.D.中所述的RIA法筛选。结果表明100个血清样品中，55个含有与HCV C100-3抗原有免疫反应的抗体。
上述结果提出，群体获得性(“Community Acquired”)NANBH也是由于HCV引起的。然而，因为已证实了HCV与黄热病有关，大多是通过节肢动物传染的，因此，认为在“群体获得性”病例中的HCV传染也是节肢动物的传染的结果。Ⅳ.L     与NANBH传染有关的供体中的HCV抗体的产生
       与代用指标的比较
进行预期的研究以测定接受来自疑有NANBH阳性的供血者的受血者是否发展了NANBH，将血清转化成阳性抗-HCV抗体。对供血者检查其代用指标非正常性，比如，ALT水平的提高及抗核抗体的存在。另外，还对供血者检查其抗HCV抗体的存在。抗HCV抗体的存在的测定是用如Ⅳ.K.中所述的放射免疫法测定的。研究结果列于表17，其表明，病人数(第1列)，病人血清中的抗HCV抗体的存在(第2列)，从病人那里得到的血制品数，各个血制品出自不同的供血者(第3列)，供血者血清中抗HCV抗体的存在(第4列)，供血者替代正常性(第5例)(NT表示未测定)(ALT是增加了的传染，ANTI-HBc是抗核抗体)。
表17中的结果证实HCV抗体检查在检测感染的血清提供者方面比接体标记检查更精确。10个增加了NANBH症状的病人中，有9测出阳性抗HCV抗体血清转化。11个怀疑供血者中(病人6接受了来自2个疑是NANBH载体个体的血制品)，9个是阳性抗HCV抗体，1个是临界阳性，因而是不明确(对病人1的供血者)。相反，用ALT升高的检查法查出10个供血者中6个是阴性，用抗核抗体检查法查出10个供血者中5个是阴性。更重要的是，在三个例子中(对病人8,9和10的供血者)ALT检查与抗-HBc检查的结果不一致。
                                表17接受来自疑为NANBH载体供血者血液的病人中的抗HCV抗体的改善
       病人中的抗HCV1                           抗HGV              代用非正常性病人          血清转化          血制品/供体的编号    阳性供体     Alt     抗HB1             yes                   18               equiv       no     no2             yes                   18               yes         NT     yes3             yes                   13               yes         no     no4             no                    18               no          --     --5             yes                   16               yes         yes    yes6             yes                   11               yes(2)      no     no
                                                               yes    yes7             yes                   15               yes         NT     no8             yes                   20               yes         no     yes9             yes                   5                yes         yes    no10             yes                   15               yes         no     yes
均为抗NANBV阳性供体
Ⅳ.M利用PCR和来自黄热病毒顺序的保守区域的引物扩大
     HCV cDNA顺序克隆
上面结果表明，HCV为黄热病病毒或类黄热病病毒，承认了一个克隆未定性HCV cDNA顺序的策略，该策略运用了PCR技术，及来自黄热病病毒中编码保守的氨基酸顺序的区域的引物。通常，引物中的一个来自规定的HCV基团组顺序，其他侧面相接在未定序HCV多核苷酸区段的引物是来自黄热病病毒基团的保守区段。已知黄热病病毒基因含有在NS1和E多肽内的保守顺序，编码在黄热病病毒基因的5′区段。编码这些区域的相应顺序如图26所示，在HCV cDNA的上游，因此，为了分离从HCV基因组的这一区段来的cDNA顺序，设计了上游引物，该引物来自黄热病病毒多肽中的保守顺序。下游引子来自HCV cDNA已知部分的上游末端。
由于密码的变化，有可能产生黄热病病毒探针和相应的HCV基因组顺序之间的错误配段，因此，就使用一个与Lee在1988年描述的相似的策略。Lee方法是应用与一段氨基酸顺序的反转录产物互补的混合寡核苷酸引物，该混合引物内的顺序考虑到保守的氨基酸顺序的每个密码子的变化。
在氨基酸同源性的基础上产生了三组引物混和物，这些同源性发现于几种黄热病病毒中，包括登革热-2,4(D-2,4)，日本脑炎病毒(JEV)，黄热病(YF)，和西聶尔病毒(WN)。从最上游的保守顺序(5′-1)衍生而来的引物混合物的氨基酸顺序为gly-trp-gly，该顺序是在D-2,JEV,YF和WN的E蛋白质中发现的保守顺序asp-arg-gly-trp-gly-aspN的一部分，下一个引物混合物(5′-2)是基于E蛋白质中一个下游的保守顺序，phe-asp-gly-asp-ser-tyr-ileu-phe-gly-asp-ser-tyr-ileu是从phe-gly-asp衍生而来的，从保守顺序存在于D-2,JEV,YF和WN中。第三个引物混合物(5′-3)是基于氨基酸顺序arg-ser-cys，该顺序是D-2,D-4,JEV,YF和WN的NSI蛋白质中的保守顺序cys-cys-arg-ser-cys的一部分。组成5′-3的混合物的各个引物如图45所示。除了从保守区段衍生来的可变顺序外，每个混合物中的每个引物还包含一个在5′端的恒定区段，该区段含有编码内切酶，HindⅢMboⅠ和EcoRⅠ的位点的顺序。
下游引物，ssc5h20A，是来自克隆5h中的核苷酸顺序，它含有HCV cDNA顺序，其顺序与克隆14i和11b顺序重迭。ssc5h20A顺序为
5′GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA3′
也可以用一个代替的引物ssc5h34A。该引物来自克隆5h中的顺序，并还包括在5′端的产生内切酶位点的核苷酸，由此促进克隆。ssc5h34A的顺序为
5′GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT
   GGT GAC AGA GTC A3′.
首先由Saiki等在1986描述的PCR反应基本上按Lee等在1988描述的进行，除了cDNA的模板是如Ⅳ.c.2中所述从感染HCV的黑猩猩肝中分离出来的RNA或如Ⅳ.A.1中所述从感染HCV的黑猩猩血清中分离出来的病毒颗粒。另外，复性条件在第一轮扩大中不是严格的(0.6MNaCl,25℃)，因为将要复性为HCV顺序的部分引物仅仅是9个核苷酸，可能会错误配段。然而，如果用ssc5h34A,不是来自HCV基因组的附加顺序就倾向于动摇引物摸板的杂交。第一次放大后，复性条件可以严格些(0.066M NaCl,32℃～37℃,因为现在被放大的顺序含有与引物互补或相同的区域。还有，初始10次的放大是用Klenow酶Ⅰ进行，并在对该酶合适的PCR条件下。在这几次完成后，抽提样品，再如Cetus/Perkin Elmer完成的，按试剂盒中的说明，用Taq多聚酶进行。放大以后，用来自克隆5h的探针的杂交来检测放大的HCVcDNA顺序。这个探针是来自产生引物的上游顺序，与产生引物的克隆5h中的顺序不重叠。该探针顺序为
5′ CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA
    CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG
    TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG
    GTT GAT GGC GC  3′Ⅳ.N.1由感染NANBH的黑猩猩肝建立HCVcDNA库
由从建立Ⅳ.A.1.节中HCVcDNA库的黑猩猩的肝建立一个HCVcDNA库。建立该库的技术相似于Ⅳ.A.24节中所述，除了RNA的来源不同，以及采用基于克隆11b中的HCVcDNA顺序的引物。该引物的顺序为：
5′CTG GCT TGA AGA ATC 3′Ⅳ.N.2使克隆k9-1中的HCVcDNA与克隆11b中cDNA重叠的
     分离和核苷酸顺序
如Ⅳ.A.25，节中所述，使克隆k9-1与由NANBH感染的黑猩猩的肝建立的HCV DNA库分离。采用在5′末端上重叠克隆11b的克隆一克隆11e，从该库中筛选重叠克隆11b中顺序的克隆。图23所示为克隆11b的顺序。分离阳性克隆的频率为1/50,000。一种分离的克隆k9-1要进一步研究。通过用克隆Alex 46探测克隆，证实了克隆k9-1中HCVcDNA与图26中的HCVcDNA顺序的5′末端的重叠性；如上所述，后者克隆含有相应于在克隆14i中的HCVcDNA的5′末端上的碱基对的30碱基对的HCVcDNA顺序。
采用上述的技术测定与克性k9-1分离的HCVcDNA核苷酸顺序。图46所示为克隆k9-1中的HCVcDNA的顺序、与图26中的HCVcDNA重叠部分以及其中编码的氨基酸。
使克隆k9-1中的HCVcDNA顺序与Ⅳ.A.19中所述的克隆的顺序一致，以便用位于图32中所示的顺序上游的k9-1顺序建立复合HCVcDNA顺序，图47所示为含有k9-1顺序的复合HCVcDNA以及其中编码的氨基酸。关于疏水性和亲水性的区域外形，如上所述，以图47中所示的HCVcDNA的5′区中编码的氨基酸顺序于Dengue病毒的其中一个菌株的相应区作比较。比较表明，来自在相应于编码NS1(或者其一部分)的区中编码的HCV和Dengue的多肽具有相似的疏水的/亲水的外形。
以下提供的资料能够识别HCV菌株。其他HCV菌株的分离和鉴定可以通过使核酸与含有病毒颗粒的主组分分离、用基于以下所述的HHCVcDNA探针的多核苷酸探针建立cDNA库、从该库中筛选含有以下所述的HCVcDNA顺序的克隆以及以来自新的分离体的HCVcDNA与以下所述的cDNA作比较来完成。利用上述的多肽和抗体，对免疫交叉反应性可以监控其中或者在病毒基因组内编码的多肽。如以上定义章节中所述，HCV的参量中固定的菌株是可易于识别的。基于本文所提供的资料，识别HCV菌株的其他方法对本领域中的技术人员来说将是显而易见的。Ⅳ.0.HCV的表位定位研究Ⅳ0.1实验设计
表位定位实验是用重复合成八肽以延伸在HCV互补DNA(cDNA)编码链中编码的HCV多肽区域来完成的。所得到的八肽用经诊断已有HCV感染的病人的抗血清中得到的HCV抗体，通过测定免疫反应性的方法来测试HCV抗原决定基。Ⅳ.0.2.HCV基因组的表位定位图Ⅳ.0.2.a重叠多肽的合成
聚乙烯钉的8×12列阵排列块(Coselco Mimetopes,Victoria,Australia)是通过将钉置于室温下含20％v/v哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)浴中30分钟来制备的。然后取出该钉，在DMF中洗5分钟，然后在甲醇中洗4次(每次2分钟)。该钉在空气中干燥至少10分钟，然后在DMF中最后一次洗(5分钟)。将1-羟基苯并三唑(HOBt,367mg)，溶于DMF(80ml)中，以作联结由Fmoc保护的以下氨基酸之用：Fmoc-L-Ala-Opfp,Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp,Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OPfp,Fmoc-L-Glu(O-tBu)-OPfp,Fmoc-L-Phe-OPfp,Fmoc-Gly-OPfp,Fmoc-L-His(Boc)-OPfp,Fmoc-L-Ile-OPfp,Fmoc-L-LYs-(Boc)-OPfp,Fmoc-L-Leu-OPfp,Fmoc-L-Met-OPfp,Fmoc-L-Asn-OPfp,Fmoc-L-Pro-OPfp,Fmoc-L-Gln-OPfp,Fmoc-L-Arg(Mtr)-OPfp,Fmoc-L-Ser(t-Bu)-ODhbt,Fmoc-L-Thr(t-Bu)-EDhbt,Fmoc-L-Val-OPfp,和Fmoc-L-TYr-OPfp.
将该受保护的氨基酸放入带有HOBt的微量滴定板孔中，然后将钉列阵块放于板上，将钉浸于孔中。该装置然后被封入一塑料袋中，在25℃反应18小时，以使第一个氨基酸联结到钉上。然后再取出该列阵块，将钉以DMF洗2分钟，甲醇洗4次，每次2分钟，再以DMF洗2分钟，以清除和去保护该结合氨基酸。该过程对第一被联结的附加氨基酸均重复进行，直至所有八肽被制备完毕。
然后将游离N末端乙酰化，以补充游离酰胺基。抗原决定簇中极大多数是不能在N末端发现的，也就不会有相关的阳性电荷。在微量滴定板孔中注满DMF/醋酐/三乙胺(5∶2∶1v/v/v)使钉能于20℃下，在孔中反应90分钟来完成乙酰化。该钉然后以DMF洗(2分钟)，甲醇洗4次，每次2分钟，在空气中干燥至少10分钟。在聚丙烯袋中，以三氟醋酸/苯酚/二硫乙烷(95∶2.5∶2.5v/v/v)在室温下处理钉4小时，以去除侧链保护基团。然后将钉以二氯甲烷洗2次(每次2分钟)，5％双异丙基乙胺/二氯甲烷洗2次(每次5分钟)，二氯甲烷洗5分钟，再在空气中至少干燥10分钟。然后将钉在水中洗2分钟，甲醇中洗18小时，在真空中干燥，储在置于硅胶上的封闭塑料袋中。Ⅳ.0.2.b肽测试
(a)方法：将按Ⅳ.B.15.a制备的八肽联结的钉首先在裂解缓冲液(1％十二烷基磺酸钠，0.1％2-巯基乙醇，0.1M NaH2PO4)中，在60℃下，以超声波处理30分钟。然后将钉在(60℃)水中浸几次，随后置于沸甲醇中(2分钟)，再在空气中干燥。
该钉在每孔含有200μl封闭缓冲液(含1％卵白蛋白，1％小牛血清白蛋白，0.1％吐温，0.05叠氮钠的磷酸缓冲液)的微量滴定板孔中，于25℃在振摇下预包被1小时。然后该钉浸入含有从被诊断为有HCV的病人所得的175μl抗血清的微量滴定板孔中，在4℃培育过夜。将该钉对由3名病人所得的抗血清进行测试。标本#PAA 3663-S(“A”)显示出HCV Western杂交、HCV竞争ELISA,HCV克隆C100-3ELISA(在1∶1000稀释时)的强列反应，和对C100,5-1-1和C33c(C22未做)4+以上的重组免疫杂交试验(RIBA)反应。干净的血浆以封闭液作1∶500稀释。标本#PAA33028(“B”)显示出对HCV Western杂交与HCV竞色性ELISA的强反应。对克隆C100-3的HCV ELISA(在1∶500稀释时)的强反应，和对C100,5-1-1,C33c和C22的4+以上重组免疫杂交试验(RI-BA)反应。多克隆的抗血清部分经由A蛋白柱通道予以纯化，然后以封闭液作1∶200稀释后加以使用。标本#PAA s32931(“C”)呈现HCV Western杂交(3+)，HCV竞争ELISA，对克隆C100-3的HCVELISA(在1∶64)稀释时)中等度反应，对C100和5-1-1分别为3+和4+的重组免疫杂交试验反应(C33c和C22未做)。多克隆抗血清部分地通过A蛋白柱通道纯化，然后以封闭液作1∶500稀释后加以使用。
将钉于室温下，在PBS/Tween 20中洗4次，每次10分钟，然后于含有辣根过氧化物酶标记的山羊抗人免疫球蛋白抗血清(175μl，在不含叠氮钠的封闭液中，以：1∶2000稀释)的微量滴定板孔中，于25℃下震摇孵育1小时。抗人抗血清对人免疫球蛋白的轻、重链是特异的，可与IgG和IgM二类免疫球蛋的反应。然后将该钉再于室温下，在PBS/Tween 20中洗4次，每次10分钟。
底物溶液是以蒸馏水稀释NaH2PO4(1M,200ml)和枸橼酸(1M,160ml)来制备，校正pH至4.0。将连氮基-二-3-乙基苯噻唑烷磺酸酯(ABTS,50mg)和过氧化氢(0.3μl/ml)于用前立即加于100ml缓冲液中，以完成底物溶液。底物缓冲液(150μl)加入微量滴定板的每孔中，钉浸入该孔中，在25℃，于暗处孵育。在显色后，以取出钉的方式中止反应，于4.5nm处读取溶液之吸光度。
(B)结果：列于下面的八肽是与抗HCV抗血清起免疫反应的。能与所有三种抗血清起反应的肽列为表位，而仅能与1或2种抗血清起反应的肽列为弱表位(以“～”标记)。特别强的表位用字母(例如EpAA)而不是数字来标记。(参见八肽目录，附件A)。
                   工业应用
此公开的本发明的各种各样的揭示有许多工业用途，下列其中的几种。HCVcDNAs可用作检测样品中HCV核酸的探针的设计。来自cDNAs的探针可用来检测比如在化学合成反应中的HCV核酸。它们还可用在筛选抗病毒试剂的方案以确定该试剂在阻止细胞培养体系及动物类体系中病毒的复制的效果，HCV聚核苷酸探针在检测人体中的病毒核苷酸也是有用的，这样，反过来可以作为人体感染HCV的诊断基础。
除了上述的以外，在此提出的cDNAs提供了合成含有HCV表位的多肽的信息和方法，这些多肽在检测对HCV抗原的抗体中是上有用的。一系列感染HCV的免疫测定法基于含有在此所述的HCV表位的重组合多肽，并将发现在诊断HCV引起的NANBH中，在筛选血库中HCV引起的感染性肝炎的供血者中以及检测来自感染性供血者的污染血液中是可行有用的。病毒抗原还有在监测动物类体系中抗病毒剂的功效方面的用途。此外，在此公开的来自HCVcDNAs的多肽可用作治疗感染HCV的疫苗。
来自HCVcDNAs的多肽除了上述用途外，对提高抗HCV抗体也是有用的。这样，它们就可被用在抗HCV疫苗中。然而，作为与HCV多肽免疫的结果而产生的抗体在检测样品中病毒的存在也是有用的，因此，它们可用于测量化学体系中HCV多肽的产物。抗HCV抗体还可被用于监测筛选方案中抗病毒试剂的功效，这些试剂在该方案中是在组织培养体系里检查的。它们还可用于被动免疫疗法，及通过施行血液供给者和接受者中病毒抗原的检查来治疗HCV引起的NANBH。抗HCV抗体另一个重要用途是在用于病毒和病毒多肽的纯化的亲合层析法方面。纯化的病毒和病毒多肽制备可用在疫苗中。然而，纯化的病毒还对细胞培养体系的改善是有用的，在该体系中HCV进行复制。
含有感染HCV细胞的细胞培养体系可有许多用途。它们可用于相对大规模生产的HCV，其通常情况下是低效价病毒。这些体系还可用来阐明病毒的分子生物学，并引导抗病毒试剂的发展。细胞培养体系在筛选抗病毒试剂功效方面也是有用的。另外，HCV容纳细胞培养体系对稀释HCV株的制备是有用的。
为了方便起见，抗HCV抗体和HCV多肽，要么是天然的，要么是重结合的，可包装在盒里。
用于分离NANBVcDNA的方法，包括在一个表达载体中制备一个来自个体的感染组织的cDNA库以及以抗体的免疫反应性的筛选表达产物，该抗体含有来自第二次感染的个体的躯体组分；该方法对分离来自其它前述的未定性疾病病原体的cDNAs也是有效的，这些病原体由基因组成分组成。这样，反过来可以引起对这些病原体的分离和定性，以及制备针对这些疾病病原体的诊断试剂和疫苗。

Claims (8)

1．制备一种分离多肽的方法，所述分离多肽包含由HCV基因组编码的作为HCV功能基团的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述HCV基因组包含至少24个连续核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸的序列与如下序列的任一链互补：(ⅰ)储存于CCTCC No.M88125、或CCTCC No.M88126、或CCTCC No.M88127、或CCTCCNo.M88128、或CCTCC No.M88129的HCV cDNA的任一链，或(ⅱ)如下核苷酸序列的任一链：通过15e而得到的DNA的结合ORFGlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArgProLeuThrAspPheAspGlnGlyTrpGly1    CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGGGTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCCProIleSerTyrAlaAsnGlySerGlyProAspGlnArgProTyrCysTrpHisTyrPro61   GCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACCCGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG
   ProLysProCysGlyIleValProAlaLysSerValCysGlyProValTyrCysPheThr121  CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA
 GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT
   ProSerProValValValGlyThrThrAspArgSerGlyAlaProThrTyrSerTrpGly181  CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG
 GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC
   GluAsnAspThrAspValPheValLeuAsnAsnThrArgProProLeuGlyAsnTrpPhe241  GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT
 CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA
   GlyCysThrTrpMetAsnSerThrGlyPheThrLysValCysGlyAlaProProCysVal301  TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG
 AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC
   IleGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHisCysProThrAspCysPheArgLysHisPro361  TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC
 AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG
   AspAlaThrTyrSerArgCysGlySerGlyProTrpIleThrProArgCysLeuValAsp421  CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG
 GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC
   TyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThrIleAsnTyrThrIlePheLysIleArg481  ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCA
 TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGT
   MetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGlu541  GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG
 CCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC
   ArgCysAspLeuGiuAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeuLeuLeuThrThrThr601  AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA
 TTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT
   GlnTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIle661  CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA
 GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT
   HisLeuHisGlnAsnIleValAspValGlnPyrLeuTyrGlyValGlySerSerIleAla721  TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG
 AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC
   SerTrpAlaIleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArg781  CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC
 GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG
   ValCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn841  GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGA
 CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCT
   LeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeuValSerPheLeuVal901  ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG
 TGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC
   PhepheCysPheAlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpValProGlyAlaValTyrThrPhe961  TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCT
  ACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA
    TyrGlyMetTrpProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeu1021  TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCG TTGCCCCAG CGGGCGTACGCGC
  AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCG
    AspThrGluValAlaAlaSerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThr1081  TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGA
  ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACT
    LeuSerProTyrTyrLysArgTyrIleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuGlnTyrPheLeu1141  CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC
  GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG
    ThrArgValGluAlaGlnLeuHisValTrpIleProProLeuAsnValArgGlyGlyArg1201  TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC
  ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG
    AspAlaValIleLeuLeuMetCysAlaValHisProThrLeuValPheAspIleThrLys1261  GCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA
  CGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT
    LeuLeuLeuAlaValPheGlyProLeuTrpIleLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValPro1321  AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTAC
  TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATG
    TyrPheValArgValGlnGlyLeuLeuArgPheCysAlaLeuAlaArgLysMetIleGly1381  CCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCG
  GGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGC
    GlyHisTyrValGlnMetValIleIleLysLeuGlyAlaLeuThrGlyThrTyrValTyr1441  GAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTT
  CTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAA
    AsnHisLeuThrProLeuArgAspTrpAlaHisAsnGlyLeuArgAspLeuAlaValAla1501  ATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGG
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    ValGluProValValPheSerGlnMetGluThrLysLeuIleThrTrpGlyAlaAspThr1561  CTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATA
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    AlaAlaCysGlyAspIleIleAsnGlyLeuProValSerAlaArgArgGlyArgGluIle1621  CCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGGAGA
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    LeuLeuGlyProAlaAspGlyMetValSerLysGlyTrpArgLeuLeuAlaProIleThr1681  TACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCA
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    AlaTyrAlaGlnGlnThrArgGlyLeuLeuGlyCysIleIleThrSerLeuThrGlyArg1741  CGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACCAGCCTAACTGGCC
  GCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGG
    AspLysAsnGlnValGluGlyGluValGlnIleValSerThrAlaAlaGlnThrPheLeu1801  GGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCC
  CCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGG
    AlaThrCysIleAsnGlyValCysTrpThrValTyrHisGlyAlaGlyThrArgThrIle1861  TGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCA
  ACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGT
    AlaSerProLysGlyProValIleGlnMetTyrThrAsnValAspGlnAspLeuValGly1921  TCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGG
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    TrpProAlaProGlnGlySerArgSerLeuThrProCysThrCysGlySerSerAspLeu1981  GCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACC
  CGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGG
    TyrLeuValThrArgHisAlaAspValIleProValArgArgArgGlyAspSerArgGly2041  TTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGG
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    SerLeuLeuSerProArgProIleSerTyrLeuLysGlySerSerGlyGlyProLeuLeu2101  GCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGT
  CGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACA
    CysProAlaGlyHisAlaValGlyIlePheArgAlaAlaValCysThrArgGlyValAla2161  TGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGG
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  GATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACA
    ThrAspAsnSerSerProProValValProGlnSerPheGlnValAlaHisLeuHisAla2281  TCACGGATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATG
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    ProThrGlySerGlyLysSerThrLysValProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLys2341  CTCCCACAGGCAGCGGCAAAAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATA
  GAGGGTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATAT
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     AlaHisGlyIleAspProAsnIleArgThrGlyValArgThrIleThrThrGlySerPro2461  AGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCC
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  TACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGC
    ThrValLeuAspGlnAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValValLeuAlaThrAlaThr2641  GCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCA
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    ProProGlySerValThrValProHisProAsnIieGluGluValAlaLeuSerThrThr2701  CCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCA
  GGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGT
    GlyGluIleProPheTyrGlyLysAlaIleProLeuGluValIleLysGlyGlyArgHis2761  CCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGAC
  GGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTG
    LeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuValAlaLeu2821  ATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCAT
  TAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTA
    GlyIleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerValIleProThrSerGly2881  TGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCG
  ACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGC
    AspValValValValAlaThrAspAlaLeuMetThrGlyTyrThrGlyAspPheAspSer2941  GCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACT
  CGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGA
    ValIleAspCysAsnThrCysValThrGlnThrValAspPheSerLeuAspProThrPhe3001  CGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCT
  GCCACTATCTGACGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGA
    ThrlleGluThrIleThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThrGlnArgArgGlyArg3061  TCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCA
  AGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGT
    ThrGlyArgGlyLysProGlyIleTyrArgPheValAlaProGlyGluArgProSerGly3121  GGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCG
  CCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGC
    MetPheAspSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu3181  GCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGC
  CGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCG
    ThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyrMeLAsnThrProGlyLeuProVal3241  TCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCG
  AGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGC
    CysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeuThrHisIleAspAla3301  TGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATG
  ACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTAC
    HisPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGln3361  CCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACC
  GGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGG
    AlaThrValCysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTrpAspGlnMetTrpLysCys3421  AAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGT
  TTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCA
    LeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAla3481  GTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCG
  CAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGC
    ValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisProValThrLysTyrIleMetThrCysMetSer3541  CTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGT
  GACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACA
    AlaAspLeuGluValValThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyValLeuAlaAlaLeu3601  CGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTT
  GCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAA
    AlaAlaTyrCysLeuSarThrGlyCysValValIleValGlyArgValValLeuSerGly3661  TGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCG
  ACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGC
    LysProAlaIleIleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluMetGluGlu3721  GGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAG
  CCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTC
    CysSerGlnHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPheLysGln3781  AGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGC
  TCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCG
    LysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaProAlaVal3841  AGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTG
  TCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGAC
    GlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPheIleSer3901  TCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCA
  AGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGT
    GlyIleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnProAlaIleAlaSerLeu3961  GTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCAT
  CACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTA
    MetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGlnThrLeuLeuPheAsn4021  TGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCA
  ACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGT
    IleLeuGlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheVal4081  ACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTG
  TGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAAC
    GlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlaIleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeuIleAsp4141  TGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAG
  ACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATC
    IleLeuAlaGlyTyrGlyAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAlaPheLysIleMetSer4201  ACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGA
  TGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACT
    GlyGluValProSerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAlaIleLauSerProGly4261  GCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCG
  CGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGC
    AlaLeuValValGlyValValCysAlaAlaIleLeuArgArgHisValGlyProGlyGlu4321  GAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCG
  CTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGC
    GlyAlaValGlnTrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSer4381  AGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTT
  TCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAA
    ProThrHisTyrValProGluSerAspAlaAlaAlaArgValThrAlaIleLeuSerSer4441   CCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCA
   GGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGT
     LeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeuHisGlnTrpIleSerSerGluCysThrThr4501  GCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCA
  CGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGT
    ProCysSerGlySerTrpLeuArgAspIleTrpAspTrpIleCysGluValLeuSerAsp4561  CTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCG
  GAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGC
    PheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMetProGlnLeuProGlyIleProPheValSer4621  ACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGT
  TGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACA
    CysGlnArgGlyTyrLysGlyValTrpArgValAspGlyIleMetHisThrArgCysHis4681  CCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCC
  GGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGG
    CysGlyAlaGluIleThrGlyHisValLysAsnGlyThrMetArgIleValGlyProArg4741  ACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTA
  TGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGAT
    ThrCysArgAsnMetTrpSerGlyThrPheProIleAsnAlaTyrThrThrGlyProCys4801  GGACCTGCAGGAACATGTGGAG TGGGACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGGGCCCCT
  CCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGA
    ThrProLeuProAlaProAsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgValSerAlaGluGluTyr4861  GTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAAT
  CATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTA
    ValGluIleArgGlnValGlyAspPheHisTyrValThrGlyMetThrThrAspAsnLeu4921  ATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTGACAATC
  TACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAG
    LysCysProCysGlnValProSerProGluPhePheThrGluLeuAspGlyValArgLeu4981  TCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCC
  AGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTAACCTGCCCCACGCGG
    HisArgPheAlaProProCysLysProLeuLeuArgGluGluValSerPheArgValGly5041  TACATAGGTTTGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAG
  ATGTATCCAAACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATC
    LeuHisGluTyrProValGlySerGlnLeuProCysGluProGluProAspValAlaVal5101  GACTCCACGAATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCG
  CTGAGGTGCTTATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGC
    LeuThrSerMetLeuThrAspProSerHisIleThrAlaGluAlaAlaGlyArgArgLeu5161  TGTTGACGTCCATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGT
  ACAACTGCAGGTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCA
    AlaArgGlySerProProSerValAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSer5221  TGGCGAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCAT
  ACCGCTCCCCTAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTA
    LeuLysAlaThrCysThrAlaAsnHisAspSerProAspAlaGluLeuIleGluAlaAsn5281  CTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTGATGCTGAGCTCATAGAGGCCA
  GAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTACTGAGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGT
    LeuLeuTrpArgGlnGluMetGlyGlyAsnIleThrArgValGluSerGluAsnLysVal5341  ACCTCCTATGGAGGCAGGAGATGGGCGGCAACATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAG
  TGGAGGATACCTCCGTCCTCTACCCGCCGTTGTAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTC
    ValIleLeuAspSerPheAspProLeuValAlaGluGluAspGluArgGluIleSerVal5401  TGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAGGACGAGCGGGAGATCTCCG
  ACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAACACCGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGC
    ProAlaGluIleLeuArgLysSerArgArgPheAlaGluAlaLeuProValTrpAlaArg5461  TACCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGGAGATTCGCCCAGGCCCTGCCCGTTTGGGCGC
  ATGGGCGTCTTTAGGACGCCTTCAGAGCCTCTAAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCG
    ProAspTyrAsnProProLeuValGluThrTrpLysLysProAspTyrGluProProVal5521  GGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAGCCCGACTACGAACCACCTG
  CCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTCTGCACCTTTTTCGGGCTGATGCTTGGTGGAC
    ValHisGlyCysProLeuProProProLysSerProProValProProProArgLysLys5581  TGGTCCATGGCTGTCCGCTTCCACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGCCTCCGCCTCGGAAGA
  ACCAGGTACCGACAGGCGAAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACGGAGGCGGAGCCTTCT
    ArgThrValValLeuThrGluSerThrLeuSerThrAlaLeuAlaGluLeuAlaThrArg5641  AGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGGCCGAGCTCGCCACCA
  TCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCTCGAGCGGTGGT
    SerPheGlySerSerSerThrSerGlyIleThrGlyAspAsnThrThrThrSerSerGlu5701  GAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGACAACATCCTCTG
  CTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTGTTGTAGGAGAC
    ProAlaProSerGlyCysProProAspSerAspAlaGluSerTyrSerSerMetProPro5761  AGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCC
  TCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGG
    LeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeuSerAspGlySerTrpSerThrValSerSer5821  CCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACGGTCAGTA
  GGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGCCAGTCAT
    GluAlaAsnAlaGluAspValValCysCysSerMetSerTyrSerTrpThrGlyAlaLeu5881    GTGAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACTCTTGGACAGGCGCAC
    CACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGAATGAGAACCTGTCCGCGTG
      ValThrproCysAlaAlaGluGluGlnLysLeuProIleAsnAlaLeuSerAsnSerLeu5941    TCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTAAGCAACTCGT
    AGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGATTCGTTGAGCA
      LeuArgHisHisAsnLeuValTyrSerThrThrSerArgSerAlaCysGlnArgGlnLys6001    TGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGA
    ACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCT
      LysValThrPheAspArgLeuGlnValLeuAspSerHisTyrGlnAspyalLeuLysGlu6061    AGAAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGACAGCCATrACCAGGACGTACTCAAGG
    TCTTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCC
      ValLysAlaAlaAlaSerLysValLysAlaAsnLeuLeuSerValGluGluAlaCysSer6121    AGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCGTAGAGGAAGCTTGCA
    TCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAACGATAGGCATCTCCTTCGAACGT
      LeuThrProProHisSerAlaLysSerLysPheGlyTyrGlyAlaLysAspValArgCys6181    GCCTGACGCCCCCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGGCAAAAGACGTCCGTT
    CGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCCGTTTTCTGCAGGCAA
      HisAlaArgLysAlaValThrHisIleAsnSerValTrpLysAspLeuLeuGluAspAsn6241    GCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGAAAGACCTTCTGGAAGACA
    CGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTrGAGGCACACCTTTCTGGAAGACCTTCTGT
      ValThrProIleAspThrThrIleMetAlaLysAsnGluValPheCysValGlnProGlu6301    ATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCTAAGAACGAGGTTTTCTGCGTTCAGCCTG
    TACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAAAGACGCAAGTCGGAC
      LysGlyGlyArgLysProAlaArgLeuIleValPheProAspLeuGlyValArgValCys6361    AGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGCTCGTCTCATCGTGTTCCCCGATCTGGGCGTGCGCGTGT
    TCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAGACCCGCACGCGCACA
      GluLysMetAlaLeuTyrAspValValThrLysLeuproLeuAlaValMetGlySerSer6421    GCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAAAGCTCCCCTTGGCCGTGATGGGAAGCT
    CGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACCGGCACTACCCTTCGA
      TyrGlyPheGlnTyrSerProGlyGlnArgValGluPheLeuValGlnAlaTrpLysSer6431    CCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGGGTTGAATTCCTCGTGCAAGCGrGGAAGT
    GGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGCACGTTCGCACCTTCA
      LysLysThrProMetGlyPheSerTyrrAspThrArgCysPheAspSerThrValThrGlu6541    CCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACAGTCACTG
    GGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAACTGAGGTGTCAGTGAC
      SerAspIleArgThrGluGluAlaIleTyrGlnCysCysAspLeuAsoProGlnAlaArg6601    AGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAATGTTGTGACCTCGACCCCCAAGCCC
    TCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTTACAACACTGGAGCTGGGGGTTCGGG
      ValAlaIleLysSerLeuThrGluArgLeuTyrValGlyGlyProLeuThrAsnSerArg6661    GCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTATGTTGGGGGCCCTCTTACCAATTCAA
    CGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATACAACCCCCGGGAGAATGGTTAAGTT
      GlyGluAsnCysGlyTyrArgArgCysArgAlaSerGlyValLeuThrThrSerCysGly6721    GGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCGAGCGGCGTACTGACAACTAGCTGTG
    CCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGCTCGCCGCATGACTGTTGATCGACAC
      AsnThrLeuThrCysTyrIleLysAlaArgAlaAlaCysArgAlaAlaGlyLeuGlnAsp6781    GTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAGG
    CATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGTCGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTCC
      CysThrMetLeuValCysGlyAspAspLeuValValIleCysGluSerAlaGlyValGln6841    ACTGCACCATGCTCGTGTGrGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGGGTCC
    TGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACACTTTCGCGCCCCCAGG
    GluAspAlaAlaSerLeuArgAlaPheThrGluAlaMetThrArgTyrSerAlaProPro6901  AGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCCC
  TCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGTCCATGAGGCGGGGGG
    GlyAspProProGlnProGluTyrAspLeuGluLeuIleThrSerCysSerSerAsnVal6961  CTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACATCATGCTCCTCCAACG
  GACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCTCGAGTATTGTAGTACGAGGAGGTTGC
    SerValAlaHisAspGlyAlaGlyLysArgValTyrTyrLeuThrArgAspProThrThr7021  TGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAA
  ACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTT
    ProLeuAlaArgAlaAlaTrpGluThrAlaArgHisThrProValAsnSerTrpLeuGly7081  CCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTCAATTCCTGGCTAG
  GGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATC
    AsnIleIleMetPheAlaProThrLeuTrpAlaArgMetIleLeuMetThrHisPhePhe7141  GCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATACTGATGACCCATTTCT
  CGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACCCGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGA
    SerValLeuIleAlaArgAspGlnLeuGluGlnAlaLeuAspCysGluIleTyrGlyAla7201  TTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGG
  AATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCC
    CysTyrSerIleGluProLeuAspLeuProProIleIleGlnArgLeu7261  CCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC
  GGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG该方法包括提供氨基酸和聚合所述氨基酸以产生多肽。
2．按权利要求1所述的方法，其中作为HCV功能基团的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列由如下HCV cDNA序列编码：(ⅰ)储存于CCTCC No.M88125、或CCTCC No.M88126、或CCTCCNo.M88127、或CCTCC No.M88128、或CCTCC No.M88129的HCV cDNA克隆插入片段，或(ⅱ)如下核苷酸序列：通过15e而得到的DNA的结合ORF
   GlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArgProLeuThrAspPheAspGlnGlyTrpGly1    CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGG
 GTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCC
   ProIleSerTyrAlaAsnGlySerGlyProAspGlnArgProTyrCysTrpHisTyrPro61   GCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACC
 CGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG
   ProLysProCysGlyIleValProAlaLysSerValCysGlyProValTyrCysPheThr121  CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA
 GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT
   ProSerProValValValGlyThrThrAspArgSerGlyAlaProThrTyrSerTrpGly181  CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG
 GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC
   GluAsnAspThrAspValPheValLeuAsnAsnThrArgProProLeuGlyAsnTrpPhe241  GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT
 CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA
   GlyCysThrTrpMetAsnSerThrGlyPheThrLysValCysGlyAlaProProCysVal301  TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG
 AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC
   IleGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHisCysProThrAspCysPheArgLysHisPro361  TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC
 AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG
   AspAlaThrTyrSerArgCysGlySerGlyProTrpIleThrProArgCysLeuValAsp421  CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG
 GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC
   TyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThrIleAsnTyrThrIlePheLysIleArg481  ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCA
 TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGT
    MetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGlu541  GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG
 CCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC
   ArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeuLeuLeuThrThrThr601  AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA
 TTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT
   GlnTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIle661  CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA
 GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT
   HisLeuHisGlnAsnIleValAspValGlnTyrLeuTyrGlyValGlySerSerIleAla721  TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG
 AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC
   SerTrpAlaIleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArg781  CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC
 GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG
   ValCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn841  GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGA
 CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCT
   LeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeuValSerPheLeuVal901  ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG
 TGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC
    PhePheCysPheAlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpValproGlyAlaValTyrThrPhe961  TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCT
  ACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA
    TyrGlyMetTrpProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeu1021  TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC
  AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCG
    AspThrGluValAlaAlaSerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThr1081  TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGA
  ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACT
    LeuSerProTyrTyrLysArgTyrIleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuGlnTyrPheLeu1141  CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC
  GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG
    ThrArgValGluAlaGlnLeuHisValTrpIleProProLeuAsnValArgGlyGlyArg1201  TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC
  ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG
    AspAlaValIleLeuLeuMetCysAlaValHisProThrLeuValPheAspIleThrLys1261  GCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA
  CGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT
    LeuLeuLeuAlaValPheGlyProLeuTrpIleLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValPro1321  AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTAC
  TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATG
    TyrPheValArgValGlnGlyLeuLeuArgPheCysAlaLeuAlaArgLysMetIleGly1381  CCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCG
  GGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGC
    GlyHisTyrValGlnMetValIleIleLysLeuGlyAlaLeuThrGlyThrTyrValTyr1441  GAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTT
  CTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAA
    AsnHisLeuThrProLeuArgAspTrpAlaHisAsnGlyLeuArgAspLeuAlaValAla1501  ATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGG
  TATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACC
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  CGTTGTATTAGTACAAACGGSGGTGTGACACCCGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGA
    SerValLeuIlaAlaArgAspGlnLeuGluGlnAlaLeuAspCysGluIleTyrGlyAla7201  TTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGG
  AATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCC
    CysTyrSerIleGluProLeuAspLeuProProIleIleGlnArgLeu7261  CCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC
  GGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG
3．如权利要求1或2所述的方法，其中多肽用化学合成法制备。
4．如权利要求1或2所述的方法，其中多肽用重组DNA表达得到，所述方法包括：
(a)用来自HCV基因组的至少24个连续核苷酸的多核苷酸插入片段组成的表达载体转化宿主细胞，所述插入片段可操作地连接于表达载体中的控制因子；
(b)在所述宿主细胞中表达所述表达载体，使多核苷酸插入片段产生多肽；和
(c)分离所述多肽。
5．如权利要求4所述的方法，其中宿主细胞是重组大肠杆菌细胞，昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
6．如权利要求4所述的方法，其进一步包括：提供一固相基质，孵育包括多肽与固相基质组成的组合物，以使多肽固定于该固相基质。
7．按权利要求2所述的方法，其中氨基酸序列是由λ-gt11噬菌体5-1-1编码的，该菌株的保存号是CCTCC M88125。
8．按权利要求2所述的方法，其中氨基酸序列是由λ-gt11噬菌体81所编码的，该菌株的保藏号是CCTCC M88126。
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