JP2696116B2 - 非ａ非ｂ肝炎患者の血清と抗原抗体反応するペプチド、及び該ペプチドをコードするｄｎａ - Google Patents

非ａ非ｂ肝炎患者の血清と抗原抗体反応するペプチド、及び該ペプチドをコードするｄｎａ

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上利用の分野 本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清と抗原抗体反応
するペプチド、及び該ペプチドをコードするDNAに関す
る。更に詳細には、本発明は、特定の塩基配列によりコ
ードされるアミノ酸配列を含む、正常人及びＢ型肝炎患
者の両血清のいずれとも抗原抗体反応せず非Ａ非Ｂ型肝
炎患者の血清と抗原抗体反応する純粋なペプチド、及び
該ペプチドをコードするDNAに関する。
従来技術とその問題点 ［非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの定義］：衆知の通り、ウ
イルス性肝炎は肝炎ウイルスの感染に因り生じる肝疾患
であり、該病原ウイルスとしては現在、Ａ型、Ｂ型、お
よびＤ型（デルタ）、経口感染性非Ａ非Ｂ型の各肝炎ウ
イルスが分離同定されている。尚、Ｄ型肝炎ウイルス
（デルタ肝炎ウイルス）は、単独では増殖不能の欠損ウ
イルスであり、その増殖には常にヘルパーウイルスとし
てＢ型肝炎ウイルスを要するため、Ｂ型肝炎患者に於い
てのみ存在する。ところが、1974年にＡ型並びにＢ型各
肝炎ウイルスの両感染に因らないウイルス性肝炎例の多
数存在することが初めて報告された。爾来、これに関す
る研究が世界各地で精力的に進められると共に斯かる肝
炎例の総称として、非Ａ非Ｂ（non−A,non−Ｂ）型肝炎
なる用語が使用されるに至った。非Ａ非Ｂ型肝炎に係る
病原ウイルスが複数種、存在することは確実であるが、
既に多くの研究者により種々報告されている斯かるウイ
ルスの発見に関しては、アフリカ・インド・東南アジア
等を侵淫地とする既に確定済みの経口感染性非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルスを除き、ウイルス学上の一般承認を得たも
のはまだ知られていない。今日までの報告によれば、非
Ａ非Ｂ型ウイルスは感染経路の相違に基づき、次の２つ
の型に大別される：水や食物を介して水系伝染する流行
性肝炎型ないしは経口感染（enterically−transmitted
non−A,non−Ｂ）型；及び主として血液を介して伝播
し輸血後などに於いて多発する血液伝播［blood−trans
mitted non−A,non−Ｂ（以下「NANB」と略称する）］
型。本発明で使用されている用語「NANB型肝炎」、およ
び「NANBV」は、特に断わりのない限り、上述のうち血
液伝播（NANB）型の非Ａ非Ｂ型肝炎とその病原ウイルス
（以下「NANBV」と略称する）を夫々、意味する。
［NANB型肝炎研究の現状と課題］:NANB型肝炎の発症
機序とその治療に関する研究開発は目下、世界各地で広
くウイルス性肝炎の観点からNANBVと他の肝炎ウイルス
との比較の下で、ウイルス学、診断学、組織病理学等の
知識と技術を駆使し、盛んに進められている（日本医事
新報、No.3320、3-10ページ、1987年）。例えば、NANB
型肝炎に関し下記の通り種々報告されている： （イ） 疫学：日本のNANB型肝炎感染者数は厚生省の推
計によれば、慢性肝炎患者の60％（72万人）、肝硬変患
者の40％（10万人）および肝癌患者の40％（７千人）で
あり、これによる死亡者数は毎年16,000人に達してい
る。また、米国では年間15万〜30万例の輸血後肝炎が発
生し、その90％が該NANB型肝炎であり、更に、供血者の
１〜６％がNANBVキャリアーだと考えられている。その
他の諸外国でも、同程度またはそれ以上の発症率並びに
キャリアー率であると推定されるため、NANB型肝炎の診
断、治療および予防対策の確立は、全世界に待望の福音
をもたらす。
（ロ） ウイルス学：現在までに既報のNANBVは、エン
ベロープを有する直径約50nmの球状であり、ウイルス分
類学上トガウイルス、フラビウイルスに近似している
か、あるいは全く新しいタイプのウイルスと考えられて
いる。また、NANB型肝炎患者血清を静脈内接種したチン
パンジー肝細胞における細胞質内管状構造形成の有無や
該内粒子出現の病理学的所見、疫学、クロロホルム感受
性等に基づき、１種又は２種以上のNANBVの存在が推定
されている（Science,第205巻,197-200ページ、1979年;
Journal of Infectious Disease,第148巻,254-265ペー
ジ,1983年）。特に、Ａ型及びＢ型両肝炎に比べ患者の
血中NANBV量は極端に少ないこと［Chimpanzee infectio
us doses（CID/ml）はＢ型では108−109,NANBでは104−
105である］（Bradley DW（1985）:Research perspecti
ves in posttransfusion non−A,non−B hepatitis.In
Dodd RY,Barker LF（eds）：“Infection,lmmunity and
Blood Transfusion."New York:Alan R.Liss,Inc.,pp81
-97）、およびヒト以外の感染実験系に関し、NANBV感染
により典型的な細胞質内管状構造の出現するチンパンジ
ーのみが感受性動物として知られている現状では、畢 、この基礎研究には希少かつ高価なチンパンジーを多数
頭要することになり、その入手に係る供給制限と経済的
制約が、NANBVに係る決定的な感染実験、同定、マーカ
ーの発見等を困難にし、遅延させている。従って、斯か
る現状を打開するための新規な研究戦略の編み出しが期
待されている。
（ハ） 臨床:NANB型肝炎の潜伏期は２〜26週であり、
その初期症状は発熱，倦怠感等を伴う程度で軽くＢ型肝
炎に比し軽症で70％が無黄疸であるため、見過ごす確率
が高い。しかし、NANB型肝炎の特徴とその恐ろしさは慢
性化し易く更に、肝硬変へと移行することにある。例え
ば、血清中のアミノトランスフェラーゼ活性の上昇が観
察されたNANB型肝炎例のうち、40〜50％の率で慢性化が
起こり、慢性化した症例のうち10〜20％が肝硬変であ
る。また、受血者の年間0.5〜１％が自覚症状なしに肝
硬変へと進展する。従って、輸血のみならず出血に係る
公衆衛生上のバイオハザード防止の観点から、NANB型肝
炎の根絶は世界的に極めて重要である。
（ニ） 診断：上述の通り、NANBVは未だ同定されてお
らず、診断用の確実なウイルスマーカーが知られていな
いので、最終的にはＡ型とＢ型両肝炎、サイトメガロ、
EB、水痘、単純ヘルペス等の起炎性の各既知ウイルスの
抗体価の検査に基づく除外診断に頼らざるを得ない。そ
して、これ等と平行して例えば血清酵素、GPT［グルタ
ミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ；別名:ALT（アラ
ニンアミノトランスアミナーゼ）］、GOT［（グルタミ
ン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ；別名:AST（アス
パルラートアミノトランスアミナーゼ）］、グアニンデ
アミナーゼ（別名：グアナーゼ）等の活性の上昇の測定
（肝胆膵、第14巻、519-522ページ、1987年）；上記の
血清中のGPTないしはGOT活性の経時的異常高値の継続に
基づく診断基準（日本輸血学会誌、第31巻（第４号）、
316〜320ページ、1985年）等が採用されている。尚、診
断剤に関しては例えば、NANB型肝炎発症時に出現する抗
原に対し特異的に反応する抗体、ポリクローナル抗体
（特開昭58-735）、モノクローナル抗体（特開昭58-183
629、特開昭61-561968特開昭62-181798）、モノクロー
ナル抗体を産生の細胞株（特開昭61-25484）、アビジン
標識抗体（特開昭60-195454）、患者糞便の抽出物を感
染させたサル血清から調製した抗体（特開昭62-24999
9）；患者の剖検肝から分離精製したNANB型肝炎関連抗
原（特開昭57-198867）；吸光度によるグアナーゼ活性
の測定（特開昭60-176600）；血中の逆転写酵素活性の
測定（米国特許第4,707,439号）等が公知であるが、NAN
BVマーカーが未発見の現状では、これ等はいずれも確定
性に欠けている。
（ホ） 治療と予防：最近βインターフェロンによる慢
性NANB肝炎の治療［Hepatology、第６巻、1117、1986年
（抄録）］が注目され、投与量、投与期間等に関する治
験が進行中ではあるがその有効性は確認されていない。
また、NANBV、その抗原を有効成分として用いるワクチ
ンや診断剤、免疫グロブリン等に関しては例えば、下記
が公知である:GPT活性が高値で黄疸を呈するNANB型肝炎
患者の血清由来抗原を有効成分とするアジュバントワク
チン（特開昭59-42455）;EBウイルスで形質転換したNAN
B型肝炎患者リンパ球が産生の抗体と特異的に反応するN
ANBV抗原を、NANB型肝炎発症のチンパンジー肝細胞塊か
ら単離精製（特開昭61-176856）；患者血清由来の糖蛋
白（特開昭62-30965）；患者血清からアフィニティーク
ロマトグラフィーにて分離したDNAウイルス（公表昭59-
501774）；血漿中のフィブロネクチン画分から単離した
NANBV抗原（公表昭60-501241）；患者の血清及び尿から
分離したトガウイルス（米国特許第4,464,474号）；患
者の血清または血漿から精製したNANBV表面抗原又はガ
ンマグロブリンを有効成分として含有するワクチン（米
国特許第4,542,016号）；患者血清から精製したNANBVと
その抗原（米国特許第4,673,634号；米国特許第4,702,9
09号；および欧州公開広報第128,995号）；患者の糞便
の抽出物から分離した腸内ウイルス様ウイルス（欧州特
許第71,640号）等。更にまた、血液製剤を介するNANBV
伝播の防止方法に関しては、血清又は血漿を60℃で10分
間加熱処理（米国特許第4,438,098号）；凍結乾燥製剤
を調製後に加熱処理（特開昭59-110627）；クロロフォ
ルム等の有機溶媒による血漿蛋白の沈澱画分の採取、お
よび該溶媒可溶画分中の肝炎ウイルスの除去；ホルマリ
ンによるNANBVの不活化法（米国特許第4,291,020号）等
が公知である。しかし、これ等はNANBVそれ自体が未確
定の現状では、各効果に関する確認は不能であり、更
に、生物学的製剤の必須要件である安全性、有効性、及
び均質性の兼備に関する確認と保証を有さないため、未
だ実用の域には達していない。
問題を解決するための手段 本発明者等は、前述の従来技術の課題を克服するため
鋭意研究を重ねた結果、従来の抗原に比し優れて信頼性
が高く、更に、安全、有効かつ均質なNANBV抗原を得る
と共に、高純度の該抗原をバイオハザードの観点から安
全で、しかも経済性の観点から安定した高い生産収率の
下で製造する方法を達成した。斯かる達成は、未知の迷
入因子を有するチンパンジーを宿主として用いるNANBV
の増幅過程を経ることなく、血漿及び患者の切除肝細
片、即ち、NANBV遺伝子含有に関し信頼性の高いヒト由
来材料から直接、NANBV遺伝子をクローニングし、しか
も、その発現に成功したことによる。更に、NANBVの血
中抗原量がＡ型およびＢ型両肝炎ウイルスに比しその約
１万分の１と著しく低いため、該NANBV抗原の単離と同
定が困難であるという難題の解決に成功したことによ
る。即ち、後に詳述の通り、厳密に選別採取された前述
のヒト由来材料中のRNAに係るcDNAライブラリーから調
製したプローブと、NANB型肝炎患者血漿中のRNAの間で
特異的にハイブリダイゼーションの生じることを、ドッ
トハイブリダイゼーション変法により発見すると共に、
上記cDNAライブラリーからNANBV遺伝子をスクリーニン
グするに際し、各cDNA産物をファージプラーク上に高濃
度に発現させ、斯かる発現産物と急性NANB型肝炎患者回
復期血清および慢性NANB型肝炎患者血清とを用いるイム
ノアッセイによりNANBV抗原の検出に係る多数検体の迅
速かつ容易なスクリーニング法の確立に成功した。驚く
べきことに、本発明者等は上述の血漿及び切除肝に於い
てNANBVに特異的なRNAの存在すること、および斯かるヒ
ト由来材料からNANBVに関連のあるcDNAのクローン化が
可能であることを発見した。また、ヒト由来材料中のNA
NBV関連のcDNAの単離法並びに同定法を確立した。更に
また、該クローン化cDNAを発現ベクターに挿入連係して
発現させることにより優れて有用なNANBV抗原が大量か
つ低廉に得られることも見い出した。本発明は、これ等
の知見により完成されたものである。
即ち、本発明によれば、式（Ｉ）〜（Ｖ）のそれぞれ
の塩基配列からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩
基配列によりコードされるアミノ酸配列、又はそのアミ
ノ酸配列のうち連続する少なくとも５個のアミノ酸から
なる一部配列であって、正常人及びＢ型肝炎患者の両血
清のいずれとも抗原抗体反応せず非Ａ非Ｂ型肝炎患者の
血清と抗体抗原反応する純粋なペプチドが提供される。
該式（Ｉ）〜（Ｖ）はそれぞれ次の配列： GAATTCCAAAAAGAGCAAAA CAAACCGCCGAAGAAAAAAC TAATAAGAGAAGAAAAGGCG AAGAGACACAGGAAAAAAAA AACAGAGACGAAGGTCAGAT AGAAAAAAAGCAAGGAATTC ・・・（Ｉ） GAATTCCGAGAACAAGACCA GATAAAAACCAAAGACAGAA CACAACAGAGAAAGACGAAA AGAAGCACCAATCGCAGGCG AAGCAAAAACGAAAAAAAAA AAAAAAAGGAATTC・・・（II） GAATTCCAAGAAAAAAAGGG AGAAGCCAGCAATGGAGAAG CCGAAAACGACACACACAAG AAACAAAGGAGGTACAAAGA AAAAGAAAAAACGGCAACAA ATAACCCAGGAAAGAACAAA AAGCCAAGAGTGGGCAGAAT AAAAAACTGGAACCGGGAGG GAAGGAAGGACGCATATCAG ATTAGAAAAAGGAGGGAATT Ｃ・・・（III） GAATTCCCAACGCGTCGGCT TGGCCCGCGCCTTGGCCGCC GACCCGCGCTGATGGCCGTG GAATTC・・・（IV） GAATTCCGGGGTATTTGCCT CGATCTGCCTGCTCAGCGCT TCGGCCCTCGGCTTGGGCGC CCTGCTGCTGGCTTCCGAGC AGCTATTCAGCGCCTTGAAA GTGGTTGGCGCGGCGTACGT GTCCGGGAATTC・・・（Ｖ） 式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグア
ニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基およびＴはデ
オキシチミジル酸残基を表し、各式の左端および右端は
夫々５′末端、３′末端を表す。）で表わされる。
また、本発明の更に他の態様によれば、上記ペプチド
の２種以上を混合してなる混合ペプチドが提供される。
また、本発明の更に他の態様によれば、上記の式
（Ｉ）〜（Ｖ）のそれぞれの塩基配列によりコードされ
るアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列のうち連続する
少なくとも５個のアミノ酸からなる一部配列であって、
正常人及びＢ型肝炎患者の両血清のいずれとも抗原抗体
反応せず非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清と抗原抗体反応する
純粋なペプチドをコードするDNAが提供される。
また、本発明の更に他の態様によれば、上記のDNAを
含むベクターが提供される。
また、本発明の更に他の態様によれば、上記のベクタ
ーを含有する形質転換体が提供される。
また、本発明の更に他の態様によれば、抗原抗体反応
によって非Ａ非Ｂ型肝炎を検出するための診断剤にし
て、上記のペプチド又は混合ペプチドを、抗原抗体反応
を呈するに十分の量含有することを特徴とする診断剤が
提供される。
本発明の構成は、次の通りである： （Ｉ） NANBVのRNA抽出材料の選別と採取;NANBVのRNA
の抽出材料としては、NANBVのキャリアーおよびこれに
羅患したヒトおよびチンパンジーの血液、リンパ液、腹
水、肝細胞等が使用できる。特に、チンパンジー由来の
材料中にはNANBV量がヒトのそれに比し低濃度である可
能性が強いため、ヒト由来材料の使用が望ましい。例え
ば、血液診断基準に不合格であるため、輸血用血液とし
て使用に耐えない血液を血液銀行から入手することがで
きる。斯かる血液に由来の血漿のうち、Ｂ型肝炎ウイル
スの表面抗原（WHO expert committee on viral hepati
tis:Advances in viral hepatitis,WHO Technical Repo
rt Series,602,28-33,1977）及び遺伝子DNA（Brechot
C,Hadchouel M,Scotto J, Degos F,Charnay P,Trepo C,
Tiollais P（1981）:Detection of hepatitis B virus
DNA in liver and serum:a direct appraisal of the c
hronic carrier state.Lancet 2:765-768.）が共に診断
学的に陰性でしかも、NANB型肝炎の診断の目安として採
用されている公知の血清酵素、例えば、GPT（Whoblewsk
i,F.＆ J.S.LaDue:Serum glutamic pyruvic transamina
se in cardiac and hepatic disease.Proc.Soc.Exp.Bio
l.Med.,91:569,1956.）、GOT、グアナーゼ等の活性が異
常高値、例えば、GPTでは100Karmen単位以上の血漿を選
別採取し、プールする。尚、血中NANBV量は、Ｂ型肝炎
ウイルス量に比し、前述の通り約１万分の１であること
が感染実験の結果（Bradley DW（1985）:Research pers
pectivesin−post−transfusion non−A,non−B hepati
tis.In Dodd RY,Barker LF（eds）：“Infection,lmmun
ity and Blood Transfusion."New York:Alan R.Liss,ln
c.,pp81−97.）から予想されるので、該RNAの抽出には
大量、例えば、約30〜100lの血漿の使用が望ましい。ま
た、NANB慢性肝炎に合併した肝細胞癌の手術に際して得
られる非癌部の肝組織を１〜3g採取する。
（II） NANBVのRNAの調製：上記（Ｉ）で選別採取した
各材料から、公知の常套手段によりRNAを抽出かつ精製
し調製できる。例えば約10〜15mMの公知の緩衝液を希釈
液として使用し、血漿については約1.5〜５倍に希釈の
後、これを希釈原液としRNAの抽出精製工程に供する。
一方、肝細片についてはその体積の約５〜30倍容の下記
のRNA分解酵素阻害剤を含む希釈液を添加の後、公知の
手段、例えば、ホモジナイザー等より、肝組織を破砕な
いし磨砕し懸濁質にすることにより、肝乳剤を調製す
る。次いで、これを低速遠心し、その上清を採取した後
該上清を希釈原液とし、上記の血漿希釈原液と同様にRN
A抽出精製工程に供する。RNAの抽出精製には公知の常
法、例えば、ヘパリン、ジエチルピロカルボネート、グ
アニジンチオシアネート等のRNA分解酵素阻害剤と界面
活性剤、キレート剤または蛋白変性を増強する還元剤と
の混合液を用いる抽出法；蔗糖、セシウムクロライド、
フィコール等を溶質として用いる密度勾配遠心による分
画法;mRNAが特異的に有する３′末端のポリＡ鎖を利用
するアフィニティーカラムによる分離法；ポリソームで
合成中の蛋白質に対する抗体を用いる免疫沈降によるmR
NAの分別法;2相分配の原理に基づくフェノール抽出法；
ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸塩、アルコ
ール等による沈澱法等を適宜、組み合わせて使用でき
る。尚、斯かる抽出と精製は、RNAの不可逆的変性を避
けるためpH3〜10での実施が望ましい。
（III） NANBVのRNAに係る二本鎖cDNAの調製：上記（I
I）で調製したRNAを使用し、公知の常法によりcDNAを調
製できる。原理的には、プライマーとなるオリゴデオキ
シチミジンおよびヘキサヌクレオチドプライマーと逆転
写酵素等を用い、RNAに相補的な一本鎖cDNAを合成し、
該cDNAとRNAからなる二本鎖を得、次いで、これにリボ
ヌクレアーセＨを作用させてRNAを分解除去することに
より一本鎖cDNAを得た後、斯かるcDNAを鋳型としてDNA
合成酵素により二本鎖cDNAを合成する。尚、二本鎖cDNA
合成の簡便法として、市販のcDNA合成キット、例えば、
cDNA合成システムプラス［Amersham International社
（英国）製;BRL社（米国）製］、cDNA System Kit［Pha
rmacia LKB社（スウェーデン）製］、cDNA合成キット
［Boehringer Mannheim社（西独）製］等を用いて実施
できる。尚、合成したcDNAは下記（IV）の検査結果に基
づきその適確性を確認の後、後述（Ｖ）のcDNAライブラ
リーの作成に使用する。
（IV） 合成したcDNAのNANBVのRNAに対する特異性の検
定;NANBV遺伝子クローニングの成功を確保するため、cD
NAライブラリー作製前に、上記（III）で調製したcDNA
がNANBVに特異的な遺伝子を含有しているか否かに関し
検定する。換言すれば、上記（Ｉ）で採取した血漿中で
の特異的NANBVのRNAの存在を確認するため、検定を行
う。斯かる検定法は、公知の種々のハイブリダイゼーシ
ョン術式を工夫の下に組み合わせて使用することにより
案出される。例えば、上記（II）の方法によりNANB型肝
炎患者血漿から抽出したRNAをニトロセルロースフィル
ター又は、ナイロンフィルター上にドットした後、これ
に上記（III）で調製のcDNAから調製した32Ｐ標識cDNA
をプローブとして反応させ、斯かるRNAとプローブとの
間で特異的に生じるドットハイブリダイゼーションの陽
性率に基づき検出できる。尚、プローブとしては、例え
ば、上記（III）で調製した二本鎖cDNAを熱変性させ一
本鎖にし、次いで、これに32P-dCTP（32Ｐ標識デオキシ
シチジン５′三リン酸）、dNTP（デオキシリボヌクレオ
シド三リン酸）、およびDNAポリメラーゼＩのKlenow断
片を含有の溶液を添加混合の後、保温することにより合
成した32Ｐ標識標識cDNAを使用できる。そして、上記ハ
イブリダイゼーションの陽性率が、例えば、比較対照と
して用いた健康成人血漿由来およびＢ型肝炎患者血漿由
来の各RNAでは夫々、０％および約０〜３％であるのに
対し、NANB型肝炎患者血漿由来RNAでは特異的かつ有意
に高値、即ち、約30％以上である場合、血中のＢ型肝炎
ウイルス量に比しNANBV量が著しく少ないことを考慮
し、上記（III）で調製したcDNA中にはNANBVに特異的な
遺伝子が遜色なく存在するものとして、次の工程に使用
できる。
（Ｖ） cDNAライブラリーの作成：上記（III）で調製
したcDNAを使用し、公知の常法によりcDNAライブラリー
を作成できる。原理的には上記（III）で調製した種々
の長さのcDNAを夫夫、クローニングベクターに挿入連係
することにより作成する。斯かるベクターとしては、例
えば、公知又は市販のファージ遺伝子、コスミド、プラ
スミド、動物ウイルス遺伝子等が使用できる。尚、ベク
ターとしてファージ遺伝子およびコスミドを使用する場
合には、cDNA連係ベクターの安定化と形質転換体の出現
率を高めるため常法に従って試験管内パッケージングを
行い、各cDNAが挿入連係済みの各ベクターを組換えファ
ージ粒子にした後、これ等各粒子の集団をcDNAライブラ
リーとしてcDNAのクローニングに供する。また、ベクタ
ーとしてプラスミドや動物ウイルス遺伝子を使用する場
合には、cDNA連係ベクターを常法により感受性宿主に移
入又はトランスフェクションとして得た形質転換体又は
組換えウイルスをcDNAライブラリーとしてcDNAのクロー
ニングに供する。該ライブラリー作成の簡便法として、
市販のキット、例えば、cDNAクローニングシステムλgt
10およびλgt11［Amersham International社（英国）
製;BRL社（米国）製;Stratagene社（米国）製］，イン
ビトロ パッケージングシステム［Amersham Internati
onal社（英国）製;BRL社（米国）製］等を用いることが
できる。
（VI） cDNAライブラリーからのNANBV遺伝子cDNAのク
ローニング：この工程は、NANBV遺伝子cDNAクローンを
得るために行なう。先ず、cDNAライブラリーが形質転換
体の場合には、これ等を培養しコロニーを形成させる。
一方、cDNAライブラリーが組換え体ファージや組換え体
ウイルスの場合にはこれ等を公知の感受性宿主細胞、例
えば、大腸菌、酵母、枯草菌、動物細胞培養等に感染
後、培養することによりプラークを形成させるか、若し
くは感染細胞数を増加させる。そして、公知ノイムノア
ッセイの下で、急性NANB型肝炎患者回復期血清、慢性NA
NB型肝炎患者血清、肝細胞質内管状構造形成型NANBV感
染チンパンジー血清、および肝細胞質内管状構造非形成
型NANBV感染チンパンジー血清を用い、これ等の各血清
中の抗体と特異的に抗原抗体反応を生じる抗原、即ち、
NANBV抗原を産生しているコロニー、プラーク又は感染
細胞の選別と採取を１回以上行うことによりクローニン
グし、NANBV遺伝子cDNAクローンを得ることができる。
上記イムノアッセイとしては、例えば、パーオキシダー
ゼやアルカリ性ホスファターゼ等の酵素で標識した抗体
を用いる酵素抗体法、フルオレセインイソチオシアネー
トやユーロピウム等の蛍光物質で標識した抗体を用いる
蛍光抗体法等を使用できる。尚、斯かるイムノアッセイ
では、感度が高く、かつ、少量の患者血清の使用で実施
できる間接法の採用が望ましい。この場合には、一次抗
体として抗体の含有量が多い上述のNANB型肝炎患者やNA
NBV感染チンパンジーの血清の使用が望ましく、二次抗
体としては酵素又は蛍光物質で標識した市販の抗ヒトIg
抗体の使用が可能である。また、被検体の調製法として
は、公知の常法、例えば、レプリカ作成の要領でフィル
ター膜に核酸及び蛋白を吸い込ませ写し取るブロッティ
ング法、マイクロプレートや検鏡用スライドガラスを用
いる方法等が採用できる。これ等のうち、ブロッティン
グ法は間接酵素抗体法を適用すると、多数の被検体の迅
速な判定が可能となる。尚、この方法では、例えば、材
質がニトロセルロース、セルロースアセテート、ナイロ
ン膜等の市販のフィルターを上述のコロニーやプラーク
の上に密着させ、ブロッティングを行う。
更にまた、得られたNANBV遺伝子cDNAクローンについ
ての塩基配列の決定が望ましい。斯かる塩基配列の決定
は公知の常法、例えば、マキサム−ギルバート法，ジデ
オキシチェーンターミネーター法（Analytical Biochem
istry,第152巻,232-238ページ1986年）等により行うこ
とができる。
また、得られた複数のNANBV遺伝子cDNAクローンにつ
いて、各クローン相互の違いを明確にし分類するため、
各クローンの鑑別と確認が望まれる。そのための指標と
しては、例えば、前述のNANBV感染チンパンジーの肝細
胞質内の管状構造形状の有無を用いることができる。即
ち、NANBVには管状構造形成能を有するものと、有しな
いものが知られているため（Science、第205巻、197-20
0ページ、1979年）、これ等の各NANBVに対するチンパン
ジー抗血清と上記各クローンとの間の血清学的反応性に
基づき、各クローン相互の違いを鑑別かつ確認すると共
に、分類することができる。なお、斯かる血清学的反応
性は、上述のイムノアッセイにより検査することができ
る。
（VII） NANBV遺伝子cDNAクローンの発現、およびNANB
V抗原の大量生産：この工程は、上記（VI）でクローニ
ングしたNANBV遺伝子cDNAを産業利用上、大量に発現さ
せるために行う。即ち、NANBV遺伝子各cDNAクローンの
全領域又はその部分を制限酵素を用いて切り出すことに
よりNANBV遺伝子DNA断片を調製の後、斯かるDNA断片を
発現ベクターに挿入連係する。この場合、DNA断片１種
を発現ベクターに挿入連係することにより、該DNA断片
にコードされているペプチドを１種、産生できる。ま
た、２種以上のDNA断片を接続して発現ベクターに挿入
連係することにより、各DNA断片にコードされているペ
プチドを融合ペプチドとして発現させることができる。
尚、発現ベクターとしては公知又は市販のもの、例え
ば、腸内細菌科のプラスミドベクターpSN508（米国特許
第4,703,005号）、酵母のプラスミドベクターpBH103系
列（特開昭63-22098）とpJM105（特開昭62-286930）、
弱毒水痘ウイルス遺伝子（特開昭53-41202）、弱毒マレ
ック病ウイルス（日本獣医学会誌、第27巻、20〜24ペー
ジ、1984年；およびGan Monograph on Cancer Researc
h、第10巻、91〜107ページ、1971年）、pTTQ系列［Amer
sham International社（英国）製］、pSLV［Pharmacia
LKB社（スウェーデン）製］等が使用できる。次いで、N
ANBV遺伝子cDNAを挿入連係した発現ベクターを、常套手
段により該ベクターに感受性の宿主細胞に移入、又はト
ランスフェクションし、NANBV抗原を産生の形質転換体
又は感染細胞を選別採取できる。尚、NANBV抗原の産生
の有無は、前述（VI）に記載のイムノアッセイと同様に
して検出できる。また、発現ベクターとしてプラスミド
を使用した場合にはNANBV抗原を産生の形質転換体を
得、動物ウイルス遺伝子を使用した場合には組換え体ウ
イルスを得ることができる。そして、斯かる形質転換体
や組換え体ウイルスを夫々、常法により培養し、これ等
の培養物中に均質なNANBV抗原を大量に生産することが
できる。
（VIII） NANBV抗原の精製：上記（VII）で得た培養物
中のNANBV抗原の精製は、公知の常法、例えば、塩析、
シリカゲルや活性炭等を用いる吸脱着法、有機溶媒によ
る沈澱法、超遠心による分画法、イオン交換およびアフ
ィニティーカラムクロマトグラフィーによる分離法、高
速液体クロマトグラフィー、電気泳動による分画法等を
適宜、組み合わせて採用することにより実施できる。
尚、大腸菌や酵母等の形質転換体の培養物から、NANBV
抗原を精製採取する場合には大腸菌や酵母等に由来のア
レルゲンの混入が最終製品の品質を低下させるので、例
えば、珪酸による吸脱着処理、活性炭による不純物の吸
脱除去、および密度勾配遠心分離による分割を順次行う
（特開昭63-297）ことが望ましい。また、組換えウイル
ス培養物、例えば、細胞培養液からNANBV抗原を精製採
取する場合には、超遠心分離や密度勾配遠心分離を反復
して行うことにより、高純度のNANBV抗原を採取するこ
とができる。更にまた、培養物中のNANBV抗原を無毒化
し、安全性を確保すると共に、該抗原の免疫原性ないし
は抗原性を固定化しその安定性を図るため、精製前の培
養物又はその除菌後の培養液に常用の不活化剤、例え
ば、ホルマリンを最終濃度が0.0001〜0.001V/V％になる
よう添加混合の後、４〜37℃で５〜90日間保存によるNA
NBV抗原の不活化が望ましい。上述の方法により得た高
度精製NANBV抗原液は、NANBVワクチン原液またはNANBV
抗原原液として、次の工程に供する。尚、前述（VII）
の工程で用いるNANB遺伝子cDNAの違いにより複数種類の
NANBV抗原を調製することができる。従って、斯かる抗
原は、１種からなる単一ペプチド抗原、又は２種以上を
混合することにより調製される混合ペプチド抗原とし
て、ワクチンや診断剤の製造に供することができる。
（IX） NANBVワクチンの製造:NANBVワクチン原液を公
知の常法で除菌濾過し、濾液を採取した後、これを生理
的塩溶液で希釈し、Lowry法による蛋白質含量の測定値
が約１〜約500μg/mlになるよう調製する。次いで、ア
ジュバントとして水酸化アルミニウムゲルを最終濃度が
約0.1〜約1mg/mlになるよう添加混合し、アジュバント
にNANBV抗原を吸着させる。尚、上記以外に、例えば、
リン酸カルシウムゲル、ベントナイト、アルミナ、ムラ
ミルペプチド誘導体等、公知のアジュバントを使用でき
る。また、NANBV抗原の安定化を図るため、市販のゼラ
チン、ゼラチン加水分解物、アルブミン、糖類、アミノ
酸類糖、公知の安定化剤から１種または２種以上を適宜
選択し、これ等を組み合わせて添加混合することができ
る。次いで、これをアンプル又はバイアル瓶等の小容器
に分注し密封することにより沈降精製NANBVワクチンが
得られる。尚、製品が熱帯等の悪条件下での保存と輸送
に耐えるよう、NANBV抗原の安定化を更に図るには凍結
乾燥を行う。例えば、上記の分注済みワクチンを常法に
より凍結乾燥した後、各小容器を密封することにより乾
燥沈降精製NANBVワクチンを調製できる。尚、ワクチン
の適格性については、厚生省告示第159号「生物学的製
剤基準」に規定の「沈降Ｂ型肝炎ワクチン」、「乾燥日
本脳炎ワクチン」及び「沈降精製百日せきワクチン」に
準拠して各種試験を行い判定する。また、本発明に係る
NANBV抗原は、混合ワクチンとしても使用できる。この
場合には、上記のアジュバントに吸着済みのNANBV抗原
を、別種のワクチン用抗原、例えば、日本脳炎ウイル
ス、腎症候性出血熱ウイルス、インフルエンザウイル
ス、パラインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、
デング熱ウイルス、エイズウイルス、百日咳菌、ジフテ
リア菌破傷風菌、髄膜炎菌、肺炎球菌等に由来の諸抗原
から適宜選択された一種以上の抗原と混合することによ
り上記と同様にして液状、または乾燥混合ワクチンを調
製できる。
本発明のワクチンは、アンプル又はバイアル瓶等の容
器内で密封された状態で、液状ワクチン、沈降アジュバ
ントワクチン、又は乾燥ワクチンとして提供できる。液
状および沈降ワクチンの場合にはそのまま使用し、乾燥
ワクチンの場合には滅菌蒸留水等で溶解し乾燥前の体積
まで戻して使用する。また、斯かるワクチンは通常、被
接種者当り0.5mlずつ皮下に接種する。
（Ｘ） 診断剤の製造： （１） 精製NANBV抗原を用いる診断剤：上記（VIII）
で調製した精製NANBV抗原をバイアル瓶又は小型試験管
に分注の後、液状のまゝ密封するか、若しくは上記分注
した抗原を凍結乾燥した後、密封し使用に供する。ま
た、精製NANBV抗原を、常用されている支持体、例え
ば、マイクロプレート、ポリスチレンビーズ、濾紙、膜
等の表面に吸着させた状態で診断剤として提供すること
もできる。斯かる診断剤は、常用されている種々の抗原
抗体反応測定法、例えば、RIA（radioimmunoassay）、E
LISA（enzyme−linked−immunoadsorbent assay）、蛍
光抗体法、受身凝集反応、逆受身凝集反応等の常套術式
に従って使用可能である。
（２） ポリクロナール抗体を用いる診断剤：上記の精
製NANBV抗原を、例えば、マウス、モルモット、ウサギ
等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内等に十分量、
１〜４週間隔で複数回接種し、高度に免疫した後、斯か
る動物から採血して血清を分離し、抗NANBV抗体を作製
する。尚、高度免疫には公知および市販のアジュバント
を常法に従い使用できる。該抗体、即ち、ポリクローナ
ル抗体は、上述（１）の精製NANBV抗原と同様の方法と
術式により、診断剤として提供可能であり、また、使用
できる。
（３） モノクローナル抗体を用いる診断剤：上記の精
製NANBV抗原を用い、公知の常法によりモノクローナル
抗体（細胞工学1:23-29、1982）を作製する。例えば、
精製NANBV抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウ
スミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリ
ドーマを作製の後、このハイブリドーマの培養上清から
モノクローナル抗体を調製することができる。斯かるモ
ノクローナル抗体は、上述（２）のポリクローナル抗体
と同様の方法と術式により診断剤として提供でき、か
つ、使用可能である。
尚、これ等のポリクローナル抗体やモノクローナル抗体
を用いることにより、肝組織および血中のNANBV抗原そ
のものの同定や定量が可能となる。
（４） NANBV遺伝子を用いる診断剤：本発明のNANBV遺
伝子は、ビチオン、アルカリ性ホスファターゼ、放射性
同位元素32Ｐ等の常用物質で標識の後、これを常用のハ
イブリゼイゼーション用プローブとしてNANB型肝炎の診
断に供する。斯かる調製は公知の常法を組合せて用いる
ことにより可能である。例えば、上記（VI）で得たNANB
V遺伝子cDNAクローンである組換えファージから制限酵
素によりNANBV遺伝子を含むDNA断片を切出し、該DNA断
片を市販又は公知のプラスミドに挿入連係の後、これを
宿主細胞に移入して得た形質転換体を培養することによ
りNANBV遺伝子を含むDNA断片の増幅を行う。次いで、形
質転換体の培養物からプラスミドを抽出し、これを制限
酵素で消化の後、低融点アガロースゲル電気泳動にか
け、増幅された上記DNA断片を単離精製する。この様に
して調製されたNANBV遺伝子は、例えば、放射性同位元
素α‐32Ｐで標識する。尚、斯かる標識には、例えば、
市販ニックトランスレーションキット又はマルチプライ
ムキット［Amersham International社（英国）製、ニッ
ポンジーン社製等］を使用できる。標識されたNANBV遺
伝子１〜100μｇは、約５〜20ml容のアンプル等の小容
器に入れ、液状又は乾燥状態で密封され、診断剤として
使用に供する。
尚、斯かる診断剤は、患者の血清、血漿、白血球等の
検体との間のハイブリダイゼーション法におけるプロー
ブして使用される。
以下、本発明の具体例につき実施例を挙げて説明す
る。但し、本発明は以下の実施例にのみ限定されるもの
ではない。
実施例1. cDNA作製のための血漿RNAの抽出:GPT値（Wroblewski,
F.＆ J.S.LaDue:Serum glutamic pyruvic transaminase
in cardiac and hepatic disease.Proc.Soc.Exp.Biol.
Med.,91:569,1956）が100Karmen/l以上でＢ型肝炎ウイ
ルス（HBV）の表面抗原およびDNAが陰性（Brechot C,Ha
dchouel M,Scotto J,Degos F,Charnay P,Trepo C,Tioll
ais P（1981）:Detection of hepatitis B virus DNA i
n liverandserum:a direct appraisal of the chronicc
arrierstate.Lancet 2:765-768.）を示す血漿70lに等量
の希釈液（50mM Tris・HCl,1mM EDTA・pH8.0）を加え、
毎分300mlの流量で連続遠心操作（7,400×g,4℃）し、
上清を得た。この希釈、澄化血漿をゾーナル遠心機［El
ectro Nucleonics社（米国）製］を用い蔗糖濃度０〜60
％（W/V）の蔗糖密度勾配遠心（90,000×g,4℃，流速10
0ml/時）にて分画、沈渣に加えて比重1.17〜1.29の第１
分画，比重1.12〜1.17の第２分画，更に最上層の脂肪層
の４分画を得た。各々の分画は25mM Tris・HCl,pH8.0,
0.5mM EDTAにて透析して蔗糖を除き、凍結乾燥後、各分
画を4Mグアニジンチオシアネートを含む20mlの20mMクエ
ン酸ソーダ,pH7.0,0.5％サルコシール,0.1M 2−メルカ
プトエタノールの溶液に溶解した。
RNAを抽出するために、1/10容量の2M酢酸バッファー,
pH4.1を加え、キャリアーRNAとしてポリＣ［Ｐ−L Bioc
hemicals社（スウェーデン）製］を300μｇ加えた後、
クロロホルム・イソアミルアルコールを含むフェノール
にて核酸を抽出した。得られた水層に等量のイソプロパ
ノールを加え核酸を沈澱させた。この操作を更に一度繰
り返すため0.2mlの4Mグアニジンチアシアネートを含む
上記のバッファーに沈澱を溶解し、等量のイソプロパノ
ールを加え再度核酸を沈澱させ、75％のエタノール中で
−70℃にて保存した。
更に、混入しているDNAを除去する目的で、リボヌク
レアーゼ（RNase）フリーのデオキシリボヌクレアーゼ
（DNase）［Promega社（米国）製］を５′−（４−アミ
ノフェニール−ホスホリル）−ウリジン−２′（３′）
−リン酸・アガロースのアフィニティークロマト［Prom
ega Biotex,Milles-Yeda Lab.（米国）製］行い、混在
する微量のRNaseを除去した後、DNaseにより核酸を処理
しDNAを消去し、又、キャリアーRNAとして加えたポリＣ
を除去するため、オリゴ（dG）セルロースカラム［Phar
macia社（スウェーデン）製,type7,2gm］のアフィニテ
ィークロマトを行いNENSORB［DuPont社（米国）製］カ
ラムを通した後、凍結乾燥して精製RNAを得た。
実施例2. cDNA作製のための肝臓由来メッセンジャーRNAの抽出:
NANB型肝炎患者の切除肝1gを細片にし、実施例１の4Mグ
アニジンチオシアネート液10mlを加え、ホモジナイザー
にてホモジネイトし、実施例１に記載と同様の方法でRN
Aを抽出し、精製し、更に、オリゴ（dT）カラム（0.5m
l）を用いて肝臓由来のmRNAを得た。
実施例3. 二重鎖cDNAの調製：市販のcDNA合成キット［Amersham
社（英国）製］を用いて調製した。即ち、実施例１で精
製したRNA1μｇをキットに添付の標準反応液８μｌに加
え、オリゴdTプライマー、20μCiの［α‐32Ｐ］dCTPお
よび20単位の逆転写酵素を添加し、全量を20μｌとし
て、42℃にて40分間インキュベートした後、氷水中に反
応チューブを移し、次いでセカンドストランドcDNA合成
のために、氷水中の反応チューブに、添付のセカンドス
トランド合成反応用バッファー37.5μl,［α−32Ｐ］dC
TP20μCi,大腸菌リボヌクレアーゼＨを0.8単位，大腸菌
DNAポリメラーゼＩを23単位各々加え、蒸留水にて全量
を100μｌに調製して、12℃にて60分間、次いで22℃で6
0分間、更に70℃にて10分間インキュベートした後、２
単位のT4DNAポリメラーゼを加え、37℃で10分間反応さ
せた後４μｌの0.25M EDTA（pH8.0）を加えて反応を停
止させた。
反応停止を行った反応液104μｌに等量のフェノール
／クロロホルムを加えてよく混和後、遠心（10,000rpm,
1分間）し、水層を分離した。この水層は更に１回この
抽出操作を繰り返した後、水層にクロロホルムを等量加
え、よく混和後、数秒間遠心して水層を分離し、等量の
4M酢酸アンモニウムを加え、更に全量の２倍量の冷エタ
ノール（−20℃）を加えてcDNAを沈澱させ、遠心（15,0
00rpm,10分間）により沈澱を集め、50μｌの2M酢酸アン
モニウムに溶解、100μｌの冷エタノールを加えてcDNA
を再沈澱させ、遠心して沈澱を集め乾燥した後、20μｌ
のTEバッファー（10mM Tris・HCl pH8.0,1mM EDAT）に
溶解し、−20℃に保存した。
実施例4. cDNAの32Ｐ−標識：実施例３に述べた方法により調製
したcDNA25ngを100℃,5分間加熱後、急冷し一本鎖DNAを
調製して、牛血清アルブミン20μg,32Ｐ−dCTP（3000Ci
/mmol） 1nmol dNTP（dCTPを含まず）、５μｇのランダムヘキサ
ヌクレオチド及び２単位のDNAポリメラーゼＩ（Klenow
断片）を加えTEバッファーで全量を50μｌとし、42℃で
20分間インキュベートし、直ちにセファデックスG50の
カラムをとおして、未反応の32Ｐ−dCTPを除去し、32Ｐ
−標識cDNAを得た。
実施例5. ドットハイブリダイゼーション法によるNANBV核酸の
検出：血清又は血漿10mlに等量の希釈液（50mM Tris・H
Cl,pH8.0,1mM EDTA）を加え、遠心操作（100,000×g,6
時間）により得た沈殿物を実施例１で述べた4Mグアニジ
ンチオシアネートを含む溶液0.2mlに溶解した後、８μ
ｇのポリＣ及び20μｌの2M酢酸ソーダ（pH4.1）を加
え、フェノール抽出、イソプロピルアルコール沈澱、グ
アニジン液に溶解、イソプロピルアルコール沈澱した。
この沈澱物を0.2mlのTE緩衝液（1mM EDTA含有の1mM Tri
s-HCl、pH8.0）に溶解の後、更にオリゴ（dG）カラムと
NENSORBカラムを通し、ホルムアミドを15％加えた後、
等量の20×SSC溶液（3M塩化ナトリウム,0.3Mクエン酸ナ
トリウム）を加えて、50℃にて15分間加熱処理し、氷中
で急冷したものをバイオダイン［Pall社（米国）製］ナ
イロンフィルター膜にドットした。ナイロンフィルター
は80℃で２時間ベーキングした固定した。固定が終了し
たフィルターはプレハイブリダイゼーション液（50％ホ
ルムアミド,5×SSC,5×Denhart液,50mMリン酸クエン酸
バッファーpH6.5,1％グリシン,100μg/ml鮭精子DNA）に
て42℃、６時間処理し液を除いた後、新たに５×107〜1
0×107cpmの実施例４で調製した32Ｐ−標識cDNAプロー
ブを加えた上記ハイブリダイゼーション液に再び浸し、
42℃にて20〜24時間ハイブリダイゼーションを行う。次
にフィルターを２×SSC−0.1％SDS溶液で４回洗浄し、
更に0.1×SSC−0.1％SDS溶液で２回洗浄後、乾燥させ、
オートラジオグラフィーを行い、核酸の有無を判定し
た。結果を表１に示した。即ち、実施例１で述べた精製
RNAを用い、実施例３で述べた方法により調製されたプ
ローブにより、高率に且つ、特異的にNANBVウイルス核
酸を検出した。（第１表） 実施例6. ラムダgt11を用いたcDNAライブラリーの作製：市販の
cDNAクローニングキット［Amersham社（英国）製］を用
いて、cDNAライブラリーを作製した。
（１） EcoRIリンカーを付加したcDNAの作製： 即ち、実施例３に述べた方法により調製したcDNA200n
gにキットに添付のＭ−バッファー４μｌと１×SAM液２
μｌを加え、蒸留水にて全量を20μｌとし、４単位のEc
oRIメチラーゼを加えて37℃にて60分間反応後、更に70
℃にて10分間加熱する。この様にして調製されたメチル
化cDNAの末端にEcoRIリンカーを付加するためにキット
に添付のＬ−バッファー３μｌとEcoRIリンカー２μｌ
を加え、蒸留水で全量を30μｌとした後、T4DNAリガー
ゼを５単位加え、15℃で16〜20時間インキュベートす
る。70℃で10分間加熱処理することによりリガーゼを失
活させ、次いでキットに添付のＥ−バッファー10μｌを
加え、蒸留水で全量を100μｌに調製して、100単位の制
限酵素EcoRIを加え37℃で５時間反応後、70℃で10分間
加熱して反応を停止した。次に、過剰のフリーのEcoRI
リンカー分子を除くために、キットに添付のカラムを通
し、cDNAを含む画分に1/10容量の3M酢酸ソーダと2.5容
量の冷エタノールを加え、−20℃にて沈澱させたcDNAを
約50ng/μｌになる様にキットの添付のSTEバッファーに
溶解した。
（２） ラムダgt11へのEcoRIリンカー付加cDNAの挿
入： 上記（１）のEcoRIリンカー付加cDNAの25〜100ngにキ
ットに添付ラムダgt11アームDNA2μｌとＬ−バッファー
１μｌを加え、全量を蒸留水で10μｌにし、更に2.5段
位のT4DNAリガーゼを加え、15℃にて16〜20時間インキ
ュベートして組換えラムダgt11DNA分子を作製した。
（３） 組換えラムダgt11cDNAのIn vitroパッケージン
グ： 上記（２）で作製した組換えラムダgt11cDNA液にキッ
ト添付のＡ液10μｌと15μｌのＢ液を加え、20℃にて２
時間インキュベート後、0.5mlのSM−バッファーを加
え、更に10μｌのクロロホルムを加えたものを組換え体
ファージとして４℃に保存した。
実施例7. cDNAライブラリーよりNANBV核酸を保有するクローン
のクローニング：実施例５に用いたcDNAクローニングキ
ットの添付の大腸菌Y1090株を50mlのLBM培地（１％トリ
プトン,0.5％酵母エキストラクト,1％塩化ナトリウム,5
0μg/mlアンピシリン）にて37℃で培養し、菌数が2.5×
108/mlまで増殖した対数増殖期の菌を遠心（3,000rpm,5
分間）し、氷冷した4mlの10mM硫酸マグネシウムに再浮
遊した。実施例５に述べたcDNAのライブラリーである組
換え体のラムダgt11ファージ液をSMバッファー（0.1M塩
化ナトリウム,8mM硫酸マグネシウム,50mM Tris・HCl,0.
01％ゲラチン）にて希釈し、この希釈ファージ液を0.1m
lと上記の菌液0.1mlを混合し、37℃にて15分間インキュ
ベートしてファージを大腸菌に吸着させた。次いで、45
℃に加温した3mlの軟寒天培地（１％トリプトン,0.5％
酵母エキストラクト,0.5％塩化ナトリウム,0.25％硫酸
マグネシウム,0.7％寒天,pH7.0）を各々のファージと大
腸菌の混合液に加え、すばやく混合した後、Ｌ−寒天培
地（１％トリプトン,0.5％酵母エキストラクト,1％塩化
ナトリウム,1.5％寒天,100μg/mlアンピシリン,pH7.0）
のプレートにまく。室温にて寒天を固めた後、42℃で３
時間インキュベート後10mM IPTG（Isopropyl β‐D-thi
ogal-actopyranoside）を浸み込ませ、乾燥したニトロ
セルローズフィルターを各々のプレート上に密着させ更
に、37℃にて３時間インキュベートした。フィルターは
TBSバッファー（10mM Tris,−HCl 150mM塩化ナトリウ
ム,pH7.4）で３回洗滌し、２％ウシ血清アルブミン液に
浸し、室温にて１時間インキュベートしてフィルター表
面の未反応の部分をブロッキングした。イムノスクリー
ニングするための一次抗体は、回復期のNANB型肝炎患者
のプール血清又は慢性肝炎患者血清を、市販のイムノス
クリーニングキット［Amersham社（英国）製］に添付の
大腸菌溶解液を1/20容量加えて室温にて30分間インキュ
ベートした後、0.2％ウシ血清アルブミン加TBSバッファ
ーにて希釈し、上述のフィルターを浸し室温にて１時間
反応させた。各々のフィルターはTBSバッファーに0.05
％Tween20を加えたTBSTバッファーにて４回洗滌し、バ
ーオキシダーゼ標識抗体ヒトIgG［Cappel社（西独）
製］を0.2％ゲラチン加TBSで1000倍に希釈した二次抗体
液に浸した。室温にて１時間後、フィルターはTBSTでよ
く洗滌し、50mlのTBSバッファーに0.4mlのDAB（3,3′−
diaminobenzidine tetrahydrochloride）と30％過酸化
水素液15μｌを加えた液に浸し、５から30分間室温にて
発色させ、フィルターを蒸留水で完全に洗滌し反応を停
止させた。
上記の操作により、約2,000,000個のプラーク中より
反応陽性と考えられるプラーク22個を認めたのでこれら
の22個のプラークを含むクローンを分離し、上記操作を
繰り返すことにより５個の陽性クローンを純化かつ単離
し、得たこれ等の陽性クローンを夫々、Ｎ−１、Ｎ−
２、Ｎ−３、Ｎ−４、およびＮ−５と命名した。更にま
た、実施例３に述べた方法により調製したcDNAを、実施
例６および実施例７に述べた方法にてラムダgt11に挿入
し、cDNAライブラリーを新たに作製した。この組換えラ
ムダgt11の約2,500,000個のプラークをイムノスクリー
ニングし、陽性クローン中よりＮ−18と命名したクロー
ンを得た。
これらのクローンはいずれも正常人血清、又はＢ型肝
炎患者血清とは反応せず、特異的にNANB型肝炎患者血清
と反応した（第２表）。
尚、これ等の各λgt11ファージクローンは、大腸菌に
感染させることにより移入し、λgt11ファージクローン
Ｎ−１は大腸菌Ｎ−１（微工研条寄第2416号）、Ｎ−２
とＮ−４は大腸菌Ｎ−２（微工研条寄第2431号）、ま
た、Ｎ−１、Ｎ−３、Ｎ−５及びＮ−18については大腸
菌Ｎ−18（微工研条寄第2418号）としてそれぞれ微工研
に寄託した。
抗原の中には、クローンＮ−３及びＮ−18のように急
性NANB型肝炎回復期患者及び慢性NANB型肝炎患者両血清
中の抗体と反応するもの、クローンＮ−１のように急性
NANB型肝炎患者血清中の抗体とのみ反応するもの、ま
た、クローンＮ−２、Ｎ−４およびＮ−５のように慢性
NANB型肝炎患者血清中の抗体とのみ反応するものがあ
る。このことは、クローンＮ−３およびＮ−18に対する
抗体の存在は急性又は慢性のNANB型肝炎への感染を示唆
し、クローンＮ−１と反応する抗体の存在は急性NANB型
肝炎の可能性を、また、クローンＮ−２、Ｎ−４および
Ｎ−５と反応する抗体の存在は慢性NANB型肝炎の可能性
をそれぞれ示すものと考えられる。
実施例8. NANBV遺伝子cDNAクローンの大量発現：実施例７で得
られたクローンＮ−１およびＮ−18の組換え体ファージ
を培養しファージDNAをフェノール法にて抽出し、エタ
ノール沈澱により精製した。この精製ファージDNAを制
限酵素EcoRIで切断し、低融点アガロースゲルにて電気
泳動後、NANBVのcDNAのバンドを含むアガロース断片を
切出し、0.5mlのTENバッファー（10mM Tris・HCl,1mM E
DTA,10mM NaCl pH7.5）を加え65℃にて加熱・融解後、
フェノールおよびエタノールでcDNAを抽出・精製した。
このNANBVのcDNA断片を非常に強力な大腸菌での発現プ
ロモーターを有するベクターに組み込んだ。即ち、大腸
菌のリン酸結合蛋白（phoS）をコードする遺伝子を含む
プラスミドpSN518（Amemura,M.,Shinagawa,H.,Makino,
K.,Otsuji,N.＆ Nakata,A.（1982）J.Bacteriol.152,69
2-701）のDNAを制限酵素HpaIで消化し、6.3kbのDNA断片
を上記と同様に回収・精製し、Bal31バッファー（12mM
塩化カルシウム,12mM塩化マグネシウム,0.2M塩化ナトリ
ウム,20mM Tris・HCl,pH8.0,1mM EDTA）100μｌに融解
し、30℃で３分加熱後,0.5単位のヌクレアーゼBa131
（宝酒造社製）を加え、30℃で３〜10分反応させ、EGTA
を20mM加え反応停止を行った。次いで、フェノールにて
DNAを抽出後エタノールにて沈澱させ、実施例５に記載
した様に両末端にEcoRIリンカーを付加し上記のNANBVの
cDNA断片を連結した。この様にして得られたプラスミド
で大腸菌DH1株（Proc.Natl.Acacd.Sci.USA,60:160,196
8）を形質転換し、得られた形質転換体は上記のNANBVの
cDNAよりニックトランスレーションキット［Amersham社
（英国）製］にて調製した32Ｐ−dCTP標識プローブを用
いて、NANBVのcDNAの存在の有無が確認された、32個の
クローンのプラスミドDNAをフェノール及びエタノール
で抽出・精製した。このDNAを制限酵素EcoRIで部分消化
た後、フェノール抽出，エタノール沈澱を行い、DNAを7
0mM Tris・HCl（pH7.5）,10mM塩化マグネシウム,5mM DT
T,200μＭのdNTPを含むバッファーに溶解しT4DNAポリメ
ラーゼ（宝酒造社製）を加え37℃で30分間加温した後、
再びフェノール抽出・エタノール沈澱したDNAを実施例
５に記載と同様の方法で翻訳停止コドンをもつユニバー
サルターミネーター［Pharmacia社（スウェーデン）
製］を挿入したプラスミドを作製した。次いで、これら
のプラスミドで再び大腸菌DH1株を形質転換した。得ら
れた夫々のクローンのコロニーを単離し、0.2％（W/V）
ブドウ糖と0.64mMのリン酸一カリウムを含むTris・HCl
（pH7.2）・バッファー培地にて37℃で一晩培養後、菌
体を集めリン酸一カリウムの濃度が0.064mMの同量の上
記培地に浮遊し、更に37℃にて６時間振盪培養し、菌体
を集め、50mMリン酸バッファーpH7.2,0.15M NaClに浮遊
しガラスビーズを用いて菌体を破砕することによりNANB
V抗原を大量に産生する大腸菌のクローンを、Ｎ−１よ
り２個（クローン0A-101,0A-118）、Ｎ−18より１個
（クローン0E-8）得ることが出来た。尚、各クローン間
のNANBV抗原産生量の比較は、後述の実施例11の（２）
の記載に従い、NANB型肝炎患者血清から調製したHRPO
（ペルオキシダーゼ）標識のNANBV1gG抗体を用いる酵素
抗体反応（ELISA）により行った。結果を第3a表と第3b
表に示す。
実施例9. NANBV抗原の精製：実施例８により調製した大腸菌ク
ローン0A-101および0E-8由来のNANBV抗原の粗抽出液を1
0〜50％（W/W）蔗糖密度勾配遠心（日立工機製;RPZ-35
T,ゾーナルローター,30,000rpm,18時間）し、NANBV抗原
の画分を採取した後、該画分を50mMリン酸バッファー
（pH7.2）・0.15M NaClに対し24時間透析し蔗糖を除去
する。上記操作を再度行いM/200リン酸バッファー（pH
7.2）に対し透析する。次いで10mlを40％（W/W）臭化カ
リウム含有のM/200リン酸バッファー40mlに添加混合
後、平衡密度勾配遠心（日立工機製;RP-50T-2ローター,
45,000rpm,48時間）し、NANB画分を採取する。該画分を
5mMリン酸バッファー（pH7.2）に対し24時間透析し、臭
化カリウムを除去する。この臭化カリウム平衡密度勾配
遠心を再度行った後、NANBV抗原を含有する画分をプー
ルし、膜濃縮した2mlを生理的食塩水で平衡化したSepha
cryl S200［Pharmacia社（スウェーデン）製］にてゲル
濾過クロマトグラフィーを行いNANB抗原画分をプール
し、精製NANB抗原Lot A-001a（クローン0A-101由来）お
よびLot E-001a（クローン0E-8由来）を得た。
実施例10. 精製NANBVワクチンの調製：実施例９で調製した精製N
ANB抗原液Lot A-001aおよびLot E-001aにホルマリン0.0
2％を加え、４℃にて２〜７日間静置してホルマリン処
理を行う。次いで、生理的食塩水を用いてホルマリン処
理NANB抗原40μg/mlおよび水酸化アルミニウム0.4mg/ml
を調製し、かかる両液を等混合し30分撹拌後遠心（3,00
0rpm,20分）した沈澱を13mMリン酸バッファー（pH7.2）
・0.15M NaClに再浮遊し、アルミ沈降NANBVワクチンを
試作した。
該ワクチンの免疫原性は、「生物学的製剤基準」に定
められた沈降組換えＢ型肝炎ワクチン（酵母由来）製剤
基準に準拠して行った。即ち、上記ワクチンを生後５週
のマウスの背部皮下にそれぞれ1mlづつ接種する。接種
から５週後に採血し、血中抗体価を受身赤血球凝集反応
により測定した。その結果を第４表に示す。
実施例11. （１） 受身凝集反応（PHA法）又は逆受身凝集反応（r
PHA法）用試薬の調製：羊の血液を採取し、綿布で濾過
して13mMリン酸バッファー・0.15M NaCl（PBS）で５回
洗浄後、血球0.4mlをPBS10mlに浮遊させ、Avrames等（I
mmunochemistry,6:67,1969）の方法によりグルタルアル
デヒドを用いて血球を固定し抗原又は抗体を吸着させ
る。即ち、上記血球浮遊液に、精製NANBV抗原又は精製N
ANBVIgG抗体（１〜50mg/ml）を1ml加え、撹拌する。次
いで、PBSで10倍希釈して2.5％に調製したグルタルアル
デヒド3mlを滴下し、室温で更に１時間撹拌を続ける。P
BSで５回洗浄し、1.0Mグリシンバッファー（pH7.2）の1
mlに浮遊し１時間放置後、PBSで再び５回洗浄し、正常
羊血清を１％含むPBSにて１％浮遊液を調製した。第５
表に抗NANBV抗体検出結果と第６表にNANBV抗原の検出結
果を示す。
（２） 酵素抗体反応（ELISA）用試薬の調製・実施例
９により精製NANBV抗原Lot A-001a及びE-001aを夫々、
フロイント完全アジュバントに混合し、ウサギを過免疫
して得た高度免疫血清を硫安分画し、IgG画分をとり、S
ephacryl S200でゲルクロマトグラフィーしてNANBVIgG
抗体を精製し、Lot A−１（免疫原 A-001a）およびLot
E-3（免疫原E-001a）を得た。次いで、該精製IgGを50mM
炭酸バッファー（pH9.6）で希釈し、100μｌづつをDYNA
TECH MICROELISAプレート［Greiner社（西独）製］に加
え、４℃で18時間放置しNANBVIgG抗体でプレートの各穴
を固相化する。各穴は0.05％ Tween-20-PBS（PBS-T）で
３回洗浄する。血中NANBV抗原の定量には、血清5mlをPB
S-T希釈液には２倍希釈後、遠心（100,000×g,4℃,4時
間）して得られた沈渣を0.1％TritonX-100を含む0.2ml
の上記バッファーに溶かした後、PBS-Tで２倍階段希釈
し、各希釈の0.1mlを抗体固相化穴に加え、37℃で１時
間反応する。PBS-Tで３回洗浄後、10％牛胎児血清−PBS
-Tで希釈したHRPO（ペルオキシダーゼ）標識NANBVIgG抗
体を各穴に加え、更に37℃にて１時間反応せさる。PBS-
Tで３回洗浄後、発色剤０−フェニレンジアミン0.5mg/m
lを0.05Mクエン酸−リン酸バッファー（pH5.0）で作製
し、これに基質である過酸化水素を２μl/ml添加したも
のを各穴に0.1mlづつ加え、遮光して40分間反応した。4
N硫酸を各穴に0.1mlづつ加え、反応を停止し、各穴発色
値を0D490で測定した。抗原測定の結果を第７表に示
す。
（３） ラジオイムノアッセイ（RIA）用試薬の調製：
実施例11−（２）に記載した、精製NANBVIgG抗体をクロ
ラミンＴ法（Greenwood等;Biochemical Journal,80:11
4,1963）により125Iで標識する。精製IgG4ml（5mg/ml）
を氷水中に置き、ゆっくり攪拌しながら1mCi/10μｌの
125Iを添加する。次いで、クロラミンＴを1ml（200μg/
ml）滴下し、５分間さらに撹拌する。メタ重亜硫酸ナト
リウムを1ml（200μg/ml）加え反応を停止し、PBSにて
透析して未反応の125Iを除去し、125I標識抗NANBV抗体
を調製した。NANB抗原又はNANBVIgG抗体固相化ビーズ
は、実施例９により調製したNANBV抗原、又は実施例10
−（２）により調製したNANBVIgG抗体をグルタルアルデ
ヒドで処理したポリスチレンビーズに加え、４℃にて一
晩置き、ビーズ表面に抗原又は抗体を結合後、牛血清ア
ルブミンを加え４℃にて一晩置き、非特異的な反応が起
こらないよう処理する。上記のように調製された、125I
−標識抗体と、抗原又は抗体固相化ビーズを用い、NANB
の抗原又は抗体を測定し得る。即ち、抗体測定の場合、
125I−標識抗体を0.1mlづつ反応トレーの各穴に加え、
更に検体0.1mlを加えて、上記の抗原固相化ビーズを各
穴に１個づつ加え、室温で一晩反応させビーズを蒸留水
でよく洗浄した後、オートガンマーカウンターにてcpm
を測定し、インヒビション％より抗NANBV抗体の有無を
測定する。又、抗原測定の場合には、抗体固相化ビーズ
をトレーの各穴に加え、検体0.2mlづつを加えて室温に
て一晩反応させビーズを蒸留水でよく洗浄した後、125I
−標識抗NANBV抗体を0.2mlづつ加え、37℃にて１時間反
応後、ビーズを再び蒸留水でよく洗浄してオートガンマ
ーカウンターにてcpmを測定する。第８表と第９表に抗
体測定結果と抗原測定結果を示す。
実施例12. ドットハイブリダイゼーション法とノーザンプロット
法によるNANBVRNAの検出：実施例８で得られた組換え体
ファージクローンＮ−１よりEcoRI消化により得たcDNA
断片0.1μｇと大腸菌プラスミドpUC19をEcoRIにて開裂
し、アルカリホスファターゼ処理したベクターDNA0.1μ
ｇ、10×リガーゼ反応液（1.1mM ATP,60mM Tris-HCl・p
H7.6,66mM塩化マグネシウム,100mM DTT）５μｌ、T4DNA
リガーゼ0.2単位を加え、反応容量を蒸留水にて50μｌ
とし、４℃,16時間反応させた。フェノール抽出、エタ
ノール沈澱後、TEバッファー10μｌに溶解し、大腸菌JM
109株をカルシウム・ルビジウム法にて形質転換し、ア
ンピシリンを50μg/ml加えた寒天平板培地にてNANBVcDN
Aをもつクローンを分離した。ハイブリダイゼーション
用の32Ｐ−標識cDNAは、上記プラスミドDNAをEcoRIで消
化し、実施例８に記載のごとく、低融点アガロース用い
てcDNAを単離精製し、アマーシャムニックトランスレー
ションキット［Amersham社（英国）製］と［α−32Ｐ］
dCTP（3000Ci/mmol）を用いて調製した。ドットハイブ
リダイゼーションは実施例５に記載の方法により行なっ
た。結果を第１図に示す。又、ノーザンブロット法によ
るNANBVRNAの検出は、実施例５に記載した方法により抽
出・精製したRNAを６％ホルムアルデヒド−アガロース
ゲルにて電気泳動し、10×SSC（1.5M NaCl,0.15Mクエン
酸ナトリウム）でニトロセルロース膜にトランスブロッ
ト装置［BIO-RAD社（米国）製］を用いる常法によりブ
ロッティングする。80℃、２時間ニトロセルロース膜を
ベーキングし、プレハイブリダイゼーション液（50％ホ
ルムアミド、５×SSC、５×Den-hart液,50mMリン酸−ク
エン酸バッファーpH6.5、１％グリシン,100μg/ml鮭精
子DNA）に浸し、42℃にて４時間以上処理する。次にプ
レハイブリダイゼーション液を捨て、新たに上記プロー
ブ32Ｐ−標識cDNAを加熱処理により一本鎖にしたものを
加え更に42℃で20〜24時間処理する。ハイブリダイーシ
ョンが終了後、２×SSC-0.1％SDS-0.1％ピロリン酸液で
３回、更に0.1×SSC-0.1％SDS-0.1％ピロリン酸液で50
℃にて３回ニトロセルロース膜を洗浄し、乾燥後オート
ラジオグラフィーを行い、NANBVのRNAを検出し得た。
実施例13. モノクローナル抗体を用いたNANB型肝炎の肝内のNANB
Vの同定：現在、NANB型肝炎の診断は除外診断によって
いるが、極めて不確実又不正確である。かかる問題に対
し、本発明により得たNANBV遺伝子と抗原は極めて有用
な手段を提供するものであるが、更に本発明により得ら
れたNANBV抗原のマウスモノクローナル抗体による肝内
抗原の検索から、極めて有用なNANB型肝炎の確診が可能
となった。即ち、実施例９により得た精製NANBV抗原Lot
E-001a20μｇとフロイント完全アジュバントを等量混
合したものをBALB/cマウス（６−10週令）の腹腔内に投
与し、３週間後と５週間後に初回と同様に免疫し最終免
疫より３日後に脾臓を摘出し、４区分に切断した後、ピ
ンセットで軽く圧縮して細胞を押出す。次に、ステンレ
ススチールメッシュ＃200で過した細胞をNS-1培地［R
PM I 1640（米国・Gibco社製）；ウシ胎児血清を最終濃
度15v/v％添加］で洗浄の後、浮遊して６×10細胞/mlに
調整した脾細胞浮遊と、２×107ミエローマ細胞（SP-2/
o-Ag14,ATCC No.CRL 1581）を混合し、常法岩崎ら著
「単クローン抗体」、第39ページ、講談社1982年年発行
に従ってポリエチレングリコールPEG6000により細胞融
合を行い、抗NANBV抗原に特異的モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマクローンを得た。肝内のNANBV
抗原の検索は、切除肝の凍結切片を作成し、アセトン固
定後、常法国立予防衛生研究所学友編「ウイルス実験学
（総論）」、第297ページ、丸善1973年発行に従い上記
のモノクローナル抗体を37℃、１時間反応させ、よくPB
S（0.1M塩化ナトリウム含有の0.005Mリン酸緩衝液、pH
7.0）で洗浄後、蛍光色素FITC−標識抗マウスIgG［Capp
el社（米国）製］を37℃で１時間反応後、再び該PBSで
よく洗浄し、蛍光顕微鏡にて特異蛍光の有無を観察し
た。結果を第10表に示す。
実施例14. NANBV遺伝子cDNAクローンN-18のパネル血清との反応
性：実施例７に述べたNANBV遺伝子cDNAクローンN-18の
パネル血清との反応性を、実施例７で述べたイムノスク
リーニングの方法により試験した（第11表および第12
表）。
クローンN-18は健常人血清、またはＢ型慢性肝炎患者
血清たは反応せず、特異的にNANB型慢性肝炎患者血清と
の反応性が高く、２種のパネル血清で92.3％〜100％の
陽性反応を示した。しかしながら、NANB型肝炎急性期ま
たは、回復期血清との反応性は約50％と低率であった
が、これは検体がいずれもNANBV感染回復期中のもので
あり、検出可能な抗体量が未だ血清中に産生されていな
いためと考えられる。
実施例15. λgt11ファージクローンの塩基配列の決定：実施例７
で得られたλgt11ファージクローンを培養し、ファージ
DNAを回収し、実施例８に述べた方法により制限酵素Eco
RIで消化後、NANBVのcDNA断片を単離し、大腸菌ベクタ
ーpUC19（C.Yanisch-Perron,J.Vieira,J.Me-ssing,Gene
33,103,1985）に組込んだ。即ち、１μｇのpUC19ベク
ター（宝酒造社製）DNAをバッファー（100mMTris・HCl,
pH7.5,7mM塩化マグネシウム,100mM NaCl）30μｌに溶解
し、１μｌのEcoRI（宝酒造社製）を加えて、37℃にて6
0分間インキュベート後、10倍濃度のアルカリホスファ
ターゼバッファー（100mM Tris・HCl,pH8.0,1M塩化カリ
ウム,10mM硫酸マグネシウム）を10μｌと蒸留水59μ
ｌ、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）１μｌを加
え、60℃にて２時間処理した。フェノール抽出を２回繰
返した後、水層に1/10容量の3M酢酸バッファー（pH4.
8）と２容量のエタノールを加え、−20℃でDNAを沈澱さ
せ、12,000rpmで５分間遠心後、沈澱を乾燥させて、
５′末端部のリン酸残基が除去されたベクターDNAを調
整した。次いで、上記のアルカリホスファターゼ処理ベ
クターDNA0.1μｇとcDNA断片0.1μｇを20μｌのリガー
ゼ用バッファー（66mM Tris・HCl,pH7.6,66mM塩化マグ
ネウム,10mMジチオスレイトール,0.1mMアデノシン−
５′−三リン酸）に溶解し、１μｌのリガーゼ（宝酒造
社製）を加え、16℃にて３時間インキュベートした。フ
ェノール抽出とエタノール沈澱によりDNAを回収後、大
腸菌JM109株（宝酒造社製）を形質転換することによ
り、NANBVcDNAが挿入されたプラスミドを保有するクロ
ーンを分離した。このクローンよりプラスミドDNAを精
製し、7-DEAZAシークエンスキット（宝酒造社製,Mizusa
wa,S.,Nishimura,S.and Seela,F.（1986）Nucleic Acid
s Res.,14,1319-1324）を用いてNANBVcDNAの塩基配列の
決定を行った。クローンＮ−１は第2a図、クローンＮ−
２は第2e図、クローンＮ−４は第2f図、クローンＮ−３
は第2b図、クロークN-18は第2c図、そしてクローンＮ−
５は第2d図に示す塩基配列をそれぞれ保有していた。
発明の作用と効果 （１） 本発明のNANBV遺伝子と抗原およびその抗原に
対するモノクローナル抗体は、NANB型肝炎に特異性が極
めて高く、かつ感染力を有していないため、ワクチン及
び診断剤の有効成分として優れた有効性と安全性を兼備
している； （２） 本発明に係るNANB抗原の優れた免疫原性ないし
は抗原性、その遺伝子と抗体の特異性は実施例10、11及
び12に記載のとおりである； （３） 遺伝子工学技術により製造されるので、製造工
程下での培地の組成等の諸因子について既知のものが多
く、また、為害作用を及ぼす迷入因子混入の確率は低く
なり、かつ製造工程の制御と精製の精度が高いため、生
物学的製剤としてのNANB抗原の品質を左右する純度と安
全性並びに均質性が十分に確保され、保証される； （４） 本発明に係るNANB抗原の製法は、病原体NANBを
直接使用しないため、製造工程下でのバイオハザードの
可能性は実質的に皆無であり、製造工程が効率的かつ能
率的である； （５） 本発明の製法によれば、大量かつ高品質のNANB
V抗原の低コスト生産が可能である； （６） 血中及び肝中に本抗原に対するポリクローナル
抗体、本抗原に対するモノクローナル抗体と反応する抗
原、及び本遺伝子とハイブリッドを作るRNAの存在を検
討することにより、NANB肝炎の診断が可能となり、従来
不確実な除外診断がなされていた本感染が確信しうるよ
うになる。また、輸血液のスクリーニングによって、NA
NBによる輸血後肝炎の発症を未然に防ぐことが可能とな
る。
【図面の簡単な説明】
第１は32Ｐ−NANBVcDNAをプローブとした、NANB型肝炎
患者血漿中のウイルスRNAのドットハイブリダイゼーシ
ョン法によるオートラジオグラフィー；検体１、２、
３、４、５はNANB型肝炎患者血清，検体６、７はＢ型肝
炎患者血清および検体８は健常人血清。 第2a、2b、2c、2d、2eおよび2f図は夫々、クローンＮ−
１、Ｎ−３、N-18、Ｎ−５、Ｎ−２およびＮ−４中に存
在するNANBVcDNAの塩基配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/29 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２４１８ 早期審査対象出願 (56)参考文献 特表 平２−500880（ＪＰ，Ａ) 欧州公開318216（ＥＰ，Ａ１) Ｊ．ｆｏ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，10（1985）ｐ．307− 319 ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ （1985）88ｐ．773−779 ＳＥＭＩＮＡＲＳ ＩＮ ＬＩＶＥＲ ＤＩＳＥＡＳＥ ６（1986）ｐ．56− 66 Ｊ．ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｄ ｉｓｅａｓｅ 156（４）（1987．10) ｐ．636 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．80（1983）ｐ．1194−1198 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．80（1983）ｐ．3787−3791

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式（Ｉ）〜（Ｖ）のそれぞれの塩基配列か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基配列により
    コードされるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列のう
    ち連続する少なくとも５個のアミノ酸からなる一部配列
    であって、正常人及びＢ型肝炎患者の両血清のいずれと
    も抗原抗体反応せず非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清と抗体抗
    原反応する純粋なペプチド。 該式（Ｉ）〜（Ｖ）はそれぞれ次の配列： GAATTCCAAAAAGAGCAAAA CAAACCGCCGAAGAAAAAAC TAATAAGAGAAGAAAAGGCG AAGAGACACAGGAAAAAAAA AACAGAGACGAAGGTCAGAT AGAAAAAAAGCAAGGAATTC ・・・（Ｉ） GAATTCCGAGAACAAGACCA GATAAAAACCAAAGACAGAA CACAACAGAGAAAGACGAAA AGAAGCACCAATCGCAGGCG AAGCAAAAACGAAAAAAAAA AAAAAAAGGAATTC ・・・（II） GAATTCCAAGAAAAAAAGGG AGAAGCCAGCAATGGAGAAG CCGAAAACGACACACACAAG AAACAAAGGAGGTACAAAGA AAAAGAAAAAACGGCAACAA ATAACCCAGGAAAGAACAAA AAGCCAAGAGTGGGCAGAAT AAAAAACTGGAACCGGGAGG GAAGGAAGGACGCATATCAG ATTAGAAAAAGGAGGGAATT Ｃ・・・（III） GAATTCCCAACGCGTCGGCT TGGCCCGCGCCTTGGCCGCC GACCCGCGCTGATGGCCGTG GAATTC・・・（IV） GAATTCCGGGGTATTTGCCT CGATCTGCCTGCTCAGCGCT TCGGCCCTCGGCTTGGGCGC CCTGCTGCTGGCTTCCGAGC AGCTATTCAGCGCCTTGAAA GTGGTTGGCGCGGCGTACGT GTCCGGGAATTC・・・（Ｖ） （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
    アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基およびＴは
    デオキシチミジル酸残基を表し、各式の左端および右端
    は夫々５′末端、３′末端を表す。）で表わされる。
  2. 【請求項２】式（Ｉ）〜（Ｖ）のそれぞれの塩基配列か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基配列により
    コードされるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列のう
    ち連続する少なくとも５個のアミノ酸からなる一部配列
    であって、正常人及びＢ型肝炎患者の両血清のいずれと
    も抗原抗体反応せず非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清と抗体抗
    原反応する純粋なペプチドの２種以上を混合してなる混
    合ペプチド。 該式（Ｉ）〜（Ｖ）はそれぞれ次の配列： GAATTCCAAAAAGAGCAAAA CAAACCGCCGAAGAAAAAAC TAATAAGAGAAGAAAAGGCG AAGAGACACAGGAAAAAAAA AACAGAGACGAAGGTCAGAT AGAAAAAAAGCAAGGAATTC ・・・（Ｉ） GAATTCCGAGAACAAGACCA GATAAAAACCAAAGACAGAA CACAACAGAGAAAGACGAAA AGAAGCACCAATCGCAGGCG AAGCAAAAACGAAAAAAAAA AAAAAAAGGAATTC・・・（II） GAATTCCAAGAAAAAAAGGG AGAAGCCAGCAATGGAGAAG CCGAAAACGACACACACAAG AAACAAAGGAGGTACAAAGA AAAAGAAAAAACGGCAACAA ATAACCCAGGAAAGAACAAA AAGCCAAGAGTGGGCAGAAT AAAAAACTGGAACCGGGAGG GAAGGAAGGACGCATATCAG ATTAGAAAAAGGAGGGAATT Ｃ・・・（III） GAATTCCCAACGCGTCGGCT TGGCCCGCGCCTTGGCCGCC GACCCGCGCTGATGGCCGTG GAATTC・・・（IV） GAATTCCGGGGTATTTGCCT CGATCTGCCTGCTCAGCGCT TCGGCCCTCGGCTTGGGCGC CCTGCTGCTGGCTTCCGAGC AGCTATTCAGCGCCTTGAAA GTGGTTGGCGCGGCGTACGT GTCCGGGAATTC・・・（Ｖ） （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
    アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基およびＴは
    デオキシチミジル酸残基を表し、各式の左端および右端
    は夫々５′末端、３′末端を表す。）で表わされる。
  3. 【請求項３】式（Ｉ）〜（Ｖ）のそれぞれの塩基配列か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基配列により
    コードされるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列のう
    ち連続する少なくとも５個のアミノ酸からなる一部配列
    であって、正常人及びＢ型肝炎患者の両血清のいずれと
    も抗原抗体反応せず非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清と抗体抗
    原反応する純粋なペプチドをコードするDNA。 該式（Ｉ）〜（Ｖ）はそれぞれ次の配列： GAATTCCAAAAAGAGCAAAA CAAACCGCCGAAGAAAAAAC TAATAAGAGAAGAAAAGGCG AAGAGACACAGGAAAAAAAA AACAGAGACGAAGGTCAGAT AGAAAAAAAGCAAGGAATTC ・・・（Ｉ） GAATTCCGAGAACAAGACCA GATAAAAACCAAAGACAGAA CACAACAGAGAAAGACGAAA AGAAGCACCAATCGCAGGCG AAGCAAAAACGAAAAAAAAA AAAAAAAGGAATTC・・・（II） GAATTCCAAGAAAAAAAGGG AGAAGCCAGCAATGGAGAAG CCGAAAACGACACACACAAG AAACAAAGGAGGTACAAAGA AAAAGAAAAAACGGCAACAA ATAACCCAGGAAAGAACAAA AAGCCAAGAGTGGGCAGAAT AAAAAACTGGAACCGGGAGG GAAGGAAGGACGCATATCAG ATTAGAAAAAGGAGGGAATT Ｃ・・・（III） GAATTCCCAACGCGTCGGCT TGGCCCGCGCCTTGGCCGCC GACCCGCGCTGATGGCCGTG GAATTC・・・（IV） GAATTCCGGGGTATTTGCCT CGATCTGCCTGCTCAGCGCT TCGGCCCTCGGCTTGGGCGC CCTGCTGCTGGCTTCCGAGC AGCTATTCAGCGCCTTGAAA GTGGTTGGCGCGGCGTACGT GTCCGGGAATTC・・・（Ｖ） （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
    アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基およびＴは
    デオキシチミジル酸残基を表し、各式の左端および右端
    は夫々５′末端、３′末端を表す。）で表わされる。
  4. 【請求項４】請求項３に記載のDNAを含むベクター。
  5. 【請求項５】請求項４に記載のベクターを含有する形質
    転換体。
  6. 【請求項６】抗原抗体反応によって非Ａ非Ｂ型肝炎を検
    出するための診断剤にして、請求項１に記載のペプチド
    又は請求項２に記載の混合ペプチドを、抗原抗体反応を
    呈するに十分の量含有することを特徴とする診断剤。
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