KR19980701583A - Nanbv 진단방법 및 백신(nanbv diagnostics and vaccines) - Google Patents

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Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV)로부터 유도되는 cDNA 서열 족(family)를 제공한다. 이 서열들은 비-A 비-B 간염(NANBH)를 보유하는 개인에 존재하는 항체와 면역적으로 반응하는 그러나 A형 간염 바이러스(HAV) 또는 B형 간염 바이러스(HBV)로 감염된 개인에게는 존재하지 않는 그리고 대조균의 개인에게도 존재하지 않는 항원들을 코드화한다. 이 cDNA 서열들로 코드화된 폴리펩티드들은 HCV 항원들에 대한 항체를 일으키는데 사용될 수 있고 HCV 항원에 대한 항체의 정제에 사용될 수있다. 이 항체들은 개인들 및 헐액 은행의 수여(제공)에서 NANlBH에 연관된 HCV 항원을 검출하는 면역검사에 유용할 것이다. 또한, 이 항체들은 개인의 NANBA의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 시약들은 또한 NANlBH 인자을 분리 및 조직배양 시스템에서 이 인자들을 증폭시킬 수 있다. 또한, 이 시약들은 특히 조직배양 또는 동물 모델 시스템에서 HCV에 대한 항바이러스 인자들을 선별하기에 유용한 시약을 제공한다.

Description

NANBV 진단방법 및 백신
비-A, 비-B형 간염(NANBH) 은 전파가능한 질병 또는 바이러스-유도성인 것으로 믿어지는 질병군이며, 공지의 간염 바이러스, 즉 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV),및 델타형 간염 바이러스(HDV)에 의해 유발되는 것을 포함할 뿐만 아니라, 사이트메갈로바이러스(CMV) 또는 엡스타인-바르 바이러스(EBV)에 의해 유발되는 간염을 포함하여 바이러스-관련 간 질병의 다른 형태와는 구별된다. NANBH 는 수주된 개인에게서 처음 확인되었다. 사람으로부터 침팬지로의 전파 및 침팬지에서의 연속계대는 NANBH가 전파가능한 감염성 병원체 또는 병원체들 때문이라는 증거를 제공하였다. 그러나, NANBH의 원인이 되는 전파가능한 병원체는 여전히 미확인이고 질병을 일으킬 수 있는 병원체의 수도 알지 못한다.
역학적인 증거는 3종류의 NANBH: 물-근거의 유행병형;혈액 또는 바늘 관련형;및 산재적으로 발생하는 (획득된 지역성) 형이 있을 것이라는 것을 암시한다.
그러나, NANBH를 일으킬 만한 병원체의 수는 미지이다.
NANBH의 임상진단 및 확인은 일차적으로 다른 바이러스 마커의 배제에 의해 이루어져 왔다. 추정되는 NANB 항원과 항체의 검출에 사용된 방법중에는 아가-겔 확산법, 카운터면역전기영동법, 면역형광 현미경검사법, 면역전자 현미경검사법, 방사선면역측정법, 및 효소-결합 면역흡착 측정법이 있다. 그러나, 이들 측정법중 어떤 것도 NANBH 에 대한 진단시험법으로서 층분히 민감하고 특이적이며 재생가능한 것으로 판명된 것은 없었다.
지금까지 NANBH의 병원체와 관련된 항원항체시스템의 정체 또는 특이성에 대해서 확실한 설명이나 협약이 이루어진 것은 없었다. 이것은, 적어도 부분적으로는 개체에게서 NANBV와 함께 HBV의 앞선 또는 공-감염, 및 간세포의 게놈으로의 HBV DNA 의 통합에 뿐만아니라 HBV와 관련된 가용성 입상항원의 공지된 복합성 때문이다. 더불어, NANBH 가 잘못 진단되었을 가능성 뿐만아니라 NANBH가 하나이상의 감염성 병원체에 의해 유발되는가능성이 있다. 더욱이, 혈청학적 측정법으로NANBH 에 걸려있는 환자의 혈청에서 무엇을 검출하게 되는지는 불분명하다. 아가-겔 확산법과 카운터면역 전기영동측정법이 때로 혈청 시료간에 일어나는 자동면역반응 또는 비-특이적 단백질 상호반응을 검출하며, 그것들은 특이적인 NANBV항원-항체반응을 나타내지는 않는 것으로 가정하고 있다. 면역형광 및 효소-결합 면역 흡착법, 및 방사선면역측정법은 다른 간염 및 비간염 질병에 걸려있는 환자뿐만 아니라 NANBH에 걸려있는 환자의 혈청에 자주 존재하는 저수준의 유사류마티스 인자같은 물질을 검출한다. 검출된 반응성중 약간은 숙주-결정된 원형질 항원에 대한 항체를 나타낼 수 있다.
많은 후보 NANBV가 있다. 예를들어 프린스(1983), 파인스토운과 후우프나글리(1984), 및 오버어비(1985,1896,1987)에 의한 검토문헌과 이바르손(1987)에 의한 기사참조. 그러나, 이들 후보중 어느것도 NANBH 의 병원학적 병원체를 나타낸다는 증거는 없다.
NANBV 및 NANBV 오염된 혈액 또는 혈액 생성물의 보균자를 스크린하고 확인하기 위한 민감하고 특이적인 방법에 대한 요구는 상당하다. 수주-후 간염(PTH)은 대략 10%의 수주받은 환자에게서 일어나며 이들 경우 90%까지가 NANBH에 해당한다. 이 질병의 주된 문제점은 만성 간손상으로의 빈번한 진전이다(25-55%).
혈액 및 혈액산물에 의해 또는 밀접한 개인적 접촉에 의한 NANBH의 전파의 예방뿐만 아니라 환자의 치료는 NANBV 와 관련된 핵산, 항원 및 항체를 검출하기 위한 믿을 수 있는 진단 및 예후기구를 필요로 한다. 또한, 질병의 예방 및/ 또는 치료를 위한 효과적인 백신과 면역치료용 치료제가 필요하다.
본 발명은 비-A, 비-B형 간염 바이러스(NANBV) 감염의 확산을 방지하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 NANB 간염, 즉, C형 간염 바이러스의 병원학적 병원체에 대한 진단용 DNA 단편, 진단용 단백질, 진단용 항체 및 보호항원 및 항체에 관한 것이다.
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U.S. 특허번호 4,491,632
U.S. 특허번호 4,493,890
도 1는 클론 5-1-1의 HCV cDNA 삽입의 이중-스트란드 뉴클레오티드 서열, 및 그것에 코드화된 폴리펩티드의 추정되는 아미노산 서열을 도시한다.
도 2는 클론 5-1-1,81,1-2, 및 91 의 중첩하는 HCV cDNA 서열의 동종성을 도시한다.
도 3는 중첩하는 클론 81,1-2 및 91로부터 유도된 HCV cDNA의 혼성 서열, 및 그것에 코드화된 아미노산 서열을 도시한다.
도 4는 클론 81의 HCV cDNA 삽입의 이중-스트란드 뉴클레오티드서열 및 그것에 코드화된 폴리펩티드의 추정되는 아미노산 서열을 도시한다.
도 5는 클론 36의 HCV cDNA 서열, 클론 81의 NANB cDNA와 중첩하는 부분, 및 클론 36내에 코드화된 폴리펩티드 서열을 도시한다.
도 6도는 클론 36과 81의 HCV cDNA의 조합된 0RF, 및 그것에 코드화된 폴리펩티드를 도시한다.
도 7는 클론 32의 HCV cDNA 서열, 클론 81과 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 폴리펩티드를 도시한다.
도 8는 클론 35의 HCV cDNA 서열, 클론 36과 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 폴리펩티드를 도시한다.
도 9는 클론 35,36,81 및 32의 HCV cDNA의 조합된 ORF, 및 그것에 코드화된 폴리펩티드를 도시한다.
도 10는 클론 37b의 HCV cDNA 서열, 클론 35와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 폴리펩티드를 도시한다.
도 11는 클론 33b의 HCV cDNA 서열, 클론 32와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 폴리펩티드를 도시한다.
도 12는 클론 40b의 HCV cDNA 서열, 클론 37b와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 폴리펩티드를 도시한다.
도 13는 클론 25c의 HCV cDNA 서열, 클론 33b와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 폴리펩티드를 도시한다.
도 14는 클론 40b,37b,35,36,81,32,33b 및 25c에서 HCV cDNA를 통하여 연장하는 ORF의 그것에 코드화된 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드를 도시한다.
도 15는 클론 33c의 HCV cDNA 서열, 클론 40b와 33c와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 16는 클론 8h의 HCV cDNA 서열, 클론 33c와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 17는 클론 7e의 HCV cDNA 서열, 클론 8h와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 18는 클론 14c의 HCV cDNA 서열, 클론 25c와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 19는 클론 8f의 HCV cDNA 서열, 클론 14c와 증첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 20는 클론 33f의 HCV cDNA 서열, 클론 8f와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 21도는 클론 33g의 HCV cDNA 서열, 클론 33f와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 22는 클론 7f의 HCV cDNA 서열, 클론 7e의 서열과 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 23는 클론 11b의 HCV cDNA 서열, 클론 7f의 서열과 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 24는 클론 14i의 HCV cDNA 서열, 클론 11b의 서열과 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 25는 클론 39c의 HCV cDNA 서열, 클론 33g의 서열과 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 26는 클론 14i,11b,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,9f,33f 및 33g의 일렬로 배열된 cDNA로부터 유도된 혼성 HCV cDNA 서열을 도시하고; 또한 유도된 서열의 연장된 ORF에 코드화된 폴리펩티드의 아미노산서열을 도시한다.
도 27는 클론 12f의 HCV cDNA의 서열, 클론 14i와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 28는 클론 35f의 HCV cDNA의 서열, 클론 39c와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 29는 클론 19g의 HCV cDNA의 서열, 클론 35f와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 30는 클론 26g의 서열, 클론 19g와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 31도는 클론 15e의 서열, 클론 26g와 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 32도는 클론 12f에서 15e까지를 5' →3'방향으로 일렬로 배열함으로써 유도된 혼성 cDNA의 서열과; 연속 ORF에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 33는 융합단백질, SOD-NANB5-1-1의, BB-NANB, HAV, 및 HBV로 감염된 침팬지로부터의 침팬지 혈청과의 웨스턴 블롯의 사진을 도시한다.
도 34는 융합단백질 SOD-NANB5-1-1의, NANBV, HAV, HBV 로 감염된 사람으로부터의, 및 대조표준 사람으로부터의 혈청과의 웨스턴 블롯의 사진을 도시한다.
도 35는 벡터 pAB24의 중요한 특징을 보여주는 지도이다.
도 36는 융합 폴리펩티드 C100-3의 카르복시-말단의 추정되는 아미노산서열및 그것을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 37A는 효모에서 발현된 C100-3을 확인하는 쿠마찌블루 염색 폴리아크릴아미드겔의 사진을 도시한다.
도 37B는 NANBV 감염된 사람으로부터의 혈청과 C100-3의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 38는 클론 81의 BB-NANBV cDNA로 프로브된, BB-NANBV감염된 침팬지의 간으로부터 단리된 RNA의 노던블롯의 자동방사선 사진을 도시한다.
도 39는 클론 81의 BB-NANBV cDNA로 프로브된, RNase A 또는 DNase I로 처리된 NANBV핵산의 자동방사선 사진을 도시한다.
도 40는 클론 81로부터의32P-표지 NANBV cDNA로 프로브되고, 감염된 혈장으로부터 획득된 NANBV입자로부터 추출된 핵산의 항-NANB5-1-1과의 자동방사선 사진을도시한다.
도 41는 클론 81의 NANBV cDNA로부터 유도된32P-표지 플러스 및 마이너스 스트란드 DNA 프로브로 프로브된, 단리된 NANBV 핵산함유 필터의 자동방사선 사진을 도시한다.
도 42는 HCV cDNA에 코드화된 폴리펩티드와 덴그 플래비바이러스로부터의 NS 단백질사이의 동종성을 도시한다.
도 43는 ELISA 스크리닝에 의해 측정된, 무작위 샘플중의 HCV 감염의 분포의 막대그래프를 도시한다.
도 44는 ELISA 측정법으로 면역글로불린-효소 포합체의 2가지 구성을 사용하여 무작위 샘플중의 HCV감염의 분포를 구한 막대그래프를 도시한다.
도 45는 플래비바이러스의 NS1에 보존된 서열로부터 유도된, 프라이머믹스의 서열을 도시한다.
도 46는 클론 k9-1의 HCV cDNA서열;도 26의 서열과 중첩하는 부분, 및 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
도 47는 클론 k9-1에서 15e를 5' → 3'방향으로 일렬로 배열함으로써 유도된 혼성 cDNA 서열;또한 연속 ORF에 코드화된 아미노산 서열을 도시한다.
(실시예)
아래의 설명은 본발명의 범주를 제한하는 것이 아니라 단지 예시의 목적으로 제공된 본발명의 실시예이다. 본 설명으로, 특허청구범위의 범주내에 있는 많은 구체예가 기술분야에 숙련된 사람들에게 분명해질 것이다. 예를들어 단원 IV.A.에 설명된 과정은, 기법이 발명에 의해 제공된 정보를 토대로 한 소정 뉴클레오티드 서열의 제조에 대해 활용가능하기 때문에 원한다면, 반복할 수도 있고 반복하지 않아도 된다. 발현은 대장균에서 실례화된다;그러나 다른 시스템도 단원 Ⅲ.A에서 보다 널리 설명된 바와같이 활용가능하다. 게놈구조로부터 유도된 추가의 에피토프 또한 제조할 수 있으며, 아래에서 설명하는 바와같이 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
Ⅳ.A. HCV cDNA의 제조, 단리 및 서열분석
Ⅳ.1. HCV cDNA의 제조
NANB 병원체의 공급원은 만성 NANBH에 걸린 침팬지로부터 유도된 혈장 푸울이었다. 침팬지는 푸울된 사람혈청으로부터 유도된 제 8인자 농축물의 오염된 배치에서 HCV로의 감염으로부터 유발된 만성 NANBH에 걸린 다른 침팬지의 혈액으로 과거에 감염된 바 있었다. 침팬지 혈장푸울을 고수준의 알라닌 아미노 전달효소 활성을 함유하고 있는 많은 개개의 혈장샘플을 조합함으로써 만들었다; 이 활성은 HCV 감염에 의거한 간상해로부터 유발된다. 이 푸울된 혈청의 10-6희석의 1ml을 정맥내 주사한 경우 다른 침팬지에서 NANBH를 유발하였기 때문에, 그것의 CID는 적어도 106/ml이었다. 즉, 그것은 높은 감염성 바이러스 역가를 가졌다.
고역가의 혈장푸울로부터의 cDNA 라이브러리는 다음과 같이 제조하였다. 먼저, 바이러스 입자를 혈장으로부터 단리하였다;90ml의 알리을 50mM Tris-HC1, pH8.0, 1mM EDTA, 100mM NaCl함유 용액 310ml로 희석시켰다. 파편을 15,000 xg에서 20℃에서 20분동안 원심분리에 의해 제거하였다. 그 결과의 상징액중의 바이러스 입자를 그런 다음에 벡그만 SW28 로터로 28,000rpm에서 5시간동안 20℃에서 원심분리함으로써 펠릿화하였다. 바이러스 게놈을 방출시키기 위하여 팰릿을 1% 도데실 황산나트륨(SDS), 10mM EDTA, 10mM Tris-HC1, pH 7.5, 또한 2mg/ml의 프로테이나제 k를 함유하고 있는 용액 15ml에 현탁시킨 후 이어서 45℃에서 90분동안 배양함으로써 입자를 파괴하였다. 담체로서 0.8μg의 MS2 박테리오파지 RNA를 첨가하고 혼합물을 페놀:클로로포름의 1:1혼합물 (페놀을 0.5M Tris-HC1, pH7.5, 0.1%(v/v)베르메르캅토에탄올, 0.1%(w/v) 히드록시퀴놀린으로 포화시킨 후, 클로로포름으로 2회 추출한다)로 추출함으로써 핵산을 단리하였다. 수성층을 2.5배 부피의 절대에탄올로 밤새 -20℃에서 예비침전시키기 전에 1-부탄올로 농축시켰다. 핵산을 벡크만 SW41 로터로 40,000rpm에서 90분동안 4℃에서의 원심분리로 회수하고 0.05%(v/v) 디에틸피로카보네이트로 처리하고 오토클레이브하여 놓은 물에 녹였다.
상기 과정에 의하여 얻어진 핵산( 2μg)을 17.5mM CH3HgOH로 변성시켰다;이 변성된 핵산을 주형으로서 사용하여 cDNA를 합성하여, 역전사효소(Toylor et al(1976))에 의해 첫번째 cDNA 스트란드의 합성중에 랜덤 프라이머로올리고(dT) 12-18을 대신한 것외에는 Huynh에 의해 기재된 방법(1985)을 사용하여 파지 람다-gtl1의 EcoRI부위에 클론하였다. 그 결과 형성된 이중 스트란드의 cDNA를 크기에 따라 세파로스 CL-4B 컬럼상에서 분별하고; 대략 평균크기 400,300,200 및 100염기쌍의 용출된 물질을 각각 cDNA 푸울 1,2,3 및 4로 모았다. 람다-gtl1 cDNA 라이브러리를 푸울 3의 cDNA로부터 제조하였다.
푸울 3으로부터 제조한 람다-gtll cDNA 라이브러리를 과거에 NANBH에 걸렸던 경험이 있는 환자로부터 유도된 혈청과 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프에 대하여 스크린하였다. 약 106파지를 환자의 혈청으로 Huynh등의 방법(l985)을 사용하여 스크린하였다. 단, 결합된 사람항체는125I로 방사선-표지되어 있는 양(sheep)항-사람 Ig 항 혈청으로 검출하였다. 다섯개의 양성파지를 확인하고 정제하였다. 그런다음 그 다섯개의 양성 파지를, 동일방법을 사용하여 NANBH 병원체로 감염된 바 있는 8명의 상이한 환자의 혈청에 대한 결합 특이성에 대하여 시험하였다. 4개의 파지가 단지 하나 즉, 파지 라이브러리의 일차 스크리닝에 대해 사용된 하나의 사람혈청과 면역학적으로 반응하는 폴리펩티드를 코드화하였다. 다섯번째 파지(5-1-1) 는 8의 시험한 혈청중 5가지와 면역학적으로 반응하는 폴리펩티드를 코드화하였다. 더욱이, 이 폴리펩티드는 7의 정상혈액 수여자로부터의 혈청과는 면역학적으로 반응하지 않았다. 그러므로, 클론 5-1-1이 NANB 환자의 혈청에 의하여 면역학적으로 특이적으로 인지되는 폴리펩티드를 코드화하는 것으로 여겨진다.
IV.A.2. 재조합 파지 5-1-1의 HCV cDNA의 서열, 및 서열내에 코드화된 폴리펩티드의 서열
재조합 파지 5-1-1의 cDNA 를 상거등의 방법(1977)에 의하여 서열화하였다. 본질적으로, cDNA는 EcoRI으로 절출하였고, 겔전기영동을 사용하여 크기 분별에 의하여 단리하었다. EcoRI 제한단편을 M13벡터, mp18과 mp19 (Messing(1983))에 하위 클론하였고 상거등의 디데옥시사슬 종결방법(1977)을 사용하여 서열분석하였다. 얻어진 서열을 제 1도에 도시한다.
HCV cDNA에 코드화된 도 1에 코드화된 폴리펩티드는 그것에 융합되고 N-말단 베타-갈락토시다제 부분과 동일한 번역프레임에 있다. 단원 IV.A 에 제시된 바와같이, 5-1-1의 번역오픈리딩프레임(ORF)은 NANBH 감염된 환자 및 침팬지의 혈청에 의하여 특이적으로 인지되는 에피토프(들)을 코드화한다.
IV. A.3. 클론 5-1-1의 cDNA 에 대한 증첩 HCV cDNA 의 단리
클론 5-1-1의 cDNA 에 대한 중첩 HCV cDNA를 도 1에 도시된 바, 클론 5-1-1의 HCV cDNA 의 서열로부터 유도된 합성 폴리뉴클레오티드로 단원 IV.A.1 에 기재한 바와같이 제조된 동일한 람다-gtl1 라이브러리를 스크린함으로써 얻었다. 스크리닝에 사용된 폴리뉴클레오티드의 서열은 다음과 같았다:
5 ' -TCC CTT GCT CGA TGT ACG GTA AGT GCT GAG AGC ACT CTT CCA TCT CAT CGA
ACT CTC GGT AGA GGA CTT CCC TGT CAG GT-3 '
람다-gt11 라이브러리를 이 프로브로, Huynh(1985)에 기재된 방법을 사용하여 스크린하였다. 대략 50,000 클론중의 하나가 프로브와 혼성하였다. 합성 프로브와 혼성된 cDNA를 함유한 3개의 클론을 81,1-2, 및 91로 번호를 정하였다.
Ⅳ.A.4. 클론 5-1-1에서 HCV cDNAs에 대한 중첩 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열
클론 81,1-2 및 91에서 3개의 cDNAs의 뉴클레오티드 서열을 본질적으로 단원 IV.A.2 대로 측정하였다. 파지 5-1-1의 HCV cDNA 서열과 비교한 이들 클론의 서열을 도 2에 도시하고, 그것은 검출된 HCV 에피토프를 코드화하는 스트란드를 나타내며, 뉴클레오티드 서열에서 동종성을 서열사이의 수직선으로 표시하였다. 클론된 HCV cDNAs의 서열은 중첩영역에 높은 동종성이 있다 (도 2참조). 그러나, 두영역에 차이가 있다. 클론 1 -2에서 뉴클레오티드 67은 티미딘이고, 한편, 다른 3클론은 이 위치에 시티딘 기를 함유한다. 그러나, C 또는 T 중 하나가 이 위치를 차지할 경우, 동일한 아미노산이 코드화된다는 것을 주목해야 한다.
두번째 차이는 클론 5-1-1이 다른 3클론에 존재하지 않는 28 염기쌍을 함유하는 것이다. 이들 염기쌍은 5-1-1의 cDNA 서열의 출발에서 일어나고, 소문자로 표시한다. 단원 IV.D 중 아래에서 논의되는 방사선 면역측정 데이타에 입각하여, HCV 에피토프는 이 28bp 영역에서 코드화될 수 있다.
클론 81,1-2, 및 91 로부터의 5-1-1의 28 염기쌍의 부재는 이들 클론에서 게놈에서 유래한다는 것을 의미할 수 있다;또는, 28b 영역은 클론 5-1-1에서 말단 인공물일 수 있다.
\클론 81과 91의 뉴클레오티드 서열에서 소문자의 서열은, 단순히 이들 영역을 중첩하는 cDNAs가 아직 단리되지 않았기 때문에, 이들 서열이 다른 cDNAs에서는 발견되지 않는다는 것을 지시한다.
클론 5-1-1,81,1-2와 91에서 중첩 cDNA로부터 유도되는 혼성 HCV cDNA 서열을 도 3에 도시한다. 그러나, 이 도면에서, 클론 5-1-1의 유일한 략된다. 도면은 또한 혼성 HCV cDNA 의 ORF내에 코드화된 폴리펩티드 28 염기쌍은 생략된다. 도면은 또한 혼성 HCV cDNA의 ORF내에 코드화된 폴리펩티드 서열을 보여준다.
Ⅳ.A.5. 클론 81에서 cDNA에 대한 중첩 HCVcDNA의 단리
클론 81 cDNA에서 cDNA 서열을 중첩하는, 위쪽의 HCV cDNA 서열의 단리를 다음과 같이 완성하였다. 단원 Ⅳ.A.1에 기술한대로 제조한 람다-gt11 cDNA 라이브러리를 클론 81의 5'말단 서열에 동종성인 합성 폴리뉴클레오티드 프로브와의 혼성화에 의해 스크린하였다. 클론 81의 서열을 도 4에 제시한다. 스크리닝에 사용되는 합성 폴리뉴클레오티드의 서열은 다음과 같았다:
5' CTG TCA GGT ATG ATT GCC GCC TTc CCG GAC 3'
라이브러리 필터를 엄격한 조건하에서 2번 세척한 것, 즉, 세척을 55℃, 5 × SSC, 0.1% SDS에서 각각 30분간 실시하는 것을 제외하고는 방법은 본질적으로 Huynh(1985)에서 기술한대로다. 50,000클론에 약 하나가 프로브와 혼성화한다. 서열과 혼성화하는 cDNA 함유 포지티브 재조합 파지를 단리하고 정제하였다. 이 파지는 클론 36 으로 넘버링하였다.
클론 81 cDNA에서 카르복실-말단서열을 중첩하는 아래쪽의 cDNA 서열을, 클론 81의 3'말단 서열에 동종성인 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 제조하는 것을 제외하고는, 위쪽의 cDNA 서열의 단리와 유사한 방법을 사용하여 단리하였다. 스크리닝에 사용하는 합성 폴리뉴클레오티드의 서열은 다음과 같았다:
5 ' TTT GGC TAG TGG TTA GTG GGC TGG TGA CAG 3'
이 문자서열과 혼성화된 cDNA 함유, 포지티브 재조합 파지를 단리하고 정제하여 클론 32 라 숫자를 매겼다.
IV.A.6. 클론 36에서 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열
클론 36에서 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 본질적으로는 단원 IV.A.2에 기술
한 대로 측정하였다.
이 DNA의 이중-스트란드서열, 클론 81의 HCV cDNA와 그의 중첩영역 및 ORF에 의해 코드화되는 폴리펩티드를 도 5에 도시한다.
클론 36 에서 ORF는 클론 81에 코드화된 HCV 항원과 동일한 번역프레임에 있다. 그에따라, 조합하여, 클론 36과 81의 ORF는 큰 HCV항원의 부분을 나타내는 폴리펩티드를 코드화한다. 클론 36과 81의 HCV cDNAs의 조합 ORF에서 유도된 이 추정되는 HCV 폴리펩티드의 서열과 그것을 코드화하는 이중 스트란드 DNA서열을 도 6에 도시한다.
Ⅳ.A.7. 클론 32에서 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열
클론 32에서 cDNA의 뉴클레오티드 서열을, 클론 5-1-1의 서열에 대해 단원 IV.A.2.에서 기술한 대로 본질적으로 측정하였다. 클론 32 재조합 파지에서 cDNA는 2개의 다른 공급원에서 유래한다는 것을 서열데이타가 나타내고 있다. cDNA의 한 단편은 HCV게놈에서 유도된 418뉴클레오티드를 함유하고 다른 단편은 람다 gu11 혈장 cDNA놈에서 유도된 418뉴클레오티드를 함유하고 리오 파지 MS2게놈에서 유도된 172뉴클레오티드를 함유한다.
HCV 게놈의 cDNA 서열에 해당하는 클론 32의 cDNA 서열을 도 7에 도시한다. 클론 81의 서열영역에 중첩하는 서열영역과 ORF에 의해 코드화하는 폴리펩티드를 또한 도면에 표시한다. 이 서열은 클론 81에 의해 코드화된 HCV 항원과 동일한 번역프레임에 있는 하나의 연속 ORF를 함유한다.
IV. A.8. 클론 36의 cDNA 에 대한 중첩 HCV cDNA의 단리
합성 뉴클레오티드가 클론 36의 5'-영역에 근거를 두는 것을 제외하고는, 클론 81 cDNA와 중첩하는 HCV cDNA서열을 위해, 단원 IV.A.5.에서 기술한대로, 위쪽의, 그리고 클론 36 cDNA에서 cDNA 와 중첩하는 HCV cDNA서열의 단리를 완성하였다. 스크리닝에 사용된 합성 폴리뉴클레오티드의 서열은 다음과 같았다:
5 ' AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC 3'
50,000클론에서 약 하나가 프로브와 혼성화한다. 이 서열에 혼성화하는 cDNA 함유 재조합 파지의 단리된 정제클론을 클론 35라 칭하였다.
IV.A.9. 클론 35에서 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열
클론 35에서 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 본질적으로 단원 IV. A.2에 기술한 대로 측정하였다. 그의 영역이 클론 36의 cDNA의 영역과 중첩되는 서열 및 거기에 코드화된 추정되는 폴리펩티드를 도 8에 도시한다.
클론 35는 클론 36, 클론 81과 클론 32에 의해 코드화된 것과 동일한 번역 프레임에서 폴리펩티드를 코드화하는 단일의 연속 ORF를 분명하게 함유한다. 도 9는 그것에 코드화된 추정적인 HCV 폴리펩티드와 더불어, 클론 35,36,81과 32를 통해 연장되는 긴연속 ORF 서열을 보여준다. 이 조합서열을 동일한 람다 gtll cDNA 라이브러리에서 유래한 다른 독립 cDNA 클론을 사용하여 확인하였다.
Ⅳ.A.10. 클론 35의 cDNA 에 중첩하는 HCV cDNA 의 단리
합성 폴리뉴클레오티드가 클론 35의 5'-영역에 근거를 두는 것을 제외하고는, 클론 36 cDNA와 중첩하는 HCV cDNA 서열에 대해, 단원 IV.A.8에서 기술한대로 위쪽의, 그리고 클론 35 cDNA의 cDNA 와 중첩하는 HCV cDNA서열의 단리를 완성하였다. 스크리닝을 위해 사용된 합성 폴리뉴클레오티드 서열은 다음과 같았다:
5 ' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT 3 '
50,000클론에 약 하나가 프로브와 혼성화된다. 이 서열에 혼성화한 cDNA를 함유하는 재조합 파지의 단리된, 정제클론을 클론 37b라 칭하였다.
IV.A.11. 클론 37b에서 HCV의 뉴클레오티드 서열
클론 37b에서 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 본질적으로 단원 IV.A.2에 기술한 대로 측정하였다. 그의 영역이 클론 35에서 cDNA 영역과 중첩되는 서열 및 그것에 코드화된 추정되는 폴리펩티드를 도 10에 도시한다.
클론 35의 5'-말단 뉴클레오티드는 T이고, 한편 클론 37b에 상응하는 뉴클레오티드는 A이다. 단원 IV.A.10에 기술한 클론 37b를 단리하는 과정동안, 단리되는 3개의 다른 독립적인 클론의 cDNAs를 또한 서열화하였다. 또한, 이 클론에서 cDNAs는 이 위치에서 A를 함유한다. 그에따라, 클론 35에서 5'-말단 T는 클론화 과정의 인공물일 수 있다. 인공물은 종종 cDNA 분자의 5'-말단에서 발생한다는 것이 공지되어 있다. 클론 37b는 중첩 클론 35,36,81과 32를 통하여 연장되는 0RF에 코드화된 폴리펩티드의 연속인 폴리펩티드를 코드화하는 하나의 연속 ORF를 함유한다.
IV. A. 12. 클론 32에서 cDNA에 대해 중첩하는 HCV cDNA의 단리
클론 32의 아래쪽의 HCV cDNA 서열의 단리를 다음과 같이 완성하였다. 첫째로, 클론 cla를 클론 32의 HCV cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열에 근거를 둔 합성 혼성화 프로브를 이용하여 단리하였다. 방법은 합성 프로브의 서열이 다음과 같은 것을 제외하고는:
5' AGT GCA GTG GAT GAA CCG GCT GAT AGC CTT 3'
본질적으로 단원 Ⅳ.A.5에서 기술한 방법이었다. 클론 cla에서 뉴클레오티드 서열을 이용하여, 또 다른 합성 뉴클레오티드를 서열:
5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3'
을 가지게 합성하였다. 프로브로서 클론 cla 유도서열을 사용하여 람다 gt11 라이브러리의 스크리능은 50,000 포지티브 콜로니에서 약 하나를 생산하였다. 이 프로브와 혼성화된 단리된, 정제 클론을 클론 33b라 칭하였다.
Ⅳ.A.33. 클론 33b에서 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열
5' AGT GCA GTG GAT GAA CCG GCT GAT AGC CTT 3 '
본질적으로 단원 IV.A.5에서 기술한 방법이었다. 클론 cla에서 뉴클레오티드 서열을 이용하여, 또 다른 합성 뉴클레오티드를 서열:
5 ' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3 '
을 가지게 합성하였다. 프로브로서 클론 cla 유도서열을 사용하여 람다 gtl1 라이브러리의 스크리닝은 50,000 포지티브 콜로니에서 약 하나를 생산하였다. 이 프로브와 혼성화한 단리된, 정제 클론을 클론 33b라 칭하였다.
IV.A.13. 클론 33b에서 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열
클론 33b의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 본질적으로 단원 IV.A.2에서 기술한대로 측정하였다.
영역이 클론 32에서 cDNA의 영역과 중첩하는 서열 및 그것에 코드화된 추정되는 폴리펩티드를 도 11에 도시한다.
클론 33b는 증첩클론 37b,35,36,81및 32에서 ORFs의 연장된 하나의 연속 ORF를 분명히 함유한다. 클론 33b에 코드화된 폴리펩티드는 이들 중첩 클론의 연장되는 ORF에서 코드화되는 것과 동일한 번역 프레임에 있다.
IV. A.14. 클론 33b의 cDNA와 클론 37b의 cDNA에 중첩하는 HCV cDNA의 단리
클론 37b와 클론 33b의 cDNA 와 중첩하는 HCV cDNAs를 단리하기 위해, 이들 클론중의 cDNAs 에서 유래되는 다음의 합성 올리고뉴클레오티드프로브를, 본질적으로 단원 IV.A.3 에서 기술한 방법을 사용하여, 람다 gtl1 라이브러리를 스크린하는데 사용하였다. 사용된 프로브는:
5 ' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT C 3 ' 및
5 ' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3 '
이었고, 각각 클론 37b와 33b의 cDNA에 중첩하는 HCV cDNA 서열함유 콜로니를 검출하기 위해 사용하였다. 50,000콜로니중 약 하나가 각 프로브로 검출되었다. 위쪽의 cDNA를 함유하고, 클론 37b의 cDNA와 중첩하는 클론을 클론 40b라 칭하였다. 아래쪽의 cDNA를 함유하고 클론 33b의 cDNA와 중첩하는 클론을 클론 25c라 칭하였다.
Ⅳ.A.15. 클론 40b와 클론 25c의 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열
클론 40b와 클론 25c에서 cDNAs의 뉴클레오티드 서열을 본질적으로 단원 IV.A.2 에 기술한대로 측정하였다. 0b와 25c의 서열, 클론 37b와 33b의 cDNAs와의 그들의 중첩영역 및 그것에 코드화된 추정되는 폴리펩티드를 도 12(클론 40b)와 도 13(클론 25c)에 도시한다.
클론 40b의 5'-말단 뉴클레오티드는 G이다. 그러나, 단원 IV.A.14에서 기술한, 클론 40b를 단리하는 과정동안 단리되는 5개의 다른 독립적인 클론으로부터 cDNAs를 또한 서열화하였다. 이들 클론으로부터의 cDNAs는 또한 이 위치에 T를 함유한다. 그에따라, G는 클론화 인공물을 나타낼 수 있다(단원 IV.A.11에서의 논의참조).
클론 25c의 5'-말단은 ACT이나, 클론 cla (서열을 제시하지는 않는다)와 클론 33b에서 이 영역의 서열은 TCA이. 이 차이는 또한 클론 5-1-1에서 28 엑스트라 5'-말단 뉴클레오티드가 그러한 것처럼 클론화 인공물을 나타낼 수도 있다. 클론 40b와 25c는 각각 이전에 서열화된 클론의 연속 ORF의 연장된 ORF 를 명백하게 함유한다. 클론 40b,37b,35,36,81,32,33b와 25c를 통하여 연장되는 ORF의 뉴클레오티드 서열과 것에 코드화된 추정되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도 14에 도시한다. 도면에서, 잠재하는 인공물은 서열에서 생략되고, 대신에 다중중첩 클론의 비-5'-말단영역의 상응하는 서열을 도시한다.
V. A.16. 클론 36,81과 32의 cDNA로부터 혼성 HCV cDNA의 제조
혼성 HCV cDNA, C100을 다음과 같이 제조하였다. 첫째로, 클론 36,81과 32로부터 cDNAs를 EcoRI으로 절출시켰다. 각 클론으로부터 cDNA의 EcoRI 단편을 각각 벡터 pGEM3-블루(Promega Biotec) 의 EoRI 부위에 클론하었다. 클론 36,81과 32의 cDNAs를 함유하는 그 결과의 재조합 벡터를 각각 pGEM3-블루/36, pGEM3-블루/81과 pGEM3-블루/32라 칭하였다. pGEM3-블루/81의 적절하게 배향된 재조합체를 NaeI 및 NarI 로 소화하여, 큰(∼2850bp) 단편을 정제하여 pGEM3/ 블루/36으로부터의 작은(∼570bp) NaeI/NarI 정제된 제한단편과 연결하였다. 클론 36과 81로부터 cDNA의 이 혼성물을 사용하여 이들 클론내의 중첩 cDNA 중에 함유된 연속 HCV ORF를 함유하는 또다른 pGEM3-블루 벡터를 제조하였다. 그후, 이 새로운 플라스미드를 PvuⅡ EcoRI으로 소화하여, 약 680bp 단편을 방출하고, 이것을 적절하게 배향된 pGEM3-블루/32 플라스미드에서 단리한 작은(580bp) PvuⅡ/EcoRI 단편과 연결시켰으며, 클론 36,81과 32에서 혼성물 cDNA 를 단원 IV.B.I 에서 기술하고, 박테리아에서 클론 5-1-1을 발현시기는데 사용되는 EcoRI 선형화된 벡터 pSODcf1에 연결시켰다. 혼성 HCV cDNA(C100)의 ∼1270bp EcoRI 단편함유 재조합체를 선택하고 플라스미드로부터 cDNA 를 EcoRI로 절출시켜 정제하였다.
IV.A.17. 클로 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33g와39c의 HCV 의 다리와뉴클레오티드 서열
클론 14i,11b,7f,7e,8h,33c,14c,8f,33f,33g와 39c 의 HCV cDNAs
를 단원 IV.A.1.에서 기술한 HCV cDNAs의 람다 gtl1 라이브러리로부터 중첩 cDNA 단편을 단리하는 기술로 단리하였다. 사용되는 기법은, 사용되는 프로브가 조합된 HCV 서열의 5' 와 3' 말단으로부터 마지막 단리된 클론의 뉴클레오티드 서열로부터고안되는 것을 제외하고는, 본질적으로 단원 IV.A.3 에서 기술된 대로였다. 하기 기재의 프로브와 혼성화한 클론의 빈도는 각 경우에 약 1/50,000 이었다.
클론 14i,7f,7e,8h,33c,14c,8f,33f,33g와 39c에서 HCV cDNAs의 뉴클레오티드 서열을, 이들 파지로부터 절출한 cDNA가 클론 5-1-1에서 단리한 cDNA 대신으로 대치되는 것을 제외하고는 본질적으로 단원 IV.A.2에 기술한대로 측정하였다.
클론 33c를 클론 40b의 뉴클레오티드의 서열에 근거하는 혼성화 프로브를 사용하여 단리하였다. 클론 40b의 뉴클레오티드 서열은 도 12에 제시한다. 33c를 단리하는데 사용되는 프로브의 뉴클레오티드 서열은:
5 ' ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3 '
이었다. 클론 33c의 HCV cDNA 및 클론 40b의 HCV cDNA와의 중첩서열을 도 15에 도시하고, 도면 15 는 또한 그것에 코드화된 아미노산을 도시한다.
클론 8h는 클론 33c의 뉴클레오티드의 서열에 근거하는 프로브를 사용하여 단리하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은:
5 ' AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C 3 '
이었다. 클론 8h의 HCV cDNA 및 클론 33c의 HCV cDNA와의 중첩 서열과 그것에 코드화된 아미노산을 도 16에 도시한다.
클론 7e를, 클론 8h의 뉴클레오티드의 서열에 근거하는 프로브를 사용하여 단리하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은:
5' TCG GAC CTT TAC 더G GTC ACG AGG CAC 3 '
이었다. 클론 8h와의 중첩인 클론 7e의 HCV cDNA의 서열, 및 그것에 코드화
된 아미노산을 도 17에 도시한다.
클론 14c를, 클론 25c의 뉴클레오티드의 서열에 근거하는 프로브로 단리하였다. 클론 25c의 서열을 도 13에 도시한다. 클론 14c의 단리에서 프로브는 서열:
5' ACC TTC CCC ATT AAT GCC TAC ACC ACG GGC 3'
를 가졌다. 클론 14c의 HCV cDNA의 서열, 클론 25c의 HCV cDNA와의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 18에 도시한다.
클론 8f를 클론 14c의 뉴클레오티드의 서열에 근거하는 프로브를 사용하여 단리하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5 ' TCC ATC TCT CM GGC AAC TTG CAC CGC TAA 3 '
이었다. 클론 8f의 HCV cDNA 서열, 클론 14c의 HCV cDNA와의 그의 중첩 및 그것에 코드화돤 아미노산을 도 19에 도시한다.
클론 33f를, 클론 8f에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 근거하는 프로브를 사용하여 단리하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5 ' TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC 디C CAA A더 3 '
이었다. 클론 33f의 HCV cDNA의 서열, 클론 8f의 HCV cDNA와의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 20에 도시한다.
클론 33g를, 클론 33f의 뉴클레오티드의 서열에 근거하는 프로브를 사용하여 단리하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5 ' GCG ACA ATA CGA CAA CAT CCT CTG AGC CCG 3 '
이었다. 클론 33g의 HCV cDNA의 서열, 클론 33f의 HCV cDNA와의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 21에 도시한다.
클론 7f를 클론 7e의 뉴클레오티드의 서열에 근거하는 프로브를 사용하여 단리하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5 ' AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA TAA T 3 '
이었다. 클론 7f의 HCV cDNA 서열, 클론 7e와의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 22에 도시한다.
클론 11b를 클론 7f의 서열에 근거하는 프로브를 사용하여, 단리하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5 ' CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3 '
이었다. 클론 11b의 HCV cDNA의 서열, 클론 7f와의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 23에 도시한다.
클론 14i를 클론 11b의 뉴클레오티드의 서열에 근거하는 프로브를 사용하여 단리하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5 ' CTC TGT CAC CAT ATT ACA AGC GCT ATA TCA 3 '
이었다. 클론 14i의 HCV cDNA의 서열, 11b와의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 24에 도시한다.
클론 39c를, 클론 33g의 뉴클레오티드의 서열에 근거하는 프로브를 사용하여 단리하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5 ' CTC GTT GCT ACG TCA CCA CAA TTT GGT GTA 3 '
이었다. 클론 39c의 HCV cDNA의 서열, 클론 33g와의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 25에 도시한다.
Ⅳ.A.18. HCV cDNA 함유 단리된 클론에서 유도된 혼성 HCV cDNA 서열
상기 기술한 단리된 클론의 HCV cDNA서열을 일직선으로하여, 혼성 HCV cDNA 서열을 제조하였다. 5'에서 3' 방향으로 일직선으로 배열된 단리된 클론은:14i,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,33g 및 39c이다. 단리된 클론에서 유도된 혼성 HCV cDNA 서열과, 그것에 코드화된 아미노산을 도 26에 도시한다.
혼성서열을 제조하는데 있어서 다음의 서열 이종성을 고려하였다. 클론 33c는 클론 40b 및 37c의 cDNAs와 중첩하는 800염기쌍의 HCV cDNA를 함유한다. 5개의 다른 중첩 클론에서 뿐만아니라 클론 33c에서, 뉴클레오티드 #789는 G이다. 그러나, 클론 37b(부분 IV.A.11을 참조하라)에서, 상응하는 뉴클레오티드는 A이다. 이 서열차이는 G 또는 A에 대해 각각 CYS 또는 TYR인, 그것에 코드화된 아미노산에 외관상의 이종성을 초래한다. 이 이종성은 단백질 폴딩에 관하여 중요한 분류화를 가질 수 있다.
클론 8h HCV cDNA에서 뉴클레오티드 잔기 #2는 T이다. 그러나, 아래 도시된 대로, 클론 7e에서 상응하는 잔기는 A이다; 더욱이, 이 위치에서 A는 또한 3개의 다른 단리된 중첩 클론에서도 발견된다. 그에따라, 클론 8h에서 T잔기는 클로닝 인공물을 나타낼 수 있다. 그러므로, 도 26에서, 이 위치에서 잔기는 A로 표시한다.
클론 8f HCV cDNA에서 3'-말단 뉴클레오티드는 G이다. 그러나, 클론 33f와 2개의 다른 증첩 클론에서 상응하는 잔기는 T이다. 그러므로, 도 26에서, 이 위치의 잔기는 T로 표시한다.
클론 33f HCV cDNA 에서 3'-말단 서열은 TTGC ㅇl다. 그러나, 클론 33g와 2개의 다른 중첩클론에서 상응하는 서열은 ATTC 이다. 그러므로, 도 26에서, 상응하는 영역은 ATCC로 나타낸다.
클론 33g HCV cDNA에서 뉴클레오티드 잔기 #4는 T이다. 그러나, 클론 33f와 2개의 다른 중첩클론에서, 상응하는 잔기는 A이다. 그러므로, 도 26에서, 상응하는 잔기는 A로 표시한다.
클론 14i의 3'-말단은 AA인 한편, 클론 11b와 3개의 다른 클론에서 상응하는 디뉴클레오티드는 TA이다. 그러므로, 도 26에서 TA 잔기를 묘사한다.
다른 서열 이종성의 분석은 상기에 논의된다.
혼성 HCV cDNA의 조사는 이것이 하나의 큰 ORF를 함유한다는 것을 가리킨다.
이것은 바이러스 게놈이 번역과 동시에 또는 연이어서 프로세스되는 큰 폴리펩티드로 번역된
다는 것을 의미한다.
Ⅳ.A.9. 클론 12f,35f,19g,26g 및 15e의 HCV cDNAs의 단리와 뉴클레오티드 서열
클론 12f,35f,19g,26g 및 15e의 HCV cDNAs를 프로브가 아래지시대로인 것을 제외하고는 본질적으로 단원 IV.A.17에서 기술한 기술에 의해 단리하였다. 프로브와 혼성화되는 클론의 빈도는 각 경우에 50,000에 약 1이다. 이들 클론에서 HCV cDNAs의 뉴클레오티드 서열을, 지시된 클론에서 cDNA가 클론 5-1-1에서 단리한 cDNA 에 대치되는 것을 제외하고는, 본질적으로 단원 IV.A.2 에서 기술한 대로 측정하였다. 도 26에서 HCV cDNA 의 위쪽의 cDNA 를 함유하는 클론 12f의 단리를, 클론 14i에서 뉴클레오티드의 서열에 근거하는 혼성화 프로브를 사용하여 달성하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5 ' TGC TTG TGG ATG ATG 디A 더C ATA TCC CAA 3 '
이었다. 클론 12f의 HCV cDNA 서열, 클론 14i와의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 27에 도시한다.
도 26의 HCV cDNA의 아래쪽의 cDNA를 함유하는 클론 35f의 단리를 클론 39c에서 뉴클레오티드 서열에 근거하는 혼성화 프로브를 사용하여 완성하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5' AGC AGC GGC AAA AGT GAA GGC TAA CTT 3'
이었다. 클론 35f의 서열, 클론 39c의 서열과의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 28에 도시한다.
클론 19g의 단리를, 클론 35f의 3' 서열에 근거한 혼성화 프로브를 사용하여 완성하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5' TTC TCG TAT GAT ACC CGC TGC TTT GAC TCC 3'
이었다. 클론 19g의 HCV cDNA 서열, 클론 35f의 서열과의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 29에 도시한다.
클론 26g의 단리를, 클론 19g의 3' 서열에 근거한 혼성화 프로브를 사용하여 달성하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5' TGT GTG GCG ACG ACT TAG TCG TTA TCT GTG 3'
이었다. 클론 26g의 HCV cDNA 서열, 클론 19g의 서열과의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 30에 도시한다.
클론 15e를 클론 26g의 3' 서열에 근거한 혼성화 프로브를 사용하여 단리하였다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은
5' CAC ACT CCA GTC AAT TCC TGG CTA GGC AAC 3'
이었다. 클론 15e의 HCV cDNA 서열, 클론 26g의 서열과의 그의 중첩 및 그것에 코드화된 아미노산을 도 31에 도시한다. 이 단원에서 기술한 클론은 단원 Ⅱ.A. 에서 기술한 기간과 조건하에서 ATCC에 기탁하였다.
람다-gtll ATCC번호 기탁일
클론 12f405141988. 11. 10.
클론 35f405111988. 11. 10.
클론 15e405131988. 11. 10
클론 K9-1405121988. 11. 10.
상기 기술한 단리된 클론의 HCV cDNA 서열을 일직선으로 배치하여 혼성 HCV cDNA 서열을 제조하였다. 5'에서 3' 방향으로 일직선으로 배열된 단리된 클론은:12f,14i,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,33g,39c,35f,19g,26g 및 15e이다.
단리된 클론에서 유도된 혼성 HCV cDNA 서열과 그것에 코드화된 아미노산을 도 32에 도시한다.
Ⅳ.A.20. 클론 12f의 HCV cDNA 서열의 위쪽의 cDNA 서열을 단리하는 또다른 방법.
클론 12f의 HCV cDNA 로부터 유래된, 도 32의 대부분의 5' HCV 서열을 토대로, 역전사효소의 작은 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하고, HCV 게놈 RNA에 상응하는 서열에 결합시켜, 위쪽 서열의 역전사를 시작하는데 사용하였다. 프라이머 서열은 클론 12f의 공지의 5'-말단서열에 근접하나, 프라이머 서열의 위쪽의 프로브 서열의 고안을 허용하도록 충분히 아래쪽에 있다. 프라이밍과 클로닝의 공지의 표준법을 사용한다. 결과적인 cDNA 라이브러리를 프라이밍 부위(클론 12f의 명백한 서열에서 유추된 것처럼)의 위쪽 서열로 스크린한다. HCV 게놈 RNA는 NANBH에 걸린 침팬지에서 혈장 또는 간샘플으로부터나 NANBH에 걸린 사람에서 유사 샘플로부터 얻는다.
IV. A. 21. HCV 게놈의 5'-말단영역의 서열을 단리하는데 테일링을 이용하는 또다른 방법
HCV RNA 게놈의 극단의 5'-말단서열을 단리하기 위해, 주형 RNA로 복제된 제 1 라운드 역전사의 cDNA 생성물에 올리고 c로 꼬리표를 붙인다. 생성물을 CTP 존재하에서 말단 전달효소와 같이 배양함으로써 이것을 완성한다. cDNA의 제 1스트란드의 보체를 생산하는 제 2라운드의 cDNA 합성은 역전사 효소반응을 위한 프라이머로서 올리고 G를 이용하여 완성된다. 게놈 HCV RNA의 공급원은 단원 IV.A.20에서 기술한 대로다. 말단 전달효소로의 테일링과 역전사효소반응을 위한 방법은 Maniatis 등(1982)에 따른다. 그후에, cDNA생성물을 클론하고, 스크린하여 서열을 결정한다.
Ⅳ.A.22. HCV게놈의 3'-말단영역으롭터 서열을 단리하기 위한 테일링을 이용한 또다른 방법
이 방법은 플래비바이러스 RNA의 cDNA를 클로닝하기 위해 이전에 사용된 방법에 근거한다. 이 방법에서, RNA는 변성조건의 영향을 받아, 3'-말단에서 2차구조가 제거되고, 그후 기질로서 rATP를 사용하여, 폴리 A중합효소로 꼬리표를 붙인다. 폴리 A 꼬리표 붙인 RNA의 역전사를 프라이머로서 올리고 dT 를 이용하여, 역전사 효소로 촉매한다. cDNA의 2차 스트란드를 합성하고, cDNA생성물을 클론하여, 스크린하고 서열 결정한다.
IV.A.23. 더큰 cDNA 삽입함유 람다-gt11 HCV cDNA 라이브러리의 제조
람다 gtl1 라이브러리를 제조하고 스크린하는데 사용되는 방법은 라이브러리가 세파로스 CL-4B컬럼에서 용출된 더큰 크기의 cDNA의 푸울로부터 생산된다는 것을 제외하고는, 본질적으로 단원 IV.A.1.에서 기술한 바대로다.
IV. A. 24. 합성 올리고머를 프라이머로서 사용하는 HCV cDNA 라이브러리의 제조
새로운 HCV cDNA 라이브러리를 단원 IV.A.1 에 기술한 감염성 침팬지 혈장푸울에서 유도한 RNA와 이 감염된 동물의 간에서 유도한 폴리 A+RNA 분획으로부터 제조하였다. cDNA는, 제1 cDNA 스트란드 합성을 위한 프라이머가 상술한 HCV 게놈의 서열에 근거하는 2개의 합성올리고머인 것을 제외하고는, 본질적으로 Gubler와 Hoffman(1983)에 의해 기술된대로 제조하였다. 클론 11b와 7e의 서열에 근거하는 프라이머는 각각
5' CTG GCT TGA AGA ATC 3'과
5' AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC 3'
이었다. 결과적인 cDNAs를 람다 박테리오파지 벡터로 클론하고, 여러가지 다른 합성올리고머로 스크린하는데, 합성올리고의 서열은 도 32의 HCV서열에 근거한다.
IV.B. HCV cDNAs내에 코드화된 폴리펩티드의 발현과 HCV 유도된 항원으로서의 발현생성물의 확인
Ⅳ.B.1. 클론 5-1-1에 코드화된 폴리펩티드의 발현
클론 5-1-1에 코드화된 폴리펩티드의 발현내에 코드화된 HCV 폴리펩티드(상기의 단원 IV.A.2를 참고하라)는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)와의 융합 폴리펩티드로서 발현하였다. 이것은 다음과 같이 발현벡터 pSODcfl(Steimer et al.(1986))로 클론 5-1-1 cDNA 삽입을 서브클로닝함으로써 완성되었다.
첫째로, pSODcf1 에서 단리된 DNA를 BamHI과 EcoRI로 처리하여, 다음의 링커를 제한효소에 의해 제조된 선형 DNA로 연결시켰다:
5' GAT CCT GGA ATT CTG ATA A 3'
3' GA CCT TAA GAC TAT TTT AA 5
클로닝후에 삽입 함유 플라스미드를 단리하였다.
삽입 함유 플라스미드를 EcoRI로 제한하였다. 클론 5-1-1의 HCV cDNA 삽입을 EcoRI로 절출하여, 이 EcoRI 선형화된 플라스미드 DNA로 연결시켰다. DNA 혼합물을, 대장균균주 D1210[Sadler et al.(1980))을 변형시키는데 사용하였다. 도 1에서 보여준 ORF의 발현에 대한 올바른 방향의 5-1-1 cDNA로의 재조합체를 제한 지도화의 뉴클레오티드 서열화로 확인하였다.
하나의 클론으로부터의 재조합 박테리아는 IPTG의 존재하에서 박테리아를 성장시킴으로써 SOD-NANB5-1-1폴리펩티드를 발현하도록 유도하였다.
Ⅳ.B.2. 클론 81에 코드화된 폴리펩티드의 발현
클론 81내에 함유된 HCV cDNA 는 SOD-NANB81융합 폴리펩티드로서 발현하였다. 이 융합 폴리펩티드를 코드화하는 벡터를 제조하는 방법은, HCV cDNA의 공급원이 단원 IV.A.3에서 기술한 대로 단리되고 cDNA서열이 단원 IV.A.4에서 기술한대로 결정되는 클론 81인 것을 제외하고는, 벡터코드화 SOD-NANB5-1-1의 제조에 사용되는 방법과 동일하였다. 클론 81의 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열과 그것에 코드화된 폴리펩티드의 추정되는 아미노산 서열을 도 4에 도시한다.
클론 81의 HCV cDNA 삽입을 EcoRI로 절출하여 링커를 함유하고(Ⅳ.B.1.을 참조하라) EcoRI로 처리하여 선형화된 pSODcf1로 연결시켰다. DNA 혼합물을 대장균 균주 D1210을 변형시키는데 사용하였다. 도 4에서 보여준 ORF의 발현을 위한 올바른 방향의 클론 81 HCV cDNA와의 재조합체를 제한 지도화와 뉴클레오티드 서열화로 확인하였다.
한 클론으로부터의 재조합 박테리아는 IPTG 존재하에서 박테리아를 성장시킴으로써 SOD-NANB81을 발현시키게 유도되었다.
Ⅳ.B.3. HCVdhk NANBH 관련 항원으로서 클론 5-1-1내에 코드화된 폴리펩티드의 확인
클론 5-1-1의 HCV cDNA 내에 코드화된 폴리펩티드를, NANBN로 감염된 침팬지와 사람의 혈청이, N-말단에 슈퍼옥사이드 디스뮤타제와 C-말단에인-프레임 5-1-1을 함유하는 융합 폴리펩티드, SOD-NANB45-1-1과 면역적으로 반응한다는 것을 입증함으로써, NANBH 관련항원으로서 확인하였다. 이것은 다음과 같이 웨스턴 블롯팅(Towbin et al.(1979))에 의해 달성되었다.
단원 IV.B.1.에서 기술한, SOD-NANB5-1-1폴리펩티드를 코드화하는 발현벡터로 형질전환된 박테리아의 재조합 균주를 IPTG존재하에서 성장에 의해 융합 폴리펩티드를 발현하도록 유도하였다. 총 박테리아 용해물을 Laemmli(1970)에 따라 SDS의 존재하에 폴리아크릴 아미드겔을 통해 전기영동하였다. 분리된 폴리펩티드를 니트로셀룰로스 필터로 전달하였다(Towbin et al.(1979)). 그후, 필터를 얇은 조각으로 절단하여, 조각을 각각 다른 침팬지 및 사람혈청과 배양시켰다. 결합항체를 단원 IV.A.1에 기술한대로125I-표지된 양 항-사람 Ig와 배양하여 검출하였다.
웨스턴 블롯에서 자동방사선사진 조각의 사진에서 보여주는 결과를 도 33에 나타낸다. 폴리펩티드 함유 니트로셀룰로스 조각을 급성 NANBH(Hutchinson Strain) 감염(레인 1내지 16), A 형 간염감염(레인 17 내지 24 와 26 내지 33) 및 B형 감염(레인 34 내지 44) 동안 여러시간에 침팬지에서 유래된 혈청과 배양하였다. 레인 25와 45는, 면역블롯은 람다-gtl1 cDNA 라이브러리의 원래의 스크리닝에서 재조합 클론 5-1-1을 확인하는데 사용되는 환자혈청과 배양시키는데에서 포지티브 대조를 보인다(단원 IV.A.1 참조).
도 23에서, 대조레인 25와 45에서 가시적 밴드는 SOD 융합 폴리펩티드의 NANB5-1-1부분에 대한 항체결합의 반영이다. 이들 항체는 SOD 단독과는 결합하지 않는데, 왜냐하면 이것은 이들 샘플에서 네가티브 대조표준으로서 또한 포함되어서 SOD-NANB5-1-1융합 폴리펩티드보다 상당히 더빨리 밴드이동으로 나타나기 때문이다.
도 33의 레인 1 내지 16은 4마리 침팬지의 혈청샘플에서 항체결합을 보여준다;NANBH로 감염시키기 바로 전과 급성감염동안에 혈청을 채취하였다. 도면에서 보이는 바대로, SOD-NANB5-1-1폴리펩티드와 면역학적으로 반응하는 항체는 감염성 HCV 접종물의 투여전과 감염의 초기 급성상에서 채취한 혈청샘플에는 없는 반면, 급성상의 나중부분 또는 급성상 다음에서 이 폴리펩티드에 대한 순환하는 항체를 모든 4동물은 궁극적으로 유도하였다. 침팬지 번호 3과 4의 경우에 면역 블롯상에 관찰되는 추가 밴드는 숙주박테리아 단백질에 대한 바탕결합에 기인하였다.
NANBH 로 감염된 침팬지에서의 혈청에서 수득한 결과와 대조적으로, 융합 폴리펩티드의 NANB5-1-1부분에 대한 항체개발은 HAV로 감염된 4침팬지와 HBV로 감염된 3침팬지에서는 관찰되지 않았다. 이들 경우에 유일한 결합은 HCV감염된 샘플에서도 발생하는 숙주 박테리아 단백질에 대한 바탕 결합이었다.
웨스턴 블롯에서 사용되는 사람 혈청의 특징과 자동방사선사진 조각의 사진에서 보여주는 결과를 도 34에 도시한다. 폴리펩티드 함유 니트로셀룰로스 조각을 NANBH(레인 1 내지 21), HAV(레인 33 내지 40)와 HBV(레인 41 내지 49)로 감염되는 동안 다른 시간에 사람에서 유래된 혈청과 배양시켰다. 레인 25와 50은 면역블롯을 상기 기술한 람다-gtl1 라이브러리의 원래의 스크리닝에서 사용된 환자혈청과 배양하는 데에서 포지티브 대조를 보인다. 레인 22 내지 24 와 26 내지 32는 혈청이 정상 혈액 공여체인데에서 비-감염성 대조를 보인다.
도 34에서 보여주듯, 람다-gtll 라이브러리를 스키링하는데 사용하는 혈청을 포함하는 9명의 NANBH 환자혈청은 융합 폴리펩티드의 NANB5-5-1부분에 대한 항체를 함유하였다. NANBH에 걸린 3명의 환자혈청은 이들 항체를 함유하지 않는다. 항-NANB5-5-1항체는 이들 환자에서 미래에 발생될 가능성이 있다. 또한, 다른 NANBV병 원체로부터 발생하는 이러한 반응 부족은 1- 응답혈청이 취해진 개체에서 질환의 원인이 될 수도 있다
도 34는 또한, HAV와 HBV로 감염된 많은 환자혈청이 항-NANB5-5-1항체를 함유하지 않고, 이들 항체는 정상 대조 혈청환자에서도 존재하지 않는다는 것을 보여준다. 비록, 한 HAV환자 (레인 36)가 항-NANB5-5-1항체를 함유하는 것처럼 보이지만, 이 환자는 이전에 HCV로 감염되었을 가능성이 있는데, NANBH의 발생이 매우 높고, 이것이 종종 준임상적이기 때문이다.
이들 혈청학적 연구는 클론 5-5-1에서 cDNA가 BB-NANBV로 감염된 환자 및 동물형청에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 코드화한다는 것을 지적하고 있다. 또한, cDNA는 영장류 게놈에서 유도된 것처럼 보이지는 않는다. 클론 5-5-1 또는 클론 81에서 제조된 혼성환 프로브는 유일한, 단일-복사 유전자를 검출할 수 있는 조건하에서, 비감염된 개체에서의 대조사람 및 챔팬지 게놈 DNA 의 서던 블롯에 혼성화하지 않는다. 이들 프로브는 또한, 대조 소의 게놈 DNA의 서던블롯에 혼성화 하지도 않는다.
IV. B. 4. 클론 36, 81과 32의 HCV cDNAs 의 혼성물에 코드화된 폴리펩티드의 발현
클론 36,81과 32를 통해 연장된 ORF에서 코드화된 폴리펩티드를 SOD와의 융합 폴리펩티드로서 발현시켰다. 이것은 혼성 cDNA , C100을 사람 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 유전자를 함유하는 발현 카세트를 삽입하고, 발현카세트를 효모발현벡터로 삽입하여 효모에서 폴리펩티드를 발현함으로써 완성되었다.
클론 36,81과 32에서 유도한 혼성 C100 cDNA함유 발현 카세트를, ~1270bpEcoRI 단편을 벡터 pS3-56 (또한 pS356이라 한다)의 EcoRI부위에 삽입하고, 플라스미드 pS3-56 C100을 생성하여 제조하였다. C100의 제조는 상기의 단원 IV.A.16에 기술되어 있다.
pBR322 유도체인 벡터 pS3-56은 사람 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자의 위쪽 ADH2/GAPDH 혼성효모 촉진유전자와 아래쪽 GAPDH 전사 말단기를 포함하는 발현카세트를 함유한다. 이들 대조요소와 슈퍼옥사이드 디스무타제 유전자를 함유하는 유사한 카세트를 Cousens등(1987)과 여기 양수인과 공통 소유된 1986년 10월 1일에 발표되어, 계류중인 출원 EPO 196,056에서 기술하였다. 그러나, p53-56에서 카세트는, 이종성 프로인슐린 유전자와 면역 글로불린 힌지가 결핍되고, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 gln154가 EcoRI부위를 함유하는 어뎁터 서열에 의해 이어진다는 면에서, Cousens 등(1987)의 결과와는 다른다. 어댑터의 서열은 :
5' ATT TTG GGA ATT CCA TAA TGA G -3'
AT CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT
이다. EcoRI 부위는, 카세트함유 벡터로부터 발현될 때 아미노산 서열: -asn-leu-gly-ile-arg-함유 올리고펩티드 링커에 의해 슈퍼옥사이드 디스뮤타제에 융합된 폴리펩티드를 생성하는 이종성 서열의 삽입을 허용한다.
pS356 의 샘플은 어메리칸 타입컬춰 콜렉션(ATCC)(12301 Parklawn Dr.,Rockville, Maryland 20853)과의 부다페스트 조약과의 관계하에, 1988년 4월 29일에 기탁되었고, 수탁번호 제67683호로 지정되었다. 이용성을 위한, 그리고 기탁할수 있는, 및 기탁유지를 위한 관계와 조건은 NANBV-cDANs 함유 균주를 위해, 단원 Ⅱ.A 에 표시한 것과 동일하다. 이 기탁은 단지 편리함을 위해 작정된 것이고 여기 기술한 것에 관한 본 발명을 실행하는데 필요한 것은 아니다. 기탁물질은 여기에 참고자료로 첨부된다.
바른 방향으로 C100 cDNA 삽입을 함유하는 재조합체를 단리한 후, C100 cDNA 함유 발현카세트를 pS3-56C100으로부터 BamHI로 절출하여 카세트 함유 ~3400bp의 단편을 단리하고 정제하였다. 그런다음, 이 단편을 효모벡터 pAB24의 BamHI부위에 삽입하였다.
그의 중요한 특징이 도 35에 도시된, 플라스미드 pAB24는 복제를 위한 완전한 2미크론 서열[Broach(1981)]과 pBR322 서열을 함유하는 효모 셔틀벡터이다. 이것은 또한 플라스미드 YEp24에서 유도된 효모 URA3 유전자[Botstein et al.(1979)]와 플라스미드 pC1/1에서 유도된 효모 LEU2d유전자를 함유한다. (EPO공개번호 제 116,201호) 플라스미드 pAB24를 YEp24를 EcoRI로 분해하여, 부분적인 2미크론 서열을 제거하여, 벡터를 재융합시켜 제조하였다. 그 결과의 플라스미드, YEP24 델타 RI를 ClaI으로 소화하여 선형화하고, CIaI로 선형화된 완전한 2미크론 플라스미드와 융합시켰다. 그런다음 그 결과의 프라스미드, pDBou를 XbaI으로 소화시키고 8605bp 벡터 단편을 겔단리시켰다. 이 단리된 Xbal 단편을 pC1/1에서 단리된 LEU2d유전자 함유 4460bp XbaI 단편과 연결하였다; LEU2d유전자의 방향은 URA3 유전자와 동일한 방향이다. 발현의 삽입은 pBR322 서열의 유일한 BamHI 부위에 있고, 따라서 테트라사이 클리네 대한 박테리아 내성에 대한 유전자를 방해한다.
SOD-C100 발현 카세트 함유 재조합 플라스미드; pAB24C100-3을 다른 효모균주뿐만 아니라 효모균주 JSC308로 형질전환시켰다. 세포는 Hinnen 등(1978) 이 기술한 대로 형질전환되며, ura-선택 플레이트상에 플레이트를 이룬다. 단일 콜로니를 ieu- 선택 배지에 접종하여 성장시켜 포화를 이룬다. 배양물을 1% 글루코스 함유 YEp에서 성장시켜 SOD-C100 폴리펩티드(C100-3이라 한다)를 발현하도록 유도시켰다.
균주 JSC308은 ADRI 유전자좌에 통합된 유전자형 MAT@, leu2, ura3(del)DM15(GAP/ADR1)이다. JSC308에서, 포지티브 활성자 유전자 생성물, ADR1의 과임-발현은(ADR1 야생형 대조와 상대적으로) 하이퍼디리프레션(hyperderepression)과 이러한 단백질이 ADH2 UAS 조절시스템에 의해 합성될 때 발현된, 이종 단백질의 매우 높은 수율을 일으켰다. 효모균주 JSC308의 제조는 계류중인 미국출원 일련변호(Attorney Dockcket N. 2300-0229)에 발표되어 있고, 본원과 동시에 출원되었고 본원에 참고자료를 첨부되었다. JSC308의 샘플은 부다페스트 조약의 조건하에서 ATTCC에 1988년 5월 5일에 기탁하였고 접수번호 제 20879호를 부여받았다. 이용성을 위한, 기탁할 수 있는, 및 기탁의 유지를 위한 관계 및 조건은 HDV cDNAs 함유 균주에 대해 단원 Ⅱ.A 에 기록한 것과 동일하다.
pAB24C100-3에서코도화된 C100-3완전한 융합 폴리펩티드가 아미노산말단기
에서인 사람 SOD의 154아미노산, EcoRI 부위함유 합성 어댑터에서 유도한 5아미노산 잔기, C100 cDNA에서 유도한 363 아미노산 잔기와 클론 32에서 HCV cDNA 서열에 연결된 MS2 뉴클레오티드 서열에서 유도한 5-카르복시말단 아미노산을 함유해야 한다(단원 Ⅳ.A.7 참조). SOD의 두번째의 철자 Ala에서 시작하여, 이 폴리펩티드의 카르복시-말단의 추정되는 아미노산 서열을 도 36에 도시하고;또한 폴리펩티드의 이 부분을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
Ⅳ.B.5. NANBH 관련 항원으로서 C100 내에 코드화된 폴리펩티드의 확인
효모균주 JSC308에서 플라스미드 pAB24C100-3으로부터 발현된 C100-3 융합 폴리펩티드를 크기면에서 특징화하고, C100 내에 코드화된 폴리펩티드를 만성 NANBH를 가진 사람 혈청과의 면역 반응성에 의해 NANBH-관련 항원으로서 확인하였다.
단원 Ⅳ.B.4에 기술한 대로 발현되는 C100-3 폴리펩티드를 다음과 같이 분석하였다. 효모 JSC308 세포를 pAB24 또는 pAB24C100-3으로 형질전환시키고 이종성 플라스미드 코드화된 폴리펩티드를 발현하도록 유도하였다. 배양액 2ml에서 유도된 효모세포(OD650nm∼20)를 10,000회전수에서 1분간 원심분리하여 펠렛을 이루고, 2부피 용액과 1부피 유리비이드(0.2mμ 직경)와 격럴히(10×1분) 혼합하여 용해시켰다. 용액은 50mH 트리스-염산, pH 8.0, 1mM EDTa, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF)와 1μg/ml 펩스타틴을 함유하였다. C100-3 폴리펩티드를 함유하는 용해물중에서 불용성물질을 원심분리(10,000rpm,5분간)하여, 모으고 라엠리 SDS 샘플 완충액에서 5분간 가열하여 용해시켰다[Laemmli(1970) 참조]. 유도된 효모 배양물 0.3ml의 것과 등가의 폴리펩티드의 양을 Laemmli(1970)에 따라 SDS 존재하에서 10% 폴리아크릴아마이드 겔을 통해 전기영동하였다. 단백질 표준물을 겔상에 공-전기영동하였다. 발현된 폴리펩티드 함유 겔을 쿠마찌 형광 블루로 염색하거나 단원 Ⅳ.B.2에서 기술한대로, 만성 NANBH 환자의 혈청을 사용하여 pAB24와 pAB24 C100-3에서 발현된 폴리펩티드의 면역반응성을 결정하는 웨스턴 블롯팅을 하였다.
결과는 도 37에 도시한다. 도 37A에서, 폴리펩티드는 쿠마찌 형광 블루로 염색되었다. pAB24로 형질전환된 JSC308과 pAB24 C100-3로 형질전환된 JSC의 2개의 다른 콜로니에서 불용성 폴리펩티드를 각각 레인 1(pAB24), 그리고 레인 2와 3에서 보여준다. 레인 2와 3의 레인 1과의 비교는, pAB24로 형질전환된 JSC308에서 유도되지 않고, pAB24 C100-3으로 형질전환된 JSC308로부터 분자량 ∼54,000달톤에 상응하는 폴리펩티드의 유도된 발현을 보인다. 이들 폴리펩티드를 화살표로 표시하였다.
도 37B는 pAB24(레인 1) 또는 pAB24 C100-3(레인 2)로 형질전환된 JSC308에서 발현된 불용성 폴리펩티드의 웨스턴블롯의 결과를 보여준다. pAB24에서 발현된 폴리펩티드는 NANBH에 걸린 사람혈청과 면역학적으로 반응하지 않는다. 그러나, 화살표로 표시한대로, pAB24 C100-3으로 형질전환된 JSC308은 사람 NANBH 혈청과 면역학적으로 반응하는 ∼54,000달톤 분자량의 폴리펩티드를 발현하였다. 레인 2에서 다른 면역학적으로 반응성인 폴리펩티드는 이 ∼54,000달톤 폴리펩티드의 분해 및/또는 응집 생성물일 수 있다.
Ⅳ.B.6. 융합 폴리펩티드 c-100-3의 정제
N 말단에 SOD와 C 말단에 인-프레임 C100 HCV-폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, C100-3을 폴리펩티드가 발현되는 추출된 숙주효모세포의 불용성 분획의 차별적 추출에 의해 정제하였다.
융합 폴리펩티드, C100-3은 단위 Ⅳ.B.4에서 기술한대로, pAB24C100-3으로 형질전환된 효모균주 JSC308에서 발현되었다. 그런다음 효모세포를 균질화에 의해 용해하고 용해물중 불용성 물질을 pH 12.0에서 추출하여, 잔류 불용성 분획에서 C100-3을 SDS 함유 완충액으로 용해하였다.
효모 용해물은 Nagahuma 등(1984)에 따라 본질적으로 제조하였다. 20mM 트리스 염산, pH 8.0, 1mM 디티오트레이톨과 1mM 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF) 함유 용액(완충액 A)에서 현탁한 33% 세포(v/v)인 효모세포 현탁액을 제조하였다. 현탁액의 부분분획(15ml)을 같은 부피의 유리비이드(0.45 내지 0.50mm 직경)와 혼합하고, 혼합물을 최대 속도로 슈퍼믹서(Lab Line Instruments, Inc.) 상에서 8분간 혼합하였다. 균질물과 유리비이드를 분리하여, 유리구슬을 본래 채워 넣어둔 세포의 완충액 A의 동일 부피으로 3번 세척하였다. 세척액과 균질물을 모으고, 용해물로부터 불용성 물질을 4℃에서 15분간 균질물을 원심분리하여 수득하고, 본래 채워 넣어둔 세포의 2배부피 완충액 A에서 펠렛을 재현탁시켜서, 15분간 7,000xg에서 원심분리하여 물질을 재-펠렛시켰다. 이 세척과정을 3번 반복하였다.
용해물로부터 불용성 물질을 pH 12.0에서 다음과 같이 추출하였다. 펠렛을 현탁부피인 원래 채워넣은 세포의 1.8배와 동일한 0.5M 염화나트륨, 1mM EDTA 함유 완충액에 현탁시켰다. 현탁액의 pH를 0.4M Na 인산염 완충액;pH 12.0의 0.2부피를 가하여 조정하였다. 혼합후, 현탁액을 4℃에서 15분간 7,000xg에서 원심분리하였고, 상등액을 제거하였다. 추출을 2번 반복하였다. 추출된 펠렛을 본래 채워넣은 세포의 2배 부피와 동일한 현탁액부피를 사용하여, 0.5M 염화나트륨, 1mM EDTA에 현탁시켜, 4℃에서 15분간 7,000xg로 원심분리하여 세척하였다.
추출된 펠렛에서 C100-3 폴리펩티드를 SDS로 처리하여 용해시켰다. 펠렛을 본래 채워넣은 세포부피의 0.7부피와 동일한 완충액 A에 현탁시켰다. 현탁액을 혼합한 후 4℃에서 15분간 7,000xg로 원심분리하였다. 결과적인 펠렛을 SDS로 3번 더 추출하였다. C100-3 함유 결과 상등액을 모았다.
이 과정은 효모 균질물의 불용성 분획에서 10배이상 C100-3을 정제하고, 폴리펩티드의 수율은 50% 이상이다.
Laemmli(1970)에 따라 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 융합 폴리펩티드의 정제된 제제를 분석하였다. 이 분석에 근거하여, 폴리펩티드는 80% 이상 순수하고 외관 분자량 물54,000달톤을 가졌다.
Ⅳ.C. HCV cDNA와 혼성화하는 감염된 개체에서 RNA 확인
Ⅳ.C.1. HCV cDNA와 혼성화하는 NANBH로 침팬지간에서 RNA의 확인
NANBH에 걸린 침팬지간에서 RNA는 다음과 같이, 노던 블롯딩에 의해 클론 81내에 함유된 HCV cDNA로 혼성화되는 RNA종을 함유하는 것을 보여주고 있다.
고역가 혈장이 유도되는(단원 Ⅳ.A.1 참조) 침팬지의 간생검에서, 포유류 세포에서 총 RNA의 단리와 폴리 A+와 폴리A-분획으로의 그의 분리를 위해 Maniatis 등(1982)이 서술한 기술을 사용하여 RNA를 단리시켰다. 이들 RNA 분획을 포름알데히드/아가로스 겔(1% w/v)상에서 전기영동하여, 니트로셀룰로스로 전달하였다(Maniatis 등(1982)). 니트로셀룰로스 필터를 클론 81에서 방사선 표지된 HCV cDNA와 혼성화하였다(삽입의 뉴클레오티드 서열을 위해 도 4를 참조). 방사선 표지된 프로브를 제조하는데, 클론 81에서 단리된 HCV cDNA 삽입을 DNA 중합효소 I(Maniatis et al.(1982))을 사용하여 닉 번역으로32P를 이용하여 방사선 표지하였다. 혼성화를 10%(w/v) 황산 덱스트란, 50%(w/v) 탈이온화 포름아마이드, 750mM 염화나트륨, 75mM 시트르산나트륨, 20mM Na2HPO4,pH 6.5, 0.1% SDS, 0.02%(w/v) 우혈청알부민(BSA), 0.02%(w/v) 피콜-400, 0.02%(w/v) 폴리비닐피롤리돈, 100μg/ml의 소니케이션으로 잘려지고 변성된 연어 정자 DNA 및 106cpm/ml의 닉-번역된 cDNA 프로브함유 용액에서, 42℃, 18시간 실행하였다.
프로브된 필터의 자동방사선 사진을 도 32에 도시한다. 레인 1은32P-표지된 제한단편 마아커를 포함한다. 레인 2 내지 4는 다음과 같이 침팬지 간 RNA를 함유한다:레인 2는 20μg의 총 RNA를 함유하고;레인 3은 30μg의 폴리 A-RNA를 함유하며;레인 4는 20μg의 폴리 A+RNA를 함유한다. 도 38에서 보여주듯이, NANBH에 걸린 침팬지의 간은 HCV cDNA 프로브에 혼성되고, 크기에서 약 5000 뉴클레오티드 내지 약 11,000 뉴클레오티드로 나타나는 관련 폴리 A+RNA 분자의 이종성 집단을 함유한다. HCV cDNA에 혼성되는 이 RNA는 바이러스성 게놈 및/또는 바이러스 게놈의 특이적 전사를 나타낼 수 있다.
아래의 단원 Ⅳ.C.2에서 기술된 실험은 HCV가 RNA게놈을 함유한다는 제안과 일치한다.
Ⅳ.C.2. 감염된 개체의 혈청에서 HCV 유도된 RNA의 확인
단원 Ⅳ.A.1에서 기술한대로 고역과 침팬지 NANBH 혈장에서 단리된 입자로부터 핵산을 추출하였다. 단리된 핵산의 부분분획(1ml의 근본혈장과 동등한)을 20μl의 50mM Hepes, pH 7.5, 1mm EDTA 16μg/ml 효모 용해성 RNA에 재현탁시켰다. 샘플을 5분간 가열하고, 즉시 냉동하여 변성시키고, RNase A(25mM EDTa, 40mM Hepes, pH 7.5 중의 1단위 0.1mg/ml RNase A함유 5μl) 또는 DNase I(10mM MgCl225mM Hepes, pH 7.5 중의 1단위 DNase I 함유 5μl)로 처리하였다;대조샘플을 효소없이 배양하였다. 배양후, 2μg/ml 효모 용해성 RNA 함유 빙냉 2×SSC의 230μl를 가하고, 샘플을 니트로셀룰로스 필터상에서 여과하였다. 필터를 닉-번역에 의해32P-표지된 클론 81로부터의 cDNA 프로브와 혼성화하였다. 도 39는 필터의 자동방사선 사진을 보여주고 있다. 혼성화 신호를 DNase 처리된 및 대조샘플(각각 레인 2와 1)에서 검출하였지만 RNase 처리된 샘플(레인 3)에서는 검출되지 않았다. 이와같이, RNase A 처리는 입자에서 단리된 핵산을 파괴하고 DNase I 처리는 효과가 없기 때문에, 증명은 HCV게놈은 RNA로 구성되어 있다는 것을 강력히 제시한다.
Ⅳ.C.3. NANBH에 걸린 침팬지로부터 간 및 혈장시료에서 HCV 핵산 서열에서 유도된 증폭된 HCV 핵산서열의 검출
NANBH에 걸린 침팬지의 간과 혈장 및 대조 침팬지에서 존재하는 HCV 확산을 Saiki 등(1986)이 서술한 중합효소제 연쇄반응(PCR) 기술을 본질적으로 사용하여 증폭시켰다. 프라이머 올리고뉴클레오티드를 클론 81 또는 36 및 37에서 HCV cDNA 서열로부터 유도하였다. 증폭된 서열은, 겔 전기영동과 서던 블롯팅으로, 프로브로서 두 프라이머 사이의, 그러나 포함하지는 않고, 영역의 서열을 가진 적절한 cDNA 올리고머를 사용하여 검출하였다.
증폭 시스템에 의해 조사된 HCV 서열함유 RNA의 샘플을 NANBH 3침팬지의 간 생검과 2개의 대조 침팬지로부터 단리하였다. RNA 분획의 단리는 단원 Ⅳ.C.1에서 서술한 구아니디늄 티오시아네이트 과정에 의하였다.
증폭시스템에 의해 조사되고 있는 RNA 샘플을 NANBH에 걸린 2개의 침팬지의 혈장, 및 하나의 대조침팬지, 그리고 대조 침팬지의 다량혈장으로부터 단리하였다. 하나의 감염된 침팬지는 106과 같은 또는 보다 큰 CID/ml을 가졌고, 다른 감염된 침팬지는 105과 같은 도는 보다 큰 CID/ml을 가졌다.
핵산을 다음과 같이 혈장에서 추출하였다. 혈장의 0.1ml 또는 0.01ml를 10μl 폴리아데닐산 함유 TENB/프로테이나제 K/SDS 용액(0.05M 트리스-염산, pH 8.0, 0.001M EDTA, 0.1M NaCl, 1mg/ml 프로테이나제 K와 0.5% SDS)을 가지고 최종용적 10ml 되게 희석하여, 37℃에서 60분간 배양하였다. 이 프로테이나제 K소화후, 결과 혈장분획을 TE(10.0mM 트리스-염산, pH 8.0, 1mM EDTA) 포화페놀로 추출하여 탈단백질화 하였다. 페놀층을 원심분리로 분리하여 0.1% SDS 함유 TENB로 재추출하였다. 각 추출에서 결과적인 수성층을 모으고 각 부피의 페놀/클로로포름/이소아밀알코올[1:1(99:2)]로 2회 추출한 후 각 부피의 99:1 클로로포름/이소아밀알코올 혼합액으로 2번 추출하였다. 원심분리로 층분리를 한후, 수성층을 최종농도가 0.2M 아세트산나트륨이 되게 하고, 2부피 에탄올을 가하여 핵산을 침전시켰다. 침전된 핵산을 4℃에서 60분간, 38K로 SW41 로터에서 초원심분리하여 회수하였다.
상기에 벗붙여, 고역가 침팬지 혈장과 모아진 대조혈장을 Chomcyzski와 Sacchi(1987)에 의해 50μg의 폴리 A 담체로 각각 추출하였다. 이 과정은 산 구아니디늄 티오시아네이트 추출을 사용한다. RNA를 에펜도르프 마이크로퓨즈에서 4℃, 10분간 10,000rpm으로 원심분리하여 회수하였다.
2가지 경우에, PCR 반응에서 cDNA의 합성전에, 프로테이나제 K/SDS/페놀법에 의해 혈장으로부터 추출된 핵산을 S와 S엘루팁-R컬럼에서 용출시켜 정제하였다. 따르는 과정은 제조자의 지시에 따랐다.
PCR 반응에 대한 주형으로서 사용되는 cDNA는 상기 서술한 대로 제조된 핵산(총핵산 또는 RNA 중 하나)에서 유도하였다. 에탄올 침전반응에 이어서, 침전된 핵산을 건조시켜 DEPC 처리된 증류수에 재현탁시켰다. 핵산에서 2차 구조를 65℃에서 10분간 가열하여 파괴시키고, 샘플을 얼음상에서 즉시 냉각하였다. cDNA를 간으로부터, 또는 10 내지 100μl 혈장에서 추출한 핵산(또는 RNA)으로부터 1 내지 3μg의 총 침팬지 RNA를 사용하여 합성하였다. 합성은 역전사효소를 이용하여, 25μl 반응액에서 제조자, BRL에 의해 표기된 프로토콜을 사용하여 실행된다. cDNA 합성을 위한 프라이머는 하기 기술한 PCR 반응에서 또한 이용되는 것들이다. cDNA 합성을 위한 모든 반응 혼합물은 23단위의 RNAase 억제제, RNASINTM(Fisher/PromegA)을 함유한다. cDNA 합성에 이어서, 반응 혼합액을 물로 희석하고, 10분간 가열하여 빨리 얼음상에서 냉각시켰다.
PCR 반응을 RNase Alμg의 첨가를 제외하고는 제조자의 지시(Cetus-Perkin-Elmer)에 따라 본질적으로 수행하였다. 반응을 최종부피 100μl에서 실행하였다. PCR을 35사이클에 대해 수행하고, 37℃, 72℃와 94℃를 이용하였다.
cDNA 합성과 PCR 반응을 위한 프라이머는 클론 81, 클론 36 또는 클론 37b중 하나의 HCV cDNA 서열로부터 유도하였다(클론 81, 36과 37b의 HCV cDNA 서열을 각각 도 4, 도 5, 도 10에 도시한다). 클론 81에서 유도한 2개의 16-머 프라이머의 서열은 다음과 같았다:
5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3'과
5) GAT AAC CTC TGC CTG A 3'
클론 36에서 프라이머의 서열은:
5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'
이었다. 클론 37b에서 프라이머의 서열은:
5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'
이었다. PCR 반응에서, 프라이머 쌍은 클론 81에서 유래한 2개의 16-머 또는 클론 36에서의 16*머중 하나와 클론 37b로부터의 16-머로 구성되었다.
PCR 반응 생성물을 알칼리 겔 전기영동으로 생성물의 단리에 의해 분석하였고, 이어서 서던 블롯팅을 하고, 프라이머를 중첩하지 않는 HCV CDNA의 영역에서 유래한32P-표지된 내부 올리고뉴클레오티드프로브를 가지고 증폭된 HCV-cDNA 서열의 검출을 하였다. PCR 반응 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하여, 핵산은 염과 에탄올로 수성층으로부터 침전시켰다. 침전된 핵산을 원심분리로 모으고, 증류수에 용해시켰다. 샘플의 부분분획을 1.8% 알칼리 아가로스겔상에서 전기영동시켰다. 60,108과 161뉴클레오티드 길이의 단일 나선 DNA를 분자량 마아커로 겔상에서 동시-전기영동하였다. 전기영동후에, 겔의 DNA를 비오자르 제타프로브 페이퍼(Biorad Zeta Probe Paper)상으로 전이시켰다. 예비혼성화 및 혼성화, 그리고 세척조건은 제조자(Biorad)에 의해 표시된 것들이었다.
증폭된 HCV cDNA의 혼성화-검출을 위해 사용되는 프로브는 다음과 같았다. PCR 프라이머의 쌍을 클론 81에서 유도하였을 때, 프로브는 2개의 프라이머의 서열 사이의 영역에 위치하는 것에 상응하는 서열을 가진 108-머였다. PCR 프라이머의 쌍은 클론 36과 37b에서 유도할 때, 프로브는 클론 35에서 유도된 닉-번역된 HCV cDNA 삽입이다. 프라이머는 클론 37b 삽입의 뉴클레오티드와 클론 36 삽입의 206 내지 268에서 유도한다. 클론 36에서 HCV cDNA 삽입의 3'-말단은 클론 36에서 삽입의 뉴클레오티드 1 내지 186을 중첩한다;그리고, 클론 35삽입의 5'-말단은 클론 37b에서 삽입의 뉴클레오티드 207 내지 269를 중첩한다(도 5, 도 8 및 도 10를 비교하라). 이와같이, 클론 35에서 cDNA 삽입은 클론 36과 37b 유도된 프라이머의 서열 사이의 영역의 부분에 뻗어있어서, 이들 프라이머를 포함하는 증폭된 서열을 위한 프로브로서 유용하다.
간시료로부터 RNA 분석은 프라이머와 프로브의 두 세트를 이용하는 상기 과정에 다른다. NANBH에 걸린 3침팬지의 간에서 RNA는 기대되는 크기의 증폭서열을 위한 포지티브 혼성화 결과를 생성하였고(81과 36과 37b에 대해, 각 161과 586 뉴클레오티드), 한편, 대조 침팬지는 네가티브 혼성화 결과를 생성하였다. 동일한 결과를, 실험을 3번 반복하였을때, 달성하였다.
혈장으로부터 핵산과 RNA의 분석은 클론 81로부터 프라이머와 프로브를 이용하는 상기 과정에 또한 다른다. 혈장은 NANBH를 가진 두 침팬지, 대조 침팬지로부터, 그리고 대조침팬지로부터 모아진 혈장이다. 두 NANBH 혈장은 PCR 증폭 측정법에서 포지티브 결과를 생성하는 핵산/RNA를 함유하여였고, 한편 대조혈장의 둘다 네가티브 결과를 생성하였다. 이들 결과를 반복하여 여러번 수득하였다.
Ⅳ.D. 감염된 개체에서의 혈청중의 HCV 항체를 검출하는 방사선면역 측정법
HCV 항원에 대한 항체를 검출하는 고상 방사선 면역측정법을 Tsu와 Herzenberg(1980)에 근거하여 발전하였다. 마이크로 타이터 플레이트(Immulon 2, Removawell strips)를 HCV 에피토프 함유 정제된 폴리펩티드로 피복한다. 피복된 플레이트를 HCV 에피토프 또는 적절한 대조표준에 대한 항체를 함유한다고 추정되는 사람혈청샘플과 배양한다. 배양하는 동안, 항체가, 존재할 경우, 면역학적으로 고상항원에 결합된다. 비결합 물질의 제거와 마이크로타이터 플레이트의 세척후에, 사람항체-NANBV 항원의 복합체를125I-표지된 양 항-사람 면역글로불린과의 배양에 의해 검출한다. 비 결합된 표지항체를 흡인하고 제거하고, 플레이트를 세척한다. 각각의 웰의 방사능을 측정한다;결합한 사람 항-HCV 항체의 양은 웰에서의 방사능예 비례한다.
Ⅳ.D.1. 융합 폴리펩티드 SOD-NANB5-1-1의정제
단위 Ⅳ.B.1에서 서술한 대로 재조합 박테리아에서 발현되는 융합 폴리펩티드 SOD-NANB5-1-1을 요소로의 세포추출물의 분화 추출에 의해 재조합 대장균으로부터 정제하고, 음이온과 양이온 교환 칼럼상에서 다음과 같이 크로마토그라피를 하였다.
1ℓ 배양물에서 녹은 세포를 0.0M 트리스염산, pH 8.0 함유 20%(w/v) 슈크로스 10ml에 재현탁시켜 0.4ml의 0.5M EDTA, pH 8.0을 가하였다. 0℃에서 5분후에, 혼합물을 4,000xg에서 10분간 원심분리하였다. 결과적인 펠렛을 0.05M 트리스 염산, pH 8.0, 1mM 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)와 1μg/ml 스타틴 A함유 25%(w/v) 슈크로스 10ml에 현탁시켜서, 0.5ml 리소자임(10mg/ml)을 가하고 0℃에서 10분 배양하였다. 0.05M 트리스염산, pH 8.0, 1mM EDTA중의 1%(v/v)트리톤 X-100 10ml 첨가후, 혼합물을 때때로 교반하면서, 추가로 10분, 0℃에서 배양하였다. 결과의 점성 용액을 멸균 20-게이지 피하침으로 6번 통과하여 균질화하고 25분간 13,000xg에서 원심분리하였다. 펠렛물질을 0.01M 트리스염산 pH 8.0 5ml에서 현탁하여, 헌탁액을 10분간 4,000xg에서 원심분리하였다. SOD-NANB5-1-1융합단백질 함유펠렛을 0.02M 트리스염산, pH 8.0, 1mM 디티오트레이톨중의 6M 요소 5ml(완충액 A)에 용해시키고 완충액 A로 평형을 이루는 Q-세파로스 패스트 플로우의 컬럼에 적용시켰다. 용출후에, 분획을 SDS의 존재중에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하여, SOD-NANB5-1-1의 함량을 측정하였다. 이 폴리펩티드 함유 분획을 모으고 0.02M 인산나트륨 완충액, pH 6.0, 1mM 디티오트리에톨중의 6M 요소(완충액 B)에 대해 투석하였다. 투석된 샘플을 완충액 B와 평행을 이루는 S-세파로스 패스트 플로우의 컬럼에 적용시키고, 폴리펩티드를 완충액 B에서 0.1 내지 0.3M 염화나트륨의 선형 구배로 용출하였다. 분획을 SOD-NANB5-1-1존재를 위해 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하여 적절한 분획을 모았다.
SOD-NANB5-1-1폴리펩티드의 최종제제를 SDS 존재중 폴리아크릴아미드 겔상의 전기영동으로 조사하였다. 이 분석을 근거하여, 제제는 80% 이상 순수하다.
Ⅳ.D.2. 융합 폴리펩티드 SOD-NANB81의 정제
단원 Ⅳ.B.2에서 기술된대로 재조합 박테리아에서 발현되는 융합 폴리펩티드 SOD-NANB81을 요소로 세포추출물의 분화 추출에 의해 재조합 대장균에서 정제하고, 융합 폴리펩티드 SOD-NANB5-1-1의 단리를 위해 기술된 과정(단위 Ⅳ.D.1.을 참조하라)을 사용하여 음이온과 양이온 교환 컬럼상에서 크로마토그래피하였다.
SOD-NANB81폴리펩티드의 최종제제를 SDS의 존재중에서 폴리아크릴아미드의 겔상에서 전기영동하여 조사하였다. 이 분석에 근거하여, 제제는 50% 이상 순수하였다.
Ⅳ.D.3. 고상 반사선 면역측정법에 의한 HCV 에피토프에 대한 항체의 검출
NANBH에 걸린 것으로 진단된 32환자의 혈청샘플을 방사선 면역측정법(RIA)으로 분석하여 융합 폴리펩티드 SOD-NANB5-1-1에 존재하는 HCV 에피토프에 대한 항체가 검출되지의 여부를 측정한다.
미세역가 플레이트를 단원 Ⅳ.D.1.와 Ⅳ.D.2.에 따라, 각각 부분적으로 정제된 SOD-NANB/0105-1-1 또는 SOD-NANB81로 피복하였다. 측정은 다음과 같이 실행하였다.
0.125M 붕산나트륨완충액, pH 8.3, 0.075M 염화나트륨중의 SOD-NANB5-1-1또는SOD-NANB81(BBS)의 0.1 내지 0.5μg 함유한 100μl 부분분획을 마이크로타이터 플레이트(Dynatech Immulon 2 Removawell Strips)의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 습한 챔버에서 밤새 4℃에서 배양하고, 그후에, 단백질 용액을 제거하여, 웰을 0.02% 트리톤 X-100함유 BBS(BBST)로 3번 세척하였다. 비특이적 결합을 억제하기 위해 웰을 BBS중 BSA용액 5mg/ml의 100μl 첨가에 의해 우혈청 알부민(BSA)으로 피복하고, 실온에서 1시간 배양하여;배양후에 BSA 용액을 제거하였다. 피복된 웰에서 폴리펩티드를 10mg/ml BSA 함유 0.01M 인산나트륨 완충액, pH 7.2, 0.15M 염화나트륨 중의 1/100희석된 혈청샘플(PBS) 100μl를 가하여 혈청과 반응시키고 1시간 37도시에서 혈청함유 웰을 배양하였다. 배양후에, 혈청샘플을 흡인하고 제거하고 웰을 BBST로 5분 세척하였다. 융합 폴리펩티드에 결합된 항-NANB5-1-1과 항-NANB81을 피복된 웰에 대한125I-표지된 F'(ab)2양 항-사람IgG의 결합에 의해 측정하였다. 표지된 프로브의 100μl 부분분획(특이적 활성 5 내지 20μCi/mg)을 각 웰에 가하고, 플레이트를 1시간동안 37℃에서 배양한 후, 흡인으로 과다한 프로브를 제거하여, BBST로 5번 세척하였다. 가 구멍에 결합된 방사능의 양은 감마 방사선 검출 카운터에서 카운트하여 측정하였다.
NANBH에 걸린 개체에서 항-NANB5-1-1과 항-NANB81의 검출결과를 표 1에 제시한다.
[표 1a]
[표 1b]
표 1에서 보듯이, NANBH에 걸린 것으로 진단된 환자의 32혈청중 19는 SOD-NANB5-1-1과 SOD-NANB81에 존재하는 HCV에피토프에 대한 항체에 관하여 포지티브였다. 그러나 포지티브인 혈청샘플은 SOD-NANB5-1-1및 SOD-NANB5-1-1과 면역학적으로 동일한 반응성은 없었다. 환자번호 1의 혈청샘플은 SOD-NANB81에는 포지티브이나 SOD-NANB5-1-1에는 아니다. 환자번호 10,15와 17의 혈청샘플은 두융합 폴리펩티드에 동일하게 반응하나, 한편, 환자번호 2,4,7과 9의 혈청샘플은 SOD-NANB5-1-1보다 SOD-NANB5-1-1와의 반응에서 2 내지 3배 더 높았다. 이들 결과는 NANB5-1-1과 NANB81이 적어도 1개의 유일한 에피토프를 함유하고, 2개의 폴리펩티드는 적어도 1개의 에피토프를 공유할 가능성이 있다.
Ⅳ.D.4. NANBH에 대한 고상 RIA의 특이성
NANBH에 대한 고상 RIAs의 특이성을 HAV 또는 HBV로 감염된 환자혈청과 대조 개체혈청에 대한 측정법을 사용하여 시험하였다. 부분적으로 정제된 SOD-NANB5-1-1과 SOD-NANB81을 이용하는 측정법을 이용하는 측정법을, HAV 또는 HBV를 가진 것으로 이미 진단된 환자 또는 혈액은행 공여자인 개체로부터 혈청을 얻는 것을 제외하고는 본질적으로 단원 Ⅳ.D.3에서 기술한대로 수행하였다. HAV와 HBV 감염 환자혈청에 대한 결과를 표 1에 제시하였다. RIA는 HAV 감염환자의 11혈청 견본과 HBV 감염환자의 20혈청견본을 사용하여, 시험되었다. 표 1에서 보듯이, 이들 혈청의 어떤 것도 BB-NANBV 에피토프 함유 융합 폴리펩티드와 포지티브 면역반응을 생성하지 않았다.
NANB5-1-1항원을 사용하는 RIA는 대조개체에서 혈청의 면역학적 반응성을 측정하는데 사용되었다. 정상 혈액 수여자에서 획득한 230혈청샘플중, 단지 둘만이 RIA에서 포지티브 반응을 보였다(자료에는 보이지 않는다). 이들 혈청샘플이 획득되는 두혈액 수여자를 미리 HCV에 노출시켰을 가능성이 있다.
Ⅳ.D.5. NANBH 감염의 진행동안 NANB5-1-1의 반응성
2환자와 4침팬지의 NANBH감염 진행동안, 항-NANB5-1-1항체의 존재는 단원 Ⅳ.D.3에 기술한대로 RIA를 사용하여 따른다. 또한, RIA를 감염된 침팬지에서 HAV와 HBV의 감염진행동안 항-NANB5-1-1항체의 존재 또는 부재를 결정하는데 사용하였다.
표 2에 제시된 결과는 침팬지와 사람에서, 항-NANB5-1-1항체는 NANBH 감염의 급성상의 시작에 따라서 검출된다는 것을 보여준다. 항-NANB5-1-1항체는 HAV 또는 HBV중 하나로 감염된 침팬지의 혈청 샘플에서는 검출되지 않았다. 이와같이, 항-NANB5-1-1항체는 HCV에 개체의 노즐을 위한 마아커로 작용한다.
[표 2]
Ⅳ.E. NANB5-1-1에 대한 다중 클론성 혈청항체의 정제
NANBH에 걸린 환자의 혈청샘플에서 항체와의 SOD-NANB5-1-1폴리펩티드의 특이적 면역 반응성에 근거하여, NANB5-1-1에서 에피토프와 면역학적으로 반응하는 혈청 항체를 정제하는 방법을 개발하였다. 이 방법은 친화성 크로마토그라피를 이용한다. 정제된 SOD-NANB5-1-1폴리펩티드(단원 Ⅳ.D.1. 참조)를 불용성 지지체에 부착하였다;부착은 비이동성 폴리펩티드를 NANB5-1-1에 대한 항체를 위해 그의 친화성을 유지하는 것이다. 혈청샘플에서 항체는 매트릭스-결합된 폴리펩티드에 흡수되었다. 세척하여 비특이적으로 결합된 물질과 비결합된 물질을 제거한후, 결합항체를 pH 변화 및/또는 유화제, 예를들어 요소로, 결합된 SOD-HCV 폴리펩티드로부터 방출시켰다.
결합된 SOD-NANB5-1-1함유 니트로셀룰로스 막은 다음과 같이 제조하였다. 니트로셀룰로스막, 0.2μ 세공크기의 2.1cm 사르토리우스(Sartorius)를 3분 동안 BBS로 3번 세척하였다. SOD-NANB5-1-1을 2시간동안 실온에서, BBS중에서 정제된 제제의 배양에 의해 막에 결합시켰다;또한 이것을 4℃에서 밤새 배양하였다. 비결합 항체 함유 용액을 제거하고, 필터를 BBS로 1회 세척당 3분씩, 3번 세척하였다. 막상의 잔류 활성부위를 30분간 5mg/ml BSA용액과 배양하여 BSA로 차단하였다. 과다한 BSA를 BBS로 5번, 증류수로 3번 막을 세척하여 제거하였다. 그후에, 바이러스성 항원과 BSA 함유막을 0.05M 글리신 염산염, pH 2.5, 0.01M 염화나트륨(Gly HCl)으로 15분간 처리하고, PBS로 3분간씩 3번 세척하였다.
다중클론성 항-NANB5-1-1항체를 2시간동안, NANBH를 가진 개체성분과 융합 폴리펩티드 함유 막을 배양하여 단리하였다. 배양후, 필터를 BBS로 5번, 증류수로 2번 세척하였다. 그후, 결합 항체를 매용출당 3분씩, Gly HCl의 5용출액으로 각 필터로부터 용출시켰다. 용출물의 pH를 2.0M 트리스 염산, pH 8.0 함유 시험관에 각 용출물을 모아서, pH 8.0으로 조정하였다. 친화성 크로마토그라피 후에 항-NANB5-1-1항체의 회수율은 약 50%이다.
결합 바이러스 항원함유 니트로셀룰로스 막을 결합능력에서 평가할 수 있는 감소없이 여러번 사용할 수 있다. 막을 재생하기 위해, 항체를 용출한 후, 막을 BBS로 3분동안 3번 세척한다. 그런다음, 4℃, BBS 중에서 이들을 보관한다.
Ⅳ.F. 정제된 사람 다중클론성 항-HCV 항체를 사용하여 감염된 혈장에서 HCV 입자의 포획;포획된 입자에서 HCV cDNA에 대한 핵산의 혼성화
Ⅳ.F.1. 사람 다중클론성 항-HCV 항체를 사용하여 감염된 혈장에서 HCV 입자의 포획
NANBH에 걸린 침팬지의 감염성 혈장에 존재하는 단백질-핵산 복합체를, 폴리스티렌 비이드에 결합된 정제된 사람 다중클론성 항-HCV 항체를 사용하여 단리하였다.
다중클론성 항-NANB5-1-1항체를, 클론 5-1-1에서 코드화된 SOD-HCV 폴리펩티드를 사용하여 NANBH에 걸린 사람 혈청으로부터 정제하였다. 정제방법을 단원 Ⅳ.E.에서 기술하였다.
정제된 항-NANB5-1-1항체를 폴리스티렌 비이드(1/4 직경, Specular finish, Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois)에, 실온에서 밤새 각각을 1ml항체(붕산염 완충식염수 ml중 1μg, pH 8.5)와 배양하여, 결합시켰다. 밤새 배양한 후, 비이드를 TBST[50mM 트리스염산, pH 8.0, 150mM 염화나트륨, 0.05%(v/v) 트윈 20]과 10mG/ml BSA함유 인산염 완충식염수(PBS)로 1번 세척하였다.
정제된 항-NANB5-1-1항체를, 총 사람면역글로불린에 대치하는 것을 제외하고는 대조 비이드를 동일한 방법으로 제조하였다.
비이드의 결합된 항-NANB5-1-1항체를 사용하여, NANBH 감염된 침팬지 혈장으로부터 HCV의 포획을 다음과 같이 달성하였다. 사용된 NANBH를 가진 침팬지 혈장을 단원 Ⅳ.A.1에서 기술하였다. NANBV 감염된 침팬지 혈장의 부분분획(1ml)을 37℃에서, 3시간 항-NANB5-1-1항체 또는 대조 면역글로불린중 하나로 피복된 5개 비이드의 각각과 배양시켰다. 비이드를 TBST로 3번 세척하였다.
Ⅳ. F.2. NANBV-cDNA에 대한 포획된 입자에서 핵산의 혼성화
항-NANB5-1-1항체로 포획된 입자에서 방출된 핵산성분을 클론 81에서 유도한 HCV cDNA에 대한 혼성화를 위해 분석하였다.
HCV 입자를 Ⅳ. F.1에 기술한 대로 NANBH 감염된 침팬지 혈청으로부터 포획하였다. 입자로부터 핵산을 방출하기 위해, 세척된 비이드를 프로테이나제 K(1mG/ml), 10mM 트리스염산, pH 7.5, 10mM EDTA, 0.25%(w/v)SDS, 10μg/ml 용해성 효모 RNA 함유 용액의 비이드당 2ml와 60분간 37℃에서 배양시키고, 상등ㅇㄱ을 제거하였다. 상등액을 페놀과 클로로포름으로 추출하여, 핵산을 -20℃에서 밤새 에탄올로 침전시켰다. 핵산 침전물을 원심분리로 모아서, 건조시켜, 50mM HEPES, pH 7.5에 용해시켰다. 항-NANB5-1-1항체와 총 사람면역글로불린 함유 대조 비이드로 피복된 비이드로부터 수득한 샘플에서 가용성 핵산의 중복 부분분획을 니트로셀룰로스 필터상에서 여과하였다. 필터를 클론 81에서 정제된 HCV cDNA 단편에서 만들어진32P-표지된, 닉-번역 프로브와 혼성화하였다. 프로브 제조법과 혼성화법을 단원 Ⅳ. C.1에 기술하였다.
항-NANB5-1-1항체함유 비이드에 의해 포획된 입자로부터 핵산함유 프로브된 필터의 자동 방사선 사진을 도 40에 도시한다. 항-NANB5-1-1항체를 사용하여 수득한 추출물(A1,A2)은 대조항체 추출물(A3,A4)과 대조효모 RNA(B1,B2)와 관련되어, 분명한 혼성화 신호를 제공하였다. 정제된, 클론 81 cDNA 단편의 1pg, 5pg과 10pg으로 구성된 표준은 각각 C1 내지 3에서 보여준다.
이들 결과는 항-NANB5-1-1항체에 의해 NANBH 혈장에서 포획된 입자로 클론 81에서 HCV cDNA와 혼성화되는 핵산을 함유한다는 것을 입증하며, 이와같이하여, 이들 클론에서 cDNAs는 NANBH를 위한 병인학적물질에서 유해한다는 상세한 증명을 제공한다.
Ⅳ. G. 정제된 항-NANB5-1-1항체와의 C100-3의 면역 반응성
항-NANB5-1-1항체와 C100-3 융합 폴리펩티드의 면역 반응성을 방사선면역측정법으로 결정하였고, 여기서, 고상에 결합된 항원은 정제된 항-NANB5-1-1항체와 125I-표지된 양 항-사람항체로 검출된 항원-항체 복합체에 도전시켰다. C100-3 폴리펩티드의 면역반응성을 SOD-NANB5-1-1항원의 것과 비교하였다.
융합 폴리펩티드 C100-3을 각각 단원 Ⅳ.B.5와 단원 Ⅳ.B.6에서 기술한대로 합성하고 정제하였다. 각각 단원 Ⅳ.B.1과 단원 Ⅳ.D.1에서 기술한 대로 융합 폴리펩티드 SOD-NANB5-1-1항체를 단원 Ⅳ.E.에 기술한 대로 수득하였다.
0.125M 붕산나트륨 완충액, pH 8.3, 0.075M 염화나트륨(BBS)중의 정제된 C100-3항원의 다양한 양을 함유하는 100μl 부분분획을 마이크로타이터 플레이트(Dynatech Immulon 2removavell Strips)의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 4℃ 습한 챔버에서 밤새 배양한후, 단백질 용액을 제거하고 웰을 0.02% 트리톨 X-100 함유 BBS(BBST)로 3번 세척하였다. 비-특이성 결합을 억제하기 위해, 웰을 BBS중의 BSA 용액 5mg/ml중 100μl를 가하여 BSA로 피복하여, 실온에서 1시간 배양한 후, 과다한 BSA용액을 제거하였다. 피복된 웰중의 폴리펩티드를, 1μg 항체/구멍을 가하고 샘플을 37℃에서 1시간 배양하여, 정제된 항-NANB5-1-1항체와 반응시켰다. 배양후, 과다한 용액을 흡인으로 제거하고, 구멍을 BBST로 5번 세척하였다. 융합 폴리펩티드와 결합된 항-NANB5-1-1을, 피복된 웰에126I-표지된 F'(ab)2양 항-사람 IgG를 결합시킴으로써 측정하였다. 표지된 프로브의 100μl 부분분획(특이적활성 5 내지 20μCi/μg)을 각 웰에 가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 배양하여, 흡인으로 과다한 프로브를 제거하고, BBST로 5번 세척하였다. 각 구멍에 결합된 방사능의 양을, 감마 방사선을 검출하는 카운터에서 카운트하여 측정하였다.
정제된 항-NANB5-1-1와의 C100의 면역 반응성을 정제된 항체와의 NANB5-1-1의 그것과 비교하여, 결과를 표 3에 제시한다.
[표 3]
표 3에서의 결과는 항-NANB5-1-1은 C100-3 폴리펩티드의 C100 부분에 에피토프를 인식한다는 것을 보여주고 있다. 그에 따라, NANB5-1-1과 C100은 공통 에피토프를 공유한다. 결과는 이 NANV 에피토프를 코드화하는 cDNA 서열을 클론 5-1-1과 클론 81에 존재한다는 것을 제안한다.
Ⅳ. H. HCV의 특성확인
Ⅳ. H.1. HCV 게놈의 꼬임도의 특성확인
HCV 게놈은 항-NANB5-1-1항체 피복된 폴리스티렌 비이드상에 포획된 입자로부터 핵산분획을 단리하고, 단리된 핵산의 플러스 및/또는 마이너스 HCV cDNA 스트란드와의 혼성화 여부를 측정하여 그의 꼬임도에 대하여 특성확인하였다.
입자는 단원 Ⅳ. F.1에서 기술한 대로 면역 정제된 항-NANB5-1-1항체로 피복된 폴리스티렌 비이드를 사용하여, HCV 감염된 침팬지 혈장으로부터 포획하였다. 입자의 핵산성분은 단원 Ⅳ. F.2에서 기술한 방법을 사용하여 방출시켰다. 3ml 고역가 혈장과 등가의 분리된 게놈 핵산의 부분분획을 니트로셀룰로스 필터상에서 블롯팅하였다. 대조로서, 클론 81에서 변성된 HCV cDNA의 부분분획(2pg)을 또한 동일32P-표지된 플러스 혼합물 또는 마이너스 혼합물로 프로브하였고; cDNA를 클론 40b, 81과 25c로부터 절출하였다.
클론 81, 40b와 25c로부터 HCV cDNAs를 EcoRI로 절출하고, M13벡터, mp18과 mp19에서 cDNA 단편을 클로닝하여 단일 스트란드 프로브를 수득하였다[Messin(1983)]. M13 클론이 HCV cDNAs로부터 유래된 DNA의 플러스 또는 마이너스 스트란드를 함유하는지의 여부를 측정하여, M13 클론을 서열화하였다. 서열화는 Sanger 등의 디데옥시사슬 말단화 방법(1977)으로 이루어졌다. 포획된 입자로부터 단리된 HCV 게놈의 알리큇을 함유하는 한 셋트의 중복 필터의 각각을 HCV cDNAs에서 유도한 ㅍㄹ러스 또는 마이너스 스트란드 프로브중 하나와 혼성화하였다. 도 41는 클론 81, 40b와 25c에서 유래한 프로브의 혼합물을 가지고 NANBV 게놈을 프로브하여, 수득한 자동방사선 사진을 보여준다. 이 혼합물을 혼성화 측정법의 민감도를 증가시키는데 사용하였다. 패널 Ⅰ에서 샘플은 플러스 나선 프로브 혼합물과 혼성화되었다. 패널 2에서 샘플은 마이너스 스트란드 프로브 혼합물과 혼성화되어서 프로브되었다. 면역블롯의 패널의 샘플의 성분을 표 4에 제시한다.
[표 4]
도 41의 결과에서 보듯이, 단지 마이너스 스트란드 DNA 프로브가 단리된 HCV 게놈과 혼성화되었다. 게놈이 RNase에는 민감하고 DNase에는 민감하지 않다는 것을 보여주는 결과(단원 Ⅳ.C.2 참고)와 조합하여, 이 결과는 NANBV의 게놈이 포지티브 스트란드 RNA라는 것을 제안한다.
이들 자료 및 추정되는 NANBV의 생리화학적 성질에 관한 다른 실험실 자료는 HCV가 플래비비리다에의 일원일 가능성과 일치하고 있다. 그러나, HCV가 새로운 바이러스 물질의 등급을 나타낼 가능성을 배제하지는 않는다.
Ⅳ.H.2. PCR에 의해 증폭될때 클론 81에서 유래된 HCV cDNA에 혼성화하는 포획된 입자의 서열의 검출
포획된 입자의 RNA를 단원 Ⅳ.H.1에 기술한 대로 수득하였다. 클론 81에서 유도한 HCV cDNA에 혼성화되는 서열에 대한 분석을, 혼성화 프로브가 클론 81 cDNA 서열에서 유도한 키나제화된 올리고펩티드인 것을 제외하고는, 단원 Ⅳ.C.3에 기술한 대로 PCR 증폭과정을 이용하여 실행하였다. 결과는 증폭된 서열이 클론 81 유래된 HCV cDNA 프로브와 혼성화된다는 것을 보여주었다.
Ⅳ.H.3. 덴그플래비바리어스(MNWWVD1)의 비-구조된 단백질과 클론 14i에서 39c의 조합된 ORF에 의해 코드화된 HCV 폴리펩티드 사이의 동종성
클론 14i에서 39c의 조합된 HCV cDNAs는 도 26에서 보듯이, 하나의 연속 ORF를 함유한다. 여기서 코드화된 폴리펩티드를 덴그플래비바이러스(MNWVDI)에서 비-구조성 폴리펩티드의 영역과 서열 동종성에 대하여 분석하였다. 분석은 ㄷ이호프 단백질 자료기본을 사용하여 컴퓨터로 수행하였다. 결과는 도 42에서 도시하고, 기호(:)는 정확한 동종성을 지시하고, 기호(.)는 서열에서 보존성 치환을 의미하며, 다쉬는 가장 큰 동종성을 달성하기 위해, 서열에 삽입하는 공간을 지적한다. 도면에서 보듯이, HCV cDNA에서 코드화된 서열과 덴그바이러스의 비-구조성 폴리펩티드 사이에 상당한 동종성이 있다. 도 42에서 보여주듯이 동종성에 덧붙여, cDNA의 3-말단으로 영역에서 코드화된 폴리펩티드 부분의 분석은 또한 덴그 중합효소에서의 서열과 동종성인 서열을 함유하였다. RNA-의존성 RNA 중합효소에 대해 본질적인 것으로 생각되는 정규의 Gly-Asp-Asp(GDD) 서열은 HCV cDNA에 코드화된 폴리펩티드에 포함되고, 이것은 위치에 있어서 덴그 2 바이러스에서의 위치와 일치한다(자료는 제시하지 않았다).
Ⅳ.H.4. HCV-DNANANBH 감염된 조직에서는 검출되지 않는다.
2형태의 연구는, HCV-DNA는 NANBH를 가진 개체로부터의 조직에서는 검출되지 않는다는 것을 제안하는 결과를 제공한다. Ⅳ.C와 Ⅳ.H.1R과 Ⅳ.H.2에서 기술한 것과 연결하여, 이들 결과는 HCV는 DNA 함유 바이러스가 아니고 그의 복제는 cDNA를 포함하지 않는다는 증거를 제공한다.
Ⅳ.H.4.a. 서던 블롯팅 과정
NANBH 감염된 침팬지 간이 검출할 수 있는 HCV-DNA(또는 HCV-cDNA)를 함유하는지 여부를 측정하기 위해, 이 공급원에서 단리된 DNA의 제한 효소단편을 서던 블롯트하였고 블롯을32P-표지된 HCV cDNA로 프로브하였다. 결과는 표지된 HCV cDNA로 혼성화되지 않는다는 것을 보여주었다. 대조적으로, 포지티브 대조에서, 베타-인터페론 유전자의 표지된 프로브는 강하게 제한효소로 소화된 사람 태반 DNA의 서던 블럭에 강력하게 혼성화되었다. 이들 시스템은 표지된 프로브로 검출된 유전자의 단일 복사를 검출하도록 계획되어 있다.
DNA는 NANBH를 가진 그 침팬지의 간으로부터 단리되었다. 대조 DNA는 비감염된 침팬지 간과 사람태반으로부터 단리되었다. DNA를 추출하는 과정은 본질적으로 Maniatis 등(1982)에 따르고, DNA 샘플은 단리과정동안 RNase로 처리되었다.
각 DNA 샘플을 EcoRI, M60I 또는 Hinci Ⅱ(12μg)중 하나로 제조자의 지시에 따라, 처리하였다. 소화된 DNA를 1% 중성 아가로스 겔상에서 전기영동하였고, 니트로셀룰로스 상에서 서던 블롯트를 하며, 블롯트된 물질을 적절한 닉-번역 프로브 cDNA와 혼성화하였다(3×106cpm/ml 혼성화 혼합). 감염된 침팬지 간과 정상 간으로부터 DNA를 클론 36 플러스 81로부터의32P-표지된 HCV를 클론 36 플러스 81로부터의32P-표지된 HCV cDNA와 혼성화하였다. 사람 태반으로부터의 DNA는 베타-인터페론 유전자로부터의32P-표지된 PNA와 혼성화하였다. 혼성화하웨, 블롯은 엄격한 조건하에서, 즉 0.1×SSC, 0.1% SDS 함유 용액으로, 65℃에서 세척하였다.
베타-인터페론 유전자 DNA를 Houghton 등(1981)에서 기술한 대로 제조하였다.
Ⅳ.H.4.b. PCR 기술에 의한 증폭
HCV-DNA가 NANBH에 걸린 침팬지 간에서 검출되는지 여부를 측정하기 위해, DNA를 조직으로부터 단리하여, 클론 81로부터의 HCV cDNA에서 유도한 프라이머와 프로브 폴리뉴클레오티드를 사용하는 PCR 증폭-검출기술을 실시하였다. 네가티브 대조는 감염되지 않은 HepG2 조직배양세포와 아마도 감염되지 않은 사람 태반에서 단리된 DNA 샘플이었다. 포지티브 대조는 클론 81로부터 공지의 상대적으로 소량(250분자)의 HCV cDNA 삽입을 가하는 네가티브 대조 DNA의 샘플이다.
또한, NANBH를 가진 침팬지와 동일한 간에서 단리된 RNA 분획은 HCV-cDNA 프로브와 보체의 서열을 함유하는 것을 증명하기 위해, PCR 증폭-검출 시스템을 또한 단리된 RNA 샘플에 사용하였다.
연구에서, DNA는 단원 Ⅳ.H.4.a에 기술된 과정에 의해 단리하였고, RNA는 본질적으로 Chirgwin 등이 기술한 대로 추출하였다(1981).
DNA의 샘플은 2 감염된 침팬지 간, 감염되지 않은 HepG2 세포와 사람 태반으로부터 단리하였다. 각 DNA의 1μg을 제조자의 지시에 따라 HomdiⅢ으로 소화하였다. 소화된 샘플에 대해서 역전자효소단계가 생략되는 것을 제외하고는 단원 Ⅳ.C.3에 기술된 대로 본질적으로 증폭된 HCV cDNA에 대한 PCR 증폭과 검출을 하게 되었다. PCR 프라이머와 프로브는 HCV cDNA 클론 81로부터 수득하고 단원 Ⅳ.C.3에 기술되어 있다. 증폭전에, 포지티브 대조를 위해, 각 DNA의 1μg 샘플을, 클론 81로부터 단리된 HCV cDNA 삽입의 250분자를 가하여 스파이크화하였다.
HCV 서열이 NANBH를 가진 침팬지 간에서 단리된 RNA에 존재하는지 여부를 측정하기 위해서, 총 RNA의 0.4μg 함유한 샘플을, 역전사효소가 네가티브 대조로서 얼마간의 샘플에서 생략되는 것을 제외하고는, 본질적으로 단원 Ⅳ.C.3에 기술한 대로 증폭과정을 실시하였다. PCR 프라이머와 프로브를 상술한 대로 HCV cDNA 클론 81에서 수득하였다.
결과는 HCV cDNA 프로브에 상보하는 증폭된 서열은 감염된 침팬지 간으로부터의 DNA에서 검출할 수 없고 네가티브 대조에서도 검출할 수 없다는 것을 보여주고 있다. 대조적으로, 감염된 침팬지 간으로부터 DNA 함유한 샘플이 증폭전에 HCV cDNA로 스파이크화되었을 때, 클론 81 서열을 모든 포지티브 대조샘플에서 검출하였다. 또한, RNA 연구에서, 증폭된 HCV cDNA 클론 81서열은 단지 역 전사효소가 사용될때만 검출되고, 그 결과는 DNA 오염에 기인하지 않는다는 것을 강력히 주장한다. 이들 결과는 NANBH를 가진 침팬지 간세포는 HCV DNA를 전혀 함유하지 않거나 또는 검출할 수 없는 수준으로 함유한다는 것을 보여준다. 스파이킹 연구에 근거하여, 만약 HCV DNA가 존재할 경우, 간세포당 0.06 복사 훨씬 미만의 수준이다. 대조적으로 동일한 간샘플레서 총 RNA의 HVC 서열을 PCR 기술로 용이하게 검출하였다.
Ⅵ. Ⅰ. HVC V100-3을 시험항원으로 사용할여 HCV 감염에 대한 ELISA 측정법
모든 샘플을 HCV C1003 ELISA를 사용하여 측정하였다. 이 측정법은 (단원 Ⅳ. B.5에서 기술한대로 합성하고 정제된) HCV C100-3항원과 마우스 단일클런성 항-사람 IgG의 고추냉이 과산화효소(HRP) 포합체를 이용한다.
HCV C100-3 항원으로 피복된 플레이트를 다음과 같이 제조하였다. 피복완충액(50mM 붕산나트륨, pH 9.0), 21ml/플레이트, BSA(25μg/ml), C100-3(2.50μg/ml), C100-3(2.50μg/ml) 함유 용액을 리무브어웰 임뮬론 Ⅰ 플레이트(Dynatech Corp.)에 가하여 직전에 제조하였다. 5분간 혼합한 후, 용액 0.2ml/웰 플레이트에 가하고, 뚜껑을 덮은 후, 2시간 동안 37℃에서 배양하여, 용액을 흡인으로 제거하였다. 웰을 400μl 세척완충액(100mM 인산나트륨, pH 7.4, 140mM 염화나트륨, 0.1%(w/v) 카제인, 1%(w/v) 트리톤 X-100, 0.01%(w/v)치메로살)으로 한번 세척하였다. 세처용액의 게거후에, 200μl/웰의 예비피복용액(10mM 인산나트륨, pH 7.2, 150mM 염화나트륨, 0.1%(w/v) 카레인과 2mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF))을 가하고, 플레이트를 느슨하게 뚜껑을 덮어서 증발을 억제하고, 30분간 실온에서 방치하였다. 그후, 웰을 흡인하여 용액을 제거하고, 선반가열없이, 밤새 동결건조하였다. 제조된 플레이트를 봉인된 알루미늄 주머니에서, 2 내지 8℃에 보관할 수 있다.
ELISA 측정을 수행하기 위해 20μl의 혈청샘플 또는 대조샘플을 300μl의 샘플희석액(100mM 인산나트륨, pH 7.4, 500mM 염화나트륨, 1mM EDTA, 0.1%(w/v) 카제인, 0.015(w/v)테로살, 1%(w/v) 트리톤 X-100, 100μg/ml 효모 추출물) 함유 웰에 가하였다. 플레이트를 봉인하여, 2시간 37℃에서 배양한 후, 흡인으로 용액을 제거하고, 웰을 400μl의 세척완충액(0.05% 트윈 20함유 인산염 완충식염수(PBS))으로 세척하였다. 세척된 웰을 오르토 접합 희석액(10mM 인산나트륨, pH 7.2, 150mM 염화나트륨, 50%(v/v) 우태아혈청, 1%(v/v) 열 처리된 말혈청, 1mM K3Fe(CN)6, 0.05%(w/v) 트윈 20, 0.02%(w/v) 치메로살)에 함유된 마우스 항-사람 IgG-HRP 포합체로 처리하였다. 처리하는 37℃에서 1시간하고, 용액을 흡인으로 제거하여, 웰을 세척완충액으로 세척한 후 또한, 세척액을 흡인으로 제거하였다. 결합된 효소 접합물의 양을 측정하기 위해, 200μl의 기질용액(10mg o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드/5ml 디벨로퍼용액)을 가하였다. 현상용액은 인산으로 pH가 5.1로 변경된 50mM 주석산 나트륨과 0.6μg/ml의 30% 과산화수소수를 함유한다. 기질용액 함유 플레이트를 실온, 암소에서 30분간 배양시켜, 반응을 50μg/ml 4N 황산을 가하여 중단시키고, OD를 측정하였다.
하기에 제공하는 실시예는 HCV C100-3 항원을 이용하는 마이크로타이터 플레이트 스크리닝 ELISA가 약 1%의 초기 반응율로 증면되는 것처럼, 임의의 공여자에 대해 약 0.5%의 반복 반응율을 가지는 높은 정도의 특이성을 가진다는 것을 보여준다. 측정법은 감염의 후급성상과 질한의 만성상동안 면역응답을 검출할 수 있다.
또한, 측정법은 NANBH를 위한 대리시험에서 네가티브 기목을 가진 어떤 샘플을 검출할 수 있다; 이들 샘플은 NANBH의 병렬을 가진 개체에서 취하거나 NANBH 전달에 관련된 수여자에게서 취한다.
하기 기술한 실시예에서, 다음 약어가 사용된다.
ALT알라닌 아미노 전달효소
Anti-HBcHBc에 대한 항체
Anti-HBsAgHBsAg에 대한 항체
HBcB형 간엽 코아항원
ABsAgB형 간염 표면항원
IgG면역글로불린 G
IgG면역글로불린 M
IU/L국제단위/리터
NA이용할 수 없음
NT시험되지 않음
N샘플크기
Neg네가티브
OD광학밀도
Pos포지티브
S/CO신호/커트오프
SD표준편차
x평균
WNL정산한계내
Ⅳ. 임의의 혈액 공여자의 집단에서 HCV감염
임의의 혈액 공여자중 1,056샘플(신선한 혈청)을 Irwin Memoricl 혈액 은행(샌프란시스코, 캘리포니아)에서 얻었다. 이들 샘플로 수득한 시험결과를 OD치의 분배를 보여주는 막대그래프로 요약하였다(도 43). 도 43에서 보듯이, 4 샘플은 3이고, 1샘플은 1과 3 사이이며, 5 샘플은 0.4와 1 사이이고, 나머지 1,046 샘플은 0.4이며, 이들 샘플의 90% 이상은 0.1이다.
반응성 무작위 샘플에 대한 결과를 표 5에 제시하다. 평균 플러스 5표준 편차와 동일한 커트오프수치를 사용하여, 1,056중 10샘플(0.95%)이 초기에 반응성이 있었다. 이들중, 5샘플(0.47%)은 ELISA를 사용하여 1초 측정했을때 반응성이 반복되었다. 또한, 표 5는 반복적으로 반응성인 샘플의 각각에 대해 ALT와 항-HBd 상태를 보여준다. 특히 흥미있는 것은 모든 5개의 반복반응성 샘플이 HCV ELISA에서 포지티브를 기록하는 한편 NANBH를 위한 두 대리시험에서는 네가티브였다는 사실이다.
[표 5]
Ⅳ. Ⅰ. 2. 침팬지 혈청샘플
11마리의 챔팬지로부터의 혈청샘플을 HCV c100-3 ELISA로 시험하였다. 이들 침팬지중 네마리를 제Ⅷ인자의 오염된 배치(아마도 허친슨 균주)로부터의 NANBH로 질병통제센타의 다니엘 브래들리 박사와의 공동 연구에서 수립된 과정에 따라 감염시켰다. 대조표준으로서, 네마리의 다른 침팬지를 HAV로, 그리고 세마리를 HBV로 감염시켰다. 혈청샘플을 감염후 상이한 시간에 얻었다.
표 6에 요약된 그 결과는 NANBH의 허친슨 균주로 감염된 모든 침챔지에서 증명된 항체 혈청전환을 보여주다. 감염의 급성단계(상단한 상승 및 ALT의 정상수준에로의 후속복귀에 의해 증명되는 바와 같이)에 이어서, HCV c1000-3에 대한 항체는 4마리의 후속복귀에 의해 증명되는 바와 같이)에 이어서, HCV c100-3에 대한 항체는 4마리의 NANBH 감염된 침팬지중 4마리 모두의 혈청에서 검출가능하게 되었다. 이들 샘플은 앞서 단원 Ⅳ. B. 3에서 논의된 바와 같이, 웨스턴 분석과, RIA에 의해 양성된 것으로 나타났다. 대조적으로, HAV 또는 HBV로 감염된 대조침팬지를 어느 것도 ELISA에서 반응성의 증거를 나타내지 않았다.
[표 6a]
[표 6b]
Ⅳ. Ⅰ. 3. 패널 1:만성사람 NANBH 보균자로부터 증명된 감염성 혈청
코드된 패널은 22의 단일 샘플을 포함하고, 각각은 이중으로 되어 있는 총 44의 샘플을 준비하였다. 샘플은 만성 NANBH 보균자로부터 증명된 감연성 혈청, 함의(complicated) 수여자로부터의 감염성 혈청, 및 급성단계의 NANBH환자로붙의 감염성 혈청으로부터 준비하였다. 또한, 샘플은 혈통이 매우 명백한 네가티브 대조표준 및 다른 질병 대조표준으로부터 얻었다. 이 패널은 미합중국 매릴랜드주 베데스다 소재의 네셔날 인스티튜트 오브 헬스의 헬스 및 휴먼 서비스 부서의 에이취. 알터 박사에게서 제공받았다. 패널은 여러애 전에 알터박사에 의해 제조되어 추정 상의 NANBH측정에 대한 쿨리파잉(qualifying) 패널로서 알터박사에 의해 사용되었었다.
전패널은 ELISA 측정법으로 2회 츠정하고, 그 결과를 알커박사에게 보내어 기록하도록 하였다.
기록의 결과는 표 7에 제시한다. 표가 2벌중의 단지 한세트의 결과를 기록하고 있지만, 2벌 샘플의 각가에 대해서도 동일한 값을 얻었다.
표 7에 제시된 바와 같이, 침팬지 모델에서 감염성으로 증명된 6혈청은 강한 양성이었다.
제7감염성 혈청은 급성 NANBH 경우에 대한 샘플에 해당하였고, 이 ELISA에서 반응하지 않았다. 두가지 정상 ALT 수준 및 불활실한 수준과 함의 수여로부터이 샘플은 침팬지 연구가 측정에 비반응성임을 초래한다. 급성 NANBH에 걸린 개체로부터의 3가지 다른 일련의 샘플 또한 비반응적이었다. 간염 경험이 없는, 적어도 10회의 수혈을 한 수여자로부터 얻어진, 근원적으로 매우 네가티브한 대조표준으로부터의 모든 샘플은 ELISA에서 비-반응적이었다. 결국 시험된 샘플중 네개가 다른 사람들에 의해 발생된 추정되는 NANBH 측정에서 양성된 것으로 앞서 기록되었지만, 이들 측정은 확신할 수 있는 것은 아니다. 이들 네가지 샘플은 HCV ELISA와는 네가티브적으로 기록되었다.
[표 7]
Ⅳ. Ⅰ. 4. 패널 2:수여자/수혈자 NANBH
코드된 패널은 수주 관련된 NANBH의 10가지 명백한 수여자-수혈자 경우를 포함하고 총 188샘플이었다. 각 경우는 수혈자에 대한 약간의 또는 모든 수여자의 샘플을 포함하였다. 수혈자로부터의 일련의 샘플(수주후 3,6 및 12개월에 채취함)을 포함하였다. 또한 수주전의 수혈자로부터 채취한 예비 출혈도 포함하였다. 코드된 패널은 NIH의 에이치. 알터박사로부터 제공받았고 그 결과를 기록을 위해 그에 보낸다.
표 8에 요약된 그 결과는 수주 관련된 NANBH의 10가지 역우중의 9에서 ELISA로 항체 혈청전환이 검출되었음을 나타낸다. 경우 4(혈청전환이 검추되지 않은 경우)로부터의 샘플은 ELISA에는 일관되게 불량하게 반응하였다. 10수혈자 샘플 중에서 2은 수주후 3개월째에 반응적이었다. 6달째에는 8/수혈자 샘플이 반응하였고 12달째에는 경우 4를 제외하고, 모든 샘플이 반응하였다. 더불어, 10경우 중 7에서 적어도 하나의 항체 양성 수여자가 발견되었고, 경우 10은 2가지 양상 수여자를 가진다. 또한, 경우 10에서, 수혈자의 예비출혈은 HCV 항체에 대해 양성이었다. 이 수혈자에서의 한달째의 출혈은 경계선 반응 수준까지 떨어진 한편 4 및 10개월째의 출혈에서는 양성쪽으로 상승되었다. 일반적으로, 0.4의 S/CO가 양성으로 고려된다.
그러므로, 이경우는 HCV에 걸린 개체의 선(prior) 감염을 나타내는 것이기도 하다.
모든 반응성, 즉, 양성샘플에 대한 ALT 및 HBc 상태를 표 9에 요약한다. 표에 나타나는 바와 같이, 8 수여자 샘플중 하나가 대응 마커에 대해 네가티브였고 HCV항체 ELISA에서 반응적이었다. 다른 한편으로, 수혈자 샘플(수주후 12달까지 계속됨)은 상승된 ALT, 양성항-HBc의 어느 하나, 또는 두가지를 나타냈다.
[표 8]
[표 9]
Ⅳ. Ⅰ. 5. 고위험도의 군샘플에서 HCV 감염의 측정
고위험도의 군으로부터의 샘플을 ELISA를 사용하여 모니터하여 HCV c100-3항원에 대한 반응성을 측정하였다. 이들 샘플은 미합중국 캔자스시소재의 커뮤니티블러드 뱅크의 게리테그트마이어 박사로부터 얻었다. 그결과를 표 10에 요약한다.
표에 나타난 바와 같이, 가장 높은 반응성이 샘플을 혈우병으로부터 얻는다(76%). 더불어, 상승된 ALT와 항-BHc에 대해 양성인 개체로부터의 샘플은 이 군에서 임상데이타 및 NANBH 우세로부터 예축되는 값과 일치하는 값인 51% 반응성을 기록하였다. HCV에 대한 항체의 빈도 또한 무작위 자원 수여자에 비교하였을때 상승된 ALT단독의 혈액수여자, B형 간염 코아단독에 대한 항체에 대해 양성인 혈액수여자, 및 ALT 또는 항-코아항체 이외의 이유로 인해 거절된 혈액수여자에게 더 높았다.
[표 10]
Ⅳ. Ⅰ. 6. HCV c100-3 ELISA에서 제2항체로서 항-IgG 또는 항-IgM 단일클론성 항체, 또는 항-IgM 단일클론성 항체, 또는 다중클론성 항체를 사용한 경합연구
항-IgG 단일클론성 포합체를 사용하는 ELISA 측정의 민감도를 항-IgM단일클론성포합체를 사용하여 얻어진 것, 또는 헤비 및 라이트체인 특이적인 것으로 알려진 다중클론성 항혈청과 치환됨으로써 얻어진 것과 비교하였다. 다음의 연구를 수행하였다.
Ⅳ. Ⅰ. 6. a. 혈청전환자로부터의 일련의 샘플
3가지 경우의 NANB 혈청전환자로부터의 일련의 샘플을 항-IgG 단일클론성 단독으로, 또는 항-IgM 단일클론성과 조합하여 요소 포합체를 사용하여, 또는 다중클론성 항혈청을 사용하여 HCV c100-3 ELISA 측정법으로 연구하였다. 샘플은 미합중국 뉴욕주 뉴욕시 소재의 뉴욕 블러드 센터의 클래드스티븐스 박사로부터 제공받았다. 샘플유래는 표 11에 나타낸다.
항-IgG 단일클론성 항체-효소포합체를 사용하여 얻은 결과는 표 12에 나타낸다. 그 데이터는 강한 반응성이 각각 경우 1,2 및 3의 샘플 1-4, 2-8 및 3-5에서 초기 검출됨을 나타낸다.
항-IgG 단일클론성 포합체와 항-IgM 포합체의 조합을 사용하여 얻어진 결과는 표 13에 나타낸다. 항-IgG의 항-IgM에 대한 섹지 상이한 비율을 시험하였다; 항-IgG의 1:10,000 희석액이 처음부터 끝까지 일정하였다. 항-IgG의 항-IgM에 대한 세가지 상이한 비율을 시험하였다; 항-IgG의 1:10,000 희석액이 처음부터 끝까지 일정하였다. 항-IgM 단일클론성 포함체에 대해 시험된 희석률은 1:30,000, 1:60,000, 및 1:120,000이었다. 데이타는, 항-IgG 단독으로의 연구와 일치하여, 초기의 강한 반응성이 샘플 1-4, 2-8 및 3-5에서 검출됨을 나타낸다.
항-IgG 단일클론성 포합체(1:10,000희석), 또는 타고 다중클론성 포합체(1:80.000희석), 또는 잭슨 단일클론성 포합체(1:80,000희석)를 사용하여 ELISA로 얻은 결과는 표 14에 나타낸다. 데이타는 초기의 강한 반응성이 모든 3개의 구성을 사용하여 샘플 1-4, 2-8 ALC 3-5에서 검출됨을 의미한다; 타고 다중클론성 항제는 가장 낮은 신호를 나타냈다.
상기 나타낸 결과는 모두 3가지 구성이 질병이 급성 단계후 동일한 시간에 반응성 샘플을 검출한다는 것을 나타낸다(ALT 상승에 의해 증명된 바와 같이), 더욱이, 그 결과는 항-IgG 단일클론성-효소포합체를 사용하는 HCV c100-3 ELISA의 민감도가 효소포합체에 대하여 다른 시험된 구성을 사용하여 얻어진 것과 같거나 또는 그것보다 더 양호함을 의미한다.
[표 11]
[표 12]
[표 13]
[표 14]
Ⅳ. Ⅰ. 6. b. 무작위 혈액 수여자로부터의 샘플
무작위 혈액 수여자로부터의 샘플(단원 Ⅳ. Ⅰ. 1 참조)을 HCV c100-3 ELISA를 사용하여 HCV 감염에 대해 스크린하였다. 이때에 항체-효소 포합체는 항-IgG 단일클론성 포합체, 또는 다중크론성 포합체였다. 스크린된 샘플의 총수는 다중클론성 포합체와 단일클론성 포합체에 대하여 각각 1077과 1056이었다. 스크리닝의 결과의 요약은 표 15에 제시하며 샘플분포는 도 44의 도표에 도시한다.
평균 및 표준편차의 계산은 1.5 이상의 신호를 제공하는 샘플을 배제하고 수행하였다. 즉, 10730D값을 다중클론성 포합체를 활용한 계산에 사용하였고, 1051을 항-IgG 단일클론성 포합체에 대하여 사용하였다. 표 15에 제시된 바와 같이, 다중클론성 포합체를 사용한 경우 평균은 0.0493에서 0.0931로 이동되었고 표준편차는 0.074DPTJ 0.0933으로 증가하였다. 더욱이, 그 결과는 또한 만약 X+5SD의 범위가 측정 커트오프를 규정하기 위해 사용된다면, 다중클론성-효소 포합체 구성 ELISA에서 보다 높은 커트오프값을 필요로 함을 보여준다. 이것은 단일클론성 시스템과 비교하여 측정 특이성이 감소되었음을 의미한다. 더불어, 도 44의 도표에 도시된 바와 같이, 네가티브와 포지티브 분포 사이의 결과의 보다 큰 분리는 무작위 혈액수여자가 상업적인 다중 클론성 표지를 사용한 측정에 비교하여 항-IgG 단일클론성 포합체를 사용한 ELISA로 스크린되는 경우에 일어난다.
[표 15]
Ⅳ. J. 다양한 지리적 위치의 NANBH 환자에서 HCV 혈청전환의 검출
상승된 ALT 수준을 토대로 NANBH에 걸렸으리라 추측되는 환자와, HAV와 HBV 시험에서 음성인 환자로부터의 혈청을 단원 Ⅳ. D. 에 기재된 바와 본질적으로 같은 RIA를 사용하여 스크린하였다. 단, HCV c100-3항원을 마이크로타이터 프레이트에서 스크리닝 항원으로서 사용하였다. 표 16에 표시된 결과로부터 나타내는 바와 같이, RIA는 높은 백분율의 경우에서 양성샘플을 검출하였다.
[표 16]
Ⅳ. K. 지역성 획득 NANBH에 걸린 환자에서 HCV 혈청전환의 검출
전파경로가 명백하지 않은(즉, 수주, 정맥내 약제사용, 잡혼등의 어느 것도 위험인자로서 확인되지 않았음), 100명의 NANBH환자로부터 얻어진 혈처을 질병통제센터의 엠. 알터바사와, 하바드 대학의 제이. 디엔스대그 박사로부터 제공받았다.
이들 샘플을 단원 Ⅳ. D. 에 기재된 바와 본질적으로 같게 RIA를 사용하여 스크린하였다. 단, 마이크로타이터 플레이트에 부착되는 스크리닝 하우언으로서 HCV c100-3항원을 사용하였다. 그 결과는 100개의 혈청 샘플중에서 55개가 HCV c100-3 항원과 면역학적으로 반응하는 항체를 함유하였음을 나타냈다.
상술된 결과는 지역성 획득 NANBH가 또한 HCV에 의해 유발되는 것을 시사한다. 더욱이, HCV가 플래비바이러스에 관련되고, 그 대부분은 절지동물에 의해 전파되는 것으로 본원에서 증명되었으므로, 지역성 획득 경우의 HCV 전파 또한 절지동물 전파로부터 유발되는 것으로 추측된다.
Ⅳ. L. NANBH 전파의 함의 수여자의 HCV항체 및 대용마커의 빈도의 비교
NANBH 양성으로 추측되는 수여자로부터의 혈책의 수혈자중 누가 NANBH를 발생하였는지, 항-HCV 항체 양성으로 혈청전환 되었는지를 측정항기 위하여 예기되는 연구를 수행하였다. 혈액수여자를 NANBH감염에 대한 마커로서 현재 사용되는 대용마커 이상, 즉, 상승된 ALT 수준, 및 항-코아 항체의 존재에 대하여 시험하였다.
더불어, 수여자를 또한 항-HCV 항체의 존재에 대하여 시험하였다. 항-HCV항체의 존재의 측정은 단원 Ⅳ. K.에 기재된 바와 같이 방사선 면역측정법을 사용하여 측정하였다. 연구결과를 표 17에 나타내며 다음 사항을 나타낸다:환자수(1열); 환자혈청중의 항-HCV 항체의 존재(2열); 환자가 받은 증여획수, 각 증여는 상이한 수여자로부터의 것이다(3열); 수여자 혈청중의 항-HCV항체의 존재(4열); 및 수여자의 대용이상(5열)(NT 또는 --는 시험하지 않은 것을 의미한다)(ALT는 상승된 트란스아미나제이고, ANTI-HBc는 항-코아 항체이다).
표 17의 결과는 HCVZ 항체시험이 대용 마커시험보다 감염된 혈액 수여자의 검출시 더욱 정확함을 입증한다. NANBH 증상을 나타낸 10명의 환자중 9명의 항-HCV항체 혈청전환에 대하여 양성된 것으로 시험되었다. 11명이 추측되는 수여자중에서(환자 6은 NANBH 보균자일 것으로 추측되는 상이한 2명으로부터 증여받았다), 9명이 항-HVC항체에 대해 양성이었고, 1명은 경계선 양성이었으며, 그러므로 불분명하다(환자 1에 대한 수여자). 대조적으로, 상승된 ALT시험을 사용하여서는 10명의 수여자중 6명이 음성으로 시험되었고, 항코아-항체시험을 사용하여서는 10명의 수여자중 5명이 음성으로 시험되었다. 그러나, 보다 큰 경과는 세가지 경우(환자 8,9 및 10에 대한 수여자)에서 ALT시험과 ANTI-HBc 시험이 일치하지 않는 결과를 나타냈다.
[표 17]
Ⅳ. M. 플래비바이러스 게놈서열의 보존영역으로부터 유도된 프라이머 및 RCR을 사용하여 HCV cDNA 서열의 클로닝에 대한 증폭
HCV가 플래비바이러스 또는 플래비-계 바이러스라고 임하는, 상기 표시된 결과는 플래비바이러스에서 보존된 아미노산 서열을 코드화하는 영역으로부터 유도된 프라이머와, PCR 기법을 사용하여 미확인된 HCV cDNA 서열을 클로닝 하기 위한 스트래티지를 허용한다. 일반적으로, 프라이머중의 하나는 규정된 HCV 게놈서열로부터 유도되며, 서열화되지 않는 HCV 폴리뉴클레오티드의 영역에 접한 다른 프라이머는 플래비바이러스 게놈의 보존된 영역으로부터 유도된다. 플래비바이러스 게놈은 NAS1과, 플래비바이러스 게놈의 5'-영역에 코드화된 E 폴리펩티드내에 보존된 서열을 함유하는 것으로 알려진다. 이들 영역을 코드화하는 해당서열은 도 26에 도시된 HCV cDNA 서열에 위쪽에 있다. 그러므로, HCV 게놈의 이 영역으로부터 유도되는 cDNA를 단리하기 위해서는 이들 플래비바이러스 폴리펩티드내의 보존된 서열로부터 유도되는 위쪽 프라이머가 고안된다. 아래쪽의 프라이머는 HCV cDNA의 공지부분의 위쪽끝으로부터 유도된다.
코드의 축퇴성 때문에, 플래비바이러스 프로브와 해당하는 HCV 게놈 서열사이에 미스매치(misamatch)가 있을 것이다.
그러므로, 리에 의해 기재된 것(1988)과 유사한 스트래티지를 사용한다. 리과정은 아미노산 서열의 역번역 생성물에 상보하는 혼합된 올리고뉴 크레오티드 프라임를 활용한다; 혼합된 프라이머의 서열은 보존된 아미노산 서열에 대한 모든 코돈 축티성을 설명해준다.
프라이머 혼합물의 3가지 세트를 덴그-2,4-(D-2,4), 일본뇌염 바이러스(JEV), 황열병(YF), 및 웨스트 나일 바이러스(WN)를 포함하여 여러가지 플래비바이러스에서 발견되는 아미노산 동종성을 토대로하여 제조한다. 가장 위쪽의 보존서열로부터 유도된 프라이머 혼합물(5'-1)은 D-2, JEV, YF 및 WN의 E부분에서 발견되는 보본서열 asp-arg-gly-trp-gly-aspN의 일부인 아미노산서열 gly-trp-gly을 토대로 한다.
다음의 프라이머 혼합물(5'-2)은 E단백질의 아래쪽의 보존서열, phe-asp-gly-asp-ser-tyr-ileu-phe-gly-asr-tyr-ileu를 토대로 하고, phe-gly-asp로부터 유도하며; 보존된 서열는 D-2, JEV, YF 및 WN에 존재한다. 세번째 프라이머 혼합물(5'-3)은 D-2, D-4, JEV, YF 및 WN의 NS1 부분의 보존된 서열 cys-cys-arg-ser-cys의 일부인 아미노산 서열 arg-ser-cys를 토대로 한다. 5'-3에서 혼합물을 형성하는 개개의 프라이머는 도 45에 도시한다. 보존된 영역으로부터 유도된 변형된 서열에 더불어 각 혼합물중의 각 프라이머는 5'-끝에 또한 제한효소, HindⅢ, MboⅠ, 및 EcoRⅠ에 대한 부위를 코드화하는 서열을 함유하는 일정한 영역을 함유한다.
아래쪽 프라이머 ssc5h20A는 클론 14i와 11b의 그것들과 중첩하는 서열과 HCV cDNA를 함유하는 클론 5의 뉴클레오티드 서열로부터 유도된다. ssc5h20A의 서열은 5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA3'이다. 다른 프라이머, ssc5h34A 또한 사용될 수 있다. 이 프라이머는 클론 5h의 서열로부터 유도되고, 더불어 제한효소 부위를 만드는 뉴클레오티드를 5'-끝에 함유하므로, 클로닝이 용이하다. ssc5h34A의 서열은 5' GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A 3'이다.
사이끼등에 의해(1986) 처음으로 기재되었던 PCR 반응은 리듬에 의해(1988) 기재된 것과 본질적으로 동일하게 수행한다. 단, cDNA에 대한 주형은 단원 Ⅳ. C. 2에 기재된 바와 같이 HCV 감염된 침팬지 간으로부터, 또는 단원 Ⅳ. A. 1에 기재된 바와 같이 HCV 감염된 침팬지 혈청으로부터 단리된 바이러스 입자로부터 단리된 RNA이다. 더불어, 아닐링 조건은 HCV 서열에 아닐될 프라이머의 부분이 다지 9뉴클레오티드이기 때문에 증폭의 첫번째 라운드에서 김축성이 보다 적고(0.6M NaCl, 25℃) 그 경우 미스매치가 있을 수 있다. 더욱이, 만약 ssc5h34A를 사용한다면, HCV 게놈으로부터 유도되지 않은 추가의 서열은 프라이머-주형 혼성체를 탈안정화하려는 경향이 있다. 증폭의 제1라운드후에, 아닐링 조건은, 이제 증폭된 서열이 프라이머에 상보하는, 또는 프라이머의 이중체인 영역을 함유하기 때문에 긴축성이 더 많을 수 있다(0.066M NaCl, 32℃-37℃). 더불어, 증폭의 처음 10주기는 클레노우 효소 I과, 그 효소에 적절한 PCR 조건하에서 작동한다. 이들 주기의 완료후에, 샘플을 추출하여 세투스/페르킨-엘머에 의해 제공된 바와 같이, 키트 지시를 따라서 Taq 중합효소와 함께 작동시킨다.
증폭후, 증폭된 HCV cDNA 서열을, 클론 5h로부터 유도된 프로브를 사용하여 혼성체형성에 의해 검출한다. 이 프로브는 프라이머를 유도하기 위해 사용된 것들의 위쪽 서열로 부터 유도하며, 클론 5h 유도된 프라이머의 서열과는 중첩하지 않는다. 프로브의 서열은
5 ' CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC
GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG GTT GGCGC 3'이다.
IV. N.1. 감여성 NANBH에 걸리 침팬지의 가로부터 HCV cDNA 라이브러리의 제조 HCV cDNA 라이브러리를 단원 IV. A.1.의 HCV cDNA 라이브러리를 유도해낸 침팬지의 간으로부터 제조하였다. 라이브러리 제조에 대한 기법은 단원 IV.A.24의 그것과 유사하다. 단, RNA의 공급원이 상이하고, 클론 1lb의 HCV cDNA 의 서열을 토대로 한 프라이머를 사용하였다. 프라이머의 서열은 5' CTG GCT TGA AGA ATC 3'이었다.
IV. N.2. 클론 1lb의 cDNA에 대한 클론 k9-1의 중첩 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 단리 클론 k9-1을 단원 IV.A.25에 기재한 바와같이, NANBH 감염된 침팬지의 간으로부터 제조한 HCV cDNA 라이브러리로부터 단리하였다. 라이브러리를 클론 1lb의 서열에 중첩하는 클론에 대해, 5'-말단에서 클론 1lb와 중첩하는 클론인 클론 11e를 사용하여 스크린하였다. 클론 1lb의 서열은 도 23에 도시한다. 양성클론을 500,000분의 1의 빈도로 단리하였다. 하나의 단리된 클론 k9-1에 대해 한층 더 연구하였다. 도 26에 도시된 HCV-cDNA 서열의 5'-끝에 대하여 클론 k9-1의 HCV CDNA의 중첩하는 성질을 그 클론을 클론 Alex46으로 프로브함으로써 확인하였다; 이 후자의 클론은 상술한 클론 14i의 HCV cDNA의 5' 말단의 염기쌍에 해당하는 30염기쌍의 HCV cDNA 서열을 함유한다.
클론 k9-1로부터 단리한 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열을 상술한 기법을 사용하여 측정하였다. 도 26의 HCV cDNA와 중첩하는, 클론 k9-1의 HCV cDNA의 서열과, 거기에 코드화된 아미노산을 도 46에 도시한다.
클론 k9-1의 HCV cDNA 서열을 단원 IV.A.19에 기재된 클론의 서열들과 일렬로 배열하여서 도 32에 도시된 서열위쪽에 놓이게 되는 k9-1 서열과의 혼성 HCV cDNA 서열을 제조하였다. k9-1 서열과, 거기에 코드화된 아미노산을 포함하는 혼성 HCV cDNA를 도 47에 도시한다.
도 47에 도시된 HCV cDNA 의 5'-영역에 코드화된 아미노산의 서열을 상술한 덴그바이러스의 균주중 하나의 해당하는 영역과, 소수성 및 친수성의 영역의 프로필에 대하여 비교하였다. 이 비교는 NS1(또는 그의 일부)을 코드화하는 영역에 해당하는, 이 영역에 코드화된 HCV 및 덴그로부터의 폴리펩티드가 유사한 소수성/친수성 프로필을 가짐을 보여주었다.
아래에 제공되는 그 정보는 HCV 균주의 확인을 허용한다. 다른 HCV 균주의 단리 및 특성확인은 바이러스 입자를 함유하는 신체 성분으로부터 핵산을 단리하는 단계, 아래에 기재하는 HCV cDNA 프로브를 토대로 한 폴리뉴클레오티드 프로브를))사용하유하여 cDNA 라이브러리를 제조하는 단계, 아래에 기재하는 HCV cDNA 서열을 함유하는 클론에 대해 라이브러리를 스크린하는 단계, 그리고 새로운 단리물로부터의 HCV cDNA를 아래에 기재하는 cDNA와 비교하는 단계로 이루어질 수 있다. 거기에, 또는 바이러스 게놈에 코드화된 폴리팹티드는 상술한 폴리펩티드와 항체를 사용하여 면역학적 교차-반응성에 대해 모니터될 수 있다. 상기 정의단원에 기재된 바와 같이, HCV의 파라메터내에 꼭맞는 균주는 쉽게 확인가능하다. HCV 균주를 확인하기 위한 다른 방법은 본원에 제공된 정보를 토대로하여, 기술분야에 숙련된 사람들에게 명백할 것이다.
발명은 NANBH 의 새롭게 발견된 병원학적 병원체, C 형 간염바이러스(HCV)의 단리 및 특성확인에 관련한다. 보다 구체적으로, 발명은 HCV게놈의 부분들의 cDNA 레플리카(replica) 군을 제공한다. 이들 cDNA 레플리카는 NANBH에 걸린환자의 혈청으로 감염된 조직에서 입상 병원체로부터 만들어진 cDNA 라이브러리로부터의 발현생성물을 스크린하여 지금까지 단리되지 않았고 특성이 확인되지 않았던 바이러스 병원체의 게놈으로부터 유도된 새롭게 합성된 항원을 검출하고, 비-감염 개체와 비교하여 단지 감염된 개체로부터의 혈청과만 면역학적으로 반응한 생성물을 생성하는 클론을 선택하는 새로운 단계를 포함한 기법에 의하여 단리되었다.
HCV cDNA 내에 함유된 서열정보 뿐만 아니라, HCV cDNA로부터 유도된 프로브를 활용하는, HCV의 게놈의 본성에 대한 연구는 HCV가 플래비바이러스(Flavivirus)또는 플래비-계 바이러스인 것을 암시한다.
HCV 로부터 유도된 cDNA 서열의 부분들은 샘플중의 바이러스의 존재를 진단하고, 바이러스의 자연발생 변이체를 단리하기 위한 프로브로서 유용하다. 이들 cDNA 는 또한 HCV게놈(들)내에 코드화된 HCV항원의 활용가능한 폴리펩티드 서열을 만들고 진단시험에서 대조표준 또는 시약으로서 및/또는 백신의 성분으로서 유용한 폴리펩티드의 제조를 허용한다. 이들 폴리펩티드 서열내에 함유된 HCV 에피토프에 대한 다중클론성 및 단일클론성 항체는 두가지가 다, 진단시험에 대해, 치료제로서, 항바이러스제의 스크리닝에 대해, 및 이들 cDNA 가 유도되는 NANBV병원체의 단리에 대해 또한 유용하다. 더불어, 이들 cDNA 로부터 유도된 프로브를 활용함으로써 HCV게놈의 다른 부분들을 단리하고 서열분석하는 것이 가능하며, 그에 따라 NANBH의 진단 및/또는 치료, 예방 및 치료 2가지에 모두 유용한 추가의 프로브 및 폴리펩티드가 제공된다.
따라서 폴리뉴클레오티드와 관련하여 발명의 몇가지 측면은 다음과 같다:정제된 HCV 폴리뉴클레오티드; 재조합 HCV 폴리뉴클레오티드; HCV 게놈으로 부터 또는 HCV cDNA 로부터 유도된 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드;HCV의 에피토프를 코드화하는 재조합 폴리뉴클레오티드; 상기 재조합 폴리뉴클레오티드중 어느 것을 포함하는 재조합 벡터, 및 이들 벡터중 어느 것으로 형질전환된 숙주세포.
발명의 다른 측면은 다음과 같다:HCV 게놈으로부터 또는 HCV cDNA로 부터 유도된 DNA의 오픈리딩프레임(ORF)을 포함하는 재조합 발현시스템, 이때에 ORF는 소정숙주와 부합하는 제어서열에 작동가능하게 연결된다; 재조합 발현시스템으로 형질전환된 세포;및 형질전환된 세포에 의해 생산되는 폴리펩티드.
발명의 또다른 측면은 다음과 같다:정제된 HCV, 정제된 HCV로부터의 폴리펩티드의 제조; 정제된 HCV 폴리펩티드;HCV 에 함유된 에피트프로 면역학적으로 확인가능한 에피토프를 포함하는 정제된 폴리펩티드.
발명의 또하나의 측면은 다음과 같다: 재조합 HCV 폴리펩티드;HCV 게놈으로 부터 또는 HCV cDNA 로부터 유도된 서열로 구성된 재조합 폴리펩티드;HCV 에피토프로 구성된 재조합 폴리펩티드;및 HCV폴리펩티드로 구성된 융합 폴리펩티드.
발명에는 또한 HCV 에피토프에 대한 단일클론성 항체; 및 HCV에피토프에 대한 다중클론성 항체의 정제된 제제가 포함된다.
발명의 또다른 측면은 아미노산 서열이 진핵세포 숙주에서 제조되는 경우 입자를 형성할 수 있는 상기 서열을 가지는 비-HCV 폴리펩티드와, HCV 에피토프를 포함하는, HCV 감염에 대해 면역원성인 입자이다.
여전히 또다른 발면의 측면은 HCV에 대한 폴리뉴클레오티드 프로브이다.
키트에 관련하는 발명의 측면은 다음에 대한 것이다:적당한 용기안의, 약 8 또는 그이상의 뉴클레오티드로된, HCV 로부터의 뉴클레오티드서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는, HCV 로부터 유도된 폴리뉴클레오티드의 존재에 대한 분석용 샘플; 적당한 용기안의, 검출하고자하는 HCV 항원에 대한 항체를 포함하는, HCV 항원의 존재에 대한 분석용 샘플; 적당한 용기안의, HCV 항원에 존재하는 HCV 에피토프를 함유하는 폴리펩티드를 포함하는 HCV 항원에 대한 항체의 존재에 대한 분석용 샘플.
발명의 또다른 측면은:고체기판에 부착된, HCV 에피토프로 구성된 폴리펩티드;및 고체기판에 부착된, HCV 에피토프에 대한 항체이다.
발명의 여전한 또하나의 측면은:HCV 에피토프를 함유하는 폴리펩티드를 코드화하는 서열을 함유하는 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 상기 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 것으로 이루어지는, HCV 에피토프를 함유하는 폴리펩티드의 제조방법;및 이 방법에 의하여 제조되는 HCV에피토프함유 폴리펩티드이다.
발명은 또한 샘플중의 핵산과 HCV 폴리뉴클레오티드에 대한 프로브를 프로브와 샘플로부터의 HCV 핵산간의 폴리뉴클레오티드 이중체의 형성을 허용하는 조건하에서 반응시기는 단계와;그 프로브를 함유하는 폴리뉴클레오티드 이중체를 검출하는 단계로 이루어지는, 샘플중의 HCV 핵산의 검출방법을 포함한다.
면역측정법이 또한 발명에 포함된다. 이들 방법은 HCV항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 검출하고자하는 HCV 항원에 대한 프로브 항체와 함께 항원-항체복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양하고;프로브 항체를 함유하는 항원-항체복합체를 검출하는 것으로 이루어지는, HCV 항원을 검출하기 위한 면역측정을 포함한다. HCV 항원에 대한 항체를 검출하기 위한 면역측정법은 항-HCV 항체를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 HCV의 에피토프를 함유하는 프로브 폴리펩티드와 함께, 항체-항원복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계와; 프로브 항원을 함유하는 항체-항원복합체를 검출하는 단계로 이루어진다.
또한 발명에 프함되는 것은 HCV에피토프, 또는 HCV의 비활성화된 제제, 또는 HCV의 감쇠된 제제를 함유하는 면역원성 펩티드를 포함하는, HCV 감염의 치료를 위한 백신이다.
발명의 다른 측면은 HCV로 감염된 조직배양 성장세포이다.
또다른 발명의 측면은 HCV에괴토프를 함유하는 단리된 면역원성 폴리펩티드를 면역반응을 생성하기에 충분한 양으로 개체에게 투여하는 것으로 이루어지는, HCV 에 대한 항체의 제조방법이다.
발명의 또하나의 측면은 미확인 감염성 병원체의 게놈으로부터 유도된 cDNA의 단리방법으로서, 그 방법은:(a) 병원체로 감염된 조직으로부터 단리된 핵산으로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제조하여 cDNA에 코드화된 폴리펩티드(들)의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 숙주 세포를 성장시키는 단계;(b) cDNA의 발현생성물과 상기 감염성 병언체로 감염된 개체의 항체함유신체 성분을 면역반응을 허용하는 조건하에서 상호반응시키고, 상호 반응의 걸과로서 형성된 항체-항원 복합체를 검출하는 단계;(c) 단계 (b)의 항체-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포를 개개의 클론으로서 성장을 허용하는 조건하에서 성장시기고 상기 클론을 단리하는 단계;(d) cDNA내에 코드화된 폴리펩티드(들)의 발현을 허용하는 조건하에서(c)의 클론으로부터 세포를 성장시기고, 발현 생성물을 감염성 병원체로 감염된 단계(a)의 개체이외의 개체들 및 병원체로 감염되지 않은 대조표준 개체의 항체함유 신체성분과 상호 반응시켜 상호반응의 결과로서 형성된 항체-항원 복합체를 검출하는 단계;(e) 감염된 개체 및 감염되었을 것으로 의심되는 개체의 항체함유 신체성분과, 및 대조표준 개체의 상기 성분은 제외하고, 항체-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포를 개개의 클론으로서의 성장을 허용하는 조건하에서 성장시키고, 상기 클론을 단리하는 단계;그리고(f)(e)의 숙주세포 클론으로부터 cDNA를 단리하는 단계로 이루어진다.
(발명을 수행하기 위한 형태)
I. 정의
용어 C 형 간염 바이러스 는 지금까지 NANBH의 알려지지 않은 병원학적 병원체에 대한 기술분야의 종사자들에 의해 유보되어 왔다. 따라서, 본원에서 사용되는바 C 형 간염 바이러스(HCV)는 전에는 NANBV 및/또는 BB-NANBV로서 언급되었던, NANBH를 일으킬 만한 병원체를 언급한다. 용어 HCV, NANBV,및 BB-NANBV 는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이 용어사용의 연장으로서, 전에는 NANB 간염(NANBH)으로 불렀던, HCV에 의해 유발되는 질병은 C형 간염으로 부른다. 용어 NANBH와 C형 간염은 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 HCV는 NANBH를 유발하는 바이러스종 및 감쇠된 균주 또는 그로부터 유도된 결함이 있는 간섭하는 입자를 의미한다. 아래에 제시되는 바와같이 HCV게놈은 RNA로 구성된다. RNA 함유 바이러스는 자발적인 돌연변이가 상대적으로 높은 율로, 즉, 뉴클레오티드당 10-3내지 10-4의 오더로 일어나는 것으로 알려져 있다(Fields Knipe(1986)). 그러므로, 하기 기재되는 HCV종내에는 다중균주가 있다. 본원기재의 조성물 및 방법은 각종관련 균주의 증식, 확인, 검출, 및 단리를 가능하게 한다. 더욱이, 그것들은 또한 각종 균주에 대한 진단시약 및 백신의 제조를 허용하고, 그것들이 HCV의 복제를 저해하는 약리학적 사용을 위한 항-바이러스제에 대한 스크리닝과정에 활용된다.
본원에 제공된 정보는, 이하 CDC/HCV1 으로 언급되는 HCV의 한 균주로부터 유도된다 할지라도 바이러스 분류학자가 종내에 속해있는 다른 균주를 확인하기에 충분한다. 본원에 기재된 바와같이, 본 발명자들은 HCV가 플래비바이러스 또는 플래비-계 바이러스인 것을 발견하였다. 플래비바이러스 입자의 형태 및 조성은 공지이며, 브린튼(1986)에서 논의된다. 일반적으로, 형태학과 관련하여 플래비바이러스지질이 중층으로 둘러 싸여진 중심의 뉴클레오캡시드를 함유한다. 비리온은 구형이며 약 40-50nm의 직경을 갖는다. 그의 코아의 직경은 약 25-30nm이다. 비리온의 외면을 따라서 직경이 약 2nm인 놉(knob)이 말단에 있는 약 5-10nm 길이의 엔벨로프가 돌출되어 있다.
HCV는 본원에 기재된 cDNA가 유도되는 HCV게놈의 에피토프와 면역학적으로 동일가능한 에피토프를 코드화한다; 에피토프는 본원에 기재된 cDNA에 코드화되는 것이 바람직하다. 에피토프는 다른 공지의 플래비바이러스와 비교할 때 HCV에 유일하다. 에피토프의 이 유일성은 HCV와의 면역학적 반응성 및 다른 플래비바이러스종과의 면역학적 반응성의 결핍에 의해 측정될 수 있다. 예컨대 방사선면역측정에 의해, ELISA 측정법에 의해, 헐구응집법에 의해 면역학적 반응성을 측정하는 방법은 기술분야에 공지이며, 측정에 적당한 기법의 여러가지 실시예가 본원에 기재된다.
상기한 것에 더불어, 다음의 파라메터가 단독으로 또는 조합하여 균주를 HCV로서 확인하는데 적용가능하다. HCV 균주가 진화적으로 관련되므로, 뉴클레오티드 수준에서 게놈의 전체 동종성은 약 40%이상, 바람직하게는 약 60%이상, 그리고 가장 바람직하게는 약 80%이상이 될 것으로 기대되며;또한 적어도 약 13 뉴클레오티드의 대응하는 연속서열이 있을 것으로 기대된다. 추정되는 HCV균주 게놈서열과 CDC/CHl HCV cDNA서열간의 대응성은 기술분야에 공지된 기법에 의해 측정될 수 있다. 예를들어, 그것들은 추정되는 HCV 로부터의 폴리뉴클레오티드의 서열정보를 본원에 기재된 HCV cDNA 서열과 직접 비교함으로써 측정될 수 있다. 또한, 예컨대 그것들은 폴리뉴클레오티드를 동종성 영역간에 안정한 이중체를 형성하는 조건(예컨대, S1소화에 앞서 사용될 수 있는 조건들) 하에 혼성화하고, 이어서 단일스트란드 특이적 뉴클레아제(들)로 소화한 후 소화된 단편의 크기측정에 의하여 측정될 수 있다.
HCV의 균주의 진화적인 관계 때문에, 추정되는 HCV 균주는 폴리펩티드 수준에서의 그의 동종성에 의하여 확인가능하다. 일반적으로, HCV 균주들은 폴리펩티드 수준에서 약 40%이상, 바람직하게는 약 60%이상, 더욱 바람직하게는 약 80%이상이 동종성이다. 아미노산 서열 동종성을 측정하기 위한 기법은 기술분야에 공지된다. 예를들면 아미노산 서열은 직접 및 본원에 제공된 서열과 비교하여 측정될 수 있다. 또한 예를들면, 추정되는 HCV의 게놈물질의 뉴클레오티드 서열은 측정될 수 있다(통상 cDNA 중간물질을 경유하여); 그것에 코드화된 아미노산서열이 측정될 수 있으며 대응하는 영역이 비교될 수 있다.
본원에 사용된 바와같이, 표시된 서열, 예컨대 HCV cDNA, 특히 도 1에서 도 32에 구체예로 표시된 것들 로부터 유도된, 또는 HCV 게놈으로부터의 폴리뉴클레오티드는 대략 적어도 약 6뉴클레오티드의 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열을 말하며, 표시된 뉴클레오티드 서열의 영역과 대응하는, 즉, 동종성이거나 상보하는 적어도 약 8뉴클레오티드가 바람직하고, 적어도 약 10-12뉴클레오티드인 것이 보다 바람직하며, 적어도 약 15-20 뉴클레오티드인 것이 가장 바람직하다. 폴리뉴클레오티드가 유도되는 영역의 서열은 HCV게놈에 유일한 서열과 동종성이거나 또는 상보하는 것이 바람직하다. 서열이 HCV 게놈에 유일한 것인지의 여부는 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지된 기법에 의해 측정될 수 있다. 예를들어, 서열은 그것이 감염되지 않은 숙주 또는 다른 유기체에 존재하는지의 여부를 측정하기 위해 데이타 뱅크, 예컨대 유전자은행의 서열과 비교될 수 있다. 서열은 또한 간염을 유발하는 것으로 알려진 것들, 예컨대 HAV, HBV, 및 HDV를 포함하여 다른 바이러스 병원체의 공지서열, 및 플래비바이러스의 다른 구성원과 비교될 수 있다. 유도된 서열의 다른 서열에 대한 대응성 또는 비-대응성은 적합한 긴축조건하에서의 혼성화에 의해 또한 측정될 수 있다. 핵산서열의 상보성을 측정하기 위한 혼성화 기법은 기술분야에 공지이며 아래에서 논의된다. 또한, 예컨대 마니아티스등(1982) 참조. 더불어, 혼성화에 의해 형성된 이중 폴리뉴클레오티드의 미스매치(mismatch)는 예컨대 이중 폴리뉴클레오티드의 단일-스트란드 부분을 특이적으로 소화하는 S1 같은 뉴클레아제로의 소화를 포함하여, 공지기법에 의해 측정될 수 있다. 전형적인 DNA 서열이 유도 될 수 있는 영역은, 그것에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 특이적 에피토프를 코드화하는 영역과, 비-전사 및/또는 비-번역영역이다.
유도된 폴리뉴클레오티드는 반드시 제시된 뉴클레오티드 서열로부터 물리적으로 유도되는 것은 아니지만, 예컨대 폴리펩티드가 유도되는 영역(들)의 염기서열에 의해 제공된 정보를 토대로 하는 화학적 합성법 또는 DNA복제 또는 역전사 또는 전사를 포함하여 어떠한 방법으로도 제조될 수 있다. 더불어, 표시된 서열의 그것에 대응하는 영역의 조합은 의도된 용도와 일치하도록 기술분야에 공지된 방법으로 변형될 수 있다.
유사하게, 표시된 핵산서열, 예컨대 도 1 내지 도 32의 서열 로부터 유도된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 서열에 코드화된 폴리펩티드의 그것과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 또는 부분이 적어도 3-5아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 8-10 아미노산, 및 가장 바람직하게는 적어도 11-15아미노산으로 구성되는, 또는 서열에 코드화된 폴리펩티드와 면역학적으로 동일가능한 그의 부분을 말한다.
재조합 또는 유도된 폴리펩티드는 반드시 표시된 핵산서열, 예컨대 도 1 내지 도 26의 서열로부터, 또는 HCV게놈으로부터 번역되는 것은 아니다;그것은 예컨대 화학적 합성법, 또는 재조합 발현시스템의 발현, 또는 돌연변이된 HCV로부터의 단리를 포함하여 어떠한 방법으로도 제조될 수 있다.
본원에 사용된 용어 재조합 폴리뉴클레오티드 는 게놈의, cDNA의, 반합성의, 또는 그의 기원 또는 조작에 의하여:(1) 천연으로 또는 라이브러리의 형태로 결합된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 부분과 관련되지 않은;및/또는 (2) 그것이 천연으로 결합되는 것이외의 폴리뉴클레오티드에 결합되는 합성기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 용어 폴리뉴클레오티드 란 길이에 관계없이, 뉴클레오티드의 중합체 형태를 말하는 것으로 리보뉴클레오티드거나 데옥시리보뉴클레오티드이다. 이 용어는 단지 분자의 1차 구조만을 언급한다. 그러므로 이 용어는 이중-및 단일-스트란드 DNA, 뿐만 아니라 이중-및 단일스트란드 RNA를 포괄한다. 그것은 또한 예컨대, 메틸화 및/ 또는 캡핑에 의해 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드와, 미변형 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 cDNA에 대응하는 서열을 함유하는 HCV 란 표시된 DNA의 서열에 동종성인 또는 상보하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 HCV를 의미하며;cDNA에 대한 동종성 또는 상보성의 정도는 대략 70%이상일 것이고, 바람직하게는 적어도 약 70%이상일 것이며, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%이상일 것이다. 대응하는 서열은 길이가 적어도 약 70 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 80 뉴클레오티드, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 90 뉴클레오티드일 것이다. HCV 서열과 cDNA 간의 대응성은 예컨대 기재된 cDNA와 서열화된 물질의 직접 비교, 또는 혼성체형성 및 단일스트란드 뉴클레아제로의 소화와, 이어서 소화된 단편의 크기측정을 포함하여, 기술분야에 공지된 기법에 의하여 측정될 수 있다.
용어 정제된 바이러스 폴리뉴클레오티드 란 본질적으로 바이러스폴리뉴클레오티드와 자연적으로 결합되는 폴리펩티드가 없는, 즉, 약 50%이하, 바람직하게는 약 70%이하, 그리고 가장 바람직하게는 약 90%이하로 함유하는 HCV게놈 또는 그의 단편을 말한다. 바이러스 입자로부터 바이러스 폴리뉴클레오티드를 정제하기 위한 기법은 기술분야에 공지이며, 예컨대 유화제(chaotropic agent)로의 입자의 붕괴, 및 이온-교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래괴, 및 밀도에 따른 침강법에 의한 폴리뉴클레오티드(들)과 폴리펩티드와의 분리를 포함한다.
용어 정제된 바이러스 폴리펩티드 란 본질적으로 바이러스 폴리펩티드가 결합하는 세포성분이 없는, 즉 약 50%이하, 바람직하게는 약 70%이하, 및 가장 바람직하게는 약 90%이하를 함유하는 HCV폴리뎁티드 또는 그의 단편을 말한다. 바이러스 폴리뗍티드를 정제하기 위한 기법은 기술분야에 공지이며, 이들 기법의 실례는 아래에 논의된다.
재조합 숙주세포, 숙주세포, 세포, 셀라인, 세포배양액:및 단세포 실재로서 배양된 미생물 또는 고등진핵 셀라인을 의미하는 다른 그러한 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전달 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있는, 또는 사용되었던 세포를 말하며, 형질전환되어 있는 원래의 세포의 자손도 포함한다. 단일한 어버이 세포의 자손이 우연한 또는 계획적인 돌연변이 때문에 형태에서 또는 게놈 또는 총 DNA 보체에 있어서 원래의 어버이와 반드시 완전하게 동일하지 않다는 것이 주지된다. 어버이와 층분히 유사한 어버이 세포의 자손은 관련성질, 예컨대 소정 펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 존재에 의하여 특성확인이 되어야 하고, 이 정의에 의해 의도된 자손에 포함되며 상기 용어에 의해 커버된다.
레플리콘(replicon) 은 세포내에서 폴리뉴클레오티드 복제의 자동 단위로서 행동하는, 즉, 자체 제어하에 복제할 수 있는 어떠한 유전적 요소, 예컨대 플라스미드, 염색체, 바이러스이다.
벡터 는 부착된 부분의 복제 및/또는 발현을 일으키기 위하여, 다른 폴리뉴클레오티드 부분이 부착되는 레플리콘이다.
제어서열 은 연결되는 코딩서열의 발현을 실제화하기 위하여 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 그러한 제어서열의 본질은 숙주 유기체에 따라 상이하다;원핵세포에서 그러한 제어서열은 일반적으로, 촉진유전자, 리보좀 결합부위,및 종결 유전자를 포함하며;진핵세포에서는 일반적으로, 그러한 제어서열은 촉진유전자, 종결유전자 및, 어떤 경우에는 인핸서를 포함한다. 용어 제어서열 은 최소한으로, 발현에 대해 존재하여야 할 필요성이 있는 모든 성분을 포함하는 것으로 의도되고, 또한 그의 존재가 유리한 추가의 성분, 예컨대 리더서열을 포함하기도 한다.
작동가능하게 연결된 은 상기 설명된 성분들이 그의 의도된 방식으로 작용하는 것을 허용하는 관계로 놓여있는 병렬을 의미한다. 코딩서열에 작동가능하게 연결된 제어서열은 코딩서열의 발현이 제어 서열과 부합하는 조건하에서 이루어지는 그러한 방식으로 연결된다.
오픈리딩 프레임(ORF) 은 폴리펩티드를 코드화하는 폴리 뉴클레오티드 서열의 영역이다;이 영역은 코딩서열의 일부 또는 전체 코딩서열을 나타낼 수도 있다.
코딩서열 은 적절한 조절서열의 제어하에 놓이게 되는 경우 mRNA로 전사되는 및/ 또는 폴리펩티드로 번역되는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 코딩서열의 경계 5'-말단의 번역 출발코돈과 3'-말단의 번역중지코돈에 의해 결정된다. 코딩서열은 그것에 한정되지는 않지만, mRNA, cDNA, 및 재조합 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
∼과/으로서 면역학적으로 동일가능한 은 표시된 폴리펩티드(들), 통상은 HCV 단백질에 존재하고 그것에 유일한 에피토프(들) 및 폴리펩티드(들)의 존재를 말한다. 면역학적 동일성은 항체결합 및/ 또는 결합의 경합에 의하여 측정될 수 있다; 이들 기법은 기술분야에 평균적으로 숙련된 사람들에게 공지이며 또한 아래에 예시된다. 에피토프의 유일성은 또한 에피토프를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 공지의 데이타 뱅크, 예컨대 유전자 은행을 컴퓨터로 조사함으로써, 및 다른 공지된 단백질과의 아미노산 서열비교에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바, 에피토프 란 폴리펩티드의 항원 결정기를 말한다;에피토프는 에피토프에 유일한 입체구조의 3아미노산을 포함할 수 있으며, 일반적으로 에피토프는 적어도 5의 그러한 아미노산, 보다 통상적으로는 적어도 8-10의 그러한 아미노산으로 구성된다. 아미노산의 입체구조를 측정하는 방법은 기술분야에 공지이며, 예컨대 X-선 결정사진법 및 2-차원 핵자기 공명법을 포함한다.
폴리펩티드는 그것이 항체와 결합하는 경우 폴리펩티드내에 함유된 특이적 에피토프의 항체인지 때문에 항체와 면역학적으로 반응 한다. 면역학적 반응성은 항체결합에 의하여, 보다 구체적으로는 항체결합의 역학에 의해서, 및/또는 그것에 대해 항체가 지시되는 에피토프를 함유하는 공지 폴리펩티드(들)을 경합자(들)로서 사용하는 결합시의 경합에 의하여 측정될 수 있다. 폴리펩티드가 항체와 면역학적으로 반응하는지의 여부를 측정하기 위한 기법은 기술분야에 공지이다.
본원에 사용된 바, 용어 HCV 에피토프를 함유하는 면역원성 폴리펩티드 는 자연적으로 발생하는 HCV폴리펩티드 또는 그의 단편, 뿐만아니라 예컨대 화학적 합성과 같은 다른 수단, 또는 재조합 유기체에서의 폴리펩티드의 발현에 의해 제조되는 폴리펩티드를 포함한다.
용어 폴리펩티드 는 아미노산의 분자사슬을 말하고 생성물의 특정 길이에 관련이 없다;그러므로, 펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질이 폴리펩티드의 정의내에 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 발현후 변형, 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 인산화등에도 관련이 없다.
본원에 사용된 형질전환 은 외인성 폴리뉴클레오티드의 숙주세포로의 삽입을 말하며, 예컨대 직접흡수, 형질유도, 또는 f-교배와 같은, 삽입에 사용된 방법에는 관계가 없다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-통합된 벡터로서, 예컨대 플라스미드로서 유지될 수 있으며, 또는, 숙주게놈으로 통합될 수도 있다.
본원에 사용된 처리 란 예방 및/또는 치료를 말한다.
본원에 사용된 바와같은 개체(individual)는 척추동물, 특히 포유류종의 구성원을 말하며, 그것에 한정되는 것은 아니지만 가축동물, 운동하는 동물, 영장류 및 사람을 포함한다.
본원에서 사용된 핵산의 플러스 스트란드 는 폴리펩티드를 코드화하는 서열을 함유한다. 마이너스 스트란드 는 플러스 스트란드 의 그것과 상보하는 서열을 함유한다.
본원에 사용된 바이러스의 양성 스트란드 게놈 이란 RNA 이든 DNA이든 게놈이 단일스트란드이고, 바이러스 폴리펩티드(들)을 코드화하는 것이다. 양성스트란드 RNA바이러스의 실례로는 토가바이러스, 코로나바이러스, 레트로바이러스, 피코르나바이러스, 및 칼리시바이러스가 있다. 또한 전에는 토가바이러스로서 분류되었던 플래비바이러스도 포함된다(Fields Knipe(1986) 참조).
본원에 사용된 항체함유 신체성분 은 관심의 항체의 공급원인 개체의 신체의 성분을 말한다. 항체함유 신체성분은 기술분야에 공지이며, 그것에 한정되지는 않지만, 예컨대 혈장, 혈청, 척수액, 임파액, 호흡기, 장기, 및 생식기 트랙의 외부단면, 눈물, 타액, 젖, 백헐구 및 골수종을 포함한다.
본원에 사용된 정제된 HCV 는 바이러스가 정상적으로 결합하는 세포구성성분으로부터, 및 감염된 조직에 존재할 수 있는 다른 종류의 바이러스로부터 단리된 HCV의 제제를 말한다. 바이러스를 단리하기 위한 기법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이며, 예컨대 원심분리와 친화성 크로마토그래피를 포함한다;정제된 HCV의 제조방법은 아래에서 논의된다.
Ⅱ. 발명의 설명
본 발명의 실시는 다른 표시가 없는 한, 기술분야의 숙련성내에 있는 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래기법을 사용할 것이다. 그러한 기법은 문헌에 완전하게 설명된다.
예컨대 Naniatis, Fitsch Sambrook, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I AND Il(D.N Glover ed.1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed, 1984 ); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames S.J. Higgins eds. l984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney ed. l986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYHES (IRL Press,1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO NOLECULAR CLONING (1984); the series, NETHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTQRS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller and N.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vo1.154 and Vol.155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., 각각 ), Mayer and Nalker, eds. (1987) , IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULARBIOLOGY (Academic Press, London) , Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Second Edition(Springer-Verlag, N. Y.) , and HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IM-MUNOLOGY, VOLUNES I-IV (D.H. Weir and C. C. Blackwell eds 1986) 참조.
본원에 상기 및 하기 언급된, 모든 특허, 특허출원, 및 공보는 본원에 참고문헌으로서 삽입된다.
본 발명의 유용한 물질 및 방법들은 HCV감염된 침팬지의 혈장에 존재하는 핵산서열로부터 유도된 cDNA 라이브러리로부터 밀접하게 동종성인 뉴클레오티드 서열 패밀리가 단리된다는 전제에 의해 가능하게 된다. 이 뉴클레오티드 서열의 패밀리는 사람 또는 침팬지 유래의 것은 아니다. 왜냐하면, 그것은 비감염 개체로부터의 사람 또는 침팬지 게놈 DNA의 어느 것과도 혼성되지 않으며, 이 서열 패밀리의 뉴클레오티드는 단지 HCV 감염된 침팬지의 간과 혈장에만 존재하고, 그 서열은 유전자 은행에는 존재하지 않기 때문이다. 더불어, 이 서열의 패밀리는 HBV게놈내에 함유된 서열과 상당한 동종성을 나타내지 않는다.
클론 5-1-1내에 함유된, 패밀리의 한구성원의 서열은 대략 50 아미노산의 폴리팹티드를 코드화하는 하나의 연속오픈리딩프레임(ORF)을 갖는다. HCV 감염된 사람으로부터의 혈청은 이 폴리펩티드에 결합하는 항체를 함유하는 한편, 비감염 사람으로부터의 혈청은 이 폴리펩티드에 대한 항체를 함유하지 않는다. 결국, 비감염 침팬지로부터의 혈청은 이 폴리펩티드에 대한 항체를 함유하지 않는 한편, 항체는 급성 NANBH 감염에 뒤이어 침팬지에서 유도된다. 더욱이, 이 폴리펩티드에 대한 항체는 HAV와 HBV로 감염된 침팬지와 사람에게서는 검출되지 않는다. 이들 범주에 의하여 서열은 바이러스 서열에 대한 cDNA이고, 그때에 바이러스는 NANBH를 유발하거나 또는 NANBH와 관련이 있다; 이cDNA 서열은 도 1에 도시된다. 아래에서 논의되는 바와같이, 클론 5-1-1의 cDNA 서열은 그것이 28의 엑스트라 염기쌍을 함유한다는 점에서 다른 단리된 cDNA의 그것과 상이하다.
프로브로서, 클론 5-1-1의 cDNA의 단편과 동등한 합성서열을 사용하여 단리된 cDNA 패밀리의 다른 확인된 구성원의 혼성은 도 3에 도시된다. 클론 81의 cDNA로부터 유도된 합성서열을 사용하여 단리된 cDNA패밀리의 구성원은 도 5에 도시되며, 클론 81의 그것과 이 서열과의 혼성은 도 6 에 도시된다. 클론12f,14i,1lb,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f 및 33g,39c,35f,19g,26g 및 15e에 존재하는 것들을 포함하여 cDNA 패밀리의 다른 구성원들은 단원 IV.A.에 기재된다. 이들 클론의 cDNA 의 혼성은 단원 IV.A.19에 기재되며, 도 32에 도시된다. 혼성 cDNA는 그것이 하나의 연속 ORF를 함유하고, 따라서 폴리단백질을 코드화하는 것을 보여준다. 이 데이타는 아래에서 논의되는, HCV가 플래비바이러스 또는 플래비-계 바이러스라는 제안과 일치한다.
도 1 내지 도 32에 도시된 cDNA의 이런 패밀리의 활용성은 HCV감염에 의거한 NANBH를 진단하는데 및 기증된 혈액과 혈액산물 뿐만 아니라 혈액기증자를 감염에 대해 스크린하는데 유용한 DNA 프로브 및 폴리펩티드의 제조를 허용한다. 예를들어, 그 서열로부터, 예컨대 바이러스를 은닉하고 있는 것으로 의심되는 피검체의 혈청에서 바이러스 게놈의 존재를 검출하기 위해, 또는 기증된 혈액을 바이러스의 존재에 대하여 스크린할 때 혼성체형성 프로브로서 유용한 약 8-10 뉴클레오티드, 또는 보다 큰 DNA 올리고머를 합성하는 것이 가능하다. cDNA서열의 패밀리는 또한 NANBH에 걸려있는 동안 유발된 항체의 존재에 대한 진단시약으로 유용한 HCV 특이적 폴리펩티드의 고안 및 제조를 허용한다. cDNA로부터 유도된 정제된 폴리펩티드에 대한 항체는 또한 감염된 개체 및 혈액에서 바이러스 항원을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
이들 cDNA 서열에 대한 지식은 또한 HCV에 대한 및 또한 항체의 제조를 위한 백신으로서 사용될 수 있는 폴리펩티드의 고안과 제조를 가능하게 하며, 그것은 계속해서 질병에 대한 보호, 및/또는 HCV 감염된 개체의 치료를 위하여 사용될 수 있다.
더욱이, cDNA 서열의 패밀리는 HCV게놈의 추가의 특성확인을 가능하게한다. 이들 서열로부터 유도된 폴리뉴클레오티드 프로브는 추가의 중첩하는 cDNA서열에 대한 cDNA 라이브러리를 스크린하기 위해 사용될 수 있고, 그것은 계속해서 더많은 중첩하는 서열을 얻기 위해 사용될 수 있다. 게놈이 단편화되고 그 단편들에 공통 서열이 결꾑되어 있지 않는 한, 이 기법은 전체 게놈의 서열을 얻기위해 사용될 수 있다. 그러나, 게놈이 단편화되면, 게놈의 다른 단편들이 본원에 기재된 cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 람다-gtl1 혈청학적 스크리닝 과정을 반복함으로써, 또는 달리 정제된 HCV 입자로부터 게놈을 단리함으로써 얻어질 수 있다.
cDNA서열의 패밀리 및 이들 서열로부터 유도된 폴리펩티드, 뿐만아니라 이들 폴리펩티드에 대한 항체도 BB-NANBV 병원체(들)의 단리 및 확인에 유용하다. 예를들어, cDNA로부터 유도된 폴리펩티드에 함유된 HCV 에피토프에 대한 항체는 바이러스를 단리하기 위한 친화성 크로마토그래피를 토대로 한 과정에 사용될 수 있다. 또는, 항체는 다른 기법에 의해 단리된 바이러스 입자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 항원과 단리된 바이러스 입자내의 게놈물질은 다음에 추가로 특성 확인될 수 있다.
HCV 게놈(들)의 추가의 서열분석으로부터, 뿐만 아니라 HCV항원의 추가의 특 성확인 및 게놈의 특성확인으로부터 얻어진 정보는 HCV 유도 NANBH 의 진단, 예방, 및 치료에 대해, 그리고 감염된 혈액과 혈액-관련 산물을 스크린하는데 사용될 수 있는 추가의 프로브 및 폴리펩티드와 항체의 고안 및 합성을 가능하게 한다.
항원 및 항체를 포함하여 HCV에 대한 프로브, 및 cDNA의 패밀리가 유도되는 게놈으로부터 유도된 폴리뉴클레오티드의 활용성은 또한 HCV의 생물학을 설명하는데 주로 사용될 조직배양시스템의 개발을 허용한다. 이것은 계속해서, HCV의 복제, 또는 HCV에 의한 감염을 우선적으로 저해하는 항바이러스 화합물을 토대로 한 새로운 치료법의 개발을 유도할 수 있다.
NANBH에 대한 병원학적 병원체를 확인하고 단리하기 위해 사용된 방법은 신규하며, 그것은 게놈을 함유하고, 바이러스, 비로이드, 박테리아, 진균류 및 기생충에 의해 유도되는 것들을 포함하여 각종 질병과 관련된 지금까지 특성확인이 되어있지 않은 병원체의 확인 및/또는 단리에 적용할 수 있다. 이 방법으로, cDNA 라이브러리가 감염된 개체로부터의 감염된 조직에 존재하는 핵산으로부터 제조되었다. 라이브러리는 cDNA에 코드화된 폴리펩티드의 발현을 허용한 벡터에서 제조되었다. 병원학적 병원체의 폴리펩티드의 면역학적으로 반응성인 단편을 발현한 벡터를 함유하고 있는 숙주세포의 클론은 추정되는 병원체로 전에 감염된 다른 기체로부터의 항체함유 신체성분으로 라이브러리의 발현생성물을 면역학적으로 스크리닝함으로써 선택되었다. 면역학적 스크리닝 기법의 단계는 cDNA함유 벡터의 발현생성물을 제2감염된 개체의 항체함유 신체성분과 상호반응시키고, 발현생성물(들)과 제2감염된 개체의 항체사이의 항체-항원 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함한다. 단리된 클론은 그의 발현 생성물을 추정되는 병원체로 감염된 다른 개체의 항체함유 신체성분과 및 추정되는 병원체로 감염되지 않은 대조표준 개체와 상호반응시킨 후, 감염된 개체로부터의 항체와의 항원-항체 복합체의 형성을 검출함으로써 추가로 면역학적으로 스크린되고;감염된 개체와 병원체로 감염되었을 것으로 의심되는 개체로부터의 항체와 면역학적으로 반응하는, 그러나 대조표준 개체와는 반응하지 않는 폴리펩티드를 코드화하는 cDNA 함유 벡터가 단리된다. 감염된 개체는 cDNA 라이브러리의 제조를 위해, 그리고 동일 종일 것을 필요로 하지 않는 면역학적 스크리닝을 위해 사용된다.
이 방법의 결과로서 단리된 cDNA, 및 그의 발현생성물, 그리고 발현 생성물에 대한 항체는 병원학적 병원체의 특성확인 및/또는 포휙에 유용하다. 아래에서 보다 상세히 설명되는 바와같이, 이 방법은 HCV게놈으로부터 유도된 cDNA 패밀리를 단리하기 위하여 성공적으로 사용되어 왔다.
Ⅱ.A. cDNA 서열의 제조
만성 HCV 감염되고 고역가의 바이러스, 즉, 적어도 106chimp 감염성용량/ml(CID/ml)을 함유하고 있는 침팬지로부터 모아진 혈청이 바이러스 입자를 단리하기 위하여 사용되었다; 이들 입자로부터 단리된 핵산은 바이러스 게놈에 대한 cDNA 라이브러리의 제조시 주형으로서 사용되었다. 추정되는 HCV입자의 단리에 대한 및 람다-gtl1 에서의 cDNA 라이브러리의 제조에 대한 과정은 단원 IV.A.1 에서 논의된다. 람다-gtl1 은 베타-갈락토시다제와의 융합 폴리펩티드로서 삽입된 cDNA를 발현하기 위해 및 대다수의 재조합 파지를 규정된 항원에 대해 유발된 특이적 항혈청으로 스크린하기 위해 특이적으로 개발된 벡터이다. 평균크기가 대략 200염기쌍인 cDNA를 함유하고 있는 cDNA 푸울로부터 제조된 람다-gt11 cDNA 라이브러리가 전에 NANB 감염에 걸렸던 경력이 있는 환자로부터 유도된 혈청과 특이적으로 결합할 수 있는 코드화된 에피토프에 대하여 스크린되었다(Huynh, T.V. et al.(1985)). 대략 1016파지가 스크린되었고, 다섯개의 양성파지가 확인되었으며, 정제된후 전에 HCV 병원체로 감염된 상이한 사람과 침팬지의 혈청과의 결합 특이성에 대해 시험되었다. 파지중 하나인 5-1-1은 시험된 8사람 혈청중 5개와 결합하였다. 이 결합은 7의 정상혈액 기증자의 혈청이 그러한 결합을 나타내지 않았기 때문에 앞서 NANB 간염으로 감염된 환자로부터 유도된 혈청에 대해 선택적인 것으로 여겨졌다.
재조합 파지 5-1-1의 cDNA 서열이 측정되었고, 도 1에 도시된다. 폴리펩티드는 이 클론된 cDNA에 의해 코드화되고, 그것은 뉴클례오티드 서열 위에 도시된 융합 폴리펩티드의 N-말단 베타-갈락토시다제 부분과 동일한 번역 프례임에 있다. 그러므로, 이 번역 ORF는 NANB 간염 감염에 걸린 환자로부터의 혈청에 의해 특이적인 인지된 에피토프(들)을 코드화한다.
재조합 파지 5-1-1의 cDNA의 활용성은 추가의 부분 및/또는 바이러스 게놈에 대한 cDNA의 다른 부분을 함유하고 있는 다른 클론의 단리를 허용하였다. 상기 설명된 람다-gtl1 cDNA 라이브러리는 클론된 5-1-1 cDNA의 서열로부터 유도된 합성 폴리뉴클레오티드를 사용하여 스크린되었다. 이 스크리닝은 81,1-2 및 91로 표시된 세가지 다른 클론을 산출하였고; 이들 클론내에 함유된 cDNA가 서열분석되었다. 단원 IV.A.3 및 IV.A.4 참조. 네가지 독립적인 클론간의 동종성을 도 2에 도시하며, 도면에서 동종성은 수직선으로 표시된다. 클론 5-1-1,81 및 91에 유일하게 존재하는 뉴클레오티드의 서열은 소문자로 표시한다.
클론 5-1-1, 81, 1-2 및 91의 재조합 파지에 존재하는 클론된 cDNA는 매우 동종성이며, 단지 2영역에서만 상이하다. 첫째, 클론 1-2의 뉴클레오티드 수67은 티미딘인 한편 다른 3개의 클론은 이 위치에 시티딘 잔기를 함유한다. 그러나, 이 치환은 코드화된 아미노산의 성질을 변경시키지 않는다.
클론간의 2번째 상이점은 클론 5-1-1이 그의 5'-말단에 다른 클론에는 존재하지 않는 28 염기쌍을 함유한다는 것이다. 외부서열은 5'-말단 클로닝 인공물일 것이다;5'-말단 클로닝 인공물은 통상 cDNA 방법의 생성물에서 관찰된다.
클론 81의 HCV cDNA 의 5'-영역 및 3'-영역으로부터 유도된 합성서열은 클론 81 cDNA와 중첩된, 람다-gtll NANBV cDNA 라이브러리로부터의 cDNA를 스크린하고 단리하기 위하여 사용되었다(단원 IV.A.5.). 그 결과의 cDNA, 각각 클론 36과 클론 32의 서열을 도 5와 도 7에 도시한다.
유사하게, 클론 36의 5'-영역을 토대로 한 합성 폴리뉴클레오티드가 클론 36 cDNA와 중첩된 람다 gt-1l NANBV cDNA 라이브러리로부터 cDNA의 스크린 및 단리에 사용되었다(단원 IV.A.8.). 합성 폴리뉴클레오티드 프로브와 혼성된 cDNA-함유 재조합 파지의 정제된 클론은 클론 35로 명명되었으며 이 클론내에 함유된 NANBV cDNA 서열은 도 8에 도시된다.
중첩하는 cDNA 서열을 단리하는 기법을 활용함으로써, 추가로 HCV cDNA 서열의 윗쪽과 아래쪽을 함유하는 클론이 얻어졌다. 이들 클론의 단리는 아래의 단원 IV.A 에서 설명한다.
단리된 클론내에 코드화된 HCV cDNA의 뉴클레오티드 서열의 분석은 혼성 cDNA가 하나의 긴연속 ORF를 함유한다는 것을 나타낸다.
도26는 거기에 코드화된 추정되는 HCV폴리펩티드와 함께 이들 클론으로부터의 혼성 cDNA의 서열을 도시한다.
cDNA서열을 보층하기 위한 방법의 설명은 대부분 역사적인 흥미가 있다. 그 결과의 서열(및 그의 보체)이 본원에 제공되며, 서열 또는 그의 어떠한 일부는 합성법을 사용하여, 또는 본원에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 부분서열의 보충과 함께 합성법의 조합에 의하여 제조될 수 있다.
HCV cDNA 라이브러리로부터 및 클론 5-1-1, 81, 1-2 및 91 로부터 복제된 람다-gtl1 균주가 부다페스트 조약의 조건하에 미합중국 매릴랜드주 20852, 록빌리 파크로운 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬춰콜렉션(ATCC)에 기탁되었고, 다음의 승인번호를 부여받았다.
람다 gt-11 ATCC No. 기탁일
HCV cDN 라이브러리403941987.12.1
클론 81403881987.11.17
클론 91403891987.11.17
클론 1-2403901987.11.17
클론 5-1-1403911987.11.18
본 출원의 미합중국 특허로서의 승인 및 발행시에, 이들 기탁의 활용성에 대한 모든 제한은 결정적으로 제거될 것이다; 그리고 표시된 기탁에 대한 접근은 37 CFR l.14와 35 USC 1.22하에 거기에 대해 권리가 부여될 최고 책임자에 의해 결정된 사람에게 상기 표시된 출원의 계류중에 활용가능하게 될 것이다. 더욱이, 표시된 기탁은 기탁일로부터 30년 동안 또는 기탁에 대한 최종 요청후 5년 동안;또는 U.S. 특허의 존속기간동안, 어느쪽이든지 더 긴 기간동안 유지될 수 있다. 이들 기탁 및 본원에서 언급된 다른 기탁물질은 단지 편리를 목적으로 한 것으로, 본원에서 설명의 견지에서 본 발명을 실시하기 위해 필요한 것은 아니다. 모든 기탁된 물질의 HCV cDNA 서열은 본원에 참고로 삽입된다.
HCV 람다 gt-11 라이브러리로부터 중첩 cDNA 서열을 단리함에 의한 워킹(Walking)게놈의 상기 설명은 그것에 의해 전체 cDNA 게놈에 대응하는 cDNA가 단리될 수 있는 한 방법을 제공한다. 그러나 본원에 제공된 정보, 이들 cDNA를 단리하기 위한 다른 방법은 기술분야에 숙련된 사람에게 명백하다. 이들 방법중 몇가지를 아래의 단원 IV.A.에 기재한다.
Ⅱ. B. 바이러스 폴리펩티드와 단편의 제조
cDNA서열, 아래에서 논의되는 바와같이 도 1 내지 도 32의 cDNA 서열을 사용하여 단리된 것들, 뿐만아니라 이들 도면의 cDNA 서열의 어느것이든지를 활용하는 것은 어느 하나의 스트란드에 코드화된 폴리펩티드의 항원적으로 활성을 띄는 영역을 코드화하는 발현벡터의 제조를 허용한다. 예컨대 폴리뉴클레오티드 결합단백질, 폴리뉴클레오티드 중합효소(들) 및 바이러스 입자의 복제 및/또는 조립에 필요한 다른 바이러스 단백질을 포함하여, 이들 항원적으로 활성인 영역은 외투(coat)또는 엔벨로프 항원으로부터 또는 코아항원으로부터 유도될 수 있다. 소정 폴리펩티드를 코드화하는 단편은 종래의 제한 소화를 사용하여 또는 합성방법에 의하여 cDNA 클론으로부터 유도되며, 예컨대 베타-갈락토시다제 또는 슈퍼옥시드 디스뮤타제(SOD) 같은 융합서열, 바람직하게는 SOD의 부분을 함유할 수 있는 벡터에 연결된다. SOD의 융합서열을 함유하는 폴리펩티드의 제조에 유용한 방법 및 벡터는 1986년 10월 1일 공개된 유럽특허공보 제 0196056호에 기재되어 있다. SOD와 HCV 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드를 코드화 하는 벡터, 즉 NANB5-1-1, NANB81, 및 HCV cDNA의 혼성물에 코드화된 C100-3은 각각 단원 IV.B.1,IV.B.2,IV.B.4에 기재되어 있다. 어느 하나의 센스 스트란트에, 오픈리딩프레임을 함유하고 있는 HCV cDNA의 어떠한 소정부분도 재조합 폴리펩티드로서 예컨대 성숙 또는 융합단백질로 얻어질 수 있다;또는, cDNA중에 코드화된 폴리펩티드는 화학적 합성법에 의해 제공될 수 있다.
융합된 형태로든 또는 성숙한 형태로든, 그리고 분비를 허용하기 위한 신호 서열을 함유하고 있든지 또는 함유하지 않든지, 소정 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 어떠한 편리한 숙주에도 적당한 발현벡터에 연결될 수 있다. 진핵 및 원핵숙주 시스템은 두가지가 모두 재조합 폴리펩티드 형성에 현재 사용되며, 보다 공통적인 제어시스템의 약간과 숙주 셀라인의 개요가 아래의 단원 Ⅲ.A. 에 제시된다. 폴리펩티드는 그다음에 용해된 세포로부터 또는 배양배지로부터 단리되며 그의 의도된 사용에 필요한 정도로 정제된다. 정제는 기술분야에 공지된 기법, 예컨대 염분별법, 이온교환 수지상에서의 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 원심분리등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 단백질을 정제하기 위한 각종 방법에 대한 Methods in Enzymology 참조. 그러한 폴리펩티드는 진단시약으로서 사용될 수 있으며, 또는 중화 항체에 대해 유발되는 것들이 백신으로 제형될 수 있다. 이들 폴리펩티드에 대해 유발된 항체는 또한 진단시약으로서, 또는 수동 면역치료를 위해 사용될 수 있다. 더불어, 본원 아래의 단원 Ⅱ.J. 에서 논의되는 바와 같이, 이들 폴리펩티드에 대한 항체는 HCV입자의 단리 및 확인에 유용하다.
HCV 항원은 또한 HCV비리온으로부터 단리될 수도 있다. 비리온은 조직배양중의 HCV 감염된 세포에서, 또는 감염된 숙주에서 성장할 수 있다.
Ⅱ.C. 항원성 폴리펩티드의 제조 및 담체와의 포함
폴리펩티드의 항원영역은 일반적으로 상대적으로 작다--전형적으로 그 길이가 8 내지 10아미노산 또는 그 이하이다. 5아미노산 정도로 적은 단편이 항원 영역을 특징지을 수도 있다. 이들 부분은 HCV항원의 영역에 해당할 것이다. 따라서, HCV의 cDNA를 기초로서 사용하여 HCV 폴리펩티드의 짧은 분을 코드화하는 DNA가 융합 단백질로서, 또는 단리된 폴리펩티드로서, 재조합적으로 발현될 수 있다. 더불어, 짧은 아미노산 서열이 화학적 합성법에 의하여 편리하게 얻어질 수 있다. 합성된 폴리펩티드가 정확한, 그러나 면역원이 되기에는 너무 작은 에피토프를 제공하도록 정확하게 구성되는 경우에 있어서, 폴리펩티드는 적당한 담체에 연결될 수 있다.
미합중국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 컴패니로부터 얻어지는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티오) 프로피오네이트(SPDP)와 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) (만약 펩티드에 술프히드릴기가 부족하다면, 이것은 시스테인 잔기의 첨가에 의해 제공될 수 있다.)를 사용하여 이황화 연쇄를 형성하는 것을 포함하여, 그러한 연쇄를 얻기 위한 다수의 방법이 기술분야에 공지이다.이들 시약은 그들 자체간에 및 단백질상의 팹티드 시스톄인 잔기와 아미드 연쇄 사이에 리신상의 엡실론-아미노, 또는 다른 아미노산의 다른 유리아미노기를 통하여 이황화 연쇄를 형성한다. 그러한 각종 이황화물/아미드-형성제가 공지되어 있다. 예컨대 Immun. Rev.(1982) 62:185 참조. 다른 이중기능성 커플링제는 이황화 연쇄보다는 티오에톄르를 형성한다. 이들 티오에테르-형성제중 많은 것은 상업적으로 쉽게 구할 수 있으며,6-말레이미도카프로산,2-브로모아세트산,2-요오도 아세트산,4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실산등의 에스톄르를 포함한다. 카르복실기는 그것들을 숙신이미드 또는 1-히드록실-2-니트로-4-술폰산, 나트륨염과 조합시킴으로써 활성화될 수 있다. 전술한 목록이 전부를 의미하는 것은 아니며, 표시된 화합물의 변형도 분명히 사용될 수 있다.
어떠한 담체도 그 자체가 숙주에 해로운 항체의 생성을 유도하지 않는다면 사용될 수 있다. 적당한 담체는 전형적으로 크고, 서서히 대사된 단백질같은 거대 분자; 라텍스 기능화된 세파로스, 아가로스, 셀룰로스, 셀룰로스 결합등과 같은 다당류;폴리글루탐산, 폴리리신등과 같은 중합체 아미노산;아미노산 공중합체;및 비활성 바이러스 입자이다. 예를들면 단원 Ⅱ. D. 참조. 특히 유용한 단백질 기질은 혈청 알부민, 기호울 림페트 헤모시아닌, 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오브알부민, 파상풍독소, 및 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려진 다른 단백질들이다.
Ⅱ. D. HCV 에피토프를 함유하는 흡성 입자면역원의 제조
HCV의 에피토프의 면역원성은 또한 그것들을 예컨대 B형 간염 표면 항원과 결합된 것과 같이 입자-형성 단백질과 융합된 또는 조립된 포유류 또는 효모 시스템에서 제조함으로써 증강될 수 있다. NANBV 에피토프가 입자-형성단백질 코딩서열에 직접 연결되는 구조물은 HCV 에피토프와 관련하여 면역원성인 혼성체를 생산한다. 더불어, HBV 에 특이적인 에피토프를 포함하여 제조된 모든 벡터는 예컨대 pre-S 펩티드같은 다양한 정도의 면역원성을 갖는다. 그로써, HCV 서열을 포함하는 입자 형성 단백질로부터 제조된 입자들은 HCV와 HBV와 관련하여 면역원이다.
간염표면항원(HBSAg) 은 맥주효모균에서(Valenzuela et al.(1982)), 뿐만아니라 예컨대 포유류 세포에서도(Valenzuela, P., et al,(1984)), 뿐만아니라 예컨대 포유류 세포에서도(Valenzuela, P., et al,(1984)) 입자로 형성되고 조립되는 것으로 밝혀졌다. 그러한 입자의 형성은 단량체 하위단위의 면역원성을 증강시키는 것으로 밝혀졌다. 구조물은 또한 55 아미노산의 프레표면(prs-S) 영역을 포함하여, HBSAg의 면역지배적인 에피토프를 포함할 수 있다. Neurath et al.(1984). 효모에서 발현가능한 pre-S-HBSAg의 구조는 1986년 3월 19일에 공개된 EPO 174ㅡ444에 개시된다; 효모발현에 대한 이종성 바이러스 서열을 포함하는 혼성체는 1966년 3월 26일에 공개된 EPO 175,261에 개시된다. 두가지 출원은 모두 본원 양수인에게 양도되고 본원에 참고로 삽입된다. 이들 구조물은 또한 SV40-디히드로폴레이트 환원효소 벡터(Michelle et al.(1984))를 사용하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포같은 포유류세포에서 발현될 수 있다.
더불어, 입자-형성 단백질 코딩서열은 HCV 에피토프를 코드화하는 코돈으로 대치될 수도 있다. 이런 대치에서는, 효소 또는 호유류에서 면역원 입자를 형성하기 위해 단위의 응집을 조정할 필요가 없는 영역이 결실될 수 있으며, 그에 따라 추가의 HBV 항원 부위가 HCV 에피토프와의 경합으로부터 제거된다.
Ⅱ.E. 백신의 제조
백신은 도 1 내지 도 32의 cDNA 서열로부터 뿐만 아니라 HCV cDNA로 부터 유도된 하나 또는 2이상의 면역원성 폴리펩티드로부터, 또는 그것들이 대응하는 HCV 게놈으로부터 제조될 수 있다. HCV 와 플래비바이러스간에 관찰된 동종성은 백신으로서 가장 효과적인 것처럼 보이는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 그것들이 코드화되는 게놈의 영역에 관한 정보를 제공한다. 플래비바이러스의 일반구조는 라이스등(1986)의 문헌에서 논의된다. 플래비바이러스 게놈 RNA는 단지 바이러스 특이적 mRNA 종인 것으로 믿어지며, 그것은 3가지 바이러스 구조 단백질, 즉, C,M, 및 E와, 뿐만아니라 두개의 커다란 비구조성 단백질, NV4와 NV5, 그리고 보다 작은 비구조 단백질의 복합세트로 번역된다. 플래비바이러스에 대한 주된 중화 에피토프는 E(엔벨로프) 단백질에 존재하는 것으로 알려진다(Roehrig(1986)). 해당하는 HCV E 유전자와 폴리펩티드 코드화 영역도 플래비바이러스에 대한 동종성을 토대로 예측할 수 있다. 그러므로, 백신은 HCV 티 에피토프를 함유하는 재조합 폴리펩티드로 구성될 수 있다. 이들 폴리펩티드는 박테리아, 효모, 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있으며, 또는 달리는, 바이러스 제제로부터 단리될 수 있다. 또한 다른 구조단백질이 또한 보호성 항-HCV항체에 대해 유발되는 에피토프를 함유할 수 있을 것이라고 예측된다. 그러므로, E, C, 및 M의 에피토프를 함유하고 있는 폴리펩티드도 또한, 단독으로든지 또는 조합하여서든지 HCV백신으로 사용될 수 있다.
상기한 것에 더불어, NS1(비구조 단백질 1) 으로의 면역감작이 황열병을 유발한다고 알려져 있다(Schlesinger et al(1986)). 이것은 면역감작이 중화항체에 대해 유발되지 않는다 하더라도 사실이다. 그러므로, 특히 이 단백질이 플래비바이러스중에서 고도로 보존되는 것으로 여겨지기 때문에 HCV NS1 또는 HCV감염에 대해 보호적일 것이라 여겨진다. 더욱이, 또한 비구조 단백질은 그것들이 중화항체의 생성을 유발하지 않는 때에라도 바이러스 병원성에 대한 보호력을 제공할 수 있다고 보여진다.
상기한 관점에서, HCV에 대한 다가의 백신은 하나 또는 그 이상의 구조단백질, 및/또는 하나 또는 그이상의 비구조 단백질로 구성될 것이다. 이들 백신은 예건대, 재조합 HCV 폴리펩티드 및/또는 비리온으로부터 단리된 폴리펩티드로 구성될 수도 있다. 더불어, 비활성화된 HCV를 백신에 사용하는 것도 가능할 것이다;비활성화는 바이러스 용해물의 제조에 의하여, 또는 플래비바이러스의 비활성화를 유발하기 위해 기술분야에 공지된 다른 수단, 예컨대 유기용매 또는 세제로의 처리, 또는 포르말린으로의 처리에 의하여 이루어질 수 있다. 더욱이, 백신은 또한 감쇠된 HCV 균주로부터 제조될 수 있다. 감쇠된 HCV균주의 제조는 아래에 기재된다.
플래비바이러스의 약간의 단백질이 매우 보조된 영역을 함유하는 것으로 알려지며, 그로써, 약간의 면역학적 교차반응성이 HCV와 다른 플래비바이러스 사이에서 예견된다. 플래비바이러스와 HCV 사이에 공유된 에피토프가 이들 병원성 병원체에 의해 유발된 하나 또는 그이상의 장해에 대한 보호성 항체에 대하여 유발될 것이 가능하다. 그러므로, 이 지식을 바탕으로 다목적 백신을 고안하는 것이 가능할 것이다.
활성성분으로서 면역원성 폴리펩티드(들)을 함유하는 백신의 제조는 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이다. 전형적으로, 그러한 백신은 액체용액 또는 현탁액의 어느 하나의 형태로서 주사가능한 것으로;용액 또는 현탁액에 적당한 고체형태로 제조되며, 주사전의 액체가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화된 상태일 수 있으며 또는 리포좀에 캡슐화된 단백질일 수 있다. 활성 면역원 성분은 때로 약제학적으로 허용가능하고 활성성분과 부합하는 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제는 예건대, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 등이며 그의 조합도 사용된다. 더불어, 원한다면, 백신은 습윤 또는 유화제, pH완충제, 및/ 또는 백신의 효율성을 증진시키는 보조약같은 보조물질을 소량 함유할 수 있다. 효과적일 수 있는보조약의 실례로는 거기에 한정되는 것은 아니지만:수산화 알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP11637, nor-MDP로 언급됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE 로 언급됨), 및 박테리아로부터 추출된 3가지 성분, 모노포스포릴 리피드 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포벽 골격(MPL+TDM +CWS)을 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀젼에 함유하는 RIBI가 있다. 보조약의 유효성은 각종 보조약으로 구성되기도 한 백신에 면역원성 폴리펩티드를 담아 투여함으로써 유발되는 HCV항원 서열을 함유하는 이 폴리펩티드에 대한 항체의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다.
백신은 전통적으로 비경구적으로, 주사, 예컨대 피하 또는 근육내주사에 의해 투여된다. 다른 형태의 투여에 적당한 추가의 제형은 좌약 및, 어떤 경우에는 경구용 제형을 포함한다. 좌약에 대해서는, 전통적인 결합제 및 담체, 예컨대 폴리알킬렌글리클 또는 트리글리세라이드가 포함될 수 있으며;그러한 좌약은 유효성분을 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2% 의 범위로 함유하고 있는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구용 제형은 예컨대 약제급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘등과 같은 그런 정상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환, 캡슐, 방출이 지연되는 제형 또는 분말의 형태를 취하며 10% 내지 95%, 바람직하게는 25% 내지 70%의 유효성분을 함유한다.
단백질은 중성 또는 염형태로서 백신에 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염이란 산첨가염(펩티드의 유리아미노기와 함께 형성됨)과 예컨대 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 윽살산, 타르타르산, 말레산등과 같은 유기산과 함께 형성되는 것을 말한다. 유리 카르복실기와 함께 형성된 염은 또한 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화철과 같은 무기염, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인등과 같은 유기염으로 부터 유도될 수 있다.
Ⅱ.F. 백신의 1회용량 및 투여
백신은 1회용 제형과 부합하는 방식으로, 및 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 효과를 나타낼 만한 양으로 투여된다. 일반적으로 1회용량당 항원의 5마이크로그램 내지 250마이크로그램의 범위인, 투여하고자 하는 양은 치료될 개체, 개체의 항체를 합성하는 면역시스템의 능력 및 바라는 보호의 정도에 따라 좌우된다. 투여에 요구되는 유효성분의 정확한 양은 실시자의 판단에 따라 좌우되고 각 개체에 특유할 것이다.
백신은 단일 1회 스케쥴로, 또는 바람직하게는 다중투여 스케쥴로 주어질 수 있다. 다중 투여스케쥴은 예방접종의 1차 경로는 1-10의 별도의 투여로 이루어질 것이고, 이어서 면역반응을 유지 및 또는 강화시키기 위하여 필요한 연속적인 시간 간격을 두고, 예컨대 제 2차 투여에 대해 1-4개월후에 다른 투여를 하며, 필요하다면 수개월 후에 계속해서 투여(들)을 행하는 것이다. 투약요법은 또한, 적어도 부분적으로는, 개체의 요구에 의해 결정될 것이고, 실시자의 판단에 따라 좌우될 것이다.
더불어, 면역원성 HCV항원(들)을 함유하고 있는 백신은 다른 면역조절제, 예컨대 면역글로불린과 결합되어 투여될 수 있다.
Ⅱ. G. HCV 에피토프에 대한 항체의 제조
상술한 바와같이 제조한 면역원성 폴리펩티드를 다중클론성 및 단일 클론성 두가지의 항체를 제조하기 위해 사용된다. 만약 다중클론성 항체가 소망된다면, 선택된 포유류(예컨대 마우스, 토끼, 염소, 말등)가 HCV 에피토프(들)을 포함하고 있는 면역원성 폴리펩티드로 면역된다. 면역된 동물로부터의 혈청이 수집되며 공지과정을 따라서 처리된다. 만약 HCV 에피토프에 대한 다중클론성 항체를 함유하고 있는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유한다면, 다중클론성 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 다중클론성 항혈청을 제조하고 가공처리하는 기법은 기술분야에 공지이다. 예컨대 Mayer Walker(1987) 참조.
또는 다중클론성 항체는 전에 HCV로 감염되었었던 포유류로부터 단리될 수 있다. 친화성 크로마토그래피를 토대로 하고, SOD와 cDNA 클론 5-1-1내에 코드화된 폴리펩티드의 융합 폴리펩티드를 활용하는, 감염된 개체의 혈청으로부터 HCV 에피토프에 대한 항체를 정제하는 방법의 실례는 단원 V.E.에 나타낸다.
HCV 에피토프에 대한 단일클론성 항체는 또한 기술분야에 숙련된 사람에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단일클론성 항체를 만드는 일반적인 방법이 널리 알려져 있다. 불멸의 항체-생성 셀라인은 세포융합에 의해 제조될 수 있으며, 또한 B 임파구의 발암성 DNA로의 직접 형질전환, 또는 엡스타인-바르바이러스로의 형질전환과도 같은 다른 기법에 의하여 제조될 수 있다. 예컨대 M. Schreier et al.(1980);Hammerling et al.(1981);Kennett et al,(1980);U.S. 특허 제4,341,761호; 4,399,121호; 4,227,783호, 4,444,887호; 4,466,917호; 4,472,500호; 4,491,632호; 및 4,493,890호 참조. HCV 에피토프에 대해 제조된 단일클론성 항체의 패널은 다양한 성상에 대해;즉 이소타입, 에피토프 친화성등에 대해 스크린될 수 있다.
HCV 에피토프에 대한 두가지 단일클론성 및 다중클론성 항체는 특히 진단에 유용하며, 중화시기는 것들은 수동면역치료에 유용하다. 특히 단일클론성 항체는 항-유전자형 항체를 유발하기 위해 사용될 수 있다.
항-유전자형 항체는 그것에 대해 보호가 요망되는 감염성 병원체의 항원의 내부영상 을 운반하는 면역 글로불린이다. 예컨대 Nisonoff, A., et a1.(1981) 및 Dreesman etal .(1985 ) 참조 .
항-유전자형 항체를 유발하는 기법은 기술분야에 공지이다. 예컨대 Grzych(1985), MacNamara et al.(1984),및 Utdehaag et a1.(1985) 참조. 이들 항-유전자형 항체는 또한 NANBH의 치료에 유용할 것이고, 뿐만아니라 HCV 항원의 면역 원성 영역의 설명에도 유용할 것이다.
Ⅱ.H. 진단용 올리고뉴클레오티드 프로브 및 키트
도1 내지 도 32에 도시된 것들을 포함하여 단리된 HCV cDNA의 개시된 부분들을 기초로서 사용하여, 대략 8뉴클레오티드 또는 그이상의 올리고머가 절출에 의해 또는 합성적으로 제조될 수 있으며, 그것은 HCV 게놈과 혼성화하고 바이러스 병원체(들)의 확인, 나아가 바이러스 게놈(들)의 특성확인, 뿐만 아니라 질병에 걸린 개체에서 바이러스(들)의 검출에 유용하다. HCV 폴리뉴클레오티드(천연 또는 유도된)에 대한 프로브는 혼성화에 의한 유일한 바이러스 서열의 검출을 허용하는 길이이다. 6-8 뉴클레오티드가 작동가능한 길이인 한편,10-12 뉴클레오티드의 서열이 바람직하며, 약 20 뉴클레오티드가 가장 적당한 것으로 여겨진다. 이들 서열은 이종성이 없는 영역으로부터 유도되는 것이 바람직하다. 이들 프로브는 자동 올리고 뉴클레오티드 합성법을 포함하여 기본적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 유용한 프로브중에는 예컨대 본원에 개시된 클론 5-1-1과 추가의 클론이 있고, 뿐만 아니라, 아래에서 설명되는, cDNA 라이브러리를 프로브하는데 유용한 각종 올리고머가 있다. HCV 게놈의 어떠한 유일한 부분의 보체도 만족스러울 것이다. 프로브로서사용하기 위해서는 단편의 길이가 증가되기 때문에 불필요할 수도 있겠지만, 완전한 상보성이 바람직하다.
그러한 프로브의 진단시약으로서의 사용을 위해서는 혈액 또는 혈청 같은 분석하고자 하는 생물학적 샘플이, 원한다면 거기에 함유된 핵산을 추출하기 위해 처리된다. 그 결과의 샘플로부터의 핵산에는 겔전기영동 또는 다른 크기분류법이 수행될 수 있으며; 다르게는, 핵산샘플은 크기 분류없이 돗트블롯트될 수 있다. 그런다음 프로브가 표지된다. 적당한 표지, 및 프로브를 표지하는 방법은 기술분야에 공지이며, 예컨대 닉번역 또는 활성화에 의해 통합된 방사성 표지, 비오틴, 형광프로브, 및 화학발광 프로브를 포함한다. 그런다음 샘플로부터 추출된 핵산이 적당한 긴축의 혼성화 조건하에서 표지된 프로브로 처리된다.
프로브는 HCV 게놈에 완전히 상보하게 만들어질 수 있다. 그러므로, 통상 고긴축 조건이 잘못된 양성을 방지하기 위해 바람직하다. 그러나, 고긴축 조건은 프로브가 이종성이 없는 바이러스 게놈의 영역과 상보하는 경우에만 사용되어야 한다. 혼성화의 긴축도는 온도, 이온강도, 시간의 길이 및, 포름아미드의 농도를 포함하여, 혼성화 도중 및 세척과정중의 인자의 수에 의하여 결정된다. 이들 인자는 예컨대 마니아티스의 문헌에 개요된다(Maniatis, T.(1982)).
일반적으로, HCV 게놈서열이 감염된 개체의 혈청에 상대적으로 낮은 수준으로, 즉, 대략 1ml당 102-103서열로 존재할 것으로 예견된다. 이 수준은 증폭기법이 혼성화 측정에 사용되는 것을 필요로 할 것이다. 그러한 기법은 기술분야에 공지이다. 예를들어, 엔조 바이오케미칼 코오퍼레이션 바이오-브릿지 시스템은 변형되지 않은 3'-폴리-dT 꼬리를 DNA 프로브에 첨가하기 위하여 말단 데옥시뉴클레오티드 트란스페라제를 사용한다. 폴리 dT-꼬리 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성된 후 비오틴-변형된 폴리-A에 혼성된다. PCT 출원 84/03520 및 EPA124221은 DNA 혼성화 측정법을 기재하며, 그 측정법에서는:(1) 분석시료가 효소-표지된 올리고 뉴클레오티드에 상보하는 단일-스트란드 DNA 프로브에 아닐되며;(2) 그 결과의 꼬리달린 이중체는 효소-표지된 올리고뉴클레오티드에 혼성된다. EPA 204510은 분석시료 DNA가 폴리-dT 꼬리같은 꼬리를 가지는 프로브, 폴리-A 서열같은 프로브의 꼬리에 혼성하는 서열을 가지는 증폭스트란드와 접촉되고, 그것은 다수의 표지된 스트란드와 결합할 수 있는 내용의 DNA 혼성화 측정법을 기재한다. 특히 바람직한 기법은 먼저 혈청중의 표적 HCV서열의 대략 10,000배, 즉, ml당 대략 106서열까지의 증폭을 포함할 것이다. 이것은 예컨대, 사이끼등의 기법(Saiki et al.(1986))에 의해 이루어질 수 있다. 증폭된 서열(들)은 그다음에, 1987년 10월 15일에 출원되고, 본원 양수인에게 양도된, 그리고 본원에 참고문헌으로 삽입된 공동계류중의 U.S.출원 변리사 도킷번호 제 2300-0171에 기재된 혼성화 측정법을 사용하여 검출될 수 있다. 106/ml의 수준에서 서열을 검출해야 하는 이 혼성화 측정법은 단일스트란드의 분석시료 핵산과 결합하고, 또한 다수의 단일스트란드의 표지된 올리고뉴클레오티드에 결합하는 핵산 다량체를 활용한다.
표지된 폴리뉴클레오티드 프로브와 함께 사용될 수 있는 적당한 용액상 샌드위치 측정법, 및 프로브의 제조방법이 1987년 6월 16일 공개되고, 본원 양수인에게 양도된, 그리고 본원에 참고문헌으로 삽입된 EP0 225,807 에 기재된다.
프로브는 진단용 기트안에 포장될 수 있다. 진단용 기트는 표지될 수 있는 프로브 DNA를 포함하고; 또는 프로브 DNA는 표지되지 않을 수 있으며 표지화를 위한 성분이 키트에 포함될 수 있다. 키트는 또한 특별한 혼성화 프로토콜에 필요한 다른 적당한 포장된 시약 및 물질, 예컨대, 표준품, 뿐만 아니라 시험을 수행하기 위한 지시사항을 포함할 수 있다.
Ⅱ.I. 면역측정 및 진단용 키트
HCV 항체함유 혈청과 면역학적으로 반응하는 2가지 폴리펩티드, 예컨대 단원 IV.A.에 기재된 클론으로부터 유도된 것들 또는 그 클론내에 코드화된 것들, 및 그의 혼성물,(단원 IV.A.참조) 및 이들폴리펩티드의 HCV 특이적 에피토프에 대해 유발된 항체(예컨대 단원 IV.E.참조 )들은 예컨대 혈액 또는 혈청샘플을 포함하여 생물학적 샘플중의 HCV항체의 존재, 또는 바이러스 및/ 또는 바이러스 항원의 존재를 검출하기 위한 면역측정에 유용하다. 면역측정의 계획은 매우 많이 다양해질 수 있으며, 다양한 이들 방법은 기술분야에 공지이다. 예를들어, 면역측정법은 하나의 바이러스 항원, 예컨대, 단원 IV.A.에 기재된 HCV cDNA 함유 클론의 어느 하나로부터, 또는 이들 클론의 cDNA로부터 유도된 혼성 cDNA 로부터, 또는 이들 클론이 유도되는 HCV게놈으로부터 유도된 폴리펩티드를 사용하며;달리는 면역측정법은 이들 공급원으로부터 유도된 바이러스 항원의 조합을 사용할 수 있다. 그것은 예컨대, 바이러스 에피토프(들)에 대하여 지시된 단일클론성항체, 하나의 바이러스 항원을 향하여 지시된 단일클론성 항체의 조합, 상이한 항원에 대해 지시된 단일클론성 항체, 동일한 바이러스 항원에 대해 지시된 다중클론성 항체, 또는 상이한 바이러스 항원에 대해 지시된 다중클론성 항체를 사용할 수 있다. 프로토콜은 예를들어, 경합, 또는 직접반응, 또는 샌드위치형 측정법을 토대로 할 수 있다. 프로토콜은 또한, 예컨대 고체지지체를 사용할 수 있고 또는 면역침전법에 의한 것일 수 있다. 대부분의 측정법은 표지된 항체 또는 폴리펩티드의 사용을 포함하며;표지는 예를 들어 형광, 화학발광, 방사성, 또는 염료분자일 수 있다. 프로브로부터의 신호를 증폭시기는 측정법 또한 공지이다;그런 측정법의 실례는 비오틴과 아비딘을 활용하는 측정법, 및 ELISA측정법 같은 효소-표지 및 중개면역 면역측정법이다.
HCV에 대한 플래비바이러스 모델은 비리온 구조단백질에 대한 진단용 에피토프의 있음직한 위치로 간주되는 예측을 허용한다. C, pre-M,M, 및 E 도메인은 모두 바이러스 항원의 검출용, 특히 진단용으로 상당히 유력한 에피토프를 함유하는 것 같다. 유사하게, 비구조 단백질의 도메인은 중요한 진단적 에피토프(예컨대, 추정되는 폴리머라제를 코드화하는 N95; 및 추정되는 보체-결합항원을 코드화하는 NS1)를 함유하는 것으로 기대된다. 이들 특이적 도메인으로부터의 에피토프를 포함하는, 재조합 폴리펩티드, 또는 바이러스 폴리펩티드는 감염성 혈액수여자 및 감염된 환자에서 바이러스 항체의 검출에 유용할 수 있다. 더불어, E 및/또는 M 단백질에 대하여 지시된 항체는 HCV 유발 NANBH에 걸린 환자에서, 및 감염성 혈액 수여자에서 바이러스 항원의 검출을 위한 면역측정에 사용될 수 있다. 더욱이, 이들 항체는 분명히 급성단계 수여자 및 환자를 검출하는데 유용할 것이다.
면역진단에 적당하고 적절한 표지된 시약을 함유하고 있는 키트는 HCV 에피토프 또는 HCV 에피토프에 대한 항체를 함유하고 있는 발명의 폴리펩티드를 포함하여, 적합한 물질을 적당한 용기에, 측정지시의 적당한 세트뿐만 아니라 측정의 수행에 요구되는 나머지 시약 및 물질과 함께 포장함으로써 제조된다.
Ⅱ.J. cDNA 내지 바이러스 게놈으로부터 유도된 프로브를 사용한 HCV게놈, 비리온, 및 바이러스 항원의 추가의 특성확인
도 1 내지 도 32에 도시된 바와 같이 단원 Ⅳ.A.에 기재된 클론의 HCV cDNA 서열 정보는 HCV게놈의 서열에 대한 추가의 정보를 얻기 위해 및 HCV 병원체의 확인 및 단리에 사용될 수 있고, 그에 따라 게놈의 성질, 바이러스 입자의 구조, 및 그것이 구성하고 있는 항원의 성질을 포함하여 그의 특성확인에 도움을 줄 것이다. 이 정보는 계속해서, 추가의 폴리뉴클레오티드 프로브, HCV, 게놈으로부터 유도된 폴리펩티드, 및 HCV 유발된 NANBH의 진단 및/또는 치료에 유용하게 될 HCV 에피토프에 대한 항체를 유도할 수 있다.
상기 언급된 클론의 cDNA 서열정보는 그것으로부터 단원 IV.A.에 기재된 클론의 cDNA가 유도되는 HCV게놈(들)의 미확인 영역으로부터 유도되는 추가의 cDNA 서열의 단리에 대한 프로브의 고안에 유용하다. 예를들어, 도 1, 도 3, 도 6, 도 9, 도 14 및 도 32에 도시된 HCV cDNA 서열의 패밀리의 5'-말단 또는 3'-말단에 가까운 영역으로부터 유도된, 대략 8 또는 그이상의 뉴클레오티드, 및 바람직하게는 20 또는 그이상의 뉴클레오티드의 서열을 함유하는 표지된 프로브는 HCV cDNA 라이브러리로부터 중첩하는 cDNA 서열을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 상기 언급된 클론의 cDNA 와 중첩하지만, 상기 언급된 클론의 cDNA가 유도되지는 않는 게놈의 영역으로부터 유도된 서열을 또한 함유하는 이들 서열은 그런다음에, 단원 IV.A.에 기재된 클론의 cDNA 와 필수적으로 중첩하지 않는 다른 중첩하는 단편의 특성확인을 위한 프로브를 합성하기 위해 사용될 수 있다. HCV 게놈이 절편화되고 그 절편에 공통서열이 결핍되지 않는 한, 바이러스 게놈(들)로부터 유도된 중첩하는 cDNA의 단리 기법을 활용하여 완전한 바이러스 게놈(들)의 서열을 분석하는 것이 가능하다. 유사하지는 않지만, 만약 게놈이 공통서열이 부족한 절편화된 게놈이라면, 게놈의 서열은 클론 5-1-1을 단리하고 cDNA 단리물을 서열분석하여 그 단리된 cDNA를 중첩 단편을 단리하기 위해 사용한 바와같이, 단리에 대해 기재된 기법을 사용하여 람다-gtl1 HCV cDNA 라이브러리를 혈청학적으로 스크리닝하고 단원 IV.A.에 기재된 클론을 서열분석함으로써 측정될 수 있다. 다르게는, 게놈절편의 특성확인은 정제된 HCV 입자로부터 단리된 바이러스 게놈(들)로부터 알 수 있다. HCV 입자를 정제하고 정제 과정중에 그것들을 검출하는 방법은 본원의 이하에 기재된다. 바이러스 입자로부터 폴리뉴클레오티드 게놈을 단리하는 과정들은 기술분야에 공지이며, 사용될 수 있는 한가지 과정을 실시예 IV.A.1에 제시한다. 단리된 게놈절편은 그런다음 클론되고 서열분석될 수 있다. 그에 따라, 본원에 제공된 정보를 이용하여 그것의 본성과는 관계없이 HCV 게놈(들)을 클론하고 서열분석하는 것이 가능하다.
cDNA 라이브러리를 제조하는 방법은 기술분야에 공지이며, 상기 및 아래에서 논의된다; 람다-gtl1 에서 HCV cDNA 라이브러리를 제조하는 방법은 아래의 단원 IV.A.에서 논의된다. 그러나, 핵산 프로브를 이용하여 스크린하기에 유용한 cDNA 라이브러리는 또한 기술분야에 공지된 다른 벡터, 예를들면 람다-gtlO(Huynh et a1.(1985)) 에서 제조될 수 있다.
도 1 내지 도 32의 cDNA 로부터, 및 이들 cDNA 로부터 유도된 폴리뉴클레오티드로부터 합성된 프로브로부터 유도된 프로브에 의해 검출된 HCV 유도 cDNA는 적절한 제한효소(들)을 이용하여 단리된 폴리뉴클레오티드를 소화시킴으로써 클론으로부터 단리될 수 있고, 서열화 된다. 예를들어, 클론 5-1-1에서 HCV cDNA 와 중첩하는 HCV cDNA의 단리 및 서열분석에 사용된 기법에 대하여 단원 IV.A.3.과 IV.A.4.를, 클론 81의 그것과 중첩하는 HCV cDNA 의 단리 및 서열분석에 대해서는 단원 IV.A.5 내지 IV.A.7을, 그리고 클론 81과 중첩하는 또다른 클론(클론 36)과 중첩하는 클론의 단리 및 서열분석에 대해서는 단원 IV.A.8 과 IV.A.9 참조.
이들 중첩 HCV cDNA 로부터 유도된 서열정보는 바이러스 게놈(들)내의 동종성 및 이종성 영역을 측정하기에 유용하며, 그것은 게놈의 상이한 주, 및/ 또는 결핍입자의 집단의 존재를 가리킬 것이다. 그것은 또한, 단원 Ⅱ.G. 에 기재된 기법을 활용하여, 생물학적 샘플중의 HCV 또는 HCV 항원 또는 HCV 핵산을 검출하기 위한 혼성화 프로브의 고안, 및 HCV의 단리중에 (아래에서 논의됨) 유용하다. 더욱이, 중칩 cDNA 는 클론 5-1-1,36,81,91 및 1-2에 코드화된, 및 단원 IV.A.에 기재된 다른 클론에 코드화된 폴리펩티드를 또한 코드화하는 HCV 게놈(들)로부터 유도된 폴리펩티드에 대한 발현벡터를 제조하기 위해 사용될 수 있다. HCV 에피토프를 함유하는 이들 폴리펩티드의 제조에 대한, 및 그것들내에 함유된 HCV 에피토프에 대한 항체에 대한 기법과, 뿐만 아니라 그것들의 이용은 상기 및 아래에서 논의된 클론 5-1-1,32,35,36,1-2,81, 및 91 내에 함유된 NANBV cDNA 서열로부터 유도된 폴리펩티드에 대해 기재된 것들과 유사하다.
단원 IV.A.에 기재된 클론 5-1-1,32,35,36,81,91,1-2 및 다른 클론내에 함유된 cDNA 서열의 패밀리내에는 HCV 에 유일한 것으로 여겨지는 에피토프를 함유하는 항원(들)이 코드화된다; 즉, 이들 항원에 대한 항체는 HAV 또는 HBV에 감염된 환자에게는 없으며, HCV 로 감염되지 않은 개체에게도 없다(단원 IV.B.에 표시된 혈청학적 데이터참조). 더욱이, 이들 cDNA 의 서열정보와 HAV, HBV, HDV의 서열과, 및 유전자은행의 게놈서열과의 비교는 이들 cDNA와 그런 공급원의 폴리뉴클레오티드 서열간에 최소한의 동종성이 존재함을 의미한다. 그러므로, 이들 클론의 cDNA 내에 코드화된 항원에 대한 항체는 감염된 개체로부터 단리된 BB-NANBV 입자의 확인에 사용될 수 있다. 더불어, 그것들은 또한 NANBH 병원체(들)의 단리에 유용하다.
HCV 입자는 BB-NANBV 감염된 개체로부터의 혈청으로부터 또는 세포 배양액으로부터 예를들어 침강 또는 축출방법같은 크기 구분을 토대로 하는 기법, 또는 밀도구배의 초원심분리같은 밀도, 또는 폴리에틸렌글리콜 같은 제제를 이용한 침전을 토대로 한 기법, 또는 음이온 또는 양이온 교환물질, 및 소수성에 의하여 결합하는
물질같은 다양한 물질상에서의 크로마토그래피, 뿐만아니라 친화성 컬럼을 포함하여 기술분야에 공지된 방법중의 어느 하나에 의하여 단리될 수 있다. 단리 과정중에 HCV의 존재는 상기 기재된 HCV cDNA 로부터 유도된 프로브를 사용하여 추출된 게놈의 혼성화 분석에 의하여, 또는 프로브로서 도 1 내지 도 32에 도시된 cDNA 서열의 패밀리내에 코드화된 HCV 항원에 대한, 및 또한 상기 논의된 중첩 HCV cDNA 서열내에 코드화된 HCV 항원에 대해서도 지시된 항체를 활용하여 면역측정법에 의하여 (단원 Ⅱ.I. 참조) 검출될 수 있다. 항체는 단일클론성, 또는 다중클론성일 수 있으며, 면역측정에 사용하기 전에 항체를 정제하는 것이 바람직한 것이다. 클론 5-1-1내에 코드화된 항원(들)에 대한 다중클론성 항체에 대한 정제과정은 단원 IV.E.에 기재된다; 유사한 정제과정이 다른 HCV 항원에 대한 항체에 대해 활용될 수 있다.
도 1 내지 도 32에 도시된 cDNA 의 패밀리내에 코드화된 HCV 항원, 뿐만아니라 중첩 HCV cDNA 내에 코드화된 것들에 대한, 고체지지체에 부착되는 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의한 HCV의 단리에 유용하다. 면역친화성 크로마토그래피에 대한 기법은 기술분야에 공지이며, 고체 지지체에 항체를 부착시켜 항체가 자신의 면역선택적 활성을 보유하도록 하는 기법을 포함하며;그 기법은 항체가 지지체에 흡착되는 그런 기법(예를들어, Kurstak in ENZYME IMMUNODIAGNOSIS, p31-37 참조), 뿐만아니라 항체가 지지체에 공유 연결되는 그런 것일 수 있다. 일반적으로 기법은 단원 Ⅱ.C. 에 일반적으로 기재된, 고체지지체에의 항원의 공유연결에 대해 사용된 것과 유사하다; 그러나, 스페이서 기가 이중기능성 커플링제에 포함되어서 항체의 항원결합 부위가 접근하기 쉬운 상태로 남아있을 수 있다.
정제과정중의 HCV의 존재는 프로브로서 도 1-내지 도 32에 도시된 HCV cDNA 서열의 패밀리로부터, 뿐만 아니라 상기 기재된 중칩 HCV cDNA 서열로부터 유도된 폴리뉴클레오티드를 활용하여 핵산 혼성화에 의해 검출 및/ 또는 증명될 수 있다. 이 경우에, 분휙은 바이러스 입자의 파괴를 유발하는 조건하에, 예를들어 착화제의 존재하에 세제를 이용하여 처리되고, 바이러스 핵산의 존재는 단원 Ⅱ.H. 에 기재된 혼성화 기법에 의하여 측정된다. 단리된 입자가 HCV를 유발하는 병원체라는 추가의 확증은 침팬지를 단리된 바이러스 입자로 감염시킨 후, 감염으로부터 NANBH의 증상이 유발되는지를 측정함으로써 얻어질 수 있다.
정제된 제제로부터의 바이러스 입자는 그런다음 특성확인이 될 수 있다. 게놈핵산은 정제되어 있다. DNase I이 아니라, RNase에 대한 그것의 민감성을 토대로, 바이러스가 RNA 게놈으로 구성되는 것으로 나타난다. 아래의 실시예 IV.C.2 참조. 꼬임도 및 고리성 또는 비-고리성은 예를들어 전자현미경에 의한 육안화, 밀도 구배에서의 이동, 및 침강 특징을 포함하여 기술분야에 공지된 기법에 의하여 측정될 수 있다. HCV cDNA의 네가티브 스트란드에의 포획된 HCV게놈의 혼성화를 토대로, HCV 가 포지티브 스트란드의 RNA게놈으로 구성되었을 것으로 여겨진다(단원IV.H.1 참조). 이런 기법은 예를들어 METHODS IN ENZYMOLOGY에 기재된다. 더불어, 정제된 핵산은 게놈물질이 RNA이므로 역전사를 포함하여, 공지기법에 의해 클론 및 서열분석될 수 있다. 예를들어 마니아티스(1982), 및 글로버(1985)참조. 바이러스 입자로부터 유도된 핵산을 활용하여 그것이 절편화되어 있는지에 관계없이 전체 게놈의 서열분석이 가능하다.
조합된 클론 14i에서 39c(도 26참조) 의 연속 0RF내에 코드화된 폴리펩티드의 동종성의 조사는 HCV 폴리펩티드가 플래비바이러스의 보존된 영역에 해당하는 단백질과 동종성의 영역을 함유하는 것을 나타낸다. 이것의 실시예는 단원 IV.H.3에 기재한다. 이 발견은 많은 중요한 결과를 낳는다. 첫째, HCV 가 그 크기가 대략 10,000 뉴클레오티드인 포지티브 스트란드의 게놈을 함유하는 것을 보여주는 결과와의 조합에서, 이 증거는 HCV 가 플래비바이러스거나, 또는 플래비-계 바이러스라는 착상과 일치한다. 일반적으로 플래비바이러스 비리온과 그의 게놈은 상대적으로 양립하는 구조와 조직을 가지며, 그것은 공지이다.(Rice et al.(1986), 및 Brinton, M.A.(1988)참조.) 그에 따라 폴리펩티드 C, pre-M/M 및 E를 코드화하는 구조유전자는 클론 14i의 위쪽 게놈의 5'-말단에 위치할 수 있다. 더욱이, 다른 플래비바이러스와의 비교를 사용하여 이들 단백질을 코드화하는 서열의 정확한 위치에 관한 예견도 만들어 질 수 있다.
클론 14i에 있는 것의 위쪽 서열의 단리는 기술분야에 숙련된 사람에게 명백할, 본원에 제공된 정보인 많은 방법으로 이루어질 수 있다. 예를들어, 게놈 워킹(Walking)기법은 클론 14i에서 5'이지만, 그 클론과 중첩하는 다른 서열을 단리하기 위해 사용될 수 있다; 이것은 계속해서 추가의 서열의 단리를 유도한다. 이 기법은 아래의 단원 IV.A.에서 충분히 증명되었다. 예를들어, 또한, 플래비바이러스는 에피토프와 보존된 핵산서열의 영역을 보존하는 것으로 공지된다. 보존된 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드는 HCV 게놈과 결합하는 프로브로서 사용될 수 있고, 그로써 그의 단리가 허용된다. 더불어, 이들 보조된 서열은, 도 22에 도시된 HCV cDNA 로부터 유도된 것들과 조합하여, 중합효소 사슬반응기술을 사용하여, 클론 14i에 있는 것들의 위쪽 게놈서열을 증폭하는 시스템에서 사용하기 위한 프라이머 고안에 사용될 수 있다. 이것의 실시예는 아래에 기재된다.
HCV의 구조는 또한 측정될 수 있고 그의 성분도 단리될 수 있다. 현태학 및 크기는 예를들어 전자현미경으로 측정될 수 있다. 외투 또는 엔벨로프 항원같은 특이적 바이러스 폴리펩티드 항원, 또는 핵산결합 단백질, 코아항원, 및 폴리뉴클레오티드 중합효소(들) 같은 내부항원의 특성확인 및 정위는 또한 프로브로서 단리된 cDNA 내에 코드화된 특이적 항원에 대한 항체를 활용함에 의해서 뿐만 아니라 예를들어, 주된 또는 소수의 바이러스 성분으로서의 항원의 존재여부를 측정함으로써측정될 수 있다. 이 정보는 백신의 고안에 유용하다;예를들어, 백신제조시에 외부 항원을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 다가 백신은 예컨대, 게놈의 또다른 부분으로부터의 폴리펩티드, 예를들면 비구조 또는 구조 폴리펩티드 뿐만 아니라 구조 단백질, 예컨대 E를 코드화하는 게놈으로부터 유도된 폴리펩티드로 구성될 수 있다.
Ⅱ. K. HCV 복제를 위한 세포배양시스템 및 동물모델시스템
HCV가 플래비바이러스 또는 플래비-계 바이러스라는 제안은 또한 HCV 성장 방법에 대한 정보를 제공한다. 용어 플래비-계'' 는 바이러스가 플래비바이러스의 공지된 보존영역에 상당량의 동종성을 보이며 대부분의 게놈이 단일한 ORF인 것을 의미한다. 플래비바이러스의 배양방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이다(예를들어 Brinton(1986)과 Stollar,V.(1980)의 문헌 참조). 일반적으로, HCV 배양에 적당한 세포 또는 셀라인은 플래비바이러스 복제를 지지하는 것으로 공지된 것들을 포함할 수 있으며, 예를들면 다음과 같다: 원숭이 신장 셀라인(예컨대 MK2,VERO);돼지의 신장셀라인(예컨대 PS);어린 햄스터 신장 셀라인(예컨대 BHK);쥐과의 대식세포 셀라인(예컨대 P388D1, MK1, Mm1); 사람 대식세포 셀라인(예컨대 U-937);사람 말초혈 백헐구;사람 고착성 단세포;간세포 또는 간세포 셀라인(예컨대 HUH7, HEPG2);배(embryo) 또는 배세포(예컨대, 닭의 배섬유아세포);또는 무척추동물, 바람직하게는 곤충으로부터 (예컨대 (드로소필라 셀라인), 보다 바람직하게는 절지동물로부터 유도된 셀라인, 예를들면 모스키토 셀라인 (예컨대, A.AlbopictLls, Aedes aegypti, Cutex tritaeniorhynchus)또는 진드기 셀라인(예컨대 RML-14 Dermacentor parumapertus).
기본 간세포는 배양될 수 있고, 그런다음 HCV로 감염될 수 있다는 것이 가능하다;또는 다르게는, 간세포 배양액은 감염된 개체(예컨대 사람 또는 침팬지)로부터 유도될 수 있을 것이다. 후자의 경우는 체내감염되고 시험관내 계대되는 세포의 실례이다. 더불어 각종 불멸화 방법이 간세포 배양액으로부터 유도된 셀라인을 얻기 위해 사용될 수 있다. 예를들어, 일차 간배양액(간세포 집단의 풍부화 전 및 후)이 안정성을 유지하기 위해 각종 세포에 융합될 수 있다. 예를들어, 또한 배양액은 형질전환용 바이러스로 감염될 수 있고, 또는 영구적인 또는 반영구적인 셀라인을 만들기 위하여 형질전환용 유전자로 형질전환될 수 있다. 더불어, 예를들면, 간배양액중의 세포는 셀라인(예컨대 HepG2)을 수립하기 위해 융합될 수 있다. 세포 융합에 대한 방법은 기술분야에 공지이며, 예를들면 폴리에틸렌글리클, 센다이 바이러스, 엡스타인-바르바이러스같은 융합제의 사용을 포함한다.
상기 논의된 바와같이, HCV는 플래비바이러스 또는 플래비-계 바이러스이다. 그러므로, 셀라인의 HCV감염이 플래비바이러스를 이용하여 세포를 감염시기는데 대하여 기술분야에 공지된 기법에 의하여 이루어질 수 있음이 가능하다. 이들은 예를들어 세포안으로의 바이러스의 출입을 허용하는 조건하에서 바이러스 제제와 함께 세포를 배양하는 것을 포함한다. 더불어, 단리된 바이러스 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질전환시킴으로써 바이러스 생성을 얻는 것도 가능할 것이다. 토가바이러스와 플래비바이러스 RNA가 다양한 척추동물 셀라인(Pfefferkorn and Shapiro(1974))과, 모스키토 셀라인(Peleg(1969))에서 감염성이라는 것이 공지이다. RNA 이중체, 포지티브 스트란드의 RNA, 및 DNA(cDNA 를 포함하여)로 조직배양세포를 형질전환시키는 방법은 기술분야에 공지이며, 예를들어 일렉트로포레이션을 사용하는 기법, 및 DEAE-덱스트란 또는 인산칼슘을 이용한 침전법을 포함한다. HCV RNA의 풍부한 공급원은 완전한 게놈에 해당하는 HCV cDNA 의 시험관내 전사를 수행함으로써 얻어질 수 있다. 이 물질로, 또는 클론된 HCV cDNA로의 형질전환은 바이러스 복제와 바이러스의 시험관내 증식을 유발하여야 한다.
배양된 세포에 더불어, 동물모델시스템은 바이러스 복제에 사용될 수 있다;동물시스템중의 플래비바이러스는 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이다(예를들어 Monath(1986) 문헌참조). 그러므로, HCV 복제는 침팬지에서 뿐만 아니라, 예컨대 명주원숭이와 태생마우스에서도 일어날 수 있다.
Ⅱ.L. HCV 에 대한 항-바이러스제에 대한 스크리닝
HCV에 대한 세포배양 및 동물모델시스템의 활용성은 또한 HCV 복제를 저해하는 항-바이러스제, 및 특히 바이러스 복제를 저해하는 한편으로 세포성장과 증식을 우선적으로 허용하는 그런 제제에 대한 스크리닝을 가능하게 한다. 이들 스크리닝 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이다. 일반적으로, 항바이러스제는 다양한 농도에서, 바이러스 복제를 지지하는 세포배양시스템에서 바이러스 복제를 방지하는데 미치는 효과에 대하여, 그런 다음에는 동물모델시스템에서 바이러스 병원성의 또는 감염성의 저해(및 저수준의 독성)에 대하여 시험된다.
HCV 항원과 HCV 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위해 본원에 제공된 방법 및 조성물은 그것들이 바이러스 복제에 미치는 제제의 효과를 검출함에 있어서 다른 그리고 세포플라크 측정 또는 ID50측정보다 아마도 더 민감한 수단을 제공한다는 점에서 항 바이러스제의 스크리닝에 유용하다. 예를들어, 본원에 기재된 HCV-폴리뉴클레오티드 프로브는 세포배양중에 생성된 바이러스 핵산의 양을 정량하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 예를들어, 감염된 세포핵산과 표지된 HCV-폴리뉴클레오티드 프로브와의 혼성화 또는 경합 혼성화에 의해 이루어질 수 있을 것이다. 예를들어, 또한, 항-HCV항체는 본원에 기재된 면역측정법을 활용하여 세포배양액중의 HCV 항원(들)을 확인하고 정량하기 위해 사용될 수 있다. 더불어, 경합측정에 의하여 감염된 세포배양액중의 HCV항원을 정량하는 것이 바람직할 것이므로, 본원에 기재된 HCV cDNA내에 코드화된 폴리펩티드는 이들 경합측정에 유용하다. 일반적으로, HCV cDNA로부터 유도된 재조합 HCV 폴리펩티드가 표지될 수 있으며, 세포배양 시스템에서 생성된 항원에 의거한 HCV 폴리펩티드에 대한 이 표지된 폴리펩티드의 결합의 저해가 모니터될 수 있을 것이다. 더욱이, 이들 기법은 HCV 가 세포의 파괴를 유발함이 없이 셀라인에서 복제할 수 있는 경우에 특히 유용하다.
Ⅱ. M. HCV의 감쇠된 균주의 제조
상기한 것에 더불어, 조직배양시스템 및/또는 동물모델시스템을 활용하여, HCV의 감쇠된 균주를 단리하는 것이 가능할 것이다. 이들 균주는 백신에, 또는 바이러스 항원의 단리에 적당할 것이다. 감쇠된 균주는 세포배양 및/ 또는 동물모델에서 다중 계대후에 단리가능하다. 감염된 세포 또는 개체에서 감소된 균주의 검출은기술분야에 공지된 기법에 의하여 이루어질 수 있으며, 예를들어 프로브로서 HCV에 코드화된 하나 또는 그이상의 에피토프에 대한 항체의 사용 또는 프로브로서 적어도 약 8뉴클레오티드의 HCV서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 달리는, 또는 더불어, 감쇠된 균주는 본원에 제공된 HCV의 게놈정보를 활용하여, 및 재조합 기법을 활용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 예를들어 병원성에 관련된, 그러나 바이러스 복제를 허용하는 폴리펩티드를 코드화하는 게놈의 영역을 삭제하려는 시도가 행해질 수 있다. 더불어, 게놈제조는 HCV에 대한 중화항체를 유발하는 에피토프의 발현을 허용할 것이다. 반경된 게놈은 그런다음 HCV 복제를 허용하는 세포를 형질전환하기 위해 활용될 수 있을 것이며, 그 세포는 바이러스 복제를 허용하는 조건하에서 성장된다. 감쇠된 HCV 균주는 백신 목적용으로 뿐만 아니라, 바이러스 항원의 상업적 제조를 위한 공급원으로서도 유용하다. 왜냐하면, 이들 바이러스의 가공처리가 바이러스 생성 및/또는 바이러스 생성물의 제조에 포함된 사용물에 대하여 보다 긴측성이 적은 보호수단을 필요로 할 것이기 때문이다.
Ⅲ. 일반적 방법
바이러스로부터 게놈을 추출하고, cDNA 라이브러리를 제조 및 프로브하며, 클론을 서열분석하고, 발현벡터를 제조하며, 세포를 형질전환시키고, 방사선 면역 측정 및 ELISA 측정같은 면역학적 측정을 배양중의 성장 세포에 대하여 수행하는 등에 사용된 일반적 기법은 기술분야에 공지이며 이들 기법을 설명해주는 실험실 편람이 구입가능하다. 그러나, 일반적인 지침으로서, 다음에 그러한 과정, 및 그것들을 수행하는데 유용한 물질에 대하여 현재 활용가능한 몇가지 공급원을 설명한다.
Ⅲ.A. 숙주 및 발현제어서열
원핵 및 진핵 숙주세포 두가지가 모두 표시된 숙주와 부합하는 적절한 제어 서열이 사용되는 경우 소정 코딩서열의 발현에 사용될 수 있다. 원핵 숙주중에서, 대장균이 가장 빈번히 사용된다. 원핵세포에 대한 발현제어 서열로는 임의로 작동 유전자 부분을 함유하는 촉진유전자, 및 리보좀 결합부위가 있다. 원핵 숙주와 부합하는 전달 벡터는 통상, 예를들어 암피실린과 테트리사이클린 내성을 부여하는 오페론을 함유하고 있는 플라스미드인 pBR322와, 또한 항생물질 내성 마커들을 부여하는 서열을 함유하는 각종 pUC벡터로부터 유도된다. 이들 마커는 선택에 의하여 성공적인 형질전환체를 얻기 위하여 사용될 수 있다. 통상 사용되는 원핵세포 제어 서열로는 베타-락타마제(페니실리나제) 및 락토스 촉진유전자 시스템(Chang et al.(1977)), 트립토판(trp) 촉진유전자시스템(Goeddel et al.(1980))및 람다-유도된 PL촉진유전자 및 N유전자 리보좀 결합부위(Shimatake et a1.(1981)) 및 trp 및 1ac UV5 촉진유전자 서열로부터 유도된 혼성 tac 촉진유전자(De Boer et al.(1983))가 있다. 전술한 시스템은 특히 대장균과 부합한다;만약 원한다면, 바실루스 또는 슈도모나스의 균주같은 다른 원핵숙주가 해당하는 제어서열과 함께 사용될 수 있다.
진핵숙주로는 배양시스템중의 효모 및 포유류 세포가 있다. 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae) 및 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis)가 가장 통상적으로 사용되는 효소숙주이며, 편리한 진균류 숙주이다. 효모부합 벡터는 영양요구 돌연변이주에 원양양성을 또는 야생형 균주에 대하여 중금속에 대한 내성을 부여함으로써 성공적인 형질전환체의 선택을 허용하는 마커를 운반한다. 효모부합 벡터는 2미크론 복제기원(Broach et al.(1983)), CEN3 와 ARS1의 조합 또는, 적절한 단편의 숙주세포게놈으로의 통합을 유발할 서열같은, 복제를 확실히 하기 위한 다른 수단을 사용할 수 있다. 효모벡터에 대한 제어서열은 기술분야에 공지이며 3포스포글리세레이트키나제에 대한 촉진유전자(Hitzeman(1980))를 포함하며, 해당계 효소의 합성에 대한 촉진유전자들(Hess et al.(1968);Holland et al.(1978))이 있다. 에놀라제 유전자로부터 유도된 것들 같은 종결유전자가 또한 포함될 수 있다(Holland(1981)). 특히 유용한 제어시스템은 글리세르 알데히드-3 포스페이트 데히드로게나제(GAPDH) 촉진유전자 또는 알코올 데히드로게나제(ADH) 조절가능한 촉진유전자, 또한 GAPDH로부터 유도된 종결유전자, 및 만약 분비되는 것을 원한다면 효모알파 인자로부터의 리더서열을 포함하는 것들이다. 더불어, 작동가능하게 연결되는 전사조절영역 및 전사개시영역은 그것들이 야생형 유기체에 자연적으로 관련되지 않은 그런 것일 수 있다. 이들 시스템은 1984년 10월 3일 공개된 EPO 120,551, 1984년 8월 22일 공개된 EPO 116,201;및 1985년 12월 18일 공개된 EPO 164,556에 상세하게 설명되고, 이들 모두는 본원 양수인에게 양도되었으며, 본원에 참고로 삽입된다.
발현을 위한 숙주로서 활용가능한 포유류 셀라인은 기술분야에 공지이며, HeLa세포, 차이니즈 햄스터 오바리(CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장(BMK) 세포, 및 많은 다른 셀라인을 포함하여 아메리칸 타입컬춰콜렉션(ATCC)으로부터 구입가능한 많은 불멸화된 셀라인을 포함한다. 포유류 세포에 적당한 촉진유전자 또한 기술분야에 공지이며 시미안 바이러스 40(SV40)(Fiers(1978)), 로우스 사르코마 바이러스(RSV), 아데노 바이러스(ADV), 및 소의 파필로마 바이러스(BPV) 로부터의 그것과 같은 바이러스 촉진유전자를 포함한다. 포유류 세포는 또한 종결유전자 서열과 폴리 A 첨가서열을 필요로 할 수 있다; 발현을 증가시기는 인핸서 서열이 또한 포함될 수 있으며, 유전자의 증폭을 유발하는 서열 또한 바람직할 것이다. 이들 서열은 기술분야에 공지이다. 포유류 세포에서 복제에 적당한 벡터는 바이러스 레플리콘, 또는 NANBV 에괴토프를 코드화하는 적절한 서열의 숙주게놈에의 통합을 확실하게 하는 서열을 포함할 수 있다.
Ⅲ.B. 형질전환
형질전환은 예를들어, 폴리뉴클레오티드를 바이러스에 포장하고 숙주세포를 그 바이러스로 형질전환하는 것을 포함하여, 숙주세포에 폴리뉴클레오티드를 도입시키기 위한 어떠한 공지방법에 의하여, 그리고 폴리뉴클례오티드의 직접 흡수에 의하여 이루어질수 있다. 형질전환 과정은 형질전환하고자 하는 숙주에 따라 좌우된다. 예를들어, BB-NANBW서열함유 람다-gt11을 이용한 대장균 숙주세포의 형질전환은 아래의 실시예 단원에서 논의된다. 직접 흡수에 의한 박테리아의 형질전환은 일반적으로 염화칼슘 또는 염화 루비듐으로 처리하는 것을 이용한다(Cohen(1972);Maniatis(1982)). 직접 흡수에 의한 효모 형질전환은 히넨등의 방법(1978)을 사용하여 수행될 수 있다. 직접 흡수에 의한 포유류 형질전환은 그라함과 반데르 에브의 인산칼슘 침전법(1978), 또는 그의 각종 공지변용법을 사용하여 수행될 수 있다.
Ⅲ.C. 벡터제조
벡터제조는 기술분야에 공지된 기법을 사용한다. 부위-특이적 DNA 절단은 적당한 제한효소를 이용한, 일반적으로 이들 상업적으로 구입이 쉬운 효소의 제조업자에 의해 특정화된 조건하에서의 처리에 의하여 수행된다. 일반적으로, 약 1마이크로그램의 플라스미드 또는 DNA서열이 1유니트의 효소에 의해 약 20 마이크로리터의 완충용액중에서 1 내지 2시간의 37℃에서의 항온반응에 의해 절단된다. 제한 효소와의 항온반응 후에, 단백질은 페놀/클로로포름 추출에 의해 제거되고 DNA는 에탄올을 이용한 침전에 의해 회수된다. 절단된 단편은 Methods in Enzymology(1980) 65:499-560에 제시된 일반 과정에 따라 폴리아크릴아미드 또는 아가로스겔 전기영동기법을 사용하여 분리될 수 있다. 스티기 끝(sticky end)의 절단단편은 혼합물에 존재하는 적절한 데옥시뉴클레오티드 트피포스페이트(dNTP)의 존재하에 대장균 DNA 중합효소 I(Klenow)을 사용하여 블런트 끝(blunt end)으로 될 수 있다. S1 뉴클레아제로의 처리 또한 사용될 수 있고, 그것은 어떠한 단일 스트란드 DNA부분의 가수분해를 유발한다.
연결은 표준 완충액과 온도조건을 사용하여 T4 DNA 연결효소 및 ATP를 사용하여 수행된다; 스티기 끝 연결은 블런트 끝 연결보다 더 적은 ATP와 연결효소를 필요로 한다. 벡터단편이 연결혼합물의 부분으로서 사용되는 경우에, 벡터 단편은 자주 박테리아의 알칼리 포스파다제(BAP) 또는 소의 장내 알칼리 포스파타제로 처리되어 5'-포스페이트가 제거되고 그로써 벡터의 재연결이 방지된다;달리는, 원하지 않는 단편의 제한효소 소화가 연결을 방지하기 위해 사용될 수 있다.
연결혼합물은 대장균같은 적당한 클로닝 숙주에 형질전환되고, 성공적인 형질전환체는 예컨대, 항생물질 내성에 의해 선택되며, 정확한 제조에 대해 스크린된다.
Ⅲ.D. 소정 DNA서열의 제조
합성 올리고뉴클레오티드는 워너에 의해 기재된 바(1984)와 같은 자동 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 제조될 수 있다. 원한다면 합성 스트란드는32P-ATP의 존재하에, 반응을 위한 표준조 조건을 사용하여 폴리뉴클레오티드 키나제로 처리함으로써32P로 표지될 수 있다.
cDNA 라이브러리로부터 단리된 것들을 포함하여 DNA서열은, 예컨대 졸러에 의해 기재된 바(1982)와 같은 부위특정 돌연변이생성을 포함한 공지기법에 의하여 변형될 수 있다. 간단히 말하면, 변형하고자 하는 DNA는 단일 스트란드의 서열로서 파지 안에 포장되고, 프라이머로서, 변형하고자 하는 DNA의 부분에 상보하고 그 자신의 서열에 소정의 변형을 포함하고 있는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 DNA중합효소로 이중 스트란드로 전환된다. 그 결과의 이중 스트란드 DNA는 파지를지지하는 숙주 박테리아안에 형질전환된다. 파지의 각 스트란드의 복제를 함유하는, 형질 전환된 박테리아의 배양액은 아가에 놓여져 플라크가 얻어진다. 이론적으로는, 새로운 플라크의 50%가 돌연변이된 서열을 가지는 파지를 함유하며, 나머지 50%는 원래의 서열을 갖는다. 플라크의 복제물은 미변형된 서열과는 혼성되지 않고, 정확한 스트란드와의 혼성화를 허용하는 온도 및 조건에서 표지된 합성 프로브에 혼성된다. 혼성화에 의해 확인되는 서열이 회수되고 클론된다.
Ⅲ. E. 프로브와의 혼성화
DNA 라이브러리는 그룬스타인과 호그니스의 과정(1975)을 사용하여 프로브될 수 있다. 간단히 말하면, 이 과정으로, 프로브하고자 하는 DNA는 니트로셀룰로스 필터상에서 불멸화되며, 변성되고, 0-50% 포름아미드, 0.75M NaC1, 75mM 시트르산 나트륨, 각 0.02%(중량/ 부피) 의 우혈청 알부민, 폴리비닐 피롤리돈, 및 피콜을 함유하는 완충액, 50mM 인산나트륨(pH6.5), 0.1% SDS 및 100μg/ml의 담체 변성된 DNA로 예비혼성된다. 완층액종의 포름아미드의 백분율과, 예비혼성화의 시간 및 온도조건, 그리고 혼성화 단계들은 요구되는 긴축성에 따라 좌우된다. 더 낮은 긴축성 조건을 필요로 하는 올리고머 프로브에는 일반적으로 낮은 백분율의 포름아미드, 보다 낮은 온도, 및 보다 긴 혼성화 시간이 소요된다. cDNA 또는 게놈서열로부터 유도된 것들과 같은 30 또는 40 뉴클레오티드 이상을 함유하는 프로브는 일반적으로 더 높은 온도, 예컨대 약 40-42℃, 및 높은 백분율, 예컨대, 50% 의 포름아미드를 사용한다. 예비혼성화에 이어서, 5'-32P-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 완충액에 첨가되고, 필터가 이 혼합물중에서 혼성화 조건하에 배양된다. 세척후, 처리된 필터에 대해서, 혼성된 프로브의 위치를 나타내기 위하여 자동방사선 사진이 찍혀진다;원래의 아가 플레이트상의 해당하는 위치의 DNA가 소정 DNA의 공급원으로서 사용된다.
Ⅲ.F. 제조 및 서열분석의 증명
기본벡터 제조를 위하여, 연결 혼합물이 대장균 균주 HB1이 또는 다른 적당한 숙주에 형질전환되고, 성공적인 형질전환체가 항생물질내성 또는 다른 마커에 의해 선택된다. 그런 다음 형질전환체로부터 플라스미드가 클레웰등의 방법(1969)에 따라 제조되고, 통상 클로르암페니콜 증폭이 뒤따른다(Clewel1(1972)). DNA는 단리되고, 통상적으로 제한효소분석 및/또는 서열화에 의해 분석된다. 서열화는 상거등의 디데옥시방법(1977)과 추가로 메싱등에 의해 서술된 방법(1981)에 의해, 또는 맥삼등의 방법(1980)에 의해 이루어질 수 있다. 때로 GC-풍부영역에서 관찰되는 밴드축소의 문제점은 바르등(1986)에 따라 T-데아조구아노신의 사용에 의해 극복되었다.
Ⅲ. G. 효소결합 면역흡측 측정법
효소-결합 면역흡착 측정법(ELISA) 은 항원 또는 항체 두가지의 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 항원 또는 항체중 어느 하나에의 효소의 포합에 좌우되고, 정량표지로서 결합된 효소활성을 사용한다. 항체를 측정하기 위해서는, 공지항원이 고체상(예컨대 마이크로플레이트 또는 플라스틱컵)에 고정되고, 시험헐청 희석액과 배양되며 세척한 후, 효소로 표지된 항-면역글로불린과 함께 배양된 후 다시 세척된다. 표지화에 적당한 효소는 기술분야에 공지이며, 예를들어, 양고추냉이 과산화효소를 포함한다. 고체상에 결합된 효소활성은 특이한 기질을 첨가하고, 생성물 형성 또는 기질활용도를 비색계로 측정함으로써 측정된다. 결합된 효소활성은 결합된 항체의 양의 직접 함수이다.
항원을 측정하기 위하여서는, 공지된 특이적 항체가 고체상에 고정되고, 항원 함유 시험물질이 첨가되어 고체상이 배양된 후에 세척되며, 제 2효소-표지항체가 첨가된다. 세척후에, 기질이 첨가되고, 항원농도에 관련된 효소활성이 비색계로 평가된다.
(산업상의 응용성)
본원에 개시된 다양한 표현으로, 발명은 많은 산업적용도를 가지며, 그중 몇가지는 다음과 같다. HCV cDNA는 샘플중의 HCV 핵산의 검출용 프로브의 고안을 위해 사용될 수 있다. cDNA로부터 유도된 프로브는 예를들어 화학적 합성반응에서 HCV 핵산을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 그것들은 또한 세포배양시스템과, 동물모델시스템에서 바이러스 복제를 저해하는 제제의 효과를 측정하기 위한, 항- 바이러스제에 대한 프로그램을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. HCV 폴리뉴클레오티드프로브는 또한 사람에서 바이러스 핵산을 검출하는데 유용하며, 그에 따라 사람에서 HCV 감염의 진단에 대한 기초로서 작용할 수 있다.
상기한 것에 더불어, 본원에 제공된 cDNA는 HCV의 에피토프를 함유하고 있는 폴리팹티드를 합성하기 위한 정보 및 수단을 제공한다. 이들 폴리팹티드는 HCV항원에 대한 항체의 검출에 유용하다. HCV 감염에 대한 일련의 면역측정법은 본원에 기재된 HCV에피토프를 함유하고 있는 재조합 폴리펩티드를 토대로 하고, HCV 유도된 NANBH의 진단, HCV-유발된 감염성 간염에 대한 헐액 뱅크수여자의 스크리닝에, 또한 감염성 혈액수여자로부터의 오염된 헐액을 검출하는데 상업적으로 이용될 수 있다. 바이러스 항원은 또한 동물모델시스템에서 항- 바이러스제의 효력을 모니터하는데 활용될 것이다. 더불어, 본원에 개시된 HCV cDNA로부터 유도된 폴리팹티드는 HCV감염의 치료를 위한 백신으로서도 활용될 것이다.
상기 설명된 용도외에, HCV cDNA로부터 유도된 폴리펩티드는 또한, 항-HCV 항체 유발에도 유용하다. 그러므로, 그것들은 항-HCV백신에 사용될 수 있다. 그러나, HCV 폴리펩티드로의 면역감작의 결과로서 생성된 항체는 또한 샘플중의 바이러스항원의 존재를 검출하는데도 유용하다. 그러므로, 그것들은 화학적 시스템에서 HCV폴리팹티드의 생성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 항-HCV항체는 또한 항- 바이러스제가 조직배양시스템에서 시험되는 그런 스크리닝 프로그램에서 이들 제제의 효력을 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 그것들은 또한 수동면역 치료용으로, 및 두가지 수여자 및 수헐자헐액에서 바이러스 항원(들)의 검출을 허용함으로써 HCV 유발된 NANBH를 진단하기 위해서도 사용될 수 있다. 항-HCV항체에 대한 또하나의 중요한 용도는 바이러스 및 바이러스 폴리뎁티드의 정제를 위한 친화성 크로마토그래피에 있다. 정제된 바이러스 및 바이러스 폴리팹티드 제제는 백신에 사용될 수 있다. 그러나, 정제된 바이러스는 또한 HCV가 복제되는 세포배양시스템의 발생에 대해서도 유용할 것이다.
HCV 감염세포를 함유하고 있는 세포배양시스템은 여러가지 용도를 가질 것이다. 그것들은 정상적으로 저역가의 바이러스인 HCV의 상대적으로 큰 규모의 제조에 대해 사용될 수 있다. 이들 시스템은 또한 바이러스의 분자생물학의 설명에도 유용할 것이며 항-바이러스제의 개발을 유도할 것이다. 세포배양시스템은 또한 항바이러스제의 효력에 대한 스크리닝에도 유용할 것이다. 더불어, HCV를 허용하는 세포배양시스템은 HCV의 감쇠된 균주의 제조에도 유용하다.
편리를 위해서 천연적이든, 또는 재조합체이든, 항-HCV항체 및 HCV 폴리팹티드가 기트안에 포장될 수 있다.
발현 벡터에서, 개체의 감염된 조직으로부터 유도된 cDNA 라이브러리를 제조하는 단계와, 비감염된 개체가 아닌 다른 감염된 개체로부터의 항체- 함유 신체성분중의 항체와 면역학적으로 반응하는 발현생성물을 생산하는 클론을 선택하는 단계로 이루어지는, HCV cDNA의 단리에 사용된 방법은 또한, 게놈성 성분으로 이루어지는 지금까지의 다른 미확인 질병- 관련 병원체로부터 유도된 cDNA 의 단리에도 적용될 수 있다. 이것은 계속해서, 이들 병원체의 단리 및 특성확인, 및 이들 다른 질병- 관련 병원체에 대한 진단시약 및 백신을 유도할 수 있을 것이다.

Claims (16)

  1. 하기의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스(HCV) 단백질의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 HCV에 대한 항체를 검출하기 위한 면역검사시약:
    (a) 도 47, 도 1, 도 4 또는 도 36에서 보여지는 아미노산 서열로부터 적어도 8개의 인접하는 아미노산;및
    (b) HCV에 대한 항체에 의해 결합될 수 있는 특성.
  2. 고체상에 고정된 하기의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스(HCV) 단백질의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 HCV에 대한 항체를 검출하기 위한 면역검사시약:
    (a) 도 47, 도 1, 도 4 또는 도 36에서 보여지는 아미노산 서열로부터 적어도 8개의 인접하는 아미노산;및
    (b) HCV에 대한 항체에 의해 결합될 수 있는 특성.
  3. HCV에 대한 항체를 검출하기 위한 면역검사시약의 제조방법으로서,
    (i) 하기의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스(HCV) 단백질의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    (a) 도 47, 도 1, 도 4 또는 도 36에서 보여지는 아미노산 서열로부터 적어도 8개의 인접하는 아미노산; 및
    (b) HCV에 대한 항체에 의해 결합될 수 있는 특성 및,
    (ii) 상기의 폴리펩티드를 고체상에 고정하는 단계로 이루어지는 방법.
  4. HCV에 대한 항체를 검출하기 위한 면역검사방법으로서,
    (a) 제 1 항 또는 제 2 항 따른 면역검사시약을 제공하는 단계;
    (b) 항원-항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 상기의 면역검사시약과 생물학적 샘플을 배양하는 단계; 및,
    (c) 상기의 면역검사시약을 포함하는 항원-항체 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계로 이루어지는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기의 생물학적 샘플이 인간 기원이며 혈액, 혈청, 혈장 및 타액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역검사방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기의 항원-항체 복합체의 존재 또는 부재가 효소 또는 방사성표지로 표지화된 항-인간 Ig 항체와 상기의 면역검사시약을 배양함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 면역검사방법.
  7. 하기의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스(HCV) 단백질의 서열에 면역학적으로 결합하는 항체:
    (a) 도 47, 도 1, 도 4 또는 도 36에서 보여지는 아미노산 서열로부터 적어도 8개의 인접하는 아미노산; 및,
    (b) HCV에 대한 항체에 의해 결합될 수 있는 특성.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 항체가 단일클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 항체가 다중클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  10. HCV 항원을 검출하기 위한 항체 조성물로서, 제 7 항 내지 제 9 항중 어느하나의 항체로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 조성물.
  11. 항-HCV 항체를 제조하는 방법으로서,
    (i) 하기의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스(HCV) 단백질의 서열을 포함하는 폴리뎁티드를 생합성하는 단계;
    (a) 도 47, 도 1, 도 4 또는 도 36에서 보여지는 아미노산 서열로부터 적어도 8개의 인접하는 아미노산; 및
    (b) HCV에 대한 항체에 의해 결합될 수 있는 특성; 및,
    (ii) 상기 폴리팹티드의 부위에 면역학적으로 결합하는 항체를 생성하는 단계로 이루어지는 방법.
  12. 샘플에서 HCV 항원을 검출하기 위한 면역검사방법으로서,
    (a) 제 7 항 내지 제 10 항중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 항원-항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 상기 샘플을 상기 항체와 배양하는 단계;및,
    (c) 상기 항원을 포함하는 항원-항체 복합체를 검출하는 단계로 이루어지는 방법
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 샘플이 인간 기원이며 혈액, 혈청, 혈장 및 타액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역검사방법.
  14. 제 7 항 내지 제 10 항중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 조성물이 고정된 고체상.
  15. 제 8 항에 따른 단일클론성 항체를 생성하는 하이브리도마(hybridoma)를 제조하는 방법으로서,
    (i) HCV에 대한 항체를 지니는 개인으로부터 획득한 항체-생성 세포들을 영요)Z-160 생화(immortalize)시키는 단계;
    (ii) 하기의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스(HCV) 단백질 서열을 포함하는 폴리펩티드에 면역학적으로 결합하는 항체들을 생성하는 영생화된 세포를 선택하는 단계;
    (a) 도 47, 도 1, 도 4 또는 도 36에서 보여지는 아미노산 서열로부터 적어도 8개의 인접하는 아미노산; 및
    (b) HCV에 대한 항체에 의해 결합될 수 있는 특성; 및,
    (iii) 상기 영생화된 세포를 배양하는 단계로 이루어지는 방법.
  16. HCV로 감염된 세프를 포함하는 생체외 세포 배양물로서,
    (i) HCV 게놈에 의해 코드화되고 하기의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 생물학적 샘플내의 HCV를 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 PCR 프라이머로 상기의 세포에서 HCV 게놈을 검출할 수 있는 능력에 의하여;
    (a) 제 47 도에서 보여지는 뉴클레오티드 서열의 어느쪽 가닥의 DNA 또는 대응하는 RNA의 적어도 1O개의 인접하는 뉴클레오티드; 및,
    (b) HCV 게놈에 선택적으로 혼성화할 수 있는 특성또는,
    (ii) 제 7 항에 따른 항체로 HCV 단백질을 검출할 수 있는 능력에 의하여 상기 HCV 감염을 결정하는 것을 특징으로 하는 생체외 세포 배양물.
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