JPH04126086A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、該抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを用いた非ａ非ｂ型肝炎の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原に関する。より
詳しくは、本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と特異的に
抗原抗体反応を示す抗原ポリペプチド並びに該抗原ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを
用いた非Ａ非Ｂ型肝炎の給断法に関する。

（従来の技術） 非Ａ非Ｂ型肝炎とは、伝搬性のウィルスにより惹起され
ると考えられているウィルス性肝炎の内、実体の明らか
にされている　Ａ型肝炎ウィルス（■＾■）、Ｂ型肝炎
ウィルス（ＦＩＢｖ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）、
あるいは肝細胞にも感染して症状を呈するサイトメガロ
ウィルス（ｆｆＶ）、エプスタイン・バーウィルス（Ｅ
ＢＶ）、アデノウィルス等をその病因とする肝炎を、ウ
ィルス学的・血清学的に除外したものである。輸血を受
けた人の１０〜２０ｘに輸血後肝炎が発生することはよ
く知られているが、輸血後肝炎がＢ型肝炎ウィルス以外
によっても起きることが明らかになったのはオールター
　［Ａｌｔｅｒ、Ｍ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、　Ａｎｎａｌ
ｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａ＋Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　７７．
６９１（１９７２）］、プリンス［Ｐｒ１ｎｃｅ。

＾、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ　２．２４１（
１９７４）］　、］ファインストー”ｙ　［Ｆｅ１ｎｓ
ｔｏｎｅ、Ｓ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２
９２．７６７（１９７５）］の報告以来である。その後
＾型肝炎ウィルスの関与も否定され、「非Ａ非Ｂ型肝炎
ｊと診断されるようになった。

この肝炎が感染性の疾患であることは、輸血の他、血液
製剤（凝固因子製剤や免疫グロブリン製剤）によっても
発症し、更にそれらの製剤ロットによって肝炎発生の見
られるものと見られないものがあるという疫学的な調査
から推定されていた。濾過実験や、クロロホルム、ホル
マリン処理後の感染実験、比重遠心法による分画法など
により、この感染病原因子はエンベロープを持つ小型の
ＲＮＡウィルスであり、おそらくトガウィルス（Ｔｏｇ
ａｖｉｒｕｓ）の一種であろうと考えられていた。

近年、輸血により起こる非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原遺
伝子の単離が２つのグループにより報告された。１つは
カイロン社（米国、シアトル）のグループによるもので
あり［Ｃｈｏｏ、　Ｑ−Ｌ、　、　ｅｔ　ａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．３５９（１９８９）、　Ｋｕ
ｏ、Ｇ、、ｅｔ　ｉｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ２４４、３６
２＜１９８９）、特表平２−５００８８０号　公報、欧
州特許出願公開第３１８２１６号明細書（１９８９）コ
、もう一方は岡山大学（現鹿児島大学）の有馬らのグル
ープによるものである［　Ａｒｉｍａ、　Ｔ、　、　ｅ
ｔ　＆１．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ８．１２７５（１９
８８）、　Ａｒｉｍａ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、　Ｇａ５ｔ
ｒｏｅｎｔｅｒｏｌ。

ｇｉａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　２４．６８５（１９８９）
、＾ｒｉｍａ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、　Ｇａｓｔｒｏｅｎ
ｔｅｒｏｌｏｇｉａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　２５，２１８
（１９９０）、欧州特許出願公開第３６３０２５号明細
書（１９９０）］。

両者の抗原はともに多くの輸血後非ＡＩ￥Ｂ型慢性肝炎
患者血清および一部の散発性非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血
清に特異的に反応し、正常人血清、＾型急性肝炎および
Ｂ型慢性肝炎患者血清とはほとんど反応しなかった。ま
たこれらをコードする遺伝子は細胞遺伝子由来ではなく
、これらの抗原は非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子に由来
するものと考えられた。カイロン社のグループはこの遺
伝子を含有するウィルスを　Ｃ型肝炎ウィルス（ＥＣＶ
）と命名した。但し、感染性ウィルス粒子や全ウィルス
ゲノムの単離はなされておらず、いまだ非Ａ非Ｂ型肝炎
ウィルスとしての病原性を証明するには至っていない。

その後、複数の日本のグループにより非Ａ非Ｂ型肝炎患
者血清よりイムノスクリーニング法および逆転写−ポリ
メラーゼ・チエイン反応（ＰＣＢ＞法を用いてｆＴＣＶ
にホモロジーを有する遺伝子断片がクローニングされた
が、カイロン社のＨＣＶに比べて塩基配列レベルで５ｘ
〜３０％程度、アミノ酸レベルで５ｘ〜２０　Ｘ程度の
相違が認められ、ＨＣＶの日本型変異株であると考えら
れている［口ｅｎｏ、　Ｍ、　、　ｅｔａｌ、、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１８．２６８
５（１９９０）、高田伸夫ら、肝ｍｌ　３１５ｕｐＰ１
．２１７（１９９０）、金子周一ら肝１１３１５ｕｐｐ
１．２］３（１９９０）、加藤宣之ら、肝臓３１５ｕｐ
ｐ＋、２１４　（１９９０）コ。

このように非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに関する知見が得ら
れつつあるが、ＦＩＣＶに地域差に基づく亜型がどの程
度存在するのが、また、同様の感染経路で同様の病態を
惹起する別種のウィルスが存在するのかなどについては
十分研究はなされていない、また、先進諸国でみられる
輸血によらない、”散発性”非Ａ非Ｂ型肝炎も全て上述
のＦＩＣＶで惹起されるものかどうかはまだ確定されて
いない。

すなわち全ての非Ａ非Ｂ型肝炎に対応した詳細且つ有用
な診断法及び治療用手段の開発に必要な抗原の同定に関
する研究は、いまだ十分には完成されていない、なお、
＃１発途上国でみられる軽口感染により伝搬するタイプ
の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの１種については、ゲンラボ
社（米国）と米国ＣＤＣのグループによりその抗原の同
定と遺伝子の一部の単離が成され、Ｅ型肝炎ウィルス（
ＦＩＥＶ）と命名されている［国際公開第９０１００５
９７号パンフレット（１９９０）、　Ｒｅｙｅｓ、Ｇ、
Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７．１３３５
　（１９９０）　］がこれらは上述の輸血後及び散発性
非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスとは関係ない。

ところで厚生省の推計（１９８８年）によれば輸血後急
性肝炎の９割以上が、ｔた散発性急性肝炎の約５割が非
Ａ非Ｂ型肝炎と推計されているが、こうして起こった肝
炎の、およそ半数が慢性肝炎に進み、１０〜２０　Ｋは
肝硬変へと進行する。そして更には肝癌へと進んでいく
過程においても、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの持続感染お
よび／またはそれに伴なう慢性炎症が関係していると考
えられる。従って、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの予防及び
治療法を確立することは医療上の緊急の要請であるが、
以下に述べるように現在においてもなお、１００％確実
な於断法、予防法、治療法の確立には至っていない。

すなわち、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスについては該ウィル
ス抗体診断キットが既に市販されているものもあるが、
輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎血清の約７割としか反応しないこ
と［Ｋｕｏ、　Ｇ、　、　ｅｔ　ａｔ、　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２４４．３６２（１９９０）］、慢性期非＾非Ｂ型
肝炎患者血清との反応率は高いが急性期の非Ａ非Ｂ型肝
炎患者血清および散発性非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との反
応率は低いこと［Ｍｉｙａｍｕｒａ、　Ｔ、　、　ｅｔ
　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ−３ｃｊ、Ｕ
、Ｓ、＾、　８７，９８３（１９９０）、西岡久寿弥ら
、内科６４．１０２７　（１９８９）コ、また抗体陽転
！でに平均４ケ月を要すること［＾ｔｌｅｒ、　Ｈ，Ｊ
、　、　ｅｔａｌ、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３０
．１４９４（１９８９）］および該ウつルス抗体の存在
が必ずしもウィルス血症と一致しないこと［岡本宏明、
肝臓３１５ｕｐｐ１．４０（１９９０）、古澤浩司、肝
臓３１５ｕｐｐ１．４２（１９９０）］等が知られてお
り、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体の診断法には未だ多く
の解決すべき課題が残されている。なお一般に、ウィル
スを異種動物で継代した場合にウィルス遺伝子に変異が
生じることが知られているので、該抗原をクローニング
する場合にはヒト血漿を出発材料にするのが好！しい。

（発明が解決しようとする課Ｍ） 本発明者らは、従来の該ウィルス抗原よりも有用な抗原
、即ち　１）輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清への反応率
の高い抗原、２）散発性非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清への反
応率の高い抗原、３）急性期の患者血清にも反応できる
抗原（より感染早期にウィルス抗体を検出できる抗原）
、４）ウィルス血症と相関性の強いウィルス抗体を検出
できる抗原を発見すべく鋭意研究した結果、日本人ヒト
血漿より新たな非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原の遺伝子を
取得し、その１次構造を決定したところ、従来の抗原と
は異なる新規な非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原であること
を知り本発明を完成した。

＜８題を解決するための手段） 本発明の実施においては、特に指示されない限り、当該
分野で公知である分子生物学、微生物学組換えＤＮＡ、
および免疫学の従来の手法が採用される。このような手
法は、以下の実験書を参照されたい。

実験書１：　　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ、Ｅ、Ｆ、、およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ！ｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄ、；　
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　（１９８９）実
験書２：　　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　１巻（Ｇｌｏｖ
ｅｒ、　Ｄ、　Ｍ、編）ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　　（１
９８５）実験書３：　　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３巻
（Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、　Ｍ　　編）ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ
ｓ、　　（１９８７）実験書４：　　Ｈａｎｄｂｏｏｋ
　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｉｍｗｕｎ。

１ｏｇｙ、　４ｔｈ　ｅｄ、　１〜ＴＶ巻（Ｗｅｉｒ、
　Ｄ、！、絹）、Ｂｌａｃｋｗｅｌ＋　　＜１９８６） 実験書５：　　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　
ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ。

１ｏｇｙ　（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、
、編）　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　　（１
９８８） 実験書６：　　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅａｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　１８５巻（Ｇｏｅｄｄ−ｅｌ、Ｄ、Ｖ、編）　Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）（１）ウィ
ルスＲＮＡの調製 ａ）患者血液からのＲＮＡの調製 ＨＢｓ抗原陰性、ＨＢＶ−ＤＮＡ陰性、高ＡＬＴ　（Ｇ
ＰＴ）活性値（＞３５１’Ｕ／］）を示すヒト血漿また
は非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清をプールし、ウィルスＲＮＡ
調製のための出発材料とする。ウィルス粒子はポリエチ
レングリコール沈澱法により沈澱物として濃縮・回収し
、沈澱物からのＲＮＡの抽出はグアニジン・チ゛オシア
ネート法等の方法［Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ、お
よび５ａｃｃｈｉ、Ｌ：＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６２．１５９　（１９８７）コ
により行なわれる。この際、ＲＮａｓｅによるＲＮＡの
分解を防ぐためＲＮａｓ　ｅインヒビターとして、例え
ばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボネー
ト、バナジウム複合体等を添加することも出来る。

ｂ）患者肝組織からのＲＮＡの調製 過去に非＾非Ｂ型肝炎に感染したことがあると考えられ
る肝臓がん患者より切除された肝組織より常法［実験書
１，７章］によりｍＲＮＡを調製することができる。

（２）ＣＤＮＡライブラリーの構築 得られたＲＮＡを鋳型とし、ランダムヘキサマーをプラ
イマーとしてＧｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｏ法
［Ｇｅｎｅ２５、２６３　（１９８３）　］により二本
＠　ｃＤＮＡを合成する。

該ｃＤＮＡはλｇｔｌ　１フアージベクターに挿入され
る。

λｇｔｌｌを用いたイムノスクリーニング法は特定の抗
体に対応する抗原の遺伝子を単離するために開発された
方法であり公知である［　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，＾、　ａ
ｎｄＤａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾
ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８０，１１９４（１９８３）
、実験書２．ｐ４９−７８　］、　　まなλｇｔｌｌ以
外に　＾ＺＡＰ、　Ａ　ＺＡＰＩＩ、ｐＵｃ１９．ｐＵ
ＥＸｌなどのベクターに挿入する事も出来る１組換え体
λｇｔｌｌは、宿主の大腸菌（例えばＹ１０９０株など
）に感染させるが、一定の条件下でバクテリオファージ
の増殖機構に従って増殖し、これに伴って、先に組み込
まれたｃＤＮＡも増幅される。増殖したバクテリオファ
ージは一定の条件下で、宿主大腸菌を溶菌し、肉眼的に
認識できるプラークを形成する。

（３）患者血清による　ｃＤＮＡライブラリーのイムノ
スクリーニング λｇｔｌｌファージベクターに挿入された　ｃＤＮＡは
、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）との融合ポリペ
プチドとして発現されるため、特定の抗原に対して生じ
た特異的な抗血清で多数の組換え体λｇｔ１１をスクリ
ーニングすれば、特定の抗原ポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡを免疫化学的方法によって同定することができ
る０本発明においては、上記（２〉で作製した　ｃＤＮ
Ａライブラリーを、種々の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清また
はそのプール血清でスクリーニングする事が望ましい、
具体的には、プラークを形成している培養シャーレ等か
ら発現された融合抗原蛋白をニトロセルロース膜にプロ
ットし、上述の患者血清を　１次抗体として反応させ、
これにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗（ヒト　ＩｇＧ）　
ＩｇＧ等を２次抗体として反応させ、発色反応陽性とな
る１ラークを単離する。

（４）ｃＤＮＡ配列の決定 こうして得られた本発明の抗原遺伝子の塩基配列は、組
換え体λｇｔｌｌＤＮＡ上、およびサブクローニング後
のプラスミドベクターＤＮＡ上でサンガー法［Ｓａｎｇ
ｅｒ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、　、　７４５４６３　（
１９７７）、実験書１．１３章コにより法定することが
出来る。

（５）抗原遺伝子の塩基配列を利用した患者血清中の該
ウィルスゲノムの検出法 本発明の非Ａ非ｎ型肝炎ウィルスポリヌクレオチドの塩
基配列の開示部分を基本として、連続した８残基以上の
部分を包含するポリヌクレオチドを、ホスホアミダイト
法［Ｆｌｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ、　ｅｔｉ＋、　
）ｌａｔｕｒｅ　３１０，１０５−１１１（’１９８４
）−］等の合成法、或は市販のＤＮＡ合成機（例えば、
アプライドバイオシステムズ社３８０Ａ型ＤＮＡ合成機
など）を用いて合成する事が出来る。このポリヌクレオ
チドは、本発明のウィルスゲノムとハイブリダイズし、
該ウィルスの同定、検出に用いるプローブ（またはプラ
イマー）として有用である。該ポリヌクレオチドを診断
に利用する際には、常法により、放射性プローブ、ビオ
チン蛍光プローブ、及び化学発光プローブ等の標識プロ
ーブとして用いるのが、上述のハイブリダイゼーション
法、標識法、およびシグナルの増幅、検出方法はいずれ
も公知であり、高橋豊三、　　ＤＮＡプローブ■シーエ
ムシー（１９９０）を参照し実施することができる。

これまで非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスは患者血清中に極微量
にしか存在しない事（Ｂ型肝炎ウィルスの１／１０５程
度）が知られている。この様な場合には、本発明の塩基
配列の一部を利用した逆転写−ＰＣＲ法［Ｋａｗａｓａ
ｋｉ、　Ｅ、　Ｓ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５．
５６９８（１９８８）、岡本宏明、肝臓　３１．５ｕｐ
ｐ１．４０　（１９９０）　］などにより目的ウィルス
ゲノムを増幅後検出する事も出来る。

（６）非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポリペプチド及び融
合抗原ポリペプチドの調製 ａ）遺伝子組換え技術を用いた組換え抗原ポリペプチド
及び組換え融合抗原ポリペプチドの発現：該抗原ポリペ
１チドは公知の発現ベクターを用いて発現できる０例え
ば、大腸菌での発現は実験書１の１７章、実験書３、ｐ
５９−８８、実験書６、ｐｌｌ−１２８などを、酵母で
の発現は実験書３　、　ｐ１４１−１６１、実験書６、
Ｐ２３１−４８４、また、は乳動物細胞を宿主とした場
合の発現方法は実験書１の１６章、実験書３　、　ｐ１
６３−２１２、実験書６、ｐ４８５−５９８などを参考
に実施することが出来る０発現した組換え抗原ポリペプ
チドは、溶解した細胞あるいは培地から当該分野では公
知の蛋白精製の手法（限外濾過、遠心分離、透析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲルー過、電気泳動、アフ
ィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等）を利用す
ることにより精製することができる。腋な、融合抗原ポ
リペプチドの簡便な発現方法としては、例えば本発明の
組換え体λｇｔｌｌクローンＮＳ４３が溶原化した大腸
菌Ｙ１０８９株をＩＰＴＧ　（１ｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈ
ｉｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）で発現誘導する方
法である［実験書２　、　ｐ７ロー７７　］　、　　発
現した融合抗原ポリペプチドは、ゲルろ過および／また
はβ−ｇａｌに対するマウスモノクローナル抗体（ベー
リンガーマンハイム、　５６７７７９）を用いた免疫沈
降法またはアフィニティークロマトグラフィーにより精
製できる。また、β−ｇａｌ以外を用いた融合抗原ポリ
ペプチドの発現方法は、実験書６、ｐｌｌ９−１６５に
示されている。

ｂ）ペプチド合成による該抗原ポリペプチドの調製 該抗原ポリペプチドは、本発明で決定したアミノ酸配列
をもとに化学合成により供給されうる。

この場合、全配列を合成が比較的容易な長さの断片（１
０〜５０残基）に、　しがも、隣り合う断片同士が５〜
１０残基程度重複するよう分割して合成するのが好まし
い、抗ウイルス抗体の検出のためには、これらの分割合
成したペプチド断片をすべて混合して使用するが、エピ
トープマツピングにより抗原性領域が特定されれば、抗
原性領域を含む断片だけを単独または混合して使用する
ことができる。

該抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を含む各種ポリペプ
チド（１０−１００履ｅ「）は４３０Ａ型自動ペプチド
合成Ｉ！（アプライド・バイオシステムズ）を用いて合
成できる０合成したポリペプチドは樹脂よりトリフルオ
ロメタンスルホン酸またはフッ化水素を用いて切り出し
、抽出後、逆相Ｃ１８カラムを用いて精製できる。

（７）イムノアッセイによる患者血清中のウィルス抗体
の検出法 本発明によって得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポ
リペプチド、またはその一部のエピトープからなる抗原
ポリペプチドは、イムノアッセイを用いて、例えば、血
液、血清、髄液などの体液試料およびヒトγグロブリン
製剤などを含む生物学的試料に於ける非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
ィルス抗体の存在を検出するために使用することができ
んこのイムノアッセイにおいては上記抗原ポリペプチド
と試料中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体との間で免疫学
的結合体（抗原抗体結合物）を形成し得る条件下で該抗
原ポリペプチドを試料と接触させるのが望ましい、抗原
抗体結合物がたとえわずかでも形成されるのであれば、
試料中に非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体が存在することが
分かり、適当な手段によって検出・測定できる。

このような方法として、免疫沈澱法、凝集法、ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）　、　ＥＩＡ、　ＥＬＩＳＡ、
ウェスタンプロットアッセイあるいはパインディングイ
ムノアセイなどがある。さらに該抗原ポリペプチドを用
いるアッセイプロトコールは競合的または非競合的結合
方法によってもできる。

該抗原ポリペプチドはアッセイ方法に応じて標識物でラ
ベルしてもよい、ポリペプチドに結合するラベルは公知
の物を用いる事ができ、例えば、蛍光分子、発光色素分
子、放射性分子、酵素、コファクター、ビオチン・アビ
ジン、金コロイド、磁性粒子などがある。又、本ポリペ
プチドを化学修飾すれば、公知手段によって、キアリア
タンパクやキャリアペプチドあるいは公知の支持体に結
合することができる。この様な支持体としては、例えば
ポリスチレンやポリビニル製のマイクロタイタープレー
トやビーズ、ガラス管やガラスピーズ、また紙、セルロ
ース、セルロース誘導体やシリカのようなりロマトグラ
フィー用支持体も用いることができる。

これらアッセイ法のうち、特に患者血清や血液あるいは
血液製剤などを大規模スクリーニングするには、ＥＬＩ
ＳＡ、凝集法またはウェスタンプロットアッセイなどが
好適である。

最も簡便な方法としては、例えば本発明により得られた
抗原を例えば　β−ｇａｌとの融合蛋白として発現させ
、ニトロセルロース展にプロットしたものを固相に固定
した抗原とし、ＥＬＩＳＡ法により非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルス抗体を検出する方法（イムノプラークアッセイ、ウ
ェスタンプロットアッセイなど）である。

（発明の効果） 本発明の抗原ポリペプチドは、従来の抗原を利用した検
査法では検出不可能な非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体の検
出に有用である。また、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル
スポリヌクレオチド配列を利用すれば、従来の検出法を
用いた検出感度では測定不可能なウィルス粒子の検出が
可能である。

また、該抗原ポリペプチドを用いて、該ウィルス抗原の
検出及び非Ａ非Ｂ型肝炎の治療に利用し得るポリクロー
ナル抗体及びモノクローナル抗体を作成することが出来
る。また、該抗原ポリペプチドはウィルスの感染予防及
び感染後の治療のためのワクチンの製造に利用できる。

実施例 以下に実施例をあげて１本発明を更に具体的に説明する
が、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１：　　ｃＤＮ＾ＤＭＡための血漿ＲＮＡの抽出
ＡＬＴ活性値が異常高値（＞７０１０／ｌ）でＨＢｓｔ
ｉｔＪ［および［１１１ｖ−ＤＭＡが陰性を示す凍結血
漿２１を室温で融解したのち、５０００ｒｐｍ（日立、
　ＲＰＲ９−２０−タ−）、２０分、４°Ｃで遠心しフ
ィブリンを除去した。

上清に８０　ｇのポリエチレングリコール４０００を加
え溶解した。３０分間氷冷しなのち同じ条件で遠心し、
沈澱物を回収した。沈澱物からのＲＮＡの抽出は、グア
ニジン・チオシアネートを用いたＡＧＰＣ法　［Ｃｈｏ
ｍｃｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ、および５ａｃｃｈｉ、Ｎ、：
　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
ｌｉ２．１５６　（１９８７）　］に準じた。すなわち
沈澱物を２倍量（沈澱物１ｇを　１腸］と換算）の溶液
６Ｄ（６Ｍグアニジン・チオシアネート、　　２５ｍＭ
クエン酸ナトリウム、　　ｐＨ７，０、０，５πサルコ
シール、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール）に溶解後
、０１容量の２阿酢酸ナトリウム　（ｐＨ４，０＞を加
え、次に等容量のフェノール、０，２容量のクロロホル
ム：　イソアミルアルコール混液（４９：１）で抽出を
行った。１５分間水冷後、遠心し上層を分取し、等量の
　２−プロパツールを加え、ＲＮＡを沈澱させた。遠心
後、沈澱物を０．５鵬ｆＪ　　の溶液４Ｄ　（４Ｍグア
ニジン・チオシアネート、２５冒翼クエン酸ナトリウム
　ｐＨ７，０・０．５πサルコシール、　　０．１１２
−メルカプトエタノール）で溶解後、２倍容量のエタノ
ールを添加し、再度ＲＮＡを沈澱させた。遠心後洗澱物
を　７５Ｘエタノールで洗浄し、乾燥させた。沈澱物は
、５０μ９の滅菌蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液とした。

実施例２：　　ｃＤＮＡライブラリーの作成１０μｌの
ＲＮＡ溶液を出発材料にｃＤＮＡ合成を行った。　　Ｒ
ＮＡから　２重鎖ｃＤＮＡの作成は、市販のＣＤＮＡ合
成システム・プラス（アマジャム　ＲＰＮ−１２５６２
）を用イテ行った。　　ＲＮＡがら１本鎖ＤＮＡ　ノ変
化率は約１％、１重鎖ｃＤＮＡがら２本ｊｉｇ　ｃＤＮ
Ａへの変換率は、約１００ｘであった。

合成した２本鎖ｃＤＮ＾は、エタノール沈澱を行ったの
ち　１００μＩｆ　　のＴＥ浴溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＣＩｌ　。

ｐＦ１８．０１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した０次に市販
のｃＤＮ＾合成キット（ファルマシアＬ）ＩＢ、　２７
−９２６０−０１）　ヲ用いて以下の反応を行った。ｃ
ＤＮ＾溶液をキットに付属している５ｅｐｈａｃｒｙｌ
　Ｓ−３００スパンカラムを通すことにより、１×Ｔ４
リガーゼ溶液にバッファー交換を行った０次に、説明書
に準じＥｃｏＲＩアダプターの付加反応と　Ｔ４キナー
ゼ反応を行った。

ｃＤＮＡに結合しなかったアダプターは、５ｅｐｈａｃ
ｒｙｌＳ−３００スパンカラムを用いて除去した。溶出
液中のｃＤＮＡは、５μｇのキャリアー　ｔＲＮＡとと
もにエタノール沈澱を行った。沈澱物は７５％エタノー
ルで洗浄したのち風乾した。

次に市販のｃＤＮＡクローニングシステム　λｇｔ１ド
アダブター法（アマジャム、　ＲＰＮ　１２８０）を用
いて以下の反応を行った。沈澱物に５μｇ　の滅菌蒸留
水、４μｌ　　（２μｇ）の　λｇｔｌｌ　ＥｃｏＲＴ
アーム、１μ９　のＬ／にバッファーを加えて溶解した
のち、１μＢ　　（２，５０）のＴ４リガーゼを加え、
１５℃で一晩放置した。　次に、市販のＧＩＧＡＰＡＣ
Ｋ　ｎ　　Ｇｏｌｄλ−Ｄ）ＩＡ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏバ
ッゲージングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ２００２１
６）を用いて上記反応物（組み換え　λｇｔｌｌＤＮＡ
が含まれる）の　ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング反応
を行い、ｃＤＮＡライブラリー　（Ｌｏｔ、＾）を作成
した。

実施例３：　非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原遺伝子のイム
ノスクリーニングによるクローニングｃＤ頁Ａライブラ
リー　（Ｌｏｔ、　Ａ）中のプラークと１次抗体および
２次抗体との反応は、市販のスーパスクリーン・イムノ
スクリーニングシステム（アマジャム、　ＲＰＮ　１２
８１２）の方法に準じて行った。スクリーニングに使用
した１次抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎患者のプール血清（５
名の急性肝炎回復期と５名の慢性肝炎）を、大腸菌ライ
ゼート（バイオ・ラット、　１７−３２０５）で吸収　
（２腸ｇライゼート／脂９　血清）したものを溶液Ａ　
　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ　。

ｐＨ７，５１５０履ＭＮａＣＩｌ、２χ（Ｉｆ／Ｖ）　
ＢＳＡ）で２０倍希釈して使用した。２次抗体には、パ
ーオキシダーゼ標識したヤギ抗（ヒト　ＴｇＧ）　Ｉｇ
Ｇ　（カッペル、３２０１−００８１＞を５００倍希釈
して使用した０発色反応は市販のラムダ・リフト検出キ
ット　ＧＡＲ−ＨＲＰ　（バイオ・ラッド＋’　１７−
３５５６）を用いて行った。

約５００．０００個のプラークより５ケの陽性プラクに
トロセルロースフィルター上で青紫色に発色）を単離し
た。その中の１クローンをＮＳ４３と命名し、以下の解
析を続けた。

実施例４：　クローンＮＳ４３の抗原特異性試験ａ）イ
ムノプラークアッセイ ＮＳ４３クローンと陰性クローンを　２＝８の割合で混
合したものをブレーティングし、上述のイムノスクリー
ニングの方法を用いて、非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者（輸血
歴あり）血清（５名）、非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者（輸血
歴なし）血清（５名）、非Ａ非Ｂ型急性肝炎患者（輸血
歴なし）血清（６名）、正常人コントロール血清（２６
名）、Ｂ型慢性肝炎患者血清（９名）、Ａ型急性肝炎患
者血清く２名）との反応性を調べた。その結果、クロー
ンＮＳ４３は、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清とのみ特異的に
反応することが示された（表１）。

非Ａ非Ｂ型急性肝炎患者有 非Ａ非Ｂ型急性肝炎患者無 非Ａ　４１Ｂ型慢性肝炎輸血無 Ａ型　　　急性肝炎 Ｂ型　　　慢性肝炎 コゝ　口 すなわち、クローン 患者由来の血清により、 原（エピトープ）がコ された。

免疫学的に認識される抗 ＮＳ４３には非Ａ非Ｂ型肝炎 ドされていることが確認 ６　　　　　２／６ ２　　　　　０／２ ９　　　　　０／９ ｂ）ウェスタンプロットアッセイ λｇｔｌｌ（野生株）溶原菌及び組換え体λｇｔｌｌＮ
ｓ４３溶原菌の調製、上記溶原菌の培養及びβ−ｇａｌ
およびβ−ｇａｌ融合抗原ポリペプチドの発現誘導は実
験書３．Ｐ７６　　の方法に準じて行った０発現誘導後
、培養液を超音波破砕し蛋白濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ法（
バイオ・ラット、　５００−０００１　＞で測定した。

各破砕液より５μｇ相当の蛋白量を５ＤＳ−ＰＡＧＥに
かけ、泳動後セミドライエレクトロプロッター（Ｉｎｔ
ｅｇａｔｅｄ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　５ｙｓｔｅ履Ｓ
）をもちし）てウェスタンプロットをおこなった。１次
抗体には、表１記載の各種血清を使用し、実施例３）記
載のイムノスクリーニングの方法を用いてβ−ｇａｌ、
β−ｇａｌ融合抗原に対する各種血清の反応性をしろべ
た。その結果、β−ｇａｌ融合抗原ポリペプチド（約１
００ｋｄ）と非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との組合せに於い
てのみ呈色反応が認められ（陽性率は表１の結果と同じ
）該抗原ポリペプチドの抗原特異性が確認された。

実施例５：　クローンＮＳ４３由来のｃＤＮＡの塩基配
列および該配列内にコードされる抗原ポリペプチド配列
の決定 クローンＮＳ４３を実１１の２．１１８記載のプレート
ライゼート法により増殖させたのちファージＤＮＡを調
製した。５μｇのファージＤＮＡを　ＥｃｏＲＩ消化し
た後、フェノール抽出およびエタノール沈澱により精製
した。

３μｇのＥｃｏＲＩ消化物をアルカリホスファターゼ処
理した後、Ｔ４キナーゼと　γ３２　ｐ−＾ＴＰを用い
て５′末端ラベルを行った。フェノール抽出とエタノー
ル沈澱により　ＤＮＡ断片を精製した後、５．０χポリ
アクリルアミド電気泳動を行いオートラジオグラフィー
により　ＥｃｏＲ１消化により切り出されたｃＤＮＡの
長さを調べた。その結果ｃＤＮＡのサイズは約９５０塩
基であることが判った。

次に前述のＥｃｏＲＩ消化物と　ＥｃｏＲＩ消化後脱リ
ン酸化したｐＴＺ１９　（ファルマシアＬＫＢ、　２７
−４９８６０１）とでＴ４リガーゼ反応を行った２反応
液を　ＪＭ１０９（宝酒造、　９０５２）にトランスフ
ェクションし、約９５０塩基のインサートをもつプラス
ミドを単離した　（ｐＴＺ１９−４３と命名）。

ｐＴＺ１９−４３に組み込まれた　ｃＤＮＡの塩基配列
は、実験書１の１３．１７記載の方法に従い！１１１３
ブライマーＭ４　（宝酒造、　３８３２）、Ｍ１３プラ
イマーＲＶ　（宝酒造、　３８３０）および種々の合成
ブライマーと　７ａｅａｚａシ一クエナーゼ２版キット
（東洋紡、　７０７７２）を用いて決定しな、　また、
合成オリゴヌクレオチドの作製は、３８０Ａ型ＴＩＮＡ
合成機（アプライドバイオシステムズ）により行ない、
付属の説明書に従って精製した。

また、決定した配列のいずれの鎖が組み換えλｇｔｌｌ
上でβ−ｇａｌ蛋白と融合蛋白を形成していたかどうか
を確認するため　λｇｔｌｌ　ＥｃｏＲ１部位プライマ
ー正向、逆向　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ
ｂｓ、　１２１８、１２２２）を用いてファージＤＮＡ
を直接鋳型に用いて塩基配列決定を行った。これらの結
果に基づき。

非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清に特異的に反応する抗原をコー
ドする塩基配列を第１図に示すように、また抗原のアミ
ノ酸配列を第２図に示す様に決定した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポリペ
プチドをコードする塩基配列を示す。 第２図は、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポリペ
プチドのアミノ酸配列を示す。 特許出願人　山之内製薬株式会社 有　　馬　　　　暉　　勝

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記アミノ酸配列で示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
   ルス抗原ポリペプチド 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
2. （２）化学合成された請求項（１）記載の抗原ポリペプ
   チドまたはそのアミノ酸配列を含むポリペプチド断片群
3. （３）請求項（１）のアミノ酸配列を有する融合抗原ポ
   リペプチド
4. （４）抗原ポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼ（β−
   ｇａｌ）と融合されたものである請求項（３）記載の融
   合抗原ポリペプチド
5. （５）請求項（４）記載の抗原ポリペプチドを発現する
   組換え体λｇｔｌｌクローンＮＳ４３
6. （６）請求項（１）、（３）または（４）のいずれかの
   項に記載の抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
   チド
7. （７）下記塩基配列で示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス
   ポリヌクレオチド 【遺伝子配列があります】
8. （８）非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに由来するポリヌクレオ
   チドを検出するためのポリヌクレオチドであつて、請求
   項（７）記載の連続した８残基、またはそれ以上の長さ
   からなるポリヌクレオチドプローブ
9. （９）請求項（１）、（３）または（４）いずれかの項
   に記載の抗原ポリペプチドを生産するように組換え体発
   現ベクターで形質転換された宿主細胞を該ポリペプチド
   を発現する条件下でインキュベートすることを特徴とす
   る抗原ポリペプチドの生産方法
10. （１０）請求項（１）、（３）または（４）記載の抗原
    ポリペプチドと生物学的試料中に存在する非Ａ非Ｂ型肝
    炎ウィルス抗体との反応で形成される免疫学的結合物を
    測定して生物学的試料中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体
    の存在を確認する非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体の検出方
    法